3'-S-Phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide und ... · Die Druckfreigabe für diese Arbeit...

3'-S-Phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide

und

Fluoreszierende Nucleotid-Prodrugs für

Zellaufnahmestudien

Dissertation

zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades

von

Inga Susanne Reimer

vorgelegt dem Fachbereich Chemie

der Universität Hamburg

Hamburg 2017

Die Druckfreigabe für diese Arbeit wurde am 03.04.2017 durch das Studienbüro des

Fachbereichs Chemie der Universität Hamburg erteilt.

Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Organische Chemie der Universität Hamburg im

Arbeitskreis von Prof. Dr. Chris Meier in der Zeit von Oktober 2012 bis Januar 2017

angefertigt.

1. Gutachter: Prof. Dr. Chris Meier

2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Wittko Francke

Datum der Disputation: 31.03.2017

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungen und Symbole .................................................................................................. I

Zusammenfassung ............................................................................................................. IV

Abstract.............................................................................................................................. VII

Teil I: 3'-S-Phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide

1 Einleitung .................................................................................................................. 1

2 Kenntnisstand ........................................................................................................... 3

2.1 Horizontaler Gentransfer bei Prokaryoten ............................................................... 3

2.2 Plasmid pMV158 .................................................................................................... 5

2.3 Relaxase MobM ..................................................................................................... 7

2.4 3‘-S-Phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide ..................................................... 8

2.5 Synthese der Phosphorthioamidite ....................................................................... 12

3 Aufgabenstellung .................................................................................................... 16

4 Resultate und Diskussion ...................................................................................... 17

4.1 Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe des Guanosins 30 bzw. 2‘-Desoxy-

guanosins 19 ........................................................................................................ 17

4.2 Einbringen des Schwefels .................................................................................... 26

4.3 Synthese des 2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidits .................................... 27

4.4 Fazit der verwendeten Syntheserouten ................................................................ 30

4.5 Synthese des 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotids ........................... 31

4.6 Einsatz eines 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Dinucleotids ................................. 39

4.6.1 Synthese des 3‘-O-tert-Butyldimethylsilylthymidins 53 ..................................... 39

4.6.2 Testsynthese eines 3‘-TBDMS-geschützten Dinucleotids mit einem

O-Phosphoramidit ............................................................................................ 40

4.6.3 Abspaltung der TBDMS-Gruppe an der 3‘-Position des

O-verbrückten Dinucleotids 59 ......................................................................... 42

4.6.4 Die 4-Monomethoxytritylsulfenyl-Schutzgruppe ............................................... 42

4.6.5 Synthese des 3’-O-(4-Methoxytritylsulfenyl)thymidins 61 ................................. 44

4.6.6 Synthese des 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Dinucleotids 51 ....................... 46

Teil II: Fluoreszierende Nucleotid-Prodrugs für Zellaufnahmestudien

5 Einleitung ................................................................................................................ 51

6 Kenntnisstand ......................................................................................................... 54

Inhaltsverzeichnis

6.1 Wirkstoffe zur Behandlung von HIV-Infektionen .................................................... 54

6.2 Combined antiretroviral therapy (cART) ................................................................ 56

6.3 Phosphorylierung zum antiviral aktiven Nucleosidtriphosphat ............................... 57

6.4 Nucleosidmonophosphat-Prodrugs ....................................................................... 58

6.4.1 cycloSal-Prodrugs ............................................................................................ 60

6.5 Nucleosiddi- und -triphosphat-Prodrugs ................................................................ 63

6.5.1 DiPPro- und TriPPPro-Verbindungen ............................................................... 65

6.6 Evaluierung der Zellaufnahme von Prodrugs ........................................................ 68

6.6.1 Bicyclische Nucleosidanaloga (BCNAs) ........................................................... 70

7 Aufgabenstellung .................................................................................................... 74

8 Resultate und Diskussion ...................................................................................... 77

8.1 Eignung der BCNAs als Fluoreszenzsonden für Prodrugsysteme ........................ 77

8.2 Synthese der Bicyclischen Nucleosidanaloga ....................................................... 79

8.3 Synthese des 3-Me-cycloSal-ddBCNA-Prodrugs 89 ............................................. 83

8.4 Synthese der fluoreszierenden Nucleosiddiphosphat-Prodrugs ............................ 85

8.4.1 Synthese des 6-Prop-ddBCNA-Monophosphats 128 ....................................... 86

8.4.2 Synthese des symmetrisch maskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 94 .......... 91

8.4.3 Synthese des nicht-symmetrisch maskierten

DiPPro-6-Prop-ddBCNADP 102 ....................................................................... 94

8.4.4 Synthese des monomaskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 103 .................... 98

8.5 Synthese der fluoreszierenden Nucleosidtriphosphat-Prodrugs .......................... 102

8.5.1 Synthese des nicht-symmetrisch maskierten

TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 104 ................................................................ 103

8.5.2 Synthese des monomaskierten TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 105 ............... 107

8.6 Cf1743-Prodrugs ................................................................................................ 111

8.6.1 Synthese der Cf1743-Prodrugs ...................................................................... 111

8.6.2 Antivirale Aktivität der Cf1743-Prodrugs ......................................................... 114

8.7 Hydrolyseverhalten der fluoreszierenden Prodrugs ............................................ 115

8.7.1 Hydrolyse des symmetrisch maskierten

C9-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 94 ................................................................ 116

8.7.2 Hydrolyse des nicht-symmetrisch maskierten

C4/C14-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 102 ........................................................ 118

8.7.3 Hydrolyse des C17-monomaskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 103 .......... 121

8.7.4 Hydrolyse des nicht-symmetrisch maskierten

C4/C14-TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 104 ..................................................... 123

8.7.5 Hydrolyse des C17-monomaskierten TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 105 ........ 125

8.7.6 Fazit der Hydrolysen der fluoreszierenden Prodrugs ...................................... 128

Inhaltsverzeichnis

8.8 Zellaufnahmestudien mit fluoreszierenden Prodrugs .......................................... 128

8.8.1 Zellaufnahmestudien mit dem 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89 ................. 129

8.8.2 Zellaufnahmestudien mit dem C9-DiPPro-6-Prop-ddBCNADP 94 ................... 133

8.8.3 Zellaufnahmestudien mit dem C4/C14-DiPPro-6-Prop-ddBCNADP 102 ........... 134

8.8.4 Zellaufnahmestudien mit dem C17-monomaskierten

DiPPro-6-Prop-ddBCNADP 103 ..................................................................... 135

8.8.5 Zellaufnahmestudien mit dem C4/C14-TriPPPro-6-Prop-ddBCNATP 104 ........ 136

8.8.6 Zellaufnahmestudien mit dem C17-monomaskierten

TriPPPro-6-Prop-ddBCNATP 105 .................................................................. 138

8.8.7 Fazit der Zellaufnahmestudien mit den fluoreszierenden Prodrugs ................ 139

9 Experimenteller Teil .............................................................................................. 141

9.1 Allgemeines ........................................................................................................ 141

9.1.1 Edukte und Reagenzien ................................................................................. 141

9.1.2 Lösungsmittel ................................................................................................. 141

9.1.3 Chromatographie ........................................................................................... 142

9.1.4 Spektroskopie und Spektrometrie .................................................................. 146

9.1.5 Weitere Geräte .............................................................................................. 147

9.2 Synthesen .......................................................................................................... 149

9.2.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften (AAV) ............................................................ 149

9.2.2 Synthese von 2‘-Desoxyguanosinphosphorthioamiditen ................................ 152

9.2.3 Synthese des Thymidin-Bausteins ................................................................. 170

9.2.4 Synthese eines Dinucleotidphosphorthioamidits ............................................ 177

9.2.5 Synthesizer .................................................................................................... 180

9.2.6 Synthese des 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotids 27 ................ 181

9.2.7 Synthese von bicyclischen Nucleosidanaloga (BCNA) ................................... 183

9.2.8 Synthese von BCNAMP und BCNADP .......................................................... 193

9.2.9 Synthese von Nucleosiddi- und Triphosphatprodrugs .................................... 202

9.3 Hydrolysestudien in CEM/0-Zellextrakt ............................................................... 221

9.4 Zellaufnahmestudien .......................................................................................... 222

10 Literaturverzeichnis .............................................................................................. 224

Anhang .............................................................................................................................. 237

Gefahrstoffverzeichnis ........................................................................................................ 237

Synthesizer Methoden ........................................................................................................ 245

Verbindungsübersicht ......................................................................................................... 248

Danksagung ....................................................................................................................... 252

Eidesstattliche Versicherung .............................................................................................. 253

Abkürzungen und Symbole

I


3TC Lamivudin

ABC Abacavir

Ac Acetyl

ACV Aciclovir

AIDS aquired immunodeficiency syndrome

AZT Zidovudin

BCNA Bicyclisches Nucleosidanalogon

BisAB Bis(4-acyloxybenzyl)

BisPOC Bisisopropyloxycarbonyloxymethyl

BisPOM Bispivaloyloxymethyl

BTT 5-Benzylthio-1H-tetrazol

Bu Butyl

Bz Benzoyl

CAN Ammoniumcer(IV)-nitrat

cART combined antiretroviral therapy

CatA Cathepsin A

CEM/0 humane T-Lymphozyten-Zellinie (Wildtyp)

CES1 Carboxyesterase 1

CPG controlled pore glas

cycloSal cycloSaligenyl

d4T Stavudin

d4U 2‘,3‘-Didesoxy-2‘,3‘-didehydrouridin

DBU 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en

DCA Dichloressigsäure

DCI 4,5-Dicyanoimidazol

ddC Zalcitabin

ddI Didanosin

ddNTP 2‘,3‘-Didesoxynucleosidtriphosphat

ddU 2‘,3‘-Didesoxyuridin

DEAD Diethylazodicarboxylat

DIAD Diisopropylazodicarboxylat

DIPEA N,N-Diisopropylethylamin

DMF N,N-Dimethylformamid

DMF-DEA N,N-Dimethylformamiddiethylacetal

DMSO Dimethylsulfoxid


II

DMTr 4,4‘-Dimethoxytrityl

DNA deoxyribonucleic acid

DNA pol DNA-Polymerase

dNTP 2‘-Desoxynucleosidtriphosphat

DPP Diphenylphosphonat

ER endoplasmatisches Retikulum

ESI Elektrospray-Ionisation

Et Ethyl

ETT 5-Ethylthio-1H-tetrazol

FCS fötales Kälberserum

FDA U. S. Food and Drug Administration

Fm Fluorenylmethyl

FTC Emtricitabin

HBV Hepatitis-B-Virus

HCV Hepatitis-C-Virus

HDP Hexadecyloxypropyl

HGT horizontaler Gentransfer

HIV human immunodeficiency virus

HIV-1 HIV Typ 1

HIV-2 HIV Typ 2

HPLC high performance liquid chromatography

HTLV human T-cell leukemia virus

iBu Isobutyryl

IEX ion exchange

IR inverted repeats

isc intersystem crossing

LAV-II lymphadenophathy-AIDS-virus type II

LPC Lysophosphatidylcholin

MDR multidrug resistance

Me Methyl

MK-0518 Raltegravir

MMTr 4-Monomethoxytrityl

MMTrS 4-Monomethoxytritylsulfenyl

Ms Methansulfonyl

NCS N-Chlorsuccinimid

(N)DP (Nucleosid-)Diphosphat

NDPK Nucleosiddiphosphatkinase


III

(N)MP (Nucleosid-)Monophosphat

NNRTI Nicht-Nucleosidischer Reverse Transkriptase-Inhibitor

NRTI Nucleosidischer Reverse Transkriptase-Inhibitor

(N)TP (Nucleosid-)Triphosphat

Nucl Nucleosid

oriT origin of transfer

PBP Penicillin-Bindungsproteine

Pr Propyl

QRDR quinolone resistance determining region

RNA ribonucleic acid

RP reversed phase

RPMI Roswell Park Memorial Institute

RT Reverse Transkriptase

SG Schutzgruppe

SIV simian immunodeficiency virus

SQV Saquinavir

STR single-tablet regimen

T-20 Enfuvirtid

T4CP type IV coupling protein

T4SS type IV secretion system

TAF Tenofoviralafenamid

TBAF Tetrabutylammoniumfluorid

TBDMS tert-Butyldimethylsilyl

TCA Trichloressigsäure

TDF Tenofovirdisoproxilfumarat

TFAA Trifluoressigsäureanhydrid

TFV Tenofovir

THF Tetrahydrofuran

TK(-) Thymidinkinase(-defizient)

TMS Trimethylsilyl

Ts Tosyl

T-Strang transferred strand

UV Ultraviolett

VZV Varizella-Zoster-Virus

Zusammenfassung

IV

Zusammenfassung

Teil I: 3'-S-Phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide

Eine wichtige Rolle bei der Verbreitung von Resistenzen bei Bakterien spielt die Konjugation,

bei der mobile genetische Elemente, wie Plasmide, übertragen werden. Das Schlüsselenzym

bei diesem Prozess ist die Relaxase. Diese DNA-Strangtransferasen können Plasmid-DNA

strang- und sequenzspezifisch schneiden. Die Relaxase MobM des Streptokokkenplasmids

pMV158 ist der Prototyp der MOBV-Familie. Zur Aufklärung des Mechanismus der

Bindungsspaltung durch die Relaxase MobM sollten phosphorthiolatverbrückte Oligo-

nucleotide eingesetzt werden. Durch das, bei der Reaktion gebildete, stabile DNA-Protein-

Addukt sollten biochemische und kristallographische Untersuchungen möglich werden.

Das erste Ziel dieser Arbeit war die Darstellung des für die Untersuchung der Relaxase

MobM benötigten 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotids. Die 3‘-S-Phosphorthiolat-

Verbrückung sollte hierbei zwischen einer 2‘-Desoxyguanosineinheit und einer

Thymidineinheit liegen, da dies das Spaltungsmotiv (oriT) der Relaxase MobM beinhaltet.

Phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide können mittels automatisierter Festphasen-

synthese mit Phosphorthioamiditen als Monomerbausteine synthetisiert werden. Es sollte

somit zunächst das N2-Dimethylformamidin-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2‘-desoxy-3’-thio-

guanosin-3’-S-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidit dargestellt werden.

Zur Darstellung des gewünschten 2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidits wurde eine

6-stufige Syntheseroute entwickelt, worüber das Thioamidit in einer Gesamtausbeute von

23%, ausgehend von 2‘-Desoxyguanosin, erhalten wurde (Abschnitt 4.1 - 4.4). Der

Schlüsselschritt der Route war die Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe mit gleichzeitiger

Mesylierung über eine Mitsunobu-Reaktion mit Methansulfonsäure. Das Einbringen des

Schwefels an der 3‘-Position erfolgte durch eine SN2-Reaktion mit Natriumthiobenzoat. Nach

Hydrolyse der Benzoylgruppe und BTT-vermittelter Phosphorylierung wurde das gewünschte

2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidit erhalten. Die Gesamtausbeute liegt damit im

Bereich der, von PIPERAKIS publizierten, 8-stufigen Route für 2‘-Desoxyguanosin-

3‘-phosphorthioamidite (21% Gesamtausbeute ausgehend von 2‘-Desoxyguanosin)[1]. Die

Hauptunterschiede der Routen liegen bei der Schutzgruppenstrategie, der Inversion der

3‘-Hydroxylgruppe und dem Einbringen des Schwefels.

Mit diesem modifizierten Baustein konnte das, für die mechanistischen Untersuchungen

benötigte, 3‘-S-phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotid erfolgreich über die automatisierte

Festphasensynthese mit Phosphoramiditen als Monomerbausteine dargestellt werden (Ab-

schnitt 4.5). Essentiell ist hierbei eine Fällung des Phosphorthioamidits aus n-Hexan vor dem

Einsatz in der Oligonucleotidsynthese. Nach Optimierung der Synthesebedingungen und der

Reinigung lag die Ausbeute des Oligonucleotids bei 7%. Die Synthesen wurden mehrfach

Zusammenfassung

V

wiederholt, so dass insgesamt 330 nmol des gewünschten 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten

Oligonucleotids in hoher Reinheit erhalten wurden. Damit konnte ausreichend Material für die

Untersuchung der Relaxase MobM dargestellt werden. Zum Zeitpunkt des Abschluss dieser

Arbeit lagen allerdings noch keine Ergebnisse zu diesen Untersuchungen vor.

Aufgrund der relativ niedrigen Ausbeute der Oligonucleotidsynthese wurde untersucht, ob

diese durch Verwendung eines 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Dinucleotids gesteigert

werden kann (Abschnitt 4.6). Durch die Vorverlagerung des ineffizienten Schritts sollte der

hohe zeitliche Reinigungsaufwand des Oligonucleotids verringert werden. Hierfür wurde das

N2-Dimethylformamidin-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2‘-desoxy-3’-thioguanosin-3’-S-[(2-cyano-

ethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidit mit einem 3‘-geschützten Thymidin umgesetzt. Als

Schutzgruppen wurden die TBDMS- und die oxidativ spaltbare MMTrS-Gruppe erprobt.

Aufgrund des geringen Umsatzes bei der Kupplung und der Labilität des gebildeten 3‘-S-

phosphorthiolatverbrückten Dinucleotids konnte jedoch in beiden Fällen das für die Oligo-

nucleotidsynthese benötigte Dinucleotid-3‘-phosphoramidit nicht erhalten werden. Somit war

es über diesen Weg nicht möglich, die Ausbeute der Oligonucleotidsynthese zu steigern.

Teil II: Fluoreszierende Nucleotid-Prodrugs für Zellaufnahmestudien

Neben Protease-Inhibitoren bilden Nucleosidische Reverse Transkriptase-Inhibitoren

(NRTIs) heutzutage die Grundlage der Behandlung von HIV-Infektionen. In ihrer

Darreichungsform sind die NRTIs inaktiv und müssen zunächst durch zelluläre Enzyme zum

Triphosphat metabolisiert werden. Die Phosphorylierung der Nucleosidanaloga ist jedoch

aufgrund der Substratspezifität der zellulären Kinasen häufig ineffizient. Aus diesem Grund

wurden verschiedene Nucleotid-Prodrugkonzepte entwickelt, um die antivirale Aktivität im

Vergleich zu den entsprechenden Nucleosiden zu steigern. Das DiPPro- und das TriPPPro-

Konzept sind die ersten Ansätze, mit denen eine erfolgreiche intrazelluläre Freisetzung des

Nucleosiddi- bzw. -triphosphats realisiert werden konnte.

Das zweite Ziel dieser Arbeit war eine Validierung dieser Prodrugkonzepte in Bezug auf

deren Zellaufnahme und Metabolisierung durch Verwendung von fluoreszierenden Prodrug-

analoga. Zudem sollte als Monophosphat-Prodrug eine cycloSal-Verbindung untersucht

werden. Als fluoreszierende Sonden wurden Bicyclische Nucleosidanaloga (BCNAs)

eingesetzt, die sich bereits mehrfach in Zelltests bewährt haben. Eine weitere für die

Zellaufnahmestudien hilfreiche Eigenschaft der BCNAs ist, dass sie keine Substrate für

zelluläre Kinasen sind. Wenn bei den Untersuchungen phosphorylierte BCNA-Verbindungen

detektiert werden, kann somit auf eine erfolgreiche Zellaufnahme und die gewünschte

intrazelluläre enzymatische Hydrolyse geschlossen werden.

Für diese Zellaufnahmestudien wurden drei DiPPro-BCNADP-Verbindungen (eine

symmetrisch maskierte, eine nicht-symmetrisch maskierte und eine monomaskierte) und

Zusammenfassung

VI

zwei TriPPPro-BCNATP-Verbindungen (eine nicht-symmetrisch maskierte und eine

monomaskierte) dargestellt (Abschnitt 8.4 und 8.5). Hierbei konnten für die problematischen

Synthesen des BCNA-Monophosphats und -Diphosphats Synthesewege entwickelt werden,

worüber sich diese Verbindungen in sehr guten Ausbeuten von 67% und 83% synthetisieren

ließen (Abschnitt 8.4.1 und 8.5.2). Weiterhin wurden die monomaskierten Prodrugs über eine

neue Route zugänglich gemacht, über die erstmals eine monomaskierte DiPPro-Verbindung

in einer guter Ausbeute von 40% erhalten werden konnte (Abschnitt 8.4.4).

Ein weiteres Ziel war die Synthese einer DiPPro- und einer TriPPPro-Verbindung des anti-

VZV-aktiven Nucleosids Cf1743 zur Untersuchung des Wirkmechanismus. Cf1743 ist der bis

heute potenteste bekannte VZV-Wirkstoff. Die beiden Prodrugs konnten erfolgreich

dargestellt werden. Allerdings konnten durch die Bildung des Nucleosids durch

Dephosphorylierung der Metabolite der Prodrugs während der antiviralen Tests keine

Rückschlüsse auf den Wirkmechanismus der BCNAs gezogen werden (Abschnitt 8.6).

Mit den für die Zellaufnahmestudien synthetisierten fluoreszierenden BCNA-Prodrugs

wurden zunächst Hydrolysestudien in CEM-Zellextrakt durchgeführt, um deren

Metabolisierungseigenschaften zu überprüfen (Abschnitt 8.7). Es wurde in allen Fällen die

gewünschte Freisetzung des Nucleosiddi- bzw. -triphosphats beobachtet. Hervorzuheben

sind hierbei die monomaskierten Prodrugs, bei deren Hydrolyse selektiv das Di- bzw.

Triphosphat gebildet wurde. Damit konnte die Annahme bestätigt werden, dass durch die

zusätzliche negative Ladung an der endständigen Phosphateinheit ein Bruch der

Phosphoranhydridbindung verhindert werden kann.

Die Zellaufnahmestudien mit den cycloSal-, DiPPro- und TriPPPro-Verbindungen wurden mit

CEM-Zellen durchgeführt. Nach der Inkubation wurden die Zellen lysiert und das Zelllysat

mittels HPLC mit Fluoreszenzdetektion untersucht. Es konnte bei allen untersuchten

cycloSal-, DiPPro- und TriPPPro-Verbindungen die Zellaufnahme des Prodrugs bestätigt und

intrazellulär das gewünschte Mono-, Di- bzw. Triphosphat nachgewiesen werden

(Abschnitt 8.8). Bei allen drei DiPPro-Verbindungen wurde intrazellulär ein sehr gutes

Diphosphat- zu Monophosphat-Verhältnis beobachtet. Analog zu den Ergebnissen der

Hydrolyse in Zellextrakt ist das monomaskierte Diphosphat-Prodrug hierbei hervorzuheben,

bei dem nach einer Inkubationszeit von einer Stunde mit Abstand das beste Verhältnis

erhalten wurde. Dieser Trend konnte bei den Triphosphat-Prodrugs allerdings nicht

festgestellt werden, bei denen der Anteil des Triphosphats an den intrazellulär detektierten

Metaboliten bei den Zellaufnahmestudien mit der nicht-symmetrisch maskierten und der

monomaskierten TriPPPro-Verbindung etwa gleich hoch war. Mit den durchgeführten

Studien konnte erstmals die erfolgreiche Zellaufnahme von monomaskierten DiPPro- bzw.

