Einführung in dieElektronenmikroskopie

Instrumentation

ZMB / Uni Zürich 2007

:-)• Auflösung makromolekularer

Strukturen

• Darstellung feinstrukturellerZusammenhänge

• Lokalisation von Einzelmole-külen im Kontext (Korrelationvon Struktur & Funktion )

Vor-& Nachteile derElektronenmikroskopie

:-(

• Teuer

• Platzbedarf

• Zusatzgeräte

• aufwändige Präparation

LM - Darstellung auf Zellebene

Das CytosklettnachFluoreszenz-markierung.

-> DasFilament-geflecht ist guterkennbar imLichtmikroskop.

EM: Darstellung auf makromolekularer Ebene

Extracted, CPD, Pt, SEM FD, Pt, SEM

Cytosklett nachExtraktion.

-> Die Cytosklett-Filamente sindeinzeln in ihrerFeinstrukturerkennbar (hierSEM).

EM-Lokalisation von Proteinen

TEM Replica Sample of Actin Leading Edge.

Immunogold-Lokalisationvon Aktin-ver-netzendenProteinen.

Auflösungsvermögen im Vergleich

Wellenlängen im Vergleich

Vergleich Licht- & Elektronenmikroskopie

ELEKTRONEN

° ! = 0,04-0,004 nm (1-100 kV)

• Auflösung bis 0,1 nm

• Vergrösserung bis 1 000 000 x

• TEM & SEM

• Hochvakuum

LICHT

• ! = 400-700 nm

• Auflösung bis 200 nm

• Vergrösserung bis 1 000 x

• Durchlicht & Auflicht-LM

• Proben sind wasserhaltig

Vergleich der StrahlengängeTEM REM

Elektronenoptik

• Hochvakuum (~10-7 torr)

• Elektronenquelle (Wolfram-Draht, Feldemission)

• Elektromagnetische Linsen (stromdurchflossene Drahtspulen)

• Blenden

• Detektoren (Szintillator, div.)

gemeinsame Elemente von TEM & REM

Elektronenstrahlerzeugung

Thermische Kathode Feldemmisionskathode

Elektromagnetische Linsen

Elektromagnetische Linsen verhalten sich weitgehend wie licht-optische

Linsen. Sie bestehen aus stromdurchflossenen Spulen. In Abhängigkeit

von Linsenstrom und Zahl der Windungen entsteht ein Magnetfeld, das

die Flugbahn der Elektronen beeinflusst -> Beschleunigung tangential

zur Spulenwindung. Das Magnetfeld bestimmt die Brechkraft der Linse.

Elektromagnetische Linsen sind in ihrer Brechkraft variabel.

Axialer Astigmatismus

Der axiale Astigmatismus ist der bestimmendeLinsenfehler in der biologisch/medizinischen EM.

Aufgrund von leichten Unsymmetrien oder Material-inhomogenitäten im Linsenaufbau sowie aufgrund vonKontaminationen optischer Elemente kommt es zurelliptischen Verformung des Magnetfeldes der Linse.

Kompensation durch Stigmatoren-Paar, das ein vari-ables elliptisches Kompensationsfeld erzeugt.

WechselwirkungElektron Materie

ungestreute Elektronen

elastische Streuung - geänderte Bewegungsrichtung, gleichbleibende Energie (E°)

inelastische Streuung - geändere Bewegungsrichtung, verminderte Energie (E°- ! E)

ungestreute Elektronen bleiben in Richtung und Energie unverändert (E°)

Elektronen in der Probe

K

L

M

N

Schalenmodell des Atoms.

Elektronen aus einer Schale könnenin die nächste übertreten. Dabei wirdStrahlung frei.

Beim inelastischen Zusammen-stoss von Strahlelektron undProbenatom wird Energie !Eauf das Probenelektron übertrag-en und dieses aus seiner Schaleherausgeschleudert. Innerhalb desAtoms kann es daraufhin zu Scha-lenwechseln kommen.

1

2

StrahlenschadenDurch den Energieeintrag bei inelast-ischen Streuungen kommt es zu Ver-änderungen intra-& intermokekularerBindungen, Ionisationen, Masseverlustund Objekterhitzung.

