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This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

BESTIMMUNG DER SEDIMENTATIONSKONSTANTE EINES INFEKTIÖSEN PRINZIPS 171

are not assumed to be integral constituents of the

virus and hence they were not taken into considera

tion in the diagram (Fig. 1).

The well known filamentous forms of influenza

virus apparently have a structure similar to that of

the spherical elementary body. There is less infecti-

vity, if any, combined with the filaments than with

the spheres, but more hemagglutinating capacity30.

The filaments could be disintegrated by ultrasonic

vibration, and only the HA-titer rose sharply without

corresponding rise in infectivity. Electron micro

graphs5 showed clearly that the filamentous forms

contained no dense central body like the spherical

forms. It seems very probable that the rod like forms

are enourmously elongated virus particles with pro

tein and lipid layers, with HA-subunits on the sur

face and also with a outer membrane. But they do

not seem to contain the CFA-subunits in the center

which would be necessary for infectivity. These fila

ments resemble in this respect the incomplete in

fluenza virus which recently was shown to contain

less CFA-subunits than complete virus particles36.

34 F. S. L ie f and W. H e n l e , Virology 2, 772 [1957].35 H . B . D o n a l d and A. I s a a c s , J. gen. Microbiol. 11, 325

[1954].36 F. S. L ie f and W. H e n l e , Virology 2, 782 [1957],

Bestimmung der Sedimentationskonstante eines infektiösen

Prinzips mit Nucleinsäurecharakter aus dem Virus der Maul- und

Klauenseuche mit Hilfe der Gradienten-Zentrifugation

Von K a r l S t r o h m a ie r und M a n f r e d M u ssg a y

Aus der Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere in Tübingen a. N.(Z. Naturforschg. 14 b, 171— 178 [1959] ; eingegangen am 23. Dezember 1958)

Es wird eine Methode zur absoluten Bestimmung der Sedimentationskonstante bei einer Gra- dienten-Zentrifugation beschrieben. Die Formeln zur Berechnung werden angegeben und am Beispiel eines Gradienten von D20 —H20 Mischungen wird gezeigt, wie die Funktion des Dichtegradienten gefunden und berechnet werden kann.

Mit Hilfe dieser Methode gelang es, die Sedimentationskonstante des infektiösen Prinzips mit Nucleinsäurecharakter aus dem Virus der Maul- und Klauenseuche zu bestimmen. Sie beträgt 37 S.Unter der Annahme der Gültigkeit der von G ie r e r abgeleiteten Beziehung entspricht dieser Wert einem Mol.-Gew. von 3,1-10®. Die sich daraus ergebenden weiteren Konstanten für das infektiöse Prinzip von Nucleinsäurecharakter und für das Virus der Maul- und Klauenseuche werden berechnet.

In einer ersten Arbeit1 hatten wir gezeigt, daß mit

der von G ie r e r und S c h r a m m 2 entwickelten Phenol

behandlung audi aus Homogenat von Jungmäusen,

die mit Maul- und Klauenseuche-Virus (MKS-Virus)

infiziert sind, ein infektiöses Prinzip von Ribo-

nucleinsäure-Charakter isoliert werden kann. Diese

infektiöse Komponente unterschied sich in mehreren

Eigenschaften von denen intakter Viruspartikel. Die

Unterschiede beziehen sich auf die relative Emp

fänglichkeit von Jungmäusen bei intracerebraler

und intraperitonealer Infektion, das Verhalten bei

Ribonuclease-Behandlung, die Stabilität bei 37° C

und die Neutralisation durch spezifisches Immun-

1 M . M u s s g a y u . K. S t r o h m a ie r , Zbl. Bakteriol., Parasitenkunde, Infektionskrankh. Hyg. I. Abt. Orig. 173, 163 [1958].

2 A. G ie r e r u . G . S ch ram m , Z. Naturforsdig. 11 b, 138 [1956].3 F. B r o w n , R. F. S e l l e r s u . D. L. S t e w a r t , Nature [Lon

don] 182, 535 [1958].

serum. Außerdem wiesen wir nach, daß die infek

tiöse Komponente des Nucleinsäure-Präparates die

genetische Information für die Bildung typenspezi

fischer Nachkommen trägt.

Inzwischen wurde ein Teil unserer Versuchsergeb

nisse von B r o w n und Mitarbb. 3 und d e B o er (per

sönliche Mitteilung) bestätigt, die aus MKS-Virus

material von Gewebekulturen mit der Phenolmethode

ebenfalls ein infektiöses Prinzip gewinnen konnten.