TriPPPro-Verbindungen nachgewiesen werden. Diese zeigten mit ihren ausgezeichneten

Hydrolyseeigenschaften ausgesprochen vielversprechende Eigenschaften.

Abstract

VII

Abstract

Part I: Oligonucleotides containing a 3'-S-phosphorothiolate linkage

Bacterial conjugation is a transfer process of transmittable gens, like plasmids, and plays an

important role in the distribution of antibiotic resistance. Herein, the key enzyme is the

relaxase. Relaxases are DNA strand transferases, which cleave plasmids strand- and

sequence-specific. The relaxase MobM of the streptococcal plasmid pMV158 is the prototype

of the MOBV family. For a detailed study of the cleavage reaction, catalyzed by the relaxase

MobM, oligonucleotides containing a phosphorothiolate linkage ought to be used. With the

stable protein-DNA adduct, which is formed in the reaction, biochemical and crystallographic

experiments should be possible.

The first aim of this thesis was the synthesis of an oligonucleotide containing a 3’-S-

phosphorothiolate linkage, which was needed for the experiments with the relaxase MobM.

This phosphorothiolate linkage should be located between a 2’-deoxyguanosine unit and a

thymidine unit, since the origin of transfer (oriT) of the relaxase MobM includes that

sequence. Phosphorothiolate modified oligonucleotides can be synthesized via automated

solid-phase synthesis with phosphorthioamidites as building blocks. So first, N2-[(dimethyl-

amino)-methylene]-5'-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2'-deoxy-3'-thioguanosine-3'-S-[(2-cyanoethyl)-

(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite was synthesized.

A 6-step synthesis route for the desired 2’-deoxyguanosine-3’-phosphorothioamidite has

been successfully developed. By this synthesis, the thioamidite was obtained in an overall

yield of 23%, starting from 2’-deoxyguanosine (section 4.1 - 4.4). The key step of this route

was the inversion of the 3’-hydroxyl group with a simultaneous mesylation via a Mitsunobu

reaction with methanesulfonic acid. The integration of the sulfur was done by an SN2-reaction

with sodium thiobenzoate. After hydrolysis of the benzoyl group and BTT-mediated

phosphorylation, the desired 2’-deoxyguanosine-3’-phosphorothioamidite was gained. Thus,

the overall yield is in the range of the published 8-step synthesis route for 2’-deoxy-

guanosine-3’-phosphorothioamidites (21% overall yield starting from 2’-deoxyguanosine)[1].

The main differences between the two routes are the protective group stategie, the inversion

of the 3’-hydroxyl group and the integration of the sulfur.

With this modified building block the oligonucleotide containing a 3’-S-phosphorothiolate

linkage needed for the mechanistic studies of the relaxase MobM was successfully obtained

(section 4.5). The synthesis was performed via automated solid-phase synthesis with

phosphoramidites as building blocks. Hereby, a precipitation of the phosphorothioamidite

was essential before its use in the oligonucleotide synthesis. After optimization of the

reaction conditions and the purification the oligonucleotide was obtained in a yield of 7%. By

repeating the synthesis several times 330 nmol of the desired phosphorothiolate modified

Abstract

VIII

oligonucleotide were gained in high purity. Thereby, sufficient material for the experiments

with the relaxase MobM could be synthesized. At the time of the submission of this thesis, no

results of these experiments were received.

Due to the relatively low yield of the oligonucleotide synthesis, attempts were made to

improve the yield by using a dinucleotide with a phosphorothiolate linkage (section 4.6). By

performing the inefficient step first, the time-consuming purification of the oligonucleotide

should be decreased. Therefore, the N2-[(dimethylamino)-methylene]-5'-O-(4,4’-dimethoxy-

trityl)-2'-deoxy-3'-thioguanosine-3'-S-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite was

coupled with a 3’-protected thymidine. The TBDMS and the oxidative-cleavable MMTrS

group were tested as protective groups. Due to the low conversion of the coupling reaction

and the lability of the formed phosphorothiolate modified dinucleotide, the desired

dinucleotide-3’-phosphoroamidite could not be obtained in both cases. Therefore, it was not

possible to improve the yield of the oligonucleotide synthesis by this route.

Part II: Fluorescent nucleotide prodrugs for cell uptake studies

In addition to protease inhibitors, the basis for the treatment of HIV infections are nowadays

nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs). NRTIs are inactive in their

pharmaceutical form and have to be intracellular metabolized to their corresponding

triphosphate by cellular kinases. Due to the substrate specificity of the involved kinases, this

phosphorylation is often inefficient. For this reason several pronucleotide concepts have

been developed to improve the antiviral activity in comparison to the parent nucleosides.

With the DiPPro- and the TriPPPro-approach nucleoside di- and triphosphates were

bioreversibly masked successfully for the first time.

The objective of this thesis was the validation of these prodrug concepts with regard to their

cell uptake and metabolism by using fluorescent prodrug analogs. In addition, as a

monophosphate prodrug a cycloSal-compound should be analyzed. Bicyclic nucleoside

analogs (BCNAs) were applied as fluorescent probes, which have already been used

successfully several times in cell tests. Furthermore, BCNAs are not substrates for cellular

kinases. So, if phosphorylated BCNA-species can be detected in cell uptake studies, this

would strongly indicate the successful uptake of the compound and their desired enzymatic

hydrolysis.

For these cell uptake studies three DiPPro-BCNADP-compounds (a symmetrically masked, a

non-symmetrically masked and a monomasked) and two TriPPPro-BCNATP-compounds (a

non-symmetrically masked and a monomasked) were synthesized (section 8.4 and 8.5).

Thereby, synthesis routes for the BCNA-monophosphate and -diphosphate synthesis were

developed. Via this method, the compounds were obtained in very good yields of 67% and

83% (section 8.4.1 and 8.5.2). In addition, a new synthesis route for monomasked prodrugs

Abstract

IX

was developed and, for the first time, a monomasked DiPPro-compound was obtained in a

good yield of 40% (section 8.4.4).

A further aim was the synthesis of a DiPPro- and a TriPPPro-compound of the anti-VZV

active nucleoside Cf1743 to study its mode of action. Cf1743 is the most potent known anti-

VZV drug. Both prodrugs were prepared successfully. However, due to the formation of the

nucleoside by dephosphorylation of the metabolites of the prodrugs during the antiviral tests,

no conclusion with regard to the mode of action was possible (section 8.6).

With the fluorescent BCNA-prodrugs, synthesized for the cell uptake studies, hydrolysis

studies with CEM cell extract were performed to verify their metabolic properties

(section 8.7). In all cases the release of the desired nucleoside di- or triphosphate was

observed. Hereby, a special focus should be placed on the monomasked prodrugs. By their

hydrolysis the di- or triphosphate was selectively formed. Thus, the assumption could be

verified that the additional negative charge at the terminal phosphate unit can prevent a

cleavage of the phosphoric anhydride bond.

For the cell uptake studies with the cycloSal-, DiPPro- and TriPPPro-compounds CEM-cells

were used. After incubation the cells were lysed and the cell lysate was analyzed by HPLC

with fluorescence detection. With all tested cycloSal-, DiPPro- and TriPPPro-compounds the

successful cell uptake of the prodrug was confirmed and intracellular the release of the

desired mono-, di- or triphosphate was proven (section 8.8). In case of the three DiPPro-

compounds a very good diphosphate to monophosphate ratio was obtained intracellularly.

Analogous to the results of the hydrolysis in cell extract, the monomasked diphosphate

prodrug is to be emphasized. With this compound, after an incubation time of one hour, by

far the best ratio was detected. This trend could not be observed when the non-symmetrically

masked and the monomasked triphosphate prodrug were used. The portion of the

nucleoside triphosphate in comparison to the intracellular detected metabolites was in both

cases in the same range. By the performed cell uptake studies, the successful cell uptake of

monomasked DiPPro- and TriPPPro-compounds was confirmed for the first time. These

compounds showed with their excellent hydrolysis results very promising properties.

Teil I

Teil I

3'-S-Phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide

Teil I

Einleitung Teil I

1

1 Einleitung

Antibiotikaresistenzen von Bakterien gehören zu den größten gesundheitlichen Problemen

der heutigen Menschheit, wovon jeder unabhängig des Alters oder der Bevölkerungsschicht

betroffen sein kann. Jährlich sterben allein in der Europäischen Union 25.000 Menschen an

Krankheiten, verursacht durch multiresistente Bakterien.[2] Die ansteigende Verabreichung

von Antibiotika, deren Einsatz in der Landwirtschaft und mangelnde Hygiene in

Krankenhäusern beschleunigt die Bildung und Verbreitung multiresistenter Stämme

zunehmend. Hierdurch wird die Behandlung von immer mehr Infektionen, aufgrund der

verringerten Anwendbarkeit etablierter Antibiotika, immer schwieriger. Es muss verhindert

werden, dass ehemals leicht zu heilende Krankheiten wieder zu höheren Mortalitätsraten

führen.

Eine Infektion mit dem Gram-positiven Bakterium Streptococcus pneumoniae

(Pneumokokken) kann unter anderem zu Lungenentzündung, Meningitis und Bakteriämie

führen. An den Folgen dieser Erkrankungen sterben weltweit jährlich 1.6 Millionen

Menschen. Etwa eine Million davon sind Kinder unter fünf Jahren, womit diese Infektion eine

der Hauptursachen für Todesfälle in dieser Altersgruppe ist. Die Anzahl der

Pneumokokkenerkrankungen in Europa liegt bei 10 - 100 Fällen pro 100.000 Einwohnern.[3]

Zur Behandlung von Pneumokokkeninfektionen kann eine Vielzahl an Antibiotika, wie

Penicilline, Cephalosporine, Trimethoprim-Sulfamethoxazole, Macrolide und Fluorquinolone

eingesetzt werden. Meist finden β-Lactam-Antibiotika wie Penicilline und Cephalosporine

Anwendung, zum Beispiel Penicillin G 1 und Cefotaxim 2 (Abb. 1).[4]

Abb. 1: β-Lactam-Antibiotika zur Behandlung von Pneumokokkeninfektionen.

Im Jahr 1967 wurde in Australien der erste Fall von penicillinresistenten Pneumokokken

beschrieben.[5] Zuvor konnten alle Pneumokokkeninfektionen problemlos mit Penicillin

behandelt werden. Seitdem wird weltweit ein starker Anstieg von antibiotikaresistenten

Pneumokokken beobachtet.[2]

β-Lactame verhindern die Quervernetzung der Peptidoglycane in bakteriellen Zellwänden,

indem sie im aktiven Zentrum der Penicillin-Bindungsproteine (PBPs), die Transglycosylase-

aktiv sind, binden. Durch die Inhibierung der Enzyme wird somit die Synthese der Zellwand

verhindert, was zum Absterben des Bakteriums führt.[6] β-Lactam-resistente Pneumokokken

1

2

Einleitung Teil I

2

weisen bis zu 100 Mutationen in Genen auf, die für die PBPs codieren. Hierdurch wird die

Bindungsaffinität der PBPs gegenüber β-Lactam-Antibiotika stark herabgesetzt.

Penicillinresistente Pneumokokken sind häufig ebenfalls resistent gegen weitere Antibiotika,

in den meisten Fällen gegen Trimethoprim-Sulfamethoxazole und Macrolide.[7]

Bei diesen multiresistenten Stämmen werden zur Behandlung meist Fluorquinolone, wie

Levofloxacin 3 und Moxifloxacin 4 (Abb. 2), eingesetzt.

Abb. 2: Fluorquinolone Levofloxacin 3 und Moxifloxacin 4.

Fluorquinolone inhibieren die DNA-Gyrase und die Topoisomerase IV und stören damit das

DNA-Supercoiling beim Replikationszyklus der Bakterien. Jedoch wurden auch schon

fluorquinolonresistente Pneumokokkenstämme beobachtet.[8] Die Resistenz resultiert aus

chromosomalen Mutationen in der quinolone resistance determining region (QRDR) der

gyrA-Gene der DNA-Gyrase und der parC-Gene der Topoisomerase IV. Diese Resistenzen

treten mit <2% in den meisten Ländern eher selten auf.[9] Es besteht jedoch die Gefahr, dass

aufgrund des vermehrten Einsatzes dieser Antibiotika auch die Anzahl

fluorquinolonresistenter Bakterienstämme zunimmt.

Der erste Fall von Pneumokokken, die multidrug resistance (MDR) zeigten, also resistent

gegen mindestens drei Antibiotikaklassen sind, wurde 1977 beschrieben und trat in

Südafrika auf.[10] Seitdem gibt es einen kontinuierlichen Anstieg von MDR. 1995 lag der

Anteil an MDR von der Gesamtzahl an S. Pneumoniae in den USA bei 9% und 2005 schon

bei 20%. Heutzutage sind weltweit bis zu 30% der Pneumokokken multidrug resistant.[11]

Eine wichtige Rolle bei der Verbreitung von Resistenzen spielt, neben der klonalen

Ausbreitung resistenter Stämme, der horizontale Gentransfer (HGT).[12] Die meisten der

bekannten Resistenzgene befinden sich auf mobilen genetischen Elementen, wie den

Plasmiden. Diese können durch horizontalen Gentransfer auf andere Bakterien übertragen

werden.[13]

Ein tieferes Verständnis des horizontalen Gentransfers könnte somit dazu führen, die

Ausbreitung von Antibiotika-Resistenzen einzudämmen.

3 4

Kenntnisstand Teil I

3

2 Kenntnisstand

2.1 Horizontaler Gentransfer bei Prokaryoten

Der horizontale Gentransfer bezeichnet den Prozess, bei dem Prokaryoten Genmaterial aus

ihrer Umgebung aufnehmen. Dies kann auf drei verschiedenen Wegen erfolgen: der

Transformation, der Transduktion und der Konjugation.

Bei der Transformation nimmt ein Bakterium aktiv freie, extrazelluläre Plasmid-DNA oder

chromosomale DNA auf und baut diese in das zelleigene Genom ein.[14] Dieses Phänomen

wurde erstmalig 1928 von GRIFFITH beobachtet.[15] Als Transduktion wird bezeichnet, wenn

Bakteriophagen wirtseigenes genetisches Material von einem Bakterium in das nächste

transferieren.[16] Die häufigste Art der Übertragung von Genen, die Konjugation, wurde wie

die Transduktion von LEDERBERG und TATUM 1946[17] entdeckt. Bei der Konjugation wird

durch Zellkontakt ein Plasmid von einer Donor- in eine Empfängerzelle übertragen. Somit

spielt vor allem die Konjugation eine wichtige Rolle bei der Verbreitung von Resistenzen.

Bei der bakteriellen Konjugation sind zwei Multiproteinkomplexe beteiligt. Zum einen das

Relaxosom, das für die Prozessierung und Replikation der Plasmid-DNA verantwortlich ist,

und zum anderen das type IV secretion system (T4SS), das für den Transport der Gene in

die Empfängerzelle sorgt. Diese beiden Proteinkomplexe werden durch ein Kupplungsprotein

(T4CP) verbunden.[18,19] Ein Schlüsselenzym des Relaxosoms ist die Relaxase. Relaxasen

wurden erstmalig in Plasmid-Relaxationskomplexen entdeckt.[20] Relaxasen sind DNA-

Strangtransferasen, die DNA strang- und sequenzspezifisch schneiden können. Zudem

wirken sie bei der bakteriellen Konjugation als Pilotprotein, wobei sie als DNA-Protein-

Komplex in die Empfängerzelle übertragen werden.[18]

Der allgemeine Mechanismus der bakteriellen Konjugation ist in Abb. 3 dargestellt. Zunächst

binden verschiedene Proteine, unter anderem die Relaxase, an den origin of transfer (oriT)

des Plasmids und bilden somit das Relaxosom (1). Anschließend spaltet die Relaxase eine

Phosphordiesterbindung an einer spezifischen Stelle des oriT, die nic genannt wird, und

bleibt kovalent an das 5’-Ende des T-Strangs (transferred strand) gebunden (2). Durch das

Kupplungsprotein (T4CP) wird der entstandene DNA-Protein-Komplex in unmittelbare

Umgebung des T4SS gebracht (3). Nun wird der DNA-Protein-Komplex über das T4SS in die

Empfängerzelle transportiert (4). Abschließend findet in beiden Zellen die Replikation des

komplementären Stranges statt (5a,b) und die Relaxase überträgt das 5’-Ende des T-

Strangs auf das freie 3’-Ende, sodass wieder ein zirkularisierter Strang entsteht (5b).[21]


4

Abb. 3: Allgemeiner Mechanismus der bakteriellen Konjugation (bearbeitet nach [21]).

Aufgrund ihrer Übertragungseigenschaften können Plasmide in drei Kategorien unterteilt

werden (Abb. 4). Ein konjugatives Plasmid codiert alle Enzyme, die für die Konjugation

notwendig sind. Diese Bereiche sind zum einen die mob-Region, in der die Relaxase und

das T4CP codiert sind und sich der oriT befindet, und zum anderen die tra-Region, in der die

Enzyme des T4SS codiert sind. Mobilisierbare Plasmide haben nur eine mob-Region, in der

unter Umständen auch kein T4CP codiert ist. Diese Plasmide benötigen zum Transfer ein

konjugatives Plasmid der Donorzelle. Nichtmobilisierbare Plasmide tragen keines der drei für

die Konjugation wichtigen Bereiche und können nur durch Transformation oder Transduktion

übertragen werden.[22]

Abb. 4: Einteilung von Plasmiden in konjugative und mobilisierbare Plasmide aufgrund ihrer

Übertragungseigenschaften (bearbeitet nach [22]).


5

Eine differenziertere Klassifizierung von durch Konjugation übertragbaren Plasmiden wurde

auf der Grundlage von Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz der Relaxasen der

Plasmide vorgenommen.[23,24] Die Relaxase nimmt eine Schlüsselrolle bei der Konjugation

ein. Es ist das einzige Protein, das in allen übertragbaren Plasmiden, ob konjugativ oder

mobilisierbar, codiert ist. Dieses Enzym bildet somit eine ideale Basis für eine

Klassifizierung. Da Relaxasen oft große Multidomän-Proteine sind, wurden nur die 300

Aminosäuren des N-Terminus der Relaxasen zur Analyse berücksichtigt. Dieser Bereich

beinhaltet die für die Klassifizierung wichtige Relaxase-Domäne. Aufgrund von

übereinstimmenden Aminosäuresequenzen wurden die durch Konjugation übertragbaren

Plasmide in sechs MOB-Familien eingeteilt: MOBF, MOBH, MOBQ, MOBC, MOBP und

MOBV.[24]

Diese Klassifizierung und Einteilung der bekannten Plasmide aufgrund ihrer

Übertragungseigenschaften und ihrer Relaxasen hat zu einem besseren Verständnis dieser

Eigenschaften beigetragen. Ein Anteil von 39% der prokaryotischen Plasmide können durch

Konjugation übertragen werden, wovon 62% mobilisierbare Plasmide sind. Die MOB-

Familien sind unterschiedlich stark in den verschiedenen Bakterienklassen vertreten.

Mobilisierbare Plasmide sind meist mit um die 5 kb relativ klein. Diese haben eine hohe

Vervielfältigungsrate und verbreiten sich dadurch schneller als konjugative Plasmide. Die

meisten mobilisierbaren Plasmide gehören der MOBV-Familie an, gefolgt von MOBC, MOBP

und MOBQ.[25]

2.2 Plasmid pMV158

Das Plasmid pMV158 ist ein Tetracyclin-resistentes, 5.54 kb-großes Streptokokkenplasmid

und wurde erstmals 1980 von BURDETT beschrieben.[26] Dieses mobilisierbare Plasmid ist

eines der einfachsten Systeme für einen effizienten DNA-Transfer zwischen Prokaryoten und

der Prototyp der MOBV-Familie.[24,27] In der mob-Region des pMV158 ist nur ein Protein, die

Relaxase MobM, codiert. Zudem ist dort der oriT lokalisiert.[28] Somit wird zum Transport des

T-Strangs in die Empfängerzelle ein Übertragungskomplex eines konjugativen Plasmids in

der Donorzelle benötigt. Als Helferplasmid des pMV158 können unterschiedliche konjugative

Plasmide fungieren, wie das Plasmid pIP501[29] des Gram-positiven Bakteriums

Streptococcus agalactiae, pAMβ1[30] und RP4[31]. pMV158 kann zwischen Gram-positiven

aber auch zwischen Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien übertragen werden.[30,31]

In Abb. 5 ist die Genkarte des pMV158 dargestellt. Das Plasmid besitzt vier Protein-

codierende Bereiche, mobM, copG, repB und tetL. Hierbei ist die Richtung der Transkription

bei allen gleich, was die Pfeile verdeutlichen. Die Proteine der Gene copG und repB sind bei

der Plasmid-DNA-Replikation beteiligt. Das tetL-Gen ist verantwortlich für die Tetracyclin-

Resistenz des Bakteriums. mobM codiert die bei der Konjugation entscheidende Relaxase


6

MobM. Zudem sind der origin of transfer, oriT, der Replikationsursprung des Leitstranges,

dso, und die des Folgestranges, ssoU und ssoA, ausgewiesen.[32,33]

Abb. 5: Genkarte des Plasmids pMV158.[32]

Die oriT-Sequenz des Plasmids pMV158 liegt zwischen den Einheiten 3564 und 2605

(Abb. 6).[32] Die minimale Sequenz für eine effiziente MobM-Bindung umfasst 26 Nucleotide

und ist in Abb. 6 grau hinterlegt. Diese Sequenz liegt vor der Spaltungsstelle nic, welche sich

zwischen Guanin 3595 und Thymin 3596 befindet.[25]

Abb. 6: oriT des pMV158 mit inverted repeats (IR) und Spaltungsstelle (nic) (bearbeitet nach [25]).

Innerhalb des oriT gibt es drei teilweise überlappende inverse Wiederholungen, IR1, IR2 und

IR3 (Abb. 6). Diese inversen Wiederholungen können Haarnadelschleifen ausbilden, wie in

Abb. 7 dargestellt ist.

