Post on 28-Aug-2019
Aus dem Institut für Virologie
Zentrum für Infektionsmedizin
der Tierärztliche Hochschule Hannover
Zur Pathogenese der Klassischen Schweinepest:
Analysen der Blutgerinnungsstörungen
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Sandra Blome
aus Herne
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Volker Moennig
1. Gutachter: Prof. Dr. Volker Moennig
2. Gutachter: Prof. Dr. Ingo Nolte
Tag der mündlichen Prüfung: 31.05. 2006
Das Promotionsvorhaben wurde gefördert durch ein Stipendium
des Evangelischen Studienwerks e. V. Villigst
1 EINLEITUNG....................................................................................................... 1
2 LITERATURÜBERSICHT ................................................................................... 2
2.1 Das Virus der Klassischen Schweinepest .............................................................................................. 2
2.1.1 Taxonomie ........................................................................................................................................... 2
2.1.2 Morphologie und Genomorganisation ................................................................................................. 2
2.1.3 Virale Proteine ..................................................................................................................................... 3
2.2 Die Klassische Schweinepest .................................................................................................................. 3
2.2.1 Übertragungswege und Epidemiologie ................................................................................................ 4
2.2.2 Verlaufsformen der Klassischen Schweinepest ................................................................................... 5
2.2.3 Pathologie ............................................................................................................................................ 8
2.2.3.1 Makroskopische Veränderungen ................................................................................................ 8
2.2.3.2 Mikroskopische und ultrastrukturelle Veränderungen................................................................ 9
2.2.4 Pathogenese........................................................................................................................................ 10
2.3 Virale hämorrhagische Fieber ............................................................................................................. 18
2.3.1 Klassische Vertreter ........................................................................................................................... 19
2.3.2 Pathogenese der viralen hämorrhagischen Fieber .............................................................................. 20
2.4 Hämostase und Hämostasekomponenten ........................................................................................... 23
2.4.1 Zelluläre Bestandteile ........................................................................................................................ 24
2.4.2 Endothel ............................................................................................................................................. 25
2.4.3 Das plasmatische Gerinnungssystem ................................................................................................. 26
2.4.3.1 Der extrinsische Aktivierungsweg............................................................................................ 27
2.4.3.2 Der intrinsische Aktivierungsweg ............................................................................................ 27
2.4.3.3 Gemeinsame Endstrecke und Regulation ................................................................................. 28
2.4.4 Fibrinolyse ......................................................................................................................................... 30
2.4.5 Diagnostik des plasmatischen Gerinnungssystems - Globaltests ....................................................... 31
2.4.6 Fibrinogenkonzentration .................................................................................................................... 32
2.4.7 Disseminierte intravasale Gerinnung ................................................................................................. 33
2.5 Pharmakologische Beeinflussung des Gerinnungssystems................................................................ 36
2.5.1 Direkt wirkende Antikoagulantien ..................................................................................................... 36
2.5.1.1 Hirudin...................................................................................................................................... 36
2.5.2 Hemmstoffe der Thrombozytenaggregation bzw. –funktion ............................................................. 37
2.5.2.1 Acetylsalicylsäure..................................................................................................................... 37
2.5.2.2 Abciximab ................................................................................................................................ 37
2.5.2.3 Tirofiban................................................................................................................................... 38
2.5.2.4 Clopidogrel ............................................................................................................................... 38
3 MATERIAL UND METHODEN.......................................................................... 39
3.1 Tiere und Material................................................................................................................................ 393.1.1 Tiere und Versuchsaufbau.................................................................................................................. 39
3.1.2 Pharmakologisch wirksame Substanzen ............................................................................................ 44
3.1.3 Gewinnung und Aufbereitung der Blutproben................................................................................... 45
3.1.4 Viren .................................................................................................................................................. 45
3.1.5 Diagnostische Antikörper .................................................................................................................. 46
3.1.6 Zelllinien ............................................................................................................................................ 46
3.1.7 Sonstige Materialien .......................................................................................................................... 47
3.2 Methoden............................................................................................................................................... 48
3.2.1 Behandlung der Versuchstiere und klinische Parameter .................................................................... 48
3.2.1.1 Applikation und Dosierung der eingesetzten Pharmaka........................................................... 48
3.2.1.2 Bestimmung des Clinical Score nach MITTELHOLZER et al. (2000).................................... 48
3.2.1.3 Erfassung der Körpertemperatur............................................................................................... 49
3.2.1.4 Erfassung pathologisch-anatomischer Veränderungen............................................................. 49
3.2.2 Virologische Methoden...................................................................................................................... 49
3.2.2.1 Zellkulturtechnik ...................................................................................................................... 49
3.2.2.2 Virusvermehrung und Virusernte ............................................................................................. 50
3.2.2.3 Virusisolierung ......................................................................................................................... 51
3.2.2.4 Virustitration ............................................................................................................................ 52
3.2.2.5 Virusneutralisationstest ............................................................................................................ 53
3.2.2.6 Direkte Immunfärbung (Peroxidase-linked assay, PLA).......................................................... 54
3.2.2.7 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)......................................................................... 55
3.2.2.8 Polymerasekettenreaktion (PCR).............................................................................................. 56
3.2.3 Hämatologische Methoden................................................................................................................. 58
3.2.3.1 Parameter des weißen Blutbildes.............................................................................................. 58
3.2.3.2 Thrombozytenparameter........................................................................................................... 58
3.2.4 Hämostaseologische Methoden.......................................................................................................... 59
3.2.4.1 Prothrombinzeit (Quick-Test)................................................................................................... 59
3.2.4.2 Aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) ....................................................................... 60
3.2.4.3 Thrombinzeit ............................................................................................................................ 61
3.2.4.4 Fibrinogenbestimmung............................................................................................................. 62
3.2.4.5 Ethanol-Gelation-Test (EGT) ................................................................................................... 64
3.2.4.6 Thrombozytenaggregationstest................................................................................................. 65
3.2.5 Pharmakokinetik ................................................................................................................................ 67
3.2.6 Statistik .............................................................................................................................................. 69
3.2.7 Sonstige Methoden............................................................................................................................. 69
3.2.7.1 Ecarin Clotting Time ................................................................................................................ 69
3.2.7.2 Einzelfaktorenbestimmung....................................................................................................... 70
3.2.7.3 Histopathologische Untersuchungen ........................................................................................ 71
4 ERGEBNISSE................................................................................................... 73
4.1 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit KSPV- Stamm CSF0634 ............................... 73
4.1.1 Clinical Score und Körpertemperatur ................................................................................................ 73
4.1.2 Pathologisch-anatomische Befunde ................................................................................................... 76
4.1.3 Histopathologie .................................................................................................................................. 76
4.1.4 Virus-, Antigen- und Antikörpernachweis ......................................................................................... 78
4.1.5 Hämatologische Parameter................................................................................................................. 79
4.1.6 Hämostaseologische Parameter.......................................................................................................... 84
4.2 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin ............. 93
4.2.1 Nachweis des therapeutischen PEG-Hirudinspiegels......................................................................... 93
4.2.2 Nachweis der Infektion ...................................................................................................................... 93
4.2.3 Entwicklung der Körpertemperatur.................................................................................................... 93
4.2.4 Dokumentation der klinischen Symptome ......................................................................................... 94
4.2.5 Erfassung der pathologisch-anatomischen Befunde........................................................................... 96
4.2.6 Ergebnisse der hämatologischen Untersuchungen ............................................................................. 98
4.2.6.1 Gesamtleukozytenzahl.............................................................................................................. 98
4.2.6.2 Thrombozytenzahl und Thrombozytenparameter..................................................................... 99
4.2.6.3 Hämostaseologische Parameter .............................................................................................. 101
4.3 Pharmakokinetische Vorversuche in vitro und in vivo .................................................................... 105
4.4 Untersuchungen zur Rolle der Plättcheninteraktionen mittels Clopidogrel und ASS ................. 107
4.4.1 Nachweis der Wirkung..................................................................................................................... 107
4.4.2 Nachweis der Infektion .................................................................................................................... 107
4.4.3 Entwicklung der Körpertemperatur.................................................................................................. 108
4.4.4 Dokumentation der klinischen Symptome ....................................................................................... 108
4.4.5 Erfassung der pathologisch-anatomischen Befunde......................................................................... 110
4.4.6 Ergebnisse der hämatologischen Untersuchungen ........................................................................... 110
4.4.6.1 Gesamtleukozytenzahl............................................................................................................ 110
4.4.6.2 Thrombozytenzahl .................................................................................................................. 112
4.4.6.3 Hämostaseologische Parameter .............................................................................................. 113
5 DISKUSSION .................................................................................................. 116
5.1 Auswahl und Virulenz des KSPV-Isolates........................................................................................ 117
5.2 Charakteristika der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634 .............................................................. 117
5.3 Auswirkungen der Hemmung des plasmatischen Gerinnungssystems .......................................... 123
5.4 Auswirkungen der Thrombozytenaggregationshemmung.............................................................. 124
5.5 Schlussfolgerungen ............................................................................................................................. 128
5.5.1 Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems und einer disseminierten intravasalen Gerinnung.... 128
5.5.2 Rolle der Thrombozyten und Thrombozyteninteraktionen .............................................................. 131
5.6 Ausblick ............................................................................................................................................... 134
6 ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................. 135
7 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................ 139
8 ANHÄNGE ...................................................................................................... 167
8.1 Tabellen und Abbildungen................................................................................................................. 167
8.2 Zusammensetzung der verwendeten Medien und Reagenzien ....................................................... 173
8.2.1 Zellkulturmedien.............................................................................................................................. 173
8.2.2 Lösungen und Reagenzien ............................................................................................................... 174
8.3 Sonstige Chemikalien ......................................................................................................................... 177
8.4 Pharmakologisch wirksame Substanzen........................................................................................... 178
8.5 Kommerzielle Reagenzien und Kits .................................................................................................. 179
8.6 Geräte und Gebrauchsgegenstände................................................................................................... 180
8.7 Verbrauchsmittel ................................................................................................................................ 183
8.8 Abbildungsverzeichnis........................................................................................................................ 185
8.9 Tabellenverzeichnis ............................................................................................................................ 187
DANKSAGUNG ..................................................................................................... 189
Abkürzungsverzeichnis
A. bidest. Aqua bidestillata, zweifach destilliertes Wasser
ADP Adenosindiphosphat
AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazol
α alpha
α1-PI α1-Proteaseinhibitor
α2-AP α2-Antiplasmin
α2-MG α2-Makroglobulin
APACT automated platelet and coagulation tracer
aPTT aktivierte partielle Thromboplastinzeit
ASP Afrikanische Schweinepest
ASPV Virus der Afrikanischen Schweinepest
ASS Acetylsalicylsäure
ATV adjusted trypsin-versen
BD Border Disease
BDV Border Disease Virus
BMHC-Zellen bone marrow hematopoietic cells
bp Basenpaare
BSA Bovines Serumalbumin
BVD Bovine Virus Diarrhoe
BVDV Bovines Virus Diarrhoe Virus
cDNA komplementäre DNA
CO2 Kohlenstoffdioxid
COX Cyclooxygenase
CS Clinical Score
CSFV Classical Swine Fever Virus, Virus der Klassischen
Schweinepest
Da Dalton
DIC disseminated intravascular coagulation, disseminierte
intravasale Gerinnung
DIF direkte Immunfärbung
DIN Deutsches Institut für Normung
Abkürzungsverzeichnis
DNA Deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure
dNTPs Didesoxynukleotidtriphosphate
ECT Ecarin Clotting Time
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EDulb EMEM modifiziert nach DULBECCO und FREEMAN
EGT Ethanol-Gelation-Test
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
EMEM Eagle´s Minimum Essential Medium
et al. et alii, und andere
EU Europäische Union
EURL Europäisches Referenzlabor für Klassische Schweinepest
FKN fetale Kälbernierenzellen
FKS fetales Kälberserum
fl Femtoliter
g Erdanziehungskonstante
G Giga
GPIIb/IIIa Glykoprotein IIb/IIIa, Integrin der
Thrombozytenmembran
H2O Wasser
H2O2 Wasserstoffperoxid
HE Hämatoxylin/Eosin
HE-Färbung Hämatoxylin-Eosin-Färbung
HMWK High Molecular Weight Kininogen
i.v. intravenös
IL Interleukin
κ kappa
kb Kilobasen
KID50 kulturinfektiöse Dosis50
KSP Klassische Schweinepest
KSPV Virus der Klassischen Schweinepest
Lnn. Lymphonodi, Lymphknoten
log10 Logarithmus zur Basis 10
LPS Lipopolysaccharid
Abkürzungsverzeichnis
M Molarität
mAk monoklonaler Antikörper
µl Mikroliter
µm Mikrometer
min Minute
MW Mittelwert
N Normalität
NaCl Natriumchlorid
nAk neutralisierender Antikörper
NaOH Natronlauge
ND50 Neutralisationsdosis50
NFκB Nuclear Factor κB (Transkriptionsfaktor)
nm Nanometer
nt Nukleotide
NTR nicht-translatierte Region
OIE Office International des Èpizooties, internationales
Tierseuchenamt
ORF Open reading frame, offener Leserahmen
p.i. post infectionem, nach der Infektion
p.o. per os
Pa Pascal
PAF plättchenaktivierender Faktor
PAI Plasminogenaktivatorinhibitor
PALS periarterielle lymphatische Scheiden
PBS phosphate buffered saline
PBSM phosphat buffered saline minus
PCR polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion
PEG Polyethylenglykol
PK(15)A Porzine Zelllinie, porcine kidney (15) Amsterdam
PLA peroxidase linked assay
pmol Picomol
PO Peroxidase
PPP platelet poor plasma, plättchenarmes Plasma
Abkürzungsverzeichnis
PRP platelet rich plasma, plättchenreiches Plasma
RNA Ribonucleic acid, Ribonukleinsäure
RT Reverse Transkriptase
RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
sec Sekunde
SFT-R permanente Schafthymuszelllinie
TF Tissue factor, Gewebefaktor
TFPI Tissue Factor Pathway Inhibitor
TNF-α Tumornekrosefaktor α
t-PA tissue-type plasminogen activator
TXA2 Thromboxan A2
ut-PA urokinase-type plasminogen activator
VEGF vascular endothelial cell growth factor
VNT Virusneutralisationstest
vWF von-Willebrand-Faktor
1 Einleitung
Die Klassische Schweinepest (KSP) ist eine weltweit vorkommende, verlustreiche Tierseuche
mit großer handelspolitischer und ökonomischer Relevanz. Sie zählt zu den Krankheiten, die
beim internationalen Tierseuchenamt, dem Office International des Épizooties (OIE), und in
allen europäischen Staaten, anzeigepflichtig sind. Die KSP wird durch ein kleines, behülltes
RNA-Virus aus dem Genus Pestivirus hervorgerufen. Natürliche Wirte des Virus sind
ausschließlich Haus- und Wildschweine.
Die akute Verlaufsform der Infektion mit dem KSP-Virus (KSPV) geht mit den klinischen
Symptomen und pathologisch-anatomischen Befunden eines viralen hämorrhagischen Fiebers
einher, wie man sie auch bei Ebola- oder Hantavirusinfektionen des Menschen beobachten
kann. Bis heute ist die Pathogenese dieser Erkrankung nicht hinreichend geklärt.
Die klinischen Symptome der KSP wurden in den 1970er Jahren im Sinne einer
disseminierten intravasalen Gerinnung bzw. einer Verbrauchskoagulopathie gedeutet. In
jüngerer Zeit konnte jedoch gezeigt werden, dass andere Mechanismen beteiligt sind, und eine
Fehlregulierung des plasmatischen Gerinnungssystems, die mit der disseminierten
intravasalen Gerinnung gemeinhin verknüpft wird, nicht die Hauptursache für die Entstehung
der Blutungen zu sein scheint.
Im Rahmen dieser Arbeit sollen die pathogenetischen Mechanismen der Gerinnungsstörungen
sowie der Haut- und Organblutungen näher untersucht und charakterisiert werden. Zu diesem
Zweck wurden zwei Versuchsansätze gewählt, die die pharmakologische Intervention an
unterschiedlichen Stellen der Hämostase vorsahen.
2 Literaturübersicht
2.1 Das Virus der Klassischen Schweinepest
2.1.1 Taxonomie
Das Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV) wird mit den Erregern der Border Disease
der Schafe (BD) und der Bovinen Virus Diarrhoe (BVD) in das Genus Pestivirus der Familie
Flaviviridae eingruppiert (WENGLER et al., 1995; RICE, 1996; PRINGLE, 1999).
Zur Familie Flaviviridae gehören neben dem Genus Pestivirus die Genera Flavivirus und
Hepacivirus (PRINGLE, 1999). Das Genus Hepacivirus enthält ausschließlich das Virus der
Hepatitis C (BARTENSCHLAGER und LOHMANN, 2000). In das Genus Flavivirus sind
u. a. das Dengue-Virus, das Virus der Frühsommer-Meningoenzephalitis, das West-Nile-
Virus und das Gelbfiebervirus sowie das veterinärmedizinisch relevante Louping-Ill-Virus
eingruppiert. Einige dieser Erkrankungen können mit hämorrhagischen Symptomen
einhergehen. Zu den klassischen viralen hämorrhagischen Fiebern zählen u. a. das Dengue
Haemorrhagic Fever und das Gelbfieber (BRAY, 2005).
2.1.2 Morphologie und Genomorganisation
Das KSPV ist ein behülltes, ikosaedrisches RNA-Virus. Der Durchmesser des vollständigen
Viruspartikels beträgt zwischen 40 und 60 nm (HORZINEK et al., 1967; MOENNIG und
PLAGEMANN, 1992a; WENGLER et al., 1995).
Das Genom liegt in Form eines einzelsträngigen, linearen RNA-Moleküls vor, welches
Plusstrangorientierung besitzt. Das Genom besitzt eine durchschnittliche Länge von 12,5 kb
und kodiert in einem einzigen offenen Leserahmen („open reading frame“ - ORF) für ein
hypothetisches Polyprotein von ca. 4000 Aminosäuren, das sowohl post- als auch
kotranslational prozessiert wird. Nach den Prozessierungsschritten durch virale und zelluläre
Enzyme liegen elf virale Proteine vor. Der ORF wird von zwei nicht-translatierten Regionen
(NTR) flankiert (RÜMENAPF et al., 1991; COLLETT, 1992; RÜMENAPF et al., 1993;
MEYERS und THIEL, 1996).
2 Literaturübersicht 3
Abbildung 2-1: Genomorganisation von Pestiviren. Strukturproteine sind in dunkelblau,
Nichtstrukturproteine in hellblau dargestellt (modifiziert nach MEYERS und THIEL, 1996). Die
unterschiedliche Breite der Rechtecke symbolisiert ohne direkte oder indirekte Skalierung die
unterschiedlichen Längen der Proteine im Genom.
2.1.3 Virale Proteine
Das Genom kodiert vom 5´- zum 3´-Terminus für die Proteine Npro
, C, Erns
, E1, E2, p7,
NS2-3, NS4A sowie NS5A und NS5B (Abbildung 2-1). Zu den Strukturproteinen, die das
Viruspartikel bilden, gehören die Proteine C, Erns
, E1 und E2. Während das Core-Protein C
das Nukleokapsid bildet, besteht die Virushülle aus den Glykoproteinen Erns
, E1 und E2
(THIEL et al., 1991).
Das Nichtstrukturprotein Npro
ist charakteristisch für das Genus Pestivirus und besitzt
autoproteolytische Aktivität (WISKERCHEN et al., 1991; STARK et al., 1993; TRATSCHIN
et al., 1998). Die anderen Nichtstrukturproteine p7, NS2-3, NS4A sowie NS5A und NS5B
nehmen unterschiedliche, zum Teil nicht im Detail bekannte Funktionen in der
Virusreplikation wahr (MEYERS et al., 1989; GREISER-WILKE et al., 1992a; ELBERS et
al., 1996; STEFFENS et al., 1999; HARADA et al., 2000; TAUTZ et al., 2000).
2.2 Die Klassische Schweinepest
Die KSP zählt zu den wichtigsten Tierseuchen weltweit und ist daher sowohl in allen Staaten
der Europäischen Union (EU) als auch bei der OIE anzeigepflichtig. Das Virus ist weltweit
verbreitet, wurde jedoch in einigen Ländern erfolgreich bekämpft. So sind z. B. Australien
und Neuseeland sowie die USA KSPV-frei (VAN OIRSCHOT, 1999; EDWARDS et al.,
2000). Aktuelle Informationen wurden dem Handistatus der OIE entnommen
(http://www.oie.int/hs2/report.asp, besucht am 18.12. 2005).
5´ 3´
Strukturproteine
Npro C Erns E1 E2 p7 NS2-3 NS4A NS4B NS5A-B
NS2 NS3 NS5A NS5B
2 Die Klassische Schweinepest 4
Der Ursprung der KSP ist nicht genau festzulegen (VAN OIRSCHOT, 1999), ein Bericht des
Bureau of Animal Industry (United States Department of Agriculture) aus dem Jahre 1887
weist jedoch darauf hin, dass die KSP erstmals 1833 in Ohio, USA offiziell festgestellt wurde
(LIESS, 1981). Im Jahre 1903 wurde der Erreger als filtrierbares Virus nachgewiesen (DE
SCHWEINITZ und DORSET, 1904).
Natürliche Wirte des KSPV, die an KSP erkranken, sind ausschließlich Haus- und
Wildschweine (LIESS, 1981; LADDOMADA, 2000). Von subklinischen Infektionen wurde
auch bei Kälbern, Ziegen, Schafen, Hirschen und Pekaris berichtet (LOAN und STORM,
1968).
2.2.1 Übertragungswege und Epidemiologie
Unter natürlichen Bedingungen scheint die oronasale Infektion mit dem KSPV die wichtigste
Übertragungsroute darzustellen (DUNNE, 1970; PATON und GREISER-WILKE, 2003b).
Die künstliche Besamung bzw. der Deckakt stellen ebenfalls mögliche Infektionswege dar
(FLOEGEL et al., 1998; DE SMIT et al., 1999), was auch retrospektive Studien zum
Seuchengeschehen 1997/98 in den Niederlanden zeigten (HENNECKEN et al., 2000). Das
Virus wird im Verlaufe der Erkrankung mit allen Sekreten und Exkreten, wie Urin, Kot,
Speichel und Tränenflüssigkeit ausgeschieden und kann bei infizierten, tragenden Sauen die
Plazentarschranke überschreiten und somit die Feten in der Gebärmutter infizieren (DAHLE
und LIESS, 1992a; VAN OIRSCHOT, 1999).
Direkter Kontakt zwischen infizierten und empfänglichen Schweinen ist als Hauptweg der
Virusausbreitung anzusehen (RIBBENS et al., 2004). Sowohl die (illegale) Verfütterung nicht
ausreichend erhitzter Speiseabfälle als auch mechanische Vektoren wie Transportfahrzeuge
und Stallgeräte spielen bei der Verbreitung des KSPV ebenfalls eine Rolle (VAN
OIRSCHOT, 1999). Die retrospektive Analyse der KSP-Epidemie in den Niederlanden
1997/98 sowie die Quantifizierung der Übertragungsraten zeigten, dass dem Transport
lebender Tiere die größte Bedeutung zukam, gefolgt von Transportfahrzeugen und
Personenkontakt (STEGEMAN et al., 2002).
In Ländern mit endemischem KSP-Krankheitsgeschehen in der Wildschweinpopulation,
kommt dem Eintrag des Virus in Hausschweinbestände durch infizierte Wildschweine eine
wichtige Rolle zu (DAHLE und LIESS, 1992a; KADEN, 1998; KERN et al., 1999;
2 Literaturübersicht 5
LADDOMADA, 2000; FRÖLICH et al., 2002). Neben der oben erwähnten illegalen
Fütterung von Speiseabfällen ist der direkte oder indirekte Kontakt mit infizierten
Wildschweinen die häufigste Ursache für primäre KSP-Ausbrüche in Hausschweinbeständen
(FRITZEMEIER et al., 2000). Infizierte Wildschweine stellen daher eine ständige
Infektionsgefahr für die Hausschweinpopulation dar (MOENNIG, 2000).
2.2.2 Verlaufsformen der Klassischen Schweinepest
Die KSP kann mit einer Vielzahl von Symptomen einhergehen, die äußerst variabel auftreten
und kaum spezifisch sind. Die Ausprägung der Symptome wird durch verschiedene Faktoren
sowohl des Wirtes, als auch des Virus beeinflusst. So ist das Krankheitsbild stark vom Alter
der betroffenen Tiere abhängig. Weitere Faktoren sind die Virulenz des KSPV-Stammes
sowie Wirtsfaktoren, wie Immunstatus und Sekundärinfektionen (VAN OIRSCHOT, 1999;
MOENNIG et al., 2003). Die Inkubationszeit beträgt für das Einzeltier etwa eine Woche,
wobei zwei bis zehn Tage oder noch längere Zeiträume möglich sind.
Prinzipiell können drei Verlaufsformen der KSP unterschieden werden: Die akute, die
chronische und die pränatale Form. Unter Feldbedingungen sind diese Verlaufsformen nicht
immer gut zu trennen, da verschiedene Krankheitsbilder in einem Bestand nebeneinander
auftreten können (DEPNER et al., 1996a).
Akute Verlaufsform
Die akute Verlaufsform betrifft vor allem Absatzferkel und junge Mastschweine, wenn diese
mit moderaten oder hochvirulenten KSPV-Stämmen in Berührung kommen. Zu den ersten
Anzeichen der akuten KSPV-Infektion gehören hohes Fieber (häufig über 41°C),
Abgeschlagenheit, verminderte Futteraufnahme und Bindehautentzündungen (DUNNE,
1970). Viele Tiere stehen mit aufgekrümmtem Rücken und gesenktem Kopf, wenn sie
aufgetrieben werden (VAN OIRSCHOT, 1999) und legen sich rasch wieder ab, wobei sie
Wärme suchend in Stapeln aufeinander liegen. Geschwollene Lymphknoten, die vor allem in
der Leistengegend sichtbar werden, sowie Atemwegsbeschwerden wie Husten, Niesen und
Atemgeräusche treten hinzu. Während der ersten Phase des hohen Fiebers zeigen die
betroffenen Tiere häufig Erbrechen, Hyperämie der Haut und Verstopfung (VAN
OIRSCHOT, 1999). Im weiteren Verlauf tritt schwerer Durchfall auf. Im Verlauf der
2 Die Klassische Schweinepest 6
Erkrankung können zentralnervöse Symptome auftreten, die sich in Hinterhandschwäche,
unkoordinierten Bewegungen, Lähmungen oder Krämpfen äußern können (MOENNIG et al.,
2003). In der Spätphase der Erkrankung können punktförmige (Petechien) und flächige
(Ekchymosen) Blutungen in der Haut sowie unregelmäßig blaurote Verfärbungen an Ohren,
Schwanz und im Bereich der Gliedmaßen und des Unterbauchs auftreten (VAN OIRSCHOT,
1999; MOENNIG et al., 2003). Die betroffenen Tiere versterben in der Regel zehn bis 20
Tage nach der Infektion.
Labordiagnostisch ist eine schwere Leukopenie zu finden. Die dadurch bedingte
Immunsuppression ist verantwortlich für teils schwere Sekundärinfektionen der Lunge bzw.
des Magen-Darm-Traktes (SCHMIDT und KAADEN, 1968; VAN OIRSCHOT, 1999). Diese
Symptome überlagern häufig die typischen Schweinepestanzeichen, was unter
Feldbedingungen zu Problemen in der Diagnose führen kann (DEPNER et al., 1999;
MOENNIG et al., 2003). Neben der Leukopenie tritt eine schwere Thrombozytopenie auf
(DUNNE, 1970).
Bei letal verlaufenden KSPV-Infektionen werden keine oder nur geringe Mengen
neutralisierender Antikörper gebildet, die ggf. kurz vor dem Verenden der Tiere nachweisbar
sind (RESSANG, 1973a; LIESS et al., 1977; DEPNER et al., 1994).
Neben dieser typischen akuten Verlaufsform treten auch perakute und subakute bzw.
transiente Verläufe auf. Die perakute Verlaufsform kann bei jungen Ferkeln auftreten, die
nach einer kurzen Phase hohen Fiebers plötzlich versterben (DUNNE, 1970). Untersucht man
diese Tiere, sind in der Regel ausschließlich Schocksymptome zu verzeichnen
(TRAUTWEIN, 1988). Transiente, oft subklinische Verläufe, die mit der vollständigen
Genesung der Tiere enden, treten bei älteren Mastschweinen oder Zuchttieren sowie im
Zusammenhang mit schwach virulenten Virusstämmen auf. Nach einer kurzen Phase milder
klinischer Symptome bilden diese Tiere eine effektive Immunantwort aus. Während ein
Antigen- bzw. Virusnachweis in diesen Fällen zeitweilig möglich ist, deuten die klinischen
Befunde nicht auf eine KSPV-Infektion hin. Dieser Umstand hat zur Bezeichnung „atypische“
Verlaufsform geführt (DAHLE und LIESS, 1992b; DEPNER et al., 1996a).
2 Literaturübersicht 7
Chronische Verlaufsform
Die chronische Verlaufsform tritt auf, wenn die betroffenen Tiere nicht in der Lage sind, eine
adäquate und effektive Immunantwort auszubilden. Sie ist gekennzeichnet durch eine
Krankheitsdauer von mehr als 30 Tagen (MENGELING und PACKER, 1969) und ist häufig
mit moderat virulenten KSPV-Stämmen assoziiert (VAN OIRSCHOT, 1999). Während der
Erkrankung, die in diesem Fall einen protrahierten Verlauf nimmt, zeigen die Tiere
abwechselnd Phasen akuter klinischer Erkrankung und zeitweiliger Besserung (DEPNER et
al., 1996a; DEPNER et al., 1996b). Chronisch erkrankte Schweine können mehrere Monate
überleben, die Erkrankung endet jedoch immer tödlich (MENGELING und PACKER, 1969;
VAN OIRSCHOT, 1999). Unspezifische Krankheitszeichen wie Mattigkeit und Fressunlust,
wiederkehrende Fieberschübe, Hautveränderungen, chronische Darmentzündungen und
fortschreitende Auszehrung sind im Verlauf der Erkrankung zu verzeichnen. Jungtiere sind in
ihrer Entwicklung gestört und kümmern (VAN OIRSCHOT, 1999; MOENNIG et al., 2003).
Pränatale Infektion
Das KSPV ist in der Lage, die Plazentarschranke tragender Sauen zu überschreiten (VAN
OIRSCHOT und TERPSTRA, 1977). Während die Infektion bei der Sau häufig mild oder
subklinisch verläuft, hängen die Folgen für die Feten vom Entwicklungsstadium und der
Virulenz des Erregers ab (MOENNIG und PLAGEMANN, 1992b). In der frühen Phase der
Trächtigkeit führt eine KSPV-Infektion meistens zu Aborten bzw. Totgeburten, aber auch zu
Mumifikationen und Missbildungen. Eine Infektion zwischen dem 50. und 70. Tag der
Trächtigkeit kann zur Geburt persistierend infizierter Ferkel führen (VAN OIRSCHOT und
TERPSTRA, 1977; MEYER et al., 1981). Diese Ferkel können bei der Geburt gesund
erscheinen, zeigen jedoch im weiteren Verlauf die so genannte Spätform („late onset“) der
KSP und verenden schließlich. Wachstumsstörungen, Kümmern, Bindehautentzündungen,
Hautentzündungen und Bewegungsstörungen stehen dabei im Vordergrund. An der Spätform
erkrankte Tiere können bis zu elf Monate überleben und scheiden konstant große Mengen an
Virus aus, was sie zu einer bedeutsamen Gefahr für andere Schweine werden lässt (VAN
OIRSCHOT und TERPSTRA, 1977). Nach dem 85. Tag der Trächtigkeit infizierte Ferkel
werden i. d. R. nicht virämisch geboren (MOENNIG und PLAGEMANN, 1992b).
2 Die Klassische Schweinepest 8
2.2.3 Pathologie
2.2.3.1 Makroskopische Veränderungen
Die Ausprägung des pathologischen Bildes hängt vom Alter der Tiere, dem
Infektionszeitpunkt und vom involvierten KSPV-Stamm ab. Das typische pathologisch-
anatomische Bild der akuten KSPV-Infektion ist geprägt durch multiple Blutungen
unterschiedlichen Ausmaßes in nahezu allen Organen und durch Entzündungssymptome
katarrhalischen, fibrinösen und hämorrhagischen Charakters, die sich v. a. in der Lunge, im
Magen-Darm-Trakt sowie im Urogenitaltrakt finden (RÖHRER und PEHL, 1960). Die
Entzündungssymptome sind nicht selten die Folge sekundärer Infektionen (VAN
OIRSCHOT, 1999). RÖHRER und PEHL (1960) beschreiben das Sektionsbild als
hämorrhagische Septikämie, deren charakteristische Blutungen auf eine Permeabilitätsstörung
im Blutgefäßsystem hindeuten.
Die augenfälligsten Befunde treten in Lymphknoten und Nieren auf. Die Lymphknoten sind
hochgradig vergrößert, ödematös und in vielen Fällen hämorrhagisch infarziert. In den Nieren
sind petechiale und ekchymatöse Blutungen häufig, die vor allem die Nierenrinde, seltener
auch das Nierenmark und die Hilusregion betreffen und vielfach von einer lehmartigen Farbe
des Parenchyms begleitet sind (RÖHRER und PEHL, 1960; VAN OIRSCHOT, 1999).
Ein pathologisch-anatomischer Befund, der als fast pathognomonisch für die KSP angesehen
wird, jedoch nicht immer auftritt, sind Milzrandinfarkte (RÖHRER und PEHL, 1960;
TRAUTWEIN, 1988; VAN OIRSCHOT, 1999).
Nekrotische, durch Infarkte hervorgerufene Herde treten nicht selten in den Tonsillen auf, wo
sie durch bakterielle Besiedlung zu eitrigen Entzündungen führen (DUNNE, 1970; VAN
OIRSCHOT, 1999; QUEZADA et al., 2000). Ein typischer Befund, welcher durch
Sekundärinfektionen mit bakteriellen Erregern hervorgerufen wird, sind schwere
katarrhalisch-eitrige und fibrinöse Pneumonien, die in einigen Fällen von interstitiellen
Ödemen begleitet sind (RÖHRER und PEHL, 1960). Eine nicht-eitrige Enzephalitis ist in fast
allen Fällen nachweisbar (RÖHRER und PEHL, 1960; GRUBER et al., 1995).
Chronisch erkrankte Schweine zeigen weniger ausgeprägte Befunde. Hämorrhagien und
Infarkte können vollständig fehlen. Charakteristische Befunde sind Thymusatrophie und
Lymphozytendepletion in peripheren lymphatischen Organen (VAN OIRSCHOT, 1999). Bei
chronisch erkrankten Tieren ist eine Hyperplasie der Nebennierenrinde charakteristisch
2 Literaturübersicht 9
(CHEVILLE und MENGELING, 1969; VAN DER MOLEN und VAN OIRSCHOT, 1981).
Nekrotische und ulzerative Veränderungen in der Darmwand sind ebenfalls häufig mit der
chronischen Verlaufsform assoziiert. Diese so genannten „Boutons“ treten v. a. in Zäkum und
Kolon auf und bilden kraterförmige Ulzerationen. Ossifikationsdefekte bzw. Läsionen im
Bereich von Knorpel-Knochen-Übergängen treten v. a. an den Rippen als deutliche
Auftreibungen mit heller Streifung zu Tage (DUNNE, 1970; TEIFKE et al., 2002).
2.2.3.2 Mikroskopische und ultrastrukturelle Veränderungen
Das Ausmaß der histopatholgischen Veränderungen steht ebenfalls in Beziehung zur Virulenz
des beteiligten KSPV-Stammes. Eine generalisierte Vaskulitis und Lymphozytennekrose
sowie Enzephalitis ist für die Infektion mit hochvirulenten KSPV-Stämmen charakteristisch
(NARITA et al., 2000). Die genannten Läsionen konnten mit der Lokalisation des Antigens in
Verbindung gebracht werden. Die Lymphozytendepletion betrifft v. a. die B-Lymphozyten
(SUSA et al., 1992; QUEZADA et al., 2000).
Die oben beschriebenen makroskopischen Veränderungen in den Lymphknoten korrellieren
mit einer ausgeprägten Lymphozytendepletion und retikulärer Hyperplasie im histopatho-
logischen Bild (VAN OIRSCHOT, 1999). Kleinste Gefäße können Thrombosierungen,
Nekrosen und fibrinoide Quellungen zeigen. Größere Gefäße sind dagegen nicht betroffen
(RÖHRER und PEHL, 1960).
Mit den makroskopischen Veränderungen in den Nieren korrespondiert ein Blutaustritt in das
Nierenparenchym aus interstitiellen Kapillaren, die Glomeruli scheinen hingegen nicht
betroffen. Die Kapillarschlingen können fibrinoide Veränderungen zeigen, was sekundär zu
einer Verödung der Glomeruli führt (RÖHRER und PEHL, 1960). QUEZADA et al. (2000)
beschreiben Hämorrhagien und Mikrothromben vor allem in glomerulären Kapillaren.
Die Milzrandinfarkte zeigen sich im histopathologischen Bild als gemischte Infarkte mit
ischämischer zentraler Nekrose und sekundär ausgebildetem hämorrhagischen Hof.
Mikrothromben und hyalinisierende Veränderungen in arteriellen Endothelien wurden in
diesem Zusammenhang von QUEZADA et al. (2000) beschrieben. In dieser Arbeit wurden
auch Fibrinnetze in der roten Pulpa nachgewiesen (QUEZADA et al., 2000).
Fast alle KSPV-infizierten Schweine zeigen eine nicht-eitrige Enzephalitis, deren
Hauptcharakteristikum perivaskuläre Infiltrationen sind (RÖHRER und PEHL, 1960;
GRUBER et al., 1995; VAN OIRSCHOT, 1999; QUEZADA et al., 2000).
2 Die Klassische Schweinepest 10
In den Krypten der Tonsillen finden sich leukozytäre Infiltrationen des Epithels und
Veränderungen der lymphoiden Zellsubstanz die in späten Erkrankungsstadien nekrotischen
Charakter haben können. Die ersten Veränderungen sind jedoch follikuläre Hyperplasie,
Proliferation der Retikulumzellen und Aktivierung der Endothelzellen (RÖHRER und PEHL,
1960).
Das histopathologische Äquivalent der Veränderungen an den Knorpel-Knochen-Grenzen
sind hypertrophierte Chondrozyten, erweiterte Lakunen, hyperämische Kapillaren und
multifokale Blutungen (TEIFKE et al., 2002). TEIFKE et al. (2002) fanden im Bereich der
Metaphyse zudem ein fast vollständiges Fehlen von Osteoblasten und Osteozytennekrosen.
Die dort entstehende osteoporotische Zone wurde auch von anderen Autoren beschrieben
(DUNNE et al., 1957).
Chronisch erkrankte Tiere zeigen hämotopoietische Aktivität in der Milz (VAN OIRSCHOT
und TERPSTRA, 1977; SUMMERFIELD et al., 1998a; NARITA et al., 2000).
Disseminierte Mikrothrombosen wurden im Zusammenhang mit akuten KSPV-Verläufen
beschrieben (HEENE et al., 1971; HOFFMANN et al., 1971a; QUEZADA et al., 2000).
2.2.4 Pathogenese
Die primäre Virusvermehrung erfolgt in den Tonsillen (DUNNE, 1970; RESSANG, 1973b;
LIESS, 1987). Von dort aus findet eine Ausbreitung des Virus in das umliegende
lymphoretikuläre Gewebe statt. Über die Lymphgefäße bzw. den Lymphstrom gelangt das
Virus in die regionären Lymphknoten. Hier findet eine ausgeprägte Virusreplikation mit
anschließender Ausbreitung über das Blutgefäßsystem mit massiver Virämie statt. Das Virus
gelangt so an die sekundären Replikationsorte. Die sekundäre Virusvermehrung findet vor
allem in Milz, Knochenmark, viszeralen Lymphknoten und den lymphatischen Geweben des
Darms statt. (RÖHRER und PEHL, 1960; RESSANG, 1973b). Hauptzielzellen des Virus sind
Makrophagen (SUMMERFIELD et al., 1998b; GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2001;
SANCHEZ-CORDON et al., 2003), Endothelzellen (TRAUTWEIN, 1988), lymphoretikuläre
Zellen und Epithelzellen (MOENNIG, 2000). Nach fünf bis sechs Tagen ist die
Virusausbreitung im Organismus abgeschlossen (RESSANG, 1973b).
2 Literaturübersicht 11
Das klinische Bild der akuten KSP gleicht anderen viralen hämorrhagischen Erkrankungen,
zu denen u. a. auch die Afrikanische Schweinepest (ASP) gehört. Beide Erkrankungen haben
die Replikation des Virus in monozytären Zellen und einen ähnlichen pathogenetischen
Mechanismus gemein, der zu den charakteristischen Blutungen führt (ANDERSON, 1986;
GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a).
Im Folgenden soll daher besonders auf die Veränderungen der Makrophagenpopulationen, die
möglichen Ursachen der Lymphopenie und Thrombozytopenie sowie die
Entstehungsmechanismen der Hämorrhagien während der akuten Verlaufsform der KSP
eingegangen werden.
Einfluss der KSPV Infektion auf Makrophagen
Veränderungen der Zahl der Makrophagen während einer KSPV-Infektion treten im Sinne
eines kurzfristigen Anstiegs in der Anfangsphase der Erkrankung bzw. eines Abfalls im
weiteren Verlauf zu Tage. Infektion, apoptotische Prozesse sowie phagozytotische und
sekretorische Aktivierung treten in allen Makrophagenpopulationen auf (GOMEZ-
VILLAMANDOS et al., 2003a). Betroffen sind Makrophagenpopulationen der Milz
(GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2001; SANCHEZ-CORDON et al., 2005b), des Knochen-
marks (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 1998; GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003b),
der Nieren (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2000; RUIZ-VILLAMOR et al., 2001), der
Lunge (CARRASCO et al., 2001), des Thymus (SANCHEZ-CORDON et al., 2002), des
Darms (SANCHEZ-CORDON et al., 2003) sowie der Leber (NUNEZ et al., 2005).
GOMEZ-VILLAMANDOS et al. (2001) konnten für Milzmakrophagen nachweisen, dass die
phagozytotische und sekretorische Aktivität der Makrophagen zunimmt und apoptotische
Prozesse stattfinden. Es wird angenommen, dass die Makrophagen der periarteriellen
lymphatischen Scheiden (PALS) in andere Gebiete auswandern. Die Phagozytose infizierter
apoptotischer Körperchen (Makrophagen, Lymphozyten, neutrophile Granulozyten) könnte
zur Ausbreitung des Virus beitragen und das Fehlen entzündlicher Veränderungen in durch
Zelltod betroffenen Arealen in der frühen Phase der Infektion erklären (GOMEZ-
VILLAMANDOS et al., 2003a).
Es wird angenommen, dass aktivierte bzw. qualitativ veränderte Makrophagen und deren
Mediatoren, die sie an unterschiedlichen Orten freisetzen, eine Hauptrolle in der Pathogenese
2 Die Klassische Schweinepest 12
der KSPV-Infektion spielen (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a). Eine direkte
Schädigung durch das KSPV wurde für viele Läsionen, die im Rahmen der KSP-Erkrankung
auftreten, weitgehend ausgeschlossen. So ließen sich weder die Lymphopenie
(SUMMERFIELD et al., 1998b; SATO et al., 2000; SANCHEZ-CORDON et al., 2002), noch
die beschriebenen Hämorrhagien in den Nieren (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2000) auf
direkte Viruseinwirkung zurückführen. Auch für die Thrombozytopenie konnte ein solcher
pathogenetischer Mechanismus nicht nachgewiesen werden (GOMEZ-VILLAMANDOS et
al., 1998). Es ist vielmehr anzunehmen, dass unterschiedliche Zytokine ursächlich beteiligt
sind. Zu diesen Mediatoren gehören der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Interleukin-1β (IL-
1β) und 1α (IL-1α) (SANCHEZ-CORDON et al., 2002) sowie Interleukin-6 ( IL-6).
In KSPV-infizierten Alveolarmakrophagen (in vitro) und den Lymphknoten infizierter
Schweine konnte eine erhöhte Expression von TNF-α bzw. TNF-α-Protein nachgewiesen
werden (CHOI et al., 2004). TNF-α ist in der Lage, Apoptose in unterschiedlichen
Zellpopulationen auszulösen (ZHENG et al., 1995; NAGATA, 1997) und kommt somit als
Induktor der Leukopenie in Frage. Bei den betroffenen Zellen handelt es sich vorwiegend um
Leukozyten, den morphologischen Kriterien nach speziell um Makrophagen. Ferner konnten
CHOI et al. (2004) apoptotische Vorgänge sowohl in KSPV-infizierten als auch nicht-
infizierten lymphatischen Zellen nachweisen. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass
KSPV sowohl auf direktem, als auch auf indirektem Wege Apoptose auslösen kann (CHOI et
al., 2004). Wie die KSPV-Infektion die TNF-α Produktion anregt, ist bisher nicht ausreichend
geklärt. Das Vorhandensein von KSPV-Antigen in den TNF-α positiven Makrophagen legt
jedoch nahe, dass virale Komponenten über die Bindung an einen Rezeptor auf der
Zelloberfläche oder Mechanismen im Inneren der Zelle den Trigger für die TNF-α Synthese
darstellen (CHOI et al., 2004).
Neben TNF-α können auch IL-1 und IL-6 Apoptose in unterschiedlichen Zellspezies
induzieren. Dies wurde für andere virale Erkrankungen bereits nachgewiesen (RAZVI und
WELSH, 1993; GOMEZ DEL MORAL et al., 1999). Für die KSP konnte die Rolle des
TNF-α und IL-1 demonstriert werden (SANCHEZ-CORDON et al., 2002). Eine erhöhte IL-1-
Produktion nach einer KSPV-Infektion wurde auch in vitro gezeigt (KNOETIG et al., 1999),
in diesem Fall in Kombination mit erhöhter Prostaglandin-E2-Produktion. Eine Beteiligung
des TNF-α oder IL-6 konnte in vitro nicht nachvollzogen werden (KNOETIG et al., 1999).
2 Literaturübersicht 13
Für die Makrophagen der Leber konnte gezeigt werden, dass im Verlauf der akuten KSPV-
Infektion neben einer Aktivierung der Phagozytose eine Überexpression pro-
inflammatorischer Zytokine stattfindet. Sowohl TNF-α, als auch IL-6 und IL-1α wurden
vermehrt exprimiert (NUNEZ et al., 2005). Besonders der Verlauf der IL-1α Produktion wies
einen Zusammenhang mit dem Auftreten klinischer Symptome und pathologisch-anatomisch
nachweisbarer Hämorrhagien auf (NUNEZ et al., 2005).