Die von anderen Autoren 4-6 bei Untersuchungen

von infektiösen Nucleinsäure-Präparaten aus dem

Poliomyelitis-Virus und aus Encephalitis-Viren er

haltenen Befunde haben wir früher1 schon disku-

4 I. S . C o l t e r , H. H. B i r d u . R. A. B r o w n , Nature [London] 1 7 9 , 859 [1957].

5 E. W e c k e r u . W . S c h ä f e r , Z. Naturforschg. 1 2 b . 416 [1957],

6 I. S . C o l t e r , H. H. B i r d , A. W . M o y e r u. R. A. B r o w n ,

Virology 4 , 522 [1957].

172 K. STROHMAIER UND M. MUSSGAY

tiert. Vor kurzem erschien noch eine weitere Mittei

lung von Alexander und Mitarbb." über infektiöse

Ribonucleinsäure aus dem Poliomyelitis-Virus.

Gierer8 9 stellte an der Ribonucleinsäure, die er

aus gereinigtem Tabakmosaik-Virus (TMV) gewon

nen hatte, verschiedene physikalische und chemische

Untersuchungen an, und konnte mit Hilfe von Vis-

kositäts- und Sedimentationsmessungen eine einfache

Beziehung zwischen der Sedimentationskonstante

und dem Mol.-Gew. angeben.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Sedimen

tationskonstante der infektiösen Komponente der

aus MKS infizierten Mäusen hergestellten Nuclein-

säure-Fraktion zu messen und unter Verwendung

der von Gierer8 angegebenen Beziehung auf das

Mol.-Gew. zu schließen.

Da wir von ungereinigtem Material ausgehen

mußten, ergab sich die Schwierigkeit, eine verschwin

dend kleine Menge, die sich durch Infektiosität aus

zeichnet, neben einer großen Menge Substanz ähn

lichen chemischen Aufbaues zu untersuchen. Außer

dem ist diese infektiöse Komponente sehr labil und

daher sind Infektiositätsmessungen nur mit begrenz

ter Genauigkeit möglich. Wir entwickelten aus die

sem Grunde eine Methode zur Messung der Sedimen-

dationskonstante bei einer Dichte-Gradienten-Zentri-

fugation, bei der Fehler in der Infektiositätsmes

sung nur mit geringem Gewicht in das Endergebnis

eingehen.

Material und Methode

Virus und Herstellung des Nucleinsäure-Präparates: Wir arbeiteten, wie bei früheren Versuchen1, mit Virus des C-Typs. Die Herstellung der Nucleinsäure-Präparate geschah nach der von Gierer und Schramm 2 angegebenen Methode durch Ausschütteln eines Gewebeextraktes mit Phenol. Die fertige, klare Nucleinsäure-Fraktion wurde bei 35 000 U/min 5 Min. zentrifugiert und der Überstand vorsichtig abgehebert. Dieser wurde bei den Versuchen verwendet und wird im folgenden als „Ausgangsmaterial“ bezeichnet.

Für Vergleichsmessungen mit nichtpräpariertem Virusmaterial gingen wir von Kulturvirus einer 22. Kulturpassage aus. Die Kulturflüssigkeit wurde mit m j90- NaCl-Phosphatpuffer 1 : 5 verdünnt, 15 Min. bei

7 H. E. A l e x a n d e r , G . K o c h , I. M . M o u n t a i n u . 0 . v a n D a m m e ,

J . exp. Medicine 108, 493 [1958].

8 A. G i e r e r , Z. Naturforschg. 13 b, 477 [1958].

9 A. G i e r e r , Z. Naturforschg. 13 b, 485 [1958].

10 L . J. R e e d u . H. M u e n c h , Amer. J. Hyg. 27, 493 [1938].

11 H . G . B a r b o u r u . W. H . H a m i l t o n , J. biol. Chemistry 69,625 [1926],

15 000 U/min zentrifugiert und der Überstand zum Versuch verwendet.

Infektiositätstest: Die Bestimmung des Infektiositätstiters erfolgte an 5 —6 Tage alten Mäusen. Wie früher beschrieben1, erhielten dabei die Mäuse Material einzelner Verdünnungsstufen i.e. injiziert. Wurde der zur Titerbestimmung nach R e e d und M u e n c h 10 notwendige untere Endpunkt nicht erreicht, berechneten wir die Konzentration an infektiösen Einheiten nach der Formel

v • pv worin l/v die Verdünnung und pv der Prozent-v

satz erkrankter Tiere in der Verdünnung l/v bedeutet.Dichtemessung: Die Dichte der einzelnen Fraktionen

bestimmten wir nach der Falltropfen-Methoden . Aus einer Kapillare wurden gleiche Tropfen von etwa 1 mm3 gedrückt und die Fallgeschwindigkeit in einer Flüssigkeit gemessen. Als Fallstrecke diente ein gerader, 50 cm langer Kühler, dessen Innenrohr das Fallmedium Tetralin enthielt und dessen Mantel mit einem Ultrathermostat auf 20° C gehalten wurde. Die Fallgeschwindigkeit wurde geeicht mit D20 — H20-Mischungen bekannter Zusammensetzung, deren Dichte pyknometrisch geprüft wurde.

