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Vom Molekül zur ZelleVom Molekül zur Zelle
Block 3Block 3
Seminar / Praktikum 1Seminar / Praktikum 1
Georg Weitzer, Ernst MüllnerMax F. Perutz Laboratories (MFPL)Department für Medizinische BiochemieMedizinische Universität Wien, Jan 2007
Diese Präsentation befindet sich auf der Lehr-Inhalts Seite desDepartments für Medizinische Biochemie unter der Adresse:
www.meduniwien.ac.at/Medbch/Teaching
LiteraturLiteratur
Ergänzung der theoretischen Grundlagen und biochemisches Praktikum im Block 3 - vom Molekül zur ZelleFacultas VerlagHans Goldenberg (Hg.)
Zellbiologie, Wiley - Verlag ChemieBruce Alberts ergänzend z.B.
Chemie erleben (Abschnitt „Analytische Chemie“),Facultas - Universitäts Taschenbuch VerlagEdgar Wawra, Helmut Dolznig, Ernst Müllner
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007
Der praktische Teil der1. Übung findet statt am:
Institut fürInstitut fürMedizinische ChemieMedizinische ChemieWähringerstraße 10Übungssaal III (Tiefparterre)
• DünnschichtchromatographieDünnschichtchromatographie• IonenaustauschchromatographieIonenaustauschchromatographie• Reversed Phase ChomatographyReversed Phase Chomatography
(apolare stationäre Phase, polares Elutionsmittel = mobile Phase)(apolare stationäre Phase, polares Elutionsmittel = mobile Phase)
• GaschromatographieGaschromatographie
• GelfiltrationGelfiltration (Größenausschluss Chromatographie)(Größenausschluss Chromatographie)
• ElektrophoreseElektrophorese• AffinitätschromatographieAffinitätschromatographie
TrennmethodenTrennmethoden
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007
Affinitätschromatographie::
z.B. Reinigung eines Enzyms aus einer komplexen Mischung von Proteinen
Praktikumsbeispiel 1Praktikumsbeispiel 1
Trennung von Aminosäuren mittels Dünnschichtchromatographie(nach ihrer Polarität)
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007
Glasröhrchen
Zellulose auf Alufolie,polare, stationäre Phase
Standard = Referenzwert
Auftragen der ProbenAuftragen der Proben
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007
Auftragen der ProbenAuftragen der Proben
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007
Laufmittel,apolar,mobile Phase
35% Azeton / 35%n-Butanol in Acetatpuffer
Dünschicht-Chromatographie-folie in Glastrogmit Laufmittelstellen
Wanderungs-richtungder Proben
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Dünnschichtchromatographie TrogDünnschichtchromatographie Trog
gelber Farbstoff = Isatin
Chemie erleben Wawra et al.
nach circa 2 Stunden:
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007
Front
Start
Markieren der
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DünschichtchromatogrammDünschichtchromatogrammnach der Färbung / Trocknungnach der Färbung / Trocknung
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Front
Start
Wanderungs-strecke dermobilenPhase
Wanderungsstreckeder Aminosäure
W(as)W(m)
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Nernstscher Verteilungssatz
Verteilungskoeffizient c =
W(as) = Rf(as)W(m)
Rf = Retentionsfaktor
[Aminosäure] stationäre Phase
[Aminosäure] mobile Phase
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Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007
AuswertungAuswertung
Nernstscher VerteilungssatzNernstscher VerteilungssatzBeschreibt die Verteilung eines Stoffes zwischen zwei miteinander nicht mischbaren Phasen (z.B. gasförmig / flüssig oder flüssig / fest oder flüssig / flüssig).
Verteilungskoeffizient c =[Br2] Chloroform
[Br2] Wasser
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Praktikumsbeispiel 2Praktikumsbeispiel 2
GelfiltrationGelfiltration
Trennung der Moleküle nach ihrer Größe
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007
GelfiltrationGelfiltration
Probe, z.B. Protein / Salz Gemisch
Poren und Kapillarenkleine Moleküle könnenhinein, haben dadurch einen längeren Weg zurückzulegen als die großen, (die außen herum schwimmen)und kommen daher späteraus der Säule heraus.
Glasfritte
kleine Moleküle
große
Fraktionen
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007
Trennung eines Trennung eines Dextranblau / MethylrotDextranblau / Methylrot Gemisches mittels GelfiltrationGemisches mittels Gelfiltration
• Sephadex G25 Säulenmaterial in Elutionspuffer äquilibriert.
• 0.5 ml der Probe (Dextranblau und Methylrot) direkt auf die gerade trockengelaufene Glasfritte auftragen.
• Wenn vollkommen ins Säulenmaterial eingedrungen, mit ca. 5 ml Elutionspuffer nachspülen, 3 mal wiederholen.
• Austretender Elutionspuffer wird in Fraktionen zu je 20 Tropfen (= ca. 1 ml) gesammelt.
• Um Methylrot sichtbar zu machen, Fraktionen mit je 1 Tropfen HCl ansäuern. Dextranblau ist blau gefärbt.