Einfluss des KSPV auf Lymphozyten und Pathogenese der Lymphopenie
Die KSPV-Infektion verursacht vor allem in ihrer akuten Verlaufsform eine schwere
Lymphopenie und eine damit verbundene Immunsuppression, die bereits vor Auftreten der
ersten Symptome nachweisbar ist (TRAUTWEIN, 1988; PAULY et al., 1998). Eine
Depletion verschiedener Lymphozytenpopulationen konnte schon vor dem Auftreten einer
nachweisbaren Virämie gezeigt werden (SUMMERFIELD et al., 2001a). In den lympho-
retikulären Organen kommt es zu einer ausgeprägten Depletion der Lymphozyten, v. a. der B-
Lymphozytenpopulation (SUSA et al., 1992; NARITA et al., 2000; QUEZADA et al., 2000).
Eine direkte Schädigung der Lymphozyten durch das Virus konnte nicht nachgewiesen
werden (SATO et al., 2000; SUMMERFIELD et al., 2001b; SANCHEZ-CORDON et al.,
2002), obwohl eine Nekrose lymphatischer Zellen durch direkte Viruseinwirkung (NARITA
et al., 1996) bzw. Apoptoseinduktion durch virale Komponenten (BRUSCHKE et al., 1997)
diskutiert wurden. Das Phänomen der außerordentlich früh auftretenden Leukopenie wird mit
einer indirekt induzierten Apoptose lymphatischer Zellen in Verbindung gebracht (SATO et
al., 2000, SUMMERFIELD et al., 1998). Jedoch könnten sowohl eine direkte als auch
indirekte Apoptoseinduktion durch das KSPV ein Rolle spielen (CHOI et al., 2004). Eine
Möglichkeit der direkten Einwirkung ist die Wirkung viraler Proteine auf umliegende Zellen.
BRUSCHKE et al. (1997) zeigten, dass das Glykoprotein Erms
in Lymphozyten
unterschiedlichster Spezies Apoptose auslöst. Da Erns
in bedeutsamen Mengen in die
Umgebung der infizierten Zellen abgegeben wird, könnte es in diesem Zusammenhang eine
Rolle spielen (BRUSCHKE et al., 1997; CHOI et al., 2004). Es konnte gezeigt werden, dass
die Depletion der Lymphozyten in Thymus und Milz zeitlich mit dem vermehrten Auftreten
von Makrophagen zusammenfiel, die phagozytierte Zelltrümmer enthielten („tingible body“
macrophages). Zudem ging die Lymphozytendepletion mit eindeutigen Hinweisen
2 Die Klassische Schweinepest 14
apoptotischer Veränderungen wie Kernpyknose und Karyorrhexis einher (SANCHEZ-
CORDON et al., 2005a). Quantitative Veränderungen der T-Lymphozytenpopulationen sowie
qualitative Veränderungen der Zytokinexpression durch diese Zellen wurden von SANCHEZ-
CORDON et al. (2005) im Sinne einer zellvermittelten Immunantwort vom Typ 1
interpretiert, die im späteren Verlauf von einer Typ 2 Immunantwort abgelöst wird.
Neben einer ausgeprägten Lymphopenie, kommt es im Verlauf der Infektion mit dem KSPV
auch zu einer markanten Granulozytopenie (SUSA et al., 1992; SUMMERFIELD et al.,
1998a; SUMMERFIELD et al., 1998b). Die Depletion der Granulozyten, die bereits drei Tage
nach der Infektion auftritt, betrifft sowohl reife Blutgranulozyten als auch unreife
Vorläuferzellen im Knochenmark (SUMMERFIELD et al., 2000). Es konnte von
SUMMERFIELD et al. (2000) gezeigt werden, dass sowohl apoptotische, als auch
nekrotische Veränderungen im Knochenmark eine Rolle spielen. Für die Caspasen 3 und 9
konnten erhöhte Aktivitäten besonders an Tag sieben der Infektion ermittelt werden, wobei
letzteres für die Beteiligung des mitochondrialen Weges der Apoptoseinduktion spricht
(BUDIHARDJO et al., 1999). Die Fähigkeit zur Differenzierung und somit der
Granolozytopoese war in Knochenmarkszellen infizierter Tiere über den gesamten Verlauf
der Erkrankung nicht gestört. Unreife Granulozyten nahmen, relativ gesehen, über den
Zeitraum der Infektion zu. Eine Zellschädigung bzw. Apoptoseinduktion durch die KSPV-
Infektion an sich erscheint in diesem Zusammenhang unwahrscheinlich, da die Anzahl
apoptotischer bzw. toter Zellen die Anzahl infizierter Zellen, besonders zu Beginn der
Infektion, bei weitem überstieg (SUMMERFIELD et al., 2000). Eine weitere Beobachtung in
einem in vitro Modell an BMHC-Zellen (bone marrow hematopoietic cells) war, dass die
Mehrzahl infizierter Zellen keine Anzeichen einer Apoptose zeigten, bzw. fast alle
apoptotischen Zellen nicht mit KSPV infiziert waren. Somit scheint ein indirekter
Mechanismus der Apoptoseinduktion die Hauptrolle zu spielen (SUMMERFIELD et al.,
2001b). In vitro konnten SUMMERFIELD et al. (2001b), im Gegensatz zu den Ergebnissen
in vivo (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003b), keine Beteiligung von Makrophagen,
Zytokinen oder reaktiven Sauerstoffspezies nachweisen.
2 Literaturübersicht 15
Einfluss der KSPV Infektion auf Thrombozyten
Ein charakteristisches Symptom im Verlauf der akuten KSP ist eine hochgradige
Thrombozytopenie, deren Beginn mit dem Auftreten von Fieber und einer messbaren Virämie
korrelliert (HEENE et al., 1971; HOFFMANN et al., 1971a; GOMEZ-VILLAMANDOS et
al., 1998). Prinzipiell kann eine Thrombozytopenie durch verminderte oder fehlende
Thrombozytopoiese (Bildungsstörung), erhöhten peripheren Verschleiß durch Verbrauch,
Verlust bzw. Zerstörung (Umsatzstörung oder Verlust) oder eine veränderte
Plättchenverteilung (Verteilungsstörung) hervorgerufen werden (BAUTISTA et al., 2002).
Als Ursache der Thrombozytopenie im Rahmen der KSPV-Infektion werden verschiedene
Mechanismen diskutiert. HOFFMANN et al. (1971) und CALDERON et al. (1998) führten
dieses Phänomen auf eine massive Degeneration der Megakaryozyten im Knochenmark
zurück. HEENE et al. (1971) und HOFFMANN et al. (1971) brachten die auftretende
Thrombozytopenie zudem mit den Auswirkungen einer Verbrauchskoagulopathie bzw.
disseminierten intravasalen Gerinnung in Verbindung. WEISS et al. (1973) wies Virus in
Thrombozyten akut erkrankter Schweine nach und brachte die Thrombozytopenie in
Zusammenhang mit einer vorausgehenden Infektion von Megakaryozyten und nachfolgenden
Zerstörung der Thrombozyten.
GOMEZ-VILLAMANDOS et al. konnten 1998 zeigen, dass nur eine geringe Zahl
Megakaryozyten (2-4%) eine Infektion aufweist und postulierten, dass die Intensität der
Thrombozytopenie durch eine Zerstörung der Megakaryozyten im Zuge einer Infektion nicht
hinreichend erklärt werden kann. BAUTISTA et al. (2002) beschreiben Zellveränderungen an
Tag zwei und vier post infectionem in Milz und Leber, die auf eine Plättchenaktivierung und
-aggregation sowie sekretorische und phagozytotische Aktivierung der residenten
Makrophagen hindeuten. In diesem Zusammenhang wird eine massive Aktivierung und
nachfolgende Phagozytose der Plättchen, ausgelöst durch die Freisetzung
plättchenaktivierender Faktoren durch aktivierte Makrophagen als primäre Ursache der
massiven Thrombozytopenie im Verlauf der KSP diskutiert. Eine Aktivierung und
Aggregation der Plättchen durch den Tissue Factor (TF, Gewebefaktor) wird von oben
genannten Autoren aufgrund mangelnder Fibrinablagerungen in den betroffenen Organen
ausgeschlossen, während eine disseminierte intravasale Gerinnung mit der Begründung
ausgeschlossen wird, dass Mikrothromben erst in der Finalphase der Erkrankung, also nach
2 Die Klassische Schweinepest 16
Auftreten der Thrombozytopenie zu finden sind (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a).
Morphologische Zeichen eines Endothel- oder sonstigen Gewebeschadens, der eine
Aktivierung des Gerinnungssystems herbeigeführt haben könnte, konnten von BAUTISTA et
al. (2002) ebenfalls nicht aufgespürt werden.
In verschiedenen Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass es zu ausgeprägten
Veränderungen im Knochenmark KSPV-infizierter Schweine kommt, die jedoch erst nach
dem Auftreten der Thrombozytopenie nachweisbar sind (GOMEZ-VILLAMANDOS et al.,
1998; GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a; GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003b).
Die von HOFFMANN et al. (1971) und CALDERON et al. (1998) beschriebenen
degenerativen Veränderungen der Megakaryozyten konnten auch in diesen Studien als
„nackte Megakaryozytenkerne“ gezeigt werden, werden jedoch hier im Sinne einer Folge
(Versuch einer Wiederherstellung normaler Plättchenzahlen) diskutiert (GOMEZ-
VILLAMANDOS et al., 2003b).
In vitro konnte gezeigt werden, dass in KSPV-infizierten Endothelzellen der Transkriptions-
faktor NFκB aktiviert wird, welcher für die Kontrolle der Aktivierung von Endothelzellen
verantwortlich ist. Es kommt zusätzlich zu einer erhöhten Expression von
proinflammatorischen (IL-1α, IL-6 und IL-8) und prokoagulatorischen Faktoren
(BENSAUDE et al., 2004). Sowohl die Expression des Gewebefaktors als auch des
Endothelzellwachstumsfaktors VEGF (vascular endothelial cell growth factor) und des
Zelloberflächen-Adhäsionsmoleküls E-Selektin waren in vitro erhöht. Somit könnten
aktivierte Endothelzellen eine wichtige Rolle in der Entstehung hämostaseologischer
Störungen spielen (BENSAUDE et al., 2004). NUNEZ et al. (2005) konnten
Plättchenaggregate und aktivierte Plättchen in der Leber infizierter Tiere nachweisen, die in
räumlicher Nähe zu von Kupffer-Zellen auftraten. Es wird diskutiert, ob die IL-1 Produktion
durch die von Kupffer-Zellen eine Rolle bei der Entstehung der Thrombozytopenie spielt
(NUNEZ et al., 2005), da IL-1 nachgewiesenermaßen zu einer Aktivierung von Plättchen
führen kann (REALE et al., 1996).
Pathogenese der Hämorrhagien im Verlauf der akuten KSPV Infektion
Hämorrhagien, vor allem in den Lymphknoten und Nieren, gehören zum klassischen Bild der
akuten KSPV-Infektion (RÖHRER und PEHL, 1960; VAN OIRSCHOT, 1999). Die
2 Literaturübersicht 17
zugrunde liegenden pathogenetischen Mechanismen wurden in verschiedene Richtungen
diskutiert (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a). Zu diesen Mechanismen gehören die
direkte Schädigung des Endothels durch das KSPV (HEENE et al., 1971), die ursächliche
Beteiligung der Thrombozytopenie durch veränderte Plättchen (WEISS et al., 1973) und eine
disseminierte intravasale Gerinnung (HOFFMANN et al., 1971a; GRUBER et al., 1995;
BENSAUDE et al., 2004) bzw. eine diffuse Aktivierung des Blutgerinnungssystems durch
eine Schädigung des Endothels (TRAUTWEIN, 1988). TRAUTWEIN (1988) diskutiert
zudem, dass eine durch Mikrothromben hervorgerufene Endothelschädigung die Ursache für
Plasmaverluste und perivaskuläre Hämorrhagien sein könnte. Petechien, die v. a. in
Assoziation mit Kapillaren auftreten, sind in den Nieren akut an KSP erkrankter Schweine ab
dem siebten Tag nach der Infektion in Kombination mit Erythrodiapedese (Austritt von
Erythrozyten aus den Blutgefäßen durch Lücken der Gefäßwand) nachgewiesen worden
(GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2000; RUIZ-VILLAMOR et al., 2001). Mit der
beschriebenen Erythrodiapedese gehen eine Vergrößerung der Kapillarlichtung,
mononukleäre Infiltrate und eine Erhöhung der Mastzellzahl und -degranulierung einher
(GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2000; RUIZ-VILLAMOR et al., 2001; GOMEZ-
VILLAMANDOS et al., 2003a). Ultrastrukturelle und morphometrische Untersuchungen
zeigten in diesem Zusammenhang, dass es zu einer ausgeprägten Vasodilatation und
herabgesetzter Wanddicke des Endothels kommt (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2000).
Die mononukleären Infiltrate, die im Zusammenhang mit den renalen Hämorrhagien
auftraten, wurden hauptsächlich als T- und B-Lymphozyten charakterisiert, Makrophagen
wurden nur in geringer Zahl gefunden (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2000). Sowohl die
kapilläre Vasodilatation und erhöhte Permeabilität, als auch die Auswanderung von
Erythrozyten und Leukozyten aus den Kapillaren, können durch Zytokine vermittelt werden
(MANTOVANI et al., 1992). Makrophagen, die zu den Hauptzielzellen des KSPV gehören
(RESSANG, 1973a; TERPSTRA, 1991), sind zwar nur in geringem Maße an den
perivaskulären Infiltraten im Bereich renaler Hämorrhagien beteiligt (GOMEZ-
VILLAMANDOS et al., 2000), besitzen jedoch eine ausgeprägte Kapazität, die vaskuläre
Permeabilität zu beeinflussen, was auch im Zusammenhang mit anderen viralen
hämorrhagischen Fiebern gezeigt werden konnte (BRAY, 2005). Im Verlauf der KSPV
Infektion zeigen sie eine sekretorische Aktivierung und können somit eine wichtige Rolle für
2 Virale hämorrhagische Fieber 18
den Entstehungsmechanismus KSPV induzierter Hämorrhagien spielen (GOMEZ-
VILLAMANDOS et al., 2000; GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a).
Weitere pathogenetische Mechanismen
Als pathogenetischer Auslöser wird eine hypoxische Nekrose der Osteoklasten und
Osteoblasten ausgelöst durch geschädigte Kapillarendothelien (PALMER 1992, zitiert durch
TEIFKE et al. 2002) bzw. ein Stillstand des Knorpelabbaus und der Ossifikation durch einen
KSPV induzierten Verlust osteoblastischer Aktivität diskutiert (TEIFKE et al., 2002). Eine
erhöhte Produktion von Zytokinen und Entzündungsmediatoren wird im Zusammenhang mit
Knochenerkrankungen unterschiedlicher Genese ursächlich mit der erhöhten osteoklastischen
Aktivität, aber auch einer Osteoblasten-Apoptose in Verbindung gebracht (BOYCE et al.,
1999).
In den Nieren KSPV-infizierter Schweine konnten im chronischen Verlauf der Infektion bzw.
ab dem zehnten Tag nach der Infektion Immunkomplexe nachgewiesen werden (CHEVILLE
et al., 1970; RUIZ-VILLAMOR et al., 2001), die aus den Immunglobulinen M und G sowie
dem Komplementfaktor C1q bestanden; virales Antigen war nicht als Komponente dieser
Komplexe nachweisbar (RUIZ-VILLAMOR et al., 2001). Es wird diskutiert, ob diese
Immunkomplexe aus einer Überproduktion nicht-spezifischer Antikörper resultieren, wie sie
für persistent BVDV-infizierte Rinder beschrieben wurden (HEWICKER et al., 1987).
2.3 Virale hämorrhagische Fieber
Virale hämorrhagische Fieber, zu denen auch die akute Verlaufsform der KSP zählt, weisen
trotz unterschiedlicher Genese einige Gemeinsamkeiten auf, die sich besonders in der
Pathogenese der Erkrankungen widerspiegeln (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a).
Zum Verständnis der pathogenetischen Mechanismen der KSP könnten daher auch
Erkenntnisse beitragen, die für andere virale Erkrankungen gewonnen wurden, die mit den
Symptomen eines hämorrhagischen Fiebers einhergehen. Aus diesem Grund wird ein kurzer
Einblick in die pathogenetischen Mechanismen gegeben, die für klassische Vertreter viraler
hämorrhagischer Fieber bekannt sind.
2 Literaturübersicht 19
2.3.1 Klassische Vertreter
Die Erreger charakteristischer viraler hämorrhagischer Fieber finden sich in den
Virusfamilien Arenaviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae und Filoviridae (FELDMANN et al.,
1996; CHEN und COSGRIFF, 2000). Die genannten Familien enthalten behüllte,
einzelsträngige RNA-Viren (BRAY, 2005). Das Virus der ASP (ASPV) stellt insofern eine
Ausnahme dar, als es sich um ein DNA-Virus aus der Familie Asfarviridae handelt (DIXON
et al., 2004). Zur ersten Familie gehören z. B. die Erreger des Lassa-Fiebers (Lassavirus), des
argentinischen hämorrhagischen Fiebers (Juninvirus) und des bolivianischen
hämorrhagischen Fiebers (Machupovirus) (OLDSTONE, 2002a; OLDSTONE, 2002b; JAY et
al., 2005). Vertreter der Familie Bunyaviridae sind u. a. das Hantaanvirus und das Sin-
Nombre-Virus sowie das Virus des Crimean-Congo Hemorrhagic Fever (SIMMONS und
RILEY, 2002; LEDNICKY, 2003; TAI et al., 2005). Diese Viren verursachen beim
Menschen oftmals schwere fieberhafte Erkrankungen mit hämorrhagischen Symptomen, die
in Abhängigkeit vom Virustyp zudem mit schweren renalen und pulmonalen
Begleitsymptomen einhergehen können (WHITEHOUSE, 2004). Ein Vertreter des Genus
Phlebovirus, das Virus des Rift-Valley-Fiebers, kann beim Menschen in seltenen Fällen
ebenfalls zu einem hämorrhagischen Fieber führen (GERDES, 2004). Das Rift-Valley-Fieber-
Virus besitzt tiermedizinische Bedeutung, da es neben dem zoonotischen Potential zu
schweren Erkrankungen bei Wiederkäuern führt, die mit gastrointestinalen Symptomen,
Hepatitiden und seuchenhaften Aborten einhergehen (GERDES, 2004).
Die Familie Flaviviridae beinhaltet in den Genera Flavivirus (NEYTS et al., 1999;
SOLOMON und MALLEWA, 2001) und Pestivirus (BAKER, 1995; GOMEZ-
VILLAMANDOS et al., 2003a) Erkrankungen, die mit hämorrhagischen Symptomen
einhergehen können. Zu den hämorrhagischen Erkrankungen des Genus Flavivirus gehören
das Dengue hämorrhagische Fieber (JOHN, 2003; MALAVIGE et al., 2004) und die schwere
Verlaufsform des Gelbfiebers (MONATH, 2001). Im Genus Pestivirus können Infektionen
mit dem KSPV und dem BVDV mit Symptomen eines hämorrhagischen Fiebers einhergehen.
Die Erreger der schwersten hämorrhagischen Fieber sind in der Familie Filovirus zu finden
(FELDMANN et al., 1996; PETERS und KHAN, 1999; CASILLAS et al., 2003). Die
Ebolaviren und das Marburgvirus verursachen schwerste Erkrankungen mit hoher Mortalität
(30-80%).
2 Virale hämorrhagische Fieber 20
2.3.2 Pathogenese der viralen hämorrhagischen Fieber
Eine Gemeinsamkeit viraler hämorrhagischer Fieber ist die primäre Replikation des Virus in
Monozyten bzw. Makrophagenpopulationen (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a;
BRAY, 2005) und ihre Affinität zu Endothelzellen. Eine Ausnahme bilden die Hantaviren,
die primär in Endothelzellen replizieren. Obwohl einige dieser Viren auch einen direkt
zellschädigenden Effekt haben, werden die meisten klinischen Erscheinungen durch
Reaktionen des Immunsystems und durch Mediatoren der infizierten Makrophagen verursacht
(BRAY, 2005). Die Erreger fast aller hämorrhagischer Fieber sind in der Lage, sehr
unterschiedliche Zelltypen zu infizieren (GEISBERT und JAHRLING, 2004).
Untersuchungen zur Pathogenese der Ebolavirusinfektion haben gezeigt, dass Interaktionen
des Virus mit Makrophagen und dendritischen Zellen eine tragende Rolle bei der Entstehung
unterschiedlichster Läsionen spielen (GEISBERT et al., 2003b; GEISBERT et al., 2003c;
GEISBERT et al., 2003d). Die Erreger viraler hämorrhagischer Fieber sind nicht nur in der
Lage, das unspezifische Abwehrsystem zu umgehen, sie können sich in Makrophagen, die
eigentlich eindringende Pathogene abwehren sollten, vermehren und diese als
Transportvehikel zu parenchymatösen Organen nutzen. Die Hemmung der Typ 1
Interferonproduktion spielt dabei eine unterstützende Rolle (BRAY, 2005). Die Infektion
aktiviert die sekretorische Aktivität der Makrophagen, die Zytokine und andere Mediatoren
ausschütten. Dadurch wird Fieber hervorgerufen und das Gefäßsystem im Sinne einer
Endothelzellaktivierung beeinflusst. Das Blutgerinnungssystem wird in einen
prokoagulatorischen Zustand versetzt (HENSLEY et al., 2002; GEISBERT und JAHRLING,
2004; HENSLEY und GEISBERT, 2005). Für das Ebolavirus konnte gezeigt werden, dass es
zu einer, von den infizierten Makrophagen induzierten, Aktivierung des extrinsischen Weges
der Blutgerinnung kommt. Die Überexpression des TFs scheint hier eine Schlüsselrolle zu
spielen (GEISBERT et al., 2003c). GEISBERT et al. (2003) sehen zudem Parallelen zwischen
Ebolavirusinfektionen und dem septischen Schock (Lymphozytenapoptose, Dysregulation
proinflammatorischer Zytokine, Aktivierung der Gerinnungskaskade im Sinne einer
disseminierten intravasalen Gerinnung).
Infizierte dendritische Zellen scheinen in ihrer Fähigkeit gestört zu sein, naïve Lymphozyten
zu aktivieren. In Kombination mit durch Mediatoren hervorgerufenen Effekten könnte dies zu
der massiven Lymphozytenapoptose beitragen, die im Krankheitsverlauf zu verzeichnen ist
2 Literaturübersicht 21
(GEISBERT et al., 2000; GEISBERT et al., 2003b; MAHANTY und BRAY, 2004; BRAY
und GEISBERT, 2005).
Im Gegensatz zum KSPV induzieren Filoviren einen direkten zytopathischen Effekt, der sich
sowohl in den infizierten Makrophagen und dendritischen Zellen als auch in parenchymatösen
Zellen der Leber, der Nebenniere und anderer Organe manifestiert. Der Mechanismus ist noch
weitgehend ungeklärt. Die entstehenden nekrotischen Zelltrümmer verstärken die systemische
Entzündungsreaktion und die Freisetzung von Zytokinen aus aktivierten Zellen (BRAY und
MAHANTY, 2003; HOTCHKISS und KARL, 2003; BRAY, 2005).
Die indirekten Wirkungen der Infektionen mit den angesprochenen Viren wurden besonders
anhand der Ebolavirusinfektion erforscht.
Die Replikation der Viren in Makrophagen resultiert in einer Interaktion einzelsträngiger
viraler RNA, doppelsträngiger RNA-Intermediate und anderer virus-spezifischer Substanzen
mit Typ 1 Transmembranproteinen, Toll-like receptors sowie anderen Mustererkennungs-
molekülen des unspezifischen Immunsystems. Dadurch werden NFκB, Interferon
regulierende Faktoren bzw. andere Aktivierungspfade angesprochen. Diese Aktivierung führt
zur Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren wie IL-1, IL-6, TNF-α und Stickstoffoxid
(HOTCHKISS und KARL, 2003; BRAY, 2005).
Dendritische Zellen setzen Chemokine frei, die zusätzliche Monozyten und dendritische
Zellen zu den Orten viraler Replikation locken. Damit gelangen weitere empfängliche Zellen
an die Orte der Virusreplikation und tragen zur Verbreitung des Virus bei (HENSLEY et al.,
2002; MAHANTY et al., 2003; BRAY und GEISBERT, 2005).
Die vaskulären Permeabilitätsstörungen und Koagulopathien wurden in älteren Studien häufig
direkten Wirkungen des Virus auf infizierte Endothelzellen zugeschrieben (PETERS und
ZAKI, 2002; SCHNITTLER und FELDMANN, 2003). In jüngster Zeit konnte jedoch gezeigt
werden, dass eine Virusreplikation in Endothelzellen erst in der Finalphase der Erkrankung
nachweisbar wird, wenn Gerinnungsstörungen und Schocksymptomatik bereits ausgeprägt
sind. Die auftretenden Vasodilatationen, die erhöhte Gefäßpermeabilität sowie die Expression
von Adhäsionsmolekülen im Bereich des Endothels werden daher mit der Wirkung
unterschiedlicher Entzündungsmediatoren in Verbindung gebracht (MAHANTY und BRAY,
2004; BRAY, 2005).
2 Virale hämorrhagische Fieber 22
Die systemische Entzündungsreaktion ist eng verknüpft mit der Aktivierung des
Gerinnungssystems. Entzündungsmediatoren wie IL-6 können die Synthese des TFs initiieren
und somit einen starken Aktivator der Gerinnung einbeziehen (BRAY, 2005).
Fibrinablagerungen konnten ebenfalls nachgewiesen werden (GEISBERT et al., 2003c). Die
bedeutsame Beziehung zwischen viraler Infektion, Entzündungsreaktion und Blutgerinnung
konnte experimentell belegt werden (GEISBERT et al., 2003a).
Für Infektionen mit Erregern viraler hämorrhagischer Fieber ist eine ausgeprägte Apoptose
vorwiegend nicht-infizierter lymphatischer Zellen charakteristisch, die zu einer massiven
Immunsuppression führt. Die Apoptoseinduktion scheint in allen Fällen durch Zytokine
infizierter monozytärer Zellen herbeigeführt zu werden (MAHANTY und BRAY, 2004;
BRAY, 2005; BRAY und GEISBERT, 2005).
2 Literaturübersicht 23
2.4 Hämostase und Hämostasekomponenten
Im Folgenden werden zum besseren Verständnis der pathologischen Vorgänge bei schweren
Virusinfektionen kurz die physiologischen Vorgänge im Rahmen der Blutgerinnung
dargestellt. Detailliertere Beschreibungen sind u. a. bei TROY (1988) und DODDS (1988)
bzw. in einschlägigen humanmedizinischen Monographien (NAWROTH, 1998;
HARBRECHT, 1998; GAWAZ, 1999) und Übersichtspublikationen zu finden (BLOOM,
1990; BOON, 1993; NARAYANAN und HAMASAKI, 1998; STASSEN et al., 2004; JURK
und KEHREL, 2005).
Die Hämostase umfasst die Vorgänge, die im intakten Gefäßsystem die kontinuierliche
Strömung des Blutes gewährleisten und im Bedarfsfall, d. h. bei Verletzungen und Störungen
dieses Systems, die rasche Blutstillung aktivieren und auf den Ort des Geschehens
beschränken (TROY, 1988). Somit laufen unter physiologischen Bedingungen ständige
Antikoagulations- und Koagulationsprozesse ab. Die Antikoagulation ist auf die besonderen
Eigenschaften des intakten, nicht benetzbaren Endothels, das Nichtaggregieren der inaktiven
Thrombozyten und die Inaktivität der als Proenzyme vorliegenden Gerinnungsenzyme
gestützt (BARTHELS und VON DEPKA, 2003a). Die Aktivatoren der Blutgerinnung
befinden im extravasalen Bereich. Die Blutstillung kann, da die Komponenten nicht
synthetisiert, sondern nur aktiviert werden müssen, energiearm und schnell erfolgen. Wichtige
Prozesse sind dabei die Kontraktion der Arterienwände, die Aktivierung der Thrombozyten
und der Zellen der verletzten Zelloberflächen sowie die Aktivität des fibrinolytischen
Systems. Beide Prozesse, d. h., Gerinnungsprozesse und Fibrinolyse müssen auf den Ort des
Geschehens beschränkt werden, dafür sorgt u. a. die Inaktivierung der Enzyme durch ihre
physiologischen Inhibitoren (LEWIS, 1996; NAWROTH, 1998).
Nach Virchow werden drei Hämostasebereiche unterschieden (Virchow´sche Trias, benannt
nach Rudolf Virchow, der diese Bereiche 1856 beschrieb): Thrombozyten (zelluläre
Bestandteile), Gefäßsystem (Endothel) und das plasmatische Gerinnungssystem.
2 Hämostase und Hämostasekomponenten 24
2.4.1 Zelluläre Bestandteile
Inaktive Thrombozyten liegen als Scheiben mit einem Durchmesser von 1-5 µm vor und
zirkulieren endothelnah am Rande des Blutstromes (BARTHELS und VON DEPKA, 2003a).
Sie werden im Knochenmark durch Abschnürung aus Megakaryozyten generiert. Ihre Zahl
wird für Hausschweine mit einer sehr großen Bandbreite von 220 – 620 G/l angegeben
(HAHN et al., 1996; MISCHKE, 1999a).
Zu den Plättcheninhaltsstoffen gehören gerinnungsaktive Phospholipide, Serotonin und
Adenosindiphosphat (ADP). Der inaktive Thrombozyt präsentiert diese Stoffe nicht nach
außen, die gerinnungsaktiven Phospholipide befinden sich in der Plättchenmembran. Bei einer
Endothelverletzung kommt es durch Plättchenadhäsion und –aggregation zur Bildung des
primären Thrombozytenpfropfes und damit zur Abdichtung des Gefäßdefektes (BARTHELS
und VON DEPKA, 2003a). Das bei einer Gefäßverletzung freiliegende Kollagen des
Subendothels bildet den Anhaftungspunkt der zirkulierenden Thrombozyten, die im
Folgenden aggregieren. Bei diesen Vorgängen werden die Plättchen aktiviert und präsentieren
nun die gerinnungsaktiven Phospholipide der Plättchenmembran nach außen. Durch diesen
Flip-Flop-Mechanismus der Thrombozytenmembran wird die Matrix für die anschließend
ablaufenden Gerinnungsprozesse geschaffen (HARBRECHT, 1998; GAWAZ, 1999).
Verknüpfungen zwischen Gerinnungssystem und Thrombozyten erfolgen durch Rezeptoren
auf der aktivierten Thrombozytenoberfläche wie den Glykoprotein (GP) IIb/IIIa-Rezeptor, der
Fibrinogen und den Von-Willebrand-Faktor (vWF) bindet (GAWAZ, 1999). Die
Thrombozytenaktivierung kann in verschiedene Teile untergliedert werden. Primär kommt
neben dem Kollagen des Subendothels dem Thrombin eine entscheidende Bedeutung zu. Die
sekundäre Aktivierung ist an den Thrombozytenstoffwechsel gebunden, der Thromboxan A2,
ADP und den plättchenaktivierenden Faktor (PAF) bereitstellt (BARTHELS und VON
DEPKA, 2003a). Die Verbindung zwischen Endothel und Thrombozyten wird u.a. durch den
Von-Willebrand-Faktor über den Thrombozytenrezeptor GPIIb/IIIa vermittelt.
Relevante Komponenten der Thrombozyten sind nach BARTHELS und VON DEPKA (2003)
in Tabelle 2-1 aufgeführt.
2 Literaturübersicht 25
Tabelle 2-1: Rezeptoren und weitere relevante Komponenten der Thrombozyten, die für die Blut-
gerinnung von Bedeutung sind (nach BARTHELS und VON DEPKA, 2003). Die rechte Spalte gibt die
Hauptfunktion in Bezug auf die Gerinnung an.
Komponente Funktion
Rezeptor GPIIb/IIIa bzw. Integrin αIIbβ3 Bindung von Fibrinogen und vWF
Rezeptor GPIb/IX/V Bindung des vWF
Phospholididschicht Bindung von Gerinnungsfaktoren,
insbesondere Prothrombinkomplex,
Faktor V, Faktor VIII
Prostaglandine bzw. das Endprodukt
Thromboxan
Plättchenaggregation
2.4.2 Endothel
Neben seinen strömungsfördernden Eigenschaften durch fehlende Benetzbarkeit, verfügt das
Endothel über eine Reihe von Substanzen, die für die Hämostase eine Rolle spielen. So
stammt das Prostacyclin, ein potenter Inhibitor der Plättchenaggregation, aus dem Endothel.
Heparane (Heparansulfat), Stickstoffoxid und Prostaglandin I2 spielen bei der Antikoagulation
am Endothel eine Rolle (STASSEN et al., 2004). Die Freisetzung des tissue-type plasminogen
activators t-PA führt über die Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin zur Fibrinolyse. Der
Plasminogenaktivatorinhibitor PAI ist der Gegenspieler und hemmt die Fibrinolyse. Treten
Störungen oder Verletzungen im Bereich des Endothels auf, kommt es über freiliegendes
Kollagen und den vWF bzw. den aus verletzten Gewebszellen freigesetzten TF zu einer
Aktivierung der Gerinnung (STASSEN und NYSTROM, 1997; BARTHELS und VON
DEPKA, 2003a; STASSEN et al., 2004). In Tabelle 2-2 sind die relevanten Komponenten des
Endothels und des Gewebes dargestellt.
2 Hämostase und Hämostasekomponenten 26
Tabelle 2-2: Substanzen des Endothels und Subendothels, die für die Blutgerinnung relevant sind (nach
BARTHELS und VON DEPKA, 2003).
Substanz Funktion
Kollagen Adhäsion und Aggregation der Thrombozyten
Prostacyclin Hemmung der Thrombozytenaggregation
Heparansulfat Antikoagulation am Endothel
Thrombomodulin Aktivierung von Protein C als Kofaktor des
Thrombins
vWF Bindeglied zwischen Subendothel und Thrombo-
zyten. Schützt den Faktor VIII vor vorzeitiger
Degradierung (factor VIII related antigen)
TF Aktivierung des plasmatischen Gerinnungssystems
(extrinsischer Weg) über Komplexbildung mit
Faktor VII
t-PA und ut-PA Fibrinolyseaktivatoren
PAI-1 Fibrinolyseinhibitor
2.4.3 Das plasmatische Gerinnungssystem
Nach allgemeiner Vorstellung verläuft die Aktivierung der plasmatischen Gerinnung in Form
einer feinregulierten Kaskade (NAWROTH, 1998). Obwohl die gängigen Lehrmodelle nicht
der Situation in vivo gerecht werden (HOFFMAN, 2003), bieten sie ein gutes Grundgerüst um
auftretende Gerinnungsstörungen in vitro diagnostizieren zu können (BARTHELS und VON
DEPKA, 2003a).
Im Rahmen der Blutgerinnung werden die inaktiv vorliegenden Faktoren der Enzymkaskade,
eine Reihe von Serinproteasen (NORRIS, 2003), aktiviert, was zur Aktivierung des zentralen
Gerinnungsenzyms Thrombin führt, welches Fibrinogen in Fibrin umwandelt (TROY, 1988;
NORRIS, 2003). Die Thrombinbildung findet über zwei Reaktionswege statt, den
extrinsischen und intrinsischen, die beide in einer gemeinsamen Endstrecke münden. Eine
strikte Trennung zwischen den Systemen besteht nicht (RADCLIFFE et al., 1977; TROY,
1988). Im Folgenden sind die aktivierten Faktoren durch ein hinter die römische Zahl
gestelltes a gekennzeichnet. Eine stark schematisierte Übersicht beider Aktivierungswege ist
in Abbildung 2-2 dargestellt.
2 Literaturübersicht 27
2.4.3.1 Der extrinsische Aktivierungsweg
Der extrinsische Weg wird i. d. R. durch eine Gefäßverletzung aktiviert (BARTHELS und
VON DEPKA, 2003a). Bei der Verletzung der Gefäßintegrität kommt es zur Freisetzung von
TF. Dieser bildet einen Komplex mit der Protease Faktor VII. Dieser Komplex regt über die
Aktivierung des Faktors X, und die Bildung des Prothrombinasekomplexes, die gemeinsame
Endstrecke der Gerinnung an (TROY, 1988; MANN, 1999; MORRISSEY, 2001). Über einen
Rückkopplungsmechanismus wird Faktor VII sowohl durch den entstandenen TF-Faktor-
VII-Komplex als auch durch Faktor Xa vermehrt aktiviert. Faktor VIIa ist eine allein kaum
wirksame Serinprotease, die ihre optimale Wirkung entfaltet, wenn TF in gerinnungsaktive
Phospholipide der verletzten Zellmembranen eingebunden ist (NAWROTH, 1998; MANN,
1999). Neben der Aktivierung des Faktors X, aktiviert Faktor VIIa auch Faktor IX, Faktor
IXa wiederum Faktor X. Gegenspieler dieses Weges ist der Tissue Factor Pathway Inhibitor
TFPI, der durch Komplexbildung mit Faktor Xa und dem TF-Faktor VII-Komplex den
Aktivierungsprozess rasch eindämmt (BARTHELS und VON DEPKA, 2003a).
2.4.3.2 Der intrinsische Aktivierungsweg
Der intrinsische Weg wird über die Kontaktfaktoren Faktor XII, Faktor XI, Präkallikrein und
High Molecular Weight Kininogen (HMWK) initiiert, wobei Präkallikrein und Faktor XI
gebunden an den Kofaktor HMWK vorliegen. Diese Faktoren binden an negativ geladene
Oberflächen wie Plättchenmembranen, Kollagen, aber auch Glas, Kaolin, Ellagsäure oder
andere künstliche Oberflächen (BARTHELS und VON DEPKA, 2003a). Die
Kontaktfaktoren, insbesondere Faktor XIIa und Kallikrein, sind außerdem in der Lage, Faktor
VII zu aktivieren bzw. die intrinsischen Fibrinolyse zu initiieren (MANN, 1999). Mittelpunkt
dieses Systems ist der so genannte Tenasekomplex, der aus Faktor IXa, seinem Kofaktor VIII
sowie Phospholipiden und Calciumionen besteht (TROY, 1988). Dieser Komplex aktiviert
Faktor X und mündet damit in die gemeinsame Endstrecke. In der „Josso-Schleife“ besteht
eine Interaktion zwischen dem intrinischen und extrinsischen Weg der plasmatischen
Gerinnung. Sie beschreibt die Aktivierung des Faktors IX durch den TF-Faktor-VII-Komplex
und die Rückkopplung über Faktor Xa (MANN, 1999).
2 Hämostase und Hämostasekomponenten 28
2.4.3.3 Gemeinsame Endstrecke und Regulation
Den Endpunkt der Gerinnung bildet die Umsetzung des wasserlöslichen Fibrinogens in Fibrin
durch das Enzym Thrombin (TROY, 1988). Thrombin entsteht durch die Aktivität des sog.
Prothrombinasekomplexes aus der inaktiven Vorstufe Prothrombin. Dieser Komplex enthält
neben dem aktivierten Faktor X (Xa) dessen Akzelerator Faktor V sowie Calciumionen und
Phospholipide (NAWROTH, 1998; BARTHELS und VON DEPKA, 2003a). In der
thrombinkatalysierten Reaktion werden die Fibrinopeptide A und B aus den Bereichen der
Aα- und Bβ-Ketten des Fibrinogens (siehe 2.4.6) abgespalten, wodurch Bindungsstellen
freiwerden, die eine Interaktion verschiedener Fibrinmoleküle ermöglichen. Die
Zusammenlagerung thrombinaktivierter Fibrinmoleküle führt zunächst zur Bildung von
Fibrinmonomeren, die durch weitere Anlagerungen zu Fibrinfasern werden. Erst in der
Faktor-XIII-katalysierten Reaktion erfolgt eine kovalente Vernetzung, und damit
Stabilisierung, des Fibrinnetzes (MOSESSON, 1998). Die Aktivierung des Faktors XIII
erfolgt direkt durch Thrombin (MANN, 1999). In Abbildung 2-3 ist eine stark schematisierte
Darstellung der Fibrinbildung abgebildet.
Die Kontrolle der Thrombinbildung gehört aufgrund ihrer Bedeutung für die Fibrinbildung
und Thrombozytenaktivierung zu den wichtigsten Prozessen der Hämostase. Die Generierung
von Thrombin wird über eine Feedback-Inaktivierung durch das Thrombmodulin/Protein C-
und S-System sowie direkte Hemmwirkungen durch Antithrombin kontrolliert (NAWROTH,
1998). Das Antithrombin hemmt auch Faktor Xa sowie mit geringerer Aktivität andere
Gerinnungsfaktoren (BARTHELS und VON DEPKA, 2003a). An den Endothelfaktor
Thrombmodulin gebundenes Thrombin aktiviert Protein C, welches in Zusammenspiel mit
seinem Kofaktor Protein S die Faktoren Va und VIIIa proteolytisch inaktivieren kann
(BARTHELS und VON DEPKA, 2003a).
Dieser Komplex hemmt zudem den Plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1) und hat insofern
profibrinolytische Aktivität. Reguliert wird das Thrombmodulin/Protein C-System über den
heparinabhängigen Protein Ca-Inhibitor PAI-3 und den heparinunabhängigen α1-
Proteaseinhibitor α1-PI (DOLAN et al., 1989).
2 Literaturübersicht 29
Abbildung 2-2: Schematische Darstellung des intrinsischen und extrinsischen Weges der plas-
matischen Blutgerinnung. Schema modifiziert nach BARTHELS und VON DEPKA (2003).
Abbildung 2-3: Stark schematisierte Darstellung der Fibrinbildung. Durch die Abspaltung der
Fibrinopeptide A und B (nicht im Detail dargestellt) werden Bindungsstellen im Molekül frei, die
die Polymerisierung der so entstehenden Fibrinmonomere erlauben. Durch seitliche Assoziation
der Fibrinmonomere findet eine Fibrinfaserbildung statt, deren Struktur durch Faktor-XIII-
katalysierte Quervernetzung stabilisiert wird.
Prothrombin
Fibrin
F XIII � XIIIa
Vernetzung
Fibrinmonomere
Polymerisation
T h r o m b i n
-S--S- α β γ γ β α
Intrinsischer Weg Extrinsischer Weg
Negativ geladene Oberflächen
XIa, XIIa, Kallikrein
IXa + VIIIa + Phospholipide + Ca2+
Josso-SchleifeTenasekomplex
IXa + VIIIa + Phospholipide + Ca2+
Gefäßverletzung/Endothelschaden
TF-Faktor VIIa-Komplex
TF + VIIa + Phospholipide + Ca2+
Prothrombinasekomplex
X � Xa
V � Va
Calciumionen
Phospolipide
Prothrombin ���� Thrombin
Fibrinogen ���� Fibrin (polymer) Fibrin
FXIII � FXIIIa
2 Hämostase und Hämostasekomponenten 30
Plasminogen
Plasmin
PAI-1
α2-Antiplasmin
α2-Makroglobulin
t-PA, ut-PA
Kallikrein
Faktor XIIa
Fibrinogen/Fibrin Spaltprodukte, D-Dimere
2.4.4 Fibrinolyse
Die Fibrinolyse, d. h. die Wiederauflösung eines Gerinnsels erfolgt durch das proteolytische
Enzym Plasmin. Plasmin kann sowohl Fibrin, als auch Fibrinogen spalten. Das kleinste
Abbauprodukt des Fibrins im Verlauf der Fibrinolyse ist das wasserlösliche D-Dimer.
Plasmin entsteht aus der inaktiven Vorstufe Plasminogen durch enzymatische Einwirkung von
Plasminogenaktivatoren (PRIGLINGER und BINDER, 1998).
Es gibt zwei Typen der Serinproteasen, die als Plasminogenaktivatoren (PA) tätig werden.
Dies sind der Gewebetyp (t-PA), der aus Endothelzellen freigesetzt wird, sowie der
Urokinasetyp (ut-PA). Die Gegenspieler, die freies Plasmin sofort inaktivieren, sind das α2-
Antiplasmin (α2-AP) und das unspezifische α2-Makroglobulin (α2-MG). Auf der Stufe der
Plasminogenaktivatoren wird die plasminvermittelte Proteolyse durch vier Inhibitoren (PAI-1
bis 4) reguliert, wobei der PAI-1 der wichtigste Inhibitor ist (PRIGLINGER und BINDER,
1998). PAI-1 kommt auch in relevanten Mengen in Thrombozyten vor (GAWAZ, 1999). Eine
stark vereinfachte Darstellung der Fibrinolyse ist in Abbildung 2-4 zu finden.
Abbildung 2-4: Schematische Darstellung des Fibrinolysesystems. Die Aktivierung des
Plasminogens wird durch die Plasminogenaktivatoren t-PA bzw. ut-PA sowie die
Kontaktfaktoren Kallikrein und Faktor XIIa initiiert. Gegenspieler sind die
Plasminogenaktivatorinhibitoren (stellvertretend ist hier der wichtigste, der PAI-1, dargestellt)
sowie auf Ebene des Plasmins das α2-Antiplasmin und das α2-Makroglobulin. Endprodukt der
Fibrinolyse stellen D-Dimere dar.
2 Literaturübersicht 31
2.4.5 Diagnostik des plasmatischen Gerinnungssystems - Globaltests
Zu den Globaltests der Gerinnung gehören neben der Thromboplastinzeit (Synonyme: Quick-
Test, Prothrombinzeit) die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) und die
Thrombinzeit (BARTHELS und VON DEPKA, 2003b).
Thromboplastinzeit
Die Thromboplastinzeit wurde bereits 1935 in die Blutgerinnungsdiagnostik eingeführt
(QUICK et al., 1935) und unterliegt in der Humanmedizin der Norm 58910, Teil 1-4 des
Deutschen Instituts für Normung (DIN).
Bei Menschen und Haustieren wird die Thromboplastinzeit als Screening-Test für den
extrinsischen Weg (s. 2.4.3.1) der Blutgerinnung eingesetzt.
Zusammengefasst beruht das Testprinzip auf der Zugabe von Gewebethromboplastin und
Calciumionen zu plättchenarmem Citratplasma. Über die so erfolgte Aktivierung des
extrinsischen Weges der Blutgerinnung kommt es zu einer Fibrinbildung, deren erstes
Auftreten automatisch erfasst und in Sekunden angegeben wird (MISCHKE, 1999a;
BARTHELS und VON DEPKA, 2003b). In der Humanmedizin und weniger häufig auch in
der Veterinärmedizin wird der ermittelte Wert in Sekunden in den sog. Quick-Wert
transformiert, der die Gerinnungsaktivität in Prozent angibt (MISCHKE, 1999a; BARTHELS
und VON DEPKA, 2003b).
