· 2008. 5. 27. · Methodenentwicklung zur gaschromatographisch-massenspektrometrischen Analyse...

Methodenentwicklung zur gaschromatographisch-

massenspektrometrischen Analyse freier faecaler Sterole und

Gallensäuren im Single Ion Monitoring;

Einfluss von Nahrungssupplementen auf die Exkretion

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

vorgelegt dem Rat der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät

der Friedrich-Schiller-Universität Jena

von Diplomchemikerin Sylvia Keller

geboren am 10. November 1974 in Mühlhausen

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG UND ZIELSTELLUNG 1

2 ALLGEMEINE BETRACHTUNGEN 3

2.1 Chemie, Physiologie und Analytik faecaler Steroide 3

2.1.1 Faecale Sterole 3

2.1.1.1 Struktur und Physiologie 3

2.1.1.2 Darmflora und bakterielle Metabolisierung von Cholesterol 4

2.1.1.3 Analytische Voraussetzungen zur Sterolbestimmung 7

2.1.2 Gallensäuren 9

2.1.2.1 Struktur und Physiologie 9

2.1.2.2 Modifikation der Gallensäuren durch die Intestinalflora 10

2.1.2.3 Analytische Voraussetzungen zur Gallensäurenbestimmung 13

2.2 Wechselwirkungen der faecalen Steroide - Einfluss der

Ernährung 19

2.2.1 Pathogene Wirkung und Cholesterolmetabolismus 19

2.2.1.1 Toxizität 19

2.2.1.2 Cholesterol- und Gallensäurenmetabolismus 21

2.2.2 Einfluss von Nahrungsfaktoren auf die Steroidexkretion 23

2.2.2.1 Calcium 23

2.2.2.2 Probiotika 24

3 ENTWICKLUNG DER ANALYSENMETHODEN 27

3.1 Faecale Sterole 27

3.1.1 Probenvorbereitung 27

3.1.2 Analyse mit GC/MS QP 5000 27

3.1.2.1 Probleme der gaschromatographischen Analyse 27

3.1.2.2 Probleme der massenspektrometrischen Detektion 28

3.1.2.3 Messparameter 31

3.1.3 Präzision und Richtigkeit 33

Inhaltsverzeichnis

3.1.4 Vergleich der Ergebnisse zwischen derivatisierten und

freien Sterolen 34

3.1.5 Kalibration faecaler Sterole 35

3.1.6 Interner Standard: 5α-Cholestan 35

3.2 Faecale Gallensäuren 37

3.2.1 Probenvorbereitung 37

3.2.2 Analyse mit GC/MS QP 5000 37

3.2.2.1 Probleme der gaschromatographischen Analyse 37

3.2.2.2 Probleme der massenspektrometrischen Detektion 38

3.2.2.3 Messparameter 41

3.2.3 Präzision und Richtigkeit 43

3.2.4 Kalibration der Gallensäuren 44

3.2.5 Interner Standard: Hyodeoxycholsäure 45

4 HUMANSTUDIEN 46

4.1 Supplementation von Calciumphosphaten 46

4.2 Supplementation von probiotischer Rohwurst 48

4.3 Supplementation von probiotischem Joghurt 48

4.4 Stuhlproben und in der Auswertung berücksichtigte

Parameter 49

4.5 Statistik 50

5 ERGEBNISSE 51

5.1 Studie 1 - Supplementation von Calciumphosphaten 51

5.2 Studie 2 - Supplementation von probiotischer Rohwurst 54

5.3 Studie 3 - Supplementation von probiotischem Joghurt 57

5.4 Studie 4 - Supplementation von probiotischem Joghurt 63

5.5 Studienübergreifende Ergebnisse 69

Inhaltsverzeichnis

6 DISKUSSION 70

6.1 Analysenmethoden 70

6.2 Steroidgehalte in der Trockensubstanz und die tägliche

Exkretion 77

6.3 Der Einfluss von Calcium und Probiotika auf die Steroid-

ausscheidung 83

6.4 Serumcholesterol und faecale Steroide 90

7 SCHLUSSFOLGERUNGEN 93

8 ZUSAMMENFASSUNG 95

Quellenverzeichnis I - XVI

Selbständigkeitserklärung

Lebenslauf

Danksagung

Abbildungsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis Abbildung 1 Grundgerüst und Struktur bedeutender faecaler Sterole 3

Abbildung 2 Metabolisierung von Cholesterol durch die Intestinalflora 6

Abbildung 3 Grundgerüst und Struktur bedeutender Gallensäuren 9

Abbildung 4 Metabolisierungsreaktionen an Gallensäuren durch die

Darmflora 12

Abbildung 5 Alkylesterbildung an der Carboxylgruppe freier Gallensäuren 14

Abbildung 6 Silylierungsreaktion an Hydroxygruppen des Steroidgerüstes 15

Abbildung 7 Cholesterol- und Gallensäurenmetabolismus 22

Abbildung 8 Fällung von Gallensäuren und Cholesterol durch Calcium-

phosphat-Komplexe 23

Abbildung 9 Probiotikawirkung im Colon 25

Abbildung 10 Chromatogramme eines Sterolstandardgemisches 28

Abbildung 11 Massenspektren faecaler Sterole 29

Abbildung 12 Separation von Cholesterol und Coprostanon im SIM- und

TIC-Modus 30

Abbildung 13 Temperaturverlauf zur Gaschromatographie faecaler Sterole 31

Abbildung 14 Sterolchromatogramm einer Faecesprobe 32

Abbildung 15 Vergleich der Ergebnisse von derivatisiertem und freiem

Cholesterol in einer internationalen Laborvergleichsunter-

suchung mit 20 Teilnehmern nach DGF [2001] 34

Abbildung 16 Beziehung zwischen dem Analysenergebnis und dem

Analysenwert von Cholesterol 36

Abbildung 17 Übereinanderliegende Darstellung der Chromatogramme

von 3-Oxo-LCA und 12-Oxo-DCA 38

Abbildung 18 Chromatogramm eines Gallensäurenstandardgemisches 38

Abbildung 19 Massenspektren faecaler Gallensäuren 39

Abbildung 20 Chromatogramm (MIC) von Cholsäurestandard und Chol-

säure in den Faeces 40

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 21 Vermutliche Isomere der DCA 41

Abbildung 22 Gallensäurenchromatogramm einer Faecesprobe 42

Abbildung 23 Beziehung zwischen dem Analysenergebnis und dem

Analysenwert von DCA bzw. internem Standard 45

Abbildung 24 Struktur einer Studienperiode 49

Abbildung 25 Steroidexkretion der Probanden 24 und 25 in Studie 1 52

Abbildung 26 Sterolkonzentrationen in der Gefriertrockensubstanz 52

Abbildung 27 Tägliche Steroidexkretion in Abhängigkeit von der

Verzehrsreihenfolge der Joghurts 59

Abbildung 28 Zusammenhänge zwischen den Konzentrationen an Serum-

cholesterol und primärer Gallensäuren im Stuhl 61

Abbildung 29 Vergleich der täglichen Gallensäurenexkretion und Serum-

cholesterolkonzentrationen unter Berücksichtigung der

Verzehrsreihenfolge der Joghurts und in Abhängigkeit vom

Fettstoffwechsel 62

Abbildung 30 Tägliche faecale Steroidexkretion in Abhängigkeit von der

Verzehrsreihenfolge der Joghurts 66

Abbildung 31 Zusammenhänge zwischen den Konzentrationen an Serum-

cholesterol und primärer bzw. sekundärer Gallensäuren

im Stuhl 67

Abbildung 32 Beziehung zwischen Gehalten an Cholesterol und Copros-

tanol in der Stuhltrockensubstanz 69

Abbildung 33 TIC und MIC eines Sterolstandardgemisches 70

Abbildung 34 Chromatogramm faecaler Steroide nach BATTA et al. [1999] 73

Abbildung 35 Chromatogramm faecaler Gallensäuren nach SETCHELL et al.

[1983] 74

Abbildung 36 Fragmentierung der Sterole und Gallensäuren 75

Abbildung 37 Änderungen im Cholesterol- und Gallensäurenmetabolismus 91

Tabellenverzeichnis

Tabellenverzeichnis Tabelle 1 Übersicht zum Bakterienprofil des Gastrointestinaltraktes 5

Tabelle 2 Parameter der Gallensäurenanalyse - Literaturübersicht 15

Tabelle 3 Elutionsreihenfolgen von Gallensäuren verschiedenen

Ursprungs 16

Tabelle 4 Molare Massen freier und derivatisierter Gallensäuren 17

Tabelle 5 Interne Standards zur Gallensäurenquantifizierung 18

Tabelle 6 Auswahl spezifischer Fragmente zur SIM-Detektion der

Sterole 30

Tabelle 7 Retentionszeiten der faecalen Sterole 32

Tabelle 8 Wiederholungsmessungen zur Präzision der Sterolanalyse 33

Tabelle 9 Parameter der Kalibration faecaler Sterole 35

Tabelle 10 Auswahl spezifischer Fragmente zur SIM-Detektion der

Gallensäuren 40

Tabelle 11 Retentionszeiten der Gallensäuren 42

Tabelle 12 Wiederholungsmessungen zur Präzision der Gallensäuren-

analyse 43

Tabelle 13 Parameter der Kalibration faecaler Gallensäuren 44

Tabelle 14 Berücksichtigte Humanstudien des Lehrstuhls

Ernährungsphysiologie im Überblick 47

Tabelle 15 Mittlere Stuhlausscheidung in Studie 1 51

Tabelle 16 Faecale Exkretion an Sterolen und Gallensäuren in Studie 1 53



Tabelle 19 Tägliche Gallensäurenexkretion unter Berücksichtigung der

Fettaufnahme und Trockensubstanzexkretion 56



Tabellenverzeichnis

Tabelle 22 Gallensäurenausscheidung bei normierter Fettaufnahme

der verschieden cholesterolämischen Probanden 60



Tabelle 25 Steroidexkretion der Frauen und Männer 68

Tabelle 26 Qualitative Bestimmung faecaler Sterole nach verschie-

denen Analysenmethoden 72

Tabelle 27 Übersicht zum Sterolgehalt in der Stuhltrockensubstanz 78

Tabelle 28 Übersicht zur täglichen Sterolexkretion 78

Tabelle 29 Übersicht zum Gallensäurengehalt in der Stuhltrocken-

substanz 80

Tabelle 30 Übersicht zur täglichen Gallensäurenexkretion 81

Tabelle 31 Minimal- und Maximalgehalte von Steroiden im Stuhl;

Studien 1 - 4 82

Tabelle 32 Einfluss von Calcium auf den Steroidgehalt in der Stuhl-

trockensubstanz 84

Tabelle 33 Mögliche Ursachen einer Änderung des faecalen Sterol-

profiles 86

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis Ac Acetat

But Butylester

ca. circa

CA Cholsäure

CDCA Chenodeoxycholsäure

Chol Cholesterol

DC Dünnschichtchromatographie

DCA Deoxycholsäure

df Filmdicke

DGE Deutsche Gesellschaft für Ernährung

DGF Deutsche Gesellschaft für Fettforschung

DNS Desoxyribonucleinsäure

eV Elektronenvolt

Fa. Firma

GC Gaschromatographie

GCA Glycocholsäure

griech. griechisch

GS Gallensäure

GTS Gefriertrockensubstanz

HCA Hyocholsäure

HDCA Hyodeoxycholsäure

HDL High Density Lipoprotein

KBE Koloniebildende Einheiten

L. Lactobacillus

LCA Lithocholsäure

lat. lateinisch

LDL Low Density Lipoprotein

Max Maximum

MCA Muricholsäure

Metab Cholesterolmetabolite

Meth Methylester

Abkürzungsverzeichnis

MIC Multi Ion Chromatogram

Min Minimum

MS Massenspektroskopie

Mw Mittelwert

n. d. nicht detektiert

NWG Nachweisgrenze

o. A. ohne Angabe

prim. primär

QP Quadrupol

Rel. Int. Relative Intensität

Rel. Std.abw. Relative Standardabweichung

sek. sekundär

SIM Single Ion Monitoring

Std.abw. Standardabweichung

subsp. subspecies

TIC Total Ion Chromatogram, Total Ion Current

TMS Trimethylsilylether

TS Trockensubstanz

u. a. und andere; unter anderem

UDCA Ursodeoxycholsäure

vgl. vergleiche

vs. versus

Einleitung und Zielstellung

1

1 EINLEITUNG UND ZIELSTELLUNG

„0,02 g Cholsäure werden in 0,5 g Alkohol gelöst und mit 1 ccm n/10 Jodlösung

versetzt. Beim vorsichtigen Verdünnen mit Wasser erstarrt die Flüssigkeit zu

einem Kristallbrei von Nadeln, die im durchfallenden Licht blaue Färbung

zeigen.“

Die Anfänge der Analytik von neutralen und sauren Steroiden beruhen auf nass-

chemischen Methoden wie der hier dargestellte Nachweis von Cholsäure aus dem

Jahr 1887 von MYLIUS. Viele saure Steroide wurden erstmals aus

Gallenflüssigkeiten bzw. Gallensteinen verschiedener Tiere, wie z. B. von Pavian,

Kabeljau, Warzenschwein oder Eisbär, isoliert. Noch heute gebräuchliche

Trivialnamen wie Ursodeoxycholsäure (ursus [lat.]: Bär) oder Lithocholsäure (litho

[griech.]: Stein) machen diesen Ursprung deutlich.

Durch die Beobachtung des Reaktionsverhaltens konnten chemische Strukturen

erkannt [WIELAND 1928] und die Rolle der Gallensäuren als Emulgatoren bei der

Fettverdauung des Menschen geklärt werden [LETTRÉ 1954]. In der Mitte des

20. Jahrhunderts wurden vor allem Titrations- oder Spektroskopieverfahren zur

Bestimmung genutzt [GORDON et al. 1957, MOSBACH et al. 1954], wobei Letztere

im nahen Infrarot-Bereich noch heute angewendet werden [NAKAMURA et al. 1998].

Mit der Entwicklung der Gaschromatographie im Jahre 1944 durch Erika CREMER

[1976] konnten in den folgenden Jahrzehnten Steroide aus komplexen Matrizes

wie humanen Faeces chromatographisch getrennt und quantitativ bestimmt

werden [GRUNDY et al. 1965]. Durch die Kopplung an Massenspektrometer sind

außerdem Aussagen über Strukturelemente der Verbindungen ermöglicht worden

[ENEROTH et al. 1966]. Trotz moderner Technologie ist zur Bestimmung neutraler

und saurer Steroide in den Faeces auch heute eine aufwändige

Probenvorbereitung (Festphasenextraktion, Hydrolyse, Dünnschichtchromato-

graphie, flüssig/flüssig-Extraktion, Derivatisierung) zur gaschromatographischen

Analyse notwendig [PANDA und BROITMAN 2001, SETCHELL 1982].

Mit den erweiterten Möglichkeiten der Analytik hat sich ein breites Spektrum an

Untersuchungen zum Einfluss faecaler Steroide bei der Entstehung und

Vorbeugung von Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes, der Leber oder bei

Einleitung und Zielstellung

2

Atherosklerose entfaltet. So werden Untersuchungen u. a. hinsichtlich der Gallen-

steinformation sowie zu den Effekten der Gallensäuren bei Familiärer Polyposis,

Ulcerativer Colitis, Durchfallerkrankungen, Coloncarcinogenese oder Hyper-

lipidämie durchgeführt [SETCHELL et al. 1988, WELLS et al. 2000]. Da die Ernährung

des Menschen hierbei ursächlich und vorbeugend wirken kann, erfolgte die

Durchführung einer Vielzahl von Studien zur Beeinflussung der Exkretion faecaler

Steroide durch Ballaststoffe [MIETTINEN 1987], Proteine [DUANE 1999], Fette

[ELLEGARD et al. 2000], Vitamine [DUANE und HUTTON 1983], Mineralien [VAN DER

MEER et al. 1991], Milchprodukte [HOLT 1999], Präbiotika und Probiotika [MARTEAU

2001].

Im Allgemeinen ist eine Veränderung des faecalen Steroidprofils entweder durch

Modifizierung der intestinalen Mikroflora, z. B. aufgrund verstärkter Fermentation

bei erhöhter Ballaststoffzufuhr, oder durch Änderung physiko-chemischer

Parameter im Darmlumen (pH-Wert, Löslichkeit, Adsorption) möglich.

Ziel der Arbeit ist es, effiziente Methoden zur gaschromatographisch-

massenspektrometrischen Analyse von faecalen Sterolen und Gallensäuren zu

erarbeiten, wobei die Vorteile der massenspektrometrischen Detektion hinsichtlich

Spezifität und Sensitivität in der Realisierung der Aufgabenstellung genutzt

werden. Weiterhin sollen die Methoden zur Analyse realer Proben aus

Humanstudien verschiedener Fragestellungen Anwendung finden und mögliche

Einflüsse von supplementiertem Calciumphosphat, probiotischer Rohwurst und

probiotischem Joghurt auf die Exkretion der Steroide ermittelt werden.

Allgemeine Betrachtungen

3

2 ALLGEMEINE BETRACHTUNGEN 2.1 Chemie, Physiologie und Analytik faecaler Steroide 2.1.1 Faecale Sterole

2.1.1.1 Struktur und Physiologie

Die zu den neutralen Steroiden gehörenden Sterole werden häufig mit der

Bezeichnung �Sterine� dargestellt. Man unterscheidet nach ihrem Vorkommen in

Zoosterole (Tiere), Phytosterole (Pflanzen) und Mykosterole (Pilze). Sie leiten sich

vom cyclischen, hydrierten Cyclopentanophenanthren ab, welches das typische

Grundgerüst der Steroide bildet. Zwischen den Kohlenstoffatomen 5/6 oder 7/8

und in der Seitenkette enthalten sie eine oder mehrere Doppelbindungen. Die

gesättigten Abkömmlinge enden in der trivialen Nomenklatur auf �-stanol� (Abb. 1).

Funktionelle Strukturelemente wie Hydroxy- oder Oxogruppen sind an der

Position 3 des Kohlenstoffgerüstes lokalisiert und die Seitenkette kann an C24 mit

Methyl- oder Ethylgruppen substituiert sein. Daher wird die Variabilität der Sterole

durch die Anzahl und Position der Doppelbindungen und die Struktur der

Seitenkette geprägt, hingegen ist die Vielfalt der Gallensäuren vor allem auf die

funktionellen Gruppen zurückzuführen (vgl. 2.1.2.1). Unter dem Begriff �faecale

Sterole� werden häufig die ungesättigten und gesättigten Vertreter tierischer und

pflanzlicher Herkunft zusammengefasst.

Abbildung 1: Grundgerüst und Struktur bedeutender faecaler Sterole

R1 Konfiguration A+B/

Position des H-Atoms an C5

∆5 Substituent an C24 Bezeichnung

H trans/5α - - 5α-Cholestan

β-OH - + - Cholesterol

β-OH - + -C2H5 Sitosterol

β-OH - + -CH3 Campesterol

β-OH cis/5β - - Coprostanol

β-OH trans/5α - - Cholestanol

=O cis/5β - - Coprostanon

=O trans/5α - - Cholestanon

A B

C D

R1

1

2

3

45

6

7

8

9

10

11

12

13

1415

16

1718

19

2021 22

23

24

25

26

27


4

Beim Menschen wird zwischen endogenem und exogenem Cholesterol

unterschieden, das entweder in der Leber des Menschen aus Isoprenbausteinen

über Squalen synthetisiert oder aus der Nahrung im Jejunum absorbiert werden

kann. Cholesterol ist ein bedeutender Bestandteil in den Membranen des

Menschen und ist der Ausgangsstoff für die Bildung von Vitamin D,

Sexualhormonen und Gallensäuren. Freies Cholesterol wird über die Galle in den

Darm abgegeben, rückresorbiert oder durch Darmbakterien des Colon

metabolisiert und ausgeschieden [BIESALSKI 1995].

Bei den aus Faecesproben isolierten Sterolen handelt es sich vorwiegend um

Cholesterol und dessen bakterielle Transformationsprodukte Coprostanol und

Coprostanon. Außerdem werden weitere Sterolabbauprodukte und mit der

Nahrung aufgenommene Phytosterole wie Sitosterol oder Campesterol

nachgewiesen.

2.1.1.2 Darmflora und bakterielle Metabolisierung von Cholesterol

Der Intestinaltrakt weist eine sehr differenzierte Besiedlung mit Mikroorganismen

auf. So befinden sich im Magen und oberen Abschnitt des Darmes vorwiegend

säuretolerante, mikroaerophile Lactobacillen und fakultative Streptococcen mit

einem Gesamtgehalt von 101 - 103 Organismen pro ml Inhalt. Der ileale bis cecale

Bereich bildet den Übergang zum Colon und ist sowohl durch Bakterien des

gastrisch, duodenalen Abschnittes als auch des Dickdarmes besiedelt. Der

Mikroorganismengehalt in diesem Bereich verdeutlicht ebenfalls das Übergangs-

milieu. Im anaeroben Colon ist die Artenvielfalt mit 400 - 500 Species und die

Anzahl an Organismen mit über 1010 KBE/ml Inhalt am höchsten (Tab. 1) [KELLER

und JAHREIS 2001].

Cholesterol kann durch anaerobe, gram-positive Bakterien [MIDTVEDT et al. 1990]

zu 80 - 100 % [PONZ DE LEON et al. 1987] in Coprostanol transformiert werden,

wobei vor allem Eubacterium-Stämme (z. B. Eubacterium coprostanoligenes

ATCC 51222) reduktiv wirksam sind [MACDONALD et al. 1983a].


5

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6

Mit Hilfe von radiomarkierten Wasserstoff- und Kohlenstoffatomen im

Cholesterolmolekül werden zwei verschiedene Wege zur Umwandlung in

Coprostanol nachgewiesen (Abb. 2). Der erste Mechanismus ist die direkte

Reduktion der ∆5-Doppelbindung [ROSENFELD et al. 1954]. Der zweite Weg, mit

anfänglicher Oxidation der Hydroxygruppe, Isomerisierung der Doppelbindung und

anschließender Reduktion zu Coprostanon bzw. Coprostanol, wird als vorwiegend

ablaufender Mechanismus angesehen [MACDONALD et al. 1983a, REN et al. 1996].

Abbildung 2: Metabolisierung von Cholesterol durch die Intestinalflora

1: direkte Umwandlung; 2a - c: indirekte Umwandlung

Cholesterol

Coprostanol Coprostanon

Cholest-4-en-3-on

1

2a

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2c

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19

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R1

R2

R2 R2

R2

R1R1

R1


7

2.1.1.3 Analytische Voraussetzungen zur Sterolbestimmung

Probenvorbereitung

Sterole liegen durch ihre geringe Polarität im Lipidextrakt des Stuhles vor

(vgl. 2.1.2.3). Die Trennung von anderen Steroiden, die Separation in freie und

veresterte Sterole und die Verteilung in einzelne Sterolklassen (Oxo-Sterole,

5β-Sterole, 5α-Sterole) kann mit chromatographischen Methoden an Gelen

[BARKER et al. 1993, KORPELA 1982] oder auf Dünnschichtplatten [ARCA et al.

1983] erfolgen.

Zur Abspaltung der Fettsäuren aus Sterolestern wird in nahezu allen Methoden

eine alkalische Hydrolyse in alkoholischen Medien durchgeführt [HOVING 1995].

Dabei werden methanolische bzw. ethanolische Natron- oder Kalilaugen ver-

wendet [BÖRJESSON et al. 1998, KAIBARA et al. 1983, LINDENTHAL et al. 2001,

VERBEEK et al. 1995]. Mit unpolaren Lösungsmitteln wie Hexan oder Cyclohexan

ist eine Extraktion der Sterole aus der polaren Reaktionslösung möglich [AUSMAN

et al. 1993, CLIFFORD et al. 1986].

Gaschromatographische Analyse

In den meisten Anwendungen wird die Hydroxygruppe an Position 3 des

Kohlenstoffgerüstes in Alkylsilylether, Acetate oder Haloacetate überführt

[GÖRÖG 1983]. Für Phytosterole sind auch Methoden ohne Derivatisierung be-

schrieben [SUPELCO 2002]. Für freie, faecale Sterole werden Koelutionen von

Cholestanol/Cholesterol [HOVING 1995] und Coprostanon/Cholesterol [OWEN et al.

1987] bei Verwendung unpolarer gepackter Säulen beobachtet. Die Trennung von

Cholestanol und Cholesterol wird durch eine optimierte Probenvorbereitung

(Dünnschichtchromatographie) [TURJMAN und NAIR 1984] und/oder durch die

Modifizierung des gaschromatographischen Verfahrens erreicht. Dies kann

entweder durch Trimethylsilylierung der Hydroxygruppe mit Applikation auf

unpolare Kapillarsäulen [MIETTINEN 1982], durch eine Erhöhung der Polarität der

stationären Phase der gepackten Säulen [ARCA et al. 1983] oder durch duales

Analysieren mit zwei gepackten Säulen [GERHARDT et al. 1977] geschehen.


8

Eine Separation von underivatisiertem Coprostanon und Cholesterol ist bis heute

nur durch die Probenaufarbeitung möglich bzw. es wird eine Überquantifizierung

des Cholesterol in den Faeces hingenommen [OWEN et al. 1987].

Die beschriebenen Alternativen führen zu einem höheren Zeitaufwand in der

Probenvorbereitung [SHIMADA et al. 2001], zu möglichen Substanzverlusten

besonders an 3-Oxo-Sterolen (vgl. 2.1.2.3) oder zum Einsatz gepackter Säulen,

die heute in der Regel durch Kapillarsäulen ersetzt werden.

Massenspektrometrische Detektion und interner Standard

Obwohl 5α-Cholestan keine funktionelle Gruppe am Steroidgerüst trägt, wird es in

den meisten Anwendungen als interner Standard eingesetzt [ARCA et al. 1983,

BÖRJESSON et al. 1998, KORPELA 1982, LINDENTHAL et al. 2001, PONZ DE LEON et al.