Abb. 7: Mögliche Haarnadelschleifen der inversen Wiederholungen (IR) innerhalb des oriT, wobei nic

mit einem Pfeil und die minimale Sequenz für eine effektive Bindung von MobM schwarz

gekennzeichnet sind.[33]


7

IR1 und IR3 sind Erkennungsmerkmale für die Relaxase MobM bei ssDNA-Substraten. IR2

ist an der Autoregulation des mobM-Gens beteiligt. Es wird angenommen, dass MobM auf

zwei verschiedene Weisen an oriT binden kann. Wenn IR1 oder IR3 an der Bindung beteiligt

sind, wird das Relaxosom gebildet. Wenn IR2 an der Bindung beteiligt ist, wird die

Expression des mobM-Gens gesteuert. Somit kann die Bindung von MobM an oriT nicht nur

den Plasmidtransfer initiieren, sondern auch zu einer Regulation des mobM-Gens

führen.[24,27,33]

2.3 Relaxase MobM

Die Relaxase MobM besteht aus 494 Aminosäureeinheiten (57874 Da), liegt als Dimer mit

zwei identischen Untereinheiten vor und nimmt eine zentrale Rolle bei der Konjugation des

Plasmids pMV158 ein. Hierbei bindet sie an den oriT des Plasmids pMV158, spaltet die

Phosphordiesterbindung am nic und bildet einen DNA-Protein-Komplex. Am 3’-Ende des

gespaltenen Plasmids entsteht dabei eine freie Hydroxylgruppe. Der DNA-Protein-Komplex

wird in die Rezipientenzelle transferiert. Dort wird der DNA-Strang wieder rezirkularisiert und

die Relaxase freigesetzt.[24,34]

MobM verfügt über drei wichtige Domänen. Die Erste befindet sich am N-Terminus. Sie ist

bei der DNA-Erkennung und Bindungsspaltung am oriT beteiligt. Die zweite Domäne ist eine

leucinreiche Region, die möglicherweise bei der Dimerisierung und Autoregulation des

mobM-Gens eine wichtige Rolle spielt. Die Dritte ist eine coiled coil Region am C-Terminus,

die wahrscheinlich an der Bindung der Relaxase an die Zellmembran beteiligt ist.[34]

Im aktiven Zentrum der Relaxase koordinieren drei Histidinreste (3H-Motiv) zweiwertige

Metallionen, wie Mn2+- oder Mg2+-Ionen. Diese Metallionen polarisieren die Phosphordiester-

Gruppe und begünstigen damit einen nucleophilen Angriff.[27] Bei den meisten bis heute

untersuchten Relaxasen erfolgt der nucleophile Angriff, der zur Bindungsspaltung führt,

durch einen Tyrosinrest. Es wird angenommen, dass bei der Relaxase MobM diese Rolle

das Tyr44 einnimmt.[24,34] Im Fall der Relaxase des Plasmids pBBR1, welches ebenfalls zur

MOBV-Familie gehört, wurde jedoch gezeigt, dass kein Tyrosinrest der Relaxase am Transfer

beteiligt ist.[35] Somit ist es auch möglich, dass die MOBV-Relaxasen einem anderen

Katalysemechanismus folgen.

Zur Aufklärung des Mechanismus wäre eine Kristallstruktur des DNA-Protein-Adduktes

hilfreich. Dies ist jedoch schwierig zu realisieren, da die Bindungsspaltung des

Phosphordiesters eine Gleichgewichtsreaktion ist. Die bei der Spaltung entstehende

Hydroxylgruppe des 3’-Endes kann erneut nucleophil am Phosphoratom angreifen. Dieses

Problem wurde von GONZALEZ-PEREZ, durch die Verwendung von

3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotiden bei der Untersuchung der Relaxase TrwC

des Plasmids R388 aus dem Gram-negativen Bakterium Escherichia Coli, gelöst.[36]


8

Phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide verhindern die Rückreaktion der

Bindungsspaltung (Abb. 8) und ermöglichen dadurch eine Analyse des stabilen DNA-Protein-

Komplexes.

Abb. 8: Schematische Darstellung der Phosphordiesterspaltung am nic des Plasmids R388 durch die

Relaxase TrwC.[36]

Die Spaltung des DNA-Strangs läuft analog zu der Reaktion mit einem natürlichen Substrat

ab. Durch einen nucleophilen Angriff eines Tyrosinrestes der Relaxase wird das 5’-Ende

kovalent an das Protein gebunden. Zudem entsteht am 3’-Ende eine freie Thiolgruppe. Die

Rückreaktion findet dagegen nicht statt. Die Thiolgruppe ist ein weiches Nucleophil und kann

somit keine Umesterung am Phosphatzentrum als hartes Elektrophil einleiten.[36]

Zur Aufklärung des Mechanismus der Bindungsspaltung katalysiert durch die Relaxase

MobM wäre es auch hier vielversprechend, phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide zur

Untersuchung des DNA-Protein-Komplexes zu verwenden. Für diese Untersuchung wird ein

Oligonucleotid benötigt, bei dem eine 2‘-Desoxyguanosineinheit 3‘-S-phosphorthiolat-

verbrückt zu einer Thymidineinheit vorliegt, da die zu spaltende Bindung zwischen einer

Guanosin- und einer Thymidineinheit liegt.

2.4 3‘-S-Phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide

Phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide wurden schon mehrfach bei strukturellen und

mechanistischen Untersuchungen von DNA-prozessierenden Enzymen eingesetzt, da sie

isoelektronisch zu den natürlichen Strukturen sind und dadurch in vielen Fällen ebenfalls

Substrate dieser Enzyme sind. Beispiele hierfür sind Studien der Restriktionsendonuclease

EcoRV[37], des Ribozyms Tetrahymena[38] und der Exonucleasedomäne der DNA

Polymerase I aus E. coli[39]. Zudem wurden schon, wie in Abschnitt 2.3 beschrieben,

phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide bei der Untersuchung der Relaxase TrwC

eingesetzt.[36]

Bei 3‘-S-Phosphorthiolaten ist das 3‘-Sauerstoffatom der Phosphatgruppe gegen ein

Schwefelatom ausgetauscht, was in Abb. 9 dargestellt ist. Phosphorthiolate können auch als

RNA vorliegen, es soll im Folgenden jedoch nur auf DNA eingegangen werden. Zum

Vergleich sind auch die Strukturen von DNA und Phosphorthioaten, bei denen ein nicht-


9

verbrückendes Sauerstoffatom der Phosphatgruppe gegen ein Schwefelatom ausgetauscht

ist, abgebildet (Abb. 9).

Abb. 9: Allgemeine Strukturen von 3‘-S-Phosphorthiolaten, DNA und Phosphorthioaten.

Phosphorthioate sind leicht zugänglich, wie z. B. durch Einführung des Schwefels bei der

Oxidation des Phosphits durch S8 in 2,6-Lutidin oder in einem Gemisch aus CS2 und

Pyridin.[40] 3‘-S-Phosphorthiolate dagegen sind deutlich aufwendiger zu synthetisieren. Die

erste Darstellung von 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotiden wurde von COSSTICK

und VYLE 1989 veröffentlicht.[41,42] In den letzten zwei Jahrzehnten wurde fast ausschließlich

mit Pyrimidin-Nucleotiden mit 3‘-SP-Verbrückung gearbeitet, da diese im Vergleich zu Purin-

Nucleotiden leichter zu synthetisieren sind und erst 2013 von der Gruppe um COSSTICK die

erste chemische Syntheseroute von 2‘-Desoxyguanosin-3‘-S-phosphorthiolaten veröffentlicht

wurde.[1]

Für die Synthese von Oligonucleotiden hat sich die automatisierte Festphasensynthese mit

Phosphoramiditen als Monomerbausteine bewährt.[43] Diese Methode wurde auch bei der

Synthese der phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotide mit Phosphorthioamiditen als

Monomerbausteine (Abb. 10) eingesetzt.[1,41,44]

Abb. 10: Monomerbausteine der chemischen DNA-Synthese nach der Phosphoramiditmethode.

Im Gegensatz zu der Biosynthese von Nucleinsäuren erfolgt die chemische Synthese

aufgrund der höheren Reaktivität der 5’-Hydroxylgruppe in 3’→5’-Richtung. Somit befindet

sich die Phosphoramiditgruppe an der 3‘-Hydroxylgruppe des Monomerbausteins. Alle


10

weiteren nicht an der Kupplung beteiligten funktionellen Gruppen werden, um

Nebenreaktionen zu minimieren, mit geeigneten Schutzgruppen versehen.

Als Schutzgruppen der Phosphatgruppe und der exozyklischen Aminofunktionen werden

basenlabile Schutzgruppen verwendet. Als Phosphatschutzgruppe wird eine

2-Cyanoethylgruppe verwendet. Zudem hat sich für die Phosphoramiditgruppe ein

Diisopropylaminrest bewährt, da damit eine gute Zugänglichkeit und Lagerfähigkeit erreicht

wird.[45,46] Als Schutzgruppen für die exocyclischen Aminofunktionen von Guanin, Adenin und

Cytosin haben sich Acylgruppen durchgesetzt.[47] Die am häufigsten verwendeten

Schutzgruppen sind die Isobutyrylgruppe bei Guanin, die Benzoylgruppe bei Adenin und die

Acetylgruppe bei Cytosin. Bei Thymin ist keine Schutzgruppe notwendig.

Auch die Spaltung des Oligonucleotids von der Festphase erfolgt im basischen Milieu. Das

Startmonomer der DNA-Synthese ist über die 3’-Hydroxylgruppe meist über einen

Succinyllinker und einen langkettigen Alkylamidspacer an controlled pore glas (CPG) als

Festphase gebunden. Als feste Phase wird alternativ auch das Divinylbenzol-quervernetzte

Polystyrol verwendet.[46]

Die Abspaltung der Schutzgruppe der 5‘-Hydroxylgruppe darf die anderen Schutzgruppen

nicht beeinflussen, so dass hier eine orthogonale Schutzgruppenstrategie verwendet werden

muss. Hierbei hat sich die Verwendung der säurelabilen 4,4‘-Dimethoxytritylgruppe (DMTr)

bewährt. Diese Schutzgruppe hat zudem den positiven Nebeneffekt, dass bei der Abspaltung

ein Tritylkation freisetzt wird, welches ausgezeichnet spektroskopisch detektiert werden kann

und sich damit die Kupplungsrate abschätzen lässt.

Der Synthesezyklus von Oligonucleotiden durch automatisierte Festphasensynthese mittels

Phosphoramiditmethode ist in Abb. 11 dargestellt.

Im ersten Schritt erfolgt die saure Abspaltung der DMTr-Gruppe. Anschließend wird das

Nucleosidphosphoramidit mit einem Aktivator hinzugegeben, was zur Kettenverlängerung

führt. Dann erfolgt die Oxidation des Phosphits zum Phosphat. Die nicht umgesetzten 5’-

Hydroxylgruppen werden, um Fehlsequenzen zu vermeiden, verestert (Capping). Dieser

Zyklus wird so oft durchlaufen, bis die gewünschte Oligonucleotidsequenz erreicht ist.

Abschließend erfolgen die Spaltung des Oligonucleotids von der festen Phase und die

Abspaltung der Schutzgruppen.


11

Abb. 11: Synthesezyklus der automatisierten Festphasensynthese von Oligonucleotiden.

Bei der Detritylierung wird Trichloressigsäure (TCA) oder die mildere Dichloressigsäure

(DCA) verwendet. Als Aktivator im zweiten Schritt fungiert 4,5-Dicyanoimidazol (DCI),

5-Ethylthio-1H-tetrazol (ETT) oder 5-Benzylthio-1H-tetrazol (BTT), wobei von DCI zu BTT

immer kürzere Kupplungszeiten erreicht werden können.[48-50] Um das Phosphit zum

Phosphat zu oxidieren, hat sich ein Gemisch aus Iod, Wasser und Pyridin in Tetrahydrofuran

bewährt. Beim Capping wird N-Methylimidazol mit Säureanhydriden wie Essigsäureanhydrid

eingesetzt. Die basische Spaltung von der Festphase und die Abspaltung der Schutzgruppen

erfolgt mit einer konzentrierten Ammoniaklösung. Um den Prozess zu beschleunigen, kann

40% Methylamin zugesetzt werden.

Bei Phosphorthioamiditen muss ein leicht verändertes Syntheseprotokoll im Vergleich zu den

standardmäßig eingesetzten 3’-O-Phosphoramiditen eingesetzt werden, da sich die

Eigenschaften des Amidits durch den Austausch des Sauerstoffatoms mit dem

Schwefelatom ändern. Zum einen wird die Elektronendichte am Stickstoff herabgesetzt,

wodurch das Stickstoffatom weniger basisch wird. Zudem wird die partielle positive Ladung

am Phosphoratom in der N-protonierten Form kleiner und die P-N-Bindung kürzer. Somit

wird das S-Phosphoramidit im Vergleich zum O-Phosphoramidit durch den Aktivator

langsamer protoniert und in der N-protonierten Form ist ein nucleophiler Angriff des

deprotonierten Aktivators bzw. der 5‘-OH-Gruppe eines zweiten Nucleosidbausteins auf das

Phosphoratom weniger begünstigt.[51,52] Die entscheidenden Modifizierungen des


12

Syntheseprotokolls sind eine längere Kupplungszeit, die Verwendung von saureren

Aktivatoren, wie ETT oder BTT, eine höhere Konzentration der Phosphorthioamidite und eine

niedrigere Iodkonzentration beim Oxidationsschritt.[44]

2.5 Synthese der Phosphorthioamidite

Für den Einbau von Phosphorthiolaten in Oligonucleotide ist die Synthese der

entsprechenden 2‘-Desoxynucleosid-3‘-phosphorthioamidite notwendig. Eine effiziente

Syntheseroute der Pyrimidinnucleoside wurde von der Gruppe um COSSTICK[44,53] publiziert

und ist in Abb. 12 dargestellt. Hierbei wurde die 2-Carbonylgruppe der Nucleobase (5)

ausgenutzt und über eine intramolekulare Mitsunobu-Reaktion die Anhydroverbindung 6

erhalten. Der entstandene Ring wurde anschließend über eine SN2-Reaktion mit

Natriumthiobenzoat zur Verbindung 7 geöffnet. Durch diese beiden Schlüsselschritte wurde

die Einführung des Schwefels an der 3‘-Position unter zweifacher Inversion und somit

Retention der Konfiguration realisiert. Dann wurde unter basischen Bedingungen die

Benzoylgruppe abgespalten und das erhaltene Thiol 8 zum Synthesebaustein für die

Oligonucleotidsynthese, dem Phosphorthioamidit 9, umgesetzt.[44,53]

Abb. 12: Synthese der Pyrimidin-Bausteine.[44]

Diese elegante Route für Pyrimidine unter Ausnutzung der 2-Carbonylgruppe lässt sich

jedoch nicht so leicht auf Purine übertragen, da sie keine Carbonylgruppe in geeigneter

Position tragen. Bei den Purinen erfolgt die Verbrückung über das N3-Atom des Purins. Der

Ring lässt sich allerdings nicht selektiv auf gewünschte Weise durch ein Nucleophil öffnen.

Stattdessen erfolgt ein nucleophiler Angriff auf das C-2-Atom (10) und die Öffnung des

Pyrimidinrings des Purins (11), was in Abb. 13 am Beispiel von Guanosin dargestellt ist.[54,55]

5a: T

5b: CBz

6a: X= O; R= CH3

6b: X= NBz; R= H

7a: T

7b: CBz

8a: T

8b: CBz

9a: T

9b: CBz


13

Abb. 13: Nucleophile Öffnung des Purins der cyclischen Anhydroverbindung 10 zum

Anhydronucleosid 11.[54,55]

Die Gruppe um COSSTICK hat zwei Wege zur Darstellung des 2‘-Desoxy-3‘-thioadenosin-

Bausteins 12 publiziert.[56-58] Bei der 1992 von LI et al.[56] veröffentlichten Syntheseroute

(Abb. 14) erfolgt der Schlüsselschritt, die Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe, mittels reduktiver

[1,2]-Hydridumlagerung, welche ursprünglich von HANSSKE und ROBINS entwickelt wurde.[59]

Die stereospezifische Einführung des Schwefels erfolgte analog zur Pyrimidinroute durch

eine SN2-Reaktion mit Natriumthiobenzoat als Schwefelnucleophil.

Zunächst erfolgte eine regioselektive Tosylierung der 2‘-Hydroxylgruppe von Adenosin 13.

Das tosylierte Nucleosid 14 wurde durch reduktive [1,2]-Hydridumlagerung zum Desoxy-xylo-

Nucleosid 15 umgesetzt.[54] Durch Tritylierung der 5’-Hydroxylgruppe, Mesylierung der 3’-

Hydroxylgruppe und Schützung der exocyclischen Aminogruppe mit Benzoylchlorid wurden

zum einen die für die Oligonucleotidsynthese geeigneten Schutzgruppen eingeführt und zum

anderen die 3‘-Hydroxylgruppe in eine gute Abgangsgruppe überführt. Hierdurch konnte im

nächsten Schritt das Nucleosid 16 mit Natriumthiobenzoat in einer SN2-Reaktion zum

Thioester 17 umgesetzt werden, womit das Schwefelatom mit der richtigen Konfiguration

eingeführt wurde. Durch Hydrolyse des Thiobenzoats zu dem Thiol 18 und Umsetzung zum

Phosphorthioamidit 12 wurde der 2’-Desoxy-3‘-thioadenosin-Synthesebaustein für die

Oligonucleotidsynthese erhalten.[56]

Abb. 14: Synthese des 2‘-Desoxy-3‘-thioadonosin-Bausteins 12.[56]

10 11

13

14 16

12 18 17

15


14

Auch bei 2‘-Desoxyguanosin 19 lässt sich der Schwefel, wie in Abb. 13 dargestellt, nicht über

eine cyclische Anhydrozwischenstufe einführen. Eine Syntheseroute zum 2’-Desoxy-3‘-

thioguanosin-Synthesebaustein 20 wurde 2013 von PIPERAKIS veröffentlicht (Abb. 15).[1] Die

Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe erfolgte hier nach dem von EISENHUTH und RICHERT

entwickelten one-pot 3’-OH-Oxidations-Reduktions-Protokoll.[60] Das Einbringen des

Schwefels unter erneuter Inversion der Konfiguration wurde durch Umsetzung mit

Thiobenzoesäure unter Mitsunobu-Bedingungen erreicht.

Als Ausgangsverbindung wurde 2‘-Desoxyguanosin 19 verwendet. Die exocyclische

Aminogruppe wurde mit der Isobutyrylgruppe (iBu) geschützt. Für die 5‘-Hydroxylgruppe

wurde die tert-Butyldimethylsilyl-Schutzgruppe (TBDMS) verwendet, da damit eine Ausbeute

von 79% bei der anschließenden Oxidations-Reduktions-Abfolge erreicht wurde, im

Gegensatz zu einer Ausbeute von 20% mit der für die Oligonucleotidsynthese notwendigen

Tritylschutzgruppe. Somit wurden dafür die zwei zusätzlichen Schritte in Kauf genommen.

Die Oxidation der 3‘-Hydroxylgruppe des geschützten Nucleosids 21 erfolgte mit Dess-

Martin-Periodinan. Bei der anschließenden Reduktion des entstandenen Ketons mit

Natriumborhydrid wurde eine hohe Stereoselektivität zum xylo-Produkt 22 durch

Durchführung der Reaktion bei -60 °C erreicht.[1]

Abb. 15: Synthese des 2‘-Desoxy-3‘-thioguanosin-Bausteins 20.[1]

19 21

23

26

20

24

22

25


15

Der zweite Schlüsselschritt, die Einführung des Schwefels am C-3‘ unter Inversion der

Konfiguration zu dem Thioester 23, erfolgte mittels Mitsunobu-Reaktion. Als schwefelhaltiges

Nucleophil wurde Thiobenzoesäure verwendet. Auch bei diesem Schritt konnten mit dem

TBDMS-geschützten Nucleosid deutlich höhere Ausbeuten erzielt werden (65%) als mit dem

4,4‘-Dimethoxytrityl-geschützten Nucleosid (5%). Hierbei wurden eine teilweise Detritylierung

und kein vollständiger Umsatz des Eduktes beobachtet. Als Alternative wurde ebenfalls die

bei der Synthese des analogen 2‘-Desoxyadenosins verwendeten Strategie der Mesylierung

der 3‘-xylo-OH-Gruppe und anschließender SN2-Reaktion mit Natriumthiobenzoat getestet.

Jedoch konnten hierbei vor allem durch die Mesylierung nicht so gute Ausbeuten erreicht

werden, wie bei der Mitsunobu-Reaktion.[55] Die Umschützung der 5‘-Hydroxylgruppe erfolgte

zunächst durch die Abspaltung der TBDMS-Gruppe durch Tetrabutylammoniumfluorid

(TBAF) mit Zusatz von Essigsäure, da ansonsten auch die Benzoylgruppe abgespalten wird,

zur 5‘-OH-freien Verbindung 24. Die Tritylierung erfolge anschließend mit 4,4‘-

Dimethoxytritylchlorid (DMTrCl) zum Nucleosid 25. Analog zur dA-Route wurde nun zum

Thiol 26 hydrolysiert und dieses zum Phosphorthioamidit 20 umgesetzt, welches den

benötigten Baustein für die Synthese von 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotiden

darstellt.[1,55]

Aufgabenstellung Teil I

16

3 Aufgabenstellung

Die Konjugation von Plasmiden spielt eine entscheidende Rolle bei der Übertragung von

Resistenzgenen und damit bei der Zunahme multiresistenter Bakterien. Das Schlüsselenzym

bei diesem Prozess ist die Relaxase. Relaxasen katalysieren die Spaltung von Plasmid-

DNA. Zur Aufklärung des Mechanismus haben sich 3‘-S-phosphorthiolatverbrückte

Oligonucleotide bewährt. Zur Untersuchung des Spaltungsmechanismus der Relaxase

MobM des mobilisierbaren Streptokokkenplasmids pMV138 sollte das, in Abb. 16

dargestellte, Oligonucleotid 27 synthetisiert werden, welches an der Spaltungsstelle nic eine

Schwefelverbrückung aufweist.

Abb. 16: 3‘-S-phosphorthiolatverbrücktes Oligonucleotid 27 (die Modifikation ist mit „*“

gekennzeichnet).