Aktivierte partielle Thromboplastinzeit
Die aPTT ist ein thrombozytenunabhängiger Globaltest, der die Faktoren des intrinsischen
Weges erfasst (PROCTOR und RAPAPORT, 1961). Neben den Gerinnungsfaktoren VIII, IX,
XI, XII, Präkallikrein und HMWK erfasst er auch die Faktoren X, V und Prothrombin sowie
Fibrinogen und überschneidet sich hier mit dem Quick-Test (LUSHER, 1996; BARTHELS
und VON DEPKA, 2003b). Die aPTT ist in der Humanmedizin über die DIN Norm 58908
spezifiziert. Einsatz findet er sowohl in der Human- als auch Veterinärmedizin v. a. in der
Diagnose von Hämophilien, Faktor-XI- und Faktor-XII-Mangelzuständen (BARNA und
TRIPLETT, 1989; MISCHKE, 1993). Da der Test heparin-, und in gewissem Masse auch
hirudinabhängig ist, wird er zudem in der Therapieüberwachung mit direkten
Antikoagulanzien eingesetzt (BARTHELS und VON DEPKA, 2003b). Die Aussagekraft,
2 Hämostase und Hämostasekomponenten 32
speziell für die Hirudintherapie ist nur im unteren Konzentrationsbereich gegeben, während
sie im hohen bzw. toxischen Bereich verloren geht (NOWAK, 2001).
Das Testprinzip beruht auf der Inkubation plättchenarmen Citratplasmas mit partiellen
Thromboplastinen und oberflächenaktiven Substanzen, die während der Inkubationszeit in
ihre aktivierte Form umgewandelt werden können. Nach der Zugabe von Calciumionen wird
die Gerinnung ausgelöst und die Zeit bis zum Eintritt der Fibrinbildung in Sekunden
gemessen (JOHNSTONE, 1988).
Thrombinzeit
Mit der Thrombinzeit wird die Bildung von Fibrin aus Fibrinogen beurteilt. Die gemessene
Zeit gibt an, wie lange eine standardisierte Thrombinlösung braucht, um im plättchenarmen
Citratplasma die Gerinnung auszulösen (JÜRGENS, 1952). Dieser Test umgeht somit die
vorgeschaltete Thrombinbildung über den extrinsischen oder intrinsischen Weg der
Blutgerinnung. Calciumionen sind für die Thrombin-Fibrinogen-Reaktion nicht notwendig,
beschleunigen jedoch die Fibrinpolymerisation (JOHNSTONE, 1988; BARTHELS und VON
DEPKA, 2003b). Der Test liefert eine Aussage über die Gerinnbarkeit des Fibrinogens und
damit zu Fibrinbildungsstörungen. Zudem eignet er sich als Suchtest bei Verdacht auf
schwere Fibrinogenmangelzustände (MISCHKE, 1999a).
2.4.6 Fibrinogenkonzentration
Die Fibrinogenkonzentration wird auch in der Veterinärmedizin regelmäßig im Rahmen
hämostaseologischer Untersuchungen bestimmt (CADE und ROBINSON, 1975; MISCHKE
und NOLTE, 1992). Ein Fibrinogenmangel ist häufig erworben und steht in Zusammenhang
mit gesteigertem intravasalem Umsatz bzw. Verlust. Eine Erhöhung der
Fibrinogenkonzentration ist ein unspezifischer Marker für Entzündungsvorgänge (MISCHKE,
1999a), da Fibrinogen zu den Akutphasenproteinen gehört, deren Syntheserate durch TNF-α
sowie IL-1 und IL-6 erhöht wird. Sowohl akute, als auch chronische Entzündungen gehen
daher häufig mit einer Erhöhung des Fibrinogenspiegels einher (MOSESSON, 1998).
Der Referenzbereich für das Schwein wird mit 1,6-3,9 g/l (Methode nach CLAUSS, 1957)
bzw. 3,2-7,2 g/l (Gravimetrie) angegeben (MISCHKE, 1999a). Die Messung erfolgt durch
verschiedene, semiquantitative Methoden, deren Aussage entweder die Menge gerinnbaren
2 Literaturübersicht 33
Fibrinogens (z. B. CLAUSS, 1957; STRASSLE, 1981) oder die Menge des Fibrinogen-
moleküls an sich ist (z. B. RATNOFF und MENZIE, 1951; INGRAM, 1952).
2.4.7 Disseminierte intravasale Gerinnung
Die disseminierte intravasale Gerinnung (disseminated intravascular coagulation, DIC) ist
ein erworbenes komplexes Syndrom, das im Verlaufe unterschiedlichster Erkrankungen
auftreten kann (SCHIEFER und SEARCY, 1975; MAMMEN, 2000). Sie ist ein dynamischer
Prozess, der durch eine Dysbalance zwischen pro- und antithrombotischem Potential des
Hämostasesystems ausgelöst wird (MADLENER und PÖTZSCH, 1998). Im deutschen
Sprachgebrauch findet sich häufig das Synonym Verbrauchskoagulopathie (LASCH et al.,
1971). Die DIC ist immer ein sekundäres Geschehen, das in milden, kompensierten
Verlaufsformen häufig asymptomatisch, in ihren schweren Formen jedoch mit einer hohen
Mortalität einhergehen kann (BARTHELS und VON DEPKA, 2003c). Alle Aspekte,- von der
Definition bis zu den pathophysiologischen Zusammenhängen- werden kontrovers diskutiert
(MADLENER und PÖTZSCH, 1998).
Kennzeichen einer DIC ist eine abnorme intravasale Thrombinbildung, die v. a. in der
Mikrozirkulation, also den kleinsten Kapillaren der Endstrombahn, zu diffuser Fibrinbildung
führen kann (CAREY und RODGERS, 1998). Diese diffuse Formation von Fibrin führt zu
einem hohen Umsatz („Verbrauch“) an Thrombozyten, Fibrinogen, Gerinnungsfaktoren und
Gerinnungsinhibitoren (MULLER-BERGHAUS et al., 1999). Der hohe Verbrauch an
Inhibitorpotenzial sowie eine initial häufig reduzierte fibrinolytische Aktivität verstärken den
Prozess (MULLER-BERGHAUS, 1989).
Entzündliche und insbesondere septische Prozesse zählen zu den Hauptursachen einer DIC,
wobei grundsätzlich alle Erreger in der Lage sind, eine DIC zu verursachen (LEVI und TEN
CATE, 1999). Häufig sind es jedoch gramnegative Bakterien bzw. deren Endotoxine, die zu
einer Expression des TFs und damit zu einer Aktivierung des extrinischen Weges der
Blutgerinnung führen (MADLENER und PÖTZSCH, 1998). Experimentelle Studien mit
gereinigtem Lipopolysaccharid (LPS) gramnegativer Bakterien zeigten, dass es schon kurz
nach der Infusion zu einem Anstieg der proinflammatorischen Zytokine TNF-α und IL-1,
etwas später auch des IL-6 kommt. LPS und TNF-α induzieren die TF-Expression auf
Endothelzellen und Monozyten und stellen damit die Auslöser für die Gerinnungsaktivierung
2 Hämostase und Hämostasekomponenten 34
dar (VAN DER POLL et al., 1995; BIEMOND et al., 1995a; BIEMOND et al., 1995b;
ESMON, 1999; MAMMEN, 2000; LEVI et al., 2003). IL-6 ist an der Induktion der Synthese
von Akutphaseproteinen wie Fibrinogen beteiligt und scheint ebenfalls eine wichtige Rolle in
der Gerinnungsauslösung im Rahmen der DIC zu spielen (STOUTHARD et al., 1996;
MADLENER und PÖTZSCH, 1998). Untersuchungen mit IL-1-Rezeptorantagonisten im
Tiermodell (Pavianmodell) konnten zeigen, dass auch IL-1 einen Beitrag zur
Gerinnungsaktivierung leistet (FISCHER et al., 1992). Die von Makrophagen freigesetzten
Zytokine stellen Bindeglieder zu anderen Mediatorsystemen dar, deren Effekte
zusammengenommen zu einer generellen endothelialen Entzündungsreaktion führen
(MADLENER und PÖTZSCH, 1998).
Die klinischen Symptome der DIC sind sehr stark vom Ausprägungsgrad abhängig und
können in schweren Fällen thrombotische Verschlüsse der Endstrombahn mit Ausfall der
dazugehörigen Gebiete und/oder generalisierte Blutungsneigung einschließen (TEN CATE et
al., 1999; LEVI und TEN CATE, 1999). Während die akute, dekompensierte DIC mit
markanten klinischen Symptomen einhergeht, bleibt die chronische bzw. kompensierte DIC
häufig unerkannt oder wird nur anhand von Laborbefunden diagnostiziert (MAMMEN,
2000). Die abnorme intravasale Thrombinbildung führt zu einer Erhöhung der
Aktivierungsprodukte der Gerinnung im Blut. Daneben kommt es zu einer Thrombozytopenie
und einem Abfall des Fibrinogens sowie der Gerinnungsfaktoren und Antithrombin, wenn der
Verbrauch die Syntheserate überwiegt. In der Regel ist im Verlauf der DIC auch die
Fibrinolyse gesteigert (MADLENER und PÖTZSCH, 1998; BARTHELS und VON DEPKA,
2003c).
Die DIC kann schematisch in drei Phasen eingeteilt werden (LASCH et al., 1971; MULLER-
BERGHAUS, 1989), denen aus klinischer Sicht noch eine vierte Phase, die Phase der
Erholung, angefügt werden kann (BARTHELS und VON DEPKA, 2003c). Die erste Phase
der kompensierten Aktivierung des hämostatischen Systems geht mit einem
Thrombozytenabfall, einer erhöhten (oder pseudonormalen) Fibrinogenkonzentration, einer
Aktivitätssteigerung der Faktoren V und VIII, einem Verbrauch an Antithrombin und Protein
C sowie einer erhöhten Konzentration von Aktivierungsprodukten der Gerinnung einher. In
der Regel sind die Gerinnungszeiten der Globaltests in dieser Phase verkürzt oder noch
normal (MADLENER und PÖTZSCH, 1998; BARTHELS und VON DEPKA, 2003c). Eine
2 Literaturübersicht 35
Verminderung des fibrinolytischen Potentials in dieser Phase wird als begünstigender Faktor
für die Entwicklung einer voll ausgeprägten DIC angesehen (MULLER-BERGHAUS, 1989;
MULLER-BERGHAUS et al., 1999; LEVI und TEN CATE, 1999). Die zweite Phase der
dekompensierten Aktivierung des hämostatischen Systems und eines u. U. messbaren Defizits
des Gerinnungspotentials geht mit einem verstärkten Thrombozytenabfall, einer
Verminderung des Faktors V, einer Verminderung des Fibrinogens und einer Verlängerung
der Gerinnungszeiten in den Globaltests aPTT und Quick-Test einher. Die
Aktivierungsprodukte der Gerinnung sowie lösliches Fibrin sind im Plasma erhöht.
Mikrothromben können in dieser Phase in der Mikrozirkulation entstehen und zu
Organdysfunktionen v. a. in den Nieren, der Leber und der Lunge führen (MADLENER und
PÖTZSCH, 1998). Die dritte Phase entspricht dem Vollbild der DIC. Häufig liegt in der
späten dritten Phase ein Defibrinierungssyndrom mit nicht mehr messbaren
Fibrinogenspiegeln vor, da als Gegenregulation der intravasalen Gerinnung eine Aktivierung
des Fibrinolysesystems stattfindet. Die Fibrin(ogen)-Degradationsprodukte sind stark erhöht.
In dieser Situation besteht Blutungsneigung, Gefäßverschlüsse sind aufgrund des erschöpften
Fibrinolysepotenzials häufig irreversibel und führen in der Terminalphase zu
Organschädigungen. Die Gerinnungszeiten in den Globaltests sind stark verlängert oder nicht
mehr messbar. Thrombozyten, Fibrinogen sowie die Faktoren V und VIII sind stark
vermindert. Sowohl die Aktivierungsprodukte der Gerinnung als auch die Fibrin(ogen)-
Degradationsprodukte sind stark erhöht (BARTHELS und VON DEPKA, 2003c). Wird die
dritte Phase überlebt, erholen sich in der vierten Phase die Werte aufgrund einer adäquaten
Gegensteuerung wieder (BARTHELS und VON DEPKA, 2003c).
2 Pharmakologische Beeinflussung des Gerinnungssystems 36
2.5 Pharmakologische Beeinflussung des Gerinnungssystems
2.5.1 Direkt wirkende Antikoagulantien
Zu den direkt wirkenden Antikoagulantien gehört neben Heparin und Heparinoiden auch das
Hirudin (GLUSA et al., 2001).
2.5.1.1 Hirudin
Hirudin ist ein selektiver Hemmstoff der Serinproteinase Thrombin, der ursprünglich aus dem
Speichel des medizinischen Blutegels Hirudo medicinalis gewonnen wurde (NOWAK, 1998).
Hirudin ist ein einkettiges Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ca. 7000 Da, welches
aus 65 Aminosäuren besteht. Die intramolekulare Stabilität wird durch Disulfidbrücken
gewährleistet (MARKWARDT et al., 1982; MARKWARDT, 1991). Hirudin und Thrombin
bilden einen hochaffinen monovalenten stöchiometrischen Komplex im Verhältnis 1:1
(NOWAK, 1998), der ausserordentlich stabil ist (GLUSA et al., 2001). Thrombin verliert
dabei sowohl seine katalytische Aktivität im Gerinnungssystem als auch seine Fähigkeit, an
Zellrezeptoren zu binden. Bei entsprechender Dosierung wird das gesamte Thrombin im Blut
irreversibel gehemmt, andere Proteasen werden dabei selbst im mikromolaren
Konzentrationsbereich nicht beeinflusst (GLUSA et al., 2001).
Hirudin wird nur nach parenteraler Applikation wirksam, da das Polypeptid im
Gastrointestinaltrakt zerstört wird (MARKWARDT et al., 1982). Die Eliminations-
halbwertszeit nach subkutaner Applikation beträgt zwei bis vier Stunden wobei das Hirudin
über die Nieren inaktiviert und ausgeschieden wird. Durch die Kopplung an einen
hochmolekularen Träger wie Polyethylenglykol (PEG) ändert sich die Pharmakokinetik
beträchtlich. PEG-Hirudin hat eine achtfach verlängerte Eliminationshalbwertszeit und wird
verzögert aus subkutanen Injektionsdepots resorbiert (GLUSA, 1988; NOWAK, 1998).
Die antithrombotische Wirksamkeit wurde in einer Vielzahl von Thrombosemodellen
nachgewiesen, dabei ist für die vorliegende Arbeit besonders die Wirksamkeit im Rahmen der
experimentell induzierten intravasalen Gerinnung von Bedeutung (NOWAK und
MARKWARDT, 1980c; MARKWARDT et al., 1982; NOWAK und MARKWARDT, 1991).
2 Literaturübersicht 37
NOWAK et al. konnten 1980 nachweisen, dass Hirudin in der Lage ist, die Entstehung einer
DIC nach Endotoxininfusion vollständig zu unterbinden.
Die Therapiekontrolle kann anhand der sog. Ecarin Clotting Time erfolgen, da dieser
Gerinnungstest im therapeutischen Bereich des Hirudins eine lineare Dosis-
Gerinnungszeitbeziehung zeigt (NOWAK und BUCHA, 1996; NOWAK, 2003).
2.5.2 Hemmstoffe der Thrombozytenaggregation bzw. –funktion
Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten bzw. im Vorfeld getesteten Wirkstoffe sollen im
Folgenden kurz dargestellt werden.
2.5.2.1 Acetylsalicylsäure
Acetylsalicylsäure (ASS) wurde 1897 erstmals in chemisch reiner Form hergestellt. Neben
der analgetischen, antipyretischen und antiinflammatorischen Wirkung besitzt die ASS eine
Hemmwirkung auf die Thrombozytenaggregation (CRAVEN, 1950). Die Wirkung beruht auf
einer Hemmung der Cyclooxygenase (COX), welche prinzipiell in zwei Isoformen, COX-1
und COX-2, auftritt. Beide Isoformen werden durch die ASS gehemmt, für die Thrombozyten
ist jedoch nur COX-1 relevant (PATRONO, 1994).
Es kommt durch eine irreversible Acetylierung der COX zu einer Hemmung der Thromboxan
A2 (TXA2) Bildung (ROTH und MAJERUS, 1975; ROTH et al., 1975). Da die kernlosen
Thrombozyten über einen limitierten Proteinsyntheseapparat verfügen, kann COX nur
begrenzt resynthetisiert werden. Somit findet eine nahezu irreversible Hemmung statt. Die
parallel stattfindene Prostacyclinsynthese ist von untergeordneter Bedeutung, da Prostacyclin
von Endothelzellen rasch wieder synthetisiert wird (REILLY und FITZGERALD, 1988;
PATRONO, 1994).
2.5.2.2 Abciximab
Die Bildung stabiler Plättchenaggregate wird durch die Bindung von Fibrinogen an den in der
Plättchenmembran lokalisierten GPIIb/IIIa-Rezeptor vermittelt. Diese Interaktion ist
Angriffspunkt des Fab-Fragments des chimären monoklonalen Antikörpers 7E3 (Abciximab,
ReoPro®), der den Rezeptor quasi irreversibel blockiert (FAULDS und SORKIN, 1994;
COLLER et al., 1995). Abciximab muss intravenös verabreicht werden; dabei ist die
2 Pharmakologische Beeinflussung des Gerinnungssystems 38
biologische Halbwertszeit erheblich länger als die Plasmahalbwertszeit, die mit zehn bis 30
min angegeben wird (ROSOVE, 2004).
2.5.2.3 Tirofiban
Tirofiban (Aggrastat®) ist ein nichtpeptiderger Antagonist des GPIIb/IIIa-Rezeptors. Auch
diese Substanz muss parenteral appliziert werden, die Halbwertszeit beträgt 1,4-1,8 Stunden
(ARTOIS et al., 2002). Auch Tirofiban fand Anwendung in Schweinemodellen (SHEN et al.,
2000).
2.5.2.4 Clopidogrel
Clopidogrel, ein Thienopyridinderivat, hemmt irreversibel die ADP-Bindung an den ADP-
Rezeptor P2 der Thrombozyten. Es ist das chemische Analog des Ticlopidins (QUINN und
FITZGERALD, 1999). Beide Wirkstoffe werden erst in ihrer metabolisierten Form wirksam
und müssen durch das Cytochrom P450 System der Leber aktiviert werden (SAVI et al.,
1994). In Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass die Kombination mit ASS die Wirkung
des Clopidogrels bzw. des Ticlopidins potenziert (HERBERT et al., 1996; HERBERT et al.,
1998; HARKER et al., 1998).
3 Material und Methoden
3.1 Tiere und Material
3.1.1 Tiere und Versuchsaufbau
Für alle Versuchsvorhaben, die in den Stallungen des Europäischen Referenzlabors für
Klassische Schweinepest (EURL) in Hannover durchgeführt wurden, fanden Läuferschweine
der Deutschen Landrasse Verwendung. Die Tiere stammten aus der Zucht des Lehr- und
Forschungsguts der Tierärztlichen Hochschule Hannover, Schäfersberg, Ruthe. Zum
Zeitpunkt der Einstallung waren die Tiere acht bis zehn Wochen alt und zeigten bei der
klinischen Untersuchung am Tag der Einstallung keine klinischen Auffälligkeiten. Zur
individuellen Kennzeichnung wurden Ohrmarken und farbliche Markierungen eingesetzt. Die
Tiere wurden einstreulos unter Hochsicherheitsbedingungen bei einem negativen Luftdruck
von -100 Pa gehalten und einmal täglich mit einem kommerziell erhältlichen Futter versorgt
(Gekörntes Ferkelfutter S 110, Gebrüder Weiterer, Algermissen). Die Wasserzufuhr erfolgte
ad libitum über eine automatische Tränkeeinrichtung. Alle Tiere wurden zu Versuchsbeginn
auf das Vorhandensein neutralisierender Antikörper gegen Pestiviren untersucht und erwiesen
sich als negativ. Im Versuchsverlauf wurden Tiere mit einem Clinical Score über 20 aus
Tierschutzgründen schmerzlos durch Euthanasie getötet (intravenöse Applikation einer
Überdosis Pentobarbital). Gleiches galt für Tiere, die bei niedrigerem Clinical Score nicht
vertretbare Leiden zeigten. An allen Tieren wurde zur Einschätzung der pathologisch-
anatomischen Befunde eine postmortale Untersuchung vorgenommen.
In Vorversuchen, die in den Räumen der Arbeitsgruppe (AG) „Pharmakologische
Hämostaseologie“ der Medizinischen Fakultät der Universität Jena durchgeführt wurden,
wurden Läuferschweine der Deutschen Landrasse und Hybridschweine eingesetzt. Die Tiere
wurden in einer Gewichtsklasse von 10-18 kg aus einem kommerziellen Schweinemastbetrieb
in Thüringen bezogen. Auch diese Tiere wurden vor Versuchsbeginn einer klinischen
Untersuchung unterzogen.
3 Tiere und Material 40
In den Stallungen des EURLs in Hannover wurden folgende Tierversuche unter den unten
aufgeführten Aktenzeichen und Zielsetzungen durchgeführt:
A) Nach § 8a des Tierschutzgesetzes vom 25.05.1998 anzeigepflichtige Tierversuche mit der
Zielsetzung der Charakterisierung der Pathogenese von KSP-Feldvirusisolaten unter dem
Aktenzeichen 01A 78:
1. Studien zur Pathogenese der KSP: Hämatologische, hämostaseologische und
histopathologische Untersuchungen.
Dazu wurden sieben Läufer eingestallt und randomisiert in zwei Gruppen eingeteilt. Gruppe 1
umfasste fünf Tiere, die mit dem hochvirulenten KSPV-Isolat CSF0634 infiziert wurden. Die
Infektion erfolgte mit fünf ml virushaltigen Zellkulturüberstandes. Die Virusdosis betrug
103,5
KID50 (kulturinfektiöse Dosis50) pro ml. Gruppe 2 diente als Negativkontrolle und
umfasste zwei Tiere, die nicht infiziert wurden. An den Tagen drei, sieben, elf und 14 nach
der Infektion erfolgte eine Blutentnahme. Die Proben wurden hämatologischen,
hämostaseologischen und virologischen Untersuchungen zugeführt. Die klinischen Symptome
inklusive der Körpertemperatur wurden über ein standardisiertes Bewertungsschema erfasst,
bewertet und dokumentiert. Dieser sog. Clinical Score modifiziert nach MITTELHOLZER et
al. (2000) belegt die auftretenden Symptome mit einer Punktzahl, deren Addition eine
Bewertung der Symptomatik möglich macht und ist unter 3.2.7.1 näher beschrieben. Die
Versuchsdauer wurde durch die klinischen Verläufe der Erkrankung bestimmt und betrug 21
Tage. Organmaterial (Niere, Leber, Lunge, Milz, Lymphknoten) wurde in Formalin fixiert
und für die Lichtmikroskopie aufgearbeitet.
2. Voruntersuchungen zur Blutgerinnung im Verlauf der Klassischen Schweinepest
Für dieses Versuchsvorhaben wurden ebenfalls sieben Läufer eingestallt und zufällig in zwei
Gruppen geteilt. Gruppe 1 umfasste fünf Tiere, die mit dem hochvirulenten KSPV-Isolat
CSF0634 infiziert wurden, Gruppe 2 enthielt zwei Kontrolltiere, die unter gleichen
Bedingungen gehalten, jedoch nicht infiziert wurden. Um den Stress der Tiere durch die
Untersuchungen und Zwangsmassnahmen sowie die damit verbundenen Veränderungen
hämatologischer und hämostaseologischer Parameter zu minimieren, wurde eine
Eingewöhnungsphase von 14 Tagen eingeräumt. An den ersten vier Tagen des Experimentes
wurde den Tieren täglich Blut entnommen, danach wurde ein Entnahmeintervall von drei
3 Material und Methoden 41
bzw. vier Tagen gewählt. Das entnommene Blut wurde für die Untersuchung mittels
hämatologischer und hämostaseologischer Methoden aufbereitet. In diesem Versuch fand
zusätzlich eine Untersuchung des Plasmas im Ethanol Gelation Test statt. An den Tagen null,
vier, sieben und zehn nach der Infektion wurden Leukozyten gewonnen und mittels
Virusisolierung auf KSPV untersucht. Die klinischen Symptome inklusive der
Körpertemperatur wurden über ein standardisiertes Bewertungsschema erfasst und
dokumentiert. Die Versuchsdauer wurde durch die klinischen Verläufe der Erkrankung
bestimmt und betrug 24 Tage. Organmaterial wurde in Formalin fixiert bzw. bei -80°C
eingefroren.
B) Nach § 8 des Tierschutzgesetzes vom 25.05.1998 genehmigungspflichtige Tierversuche:
1. Tierversuchsvorhaben mit der Bezeichnung:
Untersuchung zur Pathogenese der Klassischen Schweinepest (KSP): Pharmakologische
Beeinflussung des plasmatischen Gerinnungssystems mittels Hirudin zum Zwecke der
Abklärung der Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems. Das Vorhaben wurde bei der
Bezirksregierung Hannover unter dem Aktenzeichen 04/899 geführt.
Ziel dieses Versuches war, die Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems in der
Pathogenese der Klassischen Schweinepest zu bewerten. Zu diesem Zweck fand eine
pharmakologische Intervention mit PEG-Hirudin, einem spezifischen Thrombininhibitor
(Gerinnungshemmer), statt. Dieses Medikament hemmt die Endstrecke der plasmatischen
Blutgerinnung und findet in der Humanmedizin Anwendung in der Prophylaxe
thrombembolischer Ereignisse und wird in der Dialyse eingesetzt, wenn vom Patienten das
Standardmittel Heparin nicht oder nicht mehr vertragen wird. Zur Sicherung eines
therapeutischen Plasmaspiegels war die Überwachung mittels Ecarin Clotting Time (ECT)
notwendig. Es handelt sich dabei um ein standardisiertes Verfahren zur Erfassung und
Überwachung des Plasmahirudinspiegels. Die Methode ist unter 3.2.7.2 näher beschrieben,
die genaue Vorgehensweise im Tierversuch unter 3.2.1.
Der Versuchsaufbau sah vor, zwei Gruppen zu je fünf Läuferschweinen mit dem hoch-
virulenten KSPV-Isolat CSF0634 intranasal zu infizieren (fünf ml virushaltiger
Zellkulturüberstand). Die Infektionsdosis lag bei 104,75
KID50 pro ml. Eine Gruppe (Gruppe
2) blieb als positive Kontrolle ohne Behandlung, der anderen Gruppe (Gruppe 1) wurde
3 Tiere und Material 42
einmal täglich PEG-Hirudin subkutan appliziert. Die Dosierung des PEG-Hirudins erfolgte
anhand der ECT mit dem Ziel, einen Plasmahirudinspiegel von 0,5 –1,5 µg/ml zu erhalten.
Den Tieren beider Gruppen wurde täglich ca. fünf ml venöses Blut aus der Vena jugularis
externa entnommen. Aus dem gewonnenen Vollblut wurden zunächst die Parameter des
Differentialblutbildes (Leukozytenzahl, Thrombozytenzahl, Plättchenvolumen und
-verteilung) bestimmt. Anschließend wurde (Citrat-) Plasma gewonnen und in der ECT,
sowie verschiedenen gerinnungsanalytischen Tests eingesetzt (Globaltests der Gerinnung,
Bestimmung des Fibrinogengehaltes). Vor Versuchsbeginn, am zehnten Tag nach der
Infektion und am Tag der Euthanasie wurde zudem eine kleine Menge EDTA-Blut (ca. 2 ml)
entnommen, die dann der virologischen Diagnostik (Virusneutralisationstests, Virusnachweis
mittels Zellkultur und Polymerasekettenreaktion) zugeführt wurde. Die klinischen Symptome
inklusive der Körpertemperatur wurden über ein standardisiertes Bewertungsschema erfasst
und dokumentiert. Die Versuchsdauer wurde durch die klinischen Verläufe der Erkrankung
bestimmt und betrug 18 Tage gemessen vom Tag der Infektion. Organmaterial (Niere, Leber,
Lunge, Milz, Lymphknoten) wurde zur späteren Aufbereitung für die Lichtmikroskopie
entnommen und in Formalin aufbewahrt.
2. Tierversuchsvorhaben mit der Bezeichnung:
Untersuchung zur Pathogenese der Klassischen Schweinepest (KSP): Pharmakologische
Beeinflussung der Thrombozytenaggregation mittels ADP-Rezeptorblockern und COX-1-
Inhibitoren zum Zwecke der Abklärung der Rolle von Thrombozyteninteraktionen in der
Pathogenese der Klassischen Schweinepest.
Das Vorhaben wurde bei der Bezirksregierung Hannover unter dem Aktenzeichen 04/835
geführt. Die Zielsetzung des Vorhabens lässt sich wie folgt charakterisieren:
Durch die pharmakologische Intervention mit den Medikamenten ASS und Clopidogrel
(s. 3.1.2) sollte die Rolle der Plättcheninteraktionen in der Pathogenese der KSP bewertet
werden. Beide Medikamente hemmen auf unterschiedlichen Wegen irreversibel die
Plättchenaggregation und finden in der Humanmedizin Anwendung in der Prophylaxe
thrombembolischer Ereignisse, wie z.B. des Herzinfarkts. Zur Sicherung eines
therapeutischen Plasmaspiegels war die Überwachung mittels Thrombozytenaggregationstest
notwendig. Es handelt sich dabei um ein turbidimetrisches Verfahren zur Messung der durch
3 Material und Methoden 43
lösliche Induktoren ausgelösten Thrombozytenaggregation unter standardisierten
Bedingungen. Die nähere Beschreibung der Methode befindet sich unter 3.2.4.7, die genaue
Vorgehensweise im Tierversuch unter 3.2.1.
In einem viertägigen Vorversuch sollte die Wirksamkeit der Wirkstoffe Clopidogrel
(Iscover®) und ASS (ASS ratiopharm®) überprüft, und ein Dosierungsschema erarbeitet
werden. Drei Läuferschweine wurden zu diesem Zweck eingestallt und an drei aufeinander
folgenden Tagen mit Clopidogrel und ASS behandelt (s. 3.2.1). Die Wirksamkeit wurde
anhand einer Thrombozytenaggregationsmessung (s. 3.2.4.7) überprüft. Anhand der
gewonnen Ergebnisse wurde ein Dosierungsschema erstellt und in das unten aufgeführte
Vorhaben integriert.
Der Versuchsaufbau des Hauptversuchs sah vor, zwei Gruppen zu je sechs Läuferschweinen
der Deutschen Landrasse mit dem hochvirulenten KSPV-Stamm CSF0634 intranasal zu
infizieren. Die Infektion erfolgte mit fünf ml virushaltigen Zellkulturüberstandes. Die
Virusdosis betrug 104,5
KID50 pro ml. Die Tiere wurden bei der Ankunft randomisert in zwei
Gruppen geteilt. Eine Gruppe wurde täglich mit ASS und Clopidogrel behandelt, während die
Kontrollgruppe keine Medikamente erhielt. Beiden Gruppen wurde täglich ca. fünf ml
venöses Blut aus der Vena jugularis externa entnommen. Aus dem gewonnenen Vollblut
wurden zunächst hämatologische Parameter bestimmt, bevor durch Zentrifugation
Citratplasma gewonnen, und in Thrombozytenaggregationstests sowie weiteren
gerinnungsanalytischen Untersuchungen eingesetzt wurde (Globaltests der Gerinnung,
Bestimmung des Fibrinogengehaltes). Vor Versuchsbeginn, am zehnten Tag nach der
Infektion und am Tag der Euthanasie wurden zudem kleine Mengen EDTA-Blut und
Nativblut (ca. zwei ml) entnommen, die dann der virologischen Diagnostik im Sinne eines
Virusneutralisationstests und eines Virusnachweises zugeführt wurden. Die klinischen
Symptome inklusive der Körpertemperatur wurden über ein standardisiertes
Bewertungsschema erfasst und dokumentiert. Die Versuchsdauer wurde durch die klinischen
Verläufe der Erkrankung bestimmt und betrug 18 Tage gemessen vom Tag der Infektion.
Organmaterial (Niere, Leber, Lunge, Milz, Lymphknoten) wurde zur späteren Aufbereitung
für die Lichtmikroskopie entnommen und in Formalin aufbewahrt.
3 Tiere und Material 44
C) Vorversuche, die in den Räumen der der AG „Pharmakologische Hämostaseologie“ der
Medizinischen Fakultät der Universität Jena durchgeführt wurden.
Zur Etablierung der hämostaseologischen Methoden, der Auswahl der geeigneten Wirkstoffe
und zur Untersuchung der Pharmakokinetik der gewählten Wirkstoffe, wurden Vorversuche
in Kooperation mit der AG „Pharmakologische Hämostaseologie“ der Medizinischen Fakultät
der Universität Jena durchgeführt. Die Wirksamkeit des Hirudins im Schwein war bereits
belegt (NOWAK und MARKWARDT, 1980b), die Wirkstoffe zur Beeinflussung der
Thrombozyteninteraktion sowie die Monitoringmethoden mussten vorab getestet werden.
Unterschiedliche, in der Humanmedizin gebräuchliche Wirkstoffe wurden daher zunächst in
vitro und nachfolgend in verschiedenen Formulierungen, Applikationsarten und Dosierungen
an narkotisierten Schweinen getestet, und ihre Wirkung anhand von Thrombozyten-
aggregationstests mit verschiedenen Induktoren untersucht. Parameter des Gerinnungssystems
und hämatologische Parameter wurden dabei ständig überwacht. Nur die pharmakologisch
wirksamen Substanzen mit hinreichender Wirksamkeit im Schwein wurden weiterhin geprüft.
Die geprüften Wirkstoffe und die verwendeten Versuchsansätze sind unter 3.2.5 näher
charakterisiert.
3.1.2 Pharmakologisch wirksame Substanzen
Für das Versuchsvorhaben unter Verwendung von Clopidogrel und ASS wurden kommerziell
erhältliche Formulierungen aus der Humanmedizin eingesetzt. Clopidogrel wurde in der
Formulierung der Fa. Bristol-Myers Squibb Pharma EEIG, Hounslow, Großbritannien
eingesetzt. Die unter dem Markennamen Iscover® erhältlichen Filmtabletten enthielten je
75 mg Clopidogrel als Clopidogrelhydrogensulfat. ASS fand in der Formulierung der
Fa. Ratiopharm GmbH, Ulm, Verwendung. Die Tabletten, ASS-ratiopharm® 500, enthielten
je 500 mg Acetylsalicylsäure.
Das im Versuch verwendete PEG-Hirudin sowie das zur Überprüfung des Plasmaspiegels
notwendige Ecarin, wurden freundlicherweise von Prof. Goetz Nowak zur Verfügung gestellt
(AG „Pharmakologische Hämostaseologie“ der Medizinischen Fakultät der Universität Jena).
Aus dem Ecarin wurde gebrauchsfertiges Ecarin-Reagenz hergestellt, welches lyophilisiert
und gekühlt bis zum Gebrauch gelagert wurde (s. 3.2.7.2).
3 Material und Methoden 45
3.1.3 Gewinnung und Aufbereitung der Blutproben
Für die Blutentnahme aus der Vena jugularis wurden kommerziell erhältliche
Blutentnahmeröhrchen und Adaptersysteme der Fa. KABE®
Labortechnik GmbH,
Nümbrecht-Elsenroth, verwendet. Zur Blutentnahme wurden die Tiere von zwei
Hilfspersonen auf dem Rücken fixiert. Je nach Verwendungszweck wurde das
kontaminationsfrei entnommene Blut in die entsprechenden Blutentnahmeröhrchen
aufgenommen und somit Nativblut, EDTA- oder Citratblut gewonnen.
EDTA-Blutproben zur Bestimmung des Differentialblutbildes wurden noch am selben Tag
ohne weitere Aufarbeitung der Untersuchung zugeführt. Die Aufarbeitung von EDTA-
Blutproben zur Gewinnung von Leukozyten für die Virusisolierung ist unter 3.2.2.3
beschrieben. Blutproben zur Gewinnung von Serum aus Nativblut wurden für 15 min bei
1215 x g zentrifugiert, das gewonnene Serum in Kryoröhrchen (Fa. Greiner, Nürtingen)
portioniert und bis zur weiteren Bearbeitung bei -80°C aufbewahrt. Für die Globaltests der
Gerinnung sowie die Bestimmung des Fibrinogenspiegels (s. 3.2.4.1-3 und 3.2.4.5) wurden
die Citratblutproben für 10 min bei 437 x g zentrifugiert und der Überstand in Kryoröhrchen
portioniert. Für die Untersuchungen der Gerinnungsparameter konnte das Plasma bei -80°C
für einige Wochen tiefgefroren werden, für den Ethanol Gelation Test (s. 3.2.4.6) musste es
sofort verarbeitet werden. Citratblutproben für die Thrombozytenaggregationstests wurden
zunächst zur Gewinnung des plättchenreichen Plasmas bei 31 x g für 20 min (ohne Bremse)
zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen und der Rest zur Gewinnung des
plättchenarmen Plasmas für 15 min bei 941 x g zentrifugiert. Der dort entstandene Überstand
wurde ebenfalls abpipettiert und in Kryoröhrchen abgefüllt.
3.1.4 Viren
Für alle Infektionsversuche im Rahmen dieser Arbeit wurde das KSPV Isolat mit der
Datenbanknummer CSF0634 eingesetzt. Dieses Isolat wurde 1999 aus einem
niedersächsischen Hausschwein isoliert und dem Genotyp 2.3* Uelzen zugeordnet
(WONNEMANN et al., 2001). Die passwortgeschützte Datenbank des EURLs ist im Internet
unter: http://viro08.tiho-hannover.de/eg/eurl.virus.db.htm zu finden und enthält neben den
Daten zur Herkunft auch Informationen zur genetischen Einordnung sowie Sequenzen
3 Tiere und Material 46
ausgewählter viraler Genomabschnitte. Isolat CSF0634 wurde als hochvirulent eingestuft
(FLOEGEL-NIESMANN et al., 2003).
Als Referenzstamm in Virusneutralisationstests und als Positivkontrolle in Virusisolierungen
wurde der KSPV-Stamm Alfort 187 eingesetzt. Dieses Virus ist in der Datenbank unter der
Nummer CSF0902 zu finden und gehört zum Genotyp 1.1. Virusneutralisationstests zum
Nachweis kreuzreagierender Antikörper wurden mit dem BVDV Laborstamm NADL und
dem BDV Stamm Moredun durchgeführt.
3.1.5 Diagnostische Antikörper
Der Nachweis des KSPV in Zellkulturen erfolgte mit dem pestivirusspezifischen
monoklonalen Antikörper (mAK) BVD/C16. Der Antikörper ist gegen das
Nichtstrukturprotein NS2-3 aller Pestiviren gerichtet (GREISER-WILKE et al., 1992b) und
wurde am Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover hergestellt (PETERS
et al., 1986; MOENNIG et al., 1987). Er wird am EURL routinemäßig in der
Schweinepestdiagnostik verwendet. Zu diesem Zweck wird der monoklonale Antikörper
(mAk) an Peroxidase gekoppelt eingesetzt (C16-PO-Konjugat).
3.1.6 Zelllinien
Für alle zellkulturellen Arbeiten mit dem KSPV bzw. für die serologischen Untersuchungen
wurde die permanente porcine Zelllinie PK(15)A (porcine kidney (15) Amsterdam)
eingesetzt. Die epitheloide Zelllinie wird am EURL routinemäßig in der KSP-Diagnostik
eingesetzt. Sie wurde 1974 durch Einzelzellklonierung erhalten (LIESS, persönliche
Mitteilung). Die Zelllinie wird regelmäßig auf Mykoplasmen untersucht und ist frei von
Pestiviren. Die Kultivierung ist unter 3.2.2.1 beschrieben.
Serologische Untersuchungen zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen das BDV
wurden auf der permanenten Schafthymuszelllinie (SFT-R) durchgeführt, die aus der
Zellbank des Friedrich-Loeffler-Institutes (Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit)
stammte und dort unter der Katalognummer 43 geführt wird.
Die serologische Überprüfung der Versuchstiere auf Antikörper gegen das BVDV erfolgte auf
primären, fetalen Kälbernierenzellen (FKN) (FREY und LIESS, 1971).
3 Material und Methoden 47
3.1.7 Sonstige Materialien
Die Rezepturen für verwendete Medien, Puffer, Lösungen und Reagenzien, sowie die
Herkunft der dafür benötigten Chemikalien sind im Anhang unter und 8.3 aufgelistet.
Kommerziell erhältliche Reagenzien für die Gerinnungsdiagnostik, Enzyme linked
immunosorbent assay (ELISA) Testkits sowie Reagenzien für die Thrombozyten-
aggregationstests finden sich im Anhang unter 8.5. Eine Aufstellung der Geräte und
Gebrauchsgegenstände ist unter 8.6 aufgeführt. Die Verbrauchsmittel sind unter Punkt 8.7
zusammengestellt.
3 Methoden 48
3.2 Methoden
3.2.1 Behandlung der Versuchstiere und klinische Parameter
3.2.1.1 Applikation und Dosierung der eingesetzten Pharmaka
Clopidogrel und ASS wurden den Tieren oral verabreicht. Um die Aufnahme zu
gewährleisten, wurden die Tabletten fein zerkleinert und über eine 20 ml Einwegspritze
(Terumo®
, Terumo Deutschland GmbH, Eschborn) per os verabreicht. Die Dosierung wurde
nach Vorgabe der Vorversuche auf 500 mg Acetylsalicylsäure und 75 mg Clopidogrel pro
Tier und Tag festgesetzt. Nach der Voreinstellung im Haupttierversuch stellte sich heraus,
dass diese Dosierung auf längere Sicht zu niedrig angesetzt war. Daher wurde die Dosierung
der Acetylsalicylsäure auf 1000 mg pro Tier und Tag heraufgesetzt, die des Clopidogrels auf
150 mg pro Tier und Tag.
PEG-Hirudin wurde als subkutane Injektion an der Bauchwand bzw. im Nackenbereich
appliziert. Für die Applikation wurde eine zwei ml Einwegspritze mit aufgesetzter 22 G
Kanüle (beide Terumo®
, Terumo Deutschland GmbH, Eschborn) verwendet. Zwei Stunden
nach der PEG-Hirudin-Applikation wurde eine Blutprobe zur Bestimmung des
Plasmahirudinspiegels entnommen und mittels ECT untersucht (s. 3.2.7.1). Die Dosierung
wurde täglich anhand des Plasmahirudinspiegels individuell angepasst. Die Initialdosis betrug
für alle Läufer fünf mg PEG-Hirudin. Der therapeutische Plasmahirudinspiegel sollte
zwischen 0,5 und 1,5 µg/ml liegen.
3.2.1.2 Bestimmung des Clinical Score nach MITTELHOLZER et al. (2000)
Die Bewertung und Dokumentation der klinischen Symptome wurde im Verlauf der Versuche
täglich anhand des Standardprotokolls, welches am EURL gebräuchlich ist, vorgenommen.
Das Untersuchungsschema stützt sich auf die Dokumentation der klinischen Erscheinungen
anhand eines Punktesystems (MITTELHOLZER et al., 2000). Dabei wurden neun KSP-
relevante Parameter (Lebhaftigkeit, Haltung, Nährzustand, Atmung, Gang, Haut,
Augen/Konjunktiven, Appetit und Kotabsatz) je nach Ausprägungsgrad mit einer Punktzahl
von null bis drei belegt (ohne besonderen Befund (o.b.B.), +, ++ und +++). Die Addition der
vergebenen Punkte ergab die klinische Punktzahl (clinical score) eines Tieres. Die maximale
3 Material und Methoden 49
Punktzahl betrug 27 Punkte. Der Clinical Score (CS) wurde sowohl für das Einzeltier
errechnet, als auch als Gruppenmittelwert dokumentiert. Das Untersuchungsschema von
MITTELHOLZER et al. (2000) enthält einen zehnten Parameter, „Futter im Trog“, der
aufgrund der Haltungsbedingungen (Gruppenhaltung) für das Einzeltier nicht zu errechnen
war und somit routinemäßig nicht dokumentiert wurde.
3.2.1.3 Erfassung der Körpertemperatur
Die Körpertemperatur wurde einmal täglich bei jedem Tier mit einem digitalen
Fieberthermometer (Geratherm®plus, Geratherm Medical AG, Geschwenda) rektal ermittelt
und dokumentiert.
3.2.1.4 Erfassung pathologisch-anatomischer Veränderungen
Analog zur Bestimmung des CS wurde für die Erfassung der pathologisch-anatomischen
Befunde ein standardisiertes Untersuchungsschema angewandt. In Anlehnung an das von
FLOEGEL-NIESMANN et al. (2003) zur Errechnung eines Pathological Score erarbeitete
Untersuchungsschema wurden alle Organsysteme untersucht und nach Maßgabe des EURL
Standardprotokolls festgehalten. Besonderes Augenmerk galt Haut, Unterhaut und Serosen,
den Lymphknoten, Tonsillen, Milz, Nieren, Ileum inklusive Ileocaecalklappe, Rektum sowie
Herz und Respirationstrakt.
3.2.2 Virologische Methoden
3.2.2.1 Zellkulturtechnik
Für die Routineverfahren der virologischen und serologischen Diagnostik wurden PK(15)A
Zellen angezüchtet und passagiert. Die Kultivierung der Zelllinie erfolgte in 75 cm2
Kunststoff-Zellkulturflaschen unter Verwendung von Eagle´s Minimum Essential Medium
(EMEM) mit einem Zusatz von 5% fetalem Kälberserum (FKS) im Brutschrank bei 37°C.
Das FKS wurde vor der Benutzung auf Freiheit von Pestiviren und gegen sie gerichtete
Antikörper untersucht. Die Zellkultur wurde in regelmäßigen Abständen makroskopisch und
mikroskopisch kontrolliert. Nach drei bis vier Tagen war der Zellrasen konfluent und eine
weitere Passagierung konnte vorgenommen werden. Zur Passagierung wurde das
Erhaltungsmedium entfernt und der Zellrasen mit fünf ml adjusted trypsin-versen (ATV)
gewaschen. Es erfolgte ein zweiter Waschschritt mit fünf ml ATV mit kurzer Inkubation.
3 Methoden 50
Nach ca. 30 sec wurde das ATV abpipettiert und durch zwei ml frisches ATV ersetzt. Es
erfolgte nun eine 15- bis 20-minütige Inkubation bei 37°C zur Ablösung des Zellrasens. Die
nun abgelöst vorliegenden Zellen wurden in acht ml Kulturmedium (EMEM mit 5% FKS)
resuspendiert und durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren möglichst vollständig vereinzelt.
Die Zellzahl wurde mit der Thoma-Zählkammer (Heiland Vet GmbH, Hamburg) bestimmt.
Die angestrebte Zellzahl für die Aussaat in eine neue Flasche betrug 1,6 x 106 Zellen. Das
entsprechende Volumen der Zellsuspension, welches die gewünschte Zellzahl enthielt, wurde
in eine neue Kulturflasche überführt und mit ca. 20 ml Erhaltungsmedium aufgefüllt.
Für die Aussaat der Zellsuspension in Zellkulturröhrchen, Makro- oder Mikrotiterplatten
wurde das entsprechende Volumen der Zellsuspension zunächst auf das benötigte
Gesamtvolumen mit Kulturmedium aufgefüllt und mit diesem zusammen in die
entsprechenden Kulturgefäße verbracht.
Die Kultivierung der SFT-R Zelllinie erfolgte analog zu der der PK(15)A Zellen, allerdings
mit dem Erhaltungsmedium EDulb (EMEM modifiziert nach DULBECCO und FREEMAN
[1959]) und einem Zusatz von zehn % FKS.