1987, VERBEEK et al. 1995]. Als Alternativen werden 3α-Hydroxy-5β-Cholestan,

Stigmasterol oder radiomarkiertes Cholesterol verwendet [HOVING 1995].

Massenspektrometrische Daten zur quantitativen Bestimmung im Modus des

Single Ion Monitoring (SIM) sind fast ausschließlich für die Serumcholesterol-

analyse dokumentiert [GAMBERT et al. 1979, WOLTHERS et al. 1980]. Zur Analyse

von freiem Cholesterol wird das Fragment m/z = 386 erwähnt, welches dem

Molekülion der Verbindung entspricht [BJÖRKHEM et al. 1974]. Außerdem werden

Trimethylsilylether oxidierter Pflanzensterole im Serum oder Epididymissterole der

Ratte mittels SIM quantifiziert [LINDENTHAL et al. 2001, PLAT et al. 2001]. In der

Analytik weiterer Sterole wird die Fragmentierung zur Identifikation der Analyten

angewendet, jedoch nicht zur Quantifizierung [MATUSIK et al. 1988, SONG et al.

2000].


9

2.1.2 Gallensäuren

2.1.2.1 Struktur und Physiologie

Die Struktur der Gallensäuren basiert auf dem Steroidgerüst, das am Ende der

Seitenkette eine Carboxylgruppe trägt. Deshalb werden sie den sauren Steroiden

zugeordnet. Neben den C24-Hauptvertretern sind auch natürliche Abkömmlinge mit

einer Anzahl von 21 Kohlenstoffatomen dokumentiert [LUND et al. 1991,

MURI-BOBERG et al. 1990]. Im Unterschied zu den faecalen Cholesterol-

metaboliten sind die A- und B-Ringe hauptsächlich in cis-Konfiguration verknüpft,

was eine gewinkelte räumliche Struktur der Moleküle zur Folge hat. Die Vielzahl

der verschiedenen Gallensäuren ist durch Variationen in Anzahl, Position und

Lage von Hydroxy- und Oxogruppen (α: Hydroxygruppe unterhalb der

Molekülebene, β: Hydroxygruppe oberhalb der Molekülebene) am Steroidgerüst

bedingt (Abb. 3).

R1 R2 R3 R4 Trivialname (Abkürzung)

H H H H 5ß-Cholansäure

α-OH H H H Lithocholsäure (LCA)

β-OH H H H iso-Lithocholsäure (iso-LCA)

α-OH H H α-OH Deoxycholsäure (DCA)

β-OH H H α-OH iso-Deoxycholsäure (iso-DCA)

α-OH α-OH H H Hyodeoxycholsäure (HDCA)

α-OH H β-OH H Ursodeoxycholsäure (UDCA)

α-OH H α-OH H Chenodeoxycholsäure (CDCA)

α-OH H α-OH α-OH Cholsäure (CA)

α-OH H H =O 12-Oxo-Deoxycholsäure (12-Oxo-DCA)

Abbildung 3: Grundgerüst und Struktur bedeutender Gallensäuren

Beim Säuger werden primäre und sekundäre Gallensäuren unterschieden. Die

primären Gallensäuren Cholsäure (CA) und Chenodeoxycholsäure (CDCA)

werden in den Hepatozyten des Menschen aus Cholesterol mittels

7α-Hydroxylasen gebildet, mit Taurin oder Glycin an der Säuregruppe verestert

A B

C D

O

OH

R1

R2

R3

1

2

3

45

6

7

8

9

10

11

12

13

1415

16

1718

19

2021 22

23

24R4


10

und über die Gallenblase oder direkt in das Duodenum sezerniert. Die

Mizellenbildung ist die Voraussetzung zur Absorption hydrophober Moleküle (z. B.

Fette) im wässrigen Medium des Darmes. Sie bilden ein Mehrkomponen-

tensystem, bestehend aus Gallensäuren (40 � 100 %), Lecithin (0 - 60 %) und

Cholesterol (0 - 15 %). Neben den Nahrungsbestandteilen werden über 90 % der

Gallensäuren im Ileum reabsorbiert [LÖFFLER und PETRIDES 1998]. Der Durchtritt

kann sowohl passiv als auch aktiv erfolgen. Trotzdem erreichen konjugierte

Gallensäuren das Colon und werden durch die anaerobe Mikroflora metabolisiert

und anschließend als sekundäre Gallensäuren Lithocholsäure (LCA) und

Deoxycholsäure (DCA) erneut absorbiert oder mit den Faeces ausgeschieden.

2.1.2.2 Modifikation der Gallensäuren durch die Intestinalflora

Die Bakterien des Colon sind in der Lage, 15 bis 20 Metabolite aus Gallensäuren

zu formen [VAN ELDERE 1999]. Dabei sind die Hydrolyse in freie Gallensäuren, die

Dehydroxylierung der 7α-Hydroxygruppe und die Epimerisierung der Hydroxy-

gruppen am Steroidgerüst die vorwiegenden Reaktionen (Abb. 4).

Die Hydrolyse der Peptidbindung zwischen den Gallensäuren und Taurin bzw.

Glycin ist die Initialtransformation durch die intestinale Mikroflora. Sie ist nahezu

vollständig, so dass in den Faeces hauptsächlich freie Gallensäuren vorliegen

[MACDONALD et al. 1983a]. Hydrolaseaktivität entfalten viele Bakterien, so konnte

bei Bacteroides-, Bifidobacterium-, Fusobacterium-, Eubacterium-, Clostridium-,

Lactobacillus- und Streptococcus-Species die Fähigkeit zur Dekonjugation gezeigt

werden [HYLEMON und GLASS 1983, SHIMADA et al. 1969, VAN ELDERE 1999].

Die Dehydroxylierung an der C7-Position der Gallensäuren bewirkt die

Umwandlung der primären Gallensäuren in die sekundären Gallensäuren. Zu den

7α-dehydroxylierenden Bakterien zählen Clostridium [WELLS und HYLEMON 2000],

Eubacterium und Bacteroides [EDENHARDER 1984]. Bei dieser Metabolisierung

werden die Gallensäuren zuerst mittels Adenosindiphosphat aktiviert [COLEMAN et

al. 1987] und anschließend zu 3-Oxo-4-Cholensäure oxidiert [BJÖRKHEM et al.

1989]. Weiterhin erfolgt eine trans-Eliminierung von Wasser, so dass ein ∆6 unge-

sättigtes Intermediat entsteht [MACDONALD et al. 1983a].


11

In Kombination dieser Thesen müsste ein ∆4, ∆6 konjugiertes System entstehen,

das zur 7-Dehydroxy-Gallensäure gesättigt wird. Die Reaktion ist irreversibel, das

heißt, die Umkehrreaktion von z. B. DCA zu CA ist nicht möglich [VAN ELDERE

1999].

Ein weiteres bakterielles Enzym zur Transformation der Gallensäuren ist die

α-Dehydrogenase. Sie bewirkt die Epimerisierung von α-ständigen Hydroxy-

gruppen in β-Epimere über Oxo-Intermediate. Dabei können Hydroxygruppen an

den Positionen 3, 6, 7 und 12 des Steroidgerüstes umgewandelt werden. Die

Epimerisierung an der Position 7 tritt in verstärkter Konkurrenz zu der irreversiblen

Dehydroxylierung auf. 7α-Dehydrogenaseaktivität wurde in Bacteroides [SHERROD

und HYLEMON 1977], Eubacterium lentum [HIRANO und MASUDA 1981], Escherichia

coli [MACDONALD et al. 1973] und Clostridium absonum [MACDONALD et al. 1983b,

MACDONALD und ROACH 1981] gezeigt. 7β-Dehydrogenaseaktivität wurde ebenfalls

in Clostridium absonum [MACDONALD et al. 1983b, MACDONALD und ROACH 1981]

aber auch in Eubacterium aerofaeciens und Peptostreptococcus productus

gefunden [HIRANO und MASUDA 1982]. EDENHARDER und KNAFLIC [1981]

beschreiben die Epimerisierung von CDCA in UDCA über das 7-Oxo-Intermediat

durch aus den Faeces isolierten Lecithinase-Lipase-negativen Clostridien,

verweisen aber darauf, dass eine Rückreaktion nicht erfolgt.


12

3α,α,α,α,7αααα�Dihydroxy-5ββββ-Glycocholansäure

Dekonjugation

Bacteroides Bifidobacterium Fusobacterium Eubacterium Clostridium Lactobacillus Streptococcus

3α,α,α,α,7αααα�Dihydroxy-5ββββ-Cholansäure

7α-Dehydroxylierung 7α-Dehydrogenierung 7-Epimerisierung

Clostridium Clostridium absonum Anaerobier in Eubacterium Eubacterium lentum Bacteroides

Bacteroides Bacteroides fragilis Gegenwart Escherichia coli

3α−α−α−α−Hydroxy-5ββββ-Cholansäure 3αααα-Hydroxy-7oxo-5ββββ-Cholansäure

7-Epimerisierung 7β-Dehydrogenierung

Clostridium absonum Clostridium absonum Peptostreptococcus productus

Eubacterium aerofaciens

3α,α,α,α,7ββββ�Dihydroxy-5ββββ-Cholansäure Abbildung 4: Metabolisierungsreaktionen an Gallensäuren durch die Darmflora

CH3

CH3

H

CH3

OH

O

OH

NHCH2COOH

CH3

CH3

H

CH3

OH

O

OH

OH

CH3

CH3

H

CH3

OH

O

OH

CH3

CH3

H

CH3

OH

O

OH

O

CH3

CH3

H

CH3

OH

O

OH

OH


13

2.1.2.3 Analytische Voraussetzungen zur Gallensäurenbestimmung

Probenvorbereitung

Den meisten Aufarbeitungsprozeduren aus homogenisierten Faeces geht eine

Extraktion der Lipide voraus. Dabei werden Soxhlet-Extraktionen mit Petrolether

[OWEN et al. 1987], Methanol/Dichlorethan [ALI et al. 1966], Methanol/Chloroform

[Eneroth et al. 1968] oder Ethanol [PANDA und BROITMAN 2001, HORI et al. 1998]

angewendet. Weitere Möglichkeiten wie sequenzielles Extrahieren am Rückfluss

mit 90 % Ethanol, 80 % Ethanol und Chloroform/Wasser [SETCHELL et al. 1983]

oder flüssig/flüssig-Extraktion mit Toluol nach Erhitzen mit Eisessig [EVRARD und

JANSSEN 1968] werden ebenfalls beschrieben. Allerdings ist eine

Probenaufarbeitung auch direkt aus der Probe möglich [CHILD et al. 1987, GRUNDY

et al. 1965].

Die folgenden Schritte der Probenaufarbeitung dienen der Reinigung und

Separation der interessierenden Steroide und variieren je nach analytischer

Fragestellung. So können durch Ionen-Austausch-Chromatographie mit Amberlyst

A-26 [OKISHIO und NAIR 1967] neutrale und saure Steroide oder mit Lipidex-DEAP

freie, glycin- und taurinkonjugierte Gallensäuren separiert werden [SETCHELL et al.

1983]. Eine Vielzahl chromatographischer Verfahren mit Gelen (Sephadex LH-20,

Ammoniumform), Reversed-Phase C18, Aluminiumoxid, Papier, Kieselgel auf

Platten u. a. kommen zum Einsatz [ENEROTH und SJÖVALL 1971].

In der Reihenfolge der Anwendungen ist die alkalische oder enzymatische

Hydrolyse der konjugierten Gallensäuren der entscheidende Schritt. Da in

Faecesproben vorwiegend freie Gallensäuren vorliegen und bei großem

Probenumfang eine mehrtägige Aufarbeitung einer einzelnen Probe ineffektiv ist,

kann eine Separation der neutralen Steroide mittels flüssig/flüssig-Extraktion zur

Analyse freier Gallensäuren zufriedenstellende Ergebnisse liefern. So werden von

CZUBAYKO et al. [1991] nach Entfernen der neutralen Komponenten eine alkalische

Hydrolyse durchgeführt, die Gallensalze durch Ansäuern mit Salzsäure in freie

Säuren überführt, extrahiert und derivatisiert.

Bei Hydrolyse in Gegenwart von Natronlauge ist allerdings ein Verlust an Oxo-

Gallensäuren möglich. Die Ursache hierfür ist vermutlich eine basekatalysierte


14

Keto-Enol-Tautomerisierung, die eine Artefaktbildung zur Folge hat. Dies gilt

besonders für Oxogruppen am Kohlenstoffatom 3 des Steroidgerüstes [SJÖVALL et

al. 1971]. Da jedoch in den Faeces die 12-Oxo-Verbindungen die quantitativ

Bedeutendsten sind [LAWSON und SETCHELL 1988], dient die Aufarbeitung nach

CZUBAYKO et al. [1991] als Basis in der vorliegenden Arbeit.

Gaschromatographische Analyse

Aufgrund der hohen Siedepunkte der Gallensäuren ist eine Derivatisierung der

Carboxyl-, Hydroxy- und eventuell der Oxogruppen erforderlich, die in aufeinander

folgenden Schritten realisiert wird. Zur Veresterung der Carboxylgruppe können

Butanol [BATTA et al. 1999], Methanol/Dimethoxypropan [BRYDON et al. 1979,

HAYASHI et al. 1986] oder Diazomethan [KELSEY et al. 1980, TANIDA et al. 1981]

eingesetzt werden (Abb. 5).

Abbildung 5: Alkylesterbildung an der Carboxylgruppe freier Gallensäuren

Da Oxogruppen in Acetylierungsreaktionen Enolester und in Silylierungs-

reaktionen Enolether bilden können [SJÖVALL et al. 1971] wird in einigen Fällen

eine Umwandlung der Oxogruppen in Methyloxime vor die Derivatisierung der

Hydroxygruppen gesetzt [TANDON 1984]. Diese werden abschließend in Acetate

[NAKAMURA et al. 1992, SZCZEPANIK et al. 1976], Trifluoracetate [HYLLA et al. 1998,

REDDY et al. 1988] oder Trimethylsilylether [CRONHOLM et al. 1972, OWEN et al.

1984, SUMMERFIELD et al. 1976] überführt. Als Silylierungsmittel hat sich ein

Gemisch aus Hexamethyldisilazan, Trimethylchlorsilan und Pyridin bewährt [IIDA et

al. 2001] (Abb. 6).

O

OH17

2021 22

23

24

R

O

17

2021 22

23

24

ROC4H9 +

O

17

2021 22

23

24

ROCH3

a: H2SO4, C4H9OHb: HCl, CH3OH, (CH3)2C(OCH3)2c: CH2N2

a b, c


15

Trotz der Vielfalt der Derivatisierungsmöglichkeiten ist die Bildung von

Trimethylsilylether-Methylester am weitesten verbreitet.

Abbildung 6: Silylierungsreaktion an Hydroxygruppen des Steroidgerüstes

Zur Trennung der Gallensäuren werden vorwiegend unpolare stationäre Phasen in

gepackten Säulen oder Kapillarsäulen verschiedener Längen verwendet [SCALIA

1995]. Es wird ein programmierter Temperaturverlauf bevorzugt, der sich über

einen weiten Bereich erstrecken kann [ALME et al. 1977, BARKER et al. 1994,

BATTA et al. 1999, SETCHELL et al. 1983, SRIKUMAR et al. 1998] (Tab. 2).

Tabelle 2: Parameter der Gallensäurenanalyse - Literaturübersicht

Referenz stationäre Phase Säulenlänge [m]

Temperatur [°C] (Start - Ende) Derivate

ALME et al. [1977] 1,5 % SE 30 2,5 210 - 240 Meth/TMS

BARKER et al. [1994] DB-1 25 o. A. Meth/TMS

BATTA et al. [1999] CP-Sil-5CB 25 100 - 278 But/TMS

SETCHELL et al. [1983] OV-1 25 220 - 285 Meth/TMS

SRIKUMAR et al. [1998] DB-5 30 50 - 310 But/Ac

Meth: Methylester; But: Butylester; TMS: Trimethylsilylether; Ac: Acetat; o. A.: ohne Angabe

Trotz unterschiedlicher Messparameter zeigen die Chromatogramme der

verschiedenen Autoren die gleichen Elutionsreihenfolgen der jeweils analysierten

Gallensäuren. Allerdings erscheinen bei BARKER et al. [1994] die cis/trans-Isomere

der 12-Oxo-DCA in umgekehrter Reihenfolge (Tab. 3).

+5

Pyridin

HO

A

1

2

3

4

+ HX5

Hexamethyldisilazan (HMDS):Trimethylchlorsilan (TMCS):

X = NHSi(CH3)3X = Cl

CH3

Si

CH3

H3C XA

1

2

3

4

CH3

Si

CH3

H3C O


16

Tabelle 3: Elutionsreihenfolgen von Gallensäuren verschiedenen Ursprungs

Autoren mit Hinweisen zum Probenursprung, der Probenmatrix und zum

Gesundheitsstatus der untersuchten Species Gallensäuren SETCHELL

et al. [1983]

BARKER et al.

[1994]

SRIKUMAR et al.

[1998]

BATTA et al.

[1999]

SETCHELL et al.

[1983]

ALMÉ et al.

[1977] Mensch Mensch Mensch Mensch Ratte Mensch

gesund Durchfall Polypen gesund gesund gesund Leber/Galle

Lage der funktionellen Gruppen, Konfiguration und Namen Faeces Faeces Faeces Faeces Faeces Faeces Urin 3b 5b iso-LCA 1 1 1 3b 5a iso-allo-LCA 2 3a 5b LCA 2 2 1 1 3 1 3a 5a allo-LCA 2 3a,12a 5a allo-DCA 4 3 3a,12b 5b 5 4 3b,7a 5b 1 5 3b,12a 5b iso-DCA 3 3 2 6 3a,12b 5a 4 6 3b 5b 7 3a,12a 5b DCA 4 5 2 3 7 8 3b,7a,12a 5b 2 3a,7a 5a allo-CDCA 8 3a,7a 5b CDCA 5 3 6 3 4 9 3a,7a,12a 5a allo-CA 9 3a,6b 5b 8 10 3a,7a,12a 5b CA 6 4 7 4 5 11 3oxo,12a 5b 3-Oxo-DCA 6 8 3a,6b,7a 5b α-MCA 9 3a,6a 5b HDCA 10 12 3b,12a 5b 13 3b,6a 5b 11 3a,7b 5b UDCA 7 8 5 14 3b,12a 5a 12 15 3a,7b,12a 5a 15 3b,7b,12a 5a 15 3a,6b,12a 5b 15 3b,7b,12a 5b 16 3a,7b,12a 5b 8 5 17 7oxo,3a 5b 6 12oxo, 3b 5b 9 7oxo,3a,12a 5b 7 6 12oxo, 3a 5a 10 13 3b,12b 5a 14 12oxo, 3a 5b 12-Oxo-DCA 10 9 7 15 18 3a,6a,7a 5b HCA 19 3a,6b,7b 5b β-MCA 16 12oxo,3b 5a 17 3a,6a,7b 5b ω-MCA 18 3a,6a,7b 5a 19

rot markiert: Unterschied in Elutionsreihenfolge im Vergleich der anderen Autoren


17

Die Variabilität der renalen konjugierten Gallensäuren scheint im Vergleich zur

faecalen Ausscheidung beim Menschen größer zu sein [BATTA und SALEN 1999].

Das Gallensäurenprofil der Ratte unterscheidet sich vom Menschen durch

Vertreter der Muricholsäure (MCA), die Hydroxygruppen an Position 6 des

Steroidgerüstes tragen.

Massenspektrometrische Detektion und interner Standard

Generelle Fragmentierungen der Trimethylsilylether-Methylester der Gallensäuren

sind die Abspaltung der Seitenkette (M - 115), der Trimethylsilanole (M - 90) oder

angularer Methylgruppen (M - 15) (Tab. 4). Weiterhin treten Ringbrüche in A, B, C

und D auf [LAWSON und SETCHELL 1988]. Je höher die Energie des

Elektronenstoßes ist, um so stärker ist das Ausmaß der Fragmentierung. Bei

niedrigen Energien (20 eV) werden Fragmente mit einem höheren

Informationsgehalt zur Struktur der Gallensäuren erhalten [REIMENDAL und

SJÖVALL 1973]. Der Elektronenfluss in Massenspektrometern mit

Elektronenstoßionisation ist in vielen Geräten auf 70 eV standardisiert

[ANDEREGG 1990].

Tabelle 4: Molare Massen freier und derivatisierter Gallensäuren

Anzahl und Art der funktionellen Gruppen

Molare Masse (frei) [g/mol]

Molare Masse (Meth und TMS) [g/mol]

1 �OH 376 462

2 �OH 392 550

3 �OH 408 638 1 �OH + 1 =O 390 476

Meth: Methylester; TMS: Trimethylsilylether

Quantitative Analysen können sowohl mit dem Totalionenstrom (TIC, SCAN) der

gebildeten Fragmente als auch im SIM realisiert werden. Das Arbeiten mit dem

gesamten Spektrum bietet eine größere Anzahl von Fragmenten zur Analyse,

weshalb DE WEERDT et al. [1980] dieses Verfahren der Analyse im SIM vorziehen.

Da sich bei der Bestimmung aller gebildeten Fragmente die Empfindlichkeit der

Messung verringert und bei großem Probenumfang die erfasste Datenmenge


18

bedeutend vergrößert ist, zeigt die Quantifizierung im SIM einige Vorteile. So

werden bei SCALIA et al. [2000] UDCA-Gehalte im Plasma mit einer

Nachweisgrenze von 0,12 µmol/l (0,05 ppm) detektiert.

Zur Minimierung von Fehlern innerhalb der Probenvorbereitung oder der

Messmethode sind verschiedene interne Standards zur Bestimmung faecaler

Gallensäuren in der Literatur beschrieben (Tab. 5).

Tabelle 5: Interne Standards zur Gallensäurenquantifizierung

Referenz Interner Standard

IMRAY et al. [1992] nor-DCA; 3H-CA

JENKINS et al. [1999] 5β-Cholansäure ROY et al. [1999] HDCA

SETCHELL et al. [1983] Coprostanol, 14C-CA, 14C-CDCA

SUBBIAH [1973] HCA WESTSTRATE et al. [1999] 7α,12α-Dihydroxy-5β-Cholansäure


19

2.2 Wechselwirkungen der faecalen Steroide - Einfluss der Ernährung 2.2.1 Pathogene Wirkung und Cholesterolmetabolismus

2.2.1.1 Toxizität

Da der Verzehr von viel Fett und wenig Ballaststoffen mit einem erhöhten Risiko

der Coloncarcinogenese assoziiert wird [SLATTERY et al. 2000], sind Unter-

suchungen zu toxischen Wirkungen der Gallensäuren durchgeführt worden. So

wirken sie indirekt, indem sie die Fecapentaen-Biosynthese beeinflussen, die als

Mutagene in den Faeces bekannt sind [VAN TASSELL et al. 1982]. Außerdem wird

bei fettreicher Ernährung die Abgabe des Gallensaftes stimuliert, wodurch

anaerobe Bacteroides-Species im Darm gefördert werden, die Fecapentaene

bilden können [MOORE und MOORE 1995].

In genotoxischen Untersuchungen verändert LCA in vitro embryonale Hamster-

zellen und verursacht zum einen DNS-Strangbrüche in L1210-Zellen und zum

anderen steigert es die Reparaturmechanismen nach DNS-Strangbrüchen im

Rattengewebe [NAIR 1988]. In einer Studie von VENTURI et al. [1997] ist

Faeceswasser von 35 gesunden Probanden auf Genotoxizität untersucht worden.

Dabei konnte bei elf Personen ein stark erhöhter Wert ermittelt werden. Weitere

Untersuchungen haben ergeben, dass die Schädigungen der DNS vermutlich

durch oxidativen Einfluss und nicht durch Deoxycholat oder Lithocholat verursacht

worden ist. CRAVEN et al. [1987] postulieren, dass Gallensäuren einen Anstieg

reaktiver Sauerstoffspecies im Colonepithel induzieren. Generell haben

konjugierte Gallensalze ein geringeres genotoxisches Potenzial als freie Mono-

und Dihydroxygallensäuren und darüber hinaus liegt freie LCA durch die geringe

Löslichkeit im Faeceswasser nur in geringen Konzentrationen vor [NAGENGAST et

al. 1995].

Die Zytotoxizität der Gallensäuren ist stark von ihrer chemischen Struktur

abhängig. Allgemein gilt: je hydrophober eine Gallensäure ist, umso zytotoxischer

wirkt sie. Als Monohydroxygallensäure entwickelt LCA in vitro die höchste

Toxizität. Die Dihydroxygallensäuren DCA und CDCA sind stark hydrophob und

wirken verstärkt zytotoxisch. Aufgrund der räumlichen Lage der Alkoholgruppen ist


20

UDCA mit ebenfalls zwei Hydroxygruppen weniger hydrophob. CA ist ein

Intermediat und wirkt nur in hohen Konzentrationen als Zellgift [HOFMANN 1999,

LATTA et al. 1993].

Konjugierte Gallensäuren haben keine toxische Wirkung auf Zellen ohne

Gallensäuretransporter. Steigt die extrazelluläre Konzentration stark an, können

Membranschäden durch unterschiedliche Mechanismen (Prostaglandin E2, Proteinkinasen) auftreten [DE RUPERTIS et al. 1984, NISHIZUKA 1984]. Die

schädigende Konzentration ist der kritischen Mizellenkonzentration ähnlich. Da

CDCA und DCA im Vergleich zu CA geringe kritische Mizellenkonzentrationen

aufgrund ihrer hydrophoben Natur aufweisen, wirken sie verstärkt toxisch

[NAGENGAST et al. 1995].

