Post on 26-Feb-2021
Die stationäre Phase:
Liganden für den Reversed-Phase Modus
Granick Research Group
University of Illinois at Urbana-Champaign
Wassertropfen auf
einer C18-Lage
1
Nachdem man sich für das optimale Basismaterial für die jeweilige Applikation
entschieden hat, muss man nun den geeigneten funktionellen Liganden
finden. Diese Wahl hat einen großen Einfluss auf die Selektivität der Trennung.
Wahl der Partikeltechnologie:
• Vollporös
• Core-Shell
• Monolithischer Stab
• UHPLC
Wahl des Liganden:
• Alkylphasen
• Phenylphasen
• Polar-embedded Phasen
• Polar-endcapped Phasen
Auflösung (
R)
Liganden / gebundene Phasen
2
Alkylphasen (C18, C8, C4):
Phenylphasen (Phenyl, PFP):
F F
F
FF
Polar-embedded Phasen:
Fusion
Polar-endcapped Phasen:
Hydro
Klassen von RP-Liganden
3
Primärer Retentionsmechanismus
Hydrophob
Alkylphasen
4
Der Test auf Methylengruppen-Selektivität zeigt, wie gut eine stationäre Phase
verwandte Verbindungen trennen kann, die sich nur um eine CH2-Gruppe
unterscheiden. Im Allgemeinen haben sehr hydrophobe Liganden (z.B. C18)
eine höhere Methylengruppenselektivität als weniger hydrophobe Phasen.
min2 4 6 8 10
mAU
0
50
100
150
200
250
min2 4 6 8 10
mAU
0
100
200
300
400
C1
8P
he
nyl
Methylengruppen-Selektivität
5
0.000
0.020
0.040
0.060
0.080
0.100
0.120
0.140
0.160
0.180
0.200
Luna C18(2)
Synergi Hydro-RP
Jupiter C18
Synergi Max-RP
Luna C8(2)
Luna C5 Luna Phe-Hex
Jupiter C4
Synergi Polar-RP
Prodigy Phenyl
Luna Cyano
Luna Amino
Slo
pe
of
log
k v
s. #
-C
H2-
un
its
C18 > C8 > C5 ≥ Phenyl > CN > Amino
Ste
igung v
on log k
vs.
#-C
H2-E
inheiten
Methylengruppen-Selektivität
6Luna und Jupiter sind eingetragene Markenzeichen von Phenomenex, Inc. Synergi und Prodigy sind Markenzeichen von Phenomenex, Inc.
Phenyl-Phasen sind weniger hydrophob als C18-Phasen und haben häufig
deutlich unterschiedliche chromatographische Eigenschaften, da sie mit einigen
Analytmolekülen π-π-Wechselwirkungen eingehen können. Sie haben
deshalb eine orthogonale Selektivität zu herkömmlich Alkylphasen (z.B. C18).
F F
F
FF
Modes of InteractionRetentionsmechanismen
Hydrophob
Aromatisch (π-π)
Dipol-Dipol
H-Brückenbindung
Phenylphasen
7
Unterschiede zwischen den Phenylphasen sind:
• Länge des Alkyllinkers (C3, C6, Direktanknüpfung)
• Art der Substituenten: H, F, O
• Zahl der Phenylringe
Phenylphasen
Zunehmende Polarität
Kinetex®, Luna®
Phenyl-Hexyl
• hydrophob
Synergi™ Polar-RP®
• Höchste Polarität
• Polares Endcapping
Kinetex® Biphenyl
• Stark aromatisch
• δ−, für Basen
Luna PFP, Kinetex F5
• Hohes Dipolmoment
• δ+, für Säuren
8Luna, Kinetex und Polar-RP sind eingetragene Markenzeichen von Phenomenex, Inc. Synergi ist ein Markenzeichen von Phenomenex, Inc.
XIC of +MRM (10 pairs): 359.300/295.300 Da ID: Prednisone 2 from Sample 17 (KNX 2.6u c18 50x2.1m... Max. 5.3e5 cps.
1.60 1.65 1.70 1.75 1.80 1.85 1.90 1.95 2.00 2.05 2.10 2.15 2.20382 394 406 418 430 442 454 466 478 490 502 514 526
Time, min
0.0
2.0e5
4.0e5
6.0e5
8.0e5
1.0e6
1.2e6
1.4e6
1.6e6
1.8e6
2.0e6
2.2e6
2.4e6
2.6e6
Intens
ity, cp
s
Cortisol/Cortisone
Prednisone
Prednisolone
XIC of +MRM (10 pairs): 361.100/163.200 Da ID: Cortisone 1 from Sample 12 (KNX 2.6u biphenyl 50x2.... Max. 2.8e6 cps.
2.15 2.20 2.25 2.30 2.35 2.40 2.45 2.50 2.55 2.60 2.65 2.70 2.75 2.80 2.85 2.90 2.95514 526 538 550 562 574 586 598 610 622 634 646 658 670 682 694 706
Time, min
0.0
2.0e5
4.0e5
6.0e5
8.0e5
1.0e6
1.2e6
1.4e6
1.6e6
1.8e6
2.0e6
2.2e6
2.4e6
2.6e6
2.8e6
Intens
ity, cp
s
2.61
Cortisone
Cortisol
Prednisone
Prednisolone
4 Steroide per LC/MS/MS
Kinetex® 2,6 µm C18
50x2,1 mm
Kinetex 2,6 µm Biphenyl
50x2,1 mm
Umkehr der
Elutionsreihenfolge!
Phenyl-Selektivität
9Kinetex ist ein eingetragenes Markenzeichen von Phenomenex, Inc.