Die FKN-Zellen wurden aus bei -80°C eingefrorenen Primärkulturen angezüchtet. Die
Passagierung erfolgte für die gebrauchsfertige Kultur im drei bis vier Tage Rhythmus. Die
Zellen wurden dazu mit 0,125 %iger Versen-Trypsin-Lösung abgelöst, einmal mit phosphat
buffered saline minus (phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium,
PBSM) gewaschen, bei 200 x g für 10 min zentrifugiert, und das Zellpellet in EDulb
Erhaltungsmedium resuspendiert. Die Zellen wurden daraufhin in einer Zählkammer nach
Thoma (Heiland Vet GmbH, Hamburg) ausgezählt und in entsprechende Kulturgefäße
ausgesät und mit Erhaltungsmedium versehen.
3.2.2.2 Virusvermehrung und Virusernte
Für die Verwendung in den Tierversuchen bzw. in den Virusneutralisationstests zur
serologischen Diagnostik, musste das KSPV Isolat CSF0634 vermehrt und bevorratet werden.
Die Anzüchtung des Virus erfolgte auf PK(15)A Zellen in 25 cm2 Zellkulturflaschen. Die
Zelleinsaat erfolgte mit 4,2 x 105 Zellen. Auf den semikonfluenten Zellrasen einer am Vortag
angesetzten Zellkulturflasche wurde, nach Entfernung des Mediums, ein ml virushaltiger
3 Material und Methoden 51
Zellkulturüberstand verimpft. Während der Adsorptionszeit von ein bis zwei Stunden bei
37°C wurde die Flasche mehrmals geschwenkt um eine gleichmäßige Verteilung und
Adsorption des Virus zu erreichen. Anschließend wurde mit ca. sieben ml Erhaltungsmedium
(EMEM mit 10% FKS) aufgefüllt und die Kultur einer 72-stündigen Inkubationszeit bei 37°C
zugeführt. Zur Freisetzung des Virus aus den Zellen schloss sich ein Gefrier-Tau-Zyklus an.
Zu diesem Zweck wurde die Zellkulturflasche bei -80°C eingefroren und nach frühestens
einer Stunde zügig aufgetaut. Das Zell-Virus-Gemisch wurde nun in Zentrifugenröhrchen
überführt und bei 4°C für 15 min bei 437 x g zur Abtrennung der zellulären Bestandteile
zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert und in 0,5 ml Portionen bei -80°C
eingefroren. Vor Verwendung der so hergestellten Viruscharge im Tierversuch erfolgte eine
dreimalige Virustitration zur Bestimmung des Virustiters (s. 3.2.2.4).
3.2.2.3 Virusisolierung
Die Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion ist bis heute der „Goldstandard“ zum
labordiagnostischen Nachweis des KSPV (ANONYM,2004). Die Abtrennung der
Leukozytenfraktion erfolgt durch die Zugabe von EDTA-Dextran-Lösung. Die Leukozyten
binden an das Dextran und bleiben nach Sedimentation der Erythrozyten im Überstand, wo
sie abgenommen werden können. Durch Verimpfung der aufgearbeiteten
Leukozytensuspension (s.u.) auf PK(15)A Zellen erfolgten die Vermehrung und der Nachweis
des möglicherweise vorhandenen Virus. Routinemäßig wird die Vermehrung über zwei
Passagen durchgeführt.
Für die Abtrennung der Leukozytenfraktion wurden zu ca. zehn ml EDTA-Blut 0,5 ml steriler
EDTA-Dextran-Lösung hinzugefügt. Durch vorsichtiges Schwenken wurden die Bestandteile
durchmischt. Dieser Ansatz wurde daraufhin für ein bis drei Stunden bei Raumtemperatur
inkubiert, bis sich eine deutliche, helle Phase abgesetzt hatte. Dieser leukozytenhaltige
Überstand wurde mit einer Pipette vorsichtig abgenommen und in ein Kahnröhrchen
überführt. Nach zehnminütiger Zentrifugation bei 437 x g waren die Leukozyten als Pellet am
Boden des Röhrchens sichtbar. Nach Entfernung des Überstandes wurde das Pellet in drei bis
fünf ml PBSM resuspendiert und erneut unter den oben genannten Bedingungen zentrifugiert.
Der Vorgang wurde insgesamt dreimal wiederholt. Abschließend wurde das Leukozytenpellet
in zwei ml PBSM aufgenommen, in zwei Portionen geteilt und bei -80°C in Kryoröhrchen
tiefgefroren.
3 Methoden 52
Die erste Passage zur Vermehrung des Virus erfolgte in Zellkulturröhrchen. In die
Zellkulturröhrchen wurden zu diesem Zweck PK(15)A Zellen ausgesät und für 24 Stunden
bei 37°C inkubiert. Die Zelleinsaat betrug nach Zählung in der Thoma-Zählkammer ca. 8,5 x
104 Zellen. Nach Entfernung des Erhaltungsmediums wurde der semikonfluente Zellrasen mit
200 µl der wieder aufgetauten Leukozytensuspension beimpft. Als positive Kontrolle wurden
zwei Kulturröhrchen mit ca. 106,5
KID50 des Referenzstammes Alfort 187 (CSF0902) beimpft,
zwei Röhrchen wurden als Negativkontrolle unbeimpft mitgeführt. Nach einer
Adsorptionszeit von ein bis zwei Stunden bei 37°C wurde jedes Kulturröhrchen zweimal mit
1,5 ml PBSM gewaschen und danach mit einem ml Kulturmedium (EMEM mit
Antibiotikazusatz und 10% FKS) befüllt. An eine Inkubationszeit von 72 Stunden
anschließend fand ein Gefrier-Tau-Zyklus zur Freisetzung des vermehrten Virus statt. Dazu
wurde die Zellkultur bei -80°C für mindestens eine Stunde eingefroren. Nach einem raschen
Auftauprozess wurden die Röhrchen für zehn min bei 941 x g zentrifugiert.
Für die zweite Passage der Virusisolierung wurden daraufhin je 200 µl des Überstands in die
Vertiefungen einer Makrotiterplatten gegeben, in die am Vortag PK(15)A Zellen eingesät
wurden. Die Zelleinsaat betrug ca. 1,6 x 106 Zellen. Neben der Verimpfung der positiven
Kontrolle aus der ersten Passage, wurden erneut ca. 106,5
KID50 Alfort 187 in zwei Kavitäten
inokuliert. Die beimpften und mit Kulturmedium (EMEM mit Antibiotikazusatz und 10%
FKS) aufgefüllten Makrotiterplatten wurden für 72 Stunden bei 37°C im Brutschrank mit
CO2-Begasung (4%) inkubiert. Der Nachweis des KSPV wurde auf der hitzefixierten Makro-
titerplatte mittels direkter Immun(peroxidase)färbung (DIF) vorgenommen (s. 3.2.2.6).
3.2.2.4 Virustitration
Zur Bestimmung des Virustiters einer Virussuspension wurden Titrationen nach der
Endpunkt-Verdünnungsmethode in Mikrotiterplatten durchgeführt. Die Verdünnungsreihen
wurden in log10-Stufen von 10-1
bis 10-8
angelegt und in vierfachem Ansatz getestet. Dazu
wurden jeweils vier Kavitäten der Mikrotiterplatte mit je 100 µl der verdünnten
Virussuspensionen beschickt. Für die mitzuführende Zellkontrolle wurden in vier Spalten der
Mikrotiterplatte jeweils 100 µl Medium (EMEM mit 10% FKS und Antibiotikazusatz)
einpipettiert. Danach wurden jeweils 50 µl einer, auf 1,6 x 106 Zellen eingestellten,
Zellsupension zugegeben. Die Inkubation erfolgte in einer feuchten Kammer bei 37°C im
Brutschrank mit 4%-iger CO2-Atmosphäre für 72 Stunden. Nach dieser Zeit wurden die
3 Material und Methoden 53
Mikrotiterplatten bei 80°C für drei Stunden hitzefixiert und das Virusantigen mittels DIF
(3.2.2.6) nachgewiesen. Die Kalkulation des Titers als KID50 pro 100 µl erfolgte anhand der
Schätzformel nach KÄRBER (1931).
Viruschargen, die für den Einsatz im Tierversuch bestimmt waren, wurden an drei
unterschiedlichen Tagen titriert und berechnet.
3.2.2.5 Virusneutralisationstest
Der qualitative und quantitative Nachweis neutralisierender Antikörper (nAk) gegen das
Virus der KSP im Serum der Versuchstiere wurde mittels Virusneutralisationstest (VNT)
geführt. Das Testprinzip beruht auf der Inkubation einer Verdünnungsreihe des zu testenden
Serums mit einer definierten Virusmenge. Nach Verimpfung des Virus-Serum-Gemisches auf
eine empfängliche Zellkultur erfolgt ein Virusnachweis durch DIF (s. 3.2.2.6). Waren in der
Serumprobe nAk vorhanden, wurde das Virus vollständig oder bis zu einer gewissen
Verdünnungsstufe neutralisiert, d.h., es war kein Virusnachweis in der DIF möglich. Anhand
der Verdünnungsreihe lässt sich dann der Antikörpertiter, ausgedrückt als
Neutralisationsdosis50 (ND50), unter Verwendung der Formel nach KÄRBER (1931)
kalkulieren. Die ND50 ist diejenige Verdünnung, bei der noch 50% einer empfänglichen
Zellkultur vor der Infektion mit dem entsprechenden Testvirus geschützt sind.
Der VNT wurde im Verlauf der Versuche für zwei unterschiedliche Zwecke eingesetzt.
Einerseits wurde zu Versuchsbeginn nachgewiesen, dass die entsprechenden Tiere keine nAk
gegen Pestiviren besaßen, andererseits wurde das Serum vom Tag der Euthanasie auf das
Vorhandensein nAk getestet.
Frisch aufgearbeitetes bzw. aufgetautes Serum wurde direkt in einer Mikrotiterplatte
verdünnt. Alle Tests wurden im Doppelansatz ausgeführt. Für die erste Verdünnungsstufe
wurden 80 µl Erhaltungsmedium (EMEM mit 10% FKS und Antibiotikazusatz) und 20 µl
log KID50= L1,0 - Lint (S-0,5)
Mit:
L1,0 = Logarithmus der höchsten Verdünnungsstufe mit der Reaktionsrate 1,0
Lint = Logarithmus des Verdünnungsintervalls
S = Summe der Reaktionsraten, begonnen bei der letzten Reaktionsrate, die 1,0 beträgt
3 Methoden 54
Serum in jeweils zwei Vertiefungen der ersten Reihe einer Mikrotiterplatte gegeben und
durch Auf- und Abpipettieren gut durchmischt. Die Initialverdünnung betrug somit 1:5. In
alle benötigten weiteren Vertiefungen der Mikrotiterplatte wurden 50 µl Medium vorgelegt.
Mit einer Zwölfkanalpipette wurde nun eine log2-Verdünnungsreihe des Serums dergestalt
angelegt, dass jeweils 50 µl der vorherigen Verdünnungsstufe entnommen, und in die nächste
Reihe der Kavitäten einpipettiert wurden. Nach Verwerfen von 50 µl aus der letzten Reihe der
Kavitäten entstand somit eine Verdünnungsreihe des Serums von 1:5 bis 1:640. Das jeweilige
Testvirus wurde so in Medium (EMEM mit 10% FKS und Antibiotikazusatz) aufgenommen,
dass die Virussuspension ca. 200 KID50/100 µl enthielt. 50 µl, d.h. 100 KID50, wurden nun zu
den Serumverdünnungen hinzugefügt. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde bei 37°C
im Brutschrank mit 4% CO2-Atmosphäre in einer feuchten Kammer wurden 50 µl einer
Zellsuspension hinzugegeben, die auf 1,6 x 106 Zellen/ml eingestellt worden war. Eine
Negativkontrolle, die ausschließlich Medium (EMEM mit 10% FKS und Antibiotikazusatz)
und Zellen enthielt, wurde mitgeführt. Um die Validität des Tests zu überprüfen, wurde die
eingesetzte Virussuspension rücktitriert, d.h., es wurde eine Verdünnungsreihe von 100 bis
104 angelegt und in jeweils 4 Kavitäten nach den oben beschriebenen Grundsätzen einer
Virustitration (s. 3.2.2.4) behandelt. Die auf diese Weise ermittelte, tatsächlich eingesetzte
Virusdosis wurde als valide angesehen, wenn sie zwischen 30 und 500 KID50/50 µl lag.
Neben dieser Rücktitration wurde eine Virustitration der eingesetzten Viruscharge
durchgeführt um die Werte in Beziehung zu setzen und etwaige Fehlerquellen aufzuzeigen.
Die Platten wurden für 72 Stunden in einer feuchten Kammer bei 37°C im Brutschrank mit
4% CO2-Atmosphäre inkubiert. Nach einer Hitzefixierung schloss sich eine direkte
Immunfärbung (s. 3.2.2.6) an. Die Kalkulation der ND50 erfolgte nach der Formel nach
KÄRBER (1931).
3.2.2.6 Direkte Immunfärbung (Peroxidase-linked assay, PLA)
Der Nachweis des KSPV Antigens erfolgte in hitzefixierten Mikro- bzw. Makrotiterplatten als
direkte Immunperoxidasefärbung (SAUNDERS, 1977) mit einem PO-Konjugat des mAks
BVD/C16, der pestivirusspezifisch ist (s. 3.1.5).
Für die Hitzefixierung wurde das Kulturmedium mit Hilfe einer Vakuumpumpe aus den
Kavitäten der entsprechenden Platten entfernt und der Zellrasen einmal mit 1/3 PBS
(phosphate buffered saline, phosphatgepufferte Kochsalzlösung) gewaschen. Die Fixierung
3 Material und Methoden 55
der Platten erfolgte anschließend bei 80°C für drei Stunden im Heißluftsterilisator. Der wieder
erkaltete Zellrasen wurde vor dem Färbevorgang mit PBS-Tween (PBS mit einem Zusatz von
0,1% Tween20) befeuchtet. Nun wurden pro Mikrotiterplattenvertiefung 50 µl und pro
Makrotiterplattenvertiefung 200 µl der Konjugat-Gebrauchsverdünnung einpipettiert. Die
Konjugatverdünnung richtete sich nach der Charge des BVD/C16-PO-Konjugates und
bewegte sich zwischen 1:150 und 1:500 in PBS-Tween. Nach einer Inkubationszeit von einer
Stunde bei 37°C wurde das Konjugat entfernt und der Zellrasen dreimal mit PBS-Tween
sowie einmal mit Aqua bidestillata (A. bidest.) gewaschen, um ungebundenes Konjugat zu
entfernen. Die chromogene Substratlösung enthielt 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC) in einer
AEC-Dimethylformamid-Stammlösung, Natriumazetatpuffer sowie 3 %iges Wasserstoff-
peroxid (H2O2) und wurde jeweils frisch angesetzt. Die Kavitäten der Platten wurden mit
jeweils 50 µl (Mikrotiterplatte) bzw. 200 µl (Makrotiterplatte) dieser Substratlösung
überschichtet und für zehn bis 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das H2O2 diente
dabei als Substrat der Peroxidase. Die Substratumsetzung führte zu einem rot-braunen
Niederschlag im Bereich des Zytoplasmas infizierter Zellen. Die Auswertung der Platten
erfolgte im Lichtmikroskop nach Entfernung der Substratlösung, zweimaligem Waschen und
Auffüllen mit A. bidest. Eine Kavität galt als „positiv“ wenn das Zytoplasma einer bzw.
mehrerer Zellen gefärbt, der Zellkern jedoch ungefärbt war.
3.2.2.7 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Neben dem Virusneutralisationstest wurden zwei Antikörper-ELISA zum
Antikörpernachweis in Serumproben eingesetzt. Dies waren:
• CHEKIT-CSF-Sero (ehemals Dr. Bommeli AG, Liebefeld-Bern, Schweiz)
• Classical Swine Fever Virus (CSFV) Antibody Test Kit, HerdChek (IDEXX
Laboratories, Wörrstadt)
Beide Test-Kits wurden entsprechend den Herstellerangaben verwendet.
Im Rahmen der Vorversuche wurde zudem folgender Antigen-ELISA nach
Herstellerprotokoll eingesetzt:
• CSFV Antigen Test Kit, HerdChek (IDEXX Laboratories, Wörrstadt)
3 Methoden 56
Die Extinktionswerte der Proben und Kontrollen wurden im ELISA-Lesegerät (Spectra II,
Labinstruments, Österreich) gemessen und nach Herstellerangaben ausgewertet und validiert.
3.2.2.8 Polymerasekettenreaktion (PCR)
In Versuchen mit aus Tierschutzgründen limitiertem Probenvolumen wurde der Nachweis der
erfolgreichen Infektion mittels PCR erbracht. Da der Nachweis der Pestivirus-Freiheit vor
Versuchsbeginn geführt wurde, fand ausschließlich eine SYBR®
Green real-time RT-PCR
(reverse transcription polymerase chain reaction) mit den Panpesti-Primern 324 und 326 statt
(VILCEK, 1994), die ein 288 bp Fragment der 5`-NTR Region des Pestivirusgenoms
amplifizierten. Alle PCRs wurde in der MX 4000 PCR-Maschine (Stratagene, La Jolla,
California, USA) durchgeführt. Das während der PCR entstehende Amplifikat wurde in
Echtzeit mittels SYBR® Green angefärbt und die entstehende Fluoreszenz bei einer
Wellenlänge von 520 nm gemessen. Die zu erwartende Schmelztemperatur des Amplifikats
betrug 85°C. Im Folgenden sind RNA-Isolierung, reverse Transkription und PCR näher
erläutert.
RNA-Isolierung
Die Isolierung der RNA aus EDTA- bzw. Citratblutproben erfolgte mit dem QIAamp Blood
Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden) nach Herstellerangaben.
Reverse Transkription und Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Synthese der komplementären DNA (cDNA) und PCR erfolgten in einem Ansatz (single
tube two enzyme system). Die Primer nach VILCEK et al. (1994) besaßen folgende Sequenzen
(in Klammern sind die Lokalisationen der Primer im Pestivirusgenom (Nukleotide, nt)
angegeben):
Primer 324 5`-ATG-CCC-(AT)TA-GTA-GGA-CTA-GCA-3` (nt 107-127)
Primer 326 5`-TCA-ACT-CCA-TGT-GCC-ATG-TAC-3` (nt 376-396)
3 Material und Methoden 57
Der Mastermix enthielt für jede Probe folgende Komponenten: 25 µl QuantiTECT SYBR®
Green RT-PCR Mastermix (Qiagen GmbH, Hilden), jeweils einen µl (30 pmol) der Primer
324 und 326, 0,5 µl Reverse Transkriptase und 16,5 µl H2O. 44 µl des sorgfältig gemischten
Mastermixes und sechs µl der RNA wurden in die Reaktionsgefäße eingefüllt und in die PCR
Maschine verbracht. Die Reaktionsbedingungen sahen folgendermaßen aus:
50°C 30 min Reverse Transkription
95°C 15 min Aktivierung der Polymerase
95°C 15 sec
56°C 30 sec*
72°C 30 sec
81°C 15 sec* * Messung der Fluoreszenz
Die Schmelzkurvenanalyse erfolgte computergestützt.
x 40 Zyklen
3 Methoden 58
3.2.3 Hämatologische Methoden
3.2.3.1 Parameter des weißen Blutbildes
In den Experimenten zur Untersuchung der klinischen, hämatologischen, hämostaseo-
logischen sowie (histo-)pathologischen Veränderungen wurden die Parameter des weißen
Blutbildes mit dem halbautomatischen Sysmex F-800 System (Sysmex Deutschland GmbH,
Norderstedt) erhoben. Gleiches gilt für das Versuchsvorhaben zur Rolle des plasmatischen
Gerinnungssystems.
Für das Versuchsvorhaben zur Untersuchung der Thrombozyteninteraktionen wurden die
Messungen mit dem mölab Hämatologie-System Modell 8702/6 (Fa. Mölab, Hilden)
durchgeführt. Mit diesem System wurde ausschließlich die Gesamtleukozytenzahl in [G/l]
nach Herstellerangaben bestimmt. Die Dokumentation und Auswertung der ausgegebenen
Ergebnisse erfolgte manuell.
3.2.3.2 Thrombozytenparameter
Die Messung der Thrombozytenparameter erfolgten mit dem halbautomatischen Sysmex
F-800 System (Sysmex Deutschland GmbH, Norderstedt) Die ermittelten Parameter und
Referenzbereiche sind in Tabelle 3-1 dargestellt.
Tabelle 3-1: Thrombozytenparameter, die im Rahmen der Versuchsvorhaben mittels Sysmex F-800
untersucht wurden. Der Parameter Large Platelets wird auch im deutschsprachigen Bereich nicht
übersetzt, daher wird auch hier der englische Begriff verwendet.
Parameter Einheit Referenzbereich
Thrombozytenzahl (PLT) 103 /µl 138,2 – 467,8
Mittleres Thrombozytenvolumen (MPV) fl 6,8 – 12,6
Large Platelets 103 /µl nicht bekannt
Im Rahmen des Versuchsvorhabens zur Untersuchung der Thrombozyteninteraktionen
wurden die Messungen mit dem mölab Hämatologie-System Modell 8702/6 (Fa. Mölab,
Hilden) durchgeführt. Es wurde ausschließlich die Thrombozytenzahl in [G/l] nach
Herstellerangaben bestimmt.
3 Material und Methoden 59
3.2.4 Hämostaseologische Methoden
Global- bzw. Gruppentests der Blutgerinnung
Die Global- oder Gruppentests sind Screeningmethoden, die bestimmte Bereiche des
plasmatischen Gerinnungssystems überprüfen, d.h. intrinsischen und extrinsischen Pfad sowie
die gemeinsame Endstrecke. Zur Beurteilung der verschiedenen Anteile werden
stellvertretend der Quick-Wert (Synonyme: Thromboplastinzeit bzw. Prothrombinzeit) für
den extrinsischen Pfad, die aktivierte partielle Thromboplastinzeit für den intrinsischen Pfad
und die Thrombinzeit für die gemeinsame Endstrecke gemessen.
Für die Durchführung der Globaltests wurde das Kugelkoagulometers KC 4 A der Fa.
Amelung, Lemgo. Bei dieser Meßmethode befindet sich der Gerinnungsansatz in leicht
schräg gelagerten Küvetten, die sich um die eigene Achse drehen. Eine dem Ansatz
zugegebene kleine Edelstahlkugel läuft vor Eintritt der Gerinnung an vorgegebener Stelle.
Gerinnt der Ansatz, verbleibt die Kugel nicht mehr an dieser Stelle, sondern wird durch die
Fibrinfasern mitgezogen. Die Lageänderung der Kugel wird von einem magnetischen Sensor
aufgenommen und elektronisch registriert.
3.2.4.1 Prothrombinzeit (Quick-Test)
Die Messung der Prothrombinzeit erlaubt eine Einschätzung des extrinsischen Weges der
Blutgerinnung. Dabei werden die Faktoren II, V, VII und X erfasst. Das Testprinzip beruhte
auf der Gerinnungsaktivierung durch die Inkubation der Plasmaproben mit einer definierten
Menge Thromboplastin und Calcium. Es wurde die Zeit bis zur Bildung eines
Fibringerinnsels gemessen.
Zur Bestimmung der Prothrombinzeit im Citratplasma der Schweine wurde Thromborel® S
der Fa. DADE Behring (Marburg) in einem nach MISCHKE modifizierten Protokoll
eingesetzt (MISCHKE, persönliche Mitteilung). Für die Testdurchführung wurde das frisch
entnommene Citratblut zentrifugiert aliquotiert, und bis zum Verbrauch bei -80°C gelagert.
Direkt vor dem Test wurden die Proben rasch im Wasserbad bei 37°C aufgetaut und innerhalb
einer Stunde gemessen. Das Thromborel®
S Reagenz wurde durch Zugabe der vom Hersteller
angegebenen Menge A. bidest. rekonstituiert und vor Gebrauch auf 37°C vorgewärmt sowie
mindestens 30 min bei dieser Temperatur gehalten.
3 Methoden 60
Zur besseren Differenzierung des physiologischen und pathologischen Bereichs wurde eine
Verdünnung der Plasmaproben mit Diäthylbarbiturat-Acetat-Pufferlösung (Fa. DADE
Behring, Marburg) vorgenommen (NOWAK; MISCHKE, persönliche Mitteilungen). Zu
diesem Zweck wurden die Proben nach Optimierung anhand einer Eichkurve 1:10 mit der
Pufferlösung verdünnt. Um trotz Verdünnung des Plasmas die Bildung eines ausreichend
festen Gerinnsels zu gewährleisten, wurde dem Gerinnungsansatz plasminogenarmes
humanes Fibrinogen (FIB 1 der Fa. Haemochrom Diagnostica, Essen) in einer Konzentration
von 2 g/l zugesetzt (MISCHKE, persönliche Mitteilung). Dazu wurde das lyophilisierte
Fibrinogen unter ständigem Rühren vorsichtig in A. bidest. gelöst und in 1000 µl Aliquots bei
–20°C eingefroren. Erst direkt vor dem Gebrauch wurde es rasch wieder aufgetaut und
eingesetzt.
Der eigentliche Testansatz sah folgendermaßen aus: 100 µl der verdünnten Probe wurden mit
100 µl Fibrinogenlösung eine min bei 37°C inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von 100 µl
Thromborel®
S wie auch die Messung und Protokollierung der Gerinnungszeit. Zur
Evaluierung des Tests wurden täglich die Gerinnungszeiten an humanem Kontrollplasma und
gepooltem Plasma gesunder Schweine überprüft (Kontroll-Plasma N, Fa. DADE Behring,
Marburg).
3.2.4.2 Aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT)
Die Messung der aPTT erlaubte eine schnelle Aussage zur Funktion des intrinsischen Pfades
des plasmatischen Gerinnungssystems; sie erfasst die Faktoren VIII und IX sowie die
Kontaktfaktoren. Das Prinzip der Meßmethode beruhte auf der Aktivierung des intrinsischen
Pfades durch Inkubation des Plasmas mit Phospholipiden und einem Oberflächenaktivator.
Durch Zugabe von Calcium-Ionen wurde der Gerinnungsvorgang ausgelöst.
Zur Bestimmung der aPTT im Citratplasma der Schweine fanden zwei verschiedene
Reagenzien Verwendung. Zum einen das Pathromtin®
der Fa. DADE Behring (Marburg),
zum anderen das Actin FS®
derselben Firma. Der Wechsel der Reagenzien war darin
begründet, dass die Fa. DADE Behring Pathromtin®
zugunsten eines Nachfolgeproduktes
vom Markt nahm. Das neue Testsystem (Pathromtin SL®
) war jedoch nicht für
Schweineplasma geeignet.
3 Material und Methoden 61
Für die Testdurchführung wurde das frisch entnommene Citratblut bei 1215 x g für zehn min
zentrifugiert und danach sofort in kleinen Aliquots (600-1000 µl) bei –80°C eingefroren.
Direkt vor dem Test wurden die Proben rasch aufgetaut und innerhalb einer Stunde gemessen.
Die Verwendung von Pathromtin® erfolgte nach Herstellerangaben. Das aufgeschüttelte
Aktivator-Reagenz wurde in das Fläschchen mit Pathromtin® überführt, um damit das
Lyophilisat zu lösen. Nach fünf min bei Raumtemperatur war das Reagenz einsatzbereit. Der
Gerinnungsansatz wurde als Doppelansatz in eine, auf 37°C vorgewärmte Küvette pipettiert:
100 µl Citratplasma wurden mit 100 µl Pathromtin® gemischt und für zwei min bei 37°C
inkubiert. Nach Zugabe von 100 µl Calciumchlorid-Lösung (0,025 mol/l) wurde die Messung
gestartet und das Ergebnis protokolliert.
Bei der Verwendung von Actin FS®
wurde eine Verdünnung der Plasmaproben nach Vorgabe
einer im Vorfeld für jede Actin FS®
Charge erstellten Eichkurve mit Diäthylbarbiturat-Acetat-
Pufferlösung (Fa. DADE Behring, Marburg) vorgenommen, um die Gerinnungszeiten des
physiologischen und pathologischen Bereichs besser abgrenzen zu können. Die weitere
Vorbereitung der Proben und der Reagenzien sowie die Messung der Gerinnungszeit erfolgte
nach Herstellerangaben. 100 µl Actin FS®
wurden mit 100 µl der verdünnten Plasmaprobe
gemischt und bei 37°C für drei Minuten inkubiert. Nach Zugabe von 100 µl CaCl2-Lösung
wurde die Gerinnungszeit gemessen.
3.2.4.3 Thrombinzeit
Die Thrombinzeit erlaubt eine Einschätzung der Endstrecke der Gerinnung, die allerdings
auch im Rahmen der oben genannten Tests erfasst wird. Das Testprinzip beruht auf der
Zugabe von Thrombin und nachfolgender Messung der Umwandlung des in der Probe
enthaltenen Fibrinogens in Fibrin.
Zur Bestimmung der Thrombinzeit im Citratplasma der Schweine wurde Test-Thrombin-
Reagenz der Fa. DADE Behring (Marburg) verwandt. Für die Testdurchführung wurde das
frisch entnommene Citratblut (ein Teil Natriumcitrat-Lösung, neun Teile venöses Blut) wie
für die aPTT und Prothrombinzeit beschrieben zentrifugiert und aliquotiert. Direkt vor dem
Test wurden die Proben rasch im Wasserbad bei 37°C aufgetaut und innerhalb einer Stunde
gemessen. Die Vorbereitung des Testreagenz ebenso wie die Messungen erfolgte nach
Herstellerangaben. Für den Gerinnungsansatz wurden 100 µl Citratplasma eine Minute bei
37°C inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von 200 µl Test-Thrombin-Reagenz und die
3 Methoden 62
Messung der Gerinnungszeit. Auch für diesen Test erfolgte die interne Kontrolle mit
humanem Kontrollplasma (Kontroll-Plasma N, DADE Behring, Marburg).
3.2.4.4 Fibrinogenbestimmung
Photometrische Fibrinogenbestimmung im Plasma nach RATNOFF und MENZIE (1951)
Testprinzip: Durch Zusatz von Thrombin und Calciumionen wurde das in der
Citratplasmaprobe enthaltene Fibrinogen zum Gerinnen gebracht. Das ausgefallene
Fibringerinnsel wurde aus der Probe extrahiert, zur Beseitigung von Plasmaresten gewaschen
und in NaOH (0,75 mol/l) hydrolysiert. Der Proteinanteil im Hydrolysat wird unter
Ausnutzung der Biuretreaktion photometrisch bestimmt. Die Intensität der Färbung verhielt
sich zur Peptidbindungszahl linear und erlaubt eine quantitative Aussage zur
Proteinkonzentration. Die Ermittlung der Fibrinogengehalte in g/l erfolgt anhand einer
Fibrinogenstandardkurve. Ein Vorteil dieser Methode ist die Tatsache, dass die Messwerte
durch Fibrinogen-Degradationsprodukte nicht beeinflusst werden (BARTHELS u. VON
DEPKA, 2003). Das verwendete Testprotokoll wurde freundlicherweise von der AG
Pharmakologische Hämostaseologie der Friedrich-Schiller-Universität Jena zur Verfügung
gestellt.
Zur Erstellung der Standardkurve wurde eine Fibrinogenverdünnungsreihe angelegt. Der
100 % Wert entsprach 12 mg Fibrinogen (F-4883 der Fa. Sigma-Aldrich, Deisenhofen) in
einem ml Lösung. Für die gesamte Kurve wurden drei ml der 100 %igen Lösung benötigt.
Dazu wurde lyophilisiertes Fibrinogen in ein Polystyrol-Röhrchen eingewogen und bei 37°C
im Wasserbad unter vorsichtigem Schwenken in A. bidest. gelöst. Aus der Ausgangslösung
wurden unter Zugabe einer Sicherheitsmarge die restlichen Standardwerte hergestellt (Tabelle
3-1):
Tabelle 3-2: Fibrinogenverdünnungsreihe (Standardkurve).
75% Wert mit 9 mg/ml 825 µl Ausgangslösung 275 µl NaCl-Lösung
50 % Wert mit 6 mg/ml 550 µl Ausgangslösung 550 µl NaCl-Lösung
25 % Wert mit 3 mg/ml 275 µl Ausgangslösung 825 µl NaCl-Lösung
12,5 % Wert mit 1,5 mg/ml 137,5 µl Ausgangslösung 962,5 µl NaCl-Lösung
3 Material und Methoden 63
Für die Thrombinlösung wurde Thrombin in ein Polystyrol-Röhrchen eingewogen und in
NaCl-Lösung dergestalt gelöst, dass eine Lösung mit 100 U/ml entstand.
Die Gerinnungsansätze wurden in Polystyrol-Röhrchen unter Beachtung folgender
Mengenverhältnisse vorbereitet (Tabelle 3-3):
Tabelle 3-3: Gerinnungsansätze für die Fibrinogenbestimmung aus Plasma.
Prüfansatz Standardwerte
Plasmaprobe 0,5 ml -
Fibrinogenstandards - 0,5 ml
NaCl (154 mmol/l) 1,5 ml 1,5 ml
CaCl2 (50 mmol/l) 1,5 ml 1,5 ml
Thrombinlösung (100 U/ml) 0,5 ml 0,5 ml
Die Gerinnungsansätze wurden mit einem Deckel verschlossen und eine Stunde bei 37°C im
Wasserbad inkubiert. Das entstandene Fibringerinnsel wurde mit Hilfe eines rauhen
Holzstabes (Schaschlik-Stäbchen der Firma Fackelmann, Hersbruck) auf den Stab
aufgewickelt und am Röhrchenrand ausgedrückt. Plasmareste wurden durch mehrfaches
Abspülen mit NaCl und Abrollen des aufgewickelten Gerinnsels auf Filterpapier entfernt.
Nach dem Waschvorgang wurde das Gerinnsel vom Stab abgerollt und in ein neues Röhrchen
überführt. Zur Hydrolyse des Gerinnsels wurden nun zwei ml NaOH zugegeben. Das
verschlossene Röhrchen wurde über Nacht bei Raumtemperatur bzw. für eine Stunde bei
37°C im Wasserbad inkubiert. Nach vollständiger Lyse des Gerinnsels wurden vier ml Biuret-
Gebrauchslösung zugegeben und ohne Schaumbildung untergemischt. Als Leerwert wurden
zwei ml NaOH mit vier ml Biuret-Gebrauchslösung gemischt. Nach 30 bis 60 min wurden die
Ansätze durch eine Filtrationseinheit in ein neues Gefäß gegeben und unverzüglich am
Photometer (Ultraspec 2000, Amersham, Freiburg) bei einer Wellenlänge von 546 nm gegen
den Leerwert gemessen. Die Standardwerte wurden in eine Microsoft Excel Tabelle überführt
und in einem x,y-Diagramm unter Hinzufügen einer Trendlinie und der abgeleiteten Formel
graphisch dargestellt. Das Bestimmtheitsmaß R2 sollte im günstigsten Fall eins betragen. Die
3 Methoden 64
Fibrinogenkonzentrationen der Plasmaproben konnten dann anhand dieser Standardkurve,
bzw. der daraus abgeleiteten Formel, rechnerisch ermittelt werden.
Da im Versuchsvorhaben zur Rolle der Thrombozyteninteraktionen die verhandene
Plasmamenge aus Tierschutzgründen limitiert war, wurde der Ansatz für dieses Experiment
halbiert. Der Ansatz der Fibrinogenstandardkurve wurde diesen Bedingungen angepasst.
Bestimmung des gerinnbaren Fibrinogens nach CLAUSS (1957)
Abweichend von der oben beschriebenen Methode wurden die Fibrinogenbestimmungen in
den Vorversuchen nach den Vorgaben der Methode nach CLAUSS (1957) durchgeführt. Die
Methode nach CLAUSS ist in der Humanmedizin über die DIN 58 906-Fib1 festgeschrieben
und beruht auf einer Variation der Thrombinzeit. Nach Zugabe einer standardisierten Menge
Thrombins ist die gemessene Gerinnungszeit der Fibrinogenkonzentration proportional
(HOFFMAN und GREENBERG, 1987). Anhand einer Bezugskurve, die mit verschiedenen
Verdünnungen eines Plasmas bekannter Fibrinogenkonzentration erstellt wurde, konnte der
Fibrinogengehalt in g/l errechnet werden.
3.2.4.5 Ethanol-Gelation-Test (EGT)
Das Testprinzip beruht auf der Beobachtung, dass Fibrinmonomere und kleine
Fibrinpolymere in der Gegenwart einer niedrigen Ethanolkonzentration präzipitieren
(GODAL und ABILDGAARD, 1966; BREEN und TULLIS, 1968). Das Probenmaterial war
Citratplasma, welches durch zehnminütige Zentrifugation bei 1750 x g aus der mit
Natriumcitrat versetzten Blutprobe isoliert wurde. Der vorliegende Testansatz eignete sich nur
für frische, nicht für gefrorene Plasmaproben. Es fanden zwei Testprotokolle Anwendung:
Protokoll 1: In einem Glasröhrchen wurden 500 µl der Plasmaprobe für drei min bei 37°C
inkubiert. Danach wurden 150 µl Ethanol zugegeben und der Ansatz für weitere zehn min bei
37°C inkubiert. Nach dieser Zeit wurde der Ansatz makroskopisch auf die Bildung von
Fibringel untersucht. Der Test wurde als negativ betrachtet, wenn keine Reaktion eintrat oder
eine körnige Ausfällung stattfand. Im Falle einer Gelierung oder beim Sichtbarwerden von
definitiven Fibrinsträngen wurde der Test als positiv erachtet.
Da dieses Protokoll keine Differenzierung zwischen positiven und falsch positiven
Ergebnissen erlaubt, wurde es im Verlaufe der Untersuchungen durch das Originalprotokoll
3 Material und Methoden 65
von BREEN und TULLIS ersetzt. Der Aufbau des dort beschriebenen Tests beinhaltet die
Herstellung eines alkalischen Reaktionsmilieus (pH > 7,70), was eine Differenzierung
ermöglicht. Dieses Protokoll (Protokoll 2) sah folgende Verfahrensweise vor:
Neun Tropfen Plasma wurden mit einem Tropfen 0,1 N NaOH sowie drei Tropfen 50 %
Ethanol gemischt. Der Testansatz wurde vorsichtig gemischt und für eine Minute bei
Raumtemperatur inkubiert. Trat eine Gelformation binnen einer min auf, wurde der Test als
positiv betrachtet. Später auftretende Präzipitate bzw. Gelformationen in den folgenden neun
min wurden durch Zugabe eines weiteren Tropfens 0,1 N NaOH überprüft. Unspezifische
Präzipitate lösten sich unter diesen Bedingungen wieder auf, während Fibringele erhalten
blieben.
3.2.4.6 Thrombozytenaggregationstest
Testprinzip und Vorarbeiten:
Die Thrombozytenaggregation ist ein in zwei Phasen verlaufender Prozess, der am Ende zur
irreversiblen Zusammenballung der Plättchen führt. Bei dem eingesetzten Verfahren zur
Messung der Aggregation, der turbidimetrischen Bestimmung von Zellsuspensionen im
Verfahren nach BORN (1962), wurde die Trübungsabnahme im plättchenreichen
Citratplasma nach Zusatz verschiedener Induktorsubstanzen wie ADP, Arachidonsäure,
Ristocetin oder Kollagen photometrisch, im vorliegenden Versuchsansatz durch das APACT
(automated platelet and coagulation tracer) System (LABiTec GmbH, Ahrensburg) erfasst
und ausgewertet. Das Plasma wurde für die Messung auf 37°C vorgewärmt und durch einen
Magnetrührer in Bewegung gehalten. Die Methode beruht auf der Eigenschaft, dass die
optische Dichte einer Partikelsuspension abhängig von der Partikelzahl und nicht der
Partikelgröße ist. Während plättchenreiches Plasma (PRP) nur eine geringe Durchlässigkeit
für langwelliges Licht besitzt, ist plättchenarmes Plasma (PPP) nahezu vollständig
durchlässig. Die prozentuale Lichtdurchlässigkeit diente als Maß für die Aggregation, in
deren Verlauf sich die Partikelgröße erhöhte, die Partikelzahl jedoch reduzierte. Die
Transmissionsänderung wurde zur Betrachtung und Auswertung kontinuierlich aufgezeichnet
und als Kurve ausgegeben. Zur Erlangung einer ausreichenden Vergleichbarkeit und
Reproduzierbarkeit erfolgte der Test mit einer standardisierten Thrombozytenzahl. Der
3 Methoden 66
Ausgleich der Transmissionsunterschiede wurde durch Einstellung des PRP als 0%-Wert und
des PPP als 100%-Wert erreicht.
Durch tierartspezifische Unterschiede lassen sich für das Schwein nicht alle Induktoren
verwenden. In Vorversuchen wurde daher die Eignung der verschiedenen Induktoren in
verschiedenen Konzentrationen getestet. Für die weiteren Untersuchungen wurden ADP und
Kollagen eingesetzt. Die physiologische Aggregationskurve nach ADP-Zugabe sollte wie
folgt aussehen: Zunächst stellte sich eine Formveränderung der Thrombozyten ein (shape
change), die als kurze Abnahme der Transmission zu sehen war. Danach folgte ein Anstieg
der Aggregationskurve (primäre Aggregation) auf ca. 55-60 %, die im Verlauf entweder eine
rückläufige Tendenz zeigte (Desaggregation), oder nach dem Erreichen eines Plateaus in die
zweite Phase der Aggregation überging (sekundäre Aggregation). Der Verlauf war u.a. von
der Konzentration des Induktors abhängig. Die Kollagen-induzierte Aggregationskurve wies
keine shape change Phase auf und erreichte eine maximale Aggregation von bis zu 85 %.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das beschriebene Verfahren eingesetzt, um die Wirkung des
Clopidogrels und der Acetylsalicylsäure zu überwachen. Die Wirkung des Clopidogrels liess
sich an der ADP-induzierten Aggregationskurve, die der Acetylsalicylsäure an der Kollagen-
induzierten Aggregationskurve ablesen, da die genannten Stoffe Inhibitoren dieser
Aggregationswege sind.
Testdurchführung:
Das PRP wurde durch niedertourige Zentrifugation für 20 min bei 31 x g gewonnen. Der
Überstand wurde sofort mit einer Plastikpipette abgenommen und in ein verschließbares
Plastikröhrchen verbracht. Der Rückstand wurde zur Herstellung des PPP erneut zentrifugiert
(2200 x g, 15 min) und das so gewonnene PPP aliquotiert. Sowohl das Citratblut, als auch das
PRP und PPP wurden mit dem mölab Hämatologie-System 8702/6 (Fa. Mölab, Hilden) auf
ihren Thrombozytengehalt untersucht. Die Messung der Thrombozytenzahl aus Citratblut
erfolgte nach Angaben des Geräteherstellers aus der 1 : 45000 Verdünnung des Blutes in
Cello Ton (Fa. Mölab, Hilden). Für die Messungen wurde das PRP mit autologem PPP auf
500.000 Thrombozyten/µl eingestellt. Die Einstellung des Plasmas wurde durch
Thrombozytenzählung mit oben genanntem Gerät überprüft; die Toleranzgrenze lag bei
500.000 ± 10.000 Thrombozyten pro µl. Da die Messung plättchenreichen Plasmas nicht
3 Material und Methoden 67
unter Standardtestbedingungen des Gerätes durchführbar war, wurde nach einer Testreihe mit
verschiedenen Verdünnungsmethoden und –stufen eine Vorverdünnung des Plasmas mit
Diäthylbarbiturat-Acetat-Pufferlösung (Fa. DADE Behring, Marburg) im Verhältnis 1 : 7
vorgenommen. Die Messung der Plättchenzahl erfolgte sodann nach Erstellung der
Messlösung in der Primärverdünnungsstufe des zum mölab Hämatologie-System gehörenden
Diluters. Die Aggregationsmessung erfolgte innerhalb von zwei Stunden nach der
Blutentnahme. Da die Tiere im Verlauf der KSP Infektion eine hochgradige
Thrombozytopenie entwickelten, wurde das Plasma zu den späteren Messzeitpunkten auf
250.000 bzw. 125.000 Thrombozyten pro µl eingestellt.
Nach der Vorwärmphase des APACT Gerätes, der Rekonstitution der lyophilisierten
Reagenzien mit destilliertem Wasser sowie dem Starten der Software, erfolgten die
Messungen dergestalt, dass nach einer Abgleichung des Gerätes ohne Küvetten zunächst das
PPP als 100 %-Wert bzw. PRP als 0 %-Wert gesetzt wurden. Danach erfolgte die eigentliche
Messung unter Zugabe des entsprechenden Induktors. Dazu wurden 200 µl des eingestellten
PRPs 2-3 min bei 37°C inkubiert und dann mit 50 µl ADP Reagent (AMAX, Trinity Biotech,
Ireland) bzw. 100 µl Collagen Reagent (AMAX, Trinity Biotech, Ireland) versetzt. Kontrolle
und Auswertung der Aggregationskurven erfolgten mit der APACT-Software.
Die Aggregation errechnete sich aus folgenden Werten:
%100×−
−=
PRPPPP
PRPMesswertnAggregatio
Die Messkurven ergaben folgende Parameter: Maximale Aggregation, maximale Steigung der
Kurve, Steigung der Desaggregation, Desaggregationswert, Flächeninhalt des Shape Change
und Flächeninhalt unter der Kurve.
3.2.5 Pharmakokinetik
Für den Wirkstoff PEG-Hirudin waren sowohl ein Therapieschema als auch eine Methode
zum Monitoring im Schweinemodell etabliert. Dosierungsschemata und das entsprechende
Protokoll für die Therapieüberwachung wurden freundlicherweise von Prof. Goetz Nowak zur
Verfügung gestellt und vor Versuchsbeginn am EURL etabliert und kalibriert.
3 Methoden 68
Um einen geeigneten Thrombozytenaggregationshemmstoff zu finden, wurden im Vorfeld in
vitro und in vivo unterschiedliche, in der Humanmedizin gebräuchliche Substanzen getestet
und anhand ihrer Wirkung und Kinetik ausgewählt. Für die ersten Testschritte wurden die
Substanzen zunächst in verschiedenen Konzentrationen einem frisch gewonnenen
Schweineplasma in vitro zugesetzt. Dieses wurde anschließend in Thrombozyten-
aggregationstests (siehe 3.2.4.6) mit den zuvor ausgewählten löslichen Induktoren, ADP und
Kollagen, überprüft. Folgende Substanzen wurden in vitro getestet: Der chimäre monoklonale
Antikörper Abciximab (Reopro®
), das nicht-peptidische Tyrosinderivat Tirofiban
(Aggrastat®
) und der Cyclooxigenase-Hemmstoff Acetylsalicylsäure (Aspisol®
).
