© eibenglaubitz 2008 Fetale Zellen im maternalen Blut Bernd Eiben Institut für Labormedizin und...

© eibenglaubitz 2008

Fetale Zellen im maternalen Blut

Bernd EibenInstitut für Labormedizin und Klinische Genetik Rhein Ruhrim Laborverbund wagnerstibbe45127 Essen


Eine exakte pränatale Diagnostik setzt gegenwärtig einen invasive Eingriff voraus.

CVS oder AmniocenteseAbortrisiko hierdurch ca. 1%

==> alternativ: fetale Anteile in der mütterlichen Zirkulation


Suche nach fetalen Zelle in der maternalen Zirkulation

4 Ansätze

Trophoblastzellen

fetale Leukozyten

fetale Erythroblasten

fetale DNA


erste Hinweise auf fetale Zellen

fand Trophoblastzellen in der Lunge von Patientinnen, die an Präeklampsie verstorben warenUntersuchung mittels histologischer Methoden100.000 Zellen/d

1893 durch Georg Schmorl:

Schmorl, G. (1893) Pathogisch-anatomische Untersuchungen über Publeraleklampsie. Vogel, Leipzig.


Trophoblastzellen in der mat. Zirkulation

Trophoblastzellen wurden 1994 erstmals zur Diagnostik einer Häminoglobinopathie verwendet.Hawes et al. (1994): An N Y Acad Sci 173: 181-185

Zellen werden aber in der Lunge absorbiertPlazenta weist viele Mosaike aufsind mehrkernig ==> kein Aneuploidieuntersuchung

Trophoblastzellen ungeeignet


fetale Lymphozyten im maternalen Blut

seit Ende 1960er Jahre Untersuchung der fet. LymphozytenUntersuchung mittels zytogenetischer Methoden

Lymphos sind leichter anzureichern und zu kultivieren

aber: die fetale Lymphocytenproduktion startet erst ab der ca. 20. SSW. schlechte Ausgangssituation für eine frühe Diagnostik.

aber: absolutes Überwiegen mütterlicher Leukocyten extreme Selektionsschwierigkeiten zwischen fetalen und maternalen Zellen


Untersuchungen von Bianchi et al. (1996) zeigten, dass männliche fetale T-Lymphocyten (CD 3+; CD 4+) nach 27 Jahren im Blut einer Frau gefunden wurden, die einen Jungen geboren hatte.

==> Lymphozyten sind nicht geeignet

fetale Lymphozyten im maternalen Blut


kernhaltige rote Blutzellen fehlen im Blut von Erwachsenen bzw. sind äußerst selten ==> bessere Detektionschance

haben eine Lebensdauer von nur ca. 90 d ==> können damit nicht aus einer vorherigen Schwangerschaft stammen.

Vorteile:

fetale Erythroblasten im maternalen Blut

Im 1. Trimenon stellen kernhaltige rote Blutzellen den größten Teil der kernhaltigen Zellen des Feten dar==> können in die maternale Zirkulation übertragen werden



fetale Erythroblasten : mononukleärgeeignete Oberflächenantigene

gesamtes fetale Genom ohne maternale Kontaminationen==> Mögliche Diagnostik von Punktmutationen

Vorliegen einer einzelnen fetalen Zelle==> mögliche FiSH Untersuchung

Vorteile:



Untersuchung der fetalen Erythroblasten über FiSH

Bianchi et al. (1992): Detection of fetal cells with 47,XY,+21 karyotype in maternal peripheral blood. Hum Genet 90: 368- 370

Valerio, D., Altieri, V., Cavallo, D., Aiello, R. and Antonucci, F.A. (2000) Detection of fetal trisomy 18 by short-term culture of maternal peripheral blood. Am. J. Obstet. Gynecol., 183, 222±225.



sehr hoher methodischer Aufwandgroße Kontaminationsgefahr mit maternalen ZellenAllel drop out (Fehlanalyse durch „nicht Amplifikation“ einzelner Loci bei Einzelzellanalysen)

Analytische Betrachtung



3000 klinische Fälle wurden in 5 Zentren mittels MACS oder FACS untersucht==> fetale Zellen konnten nur mit eine Sensitivität von 50% entdeckt werden Bianchi et al. (2002), Prenat. Diagn. 22: 609- 615

große NIFTY Studie (National Institute of Child Health and Developement Fetal Cell Isolation Study)



NIFTY Studie der NIH zeigte deutlich, dass die Anreicherung und Diagnostik aus

zirkulierenden fetalen Zellen mit den gegenwärtigen Techniken nicht praktikabel ist! Bianchi et al. (2002), Prenat. Diagn. 22: 609- 615