Eine cholesterolreiche Diät erhöht den CDCA-Pool im Körper und steigende

Gehalte an CDCA und LCA im Colon können folgen [CHAPLIN 1998]. Außerdem

scheint der pH-Wert im Faeceswasser Einfluss auf die extrazelluläre Zytotoxizität

der Gallensäuren zu nehmen [DE KOK et al. 1999]. Bei Störungen der Integrität der

Zellmembranen stimuliert der Zellverlust die Erneuerung durch die mukosale

Proliferation. Dieses scheint der Schlüsselschritt hinsichtlich einer Tumorbildung

im Colon zu sein, da eine hyperproliferierende Mukosa sensibler auf Carcinogene

reagiert [NAGENGAST et al. 1995].

Im Gallentrakt und im Dünndarm bei Gesunden ist die Zytotoxizität vernach-

lässigbar, da bei der Verdauung von Lipiden mit konjugierten Gallensäuren

gemischte Mizellen gebildet werden, deren Konzentrationen unterhalb der

schädigenden Wirkung liegen [HOFMANN 1999]. Neben der extrazellulären

Zytotoxizität erfolgen weiterhin Untersuchungen zu intrazellulären Veränderungen

durch Gallensäuren [LATTA et al. 1993].

Die Rolle der neutralen Sterole in der Coloncarcinogenese ist nicht geklärt. So

deklarieren WEISBURGER et al. [1983] neutrale Sterole nicht als Tumorpromotoren,

obwohl gezeigt wird, dass Vegetarier als Gruppe mit einem niedrigen Risiko zur

Darmkrebsinzidenz einen signifikant verminderten Gehalt an bakteriellen

Cholesterolabbauprodukten und geringere oder unveränderte Konzentrationen an

Cholesterol in den Faeces im Vergleich zu Omnivoren oder Ovo-Lacto-Vegetariern

aufweisen [NAIR et al. 1984]. Im Gegensatz dazu zeigen NAIR und TURJMAN [1983],

dass das Darmkrebsrisiko mit niedrigen Konversionsraten des Cholesterols


21

korreliert, d. h. hohe Konzentrationen an Cholesterol und geringe Gehalte an

Coprostanol im Stuhl.

Es kann geschlussfolgert werden, dass eine fettreiche Ernährung die anaerobe

Darmflora beeinflussen kann [MOORE und MOORE 1995], was u. a. eine Erhöhung

von Enzymaktivitäten (Nitroreduktase, Azoreduktase, Glucuronidase, De-

hydroxylase) zur Folge hat [GOLDIN und GORBACH 1976]. Außerdem kommt es zu

einer vermehrten Gallensekretion. Dadurch sind die Konzentrationen an

Gallensäuren im Stuhl erhöht [REDDY et al. 1983] und infolge der Enzymaktivität

findet eine verstärkte Metabolisierung zu zytotoxischen, sekundären Gallensäuren

statt [STADLER et al. 1988]. Dies kann zu einer erhöhten Darmkrebsinzidenz

führen.

2.2.1.2 Cholesterol- und Gallensäurenmetabolismus

Gallensäuren wirken als Regulatoren für den Cholesterolmetabolismus in

Leberzellen. Sie sind Abbauprodukte des Cholesterols und hemmen die

Biosynthese (Abb. 7). Die Fütterung von CA und CDCA an Ratten und Hamster

unterdrückt die hepatische Cholesterolsynthese. Die Gehalte an Cholesterolestern

und LDL-Cholesterolkonzentrationen steigen an [CHIANG et al. 1998, SPADY et al.

1986].

Zur Gallensäurensynthese sind zwei Wege bekannt [VLAHCEVIC et al. 1992]. In

dem vorwiegend stattfindenden Prozess gilt die 7α-Hydroxylase als

Schlüsselenzym. Es wird hauptsächlich CA und weiterhin CDCA gebildet.

Alternativ kann eine Seitenkettenoxidation am Cholesterol als Initialreaktion

auftreten. Es wird 27-Hydroxycholesterol gebildet, welches die Cholesterol-

synthese nach unten reguliert. In diesem Fall ist CDCA das Hauptprodukt [CHAPLIN

1998, DOWLING und MURPHY 1990].

Durch Resorption im Darm gelangen primäre und sekundäre Gallensäuren erneut

in die Leber. Die Konzentration und Zusammensetzung des Gallensäurenpools

beeinflussen den Metabolismus des hepatischen Cholesterols. Ein hoher Gallen-

säurenpool induziert die Exkretion von Cholesterol in die Galle und vermindert die

CA-Synthese.


22

GS-Pool

Durch hydrophobe Gallensäuren wie CA, CDCA und DCA wird die

12α-Hydroxylaseaktivität in Ratten vermindert. Hydrophile Gallensäuren wie

UDCA und HCA erhöhen die Spezifität. Die Fütterung von Cholesterol unterdrückt

die 12α-Hydroxylaseaktivität und fördert die 7α-Hydroxylaseaktivität [VLAHCEVIC et

al. 2000].

Die Tarahumara-Indianer in Mexiko weisen lebenslang sehr geringe Cholesterol-

konzentrationen im Plasma auf, und sie haben eine höhere Exkretion faecaler

Gallensäuren. Die intestinale Absorption von Cholesterol ist im Vergleich zu

Amerikanern und Australiern gering, die endogene Biosynthese ist im Gegensatz

dazu erhöht [MCMURRY et al. 1985].

Chol Chol

CA, CDCA

CA,CDCA DCA, iso-~ LCA, iso-~ UDCA, Chol

Metab

Chol, Metab CA, CDCA

sek. GS

Abbildung 7: Cholesterol- und Gallensäurenmetabolismus

Chol: Cholesterol; GS: Gallensäuren; Metab: Cholesterolmetabolite

Chol.ester Acetyl-Co A HMG-Co A-R • -

Chol

CA

CDCA Leber

LDL: Chol, 27OH-Chol HDL: Chol

Serum

GalleChol CA

CDCA sek. GS

27-H

ydro

xyla

se

7-H

ydro

xyla

se

Ileum

Jej

unum

D

uode

num

F

aece

s

Col

on

Förderung Hemmung Gallensäuren � � Cholesterol + -

��

� +


23

2.2.2 Einfluss von Nahrungsfaktoren auf die Steroidexkretion

2.2.2.1 Calcium

Untersuchungen zur Verminderung der zytotoxischen Wirkung der Gallensäuren

im Colon beziehen sich auf den Einfluss von Calcium. Oral aufgenommenes

Calcium soll die oberflächenaktiven Gallensäuren inaktivieren. Konjugierte

Gallensäuren weisen eine höhere Löslichkeit bei niedrigem pH-Wert und eine

größere Stabilität gegen Fällungsmittel wie Calcium auf. Daher sind keine

Änderungen im Ileum zu beobachten [GOVERS und VAN DER MEER 1993]. Durch

den Angriff von Hydrolasen der Colonbakterien werden die Gallensäuren

dekonjugiert. Calcium kann entweder als freies Ion mit der ionisierten Gallensäure

ein Salz bilden, oder es verbindet sich mit ebenfalls aus der Nahrung

aufgenommenen anorganischen Phosphaten im Lumen zu einem Komplex, der

eine Fällung der Gallensäuren und eine Mitfällung von Cholesterol bewirkt, wobei

der letztere Mechanismus wirksam sein soll [VAN DER MEER et al. 1991, VAN DER

MEER et al. 1997] (Abb. 8).

Faeceswasser CaPi + freie Gallensäuren + Cholesterol CaPi ··· freie Gallensäuren ↓ + Cholesterol ↓

Abbildung 8: Fällung von Gallensäuren und Cholesterol durch Calciumphosphat-

Komplexe

So zeigt BOVEE-OUDENHOVEN et al. [1999] an Ratten eine Verminderung der

Gallensäurenkonzentration mit einhergehender Verminderung der Zytotoxizität

des Faeceswassers. LUPTON et al. [1996] stellen in einer Studie mit 22 Probanden,

deren Nahrung mit Calcium supplementiert wurde, keine signifikante

Verminderung des Gesamtgallensäurengehaltes, aber eine Verminderung an

primären Gallensäuren im Faeceswasser fest. Eine weitere Humanstudie mit

kontrolliertem Milchverzehr ergibt eine erhöhte faecale Exkretion an Gallensäuren,

der Gehalt im Faeceswasser ist jedoch vermindert [GOVERS et al. 1996].


24

Im Gegensatz dazu hat die Supplementation von Calciumcarbonat keinen Einfluss

auf die vermehrte Tumorbildung bei Nitrosomethylharnstoff-exponierten Ratten.

Sie führt zu einer erhöhten Cholesterol- und unveränderten Coprostanolexkretion

[QUILLIOT et al. 1999]. In einer prospektiven Kohortenstudie mit ca. 10.000

Probanden und einer Langzeitstudie über drei Jahre mit 116 Probanden zeigen

sich keine Korrelationen zwischen der Calciumaufnahme und dem Risiko an

Darmkrebs zu erkranken [HOFSTAD et al. 1998, JÄRVINEN et al. 2001].

In Studien zu Veränderungen der Darmflora durch den Einfluss von Calcium

werden in Ratten die Salmonelleninfektionen vermindert und intestinale

Lactobacillen stimuliert [BOVEE-OUDENHOVEN et al. 1999, BOVEE-OUDENHOVEN und

VAN DER MEER 1997]. Milchsäure wirkt auf gram-negative Bakterien in vitro

antimikrobiell und erhöht durch Entfernen von Lipopolysacchariden die

Permeabilität der Bakterienmembranen [ALAKOMI et al. 2000].

2.2.2.2 Probiotika

Den Probiotika werden eine Vielzahl von gesundheitsfördernden Wirkungen

zugeschrieben. Neben Untersuchungen zur Lactoseintoleranz, zur Stimulation des

Immunsystems und zur Senkung der Cholesterolkonzentrationen im Serum sind

Studien zur Prävention von Darmkrebs durchgeführt worden (Abb. 9). Dabei wird

u. a. festgestellt, dass die enzymatische Aktivität von Enzymen des Dickdarmes,

die zur Bildung von Carcinogenen führen, vermindert wird. Dies konnte für

β-Glucuronidase, Nitroreduktase, Glycocholsäurehydrolase und Azoreduktase

gezeigt werden [BEZKOROVAINY 2001]. Neben den erwähnten Enzymen sind die

7α-Dehydroxylase und die 7α-Dehydrogenase von Interesse, da LCA und DCA

als mögliche Promotoren einer Tumorbildung gelten (vgl. 2.2.1.1). So werden die

Dekonjugation und Dehydroxylierung von Gallensalzen als unerwünschte

physiologische Leistungen von Milchsäurebakterien dargestellt [HAMMES 1998].

Der gezielte Einsatz diätetischer Erzeugnisse (Ballaststoffe, fermentierte Milch-

produkte, Milchsäurebakterien) sollte eine Absenkung des pH-Wertes aufgrund

kurzkettiger, organischer Säuren hervorrufen [GARROTE et al. 2000], so dass

dieser nicht mehr im Aktivitätsoptimum krebsrelevanter Enzyme, z. B. der

7α-Steroid-Dehydrogenase liegt [MACDONALD et al. 1978].


25

Eine Verminderung der Aktivität müsste einen Abfall des Gehaltes an sekundären

Gallensäuren in den Faeces zur Folge haben. In einer Humanstudie von VAN

MUNSTER et al. [1994] wird 14 gesunden Probanden eine mit resistenter Stärke

angereicherte, standardisierte Diät verabreicht. Die Exkretion an DCA vermindert

sich um 50 % und die Ausscheidung an kurzkettigen Fettsäuren steigt um 35 %

an. In vitro wird eine verminderte Umwandlung von CA und CDCA in ihre

sekundären Verbindungen durch Darmbakterien bei pH = 6 im Vergleich zu einem

neutralen Wert (pH = 7) beschrieben [CHRISTL et al. 1996]. Weiterhin wird eine

verminderte bakterielle Umwandlung von CDCA bei Zusatz von Lactobacillus

acidophilus zum faecalen Medium beobachtet [FERNANDES und SHAHANI 1990].

Daraus schlussfolgernd soll eine Erniedrigung des pH-Wertes im Colon eine

Verminderung an sekundären Gallensäuren zur Folge haben.

Im Kontrast dazu führt in einer randomisierten Doppelblindstudie von MARTEAU et

al. [1995] die Supplementation eines mit Bifidobacterium und Lactobacillus

acidophilus fermentierten Milchproduktes bei acht Ileostomiepatienten zu einer

signifikanten Erhöhung freier und sekundärer Gallensäuren, aufgrund einer hohen

Metabolisierungsaktivität der verabreichten Kulturen. In Untersuchungen zu

beiden Stämmen in vitro wird eine schnelle und umfassende Dekonjugation von

Gallensalzen beobachtet, jedoch keine Dehydroxylierung.

Senkung der Serumcholesterolkonzentration Verminderung des Darmkrebsrisikos Cholesterolassimilation Dekonjugation von GS Bindung von GS β-Glucuronidase ↓

an Zellwand Nitroreduktase ↓ Azoreduktase ↓ (GCA-Hydrolase)

Löslichkeit von GS ↓ (7-Dehydroxylase) (7-Dehydrogenase)

Fällung von Cholesterol + GS

Neusynthese an GS

Verminderung an Cholesterol Verminderung an Gallensäuren Verminderte Enzymaktivitäten

Abbildung 9: Probiotikawirkung im Colon (GCA: Glycocholsäure)

sek. GS


26

Lactobacillen können auf verschiedenen Wegen den Gehalt an Taurocholsäure

vermindern. Dabei erfolgt beim Abbau durch L. casei subsp. casei TMC 0409

keine Substanzumwandlung, so dass vermutlich die konjugierte Gallensäure an

die Zellwand gebunden wird und ein physikalischer Prozess die Ursache für eine

Verminderung ist. Beim Abbau durch L. reuteri TMC 4405 hingegen werden

chromatographisch neben der Taurocholsäure auch andere Substanzen detektiert.

Nach massenspektrometrischer Analyse der unbekannten Stoffe wird davon

ausgegangen, dass eine Oxidation und Dekonjugation zur Verminderung der

Taurocholsäure führt [HASHIMOTO et al. 2000].

Keine signifikanten Änderungen in der faecalen Gallensäuren- und Sterolexkretion

werden in einer Humanstudie von BARTRAM et al. [1994] bei Gabe eines mit

Bifidobacterium longum supplementierten Joghurts beobachtet.

Weiterhin ist die Gallensalz-Hydrolase zur Dekonjugation der Gallensalze in

Hinblick auf die cholesterolsenkende Wirkung der Probiotika von besonderer

Bedeutung. Die Gallensalz-Hydrolase ist ein wesentlicher Faktor zur Vermin-

derung von Cholesterol in vitro durch Lactobacillus reuteri [TARANTO et al. 1997].

Durch die Bildung freier Gallensäuren mit geringer Löslichkeit bei einem niedrigen

pH-Wert soll ein Ausfällen der Gallensäuren unter Kopräzipitation des

Cholesterols folgen. Andere Studien beschreiben die Assimilation und eine daraus

folgende Verminderung von Cholesterol durch Lactobacillus acidophilus und

Bifidobacterium longum [GILLILAND et al. 1985, DAMBEKODI und GILLILAND 1998]

oder eine ansteigende Exkretion dekonjugierter Gallensäuren infolge erhöhter

Hydrolaseaktivität im Colon durch Lactobacillus plantarum [DE SMET et al. 1994,

DE SMET et al. 1998] und damit eine verstärkte hepatische Neusynthese von

Gallensäuren aus Cholesterol. Dieser Weg wurde in den letzten Jahren verstärkt

kritisiert, da eine daraus resultierende Erhöhung sekundärer Gallensäuren im

Colon aufgrund der engen Beziehung zur Coloncarcinogenese unerwünscht ist

[SANDERS 2000].

Entwicklung der Analysenmethoden

27

3 ENTWICKLUNG DER ANALYSENMETHODEN 3.1 Faecale Sterole 3.1.1 Probenvorbereitung

Die aus den jeweiligen Perioden der Humanstudien gesammelten individuellen

Stuhlproben werden gepoolt und Aliquote lyophilisiert. Zur Doppelbestimmung

werden zwei Proben der gepulverten Faeces (je 50 mg) in Gefäße mit 250 µg

internem Standard eingewogen. Aufgrund des stabilen chemischen Verhaltens,

der einfachen Handhabung und der in der Literatur beschriebenen, positiven

Erfahrung wird 5α-Cholestan eingesetzt.

50 µl destilliertes Wasser werden zum Quellen der Probe zugegeben. Nach einer

milden alkalischen Hydrolyse mit 1 M ethanolischer Natronlauge (90 %) bei 70 °C

für 1 h und Zugabe von 0,5 ml destilliertem Wasser erfolgt viermal die Extraktion

der freien Sterole mit je 1 ml Cyclohexan. Die vereinigten Extrakte werden unter

einem Stickstoffstrom eingeengt, in 500 µl Decan aufgenommen und ohne weitere

Derivatisierung in den Gaschromatographen GC/MS QP 5000 (Fa. SHIMADZU)

injiziert.

3.1.2 Analyse mit GC/MS QP 5000

3.1.2.1 Probleme der gaschromatographischen Analyse

Die gaschromatographische Analyse eines Standardgemisches mit einer

unpolaren Kapillarsäule (100 %-Dimethylpolysiloxan, Optima 1 ms) und Detektion

des Totalionenstromes zeigt, dass eine Separation von freiem Cholesterol und

Cholestanol möglich ist. Nach Zugabe von Coprostanon erscheint es zusammen

mit Cholesterol unter einem Peak (vgl. 2.1.1.3). Bei der Optimierung des

Temperaturprogramms durch einen verminderten Temperaturanstieg erfolgt keine

Änderung.

Die geringe Erhöhung der Säulenpolarität durch einen Anteil von 5 %

Phenylsubstituenten (95 %-Dimethylpolysiloxan, DB 5) im Trägermaterial bewirkt


28

zwar eine erhöhte Auflösung der beiden Substanzen, jedoch ist diese für eine

Quantifizierung nicht ausreichend (Abb. 10). Eine weitere Steigerung der Polarität

der stationären Phase durch einen 20 bzw. 50 %igen Gehalt an Phenylgruppen

zeigt keine zufriedenstellende Separation. Kapillarsäulen höherer Polarität mit

Cyanopropylsubstituenten oder auf Polyethylenglycolbasis können aufgrund der

geringeren thermischen Stabilität nicht berücksichtigt werden. Eine Separation der

zu untersuchenden Komponenten ist allein durch die gaschromatographische

Trennung nicht zu realisieren.

Abbildung 10: Chromatogramme eines Sterolstandardgemisches

1: Coprostanol; 2: Cholesterol; 3: Coprostanon; 4: Cholestanol I + II: Optima 1 ms; 50 m; 0,2 mm; 0,2 µm df

III: DB 5; 50 m; 0,2 mm; 0,2 µm df

3.1.2.2 Probleme der massenspektrometrischen Detektion

Mit Hilfe von Einzelstandardlösungen sind die Massenspektren von 5α-Cholestan

(M = 372 g/mol), Coprostanol (M = 388 g/mol), Cholesterol (M = 386 g/mol),

Coprostanon (M = 386 g/mol), Cholestanol (M = 388 g/mol) und Cholestanon

(M = 386 g/mol) bei einer Energie des Elektronenstromes von 70 eV

aufgenommen worden (Abb. 11). In den Spektren aller Verbindungen werden die

Molekülionen nachgewiesen, allerdings haben die Fragmente im mittleren bis

1

2

4 2

2 4

4

1

1 3

3

III

II

I


29

niederen Massenbereich aufgrund der hohen Elektronenstrahlenergie höhere

relative Intensitäten und damit eine höhere Empfindlichkeit (vgl. 2.1.2.3). Eine

Variation der Energie ist aus gerätetechnischen Gründen nicht möglich. Durch den

Übergang vom SCAN- in den SIM-Modus, bei dem nur mit wenigen

Massenspuren gearbeitet wird, kann eine ausreichende Empfindlichkeit für

Fragmente mit niedrigen relativen Intensitäten erreicht werden. Weiterhin ist durch

Selektion substanzspezifischer Massen eine Quantifizierung koeluierender

Verbindungen ermöglicht (Tab. 6).

Abbildung 11: Massenspektren faecaler Sterole

5α-Cholestan

Coprostanol

Cholesterol

Coprostanon

Cholestanol

Cholestanon


30

Tabelle 6: Auswahl spezifischer Fragmente zur SIM-Detektion der Sterole

Substanz Fragment Rel. Int. [%] Koelution Rel. Int. des Fragments in koeluierender Substanz

5α-Cholestan 357,25 31 - -

Coprostanol 373,50 29 Epicoprostanol 4,4

Cholesterol 301,30 32 Coprostanon 1,5 Coprostanon 316,30 34 Cholesterol -

Cholestanol 215,10 92 - -

Cholestanon 232,00 50 Lathosterol 1,9 Brassicasterol -

Rel. Int.: Relative Intensität

Für den internen Standard ist das Fragment m/z = 357,25 mit einer relativen

Intensität von 31 % gewählt worden, um ähnliche Messbedingungen mit den

Hauptkomponenten Coprostanol, Cholesterol und Coprostanon zu gewährleisten.

Da Cholestanol und Cholestanon in geringen Konzentrationen in den Faeces

vorkommen und deshalb eine hohe Messempfindlichkeit erforderlich ist, stellt die

Anwendung von nahezu ungestörten Massenspuren mit hohen Intensitäten (92 %

bzw. 50 %) eine gute Voraussetzung für den Einsatz in Faecesproben dar. Die

Verunreinigungen durch Epicoprostanol und Lathosterol sind vernachlässigbar, da

die Konzentrationen dieser Verbindungen in den Faeces im Spurenbereich liegen

[RAJARATNAM 2000, DEPARTMENT OF NATURAL RESOURCE PROTECTION/USA 1998].

Durch die gekoppelte Anwendung der gaschromatographischen Vortrennung und

die Wahl geeigneter Fragmente zur massenspektrometrischen Detektion im SIM-

Modus wird eine Separation der interessierenden Verbindungen zur

Quantifizierung erreicht (Abb. 12).

Abbildung 12: Separation von Cholesterol (1, rot) und Coprostanon (2, hellblau)

im SIM- und TIC-Modus (dunkelblau)

1 2


31

3.1.2.3 Messparameter

Da die Chromatographie freier Phytosterole bei einer isothermen Arbeitsweise von

285 °C durchgeführt werden kann [SUPELCO 2002], ist zu Beginn der hier

beschriebenen Untersuchungen diese Methode angewendet worden. Jedoch zeigt

sich bei einem programmierten Temperaturverlauf (Abb. 13) eine verbesserte,

schmale Peakform. Die Injektortemperatur beträgt 280 °C und das Interface wird

bei 330 °C gehalten, um eine Ionenquellentemperatur von 300 °C zu

gewährleisten. Helium dient als Trägergas bei einer konstanten, linearen

Geschwindigkeit von 32 cm/sec. Bei Einsatz der unpolaren Kapillarsäule

Optima 1 ms (50 m; 0,2 mm; 0,2 µm df) ergibt sich ein anfänglicher Druck von

387,9 kPa und durch einen kontrollierten Druckverlauf ein Endzustand von

399,0 kPa.

Abbildung 13: Temperaturverlauf zur Gaschromatographie faecaler Sterole

Das Splitverhältnis beträgt 1 : 45 und die Daten werden zweimal pro Sekunde

aufgenommen. Die Empfindlichkeit der Messung kann weiterhin durch die

Detektorspannung beeinflusst werden. Aus dem Tuning des Gerätes folgt eine

minimale Arbeitsspannung von 1,23 kV. Für die Messungen der Sterole wird eine

höhere Spannung von 1,50 kV angelegt. Unter Anwendung der beschriebenen

Parameter ist die gaschromatographisch-massenspektrometrische Bestimmung

faecaler Sterole realisierbar (Tab. 7, Abb. 14). Gallensäuren wurden im

Cyclohexanextrakt nicht nachgewiesen.

300

280

250

0 25,5 Zeit [min]

10 °C/min

40 °C/min

Tem

pera

tur [

°C]

5 21


32

Tabelle 7: Retentionszeiten der faecalen Sterole

Substanz Absolute Retentionszeit [min] Relative Retentionszeit [min]

5α-Cholestan 12,8 1,00

Coprostanol 16,7 1,30

Cholesterol 17,6 1,38

Coprostanon 17,6 1,38 Cholestanol 17,8 1,39

Cholestanon 18,7 1,46

Abbildung 14: Sterolchromatogramm einer Faecesprobe

1: 5α-Cholestan; 2: Coprostanol; 3: Cholesterol (rot, oben);

4: Coprostanon (blau); 5: Cholestanol; 6: Cholestanon

1

6

4 3

2

5


33

3.1.3 Präzision und Richtigkeit

Anhand von zehn Wiederholungsmessungen einer Faecesprobe ist die Präzision

des Messinstrumentes bestimmt worden. Die relativen Standardabweichungen für

die Hauptkomponenten betragen ca. 1 %. Außerdem ist die Homogenität der

Proben und die Präzision der Probenaufarbeitung durch Präparation von fünf

Parallelen einer Faecesprobe getestet worden. Die relativen Standard-

abweichungen für alle Komponenten variieren zwischen 5 und 6 % (Tab. 8). Die

Unterschiede in den Flächen zwischen beiden Messreihen sind auf verschiedene

Faecesproben und veränderte Spliteinstellungen zurückzuführen. Zur Bestimmung

der Richtigkeit sind zwei Standardlösungen mit einem Gemisch aus

Cholesterylstearat und Cholesterylacetat mit einer Konzentration von je 0,5 mg/ml

hergestellt worden. Daraus folgt eine berechnete Konzentration an Cholesterol im

Gemisch von 0,747 mg/ml. Nach Aufarbeitung der Proben und unter Anwendung

der beschriebenen Messparameter ergibt sich eine mittlere Konzentration an

Cholesterol von 0,724 mg/ml, was einer Wiederfindung von 96,9 % entspricht.