Viskosität: Die Viskosität bestimmten wir mit einemO s t w a 1 d sehen Viskosimeter. Es zeigte sich, daß innerhalb der Meßgenauigkeit die Zähigkeit der D20 — H20- Mischungen dem Mischungsverhältnis entsprach12.

Gradienten-Zentrifugation: Da die zu untersu

chende Substanz nur durch ihre Eigenschaft der In

fektiosität vor der übrigen in der Ausgangslösung

vorhandenen RNS ausgezeichnet war, kam für die

Bestimmung der Sedimentationskonstante nur eine

biologische Methode in Frage. Dabei schieden alle

diejenigen Methoden aus, bei denen das Meßergeb

nis von einem genauen biologischen Test abhängt.

Wir entwickelten und prüften daher die absolute

Bestimmung bei der Gradienten-Zentrifugation.

Ähnliche Methoden sind vor allem von B r a k k e 13,14 beschrieben worden. Er benützte die Methode um

die Sedimentationskonstanten von Pflanzenviren

durch Vergleich mit Substanzen bekannter Sedimen

tationskonstante zu bestimmen. Während B r a k k e

mit Zuckergradienten arbeitet, benutzen wir einen

Gradienten aus Mischungen von D20 und H20. Das

hat den Vorteil, daß auch eine schwach verdünnte

Substanz an Mäusen getestet werden kann, ohne

Störungen des Testes durch zu hohen Zuckergehalt

befürchten zu müssen. Außerdem nimmt die Zähig

keit dieser Lösung nicht so schnell mit der Dichte zu,

12 G. N. L e w is u . R. T. M a c d o n a ld , J. Amer. chem. Soc. 55,4730 [1930] ; ref. bei R. F r e r ic h s , Ergehn, exakt. Natur-wiss. 13, 295 [1934].

13 M. K. B r a k k e , Virology 6, 96 [1958].14 M. K. B r a k k e , Arch. Biochem. Biophysics 45, 275 [1953].


so daß in kürzerer Zeit eine längere Sedimentations

strecke zu erreichen war, was für das Auflösungs

vermögen der Methode von Vorteil ist.

Nach der Zentrifugation heberten wir den Uber

stand stufenweise bis zu bestimmten Tiefen in ein

zelnen Fraktionen ab, führten damit den biologischen

Test und andere Messungen aus und bestimmten

so die örtliche Verteilung der Infektiosität nach der

Zentrifugation. Daraus ließ sich der Sedimentations

weg errechnen.

Theorie: Das Gesetz, das allen Sedimentations

messungen zugrunde liegt, sagt aus, daß die Ge

schwindigkeit des sedimentierenden Teilchens pro

portional der bewegenden Kraft und umgekehrt

proportional der Zähigkeit der Flüssigkeit ist. (Bei

der Größe der hier betrachteten Teilchen kann die

Diffusion noch vernachlässigt werden.)

Bei einer Sedimentation im Zentrifugalfeld heißt

dies:

(1)d R r o — o „ _— = r --— OJ R ,d« rj

wobei R = Abstand von der Drehachse,

o = Dichte des Teilchens,

q = Dichte der Flüssigkeit,

t = Zeit,

(ü = Kreisfrequenz,

F = Proportionalitätsfaktor ist.

Der hier benützte Faktor F hängt mit dem üblich be

nützten Formfaktor / durch die Gleichung F = V rj/f

zusammen. (V ist das Volumen des Teilchens.)

Sind Q und rj konstant, so folgt daraus durch

Integration die bekannte Grundgleichung für die

Sedimentationskonstante s

ln (Rl/R0)s = F

O-Q(2)

rj a>2 (*! — <(,) ‘

Sie wird in bekannter Weise auf Normalbedingun

gen, d. h. Sedimentation in Wasser von 20° C um

gerechnet.