Zusätzlich kann er zum Aufbacken vonKontaminationsschichten im Strahl führ-en, die das Bild verdunkeln.

-> Detailverlust !!

daher:

• Minimale Strahlendosis durch geeig- nete Beleuchtung.

• Fokussieren und korrigieren vor Bildauf- nahme an anderer Probenstelle.

Probe Interaktionsvolumen

Primärelektronen (Strahl)Primärelektronen (Strahl)

Ungestreute ElektronenUngestreute Elektronen

Elastisch gestreute ElektronenElastisch gestreute Elektronen

Inelastisch gestreute Elektronen

TE

M

RE

M

SekundärelektronenSekundärelektronenRückstreuelektronenRückstreuelektronen

Auger-ElektronenWärme

KathodoluminisenzRöntgenstrahlen

Signale durch Elektronenbeschuss

TEM

vacuum

vacuum specimen support

REM

vacuum

Vergleich TEM vs. REM

pseudo

pod

plasma

membran

Das Transmissionselektronenmikroskop

Elektronenoptik im TEM

Strahlquelle - Elektronenwerden emittiert und be-schleunigt.

Kondensor - optimiert die„Beleuchtung“.

Objektiv - ist die eigent-liche abbildende Linse.

Projektive - bis zu 4Linsen zur mehrstufigenNachvergrösserung desZwischenbildes.

Objektivblende - ist dasKontrast-gebende Ele-ment.

Strahlengang in LM und TEMLM - Fokussierendurch Verstellen desAbstandes zwischenObjektiv und Probe.Die optischen Eigen-schaften der Glaslinsesind fix.

TEM - Fokussierendurch Verstellen derBrennweite derelektromagnetischenObjektivlinse. Der Ab-stand zwischen Linseund Probe ist fix.

Bildprojektion im TEM

Die durch die Probehindurch gestrahltenElektronen werd-en auf einen Leucht-schirm projiziert.-> Eine Platte istphosphoreszierendbeschichtet: trifft einElektron auf die Patte,so wird sie an dieserStelle zum leuchtenangeregt. DiesesLeuchten kann nundirekt, oder durch einVergrösserungsglas,betrachtet werden.

TEM - Proben

3 mm

Grids aus Kupfer, Gold, Nickel mit ver-schiedener Maschenzahl und Maschenweite.Oftmals noch mit einem transluzenten Träger-film versehen. Die Netzchen dienen als Trägerder dünnen Probe z.B. Einzelpartikel, Ultra-dünnschnitte.

Ein Ultradünnschnitthat eine Fläche ~ 0,5x 0,4 mm und ist 30 -100 nm dick. 0,00001 mm3.

Kontrastentstehung im TEM

Die im grossen Winkelgestreuten Elektronen werdendurch die Kontrastblende ausdem Strahlengang entfernt(ausgeblendet) und tragennicht mehr zum Bild bei.

Stellen in der Probe, dieaufgrund höherer Dichte oderdem Vorkommen schwererElemente (z.B. Metalle) stärk-er streuen, erscheinen daherim Bild dunkler.(Dichte/Dicke-Kontrast,Materialkontrast)Die Objektivblende als

kontrastgebendes Element.

Beispiele für EM in Biologie/Medizin

Immunogoldmarkierung eines Peptidhormons an Herzmuskelzelle

Beispiele für EM in Biologie/Medizin

mit Blei und Uran nachkontrastierte Probe

BeugungsbilderZwischenlinsefokussiert aufBildebene derObjektivlinse

Zwischenlinsefokussiert auf

Brennebene derObjektivlinse

Anhand von Beugungsbildern lassen sich Aus-sagen über die kristalline Struktur von Probenmachen - z.B. über die Abstände und Orientier-ungen im Kristallgitter oder über Kristalldefekte.

Je nachdem, ob die Zwischenlinsen auf die Bild-ebene oder die Brennebene der Objektivlinsefokussiert werden, wird das Durchstrahlungsbildoder das Beugungsbild der Probe vergrössert.

Be

ug

un

gsb

ild

Ab

bild

Elektronen Tomographie

Selbst relativdünne durch-strahlbare TEM-Proben habeneine räumlicheDimension.