Aufbauend auf die in vitro Untersuchungen wurden nachfolgend Tirofiban (Aggrastat®
),
Acetylsalicylsäure (ASS®
ratiopharm) und der Hemmstoff der ADP-induzierten Plättchen-
aggregation Clopidogrel in vivo getestet. Die letzteren Substanzen wurden zusätzlich in
Kombination getestet. Die pharmakokinetischen Untersuchungen in vivo wurden am
narkotisierten Schwein über einen Zeitraum von acht bis zwölf Stunden durchgeführt. Die
Narkose wurde über einen venösen Zugang am Ohr mit Pentobarbital-Natrium (Narcoren®,
Merial GmbH, Hallbergmoos) eingeleitet (20 mg/kg in NaCl-Lösung) und mit Ethylurethan
25% vertieft und erhalten. Ethylurethan wurde intraperitoneal nach Wirkung appliziert. Der
Venenzugang zur Entnahme der Blutproben und Applikation der pharmakologisch wirksamen
Substanzen wurde an der freipräparierten Vena jugularis durch einen eingelegten
Verweilkatheter (Heiland Vet, Hamburg) gewährleistet. Nach der Entnahme der
Nullwertprobe und Applikation des Medikaments fand eine Blutentnahme und Auswertung
der Messergebnisse nach 15 min, 30 min sowie 60 min statt. Danach wurden stündliche
Intervalle gewählt. Neben der Thrombozytenaggregation wurden die Parameter des weißen
und roten Blutbildes sowie die Thrombozytenzahlen überprüft. Nach Beendigung der
Untersuchungen wurden die Tiere durch eine Überdosis Ethylurethan schmerzlos getötet.
3 Material und Methoden 69
3.2.6 Statistik
Die Versuchsvorhaben waren als Orientierungsstudien angelegt und wurden aufgrund der
Gruppengröße nicht statistisch ausgewertet. Zur Abschätzung der Tendenzen wurden
Gruppenmittelwerte und deren Standardabweichungen berechnet. Alle Untersuchungen zur
Bestimmung der Gerinnungsparameter wurden mindestens im Doppelansatz ausgeführt, die
dokumentierten Werte verstehen sich als Mittelwerte dieser Ansätze.
3.2.7 Sonstige Methoden
3.2.7.1 Ecarin Clotting Time
Die ECT wurde zur Überwachung des Hirudinspiegels im Blut der behandelten Schweine
eingesetzt. In Gegenwart von Hirudin wandelt das, der zu untersuchenden Plasmaprobe
zugegebene Ecarin, Prothrombin hochspezifisch in Meizothrombin um. Meizothrombin wird
durch Hirudin inaktiviert. Erst wenn das Hirudin der Plasmaprobe verbraucht ist, kann das
freigesetzte Meizothrombin (bzw. dessen Aktivierungsprodukt) die Gerinnung induzieren
(NOWAK, 2003). Die Gerinnung kann mit Koagulometern erfaßt werden. Mit steigendem
Hirudinspiegel verlängerte sich die Ecarin Clotting Time.
Für die Messung der ECT wurde zunächst Ecarin-Reagenz vorbereitet, welches aus Ecarin
(freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Goetz Nowak, Jena), Calcium und
Puffersubstanzen bestand. Zur Herstellung von einem ml Ecarin-Reagenz wurden 800 µl Tris
mit 3 % BSA (Tris 0,05 M, pH 7,5 bei 37°C in 0,1 M NaCl), 100 µl 0,1 M CaCl2-Lösung und
100 µl Ecarin-Lösung (10 U/ml in 0,9 % NaCl) durchmischt und bei –80°C eingefroren.
Um eine Interpretation der ECT Werte zu ermöglichen und die Vergleichbarkeit zu
gewährleisten, wurde eine Kalibrationskurve für das Ecarin-Reagenz erstellt. Zu diesem
Zweck wurde eine Hirudin-Verdünnungsreihe wie folgt hergestellt:
Eine PEG-Hirudin-Ausgangslösung mit 10 mg/ml PEG-Hirudin (freundlicherweise zur
Verfügung gestellt von Prof. Goetz Nowak, Jena) wurde mit 0,9 %iger NaCl-Lösung auf
200 µl/ml verdünnt. Für einen Plasmahirudinwert von zwei µg/ml wurden zehn µl der PEG-
Hirudin-Verdünnung mit 990 µl Plasma gemischt und im Weiteren geometrisch bis zu einer
Konzentration von 0,0625 µg/ml verdünnt. Der Gerinnungsansatz am KC 4A (Amelung,
Lemgo) sah wie folgt aus: 100 µl Plasma wurden nach einer Inkubationszeit von zwei min bei
3 Methoden 70
37°C mit 100 µl vorgewärmtem Ecarin-Reagenz gemischt und die Gerinnungszeit
protokolliert. Die ermittelten Gerinnungszeiten für die verschiedenen Plasmakonzentrationen
wurden in eine Microsoft Excel© Tabelle übertragen und graphisch dargestellt. Aus einer
unbekannten Plasmaprobe konnte nun der PEG-Hirudin-Spiegel ermittelt werden, indem die
Formel der Kalibrationskurve umgestellt und eingesetzt wurde.
Die Probenentnahme und –aufbereitung fand folgendermaßen statt: Neun Teile venöses Blut
wurden mit einem Teil 0,11 mol/l Natriumcitrat gemischt und baldmöglichst bei 1215 x g für
10 min zentrifugiert. Das gewonnene Plasma wurde sofort in Kunststoffröhrchen aliquotiert
(500 µl pro Kryoröhrchen) und entweder unverzüglich gemessen oder bei –80°C bis zum
endgültigen Verbrauch eingefroren. Eingefrorene Proben wurden vor der Messung rasch bei
37°C im Wasserbad aufgetaut und nach 15 min bei Raumtemperatur gemessen. Die
Überprüfung der Methode fand täglich mit humanem Kontrollplasma (Kontrollplasma N der
Fa. DADE Behring, Schwalbach) und gepooltem Plasma gesunder Schweine statt.
3.2.7.2 Einzelfaktorenbestimmung
Im Rahmen der Voruntersuchungen wurden die Aktivitäten der Faktoren II und V mittels
koagulometrischer Verfahren untersucht. Untersuchungsmaterial war plättchenarmes
Citratplasma. Die Untersuchungsmethode wurde als Modifikation der Prothrombinzeit (siehe
3.2.4.3) durchgeführt. Die Probe wurde dabei durch eine vorverdünnte Probe in Kombination
mit einem kommerziellen Mangelplasma (Fa. DADE Behring, Schwalbach) ersetzt.
Grundprinzip war, dass durch diesen Aufbau die Gerinnungszeit der Testansätze nur von der
Aktivität des zu messenden Faktors in der Probe abhing. Der Testablauf erfolgte wie für die
Prothrombinzeit beschrieben. Mit Verdünnungsstufen eines Poolplasmas gesunder Schweine
wurde eine Referenzkurve erstellt und die Ergebnisse anhand dieser Kurve in Prozent der
Norm ausgedrückt.
Die Aktivität des Inhibitors der Serinproteasen des Gerinnungssystems, Antithrombin III
(AT III), wurde mittels eines chromogenen Substrats in plättchenarmem Citratplasma
bestimmt. Das Reagenz (Fa. Roche Diagnostics, Mannheim) enthält Heparin und eine
definierte Menge Thrombin. Heparin bildet mit AT III einen Komplex und katalysiert die
Inaktivierungsreaktion. Das AT III der Probe geht mit dem zugesetzten Thrombin eine
3 Material und Methoden 71
Verbindung ein, das dann für die thrombininitiierte Freisetzung von p-Nitroanilin aus dem
chromogenen Substrat nicht mehr zur Verfügung steht und somit die Extinktion verringert.
Aus der Restaktivität des Thrombins lässt sich der AT-III-Gehalt der Probe berechnen. Der
Test wurde nach Herstellerangaben mit der Ausnahme durchgeführt, dass die Vorverdünnung
des Plasmas höher (1:80 in NaCl) gewählt wurde. Zur Kalibrierung des Testsystems wurde
gepooltes Schweineplasma verwendet. Die Ergebnisse wurden anhand der Werte für das
Poolplasma in Prozent der Norm ausgedrückt.
3.2.7.3 Histopathologische Untersuchungen
Für die histopathologischen Untersuchungen wurden formalinfixierte Organproben in Paraffin
eingebettet. Daraus erstellte Mikrotomschnitte wurden vollautomatisch (Varistain 24-3, Fa.
Shandon, Frankfurt) mit Hämatoxylin/Eosin (HE) gefärbt und im Lichtmikroskop
begutachtet.
Fixierung der Organe:
Bei der Sektion wurden die Organe zunächst grob zerteilt und in eine 10 %ige, gepufferte
Formalinlösung für mindestens 24 Stunden eingelegt. Die auf diese Weise fixierten Proben
wurden daraufhin mit einem Skalpell so zugeschnitten, dass sie in standardisierte
Einbettungskassetten passten.
Einbettung in Paraffin:
Die Einbettung der Gewebestücke erfolgte mit dem Gewebeeinbettungsautomaten
Hypercenter II der Fa. Shandon, Frankfurt. Zur Entwässerung wurden die Proben, nach einer
mindestens einstündigen Nachfixierung in frischem Formalin, zunächst mit Leitungswasser
gespült und dann in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70 %, 85 %, 96 %) dehydriert. Durch
anschließende Isopropanol- und Essigsäure-n-Butylester-Schritte wurden die Proben sodann
wieder vom Alkohol befreit und für die Paraffineinbettung vorbereitet. In Metallschalen
wurden die Präparate mit 60°C warmem Paraffin (Paraplast, Fa. Shandon, Frankfurt)
ausgegossen und auf einer Kühlplatte bei -5°C zum Erstarren gebracht.
3 Methoden 72
Anfertigung der Schnitte und Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Aus den Paraffin-eingebetteten Präparaten wurden mit dem Schlittenmikrotom (Fa. Mikrom,
Heidelberg) ca. vier µm dicke Schnitte angefertigt und nach Streckung im Wasserbad bei ca.
55°C auf Glasobjektträger (Fa. Engelbrecht, Edermünde) aufgezogen. Zur Entfernung des
überschüssigen Paraffins wurden die Schnitte für ca. 30 min in einen 60°C Wärmeschrank
(Fa. Medite, Burgdorf) verbracht. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung) erfolgte im
Färbeautomaten Varistain 24-3 der Fa. Shandon, Frankfurt. Nach der Färbung wurden die
Deckgläser mittels Eindeckautomaten auf die Objektträger gebracht. Die Eindeckung erfolgte
mit Corbitbalsam (Fa. Hecht, Kiel).
Die HE-Färbung ist eine Routine-Übersichtsfärbung. Sie färbt die Zellkerne dunkelviolett, die
anderen Gewebestrukturen rötlich an. Vor der eigentlichen Färbereaktion wurden die Schnitte
in einer absteigenden Alkoholreihe entparaffiniert. Abschluss der Entparaffinierung bildete
ein Spülschritt mit A. bidest.
Der erste Färbeschritt wurde in einer Hämalaun-Lösung nach MAYER für 15 min
durchgeführt. Anschließend wurde überschüssiger Farbstoff durch einen 20-minütigen
Spülschritt mit Leitungswasser entfernt, und die Schnitte abschließend eine min in 1 %iger
Eosin-Lösung gefärbt. Nach der Eindeckung und Trocknung erfolgte die Begutachtung im
Axiostar plus Lichtmikroskop (Fa. Zeiss, Oberkochen).
4 Ergebnisse
4.1 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV-
Stamm CSF0634
Im Rahmen der Voruntersuchungen wurden zwei Tierexperimente mit je sieben
Läuferschweinen durchgeführt. Für beide Untersuchungen wurden jeweils fünf
Läuferschweine mit dem als hochvirulent eingestuften KSPV-Stamm CSF0634 intranasal
infiziert (103,5
KID50 pro Tier). Je eine Gruppe mit zwei Schweinen diente als negative
Kontrolle.
Diese Versuche sollten eine Übersicht über die zu erwartenden klinischen, hämatologischen,
hämostaseologischen, pathologisch-anatomischen und histopatholgischen Befunde erbringen
nach einer Infektion mit CSF0634 erbringen und zeigen, ob sich dieser Stamm für weitere
Untersuchungen eignete. Die Ergebnisse wurden für die weitere Versuchplanung eingesetzt.
Im zweiten Vorversuch wurde besonderes Augenmerk auf die Frühphase (Tag 0 - 4 post
infectionem, p.i.) der Erkrankung gelegt, da in diesem Bereich gemeinhin die ersten
Veränderungen der hämatologischen und hämostaseologischen Parameter, vor allem der
Leukozyten- und Thrombozytenzahlen, auftreten (DUNNE, 1970). Ziel war es, diese
Ereignisse mit Befunden der Gerinnungstests und Fibrinogenbestimmungen zu korrelieren.
4.1.1 Clinical Score und Körpertemperatur
Neun KSP-relevante klinische Parameter wurden täglich nach Vorgabe des am EURL ge-
bräuchlichen Erfassungsbogens untersucht und die Ausprägung der Symptome mit einer
Punktzahl von null bis drei belegt. Die Addition ergab die klinische Punktzahl Clinical Score
(CS) eines Tieres. Zusätzlich wurde täglich die rektale Körpertemperatur erfasst und
dokumentiert.
Die Tiere 153, 156 und 157 entwickelten das klassische Bild der akut-letalen KSPV-Infektion
mit hohem Fieber, gastrointestinalen und respiratorischen Symptomen sowie zentralnervösen
Ausfallserscheinungen. Diese Tiere entwickelten ab dem 14. Tag p.i. petechiale Blutungen.
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 74
Tier 154 erkrankte zunächst ebenfalls an der akuten KSP, erholte sich jedoch ab dem 14. Tag
p.i. wieder. Das Tier 155 zeigte schwere, unspezifische Allgemeinsymptome. Der maximale
CS der Einzeltiere lag zwischen 15 und 21. Die Kontrolltiere zeigten über den gesamten
Versuchsverlauf weder eine erhöhte Körpertemperatur noch andere Krankheitsanzeichen.
Die Tiere 176, 178 und 179 entwickelten schwere, klassische Symptome einer KSPV-
Infektion und erreichten einen maximalen CS von 17 (Tiere 176 und 179) bzw. 16 (Tier 178).
Diese Tiere entwickelten in der Finalphase der Erkrankung (ab 14 Tage p.i.) petechiale
Blutungen im Bereich der Akren. Tier 175 zeigte im Versuchsverlauf schwere
Allgemeinsymptome ohne hämorrhagische Erscheinungen und erreichte einen maximalen CS
von 10. Milde Allgemeinsymptome mit Fieber, geringgradiger Konjunktivitis und Diarrhoe
konnten bei Tier 177 verzeichnet werden, sein maximaler CS betrug 7. Die Kontrolltiere
zeigten zu keinem Zeitpunkt klinische Auffälligkeiten, die auf eine Infektion mit KSPV
hindeuteten. Kontrolltier 181 zeigte eine hochgradige Entzündung des rechten Sprunggelenks,
die am zweiten Tag des Versuches sichtbar wurde und bis zum Versuchsende ausheilte.
Charakteristische KSP-Symptome sind in Abbildung 4-1 und Abbildung 4-2 dargestellt. Die
Fotographien zeigen exemplarisch für Tier 179 die unterschiedlichen Ausprägungen
klinischer Symptome im Verlauf der KSPV-Infektion.
Abbildung 4-1: Die Abbildung zeigt das Tier 179, links 14 und rechts 15 Tage p.i.
Hämorrhagische Symptome entwickelten sich in der Finalphase der KSPV-Infektion
innerhalb von wenigen Stunden.
4 Ergebnisse 75
Abbildung 4-2: Unterschiedliche Ausprägungen klinischer Symptome im Verlauf der KSPV-
Infektion. Exemplarisch sind hier unterschiedliche Krankheitsstadien für das Tier 179 dargestellt.
Das obere Bild wurde an Tag zehn p.i. aufgenommen. Das Tier zeigte zu diesem Zeitpunkt
Apathie, Konjunktivitis, einen aufgekrümmten Rücken, Diarrhoe, ein struppiges Borstenkleid,
leichte respiratorische Symptome und hohes Fieber. Das untere Bild wurde an Tag 15 p.i. erstellt
und zeigt, dass hämorrhagische Symptome in den Vordergrund traten. Das Tier war hochgradig
abgemagert, auffallend blass, zeigte zentralnervöse Ausfallserscheinungen und Somnolenz.
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 76
4.1.2 Pathologisch-anatomische Befunde
Alle Tiere wurden nach der Euthanasie einer pathologisch-anatomischen Untersuchung nach
dem Protokoll des EURL unterzogen. Die Tiere 153, 155, 156 und 157 zeigten typische KSP-
Befunde mit vergrößerten, hämorrhagisch infarzierten Lymphknoten im gesamten
Organismus, petechiale Blutungen in der Nierenrinde und der äußeren Haut (exklusive Tier
155), eine katarrhalische Enteritis sowie eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie
unterschiedlichen Schweregrades. Bei der Untersuchung des Tieres 154 wurden
ausschließlich eine Pneumonie und mittelgradig vergrößerte Lymphknoten gefunden. Die
Kontrolltiere zeigten keine augenfälligen pathologisch-anatomischen Veränderungen.
KSP-typische Veränderungen mit generalisierten Lymphknotenschwellungen und
-hämorrhagien sowie petechialen Blutungen in den Nieren, der Blasenwand und der äußeren
Haut sowie Sekundärinfektionen der Lunge konnten bei den Tieren 176, 178 und 179
gefunden werden. Zwei dieser Tiere zeigten zudem Milzrandinfarkte. Während Tier 175
vergrößerte Lymphknoten und eine Bronchopneumonie aufwies, zeigte Tier 177 keine KSP-
typischen Befunde zum Zeitpunkt des Versuchsendes. Die Kontrolltiere waren, abgesehen
von einer geringgradigen Spitzenlappenpneumonie, ohne besonderen Befund zum Zeitpunkt
der Euthanasie. Charakteristische Veränderungen, die im Rahmen der Infektion mit dem
KSPV-Isolat CSF0634 auftraten, sind in Abbildung 4-3 gezeigt.
4.1.3 Histopathologie
Paraffin-eingebettete Organschnitte der Leber, der Lunge, der Nieren sowie eines
Lymphknotens der Tiere 153 – 159 wurden HE-gefärbt und im Lichtmikroskop ausschließlich
auf das Vorhandensein sichtbarer Thromben untersucht. In keinem der angefertigten Schnitte
konnten unter diesen Bedingungen Thromben nachgewiesen werden.
4 Ergebnisse 77
Abbildung 4-3: Charakteristische pathologisch-anatomische Befunde. In der ersten Reihe sind
hochgradig vergrößerte und hämorrhagische Darmlymphknoten abgebildet. Reihe zwei zeigt
hämorrhagische Hautveränderungen im Bereich der distalen Hintergliedmaßen. Ein vergrößerter,
hämorrhagischer Mandibularlymphknoten sowie multiple Milzinfarkte sind in Reihe drei von
rechts nach links dargestellt. In der unteren Reihe sind die Veränderungen in den Nieren sichtbar.
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 78
4.1.4 Virus-, Antigen- und Antikörpernachweis
Zur Bestätigung der erfolgreichen Infektion und zum Nachweis der Virusfreiheit der
Kontrolltiere wurde für die Tiere 153 – 159 eine Virusisolierung aus Leukozyten (s. 3.2.2.3)
am Tag vor der Infektion und am Tag des Todes bzw. der Euthanasie vorgenommen.
Zusätzlich wurde ein Antigen-ELISA (s. 3.2.2.7) an den Tagen zehn und 14 p.i. durchgeführt.
Alle Tiere erwiesen sich als negativ in der Virusisolierung am Tag vor der Infektion. Positive
Ergebnisse wurden am Tag der Euthanasie in der Virusisolierung für die Tiere 153, 155, 156
und 157 erzielt. Sowohl die Kontrolltiere (158 und 159) als auch Tier 154 waren negativ. Der
Antigen-ELISA ergab positive Ergebnisse für alle infizierten Tiere an Tag zehn p.i., während
die Kontrolltiere negativ waren. An Tag 14 p.i. waren positive Ergebnisse für die Tiere 153,
155, 156 und 157 zu verzeichnen, Tier 154 erwies sich als negativ. Alle Kontrolltiere zeigten
auch hier eine negative ELISA-Reaktion. Die Ergebnisse der Virus- bzw.
Antigennachweisese sind im Anhang unter 8.1 in Tabelle 8-1 aufgeführt.
Für die Tiere 175 – 181 wurde die Virusisolierung an den Tagen vier, sieben, zehn und 14 p.i.
durchgeführt. Alle infizierten Tiere waren positiv an den Tagen sieben und zehn p.i.. Während
die Tiere 175, 176, 178 und 179 an Tag 14 p.i. ebenfalls positiv reagierten, erwies sich Tier
177 als negativ. Die Kontrolltiere blieben im gesamten Versuchsverlauf negativ. Die
Ergebnisse sind im Anhang unter 8.1 in Tabelle 8-2 dargestellt.
Um die Immunantwort der Tiere zu beurteilen, wurden am Tag der Euthanasie
Antikörpernachweise geführt. Zur quantitativen Einschätzung der Antikörperproduktion
wurden VNTs nach Vorgabe der Standardmethoden des EURLs mit den diagnostischen
Referenzstämmen CSF0902 (Alfort 187), BVDV NADL und BDV Moredun einerseits, und
dem homologen KSPV-Stamm CSF0634 andererseits durchgeführt. Zusätzlich wurden
ELISA-Testkits (s. 3.2.2.7) zum qualitativen Antikörpernachweis eingesetzt. Die Ergebnisse
dieser Untersuchungen sind für die Tiere 153 - 159 im Anhang 8.1 in Tabelle 8-3 dargestellt.
Tier 154 entwickelte einen niedrigen Antikörpertiter von 40 ND50 gegen CSF0902 sowie
einen moderaten Antikörpertiter (120 ND50) gegen den homologen Stamm CSF0634. In den
differentialdiagnostischen VNTs mit den oben aufgeführten Pestiviren, konnten bei diesem
Tier kreuzreagierende Antikörper gegen BDV Moredun festgestellt werden. Tier 155 zeigte
ausschließlich einen niedrigen Antikörpertiter (30 ND50) gegen das homologe Virus. Sowohl
4 Ergebnisse 79
Tier 154, als auch Tier 155 reagierten positiv im Antikörper-ELISA. Beide Antikörper-
ELISAs befundeten Tier 156 als fraglich. Die Kontrolltiere sowie alle anderen Tiere
reagierten in allen Tests negativ.
Für die Tiere 175 – 181 wurden am Tag der Euthanasie die oben genannten VNTs sowie ein
Antikörper-ELISA durchgeführt. Die Ergebnisse sind im Anhang unter 8.1 in Tabelle 8-4
aufgeführt. Tier 177 entwickelte einen Antikörpertiter von 480 ND50 gegen das homologe
Virus und einen niedrigen Antikörpertiter (30 ND50) gegen den Referenzstamm CSF0902.
Dieses Tier wies zudem kreuzreagierende Antikörpertiter gegen BDV auf. Tier 178 wies
einen niedrigen Antikörpertiter (40 ND50) gegen das homologe Virus auf. Alle anderen Tiere
zeigten in den durchgeführten VNTs negative Ergebnisse. Die Tiere 177 und 178 wurden
auch im Antikörper-ELISA positiv befundet, fragliche Reaktionen zeigten die Tiere 175 und
179. Die Kontrolltiere waren negativ in allen durchgeführten Antikörpernachweisen.
4.1.5 Hämatologische Parameter
Aus den EDTA-Blutproben aller Tiere wurden sowohl die Leukozyten- als auch
Thrombozytenzahlen bestimmt. Zusätzlich erfolgte für die Tiere des zweiten Vorversuches
(Tiere 175 – 181) eine Untersuchung des Plättchenvolumens über den Parameter MPV.
Die Leukozytenzahlen der Tiere 153 bis 157 zeigten eine Depletion im Verlauf des
Experiments. Bereits ab dem dritten Tag p.i. war bei den Tieren 153, 154, 156 und 157 ein
anhaltender Abwärtstrend feststellbar, der zu einer Reduktion der Leukozytenzahlen um
80-90% führte. Durchschnittlich fielen die Leukozytenzahlen im Versuchsverlauf von
23,2 G/l auf 4,5 G/l ab. Tier 154 zeigte zu Versuchsende wieder einen leichten Aufwärtstrend
von 4,9 G/l an Tag 14 p.i. auf 6,7 G/l an Tag 17 p.i.. Die Leukozytenzahlen der Kontrolltiere
blieben, abgesehen von intraindividuellen Schwankungen, im Normbereich. Die
Entwicklungen der Leukozytenzahlen sind in Abbildung 4-4 dargestellt.
Alle infizierten Tiere des zweiten Vorversuches zeigten nach der Infektion eine deutliche
Leukopenie, wobei die Leukozytenzahlen beginnend an Tag drei p.i. durchschnittlich von
22,4 G/l auf 7,9 G/l abfielen. Dies entsprach einer Reduktion der Leukozytenzahlen um
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 80
70-90 % für die einzelnen Schweine. Abweichend von den Verläufen der anderen infizierten
Tiere, zeigten die Leukozytenzahlen der Tiere 175 und 177 eine Erholung zum Versuchsende.
Während Tier 175 jedoch mit 6,5 G/l unter dem Normalbereich blieb, kehrte Tier 177 nach
dem zehnten Tag p.i. in den Normalbereich zurück. Zu Versuchsende lag die Leukozytenzahl
für dieses Tier bei 13,8 G/l (Tag 21 p.i.). Die Kontrolltiere wiesen zu keinem Zeitpunkt eine
Leukopenie auf. Tier 181 zeigte jedoch eine Leukozytose, die zwischen dem zweiten und
vierten Tag des Versuches ihr Maximum erreichte. Die Leukozytenzahlen sind in Abbildung
4-5 dargestellt.
Analog zu den Entwicklungen der Leukozytenzahlen begann bereits drei Tage p.i. ein Abfall
der Thrombozytenzahlen für die Tiere 153, 155, 156 und 157. Diese Tendenz verstärkte sich
bis zum Versuchsende. Durchschnittlich fielen die Thrombozytenzahlen von 583 G/l auf 102
G/l an Tag 17 p.i., was einer Abnahme von 82,5 % entsprach. Für Einzeltiere konnte eine
prozentuale Abnahme von 93 % (Tier 157) bzw. 98 % verzeichnet werden (Tier 153). Die
Thrombozytenzahlen des Tieres 154 folgten zunächst diesem Trend, zeigten jedoch
beginnend an Tag zehn p.i. eine Normalisierung bis hin zu Normalwerten (307 G/l) an Tag 17
p.i.. Die Thrombozytenzahlen der Kontrolltiere zeigten ausschließlich Schwankungen im
Normalbereich. Die Darstellung der Thrombozytenzahlen für die Tiere 153 bis 159 ist in
Abbildung 4-6 zusammengefaßt.
Bei der Ermittlung der Thrombozytenzahlen war festzuhalten, dass die Werte der Tiere 175,
177, 179 und 181 bei Ermittlung des Referenzwertes vor der Infektion unter dem
Normalbereich lagen. Die Werte an Tag eins p.i. lagen jedoch für alle Tiere im
Normalbereich. Die Tiere 175, 176, 178 und 179 zeigten einen anhaltenden Abwärtstrend der
Thrombozytenzahlen ab Tag zwei bzw. vier p.i., der sich bis zur Euthanasie der Tiere
fortsetzte. Die Thrombozytenzahlen sanken durchschnittlich auf 100 G/l an Tag 17 p.i.. Der
maximale Abfall war bei Tier 176 mit 96 % zu verzeichnen. Die Thrombozytenzahlen für
Tier 177 zeigten einen Abfall bis Tag sieben p.i., erholten sich jedoch wieder vollständig
(616 G/l an Tag 21 p.i.). Die Kontrolltiere zeigten deutliche intraindividuelle Schwankungen,
blieben jedoch über den gesamten Versuch im Referenzbereich bzw. darüber. Die ermittelten
Werte sind in Abbildung 4-7 festgehalten.
4 Ergebnisse 81
Der Parameter MPV zeigte große intra- und interindividuelle Schwankungen. Ein Anstieg des
Thombozytenvolumens war für infizierte Tiere zwischen dem vierten und zehnten Tag p.i. zu
verzeichnen. Der vom Gerätehersteller angegebene Referenzbereich von 6,8 – 12,6 fl wurde
mit geringfügigen Ausnahmen nicht verlassen. Tier 181 unterschritt den unteren Referenzwert
zu Beginn des Versuches, das andere Kontrolltier, Tier 180, zum Ende des Versuchs. Tier 176
zeigte zudem am Tag der Euthanasie einen Abfall des MPV auf 6,4 fl. Das MPV ist für die
Tiere 175 - 181 in Abbildung 4-8 dargestellt.
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 82
Leukozytenzahlen
0
5
10
15
20
25
30
0 3 7 10 14 17
Tage pi
Leu
ko
zyte
n [
G/l
]
Tier 153
Tier 154
Tier 155
Tier 156
Tier 157
Tier 158
Tier 159
Ref. 1
Ref. 2
Abbildung 4-4: Leukozytenzahlen der Tiere 153 - 159 im Versuchsverlauf. Tiere, die mit dem
hochvirulenten KSPV-Stamm CSF0634 infiziert wurden, zeigten, beginnend an Tag drei bzw.
sieben p.i. (Tier 155) eine deutliche Leukozytendepletion. Die Kontrolltiere 158 und 159 sind in
dunkelgrau dargestellt. Der Referenzbereich wurde vom Gerätehersteller mit 11,3 – 22,8 G/l
angegeben und ist durch die gestrichelten Linien verdeutlicht (Ref. 1 für den unteren, Ref. 2 für
den oberen Referenzwert).
Leukozytenzahlen
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 1 2 3 4 7 10 14 17 21
Tage pi
Leu
ko
zyte
n [
G/l
]
Tier 175
Tier 176
Tier 177
Tier 178
Tier 179
Tier 180
Tier 181
Ref. 1
Ref. 2
Abbildung 4-5: Leukozytenzahlen der Tiere 175 – 181 im Versuchsverlauf. Alle infizierten Tiere
zeigen eine Leukozytendepletion. Die Werte des Tieres 177 erreichen zu Versuchsende den
Normbereich. Die Kontrolltiere 180 und 181 sind in dunkelgrau dargestellt. Der Referenzbereich
wurde vom Gerätehersteller mit 11,3 – 22,8 G/l angegeben und ist durch die gestrichelten Linien
verdeutlicht (Ref. 1 für den unteren, Ref. 2 für den oberen Referenzwert).
4 Ergebnisse 83
Thrombozytenzahlen
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 3 7 10 14 17
Tage pi
Th
rom
bo
zyte
n [
G/l
]
Tier 153
Tier 154
Tier 155
Tier 156
Tier 157
Tier 158
Tier 159
Ref. 1
Ref. 2
Abbildung 4-6: Thrombozytenzahlen der Tiere 153 bis 159 im Verlauf des Experiments. Die
Kontrolltiere 158 und 159 sind in grau dargestellt. Der Referenzbereich wurde vom
Gerätehersteller mit 138,2 – 467,8 G/l angegeben und ist durch die gestrichelten Linien im
Diagramm gekennzeichnet (Ref. 1 und Ref. 2).
Thrombozytenzahlen
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 1 2 3 4 7 10 14 17 21
Tage pi
Th
rom
bo
zyte
n [
G/l
]
Tier 175
Tier 176
Tier 177
Tier 178
Tier 179
Tier 180
Tier 180
Ref. 1
Ref. 2
Abbildung 4-7: Thrombozytenzahlen der Tiere 175 – 181 im Versuchsverlauf. Die Kontrolltiere
180 und 181 sind in grau dargestellt. Der Referenzbereich wurde vom Gerätehersteller mit
138,2-467,8 G/l angegeben und ist durch die gestrichelten Linien im Diagramm gekennzeichnet
(Ref. 1 und Ref. 2).
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 84
Mittleres Thrombozytenvolumen (MPV)
5
6
7
8
9
10
11
12
13
0 1 2 3 4 7 10 14 17 21
Tage pi
Th
rom
bo
zyte
nv
olu
men
[fl
]
Tier 175
Tier 176
Tier 177
Tier 178
Tier 179
Tier 180
Tier 181
Ref. 1
Ref. 2
Abbildung 4-8: Mittleres Thrombozytenvolumen für die Tiere 175 bis 181 im Versuchsverlauf.
Der Referenzbereich (6,8 – 12,6 fl) liegt zwischen den gestrichelten Linien (Ref. 1 und Ref. 2).
4.1.6 Hämostaseologische Parameter
Neben den Globaltests der Gerinnung wurde für alle Tiere die Fibrinogenkonzentration im
Plasma bestimmt. Da unterschiedliche Methoden zum Einsatz kamen, konnte der Vergleich
ausschließlich auf Ebene der Verläufe und der prozentualen Veränderungen stattfinden.
Im Rahmen des ersten Vorversuches wurde zusätzlich eine Einzelfaktorenbestimmung der
Gerinnungsfaktoren II und V sowie von Antithrombin III durchgeführt (Tiere 154 – 159).
Die aPTT zeigte im Versuchsverlauf Schwankungen von maximal 20% für alle Tiere.
Ähnliches galt für die Thrombinzeit, deren Schwankungen mit einer Ausnahme ebenfalls
unter 20% lagen und alle Tiere betrafen. Tier 157 zeigte ausgeprägtere Schwankungen, die
sich vor allem in einem Anstieg um 28 % zwischen den Tagen drei und sieben p.i. sowie
einem nachfolgenden Abfall bis auf 43 % des Maximalwertes an Tag 14 p.i. manifestierten.
Die Verläufe sind in Abbildung 4-9 (aPTT) und Abbildung 4-10 (Thrombinzeit)
wiedergegeben.
4 Ergebnisse 85
Für die Prothombinzeit war ab dem zehnten Tag p.i. bis zum Tag der Euthanasie ein Anstieg
bei den infizierten Tiere, abgesehen von Tier 154, feststellbar. Die Werte stiegen dabei um 70
(Tier 156) bis 94 % (Tier 157), wobei der durchschnittliche Anstieg 83 % betrug. Die
Kontrolltiere zeigten nur geringfügige Schwankungen (mit wenigen Ausnahmen unter
zehn Prozent) in allen durchgeführten Globaltests. Die Prothrombinzeit ist in Abbildung 4-11
gezeigt.
Die unter 3.2.4.2 genannten Inkompatibilitäten in den Reagenzien zur aPTT-Bestimmung
führten, da das Plasma für eine erneute Bestimmung mit dem neuen Reagenz nicht ausreichte,
dazu, dass die aPTT-Ergebnisse des zweiten Vorversuchs erst ab dem vierten Tag p.i.
aufgezeichnet werden konnten. In allen Globaltests wurde ein kommerzielles, humanes
Kontrollplasma mitgeführt.
Bei den Werten der aPTT kam es zu Schwankungen von weniger als 20% bei allen Tieren.
Abweichend zeigte Tier 176 einen Anstieg von ca. 30% vom zehnten auf den 14. Tag p.i. Das
mitgeführte humane Kontrollplasma gab über den gesamten Versuchsverlauf Werte im vom
Hersteller vorgegebenen Referenzbereich. Die ermittelten Werte sind in Abbildung 4-12
dargestellt.
Die Probenaliquots der Tage 14 bis 24 p.i. zur Bestimmung der Thrombinzeit und
Prothrombinzeit für die Tiere 175 bis 181 wiesen nach dem Auftauen teilweise gelartige
Konsistenzveränderungen auf. Standen keine weiteren Proben zur Verfügung, wurden diese
Aliquots versuchsweise eingesetzt.
Die Thrombinzeit zeigte intra- und interindividuelle Schwankungen in den Werten aller Tiere
von Tag null bis zehn p.i., die im Bereich zwischen <10 % (Tiere 175, 180, 181) und 26%
(Tier 176) lagen. Das Plasma der Tiere 176, 178 und 179 wies an den Tagen 14, 21 und 24
p.i. die oben genannten Veränderungen auf und wurde nicht in die Auswertung einbezogen.
Für die Tiere 175 und 177 war ein Anstieg an Tag 21 p.i. zu verzeichnen, dessen Werte
jedoch nur acht bzw. 13 % über dem Ausgangswert an Tag null p.i. lagen. Die Kontrolltiere
wiesen über den gesamten Versuchsverlauf ausschließlich Schwankungen unter 10 % auf.
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 86
Das humane Kontrollplasma zeigte durchgängig Werte im angegebenen Referenzbereich. Die
Verläufe sind in Abbildung 4-13 zu finden.
Die Bestimmung der Prothrombinzeit wurde durch Konsistenzveränderungen einiger
Plasmaaliqouts erschwert. Das Plasma der Tiere 176, 178 und 179 wurde an den Tagen 14, 21
und 24 p.i. nicht in die Auswertung einbezogen. Die Plasmaaliquots der Tage eins p.i. für Tier
179 bzw. drei p.i. für Tier 180 zeigten ähnliche Veränderungen. Die Prothrombinzeit wies
einen leichten Anstieg an Tag zehn p.i. für die Tiere 177, 178 und 179 bzw. 14 Tage p.i. für
die Tiere 175 und 176 auf, allerdings war auch für Kontrolltier 180 ein Gipfel zehn Tage p.i.
nachweisbar. Im Vergleich mit dem Nullwert lagen die genannten Verlängerungen unter 10 %
bzw. lagen noch unter den absoluten Zahlen der Nullwerte. Die auswertbare Messwerte der
Kontrolltiere (Tiere 180, 181) zeigten geringe Schwankungen (<10 %). Das humane
Kontrollplasma lag stets im zuvor laborintern ermittelten Bereich für das modifizierte
Protokoll zur Prothrombinzeitbestimmung. Die Darstellung der ermittelten Werte ist in
Abbildung 4-14 abgebildet.
4 Ergebnisse 87
aPTT
0
5
10
15
20
25
0 3 7 10 14 17
Tage pi
aP
TT
[s]
Tier 153
Tier 154
Tier 155
Tier 156
Tier 157
Tier 158
Tier 159
Abbildung 4-9: Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung. Die aPTT im Verlauf der KSPV-
Infektion.
Thrombinzeit
0
5
10
15
20
25
30
0 3 7 10 14 17
Tage pi
Th
rom
bin
zeit
[s]
Tier 153
Tier 154
Tier 155
Tier 156
Tier 157
Tier 158
Tier 159
Abbildung 4-10: Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung. Thrombinzeit im Verlauf der KSPV-
Infektion.
Abbildung 4-11: Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung. Prothrombinzeit im Verlauf der
KSPV-Infektion.
Prothrombinzeit
0
10
20
30
40
50
0 3 7 10 14 17
Tage pi
Pro
thro
mb
inze
it [
s]
Tier 153
Tier 154
Tier 155
Tier 156
Tier 157
Tier 158
Tier 159
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 88
aPTT
10
15
20
25
30
35
4 7 10 14 17 21 24
Tage pi
Ger
inn
un
gsz
eit
[s]
Tier 175
Tier 176
Tier 177
Tier 178
Tier 179
Tier 180
Tier 181
Kontrolle
Abbildung 4-12: Globaltests der Gerinnung. Ergebnisse der aPTT-Bestimmung. Die Werte für
das humane Kontrollplasma sind hellgrau dargestellt.
Thrombinzeit
8
10
12
14
16
18
0 1 2 3 4 7 10 14 17 21 24
Tage pi
Th
rom
bin
zeit
[s]
Tier 175
Tier 176
Tier 177
Tier 178
Tier 179
Tier 180
Tier 181
Kontrolle
s
Abbildung 4-13: Globaltests der Gerinnung. Ergebnisse der Thrombinzeitbestimmung. Die Werte
für das humane Kontrollplasma sind hellgrau dargestellt.
Prothrombinzeit
10
12
14
16
18
20
22
24
26
0 1 2 3 4 7 10 14 17 21 24
Tage pi
Pro
thro
mb
inze
it [
s]
Tier 175
Tier 176
Tier 177
Tier 178
Tier 179
Tier 180
Tier 181
Kontrolle
Abbildung 4-14: Globaltests der Gerinnung. Ergebnisse der Prothrombinzeitbestimmung. Die
Werte des humanen Kontrollplasmas sind hellgrau dargestellt.
4 Ergebnisse 89
Die Ergebnisse der Fibrinogenbestimmungen für die Tiere beider Vorversuche sind in
Abbildung 4-15 (Tiere 153 – 159) und Abbildung 4-16 (Tiere 175 – 181) dargestellt. Die
absoluten Werte waren nur in der Tendenz vergleichbar, da sie mit unterschiedlichen
Methoden ermittelt wurden (s. 3.2.4.4).
Die Fibrinogenkonzentrationen wiesen für die Tiere 153 – 159 ausgeprägte interindividuelle
Schwankungen auf, welche jedoch für die infizierten Tiere deutlicher ausfielen. Der
Referenzbereich der Methode nach CLAUSS wird von MISCHKE (1999) mit 1,6 – 3,9 g/l
angegeben. Somit sank die Konzentration für keines der Tiere unter den Referenzbereich. Die
oberen Referenzwerte wurden von allen infizierten Tieren im Versuchsverlauf überschritten,
wobei der prozentuale Anstieg, bezogen auf den Vergleich zwischen Nullwert und
Maximalwert, 40,7 (Tier 155) bis 64,1 % (Tier 156) betrug. Tier 157 bildete insofern eine
Ausnahme, als dass bereits der Nullwert über dem Referenzbereich lag.
Die Tiere 176, 178 und 179 zeigten einen erkennbaren Anstieg der Fibrinogenkonzentration
beginnend mit leichten Schwankungen ab dem vierten Tag p.i.. Gleiches galt für die Tiere
175 und 177, deren Werte jedoch daraufhin wieder sanken. Für Tier 177 war zu Versuchsende
der Ausgangswert wieder erreicht, Tier 175 blieb deutlich darüber. Für das Tier 179 konnte an
Tag eins p.i. nur ein hämolytisches Plasma gewonnen werden, welches zudem bereits
Gerinnsel enthielt. Der Anstieg für die infizierten Tiere lag zwischen 32,9 (Tier 177) und
41,9 % (Tier 159) gemessen am Verhältnis zwischen Nullwert und Maximalwert. Für die
Kontrolltiere waren nur geringe Schwankungen erkennbar. Ein Poolplasma der Versuchstiere
vor der Infektion erbrachte Werte von 2,5 ± 0,4 g/l.
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 90
Fibrinogenkonzentration
(Methode nach CLAUSS)
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
0 3 7 10 14 17 18 21
Tage pi
Fib
rin
og
en [
g/l
]
Tier 153
Tier 154
Tier 155
Tier 156
Tier 157
Tier 158
Tier 159
Abbildung 4-15: Fibrinogenkonzentrationen. Die Bestimmungen erfolgten für die Tiere 153 bis
159 mit der Methode nach CLAUSS (Referenzbereich 1,6 – 3,9 g/l).
Fibrinogenkonzentration
(Methode nach RATNOFF und MENZIE)
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
0 1 2 3 4 7 10 14 17 21 24
Tage pi
Fib
rin
og
en [
g/l
]
Tier 175
Tier 176
Tier 177
Tier 178
Tier 179
Tier 180
Tier 181
Abbildung 4-16: Fibrinogenkonzentrationen. Die Bestimmungen erfolgten für die Tiere 175 bis
181 mit der Methode nach RATNOFF und MENZIE (Normalwert für Poolplasma 2,5 ± 0,4 g/l).
4 Ergebnisse 91
Für den Gerinnungsfaktor II (Prothrombin) war bereits vor der Infektion eine große
interindividuelle Schwankungsbreite zu verzeichnen. Für die Tiere 153, 154 und 155 sowie
in geringerem Ausmaß auch für Tier 156 war ein Gipfel an Tag sieben p.i. zu verzeichnen,
der sich nicht bei den Kontrolltieren fand. Der prozentuale Anstieg lag für diesen Gipfel,
bezogen auf den vorangegangenen Wert bei 38 (Tier 153), 53 (Tier 154) und 48 % (Tier
155), für Tier 156 bei 15 %. Die Werte erreichten Tag 14 p.i. jedoch wieder annähernd den
Wert des vorangegangenen Entnahmetages (Tag drei p.i.). Tier 156 zeigte auf den Gipfel
folgend eine Abnahme der Aktivität, die bis zum Tag der Euthanasie anhielt. Die Aktivität
halbierte sich in dieser Phase. Dieser Abfall war auch für Tier 157 zu verzeichnen. In diesem
Fall sank die Aktivität um mehr als 50 %. Die Verläufe sind in Abbildung 4-17 abgebildet.
Der für den Faktor II beschriebene Gipfel an Tag sieben p.i. fand sich auch in der Aktivität
des Gerinnungsfaktors V. Hier zeigten besonders die Tiere 154 und 155 eine Steigerung der
Aktivität auf Werte von fast bzw. über 300 %. Eine geringere Aktivitätssteigerung war auch
für die Tiere 153 (50 %) und 156 (24 %) zu verzeichnen, deren Faktor-V-Aktivitäten im
Folgenden absanken. Tier 157 zeigte ausschließlich einen Aktivitätsabfall beginnend an Tag
zehn p.i., der zu einer Halbierung der Aktivität führte. Die Kontrolltiere zeigten
Aktivitätsschwankungen bis zu 25 %, wobei die Werte durchschnittlich zwischen 80 und
110 % lagen. Die ermittelten Werte sind in Abbildung 4-18 dargestellt.
Die Aktivität des Antithrombins III nahm bei allen Tieren der infizierten Gruppe im
Versuchsverlauf ab. Besonders ausgeprägt war dieser Verlauf bei den Tieren 153, 155 und
157, bei denen sich die Aktivität halbierte. Kontrolltier 158 wies einen leichten Abwärtstrend,
jedoch keine auffallenden Schwankungen auf, während die Werte von Tier 159 zwischen
110 % und 85 % schwankten. Die Verläufe sind in Abbildung 4-19 abgebildet.
Der EGT, der ausschließlich für die Tiere 175 – 181 durchgeführt wurde, zeigte positive
Reaktionen für die Tiere 175 und 176 an Tag 17 p.i. und für das Tier 179 an den Tagen 14
und 15 p.i. Alle verbleibenden Tiere reagierten über den gesamten Versuchsverlauf negativ.
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 92
Aktivität des Gerinnungsfaktors II
20
40
60
80
100
120
140
0 3 7 10 14 17 18 21
Tage pi
Ak
tiv
itä
t [%
]
Tier 153
Tier 154
Tier 155
Tier 156
Tier 157
Tier 158
Tier 159
Abbildung 4-17: Einzelfaktorenbestimmung. Faktor-II-Aktivität.
Aktivität des Gerinnungsfaktors V
0
50
100
150
200
250
300
350
0 3 7 10 14 17 18 21
Tage pi
Ak
tiv
itä
t [%
]
Tier 153
Tier 154
Tier 155
Tier 156
Tier 157
Tier 158
Tier 159
Abbildung 4-18: Einzelfaktorenbestimmung. Faktor-V-Aktivität.
Aktivität des Antithrombins III
40
50
60
70
80
90
100
110
120
0 3 7 10 14 17 18 21
Tage pi
Ak
tiv
itä
t [%
]
Tier 153
Tier 154
Tier 155
Tier 156
Tier 157
Tier 158
Tier 159
Abbildung 4-19: Einzelfaktorenbestimmung. Antithrombin-III-Aktivität.