Für die Synthese von Oligonucleotiden hat sich die automatisierte Festphasensynthese mit

Phosphoramiditen als Monomerbausteine bewährt. Diese Methode sollte auch bei der

Synthese des phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotids 27 eingesetzt werden. Dafür sollte

das in Abb. 17 dargestellte 2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidit 28 synthetisiert

werden. Um möglicherweise höhere Ausbeuten bei der automatisierten Oligonucleotid-

synthese zu erreichen, sollte zudem ein phosphorthiolatverbrücktes Dimer 29 eingesetzt

werden (Abb. 17).

Abb. 17: Monomerbausteine für die Synthese des phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotids 27.

28 29

Resultate und Diskussion Teil I

17

4 Resultate und Diskussion

Die Synthesestrategie zur Darstellung des gewünschten 2‘-Desoxyguanosin-3‘-

phosphorthioamidits, unter Nutzung des chiral pool, ist in Abb. 18 dargestellt. Ausgehend

von Guanosin oder 2‘-Desoxyguanosin bestand diese aus drei wesentlichen Schritten, die

Umsetzung zum Phosphoramidit, das Einbringen des Schwefels an der 3‘-Position in der

entsprechenden Konfiguration und die Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe. Die Realisierung

dieser drei Schritte soll in den nächsten drei Kapiteln vorgestellt werden. Die Schutzgruppen

(SG) in Abb. 18 sind als Platzhalter anzusehen. Auf die jeweilige Schutzgruppenstrategie

wird bei der Beschreibung der unterschiedlichen Wege eingegangen.

Abb. 18: Retrosyntheseschema des 2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidits.

4.1 Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe des Guanosins 30 bzw. 2‘-Desoxyguanosins

19

Die erste Syntheseroute zur Inversion der Konfiguration der 3‘-Hydroxylgruppe sollte über

die, bereits in Abschnitt 2.5 vorgestellte, regioselektive Tosylierung mit anschließender [1,2]-

Hydridumlagerung erfolgen.[56,59] Des Weiteren sollten zum einen die für die

Oligonucleotidsynthese geeigneten Schutzgruppen eingeführt und zum anderen die 3‘-

Hydroxylgruppe, zum Einbringen des Schwefels, in eine gute Abgangsgruppe überführt

werden.

Mit der von SHANG[61] publizierten Synthese von 2‘-O-Tosylguanosin 31 konnte gegenüber

anderen Protokollen[54,62] in eigenen Vorarbeiten der beste Umsatz erzielt werden.[63] Es

wurde Guanosin in Acetonitril suspendiert und mit n-Dibutylzinnoxid als Katalysator und p-

Toluolsulfonsäurechlorid umgesetzt (Abb. 19). Der gebildete Chlorwasserstoff wurde als


18

Triethylammoniumchlorid abgefangen. Nach einer Reaktionszeit von 28 Stunden wurde das

Reaktionsgemisch filtriert und 2‘-O-Tosylguanosin 31 mit Salzverunreinigungen erhalten.

Aufgrund der schlechten Löslichkeit des 2‘-O-Tosylguanosins 31 wurde auf eine

chromatographische Reinigung verzichtet und das Rohprodukt im nächsten Schritt

eingesetzt. Die [1,2]-Hydridumlagerung erfolgte durch Umsetzung des 2‘-O-Tosylguanosins

31 in Dimethylsulfoxid mit Lithiumtriethylborhydrid (1 M in THF). Nach Umkristallisation aus

Methanol wurde 2‘-Desoxy-xylo-guanosin 32 in einer Ausbeute von 60% über zwei Stufen

erhalten.[63] Aufgrund der geringen Löslichkeit des 2‘-O-Tosylguanosins 31 musste allerdings

ein großes Volumen an Dimethylsulfoxid als Lösungsmittel eingesetzt werden. Die

Aufarbeitung bzw. Entfernung des Lösungsmittels war damit sehr zeitintensiv.

Abb. 19: Synthese des 2‘-Desoxy-xylo-guanosins 32.[63]

Die Schutzgruppenstrategie bei der Oligonucleotidsynthese wurde bereits in Abschnitt 2.4

ausführlich dargestellt. Als Schutzgruppe für die exocyclische Aminofunktion der Nucleobase

wurde an dieser Stelle anstatt der für Guanin am häufigsten verwendeten Isobutyrylgruppe

die Formamidingruppe eingesetzt. Zum einen sind die Abspaltungszeiten der

Formamidingruppe mit Ammoniak bei Raumtemperatur mit 16 Stunden deutlich kürzer als

die der Isobutyrylgruppe (36 Stunden).[64] Zum anderen bietet sie bei der Schützung der

Nucleobase den synthetischen Vorteil, dass N,N-Dimethylformamiddiethylacetal (DMF-DEA)

selektiv mit der Aminogruppe reagiert und somit die Hydroxylgruppen nicht, wie bei der

Reaktion mit Isobuttersäureanhydrid, zuvor blockiert werden müssen. Als Schutzgruppe für

die 5‘-Hydroxylgruppe wurde zunächst die stabilere Monomethoxytritylgruppe, analog zu der

in Abschnitt 2.5 beschriebenen Syntheseroute des 2’-Desoxy-3‘-thioadenosin-Bausteins 12,

verwendet und die Reaktionsbedingungen anschließend auf die reaktivere Dimethoxytrityl-

gruppe übertragen. Damit der Schwefel in einer nucleophilen Substitutionsreaktion eingeführt

werden kann, wurde zudem die 3‘-Hydroxylgruppe durch Mesylierung in eine gute

Abgangsgruppe umgewandelt.

Die Reaktionsabfolge zur Darstellung des N2-Dimethylformamidin-3’-O-methansulfonyl-5’-O-

(4-methoxytrityl)-2'-desoxy-xylo-guanosins 33 ist in Abb. 20 dargestellt. Im ersten Schritt

erfolgte die Umsetzung von 2‘-Desoxy-xylo-guanosin 32 mit DMF-DEA. Nach

chromatographischer Reinigung wurde N2-Dimethylformamidin-2'-desoxy-xylo-guanosin 34 in

einer Ausbeute von 76% erhalten. Die für diese Reaktion vergleichsweise niedrige Ausbeute

30 31 32


19

ist auf die geringe Löslichkeit des Produkts zurückzuführen, was zu Verlusten bei der

Chromatographie führte. Anschließend wurde N2-Dimethylformamidin-2'-desoxy-xylo-

guanosin 34 durch Zugabe von 4-Methoxytritylchlorid zum MMTr-geschützten Nucleosid 35

umgesetzt. Nach säulenchromatographischer Reinigung, bei der sich ein geringer

Prozentsatz, trotz Zusatz von Triethylamin zum Laufmittel, aufgrund der Säurelabilität des

Produkts zersetzte, wurde N2-Dimethylformamidin-5’-O-(4-methoxytrityl)-2'-desoxy-xylo-

guanosin 35 in einer Ausbeute von 72% erhalten.

Abb. 20: Synthese des N2-Dimethylformamidin-3’-O-methansulfonyl-5’-O-(4-methoxytrityl)-2'-desoxy-

xylo-guanosins 33.

Die Mesylierung stellte den schwierigsten Schritt bei dieser Route dar. Zunächst wurde nach

der Zugabe von Methansulfonylchlorid bei 4 °C nur eine Zersetzung zu einer Vielzahl

undefinierbarer Produkte beobachtet. Durch eine Reduzierung der Temperatur bei der

Zugabe des Methansulfonylchlorids von 4 °C auf -20 °C konnte die Ausbeute auf 64%

gesteigert werden. Beim Upscalen des Reaktionsansatzes auf Grammmaßstab reduzierte

sich die Ausbeute etwas auf 50%. Die Probleme bei der Mesylierung des geschützten

2‘-Desoxy-xylo-guanosins wurden ebenfalls von PIPERAKIS beobachtet.[55] Die Gründe für die

unerwünschte Zersetzung des Edukts 35 unter den Reaktionsbedingungen sind nicht

bekannt.

Analog zu den beschriebenen Synthesen wurde N2-Dimethylformamidin-2'-desoxy-xylo-

guanosin 34 zum DMTr-geschützten Nucleosid 36 und anschließend mit

Methansulfonylchlorid zu N2-Dimethylformamidin-3’-O-methansulfonyl-5’-O-(4,4’-dimethoxy-

trityl)-2'-desoxy-xylo-guanosin 37 umgesetzt (Abb. 21). Die Ausbeuten von 65% und 55%

lagen im gleichen Bereich wie die Ausbeuten der entsprechenden MMTr-Synthesen.

32 34

33 35


20

Abb. 21: Synthese des N2-Dimethylformamidin-3’-O-methansulfonyl-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2'-

desoxy-xylo-guanosins 37.

Alle in dieser Arbeit synthetisierten 5‘-DMTr-geschützten Nucleoside wurden mittels

zirkulärer, präparativer Dünnschichtchromatographie am Chromatotron gereinigt. Mit der

üblichen Säulenchromatographie mit Kieselgel musste, um eine Abspaltung der DMTr-

Gruppe zu verhindern, Triethylamin zum Laufmittel zugesetzt werden (0.5% v/v). Im

anschließenden 1H-NMR-Spektrum der gereinigten Verbindung wurden jedoch immer

signifikante Mengen an Triethylammoniumsalz-Verunreinigungen beobachtet. Am

Chromatotron dagegen wurden die Platten mit einem Laufmittel mit 0.5% Triethylamin-

Zusatz äquilibriert. Dem Laufmittel zur Trennung des Substanzgemischs wurde kein

Triethylamin zugesetzt. Mit dieser Methode konnte eine Abspaltung der Tritylgruppe während

der Reinigung verhindert und eine Verunreinigung der Verbindung mit Triethylammonium-

salzen ausgeschlossen werden.

Über den Weg der [1,2]-Hydridumlagerung, der anschließenden Schützung der funktionellen

Gruppen und Mesylierung der 3‘-Hydroxylgruppe konnte der benötigte xylo-Baustein 37

erfolgreich dargestellt werden. Aufgrund der zeitintensiven Aufarbeitung der [1,2]-Hydrid-

umlagerung und der geringen Ausbeute bei der Mesylierung bestand allerdings der Bedarf

an Optimierung, weswegen weitere Alternativen untersucht wurden.

Während der Anfertigung dieser Arbeit veröffentlichte PIPERAKIS eine Syntheseroute zum

2’-Desoxy-3‘-thioguanosin-Synthesebaustein,[1] welche bereits in Abschnitt 2.5 vorgestellt

wurde. Hierbei wird zur Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe das Oxidations-Reduktions-Protokoll

von EISENHUTH und RICHERT verwendet.[60] Als Schutzgruppen werden die Isobutyrylgruppe

und, aufgrund der deutlich besseren Ausbeuten bei der Inversion, die tert-

Butyldimethylsilylgruppe verwendet (Abschnitt 2.5). Bei Verwendung von Tritylschutzgruppen

werden diese beim Oxidationsschritt teilweise abgespalten, was zur Reduzierung der

Ausbeute führt.[60] Um eine hohe Vergleichbarkeit der eigenen Ergebnisse mit den

Referenzsynthesen zu gewährleisten, wurden die gleichen Schutzgruppen verwendet.

Zusätzlich wurden die Reaktionen mit der in dieser Arbeit favorisierten Formamidin- anstatt

der Isobutyrylgruppe durchgeführt.

Die Darstellung des N2-Isobutyryl-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-desoxyguanosins 21 ist in

Abb. 22 dargestellt. Es wurde von 2‘-Desoxyguanosin 19 ausgegangen. Die freien

Hydroxylgruppen wurden zunächst mit Trimethylsilylchlorid silyliert, um Nebenreaktionen zu

34

36 37


21

minimieren. Anschließend wurde die exocyclische Aminofunktion mit Isobuttersäureanhydrid

umgesetzt. Nach Entschützung der Hydroxylgruppen, wässriger Aufarbeitung und

chromatographischer Reinigung wurde N2-Isobutyryl-2'-desoxyguanosin 38 in einer Ausbeute

von 59% erhalten. Die Umsetzung zum 5‘-TBDMS-geschützten Nucleosid 21 erfolgte in

Pyridin durch Zugabe von tert-Butyldimethylsilylchlorid (TBDMSCl). Nach

chromatographischer Reinigung wurde das gewünschte Produkt in einer Ausbeute von 56%

gewonnen. Als Nebenprodukt entstand das zusätzlich an der 3‘-Hydroxylgruppe TBDMS-

geschützte Nucleosid. Es wurde auf eine Isolierung verzichtet.

Abb. 22: Synthese des N2-Isobutyryl-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-desoxyguanosins 21.

Für die Darstellung des N2-Dimethylformamidin-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-desoxy-

guanosins 39 wurde ebenfalls von 2‘-Desoxyguanosin 19 ausgegangen (Abb. 23). Die

Reihenfolge der beiden Syntheseschritte ist nicht entscheidend. In dieser Arbeit wurde

zunächst das 5’O-tert-Butyldimethylsilyl-2'-desoxyguanosin 40 durch Zugabe von TBDMSCl

dargestellt. Es wurde in einer Ausbeute von 69% isoliert. Als Nebenprodukt wurde erneut

das zweifach TBDMS-geschützte 2‘-Desoxyguanosin identifiziert. Anschließend erfolgte die

Umsetzung mit N,N-Dimethylformamiddiethylacetal zum Formamidin-geschützten Nucleosid

39. Nach chromatographischer Reinigung wurde das Produkt in einer Ausbeute von 91%

erhalten.

Abb. 23: Synthese des N2-Dimethylformamidin-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-desoxyguanosins 39.

Die beiden unterschiedlich geschützten Nucleoside 21 und 39 standen nun zur Inversion der

3’-Hydroxylgruppe durch das Oxidations-Reduktions-Protokoll[60] zur Verfügung. Bei dieser

Methode wird die Hydroxylgruppe zunächst mit dem Dess-Martin-Reagenz zum Keton

reduziert. Das Keton ist aufgrund der hohen C-H-Acidität des H2-Protons anfällig für eine

1,2-Eliminierung unter Abspaltung der Nucleobase. Es wird darum nicht isoliert und in einer

one-pot Reaktion bei tiefen Temperaturen weiter umgesetzt. Nach dem Quenchen des

19 38 21

19

40 39


22

überschüssigen Oxidationsreagenzes mit Isopropanol erfolgt die Reduktion mit

Natriumborhydrid. Bei diesem Schritt sind tiefe Temperaturen notwendig, um eine

Abspaltung der Nucleobase zu verhindern und eine hohe Diastereoselektivität zum

gewünschten xylo-Produkt zu erreichen. Das überschüssige Natriumborhydrid wird

anschließend mit Aceton gequencht. Die Umsetzung der Isobutyryl- bzw. Formamidin-

geschützten Nucleoside 21 und 39 zu ihren xylo-Derivaten 22 und 41 ist in Abb. 24

dargestellt.

Abb. 24: Synthese der xylo-Nucleoside 22 und 41.

Das N2-Isobutyryl-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-desoxy-xylo-guanosin 22 wurde nach

wässriger Aufarbeitung und chromatographischer Reinigung in einer Ausbeute von 49%

erhalten. Damit konnte die Literaturausbeute von 79% bei einmaliger Durchführung nicht

reproduziert werden. Bei dem N2-Dimethylformamidin-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-desoxy-

xylo-guanosin 41 lag die Ausbeute mit 34% etwas darunter. Allerdings wurden weitere 13%

des xylo-Nucleosids, bei dem die Formamidingruppe abgespalten war, isoliert. Durch eine

erneute Schützung konnte die Ausbeute des Produkts 41 auf 45% gesteigert werden, was im

Bereich des Isobutyryl-geschützten Nucleosids 22 liegt.

Die Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe lässt sich deutlich an der chemischen Verschiebung und

dem charakteristischen Aufspaltungsmuster der 2‘-Protonen im 1H-NMR-Sprekrum

erkennen. Ein Ausschnitt der 1H-NMR-Spektren des N2-Isobutyryl-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-

2'-desoxyguanosins 21 und des xylo-Produkts 22 sind in Abb. 25 dargestellt.

iBu 21

dmf 39

iBu 22: 49%

dmf 41: 34% (45%)


23

Abb. 25: Ausschnitt der 1H-NMR-Spektren des N

2-Isobutyryl-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-

desoxyguanosins 21 (oben) und des xylo-Produkts 22 (unten) (in DMSO-d6).

Im Vergleich zu der eingangs beschriebenen Inversion über eine [1,2]-Hydridumlagerung

und anschließendem Einbringen der Schutzgruppen wurde mit der Oxidations-Reduktions-

Route keine Verbesserung erzielt. Die Gesamtausbeute des 3‘-OH-freien xylo-Nucleosids 36

ausgehend von Guanosin 30 über den Weg der [1,2]-Hydridumlagerung lag bei 30%. Im

gleichen Bereich befand sich mit 28% die Gesamtausbeute des xylo-Nucleosids 41

ausgehend von 2‘-Desoxyguanosin 19 über die Oxidations-Reduktions-Route. Auch der

Zeitaufwand konnte nicht verbessert werden, da zwar die Oxidations-Reduktions-Methode

etwas weniger Zeit in Anspruch nimmt, dafür allerdings die 5‘-Hydroxylgruppe noch

umgeschützt werden muss.

Der dritte verwendete Ansatz war die Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe über eine Mitsunobu-

Reaktion.[65-67] Die Mitsunobu-Reaktion ist eine stereospezifische, nucleophile Substitution

einer sekundären Hydroxylgruppe durch ein Nucleophil unter Inversion der Konfiguration,

vermittelt durch die Reaktion eines Dialkylazodicarboxylats mit einem Trialkyl- oder

Triarylphosphin (Abb. 26). Bei dem Prozess wird das Azodicarboxylat zu einem Hydrazin-

Derivat reduziert und das Phosphin zu Phosphinoxid oxidiert.[68]

H-iBu

H-2‘a

H-iBu

H-2‘a

H-2‘b

H-2‘b


24

Abb. 26: Mitsunobu-Reaktion.[68]

Das Phosphin reagiert mit dem Azodicarboxylat zu einem Betain-Intermediat, welches

aufgrund seiner Basizität ein Proton der korrespondierenden Säure des Nucleophils

(Pronucleophil) abstrahiert. Die zu invertierende Hydroxylgruppe greift nun nucleophil am

partiell positiv geladenen Phosphoratom an. Es wird ein Hydrazindicarboxylat-Derivat und

ein Oxaphosphonium-Salz gebildet. Im letzten Schritt erfolgt die SN2-Reaktion durch Angriff

des Nucleophils und Abspaltung des Phosphinoxids als gute Abgangsgruppe. Üblicherweise

werden als Mitsunobu-Reagenzien Diethylazodicarboxylat (DEAD) oder Diisopropyl-

azodicarboxylat (DIAD) und Triphenylphosphin verwendet. Es können etliche Verbindungen

als Nucleophil verwendet werden, sofern der pKa-Wert des Pronucleophils um 11 oder

kleiner ist. Der Grund dafür ist, dass das gebildete Betain-Intermediat einen pKa-Wert von

etwa 13 hat und in der Lage sein muss, das acide Proton des Pronucleophils zu

abstrahieren. Anderenfalls wird das Azodicarboxylat alkyliert.[68]

Zur Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe des geschützten 2‘-Desoxyguanosins schien die

Verwendung von Methansulfonsäure als Pronucleophil, die bereits erfolgreich in Mitsunobu-

Reaktionen eingesetzt werden konnte,[69] sinnvoll. Dadurch könnte die ineffiziente

Mesylierung der 3‘-Hydroxylgruppe umgangen werden.

Bei der, in Abschnitt 2.5 beschriebenen, Mitsunobu-Reaktion wurden Schwierigkeiten bei der

Verwendung einer DMTr-Schutzgruppe für die 5‘-Hydroxylgruppe beschrieben, was auf eine

Detritylierung unter den Reaktionsbedingungen zurückgeführt wurde.[1] Aus diesem Grund

sollte die Reaktion zunächst mit N2-Dimethylformamidin-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-

desoxyguanosin 39 durchgeführt werden.

Die Synthese des N2-Dimethylformamidin-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-3’-methansulfonyl-2'-

desoxy-xylo-guanosins 42, unter Mitsunobu-Bedingungen, ist in Abb. 27 dargestellt. Die

Bildung des Betain-Intermediats erfolgte durch Zugabe von Diisopropylazodicarboxylat zu

Triphenylphosphin. Anschließend wurden erst das Nucleosid 39 und dann die

Methansulfonsäure hinzugegeben. Ein vollständiger Umsatz des Eduktes wurde durch

Erhöhung der Temperatur auf 40 °C erreicht. Nach mehrfacher chromatographischer

Reinigung wurde N2-Dimethylformamidin-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-3’-methansulfonyl-2'-

desoxy-xylo-guanosin 42 in einer Ausbeute von 39% erhalten.


25

Abb. 27: Synthese des N2-Dimethylformamidin-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-3’-methansulfonyl-2'-


Nach diesem vielversprechenden Ergebnis sollte überprüft werden, ob nicht doch die DMTr-

Gruppe anstatt der TBDMS-Gruppe verwendet werden kann, um den zusätzlichen

Schutzgruppenwechsel zu vermeiden. Dafür wurde zunächst das N2-Dimethylformamidin-5’-

O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2'-desoxyguanosin 43 dargestellt. Ausgehend von 2‘-Desoxy-

guanosin 19 wurde mit N,N-Dimethylformamiddiethylacetal zum N2-Dimethylformamidin-2'-

desoxyguanosin 44 umgesetzt. Ohne chromatographische Reinigung erfolgte mit 4,4‘-

Dimethoxytritylchlorid die Reaktion zum gewünschten Produkt 43, welches in einer Ausbeute

von 69% über zwei Stufen gewonnen wurde (Abb. 28).

Abb. 28: Synthese des N2-Dimethylformamidin-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2'-desoxyguanosins 43.

Das DMTr-geschützte Nucleosid 43 wurde unter Mitsunobu-Bedingungen mit Methansulfon-

säure zu N2-Dimethylformamidin-3’-O-methansulfonyl-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2'-desoxy-

xylo-guanosin 37 umgesetzt (Abb. 29). Nach Optimierung der Reaktionsbedingungen, was

hauptsächlich die Reihenfolge der Zugabe der Methansulfonsäure und des Nucleosids

betraf, wurde eine Ausbeute von 57% erreicht. Es war entscheidend, zuerst die

Methansulfonsäure und erst danach das Nucleosid zuzugeben. Dies verhindert einen sauren

pH-Wert der Reaktionslösung, so dass die Abspaltung der DMTr-Gruppe unterbunden wird.