XIC of +MRM (10 pairs): 361.100/163.200 Da ID: Cortisone 1 from Sample 12 (KNX 2.6u biphenyl 50x2.... Max. 2.8e6 cps.
2.15 2.20 2.25 2.30 2.35 2.40 2.45 2.50 2.55 2.60 2.65 2.70 2.75 2.80 2.85 2.90 2.95514 526 538 550 562 574 586 598 610 622 634 646 658 670 682 694 706
Time, min
0.0
2.0e5
4.0e5
6.0e5
8.0e5
1.0e6
1.2e6
1.4e6
1.6e6
1.8e6
2.0e6
2.2e6
2.4e6
2.6e6
2.8e6
Intens
ity, cp
s
2.61
Cortisone
Cortisol
Prednisone
Prednisolone
Cortison
Log P = 1,66
Cortisol
Log P = 1,28
Prednison
Log P = 1,66
Prednisolon
Log P = 1,27
Kinetex® 2,6 µm Biphenyl
50x2,1 mm
Mehr Wasserstoffbrücken Mehr Retention
Erhöhte - Wechselwirkungen auf Core-Shell Biphenyl10
Phenyl-Selektivität
Kinetex ist ein eingetragenes Markenzeichen von Phenomenex, Inc.
Durch die gezielte Einführung von polaren funktionellen Gruppen (durch Endcapping oder eingebettet im Liganden) können mittels spezifischer sekundärer Wechselwirkungen polare Verbindungen besser retiniert werden. Vorteile dieser Phasen sind:
a. Polare Selektivität für polare Analyten
b. Stabilität in 100 % wässrigen mobilen Phasen
c. Verbesserte Peakform für basische Arzneimittel (weniger Silanole)
Synergi Fusion-RP
Polar-embedded
Synergi™ Hydro-RP
Polar-endcapped
Polar-embedded und polar-endcapped Phasen
Luna® Omega Polar C18 mitpolarer Oberfläche
Luna Omega PSC18 mit geladener OberflächeLuna ist ein eingetragenes Markenzeichen von Phenomenex Inc.
Synergi ist ein Markenzeichen von Phenomenex Inc.
Nukleinsäurebasen:
Day 2
min2 4 6 8 10 12 14
0
Day 1
2 4 6 8 10 12
0
Phasenkollaps!
konventionelle C18
Tag 1
Tag 2
100 % Wasserstabilität
Liganden
Kieselgel
Day 1
0 2 4 6 8 10 12
0
Day 6
2 4 6 8 10 12 14
0
Synergi™ Hydro-RP
Tag 1
Tag 6
12Synergi ist ein Markenzeichen von Phenomenex, Inc.
100 % Wasserstabilität
PyridoxinNicotinsäure
Luna® Omega C18 1,6 µm beginnend mit 3% ACN:
Luna Omega Polar C18 1,6 µm beginnend mit 0% ACN:
13Luna ist ein eingetragenes Markenzeichen von Phenomenex, Inc.
Bessere Retention polarer Analyten
14
Vergleichende Trennungen sind möglicherweise
nicht für alle Applikationen repräsentativ.
Vollporöse 1,8 µm
polare C18 Phase
Luna® Omega 1,6 µm PS C18
Vollporöse 1,8 µm polare C18
Luna ist ein eingetragenes Markenzeichen von Phenomenex, Inc.
Oxymetazolin und Oxidationsprodukt:
min2 2.5 3 3.5 4 4.5
mAU
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
DAD1 A, Sig=280,4 Ref=360,100 (C:\CHEM32\1\DATA\JL121310\JEFF 2010-12-13 09-02-10\SELECT3C1800001.D)
3.233
3.336
C18
Rs 1,45
min2 2.5 3 3.5 4 4.5
mAU
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
DAD1 A, Sig=280,4 Ref=360,100 (C:\CHEM32\1\DATA\JL121310\JEFF 2010-12-13 09-18-10\SELECT3C1800001.D)
3.684
3.902
Phenyl
Rs 2,1
min2 2.5 3 3.5 4 4.5
mAU
-1
0
1
2
3
4
5
6
DAD1 A, Sig=280,4 Ref=360,100 (C:\CHEM32\1\DATA\JL121310\JEFF 2010-12-13 09-58-12\SELECT3C1800001.D)
3.049
3.563
Polar-embedded
Phenyl
Rs 3,2
Oxymetazoline
• Bessere Rs mit Phenyl • Optimale Rs mit polar-
embedded und polar-
endcapped Phenylphase
Erweiterte polare Selektivität
15
Kinetex Biphenyl
Kinetex F5
Synergi Polar-RP®
Luna® Omega C18
Kinetex® C18
Gemini® C18
Universelle C18
Luna Omega Polar
C18
Kinetex Biphenyl
Kinetex Polar C18
Synergi™ Fusion-RP
Polare Basen &
Neutralver-
bindungenLuna Omega PS C18
Luna Omega Polar
C18
Kinetex F5
Synergi™ Hydro
Polare Säuren
Kinetex F5
Kinetex Biphenyl
Kinetex Phenyl-
Hexyl
Gemini C6-Phenyl
Positions-
isomers
Kinetex EVO C18
Gemini C18
Gemini-NX C18
Gemini C6-Phenyl
Basische mobile
Phase
Luna Omega PS C18
Kinetex EVO C18
Kinetex XB-C18
Synergi Max-RP
Peaktailing
für Basen
Orthogonal
zu C18
Phasenauswahl Tipps
Luna, Gemini, Kinetex und Polar-RP sind eingetragene Markenzeichen von Phenomenex, Inc. Synergi ist ein Markenzeichen von Phenomenex, Inc.