Sedimentiert dagegen das Teilchen in einer Flüs

sigkeit, in der die Dichte Qr und die Zähigkeit

eine Funktion des Ortes R sind, so muß dies bei der

Integration berücksichtigt werden. Dann gilt

R R

d R

t) R „ — >{3)s 20 —

IX

f VßdR

J (o-Qz)R.

/a(Ä) dR

t

/&>2 df

wobei a(R) = Vr

(o — Qr ) R ■/und G = ü)2 dt ist.

£>020 und t]020 sind die Dichte und Zähigkeit von Was

ser von 20° C. Mit dieser Gleichung kann auch in

einem Medium wechselnder Dichte die Sedimenta

tionskonstante bestimmt werden, wenn die Funk

tion a(R ) bekannt ist.

Voraussetzung bei dieser Berechnung ist, daß die

Sedimentation ungestört, d. h. in radialer Richtung,

vor sich gehen kann und daß keine Konvektion

auftritt. Wir arbeiteten daher wie schon früher 15 mit

dem Rotor SW 39 mit ausschwingenden Bechern der

Spinco-Ultrazentrifuge „Model L“. Statt der Zellu

loidhülsen benützten wir Einsätze aus Plexiglas mit

sektorenförmigem Sedimentationsraum. Diese Zellen

halten eine Zentrifugalbeschleunigung von 1,5 • 105g

aus, wie sie bei 38 000 U/min auftritt, wenn sie in

den Aluminiumbechern in 0,2 ml Glycerin „schwim

men“.

Die Sektorenzelle reicht von 5,4 cm bis 9,1cm

Achsabstand, sie wurde jedoch meist nur bis 5,6 cm

Achsabstand gefüllt.

LösungD20

[%]

Einfüllhöhe

von bis

[cm] [cm]

Dichte w/50-Phos- phat bei 6° C

[g/cm3]

Zähii' keit

bei 6° [cP.]

Ausgangs 0 5,6 6,1 1,003* 1,48*lösung

1 25 6,1 6,7 1,028 1,602 44 6,7 7,3 1,048 1,693 61 7,3 7,9 1,066 1,764 76 7,9 8,5 1,082 1,835 90 8,5 9,1 1,097 1,89

Tab. 1. Zusammensetzung und Stufung der D20 —H20-Mi- schungen zur Einstellung des Dichtegradienten. Die Einfüllhöhen sind umgerechnet in Achsabstände bei der Zentrifugation. * Werte des reinen Puffers. Die Ausgangslösungen hatten eine etwas höhere Zähigkeit, die je nach der Konzentra

tion bei den einzelnen Präparationen etwas schwankte.

Den Gradienten stellten wir aus m/50-phosphat-

gepufferten Mischungen, pn-Wert von etwa 7,2,

von schwerem und leichtem Wasser her. In der

Tab. 1 sind die Zusammensetzungen angegeben, zu

sammen mit der Dichte und Zähigkeit und der Ein

füllhöhe. (Die Schichttiefen in der Zelle sind hier

15 K. S t r o h m a ie r u. Th. Z im m e rm a n n , Z . Naturforschg. 13 b, 234 [1958].


und im folgenden als Achsabstände, bei aus

geschwungenen Bechern, angegeben.)

Die so vorbereiteten Zellen standen eine Stde.

lang bei 4° C. Wie die nachfolgend beschriebenen

Versuche zeigen, reicht diese Zeit aus, um einen

gleichmäßigen Gradienten zu schaffen. Danach

wurde eine 0,5 cm hohe Schicht der zu untersuchen

den Flüssigkeit überschichtet und nach dem Austarie

ren der Becher sofort zentrifugiert.

Die genaue Wirkung G = J oj2 df wurde, wie in

1. c. 15 beschrieben, berechnet und An- und Auslauf

mitberücksichtigt. Der Rotor wurde vor dem Ver

such auf eine Temperatur von 6° C gebracht und die

Temperatur des Rotortopfes so eingestellt, daß bei

der betreffenden Umdrehungszahl der Rotor eine

konstante Temperatur von etwa 6° C behielt. Nach

der Zentrifugation maßen wir die Rotortemperatur

mit einem Thermoelement. Eine größere Abwei

chung der Temperatur vom Sollwert wurde bei der

Berechnung berücksichtigt.

Nach der Zentrifugation heberten wir den Uber

stand aus den Zellen stufenweise in mehrere eis

gekühlte Röhrchen ab. Diese einzelnen Fraktionen

prüften wir in der oben beschriebenen Weise auf

ihre Infektiosität, UV-Absorption und Dichte.