Abb. 29: Synthese des N2-Dimethylformamidin-3’-O-methansulfonyl-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2'-


42 39

44 19

43

37 43


26

Die Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe über eine Mitsunobu-Reaktion ist damit die effektivste

Route der drei verwendeten Methoden. Im Vergleich zu dem Weg der [1,2]-Hydrid-

umlagerung, über den das N2-Dimethylformamidin-3’-O-methansulfonyl-5’-O-(4,4’-

dimethoxytrityl)-2'-desoxy-xylo-guanosin 37 in einer Ausbeute von 17% ausgehend von

Guanosin 30 erhalten wurde, konnte das Nucleosid 37 über den Mitsunobu-Weg in einer

Ausbeute von 39% ausgehend von 2‘-Desoxyguanosin 19 gewonnen werden. Wie bereits

auf Seite 23 beschrieben, lag die Gesamtausbeute der Oxidations-Reduktions-Route

ebenfalls nur im Bereich der [1,2]-Hydridumlagerung. Weiterhin wurden über den Mitsunobu-

Weg zwei Synthesestufen weniger benötigt und damit nicht nur eine bessere Ausbeute,

sondern auch ein verkürzter zeitlicher Syntheseaufwand erreicht.

4.2 Einbringen des Schwefels

Das Einbringen des Schwefels an der 3‘-Position des 2‘-Desoxyguanosins erfolgte analog zu

der von LI veröffentlichten Methode für 2‘-Desoxyadenosin (Abschnitt 2.5).[56] Hierbei wurde

das entsprechende Nucleosid mit Natriumthiobenzoat in einer SN2-Reaktion unter Inversion

der Konfiguration zum entsprechenden Thioester umgesetzt. Dies wurde durch die vorherige

Überführung der 3‘-Hydroxylgruppe in eine gute Abgangsgruppe ermöglicht.

Die Reaktion ist in Abb. 30 dargestellt. Das MMTr- bzw. DMTr-geschützte Nucleosid 33 bzw.

37 wurde durch portionsweise Zugabe mit einem großen Überschuss an Natriumthiobenzoat

bei 110 °C zu dem gewünschten Thioester 45 bzw. 46 umgesetzt. Die portionsweise Zugabe

hat sich bewährt, da Natriumthiobenzoat mit der Zeit mit DMF reagiert und bei einer

einmaligen Zugabe das Reagenz nach einer Stunde verbraucht ist.[44] Nach wässriger

Aufarbeitung und chromatographischer Reinigung wurde der MMTr-geschützte Thioester 45

in einer Ausbeute von 58% und der DMTr-geschützte Thioester 46 in einer sehr guten

Ausbeute von 82% erhalten. Die Reaktion mit dem MMTr-geschützten Nucleosid wurde nur

einmalig durchgeführt, weswegen der Ausbeuteunterschied nicht überbewertet werden

sollte.

Abb. 30: Synthese der Thioester 45 und 46.

Als Alternative zu der SN2-Reaktion wurde die von PIPERAKIS[1] publizierte Mitsunobu-

Reaktion mit Thiobenzoesäure (Abschnitt 2.5) getestet. Die Synthese erfolgte zunächst

R = MMTr 33

R = DMTr 37 R = MMTr 45: 58%

R = DMTr 46: 82%


27

analog zur Veröffentlichung mit dem Isobutyryl-geschützten Nucleosid 22 und zum Vergleich

mit der in dieser Arbeit favorisierten Formamidinschutzgruppe. Zudem wurde als

Schutzgruppe für die 5‘-Hydroxylgruppe ebenfalls TBDMS verwendet, damit eine möglichst

hohe Vergleichbarkeit mit den Literaturdaten gegeben ist. Allerdings sollte auch der Einsatz

der DMTr-Gruppe bei Verwendung des, in dieser Arbeit optimierten, Protokolls

(Abschnitt 4.1) mit guten Ausbeuten möglich sein. Die Mitsunobu-Reaktion der Nucleoside

22 und 41 zu den entsprechenden Thioestern 23 und 47 ist in Abb. 31 dargestellt.

Abb. 31: Synthese der Thioester 23 und 47.

Die chromatographische Reinigung stellte sich als sehr aufwendig heraus. Erst nach

mehrmaliger Durchführung konnten die reinen Produkte 23 und 47 isoliert werden. Der

Isobutyryl-geschützte Thioester 23 wurde in einer Ausbeute von 31% und das Formamidin-

geschützte Nucleosid 47 in einer Ausbeute von 61% erhalten. Der Grund für die Differenz

der Ausbeuten ist nicht bekannt. Laut Literatur sollte die Ausbeute für den Isobutyryl-

geschützten Thioester 23 bei 65% liegen.[1] Die Ausbeute des Formamidin-geschützten

Thioesters 47 lag somit im Bereich der Literaturausbeute.

Aufgrund der Schwierigkeiten bei der Reinigung und der geringeren Ausbeuten bei der

Mitsunobu-Reaktion im Vergleich zur SN2-Reaktion ist letztere zu favorisieren.

4.3 Synthese des 2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidits

Die Darstellung des gewünschten 2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidits 48 wurde nach

dem von COSSTICK etablierten Protokoll durchgeführt.[1,44,56] Es erfolgte zunächst eine

selektive, basische Hydrolyse der 3‘-S-Benzoylgruppe zum 3‘-Thionucleosid 49, ohne die

basenlabile Schutzgruppe an der Nucleobase zu beeinflussen. Dies wurde durch die

Verwendung einer verdünnten Natronlauge bei 0 °C Reaktionstemperatur realisiert. Aufgrund

der Oxidationsempfindlichkeit des Thiols wurde die Reaktion unter Sauerstoffausschluss

durchgeführt. Nach Neutralisation mit Citronensäure und wässriger Aufarbeitung wurde das

Rohprodukt ohne weitere Reinigung in der finalen Synthese eingesetzt. Die

Phosphorylierung zum gewünschten Phosphorthioamidit 48 wurde durch Umsetzung mit

dem 5-Benzylthio-1H-tetrazol (BTT)-aktivierten 2-Cyanoethyl-N,N,N’,N’-tetraisopropyl-

phosphordiamidit erreicht. Die Aktivierung des Diamidits durch BTT erfolgt durch Säure-

Base-Reaktion und anschließender nucleophiler Substitution der protonierten

iBu 22

dmf 41 iBu 23: 31%

dmf 47: 61%


28

Isopropylaminogruppe mit dem deprotonierten BTT. Die Reaktionssequenz der Synthese

des 2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidits 48 ist in Abb. 32 dargestellt. Die Reaktionen

wurden, wie in den Abschnitten zuvor, zunächst mit dem MMTr-geschützten Nucleosid

durchgeführt.

Abb. 32: Synthese des Phosphorthioamidits 48.

Das 2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidit 48 wurde als Diastereomerengemisch im

Verhältnis 1.2:1 (bestimmt aus dem 31P-NMR-Spektrum des Rohgemischs) gebildet. Nach

zweimaliger säulenchromatographischer Reinigung konnte das gewünschte Produkt nur

verunreinigt erhalten werden, wie anhand des 31P-NMR-Spektrums zu erkennen ist

(Abb. 33). Die erfolgreiche Reinigungsmethode mit dem Chromatotron wurde erst im

späteren Verlauf dieser Arbeit entwickelt.

Abb. 33: 31

P-NMR-Spektrum des Phosphorthioamidits 48.

45 49

48


29

Um eine vollständige Zersetzung des Produkts zu verhindern, wurde auf eine weitere

Reinigung verzichtet und das verunreinigte Produkt in der automatisierten

Oligonucleotidsynthese eingesetzt. Optimierungen des Syntheseprotokolls und der

Reinigungsmethode wurden mit den entsprechenden DMTr-geschützten Nucleosiden

durchgeführt.

Durch Verwendung von nur 3 Äquivalenten Citronensäure anstatt 15 Äquivalenten konnte

die Ausbeute von 57% auf 71% über zwei Stufen gesteigert werden (Abb. 34). Weiterhin

bewährte sich eine langsame Zugabe des Diamidits.

Abb. 34: Synthese des Phosphorthioamidits 28.

Im 1H-NMR-Spektrum des Rohprodukts des 3‘-Thionucleosids 50 ist das charakteristische

Dublett des Protons der Thiolgruppe bei 1.66 ppm zu erkennen (Abb. 35).

Abb. 35: 1H-NMR-Spektrum des 3‘-Thionucleosids 50 (in CDCl3).

Durch Verwendung des Chromatotrons konnte die Reinigung des Phosphorthioamidits

deutlich verbessert werden. Es wurden, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben, mit Triethylamin-

Zusatz äquilibrierte Platten verwendet. Mit dieser Methode konnte das reine

Phosphorthioamidit 28 als Diastereomerengemisch gewonnen werden, wie anhand des 31P-

NMR-Spektrums zu erkennen ist (Abb. 36). Zudem war es darüber möglich, die beiden

Diastereomere voneinander zu trennen, was allerdings für die Synthese der Oligonucleotide

nicht notwendig war.

H-a

H-5‘ NH

H-8

OMe

H-4‘ SH

H-2‘a

SH

H-2’b

H-b H-c

H-1‘

DMTr DMTr

H-3‘

28

46 50


30

Abb. 36: 31

P-NMR-Spektrum des Phosphorthioamidits 28.

Für die Oligonucleotidsynthese war es neben der chromatographischen Reinigung von

großer Bedeutung, dass das Phosphorthioamidit als zusätzlichen Reinigungsschritt in

n-Hexan gefällt wurde. Hierauf wird in Abschnitt 4.5 noch genauer eingegangen.

Es konnte somit das, für die Synthese der 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotide

benötigte, 2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidit 28 erfolgreich in hoher Reinheit

dargestellt werden.

4.4 Fazit der verwendeten Syntheserouten

Die erfolgreichste Kombination der durchgeführten Reaktionsschritte zur Darstellung des

2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidits 28 ist in Abb. 37 zusammengefasst. Ausgehend

von 2‘-Desoxyguanosin 19 wird die 5‘-Hydroxylgruppe DMTr und die Nucleobase

Formamidin geschützt. Die Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe mit gleichzeitiger Mesylierung

erfolgt über eine Mitsunobu-Reaktion mit Methansulfonsäure. Das Einbringen des Schwefels

an der 3‘-Position wird durch eine SN2-Reaktion mit Natriumthiobenzoat erreicht. Nach

Hydrolyse der Benzoylgruppe und BTT-vermittelter Phosphorylierung wird das gewünschte

2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidit 28 erhalten. Über diesen 6-stufigen Weg konnte

mit einer Ausbeute von 23% ausgehend von 2‘-Desoxyguanosin 19 die höchste

Gesamtausbeute mit dem geringsten zeitlichen Syntheseaufwand erzielt werden. Die

Gesamtausbeute lag damit im Bereich der, von PIPERAKIS publizierten, 8-stufigen Route[1]

(21% Gesamtausbeute ausgehend von 2‘-Desoxyguanosin 19).


31

Abb. 37: Erfolgreichste Syntheseroute des 2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidits 28.

4.5 Synthese des 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotids

Die Synthese des 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotids 27 (Abb. 38) erfolgte über

die in Abschnitt 2.4 beschriebene automatisierte Festphasensynthese mit Phosphoramidit-

Monomerbausteinen.

Abb. 38: Sequenz des gewünschten 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotids 27 (die

Modifikation ist mit „*“ gekennzeichnet).

Die erste Synthese wurde mit dem MMTr-geschützten Phosphorthioamidit 48 als

modifizierten Baustein durchgeführt. Hierbei ist anzumerken, dass das Phosphorthioamidit

48 stark verunreinigt eingesetzt wurde (Abschnitt 4.3). Da die Verunreinigungen eine

chemische Verschiebung im 31P-NMR-Spektrum von ca. 0 ppm aufwiesen (Abb. 33), sollten

diese bei der Synthese nicht stören, da es sich nicht um reaktive Phosphoramidite handeln

kann. Aufgrund der geringeren Reaktivität der Phosphorthioamidite gegenüber

O-Phosphoramiditen wurde für den Kupplungsschritt des Phosphorthioamidits ein leicht

verändertes Protokoll verwendet. Die Zugabe des Phosphorthioamidits 48 erfolgte in zwei

Schritten mit einer Kupplungsdauer von jeweils 6 Minuten. Als Aktivator wurde bei allen

Kupplungsschritten 5-Benzylthio-1H-tetrazol (0.3 M in Acetonitril) eingesetzt. Das genaue

Protokoll ist im Experimentalteil unter Variante A zu finden. Die unterschiedlichen

5’-ATAAAGTATAGTGTG*TTAT-3’

19 44

43 46 37

28

50


32

Syntheseprotokolle werden im Folgenden als Varianten und die verschiedenen

Reinigungsmöglichkeiten als Methoden bezeichnet. Die Abspaltung der MMTr-Gruppe

wurde, aufgrund der höheren Stabilität, abweichend von der Standardmethode, mit

Trichloressigsäure anstatt Dichloressigsäure durchgeführt. Die Überwachung der

Kupplungsrate erfolgte photometrisch durch den sogenannten Tritylmonitor, der allerdings

nur ein ungefähres Maß für die Kupplungsrate ist. Nach der Kupplung des modifizierten

Bausteins wurde eine Kupplungsrate von lediglich 25% angezeigt. Die Spaltung des

Oligonucleotids von dem CPG-Träger und die Abspaltung der weiteren Schutzgruppen

erfolgten mit Ammoniak. Die Reinigung des Oligonucleotids wurde mittels HPLC mit einer

Anionenaustauschersäule (IEX) durchgeführt (Methode A). Das Chromatogramm des IEX-

Reinigungslaufs ist in Abb. 39 dargestellt. Bei einer Retentionszeit von 24.7 Minuten ist das

Signal des gewünschten 19-mers zu erkennen. Bei 1.9 Minuten ist das Tetramer zu sehen,

welches, durch die geringe Kupplungsrate des Phosphorthioamidits 48, das Hauptprodukt

der Synthese darstellte. Es ist hierbei schon zu erkennen, dass die Ausbeute deutlich unter

der beim Tritylmonitor angezeigten Ausbeute lag, was die Ungenauigkeit dieser

Messmethode verdeutlicht.

Abb. 39: IEX-HPLC-Chromatogramm der Reinigung des Roholigonucleotids 27 (Methode A).

Nach der Reinigung über die IEX-Säule wurden die Salze über Größenausschluss-

chromatographie abgetrennt. Da für die Reinigung eine analytische HPLC verwendet wurde,

waren 10 Läufe zur Reinigung der vollständigen Synthese notwendig. Nach den

Reinigungsschritten wurden lediglich 1.3 nmol des Oligonucleotids erhalten, was einer

19-mer 27

Tetramer


33

Ausbeute von 0.1% entspricht. Die hohe Reinheit des erhaltenen Oligonucleotids 27 ist

anhand der in Abb. 40 dargestellten MALDI-MS-Spektren zu erkennen.

Abb. 40: MALDI-MS-Spektrum des gereinigten Oligonucleotids 27, berechnete monoisotopische

Masse: 5893.0 Da, gefunden: 5889.3 Da.

Es konnte damit erfolgreich das gewünschte 3‘-S-phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotid

27 dargestellt werden. Allerdings bot die Ausbeute noch deutlichen Steigerungsbedarf, da für

die Untersuchungen der Relaxase etwa 300 nmol des Oligonucleotids benötigt wurden. Die

Optimierung der Synthese wurde mit dem DMTr-geschützten Phosphorthioamidit 28

durchgeführt, welches im Gegensatz zum MMTr-geschützten Phosphorthioamidit 48 in hoher

Reinheit vorlag (Abschnitt 4.3). Die Verwendung der DMTr-Gruppe war sinnvoll, da dadurch

der Wechsel der Säure für die Abspaltung vermieden wurde.

[M-H]-

[M-2H]2-

[M-3H]3-

[M-H]-

[M-2H+Na]-

[M-2H+K]-


34

Die Kupplung des DMTr-geschützten Phosphorthioamidits 28 wurde mit einer 0.14-molaren

Lösung durchgeführt. Die Zugabe des Phosphorthioamidits erfolgte in drei Schritten mit einer

Kupplungsdauer von jeweils 6 Minuten (Variante B). Hierbei wurde eine Kupplungsrate von

30% erreicht (Trityl-Monitor). Die Reinigung erfolgte analog zu der Synthese mit dem MMTr-

geschützten Phosphorthioamidit 48 mittels IEX-HPLC und anschließender Größen-

ausschlusschromatographie. Das Chromatogramm der Reinigung mittels IEX-HPLC ist in

Abb. 41 dargestellt. Es wurde eine leicht veränderte HPLC-Methode verwendet (Methode B),

weswegen die Retentionszeit des 19-mers 27 bei 21.8 Minuten und die des Tetramers bei

7.2 Minuten lag.

Abb. 41: IEX-HPLC-Chromatogramm der Reinigung des Roholigonucleotids 27 (Methode B).

Zudem wurde die Reinigung beschleunigt, indem das Rohprodukt in einem kleineren

Volumen aufgenommen wurde und damit der komplette Syntheseansatz über die Säule

gegeben werden konnte. Dadurch war allerdings eine dreimalige Reinigung notwendig. Nach

den IEX-HPLC-Läufen musste jeweils entsalzt werden. Es wurden 8 nmol des gewünschten

Oligonucleotids 27 erhalten, was einer Ausbeute von 1% entspricht. Das Chromatogramm

des gereinigten Oligonucleotids ist in Abb. 42 dargestellt.

19-mer 27

Tetramer


35

Abb. 42: IEX-HPLC-Chromatogramm des gereinigten 3‘-S-thiophosphatverbrückten Oligonucleotids

27 (Methode B).

Das erhaltene MALDI-MS-Spektrum demonstriert neben dem Chromatogramm ebenfalls die

hohe Reinheit des Oligonucleotids 27 (Abb. 43).

Abb. 43: MALDI-MS-Spektrum des gereinigten Oligonucleotids 27, berechnete monoisotopische

Masse: 5893.0 Da, gefunden: 5894.9 Da.

Durch die Verwendung des reinen Phosphorthioamidits 28 und der Verbesserung der

Reinigung konnte die Ausbeute deutlich gesteigert werden. Allerdings war die Ausbeute mit

[M-H]-

[M-2H]2-

[M-3H]3-


36

1% immer noch sehr niedrig. Es wurde versucht, durch Erhöhung der Konzentration der

Phosphorthioamidit-Lösung von 0.14 M auf 0.24 M die Kupplungsrate zu steigern

(Variante C). Der Trityl-Monitor zeigte jedoch wieder die gleiche Rate von 30% an. Da der

Aktivator 5-Benzylthio-1H-tetrazol eine geringe Löslichkeit in Acetonitril aufweist und dadurch

keine höhere Konzentration bei der Synthese als 0.3 M eingesetzt werden kann, wurde

stattdessen eine 1-molare Lösung des 5-Ethylthio-1H-tetrazols verwendet (Variante D). Es

wurde erneut eine 0.24-molare Lösung des Phosphorthioamidits verwendet. Dabei sank die

Kupplungsrate jedoch auf 20% (Trityl-Monitor) und brachte damit ebenfalls keine

Verbesserung.

Den entscheidenden Durchbruch schaffte eine zusätzliche Reinigung des Phosphorthio-

amidits 28 vor dem Einsatz in der Oligonucleotidsynthese. Das Amidit wurde in

Dichlormethan gelöst und langsam in n-Hexan getropft, wobei es sofort in farblosen

Kristallen ausfiel. Mit dem so gewonnenen Phosphorthioamidit 28 wurden Kupplungsraten

von bis zu 90% erreicht (Trityl-Monitor).

Es wurde eine 0.17-molare Lösung des gefällten Phosphorthioamidits 28 eingesetzt. Zudem

wurden die Zugabeschitte bei der Kupplung von 3 auf 4 erhöht und die Kupplungsdauer von

6 auf 10 Minuten verlängert (Variante E). Als Aktivator wurde wieder 5-Benzylthio-1H-tetrazol

verwendet. Hierbei wurde eine Kupplungsrate von 82% erreicht (Trityl-Monitor). Das

erhaltene IEX-HPLC-Chromatogramm der Reinigung der Synthese ist in Abb. 44 dargestellt

(Methode A).

Abb. 44: IEX-HPLC-Chromatogramm der Reinigung des Roholigonucleotids 27 (Methode A).

19-mer 27

Tetramer


37

Das gewünschte Oligonucleotid 27 konnte in einer deutlich gesteigerten Ausbeute von 6%

erhalten werden.

Durch Erhöhung der Zugaben des Phosphorthioamidits bei der Kupplung auf 8 Schritte

konnte die Kupplungsrate auf 90% gesteigert werden (Variante F). Die Ausbeuteverluste bei

der Reinigung konnten zudem durch die Verwendung einer RP- anstatt der IEX-Säule etwas

verringert werden (Methode C). Das RP-HPLC-Chromatogramm der Reinigung des

Oligonucleotids 27 ist in Abb. 45 dargestellt.

Abb. 45: RP-HPLC-Chromatogramm der Reinigung des Roholigonucleotids 27 (Methode C).

Anschließend musste ebenfalls eine Größenausschlusschromatographie angeschlossen

werden, da der Laufpuffer im Ölpumpenvakuum nicht vollständig entfernt werden konnte.

Das Oligonucleotid 27 wurde in einer leicht verbesserten Ausbeute von 7% erhalten. Wie das

Chromatogramm in Abb. 46 verdeutlicht, konnte das Oligonucleotid 27 auch über diese

Reinigungsmethode in einer hohen Reinheit erhalten werden.

19-mer 27

Tetramer


38

Abb. 46: RP-HPLC-Chromatogramm des gereinigten 3‘-S-thiophosphatverbrückten Oligonucleotids

27 (Methode C).

In Tab. 1 sind noch einmal die Kupplungsraten, die Peakflächenanteile des 19-mers in den

Chromatogrammen der Rohprodukte und die Ausbeuten der wichtigsten Synthesevarianten

zusammengefasst. Durch die Fällung des Phosphorthioamidits 28 vor dem Einsatz in der

Oligonucleotidsynthese konnte die stärkste Verbesserung erzielt werden. Durch die

Verwendung einer RP- anstatt einer IEX-Säule konnte eine weitere leichte Steigerung der

Ausbeute erreicht werden.

Tab. 1: Gegenüberstellung der Kupplungsraten, der Peakflächenanteile des 19-mers in den

Chromatogrammen der Rohprodukte und der Ausbeuten der verschiedenen Varianten.