4 Ergebnisse 93
4.2 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels
PEG-Hirudin
Die zehn Läuferschweine für dieses Experiment, die nach dem Zufallsprinzip in zwei
Gruppen aufgeteilt worden waren, wurden mit 5 x 104,5
KID50 des KSPV Isolats CSF0634
intranasal infiziert. Gruppe I, bestehend aus den Tieren 182 - 186, erhielt täglich PEG-Hirudin
als subkutane Injektion. Gruppe II, die Tiere 187-191 umfassend, diente als unbehandelte
Kontrolle.
4.2.1 Nachweis des therapeutischen PEG-Hirudinspiegels
Der Plasmahirudinspiegel der Tiere 182 – 186 (Gruppe I) wurde täglich mittels ECT
bestimmt, um zu gewährleisten, dass der Plasmahirudinspiegel im therapeutischen Bereich
(ca. 0,5 – 1,5 µg/ml) lag, ohne jedoch toxische Werte zu erreichen. Die Messung erfolgte aus
Citratplasma. Alle Tiere der Gruppe I zeigten über den gesamten Versuch einen den oben
genannten Kriterien entsprechenden PEG-Hirudinspiegel. Die Kalibration der ECT und die
gemessenen Werte für die Einzeltiere befinden sich im Anhang unter 8.1 in Abbildung 8-1
und Abbildung 8-2.
4.2.2 Nachweis der Infektion
Für den Nachweis der Infektion mit dem KSPV-Isolat CSF0634 wurde an Tag zehn nach der
Infektion eine EDTA-Blutprobe gewonnen und die daraus gewonnenen Leukozyten in der
Virusisolierung untersucht. Alle Tiere erwiesen sich als KSPV positiv an Tag zehn p.i. Die
Ergebnisse sind im Anhang unter 8.1 in Tabelle 8-5 dargestellt.
4.2.3 Entwicklung der Körpertemperatur
Die rektale Körpertemperatur der Schweine wurde einmal täglich erfasst und dokumentiert.
Als Fieber wird nachfolgend eine Körpertemperatur über 40°C verstanden. Nach der Infektion
mit dem KSPV-Isolat CSF0634 entwickelten die Tiere der Gruppe I zwischen dem vierten
und siebten Tag Fieber, das bei allen Tieren auf Werte über 41°C anstieg.
Die Tiere der Gruppe II zeigten zwischen dem fünften und sechsten Tag nach der Infektion
erstmals febrile Temperaturen. Die durchschnittliche Maximaltemperatur betrug 41,5°C.
4 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin 94
Der Verlauf der Körpertemperaturen beider Gruppen wurde anhand der Gruppenmittelwerte
verglichen. Wie aus Abbildung 4-20 zu ersehen ist, ergaben sich nur geringfügige
Abweichungen in den Kurvenverläufen.
Gruppenmittelwerte der Körpertemperaturen im Versuchsverlauf
38
39
40
41
42
43
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tage pi
Tem
per
atu
r in
°C
Gruppe I
Gruppe II
Abbildung 4-20: Temperaturkurven dargestellt als Gruppenmittelwerte (Mittelwerte ±
Standardabweichung) der Gruppen I und II.
4.2.4 Dokumentation der klinischen Symptome
Die Dokumentation der klinischen Symptome wurde nach der Inkubationszeit (Zeit zwischen
Infektion und dem Auftreten der ersten Symptome, hier Fieber) gemäß den
Standardprotokollen des EURLs zur Erfassung des CS modifiziert nach MITTELHOLZER
vorgenommen.
Die Tiere der Gruppe I entwickelten nach vier bis sieben Tagen zunächst unspezifische
Krankheitssymptome. Dazu gehörten Apathie, Konjunktivitis, Fressunlust, Diarrhoe und
Obstipation. Tier 182 zeigte bereits neun Tage p.i. schwerste Allgemeinsymptome,
hochgradige Dyspnoe, Ataxie und Hautblutungen und wurde daraufhin moribund
euthanasiert. Bei den anderen Tieren aus Gruppe I entwickelten sich erste Hautblutungen und
zentralnervöse Symptome zwischen dem elften (Tier 183) und 15. Tag p.i. (Tier 185). Alle
Tiere zeigten die akute Verlaufsform der KSP mit hämorrhagischen Symptomen, die sich v. a.
in petechialen Blutungen im Bereich der Akren äußerten, sowie zentralnervöse Symptome.
4 Ergebnisse 95
Vier der fünf Tiere zeigten Anzeichen einer schweren Atemwegsinfektion. Die Euthanasie der
Tiere wurde zwischen dem neunten und 17. Tag nach der Infektion durchgeführt. Der
Mittelwert des CS zum Zeitpunkt der Euthanasie betrug für die Tiere der Gruppe I 17,6.
Desgleichen entwickelten alle Tiere der Gruppe II die akute Verlaufsform der KSP. Nach
einer anfänglichen Phase mit unspezifischen Symptomen (s. o.) entwickelten alle Tiere
hämorrhagische Symptome unterschiedlicher Ausprägung. Erste Hautblutungen traten
zwischen dem elften (Tier 189) und 14. Tag p.i. (Tier 190) auf. Wie die Tiere der Gruppe I,
entwickelten auch diese Tiere unterschiedlich ausgeprägte zentralnervöse Symptome. Alle
Tiere zeigten respiratorische Symptome. Die Euthanasie erfolgte zwischen dem 15. und 18.
Tag nach der Infektion. Der Mittelwert des CS zum Zeitpunkt der Euthanasie betrug für die
Tiere der Gruppe II 21,6.
Um die Krankheitsverläufe zu vergleichen, wurde der CS auch als Gruppenmittelwert
dokumentiert. Die Gruppenmittelwerte und die entsprechenden Standardabweichungen sind
in Abbildung 4-21 zu sehen. Wie aus der Abbildung ersichtlich wird, zeigten die Tiere der
Gruppe I einen geringfügig niedrigeren CS, die Verläufe präsentierten sich jedoch sehr
ähnlich.
Entwicklung der klinischen Symptome
(Gruppenmittelwerte)
0
5
10
15
20
25
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tage pi
CS
Gruppe I
Gruppe II
Abbildung 4-21: Gruppenmittelwerte für den CS beider Tiergruppen. Die Angabe des CS erfolgt
in Punkten von maximal 27. Gruppe I erhielt täglich Hirudin, Gruppe II diente als
Positivkontrolle. Die Erfassung begann mit dem Auftreten erster klinischer Symptome.
4 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin 96
4.2.5 Erfassung der pathologisch-anatomischen Befunde
Die Erfassung und Dokumentation der pathologisch-anatomischen Befunde erfolgte nach dem
Standardprotokoll des EURLs in Anlehnung an das von FLOEGEL-NIESMANN et al. (2003)
erarbeitete Verfahren.
Die Tiere der Gruppe I wurden zwischen dem neunten und 17. Tag p.i. euthanasiert. Alle
Tiere zeigten in den postmortalen Untersuchungen klassische Befunde, die gemeinhin mit der
KSPV-Infektion in Verbindung gebracht werden. In unterschiedlicher Ausprägung zeigten die
Tiere petechiale und ekchymatöse Blutungen im Bereich der Akren und des ventralen
Abdomens sowie in den Nieren. Alle Tiere wiesen vergrößerte, zum großen Teil
hämorrhagisch-infarzierte Lymphknoten auf. Bei den Tieren 185 und 186 waren
Milzrandinfarkte zu verzeichnen. Schwere Sekundärinfektionen des Respirationstraktes
zeigten die Tiere 183, 184, 185 und 186. Tier 185 zeigte zudem eine purulente Pyelonephritis.
Die Tiere der Gruppe II wurden zwischen dem 15. und 18. Tag nach der Infektion
euthanasiert. Die Sektion zeigte bei allen Tieren klassische Befunde der KSPV Infektion.
Ohne Ausnahme, jedoch in unterschiedlicher Ausprägung, zeigten die Tiere hämorrhagische
Symptome. Hochgradig vergrößerte Lymphknoten im gesamten Körper konnten ebenfalls bei
allen Tieren gefunden werden. Milzrandinfarkte zeigten die Tiere 187 und 191. Die Tiere 187,
188, 189 und 190 zeigten schwere Sekundärinfekionen des Respirationstraktes, die Tiere 187
und 188 wiesen zudem eine hochgradige Pyelonephritis auf.
Die vergleichende Betrachtung der pathologisch-anatomischen Befunde beider Gruppen zeigt
keine Unterschiede in der Ausprägung oder der Art der Befunde.
Einige Bilder charakteristischer pathologisch-anatomischer Befunde sind in Abbildung 4-22
festgehalten.
4 Ergebnisse 97
Abbildung 4-22: Pathologisch-anatomische Veränderungen, die während der postmortalen
Untersuchungen der Tiere beider Gruppen erhoben wurden. Bild A: Hämorrhagisch-infarzierte
Dünndarmlymphknoten des Tieres 190. Bild B: Charakteristische Hautveränderungen im Bereich
der Ohren. Bild C: Petechien im Verlauf der Herzkranzgefäße und im Myokard. Bild D:
Multifokale Petechien in der Nierenrinde. Bild E: Eitrige Tonsillitis. Bild F: Sekundärinfektion
der Lunge.
BA
E F
DC
4 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin 98
4.2.6 Ergebnisse der hämatologischen Untersuchungen
4.2.6.1 Gesamtleukozytenzahl
Im Verlauf der Infektion mit dem KSPV-Isolat CSF0634 zeigten alle Tiere der Gruppe I eine
hochgradige Leukopenie. Die durchschnittliche Leukozytenzahl sank von 25,58 G/l auf
3,61 G/l. Der Abfall betrug für die Einzeltiere zwischen 48 (Tier 182, neun Tage pi) und 86 %
(Tier 186, 16 Tage pi).
Auch die Tiere der Gruppe II entwickelten eine ausgeprägte Leukopenie im Verlauf der
KSPV-Infektion. Die durchschnittliche Leukozytenzahl betrug zu Beginn des Versuchs 22,68
G/l. Unter der Infektion verringerte sie sich auf 9,85 G/l. Der prozentuale Abfall lag zwischen
32 (Tier 187, 17 Tage p.i.) und 87,2 % (Tier 188, 16 Tage p.i.).
Der Vergleich der beiden Gruppen macht deutlich, dass die Leukopenie in Gruppe II etwas
weniger ausgeprägt war, wobei der Verlauf jedoch einen nahezu parallelen Charakter zeigte
(Abbildung 4-23).
Leukozytenmittelwerte
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 14 15 16 17
Tage pi
Leu
ko
zyte
n [
G/l
]
Gruppe I
Gruppe II
Ref. 1
Ref. 2
Abbildung 4-23: Gruppenmittelwerte (MW ± Standardabweichung) für die Leukozytenzahlen
beider Gruppen. Der Referenzbereich ist durch die gestrichelten Linien (Ref. 1 und Ref. 2)
dargestellt.
4 Ergebnisse 99
4.2.6.2 Thrombozytenzahl und Thrombozytenparameter
Alle Tiere entwickelten im Infektionsverlauf eine ausgeprägte Thrombozytopenie. Zwischen
dem zweiten und fünften Tag bzw. dem sechsten und neunten Tag nach der Infektion zeigten
beide Gruppen Gipfel in den Thrombozytenwerten, die der Verlaufkurve ein wellenförmiges
Aussehen verlieh. Die inter- und intraindividuellen Schwankungen waren ausgeprägt.
Die durchschnittliche Thrombozytenzahl sank für die Tiere der Gruppe I von 549 G/l zu
Versuchsbeginn auf 39 G/l, bzw. für das letzte verbleibende Tier (184) auf 13 G/l ab.
Prozentual lag der Abfall für die Einzeltiere zwischen 75 (Tier 182, zehn Tage p.i.) und 96 %
(Tier 184, 17 Tage p.i.). Für Gruppe II war ein Thrombozytenabfall von 395 G/l auf 106 G/l
zu verzeichnen, wobei die prozentuale Änderung, bezogen auf den Nullwert, 30 (Tier 190, 17
Tage p.i.) bis 96 % (Tier 188, 16 Tage p.i.) betrug. Im Vergleich der Maximalwerte mit den
Minimalwerten lag die prozentuale Änderung zwischen 79 (Tier 190) und 97 % (Tier 188).
Die Thrombozytenmittelwerte, deren Verläufe quasi parallel waren, finden sich in unten
stehender Abbildung (Abbildung 4-24).
Thrombozytenzahlen
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 14 15 16 17
Tage pi
Th
rom
bo
zyte
n [
g/l
]
Gruppe 1
Gruppe 2
Ref. 1
Ref. 2
Abbildung 4-24: Thrombozytenmittelwerte (MW ± Standardabweichung) für die Tiere beider
Gruppen. Der vom Gerätehersteller angegebene Referenzbereich ist durch die gestrichelten
Linien gekennzeichnet.
Das MPV zeigte inter- und intraindividuelle Schwankungen, die Gruppenmittelwerte
spiegelten den Verlauf wieder. Die Darstellung befindet sich in Abbildung 4-25.
4 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin 100
Gruppe I zeigte einen biphasischen Verlauf mit einem Gipfel zwischen dem fünften und
sechsten Tag p.i. und einem zweiten Gipfel zwischen dem 14. und 16. Tag p.i.. Der obere
Referenzwert von 12,6 fl wurde dabei von den Tieren mit Ausnahme des Tieres 185 für den
ersten Gipfel erreicht (Tier 186) bzw. um 0,2 und 2,5 fl (Tiere 182 und 186) überschritten.
Alle Tiere, die zu diesem Zeitpunkt noch lebten, überschritten den oberen Referenzwert
zwischen dem 14. und 16. Tag p.i. um 0,5 (Tier 185) bis 1,9 fl (Tier 184).
Die MPV-Verläufe der Gruppe II stellten sich ähnlich dar. Alle Tiere zeigten, unterschiedlich
ausgeprägt, einen Gipfel zwischen Tag fünf und sechs p.i. sowie einen ähnlichen Gipfel an
Tag 14 p.i.. Tier 187 zeigte dabei ausgeprägte Schwankungen und erreichte fünf Tage p.i. ein
MPV von 20 fl. Tier 188 zeigte einen ersten Gipfel von 14,8 fl und einen nur sehr flach
ausgeprägten Gipfel an Tag 14, der den Referenzbereich nicht verließ. Für die Tiere 189 und
191 konnte zwischen dem fünften und sechsten Tag p.i. kein Blut gewonnen werden, daher
fehlen Informationen über den Verlauf in diesem Bereich. Der erste Gipfel verließ nur bei
Tier 187 den Normalbereich. Für den zweiten Gipfel waren es die Tiere 187, 189 und 191.
Tier 188 unterschritt an den Tagen 15 und 16 p.i. den Referenzbereich. Die Verläufe beider
Gruppen waren somit annähernd parallel.
Mittleres Thrombozytenvolumen
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 14 15 16 17
Tage pi
MP
V [
fl]
Gruppe I
Gruppe II
Ref. 1
Ref. 2
Abbildung 4-25: Mittleres Thrombozytenvolumen (MW ± Standardabweichung) für die Tiere
beider Gruppen. Der vom Gerätehersteller angegebene Referenzbereich ist mit gestrichelten
Linien angedeutet (Ref. 1 und Ref. 2).
4 Ergebnisse 101
Der Parameter Large Platelets zeigte für alle Tiere einen Gipfel an Tag fünf bzw. sechs p.i.
Große intra- und interindividuelle Schwankungen waren zu beobachten, die
Gruppenmittelwerte geben jedoch den Verlauf wieder. Insgesamt lagen die Maxima für die
Gruppe I zwischen 42000 (Tier 182) und 66000 (Tier 186) Large Platelets pro µl, für die
Gruppe II zwischen 40000 (Tier 191) und 81000 (Tier 187) Large Platelets pro µl. Die
Gruppenmittelwerte sind in Abbildung 4-26 wiedergegeben.
Large Platelets
0
10
20
30
40
50
60
70
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 14 15 16 17
Tage pi
La
rge
Pla
tele
ts [
10
*3
/µl]
Gruppe I
Gruppe II
Abbildung 4-26: Large Platelets (MW ± Standardabweichung) für die Tiere beider Gruppen.
4.2.6.3 Hämostaseologische Parameter
Die Verläufe der Gruppenmittelwerte für die Globaltests der Gerinnung sind in Abbildung
4-27 (aPTT), Abbildung 4-28 (Thrombinzeit) und Abbildung 4-29 (Prothrombinzeit)
abgebildet.
Im Vorfeld dieses Versuches wurde die aPTT so kalibriert, dass die eingesetzte
Plasmaverdünnung in Diäthylbarbituratacetatpuffer im physiologischen Bereich eine
Gerinnungszeit von 30 ± 3 sec aufwies (Kalibrierungsdaten sind im Anhang unter 8.1 in
Abbildung 8-3 zu finden). Das gepoolte Plasma wurde im Versuchsverlauf zur Überprüfung
der Methode eingesetzt.
Die aPTT zeigte für beide Gruppen einen leichten Anstieg zwischen dem vierten und sechsten
Tag p.i.. Die Werte der Gruppe I lagen durchschnittlich zehn sec über denen der Gruppe II,
die Werte zeigten jedoch ansonsten einen annähernd parallelen Verlauf. Die Tiere der
Gruppe II wichen vom laborinternen Normalwert an den Tagen drei bis sechs, acht und 16 p.i.
4 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin 102
ab, wobei Verlängerungen der Gerinnungszeit zwischen 1,3 und 6,6 sec zu verzeichnen
waren. Die prozentualen Schwankungen der Gruppenmittelwerte im Versuchsverlauf
betrugen maximal 25 % für Gruppe I und 31 % für Gruppe II. Das Kontrollplasma ergab über
den gesamten Versuchsverlauf Werte im laborinternen Referenzbereich.
Die Gabe des Thrombininhibitors Hirudin machte die Messung der Thrombinzeit für die Tiere
der Gruppe I unmöglich, daher wurde dieser Test nur für die Tiere 187 – 191 durchgeführt
(Gruppe II). Der Verlauf zeigte Gipfel an den Tagen fünf und acht p.i. An Tag fünf p.i.
wurden Gerinnungszeiten gemessen, die drei bis vier sec über dem Ausgangswert lagen. Für
den zweiten Gipfel an Tag acht p.i. lagen die Werte drei bis 3,5 sec darüber. Die Werte
erreichten zu Versuchsende annähernd den Ausgangwert. Das mitgeführte Poolplasma ergab
Thrombinzeiten von 15,5 ± 0,3 sec.
Die Prothrombinzeit zeigte nach einem Abfall an den Tagen eins und zwei p.i. einen bis zum
Versuchsende andauernden Anstieg, dessen Verlauf für die Tiere beider Gruppen quasi
parallel war. Gruppe I lag dabei immer etwas über den Werten der Gruppe II und erreichte zu
Versuchsende einen ca. 7 sec höheren Wert. Im Versuchsverlauf war für die Gruppe I ein
durchschnittlicher Anstieg von fast 20 sec (110 %) zu verzeichnen. Der Ausgangswert lag
durchschnittlich bei 17,8 sec. Die Tiere der Gruppe II zeigten einen durchschnittlichen
Anstieg von 17,4 sec auf 30,2 sec (73,5 %). Das mitgeführte Poolplasma zeigte Werte von
13,1 ± 0,5 sec.
4 Ergebnisse 103
Aktivierte partielle Thromboplastinzeit
20
25
30
35
40
45
50
55
60
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tage pi
aP
TT
[s]
Gruppe I
Gruppe II
Ref.
Abbildung 4-27: aPTT für die Tiere der Gruppen I und II (MW ± Standardabweichung). Der
laborintern an gepooltem Schweineplasma vor der Infektion ermittelte Standard ist in grau
dargestellt.
Thrombinzeit
10
12
14
16
18
20
22
24
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tage pi
Th
rom
bin
zeit
[s]
Gruppe II
Abbildung 4-28: Thrombinzeit für die Tiere der Gruppe II (MW ± Standardabweichung). Da
Hirudin als spezifischer Thrombininhibitor die Messung der Thrombinzeit bei den behandelten
Tieren unmöglich machte, ist hier nur die Kontrollgruppe dargestellt.
4 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin 104
Prothrombinzeit
10
15
20
25
30
35
40
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tage pi
Pro
thro
mb
inze
it [
s]
Gruppe I
Gruppe II
Abbildung 4-29: Prothrombinzeit für die Tiere der Gruppen I und II. Dargestellt sind die
Gruppenmittelwerte (MW ± Standardabweichung).
Die Fibrinogenkonzentration ist als Gruppenmittelwert für beide Gruppen in Abbildung 4-30
festgehalten. Die Werte beider Gruppen zeigten einen anhaltenden Aufwärtstrend ab dem
dritten Tag p.i.. Der Ausgangswert von ca. 2,25 g/l erhöhte sich dabei durchschnittlich auf
2,85 g/l für die Tiere der Gruppe I und auf 3,15 g/l für die Tiere der Gruppe II. Der
Gruppenmittelwert der Gruppe I erreichte seinen Gipfel von 3,07 g/l an Tag 13 p.i. und fiel
daraufhin wieder geringfügig ab. Das Maximum für die Gruppe II wurde an Tag elf mit
3,37 g/l erreicht. Zu Kontrollzwecken wurde ein kommerzielles humanes Plasma mitgeführt.
Dieses Plasma zeigte über den gesamten Versuchsverlauf Werte von 2,01 bis 2,12 g/l und lag
damit im unteren Referenzbereich des Herstellers. Die Kalibrationskurve zur Errechnung der
Fibrinogenkonzentration ist im Anhang 8.1 beispielhaft in Abbildung 8-4 dargestellt.
4 Ergebnisse 105
Fibrinogenkonzentration
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tage pi
Fib
rin
og
en [
g/l
]
Gruppe I
Gruppe II
Abbildung 4-30: Fibrinogenkonzentration für die Tiere der Gruppen I und II (MW ±
Standardabweichung).
4.3 Pharmakokinetische Vorversuche in vitro und in vivo
Eine Vorprüfung der verfügbaren Wirkstoffe in vitro ergab, dass Tirofiban und ASS zu einer
Hemmung der Thrombozytenaggregation in Schweineplasma führten. Diese Wirkstoffe
wurden daraufhin in vivo getestet. Dabei stellte sich heraus, dass Tirofiban aufgrund seiner
Kinetik nicht für den Einsatz in einem längeren Experiment geeignet war. Nach subkutaner
Gabe des Wirkstoffs konnte eine 20 %ige Hemmung erreicht werden, die sich jedoch nicht
aufrechterhalten ließ. Nach einer Stunde konnte keine Hemmwirkung mehr in der
Thrombozytenaggregation nachgewiesen werden. Dieser Wirkstoff wurde daher nicht weiter
geprüft. ASS zeigte bei intravenöser (i.v.) Gabe nach 60 Minuten eine irreversible Hemmung
der Kollagen-induzierten Thrombozytenaggregation; die ADP-induzierte Aggregation blieb
dabei fast unbeeinflusst. Der monoklonale Antikörper Abciximab zeigte weder in vitro noch
in vivo eine messbare Wirkung und wurde daher nach ersten Versuchen ausgeschlossen. Das
oral zu verabreichende Clopidogrel wurde ausschließlich in vivo getestet und erwies sich in
diesem Vorversuch als wirksam.
Clopidogrel und ASS wurden daraufhin kombiniert in einem dreitägigen Experiment in vivo
eingesetzt. Es kamen orale Formulierungen der Wirkstoffe zum Einsatz, deren Dosierungen in
Tabelle 4-1 aufgeführt sind. Den Tieren wurde nach der Nullwertprobe vor Versuchsbeginn
zweimal täglich Blut entnommen, einmal vor der erneuten Wirkstoffapplikation und einmal
vier bis sechs Stunden danach. Es zeigte sich im Thrombozytenaggregationstest, dass die
4 Pharmakokinetische Vorversuche in vitro und in vivo 106
ADP-induzierte Thrombozytenaggregation durch eine einmal tägliche Applikation der oben
genannten Kombination dauerhaft um 30 – 50 % gehemmt wurde. Die Kollagen-induzierte
Thrombozytenaggregation konnte bei zwei von drei Tieren über die gesamte Versuchsdauer
um ca. 30% gehemmt werden. Für das Tier 229 traten starke Schwankungen auf, eine
kontinuierliche Hemmung konnte nicht erreicht werden. Insgesamt zeigte die Kollagen-
induzierte Thrombozytenaggregation stärkere Schwankungen. Die zu Kontrollzwecken
untersuchten Thrombozytenzahlen zeigten im Versuchsverlauf keine nennenswerten
Änderungen.
Die verwendeten Wirkstoffe, Monitoringverfahren, Dosierungen und Ergebnisse sind
zusammenfassend in Tabelle 4-1 dargestellt.
Tabelle 4-1: Wirkstoffe, Monitoringmethoden, Dosierungen und Ergebnisse der pharmakokinetischen
Vorversuche. Abkürzungen i.v. für intravenös, p.o. für per os.
Wirkstoff
(Handelsname)
Methode zur Überprüfung
der Wirksamkeit
Dosierung Wirksamkeit
Tirofibanhydrochlorid
(Aggrastat®)
Thrombozytenaggregationstests
(ADP)
0,4 mg/kg s.c. Hemmung der
Aggregation nur
kurzfristig und nicht
ausreichend
Abciximab (ReoPro®) Thrombozytenaggregationstests
(ADP)
0,4 mg/kg i.v. Keine Wirkung
Acetylsalicylsäure
(Aspisol®)
Thrombozytenaggregationstests
(Kollagen)
150 mg/kg i.v. Hemmung der Kollagen-
induzierten Aggregation
irreversibel ab 60 min
post injectionem, keine
bzw. geringfügige
Beeinflussung der ADP-
induzierten Aggregation
Clopidogrel
(Iscover®)
Thrombozytenaggregationstests
(ADP)
150 mg/Tier
p.o.
Hemmung in der ADP-
induzierten Aggregation
um 30 – 40%
Clopidogrel
(Iscover®)
+
Acetylsalicylsäure
(ASS ratiopharm®)
Thrombozytenaggregationstests
(ADP und Kollagen)
150 mg/Tier
Clopidogrel
p.o.
+
500 mg ASS
Hemmung der ADP- und
Kollagen-induzierten
Aggregation im
Vorversuch über 3 Tage
4 Ergebnisse 107
4.4 Untersuchungen zur Rolle der Plättcheninteraktionen mittels
Clopidogrel und Acetylsalicylsäure
Das Experiment umfasste zehn Läuferschweine, die nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen
aufgeteilt wurden. Gruppe I, bestehend aus den Tieren 248 - 253, erhielt täglich eine orale
Clopidogrel- und ASS-Gabe. Gruppe II umfasste die Tiere 254 und 256 - 258 und diente als
Kontrolle. Die Einstellung der Medikamentengabe erfolgte eine Woche vor Beginn des
Infektionsversuches. Die Infektion der Tiere wurde mit 5 x 104,5
KID50 des KSPV-Isolats
CSF0634 intranasal durchgeführt.
4.4.1 Nachweis der Wirkung
Im Versuchsverlauf konnte eine Hemmung der ADP-induzierten Thrombozytenaggregation
um durchschnittlich 20 – 30% erreicht werden. Die Darstellung der Gruppenmittelwerte ist im
Anhang unter 8.1 in Abbildung 8-5 zu finden. Bis zum siebten Tag pi verliefen die Werte für
die Gruppen I und II in oben genanntem Abstand von 20 – 30 % quasi parallel, die Werte für
beide Gruppen näherten sich jedoch bis zum Tag elf p.i. an. Zu Versuchsende konnte für drei
Tiere (Tiere 249, 250 und 257) keine Aggregation mehr induziert werden.
Die Ergebnisse für die Kollagen-induzierte Thrombozytenaggregation wiesen sowohl für die
behandelten als auch die Kontrolltiere ausgeprägte intra- und interindividuelle Schwankungen
auf. Ein eindeutiger Verlauf oder Unterschiede zwischen den Gruppen waren nicht zu
erkennen.
4.4.2 Nachweis der Infektion
Für den Nachweis der Infektion mit dem KSPV-Isolat CSF0634 wurde an Tag neun p.i. eine
RNA-Isolierung aus EDTA-Blut vorgenommen und das gewonnene Material in der RT-PCR
untersucht. Für alle Tiere war der KSPV-Nuleinsäurenachweis positiv (siehe Tabelle 8-6).
4 Untersuchungen zur Rolle der Plättcheninteraktionen mittels Clopidogrel und Acetylsalicylsäure 108
4.4.3 Entwicklung der Körpertemperatur
Alle Tiere der Gruppen I und II zeigten Fieber (Temperatur >40°C) am vierten Tag p.i.. Die
Temperatur stieg für alle Tiere durchschnittlich bis zum sechsten oder siebten Tag an und
erreichte danach ein Plateau von durchschnittlich 41 bis 41,5°C. Die febrilen Temperaturen
waren bis zum Zeitpunkt der Euthanasie feststellbar, wobei Tiere, die moribund euthanasiert
wurden, einen Temperaturrückgang zeigten. Es konnten keine augenfälligen Unterschiede
zwischen den Gruppen festgestellt werden. Der Verlauf der Temperaturentwicklung ist in
Abbildung 4-31 als Darstellung der Gruppenmittelwerte festgehalten.
Körpertemperatur im Versuchsverlauf
37
38
39
40
41
42
43
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Tage pi
Tem
per
atu
r [°
C]
Gruppe I
Gruppe II
Abbildung 4-31: Körpertemperatur im Versuchsverlauf für die Gruppen I und II.
(Gruppemittelwerte und deren Standardabweichungen).
4.4.4 Dokumentation der klinischen Symptome
Die Dokumentation der klinischen Symptome wurde nach der Inkubationszeit gemäß den
Standardprotokollen des EURLs zur Erfassung des CS modifiziert nach MITTELHOLZER et
al. (2000) vorgenommen.
Die Tiere der Gruppe I entwickelten nach sieben Tagen zunächst unspezifische
Krankheitssymptome. Dazu gehörten Apathie, Konjunktivitis, Fressunlust, Obstipation und
Diarrhoe. Alle Tiere der Gruppe I entwickelten im weiteren Verlauf unterschiedlich
ausgeprägte zentralnervöse Symptome wie Schwäche in der Nachhand,
Koordinationsprobleme und Krampfneigungen. Hautblutungen im Bereich der Akren traten
4 Ergebnisse 109
bei allen Tieren zwischen dem 13. und 14. Tag auf. Alle Tiere zeigten zudem respiratorische
Symptome ab dem achten bzw. neunten Tag p.i.
Die ersten Krankheitssymptome zeigten die Tiere der Gruppe II fünf Tage p.i.. Nach einer
Phase mit unspezifischen Symptomen entwickelten auch diese Tiere typische Symptome einer
KSPV-Infektion mit zentralnervösen Symptomen und Hautblutungen unterschiedlichen
Ausmaßes. Die Hautblutungen wurden ab dem zehnten (Tier 254) bis 14. Tag p.i. (Tier 256)
offensichtlich. Auch diese Tiere zeigten respiratorische Symptome ab dem achten Tag p.i..
Der CS stieg für die Tiere der Gruppe II etwas früher und bis Tag elf p.i. zudem etwas steiler
an. Danach verliefen die Gruppenmittelwerte der Gruppen I und II quasi parallel. Der
maximale CS für ein Einzeltier der Gruppe I betrug 21 (Tier 253), der maximale
Gruppenmittelwert 17. Für die Gruppe II lag der maximale Einzelwert bei 18 (Tier 257), der
maximale Gruppenmittelwert bei 15.
Die Euthanasie der Tiere wurde zwischen dem 13. und 16. Tag p.i. durchgeführt. Der
Mittelwert des CS zum Zeitpunkt der Euthanasie betrug für die Tiere der Gruppe I 16,67, für
die Tiere der Gruppe II 15,75. Die Gruppenmittelwerte und die entsprechenden
Standardabweichungen sind in Abbildung 4-32 dargestellt.
Clinical Score
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Tage pi
CS
Gruppe I
Gruppe II
Abbildung 4-32: Clinical Score für die Gruppen I und II (MW ± Standardabweichung). Die
Darstellung erfolgt in Punkten von 27.
4 Untersuchungen zur Rolle der Plättcheninteraktionen mittels Clopidogrel und Acetylsalicylsäure 110
4.4.5 Erfassung der pathologisch-anatomischen Befunde
Die Erfassung und Dokumentation der pathologisch-anatomischen Befunde erfolgte nach dem
Standardprotokoll des EURLs in Anlehnung an das von FLOEGEL-NIESMANN et al. (2003)
erarbeitete Verfahren.
Alle Tiere zeigten in den postmortalen Untersuchungen klassische Befunde, die gemeinhin
mit der KSPV-Infektion in Verbindung gebracht werden, eine augenfällige Differenz
zwischen den Gruppen gab es nicht.
In unterschiedlicher Ausprägung zeigten die Tiere petechiale und ekchymatöse Blutungen im
Bereich der Akren und des ventralen Abdomens sowie in den Nieren. Alle Tiere wiesen
vergrößerte, zum großen Teil hämorrhagisch-infarzierte Lymphknoten auf.
Schwere Lungenentzündungen wiesen die Tiere 248, 249 und 250 auf. Multifokale
Milzrandinfarkte wurden bei den Tieren 248 und 251 gefunden. Tier 252 zeigte auffällige
petechiale Blutungen in der Magen- und Darmwand, die mit einem kaffeesatzartigen Inhalt
vergesellschaftet waren; dieses Tier wies zudem nekrotische Veränderungen im Bereich der
Ileocaecalpapille auf. Tier 258 zeigte ähnliche Veränderungen der Magen- und Darmwand.
4.4.6 Ergebnisse der hämatologischen Untersuchungen
4.4.6.1 Gesamtleukozytenzahl
Bei der Bewertung der ermittelten Leukozytenzahlen wurde in Ermangelung eines
gerätespezifischen Referenzbereiches für Schweineblut der von MISCHKE (1999)
angegebene Referenzbereich von zehn bis 22 G/l zugrunde gelegt.
Im Verlauf der Infektion mit dem KSPV-Isolat CSF0634 zeigten alle Tiere eine hochgradige
Leukopenie. Die Leukozytenzahlen begannen bereits nach dem ersten Tag p.i. zu sinken und
ausschließlich die Leukozytenzahlen des Tieres 256 zeigten gegen Versuchsende wieder
einen Aufwärtstrend. Die in Abbildung 4-33 abgebildeten Gruppenmittelwerte zeigten einen
annähernd parallelen Verlauf.
Für die Tiere der Gruppe I sank die durchschnittliche Leukozytenzahl von 19,5 G/l auf
4,7 G/l, was einem prozentualen Abfall von 76 % entsprach. Der maximale Rückgang war für
Tier 253 zu verzeichnen, dessen Leukozytenzahlen im Verlauf der Infektion von 14 G/l um
4 Ergebnisse 111
89 % auf 1,6 G/l absanken. Am geringsten ausgeprägt war die Leukozytendepletion bei
Tier 252 mit einem Rückgang um 50 % von 13,1 G/l auf 6,5 G/l.
Durchschnittlich sanken die Leukozytenzahlen der Tiere aus Gruppe II um 74 % von 25,4 G/l
auf 6,55 G/l. Abweichend von diesen Verläufen zeigte Tier 256 nach einem Rückgang der
Leukozytenzahlen von 23,7 G/l auf 6,7 G/l an Tag elf p.i. eine Normalisierung der Werte bis
auf 10,4 G/l an Tag 16 p.i.. Der Rückgang der Leukozytenzahlen war bei Tier 258 mit 91 %
von 32 G/l auf 2,9 G/l am stärksten ausgeprägt. Die Verläufe der Gruppenmittelwerte sind in
Abbildung 4-33 dargestellt.
Abbildung 4-33: Leukozytenzahlen für die Gruppen I und II (MW ± Standardabweichungen). Als
Referenzbereich wurde der von MISCHKE (1999) angegebene Bereich von zehn bis 22 G/l
zugrunde gelegt. Dieser ist in der Graphik mit gestrichelten Linien markiert (Ref. 1, Ref. 2).
Leukozytenzahlen
0
5
10
15
20
25
30
35
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Tage pi
Leu
ko
zyte
n [
G/l
]
Gruppe I
Gruppe II
Ref. 1
Ref. 2
4 Untersuchungen zur Rolle der Plättcheninteraktionen mittels Clopidogrel und Acetylsalicylsäure 112
4.4.6.2 Thrombozytenzahl
Für die Bewertung der Thrombozytenzahlen wurde der von MISCHKE (1999) angegebene
Referenzbereich für Schweineblut von 220 bis 620 G/l zugrunde gelegt.
Alle Tiere entwickelten im Infektionsverlauf eine ausgeprägte Thrombozytopenie. Die
Gruppenmittelwerte beider Gruppen zeigten einen nahezu parallelen Verlauf mit einem ersten
Abfall der Thrombozytenzahlen ab dem dritten Tag p.i., einem leichten Anstieg zwischen den
Tagen vier und sieben p.i. und darauf folgendem Abfall bis zum Versuchsende.
Der Gruppenmittelwert für Gruppe I sank von 449 G/l auf 79 G/l (durchschnittlicher Abfall
von 82 %). Der Abfall lag zwischen 67 % (Tier 251) und 89 % (Tier 252).
Die Tiere der Gruppe II zeigten einen durchschnittlichen Abfall um 90 % von 582 G/l auf
58 G/l. Die Verluste lagen zwischen 72 % (Tier 254) und 95 % (Tier 258).
Abbildung 4-34: Thrombozytenzahlen für die Gruppen I und II im Versuchsverlauf (MW ±
Standardabweichung). Als Referenzbereich wurde der von MISCHKE (1999) angegebene
Bereich von 220 bis 620 G/l zugrunde gelegt. Dieser Bereich ist mit gestrichelten Linien (Ref. 1,
Ref. 2) angedeutet.
Thrombozytenzahlen
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Tage pi
Th
rom
bo
zyte
n [
G/l
]
Gruppe I
Gruppe II
Ref. 1
Ref. 2
4 Ergebnisse 113
4.4.6.3 Hämostaseologische Parameter
Die Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung sind in Abbildung 4-35 (aPTT), Abbildung
4-36 (Thrombinzeit) und Abbildung 4-37 (Prothrombinzeit) festgehalten.
Im Vorfeld dieses Versuches wurde die aPTT wiederum so kalibriert, dass die eingesetzte
Plasmaverdünnung in Diäthylbarbituratacetatpuffer im physiologischen Bereich eine
Gerinnungszeit von 30 ± 3 sec aufwies (Kalibrierungsdaten sind im Anhang unter 8.1 in
Abbildung 8-6 zu finden).
Die aPTT zeigte für die Tiere der Gruppe II nur geringfügige Schwankungen, die mit wenigen
Ausnahmen den für das Poolplasma gesunder Schweine ermittelten Wertebereich nicht
verließen. An Tag fünf und sechs p.i. war ein Anstieg um 40% zu beobachten, der sich an den
Tagen 16 und 17 für das einzige verbleibende Tier (256) wiederholte.
Die Werte der Tiere aus Gruppe I lagen im Versuchsverlauf etwas über denen der Gruppe II,
folgtem dem Verlauf jedoch im Wesentlichen. Der Gruppenmittelwert zeigte einen Anstieg an
Tag zwei p.i. um sieben sec (24 %) und zwischen den Tagen 13 und 15 p.i. einen
zweigipfeligen Anstieg um maximal 44 % bezogen auf den Ausgangswert.
Das zu Kontrollzwecken mitgeführte Humanplasma zeigte Werte zwischen 32,1 und 33,3 sec
und lag damit im vom Hersteller angegebenen Referenzbereich (25,5 – 34,5 sec).
Die Thrombinzeit zeigte einen nahezu parallelen Verlauf der Gruppenmittelwerte bis Tag 14
p.i. mit maximalen Schwankungen von 32 % (ca. 5,5 sec). Tier 250 zeigte 14 Tage p.i. einen
Anstieg der Thrombinzeit um fast 250 % und darauf folgend einen rapiden Abfall. Das
humane Kontrollplasma zeigte Thrombinzeiten von 18,65 – 19,9 sec und lag damit über den
gesamten Versuch im Referenzbereich des Herstellers (14,3 – 21,5).
Die Prothrombinzeit zeigte einen parallelen Verlauf der Gruppenmittelwerte mit geringen
Schwankungen von maximal 15 % bis Tag elf p.i.. Zwischen dem zwölften und 14. Tag p.i.
zeigten die Tiere der Gruppe I einen Anstieg um nahezu 200 %, wobei der Maximalwert für
Tier 249 mit einem Anstieg um über 700 % zu verzeichnen war.
Der Anstieg konnte auch für die Tiere der Gruppe II gezeigt werden. Hier stieg der
Gruppenmittelwert zwischen dem zwölften und 17. Tag p.i. um ca. 600 %.
4 Untersuchungen zur Rolle der Plättcheninteraktionen mittels Clopidogrel und Acetylsalicylsäure 114
aPTT
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Tage pi
aP
TT
[s]
Gruppe I
Gruppe II
Abbildung 4-35: aPTT für die Gruppen I und II (MW ± Standardabweichung). Der Test wurde
anhand eines Poolplasmas gesunder Schweine kalibriert. Die Werte für das Poolplasma lagen bei
30 ± 3 sec.
Thrombinzeit
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Tage pi
Th
ro
mb
inzeit
[s]
Gruppe I
Gruppe II
Abbildung 4-36: Thrombinzeit für die Gruppen I und II (MW ± Standardabweichung).
Prothrombinzeit
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Tage pi
Pro
thro
mb
inzeit
[s]
Gruppe I
Gruppe II
Abbildung 4-37: Prothrombinzeit für die Gruppen I und II (MW ± Standardabweichung).
4 Ergebnisse 115
Die Fibrinogenkonzentration der Gruppen I und II zeigten einen annähernd parallelen Verlauf
mit einem Anstieg ab Tag sechs bis sieben p.i.. Die Gruppenmittelwerte spiegelten die
individuellen Verläufe wider. Der durchschnittliche Anstieg der Fibrinogenkonzentration
betrug für Gruppe I ca. 45 % (von 4,78 auf 6,92 g/l), für Gruppe II ca. 52 % (von 4,97 auf
7,56 g/l). Die Werte für das mitgeführte humane Kontrollplasma lagen mit 3,0 ± 0,4 g/l im
oberen Referenzbereich. Die Verläufe der Gruppenmittelwerte sind in Abbildung 4-38
dargestellt.
Fibrinogenkonzentration
2
3
4
5
6
7
8
9
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Tage pi
Fib
rin
og
en [
g/l
]
Gruppe I
Gruppe II
Abbildung 4-38: Fibrinogenkonzentration (MW ± Standardabweichung) für die Gruppen I und II.
5 Diskussion
Die Infektion mit hochvirulenten KSPV-Stämmen kann v. a. bei jungen Tieren zu einem
akuten Krankheitsbild führen, das durch hämorrhagische Symptome gekennzeichnet ist, die
dem Bild eines klassischen viralen hämorrhagischen Fiebers entsprechen (GOMEZ-
VILLAMANDOS et al., 2003a). Gemeinsamkeiten mit anderen viralen hämorrhagischen
Fiebern wie z. B. der Ebolavirusinfektion betreffen sowohl die klinischen Symptome als auch
die Zielzellen des Virus und die pathogenetischen Mechanismen (GOMEZ-VILLAMANDOS
et al., 2003a).
Bisher konnten weder die Genese der hämorrhagischen Symptome, die im Verlauf der akuten
KSPV-Infektion auftreten, noch die der Thrombozytopenie und Leukopenie hinreichend
aufgeklärt werden. Während Thrombozytopenie und Hämorrhagien in den 1970er Jahren im
Sinne einer DIC bzw. Verbrauchskoagulopathie gedeutet wurden (HEENE et al., 1971;
HOFFMANN et al., 1971a), werden gegenwärtig v. a. Makrophagen und deren Zytokine für
die Symptomatik verantwortlich gemacht (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a).
Im Rahmen dieser Arbeit sollten die pathogenetischen Mechanismen, die den
hämorrhagischen Symptomen und hämostaseologischen Veränderungen zugrunde liegen,
näher charakterisiert werden. Nach Vorversuchen zur Auswahl des geeigneten KSPV-Isolates
und zur Untersuchung des Verlaufs klinischer, pathologisch-anatomischer, hämatologischer
und hämostaseologischer Parameter wurden dazu zwei Ansätze gewählt, welche eine
pharmakologische Intervention an unterschiedlichen Stellen des Hämostasesystems vorsahen.
Es wurde einerseits die Endstrecke der plasmatischen Gerinnung und andererseits die
Thrombozytenaggregation gehemmt. Zu diesem Zweck wurden der Thrombininhibitor PEG-
Hirudin und die Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel und Acetylsalicylsäure
verwendet.
5 Diskussion 117
5.1 Auswahl und Virulenz des KSPV-Isolates
Für die Zielsetzung dieser Arbeit war es unabdingbar, die Tierversuche mit einem
hochvirulenten KSPV-Stamm durchzuführen, der in der Lage war, die KSP-typischen
Hämorrhagien zu induzieren.
Aus vorangegangenen Versuchen am EURL war bekannt, dass das KSPV-Isolat CSF0634
anhand des modifizierten Untersuchungsschemas nach MITTELHOLZER et al. (2000) mit
einem CS >14 als hochvirulent eingestuft werden konnte (FLOEGEL-NIESMANN et al.,
2003). Mit diesem Isolat infizierte Tiere zeigten zudem reproduzierbar unterschiedlich
ausgeprägte hämorrhagische Symptome.
Das Isolat wurde für die vorliegende Arbeit zunächst im Rahmen der Vorversuche eingesetzt.
Da alle infizierten Tiere (n = 10) an der akuten Verlaufsform der KSP erkrankten und die
überwiegende Mehrzahl (80 %) unterschiedlich ausgeprägte Hämorrhagien entwickelte,
wurde das Isolat als geeignet eingeschätzt und in den Hauptversuchen eingesetzt. Alle Tiere
der Hauptversuche erkrankten ebenfalls akut und zeigten hämorrhagische Symptome sowie
einen CS ≥ 14.
5.2 Charakteristika der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634
Neben den klinischen Symptomen wurden in allen Versuchen die pathologisch-anatomischen
Befunde sowie hämatologische und hämostaseologische Parameter bewertet.
Die erhobenen pathologisch-anatomischen Befunde entsprachen mit vergrößerten,
hämorrhagisch-infarzierten Lymphknoten im gesamten Organismus, hämorrhagischen
Veränderungen in den Nieren und anderen inneren Organen, entzündlichen Veränderungen
des Respirationstraktes sowie Milzrandinfarkten den Ergebnissen, die von RÖHRER und
PEHL (1960) und VAN OIRSCHOT (1999) für die akute Verlaufsform der KSP beschrieben
wurden.