Bestimmung des Gradienten: Um die Gl. (3) an

wenden zu können, muß die Funktion <x{R) bekannt

sein. Wir bestimmten sie auf folgende Weise:

Für die Diffusions-Meßeinrichtung konstruierten

wir eine sektorenförmige Meßzelle, die in gleichen

Höhen dieselben Flächen besitzt wie die Zentrifugen

zelle. In diese Zellen füllten wir in derselben Weise

D20 — H20-Mischungen ein wie es in Tab. 1 an

gegeben ist.

Die Vermischung der Lösungen wurde im Strah

lengang nach P h i l p o t - S v e n s o n beobachtet.

Nach einer Stde. wurde auf den eingestellten Gra

dienten noch einmal reines Wasser geschichtet, dar

auf noch einmal 2 Stdn. der Konzentrationsverlauf

beobachtet.

In Abb. 1 sind einige Aufnahmen der Dichte

gradienten dargestellt und ausgerechnet. Die Höhe

der Diffusionszelle ist auf der Abszisse aufgetragen

und in die betreffenden Achsabstände der Zen

trifugenzelle umgerechnet. In der linken Reihe

sind die aufgenommenen Gradientenkurven wieder

gegeben. Aus der obersten Kurve ist ersichtlich, daß

die angewandte Technik zu gleichmäßigen Stufen

führte. Die darunterliegende Kurve zeigt, daß sich

nach einer Stde. der Gradient schon so ausgeglichen

hat, daß die Stufen kaum mehr zu erkennen sind.

Die nächste Kurve zeigt die Überschichtung mit Was

ser. Die Aufnahme wurde etwa zu der Zeit gemacht,

zu der die Zentrifugenzelle in die Zentrifuge kommt.

Die nächste Aufnahme ist nach der halben Zentrifu

gationszeit und die letzte zu dem Zeitpunkt auf

genommen, zu dem die einzelnen Fraktionen aus der

Zentrifugenzelle entnommen wurden. Die rechte

Reihe gibt den durch Integration des Gradienten er

haltenen Konzentrationsverlauf der eben besproche

nen Aufnahme wieder. An der rechten Ordinate sind

die Volumenprozent D20, an der linken Ordinate

die Dichte Q und Viskosität r\ der m/50-phosphat-

gepufferten Mischungen bei 6° C aufgetragen. Um

zu prüfen, ob die Diffusion in der ruhenden Dif

fusionszelle genau so vor sich geht wie in einer

Zentrifugenzelle während der Zentrifugation, füllten

wir von denselben Lösungen in derselben Weise auch

eine Zentrifugenzelle und zentrifugierten von der

64. bis 175. Min. nach dem Einfüllen des ersten

Gradienten bei 35 000 U/min. Nach der Zentrifuga

tion wurden sowohl die Diffusionszelle als auch die

Zentrifugenzelle stufenweise in einzelnen Fraktio

nen abgenommen und die Dichten der Lösungen be

stimmt. In Abb. 1 sind in der untersten Kurve rechts

die erhaltenen Stufen der Zentrifugenzelle als ge

strichelte Gerade eingetragen. Die Übereinstimmung

kann als sehr gut bezeichnet werden, und es konn

ten auch beim Dichtevergleich der einzelnen Fraktio

nen außerhalb der Fehlerbreite keine Abweichungen

festgestellt werden.

Aus den Kurven der Abb. 1 können nun die

Werte zur Berechnung des Integrals im Zähler der

Gl. (3) entnommen werden. Als freier Parameter

geht nur noch die Dichte des sedimentierenden Teil

chens ein. In Abb. 2 ist der Wert dieses Integrals

normiert mit dem Faktor o — Q020/r]020 als Funktion

des Achsabstandes R dargestellt. Als Parameter sind

die Dichten von Nucleinsäure und von Haemocyanin

1,67 und 1,348 g/cm3 zu den beiden Kurven ge

schrieben. Der letztere Wert wurde aus den Daten

einer Arbeit von S v e d b e r g und E r ik s o n -Qu en sel 16

berechnet. Es braucht nur der Sedimentationsweg an

der Abszisse abgegriffen zu werden, dann gibt die

Ordinatendifferenz sofort den Wert s20 * G wieder.