Trityl-

Monitor [%] Reinigung

Peakfläche

19-mer [%]

Ausbeute

[nmol]

Ausbeute

[%]

Variante C 30 IEX 9 8 1

Variante E 82 IEX 21 57 5.7

Variante F 90 RP 23 72 7.2

Die Synthesen wurden mehrfach wiederholt, so dass insgesamt 330 nmol des gewünschten

3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotids 27 in hoher Reinheit erhalten wurden. Damit

stand ausreichend Material für die Untersuchung der Relaxase MobM zur Verfügung. Zum

Zeitpunkt der Abgabe dieser Arbeit lagen allerdings noch keine Ergebnisse zu diesen

Untersuchungen vor.


39

4.6 Einsatz eines 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Dinucleotids

Die Ausbeuten der Oligonucleotidsynthese mit dem Phosphorthioamidit 28 waren trotz

erfolgreicher Optimierung mit 7% noch relativ niedrig (Abschnitt 4.5). Aus diesem Grund

sollte untersucht werden, ob die Ausbeute der Oligonucleotidsynthese durch Verwendung

eines 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Dinucleotids gesteigert werden kann. Durch die

Vorverlagerung des ineffizienten Schritts sollte der hohe zeitliche Reinigungsaufwand des

Oligonucleotids verringert werden.

Die geplante Retrosyntheseroute zur Darstellung des 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten

Dinucleotid-3’-phosphoramidits 29 ist in Abb. 47 dargestellt. Das Phosphoramidit 29 sollte

durch Phosphorylierung des 3‘-OH-freien Dinucleotids 51 gebildet werden, was wiederum

durch Abspaltung der Schutzgruppe gewonnen werden sollte. Die Kupplung zum Dinucleotid

52 sollte mit dem bereits in der Oligonucleotidsynthese eingesetzten Phosphorthioamidit 28

und dem 3‘-TBDMS-geschützten Thymidin 53 erfolgen. Die TBDMS-Gruppe wurde

ausgewählt, da eine Abspaltung ohne Beeinflussung der anderen Schutzgruppen möglich

sein sollte.

Abb. 47: Retrosynthese des 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Dinucleotid-3’-phosphoramidits 29.

Da die Synthese des Phosphorthioamidits 28 bereits in Abschnitt 4.3 beschrieben wurde, soll

im Folgenden auf die Darstellung des 3‘-TBDMS-geschützten Thymidins 53 eingegangen

werden.

4.6.1 Synthese des 3‘-O-tert-Butyldimethylsilylthymidins 53

Zur Darstellung des 3’-O-tert-Butyldimethylsilylthymidins 53 wurde eine orthogonale

Schutzgruppenstrategie angewendet (Abb. 48). Zunächst wurde Thymidin 54 mit

29

51

28 52

53


40

4,4‘-Dimethoxytritylchlorid (DMTrCl) an der 5’-Position geschützt. Der bei der Reaktion

entstandene Chlorwasserstoff wurde durch Pyridin in Form von Pyridiniumchlorid

abgefangen. Nach wässriger Aufarbeitung und säulenchromatographischer Reinigung wurde

das 5’-DMTr-geschützte Thymidin 55 in einer Ausbeute von 82% erhalten.

Abb. 48: Synthese des 3‘-O-tert-Butyldimethylsilylthymidins 53.

Die anschließende Schützung der 3’-Hydroxylgruppe erfolgte durch die Zugabe von tert-

Butyldimethylsilylchlorid. Aufgrund des großen sterischen Anspruchs der TBDMS-Gruppe

und der, im Vergleich zur 5‘-Hydroxylgruppe, geringeren Reaktivität der 3‘-Hydroxylgruppe

war eine relativ lange Reaktionszeit von zwei Tagen zum vollständigen Umsatz des Edukts

notwendig. Nach wässriger Aufarbeitung und säulenchromatographischer Reinigung wurde

das vollständig geschützte Thymidin 56 in einer Ausbeute von 75% erhalten. Die säurelabile

DMTr-Gruppe wurde mit Dichloressigsäure abgespalten, wobei die TBDMS-Gruppe

unbeeinflusst blieb. Nach Aufarbeitung und Reinigung wurde der gewünschte

Synthesebaustein 53 für die Dinucleotidsynthese in einer Ausbeute von 82% erhalten.

4.6.2 Testsynthese eines 3‘-TBDMS-geschützten Dinucleotids mit einem

O-Phosphoramidit

Die Kupplungsreaktion wurde zunächst mit dem käuflich erwerbbaren 2‘-Desoxyguanosin-3‘-

phosphoramidit 57 als Diastereomerengemisch untersucht. Die Kupplung des

Phosphoramidits 57 mit dem 3‘-TBDMS-geschützten Thymidin 53 ist in Abb. 49 dargestellt.

Als Aktivator wurde, wie bei der Oligonucleotidsynthese, 5-Benzylthio-1H-tetrazol (BTT)

verwendet. Anschließend erfolgte die Oxidation des Phosphits 58 zum Phosphat 59 durch

Zugabe von Iod mit Zusätzen von Pyridin und Wasser in Tetrahydrofuran.

54 55

53 56


41

Abb. 49: Synthese des O-verbrückten Dinucleotids 59.

Zu verschiedenen Zeiten der Synthese wurden Aliquote für eine NMR-spektroskopische

Verfolgung der Reaktion entnommen. Es wurden nach der Zugabe des Aktivators im 31P-

NMR-Spektrum zwei Signale mit der chemischen Verschiebung von 140.9 und 139.9 ppm

beobachtet, was auf die Bildung des gewünschten Kupplungsprodukts 58 als

Diastereomerengemisch hindeutete. Nach anschließender Oxidation wies das Spektrum

Signale bei -1.9 und -2.8 ppm auf. Diese, für Phosphatverbindungen charakteristische,

chemische Verschiebung um 0 ppm, ließ auf das Produkt 59 schließen. Da im Spektrum

keine Signale des Phosphits 58 zu erkennen waren, konnte davon ausgegangen werden,

dass das Phosphit 58 quantitativ zum Phosphat 59 oxidiert wurde. Nach der Reinigung des

Rohprodukts am Chromatotron wurde das gewünschte Produkt 59 als Diastereomeren-

gemisch im Verhältnis von 1:1.1 erhalten. Allerdings konnte aufgrund der NMR-

Reaktionsverfolgung keine Ausbeute bestimmt werden. Das 31P-NMR-Spektrum zeigt die

hohe Reinheit des erhaltenen Dinucleotids 59 (Abb. 50).

Abb. 50: 31

P-NMR-Spektrum des O-verbrückten Dinucleotids 59.

57

58

53

59


42

4.6.3 Abspaltung der TBDMS-Gruppe an der 3‘-Position des O-verbrückten

Dinucleotids 59

Die Abspaltung der Schutzgruppe der 3‘-Hydroxylgruppe des O-verbrückten Dinucleotids 59

ist sehr komplex. Es sind milde, neutrale Reaktionsbedingungen erforderlich, da das Molekül

basen- und säurelabile Schutzgruppen trägt, die unter den Bedingungen nicht abgespalten

werden dürfen. Durch Untersuchungen mit dem 3’-O-tert-Butyldimethylsilyl-5’-O-(4,4’-

dimethoxtrityl)thymidin 56 als Modellnucleosid wurde zunächst bestätigt, dass eine selektive

Abspaltung der TBDMS-Schutzgruppe ohne eine Beeinflussung der DMTr-Gruppe mit

Triethylamintrihydrofluorid und Zusatz von Triethylamin möglich ist.

Mit den erprobten Reaktionsbedingungen wurde nun versucht, die TBDMS-Schutzgruppe am

Dinucleotid 59 selektiv zum 3‘-OH-freien Dinucleotid 60 abzuspalten (Abb. 51).

Abb. 51: Versuch der selektiven Abspaltung der TBDMS-Gruppe.

Bei der dünnschichtchromatographischen Reaktionsverfolgung waren jedoch bereits nach

5 Minuten drei Spots zu sehen und im weiteren Reaktionsverlauf waren immer mehr Spots

zu erkennen. Dies deutete darauf hin, dass sich neben der TBDMS-Schutzgruppe noch

weitere labile Gruppen des Dinucleotids 59 abgespaltet haben oder es sogar zu einer

Spaltung des Phosphattriesters gekommen ist. Auch eine Veränderung der Äquivalente und

die Verwendung von Tetrabutylammoniumfluorid (1 M in THF) mit Zusatz von Essigsäure

führten nur zu einer undefinierten Zersetzung des Dinucleotids 59.

Da die TBDMS-Gruppe nicht selektiv abgespalten werden konnte, ohne die restlichen

funktionellen Gruppen des Dinucleotids zu beeinflussen, sollte eine andere Schutzgruppe an

dieser Position verwendet werden.

4.6.4 Die 4-Monomethoxytritylsulfenyl-Schutzgruppe

Eine vielversprechende Alternative für die TBDMS-Schutzgruppe stellte die Verwendung der

4-Monomethoxytritylsulfenyl-Schutzgruppe (MMTrS) dar. Diese Gruppe kann durch Iod

abgespalten werden,[70] was ebenfalls bei der Dinucleotidsynthese zur Oxidation des

Phosphoratoms verwendet wurde (Abschnitt 4.6). Somit sollte, nach der Kupplung des

Phosphorthioamidits 28 mit dem 3‘-MMTrS-geschützten Thymidin 61 zum Dinucleotid 62, die

Oxidation des Phosphits und die Abspaltung der 3’-Hydroxyl-Schutzgruppe gleichzeitig

59 60


43

erfolgen und das gewünschte 3‘-OH-freie 3‘-S-phosphorthiolatverbrückte Dinucleotid 51

erhalten werden (Abb. 52).

Abb. 52: Syntheseplan des 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Dinucleotids 51 mit Hilfe einer MMTrS-

Schutzgruppe.

Zur Darstellung des 3‘-MMTrS-geschützten Thymidins 61 musste zunächst das Reagenz für

die Schützung der Hydroxylgruppe synthetisiert werden. Dies sollte in einer dreistufigen

Synthese ausgehend von 4-Monomethoxytritylchlorid 63 erfolgen, was in einer nucleophilen

Substitution mit Kaliumthioacetat zu 4-Monomethoxytritylthioacetat 64 umgesetzt werden

sollte. Durch Verseifung zum Thiol 65 und anschließender Chlorierung sollte das

gewünschte 4-Monomethoxytritylsulfenylchlorid 66 zugänglich sein.

Die Darstellung des 4-Monomethoxytritylthioacetat 64 erfolgte nach dem Protokoll von

ZHENG.[71] 4-Monomethoxytritylchlorid 63 wurde mit Kaliumthioacetat in N,N-Dimethyl-

formamid umgesetzt (Abb. 53). Nach wässriger Aufarbeitung wurde das Produkt 64 in einer

Ausbeute von 97% erhalten. Eine säulenchromatographische Reinigung war nicht

notwendig.

Abb. 53: Synthese des 4-Monomethoxytritylthioacetats 64.

Im zweiten Schritt der Synthese erfolgte die Hydrolyse des 4-Monomethoxytritylthioacetats

64 mit Natriumhydroxid zum 4-Monomethoxytritylthiol 65 (Abb. 54). Die Reinigung des

Rohprodukts stellte sich jedoch als problematisch heraus. Mit einer säulenchromato-

graphischen Reinigung konnten nur Ausbeuten von maximal 38% erreicht werden. Trotz

Zusatz von Triethylamin konnte eine teilweise Zersetzung des Produkts nicht verhindert

werden. Aufgrund dieser Schwierigkeiten wurden weitere Reinigungsmethoden untersucht.

Dabei führte die Aufnahme des, nach der wässrigen Aufarbeitung erhaltenen, Feststoffs in

61

62 51

28

63 64


44

Methanol und anschließender Filtration zu einem reinen Produkt in einer guten Ausbeute von

60%.

Abb. 54: Synthese des 4-Monomethoxytritylthiols 65.

Nach der Vorschrift von SEIO[70] wurde 4-Monomethoxytritylthiol 65 zum gewünschten

Reagenz 4-Monomethoxytritylsulfenylchlorid 66 umgesetzt. Dabei erfolgte die Reaktion des

Thiols 65 in Dioxan durch Zugabe von 1,3-Dichloro-5,5-dimethylhydantoin (Abb. 55). Nach

wässriger Aufarbeitung und Coevaporieren mit Ethylacetat wurde

4-Monomethoxytritylsulfenylchlorid 66 erhalten. Allerdings war das Produkt noch mit etwa

5% nicht umgesetztem Edukt verunreinigt. Durch eine noch längere Reaktionszeit kann

möglicherweise eine vollständige Umsetzung des Edukts erreicht werden. Eine

säulenchromatographische Reinigung an Kieselgel wurde mit einer geringen Menge des

Produkts erprobt. Allerdings konnte keine Trennung der beiden Substanzen erreicht werden.

Zudem trat eine Zersetzung des Produkts während der Chromatographie auf. Auf eine

säulenchromatographische Reinigung wurde deswegen verzichtet und das

4-Monomethoxytritylsulfenylchlorid 66 als Rohprodukt bei der Schützung der

3‘-Hydroxylguppe des Thymidins eingesetzt.

Abb. 55: Synthese des 4-Monomethoxytritylsulfenylchlorids 66.

4.6.5 Synthese des 3’-O-(4-Methoxytritylsulfenyl)thymidins 61

Zur Darstellung des 3’-O-(4-Methoxytritylsulfenyl)thymidins 61 wurde eine orthogonale

Schutzgruppenstrategie angewendet. Dabei wurde die 5‘-Hydroxylgruppe zunächst mit tert-

Butyldimethylsilylchlorid blockiert, anschließend mit 4-Monomethoxytritylsulfenylchlorid

umgesetzt und abschließend die 5‘-Hydroxylgruppe selektiv entschützt, ohne dabei die

MMTrS-Gruppe zu beeinflussen.

64 65

65 66


45

Die Reaktion des Thymidins 54 mit tert-Butyldimethylsilylchlorid in Pyridin ist in Abb. 56

dargestellt. Nach wässriger Aufarbeitung und säulenchromatographischer Reinigung wurde

5‘-O-tert-Butyldimethylsilylthymidin 67 in einer Ausbeute von 83% erhalten.

Abb. 56: Synthese des 5‘-O-tert-Butyldimethylsilylthymidins 67.

Für die Einführung der MMTrS-Gruppe musste zunächst die 3‘-Hydroxylgruppe des

Nucleosids 67 deprotoniert werden, damit eine Reaktion mit 4-Monomethoxytrityl-

sulfenylchlorid stattfindet. Hierfür verwendete SEIO n-Butyllithium (n-BuLi) oder

Lithiumhexamethyldisilazid (LHMDS), wobei in der Publikation die 5‘-Hydoxylgruppe MMTrS

geschützt wurde.[70,72]

Mit dem Einsatz von n-BuLi als Base wurde nur die Abspaltung der TBDMS-Gruppe und

keine Reaktion zum gewünschten Produkt 68 beobachtet. Bei der Verwendung von LHMDS

als Base erfolgte immerhin keine Zersetzung des Edukts 67, jedoch ebenfalls keine

Umsetzung zum 5‘-O-tert-Butyldimethylsilyl-3’-O-(4-methoxytritylsulfenyl)thymidin 68.

Aufgrund der unerfreulichen Ergebnisse wurde eine weitere Base untersucht. Die Wahl fiel

auf Natriumhydrid, da sie stark genug sein sollte, um die 3‘-Hydroxylgruppe zu

deprotonieren, gleichzeitig aber keine Abspaltung der TBDMS-Schutzgruppe erwartet wurde.

Bei dem Einsatz von Natriumhydrid als Base wurde die Bildung des gewünschten MMTrS-

geschützten Nucleosids 68 beobachtet. Allerdings entstanden zusätzlich zwei Neben-

produkte, zum einen ein lediglich an der Nucleobase MMTrS-geschütztes Nucleosid und

zum anderen ein zweifach MMTrS-geschütztes Nucleosid. Die Nebenprodukte entstehen, da

die Nucleobase ebenfalls deprotoniert wird, und um eine vollständige Deprotonierung der

3‘-Hydroxylgruppe zu erreichen, mindestens zwei Äquivalente Base eingesetzt werden

müssen. Es wurde eine Reihe an Variationen der Reaktionsbedingungen untersucht, um das

Produktverhältnis zugunsten des gewünschten Produkts zu verschieben. Bei

Raumtemperatur bildete sich hauptsächlich das an der Nucleobase geschützte Produkt und

bei tieferen Temperaturen hauptsächlich das gewünschte, 3‘-geschützte Nucleosid 68. Bei

zu tiefen Temperaturen, wie -30 °C, wurde allerdings kein Umsatz mehr beobachtet. Es

wurde eine optimale Reaktionstemperatur von -10 °C ermittelt. Bei Erhöhung der Äquivalente

war das zweifach geschützte Nucleosid das Hauptprodukt. Wenn statt dem Nucleosid das

Reagenz vorgelegt wurde, verringerte sich der Umsatz des Edukts deutlich. Die

Reaktionsbedingungen, mit denen das beste Ergebnis erzielt wurde, sind in Abb. 57

54 67


46

dargestellt. Nach wässriger Aufarbeitung und säulenchromatographischer Reinigung wurde

das gewünschte 5‘-O-tert-Butyldimethylsilyl-3’-O-(4-methoxytritylsulfenyl)thymidin 68 in einer

Ausbeute von 43% erhalten.

Abb. 57: Synthese des 5‘-O-tert-Butyldimethylsilyl-3’-O-(4-methoxytritylsulfenyl)thymidins 68.

Im letzten Schritt der Darstellung des 3’-O-(4-Methoxytritylsulfenyl)thymidins 61 wurde die

5‘-Hydroxylgruppe entschützt. Die TBDMS-Schutzgruppe wurde durch Zugabe von

Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) als Fluoridionen-Donor abgespalten. Durch säulen-

chromatographische Reinigung wurde das Produkt in einer sehr guten Ausbeute von 93%

erhalten (Abb. 58)

Abb. 58: Synthese des 3’-O-(4-Methoxytritylsulfenyl)thymidins 61.

3’-O-(4-Methoxytritylsulfenyl)thymidin 61 konnte somit erfolgreich dargestellt werden und

stand für die Synthese des 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Dinucleotids 51 zur Verfügung.

4.6.6 Synthese des 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Dinucleotids 51

Der geplante Syntheseweg des 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucletids wurde bereits

in Abschnitt 4.6.4 vorgestellt (Abb. 52). Zunächst sollte die BTT-vermittelte Kupplung des

Phosphorthioamidits 28 mit dem 3‘-MMTrS-geschützten Thymidin 61 zum Dinucleotid 62

erfolgen. Anschließend sollte durch Zugabe von Iod, mit Zusätzen von Pyridin und Wasser,

die Oxidation des Phosphits und die Abspaltung der 3’-Hydroxyl-Schutzgruppe gleichzeitig

ablaufen und das gewünschte 3‘-OH-freie Dinucleotid 51 erhalten werden.

Als Vorversuch wurde die Abspaltung der MMTrS-Gruppe mit dem 3’-O-(4-

Methoxytritylsulfenyl)thymidin 61 als Modellnucleosid untersucht (Abb. 59). Dabei wurde

festgestellt, dass die Abspaltung der Schutzgruppe deutlich langsamer als die Oxidation

verläuft. Erst nach 24 Stunden war das Edukt vollständig umgesetzt. Nach wässriger

Aufarbeitung und säulenchromatographischer Reinigung konnte das Thymidin 54 in einer

67 68

68 61


47

Ausbeute von 92% erhalten werden. Trotz der langen Reaktionszeit konnte somit die

MMTrS-Schutzgruppe erfolgreich unter den gewünschten Reaktionsbedingungen

abgespalten werden. Somit sollte sich die Schutzgruppe für die Synthese eines Dinucleotids

eignen. Allerdings muss untersucht werden, ob die lange Reaktionszeit ein Problem darstellt.

Abb. 59: Testversuch zur Abspaltung der MMTrS-Gruppe mit Iod.

Nachdem die Testreaktion der Schutzgruppenabspaltung erfolgreich verlaufen war, wurden

nun die BTT-vermittelte Kupplungsreaktion des Phosphorthioamidits 28 mit dem 3’-O-(4-

Methoxytritylsulfenyl)thymidin 61 sowie die Oxidation und die Abspaltung der MMTrS-

Schutzgruppe durchgeführt (Abb. 60).

Abb. 60: Synthese des 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Dinucleotids 51.

Um genauere Informationen über den Ablauf der Reaktion zu erhalten, wurden 31P-NMR-

Spektren der Reaktionslösung aufgenommen. Dafür wurden zu geeigneten Zeitpunkten

Aliquote (0.3 mL) entnommen, mit 0.3 mL deuteriertem Acetonitril versetzt und NMR-

spektroskopisch untersucht. Nach der Zugabe des Aktivators und des 3‘-MMTrS-geschützten

Thymidins 61 war im 31P-NMR-Spektrum ein Signal bei 188.6 ppm zu erkennen, was

aufgrund der chemischen Verschiebung auf das gewünschte Kupplungsprodukt

hindeutete.[42] Allerdings waren daneben auch noch eine Reihe weiterer Signale im Bereich

von 80 bis 0 ppm zu beobachten. Nach der Zugabe von Iod wies das NMR-Spektrum, neben

einer Reihe anderer Signale, zwei Signale bei 25.7 und 25.4 ppm auf. Das Produkt 51 sollte

eine chemische Verschiebung von 30 bis 20 ppm zeigen.[42] Dadurch kann bei den Signalen

wahrscheinlich auf das gewünschte Produkt 51 geschlossen werden. Allerdings kann keine

Aussage darüber getroffen werden, ob die vorliegende Verbindung noch die MMTrS-Gruppe

trägt oder nicht. Nach der bewährten Reinigungsmethode mit dem Chromatotron konnte das

Produkt jedoch nicht isoliert werden, so dass von einer Zersetzung während der Reinigung

auszugehen ist. Auch massenspektrometrisch konnte das 3‘-S-phosphorthiolatverbrückte

61 54

28 61

51


48

Dinucleotid 51 nicht nachgewiesen werden. Neben den Schwierigkeiten der Reinigung war

der Umsatz der Reaktion sehr gering und es entstand eine Vielzahl an Nebenprodukten.

Eine Variation der Äquivalente und Reaktionszeiten brachte keine Verbesserung. Um eine

Zersetzung des Produkts während der Reinigung zu verhindern, wurde eine wässrige

Aufarbeitung mit Natriumsulfit sowie mit Natriumhydrogencarbonat erprobt. Dadurch sollte

der Überschuss an Iod durch Natriumsulfit reduziert werden. Gegebenenfalls kann nicht

reagiertes Iod zuvor zu Problemen bei der Reinigung geführt haben. Zusammen mit der

Verwendung einer automatisierten Säulenchromatographie konnten auch nach den

Reinigungsschritten noch die Produktsignale im 31P-NMR-Spektrum beobachtet werden.