Tabelle 8: Wiederholungsmessungen zur Präzision der Sterolanalyse

Substanz

10 Messwiederholungen von einer Faecesprobe

Wiederholmessungen von 5 Faecesproben desselben Ursprungs

Mw Std.abw. Rel. Std.abw. [%] Mw Std.abw. Rel. Std.abw. [%]

Cholestan 2.583.608 20.865 0,8 1.871.097 97.323 5,2

Coprostanol 1.248.675 11.200 0,9 1.397.510 71.012 5,1

Cholesterol 123.913 500 0,4 99.723 5.496 5,5

Coprostanon 251.121 3.377 1,3 175.020 10.992 6,3

Cholestanol 51.769 1.419 2,7 42.835 2.522 5,9

Mw: Mittelwert der Peakflächen; Std.abw.: Standardabweichung; Rel. Std.abw.: Relative Standard-

abweichung


34

3.1.4 Vergleich der Ergebnisse zwischen derivatisierten und freien Sterolen

Zur Bestimmung von Phytosterolen einschließlich Cholesterol in Ölen hat die

Deutsche Gesellschaft für Fettforschung [DGF 2001] eine internationale Labor-

vergleichsuntersuchung basierend auf der Einheitsmethode DGF-F-III1 (98)

durchgeführt. Diese Methode beinhaltet die Silylierung der Sterole, die von der

Mehrheit der Teilnehmer angewendet wurde. Die Auswertung des an dieser Stelle

interessierenden Cholesterols zeigt, dass die Analyse ohne Derivatisierung eine

zufriedenstellende Vergleichbarkeit zu anderen Laboratorien mit einem z-score

von 0,0 bzw. 0,4 gewährt, wobei |z| ≤ 1 als gutes Ergebnis deklariert wird

(Abb. 15).

Abbildung 15: Vergleich der Ergebnisse von derivatisiertem und freiem

Cholesterol in einer internationalen Laborvergleichsuntersuchung

mit 20 Teilnehmern nach DGF [2001] (eigene Nummer: 30);

Proben: Gemische aus Fisch- und Pflanzenölen

z-Score Sample 701 - Cholesterin

-5-4-3-2-1012345

z-Sc

ore

57

26

68

72

77

61

32 33

62

35

55

39

58 21

10

49

13

30

2

40

z-Score Sample 702 - Cholesterin

-5-4-3-2-1012345

z-Sc

ore

77

49

57

26 13

68

72

33

61

30

32

35 2

40

39

21

10

58

62

55

Lab-ID

Lab-ID


35

3.1.5 Kalibration faecaler Sterole

Zur Quantifizierung sind Standardlösungen mit definierten Konzentrationen im

Bereich von 10 - 2.000 ppm unter Berücksichtigung der in den Faeces

auftretenden Konzentrationsunterschiede und einer internen Standardkonzen-

tration von 500 ppm hergestellt worden. Alle Standardsubstanzen haben eine

Reinheit von > 95 % und sind bei SIGMA Deutschland erworben worden.

Zur Auswertung werden die Quotienten aus den Peakflächen der Sterole und des

internen Standards verwendet. Die Korrelationskoeffizienten liegen im Bereich von

0,9993 und 0,9998 und die relativen Verfahrensstandardabweichungen (Vx0)

zwischen 2,5 und 4,8 % (Tab. 9).

Tabelle 9: Parameter der Kalibration faecaler Sterole

Substanz

Kalibrierbereich (Min - Max) [ppm]

y = mx + n

r2

Rel. sy

[%] sxo

Vxo [%]

NWG [ppm]

Coprostanol 30 - 2.000 m: 0,1519 n: 0,0065 0,9997 2,9 0,017 3,2 1,35

Cholesterol 15 - 1.000 m: 0,5437 n: -0,0060 0,9998 2,6 0,007 2,5 1,19

Coprostanon 15 - 1.000 m: 1,4365 n: -0,0110 0,9998 3,4 0,008 3,3 0,24

Cholestanol 10 - 600 m: 0,6484 n: 0,0070 0,9993 4,5 0,007 4,8 0,90

Cholestanon 10 - 750 m: 3,1206 n: -0,0243 0,9998 2,7 0,005 2,6 0,26

y = mx + n: lineare Kalibrationsfunktion; r2: Korrelationskoeffizient; Rel. sy: Relative Reststreuung; sxo: Verfahrensstandardabweichung; Vxo: Verfahrens-Variations-Koeffizient; NWG: Nachweis-grenze (Signal/Rausch-Verhältnis = 3); Vertrauensbereich: 95 % 3.1.6 Interner Standard: 5α-Cholestan

Da innerhalb der Messung der Proben aus den Humanstudien in einigen Fällen

auffallende Schwankungen der Peakflächen des internen Standards beobachtet

werden, sind methodische Untersuchungen zur Klärung durchgeführt worden.

Lösungsmitteleffekte, Matrixeffekte, Verunreinigungen der Ionenquelle oder des

Injektors, veränderliche Gasflüsse, Injektionsmodi oder die Lagerzeiten der


36

Proben können als Ursachen ausgeschlossen werden. Eine weitere mögliche

Ursache kann ein unterschiedlicher Fragmentierungsgrad aufgrund Verschleiß-

erscheinungen (Oberflächendeformierung) der Filamente des Massen-

spektrometers sein.

Zur Prüfung des Einflusses der veränderlichen Peakflächen des internen

Standards auf die Messergebnisse sind deren funktionelle Zusammenhänge am

Beispiel des Cholesterols bestimmt worden. Der Quotient aus der Peakfläche von

Cholesterol und des internen Standards und die Rohflächen von Cholesterol

korrelieren hochsignifikant bei einer Anzahl von 278 Messungen mit 0,991

(p < 0,001) (Abb. 16). Die Teilung der Werte in zwei scheinbare Gruppen wird

durch das intestinale Verhalten einiger Probanden verursacht, bei denen

Cholesterol im geringen Umfang metabolisiert wird. Unter Ausschluss dieser

Daten korrelieren die Parameter mit 0,985. Hingegen gibt es keine Korrelation

zwischen dem Quotienten und der Fläche des internen Standards. Daher werden

Änderungen in Messergebnissen durch unterschiedliche Konzentrationen des

Analyten in den Faeces und nicht durch unterschiedliche Anteile des internen

Standards in der Probe hervorgerufen.

Abbildung 16: Beziehung zwischen dem Analysenergebnis und dem

Analysenwert von Cholesterol (n = 278; p < 0,001)

y = 4E-07x + 0,0051R2 = 0,991

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000

Fläche Cholesterol

Fläc

he C

hole

ster

ol /

Fläc

he in

t. St

anda

rd


37

3.2 Faecale Gallensäuren 3.2.1 Probenvorbereitung

Aufgrund der Ähnlichkeit zu den Analyten, einfacher Zugänglichkeit und der

zentralen Lage im Chromatogramm wird als interner Standard zur Gallensäuren-

bestimmung Hyodeoxycholsäure (HDCA) gewählt.

Die wässrige Phase der Sterolextraktion wird zur Isolierung der Gallensäuren mit

200 µl 10 M Natronlauge versetzt und 2 h bei 120 °C gehalten. Die entstandenen

Natriumsalze werden durch Zugabe von Salzsäure (25 %) bis pH = 1 in die freien

Säuren überführt. Nach vierfacher Extraktion mit je 1 ml Diethylether, Vereinigung

der Etherextrakte und der Zugabe von 125 µg HDCA wird das Lösungsmittel unter

einem Stickstoffstrom bis zur Trockne eingedampft. Die Methylierung erfolgt durch

Zugabe von 650 µl Dimethoxypropan, 950 µl Methanol und 50 µl methanolischer

Salzsäure (3 N) bei einer Temperatur von 50 °C für 45 min. Die Reaktionslösung

wird bis zur Trockne eingedampft, in 150 µl Sylon (Hexamethyldi-

silazan : Trimethylchlorsilan : Pyridin = 3 : 1 : 9, Fa. SUPELCO, Deutschland)

aufgenommen und eine Stunde bei 90 °C silyliert. Nach Abdampfen unter einem

Stickstoffstrom wird der Rückstand in 250 µl Decan gelöst, 10 min geschüttelt und

20 min bei 3.000 Umdrehungen/min zentrifugiert. Der klare Überstand wird

abgenommen und 1 µl wird in den Gaschromatographen injiziert. 3.2.2 Analyse mit GC/MS QP 5000

3.2.2.1 Probleme der gaschromatographischen Analyse

Zur gaschromatographischen Analyse werden von iso-LCA, LCA, iso-DCA, DCA,

CDCA, CA, HDCA, HCA, UDCA, 12-Oxo-DCA, 3-Oxo-LCA, 3,7-Dioxo-CDCA und

3,7,12-Trioxo-CA einzelne Chromatogramme im SCAN-Modus aufgenommen. Im

Gegensatz zu 12-Oxo-DCA bilden Gallensäuren mit einer 3-Oxogruppe infolge der

Probenvorbereitung Artefakte, die im Chromatogramm sichtbar werden (vgl.

2.1.2.3, Abb. 17).


38

Abbildung 17: Übereinanderliegende Darstellung der Chromatogramme von

3-Oxo-LCA (blau) und 12-Oxo-DCA (grün)

Unter Ausschluss der instabilen Verbindungen kann eine zufriedenstellende

Separation der Gallensäuren in einem Standardgemisch mit einer unpolaren

Kapillarsäule (ZB 5; 30 m; 0,25 mm; 0,25 µm df) erreicht werden (Abb. 18).

Abbildung 18: Chromatogramm (SCAN) eines Gallensäurenstandardgemisches 3.2.2.2 Probleme der massenspektrometrischen Detektion

Da die humane Stuhlprobe eine komplexe Matrix mit vielen möglichen

Verunreinigungen darstellt, wird trotz zufriedenstellender Separation der

interessierenden Gallensäuren eine Quantifizierung im SIM-Modus bevorzugt, um

Fehler durch Peakunreinheiten weitestgehend auszuschließen. Daher sind die

Massenspektren bei 70 eV von iso-LCA, LCA, iso-DCA, DCA, CDCA, CD, HDCA,

UDCA und 12-Oxo-DCA zur Auswahl geeigneter Fragmente registriert worden

(Tab. 10). Molekülionen können nur für 12-Oxo-DCA nachgewiesen werden, alle

anderen Gallensäuren fragmentieren in kleinere Bruchstücke (Abb. 19).

UD

CA

HC

A

12-O

xo-

DC

A HD

CA

CD

CA

CA

DC

A is

o-D

CA

LCA

iso-

LCA


39

Abbildung 19: Massenspektren faecaler Gallensäuren

12-Oxo-DCA

iso-LCA

LCA

iso-DCA

DCA

CDCA

CA

HDCA

UDCA


40

Tabelle 10: Auswahl spezifischer Fragmente zur SIM-Detektion der Gallensäuren

Substanz Fragment Relative Intensität [%]

iso-LCA 215,25 31

LCA 215,25 58

iso-DCA 75,10 91 DCA 255,30 93

CDCA 73,10 100

CA 253,20 44 HDCA 81,15 45

UDCA 460,00 14

12-Oxo-DCA 231,25 52

Um eine größtmögliche Peakreinheit in Faecesproben zu sichern, sind weiterhin

Multi Ion Chromatogramme (MIC) von Standard- und Faecesproben erstellt

worden. Dabei hat sich eine Koelution einer weiteren Steroidverbindung mit

Cholsäure in Faecesproben gezeigt, die im SCAN-Modus nicht zu erkennen ist.

Während im Standard die relativen Intensitäten der Fragmente m/z = 253,20 und

m/z = 255,30 ein Verhältnis von 25 : 1 aufweisen, zeigt sich in der Faecesprobe

ein Verhältnis von ca. 1 : 1 und eine Verschiebung der Peakmaxima (Abb. 20).

Abbildung 20: Chromatogramm (MIC) von Cholsäurestandard (I) und Cholsäure

in den Faeces (II)

I

II


41

Aufgrund der höheren Messempfindlichkeit sind wahrscheinlich weitere Isomere

der DCA [SJÖVALL et al. 1971] und die 12-Oxo-3α-Hydroxy-5α-Cholansäure als

trans-Isomer der 12-Oxo-DCA zu finden [SETCHELL et al. 1983] (Abb. 21, Abb. 22).

Da sie in geringen Mengen in den Faeces vorliegen oder Vergleichssubstanzen

nicht zur Verfügung stehen, ist von einer weitergehenden Identifikation abgesehen

worden. Faecale Sterole werden im Diethyletherextrakt nicht nachgewiesen.

Abbildung 21: Vermutliche Isomere der DCA

1 - 2: nicht strukturell analysiert; 3: iso-DCA; 4: DCA

3.2.2.3 Messparameter

Alle Messungen werden auf einer unpolaren Kapillarsäule (ZB 5; 30 m; 0,25 mm;

0,25 µm df) bei einer Injektortemperatur von 280 °C und einer Interfacetemperatur

von 300 °C durchgeführt. Helium wird als mobile Phase mit einer konstanten,

linearen Geschwindigkeit von 32 cm/sec verwendet; das Splitverhältnis ist auf 1:50

eingestellt. Die Ofentemperatur folgt einem programmierten Temperaturverlauf mit

abschließender Ausheizphase (150 °C 5 min, 40 °C/min 240 °C, 1 °C/min 255 °C,

4 °C/min 270 °C, 1 °C/min 278 °C, 278 °C 9 min, 40 °C/min 290 °C, 290 °C

4,7 min). Am Detektor wird mit einer Spannung von 1,5 kV gearbeitet und die

Daten werden mit einer Geschwindigkeit von 5 Messungen pro Sekunde

aufgezeichnet. Mit diesen Parametern werden Chromatogramme von

Faecesproben erhalten, die zur Quantifizierung geeignet sind (Tab. 11, Abb. 22).

1 2

3 4


42

Tabelle 11: Retentionszeiten der Gallensäuren

Substanz Absolute Retentionszeit [min] Relative Retentionszeit [min]

iso-LCA 33,9 0,90

LCA 34,3 0,91

iso-DCA 35,8 0,95

DCA 36,4 0,97 CDCA 37,0 0,98

CA 37,4 0,99

HDCA 37,6 1,00 12-Oxo-DCA 42,0 1,12

Abbildung 22: Gallensäurenchromatogramm einer Faecesprobe 1: iso-LCA; 2: LCA; 3: iso-DCA; 4: DCA; 5: CDCA; 6: CA;

7: HDCA; 8: 12-Oxo-3α-Hydroxy-5α-Cholansäure (?);

9: 12-Oxo-DCA

1 2

3 4

5 6

7

8 9


43

3.2.3 Präzision und Richtigkeit

Zur Prüfung der Präzision des Messverfahrens und des Messgerätes werden

Wiederholungsmessungen an Faecesproben durchgeführt. Die Abweichungen

vom Mittelwert der einzelnen Verbindungen nach 10 Messungen einer Probe

liegen zwischen 1,2 % und 2,0 %, währenddessen in diesem Verfahren die

Ergebnisse für UDCA mit 5,2 % sehr breit streuen. Außerdem sind für diese

Gallensäure große Unterschiede (18 %) zwischen 5 Parallelbestimmungen einer

Faecesprobe gefunden worden. Eine mögliche Ursache ist die geringe Ausbeute

des Fragmentes m/z = 460,00 mit einer relativen Intensität von 14 %. Alle anderen

Gallensäuren weisen relative Standardabweichungen von 3,5 bis 8,4 % auf

(Tab. 12).

Tabelle 12: Wiederholungsmessungen zur Präzision der Gallensäurenanalyse

Substanz

10 Messwiederholungen von einer Faecesprobe

Wiederholmessungen von 5 Faecesproben desselben Ursprungs

Mw Std.abw. Rel. Std.abw. [%] Mw Std.abw. Rel. Std.abw. [%]

iso-LCA 570.233 8.101 1,4 590.683 23.751 4,0

LCA 1.758.567 21.807 1,2 1.795.491 62.970 3,5

iso-DCA 316.836 4.232 1,3 341.076 23.324 6,8

DCA 9.611.130 122.281 1,3 9.414.557 484.863 5,2

CDCA 368.649 7.271 2,0 393.243 32.938 8,4

CA 1.060.947 19.536 1,8 916.449 72.372 7,9

HDCA 1.278.417 17.764 1,4 1.366.799 80.645 5,9

UDCA 34.481 1.778 5,2 17.442 3.135 18,0

12-Oxo-DCA 74.388 1.327 1,8 68.339 3.807 5,6

Mw: Mittelwert der Peakflächen; Std.abw.: Standardabweichung; Rel. Std.abw.: Relative Standard-abweichung Zwei Parallelproben zu je 1 ml einer Lösung von Deoxycholsäure-

methylesteracetat (1 mg/ml, M = 448 g/mol) sind analog der beschriebenen

Probenaufarbeitung und -messung behandelt und quantifiziert worden. Der

theoretische Deoxycholsäuregehalt beträgt 0,875 mg/ml. Der Mittelwert der

gemessenen Konzentrationen beträgt 0,916 mg/ml. Das entspricht einer

Abweichung von 4,5 %.


44

3.2.4 Kalibration der Gallensäuren

Die Quantifizierung erfolgt analog den Sterolen nach der Methode des internen

Standards mittels Verhältnisbildung. Die Konzentration des internen Standards

HDCA beträgt 500 ppm, der Gehalt der Gallensäuren in den Kalibrationsstandards

liegt zwischen 5 und 2.000 ppm. Da UDCA während den Wiederholungs-

messungen starken Schwankungen unterlegen ist, HCA in den humanen Faeces

nicht vorkommt [SETCHELL et al. 1983, BATTA et al. 1999, BARKER et al. 1994,

SRIKUMAR et al. 1998] und 3-Oxo-Gallensäuren Artefakte bilden, werden sie in der

Kalibration nicht berücksichtigt. Die Standardsubstanzen iso-LCA, iso-DCA,

12-Oxo-DCA (STERALOIDS, USA), LCA, DCA, CDCA, CA und HDCA (SIGMA,

Deutschland) haben eine Reinheit von > 95 %. Die linearen Funktionen korrelieren

mit 0,9997 bis 0,9999 und die relativen Verfahrensstandardabweichungen

überschreiten 5 % nicht (Tab. 13).

Tabelle 13: Parameter der Kalibration faecaler Gallensäuren

Substanz

Kalibrierbereich (Min - Max) [ppm]

y = mx + n

r2

Rel. sy

[%] sxo

Vxo [%]

NWG [ppm]

iso-LCA 5 - 500 m: 1,9069 n: 0,0001 0,9997 3,0 0,003 3,0 0,45

LCA 10 - 1.000 m: 2,5449 n: -0,0007 0,9999 1,7 0,004 1,7 0,31

iso-DCA 5 - 500 m: 3,2289 n: -0,0095 0,9998 2,1 0,003 2,0 0,86

DCA 20 - 2.000 m: 7,7257 n: 0,0079 0,9998 3,2 0,013 3,2 0,16

CDCA 5 - 500 m: 3,8610 n: -0,0046 0,9999 1,1 0,001 1,1 1,43

CA 10 - 1.000 m: 3,6655 n: -0,0023 0,9999 0,3 0,001 0,3 0,64

12-Oxo-DCA 5 - 500 m: 1,9047 n: -0,0028 0,9999 1,0 0,001 1,0 0,61

y = mx + n: lineare Kalibrationsfunktion; r2: Korrelationskoeffizient; Rel. sy: Relative Reststreuung; sxo: Verfahrensstandardabweichung; Vxo: Verfahrens-Variations-Koeffizient; NWG: Nachweis-grenze (Signal/Rausch-Verhältnis = 3); Vertrauensbereich: 95 %


45

3.2.5 Interner Standard: Hyodeoxycholsäure

Um den Einfluss von Schwankungen in der Peakfläche des internen Standards auf

das Analysenergebnis zu untersuchen, sind die funktionellen Zusammenhänge

zwischen dem Quotienten aus der Peakfläche des Analyten DCA und des internen

Standards und der Peakfläche von DCA untersucht worden (vgl. 3.1.6). Bei einem

Probenumfang von 261 Messungen ergibt sich eine hochsignifikante Korrelation

von 0,819 (p < 0,001) zwischen dem Analysenergebnis und der Fläche von DCA.

Es existiert kein signifikanter mathematischer Zusammenhang (linear, quadratisch,

logarithmisch, exponentiell) zur Fläche des internen Standards HDCA (Abb. 23).

Diese Beziehungen gelten für jede quantifizierte Gallensäure in allen untersuchten

Humanstudien.

Abbildung 23: Beziehung zwischen dem Analysenergebnis und dem Analysen-

wert von DCA (oben, p < 0,001) bzw. internem Standard (unten);

n = 261

y = 3E-07x + 0,4695R2 = 0,819

0

5

10

15

20

0 17500000 35000000 52500000 70000000

Fläche DCA

Fläc

he D

CA

/Fl

äche

inte

rner

Sta

ndar

d

y = -9E-07x + 11,018R2 = 0,0324

0

5

10

15

20

1500000 3000000 4500000 6000000

Fläche interner Standard

Fläc

he D

CA

/Fl

äche

inte

rner

Sta

ndar

d

Humanstudien

46

4 HUMANSTUDIEN

Alle Studien sind vor ihrem Beginn von der Ethikkommission der Medizinischen

Fakultät der Friedrich-Schiller-Universität Jena auf ihre Durchführbarkeit geprüft

und genehmigt worden. Die Probanden erklärten ihre freiwillige Teilnahme.

4.1 Supplementation von Calciumphosphaten

In einer Humanstudie (Studie 1) mit 11 männlichen Probanden wird eine Diät mit

einer gesteigerten Zufuhr von Calcium und Phosphor im Verhältnis Ca : P = 1 : 1,3

verzehrt [GRIMM 2000]. Nach einer dreiwöchigen Basisperiode, in der die

Probanden ein 7-Tage-Ernährungsprotokoll erstellen, folgen zwei Zulageperioden

mit einer Dauer von je zwei Wochen. Auf der Basis der Ergebnisse aus den

Verzehrsdaten wird eine Standarddiät mit einem Calciumgehalt von 1.231 mg/d

und einem Phosphorgehalt von 1.600 mg/d erstellt. In der ersten Zulageperiode

werden täglich 609 mg Calcium und 793 mg Phosphor in Form von Tabletten

supplementiert, was einer gesteigerten Zufuhr von 50 % entspricht. Die Tabletten

setzen sich aus Tricalciumphosphat (41,6 %), Mononatriumphosphat (29,7 %),

Dinatriumphosphat (25,2 %) und Tablettierzusatz (3,5 %) zusammen. In der

zweiten Zulageperiode wird die Dosis verdoppelt, so dass die tägliche

Gesamtaufnahme an Calcium 2.462 mg und an Phosphor 3.200 mg beträgt

(Tab. 14).

Humanstudien

47

Stud

ie 4

Lact

obac

illus

acid

ophi

lus

145

Bifid

obac

teriu

m s

peci

es 4

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Jogh

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13 M

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r; 13

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25 ±

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Stud

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Stud

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Lact

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Stud

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Ca

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Humanstudien

48

4.2 Supplementation von probiotischer Rohwurst

In einer Interventionsstudie (Studie 2) wird Lactobacillus paracasei LTH 2579

(108 KBE/g) an 10 männliche und 10 weibliche gesunde Probanden verabreicht

[JAHREIS et al. 2002]. Die Probanden durchlaufen zwei Versuchsperioden, in

denen täglich 50 g Rohwurst verzehrt wird. In der ersten Periode erhalten alle

Teilnehmer eine konventionelle und in der zweiten eine probiotische Wurst. Beide

Versuchsphasen dauern je 5 Wochen und innerhalb der letzten 9 Tage wird

jeweils eine vollständig vorgegebene Diät bereitgestellt, die aus den Ergebnissen

von zuvor erfassten Ernährungsprotokollen der Probanden zusammengestellt ist

(Tab. 14).

4.3 Supplementation von probiotischem Joghurt In randomisierten, placebo-kontrollierten Doppelblindstudien (Studien 3 und 4)

werden die Effekte verschiedener, mit probiotischen Bakterien supplementierter

Joghurts untersucht. Der Testjoghurt der dritten Studie enthält Lactobacillus

acidophilus 145 (106-108 KBE/g) und Bifidobacterium longum 913 (105 KBE/g)

[KIEßLING et al. 2002]. Die Studie ist in drei 7-wöchige Perioden strukturiert, wobei

die erste eine Adaptationsphase mit konventionellem Joghurt darstellt. Die

Starterkulturen zur Fermentation sind Streptococcus thermophilus und

Lactobacillus lactis.

Die 29 normocholesterolämischen oder moderat hypercholesterolämischen

Frauen sind auf zwei Gruppen verteilt. Sie verzehren anschließend über

7 Wochen entweder 300 g konventionellen Joghurt oder Testjoghurt und das

Supplement wechselt in den folgenden 7 Wochen.

In der vierten Studie erhalten je 13 männliche und weibliche Probanden täglich

300 g mit Lactobacillus acidophilus 742 (107 KBE/ml) und Bifidobacterium species

420 (104 KBE/ml) versetzten Joghurt [KLEIN et al. 2002]. Im Gegensatz zu Studie 3

wird während der ersten Phase kein Kontrolljoghurt gegeben, als Starterkulturen

werden Streptococcus thermophilus und Lactobacillus bulgaricus eingesetzt und

die beiden Studienphasen dauern je 5 Wochen (Tab. 14).

Humanstudien

49

4.4 Stuhlproben und in der Auswertung berücksichtigte Parameter Die Stuhlproben werden in jeder Studie auf die gleiche Weise erfasst. Während

den letzten 7 - 9 Tagen der Basis-, Kontroll-, Adaptations- oder Zulageperioden

wird jedem Proband die gesamte Diät auf der Basis von zuvor ausgewerteten

Ernährungsprotokollen vorgegeben. Nach einer zweitägigen Ausschleusphase

wird der Stuhl über 5 bzw. 7 Tage quantitativ gesammelt, tiefgefroren, am Ende

der Studie homogenisiert und gepoolt (Abb. 24). Aus den Proben werden Aliquote

lyophilisiert und ihr Sterol- und Gallensäurengehalt analysiert (vgl. 3).

