Standards im infektiologischen Monitoring Martina Sester, PhD Abteilung für Transplantations- und Infektionsimmunologie Universität des Saarlandes 66421 Homburg martina.sester@uks.eu

Infektionen nach Transplantation

Fishman (2007) N Engl J Med 357: 2601

CMV BKPyV

Immunosuppression Balance zwischen Abstoßung und Infektion

Infektion

Abstoßung

Funktionelle Parameter/Tests

EBV gesteuerte Immunsuppression zur Verhinderung einer PTLD

Lee et al. (2005) Am J Transplant 5: 2222

Therapie-Algorithmus

EBV Viruslast unterhalb des Schwellenwertes

EBV Viruslast oberhalb des Schwellenwertes

in 2 Proben oder symptomatische EBV Infektion

Normale Reduktion der Immunsuppression

Schnelle Reduktion der Immunsuppression

EBV gesteuerte Immunsuppression zur Verhinderung einer PTLD

Lee et al. (2005) Am J Transplant 5: 2222

0 50 100 150 200 2500

5

10

15

20

historische Kontrolle

Therapiegruppe

Monate nach Lebertransplantation

Pat

ien

ten

mit

PTL

D [

%]

Bakker et al. (2007) Transplantation 83: 433

CMV Infektion nach Transplantation

• Direkte Manifestationen einer CMV Infektion

• Indirekte Effekte: CMV als Risikofaktor einer Abstoßung

Direkte Manifestationen der CMV Infektion

Allgemeinsymptome

• Fieber, Leukopenie, Arthralgie,

Myalgie

Gastrointestinale Symptome

• Hepatitis, Colitis, Ulcerationen

Pneumonie

Nephropathie

Neurologische Symptome

• Enzephalitis, Radikulitis

Retinitis

Indirekte Effekte auf das Transplantatüberleben

Sagedal et al. (2004) Kidney Int 66: 329

Schnitzler et al. (2003) J Am Soc Nephrol 14: 780

Kliem et al. (2008) Am J Transplant 8: 975

Maßnahmen zur Minimierung des Infektrisikos nach Transplantation

• Identifizierung von Risikofaktoren

– CMV Status von Empfänger und Spender

– Höhe und Art der Immunsuppression

• Risikoadaptierte Wahl therapeutischer und diagnostischer Strategien

– Prophylaxe

– Präemptive Therapie incl. regelmäßiges Monitoring auf Hinweis einer Infektion

Risiko einer CMV Infektion in Abhängigkeit des Serostatus

CMV Status Empfänger R

CMV Status Spender D

Risiko

Negativ Negativ Niedrig

Positiv Negativ/Positiv Moderat

Negativ Positiv Hoch

Risiko

Hochrisiko auch bei T Zell-depletierenden Antikörpern (ATG, ALG, OKT-3)

Maßnahmen zur Minimierung des Infektrisikos nach Transplantation

• Identifizierung von Risikofaktoren

– CMV Status von Empfänger und Spender

– Höhe und Art der Immunsuppression

• Risikoadaptierte Wahl therapeutischer und diagnostischer Strategien

– Prophylaxe

– Präemptive Therapie incl. regelmäßiges Monitoring auf Hinweis einer Infektion

Internationale Consensus Guidelines

Diagnostik

Prävention

Behandlung

Resistenz

Immunologie

Aspekte der Pädiatrie

Update Guidelines meeting 25.-26. Oktober 2012

Montréal, Kanada

International consensus guidelines on the management of cytomegalovirus in solid organ transplantation

Update: Kotton C.N. et al. Transplantation (2013) 96: 333

Kliem et al. (2015) Dtsch Med Wochenschr 140: 612

Diagnostik Prä-Transplant

Serologie von Spender und Empfänger zur Risikoeinschätzung

Bei seronegativem Empfänger, Wiederholung vor Transplantation

Cave: Transfusionen/Kinder < 12 Monate, im Zweifelsfall Hochrisiko annehmen

Bestimmung CMV spezifischer T Zellen

Kotton C.N. et al. Transplantation (2013) 96: 333 Kliem et al. (2015) Dtsch Med Wochenschr 140: 612