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Gelfiltrations - Chromatographie SäuleGelfiltrations - Chromatographie Säule
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Elutionspuffer in Dispenserflasche
Dextransblau / Methylrot Farbstoffmischung
Salzsäure (HCl) zum Ansäuern und Entwickeln der Rotfärbung von Methylrot
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Reagenzien für Reagenzien für die Gelfiltrationdie Gelfiltration
GelfiltrationGelfiltrationSammeln der Fraktionen
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Fraktionen nach der GelfiltrationFraktionen nach der Gelfiltration
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007
Schema der Trennung eines Schema der Trennung eines Dextranblau / Dextranblau / MethylrotMethylrot Gemisches mittels Gelfiltration Gemisches mittels Gelfiltration
Fraktionen
Fa
rbin
ten
sit
ät
Dextranblau: großes Molekül, eluiert zuerstMethylrot: kleines Molekül, kommt später aus der Säule heraus
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Praktikumsbeispiel 3Praktikumsbeispiel 3
ElektrophoreseElektrophorese
Trennung von geladenenMolekülen imelektrischen Feld
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007
Trennung und quantitative Analyse der Serumproteine
Voraussetzungen:
• Serumproteine müssen positiv oder negativ geladen sein.
• richtige Wahl des Puffers !• Trägermaterial (analog zur stationären Phase)
• Gleichstromquelle
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Arbeitsplatz ElektrophoreseArbeitsplatz Elektrophorese
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Elektrophorese ApparaturElektrophorese Apparatur
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pipettieren kleiner Voluminapipettieren kleiner Volumina
mit automatische Pipetten
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Elektrophorese - ProbenvorbereitungElektrophorese - Probenvorbereitung
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Proben aufgetragenProben aufgetragen
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Cellogel, Trägermaterial
Tröge mit Pufferlösung
PlatinElektroden
Gleichstromquelle
+
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Anode
Kathode
Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen?wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen?
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007
Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen?wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen?
Der isoelektrische Punkt pI der
Serumproteine ist ~ 5.
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007
Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen?wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen?
Der isoelektrische Punkt
pI der Serumproteine
ist ~ 5.
Daher muss der pH des Puffer > 5 sein (in der Praxis bei etwa pH = 9), damit ALLE Proteine negativ geladen werden ...
Chemie erleben, Wawra et al.
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007
... ansonsten würden der Anteil an positiv geladenen Proteinen zur Kathode wandern
Gleichstromquelle
+Proben
StandardSerum
250V30 min
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Anode
Kathode
negativ geladene Proteine(Anionen) wandern zur positivgeladenen Anode
Wanderungsrichtung
Zwischenfrage:Zwischenfrage:
• Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie Na+, K+, Ca++, Mg++ als Anionen, wie Cl-, HCO3
- ?
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007
Zwischenfrage:Zwischenfrage:
• Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie Na+, K+, Ca++, Mg++ als Anionen, wie Cl-, HCO3
- ?
• Weil die Anionenlücke durch dienegative Ladung der Proteine bei pH 7.4 ausgeglichen wird.
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007
Gleichstromquelle: 250 VGleichstromquelle: 250 V
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Nach der ElektrophoreseNach der Elektrophorese
• Färben der Proteine
• Trägermaterial durchsichtig machen
• Photometrische (densitometrische) Auswertung
• Messen der Farbstoffdichte entlang des Trägermaterials
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aufgetrennte Serumproteine
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Fläche ist proportionalder Farbmenge, also auch der Proteinmenge
Detektor
Lichtquelle
Probe wird am Detektor vorbeigezogen
Das Prinzip derDas Prinzip derAuswertung ...Auswertung ...
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E = x c x d
Küvetted = 1 cm
PrismaLichtquelle
E = log (1/T) = log (I0/I)
Detektor
II0
... beruht auf dem Lambert-Beerschen Gesetz... beruht auf dem Lambert-Beerschen Gesetz
E = Extinktion = spez. Molarer Extinktionskeoff.c = Konzentration d = Schichtdicke
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Photozelle
verwendetes Densitometer verwendetes Densitometer (ein Typ von Photometer)(ein Typ von Photometer)
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Ausdruck der ErgebnisseAusdruck der Ergebnisse
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Elektrophorese von SerumproteinenElektrophorese von Serumproteinen
Chemie erleben Wawra et al.
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diagnostischediagnostischeAussage-Aussage-möglichkeitenmöglichkeiten
(Beispiele)
für eine ausführlichere Darstellung siehe z.B. www.med4you.at/laborbefunde/lbef_ephorese_eiweiss.htm
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007
aus: “Ergänzungder theoretischen Grundlagen”,H. Goldenberg, (Hg.)
Protokoll zur Bewertung der ErgebnisseProtokoll zur Bewertung der Ergebnisse
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007
Fotos: Gelfiltration-Auswertung neufertige Aminosäure-Dünnschichtneue Ausdrucke DensitometerFoto LageplanFoto Med. Chem. Gebäude (von Homepage)
Informationen zur Protein-Elpho:www.med4you.at/laborbefunde/lbef_ephorese_eiweiss.htm
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007