Abbildung 24: Struktur einer Studienperiode

Neben der Bestimmung der faecalen Steroide werden weitere Erhebungen aus

den Studien berücksichtigt und statistisch ausgewertet.

• Studie 1: Frisch- und Gefriertrockensubstanzexkretion

pH-Wert im Stuhl

• Studie 2: Frisch- und Trockensubstanzexkretion

pH-Wert im Stuhl

Keimzahlbestimmung der Lactobacillen im Stuhl

Fettaufnahme


pH-Wert im Stuhl

Fettaufnahme

1 - 6 Wochen 2 Tage 5 - 7 Tage Basis-, Kontroll-, Ausschleusphase Sammelphase Adaptations- oder Zulageperiode

Standardisierte Diät

Humanstudien

50

Gesamtcholesterolkonzentration im Serum

LDL-Cholesterolkonzentration im Serum

HDL-Cholesterolkonzentration im Serum

Triglyceridkonzentration im Serum


pH-Wert im Stuhl

Fettaufnahme

LDL-Cholesterolkonzentration im Serum

HDL-Cholesterolkonzentration im Serum

4.5 Statistik Zur Auswertung aller erhobenen Parameter wird die Computer-Software SPSS

10.0 unter Anwendung des allgemeinen linearen Modells für Messwiederholungen

eingesetzt. Diese Statistik berücksichtigt die Änderungen der abhängigen

Variablen bei wiederholter Erhebung von Daten zur Untersuchung des

interessierenden Einflusses (Calcium, Probiotika, Joghurt) im Einzelfall. Es

beschreibt die Unterschiede der mittleren Differenz geschätzter Randmittel im

untersuchten Einfluss. Dadurch werden inter-individuelle Unterschiede weniger

gewichtet als bei dem Vergleich von Mittelwerten mittels t-Test und F-Test.

Eventuelle Einflüsse der faecalen pH-Werte (Studie 1), der Keimzahlen an

Lactobacillen im Stuhl (Studie 2), der Serumkonzentrationen an Cholesterol

(Studie 3), der Reihenfolge der Supplementation (Studie 3, 4) und geschlechts-

spezifische Unterschiede (Studie 4) haben in diesem mathematischen Modell als

Zwischensubjektfaktoren Anwendung gefunden. Bei einem Auftreten von

signifikanten Unterschieden in diesen Faktoren werden die Mittelwerte zwischen

den jeweiligen Gruppen (normocholesterolämische vs. hypercholesterolämische

Probanden, Frauen vs. Männer) mit Hilfe des Modells der einfaktoriellen ANOVA

statistisch geprüft. In allen Studien werden sowohl die jeweiligen Gehalte in der

Stuhltrockensubstanz als auch die tägliche Exkretion der Sterole bzw.

Gallensäuren ausgewertet.

Ergebnisse

51

5 ERGEBNISSE 5.1 Studie 1 - Supplementation von Calciumphosphaten In allen drei Perioden sind weder in der Exkretion an Frischsubstanz noch an

Gefriertrockensubstanz Änderungen zu verzeichnen (Tab. 15). In der ersten

Zulageperiode ist eine signifikante Verminderung des pH-Wertes in den Faeces

festzustellen, obwohl keine Änderungen in den Konzentrationen an kurzkettigen,

flüchtigen Fettsäuren im Stuhl aufgetreten sind [GRIMM 2000].

In der Auswertung der faecalen Exkretion wird ein Proband (Nr. 24)

ausgeschlossen, da dieser sowohl in der Ausscheidung der Sterole als auch der

Gallensäuren ein inverses Steroidprofil aufweist (Abb. 25). Das bedeutet, dass die

Gehalte der Ausgangsverbindungen (Cholesterol, primäre Gallensäuren) größer

oder gleich den Gehalten der bakteriellen Metabolisierungsprodukte (Coprostanol,

sekundäre Gallensäuren) sind (vgl. 6.2).

Tabelle 15: Mittlere Stuhlausscheidung in Studie 1

Periode I Periode II Periode III

Gefriertrockensubstanz [g/d] 39,2 ± 6,6 40,0 ± 13,4 45,3 ±14,0

Frischsubstanz [g/d] 164 ± 42 164 ± 63 180 ± 80

pH 6,9 ± 0,2 6,6 ± 0,2a 6,8 ± 0,2

a: Signifikanz zu Periode I (p < 0,05)

Ergebnisse

52

Abbildung 25: Steroidexkretion der Probanden 24 und 25 in Studie 1

I - III: Nummer der Perioden; Prim. GS: Primäre Gallensäuren;

Sek. GS: Sekundäre Gallensäuren

Die Konzentrationen der faecalen Gallensäuren in der Gefriertrockensubstanz

ändern sich im gesamten Verlauf der Studie nicht, jedoch sind in den

Cholesterolmetaboliten Coprostanon und Cholestanol signifikante Konzentrations-

unterschiede durch die Calciumphosphatzulage zu verzeichnen (Abb. 26).

Abbildung 26: Sterolkonzentrationen in der Gefriertrockensubstanz

Stern: Signifikanz zu Periode I (p < 0,05)

0

200

400

600

800

Exkr

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n [m

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S II

Choles

terol

III

Copros

tanol

III

Prim. G

S III

Sek. G

S III

Proband 24 Proband 25

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

Periode I Periode II Periode III

[mg/

g G

TS]

0

10

20

30

40

Cop

rost

anol

[mg/

g G

TS]

Cholesterol Coprostanon Cholestanol Coprostanol

Ergebnisse

53

Durch Zulage von Calciumphosphaten wird die tägliche Exkretion der Sterole und

der Gallensäuren nicht beeinflusst. Lediglich die Gehalte an Coprostanon sind in

Periode III bei einer Gesamtaufnahme von Calcium mit 2.462 mg/d und von

Phosphor mit 3.200 mg/d im Vergleich zur Kontrollperiode I signifikant erhöht

(Tab. 16). Weiterhin werden keine Unterschiede in den faecalen

Steroidkonzentrationen von Probanden mit einer Verminderung des pH-Wertes

(> 5 %) im Vergleich zu den restlichen Probanden festgestellt.

Tabelle 16: Faecale Exkretion an Sterolen und Gallensäuren in Studie 1 [mg/d]

Periode p

I II III I : II I : III II : III

Cholesterol 59,7 ± 27,9 68,2 ± 31,2 90,4 ± 89,7 0,519 0,245 0,522

Coprostanol 879 ± 421 646 ± 232 739 ± 323 0,193 0,372 0,471

Coprostanon 45,0 ± 20,5 55,8 ± 26,4 68,5 ± 35,6 0,271 0,010 0,232

Cholestanol 15,0 ± 2,0 14,3 ± 4,5 15,0 ± 4,3 0,425 0,989 0,511

Gesamt 998 ± 445 784 ± 77 912 ± 127 0,246 0,552 0,367

Metabolite 939 ± 437 716 ± 234 822 ± 349 0,218 0,460 0,419

Konversion [%] 92 ± 6 90 ± 5 88 ± 10 0,219 0,209 0,678

iso-LCA 56,4 ± 27,9 55,4 ± 26,9 56,3 ± 25,0 0,888 0,981 0,874

LCA 88,8 ± 30,8 92,2 ± 35,5 97,2 ± 42,7 0,673 0,450 0,498

iso-DCA 38,5 ± 30,2 40,2 ± 35,0 42,7 ± 30,4 0,819 0,137 0,661

DCA 144 ± 68 157 ± 101 158 ± 81 0,532 0,456 0,960 12-Oxo-DCA 18,4 ± 10,3 19,4 ± 15,6 19,3 ± 10,3 0,645 0,600 0,965

CDCA 8,83 ± 9,13 8,94 ± 7,19 8,85 ± 7,37 0,956 0,984 0,941

CA 17,8 ± 25,7 19,4 ± 24,4 14,8 ± 15,1 0,739 0,462 0,383

Gesamt 373 ± 132 392 ± 200 397 ± 165 0,647 0,517 0,905

Sek. GS 346 ± 117 364 ± 182 373 ± 153 0,645 0,458 0,780

Prim. GS 27 ± 35 28 ± 31 24 ± 22 0,795 0,532 0,419 Prim./Sek. 0,074 ± 0,099 0,073 ± 0,075 0,058 ± 0,051 0,931 0,445 0,138

Prim./Sek.: Verhältnis zwischen primären und sekundären Gallensäuren

Ergebnisse

54

5.2 Studie 2 - Supplementation von probiotischer Rohwurst

Die tägliche Stuhlausscheidung unterscheidet sich zwischen Männern und Frauen

sowohl in der Trocken- als auch in der Frischsubstanz signifikant (p < 0,01).

Weiterhin ist eine signifikante bzw. tendenzielle Verminderung der Exkretion an

Trockensubstanz (p = 0,02) bzw. Frischsubstanz (p = 0,056) aller Probanden in

der zweiten Periode festzustellen. Der pH-Wert des Stuhles bleibt unverändert. Im

Stuhl sind die Keimzahlen an Lactobacillen nach Zulage von L. paracasei in der

zweiten Periode signifikant erhöht (p = 0,002) (Tab. 17).


Trockensubstanz Frischsubstanz Keimzahl an Lactobacillen pH

[g/d] [g/d] [KBE/g Stuhl]

log10

Periode I gesamt 32,0 ± 7,7 121 ± 35 5,25 ± 1,22 6,74 ± 0,34 Männer 37,0 ± 8,0 142 ± 42 5,23 ± 0,97 6,54 ± 0,43

Frauen 27,0 ± 7,41 101 ± 271 5,27 ± 1,44 6,94 ± 0,43

Periode II gesamt 26,1 ± 6,9a 105 ± 43 6,19 ± 0,72b 6,74 ± 0,30 Männer 32,1 ± 6,9 133 ± 48 6,26 ± 0,44a 6,68 ± 0,25

Frauen 20,1 ± 6,81a 76 ± 371a 6,12 ± 0,93 6,81 ± 0,34

1: Signifikanz zwischen Geschlecht (p < 0,01); a: Signifikanz zu Periode I (p < 0,05); b: Signifikanz zu Periode I (p < 0,01)

In der statistischen Auswertung der faecalen Sterole sind die Probanden 10 und

12 nicht berücksichtigt worden, da sie jeweils in einer Periode ein inverses

Verhältnis von Coprostanol und Cholesterol aufweisen.

Frauen scheiden signifikant weniger Cholestanol, Cholestanon, iso-LCA, LCA und

iso-DCA als Männer aus (Tab. 18). Unter Berücksichtigung einer normierten

Fettaufnahme (100 g/d) sind die Unterschiede in der Gallensäurenexkretion

zwischen den Geschlechtern mit Ausnahme der 12-Oxo-DCA nicht nachzuweisen

(Tab. 19).

Ergebnisse

55

< 10

6 [KBE

/g]

27,3

± 2

7,6

573

± 26

6

63,4

± 4

5,8

11,1

± 1

,5

3,07

± 0

,56

706

± 26

9

651

± 27

4

94 ±

5

42,8

± 1

4,0

53,7

± 2

0,4c

24,4

± 1

5,8

145

± 69

16,8

± 7

,8

3,99

± 5

,99

4,83

± 8

,64

291

± 13

3

282

± 10

5

9 ±

18

0,03

1 ±

0,04

8

Keim

zahl

an

Lact

obac

illen

> 10

6 [KBE

/g]

55,5

± 2

7,8

619

± 26

7

50,0

± 4

6,2

11,9

± 1

,7

3,32

± 0

,58

772

± 27

0

684

± 27

6

91 ±

5

56,7

± 1

3,9

85,2

± 2

0,5

40,5

± 1

5,9

166

± 71

12,7

± 7

,4

7,74

± 6

,04

10,1

± 8

,7

379

± 11

3

361

± 10

7

18 ±

14

0,05

5 ±

0,04

6

Frau

en

29,0

± 3

1,7

504

± 30

8

32,5

± 5

2,9

10,2

± 1

,9b

2,64

± 0

,72b

603

± 28

8

549

± 31

7

93 ±

6

36,1

± 1

6,8b

51,8

± 2

4,6b

20,2

± 1

8,9b

135

± 85

12,1

± 9

,3

5,04

± 7

,30

7,57

± 1

0,41

273

± 13

61

260

± 12

92

13 ±

17

0,05

2 ±

0,05

7

G

esch

lech

t

Män

ner

53,8

± 3

3,0

688

± 32

0

80,9

± 5

5,2

12,8

± 2

,0

3,75

± 0

,70

874

± 32

3

786

± 33

0

93 ±

6

63,3

± 1

7,4

87,2

± 2

5,3

44,8

± 1

9,6

177

± 88

17,3

± 9

,8

6,70

± 7

,61

7,32

± 1

0,79

398

± 14

1

384

± 13

4

14 ±

18

0,03

4 ±

0,06

0

I

I

39,7

± 5

0,3

543

± 36

0

50,5

± 4

5,4

9,7

± 2,

8a

2,71

± 0

,83a

671

± 36

8

606

± 37

0

93 ±

9

44,7

± 2

3,5

70,0

± 3

6,6

27,3

± 1

7,9a

122

± 86

a

10,4

± 1

0,5a

5,34

± 1

1,10

5,97

± 1

5,31

276

± 15

8a

264

± 14

7a

11 ±

26

0,04

0 ±

0,06

1

Perio

de

I

43,1

± 3

4,6

649

± 36

4

62,9

± 7

1,3

13,3

± 3

,3

13,3

± 3

,3

806

± 39

5

729

± 39

1

93 ±

7

54,7

± 2

0,5

83,9

± 3

0,1

37,7

± 2

4,4

190

± 10

3

19,1

± 1

4,8

6,39

± 8

,40

8,91

± 1

1,79

395

± 15

8

380

± 15

2

15 ±

20

0,04

7 ±

0,07

4

Cho

lest

erol

Cop

rost

anol

Cop

rost

anon

Cho

lest

anol

Cho

lest

anon

Ges

amt

Met

abol

ite

Konv

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on [%

]

iso-

LCA

LCA

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DC

A

DC

A

12-O

xo-D

CA

CD

CA

CA

Ges

amt

Sek.

GS

Prim

. GS

Prim

./Sek

.

a : Sig

nifik

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iode

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< 0

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band

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er 1

06 KBE

/g

Stuh

l; 1 : p

= 0

,068

; 2 : p =

0,0

58; P

rim./S

ek.:

Verh

ältn

is z

wis

chen

prim

ären

und

sek

undä

ren

Gal

lens

äure

n

Tabe

lle 1

8: F

aeca

le E

xkre

tion

an S

tero

len

und

Gal

lens

äure

n in

Stu

die

2 [m

g/d]

Ergebnisse

56

Die Zulage von L. paracasei bewirkt keine Änderung der Konversionsrate von

Cholesterol in die bakteriellen Metabolite und beeinflusst nicht das Verhältnis von

primären zu sekundären Gallensäuren. Allerdings zeigt sich eine geringere

Konzentration der Gesamtgallensäuren in den Faeces, die durch eine verminderte

Exkretion sekundärer Gallensäuren verursacht wird. Weiterhin sind die Probanden

mit einer Keimzahl an Lactobacillen in der zweiten Periode über und unter

106 KBE/g Stuhl differenziert betrachtet worden. Eine signifikant erhöhte tägliche

Ausscheidung an LCA ist in Probanden mit hohen Keimzahlen zu beobachten,

außerdem haben sie tendenziell erhöhte Konzentrationen an Cholesterol, iso-LCA

und iso-DCA im Stuhl (Tab. 18).

Wird die signifikant verminderte Stuhlausscheidung in der zweiten Periode

berücksichtigt, und die Steroidexkretion auf eine Trockensubstanzexkretion von

30 g/d bezogen, treten keine Unterschiede nach Zulage von L. paracasei in den

faecalen Gallensäurengehalten auf (Tab. 19). Dieses Ergebnis wird durch

unveränderte Konzentrationen an Gallensäuren in der faecalen Trockensubstanz

bestätigt. Eine tendenzielle Verminderung der DCA im Stuhl ist weiter vorhanden

(p = 0,085).

Tabelle 19: Tägliche Gallensäurenexkretion [mg/d] unter Berücksichtigung der

Fettaufnahme und Trockensubstanzexkretion

Normierte Fettaufnahme (100 g/d) Normierte TS-Exkretion (30 g/d) Männer Frauen p Periode I Periode II p

Cholesterol 69,4 ± 64,4 41,4 ± 18,4 0,104 47,7 ± 26,3 53,6 ± 40,8 0,539

Coprostanol 671 ± 268 679 ± 411 0,943 640 ± 329 688 ± 412 0,429

iso-LCA 57,7 ± 21,0 53,7 ± 20,2 0,677 52,5 ± 24,4 57,1 ± 25,7 0,193

LCA 80,9 ± 34,1 72,7 ± 32,9 0,602 73,7 ± 23,5 72,0 ± 28,3 0,785

iso-DCA 42,1 ± 24,8 27,4 ± 23,9 0,205 34,7 ± 24,4 32,4 ± 19,6 0,533

DCA 167 ± 101 186 ± 97 0,684 174 ± 72 148 ± 62 0,085

12-Oxo-DCA 11,1 ± 12,3 23,6 ± 11,8 0,093 16,6 ± 10,3 13,4 ± 16,5 0,479

CDCA 6,74 ± 9,52 6,61 ± 9,17 0,975 6,04 ± 8,00 6,06 ± 10,51 0,996

CA 7,38 ± 13,32 9,88 ± 12,82 0,682 8,73 ± 12,41 6,85 ± 14,72 0,629

Gesamt 373 ± 180 379 ± 173 0,935 366 ± 120 336 ± 115 0,209

Sek. GS 359 ± 166 363 ± 159 0,954 352 ± 116 323 ± 109 0,179

Prim. GS 14 ± 22 16 ± 22 0,817 14 ± 20 13 ± 25 0,781

TS: Trockensubstanz

Ergebnisse

57

5.3 Studie 3 - Supplementation von probiotischem Joghurt

In der im cross-over Design durchgeführten Interventionsstudie mit

Supplementation von Lactobacillus acidophilus 145 und Bifidobacterium

longum 913 in Joghurt scheiden die Probanden nach Gabe des probiotischen

Produktes signifikant weniger Stuhl aus (Tab. 20). Der pH-Wert ist sowohl nach

konventioneller als auch nach probiotischer Joghurtzulage signifikant zur

Adaptationsperiode, in der über 7 Wochen das konventionelle Produkt verzehrt

wurde, vermindert.


Adaptation Konventioneller Joghurt Probiotischer Joghurt

Gefriertrockensubstanz [g/d] 31,0 ± 7,3 27,7 ± 7,3 26,6 ± 8,2a

Frischsubstanz [g/d] 113 ± 39 106 ± 39 97 ± 38a

pH 7,15 ± 0,60 6,86 ± 0,42a 6,91 ± 0,53a

a: Signifikanz zu Adaptation (p < 0,05)

Bei der Auswertung der neutralen Sterole werden zwei Probanden aufgrund ihres

inversen Sterolprofiles ausgeschlossen. In der Exkretion der Gallensäuren zeigt

sich kein konträres Verhalten, so dass sie in die Statistik mit aufgenommen

werden können.

Die tägliche Exkretion von Cholesterol und dessen bakteriellen Abbauprodukten

ändert sich durch Gabe von Joghurt nicht. Auch der Zusatz von probiotischen

Keimen verursacht keine signifikante Beeinflussung der Sterolexkretion. Die

Konversionsrate bleibt unverändert bei ca. 88 %.

Sowohl nach konventionellem als auch nach probiotischem Joghurt werden CA,

CDCA, iso-LCA, LCA, DCA und 12-Oxo-DCA täglich signifikant weniger

ausgeschieden (Tab. 21). Die Exkretion der sekundären Gallensäuren vermindert

sich um etwa 30 %. Das Verhältnis zwischen primären und sekundären

Gallensäuren wird nicht signifikant verändert.

Ergebnisse

58

Prob

iotis

cher

Jo

ghur

t

2,1

3 ±

0,95

18,4

± 5

,9

1,46

± 0

,68

0,52

± 0

,05

22,5

± 6

,2

20,4

± 6

,1

88,4

± 7

,2

1,44

± 0

,66b

2,06

± 0

,71b

1,55

± 0

,85

4,46

± 1

,68c

0,28

± 0

,21a

0,21

± 0

,08

0,12

± 0

,07a

10,1

± 3

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9,8

± 3,

0c

0,3

± 0,

1a

0,03

5 ±

0,01

6

Konv

entio

nelle

r Jo

ghur

t

2,05

± 1

,14

18,9

± 7

,1

1,43

± 0

,68

0,51

± 0

,05

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± 7

,4

20,9

± 7

,4

88,9

± 7

,8

1,39

± 0

,56c

2,03

± 0

,79c

1,61

± 0

,89

4,09

± 1

,34c

0,32

± 0

,27a

0,20

± 0

,08

0,09

± 0

,05b

9,7

± 2,

6c

9,4

± 2,

6c

0,3

± 0,

1a

0,03

3 ±

0,01

6

mg/

g G

efrie

rtroc

kens

ubst

anz

Adap

tatio

n

2,16

± 1

,21

17,8

± 5

,3

1,50

± 1

,18

0,51

± 0

,04

22,0

± 6

,4

19,8

± 6

,0

88,4

± 6

,7

1,79

± 0

,78

2,63

± 1

,23

1,57

± 1

,06

5,95

± 2

,26

0,43

± 0

,42

0,25

± 0

,16

0,23

± 0

,23

12,9

± 4

,4

12,4

± 4

,4

0,5

± 0,

4

0,04

4 ±

0,04

2

Prob

iotis

cher

Jo

ghur

t

57,2

± 2

8,8

491

± 20

6

38,3

± 1

9,5

13,6

± 3

,2

600

± 22

8

543

± 21

7

88,4

± 7

,2

39,4

± 2

0,7b

55,3

± 2

4,6c

43,9

± 2

9,6

122

± 60

c

8,0

± 7,

3b

5,46

± 2

,18a

3,10

± 1

,80b

277

± 12

2c

268

± 12

1c

9 ±

4b

0,03

5 ±

0,01

6

Konv

entio

nelle

r Jo

ghur

t

55,6

± 2

6,9

520

± 19

9

38,9

± 1

8,8

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± 2

,5

629

± 21

0

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± 20

8

88,9

± 7

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39,2

± 1

8,3b

56,2

± 2

6,9c

45,0

± 2

7,1

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± 48

c

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± 7

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5,26

± 1

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2,58

± 1

,28b

271

± 10

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263

± 10

1c

8 ±

3b

0,03

3 ±

0,01

6

mg/

d

Adap

tatio

n

62,7

± 3

8,6

519

± 18

9

42,7

± 2

9,2

14,6

± 2

,8

639

± 21

7

577

± 20

4

88,4

± 6

,7

53,2

± 2

8,3

78,2

± 3

8,5

46,3

± 3

2,1

176

± 73

12,8

± 1

2,1

7,62

± 5

,25

7,04

± 6

,92

382

± 14

7

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± 14

4

15 ±

12

0,04

4 ±

0,04

2

Cho

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Met

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]

iso-

LCA

LCA

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DC

A

DC

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12-O

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CA

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Sek.

GS

Prim

. GS

Prim

./Sek

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n in

Stu

die

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,05)

; b : Sig

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; c : Sig

nifik

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n (p

< 0

,001

); P

rim./S

ek.:

Verh

ältn

is z

wis

chen

prim

ären

und

sek

undä

ren

Gal

lens

äure

n

Ergebnisse

59

Die Ergebnisse der Gallensäurengehalte in der Gefriertrockensubstanz der

Faeces bestätigen die verminderte Ausscheidung (Tab. 21). Die Signifikanz-

niveaus sind nach Gabe der probiotischen Bakterien etwas erhöht, was durch die

verminderte Stuhlexkretion während dieser Periode verursacht wird. Weiterhin

weisen die auf 30 g Trockensubstanz Stuhlausscheidung angepassten

Gallensäurengehalte gleiche Beziehungen auf.

Da zwischen der Aufnahme von konventionellem und probiotischem Joghurt kein

differenter Zusammenhang zu erkennen ist, sollte ein möglicher zeitabhängiger

Einfluss des Joghurtkonsums untersucht werden. Dazu sind die Probanden mit

der Verzehrsreihenfolge konventioneller Joghurt, probiotischer Joghurt und diese

mit der Folge probiotischer Joghurt, konventioneller Joghurt getrennt voneinander

ausgewertet worden. Mit Ausnahme von Coprostanol ändert sich die mittlere

tägliche Steroidexkretion in beiden Gruppen in derselben Weise (Abb. 27). Es

treten keine signifikanten Änderungen in der täglichen Exkretion faecaler Steroide

zwischen herkömmlichen Joghurt und den mit probiotischen Keimen

supplementierten Produkt unter Berücksichtigung der Reihenfolge des Verzehrs

auf.

Abbildung 27: Tägliche Steroidexkretion in Abhängigkeit von der Verzehrs-

reihenfolge der Joghurts

01020304050607080

Prim. GS Sek. GS(1:10)

Cholesterol(1:10)

Coprostanol(1:10)


Cholesterol(1:10)

Coprostanol(1:10)

Exkr

etio

n [m

g/d]

Konventionell Probiotisch

Ergebnisse

60

Die Probanden sind weiterhin in je eine normocholesterolämische und moderat

hypercholesterolämische Gruppe geteilt. Zur Einordnung ist vor Beginn der Studie

Blut genommen und als Grenzwert ein Gesamtcholesterolgehalt von 6,5 mmol/l

definiert worden.

Die Frauen der verschiedenen Gruppen tendieren zu einem unterschiedlichen

Verhalten in der täglichen Gallensäurenausscheidung. Um Einflüsse durch die

Nahrungsaufnahme auszuschließen, sind die Gallensäurengehalte in den Faeces

auf eine tägliche Fettaufnahme von 100 g bezogen worden. Es zeigt sich, dass

hypercholesterolämische Probanden signifikant weniger sekundäre Gallensäuren

und tendenziell mehr primäre Gallensäuren pro Tag ausscheiden. Dieses wird

außerdem durch einen signifikant höheres Verhältnis der Gallensäuren zueinander

widergespiegelt (p < 0,01) (Tab. 22).