In einer Übersichtsfärbung (HE) wurde an Paraffin-eingebetteten Organschnitten von fünf
infizierten Tieren versucht, eine Thrombosierung der kleineren bis mittelgroßen Gefäße
nachzuweisen, die zu den histopathologischen Äquivalenten der oben beschriebenen
makroskopischen Veränderungen gehören sollten (RÖHRER und PEHL, 1960; HEENE et al.,
5 Charakteristika der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634 118
1971; HOFFMANN et al., 1971a; QUEZADA et al., 2000). In den großen Gefäßen wurden,
den Berichten in der Literatur entsprechend, keine Thromben gefunden (RÖHRER und
PEHL, 1960; HOFFMANN et al., 1971a).
Während HOFFMANN et al. (1971) eine Thrombosierung kleiner und mittlerer Gefäße
verschiedener Organe in der HE-Färbung Paraffin-eingebetteter Organschnitte nachwies,
konnte dieser Befund in der vorliegenden Studie nicht nachvollzogen werden.
Für diese Diskrepanz der Befunde sind mehrere Erklärungen denkbar. Zum einen sind
Mikrothromben und Plättchenaggregate in Kapillaren auch mit spezifischen Färbemethoden
sehr schwer nachweisbar, da sie von unterschiedlichsten Proteasen des fibrinoytischen
Systems und leukozytärer Zellen aufgelöst und durch aktivierte Makrophagen phagozytiert
werden (SCHIEFER und SEARCY, 1975). Diese Prozesse laufen auch postmortal weiter und
beeinflussen die Aussagekraft negativer Befunde. Daher ist nicht auszuschließen, dass eine
perimortale Auflösung der Thromben den Nachweis unmöglich machte. Eine Hemmung des
proteolytischen Abbaus könnte zur Abklärung sinnvoll sein, dieser Ansatz ließ sich jedoch
unter den gegebenen Umständen nicht umsetzen.
Zum anderen ist die HE-Färbung als Nachweismethode kritisch zu hinterfragen, da die HE-
Färbung nur eine Übersichtsfärbung ist, die aus Praktikabilitätsgründen durchgeführt wurde.
Kleinste Thromben und Fibrinablagerungen wären mit Färbungen wie der PTAH-Färbung
(phosphotungstic acid-hematoxilin) besser und sicherer nachweisbar gewesen, jedoch waren
diese Färbungen unter den gegebenen Möglichkeiten nicht durchführbar. Wie oben erwähnt,
waren Thrombosierungen in der Studie von HOFFMANN et al. (1971) allerdings auch in der
HE-Färbung nachweisbar.
Des Weiteren ist die Rolle des verwendeten Virusstamms zu betrachten. Die Versuche in den
1970er Jahren wurden mit einem anderen KSPV-Stamm durchgeführt, der u. U. andere
pathologisch-anatomische Befunde induzierte. Leider ist der Publikation von HOFFMANN et
al. (1971) die genaue Beschreibung des Virusstammes nicht zu entnehmen, es hat sich jedoch
gezeigt, dass in den letzten Jahrzehnten ein Wandel in der Virulenz und Klinik der KSP-
Stämme zu beobachten war (WILLIAMS und MATTHEWS, 1988; KOENEN et al., 1996;
PATON und GREISER-WILKE, 2003a). Das KSPV-Isolat CSF0634, welches für die
vorliegende Studie verwendet wurde, gehört zu den aktuellen Stämmen der 1990er Jahre und
könnte daher abweichende Charakteristika aufweisen.
5 Diskussion 119
Der Virus- bzw. Antigennachweis, der zum Beweis der Infektion mit dem KSPV
durchgeführt wurde, zeigte, dass alle Tiere erfolgreich infiziert werden konnten. Negative
Antigen- und Virusnachweise für zwei der 30 Tiere zu Versuchsende zeigen, dass diese Tiere
trotz der hohen Virulenz des KSPV-Isolates in der Lage waren, das Virus zu eliminieren und
in die Phase der Rekonvaleszenz eintraten; diese Tiere zeigten zudem auch eine moderate
Antikörperproduktion und Normalisierung der Blutparameter. Für die vorliegende Arbeit
waren Rekonvaleszenten für eine weitere Auswertung nicht mehr nutzbar. Ihr Auftreten
zeigte jedoch, dass die Virulenz des Erregers stark von der Konstitution des betroffenen
Tieres abhängt.
Alle Tiere entwickelten im Verlauf der KSPV-Infektion eine markante Leukopenie, die
sowohl in ihrem Verlauf als auch in der Ausprägung den für die akute Verlaufsform der
KSPV-Infektion publizierten Beobachtungen entsprach (TRAUTWEIN, 1988; PAULY et al.,
1998; SUMMERFIELD et al., 2001a).
Alle infizierten Tiere entwickelten eine Thrombozytopenie, die für einige Tiere zum fast
vollständigen Verlust der Thrombozyten führte (Absinken um 98 %). Die Verläufe der
Thrombozytenzahlen entsprachen ebenfalls den publizierten Daten (HEENE et al., 1971;
HOFFMANN et al., 1971a), wobei im vorliegenden Fall die von GOMEZ-VILLAMANDOS
et al. (1998) postulierte direkte Korrelation zwischen dem Auftreten der ersten Symptome und
dem Absinken der Thrombozytenzahlen nicht nachvollziehbar war. Dies könnte u. U. daran
liegen, dass diese Arbeitsgruppe ein KSPV-Isolat verwendete, das früher zu klinischen
Symptomen führte. Während diese Autoren für den KSPV-Stamm „Quillota“ vom ersten
Auftreten klinischer Symptome an Tag zwei p.i. berichten, traten die ersten Symptome mit
dem Isolat CSF0634 vier bis sieben Tage p.i. auf, was den allgemeinen Beobachtungen
entspricht (FLOEGEL-NIESMANN et al., 2003).
Auffällig war, dass der Referenzbereich des Geräteherstellers (Sysmex Deutschland,
Norderstedt) für Thrombozytenwerte des Schweins bei 16 von 24 Tieren an den ersten Tagen
überschritten wurde. Da dies sowohl für die Einzeltiere als auch für das gepoolte Plasma
gesunder Schweine der Fall war, ist die Gültigkeit der oberen Grenze des Referenzbereiches
kritisch zu hinterfragen. Legte man den Referenzbereich nach MISCHKE (1999) zugrunde,
lägen über 95% der Tiere im Normalbereich.
5 Charakteristika der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634 120
Trotz fehlender Referenzbereiche für Schweinethrombozyten in der Literatur wurden die
Thrombozytenparameter MPV und Large Platelets in die hämatologischen Untersuchungen
und Auswertung einbezogen, da sie als Marker für die Aktivität der Thrombozyten gelten. Für
das MPV lagen Referenzbereiche des Geräteherstellers vor, nach denen sich die Auswertung
richtete. Ein Anstieg des MPV wird als regenerative Veränderung gedeutet, die durch den
Nachschub junger, größerer Thrombozyten aus dem Knochenmark entsteht. Sie ist somit
indirekt auch ein Anzeiger kompensierter Verbrauchsreaktionen (mit funktionsfähigem
Knochenmark). Im Verlauf der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634 zeigte sich eine sehr
große intra- und interindividuelle Schwankungsbreite. Es war jedoch bei den infizierten
Tieren ein tendenzieller Anstieg zwischen dem vierten und zehnten Tag p.i. zu verzeichnen.
Der Parameter Large Platelets zeigte einen gleichsinnigen Gipfel. Betrachtet man diese
Tendenzen zusammen, ist anzunehmen, dass eine regenerative Kapazität des Knochenmarks
vorhanden war, und vermehrt junge Thrombozyten freigesetzt wurden. Das Auftreten dieser
Thrombozyten ist jedoch auch als Indiz einer Verbrauchsreaktion zu werten.
Die Globaltests der Gerinnung aPTT, Thrombinzeit und Prothrombinzeit wurden als
Screeningtests des plasmatischen Gerinnungssystems durchgeführt. Die aPTT diente dabei
der thrombozytenunabhängigen Untersuchung des intrinsischen Weges der Blutgerinnung
(MISCHKE, 1999a; MISCHKE, 1999b; BARTHELS und VON DEPKA, 2003b). Abgesehen
von den in 5.3 genannten Verschiebungen durch die Hirudintherapie, zeigte die aPTT hier nur
moderate Schwankungen (bis 20%). Einzelwerte, die deutlich außerhalb des erwarteten
Bereichs lagen, konnten eindeutig mit Problemen bei der Blutentnahme und zu langen
Auftauzeiten in Verbindung gebracht werden. Kam es bei der Blutentnahme durch Verletzung
des Endothels zu einer verstärkten lokalen Aktivierung der Gerinnung, wurde häufig eine
Verkürzung der Gerinnungszeiten beobachtet. Es zeigte sich zudem, dass sowohl die
Auftaugeschwindigkeit als auch die Temperatur des Diäthylbarbituratacetatpuffers wichtige
Einflussgrößen auf die Aussagekraft und Reproduzierbarkeit der Gerinnungszeiten
darstellten. Die besten Ergebnisse wurden mit vorgewärmtem Puffer und rasch aufgetauten
Proben erzielt. Dabei war dem schnellen Auftauen im Wasserbad bei 37°C gegenüber dem
Auftauen bei Raumtemperatur der Vorzug zu geben.
5 Diskussion 121
Der Verlauf der aPTT im Infektionsgeschehen legt nahe, dass dem intrinsischen Weg des
plasmatischen Gerinnungssystems keine entscheidende Bedeutung in der Pathogenese der
KSP zukommt. Eine dekompensierte DIC geht gemeinhin mit einer Verlängerung der aPTT
einher, die im vorliegenden Fall nicht in Erscheinung trat. Auch die Verkürzung der aPTT,
die für die kompensierte Phase einer DIC charakteristisch ist, trat nicht auf.
Die Thrombinzeit gilt als Suchtest bei Verdacht auf Fibrinogenmangelzustände und beurteilt
die gemeinsame Endstrecke der Gerinnung, die auch von aPTT und Prothrombinzeit
abgedeckt wird (MISCHKE, 1999a). Die Thrombinzeit zeigte analog zu den Werten der aPTT
nur moderate Schwankungen. Einige Werte mit ausgeprägten Abweichungen konnten mit
Konsistenzveränderungen der Plasmaaliquots korreliert werden, was die Bedeutung der
Probenqualität für die Aussagekraft dieses Tests unterstreicht.
Markante Änderungen traten ausschließlich in den Werten der Prothrombinzeit auf, die als
Screeningtest für den extrinischen Weg der Blutgerinnung (BARTHELS und VON DEPKA,
2003b) gilt. Für alle infizierten Tiere zeigte sich ein Anstieg ab dem zehnten Tag pi, der
jedoch unterschiedlich ausgeprägt war. Wie die oben genannten Gerinnungstests reagierte
auch die Prothrombinzeit empfindlich auf Änderungen der Entnahme-, Lagerungs- und
Auftaubedingungen.
Für die Prothrombinzeit ist bekannt, dass sie im Verlauf einer DIC häufig erhöht ist
(BARTHELS und VON DEPKA, 2003c). Die in der vorliegenden Arbeit gemessenen Werte
zeigten, dass es in der Finalphase der Erkrankung zu einem Verbrauch der Faktoren des
extrinsischen Systems kommt. Dieser Befund entsprach den Befunden, die in den 1970er
Jahren erhoben wurden (HEENE et al., 1971).
Die Fibrinogenbestimmung zeigte einen Aufwärtstrend für alle infizierten Tiere, der in
seinem Verlauf mit den Befunden von HEENE et al. (1971) übereinstimmte.
Die Fibrinogenkonzentrationen für die Tiere des ersten Vorversuches zeigten ausgeprägte
Schwankungen, die eine exakte Auswertung nicht zuließen. Die in diesem Vorversuch
durchgeführte Methode nach CLAUSS erwies sich als störanfällig und war für den
Versuchskomplex mit Hirudin nicht geeignet (BARTHELS und VON DEPKA, 2003b). Sie
wurde durch die Methode nach RATNOFF und MENZIE ersetzt, die zwar arbeits- und
zeitintensiv ist, jedoch weder durch Gerinnungshemmer noch Fibrinogen-
Degradationsprodukte beeinflusst wird (BARTHELS und VON DEPKA, 2003b).
5 Charakteristika der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634 122
Fibrinogen kann als Akutphaseprotein schnell und in großer Menge bereitgestellt werden und
ist daher bei inflammatorischen Prozessen erhöht. Es ist zudem von wesentlicher Bedeutung
bei der Thrombozytenaggregation, wo es über die Bindung an den GPIIB/IIIa Rezeptor die
Verbindung der aktivierten Thrombozyten realisiert.
Die auftretenden, moderaten Erhöhungen können als Anpassungs- bzw. Regenerationsversuch
nach einem erhöhten Verbrauch gewertet werden. Der für eine dekompensierte DIC häufig
charakteristische Abfall der Fibrinogenkonzentration (BATEMAN et al., 1999) konnte im
Verlauf der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634 nicht nachgewiesen werden.
Das Auftreten löslicher Fibrinmonomere im Plasma wurde mit dem EGT überprüft, der als
Schnelltest eine rein qualitative Auskunft gibt. Erhöhte Konzentrationen werden bei
gesteigerter intravasaler Gerinnung und Gefäßverschlüssen erwartet (BARTHELS und VON
DEPKA, 2003d). Der EGT wurde bei den Tieren des zweiten Vorversuchs durchgeführt und
erbrachte positive Ergebnisse erst in der Finalphase der Erkrankung bei drei von fünf
infizierten Tieren. Der Test erwies sich als störanfällig. Da lösliches Fibrin sehr instabil ist,
eine Fehlinterpretation durch präanalytische Fehler (Thrombinbildung bei der Entnahme)
relativ häufig auftritt sowie Kreuzreaktionen mit plasmininduzierten Fibrin(ogen)derivaten
gegeben sein können (BARTHELS und VON DEPKA, 2003d), gibt der Test nur einen ersten
Anhaltspunkt. Dennoch sind die positiven Ergebnisse als Indiz dafür zu werten, dass eine
überschießende Aktivierung des Gerinnungssystems in der Finalphase der KSP-Erkrankung
vorlag.
Einzelfaktorenbestimmungen wurden für die Tiere des ersten Vorversuches für die Faktoren
II, V und Antithrombin III durchgeführt. Gerinnungsfaktor II (Prothrombin) zeigte
ausgeprägte Schwankungen und konnte nur in einer Trendanalyse ausgewertet werden. Vier
von fünf infizierten Tieren zeigten im Gegensatz zu den Kontrolltieren einen deutlichen
Anstieg an Tag sieben p.i.. Diese Aktivitätssteigerung indiziert eine Aktivierung des
Gerinnungssystems, die jedoch kompensiert zu sein scheint, da auffällige Entsprechungen in
den Globaltests nicht nachweisbar waren.
Die Faktor-V-Aktivität stellt einen besonders sensiblen Indikator für intravasale
Thrombinaktivität und damit eine Verbrauchskoagulopathie dar (HEENE et al., 1971), wobei
eine erhöhte Faktor-V-Aktivität in der Phase I einer Verbrauchskoagulopathie zu erwarten ist
(BARTHELS und VON DEPKA, 2003b). Die Messwerte für Faktor V reagierten empfindlich
5 Diskussion 123
auf eine Aktivierung des Gerinnungssystems bei Blutentnahmeproblemen im Sinne eines
falsch erhöhten Spiegels. Dessen ungeachtet, zeigte Faktor V gleiche Veränderungen wie
Faktor II. Der Gipfel an Tag sieben p.i. ist Anzeichen einer kompensierten
Gerinnungsaktivierung, während der Abfall gegen Ende des Versuchs für eine
Verbrauchsreaktion spricht.
Antithrombin III ist der natürliche Inhibitor der Gerinnungsfaktoren und zeigt verminderte
Aktivität v. a. im Rahmen einer Hyperfibrinolyse und in der dekompensierten Phase einer
DIC (MISCHKE, 1999a). Die Antithrombin-III-Aktivität nahm bei allen infizierten Tieren ab,
wobei sich die Werte bei drei von fünf Tieren in etwa halbierten. Diese Reaktion korreliert
mit den oben genannten Befunden und ist hinweisend für eine Verbrauchssituation.
5.3 Auswirkungen der Hemmung des plasmatischen Gerinnungssystems
auf den Infektionsverlauf
Der Thrombininhibitor PEG-Hirudin wurde gewählt, um die Endstrecke der plasmatischen
Gerinnung zu hemmen und damit den Einfluss dieses Systems auf den Krankheitsverlauf
näher zu untersuchen. Die Wirksamkeit von Hirudin war bereits in einem Versuch zur
Prävention der endotoxininduzierten DIC im Schweinemodell belegt worden (NOWAK und
MARKWARDT, 1980a). Für das Experiment in der vorliegenden Arbeit wurden zehn
Läuferschweine mit dem KSPV-Isolat CSF0634 infiziert. Fünf Schweine (Gruppe I) erhielten
eine tägliche, subkutane PEG-Hirudininjektion, fünf unbehandelte Schweine dienten der
Kontrolle. Im Versuchsverlauf wurden klinische, hämatologische und hämostaseologische
Parameter erhoben und für beide Gruppen verglichen. Gleiches galt für die Ergebnisse der
postmortalen Untersuchung nach der Euthanasie der Tiere.
Mittels ECT konnte über den gesamten Versuchsverlauf gezeigt werden, dass ein
therapeutischer Plasmahirudinspiegel von ca. 0,5 – 1,5 µg/ml bei allen Tieren der behandelten
Gruppe erreicht und erhalten werden konnte, ohne in den toxischen Wertebereich zu
kommen.
Alle infizierten Tiere entwickelten die akute Verlaufsform der KSP mit unterschiedlich
ausgeprägten hämorrhagischen Symptomen und pathologisch-anatomischen Befunden, wobei
die hämorrhagischen Erscheinungen durch eine PEG-Hirudingabe über das erste Auftreten
5 Auswirkungen der Thrombozytenaggregationshemmung auf den Infektionsverlauf 124
petechialer Blutungen hinaus, nicht negativ beeinflusst wurde. Die Ausprägung der
Hämorrhagien zeigte keine Korrelation mit der Gruppenzugehörigkeit.
Der Vergleich beider Gruppen hinsichtlich des Krankheitsverlaufs und der hämatologischen
und hämostaseologischen Parameter zeigte keinen augenfälligen Einfluss der PEG-
Hirudingabe auf die erhobenen Parameter. Auch die Gruppenmittelwerte für die Parameter
Körpertemperatur, CS, Globaltests der Gerinnung, Leukozyten- und Thrombozytenzahlen,
MPV, Large Platelets und Fibrinogen zeigten einen nahezu parallelen Verlauf. Eine
Ausnahme bildete die aPTT, deren Verläufe der Gruppenmittelwerte sich versetzt parallel
darstellten. Die aPTT-Werte der behandelten Gruppe lagen über den gesamten
Versuchsverlauf ca. zehn sec über denen der Kontrollgruppe, was durch die Wirkung des
PEG-Hirudins zu erklären ist. Es ist bekannt, dass die aPTT im unteren therapeutischen
Konzentrationsbereich eine nahezu lineare Korrelation zwischen Hirudinkonzentration und
Verlängerung der Gerinnungszeit zeigt. Sie wurde deshalb zur Überwachung der
Hirudintherapie in der Humanmedizin herangezogen (MONREAL et al., 1995; BARTHELS
und VON DEPKA, 2003d; GOSSELIN et al., 2004) und von den Herstellern teilweise noch
immer dafür empfohlen. Die mangelnde Linearität im oberen und toxischen
Konzentrationsbereich sowie ihre großen interindividuellen Unterschiede machen sie jedoch
für eine aussagekräftige Überwachung ungeeignet (NOWAK, 2001). Dennoch belegen die
aufgetretenen Verlängerungen der aPTT und der parallele Verlauf zu den Werten der
Kontrollgruppe die Hirudinwirkung und ihre Konstanz.
Die Thrombinzeit war durch die Gabe des direkten Inhibitors PEG-Hirudin so ausgeprägt
verlängert, dass eine Messung mit den etablierten Methoden unmöglich war. Für die
Kontrollgruppe ergab sich ein Anstieg der Thrombinzeit zwischen dem fünften und achten
Tag p.i., der jedoch vor dem Hintergrund, dass Referenzwerte für die Thrombinzeit beim
Schwein mit einer Spannbreite von mehreren Sekunden angegeben werden (KARGES et al.,
1994), zu vernachlässigen zu sein scheint.
5.4 Auswirkungen der Thrombozytenaggregationshemmung auf den
Infektionsverlauf
In Vorversuchen wurde in vitro und in vivo ein geeigneter Wirkstoff zur Hemmung der
Thrombozytenaggregation gesucht, dessen Wirksamkeit sich über einen Aggregationstest
5 Diskussion 125
nachweisen ließ. Da der Thrombozytenaggregationstest für Schweineplasma nicht etabliert
war, musste die Anwendbarkeit der gebräuchlichen Aggregationsinduktoren zunächst getestet
werden. Als Vergleichswert wurde humanes Plasma eingesetzt. Von den Induktoren ADP,
Kollagen, Ristocetin und Arachidonsäure zeigten nur die beiden ersten eine zufriedenstellende
Induktion der Thrombozytenaggregation.
Wirkstoff der ersten Wahl zur Thrombozytenaggregationshemmung wäre der monoklonale
Antikörper Abciximab gewesen, da er über die Hemmung des GPIIb/IIIa-Rezeptors nicht nur
die Thrombozyteninteraktionen, sondern auch die Interaktionen mit polymorphkernigen
neutrophilen Granulozyten gehemmt hätte (HABAZETTL et al., 2000). Der Interaktion der
Thrombozyten mit neutrophilen Granulozyten über den GPIIb/IIIa-Rezeptor wird in der
Humanmedizin v. a. eine Rolle in der Pathogenese thrombotischer Ereignisse beigemessen, da
diese Interaktion die Thrombusbildung fördert und zur weiteren Plättchenaktivierung führen
kann (DE GAETANO et al., 1999; ANDREWS und BERNDT, 2004). Im Zusammenhang mit
dieser Studie wäre die Hemmung der Plättchenaktivierung das Ziel gewesen.
Da jedoch schon in vitro Versuche mit unterschiedlichen Konzentrationen zeigten, dass
Abciximab keine Wirksamkeit im Schwein besitzt, musste ein anderer Wirkstoff gefunden
werden. Für die GPIIb/IIIa-vermittelte Thrombozytenaggregation wurden speziesspezifische
Unterschiede nachgewiesen (JENNINGS et al., 1995), so dass die mangelnde Wirksamkeit
des chimären monoklonalen Antikörpers, der im entscheidenden Teil humane Spezifikationen
zeigt, auf dieser Grundlage erklärt werden kann.
Der GPIIb/IIIa-Rezeptorblocker Tirofiban, der bereits im Schweinemodell angewendet wurde
(SHEN et al., 2000), erwies sich nach den in vitro Studien zunächst als Erfolg versprechender
Kandidat, zeigte jedoch in vivo eine sehr ungünstige Kinetik und musste daher ebenfalls
ausgeschlossen werden. Es zeigte sich, dass Daten zu den Wirkstoffen, die in kurzfristigen
Studien an häufig narkotisierten Schweinen und bei überwachter intravenöser Gabe der
Substanzen gewonnen wurden, für die Anwendung außerhalb dieser Modelle nicht
übertragbar waren.
Der Wirkstoff Clopidogrel, welcher die ADP-induzierte Thrombozytenaggregation hemmt,
wurde, da er oral zu verabreichen ist und erst in seiner metabolisierten Form wirksam wird,
ausschließlich in vivo getestet. Es zeigte sich, dass sich mit einer Dosierung von 150 mg/Tier
die ADP-induzierte Thrombozytenaggregation um 30 bis 40 % hemmen ließ. 150 mg
5 Auswirkungen der Thrombozytenaggregationshemmung auf den Infektionsverlauf 126
entsprechen der doppelten Dosis, die für einen erwachsenen Menschen pro Tag veranschlagt
wird. Diese Unterschiede in der Dosis-Wirkungsbeziehung könnten auf die unterschiedliche
physiologische Thrombozytenzahl zurückzuführen sein. Während der Referenzbereich für
einen erwachsenen Menschen bei 150 – 400 G/l liegt, liegen die physiologischen Werte für
das Schwein trotz großer individueller Schwankungsbreite bei 600 G/l und darüber. In
Tiermodellen wurde gezeigt, dass ASS die Wirkung des Clopidogrels potenzieren kann
(HERBERT et al., 1996; HERBERT et al., 1998; HARKER et al., 1998), daher wurde auch
die Wirksamkeit der ASS überprüft. Die Versuche mit ASS zeigten, dass sie sowohl in vitro
als auch in vivo eine Hemmung der kollageninduzierten Thrombozytenaggregation hervorrief.
Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die Kombination Clopidogrel und ASS in einem
dreitägigen in vivo Versuch getestet. Es konnte gezeigt werden, dass eine Kombination aus
150 mg/Tier/Tag Clopidogrel und 500 mg/Tier/Tag ASS zu einer stabilen Hemmung der
ADP- und kollageninduzierten Thrombozytenaggregation führte. Die Hemmung betrug ca.
30 – 50 % für die ADP-induzierte Thrombozytenaggregation und ca. 30 % für die
kollageninduzierte Thrombozytenaggregation, wobei die Hemmung der kollageninduzierten
Aggregation nur für zwei von drei Tieren sicher belegt werden konnte, da das dritte Tier
starke Schwankungen zeigte, die eine Auswertung unmöglich machten.
Da sowohl ASS als auch Clopidogrel irreversible Hemmstoffe der Thrombozytenaggregation
sind, ist es auffallend, dass derart hohe Dosierungen für ein Läuferschwein von ca. 15 kg
Lebendgewicht notwendig waren. Die hohen physiologischen Thrombozytenzahlen des
Schweins und die große Reservekapazität des Knochenmarks könnten jedoch eine Rolle dabei
spielen.
Da im Vorversuch eine kontinuierliche Hemmung der ADP-induzierten Aggregation erreicht,
und auch die ASS-Wirkung für die Mehrzahl der Schweine hinreichend gezeigt werden
konnte, wurde die Kombination aus Clopidogrel und ASS für den Infektionsversuch
ausgewählt.
Im Rahmen des Infektionsversuchs wurden zehn Läuferschweine mit dem KSPV-Isolat
CSF0634 intranasal infiziert. Sechs Schweine erhielten täglich eine orale Gabe der
Clopidogrel/ASS-Kombination, vier Schweine dienten als unbehandelte Kontrolle. Über die
Versuchsdauer wurde den Tieren täglich Blut zur Bestimmung hämatologischer und
hämostaseologischer Parameter, inklusive der Thrombozytenaggregationstests, entnommen
5 Diskussion 127
und die Ergebnisse zwischen den Gruppen verglichen. Zudem wurde die Entwicklung des
Krankheitsbildes sowie die pathologisch-anatomischen Befunde dokumentiert und
gegenübergestellt.
Die Kontrolle der Wirksamkeit des Clopidogrels mittels ADP-induzierter
Thrombozytenaggregation erbrachte mit einer kontinuierlichen Hemmung um
durchschnittlich 30 % ein zufriedenstellendes Ergebnis, die Wirksamkeit der ASS konnte
nicht hinreichend belegt werden. Die Tatsache, dass die Schweine des Hauptversuches nicht
aus dem Betrieb kamen, aus dem die Tiere des Vorversuches stammten, lässt die Vermutung
zu, dass es einen Zusammenhang der ASS-Wirksamkeit mit dem genetischen Hintergrund der
Schweine gibt. Aus der Humanmedizin ist bekannt, dass es Menschen gibt, die eine ASS-
Resistenz aufweisen (MASON et al., 2004; WONG et al., 2004; EIKELBOOM et al., 2005;
SCHNEIDER, 2005; SZCZEKLIK et al., 2005; ANGIOLILLO et al., 2006; HANJIS et al.,
2006) und es ist nicht auszuschließen, dass ein ähnliches Phänomen bei Schweinen existiert.
In einer humanmedizinischen Studie zur Langzeittherapie mit Clopidogrel und ASS wurde
gezeigt, dass 44 % der Studienteilnehmer eine ASS-Resistenz aufwiesen und wesentlich
schlechter auf die Kombinationstherapie ansprachen (ANGIOLILLO et al., 2006).
Ob es ein mit der ASS-Resistenz des Menschen vergleichbares Phänomen gab, kann aus den
vorliegenden Daten nicht schlüssig beantwortet werden. Eine mangelnde Aufnahme durch die
Tiere scheidet aus, da die Verabreichung mit Clopidogrel zusammen in Pulverform per
direkte orale Eingabe mittels Spritze erfolgte, und dieses durchweg eine Wirksamkeit zeigte.
Eine Dosiserhöhung erbrachte keine höheren Hemmwerte, was ebenfalls auf eine mögliche
Resistenz hindeuten könnte. Es ist festzuhalten, dass beide Testsysteme sehr empfindlich auf
Entnahmeprobleme und Lagerungszeiten reagierten. Hämolytisches Plasma war nicht
geeignet zur Messung in der ADP-induzierten Thrombozytenaggregation und ergab nicht
auswertbare Ergebnisse. Da Erythrozyten bei der Zerstörung u. a. auch ADP in nicht
unerheblichen Mengen freisetzen (NOWAK, persönliche Mitteilung), ist eine vorzeitige
Aktivierung und Aggregation durch den physiologischen Induktor anzunehmen.
Blutentnahmeprobleme im Sinne eines Durchstechens der Vene beeinflussten die
kollageninduzierte Aggregation. Es ist anzunehmen, dass die bereits aktivierten
Thrombozyten nicht mehr für den Test zur Verfügung standen. Im Versuchsverlauf musste
die Zahl der eingestellten Thrombozyten halbiert werden, da der Wert von 500.000 /µl auch
5 Schlussfolgerungen 128
im PRP durch die markante Thrombozytendepletion nicht mehr erreicht wurde. Die
Thrombozytenzahl spielte somit zum Versuchsende eine bedeutende Rolle für das
Testsystem.
Der Vergleich der beiden Gruppen erbrachte keinen Hinweis bezüglich einer Beeinflussung
des Krankheitsgeschehens durch die pharmakologische Intervention. Alle klinischen,
hämatologischen und hämostaseologischen Parameter zeigten, abgesehen von unterschiedlich
ausgeprägten inter- und intraindividuellen Schwankungen, einen quasi parallelen Verlauf.
5.5 Schlussfolgerungen
5.5.1 Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems und einer disseminierten
intravasalen Gerinnung
Für die Infektion mit dem KSPV-Isolat CSF0634 konnte gezeigt werden, dass es zu
unterschiedlichen Veränderungen im plasmatischen Gerinnungssystem kam. Insbesondere
konnte eine Aktivierung des extrinsischen Weges der Gerinnung reproduzierbar anhand der
Prothrombinzeit in der Finalphase der Erkrankung nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der
aPTT legten nahe, dass der Aktivierung des intrinsischen Systems im Verlauf der KSPV-
Infektion keine wesentliche Bedeutung zukommt. Diese Ergebnisse konnten für drei bzw. vier
Tiere des ersten Vorversuchs mit deutlichen Veränderungen in den Einzelfaktorenaktivitäten
korreliert werden. Ab dem zehnten Tag p.i. konnte ein Verlust der Aktivität der Faktoren II, V
und Antithrombin-III gezeigt werden, der ebenfalls für eine Verbrauchsreaktion in der
plasmatischen Gerinnung sprach. In diesem Zeitraum konnte zudem für einige Tiere mittels
EGT eine erhöhte Fibrinmonomerkonzentration nachgewiesen werden.
Die genannten Befunde wurden in entsprechender Form auch von HEENE et al. (1971)
erhoben. Diese Autorengruppe interpretiert die Ergebnisse dahingehend, dass in der
Finalphase der Erkrankung eine dekompensierende intravasale Gerinnung zu einer
eindeutigen Verbrauchskoagulopathie führt. In der Arbeit von HEENE et al. (1971) konnten
diese Befunde mit den histopathologischen Nachweisen einer Mikrothrombosierung korreliert
werden. In der vorliegenden Arbeit konnte dies nicht nachvollzogen werden. Die Thromben,
die als histopathologisches Äquivalent der überschießenden Gerinnungsaktivierung bei einer
5 Diskussion 129
disseminierten intravasalen Gerinnung auftreten, wurden von anderen Arbeitsgruppen
ausschließlich und nur in geringem Maße in der Finalphase der Erkrankung gefunden
(GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a). Fibrinablagerungen in betroffenen Organen
fehlten in diesen Studien.
Neben den oben erwähnten Befunden wurde für vier von fünf Tieren des ersten Vorversuches
eine Erhöhung der Faktor-V- und Faktor-II-Aktivität an Tag sieben p.i. gefunden, was für
eine Aktivierung der Gerinnung zu diesem Zeitpunkt spricht. Die Ergebnisse konnten jedoch
nicht mit den Globaltests der Gerinnung korreliert werden, die zu diesem Zeitpunkt keine
deutlichen Veränderungen zeigten. Da die Globaltests keine sehr hohe Sensitivität aufweisen
und bei kompensierten Aktivierungs- und Verbrauchsreaktionen häufig im Normalbereich
bleiben, stehen diese Befunde nicht im Widerspruch zueinander. Im Rahmen weiterer Studien
wäre es sinnvoll, die Einzelfaktorenbestimmung für eine größere Anzahl Tiere durchzuführen,
nicht zuletzt, um durch Probleme bei der Blutentnahme bedingte Artefakte sicher
auszuschließen. Das Auftreten dieser Veränderungen ausschließlich bei infizierten Tieren,
und am gleichen Tag nach der Infektion, deutet jedoch stark darauf hin, dass es sich um eine
reelle Aktivitätssteigerung handelte. Für die Faktor-V-Aktivität ließ sich auch in der Arbeit
von HEENE et al. (1971) ein leichter Anstieg feststellen, der jedoch dort als nicht signifikant
bewertet wurde.
Die Aktivierung des Gerinnungssystems scheint über einen langen Zeitraum in kompensierter
Form zu verlaufen. Erst in der Finalphase der Erkrankung kommt es zu
Dekompensierungserscheinungen, die teilweise für eine DIC sprechen. Fraglich ist jedoch, ob
dieser Mechanismus für die klinischen Hämorrhagien verantwortlich ist.
Der initiale Mechanismus, der zur Entstehung einer DIC führt, ist die forcierte Ausschüttung
von TF durch geschädigte Endothelzellen oder aktivierte Monozyten, die zu einer
überschießenden Aktivierung der plasmatischen Gerinnung führt. Die vermehrte
Fibrinbildung durch systemisch zirkulierendes Thrombin führt im Folgenden zu einer diffusen
mikrovaskulären Thrombenbildung, die einerseits Thrombozyten und Gerinnungsfaktoren
verbraucht, jedoch auch andererseits die Fibrinolyse aktiviert (CAREY und RODGERS,
1998; LEVI und TEN CATE, 1999; MAMMEN, 2000). Das gleichzeitige Zirkulieren von
Thrombin und Plasmin in hohen Konzentrationen ist das Hauptcharakteristikum einer DIC
(BATEMAN et al., 1999).
5 Schlussfolgerungen 130
In den letzten Jahren wurde deutlich, dass die inadäquate Expression des TFs durch
zirkulierende Monozyten eine wichtige Rolle bei der Entwicklung unterschiedlichster
pathologischer Zustände mit überschießender Gerinnung spielt (ESMON, 2001). Auch für
virale hämorrhagische Fieber, v. a. die Ebolavirusinfektion, ist die TF-Expression durch
aktivierte Makrophagen als Hauptmechanismus der Pathogenese auftretender
Gerinnungsstörungen anzusehen (BRAY und MAHANTY, 2003; GEISBERT et al., 2003c;
BRAY, 2005). Die TF-Expression auf der Monozytenoberfläche, die beispielsweise durch IL-
1, IL-6 und TNF induziert werden kann, ermöglicht die Interaktion der Monozyten mit
aktivierten Thrombozyten und Endothelzellen über die Bindung von P-Selektin (CAREY und
RODGERS, 1998; SHEBUSKI und KILGORE, 2002) und fördert auf diesem Wege die
Thrombusbildung. Monozyten stellen auf diesem Wege ein wichtiges Bindeglied zwischen
Entzündungs- und Gerinnungsreaktionen dar (NAPOLEONE et al., 1997). GEISBERT et al.
(2003) stellten in diesem Zusammenhang heraus, dass sowohl die TF-Expression durch
Monozyten und Makrophagen als auch die hohen Level zirkulierender proinflammatorischer
Zytokine und die Lymphozytenapoptose bei viralen hämorrhagischen Fiebern und dem
septischen Schock gleichermaßen auftreten. Die Ähnlichkeiten zwischen diesen beiden
Krankheitsgeschehen könnten für die Erforschung der Pathogenese viraler hämorrhagischer
Fieber von Bedeutung sein (PETERS und ZAKI, 2002; BRAY und MAHANTY, 2003).
Analog zu den Befunden bei klassischen viralen hämorrhagischen Fiebern, geht auch die
KSPV-Infektion sowohl mit einer erhöhten Expression von TNF als auch IL-1 einher
(KNOETIG et al., 1999; SANCHEZ-CORDON et al., 2002; CHOI et al., 2004; NUNEZ et
al., 2005), wobei besonders die erhöhte IL-1-Synthese mit dem Auftreten klinischer
Symptome korrelierte (NUNEZ et al., 2005). In vitro konnte zudem eine erhöhte TF-
Expression nachgewiesen werden (BENSAUDE et al., 2004). In vivo existieren hierfür bisher
keine konkreten Daten, da jedoch eine Aktivierung des extrinsischen Weges der Gerinnung
nachweisbar war, ist davon auszugehen, dass der TF-Überexpression durch Monozyten auch
in vivo eine Rolle in der Entstehung der Gerinnungsstörungen zukommt. Eine Untersuchung
des Gerinnungspotentials und der Thrombingenerierung im Verlauf der KSPV-Infektion
könnte in diesem Bereich Aufschluss geben.
Bei der Beantwortung der Frage, ob es sich bei den festgestellten Veränderungen um eine
klassische DIC handelt, muss man sich vor Augen führen, dass das Bild einer DIC sehr
5 Diskussion 131
vielfältig sein kann und für die labordiagnostische Diagnose mehrere Parameter verändert
sein müssen. Die am häufigsten veränderten Parameter sind eine erniedrigte
Thrombozytenzahl, eine verlängerte aPTT, erhöhte Fibrinspaltprodukte und eine verlängerte
Prothrombinzeit (MISCHKE und NOLTE, 1992). Abgesehen von der aPTT sind diese
Befunde auch im Verlauf der KSPV-Infektion zu erheben.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die Befunde in der Finalphase der
Erkrankung und die pathogenetischen Erkenntnisse auf molekularer Ebene für eine
Aktivierung und Verbrauchsreaktion des Gerinnungssystems sprechen. Dabei gleichen die
erhobenen Befunde in weiten Teilen den in der Literatur beschriebenen Erkenntnissen zur
Pathogenese viraler hämorrhagischer Fieber. Ihre Ausprägung stellt jedoch v. a. im
Zusammenhang mit dem zeitlichen Ablauf der klinischen Erkrankung keine befriedigende
Erklärung für die auftretenden Hämorrhagien dar. Die zum Zeitpunkt des Auftretens erster
Hämorrhagien erhobenen hämostaseologischen Befunde erklären nicht eine weitreichend
erhöhte Blutungsneigung, da sowohl die Anzeichen für ein Zusammenbrechen des
fibrinolytischen Systems als auch eines Fibrinogenmangels fehlten und die
thrombozytenunabhängige aPTT keine Veränderungen zeigte. Für wenige Tiere sank die
Thrombozytenzahl so weit ab, dass dies alleine für eine Blutungsneigung verantwortlich sein
konnte. Die mangelnde Beeinflussbarkeit des Krankheitsverlaufs durch eine therapeutische
PEG-Hirudingabe ist ein Indiz dafür, dass der alleinigen Aktivierung des plasmatischen
Gerinnungssystems keine entscheidende Bedeutung im Krankheitsgeschehen zukommt. Ein
weiterer Hinweis ist die Tatsache, dass eine PEG-Hirudingabe nicht zu einer Verstärkung der
hämorrhagischen Symptome führte.
Auf der Grundlage der vorliegenden Ergebnisse und der in der Literatur publizierten Daten
kann postuliert werden, dass eine DIC an der Pathogenese der KSP beteiligt ist. Sie ist jedoch
nicht klassisch ausgeprägt und spielt als Ursache der Krankheitserscheinungen eine
untergeordnete Rolle. Die DIC ist somit mehr eine Folgeerscheinung anderer
pathogenetischer Mechanismen.
5.5.2 Rolle der Thrombozyten und Thrombozyteninteraktionen
Wie in der Literatur beschrieben (HEENE et al., 1971; HOFFMANN et al., 1971a; GOMEZ-
VILLAMANDOS et al., 1998), kam es auch im Rahmen der vorliegenden Arbeit zu einer
5 Schlussfolgerungen 132
hochgradigen Thrombozytopenie, wobei der erste Abfall der Werte schon vor dem Auftreten
klinischer Symptome zu verzeichnen war. Zum Ende der Versuche zeigten drei von 30 Tieren
Thrombozytenzahlen, die nach MISCHKE (1999) mit dem Auftreten lebensgefährlicher
Blutungen (< 30 G/l) bzw. Spontanblutungen (< 10 G/l) einhergehen könnten. Diese Tiere
zeigten deutlich ausgeprägte Hämorrhagien, an deren Ausmaß die extrem niedrige
Thrombozytenzahl höchstwahrscheinlich ursächlich beteiligt war.
Der frühe Abfall der Thrombozytenzahlen im Rahmen der KSPV-Infektion wurde von
verschiedenen Arbeitsgruppen mit massiven Degenerationen der Megakaryozyten im
Knochenmark in Verbindung gebracht (HOFFMANN et al., 1971b; CALDERON et al.,
1998). Eine schwerwiegende Störung der Thrombozytopoese erscheint in Zusammenhang mit
den vorliegenden Ergebnissen jedoch unwahrscheinlich, da die Anstiege in den Parametern
MPV und Large Platelets andeuten, dass eine regenerative Kapazität vorhanden war, und
vermehrt junge, reaktive Thrombozyten freigesetzt wurden. Das Auftreten der jungen
Thrombozyten zwischen dem vierten und zehnten Tag p.i. ist auch ein Indiz für eine
Verbrauchsreaktion, die durch vermehrte thrombozytopoetische Aktivität ausgeglichen
werden sollte. Die Kompensationsmöglichkeiten wurden im weiteren Krankheitsverlauf
jedoch offensichtlich überschritten und die Thrombozytenzahl nahm rasch ab. Es ist
anzunehmen, dass die hohe Reaktivität junger Thrombozyten den Vorgang beschleunigte.
Korreliert man diese Ergebnisse mit den Daten von GOMEZ-VLLAMANDOS et al. (1998),
die nachweisen konnten, dass nur eine geringe Anzahl Megakaryozyten KSPV-infiziert war,
kann die These, dass die Intensität der Thrombozytopenie nicht über eine Zerstörung
infizierter Megakaryozyten im Knochenmark zu erklären sei, gestützt werden.
Die von HEENE et al. (1971) und HOFFMANN et al. (1971) geäußerte Theorie, dass die
Thrombozytopenie mit der Entwicklung einer DIC ursächlich zu erklären sei, ist vor dem
Hintergrund, dass die Thrombozyten bereits lange vor dem Auftreten erster fassbarer
Veränderungen in den Gerinnungsparametern einen deutlichen Abfall zeigten, nicht
nachvollziehbar. BAUTISTA et al. (2002) zeigten, dass es zwei bis vier Tage p.i. zu einer
Thrombozytenaktivierung und -aggregation in Milz und Leber kommt, wobei dieses
Phänomen mit einer Aktivierung der residenten Makrophagenpopulation verbunden war.
Aktivierungsreaktionen aufgrund einer mutmaßlichen Zytokinwirkung (NUNEZ et al., 2005)
5 Diskussion 133
stellen eine plausible Erklärung für die auftretenden Thrombozytenverluste und die
nachfolgenden Regenerationsversuche durch das Knochenmark dar. Die Annahme, dass
kleinste Thrombozytenaggregate unter Einbeziehung von Fibrinogen in der Mikrozirkulation
entstehen, wird auch durch die Erhöhung des Fibrinogens im Plasma gestützt, da Fibrinogen
über die Bindung an den GPIIb/IIIa-Rezeptor der Thrombozytenmembran direkt an dem
Vorgang der Thrombozytenaggregation beteiligt ist (MOSESSON, 2005; LISMAN et al.,
2005). Der Verlauf der ermittelten Fibrinogenkonzentration im Plasma lässt sich im Sinne
einer Anpassungsreaktion auf einen Verbrauch in kleinsten Plättchenaggregaten deuten.
Auch diese Befunde wurden in gleichsinniger Form von HEENE et al. (1971) erhoben. Stellt
man dies in Zusammenhang mit der Gesamtheit der Befunde, fällt auf, dass der Anstieg der
Fibrinogenkonzentration nach dem ersten Abfall der Thrombozyten und in zeitlicher Nähe zu
den Spitzen der Einzelfaktorenaktivitäten auftrat, was die Theorie einer „Nachschub“-
Reaktion stützt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es zu einer Aktivierung der Gerinnung
bzw. der Thrombozytenaggregation in der frühen Phase der Infektion kommt, die durch die
Globaltests nicht fassbar ist.
Die Interaktionen aktivierter Thrombozyten spielen in der Pathogenese der KSP eine wichtige
Rolle. Der Versuch diese Interaktionen mit Hemmstoffen der Thrombozytenaggregation zu
beeinflussen, zeigte jedoch keine positive Beeinflussung des Krankheitsgeschehens. Die
Einflussmöglichkeiten waren aufgrund der Anwendbarkeit und Wirksamkeit der aus der
Humanmedizin stammenden Wirkstoffe beim Schwein limitiert und ließen eine optimale
Intervention nicht zu. So war die Hemmung der GPIIb/IIIa-vermittelten Aggregation unter
den gegebenen Umständen nicht möglich, obwohl sie ein sehr lohnender Angriffspunkt
gewesen wäre.
Thrombozyten verfügen über eine Vielzahl von Aktivierungsmöglichkeiten, von denen in der
vorliegenden Arbeit nur ein Bereich, nämlich die ADP-induzierte Aggregation, erfolgreich
gehemmt werden konnte. Die Hemmung dieses Weges um durchschnittlich 30 % reichte nicht
aus um einen sichtbaren oder messbaren Erfolg bezüglich der Symptome der Erkrankung zu
zeigen. Da die Hemmung der COX-1 nicht durchgängig erreicht werden konnte, standen den
Thrombozyten alle anderen Möglichkeiten der Aktivierung und Aggregation fast
uneingeschränkt zur Verfügung.
5 Ausblick 134
Nimmt man die in dieser Studie erhobenen Daten und die in der Literatur publizierten
Ergebnisse zusammen, wird deutlich, dass der vermutlich Zytokin-vermittelten Aktivierung
der Thrombozyten und deren Interaktionen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der
KSP zukommt. Die Bildung kleinster Thrombozytenaggregate ist als treibende Kraft der
KSPV-assoziierten Gerinnungsstörung anzusehen.