Diagnostik Post-Transplant

Quantitative Viruslastmessverfahren

– pp65 Antigenämietest

• Wenig standardisiert

• Cave bei Leukopenie

– Quantitative PCR Verfahren

• Grenzwerte wenig standardisiert

• Vollblut oder Plasma

– Cut-off muss in Kooperation mit Labor entwickelt und

evaluiert werden

Diagnose Therapiesteuerung Therapieansprechen

Kotton C.N. et al. Transplantation (2013) 96: 333 Kliem et al. (2015) Dtsch Med Wochenschr 140: 612

Nicht empfohlen

– Serologie

– ausschließlich qualitative Verfahren

– Kulturverfahren, nur in Ausnahmefällen

Diagnostik Post-Transplant

Kotton C.N. et al. Transplantation (2013) 96: 333 Kliem et al. (2015) Dtsch Med Wochenschr 140: 612

Prophylaxe

Besonders bei Hochrisikogruppen D+/R-

3-6 Monate

Medikation angepasst an Nierenfunktion (I)

- Valganciclovir

- i.v. oder oral Ganciclovir

- (Valaciclovir)

Problem: Späte CMV Erkrankung (Hybrid-Strategie)

Kotton C.N. et al. Transplantation (2013) 96: 333 Kliem et al. (2015) Dtsch Med Wochenschr 140: 612

Präemptive Therapie

Monitoring mittels (Antigenämie oder) quantitativer PCR - 1x/Woche bis 3-4 Monate nach Transplantation

Medikation in therapeutischer Dosierung - Valganciclovir

- i.v. Ganciclovir

- Ggfalls Reduktion der Immunsuppression

Monitoring unter Therapie - 1-2/Woche

- Therapiedauer ≥ 2 Wochen, bis Viruslast 2x negativ

- Ggfalls Sekundärprophylaxe

Kotton C.N. et al. Transplantation (2013) 96: 333 Kliem et al. (2015) Dtsch Med Wochenschr 140: 612

BK virus (BKPyV) • Mitglied der Polyomavirus Familie

• Infektion in der frühen Kindheit

• Persistenz in renalen Tubuluszellen

• Spontane asymptomatische Reaktivierungen bei Gesunden

• Ursache von

– Nephropathien bei Nierentransplantierten

– Hämorrhagische Zystitis bei Stammzelltransplantierten

Babel et al. (2011) Nat Rev Nephrol 7: 399

Begrifflichkeiten

Definition Befunde

Infektion Früherer oder akuter Kontakt

Serologie

Replikation Nachweis einer Virusvermehrung

Decoy Zellen Virurie, Virämie

Erkrankung Nachweis einer Gewebeschädigung

BKPyV-Replikation in Biopsie und Organdysfunktion

Decoy Zellen in der Urinzytologie

Nickeleit et al. (2000) N Engl J Med 342: 1309

BKPyV-infizierte Zellen in der Biopsie

Nickeleit et al. (2000) N Engl J Med 342: 1309

BKPyV nach Nierentransplantation

Decoy Zellen

Virämie

Nephropathie

Hirsch et al. (2002) N Engl J Med 347: 488

Nierenbiopsie • Polyomavirus-Nephropathie • Abstoßung

BKPyV-Replikation - Quantitative PCR: Im Urin >10^7 Kopien/ml oder Im Plasma >10^4 Kopien/ml

positiv

negativ Wiederholung in < 4 Wochen

Intervention nach Biopsiebefund und Klinik

Monat 1-3 4-wöchentlich Monat 4-12 4 bis 8-wöchentlich bei Transplantatdysfunktion bei geplanter Biopsie

BKPyV-Screening nach Transplantation

modifiziert nach Suwelack et al. (2012) Transplant Rev (Orlando) 26: 201

Maßnahmen zur Diagnostik und Therapie der BKPyV Infektion

Monitoring von Urin- und Plasma-Viruslast, Biopsie

Reduktion der Immunsuppression

Umstellung auf CyA oder mTOR Inhibitoren

(Cidofovir, Leflunomid, iv-Ig)