Tabelle 22: Gallensäurenausscheidung bei normierter Fettaufnahme (100 g/d)

der verschieden cholesterolämischen Probanden

Normocholesterolämische Probanden

Hypercholesterolämische Probanden p

mg/d

Gesamtsterole 781 ± 306 786 ± 323 0,939

iso-LCA 65,2 ± 34,1 47,8 ± 24,9 0,008

LCA 89,8 ± 46,0 73,8 ± 29,2 0,059

iso-DCA 63,3 ± 25,0 53,6 ± 48,2 0,237 DCA 192 ± 86 161 ± 71 0,071

12-Oxo-DCA 13,4 ± 13,6 11,9 ± 9,6 0,546

CDCA 7,22 ± 3,27 9,44 ± 6,77 0,052 CA 4,63 ± 3,82 6,56 ± 8,02 0,152

Gesamt 436 ± 169 367 ± 154 0,043

Sek. GS 424 ± 167 348 ± 150 0,029 Prim. GS 12 ± 7 16 ± 14 0,080

Prim./Sek. 0,030 ± 0,015 0,047 ± 0,037 0,005

Prim./Sek.: Verhältnis zwischen primären und sekundären Gallensäuren

Ergebnisse

61

Die Serumkonzentrationen aller Probanden an Gesamtcholesterol,

HDL-Cholesterol, LDL-Cholesterol, Triglyceriden, dem Verhältnis von

LDL/HDL-Cholesterol und den Gehalten in der Stuhlgefriertrockensubstanz an

Gesamtgallensäuren, sekundären Gallensäuren, primären Gallensäuren, dem

Verhältnis aus primären und sekundären Gallensäuren, Cholesterol, Coprostanol

und der Konversionsrate von Cholesterol sind hinsichtlich korrelativer

Beziehungen untersucht worden. Es wird festgestellt, dass hohe Gehalte an

primären Gallensäuren mit hohen LDL- und geringen HDL-Cholesterol-

konzentrationen korrelieren, was sich im Verhältnis LDL/HDL-Cholesterol fortsetzt

(Abb. 28). Dabei zeigt vor allem CDCA einen engen Zusammenhang mit der

LDL-Cholesterolkonzentration (r = 0,36) im Serum. Alle weiteren Stuhlparameter

können in keinen Zusammenhang mit den Blutparametern gebracht werden.

Abbildung 28: Zusammenhänge zwischen den Konzentrationen an Serum-

cholesterol und primärer Gallensäuren im Stuhl (n = 86, p < 0,01)

0,0

2,0

4,0

6,0

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Exkretion [mg/g GTS]

LDL/

HD

L-C

hole

ster

ol

0,0

1,0

2,0

3,0

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0


HD

L-C

hole

ster

ol [m

mol

/l]

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0


LDL-

Cho

lest

erol

[mm

ol/l]

y = 1,8695x + 1,8835 r = 0,52

y = -0,4251x + 1,6688 r = 0,31

y = 1,2356x + 3,1755 r = 0,36

Ergebnisse

62

0

15

30

45


Prim./Sek.GS (100:1)

HDL-Cholesterol

LDL-Cholesterol

LDL/HDLExkr

etio

n [m

g/d]

// S

erum

konz

entra

tion

[mm

ol/

Adaptation Probiotisch Konventionell

0

15

30

45


Prim./Sek.GS (100:1)

HDL-Cholesterol

LDL-Cholesterol

LDL/HDL

Exkr

etio

n [m

g/d]

// S

erum

konz

entra

tion

[mm

ol/

Adaptation Konventionell Probiotisch

Im Vergleich der Ergebnisse der Konzentrationen an Serumcholesterol und der

faecalen Gallensäuren der hypercholesterolämischen Probanden geht eine

verminderte Exkretion primärer und sekundärer Gallensäuren mit einer

gleichmäßigen Absenkung des Verhältnisses von LDL/HDL-Cholesterol einher.

Dabei ist erneut die Dauer des Joghurtkonsums und nicht der probiotische Zusatz

der einflussnehmende Faktor. Die normocholesterolämischen Probanden

verhalten sich in ähnlicher Form, jedoch sind die Unterschiede von geringerem

Ausmaß (Abb. 29).

Abbildung 29: Vergleich der täglichen Gallensäurenexkretion und Serumcholes-

terolkonzentrationen unter Berücksichtigung der Verzehrsreihen-

folge der Joghurts und in Abhängigkeit vom Fettstoffwechsel;

Stern: Signifikanz zu Adaptation (p < 0,05); Kreis: Signifikanz zu

Probiotika (p < 0,05)

Hypercholesterolämische Probanden

Normocholesterolämische Probanden

Ergebnisse

63

5.4 Studie 4 - Supplementation von probiotischem Joghurt

In der im cross-over Design durchgeführten Studie mit je 13 normolipidämischen

Frauen und Männern sind weder in der Kontrollperiode mit konventionellem

Joghurt noch in der Testperiode mit probiotischem Joghurt (Supplement:

Lactobacillus acidophilus 742 und Bifidobacterium species 420) Änderungen in der

täglichen Stuhlexkretion und des faecalen pH-Wertes zu verzeichnen. Die Frauen

scheiden in der Start- und Probiotikaperiode signifikant weniger Trockenstuhl als

Männer aus und haben in diesen beiden Versuchsabschnitten einen signifikant

geringeren pH-Wert im Stuhl als die männlichen Studienteilnehmer (Tab. 23).


Start Konventioneller Joghurt Probiotischer Joghurt

Frischsubstanz [g/d]

alle 122 ± 95 132 ± 63 122 ± 51

Frauen 67 ± 42 105 ± 61 99 ± 49 Männer 132 ± 27a 139 ± 34 134 ± 30a

Gefriertrockensubstanz [g/d]

alle 26,0 ± 11,3 28,1 ± 9,6 27,2 ± 9,6 Frauen 18,2 ± 8,5 24,4 ± 8,8 23,4 ± 8,6

Männer 29,8 ± 4,9a 30,3 ± 6,2 30,8 ± 6,1a

pH alle 7,14 ± 0,60 7,11 ± 0,49 7,22 ± 0,59

Frauen 6,95 ± 0,46 6,98 ± 0,47 6,98 ± 0,43

Männer 7,51 ± 0,48a 7,33 ± 0,46 7,58 ± 0,48a

a: Signifikanz zwischen Frauen und Männer (p < 0,05)

Ergebnisse

64

Drei Probanden (Nummer: 12, 22, 26) werden aufgrund ihres inversen Sterol- und

Gallensäurenprofils in der statistischen Auswertung nicht berücksichtigt.

Der Konsum von konventionellem Joghurt führt zu signifikant erhöhten Gehalten

an Cholesterol und Cholestanol in der Gefriertrockensubstanz im Vergleich zu den

Ausgangswerten. Daraus folgt eine verminderte Konversionsrate des

Cholesterols. Nach Verzehr des mit probiotischen Keimen supplementierten

Produktes sind die Konzentrationen von Cholesterol und den Metaboliten in der

Gefriertrockensubstanz signifikant zu den Kontrollgehalten vermindert. Die

Konzentrationen an Gallensäuren in der Gefriertrockensubstanz sind im gesamten

Verlauf der Studie unverändert (Tab. 24).

Die tägliche Exkretion der Sterole ist nach konventioneller Joghurtgabe hinsichtlich

der Startbedingungen erhöht. Mit Ausnahme des Coprostanols tendieren die

Sterolexkretionen pro Tag nach der probiotischen Periode ebenfalls zu erhöhten

Werten. Die Ausscheidung der sekundären Gallensäure DCA ist nach dem

Verzehr von Joghurt im Vergleich zu den Ausgangswerten und unabhängig von

der Joghurtart angestiegen. Weiterhin ist eine signifikant erhöhte tägliche

Exkretion an der primären Gallensäure CDCA nach Gabe von probiotischem

Joghurt im Vergleich zu den Basisdaten zu beobachten. Da die Probanden (vor

allem die Frauen) in der Startperiode geringe Mengen an Stuhl ausscheiden, ist

ein Einfluss durch ansteigende Stuhlmassen nach den Joghurtperioden auf die

höhere tägliche Steroidexkretion nicht auszuschließen.

Ergebnisse

65

Prob

iotis

cher

Jo

ghur

t

1,57

± 0

,681

8,52

± 3

,271

0,99

± 0

,58

0,28

± 0

,20a

11,4

± 3

,41

9,8

± 3,

41

82,0

± 1

0,3

1,30

± 0

,65

2,01

± 0

,66

1,49

± 1

,03

4,57

± 1

,48

0,28

± 0

,27

0,20

± 0

,13

0,08

± 0

,06

9,93

± 3

,05

9,65

± 3

,06

0,28

± 0

,17

0,03

2 ±

0,02

4

Konv

entio

nelle

r Jo

ghur

t

2,22

± 0

,98b

12,2

7 ±

7,62

1,13

± 0

,62

0,27

± 0

,11b

15,9

± 8

,0

13,7

± 8

,0

80,2

± 1

1,6b

1,31

± 0

,68

2,08

± 0

,67

1,80

± 1

,30

4,67

± 1

,35

0,30

± 0

,37

0,21

± 0

,20

0,10

± 0

,17

10,4

8 ±

3,42

10,1

6 ±

3,48

0,32

± 0

,36

0,03

7 ±

0,04

8

mg/

g G

efrie

rtroc

kens

ubst

anz

Star

t

1,32

± 0

,92

9,88

± 4

,71

0,96

± 0

,67

0,14

± 0

,12

12,3

± 5

,0

11,0

± 5

,1

86,0

± 1

3,4

1,42

± 0

,69

2,00

± 0

,74

1,54

± 0

,92

4,14

± 1

,19

0,30

± 0

,29

0,17

± 0

,12

0,14

± 0

,19

9,72

± 2

,58

9,41

± 2

,70

0,31

± 0

,28

0,04

0 ±

0,04

8

Prob

iotis

cher

Jo

ghur

t

41,6

± 1

9,5c1

221

± 94

26,5

± 1

7,1

7,72

± 6

,19b

297

± 11

2

256

± 10

4

82,0

± 1

0,3

36,5

± 2

1,7

54,3

± 2

0,2

40,6

± 3

3,2

125

± 49

a

6,97

± 4

,88

5,53

± 4

,68a

2,12

± 1

,93

272

± 10

3

264

± 10

0

8 ±

6

0,03

2 ±

0,02

4

Konv

entio

nelle

r Jo

ghur

t

60,4

± 3

6,8c

316

± 21

6

28,8

± 1

5,5a

6,84

± 3

,42c

412

± 23

9a

352

± 22

4

80,2

± 1

1,6b

34,5

± 1

7,4

58,0

± 2

5,2

44,5

± 2

8,0

128

± 48

a

7,61

± 6

,77

6,28

± 7

,22

3,13

± 6

,01

282

± 99

a

273

± 95

9 ±

13

0,03

7 ±

0,04

8

mg/

d

Star

t

25,5

± 1

4,0

221

± 10

7

20,6

± 1

1,7

2,73

± 2

,50

270

± 11

6

244

± 11

3

86,0

± 1

3,4

35,2

± 1

9,7

48,7

± 2

4,0

34,4

± 2

4,6

98 ±

38

7,34

± 7

,29

3,90

± 2

,83

2,67

± 3

,24

231

± 91

224

± 90

7 ±

5

0,04

0 ±

0,04

8

Cho

lest

erol

Cop

rost

anol

Cop

rost

anon

Cho

lest

anol

Ges

amt

Met

abol

ite

Konv

ersi

on [%

]

iso-

LCA

LCA

iso-

DC

A

DC

A

12-O

xo-D

CA

CD

CA

CA

Ges

amt

Sek.

GS

Prim

. GS

Prim

./Sek

.

Tabe

lle 2

4: F

aeca

le E

xkre

tion

an S

tero

len

und

Gal

lens

äure

n in

Stu

die

4

a : Sig

nifik

anz

zu S

tart

(p <

0,0

5); b : S

igni

fikan

z zu

Sta

rt (p

< 0

,01)

; c : Sig

nifik

anz

zu S

tart

(p <

0,0

01);

1 : Sig

nifik

anz

zu

konv

entio

nelle

r Jo g

hurtp

erio

de; P

rim./S

ek.:

Verh

ältn

is z

wis

chen

prim

ären

und

sek

undä

ren

Gal

lens

äure

n

Ergebnisse

66

Die Auswertung der täglichen Steroidexkretion nach Separation in Gruppen mit

unterschiedlicher Reihenfolge des Joghurtverzehrs ergibt eine gleichförmige

Veränderung des Steroidprofiles mit Ausnahme von Coprostanol (Abb. 30). Die

mittlere Coprostanolausscheidung ist nach Konsum von herkömmlichen Joghurt

erhöht, vor allem bei den Probanden, denen in der ersten Studienperiode

probiotischer Joghurt verabreicht wurde.

In der Probandengruppe, die zuerst konventionellen Joghurt verzehrt hat, sind die

Änderungen in der Gallensäureexkretion im zeitlichen Verlauf verstärkt

ausgeprägt. Hingegen ist mit beginnender probiotischer Joghurtgabe die tägliche

Exkretion faecaler Sterole im Studienverlauf signifikant beeinflusst.

Abbildung 30: Tägliche faecale Steroidexkretion in Abhängigkeit von der

Verzehrsreihenfolge der Joghurts

Stern: Signifikanz zwischen Perioden (p < 0,05)

01020304050607080


Cholesterol(1:10)

Coprostanol(1:10)


Cholesterol(1:10)

Coprostanol(1:10)

Exkr

etio

n [m

g/d]

Konventionell Probiotisch

Ergebnisse

67

Zwischen dem LDL/HDL-Cholesterol-Verhältnis im Serum und der Konzentration

der faecalen Steroide in der Gefriertrockensubstanz bestehen lineare

Beziehungen, wobei der Gehalt primärer Gallensäuren im Stuhl positiv (p < 0,01)

und die Konzentrationen sekundärer Gallensäuren negativ (p < 0,01) mit dem

Quotienten korrelieren (Abb. 31). Keine mathematischen Zusammenhänge

können zu den Gehalten in der Stuhlgefriertrockensubstanz an Cholesterol,

Coprostanol und der Konversionsrate von Cholesterol nachgewiesen werden.

Abbildung 31: Zusammenhänge zwischen den Konzentrationen an Serum-

cholesterol und primärer bzw. sekundärer Gallensäuren im Stuhl

(n = 69, p < 0,01)

Sekundäre Gallensäuren

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0


LDL/

HD

L-C

hole

ster

ol

Primäre Gallensäuren

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

0,0 0,5 1,0 1,5


LDL/

HD

L-C

hole

ster

ol

y = 0,8641x + 1,3638 r = 0,33

y = -0,0599x + 2,1751 r = 0,35

Ergebnisse

68

Die Exkretion der faecalen Steroide ist zwischen den Frauen und den Männern

verschieden (Tab. 25). Während die Männer täglich mehr sekundäre Gallensäuren

ausscheiden, ist die Konzentration in der Gefriertrockensubstanz im Vergleich zu

den Frauen unverändert.

Obwohl die männlichen Probanden signifikant mehr Fett pro Tag aufnehmen

(p < 0,001), sind in den Faeces der Frauen höhere Konzentrationen an

Cholesterol, Coprostanol und Coprostanon nachweisbar. Außerdem sind die

primären Gallensäurengehalte durch eine verstärkte CA-Exkretion in der

Gefriertrockensubstanz der weiblichen Probanden signifikant erhöht. Die

Unterschiede treten in allen Perioden auf.

Tabelle 25: Steroidexkretion der Frauen und Männer

mg/d

mg/g Gefriertrockensubstanz

Frauen Männer Frauen Männer

Cholesterol 45,5 ± 32,7 39,6 ± 23,9 2,11 ± 1,14 1,30 ± 0,71a

Coprostanol 243 ± 146 263 ± 155 12,0 ± 6,7 8,49 ± 4,30a Coprostanon 25,4 ± 18,2 25,2 ± 11,1 1,23 ± 0,81 0,83 ± 0,34a

Cholestanol 5,09 ± 2,81 6,44 ± 6,29 0,25 ± 0,12 0,21 ± 0,20

Gesamt 319 ± 171 334 ± 173 15,6 ± 7,1 10,8 ± 4,8a

Metabolite 273 ± 157 294 ± 161 13,4 ± 7,1 9,5 ± 4,5a Konversion [%] 80,3 ± 14,8 85,2 ± 8,2 80,3 ± 14,8 85,2 ± 8,2

iso-LCA 27,0 ± 19,3 43,8 ± 18,9a 1,25 ± 0,72 1,44 ± 0,57

LCA 36,6 ± 14,4 70,8 ± 29,6a 1,77 ± 0,63 2,30 ± 0,74a iso-DCA 42,6 ± 34,0 37,1 ± 20,0 1,98 ± 1,36 1,24 ± 0,63a

DCA 87,3 ± 40,6 147,4 ± 51,3a 4,07 ± 1,43 4,85 ± 1,29a

12-Oxo-DCA 5,71 ± 6,64 8,91 ± 5,72a 0,29 ± 0,38 0,29 ± 0,18 CDCA 5,02 ± 6,00 5,46 ± 4,08 0,21 ± 0,17 0,18 ± 0,12

CA 3,70 ± 5,42 1,57 ± 1,31a 0,16 ± 0,21 0,05 ± 0,04a

Gesamt 208 ± 97 315 ± 99a 9,74 ± 3,52 10,35 ± 2,38

Sek. GS 199 ± 94 308 ± 96a 9,36 ± 3,61 10,12 ± 2,33 Prim. GS 8,73 ± 10,94 7,03 ± 5,18 0,38 ± 0,36 0,23 ± 0,15a

Prim./Sek. 0,050 ± 0,056 0,023 ± 0,014a 0,050 ± 0,056 0,023 ± 0,014a

a: Signifikanz zwischen Männern und Frauen (p < 0,05); Prim./Sek.: Verhältnis zwischen primären und sekundären Gallensäuren

Ergebnisse

69

5.5 Studienübergreifende Ergebnisse Unter Einbeziehung aller in den vier Humanstudien erhobenen Daten zeigt sich

eine logarithmische Korrelation zwischen den Gehalten an Coprostanol und

Cholesterol in der Gefriertrockensubstanz (Abb. 32). Hingegen verhalten sich die

beiden Metabolite Coprostanol und Coprostanon signifikant positiv linear

zueinander (y = 0,0581x + 0,4356; r = 0,52; n = 232; p < 0,001).

Weiterhin sind alle Gehalte faecaler Sterole und Gallensäuren in der

Trockensubstanz auf einen Zusammenhang zu dem faecalen pH-Wert untersucht

worden. Dabei sind keine Korrelationen zwischen den faecalen Steroidkonzentra-

tionen und dem pH-Milieu in den Faeces festzustellen.

Abbildung 32: Beziehung zwischen Gehalten an Cholesterol und Coprostanol

in der Stuhltrockensubstanz (n = 232, p < 0,001)

0

10

20

30

0 20 40 60 80

Coprostanol [mg/g GTS]

Cho

lest

erol

[mg/

g G

TS]

y = -0,2981ln(x) + 3,1151 r = 0,57

Diskussion

70

6 DISKUSSION

6.1 Analysenmethoden Die Quantifizierung von Cholesterol und den bakteriellen Abbauprodukten

Coprostanol, Coprostanon, Cholestanol und Cholestanon ist mit der Anwendung

der Gaschromatographie-Massenspektrometrie realisierbar. Da Cholestanon in

den Faeces nur in sehr geringen Mengen vorliegt, wird auf die Darstellung dieser

Ergebnisse verzichtet. Neben den quantifizierten Sterolen sind weitere Vertreter

analysiert und spezifische Fragmente ausgewählt worden (Abb. 33). Campestanol

ist in der gewählten Massenspur m/z = 215,10 in Abb. 33 wegen der geringen

Auflösung nicht sichtbar. Weiterhin kann ∆5-Avenasterol (m/z = 314,20)

identifiziert werden. Es retendiert nach Sitostanol und ist im Standardgemisch

nicht enthalten.

Abbildung 33: TIC und MIC eines Sterolstandardgemisches

(Zebron 5; 60 m; 0,25 mm; 0,25 µm df)

a: Coprostanol; b: Epicoprostanol; c: Cholesterol; d: Coprostanon;

e: Cholestanol; f: Desmosterol; g: Brassicasterol; h: Cholestanon;

i: Lathosterol; j: Campesterol; k: Campestanol; l: Stigmasterol;

m: Sitosterol; n: Fucosterol; o: Sitostanol

a

b

b

c

c d

e

e

f i

g

g

h

i j

j

k

l

l m

m n

n

o

o

a

fd

h

Diskussion

71

Im Literaturvergleich zeigt sich, dass die beschriebene Analysenmethode zur

Bestimmung von Sterolen tierischen Ursprungs und deren intestinalen

Abbauprodukten sowie von Phytosterolen mit etablierten Methoden vergleichbar

ist (Tab. 26). Die Analyse von Abbauprodukten der Pflanzensterole mit dieser

Methode ist aufgrund nicht zur Verfügung stehender Referenzsubstanzen nicht

möglich gewesen. Für zukünftige Untersuchungen bei denen der Gehalt

pflanzlicher Sterole in den Faeces von Interesse sein kann, wird die Erweiterung

des Sterolprofiles in der Analyse mit den Abbauprodukten der Phytosterole

angestrebt und weiterhin ist die Anwendung eines radiomarkierten Sterols mit

einer Hydroxygruppe an Position 3 des Steroidgerüstes als interner Standard zu

prüfen.

Die Methoden von BARKER et al. [1993], CZUBAYKO et al. [1991] und MIETTINEN

[1982] beinhalten die Analyse von Coprostanon � eines der Hauptabbauprodukte

des Cholesterols � ohne auf die Artefaktbildung von 3-Oxo-Steroiden nach einer

Trimethylsilylierung einzugehen. In eigenen Voruntersuchungen zeigt sich, dass in

reinen Standardsubstanzen die Trimethylsilylierung des Coprostanon frei von

Nebenprodukten möglich ist. Hingegen werden durch mögliche Einflüsse der

komplexen Faecesmatrix in realen Proben Artefakte des Coprostanons gefunden.

Lediglich CHILD et al. [1987] verweisen auf das instabile Verhalten dieser

Steroidgruppe und führen Coprostanon in der Sterolbestimmung nicht auf.

Die Hydrolyse mit ethanolischer Natronlauge ist mit der beschriebenen Methode

weiterhin notwendig, um die GC-Kapillarsäule vor hochsiedenden Verun-

reinigungen zu schützen. Aus diesem Grund ist nur die Analyse unveresterter

Sterole möglich. BATTA et al. [1999] beschreiben eine simultane Sterol- und

Gallensäurenanalysenmethode, bei der die Methylierung und Silylierung direkt in

der gepulverten Trockenfaecesprobe durchgeführt und die Steroide anschließend

extrahiert werden. Das Chromatogramm zeigt viele unidentifizierte Peaks und

Coprostanon sowie Cholestanol werden nicht qualitativ angegeben. Im Bereich

der Gallensäuren wird keine Basislinientrennung von iso-DCA und DCA erreicht,

iso-LCA scheint nicht enthalten zu sein, dafür zeigt der LCA-Peak im unteren

Bereich eine leichte Verbreiterung, die auf eine Überlagerung deuten kann

(Abb. 34).

Diskussion

72

MIE

TTIN

EN

[198

2]

+ + + + + + + + + + + + + + + + + +

CZU

BAY

KO

et

al.

[199

1]

+ + + + + + + + + + + +

CH

ILD

et

al.

[198

7]

+ + + + + + + + + + +

BAT

TA

et a

l. [1

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den

Diskussion

73

Abbildung 34: Chromatogramm faecaler Steroide nach BATTA et al. [1999]

(a: Coprostanol; b: Cholesterol; c: 24-Methyl-Coprostanol;

d: Campesterol; e: 24-Ethyl-Coprostanol; f: Stigmasterol;

g: Sitosterol; h: Sitostanol; 1: nor-CA; 2: LCA; 3: iso-DCA;

4: DCA; 5: CDCA; 6: CA; 9: 3-Oxo-DCA; 10: 12-Oxo-DCA)

Im Gegensatz zur Methode von BATTA et al. [1999], bei der eine minimale

Probenaufarbeitung beschrieben ist, werden in einer etablierten Methode von

SETCHELL et al. [1983] zur Gallensäurenanalyse eine dreistufige Lipidextraktion

und Separationen auf Festphasen bzw. Gelen (Lipidex 1000, RP-C18, SP-

Sephadex, Lipidex DEAP) vor der Derivatisierung in Trimethylsilylether-

Methylester benannt. Dadurch ist eine getrennte Analyse von neutralen Sterolen,

unkonjugierten Gallensäuren, glycin- bzw. taurinkonjugierten Gallensäuren und

sulphatierten Konjugaten möglich. Trotz der Separation und Reinigung der Probe

sind im Chromatogramm einer Faecesprobe eines Gesunden einige Gallensäuren

(iso-LCA, iso-DCA, DCA, UDCA) zu verzeichnen, bei denen keine

Basislinientrennung mit der Flammenionisationsdetektion erreicht werden kann

(Abb. 35). Trotzdem geben SETCHELL et al. [1983] quantitative Aussagen zur

täglichen Exkretion dieser Gallensäuren an.

Diskussion

74

Abbildung 35: Chromatogramm faecaler Gallensäuren nach SETCHELL et al.

[1983]

(1: iso-LCA; 2: LCA; 3: iso-DCA; 4: DCA; 5: CDCA; 6: CA;

7: UDCA; 8: 7β-CA; 9: 12-Oxo-iso-DCA; 10: 12-Oxo-DCA)

Beim Übergang zur massenspektrometrischen Detektion ist die vollständige

Separation mit Ausnahme von UDCA realisierbar. Wahrscheinlich ist die relative

Intensität des gewählten Fragments m/z = 460,00 mit 14 % zu gering um

reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten (vgl. 3.2.3). Außerdem kann diese

Massenspur eventuell durch andere Steroide gestört sein, da bei SETCHELL et al.