TEM Bilder sind2D-Projektioneneiner 3D-Probe.

Durch Projektionen ver-schiedener Ansichten lässtsich die 3D-Struktur rekon-struieren.

Elektronen Tomographie

• Semi-dünne Schnitte(250 nm)

• Aufnahme einerBildserie unterverschiedenenWinkeln (z.B.jedes 1° zwischen-70 und +70°)

• Bildverarbeitung(Alignment,Rekonstruktion)

Image width

Features insidefield of view

Features outsidefield of view

Images

Elektronen Tomographie

tilt series

Tecnai 200kV FE-TEM STEM mode

Elektronen Tomographie

(raw data)

virtual sectioning (reconstruction)

(C

hri

stia

n K

üb

el, F

EI

Ein

dh

ove

n)

Image processing, 3D-modeling

Elektronen Tomographie

Das Rasterelektronenmikroskop

REM-ProbenkammerRasterelektronenmikros-kopische Proben könnensehr gross sein.Entsprechend gross istauch die Probenkammer.

Die Probenbühne ist in5 Achsen frei verfahrbar:X - Y - Z - T - R

Elektronenoptik im REM

Die Linsen dienen der Kon-ditionierung des Elektronen-strahls. Es gibt keine ab-bildende Linse im SEM.

Kathode als Strahlquelle(z.B. Feldemissionskathode)

Die Probe wird von einem stakt gebündelten Elektronenstrahlabgetastet. Die entstehenden Signale werden von verschieden-en Detektoren gemessen.

Abtasten der Probenoberfläche

Der Primärelektronenstrahl wird Punkt für Punkt über die Probe geführt. An jedemPunkt wird die Signalintensität gemessen. Die Messwerte werden in Graustufenübersetzt und im Rechner zu einer Bildmatrix zusammengesetzt -> ein Bild wirdgeneriert.

Abtasten der Probenoberfläche

Elektromagnetische Linsen formen den Elektronenstahl zu einem eng fokussierten Bün-del. Ablenkspulen lenken den den Strahl in x- und y-Richtung ab. Ein Rastergeneratorsteuert die Ablenkung so, dass der Strahl Punkt für Punkt und Zeile für Zeile über dieProbe geführt wird. Die Signalintensität wird in jedem Punkt gemessen und als Hellig-keitswert auf dem Bildschirm „zeitgleich“ mittels Rastergenerator dargestellt.

Durch zoomen werden die Messpunkte näher zueinander gelegt -> ein kleineres Feldder Probe wird vom Primärstrahl feiner abgerastert, das dabei entstehende Bild hatdie gleiche Anzahl Bildpunkte. Strukturen erscheinen grösser und Details werdensichtbar.

Vergrösserung durch Zoom

Interaktion Elektronenstrahl - Probe

Elektronendiffusionshof an der Oberflächedicker Proben. Der Stahl kann über 10 µmtief in die Probe eindringen.

Simulation

Jedoch nur aus oberflächen-nahen Schichten könnenSignale (Elektronen, Strahl-ung) die Probe verlassen.

Eindringtiefe des Primärstrahls

Austrittstiefe

Interaktionsvolumen der Primärelektronen

Während durch dünne Proben der Elektronenstrahlhindurchtritt, bleibt er in der dicken Probe stecken undbreitet sich aus.

TEM REM

Aufladungsphänomene in REMKann die Ladungszufuhr durch den Primärelektronenstrahl nicht via Probenhalteroder Probenoberfläche abgeleitet werden kommt es zu Aufladungen der Probe,diese können sich z.B. in Ladungswolken oder Verzerrungen äussern. Im Extremfallbewegen sich Probenteile im Strahl oder fliegen ganz weg.

Minimieren von Aufladungsphänomenen z.B. durch geeignete Probenpräparation,Reduktion von Beschleunigungsspannung bzw. Strahlstrom, Variation des Kammervakuums.

Simulationen verschiedener Eindringtiefen des Primärelektronen-strahls. Die Grösse und Form des Interaktionsvolumens hängt vonvon verschiedenen Faktoren ab: Eintrittswinkel und Energie derPrimärelektronen, Ordnungszahl oberflächlicher Probenatome.