==> fetale DNA im maternalen Blut

Lo et al. (1997): Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 12: 1904- 1904


fetale DNA im maternalen Blut

Herkunft der cell free fetal DNA: Adoptosis von TrophoblastzellenBischoff et al. (2005). Hum Repro Update 11: 59- 67

Cell free fetal DNA (cff DNA) ist kürzer als cell free maternal DNA (cfm DNA): 99% cff DNA < 313 bp: Hauptanteil bei </= 145 bp

1. Präparation über Qiagen Säulen

2. Präparation über Gel Elektrophorese (MG)3. (Unterscheidung über unterschiedliche Methylierung)

Kann schon 7 Wochen post conceptionem analysiert werden

cff DNA wird sehr schnell pp vollständig abgebaut

3- 5% der freien DNA im maternalen Blut ist fetaler Herkunft



Aneuploidiediagnostik1) Der relative DNA Anteil eines jeden Chromosoms in der freien DNA müsste grundsätzlich gleich sein.Messung einzelner Chrom. 21 Marker und Vergleich zu Referenzmarkern anderer Chromosomen: Relative Chromosomen Dosis RODROD Verhältnis 2:2 = Euploid/ Verhältnis 3:2 = Aneuploid

2) Untersuchung chromosomenspezifischer Polymorphismen bei Vater & Mutter Allel Verhältnis (Allel Ratio AR) Bei euploidem Fetus Heterozygot ==> AR 1:1 bei aneuploidem Fetus ==> AR 2:1

Analysen mit hoher Sicherheit können mit nur mit multi copy Sequenzen vom Y Chromosom

erfolgen!!!!!

■ Schwangere, die eine Präeklampsie entwickeln, haben bereits Wochen vor Erkrankungsbeginn eine erhöhte Konzentration von fetalen Zellen und fetaler freier DNA im Blut. Zhong XY, Holzgreve W, Hahn S.: Circulatory fetal and maternal DNA in pregnancies at risk and those affected by preeclampsia. Ann N Y Acad Sci 2001; 945: 138–140. ■ 5 fach höhere cffDNA bei Schwangeren mit PräeklampsieLo et al.: Quantitative abnormalities of fetal DNA in maternal serum in PET. Clin chem 1999; 45; 184- 188

■ je höher die cffDNA Konzentration ist, desto schwerer der KrankheitsverlaufSchwinkel et al.: Hemolysis, elevated live enzymes and low platele count (HELLP) syndrome as a complication of PET...Clin Chem 2002; 48; 650-653


fetale DNA im maternalen Blutbei Präeklampsie



Mögliche sichere diagnostische Möglichkeiten: ==> fetales Geschlecht

sinnvoll? Ethisch problematisch==> fetaler Rhesusfaktor bei rh neg. Schwangeren

17% der Deutschen sind Rhesus D negativ0,4% unvollständige D Ausprägung

Deletion des Rh-D-Gens ist die häufigste Form bei Rhesus-D-negativen Europäerinnen.

Aber: Mehrheit der Rh-D-negativen afrikanischen Patientinnen tragen ein Pseudogen (RHDy) oder ein (C)cdes-Allel. In beiden Allelen sind Rh-D-spezifische Sequenzen vorhanden. Aufgrund der Anwesenheit eines Stop-Codons (RHDy) oder des Ersatzes der Rh- D-spezifischen Sequenzen bei Rh-CE-spezifischen Sequenzen ([C]cdes) keine D-Epitope auf den Erythrozyten feststellbar.

==> Sonderformen müssen mitberücksichtigt werden Molekülgrösse fetaler DNS von <300 bp zu beachten

Sensitivität von >99% erforderlich


fetaler Rhesusfaktor bei Rh D neg. Schwangeren

Wegen unterschiedlichen Varianten des Rh-D-Genes ist eine «Multiplex»-PCR notwendig, in welcher verschiedene Regionen des Rhesus-D-Genes amplifiziert werden.



Risiko einer Alloimmunisierungbei anti-RhD Prophylaxe post Partum: ca. 1% bei anti-RhD Prophylaxe pP & pränatal: 0,3%

Annahme: Rhesus Typisierung direkt nach Geburt96,7%: anti-RhD Prophylaxe nur bei pränatalem Nachweis Rh D pos.99,7%: anti-RhD Prophylaxe bei pränat. Nachweis Rh pos., unbestimmt & Rh. Varianten


FazitDie meisten Anwendungshoffnungen haben sich nicht erfüllt!

Realisierbar sind gegenwärtig die Bestimmung Marker wie Rhesus oder y Chromosom Anteile, die bei der ggf. Mutter nicht vorhanden sind!

Fetale Zellen/ DNA in der maternalen Zirkulation

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