[1983] im Zeitbereich der UDCA des Chromatogramms eine Peakhäufung zu

erkennen ist. Die Wahl eines anderen Fragmentes bzw. die Anwendung eines

Targetfragmentes zur Peakreinheitskontrolle (Prüfung eines konstanten

Verhältnisses zweier Fragmente der UDCA) in der Routineanalyse sollten

zukünftig geprüft werden.

Diskussion

75

Mit Ausnahme der iso-DCA (m/z = 75,10), CDCA (m/z = 73,10) und HDCA

(m/z = 81,15) sind Strukturangaben zu den analysierten Fragmenten aller anderen

Sterole und Gallensäuren möglich (Abb. 36).

M [g/mol] Fragment m/z M

[g/mol] Fragment m/z

Cholestan 372 M � (15) 357 iso-LCA 462 M � (90 + 115 + 42) 215

Coprostanol 388 M � (15) 373 LCA 462 M � (90 + 115 + 42) 215

Cholesterol 386 M � (15 + 70) 301 iso-DCA 550 - 75

Coprostanon 386 M � (70) 316 DCA 550 M � (2 � 90 + 115) 255

Cholestanol 388 M � (113 + 42 + 18) 215 12-Oxo-DCA 476 M � (90 + 115 + 40) 231

Cholestanon 386 M � (113 + 41) 232 CDCA 550 - 73

CA 638 M � (3 � 90 + 115) 253

HDCA 550 - 81

Abbildung 36: Fragmentierung der Sterole und Gallensäuren

Durch den Verlust einer Methylgruppe werden bei Cholestan und Coprostanol

Fragmente gebildet, deren Masse um m/z = 15,00 geringer ist als die

Molekülmasse. Hierbei werden wahrscheinlich angulare Methylgruppen des

Steroidgerüstes abgespalten, wie LAWSON und SETCHELL [1988] es für die

strukturähnlichen Gallensäuren beschreiben.

OM - (70)

M - (113)

M - (113 + 41)M - (113 + 42)

M - (70)

M - (90)

M - (115)

M - (115 + 40)M - (115 + 42)

O

O

OTMS

Meth

Sterole Gallensäuren

Diskussion

76

Sowohl bei den Sterolen als auch bei den Gallensäuren ist die Abspaltung der

Seitenketten und das Aufbrechen des Cyclopentanringes aufgetreten. Dabei

können die Protonen entweder am Steroidgerüst verbleiben oder mit der

abgespaltenen Gruppe aus dem Molekül austreten. Dadurch sind Fragmente mit

M - (113 + 42), M - (113 + 41) bzw. M - (113 + 40) möglich. Die verschiedenen

Fragmentierungsprodukte werden übereinstimmend bei SJÖVALL et al. [1971]

beschrieben.

Die Trimethylsilylgruppen werden mit einem Proton des Steroidgerüstes als

Alkohol abgespalten, so dass Fragmente mit M - (n � 90) gebildet werden

(n = Anzahl der Trimethylsilylgruppen im Molekül). Die Abgangsgruppen werden

von IIDA et al. [2001] auch bei tertiär hydroxylierten Steroiden detektiert. SJÖVALL

et al. [1971] verweisen weiterhin auf den Austritt von Trimethylsiloxygruppen bei

dem Fragmente mit M - (n � 89) gebildet werden. Diese Fragmente sind in den in

dieser Arbeit erhaltenen Massenspektren � jedoch von geringer Intensität �

nachweisbar.

Für das bei Coprostanon gebildete Fragment M - (70) sind zwei Fragmentierungen

möglich. Zum einen kann ein Bruch in der Seitenkette erfolgen [SJÖVALL et al.

1971], zum anderen ist die Spaltung des Cyclohexanringes A möglich [LAWSON

und SETCHELL 1988, MATUSIK et al. 1988].

Diskussion

77

6.2 Steroidgehalte in der Trockensubstanz und die tägliche Exkretion

Unter Berücksichtigung aller Probanden aus allen Perioden der vier Humanstudien

(n = 232, 86 Probanden) ergibt sich ein mittlerer Gesamtsterolgehalt von

19,4 ± 9,1 mg/g Trockensubstanz, der im Bereich der von PEROGAMBROS et al.

[1982] und REDDY et al. [1989] beschriebenen Konzentrationen von

21,8 ± 3,7 mg/g bzw. 23,1 ± 10,9 mg/g Trockensubstanz liegt (Tab. 27). Die

Konversionsrate des Cholesterols in die Metabolite ist mit 87 ± 10 % höher als bei

BARKER et al. [1993] und KORPELA und ADLERCREUTZ [1985]. Sowohl die

Omnivoren als auch die Vegetarier in der Studie von KORPELA und ADLERCREUTZ

[1985] weisen höhere Gehalte an Cholesterol in den Faeces auf. Die von BARKER

et al. [1993] beschriebenen Ergebnisse der einzelnen Sterole sind im Vergleich zu

den hier dargestellten Werten und den Literaturangaben [KORPELA und

ADLERCREUTZ 1985, PEROGAMBROS et al. 1982, REDDY et al. 1989, WESTSTRATE et

al. 1999] deutlich niedriger, was auf die Angabe des Median und nicht des

arithmetischen Mittels zurückzuführen sein kann.

Die Angaben für die tägliche Exkretion faecaler Sterole sind in der Literatur

differenziert. Diese Unterschiede können durch ungleich abgesetzte Stuhlmengen

der Probanden hervorgerufen werden (Tab. 28). Lediglich BARTRAM et al. [1991]

berücksichtigen die tägliche Exkretion an Trockenstuhl. Sie ermitteln eine höhere

Stuhlmasse und damit eine gesteigerte tägliche Gesamtsterolexkretion im

Vergleich zu den Probanden der vorliegenden Arbeit.

Die in der Literatur beschriebene Cholesterolexkretion variiert zwischen

43 ± 10 mg/d und 287 ± 248 mg/d [NAIR et al. 1984, NAKAMURA et al. 1992]. Die

ermittelte tägliche Ausscheidung an Cholesterol der Probanden ohne inversem

Sterolprofil aus den untersuchten Humanstudien beträgt 54 ± 32 mg. Unter

Berücksichtigung aller Probanden werden im Mittel 86 ± 111 mg Cholesterol pro

Tag mit den Faeces abgegeben. Die tägliche Coprostanolausscheidung ist im

Vergleich mit den in der Literatur aufgeführten Studien erhöht. Dies führt zu einer

hohen Konversionsrate von 87 ± 10 %, die den Ergebnissen von PONZ DE LEON et

al. [1987] mit einem Cholesterolumsatz von 89 ± 10 % entspricht.

Diskussion

78

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999]

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982]

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992]

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[199

1]

12 P

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176

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Diskussion

79

Der mittlere Gesamtgallensäurengehalt in der Trockensubstanz aller erhobenen

Daten aus den Humanstudien entspricht mit 10,6 ± 3,5 mg/g den in der Literatur

aufgeführten Konzentrationen, die zwischen 4,0 ± 0,5 bis 9,5 ± 6,4 mg/g

Trockensubstanz variieren [REDDY et al. 1989, HOFSTAD et al. 1998] (Tab. 29). Die

etwas erhöhte Tendenz innerhalb der Studien 1 - 4 im Vergleich zur Literatur ist

u. a. darauf zurückzuführen, dass die Autoren weniger Gallensäuren analysiert

haben.

Bei den Teilnehmern der im Rahmen dieser Arbeit beschriebenen Studien liegen

ähnliche Konzentrationen an LCA und DCA in der Faecestrockensubstanz vor, wie

bei Probanden der Studien von REDDY et al. [1989], SPANHAAK et al. [1998],

WESTSTRATE et al. [1999] und den Patienten der Studie von HOFSTAD et al. [1998].

Zwischen den Studien unterscheiden sich die Gehalte der primären Gallensäuren

im Bereich von 0,00 bis 0,61 ± 1,51 mg/g Trockensubstanz. Auch innerhalb der

Studien von KAIBARA et al. [1983], HOFSTAD et al. [1998], SPANHAAK et al. [1998]

und den hier dargestellten Werten streuen die Gehalte an CDCA und CA in der

Trockensubstanz teilweise über 100 %.

Die Gehalte der 12-Oxo-DCA in der Trockensubstanz sind mit 0,37 ± 0,35 mg den

bei REDDY et al. [1989] und KAIBARA et al. [1983] dokumentierten Gehalten von

0,34 ± 0,02 mg bzw. 0,47 ± 0,29 mg vergleichbar. Es ist weiter festzustellen, dass

in früheren Arbeiten durchschnittlich geringere Konzentrationen an sekundären

und größere Mengen an primären Gallensäuren in den Faeces nachgewiesen

werden [KAIBARA et al. 1983, MOWER et al. 1979]. So sind die von KAIBARA et al.

[1983] ermittelten Gehalte an faecaler iso-LCA und iso-DCA niedriger als die

entsprechenden Ergebnisse der Probanden dieser Arbeit. Auch die von

WESTSTRATE et al. [1999] dargestellten Werte an iso-DCA im Stuhl liegen unter

dem mittleren Gehalt der 86 Teilnehmer der angeführten Humanstudien; iso-LCA

ist nicht quantifiziert worden. Unter Berücksichtigung der inter-individuellen

Streuung sind die Ergebnisse vergleichbar.

Diskussion

80

WES

TSTR

ATE

et a

l. [1

999]

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998]

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989]

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983]

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998]

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atie

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Poly

pen

im C

olon

Diskussion

81

Während die Ergebnisse der Gallensäurengehalte in der Trockensubstanz zu

höheren Werten im Vergleich zu den Literaturdaten tendieren, scheint die tägliche

Exkretion vermindert (Tab. 30). Dass die Ausscheidung faecaler Gallensäuren

stark von der täglichen Stuhlmasse der Probanden abhängt, zeigt der Vergleich

der mittleren Gallensäurenausscheidung mit den Ergebnissen anderer Studien.

Die tägliche Trockensubstanzexkretion der Probanden ist mit 28 ± 8 g/d um ca.

40 % im Vergleich zur Studie von JENKINS et al. [1999] geringer. Die tägliche

Ausscheidung an Gesamtgallensäuren ist ebenfalls um ca. 40 % vermindert; die

Exkretion sekundärer Gallensäuren ist etwa 30 % niedriger.

BARTRAM et al. [1991] quantifizieren neben den in Tabelle 30 angeführten

Gallensäuren auch 3-Oxo-, 6-Oxo- und 7-Oxo-Gallensäuren, was zu einer

höheren täglichen Exkretion an Gesamtgallensäuren führt. Nach einer

Probenaufarbeitung mit 10 M Natronlauge und Ansäuern mit Salzsäure auf einen

pH-Wert von 2 folgt die Derivatisierung mittels Methylierung und Bildung von

Trifluoracetaten. Die Oxo-Gruppe wird nicht geschützt, so dass einzelne Oxo-

Gallensäuren fragmentieren können und Artefakte mit anderen Gallensäuren

vermutlich koeluieren. Auf diese Problematik wird bei BARTRAM et al. [1991] nicht

eingegangen.

Tabelle 30: Übersicht zur täglichen Gallensäurenexkretion

mg/d

Studie 1 - 4 BARTRAM et al. [1991] JENKINS et al. [1999]

86 Probanden 12 Probanden 30 Probanden

iso-LCA 43 ± 26 80 ± 20

LCA 65 ± 36 129 ± 33 226 ± 27 iso-DCA 41 ± 28

DCA 135 ± 73 153 ± 38 195 ± 20

12-Oxo-DCA 11 ± 10 12 ± 5 CDCA 9 ± 15 30 ± 9 20 ± 5

CA 9 ± 23 23 ± 10 47 ± 14

Gesamt 313 ± 150 521 ± 96 506 ± 53

Sek. GS 295 ± 144 421 ± 38 Prim. GS 18 ± 38 67 ± 19

TS-Exkretion [g/d] 28 ± 8 37 ± 3 49 ± 3

TS: Trockensubstanz

Diskussion

82

Die große intra- und interindividuelle Variation in der Steroidausscheidung bedingt

eine hohe Streuung der 232 Messwerte (Tab. 31). Vor allem die Probanden mit

einem inversen faecalen Steroidprofil bestimmen die Maximalgehalte von

Cholesterol und CA. Zwei der Probanden waren an Durchfall erkrankt. Bei einem

Probanden ist nach der Studie Multiple Sklerose diagnostiziert worden, welche mit

einem veränderten Gallensäurenmetabolismus assoziiert wird [DOWLING und

MURPHY 1990]. Alle weiteren fünf Studienteilnehmer sind Omnivoren und es

bestand weder eine Indikation für eine Darmerkrankung noch wurden sie mit

Antibiotika behandelt.

In einer Vielzahl von Studien wird eine geringe Konversion des Cholesterols mit

einer Polypenbildung oder einer Darmkrebserkrankung in Zusammenhang

gebracht [KORPELA et al. 1988, NAIR und TURJMAN 1983, PONZ DE LEON et al.

1987]. Andere Studien zeigen, dass auch in den Faeces von Gesunden ein

inverses Sterolprofil nachgewiesen werden kann [BARKER et al. 1993, KORPELA

und ADLERCREUTZ 1985, WILKINS und HACKMAN 1974].

Tabelle 31: Minimal- und Maximalgehalte von Steroiden im Stuhl; Studien 1 - 4

mg/g Trockensubstanz

Minimum Maximum

Cholesterol n. d. 23,67

Coprostanol n. d. 69,60

Coprostanon 0,16 6,26

iso-LCA 0,01 3,69

LCA 0,01 7,40

iso-DCA 0,03 5,92 DCA n. d. 13,82

12-Oxo-DCA 0,02 2,21

CDCA 0,04 2,50 CA 0,01 4,78

n. d.: nicht detektiert

Diskussion

83

6.3 Der Einfluss von Calcium und Probiotika auf die Steroid-ausscheidung

Da von den faecalen Steroiden vor allem die Gallensäuren aufgrund ihres

toxischen Verhaltens im Faeceswasser und nicht in der Stuhltrockensubstanz

hinsichtlich einer Calciumsupplementation untersucht werden, sind wenige Daten

in der Literatur zum Sterolprofil dokumentiert. In Studie 1 sind durch die Zulage

von anorganischem Calciumphosphat keine signifikanten Änderungen im

Gallensäurengehalt der Trockensubstanz und in der täglichen Exkretion zu

verzeichnen. Der Gehalt an Coprostanon in der Trockensubstanz steigt nach einer

täglichen Zufuhr von 2.462 mg Calcium und 3.200 mg Phosphor signifikant an. Es

ergibt sich ein paralleler Verlauf der Cholesterol- und Coprostanongehalte. Die

Cholesterolexkretion ist aufgrund der starken Streuung nicht signifikant verändert.

Die an der Position 3 hydrogenierten Abbauprodukte Coprostanol und Cholestanol

tendieren zu geringeren Gehalten. Es ist an dieser Stelle zu erwähnen, dass keine

Aussage zum Gallensäurenprofil im Faeceswasser möglich ist. Differenzen durch

ein Calcium-bedingtes Fällen der sauren Steroide werden in der Analyse der

Trockensubstanz nicht berücksichtigt. Die Untersuchung der wässrigen Phase ist

für spätere Studien vorbehalten.

Hinsichtlich der Sterolausscheidung in den Faeces verweisen QUILLIOT et al.

[1999] nach einer 8-monatigen Studie an Ratten auf eine signifikant erhöhte

wöchentliche Cholesterol- und unveränderte Coprostanolexkretion (Tab. 32). Die

Basisdiät enthält 24 % Sonnenblumenöl. In 100 g von diesem Pflanzenöl sind

etwa 200 - 450 mg Phytosterole enthalten [VLAHAKIS und HAZEBROEK 2000].

Phytosterole führen zu einer verminderten Cholesterolabsorption und einer

verstärkten Cholesterolexkretion [NTANIOS et al. 2001]. Die Exkretion an Sitosterol

und Cholesterol ist sowohl in der Kontrollgruppe als auch in der Testgruppe der

Ratten angestiegen. Bei Zulage von Calciumcarbonat sind die wöchentlichen

Ausscheidungen beider Sterole im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant höher.

In einer Studie an Ratten [APPLETON et al. 1992] in der über 2 Wochen

Calciumlactat verabreicht worden ist, werden keine signifikanten Unterschiede in

der Konzentration an Cholesterol und dem Gesamtsterolgehalt in der

Trockensubstanz festgestellt.

Diskussion

84

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l. [1

999]

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8]

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[199

6]

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Diskussion

85

Durch Aufnahme eines mit Bifidobacterium und Lactobacillus supplementierten

Joghurts ist in Studie 4 ein kontinuierlicher Anstieg der Cholesterolexkretion zu

verzeichnen. Nach einem 10-wöchigen Verzehr von Joghurt hat sich die tägliche

Cholesterolexkretion unabhängig von der Probiotikazulage zum Ausgangswert ca.

verdreifacht. Der Vergleich zu den Werten ohne Joghurtkonsum ist in Studie 3

nicht möglich, da der erste Messwert die Cholesterolexkretion nach 7 Wochen

Adaptation an konventionellen Joghurt repräsentiert. In dieser Studie ist sowohl

nach 14-wöchigem Joghurtkonsum als auch nach 21 Wochen ein der Adaptation

vergleichbarer Cholesterolgehalt nachweisbar.

Da die Effekte auf den faecalen Cholesterolgehalt unabhängig von der Joghurtart

auftreten und in Studie 2 nach Gabe von probiotischen Keimen ohne

Calciumsupplementation keine Änderungen im Sterolgehalt zu verzeichnen sind,

scheint die Calciumzufuhr einen erhöhten Cholesterolgehalt in den Faeces zu

bewirken.

In Studie 4 wird nach probiotischer Joghurtgabe im Vergleich zur konventionellen

Studienphase ein signifikant verminderter faecaler Coprostanolgehalt in der

Trockensubstanz gefunden. Dies führt zu einer herabgesetzten Gesamtsterol-

konzentration und durch den erhöhten Cholesterolgehalt zu einer verminderten

Konversionsrate. Die Coprostanolexkretion der Probanden in den Studien 2 und 3

ist in allen Perioden in der Stuhltrockensubstanz unverändert, tendiert aber in der

Studie 3 nach Probiotikasupplementation zu einer verminderten täglichen

Exkretion.

Es ist zu berücksichtigen, dass der Joghurtkonsum zu einer erhöhten

Cholesterolaufnahme führt und damit eine erhöhte Cholesterolexkretion zur Folge

haben kann. In einer Humanstudie von BARTRAM et al. [1994] werden nach

3-wöchigem Joghurtkonsum (500 ml/d) keine Änderungen in der Cholesterol- und

Coprostanolexkretion unabhängig von einer Probiotikasupplementation ermittelt.

Weiterhin beschreiben SPANHAAK et al. [1998] keine Änderungen der faecalen

Cholesterol- und Coprostanolgehalte nach 4-wöchiger Aufnahme von 100 ml mit

L. casei Shirota fermentierter Milch. Hingegen sind in einer Studie an Hamstern,

denen Sojamilch bzw. mit Bifidobacterium breve fermentierte Sojamilch auf der

Basis einer cholesterolfreien bzw. -angereicherten Diät verabreicht worden ist, die

Cholesterolgehalte in den Faeces nach Cholesterolzulage signifikant erhöht.

Diskussion

86

Weder die Sojamilch noch das fermentierte Produkt beeinflussen die faecalen

Cholesterolgehalte [KIKUCHI-HAYAKAWA et al. 1998].

Da sowohl in der Studie an Ratten von QUILLIOT et al. [1999] als auch in Studie 1

die Cholesterolaufnahmen zwischen den Perioden nicht signifikant verschieden

sind, können die höheren Gehalte an Cholesterol in der Trockensubstanz nicht

durch eine verstärkte Zufuhr exogenen Cholesterols verursacht werden. Daher

lassen sich mögliche Thesen ableiten (Tab. 33):

1. der Cholesterolfluss in das Colon ist erhöht

2. der Cholesterolgehalt in den Faeces ist durch veränderte Konversion durch

Darmbakterien erhöht

Tabelle 33: Mögliche Ursachen einer Änderung des faecalen Sterolprofiles

Cholesterolfluss in das Colon erhöht Cholesterolfluss in das Colon

unverändert

Gehalte in den Faeces Gehalte in den Faeces

Konversionsrate Cholesterol Metabolite Gesamt Cholesterol Metabolite Gesamt

gleich ↑ ↑ ↑ = = = erhöht ↓ / = / ↑ ↑ ↑ ↓ ↑ =

vermindert ↑ ↓/ = / ↑ ↑ ↑ ↓ =

↑: Erhöhung; ↓: Verminderung; =: unverändert

Für beide Thesen sind Hinweise zu finden. VAN DER MEER et al. [1991, 1997]

postulieren, dass Calcium im Colon die Fällung der Gallensäuren und eine

Mitfällung von Cholesterol bewirkt, was zu einer erhöhten Cholesterol-

ausscheidung führen kann (vgl. 2.2.2.1). Dies geschieht nach GOVERS und VAN

DER MEER [1993] nicht im jejunal-ilealen Bereich, da konjugierte Gallensäuren eine

höhere Löslichkeit bei niedrigem pH-Wert und eine größere Stabilität gegen

Fällungsmittel aufweisen. Weder das Lösungsverhalten von freiem noch von

verestertem Cholesterol in diesem Darmabschnitt unter Calciumeinfluss wird

diskutiert.

Diskussion

87

Unter Phytosterolsupplementation wird die Cholesterolabsorption im Dünndarm

vermindert und die Cholesterolexkretion steigt [NTANIOS et al. 2001]. Da der

Cholesterolmetabolismus eng mit dem der Gallensäuren verbunden ist, kann die

Exkretion an Gallensäuren beeinflusst werden [CHAPLIN 1998] (Abb. 37). UCHIDA et

al. [1984] beschreiben endogenes Cholesterol als Präkursor für faecale CA-

Gehalte und exogenes Cholesterol als Präkursor für CDCA-Gehalte.

Probanden einer Humanstudie von WESTSTRATE et al. [1999] weisen nach

Phytosterolsupplementation höhere Gehalte an Cholesterol und geringere Gehalte

an primären Gallensäuren in den Faeces im Vergleich zu einer Placebogruppe

auf. Die Gehalte sekundärer Gallensäuren bleiben unverändert. HOFSTAD et al.

[1998] und LUPTON et al. [1996] beschreiben in den Langzeitstudien mit

Calciumsupplementation ebenfalls verminderte Gehalte primärer Gallensäuren,

vor allem der CDCA. Da die sekundäre Gallensäure LCA durch Dehydroxylierung

der primären Gallensäure CDCA gebildet wird, ist eine Verminderung des

Gehaltes, wie HOFSTAD et al. [1998] nachweisen, möglich. DE RODAS et al. [1996]

stellen nach Calciumsupplementation eine schnellere Verminderung der Gehalte

an Gesamtcholesterol und Gallensäuren im Serum von Schweinen fest, die

wahrscheinlich aus einer Beeinflussung des enterohepatischen Kreislaufes

resultieren.

Es ist weiter anzumerken, dass die Tiere in der Studie von QUILLIOT et al. [1999]

aus der Gruppe mit supplementiertem Calcium und erhöhter Cholesterolexkretion

langsamer wuchsen. Bei BEHLING et al. [1990] wird eine verminderte

Wachstumsrate bei Ratten, deren Futter mit Calciumcabonat supplementiert

worden ist, nachgewiesen. Die Calciumzulage führt aufgrund einer geringen

intestinalen Absorption zu einer verstärkten Lipidexkretion.

Neben den erhöhten Cholesterolgehalten im Dickdarm ist durch Veränderungen

der intestinalen Mikroflora eine verminderte Konversionsrate des Cholesterols

möglich, die zu einem erhöhten Cholesterolgehalt in den Faeces führen können.

BOVEE-OUDENHOVEN und VAN DER MEER [1997] sowie BOVEE-OUDENHOVEN et al.

[1999] zeigen, dass durch den Einfluss von Calcium die intestinalen Lactobacillen

in Ratten stimuliert werden.

Diskussion

88

Diese Bakterien haben nicht die Fähigkeit Cholesterol in Coprostanol zu

transformieren [NORIN et al. 1991]. Die gebildete Milchsäure wirkt weiterhin auf

gram-negative Bakterien in vitro antimikrobiell [ALAKOMI et al. 2000].

Die Umwandlung von Cholesterol in die faecalen Metabolite wird vor allem durch

gram-positive Stämme wie Eubacterium, Clostridium und Bifidobacterium

hervorgerufen. Aber auch gram-negative Species wie Escherichia coli oder

Bacteroides � ein Hauptvertreter der Colonflora � haben die Fähigkeit zur

Metabolisierung [Eyssen et al. 1973, Mott et al. 1980, Owen et al. 1978, Tenneson

et al. 1977]. Eine mögliche Änderung des Bakterienprofiles durch Calciumzulage

und zusätzlicher Gabe von Lactobacillen kann zu einer Wandlung des

Sterolprofiles in den Faeces führen, wobei der Sterolgesamtgehalt sich nicht

verändert. Die Ergebnisse der Studie 4 stützen diese These. In der probiotischen

Periode dieser Studie ist die tägliche Cholesterolexkretion im Vergleich zu den

Ausgangswerten signifikant erhöht, die Coprostanolausscheidung ist unverändert.

Bei Gabe von konventionellem Joghurt zeigt der Coprostanolgehalt eine steigende

Tendenz.

Weiterhin scheint die Expositionsdauer beeinflussend zu wirken, da keine

Änderungen im Steroidprofil nach einer Calciumsupplementation von

1 - 2 Wochen auftreten [APPLETON et al. 1992, GOVERS et al. 1993]. Ab einer

Calciumzulage von 4 Wochen werden Änderungen in der Steroidexkretion

verzeichnet [Studie 1, Studie 3, Studie 4, HOFSTADT et al. 1998, LUPTON et al.