Simulation der Interaktionsvolumen

Parameter des Interaktionsvolumens

Die Eindringtiefeist bei Materialienniedriger Ordungs-zahl grösser.

Die Eindringtiefedes Primärelek-tronenstrahlsnimmt mit derSpannung zu.

Beispiel SignaltiefeJe nach Wahl der Beschleu-nigungsspannung derPrimärelektronen ist dieSignaltiefe verschieden.

SE

SE

18 kV

6 kV

Bei kleinen Beschleuni-ungsspannungen stammendie Signale unmittelbar vonder Probenoberfläche.

Bei höheren Spannungenkommt die Information ausgrösseren Tiefen der Probe.

Verschiedene Materialienliefern unterschiedlicheSignalausbeuten.

Zellen auf Mikrochip. Pt-coated.

Signalentstehung im REM

Primärelektronen desStrahls werden anProbenatomen abge-lenkt: gestreut odersogar reflektiert (Rück-streuelektronen BSE).

Elektronen der Proben-atome selbst (Sekundär-elektronen SE) werdendabei gelegentlich ausihrer Schale geschlagen(inelastische Streuung).

BSE

SE

SE

Signalentstehung im REM

PE

BSE

SE IISE I

Polschuh undSäuleninnenwände

SE III

Primärelektronen des Strahlsdringen in die Probe ein undwerden dabei an den Proben-atomen mehrfach gestreut.Rückgestreute Elektronenverlassen die Probe wieder.

Bei inelastischen Zusammen-stössen der Primärelektronenmit Probenatomen werdenüberall im Interaktionsvolu-men Sekundärelektronen frei.Jedoch nur SE unmittelbar ander Oberfläche können dieProbe verlassen.

Unerwünschte SE entstehenauch an den Innenflächen derProbenkammer.

Unterscheidung SE BSE

Sekundärelektronen und Rückstreuelektronenunterscheiden sich signifikant in ihrem Ener-giegehalt. SE sind sehr niederenergetisch.BSE haben nahezu die gleiche Energie wiedie Primärelektronen.

Interaktionsbirne und AuflösungSE treten direkt an der Proben-oberfläche aus, aus einer Tiefevon 1 nm (Pt) bis zu 10 nm (C).Sie geben das topografisch ge-naueste Signal. Ihre Austritts-tiefe ist von der Beschleunig-ungsspannug unabhängig.

BSE stammen aus tieferenSchichten (1-2 µm). Röntgen-Strahlen für die Elementana-lyse kommen aus noch ober-flächenferneren Regionen (bis10 µm). Die Austrittstiefe dieserSignale ist von der Bescheunig-ungsspannung der Primär-elektronen abhängig.

SignalauflösungenSignalauflösungen SE BSE X-ray

Austr

itts

tiefe

nA

ustr

itts

tiefe

n

Signaldetektion im REM

Materialbeschaffenheit (Ordnungszahl, Ladungsunter- schiede, Magnetismus, mole- kulare Orientierung, ...)

Topografie (Kontext, molekulare Auflösung, Quantifizierung).

Elementverteilung (EDX, WDX)

Topografische Abbildung

HR -REMP. Walther P. Walther

Hohe Tiefenschärfe bei der topografischen Abbildung (SE) dreidimensionaler Proben.Stark variabler Vergrösserungsbereich erlaubt Darstellung sowohl ganzer Organismenals auch von Zellen & Makromoleküle. Auflösungsvermögen ca. 1-3 nm.

Darstellung nicht-topografischerProbeneigenschaften (Beispiele)

Materialkontrast, BSE Elementverteilung, Röntgenstrahlen

Geräteparameter & Detektoren

Je nach Einstellungen am SEM und Auswahl des Detektors, könnenunterschiedliche Eigenschaften einer Probe dargestellt werden.

SE-Signal bei 2kV BSE-Signal bei 30kV

aufgebrochenen Pflanzenzelle mit Metalleinlagerung in den Chloroplasten.

red blood cells labeled against surface proteins

SE BSE

Detektoren im REM: SE vs. BSETopografie & Antigen-Lokalisation

Anordnung der Detektoren

PEBSESE

Die hochenergetischen BSE werden von einem Ringdetektor gemessen,der um den Primärstrahl herum direkt unterhalb der Endlinse positioniertist.