Nephrektomie

Suwelack et al. (2012) Transplant Rev 26: 201 Hirsch et al. (2014) Clin Microbiol Infect 20 Suppl 7: 74

Effekt der Umstellung der Immunsuppression

Hirsch et al. (2015) Am J Transplant 15: in press

Die Rolle der zellulären Immunität

Infektion

Abstoßung

Quantifizierung Antigen-spezifischer T Zellen nach Stimulation

T-Zelle

Vollblut/PBMC Stimuli Antigene/Peptide

APC

T cell

Aktivierung Zytokin-Induktion

6-24 Stunden

Proliferation

3-5 Tage

Quantifizierung Antigen-spezifischer T Zellen nach Stimulation

T-Zelle

Vollblut/PBMC

APC

T cell

Aktivierung Zytokin-Induktion

6-24 Stunden

IFN- release assays

Stimuli Antigene/Peptide

IFN- Release Assays

IFN- [U/ml] % IFN- positive T Zellen IFN- positive Zellen/ 200.000 PBMC

Einsatz der Immundiagnostik bei klinisch relevanten Erregern

M. tuberculosis Diagnose einer

latenten Infektion

Adenoviren Monitoring infektiöser Komplikationen

Influenzavirus Charakterisierung von

Impf-induzierten Immunantworten

VZV Epidemiologie

Monitoring infektiöser Komplikationen

BKV Epidemiologie

Monitoring infektiöser Komplikationen

Antigen-spezifische T Zellen

CMV Monitoring infektiöser Komplikationen Steuerung der antiviralen Therapie

Die T-Zell Antwort bei stabiler Erregerkontrolle

Stable T-cell immunity Viral control

T-ce

ll le

vels

/vir

al lo

ad

Primary infection Time

No replication/infection No T-cells

T-ce

ll le

vels

/vir

al lo

ad

Time

Sester et al. (2002) J Virol 76: 3748; Sester et al. (2003) Transplantation 76: 1229

13.5 14.0 14.5 15.0 15.5

0.1250.25

0.51248

163264

  

CM

V s

pe

cifi

c

CD

4 T

cells

(%

)

15.0 15.5 16.0 16.5

6.5 7.0 7.5 8.0 8.5

0.1250.25

0.51248

163264

<0.05  

CM

V s

pe

cifi

c

CD

4 T

cells

(%

)

3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

0.125

0.25

0.5

1

2

4

8

16

32

64

seropositive<0.05         

CM

V s

pec

ific

CD

4 T

cel

ls (

%)

Anwendung nach Transplantation PROPHYLAXIS

Sufficient T-cell immunity

Viral control

T-ce

ll le

vels

/vir

al lo

ad

Transplantation Time after transplantation

PROPHYLAXIS

No T-cell immunity Primary infection

T-ce

ll le

vels

/vir

al lo

ad

Transplantation Time after transplantation

D+/R- n=127

T Zellen am Ende der Prophylaxe

CMV Erkrankung

Keine Erkrankung

Manuel et al. (2013) Clin Infect Dis 56: 817

Quantiferon positiv

Quantiferon non-reaktiv

p=0.024

Anwendung zur Identifizierung von Risikopatienten und Relapse

THERAPY

Self-limited viral control Sufficient T-cell immunity

T-ce

ll le

vels

/vir

al lo

ad

Transplantation Time after transplantation

Viral reactivation Loss of T-cell immunity

T-ce

ll le

vels

/vir

al lo

ad

Transplantation Time after transplantation

THERAPY

Sustained viral control

Restoration of T-cell immunity

T-ce

ll le

vels

/vir

al lo

ad

Time after transplantation

Viral relapse

Insufficient T-cell immunity

T-ce

ll le

vels

/vir

al lo

ad

Time after transplantation

controls HD BKV neg BKV pos

0.1

1 p = 0.0002

0.01

DL

Tx patients

% B

KV

sp

eci

fic

CD

4 T

ce

lls

Anstieg BKPyV spezifischer T Zellen bei Patienten mit Virämie

Schmidt et al. (2014) Am J Transplant 14: 1334

Kontrollen Hämodialysepatienten

Tx Patienten – BKV neg Tx Patienten – BKV pos

Eingeschränkte Funktionalität BKPyV spezifischer T Zellen bei Virämie

triple positive

IFNγ and/or TNFα

IL-2 single/double

66.0% (±20.1%)