Genau genommen müßte, wegen der noch andauern

den Diffusion, für jedes Zeitintervall eine geson

derte Kurve ausgerechnet werden. Es zeigt sich je

doch, daß die Kurven so wenig voneinander unter

schieden sind, daß, ohne Beeinträchtigung der Meß-

j = 4 min

i = 60 min

j = 65 min 2= 5 min

j = 112 min 2= 52 min

! = 180 min 2= 120 min

Abb. 1. Zur Berechnung der Dichtefunktion der D20 —H20-Mischungen. Die linke Spalte gibt den Gradienten in Funktion des Radius wieder, die rechte den durch Integration erhaltenen Konzentrations-Verlauf, tj ist die Zeit der Aufnahme nach

Einfüllen des Gradienten, f2 die Zeit nach dem Uberschichten.


genauigkeit, eine mittlere Kurve ausreicht. Die in

Abb. 2 dargestellten Kurven sind aus zwei Grund

kurven der Art von Abb. 1 errechnet. Von R = 5,6

bis 6,4 cm stammen sie aus einer Grundkurve der

ersten Hälfte, der nachfolgende Verlauf aus einer

Kurve der zweiten Hälfte der Zentrifugation.

Die Kurve in Abb. 2 mit dem Parameter

1,67 g/cm3 steigt nahezu linear an. Ihre Steigung

schwankt nur um 10 Prozent. Daraus folgt, daß der

Gradient so eingestellt ist, daß ein einheitlicher Stoff

dieser Dichte mit konstanter Breite durch die Zelle

sedimentiert. Wäre die Kurve nach oben gekrümmt.

Abb. 2. Darstellung der Funktion

S2<>-C= -~L°20 ^ Vb

Vo20 J (o — Qs) R5,6

d R .

Die beiden Parameter bedeuten die Dichte o der sedimentie-renden Substanz, für die die Funktion berechnet wurde.

so wäre eine Verengung, bei einer Krümmung nach

unten eine Verbreiterung der Sedimentationszone zu

erwarten. Bei einer zu hohen Konzentration des

sedimentierenden Materials kommt es noch dadurch

zu einer Verbreiterung, daß beim Einwandern der

Teilchen in eine unterhalb liegende Schicht eine Zone

entstehen kann, die eine größere mittlere Dichte als

die darunterliegende besitzt. Die dadurch entste

hende Konvektion schafft eine verbreiternde, nach

unten verwaschene Übergangszone.

Prüfung der Methode mit Haemocyanin: Um die Brauchbarkeit der Methode zu prüfen, überschichteten wir mit einer verdünnten Haemocyaninlösung von Helix pomatia. Der pn-Wert war bei diesem Versuch auf 6,1 eingestellt. Wir zentrifugierten diese Lösung ebenfalls bei 6° C, jedoch nur mit 26 000 U/min. Der Ort der Substanz nach der Zentrifugation konnte im Streulicht nach B rakke 13 gut beobachtet werden. Die obere Kante ist dabei scharf, die untere Grenze etwas verwaschen. Es wurde sowohl der Abstand des Meniskus von der im Streulicht beobachteten oberen Kante gemessen als auch, entsprechend den anderen Versuchen, in verschiedenen Höhen abgehebert und die UV-Absorption der

Methode

Sedimentationsweg von bis [cm] [cm]

s20 ' GrS20

[S]

Beobachtung im Streulicht. Wanderung der oberen Kante 5,60 7,42 0,500 106

Bestimmung der Konzentration der Fraktionen durch UV-Messung bei 345 m[x 5,85 7,59 0,485 104

Optische Messung im analytischen Rotor 105

Tab. 2. Prüfung der Gradienten-Zentrifugations-Methode mit Hämocyanin von Helix pomatia. Zentrifugationstemperatur:

6° C. ph : 6,1, G = 4,654 • 1010 sec-1.

Fraktionen bei 345 und 280 m/x bestimmt. Die Werte sind in Tab. 2 zusammengestellt. Dieselbe Lösung wurde, etwas weniger stark verdünnt, auch im analytischen Rotor der Phywe-Ultrazentrifuge gemessen. Dabei konnte die Einheitlichkeit der Substanz geprüft werden. Die Werte zeigen unter sich eine gute Übereinstimmung, sind jedoch um ein Geringes größer als die von S vedberg und seiner Schule16 angegebenen Werte des Haemocyanins von Helix pomatia im Rereich um pH 6,1, der eine Sedimentationskonstante von 99 S fand.