Der SE-Detektor sitzt meist seitlich. Die niederenergetischen SE werdenvom Detektor mittels eines positiv geladenen Käfigs angesaugt. DieFlugbahnen der BSE werden durch diese geringe Saugspannung (ca.300 V) nicht beeinträchtigt.

Der SE-Detektor

SE-Detektoren sind eine Kombination aus Szintillator und Photomulti-pliertube. Der Szintillator reagiert auf Elektronenkontakt mit Lumineszenz.Die Photonen werden in einer vielstufigen Kaskade vermehrt und dasSignal in einen Stromimpuls (output) verwandelt.

Flächenneigungskontrast

Durch die seitliche Anordnung und die an-liegende Saugspannung des SE-Detektorsentsteht eine Richtungsabhängigkeit desSignals mit topografieabhängigen Hellig-keitsverteilung und Abschattungen.

„Stehlampen-Effekt“

Kantenkontrast

An Kanten tretenmehr Sekundär-elektronen ausals in der Ebene.

Auch bei kleinenPartikeln undMikrorauhigkeitder Oberflächekönnen SEvermehrt dieProbe verlassen.

Der BSE-Detektor

Der BSE-Detektor besteht aus einer Anordnung mehrerer Detektorfelder (Ring), derenSignale miteinander verrechnet werden.Der Detektor besteht aus einer goldbeschicht-eten Silizium-Diode. Hochenergetische Rückstreuelektronen duchdringen die dünneGoldschicht und ionisieren die darunterliegenden Silizium-Atome. Es kommt zu einerWanderung von Ladungsträgern im Silizium und somit zum Stromfluß =Signal.

Die Probe emittiert unter Beschuss mit energiereichen Primärelektronen Röntgenstrahlung.Diese kann mit einem seitlich angebrachten, LN2-gekühlten Si(Li)-Kristall detektiert werden.

EDX Elementanalyse EDX = Elementdispersive Röntgenmikroanalyse

Schalenmodell des Atoms: Elektronenbewegen sich auf Bahnen („Schalen“)um den Atomkern. Jedes Element be-sitzt eine typische Anornung seinerElektronenschalen. Elektronen aus einerSchale können in eine andere über-treten. Innere Schalen sind energetischgünstiger als weiter aussen liegendeSchalen.

Primärelektronen stossen Elektronenaus kernnahen Schalen der Proben-atome heraus. In die entstandenenLücken fallen Elektronen aus weitervom Atomkern entfernten Elektronen-schalen. Dabei wird Röntgen-Strahlungfrei. Die Energie der Strahlung istcharakteristisch für jedes Element.

CharakteristischeRöntgenstrahlung

verlässt das Atom

Die Röntgenquanten werden detektiert. Die Impulsewerden verstärkt und A/D-gewandelt. Ein Vielkanal-analysator zählt die Röntgenquanten nach ihremEnergiegehalt einzeln aus. Auf dem Bildschirmwächst ein Spektrum (Intensität vs. Energie) heran.

Röntgenstrahldetektion

energiedispersives Röntgenspektrum

Die gemessene Röntgenstrahlung wird hinsichtlich ihrer Energie analysiert und in einemSpektrum dargestellt. Die im Röntgenspektrum enthaltenen Spektrallinien erlauben es,anhand der Energieverteilung die Elementzusammensetzung der Probe zu identifizierenund über die Intensitäten auch zu quantifizieren.

Röntgenquanten-Energie

Zahl der

Impuls

e p

ro E

nerg

iein

terv

all

Punktgenaue RöntgenanalyseDas Röntgenspektrum kannals Summenspektrum für einganzes Bild aufgenommenwerden oder für einzelneMesspunkte bzw. Regionen.

Das Röntgensignalkommt stets aus einergrösseren Tiefe derProbe (etwa 2-10 µm)als das topografischeBild.