11.8% (±5.5%)

22.2% (±21.1%)

24.7% (±8.8%)

31.8% (±18.3%)

43.5% (±17.1%)

67.0% (±11.1%)

16.9% (±11.0%)

16.1% (±7.0%)

67.0% (±11.1%)

16.9% (±11.0%)

16.1% (±7.0%)

Schmidt et al. (2014) Am J Transplant 14: 1334

Mögliche Anwendungsgebiete

T-Zell Immunität als Alternative zur Serologie

Risikoabschätzung einer Virämie/Erkrankung nach Prophylaxe

Frühzeitige Identifizierung von Risikopatienten in einem präemptiven Setting

Steuerung der Therapiedauer

Zusammenfassung

Serologische Verfahren nur zur Risikoeinteilung vor Transplantation

Viruslastmessungen immer mit derselben Methode im selben Labor

Virusreplikation als Zeichen einer Überimmunsuppression

Konsequente Umsetzung der Präventionsstrategie

Erreger-spezifische T Zellimmunität als neue diagnostische Methode in Ergänzung zu Viruslastbestimmungen

Einsatz der Immundiagnostik bei klinisch relevanten Erregern

CMV Monitoring infektiöser Komplikationen Steuerung der antiviralen Therapie

M. tuberculosis Diagnose einer

latenten Infektion

Adenoviren Monitoring infektiöser Komplikationen

Influenzavirus Charakterisierung von

Impf-induzierten Immunantworten

VZV Epidemiologie

Monitoring infektiöser Komplikationen

BKV Epidemiologie

Monitoring infektiöser Komplikationen

Antigen-spezifische T Zellen

Varizella zoster virus (VZV)