5.6 Ausblick
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass v. a. den Thrombozyteninteraktionen
eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Gerinnungsstörungen im Verlauf der akuten
KSP zukommt. Diese sind anhand der in der Literatur publizierten Daten mit
Zytokinwirkungen in Verbindung zu bringen, die durch aktivierte Makrophagenpopulationen
induziert werden (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a; NUNEZ et al., 2005; SANCHEZ-
CORDON et al., 2005b). An erster Stelle stehen dabei IL-1, IL-6, IL-8 und TNF-α
(BENSAUDE et al., 2004; CHOI et al., 2004; SANCHEZ-CORDON et al., 2005b). Diesen
proinflammatorischen und prokoagulatorischen Zytokinen wurden auch in der Pathogenese
der Ebolavirusinfektion eine entscheidende Bedeutung beigemessen (BRAY, 2005; BRAY
und GEISBERT, 2005). Allerdings werden diese Reaktionen dort nicht explizit mit
Thrombozyten und deren Interaktionen in Verbindung gebracht.
Die KSPV-Infektion weist sowohl auf der Ebene der Symptome als auch der
pathogenetischen Mechanismen Gemeinsamkeiten mit klassischen viralen hämorragischen
Fiebern auf (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a), daher sollte die Übertragbarkeit der in
diesem Zusammenhang gewonnenen Erkenntnisse geprüft werden. Beispielsweise konnten
die Mechanismen, die der Makrophagenaktivierung zugrunde liegen für die Ebolainfektion
bereits teilweise charakterisiert werden. Es wurde gezeigt, dass die Interaktion
einzelsträngiger viraler RNA, doppelsträngiger Replikationsintermediate und
virusspezifischer Substanzen mit Toll-like Rezeptoren bzw. pattern-recognition Molekülen
einen Trigger für NFκB, Interferon Regulationsfaktor 3 und andere Aktivierungswege
darstellt (BRAY, 2005). Diese Erkenntnisse sollten in weiterführende Studien zur
Erforschung der Mechanismen der Makrophagen- und Thrombozytenaktivierung bzw. der
involvierten Signalwege und Interaktionen im Rahmen der KSPV-Infektion einfließen.
6 Zusammenfassung
Sandra Blome
Zur Pathogenese der Klassischen Schweinepest:
Analysen der Blutgerinnungsstörungen
Die Klassische Schweinepest (KSP) ist eine weltweit vorkommende, verlustreiche Tierseuche
mit großer handelspolitischer und ökonomischer Relevanz. Sie zählt zu den Krankheiten, die
beim internationalen Tierseuchenamt, dem Office International des Épizooties (OIE),
anzeigepflichtig sind und wird durch ein kleines, behülltes RNA-Virus aus dem Genus
Pestivirus der Virusfamilie Flaviviridae hervorgerufen.
Die Infektion mit hochvirulenten KSPV-Stämmen kann v. a. bei jungen Tieren zu einem
akuten Krankheitsbild führen, das durch hämorrhagische Symptome und
Blutbildveränderungen gekennzeichnet ist, die dem Bild eines klassischen viralen
hämorrhagischen Fiebers entsprechen. Bisher konnte weder die Genese der hämorrhagischen
Symptome, die im Verlauf der KSPV-Infektion auftreten, noch die der Thrombozytopenie
und Leukopenie hinreichend aufgeklärt werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die pathogenetischen Mechanismen, die den
hämorrhagischen Symptomen und hämostaseologischen Veränderungen zugrunde liegen,
näher charakterisiert. Nach Vorversuchen zur Auswahl des geeigneten KSPV-Isolates und zur
Untersuchung des Verlaufs klinischer, pathologisch-anatomischer, hämatologischer und
hämostaseologischer Parameter wurden zu diesem Zweck zwei tierexperimentelle Ansätze
gewählt, welche eine pharmakologische Intervention an unterschiedlichen Stellen des
Hämostasesystems vorsahen. Es wurde einerseits die Endstrecke der plasmatischen
Gerinnung mit PEG-Hirudin und andererseits die Thrombozytenaggregation durch eine
Kombination der Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel und Acetylsalicylsäure
gehemmt.
In beiden Experimenten wurden zwei Läuferschweingruppen mit dem hochvirulenten KSPV-
Stamm CSF0634 infiziert. Während eine Gruppe täglich mit den erwähnten Medikamenten
6 136
behandelt wurde, diente die zweite Gruppe der Kontrolle. Es erfolgte eine tägliche
Blutentnahme und Durchführung gerinnungsanalytischer und hämatologischer Tests. Die
klinischen Symptome im Verlauf der Infektion wurden nach einem Punkteschema
dokumentiert und analysiert.
Alle Tiere entwickelten die akute Verlaufsform der KSP mit unterschiedlich ausgeprägten
hämorrhagischen Symptomen. Neben einer ausgeprägten Leuko- und Thrombozytopenie
konnte bei allen Tieren eine Verlängerung der Prothrombinzeit, die für einen Verbrauch der
Faktoren des extrinsischen Pfades spricht, reproduzierbar in der Finalphase der Erkrankung
gezeigt werden. Des Weiteren kam es zu einem Anstieg der Fibrinogenkonzentration sowie
zu einem Gipfel in den Parametern Large Platelets und mittleres Plättchenvolumen zwischen
dem vierten und zehnten Tag nach der Infektion. Der Vergleich der beiden Gruppen erbrachte
keine Anhaltspunkte für eine Beeinflussung des Krankheitsgeschehens durch die
pharmakologische Intervention.
Obwohl es im Verlauf der KSPV-Infektion zu einer Aktivierung der Gerinnung und zu einem
Verbrauch der Faktoren des extrinischen Pfades kommt, bieten diese Vorgänge keine
schlüssige Erklärung für das Auftreten der Hämorrhagien bzw. der Thrombozytopenie, die
bereits vor den ersten Dekompensationsanzeichen auftreten. Die mangelnde Beeinflussbarkeit
des Geschehens durch die Gabe des Thrombininhibitors PEG-Hirudin unterstützt die
Annahme, dass das plasmatische Gerinnungssystem nicht die Hauptrolle in der Pathogenese
der KSP spielt.
Der Anstieg des Fibrinogens spricht zusammen mit der Thrombozytopenie für eine
kompensierte Verbrauchsreaktion, welche durch die Bildung kleinster
Thrombozytenaggregate in der Frühphase der Infektion zu erfolgen scheint. Über den
GPIIb/IIIa-Rezeptor vermittelt Fibrinogen die Aggregation aktivierter Thrombozyten und
wird in diesem Zusammenhang vermehrt umgesetzt. Für die Aktivierung der Thrombozyten
werden in der Literatur Makrophagenzytokine als auslösendes Moment diskutiert. Weitere
Studien sollten daher die Makrophagen-Thrombozyten-Interaktionen näher beleuchten, denen
eine wichtige Rolle in der Pathogenese der KSP zuzukommen scheint.
137
Summary
Sandra Blome
On the pathogenesis of classical swine fever:
Analyses of coagulation disorders
Classical swine fever (CSF) is one of the most important diseases of pigs with worldwide
distribution and high impact on trade and economy. CSF is caused by a small enveloped RNA
virus that is grouped into the genus Pestivirus within the Flaviviridae family. The disease is
notifiable to the OIE (Office International des Épizooties).
Especially in young animals, infections with highly virulent CSF virus (CSFV) strains may
lead to an acute clinical picture that is characterized by hemorrhagic lesions and changes in
blood count that resemble the signs seen with viral hemorrhagic fevers. So far, neither the
mechanisms underlying the hemorrhages occurring in the course of CSFV infections nor the
genesis of thrombocytopenia and leukopenia are sufficiently elucidated.
In the context of this project the pathogenetic mechanisms underlying the hemorrhagic lesions
and coagulation changes were investigated. After preliminary trials to select an adequate
CSFV strain and to investigate the course of clinical, pathological, hematological, and
hemostaseological parameters upon infection, two animal experiments were designed
targeting two parts of the coagulation system with direct pharmacological interventions. On
one hand the common final pathway of the plasmatic coagulation system was arrested using
direct thrombine inhibitor PEG-Hirudin and on the other hand platelet aggregation was
inhibited with a combination of Clopidogrel and Acetyl Salicylic Acid.
In both experiments, two groups of piglets were infected with highly virulent CSFV strain
CSF0634. While one group was treated daily with the above mentioned drugs, the second
group acted as control. Blood samples were taken daily and coagulation tests as well as blood
counts were performed. Clinical signs observed in the course of CSFV infection were
assessed using a clinical score scheme.
All animals developed acute CSF with variable hemorrhagic lesions. Beside marked
leukopenia and thrombocytopenia, all animals displayed prolongations of prothrombin time
during the final phase of the disease that are indicative for the consumption of coagulation
6 138
factors of the extrinsic pathway. Furthermore, an increase in fibrinogen as well as peaks in
parameters Large Platelets and Mean Platelet Volume between days four and ten post
infection were observed. Comparison of groups did not provide any indication for an
influence of the pharmacological interventions on the course of the disease.
Although activation of the coagulation system and consumption of coagulation factors of the
extrinsic pathway were observed upon CSFV infection, these processes do not provide a
conclusive explanation for the occurrence of hemorrhages and thrombocytopenia respectively,
as these signs occur prior to any decompensation. The lack of influence of PEG-Hirudin
corroborates the assumption that the plasmatic coagulation system does not play a major role
in the pathogenesis of CSF.
The increase in fibrinogen together with thrombocytopenia are indications for a compensated
consumption caused by generation of platelet microaggregates in the early phase of infection.
Fibrinogen mediates aggregation of activated platelets through binding to the GPIIb/IIIa
receptor and is consumed in this context. Cytokines released by activated macrophages are
discussed in literature as triggers for platelet activation. Further studies should therefore
elucidate interactions of macrophages and platelets that seem to play an important role in CSF
pathogenesis.
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8 Anhänge 167
8 Anhänge
8.1 Tabellen und Abbildungen
Tabelle 8-1: Ergebnisse der Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion und des Antigen-ELISAs für
die Tiere 153 bis 159. Die Virusisolierung wurde vor der Infektion und am Tag der Euthanasie
durchgeführt, der Antigen-ELISA an den Tagen 10 und 14 p.i.
Tiernummer Virusisolierung Antigen-ELISA
Tag 0 Tag der Euthanasie Tag 10 p.i. Tag 14 p.i.
Tier 153 negativ positiv positiv positiv
Tier 154 negativ negativ positiv negativ
Tier 155 negativ positiv positiv positiv
Tier 156 negativ positiv positiv positiv
Tier 157 negativ positiv positiv positiv
Tier 158 negativ negativ negativ negativ
Tier 159 negativ negativ negativ negativ
Tabelle 8-2: Ergebnisse der Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion für die Tiere 175 bis 181. Die
Virusisolierung wurde an den Tagen vier, zehn und 14 p. i. durchgeführt (dpi = Tage nach der
Infektion).
Tiernummer 4 dpi 7 dpi 10 dpi 14 dpi
Tier 175 negativ positiv positiv positiv
Tier 176 negativ positiv positiv positiv
Tier 177 negativ positiv positiv negativ
Tier 178 negativ positiv positiv positiv
Tier 179 negativ positiv positiv positiv
Tier 180 negativ negativ negativ negativ
Tier 181 negativ negativ negativ negativ
8 Anhänge 168
Tabelle 8-3: Antikörpernachweis in VNT und Antikörper-ELISA für die Tiere 153 bis 159. Die
Untersuchung auf Antikörper ist für die Seren dargestellt, die am Tag der Euthanasie gewonnen
wurden. Der im VNT ermittelte Antikörpertiter ist in ND50 angegeben. ELISA 1 = Chekit-CSF-Sero
(Dr. Bommeli AG, Liebefeld, Bern, Schweiz); ELISA 2 = Classical Swine Fever Virus Antibody Test
Kit, HerdChek (IDEXX Laboratories, Wörrstadt).
Tiernummer Virusneutralisationstest Antikörper-ELISA
CSF0902 CSF0634 BVDV NADLBDV
MoredunELISA 1 ELISA 2
Tier 153 <5 <5 <10 <5 negativ negativ
Tier 154 40 120 <10 15 positiv positiv
Tier 155 <5 30 <10 <5 positiv positiv
Tier 156 <5 <5 <10 <5 fraglich fraglich
Tier 157 <5 <5 <10 <5 negativ negativ
Tier 158 <5 <5 <10 <5 negativ negativ
Tier 159 <5 <5 <10 <5 negativ negativ
Tabelle 8-4: Antikörpernachweis in VNT und Antikörper-ELISA für die Tiere 175 bis 191. Die
Untersuchung auf Antikörper ist für die Seren dargestellt, die am Tag der Euthanasie gewonnen
wurden. Der im VNT ermittelte Antikörpertiter ist in ND50 angegeben. ELISA 1 = Chekit-CSF-Sero
(Dr. Bommeli AG, Liebefeld, Bern, Schweiz).
Tiernummer Virus Neutralisation Test Antibody ELISA
CSF0902 CSF0634BVDV
NADL
BDV
Moredun ELISA 1
Tier 175 <5 <5 <10 <5 fraglich
Tier 176 <5 <5 <10 <5 negativ
Tier 177 30 480 <10 30 positiv
Tier 178 <5 40 <10 <5 positiv
Tier 179 <5 <5 <10 <5 fraglich
Tier 180 <5 <5 <10 <5 negativ
Tier 181 <5 <5 <10 <5 negativ
8 Anhänge 169
Eichkurve für die PEG-Hirudin-Bestimmung im
Citratplasma mittels ECT
y = 13,434x + 48,587
R2 = 0,9989
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15
PEG-Hirudinkonzentration [µg/ml]
Zei
t [s
]
PEG-Hirudin-
Verdünnungsreihe
Linear (PEG-Hirudin-
Verdünnungsreihe)
Abbildung 8-1: Eichkurve aus einer PEG-Hirudin-Standardverdünnungsreihe. Diese Eichkurve
wurde der Berechnung der ECT zugrunde gelegt. R2 beschreibt das Bestimmtheitsmass der
Kurve.
Ecarin Clotting Time für Gruppe I
45
50
55
60
65
70
75
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Tage pi
EC
T [
s]
Tier 182
Tier 183
Tier 184
Tier 185
Tier 186
Tier 187
Maximum
Minimum
Abbildung 8-2: Ecarin Clotting Time für die Tiere 182 bis 186 (Gruppe 1). Diese Tiere wurden
mit PEG-Hirudin behandelt. Der therapeutische Dosisbereich von 0,5 bis 1,5 µg/ml PEG-Hirudin
ist durch die Kurven mit der Bezeichnung „Minimum“ und „Maximum“ eingegrenzt. Das
unbehandelte Tier 187 wurde als Kontrolle mitgeführt.
8 Anhänge 170
Tabelle 8-5: Nachweis der KSPV-Infektion. Ergebnisse der Virusislierung an Tag zehn p.i. für die
Tiere 182 bis 191 unter Angabe der Gruppenzugehörigkeit im Versuch zum Einfluss einer PEG-
Hirudinbehandlung auf das Krankheitsgeschehen.
Tiernummer Gruppenzugehörigkeit Virusisolierung
Tier 182 Gruppe 1 positiv
Tier 183 Gruppe 1 positiv
Tier 184 Gruppe 1 positiv
Tier 185 Gruppe 1 positiv
Tier 186 Gruppe 1 positiv
Tier 187 Gruppe 2 positiv
Tier 188 Gruppe 2 positiv
Tier 189 Gruppe 2 positiv
Tier 190 Gruppe 2 positiv
Tier 191 Gruppe 2 positiv
Poolplasma-Verdünnungsreihe für aPTT
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 20 40 60 80 100
Konzentration in % des Poolplasmas
Ger
inn
un
gsz
eit
[s]
Abbildung 8-3: Verdünnungsreihe zur Ermittlung der optimalen Plasmavorverdünnung für die
Messung der aPTT mit Actin®
FS im Versuch zur Beeinflussung des plasmatischen
Gerinnungssystems. Die orange Linie zeigt den Bereich der gewünschten aPTT für Poolplasma
an. Die Ergebnisse wurden für die Auswahl des Verdünnungsverhältnisses verwendet.
8 Anhänge 171
Kalibrationskurve für Biuret-Methode
y = 0,0171x - 0,0026
R2 = 0,9995
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0 3 6 9 12
Fibrinogenkonzentration [g/l]
Ab
sorb
an
z Fibrinogen-Standard
Linear (Fibrinogen-
Standard)
Abbildung 8-4: Kalibrationskurve zur Fibrinogenbestimmung. Diese wurden für jedes
Versuchsvorhaben im Rahmen der Methodenetablierung ermittelt und anhand eines humanen
Kontrollstandards und eines porzinen Poolplasmas überprüft. Erstellt wurde eine
Standardverdünnungreihe mit 1,5, 3, 6, 9 und 12 mg/ml Fibrinogen in NaCl. Die aus der
linearisierten Standardkurve errechnete Funktion wurde der Berechnung der
Fibrinogenkonzentrationen zugrunde gelegt.
ADP-induzierte Thrombozytenaggregation
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Nu
llw
ert 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
11
12
13
14
Tage pi
Ag
gre
ga
tio
n [
%]
Gruppe I
Gruppe II
Abbildung 8-5: Verlauf der ADP-induzierten Thrombozytenaggregation im Infektionsverlauf.
Gruppe I erhielt täglich Clopidogrel und ASS p.o., Gruppe II diente der unbehandelten Kontrolle.
Dargestellt sind die mittels APACT ermittelten Aggregationsmaxima. Es wurden 50 µl des
gebrauchsfertigen ADP-Reagenz eingesetzt.
8 Anhänge 172
Tabelle 8-6: Nachweis der KSPV-Infektion. Ergebnisse der RT-PCR an Tag neun p.i. für die Tiere
248 bis 254 und 256 bis 258 unter Angabe der Gruppenzugehörigkeit im Versuch zum Einfluss einer
Clopidogrel- und ASS-Behandlung auf das Krankheitsgeschehen.
Tiernummer Gruppenzugehörigkeit RT-PCR
Tier 248 Gruppe 1 positiv
Tier 249 Gruppe 1 positiv
Tier 250 Gruppe 1 positiv
Tier 251 Gruppe 1 positiv
Tier 252 Gruppe 1 positiv
Tier 253 Gruppe 1 positiv
Tier 254 Gruppe 2 positiv
Tier 256 Gruppe 2 positiv
Tier 257 Gruppe 2 positiv
Tier 258 Gruppe 2 positiv
Verdünnungsreihe für aPTT mit Actin FS
10
15
20
25
30
35
40
45
0 20 40 60 80 100
Konzentration in % des Poolplasmas
Ger
inn
un
gsz
eit
[s]
Abbildung 8-6: Verdünnungsreihe zur Ermittlung der optimalen Plasmavorverdünnung für die
Messung der aPTT mit Actin®
FS im Versuch zur Beeinflussung der Thrombozyteninterkationen.
Die orange Linie zeigt den Bereich der gewünschten aPTT für Poolplasma an. Die Ergebnisse
wurden für die Auswahl des Verdünnungsverhältnisses verwendet.
8 Anhänge 173
8.2 Zusammensetzung der verwendeten Medien und Reagenzien
8.2.1 Zellkulturmedien
EMEM (Eagle´s minimum essential medium)
Pulvermedium 9,60 g Fa. Invitrogen, Karlsruhe
NaHCO 2,20 g Fa. Merck, Darmstadt
Phenolrot 0,016 g Fa. Merck, Darmstadt
Aqua bidest. ad 1000,00 ml
Der pH-Wert wurde durch CO2-Begasung auf 6,9 eingestellt.
EMEM wurde als Erhaltungsmedium für die PK(15)A-Zelllinie unter Zugabe von 50 ml
Fetalem Kälberserum (Fa. Biochrom, Hamburg) eingesetzt.
Für zellkulturbasierte Nachweissysteme in Mikro- und Makrotiterplatten wurden dem EMEM
folgende Inhaltsstoffe zugefügt:
Penicillin G 50 mg Fa. Sigma, Deisenhofen
Streptomycinsulfat 60 mg Fa. Sigma, Deisenhofen
Fetales Kälberserum 100 ml Fa. Biochrom, Hamburg
EDulb (EMEM, modifiziert nach DULBECCO und FREEMAN [1959])
EDulb-Pulvermedium 13,53 g Fa. Serva, Heidelberg
NaHCO2 2,20 g Fa. Merck, Darmstadt
Penicillin G 60 mg Fa. Sigma, Deisenhofen
Streptomycin Sulfat 50 mg Fa. Sigma, Deisenhofen
Fetales Kälberserum 100 ml Fa. Biochrom, Hamburg
Aqua bidest. ad 1000,00 ml
Der pH-Wert wurde durch CO2-Begasung auf 6,9 eingestellt.
Einfriermedium
EMEM 700 ml
DMSO 100 ml Fa. Sigma, Deisenhofen
Fetales Kälberserum 200 ml Fa. Biochrom, Hamburg
8 Anhänge 174
8.2.2 Lösungen und Reagenzien
ATV (adjusted trypsin-versen)-Lösung
NaCl 8,00 g Fa. Merck, Darmstadt
KCl 0,40 g Fa. Merck, Darmstadt
NaHCO3 0,58 g Fa. Merck, Darmstadt
Dextrose 1,00 g Fa. Sigma, Deisenhofen
EDTA (Versen) 0,20 g Fa. Merck, Darmstadt
Trypsin(3U/mg) 0,50 g Fa. Serva, Heidelberg
Aqua bidest. ad 1000,00 ml
Versen-Trypsin-Lösung (0,125%)
NaCl 8,0 g Fa. Merck, Darmstadt
KCl 0,2 g Fa. Merck, Darmstadt
KH2PO4 0,2 g Fa. Merck, Darmstadt
Na2HPO4 x 12 H2O 2,37 g Fa. Merck, Darmstadt
CaCl2 x 2 H2O 0,132 g Fa. Merck, Darmstadt
Trypsin (3 U/mg) 1,25 g Fa. Serva, Heidelberg
EDTA (Versen) 1,25 g Fa. Merck, Darmstadt
Penicillin G 50 mg Fa. Sigma, Deisenhofen
Streptomycinsulfat 60 mg Fa. Sigma, Deisenhofen
MgCl2 x 6 H2O 0,1 g Fa. Sigma, Deisenhofen
Aqua bidest. ad 1000,00 ml
Einstellung des pH-Wertes auf 7,0 mit 1 N NaOH
AEC-Lösung
3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC) 20,00 mg Fa. Sigma, Deisenhofen
Dimethylformamid 3,00 ml Fa. Merck, Darmstadt
Natriumazetat-Puffer
(0,05 M, pH 5,0) ad 50,00 ml Fa. Merck, Darmstadt
H2O2 (3 %) 0,40 ml Fa. Merck, Darmstadt
8 Anhänge 175
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
NaCl 8,00 g Fa. Merck, Darmstadt
KCl 0,20 g Fa. Merck, Darmstadt
Na2HPO4 x 12 H2O 2,37 g Fa. Merck, Darmstadt
KH2PO4 0,20 g Fa. Merck, Darmstadt
CaCl2 x 2 H2O 0,132 g Fa. Merck, Darmstadt
MgCl2 x 6 H2O 0,10 g Fa. Sigma, Deisenhofen
Aqua bidest. ad 1000,00 ml
PBSM (phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Kalzium und Magnesium)
NaCl 8,00 g Fa. Merck, Darmstadt
KCl 0,20 g Fa. Merck, Darmstadt
Na2HPO4 x 12 H2O 2,37 g Fa. Merck, Darmstadt
KH2PO4 0,20 g Fa. Merck, Darmstadt
Aqua bidest. ad 1000,00 ml
PBS/Tween
PBSM 1000,00 ml
Tween® 20 100,00 µl Fa. Serva, Heidelberg
Biuret-Stammlösung
Kaliumnatriumtartrat
(C4H4KnaO6 x 4 H2O) 45,0 g Fa. Merck, Darmstadt
NaOH (0,2 mol/l) ad 400 ml Fa. Roth, Karlsruhe
Kupfer-II-Sulfat ad 15,0 g Fa. Merck, Darmstadt
Kaliumjodid ad 5,0 g Fa. Merck, Darmstadt
NaOH (0,2 mol/l) ad 1000 ml Fa. Roth, Karlsruhe
Filtrierung der Lösung durch einen Faltenfilter und lichtgeschützte Aufbewahrung.
Kaliumjodidlösung
Kaliumjodid 5,0 g Fa. Merck, Darmstadt
NaOH (0,2 mol/l) ad 1000 ml Fa. Merck, Darmstadt
8 Anhänge 176
Biuret-Gebrauchslösung
Biuret-Stammlösung 100 ml
Kaliumjodidlösung ad 500 ml
Ecarin-Reagenz
Ecarin-Lösung (10 U/ml)
in 0,9 %iger NaCl-Lösung) 100 µl
Tris mit 3 % BSA
(0,05 M, pH 7,5 in 0,1 M NaCl) 800 µl
CaCl2-Lösung (0,1 M) 100 µl
Hämalaunlösung nach MAYER
Hämatoxylin 1 g
Aqua bidest. ad 1000 ml
Natriumjodad ad 0,2 g
Kaliumaluminiumsulfat x 12 H2O ad 50 g
Lösung erwärmen, weitere Bestandteile nach Erkalten lösen.
Chloralhydrat ad 50 g
Citronensäure (kristallin) ad 1 g
8 Anhänge 177
8.3 Sonstige Chemikalien
Aceton Fa. Applichem, Darmstadt A 0993
AEC Fa. Sigma, Deisenhofen A 5754
Bovines Serumalbumin Fa. Serva, Darmstadt 11930
Calciumchlorid Dihydrat Fa. Merck, Darmstadt 1.02382
Citronensäure Fa. Merck, Darmstadt 1.00247
Dimethylformamid Fa. Merck, Darmstadt 1.02952
Essigsäure Fa. Roth, Darmstadt 3738.2
Ethanol Fa. Merck, Darmstadt 1.00983
Glycerin Fa. Gibco BRL 15514-011
Kaliumchlorid Fa. Merck, Darmstadt 1.04936
Kaliumdihydrogenphoshat Fa. Merck, Darmstadt 1.04877
Kalium-EDTA Fa. Merck, Darmstadt 1.04819
Kaliumhydrogencarbonat Fa. Merck, Darmstadt 1.04854
Magnesiumchlorid Fa. Merck, Darmstadt 0059097
Natriumacetat-Trihydrat Fa. Merck, Darmstadt 1.06267
Natrium-Carbonat, wasserfrei Fa. Merck, Darmstadt 1.06392
Natriumchlorid Fa. Roth, Karlsruhe 9265.2
Natriumhydrogencarbonat Fa. Merck, Darmstadt 1.06329
Phenolrot Fa. Merck, Darmstadt 7241.0005
Salzsäure Fa. Roth, Karlsruhe 6331.2
TRIS Fa. Roth, Karlsruhe 5429.2
Tween 20 Fa. Serva, Heidelberg 37470
Wasserstoffperoxid Fa. Merck, Darmstadt 1.07209
Paraplast (Paraffin) Fa. Shandon, Frankfurt
Corbitbalsam Fa. Hecht, Kiel
8 Anhänge 178
8.4 Pharmakologisch wirksame Substanzen
Abciximab (ReoPro®
) Centocor B.V., Leiden, NL
Acetylsalicylsäure (Aspisol®
) Bayer, Leverkusen
Acetylsalicylsäure (ASS ratiopharm®
) Ratiopharm, Ulm
Clopidogrel (Iscover®
) Bristol-Myers Squibb Pharma, Hounslow, GB
PEG-Hirudin zur Verfügung gestellt von Prof. Nowak, Jena
Pentobarbital (Narcoren®
) Merial, Halbergmoos
Tirofibanhydrochlorid (Aggrastat®
) MSD Sharp und Dohme, Haar
8 Anhänge 179
8.5 Kommerzielle Reagenzien und Kits
Actin®
FS Fa. DADE Behring, Schwalbach B4218-100
AMAX ADP Reagent Fa. Trinity Biotech, Darmstadt 885-3
AMAX Collagen Reagent Fa. Trinity Biotech, Darmstadt 885-1
AMAX Platelet Aggregation
Screening Test
Fa. Trinity Biotech, Darmstadt 885-A
Antithrombin III Fa. Roche Diagnostics, Mannheim
CaCl2-Lösung, 0,025 mol/l Fa. DADE Behring, Schwalbach ORHO 37
CELLaTOXIK Fa. Mölab, Hilden 0200050
Cello-clean Enzym Fa. Mölab, Hilden 0200020
Cello-ton Verdünnungslösung Fa. Mölab, Hilden 0200003
Chekit-CSF-Sero Dr. Bommeli AG, Liebefeld-Bern,
Schweiz
CST113-
413
CSFV Anitgen Test Kit,
HerdChek
IDEXX Laboratories, Wörrstadt ESF113-
556
CSFV Antibody Test Kit,
HerdChek
IDEXX Laboratories, Wörrstadt 43220-
3492
Diäthylbarbiturat-Acetat-
Pufferlösung Fa. DADE Behring, Schwalbach ORHW 61
Fibrinogen (human) Fa. Sigma-Aldrich, Deisenhofen F-4883
Fibrinogen, plasminogenfrei Fa. Haemochrom Diagnostica, Essen FIB1
Gerinnungsfaktor II-
Mangelplasma Fa. DADE Behring, Schwalbach OSGR 13
Gerinnungsfaktor V-
Mangelplasma DADE Behring, Schwalbach ORSM 19
Kontrol-Plasma N Fa. DADE Behring, Schwalbach ORKE 41
mö-lyse Hämolaysemittel Fa. Mölab, Hilden 0200012
Pathromtin®
Fa. DADE Behring, Schwalbach OTXA 31
QIAamp Blood Mini Kit Fa. Qiagen GmbH, Hilden 51106
QuantiTECT SYBR®
Green
RT-PCR Mastermix
Fa. Qiagen GmbH, Hilden 204243
Test-Thrombin-Reagenz Fa. DADE Behring, Schwalbach OWHM 13
Thrombin (bovin) Fa. Sigma-Aldrich, Deisenhofen T-4648
Thromborel®
S Fa. DADE Behring, Schwalbach OUHP 49
8 Anhänge 180
8.6 Geräte und Gebrauchsgegenstände
Autoklav
Autoklav 17 Melag, Berlin
Einbettungsautomat
Hypercenter II Shandon, Frankfurt
ELISA-Reader
Spectra II Tecan, Crailsheim
Färbeautomat
Varistain 24-3 Shandon, Frankfurt
Fieberthermometer
Geratherm®
plus Geratherm Medical AG, Geschwenda
Geräte zur Blutuntersuchung
Sysmex F-800 System Sysmex Deutschland, Norderstedt
Mölab Hämatologie System 8702/6 Mölab, Hilden
Glaspipetten und –gefäße Jürgens, Hannover
Inkubator
CO2-Inkubator Typ B 5060 EK/CO2 Heraeus, Hanau
Kugelkoagulometer
Amelung Coagulometer KC 4A Amelung, Lemgo
Mikroskop
Inverses Mikroskop (715075) Leitz, Wetzlar
Axiostar plus Lichtmikroskop Zeiss, Oberkochen
Mikrotom
Schlittenmikrotom Mikrom, Heidelberg
8 Anhänge 181
PCR-Maschine
MX 4000 PCR Maschine Strategene, La Jolla, California, USA
pH-Meter Jürgens, Hannover
Photometer
Ultraspec 2000 Amersham, Freiburg
Pipetten und Pipettierhilfen
Pipetman, P20, P100, P200, P1000 Abimed Analysen Technik
Blutmischpipetten für Leukozyten Landgraf Laborgeräte, Langenhagen
pipettus®
-standard Hirschmann Laborgeräte
Pipetboy plus®
Tecnomara AG, Wallisellen, Schweiz
12-Kanal-Pipette Brand
Multipette®
4780 Eppendorf, Hamburg
Micro-Pipettierhelfer BRAND Heiland Vet, Hamburg
Sicherheitswerkbänke
NUAIRE™ Klasse II Typ A/B3 NUAIRE, Plymouth, Minnesota, USA
Nunc Mikroflow adv. biosafety cabinet Schnakenberg, Bremen
Thermocycler
T personal Cycler Biometra, Göttingen
Thrombozytenaggregationsmessung
APACT System LABiTec, Ahrensburg
Trockenschrank (80°C) Ehret, Emmerdingen
Vakuumpumpe
Vacusafe Integra Biosciences, Chur, Schweiz
Vortex
Reax 2000 Heidolph, Schwabach
8 Anhänge 182
Waagen
1213 MP Sartorius GmbH, Göttingen
Analysenwaage, 1712 MP 8 Sartorius, Göttingen
Wärmeschrank Fa. Medite, Burgdorf
Wasserbad
Type 1003 Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel
Zählkammer
Thomakammer Heiland Vet GmbH, Hamburg
Neubauer, improved Landgraf Laborgeräte, Langenhagen
Zentrifugen
Labofuge 400R Heraeus-Christ, Osterode/Harz
Multifuge 3 S-R Heraeus- Christ, Osterode/Harz
Mikroliter-Kühlzentrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg
8 Anhänge 183
8.7 Verbrauchsmittel
Blutentnahme
Kabavette®
G EDTA 3,5 Kabe, Nürmbrecht 102325
Kabavette®
G EDTA 7,5 Kabe, Nürmbrecht 102200
Kabavette®
G Gerinnung 5,5 Kabe, Nürmbrecht 102100
Kabavette®
G Gerinnung 4 Kabe, Nürmbrecht 102125
Kabavette®
G Serum 7,5 Kabe, Nürmbrecht 102600
Adapter zur Mehrfachentnahme
mit Luer-Konus Kabe, Nürmbrecht 104300
Terumo®
Einmalkanülen 18 G Heiland Vet, Hamburg 370-690
Terumo®
Einmalkanülen 20 G Heiland Vet, Hamburg 370-692
Terumo®
Einmalkanülen 22 G Heiland Vet, Hamburg 370-218
Gewebeschnitte
Objektträger, Mattrand Engelbrecht, Edermünde
SuperFrost®
Objektträger Roth, Karlsruhe
Deckgläschen Roth, Karlsruhe
Pipettenspitzen
Combitips 1,25 ml Eppendorf, Hamburg 0030 048.083
Volumen bis 1000 µl Ratiolab, Dreieich 2100611
Volumen bis 200 µl Ratiolab, Dreieich 2100601
Reaktionsgefäße
Mikrotiterplatten Greiner, Nürtingen 653190
Makrotiterplatten Greiner, Nürtingen 662160
Polystyrol- Reagenzröhrchen Heiland Vet, Hamburg 370-470
Polyethylen-Stopfen für
Reagenzröhrchen Heiland Vet, Hamburg 370-495
Makro-Küvetten, Polystyrol Heiland Vet, Hamburg 370-485
Küvetten und Kugeln für KC 4A Trinity Biotech, Lemgo Z 05100
mölab-cups, klein Mölab, Hilden 0300002
Mikro-Küvetten inkl. Mixer Greiner BioChemica, Flacht 6130005
8 Anhänge 184
Sonstiges
Schachlik-Stäbchen Fackelmann, Hersbruck
Kryo-Vials, 2 ml Greiner, Nürtingen 126263
Latex Handschuhe Zentralbestand TiHo
Rotilabo®
-Spritzenfilter, 0,22 µm Roth, Karlsruhe P666.1
Parafilm®
„M“ Heiland Vet, Hamburg 371-053
Spritzen
Terumo®
Einwegspritzen, 5 ml Heiland Vet, Hamburg 710-2096
Terumo®
Einwegspritzen, 10 ml Heiland Vet, Hamburg 710-2094
Terumo®
Einwegspritzen, 20 ml Heiland Vet, Hamburg 710-2092
Transcoject Einmalspritzen, 30 ml Tierärztebedarf Hannover 60.530
Zellkultur
Gewebekulturflaschen, 50 ml Greiner, Nürtingen 690160
Gewebekulturflaschen, 250 ml Greiner, Nürtingen 658170
185
8.8 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 2-1: Genomorganisation von Pestiviren................................................................... 3
Abbildung 2-2: Schematische Darstellung des intrinsischen und extrinsischen Weges der
plasmatischen Blutgerinnung ........................................................................................... 29
Abbildung 2-3: Stark schematisierte Darstellung der Fibrinbildung. ...................................... 29
Abbildung 2-4: Schematische Darstellung des Fibrinolysesystems ........................................ 30
Abbildung 4-1: Hämorrhagische Symptome in der Finalphase der KSPV-Infektion.............. 74
Abbildung 4-2: Klinischer Symptome im Verlauf der KSPV-Infektion.................................. 75
Abbildung 4-3: Charakteristische pathologisch-anatomische Befunde ................................... 77
Abbildung 4-4: Leukozytenzahlen der Tiere 153 - 159 im Versuchsverlauf........................... 82
Abbildung 4-5: Leukozytenzahlen der Tiere 175 – 181 im Versuchsverlauf .......................... 82
Abbildung 4-7: Thrombozytenzahlen der Tiere 175 – 181 im Versuchsverlauf ..................... 83
Abbildung 4-8: Mittleres Thrombozytenvolumen für die Tiere 175 bis 181 im
Versuchsverlauf................................................................................................................ 84
Abbildung 4-9: Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung. Die aPTT im Verlauf der KSPV-
Infektion. .......................................................................................................................... 87
Abbildung 4-10: Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung. Thrombinzeit im Verlauf der
KSPV-Infektion................................................................................................................ 87
Abbildung 4-11: Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung. Prothrombinzeit im Verlauf der
KSPV-Infektion................................................................................................................ 87
Abbildung 4-12: Globaltests der Gerinnung. Ergebnisse der aPTT-Bestimmung................... 88
Abbildung 4-13: Globaltests der Gerinnung. Ergebnisse der Thrombinzeitbestimmung........ 88
Abbildung 4-14: Globaltests der Gerinnung. Ergebnisse der Prothrombinzeitbestimmung.... 88
Abbildung 4-15: Fibrinogenkonzentrationen für die Tiere 153 bis 159 .................................. 90
Abbildung 4-16: Fibrinogenkonzentrationen für die Tiere 175 bis 181 .................................. 90
Abbildung 4-17: Einzelfaktorenbestimmung. Faktor-II-Aktivität. .......................................... 92
Abbildung 4-18: Einzelfaktorenbestimmung. Faktor-V-Aktivität........................................... 92
Abbildung 4-19: Einzelfaktorenbestimmung. Antithrombin-III-Aktivität. ............................. 92
Abbildung 4-20: Temperaturkurven für die Gruppen I und II. ................................................ 94
Abbildungsverzeichnis 186
Abbildung 4-21: Gruppenmittelwerte für den CS beider Tiergruppen .................................... 95
Abbildung 4-22: Pathologisch-anatomische Veränderungen der Tiere beider Gruppen ......... 97
Abbildung 4-23: Gruppenmittelwerte für die Leukozytenzahlen beider Gruppen .................. 98
Abbildung 4-24: Thrombozytenmittelwerte für die Tiere beider Gruppen.............................. 99
Abbildung 4-25: Mittleres Thrombozytenvolumen für die Tiere beider Gruppen ............... 100
Abbildung 4-26: Large Platelets für die Tiere beider Gruppen. ............................................ 101
Abbildung 4-27: aPTT für die Tiere der Gruppen I und II .................................................... 103
Abbildung 4-28: Thrombinzeit für die Tiere der Gruppe II................................................... 103
Abbildung 4-29: Prothrombinzeit für die Tiere der Gruppen I und II ................................... 104
Abbildung 4-30: Fibrinogenkonzentration für die Tiere der Gruppen I und II...................... 105
Abbildung 4-31: Körpertemperatur im Versuchsverlauf für die Gruppen I und II................ 108
Abbildung 4-32: Clinical Score für die Gruppen I und II ...................................................... 109
Abbildung 4-33: Leukozytenzahlen für die Gruppen I und II................................................ 111
Abbildung 4-34: Thrombozytenzahlen für die Gruppen I und II im Versuchsverlauf .......... 112
Abbildung 4-35: aPTT für die Gruppen I und II .................................................................... 114
Abbildung 4-36: Thrombinzeit für die Gruppen I und II ....................................................... 114
Abbildung 4-37: Prothrombinzeit für die Gruppen I und II................................................... 114
Abbildung 4-38: Fibrinogenkonzentration für die Gruppen I und II. .................................... 115
Abbildung 8-1: Eichkurve aus einer PEG-Hirudin-Standardverdünnungsreihe .................... 169
Abbildung 8-2: Ecarin Clotting Time für die Tiere 182 bis 186 (Gruppe 1) ......................... 169
Abbildung 8-3: Verdünnungsreihe zur Ermittlung der optimalen Plasmavorverdünnung für die
Messung der aPTT mit Actin®
FS .................................................................................. 170
Abbildung 8-4: Kalibrationskurve zur Fibrinogenbestimmung ............................................. 171
Abbildung 8-5: Verlauf der ADP-induzierten Thrombozytenaggregation ............................ 171
Abbildung 8-6: Verdünnungsreihe zur Ermittlung der optimalen Plasmavorverdünnung für die
Messung der aPTT mit Actin®
FS .................................................................................. 172
187
8.9 Tabellenverzeichnis
Tabelle 2-1: Rezeptoren und weitere relevante Komponenten der Thrombozyten.................. 25
Tabelle 2-2: Substanzen des Endothels und Subendothels ...................................................... 26
Tabelle 3-1: Thrombozytenparameter, die mittels Sysmex F-800 untersucht wurden ............ 58
Tabelle 3-2: Fibrinogenverdünnungsreihe (Standardkurve). ................................................... 62
Tabelle 3-3: Gerinnungsansätze für die Fibrinogenbestimmung aus Plasma. ......................... 63
Tabelle 4-1: Wirkstoffe, Monitoringmethoden, Dosierungen und Ergebnisse der
pharmakokinetischen Vorversuche ................................................................................ 106
Tabelle 8-1: Ergebnisse der Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion und des Antigen-
ELISAs für die Tiere 153 bis 159 .................................................................................. 167
Tabelle 8-2: Ergebnisse der Virusisolierung für die Tiere 175 bis 181 ................................. 167
Tabelle 8-3: Antikörpernachweis in VNT und Antikörper-ELISA für die Tiere 153 bis 159.
........................................................................................................................................ 168
Tabelle 8-4: Antikörpernachweis in VNT und Antikörper-ELISA für die Tiere 175 bis 191.
........................................................................................................................................ 168
Tabelle 8-5: Nachweis der KSPV-Infektion .......................................................................... 170
Tabelle 8-6: Nachweis der KSPV-Infektion .......................................................................... 172
Tagungsbeiträge
Teile dieser Arbeit wurden vorab veröfffentlicht:
BLOME, S., A. MEINDL-BÖHMER, G. NOWAK und V. MOENNIG (2004):
Does disseminated intravascular coagulation (DIC) play a major role in the pathogenesis of
Classical Swine Fever? In: Annual Meeting of the "Gesellschaft für Virologie" Joint Meeting
with Società Italiana di Virologia, Tübingen, March 17–20, 2004, 208.
BLOME, S., A. MEINDL-BÖHMER, G. NOWAK, R. MISCHKE und V. MOENNIG
(2005): Characterisation of Coagulation Disorders occuring in the Course of Classical Swine
Fever using Thrombocyte Aggregation Inhibitors Clopidogrel and Acetyl Salicylic Acid.
In: Annual Meeting of the "Gesellschaft für Virologie", Hannover, Germany, March 16-19,
2005, 179.
BLOME, S., A. MEINDL-BÖHMER, G. NOWAK und V. MOENNIG (2005):
Characterisation of coagulation disorders occuring in the course of acute classical swine fever
virus (CSFV) infections using direct thrombine inhibitor Hirudin and thrombozyte
aggregation inhibitors Clopidogrel and acetyl salicylic acid.
In: 6th ESVV Pestivirus Symposium, Thun, Switzerland, 13 - 16 September 2005, 75.
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. V. Moennig für die Überlassung des Themas, die
wissenschaftliche Betreuung der Arbeit sowie die freundliche Aufnahme am Institut für
Virologie.
Ich danke Herrn Prof. Dr. G. Nowak und der Arbeitsgruppe „Pharmakologische
Hämostaseologie“ für die freundliche Unterstützung in allen hämostaseologischen Fragen und
Techniken, die geduldige Diskussionsbereitschaft sowie die Bereitstellung diverser
Reagenzien und Protokolle.
Frau Prof. Dr. I. Greiser-Wilke danke ich besonders dafür, dass sie die Zusammenarbeit mit
der AG „Pharmakologische Hämostaseologie“ durch ihr persönliches Engagement möglich
gemacht hat.
Frau Dr. A. Meindl-Böhmer danke ich für ihre stete Diskussionsbereitschaft, die
konstruktiven Vorschläge für die Überarbeitung des Schrifttums und ihre Hilfe und Betreuung
bei der Durchführung der experimentellen Arbeiten.
Dem Evangelischen Studienwerk e. V. Villigst danke ich für die finanzielle Unterstützung im
Rahmen eines Promotionsstipendiums.
Mein Dank gilt Prof. Dr. W. Baumgärtner, Institut für Pathologie TiHo Hannover, für die
Beratung in histopathologischen Fragen und die Erlaubnis, die Geräte des Instituts zu nutzen.
Insbesondere danke ich auch den Mitarbeiterinnen des Instituts Frau P. Grünig und Frau K.
Rohn für die Einarbeitung in die Anfertigung histopathologischer Präparate.
Ich danke Herrn Prof. Dr. R. Mischke und Herrn Prof. Dr. I. Nolte, Klinik für kleine Haustiere
TiHo Hannover, für die Beratung während der Ausarbeitung der Vorversuche und Herrn D.
Menzel für die freundliche Einarbeitung in die hämostaseologische Diagnostik.
Für die exzellente Pflege der Versuchstiere und die weit über das übliche Maß hinausgehende
Einsatzbereitschaft danke ich insbesondere Günter Thiem, Helmut Schulz und Monika Berg.
Ich danke Frau Gabriele Müller für die freundliche Einarbeitung in alle virologischen
Techniken und die umfassende und verständnisvolle Unterstützung während des gesamten
Projektes.
Meinen Mitdoktoranden Andreas Gavrilenko und Stefan von Rüden sowie Frau Dr. Stefanie
Bendfeldt danke ich für ihre Diskussionsbereitschaft, die Korrektur der schriftlichen Arbeit
und die moralische Unterstützung.
Ich danke Christina Fuest für die unermüdliche Hilfe bei der Aufarbeitung diverser Proben.
Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Instituts für Virologie gilt mein herzlicher Dank
für die freundliche Aufnahme und stete Hilfsbereitschaft.
Meinen Freunden und meiner Familie danke ich für ihre Geduld und Unterstützung.
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Zur Pathogenese der Klassischen
Schweinepest: Analyse der Blutgerinnungsstörung“ selbstständig verfasst habe.
Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:
• Die automatischen Schritte der Einbettung, Färbung und Eindeckung der
histopathologischen Präparate erfolgte am Institut für Pathologie der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten
(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir
unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im
Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt:
• Institut für Virologie, Europäisches Referenzlabor für Klassische Schweinepest
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen
Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der
Wahrheit entsprechend gemacht habe.
31.05. 2006
Sandra Blome