Für eine EDX-Messungist eine hohe Beschleu-nigungsspannung not-wendig (ca. 2-3facheEnergie der zu mess-enden Röntgenquan-ten).-> die Primärelektronendringen somit tief in dieProbe ein: grossesInteraktionsvolumen,geringe örtlicheAuflösung)

Energie

Inte

nsitä

t

Elementverteilungsbilder

1. Aufnahme eines

REM-Bildes eines

interessierenden

Bereichs

2. Aufnahme eines

Summenspektrums

und Indizierung der

vorkommenden

Elemente

3. Auswahl der

relevanten Elemente

und Aufnahme von

Elementverteilungs-

bildern

2.

1. 3. 3.

3.3.3.

Durch Abtastung mittels fokussierten Primärelektronenstrahl kann die Ele-mentverteilung auf der Probenoberfläche im REM örtlich aufgelöst gemessenwerden.

"

REM StereobilderDurch Kippung der Probe um5-10° entstehen 2 verschiedeneAnsichten des Objekts. DurchRot-Grün-Überblendung dieserAnsichten kann mit einer ent-sprechenden Brille die Proben-topografie dreidimensional be-trachtet werden.

Geeignete Software erlaubt die quan-titative Auswertung definiert erstellterStereobilder -> Höhenmessungen, Be-stimmung der Mikrorauhigkeit.

P. Walther

Pseudoskorpion (Zentrum Mikroskopie Uni Basel, für wdr)

Kurzzeitige Lebendbeobachtungen strahlenresistenter Organismenunter Niedervakuumbedingungen im REM möglich!! Jedoch dabei

keine Hochauflösung von Oberflächendetails.

Lebendbeobachtungen im ESEM

Hydratisierte Blattoberfläche.

-> Die Strukturen sind von einendünnen Wasserfilm überzogen.

Niedervakuumbedingungen in der Proben-kammer. Es herrscht ein kontrollierterWasserdampf-Partialdruck. Aufspreitungdes Elektronenstrahls. Zusammenstössezwischen Elektronen und Wasser-molekülen.

Niedervakuum-REM (ESEM)

Lufttrocknung führt zuKollaps und Verformung.

Wasser ist für Elektronennicht transluzent, d.h. nur

die Wasseroberfläche wirdabbgebildet. -> Selbst

dünne Wasserfilmeverdecken Details der

Probenoberfläche.

EnvironmentalSEM in der

Biologie

„Cross beam SEM“

FIB/SEM ist eine Kombination aus gerasterter Gallium-Ionenquelle (FocusedIon Beam, FIB) mit einem hochauflösenden Rasterelektronenmikroskop.

Ionenstrahl und Elektronenstrahl kreuzen sich („cross beam“) auf der Probe.Die Abbildung der Probe kann mittels Elektronen oder mit dem FIBvorgenommen werden.

Cross beam SEM

Mit dem Ionenstrahl lässt sich gezielt die Probe an vordefinierterStelle bestrahlen. Die Ionen tragen dabei Probenmaterial ab(Ionenätzung). Damit können Schnitte der Probe senkrecht zurProbenoberfläche hergestellt werden.

Cross beam SEM

-> sequentielle Mikro-Querschnitte liefern räumliche Informationen und erlauben eine 3D-Re-konstruktion. Der Ionenätzprozess kann sogar als Film in Echtzeit mit dem REM aufgezeichnetwerden.

Typisches Volumenfür 3D-Abbildungen:

200-500 µm3

ca. 10 µm x 5 µm x 10 µm

1897 Discovery of the electron (J.J. Thompson)

1924 particle/wave dualism (P.De Broglie)

1927 Electron beams can be focused(H. Busch)

1931 the first TEM was built (M. Knoll and E. Ruska)

1935 SEM theory (M. Knoll)

1938 the first SEM was constructed(M. von Ardenne)

1939 First commercial TEM by Siemens

1951 X-ray spectroscopy (R. Castaing)

1960 Improved signal detection in SEM (Everhart & thornley)

1964 First commercial SEM by Cambridge Instruments

~1970 HRTEM microscopes with a resolution better than 4 Å

1971 first SEM with Field emission gun (Crewe & Wall)

Geschichte der Elektronenmikroskopie