Allerdings lag das Produkt auch nach verschiedenen Optimierungsversuchen immer stark

verunreinigt vor und konnte nicht isoliert werden.

Trotz der starken Verunreinigungen wurde das Gemisch mit BTT und 2-Cyanoethyl-

N,N,N’,N’-tetraisopropylphosphordiamidit umgesetzt und das Rohprodukt direkt in der

Oligonucleotidsynthese eingesetzt. Das gewünschte Oligonucleotid 27 wurde allerdings nicht

erhalten.

Aufgrund des geringen Umsatzes bei der Kupplungsreaktion des Phosphorthioamidits 28 mit

dem 3‘-geschützten Thymidin 61 und der Labilität des 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten

Dinucleotids 51 war es damit nicht möglich, die Ausbeute der Oligonucleotidsynthese durch

Verwendung eines 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Dinucleotids zu steigern.

Teil II

49

Teil II

Fluoreszierende Nucleotid-Prodrugs für

Zellaufnahmestudien

Teil II

50

Einleitung Teil II

51

5 Einleitung

Weltweit lebten 2015 etwa 37 Millionen Menschen mit dem aquired immunodeficiency

syndrome (AIDS), verursacht durch das human immunodeficiency virus (HIV). Jedes Jahr

kommen ca. 2 Millionen Neuinfizierte hinzu. Durch das Virus wird das Immunsystem so stark

geschädigt, das es den Organismus nicht mehr gegen opportunistische Infektionen und

Tumorbildung schützen kann. An den Folgen sterben jährlich etwa eine Million Menschen.[73]

In den USA wurden 1981 die ersten Fälle von AIDS beschrieben.[74] Zwei Jahre später

gelang erstmals die Isolierung des HIV Typ 1 (HIV-1),[75] damals noch den human T-cell

leukemia viruses (HTLV) zugeordnet. 1986 wurde der HIV Typ 2 (HIV-2) isoliert,[76] in der

Publikation als lymphadenophathy-AIDS-virus type II (LAV-II) ausgewiesen. Das

„International Committee on the Taxonomy of Viruses“ empfahl 1986, dass die AIDS-

verursachenden Viren einheitlich als human immunodeficiency viruses, kurz HIV, bezeichnet

werden sollten.[77]

Die Virus-Typen HIV-1 und HIV-2 unterscheiden sich in ihrem Ursprung und ihrer

Gensequenz, jedoch verursachen beide AIDS mit einem ähnlichen Spektrum an

Symptomen.[78] Es wird davon ausgegangen, dass die verschiedenen HIV-Stämme aus

mehreren unabhängigen Übertragungen von verschiedenen Typen des simian

immunodeficiency virus (SIV) in Zentralafrika von Affen auf den Menschen entstanden sind.

Bei HIV-1 wird angenommen, dass dessen Ursprung die Übertragung eines SIV-Typs von

Schimpansen auf den Menschen war. Wohingegen der Westafrikanische Affe Rußmangabe

als Überträger eines weiteren SIV-Typs auf den Menschen ausgemacht wurde, was als

Ursprung für HIV-2 gilt.[78] Es wurde schon in den ersten Jahren nach der Virusidentifikation

eine hohe Diversität des Virus festgestellt. Trotz der hohen Mutationsrate des HIV ist

aufgrund dieses hohen Grades an Diversität davon auszugehen, dass der Vorläufer der HIV-

1-Stämme schon um die 1920er Jahre und der der HIV-2-Stämme in den 1940er Jahren auf

den Menschen übertragen worden sein muss. Im Gegensatz zu HIV-1, welches weltweit

verbreitet ist, ist HIV-2 hauptsächlich in Westafrika zu finden.[79-81]

HIV gehört zu den Retroviren, dessen Genom aus zwei einzelsträngigen RNA-Strängen

besteht. Die Übertragung von HIV erfolgt durch Austausch von Blut und Samen- oder

Vaginalflüssigkeit. Als Wirtszellen dienen dem Virus Zellen, die einen CD4-Rezeptor tragen,

also vornehmlich T-Helferzellen aber auch dendritische Zellen, Makrophagen und

Monocyten. Diese Zellen sind Kernkomponenten des menschlichen Immunsystems.[78]

Ein tieferes Verständnis der Schritte der HIV-Replikation ist unabdingbar für eine effiziente

und zielgerichtete Entwicklung antiretroviraler Wirkstoffe. Der Replikationszyklus des HIV,

welcher in Abb. 61 dargestellt ist, beginnt mit der Bindung des viralen Membranproteins

gp120 an den CD4-Rezeptor der Wirtszelle. Hierdurch wird eine Konformationsänderung des

Einleitung Teil II

52

viralen Glycoproteins gp41 ausgelöst, wodurch eine Interaktion des gp41 mit Corezeptoren

auf der Oberfläche der Wirtszelle, wie den Chemokinrezeptoren CCR5 oder CXCR4, möglich

wird. Durch die Bindung der beiden viralen Proteine an die Zellrezeptoren erfolgt die Fusion

der Virushülle mit der Zellmembran der Wirtszelle. Es folgt die Freisetzung des Capsids des

Virus mit dem einzelsträngigen RNA-Genom, tRNA-Primern und der viralen Proteine

Protease, Reverse Transkriptase (RT) und Integrase in das Cytoplasma der Wirtszelle. Im

Cytoplasma lagern sich die viralen tRNA-Primer an das Virusgenom an und die reverse

Transkription des Genoms durch die RT kann erfolgen. Zunächst entsteht eine RNA-DNA-

Hybridhelix, dessen RNA-Strang anschließend durch die RNase-H-Funktion der Reversen

Transkriptase hydrolysiert wird. Durch erneute Transkription des einzelsträngigen DNA-

Templats wird die provirale doppelsträngige DNA gebildet. Die RT besitzt keine proof-

reading-Funktion und keine Exonucleaseaktivität, was zu einer hohen Fehlerrate bei der

Transkription führt. Dies ist eine Ursache für die schnelle Resistenzbildung von HIV gegen

Wirkstoffe. Nach dem Transport der proviralen DNA in den Zellkern integriert die virale

Integrase die DNA in das Wirtsgenom. Dort verhält sich das Provirus wie ein zelluläres

Gen.[82,83]

Abb. 61: Replikationszyklus des HIV und Targets der antiretroviralen Therapie.[84]

Die Transkription der integrierten viralen DNA erfolgt durch die RNA-Polymerase der

Wirtszelle. Die gebildete RNA dient zum einen ungespleißt als neues Virusgenom und zum

anderen als mRNA sowohl gespleißt als auch ungespleißt zur Translation zu viralen

Vorläuferproteinen. Bei T-Helferzellen lagern sich die Vorläuferproteine und das Virusgenom

an der Cytoplasmamembran zusammen. Anschließend werden unreife Viruspartikel von der

Zelloberfläche freigesetzt. Die Reifung erfolgt durch die Spaltung der Vorläuferproteine durch

die virale Protease. Bei Monocyten und Makrophagen dagegen findet die

Zusammenlagerung der Virusbestandteile an intrazellulären Membranen statt, wie der des

Einleitung Teil II

53

endoplasmatischen Retikulums (ER), wobei die Viruspartikel in das Lumen des ER entlassen

werden. Hierdurch bilden Monocyten und Makrophagen Reservoirs des Erregers.[83]

Durch das Verständnis des Replikationszyklus des HIV wurden Targets für Wirkstoffe

ausgemacht, wie die viralen Proteine Reverse Transkriptase, Integrase und Protease. Aber

auch die Fusion des Viruspartikels mit der Zellmembran der Wirtszelle und der

anschließende Eintritt in die Zelle bieten Möglichkeiten in die Virusreplikation einzugreifen.

Kenntnisstand Teil II

54

6 Kenntnisstand

6.1 Wirkstoffe zur Behandlung von HIV-Infektionen

Schon sechs Jahre nach der Beschreibung der ersten AIDS-Fälle wurde 1987 das erste

Medikament gegen HIV von der U. S. Food and Drug Administration (FDA) in den USA

zugelassen. Es handelte sich um Zidovudin 69 (AZT), einen Reverse Transkriptase-Inhibitor.

Aufgrund der hohen Mutationsrate von HIV und der damit einhergehenden schnellen

Resistenzbildung gegen eingesetzte Wirkstoffe, gab es schon früh das Bestreben, möglichst

viele unterschiedliche Targets zu adressieren.[85,86] Bis heute zugelassene Medikamente

inhibieren die Reverse Transkriptase, die Protease, die Integrase und die Virusfusion mit der

Wirtszelle, jedoch ist noch immer keine Heilung möglich. Die ersten von der FDA

zugelassenen Wirkstoffe gegen die verschiedenen Targets sind in Abb. 62 dargestellt.

Abb. 62: HIV-Wirkstoffe Zidovudin 69, Saquinavir 70 und Raltegravir 71.[87]

Neben AZT 69 als Reverse Transkriptase-Inhibitor wurde mit Saquinavir 70 (SQV) 1995 der

erste Protease-Inhibitor zugelassen. Es folgten 2003 der erste Fusionsinhibitor Enfuvirtid

(T-20), ein 36 Aminosäuren langes Peptid, und 2007 der erste Integrase-Strangtransfer-

Inhibitor Raltegravir 71 (MK-0518). Die meisten heute zugelassenen Wirkstoffe sind Reverse

Transkriptase- und Protease-Inhibitoren.[88]

RT-Inhibitoren werden aufgrund ihrer Struktur und des damit verbundenen

Wirkmechanismus in zwei Klassen eingeteilt, die Nucleosidischen Reverse Transkriptase-

Inhibitoren (NRTIs) und die Nicht-Nucleosidischen Reverse Transkriptase-Inhibitoren

(NNRTIs).

NRTIs, wie Zidovudin 69, wirken als DNA chain terminator. Sie weisen strukturelle

Ähnlichkeit zu natürlichen Desoxynucleosiden auf, jedoch fehlt ihnen die 3‘-Hydroxylgruppe.

In ihrer Darreichungsform sind die NRTIs inaktiv und müssen zunächst durch zelluläre

Enzyme zum Triphosphat metabolisiert werden. Bei der Bildung der proviralen DNA

konkurrieren die ddNTPs dann mit den endogenen dNTPs als Substrat für die Reverse

Transkriptase. Die fehlende 3‘-Hydroxylgruppe der Analoga führt nach dem Einbau eines

Analogons zum Abbruch der Elongation und damit zum Abbruch der Virusreplikation.[86]

69

71

70


55

Bis heute wurden von der FDA neun NRTIs als Medikament gegen HIV zugelassen, neben

Zidovudin 69 (Abb. 62) Didanosin 72 (ddI) 1991, Zalcitabin 73 (ddC) 1992, Stavudin 74 (d4T)

1994, Lamivudin 75 (3TC) 1995, Abacavir 76 (ABC) 1998, Tenofovirdisoproxilfumarat 77

(TDF) 2001, Emtricitabin 78 (FTC) 2003 und Tenofoviralafenamid 79 (TAF) 2015, welche in

Abb. 63 dargestellt sind.[88,89]

Abb. 63: Zugelassene NRTIs gegen HIV: Didanosin 72 (ddI), Zalcitabin 73 (ddC), Stavudin 74 (d4T),

Lamivudin 75 (3TC), Abacavir 76 (ABC), Tenofovirdisoproxilfumarat 77 (TDF), Emtricitabin 78 (FTC)

und Tenofoviralafenamid 79 (TAF).[87,90]

Die neun zugelassenen NRTIs sind nach ihrer Metabolisierung Analoga aller vier endogenen

dNTPs. Abgesehen davon, dass alle Didesoxynucleoside sind, weisen sie verschiedenste

Modifikationen der Riboseeinheit auf. AZT 69 trägt eine 3‘-Azidfunktion und d4T 74 und ABC

76 eine Doppelbindung im Ribosering. Zudem ist ABC 76 ein carbocyclisches Analogon, bei

dem der Riboseringsauerstoff durch eine Methylengruppe ausgetauscht ist. 3TC 75 und FTC

78 sind unnatürliche L-Zucker, die einen Oxathiolanring aufweisen. TDF 77 und TAF 79 sind

Nucleotidanaloga, bei denen ein acyclischer Linker die Nucleobase mit der Phosphateinheit,

welches hier ein Phosphonat ist, verbindet. Modifikationen an der Nucleobase haben

dagegen nur ABC 76 und FTC 78.

Im Gegensatz zu den NRTIs wirken NNRTIs als nicht-kompetitive Inhibitoren der HIV-1-RT.

Sie binden in einer hydrophoben Tasche der Reversen Transkriptase nahe dem aktiven

Zentrum der Polymerase. Dies führt zu einer Konformationsänderung der dNTP-

Bindungsstelle, wodurch die Bindung von Nucleosidtriphosphaten inhibiert wird. Somit ist bei

NNRTIs keine Aktivierung durch intrazelluläre Phosphorylierung notwendig. Jedoch bilden

sich sehr schnell resistente Viren, da für eine Resistenz gegen NNRTIs nur eine Mutation

ausreicht. Aus diesem Grund werden sie ausschließlich in Kombinationstherapien

77 79

78

72 75 73 74 76


56

eingesetzt.[85,86] Als erster Vertreter der NNRTIs wurde Nevirapin 80 1996 in den USA als

HIV-Medikament zugelassen. Es folgten Delavirdin 81 (1997), Efavirenz 82 (1998), Etravirin

83 (2008) und Rilpivirin 84 (2011), welche in Abb. 64 dargestellt sind.[88]

Abb. 64: Nicht-Nucleosidische Reverse Transkriptase-Inhibitoren Nevirapin 80, Delavirdin 81,

Efavirenz 82, Etravirin 83 und Rilpivirin 84.[87]

6.2 Combined antiretroviral therapy (cART)

Einen Durchbruch bei der Behandlung von HIV-Infektionen schaffte die 1996 eingeführte

combined antiretroviral therapy (cART), die zu einer starken Abnahme der durch AIDS

verursachten Todesfälle führte und es dadurch zu einer behandelbaren, chronischen

Infektionskrankheit wurde. Diese Behandlungsmethode basiert auf der Kombination von

mehreren Wirkstoffen mit unterschiedlichen viralen Targets, was durch die Zulassung von

Saquinavir 70 1995 und Nevirapin 80 1996 möglich wurde. Somit bestand die Kombination

anfangs aus zwei NRTIs und einem NNRTI oder Protease-Inhibitor. Heutzutage werden

mindestens drei unterschiedliche Wirkstoffe, die mindestens zwei unterschiedliche Targets

adressieren, eingesetzt, wobei meistens die Grundlage immer noch NRTIs bilden.

Die Kombinationstherapie hat eine Reihe von Vorteilen gegenüber der Monotherapie. Durch

synergistische Effekte und unterschiedliche Toxizitätsprofile kann die Dosis der einzelnen

Wirkstoffe reduziert und somit toxische Nebeneffekte minimiert werden. Zudem wird durch

die Adressierung unterschiedlicher Targets die Replikationsrate des Virus und damit die

Viruslast effektiver reduziert, wodurch sich gleichzeitig die Bildungsrate von Mutanten

verringert. Weiterhin wird die Ausbildung von Resistenzen deutlich komplexer, da das Virus

Resistenzen gegen eine Bandbreite an Wirkstoffen ausbilden muss. Somit kann die

Kombinationstherapie deutlich länger zur Behandlung von HIV-Infektionen eingesetzt

werden, als die Therapie mit nur einem Wirkstoff, bei der die Wirksamkeit durch

Resistenzbildung in den meisten Fällen auf drei bis sechs Monate beschränkt ist.[85,86,91]

Im Jahr 2006 wurde Atripla® zugelassen. Dies ist eine Fixdosis-Kombinationstablette, auch

single-tablet regimen (STR) genannt, bestehend aus den NRTIs TDF 77, FTC 78 und dem

NNRTI Evafirenz 82. Damit mussten Patienten erstmals nur eine Tablette pro Tag

einnehmen. Es folgten 2011 Complera® (TDF 77, FTC 78 und Rilpivirin 84) und 2012

80

84 82

81 83


57

Stribild® (TDF 77, FTC 78, Elvitegravir und Cobicistat). Die beiden Kombinationen wurden

2015 und 2016 als Genvoya® und Odefsey® auch mit Tenofoviralafenamid 79 anstatt TDF 77

von der FDA zugelassen. Diese einfache Einnahmeform von einer Tablette pro Tag schaffte

eine starke Verbesserung der Lebensqualität von HIV-Patienten und damit sind heutzutage

Tenofovir (77 und 79) und Emtricitabin 78 die am häufigsten verschriebenen Arzneimittel

gegen HIV.[88-92]

6.3 Phosphorylierung zum antiviral aktiven Nucleosidtriphosphat

Wie schon in Abschnitt 6.1 beschrieben, müssen Nucleosidische Reverse Transkriptase-

Inhibitoren intrazellulär in ihre biologisch aktive Triphosphatform metabolisiert werden. Dass

die notwenigen Schritte effizient ablaufen, ist von vielen verschiedenen Faktoren abhängig.

Zunächst muss die Zellaufnahme durch passive Diffusion oder Transporter-vermittelten

Transfer stattfinden. Besonders interessant sind hier konzentrationsabhängige

Nucleosidtransporter, die Nucleoside in die Zelle jedoch auch aus der Zelle heraus

transportieren. Intrazellulär ist die Phosphorylierung abhängig von der Konzentration und

Umsatzgeschwindigkeit von phosphorylierenden und dephosphorylierenden Enzymen und

dem Verhältnis von ddNTPs zu dNTPs.[93-95]

Der erste Phosphorylierungsschritt zum Monophosphat erfolgt durch cytosolische und

mitochondriale Desoxynucleosid-Kinasen, die für die Umsetzung von endogenen

Nucleosiden zu den entsprechenden Monophosphaten verantwortlich sind. Die involvierten

cytosolischen Kinasen sind die Desoxycytidin-Kinase und die Thymidin-Kinase 1. Die

beteiligten mitochondrialen Kinasen sind die Thymidin-Kinase 2 und die Desoxyguanosin-

Kinase. Die Umsetzung der Analoga zum Diphosphat wird durch die zellulären NMP-Kinasen

Thymidylat-Kinase, Uridylat-Cytidylat-Kinase, die Adenylat-Kinasen 1 bis 5 und die Guanylat-

Kinasen katalysiert. Der letzte Schritt zum antiviral aktiven Nucleosidtriphosphat kann durch

eine Reihe an Kinasen katalysiert werden, wie der NDP-Kinase, der Phosphoglyceratkinase,

der Pyruvatkinase und der Creatinkinase, wodurch dieser Schritt durch die Vielzahl und die

breite Substrattoleranz der Kinasen meist effektiv abläuft.[93-95]

Die Menge an gebildetem antiviral aktiven Triphosphat aus den entsprechenden inaktiven

Nucleosidanaloga ist oft limitiert durch den ersten Phosphorylierungsschritt aufgrund der

Substratspezifität der beteiligten Kinasen. Zudem hängt die Expression dieser Kinasen stark

vom Zelltyp und dem Aktivierungszustand der Zellen ab, was besonders bei den Thymidin-

Kinasen eine Rolle spielt. Somit zeigen die Analoga nicht in allen HIV-infizierten Zellen die

gleiche antivirale Aktivität. Auch die Kinase-katalysierten Reaktionen zum Di- und

Triphosphat können ineffizient sein.[94,95]

Es wäre wünschenswert diese ineffizienten Phosphorylierungsschritte zu umgehen. Es ist

jedoch nicht möglich direkt die entsprechenden Nucleotide zu verabreichen, da Phosphate


58

schnell durch enzymatischen Abbau zersetzt werden und aufgrund ihrer negativen Ladung

die Membranpermeabilität nicht gegeben ist. Aus diesen Gründen wurden verschiedenste

Nucleotid-Prodrugkonzepte entwickelt, die diese Probleme lösen.

6.4 Nucleosidmonophosphat-Prodrugs

Definitionsgemäß sind Prodrugs Substanzen, „die selbst biologisch weitgehend inaktiv sind,

die aber im Organismus - enzymatisch oder nichtenzymatisch - in eine aktive Form

umgewandelt werden“.[96] Die Anforderungen an ein Nucleotid-Prodrug sind eine

ausreichende Stabilität außerhalb der Zelle und eine schnelle intrazelluläre Freisetzung des

Nucleotids. Zudem dürfen die abgespaltenen Maskierungseinheiten nicht toxisch sein.

In der HIV-Therapie erfolgreich eingesetzte Nucleosidmonophosphat-Prodrugs sind die

Tenofovir-Prodrugs Tenofovirdisoproxilfumarat 77 (TDF) und Tenofoviralafenamid 79 (TAF)

(s. Abschnitt 6.1). Das NMP-Analogon Tenofovir 85 (TFV) und dessen Prodrugs sind in

Abb. 65 dargestellt.

Abb. 65: Tenofovir 85 und dessen Prodrugs TDF 77 und TAF 79.

Das Prodrug Tenofovirdisoproxilfumarat 77 hat als Masken der Phosphonateinheit zwei

Isopropyloxycarbonyloxymethyl-Gruppen (BisPOC-Prodrug). Die Abspaltung der Masken

wird durch eine Carbonatspaltung, katalysiert durch Esterasen, initiiert. Anschließend

entsteht durch Abspaltung von Kohlenstoffdioxid und Formaldehyd ein monomaskiertes

Intermediat. Über den gleichen Weg wird auch die zweite Maske abgespalten und Tenofovir

85 freigesetzt, was dann durch zelluläre Kinasen zum Tenofovir-Diphosphat phosphoryliert

wird.[97]

Tenofoviralafenamid 79 ist ein Phosphoramidat-Prodrug, ein sogenanntes ProTide. Dieses

Prodrugkonzept wurde von MCGUIGAN entwickelt.[98] Hierbei sind die negativen Ladungen

der Phosphonatgruppe durch einen Arylsubstituenten und einen Aminosäureester maskiert.

Im Fall des TAF 79 sind dies ein Phenyl- und ein L-Alaninisopropylestersubstituent. Nach der

Zellaufnahme werden diese Masken in zwei enzymatischen Schritten abgespalten und das

entsprechende Nucleosidanalogon freigesetzt. Im ersten Schritt wird abhängig vom Zelltyp

von der Hydrolase Cathepsin A oder der Carboxyesterase 1 der Isopropylester gespalten.