1996, QUILLIOT et al. 1999].

Eine verminderte CDCA-Exkretion unter erhöhter Calciumzufuhr scheint im

Widerspruch zur erhöhten täglichen CDCA-Ausscheidung nach Joghurtkonsum

der Studie 4 zu stehen. Da bei hoher Zufuhr Nahrungscholesterol in der Leber und

Geweben zu 27-Hydroxycholesterol umgewandelt und dieses zu CDCA

transformiert wird [LEE et al. 1996], kann der kontinuierliche Joghurtkonsum zu

erhöhten faecalen CDCA-Gehalten führen. Die tägliche Exkretion an sekundären

Gallensäuren ist nach Joghurtgabe tendenziell bzw. signifikant erhöht. Da dies

sowohl in der konventionellen als auch in der probiotischen Phase zu beobachten

ist, scheint kein Einfluss aus dem Dekonjugationsvermögen der probiotischen

Keime zu bestehen, vielmehr kann eine höhere Stuhlausscheidung bzw. eine

gesteigerte Exkretion primärer Gallensäuren ursächlich sein.

Diskussion

89

In Studie 3 sind nach einem Joghurtkonsum von 14 Wochen nahezu alle

Gallensäuren in den Faeces signifikant vermindert und bleiben nach 21 Wochen

auf einem verminderten Niveau. Die faecalen pH-Werte in diesen Perioden sind im

Vergleich zur Adaptation signifikant vermindert. Da eine Absenkung des faecalen

pH-Wertes mit einer sinkenden Enzymaktivität der Intestinalflora in

Zusammenhang gebracht wird, kann die Dehydroxylierung der primären

Gallensäuren beeinflusst werden [DGE 2000; MACDONALD et al. 1978]. Weiterhin

ist eine verminderte Hydrolyse der Konjugate möglich, was zu einer verminderten

Exkretion freier Gallensäuren führen kann. Da die Probenaufarbeitung vorwiegend

diese berücksichtigt, können die aus konjugierten Verbindungen stammenden

Gallensäuren nicht in die Analysenwerte eingegangen sein.

Aus den Ergebnissen der Studien 3 und 4 lässt sich schließen, dass sich durch die

Aufnahme von Joghurt anfangs das faecale Steroidprofil ändert. Mit zunehmender

Konsumdauer stabilisiert sich das Sterolprofil und die Gehalte unkonjugierter

Gallensäuren in den Faeces werden vermindert. Die Supplementation von

probiotischen Keimen wirkt nicht gegensätzlich (Studie 2).

Diskussion

90

6.4 Serumcholesterol und faecale Steroide Aus Studie 4 ist ersichtlich, dass die Probanden mit einer höheren faecalen

Exkretion sekundärer Gallensäuren ein geringeres LDL/HDL-Cholesterol-

verhältnis im Serum aufweisen. Weiterhin ist der Lipoproteinquotient bei

Probanden mit einer geringen Ausscheidung primärer Gallensäuren vermindert.

Diese Korrelation ist ebenfalls bei den Probanden der Studie 3 zu beobachten. Die

hypercholesterolämischen Probanden scheiden weniger sekundäre bzw. mehr

primäre Gallensäuren aus als die normocholesterolämischen Probanden. Die

Frauen der Studie 4 haben im Vergleich zu den männlichen Probanden höhere

Gehalte an Cholesterol im Blut [KLEIN 2002] und verminderte Gehalte sekundärer

bzw. erhöhte Gehalte primärer Gallensäuren im Stuhl.

In einer Studie mit 30 Patienten, die an Atherosklerose erkrankt sind, ist die

Exkretion sekundärer Gallensäuren hochsignifikant im Vergleich zu einer

gesunden Kontrollgruppe vermindert. Die HDL-Cholesterolgehalte sind in der

Patientengruppe niedriger [CHARACH et al. 1998].

Eine verringerte Gallensäurenausscheidung kann aus einem geringen

Gallensäurenpool im Körper (These 1, Abb. 37) oder aus einer erhöhten

Resorption sekundärer Gallensäuren im Colon folgen. Dadurch vergrößert sich der

Gallensäurenpool im Körper (These 2, Abb. 37), der durch Beeinflussung des

hepatischen Cholesterols einen erhöhten Cholesterolfluss in die Galle bzw. in das

Blut zur Folge hat [NAITO et al. 1996]. In der Leber, an Blutgefässwänden und

durch Makrophagen wird Cholesterol zu 27-Hydroxycholesterol oxidiert, was als

Substrat für den mitochondrialen, alternativen Weg zur Gallensäurensynthese gilt,

wobei vorwiegend CDCA gebildet wird [VLAHCEVIC et al. 2000, REISS et al. 1997,

JAVITT et al. 1994.]

In einer Studie von PULLINGER et al. [2002] wird eine verminderte Gesamtgallen-

säurenexkretion und ein erhöhter faecaler CDCA-Gehalt an einem Probanden mit

hypercholesterolämischen LDL-Cholesterolgehalten und verminderter

7α-Hydroxylaseaktivität in der Leber nachgewiesen. Die Autoren sehen als

Ursache eine Hochregulierung der alternativen Gallensäurensynthese und einen

verminderten Gallensäurenpool.

Diskussion

91

GS-Pool

Bei Probanden mit verstärkter Exkretion primärer Gallensäuren in der Studie 3

sind erhöhte LDL-Cholesterol- und geringe HDL-Cholesterolkonzentrationen im

Serum zu verzeichnen. Daraus ergibt sich eine signifikante Korrelation des

LDL/HDL-Cholesterolverhältnisses. Die Beziehungen der Gallensäurenexkretion

zu den einzelnen Blutparametern ist in Studie 4 nicht gegeben. Da die Studie mit

Normocholesterolämikern durchgeführt worden ist, sind die Korrelationen gering,

erreichen aber für den LDL/HDL-Quotienten ein signifikantes Niveau.

Chol, GS Chol

CA, CDCA

CA,CDCA DCA, iso-~ LCA, iso-~ UDCA, Chol

Metab

CDCA ↑↑↑ CA ↑↑

sek. GS ↓↑↑

Abbildung 37: Änderungen im Cholesterol- und Gallensäurenmetabolismus

Chol: Cholesterol; GS: Gallensäure; Metab: Cholesterolmetabolite;

Ca: hohe Calciumaufnahme; Ballast: hohe Ballaststoffaufnahme;

LDL: LDL-Cholesterolkonzentration; ↑: Erhöhung; ↓: Verminderung

Chol.ester ↑ Acetyl-Co A

HMG-Co A-R

Chol

CA

CDCA Leber

LDL: Chol ↑↓↓↓↑, 27OH-Chol HDL: Chol ↑↑↑

Serum

GalleChol CA

CDCA sek. GS

27-H

ydro

xyla

se

7-H

ydro

xyla

se

Ileum

Jej

unum

D

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F

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s

Col

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LDL ↑ These 1 These 2 Ca Ballast GS-Output ↑ GS-Input ↑ Anstieg ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ Abfall ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓

↑↓↓↑

↑↑

↑↑↓ ↓

↓ ↑ ↑

↑

↑

Diskussion

92

Die These der erhöhten Resorption von Gallensäuren wird durch die Arbeiten von

GYLLING et al. [2002] unterstützt. Dabei wird in Hypercholesterolämikern eine

Mangelabsorption an Gallensäuren induziert, die eine Verminderung des

LDL-Cholesterols und eine Erhöhung des HDL-Cholesterols zur Folge hat. Die

gleichen Änderungen der Blutparameter werden nach Gabe von Koriandersamen

von CHITHRA und LEELAMMA [1997] bei Anstieg der faecalen Gallensäurenexkretion

beobachtet. In einer Tierstudie mit Ratten von USMAN und HOSONO [2000] wird ein

hypocholesterolämischer Effekt von L. gasseri SBT0274 durch eine verminderte

Reabsorption von Gallensäuren im enterohepatischen Kreislauf und eine erhöhte

faecale Exkretion beschrieben. Die Fütterung von primären Gallensäuren führt

hingegen zu erhöhten LDL-Cholesterolkonzentrationen in Ratten und Hamstern

bei einem zunehmenden Gallensäurenpool [CHIANG et al. 1998, SPADY et al. 1986]

(Abb. 37).

In Studie 3 sind durch 6-monatigen Joghurtkonsum sowohl bei den normo- als

auch bei den hypercholesterolämischen Probanden die HDL-Cholesterol-

konzentrationen angestiegen, die LDL-Cholesterolkonzentrationen gesunken und

das Verhältnis von LDL/HDL-Cholesterol vermindert sich. Die Ausscheidung an

unkonjugierten primären und sekundären Gallensäuren ist in beiden

Probandengruppen vermindert. Während das Verhältnis der primären und

sekundären Gallensäuren in der normocholesterolämischen Probandengruppe

unverändert bleibt, ist es in der hypercholesterolämischen Gruppe mit

zunehmenden Joghurtkonsum tendenziell vermindert. In einer Studie an Ratten

wurde durch Calciumzulage die LDL-Cholesterolkonzentration vermindert und die

HDL-Cholesterolkonzentration erhöht, dies führt zu einem Anstieg im

HDL/LDL-Cholesterolquotienten und demzufolge in eine Verminderung des

LDL/HDL-Cholesterolverhältnisses [VASKONEN et al. 2002] (Abb. 37).

Schlussfolgerungen

93

7 SCHLUSSFOLGERUNGEN » Die gaschromatographisch-massenspektrometrische Analyse von faecalem

Cholesterol und dessen bakteriellen Metaboliten Coprostanol, Coprostanon,

Cholestanol und Cholestanon zeigt, dass sie für quantitative Aussagen

geeignet ist.

» Die Separation von Cholesterol und Cholestanol wird durch die Anwendung

der Gaschromatographie mit üblicher Detektion erreicht. Hingegen ist zur

Separation von Cholesterol und Coprostanon die spezifische Detektion im

Single Ion Monitoring erforderlich.

» Mit der Analyse underivatisierter Sterole können sowohl die Artefaktbildung

des Hauptabbauproduktes Coprostanon durch Trimethylsilylierung als auch

Substanzverluste durch eine unvollständige Reaktion verhindert werden.

» Die neue Methode erlaubt hinsichtlich des Zeit- und Chemikalienaufwandes

eine vereinfachte Probenaufarbeitung.

» Die quantitative gaschromatographische Analyse von faecaler iso-Deoxy-

cholsäure, Deoxycholsäure, iso-Lithocholsäure, Lithocholsäure, Cheno-

deoxycholsäure, Cholsäure und 12-Oxo-Deoxycholsäure ist realisierbar.

» Mittels massenspektrometrischer Detektion im Modus des Single Ion

Monitorings sind Peaküberlagerungen durch koeluierende Substanzen

vermindert, wie es am Beispiel der Cholsäure gezeigt werden kann.

» Die Analyse von 3-Oxo-Gallensäuren ist aufgrund ihres instabilen

chemischen Verhaltens innerhalb der Probenvorbereitung nicht möglich.

» Die entwickelten Methoden zur Sterol- und Gallensäurenanalyse sind für

einen hohen Probendurchsatz geeignet.

Schlussfolgerungen

94

» Die tägliche Aufnahme von bis zu 2.460 mg anorganischem Calcium und

3.200 mg Phosphor ist ohne Einfluss auf die faecale Exkretion von

Gesamtgallensäuren. Durch die Calciumphosphatzulage ist der Gehalt an

Coprostanon in der Trockensubstanz signifikant erhöht; die Cholesterol-

konzentrationen sind aufgrund starker Streuung unverändert (Studie 1).

» Der Verzehr von Joghurt über 6 Monate vermindert die faecale Exkretion

unkonjugierter primärer und sekundärer Gallensäuren, wobei die

Sterolausscheidung unverändert bleibt (Studie 3).

» Die probiotischen Stämme Lactobacillus paracasei LTH 2579, Lactobacillus

acidophilus 145, Bifidobacterium longum 913, Lactobacillus acidophilus 742

und Bifidobacterium species 420 bewirken keine Änderung des faecalen

Gallensäurenprofiles. Bei Supplementation von L. paracasei ist eine

Tendenz zu verminderten Deoxycholsäuregehalten erkennbar. Die in

Joghurt verabreichten Stämme führen zu verminderten faecalen

Coprostanolkonzentrationen (Studien 2 - 4).

» In allen vier Studien konnten Probanden mit einem inversen Sterolprofil

nachgewiesen werden, wobei in fünf von acht Fällen kein Hinweis auf eine

Darmerkrankung zu erkennen war.

» Hypercholesterolämische Probanden scheiden weniger sekundäre Gallen-

säuren aus als normocholesterolämische Probanden und tendieren zu

erhöhten Gehalten primärer Gallensäuren in den Faeces (Studie 3).

» Die tägliche Steroidexkretion von 86 erfassten Probanden und deren

Gehalte an Sterolen und Gallensäuren in der Stuhltrockensubstanz sind mit

den in der Literatur zitierten Werten vergleichbar.

» Die Gehalte an Cholesterol und Coprostanol in der Trockensubstanz stehen

in einem korrelativen Zusammenhang.

Zusammenfassung

95

8 ZUSAMMENFASSUNG

Ziel der Arbeit war es, analytische Methoden zur Bestimmung faecaler Sterole und

Gallensäuren zu erstellen. Weiterhin sollten unter Anwendung der Methoden

Einflüsse einer Supplementation der Nahrung mit Calciumphosphaten, Probiotika

und Joghurt auf die Exkretion dieser Steroide eruiert werden.

Etablierte gaschromatographische Methoden zur Sterolanalytik mit Flammen-

ionisationsdetektion erfordern eine Derivatisierung zur Trennung der Analyten. Mit

Einsatz der massenspektrometrischen Detektion ist es möglich, spezifische

Fragmente zu bestimmen und dadurch eine Separation koeluierender Substanzen

zu gewährleisten. Auf der Basis dieser analytischen Komponenten ist die

quantitative Analyse underivatisierter Sterole (Cholesterol, Coprostanol,

Coprostanon, Cholestanol, Cholestanon) realisierbar. Dazu werden die Sterole

hydrolysiert und anschließend mit Cyclohexan extrahiert. Nach Vereinigung der

Extrakte und Einengen bis zur Trockne werden die Sterole in Decan gelöst und in

den Gaschromatographen injiziert. Als interner Standard wird 5α-Cholestan

eingesetzt. Unter Auswertung der Massenspektren sind folgende Fragmente zur

Quantifizierung ausgewählt worden: 5α-Cholestan (m/z = 357,25), Coprostanol

(m/z = 373,50), Cholesterol (m/z = 301,30), Coprostanon (m/z = 316,30),

Cholestanol (m/z = 215,10) und Cholestanon (m/z = 232,00).

Durch den Einsatz des Single Ion Monitoring in der faecalen Gallensäurenanalytik

ist es möglich, Peaküberlagerungen durch die komplexe und individuelle

Faecesmatrix vor allem bei hohen Probendurchsätzen im Vergleich zur Detektion

mittels Flammenionisationsdetektion zu verringern. Zur Probenvorbereitung wird

die wässrige Phase der Sterolextraktion mit Natronlauge hydrolysiert,

anschließend mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 1 eingestellt und die freien

Gallensäuren werden mit Diethylether separiert. Nach Methylierung und

Silylierung wird 1 µl in den Gaschromatographen injiziert. Zur quantitativen

Analyse sind die Fragmente für iso-LCA (m/z = 215,25), LCA (m/z = 215,25), iso-

DCA (m/z = 75,10), DCA (m/z = 255,30), CDCA (m/z = 73,10), CA (m/z = 253,20),

HDCA (interner Standard, m/z = 81,15), 12-Oxo-DCA (m/z = 231,25) aus den

Massenspektren ausgewählt worden.

Zusammenfassung

96

Um einen möglichen Einfluss von Calciumphosphat, Probiotika und Joghurt auf

die Steroidexkretion zu bestimmen, werden gefriergetrocknete Faecesproben aus

vier Humanstudien analysiert. Diese sind am Institut für Ernährungswissenschaft,

Lehrstuhl Ernährungsphysiologie, der Friedrich-Schiller-Universität Jena zwischen

1997 und 2001 durchgeführt worden.

In Studie 1 verzehren 11 männlichen Probanden eine Diät mit einer gesteigerten

Zufuhr von Calciumphosphat im Verhältnis Ca : P = 1 : 1,3. Die Studie ist in drei

Perioden gegliedert. In der Kontrollperiode nehmen die Probanden auf der Basis

von erhobenen Ernährungsprotokollen täglich 1.231 mg Calcium und 1.600 mg

Phosphor auf. In der ersten Zulageperiode werden täglich 609 mg Calcium und

793 mg Phosphor in Form von Tabletten supplementiert. Die Dosis wird in der

zweiten Zulageperiode verdoppelt.

Die Probanden setzen in allen Perioden vergleichbare Stuhlmassen ab. Eine

gesteigerte Zufuhr von anorganischem Calcium und Phosphor beeinflusst die

tägliche faecale Gallensäurenexkretion und die Konzentrationen in der

Trockensubstanz nicht. Durch Calciumphosphat (Ca: 1.218 mg/d bzw.

P: 1.586 mg/d) sind die täglichen Coprostanonausscheidungen und die Gehalte im

Stuhl signifikant erhöht. Die Änderungen der mittleren Konzentrationen an

Coprostanon und Cholesterol in der Trockensubstanz verlaufen gleichförmig. Die

Konzentrationsunterschiede des Cholesterols sind aufgrund einer starken

Streuung statistisch nicht gesichert.

Der Einfluss von Lactobacillus paracasei LTH 2579 (108 KBE/g) auf die faecale

Steroidexkretion wird an je 10 männlichen und weiblichen Probanden in Studie 2

untersucht. Dabei werden über zwei Versuchsperioden täglich 50 g Rohwurst mit

bzw. ohne Probiotikum verzehrt.

Die Frauen der Studie 2 setzen signifikant weniger Stuhl ab als die Männer. Bei

allen Probanden ist eine verringerte Stuhlexkretion in der zweiten Periode

festzustellen. Die Keimzahlen an Lactobacillen in den Faeces sind nach Zulage in

der zweiten Periode erhöht. Weibliche Probanden scheiden weniger Sterole und

Gallensäuren aus als die männlichen. Unter Berücksichtigung der Fettaufnahme

sind die geschlechtsspezifischen Unterschiede in der Gallensäurenexkretion nicht

Zusammenfassung

97

mehr nachzuweisen. Die gesamte tägliche Gallensäurenausscheidung ist in der

zweiten Periode signifikant vermindert. Allerdings bleiben unabhängig vom

Probiotikum die Gehalte an sauren Steroiden in der Trockensubstanz und nach

Standardisierung auf 30 g Trockensubstanzexkretion mit Ausnahme tendenziell

verminderter Deoxycholsäurewerte unbeeinflusst. Die Diskrepanz wird durch

verschiedene Stuhlmassen zwischen den Versuchsperioden hervorgerufen.

In Studie 3 wird der Einfluss eines mit Lactobacillus acidophilus 145

(106 - 108 KBE/g) und Bifidobacterium longum 913 (105 KBE/g) supplementierten

Joghurts auf Änderungen der faecalen Steroidexkretion von 29 normo-

cholesterolämischen bzw. moderat hypercholesterolämischen Frauen untersucht.

Die Studie ist im cross-over Design in drei 7-wöchige Perioden strukturiert, wobei

die erste eine Adaptationsphase mit konventionellem Joghurt darstellt.

In Analogie zu Studie 2 scheiden die Probanden nach Gabe des probiotischen

Produktes weniger Stuhl aus. Der faecale pH-Wert ist sowohl nach

konventionellem als auch nach probiotischem Joghurtverzehr signifikant zur

Adaptationsperiode vermindert. Die Konversionsrate des Cholesterols bleibt in

allen Perioden unverändert bei ca. 88 %. Die tägliche Exkretion der sekundären

Gallensäuren vermindert sich um etwa 30 % unabhängig vom Probiotika-

supplement im Vergleich zu den Adaptationswerten. Weiterhin ist die

Ausscheidung an primären Gallensäuren ohne Einfluss der zugesetzten Bakterien

verringert. Die Ergebnisse der Gallensäurengehalte in der Gefriertrockensubstanz

der Faeces bestätigen die verminderte Exkretion. Hypercholesterolämische

Probanden scheiden signifikant weniger sekundäre Gallensäuren und tendenziell

mehr primäre Gallensäuren pro Tag aus.

In der vierten Studie wird ein mit Lactobacillus acidophilus 742 (107 KBE/ml) und

Bifidobacterium species 420 (104 KBE/ml) versetzter Joghurt an je 13 männliche

und weibliche Probanden verabreicht. In den im cross-over Design durchgeführten

Untersuchungen dauern die beiden Studienphasen jeweils 5 Wochen und in der

Startperiode wird kein Joghurt verzehrt.

Im Verlauf der Studie sind keine signifikanten Änderungen in der täglichen

Stuhlexkretion und des faecalen pH-Wertes aufgetreten. Die Frauen scheiden in

Zusammenfassung

98

der Basisperiode mit 18 g/d Trockenstuhl bzw. 67 g/d Frischsubstanz geringe

Mengen aus. Im Studienverlauf ändern sich die Gallensäurenkonzentrationen in

der Gefriertrockensubstanz nicht. Nach konventioneller Joghurtgabe sind im

Vergleich zu den Basisdaten die Gehalte an Cholesterol erhöht und die

Konversionsrate vermindert. Die Gesamtsterol-, Coprostanol- und

Cholesterolkonzentrationen sind nach Konsum von probiotischem Joghurt im

Vergleich zu dem konventionellen Produkt vermindert. Die tägliche Ausscheidung

an Cholesterol, Cholestanol, Coprostanon und Deoxycholsäure ist nach dem

Verzehr von Joghurt im Vergleich zu den Ausgangswerten und unabhängig von

der Joghurtart angestiegen. Ein steigender Effekt durch erhöhte Stuhlmassen

nach den Joghurtperioden ist nicht auszuschließen. Im Stuhl der weiblichen

Probanden liegen höhere Konzentrationen an Cholesterol, Coprostanol,

Coprostanon und primären Gallensäuren vor als in dem der männlichen

Probanden. Diese scheiden hingegen mehr Litho- und Deoxycholsäure aus.

An allen vier Studien nahmen Probanden mit einem inversem Sterolprofil teil,

wobei in einigen Fällen kein Hinweis auf eine Darmerkrankung zu erkennen war.

Der Verzehr von Joghurt über 6 Monate verringert die faecale Ausscheidung freier

primärer und sekundärer Gallensäuren, was durch eine Verminderung des

faecalen pH-Wertes und einer folgenden Modifikation von Enzymaktivitäten im

Colon verursacht sein kann. Die supplementierten Lactobacillen und

Bifidobakterien bewirken keine Änderung des faecalen Gallensäurenprofiles,

führen aber in Kombination mit Joghurt zu verminderten Coprostanol-

konzentrationen. Bei Supplementation von L. paracasei ist eine Tendenz zu

verminderten Deoxycholsäuregehalten in den Faeces erkennbar.

Dass ein enger Zusammenhang zwischen dem Cholesterol- und dem

Gallensäurenkreislauf im Menschen besteht, wird durch ein differentes faecales

Gallensäurenprofil moderat hypercholesterolämischer Probanden im Vergleich zu

Gesunden bestätigt. Ein dauerhafter Joghurtkonsum kann die Gehalte freier

Gallensäuren in den Faeces vermindern und die Cholesterolgehalte im Blut positiv

beeinflussen. Geringe Gallensäurenkonzentrationen im Colon sind weiterhin unter

dem Aspekt der Carcinogenese von Vorteil, da freie Gallensäuren aufgrund ihres

toxischen Verhaltens als Promotoren einer Tumorgenese gelten.

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Selbständigkeitserklärung

Selbständigkeitserklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als

die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.

Die Arbeit wurde bisher keiner anderen Prüfungsbehörde vorgelegt und auch nicht

veröffentlicht.

Jena, 28. Oktober 2002

Sylvia Keller

Danksagung

Danksagung

Mein Dank gilt Herrn Prof. G. Jahreis, der es mir ermöglichte, die Freude an der

praktischen Arbeit der Gaschromatographie, die Neugier an den physiologischen

Prozessen im Menschen und die Vorliebe für Mathematik in der Aufgabenstellung

zur Steroidanalyse und deren Anwendung zu verbinden. Er verfolgte meine teils

auch unkonventionellen Ideen stets mit Aufmerksamkeit und unterstützte mich bei

der Umsetzung in eine praktizierbare Anwendung.

Weiterhin möchte ich den derzeitigen und ehemaligen Mitarbeitern des

Lehrbereichs Ernährungsphysiologie danken. Sie wurden nie müde meine häufigen

und wohl manchmal drängenden Fragen zur Physiologie und Ernährung des

Menschen zu beantworten. Innerhalb von vier Jahren meiner Arbeit gab es auch

Momente, in denen sich das Gesetz von Murphy bewahrheiten wollte. Jedoch der

humorvolle Geist meiner Kollegen erzeugte immer wieder die innere

Herausforderung sich das scheinbare Eigenleben der Gerätetechnik zu Nutze zu

machen.

Der Arbeit von Frau Andrea Klein, Frau Dr. Manuela Grimm und Frau Dr. Grit

Kießling bei der Durchführung der Humanstudien ist es zu verdanken, dass es mir

nie an Probenmaterial mangelte und mir alle notwendigen Informationen zur

Verfügung standen.

Die Gesprächsbereitschaft der Mitarbeiter der Firma SHIMADZU über Themen des

Handbuchs „GC-MS QP 5000“ hinaus, verschaffte mir theoretische und praktische

Hilfe.

Abschließend danke ich meiner Familie für die vielen Stunden des „Fezes“.

· 2008. 5. 27. · Methodenentwicklung zur gaschromatographisch-massenspektrometrischen Analyse...

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