Experimentelles Ergebnis

Zur Messung der infektiösen Komponente von

Nucleinsäurecharakter verfuhren wir ebenso wie

oben beschrieben. In Abb. 3 sind die Ergebnisse von

drei Zentrifugationen mit annähernd gleicher Zentri

fugationswirkung G wiedergegeben. Die ausgezoge

nen Kurven zeigen die Verteilung der Konzentration

an infektiösen Einheiten, die gestrichelten die UV-

Extinktion bei 260 mju. Der Ordinatenmaßstab be

zieht sich auf die UV-Extinktion der unverdünnten

Lösung. Die Infektiosität ist in willkürlichen Ein

heiten aufgetragen. Die Fläche über einem Radius

intervall ist immer proportional der Stoffmenge in

dem zugehörigen Volumenintervall der Zelle. Zur

Bestimmung des Sedimentationsweges berechneten

wir den Schwerpunkt der Infektiosität so, daß sich

auf beiden Seiten gleich viele infektiöse Einheiten

befanden. Er ist in Abb. 3 mit S gekennzeichnet. Den

Schwerpunkt der Aktivität des überschichteten Aus

gangsmaterials am Anfang des Versuches bestimm

ten wir aus den geometrischen Daten. Der Sedimen

tationsweg gibt, in Abb. 2 auf der Abszisse abgetra-

16 T. S v e d b e r g u . J. B. E r ik s s o n -Q u e n s e l , Nature [London]137, 400 [1936].


Sedii

Nr tatior von

j [cm]

men-lsweg

bis[cm]

G = J w2 dt• 1010 [sec-1]

s20 ' ^S20

[S]

1 j 5,8 8,2 16,75 0,62 372 5,8 6,8 9,85 0,30 313 5,9 7,4 10,49 0,39 374 5,9 7,6 10,63 0,435 415 5,9 7,5 10,51 0,395 38

Mittelwert 37

Tab. 3. Zusammenstellung der Zentrifugationsdaten von 5 Versuchen. Die Versuche 3, 4 und 5 sind in Abb. 3

dargestellt.

cm'

Abb. 3. Aufzeichnung der Meßergebnisse bei 3 Zentrifugationen. Auf der Abszisse sind die Stufen eingetragen, wie die Fraktionen abgenommen und ausgetestet wurden. Die Ordinate ist geteilt in Einheiten der UV-Extinktion bei ̂ = 260 m/u, gemessen in 1-cm-Kiivetten. Der horizontal schraffierte Bereich gibt die Lage der Ausgangslösung vor der Zentrifugation wieder. Die Höhe entspricht der UV-Extinktion, jedoch in einem 1 : 10 verkleinerten Maßstab. Die gestrichelte Kurve zeigt den Verlauf der UV-Extinktion, die ausgezogene, schräg schraffierte Kurve den Ort der Infektiosität in beliebigen

Einheiten nach der Zentrifugation.

gen, zusammen mit der Zentrifugationswirkung G

sofort die gesuchte Sedimentationskonstante. In

Tab. 3 sind einige der gewonnenen Werte zusam

mengestellt. Der Mittelwert aus fünf Messungen

beträgt

ä20 = 37 S .

Es zeigte sich immer wieder, daß die Infektiosität

von den in der Lösung enthaltenen UV absorbieren

den Substanzen am schnellsten sedimentierte. Aus

Abb. 3 ersieht man, daß die Infektiosität erst dort

ihren Höhepunkt erreicht, wo die UV-Absorption

schon sehr stark abgeklungen ist. Es folgt daraus,

daß die in der Lösung vorliegenden Begleitsubstan

zen ein geringeres Mol.-Gew. besitzen und langsamer

im Zentrifugalfeld wandern als die infektiöse Kom

ponente. Dieser Umstand ergibt die Berechtigung

zur Annahme, daß keine Extrapolation auf unend

liche Verdünnung notwendig ist, da die infektiöse

Komponente sofort in reinen Puffer sedimentiert.

Die Absorptionsspektren der Fraktionen gleichen

alle dem von Nucleinsäure, nur in der Fraktion von

8,3 — 8,7 cm tritt ein etwas anders geartetes Spek

trum auf. Dieser Fraktion entspricht annähernd eine

Sedimentationskonstante von s2o = 70S. Sie zeigte

jedoch keine Infektiosität.

Wir stellten mit MKS-Kulturvirus, das nicht der

Phenolbehandlung unterworfen war, ebenfalls eine

Gradienten-Zentrifugation in derselben Weise an.

Dabei zentrifugierten wir jedoch nur mit

G = 3,313 • IO10 sec-1.