• Member of the herpesvirus family

• Establishes latency after initial infection

– Primary infection – chickenpox

– Reactivation – herpes zoster (shingles)/PHN

• Zoster incidence up to 5 fold higher in transplant recipients

• Recurrence rate up to 20%

Analyse VZV spezifischer T Zellen

IFNγ IFNγ IFNγ

CD

69

CD

69

CD

69

Control-Ag VZV-Ag SEB

Co-ag VZV-ag SEB

0.1

1

10

100

p < 0.0001

******

<0.01

***

% C

D6

9+ IF

N

+ /CD

4 T-

cells

negative intermediate positive

0.1

1

<0.01

p < 0.0001

***

DL

VZV-IgG status

% V

ZV-s

pe

cifi

c C

D4

T-c

ells

Schub et al. (2015) J Infect Dis 211: 600

IFNγ+TNFα+IL-2+ ↓

IFN+ single ↑

VZV spezifische T Zellen bei akutem Herpes zoster

controls

0

20

40

60

% o

f cyto

kin

e p

osit

ive

CD

4 T

cells

zoster

0

20

40

60

% o

f cyto

kin

e p

osit

ive

CD

4 T

cells

+ + + + – – – IL-2

– + – + + – + TNFα

– – + + + + – IFNγ

+ + + + – – – IL-2

– + – + + – + TNFα

– – + + + + – IFNγ

conto

ls

zost

er

0.01

0.1

1

10

<0.001% V

ZV s

pec

ific

CD

4 T

cells

T-Zell Frequenz↑

Schub et al. (2015) J Infect Dis 211: 600

Phenotypische Veränderungen VZV spezifischer T Zellen bei akutem Zoster

CTLA-4 ↑ CD127 ↓

contro

ls

zost

er

0

20000

40000

60000

CTL

A-4

MFI

on

VZV

sp

eci

fic

CD

4 T

ce

lls

contro

ls

zost

er

0

20

40

60

80

100

% C

D1

27

+ V

ZV s

pe

cifi

c C

D4

T c

ell

s

contro

ls

zost

er

0

1000

2000

3000

PD

1 M

FI o

n V

ZV s

pe

cifi

c C

D4

T c

ell

s

PD-1 ↑

Schub et al. (2015) J Infect Dis 211: 600

Normalisation of phenotype and functionality upon resolution of symptoms

0.1

1

10

<0.01

p < 0.001

p = 0.938

zoster follow-up zoster follow-up

VZV SEB%

re

acti

ve C

D4

T-c

ells

1000

10000

<80

p = 0.938110

zoster follow-up

IgG

IgG

-le

vel (

IU/l

)

0.01 p < 0.001

0.1

0.81.1

10

100

zoster follow-up

IgA

IgA

-le

vel [

rati

o]

zoster follow-up zoster follow-up

0

20

40

60

80

p = 0.025 p = 0.492

VZV SEB

% I

FN

+IL

-2+ TN

F

+ CD

4 T-

cells

zoster follow-up zoster follow-up

0

20

40

60

80

VZV SEB

p < 0.001 p = 0.023

% I

FN

(sin

gle)

+ C

D4

T-ce

lls

102

103

104

105

p = 0.011p = 0.0001

VZV SEB

zoster follow-up zoster follow-up

CTL

A-4

MFI

102

103

104

p = 0.156p = 0.031

VZV SEB

zoster follow-up zoster follow-up

PD

-1 M

FI

0

20

40

60

80

100

p = 0.945p = 0.008

zoster follow-up zoster follow-up

VZV SEB

% C

D1

27

+

A B C

D E

F

frequency

cytokine profile

pheno- type

Schub et al. (2015) J Infect Dis 211: 600

Zoster follow-up

Eigenschaften Virus-spezifischer T Zellen bei aktiver Infektion

• Dynamik in der Frequenz

• Eingeschränkte Funktionalität

• Verstärkte Expression von PD-1, CTLA-4

• Verminderte Expression von CD127

• Verminderte Expression von CD27

CMV spezifische T Zellen zur Bestimmung der Infektionsstatus

negativ positiv

negativ

CMV negativ

positiv?

po

sitiv

Passive Immunität

CMV positiv

CMV-spezifische T Zellen zur Unterscheidung zwischen passiv positivem und tatsächlich positiven CMV Infektionsstatus

Sester et al. (2003) Transplantation 76: 1229

Plasmagabe

Schwanger-schaft

Schmidt et al. (2012) J Clin Virol 54: 272 Ritter et al. (2013) Eur J Immunol 43: 1099

Emery (2013) Eur J Immunol 43: 886

0.31%

CMV seronegative

25.51%

CD28

CD

27

CMV seropositive

0.01 0.1 1 10 1000.01

0.1

1

10

100

r=0.73p<0.0001

% CMV specific CD4 T cells after stimulation

% C

D2

8- C

D2

7- C

D4

T c

ell

s

CD28-CD27- CD4 T Zellen: Assoziation mit CMV Status

0.01% 24.24%

IFN-

CD

69

Nach spezifischer Stimulation – 500µl Vollblut, 6h

Oberflächenfärbung – 100µl Vollblut, 1h

Dirks et al. (2013) Am J Transplant 13: 3132

CD27

CD4

CD27CD27

CD

28

CD27CD27

CD4

CD27CD27

CD

28

0.31%

CMV seronegative

25.51%

CD28

CD

27

CMV seropositive

CD28-CD27- CD4 T Zellen: Assoziation mit CMV Status

0.01% 24.24%

IFN-

CD

69

Nach spezifischer Stimulation – 500µl Vollblut, 6h

Oberflächenfärbung – 100µl Vollblut, 1h

Dirks et al. (2013) Am J Transplant 13: 3132

CD27

CD4

CD27CD27

CD

28

CD27CD27

CD4

CD27CD27

CD

28

seronegative seropositive

0.01

0.1

1

10

100 ***

0.44

% C

D2

8- C

D2

7- C

D4

T-c

ell

s

AUC=0.98 sensitivity: 93% specificity: 97%