Die erste Fraktion, die Virus enthielt, befand sich

in einer Tiefe von 7,2 — 7,6 cm Achsabstand. Am

Beginn befand sich das Ausgangsmaterial zwischen

5,6 und 6,1 cm. Aus Abb. 2 ergibt sich daraus nach

der Temperaturkorrektur eine Sedimentationskon

stante von mindest 136 S. Es ist dies ein Beweis

dafür, daß die Infektiosität in den Nucleinsäure-

Präparaten nicht von noch übriggebliebenem Virus

herrühren kann. Rechnet man aus, wie weit das

Virus gewandert wäre bei einem G = 10,5 • IO10 sec-1,

wie es bei den in Abb. 3 dargestellten Nucleinsäure-

versuchen angewandt wurde, so käme man auf einen

Sedimentationsweg von über 5 cm, d. h., es konnte

sich kein Virus mehr in den Nucleinsäure-Fraktio-

nen befinden.

Bei den Infektiositätstests mit Material der zen

trifugierten Fraktionen zeigte es sich auch, daß die

Zahl der spezifisch gestorbenen Mäuse mit der Ver

dünnung des Infektionsmaterials abnahm. Bei un

seren früheren Versuchen1 hatten wir die Beobach

tung gemacht, daß in den ersten Verdünnungsstufen

der Prozentsatz der infizierten Tiere kleiner war als

bei den folgenden noch infektiösen Verdünnungen.

178 BESTIMMUNG DER SEDIMENTATIONSKONSTANTE EINES INFEKTIÖSEN PRINZIPS

Es scheint, daß in der Ausgangslösung ein niedrig

molekularer Inhibitor wirksam ist, der die vorhan

dene infektiöse Komponente blockieren kann. Bei

der Zentrifugation werden die Stoffe getrennt und

die infektiöse Komponente kann ungehindert zur

Wirksamkeit kommen. Mit dieser Erklärung würde

auch folgende Erfahrung übereinstimmen: Bei den

Zentrifugations-Versuchen wurden Kontrollen des

Ausgangsmaterials während der Zentrifugation im

Thermostat auf 6° C gehalten und nach der Zentri

fugationszeit ebenfalls entnommen und ausgetestet.

Diese Kontrollen zeigten in der Regel eine geringere

Infektiosität als die zentrifugierten, abgeheberten

Fraktionen.

Diskussion

Geht man von der Annahme aus, daß die von uns

untersuchte infektiöse Komponente von Nuclein-

säurecharakter von derselben Struktur wie die von

G ie r e r 8 untersuchte RNS von TMV ist, so kann mit

der von G ie r e r angegebenen Formel das Mol.-Gew.

bestimmt werden. Er stellte fest, daß bei hochmole

kularer RNS das Mol.-Gew. M durch die Beziehung

M = 1 1 0 0 . 52’2 mit der Sedimentationskonstante

verbunden ist. Diese Beziehung sollte annähernd

auch für die von uns betrachtete Substanz gelten.

Setzt man den von uns gefundenen Wert in die For

mel ein, so ergibt sich ein Mol.-Gew. von

M = 3,1 • 106 .

Berechnet man daraus die Masse des Teilchens,

so ergibt sich ein Wert von etwa 0,51-1017g. Da

die Dichte von RNS 1,67 g/cm3 beträgt, kann das

Volumen berechnet werden, das diese infektiöse

Komponente von Nucleinsäurediarakter einnimmt.

Man kommt dabei auf 3 • 10-18 cm3. Aus der Arbeit

von B a ch ra c h und B r e e s e 17 ist bekannt, daß das

Virus der MKS ein kugelförmiges Teilchen mit

einem Durchmesser von 22 m/u ist. Sein Volumen

beträgt damit 5,56 * 10-18 cm3. Subtrahiert man

davon den oben berechneten Rauminhalt für die

Nucleinsäure, so ergibt sich, daß für das Viruspro

tein nurmehr 2,56 * 10~ 18 cm3 verbleiben. Wird nun

noch vorausgesetzt, daß die Dichte des Virusproteins

der des Proteins beim TMV entspricht und ebenfalls

1,33 g/cm3 beträgt, so findet man schließlich, daß

das gesamte Virusteilchen eine Masse von

8 ,4 ‘ 10~18g besitzt und damit ein Mol.-Gew. von

5,1 * 106. Der prozentuale Anteil der Komponente

von Nucleinsäurediarakter beträgt damit 65%

und das spezifische Volumen des Virusteilchens

0,66 cm3/g.

Für gewissenhafte Assistenz bei den biologischen Versuchen danken wir Frau G isela L ed erh ilger und unserer feinmechanischen Werkstatt unter Leitung von Herrn O ehlmann für die präzise Ausführung der Zentrifugenzelle und anderer technischer Hilfsmittel.

17 H. L. B a c h r a c h u . S. S. B r e e s e Jr., Proc. Soc. e x p . Biol.Med. 97, 659 [1958].

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