Die freie Säure greift anschließend intramolekular nucleophil das Phosphoratom an, wodurch

85 79 77


59

der Arylsubstituent abgespalten wird. Der dabei entstehende instabile Fünfring wird durch

Wasser wieder zum Phosphoramidat geöffnet. Abschließend katalysiert eine

Phosphoramidase die Spaltung der P-N-Bindung und Tenofovir 85 wird freigesetzt.[97]

Aryloxyphosphoramidat-Prodrugs werden nicht nur erfolgreich in der HIV-Therapie

eingesetzt. Das ProTide Sofosbuvir wird zur Behandlung von Hepatitis-C-Virus (HCV)-

Infektionen verwendet und eine Reihe weiterer vielversprechender Prodrugs gegen HIV,

HCV und Krebs befinden sich in klinischen Studien.[97,99]

Neben diesen Prodrugkonzepten wurden noch eine Reihe weiterer, erfolgreicher Ansätze

entwickelt. In Abb. 66 sind einige Konzepte in einer Übersicht zusammengestellt.

Das erste Pronucleotidkonzept wurde 1984 von SRIVASTVA publiziert.[100] Hierbei wurden die

negativen Ladungen an der Phosphatgruppe durch zwei Pivaloyloxymethyl-Gruppen

maskiert, wonach sich die Abkürzung BisPOM-Prodrug ableitet. Ein in der Hepatitis-B-Virus

(HBV)-Therapie erfolgreich eingesetztes BisPOM-Prodrug ist Adefovirdipivoxil.[101] Der erste

Schritt zur Freisetzung des Monophosphats ist die durch Esterasen katalysierte Abspaltung

der Pivaloylgruppe. Das entstandene instabile Hydroxylmethylalkoholat zerfällt anschließend

zu Formaldehyd und dem Nucleosidmonophosphat. Der Spaltungsmechanismus ist somit

sehr ähnlich zu dem der BisPOC-Prodrugs, bei denen zwei Isopropyloxycarbonyloxymethyl-

Gruppen als Maskierungseinheiten fungieren.

Abb. 66: Verschiedene Nucleosidmonophosphat-Prodrugkonzepte.

Eine organspezifische Freisetzung bietet das HepDirect-Konzept. Die Metabolisierung der

Prodrugs erfolgt hauptsächlich in der Leber durch Cytochrom P450-Enzyme und ist somit

ideal geeignet für Medikamente, die spezifisch in der Leber freigesetzt werden und dort


60

wirken sollen. HepDirect-Prodrugs sind Aryl-substituierte cyclische 1,3-Propanylester.

Dadurch, dass die Maske ein cyclisches System darstellt, wird im Gegensatz zu den bisher

vorgestellten Prodrugkonzepten nur eine Maskierungseinheit pro Nucleotid freigesetzt. Nach

der Oxidation durch Cytochrom P450-Enzyme erfolgt eine Ringöffnung mit anschließender β-

Eliminierung, so dass die freie Phosphatgruppe erhalten wird. Das zusätzlich gebildete

Arylvinylketon wird durch die Reaktion mit Glutathion abgefangen.[102] Aufgrund der

bevorzugten Metabolisierung in der Leber bietet sich an, dies bei der Behandlung von

Hepatitis-Infektionen auszunutzen. Zurzeit befinden sich mit Pradefovir und MB07133 zwei

HepDirect-Prodrugs zur Behandlung von HBV-Infektionen und Hepatozellulären Karzinomen

in klinischen Studien.[97]

Ein weiterer Ansatz sind Alkoxyalkylmonoester-Prodrugs, im speziellen die

Hexadecyloxypropylmonoester-Prodrugs, kurz HDP-Prodrugs. Die Prodrugs sollen

Lysophosphatidylcholin (LPC) imitieren, um die natürlichen Aufnahmewege des LPCs zu

nutzen. Bei diesen LPC-Analoga ist der Cholinrest gegen ein Nucleosidanalogon

ausgetauscht. Bei den HDP-Prodrugs ist damit nur ein Sauerstoffatom anstatt der zwei

möglichen maskiert, somit wird wie bei den HepDirect-Prodrugs nur eine Maskierungseinheit

pro Nucleotid freigesetzt. Die Metabolisierung zum Nucleosidmonophosphat erfolgt durch

Phospholipasen.[103,104] In klinischen Studien befinden sich zurzeit die HDP-Prodrugs

Brincidofovir als Prophylaxe gegen eine Cytomegalievirus-Infektion und HDP-Tenofovir als

HIV-Medikament.[97]

Bei dem BisAB-Konzept werden zwei 4-Acyloxybenzyleinheiten zur Maskierung der

Phosphatgruppe verwendet.[105] Dieses Konzept bildet die Grundlage von

vielversprechenden Nucleosiddi- und -triphosphat-Prodrugs. Auf den Abspaltungs-

mechanismus der Masken und die Weiterentwicklung dieses Ansatzes wird in

Abschnitt 6.5.1 noch genauer eingegangen.

Bisher wurden nur Konzepte vorgestellt, die auf einer enzymatischen Aktivierung zur

Freisetzung des Monophosphats beruhen. Bei dem cycloSal-Ansatz dagegen erfolgt eine

pH-Wert-abhängige, chemische Abspaltung der Maskierungseinheit. Da auf diesem Konzept

ein Schwerpunkt dieser Arbeit liegt, soll darauf im Folgenden genauer eingegangen werden.

6.4.1 cycloSal-Prodrugs

Bei den cycloSal-Prodrugs fungiert ein Salicylalkohol als Maske, der sich durch pH-

abhängige chemische Hydrolyse abspalten lässt. Die cycloSal-Pronucleotide weisen drei

unterschiedliche Phosphatesterbindungen auf, die Phenyl- und Benzylesterbindung der

Maske und die Alkylesterbindung, über die das Nucleosidanalogon gebunden ist. Hierdurch

wird ein selektiver Hydrolyseprozess möglich. Wie bei den HepDirect- und den HDP-


61

Prodrugs wird auch bei den cycloSal-Prodrugs nur eine Maskeneinheit pro Nucleotid

freigesetzt.

Der Hydrolysemechanismus der cycloSal-Prodrugs ist in Abb. 67 dargestellt. Zunächst

erfolgt ein nucleophiler Angriff eines Hydroxidions an das Phosphoratom des cycloSal-

Phosphattriesters. Hierdurch wird das Phenolat in einer SNP-Reaktion verdrängt, da die

negative Ladung über den aromatischen Ring delokalisiert werden kann und damit das

Phenolat die beste Abgangsgruppe ist. Es entsteht ein 2-Hydroxybenzylphosphatdiester,

wodurch sich der ortho-Substituent des Benzylesters von einem sehr schwachen zu einem

starken Elektronendonor verändert hat. Die damit einhergehende Destabilisierung führt über

einen intramolekularen Protonentransfer zu einem spontanen Zerfall des

Benzylphosphatdiesters, bei dem das Nucleosidmonophosphat und der entsprechende

Salicylalkohol freigesetzt werden.[106,107]

Abb. 67: Hydrolysemechanismus der cycloSal-Prodrugs (bearbeitet nach [106]).

Eine unerwünschte Nebenreaktion ist die Spaltung der Benzylesterbindung. Der gebildete

negativ geladene Phenylphosphatdiester ist extrem resistent gegenüber weiterer chemischer

Hydrolyse oder enzymatischer Zersetzung. Somit führt dieser Weg nicht zur Freisetzung des

Nucleosidmonophosphats. Die Spaltung der Benzylesterbindung findet jedoch nur in

untergeordnetem Maße statt, da der Phosphatrest in ortho-Position die Bindung stabilisiert,

was durch zusätzliche Akzeptorsubstituenten in ortho- oder para-Position zur benzylischen

Esterbindung weiter minimiert werden kann.[106,107]

Das cycloSal-Konzept wurde erfolgreich auf verschiedenste Nucleosidanaloga angewendet.

Dabei konnte gezeigt werden, dass die Nucleoside keinen Einfluss auf den Hydrolyseweg

haben. Die in vitro Evaluierung mit cycloSal-d4TMP-Prodrugs konnte den Erfolg des

Konzepts bestätigen. Hierbei wurde die antivirale Wirksamkeit gegen HIV-1 und HIV-2 in

T-Lymphozytzellen getestet und vergleichbare oder höhere Aktivität in Bezug auf d4T 74

festgestellt. Da bei d4T 74 der erste Phosphorylierungsschritt der geschwindigkeits-


62

bestimmende Schritt zur Bildung des biologisch aktiven Nucleosidtriphosphats ist, wurden

zur Überprüfung des Konzepts auch Thymidinkinase-defiziente Zellen verwendet. Hierbei

konnte mit den cycloSal-Prodrugs im Gegensatz zu d4T 74 die vollständige antivirale

Wirksamkeit erhalten werden. Daraus lässt sich schließen, dass die Prodrugs erfolgreich in

die Zellen aufgenommen werden, das Monophosphat intrazellulär freigesetzt wird und die

Metabolisierung zum Triphosphat unabhängig von der Thymidinkinase abläuft.[106] Dies

wurde ebenfalls durch die Verwendung von Tritium-markierten Prodrugs bestätigt.[108]

Trotz der vielversprechenden Ergebnisse gab es Bestrebungen das Konzept weiter zu

verbessern, da eine hohe intrazelluläre Konzentration des Prodrugs wünschenswert wäre,

um damit auch eine hohe Konzentration an freigesetztem Nucleosid zu erreichen. Dies ist

jedoch mit den cycloSal-Prodrugs der ersten Generation nicht möglich, da sich wegen des

lipophilen Charakters der Prodrugs ein Konzentrationsgleichgewicht über die Zellmembran

einstellt. Zudem findet die chemische Hydrolyse der Prodrugs auch extrazellulär aufgrund

des ähnlichen pH-Werts statt. Somit wurde bei der Weiterentwicklung des Ansatzes zu den

cycloSal-Triestern der zweiten und dritten Generation versucht, dieses Problem zu beheben.

Die Idee war es, eine schnelle intrazelluläre, enzymatische Metabolisierung des Prodrugs zu

einer polaren Substanz zu erreichen, so dass die Bildung des Konzentrationsgleichgewichts

über die Zellmembran unterbunden wird. Dies ist mit Beispielen von cycloSal-Prodrugs der

zweiten und dritten Generation in Abb. 68 illustriert.

Die zweite Generation der cycloSal-Pronucleotide, auch „lock-in“-cycloSal-Pronucleotide

genannt, tragen eine durch Esterasen spaltbare Estergruppe am aromatischen Ring,

verbrückt durch einem Alkylspacer. Durch eine schnelle intrazelluläre Metabolisierung durch

Esterasen wird ein polares Säureintermediat gebildet, wodurch eine Anreicherung des

Intermediats in den Zellen stattfindet. Jedoch wird daraus das Monophosphat durch

chemische Hydrolyse nur sehr langsam freigesetzt, da das negativ geladene Intermediat

eine hohe Stabilität aufweist. Bei den cycloSal-Prodrugs der dritten Generation erfolgt eine

enzymatische Aktivierung. Es entsteht nach der Metabolisierung durch Esterasen eine direkt

am aromatischen Ring gebundene Aldehydgruppe, die ein starker Elektronenaktzeptor ist.

Hierdurch findet anschließend eine schnelle chemische Hydrolyse unter Freisetzung des

gewünschten Monophosphats statt. Jedoch wurde auch mit dieser Methode keine

verbesserte antivirale Aktivität gegenüber den cycloSal-Prodrugs der ersten Generation

erreicht, was auf die zu geringe extrazelluläre Stabilität zurückzuführen ist.[109,110]


63

Abb. 68: cycloSal-Prodrugs der zweiten und dritten Generation und deren Zellaufnahme und

Metabolisierung (bearbeitet nach [109]).

Da cycloSal-Prodrugs drei unterschiedliche Substituenten am Phosphoratom aufweisen, sind

sie chirale Moleküle und liegen bei der üblichen Synthese als Gemisch zweier

Diastereomere vor. Diese weisen jedoch signifikante Unterschiede in ihrer Hydrolyse-

geschwindigkeit und antiviralen Aktivität auf. Somit wurden stereoselektive Syntheserouten

mit Auxiliaren entwickelt und dadurch auch diastereomerenreine Prodrugs zugänglich

gemacht.[111,112]

6.5 Nucleosiddi- und -triphosphat-Prodrugs

Es wurden, wie in dem vorherigen Abschnitt 6.4 beschrieben, in den letzten Jahrzehnten

eine ganze Reihe an verschiedenen NMP-Prodrugkonzepten entwickelt. Ansätze für

Nucleosiddi- und triphosphat-Prodrugs wurden dagegen kaum publiziert. Dabei kann auch

der zweite und dritte Phosphorylierungsschritt der Nucleosidanaloga zum biologisch aktiven

Triphosphat ineffizient sein. Somit gibt es einen Bedarf, möglichst alle Phosphorylierungs-

schritte zum aktiven Wirkstoff zu umgehen. Jedoch ist die Entwicklung von Konzepten für


64

NDP- und NTP-Prodrugs aufgrund der instabilen Phosphoranhydridbindungen deutlich

komplexer. Phosphoranhydridbindungen sind nur durch die negativen Ladungen kinetisch

stabilisiert, da dadurch ein nucleophiler Angriff am Phosphoratom erschwert wird. Wenn die

Ladungen allerdings lipophil maskiert werden, was das Grundprinzip der meisten NMP-

Prodrugkonzepte ist, wird die Bindung deutlich labiler und dadurch die selektive Freisetzung

des gewünschten Metaboliten unwahrscheinlicher. Aus diesem Grund wurde bei allen bis

jetzt publizierten Ansätzen für NDP- und NTP-Prodrugs nur die endständige Phosphatgruppe

maskiert, um eine gewisse Stabilität der Anhydridbindung durch die verbliebenen negativen

Ladungen zu erreichen.

Die meisten NDP- und NTP-Prodrugkonzepte wurden für AZT 69 entwickelt, da die

Eigenschaften des bereits in Abschnitt 6.1 vorgestellten Nucleosidanalogons intensiv

untersucht worden sind und bekannt ist, dass der zweite Phosphorylierungsschritt zum

Zidovudindiphosphat geschwindigkeitsbestimmend ist. Dies führt zu einer intrazellulären

Akkumulation des AZTMPs, was für einige Nebenwirkungen von Zidovudin 69 verantwortlich

gemacht wird.

In Abb. 69 sind drei ausgewählte Ansätze für NDP- und NTP-Prodrugs zusammengefasst.

Abb. 69: Ansätze für NDP- und NTP-Prodrugs.

Ein Ansatz ist die Nutzung von Acyl- und Alkylglycerideinheiten zur Maskierung der

endständigen Phosphateinheit. NDP-Diglyceride setzen jedoch intrazellulär nur das

Nucleosidmonophosphat frei, da die Spaltung der Pyrophosphatbindung schneller abläuft als

die Metabolisierung der Maskeneinheit durch Enzyme, die zur Freisetzung des Diphosphats

führen würde.[113,114] Auch AZTTP-Diglyceride wurden erfolgreich synthetisiert, jedoch wurden

auch hier nur AZT 69 und AZTMP in Enzymassays freigesetzt.[115]

Der zweite dargestellte Ansatz beruht auf der Verwendung von lipophilen Acylketten am β-

bzw. γ-Phosphat. Der lipophile Acylrest sollte die notwendige Membrangängigkeit des

negativ geladenen Nucleotids gewährleisten. Zudem wurde angenommen, dass die

Hydrolyse des gemischten Carboxylphosphoranhydrids schneller ablaufen sollte als die

Spaltung der Phosphoranhydridbindung. Dies konnte in Puffer und Kulturmedium erfolgreich

bestätigt werden. Es wurde aus dem AZTDP-Prodrug bzw. dem AZTTP-Prodrug selektiv das

AZT-Diphosphat bzw. das AZT-Triphosphat freigesetzt. Jedoch konnte keine gesteigerte

antivirale Aktivität der Prodrugs im Vergleich zu AZT 69 festgestellt werden. Es wird davon


65

ausgegangen, dass aufgrund der Labilität der Verbindungen kein effektiver Transport in den

intrazellulären Raum stattfindet, da der Hauptteil bereits extrazellulär zersetzt wird.[116]

Das bereits in Abschnitt 6.4.1 vorgestellte cycloSal-Konzept wurde auch als Ansatz für

Nucleosiddiphosphat-Prodrugs verwendet. Jedoch wird bei der Hydrolyse von 3-Methyl-

cycloSal-AZTDP in Phosphatpuffer aufgrund der labileren Phosphoranhydridbindung im

Vergleich zur Benzylesterbindung hauptsächlich das Zidovudinmonophosphat und nur in

untergeordnetem Maße das Zidovudindiphosphat freigesetzt.[117]

Das erste NDP-Prodrugkonzept, das eine erfolgreiche intrazelluläre Freisetzung des

Nucleosiddiphosphats realisieren konnte, war das DiPPro-Konzept, welches auch erfolgreich

auf Nucleosidtriphosphate übertragen werden konnte. Dieses TriPPPro-Konzept war

ebenfalls das erste Konzept, was eine erfolgreiche intrazelluläre Freisetzung des

Nucleosidtriphosphats erreichen konnte.

6.5.1 DiPPro- und TriPPPro-Verbindungen

Die DiPPro-Verbindungen (Diphosphat-Prodrugs) wurden erstmal von JESSEN und MEIER

2008 publiziert[118] und von SCHULZ und GOLLNEST auf Triphosphate (TriPPPro)

übertragen.[119-121] Das Konzept beruht auf den von THOMSON entwickelten BisAB-Prodrugs

(Abschnitt 6.4), die die enzymatisch aktivierbaren 4-Acyloxybenzylgruppen zur Maskierung

der Phosphatgruppe nutzen.[105] Bei den DiPPro- und TriPPPro-Verbindungen erfolgt die

Maskierung der negativen Ladungen am β- bzw. γ-Phosphat ebenfalls durch zwei

4-Acyloxybenzylgruppen. Die negativen Ladungen der weiteren Phosphatgruppen bleiben

unmaskiert, da die Phosphorsäureanhydrid-Bindung damit stabilisiert wird. Durch die Wahl

der enzymatisch aktivierbaren Masken, gegenüber der chemisch aktivierbaren, bleibt die

Phosphoranhydridbindung bei der Abspaltung vollständig unbeteiligt, so dass eine hohe

chemische Stabilität der Prodrugs erreicht werden kann. Eine selektive intrazelluläre

Freisetzung wird durch die Nutzung von Esterasen bei der Aktivierung der Masken aufgrund

ihrer hohen intrazellulären Konzentration erreicht.[117,118]

Der Abspaltungsmechanismus der 4-Acyloxybenzylgruppen ist in Abb. 70 dargestellt. Die

Initiierung der Freisetzung der Maskeneinheiten erfolgt, wie bereits erwähnt, durch Hydrolyse

des phenolischen Acylesters durch Esterasen. Die daraus resultierende Umwandlung des

Akzeptor- in einen Donorsubstituenten hat eine Destabilisierung der Benzylphosphatester-

bindung zur Folge. Dies führt zu einem spontanen Zerfall des Intermediats über eine 1,6-

Eliminierung in 4-Hydroxybenzylalkohol und ein monomaskiertes NMP, NDP bzw. NTP. Die

Abspaltung der zweiten Maske findet auf dem gleichen Weg statt, so dass es anschließend

zur Freisetzung des entsprechenden Nucleotids kommt.[105,118]


66

Abb. 70: Enzymatischer Spaltungsmechanismus der 4-Acyloxybenzyl-Maskierungseinheiten.

Die chemische Stabilität der DiPPro- und TriPPPro-Verbindungen korreliert mit der

Acylkettenlänge. Je länger der Alkylrest ist, desto stabiler ist das Prodrug. Jedoch nimmt mit

steigender Kettenlänge auch der Anteil des gebildeten Monophosphats bzw. Diphosphats zu,

das durch Spaltung der Phosphoranhydridbindung entsteht. Somit lässt sich mit der Wahl

des Acylrests nicht nur die Lipophilie, sondern auch die Stabilität der Prodrugs und deren

Metabolisierung steuern. Bei der chemischen Hydrolyse des monomaskierten Intermediats in

Phosphatpuffer (pH 7.3) entsteht selektiv das Nucleosiddiphosphat bzw. -triphosphat, da die

zusätzliche negative Ladung am endständigen Phosphat den nucleophilen Angriff auf das

Phosphoratom erschwert.[121-123]

Die Abspaltung der zweiten Maske verläuft deutlich langsamer als die der ersten Maske, da

die Abspaltung der zweiten Maske über einen anderen Mechanismus abläuft als die

Hydrolyse der ersten Maske. Die unterschiedlichen Hydrolysewege sind in Abb. 71

dargestellt. Die chemischen Hydrolysemechanismen wurden mit TriPPPro-Verbindungen

aufgeklärt. Es ist jedoch davon auszugehen, dass die Ergebnisse ihre Gültigkeit auch für die

Diphosphat-Prodrugs behalten.[121,123]

Abb. 71: Chemische Hydrolyse der DiPPro- und TriPPPro-Verbindungen.

Die Hydrolyse der ersten Maske erfolgt durch nucleophile Substitution am

Benzylkohlenstoffatom (Weg A). Diese Reaktion läuft schneller ab, als die Spaltung des


67

Acylesters. Als unerwünschte Nebenreaktion wird auch die Phosphoranhydridbindung

gespalten (Weg B). Diese beiden Wege sind bei der Hydrolyse der zweiten Maske, aufgrund

der gebildeten negativen Ladung an der endständigen Phosphatgruppe, nicht mehr möglich.

Stattdessen wird der Acylester gespalten und das Diphosphat bzw. das Triphosphat selektiv

freigesetzt (Weg C).[121,123]

Die enzymatische Hydrolyse der Prodrugs wurde in T-Lymphozyt-CEM-Zellextrakt evaluiert.

Hierbei konnte die erfolgreiche Freisetzung des Nucleosiddiphosphats bzw. -triphosphats

aus den Prodrugs bestätigt werden. Die Hydrolysehalbwertszeiten der Prodrugs lagen dabei

deutlich unter denen der chemischen Hydrolyse, was die postulierte enzymatische

Aktivierung bestätigt. Bei den Studien wurde zudem die gleiche Korrelation zwischen

Acylkettenlänge und Stabilität wie bei den chemischen Hydrolysen festgestellt.

Zudem wurde eine antivirale Evaluation durchgeführt. DiPPro-d4TDP- und TriPPPro-d4TTP-

Verbindungen mit unterschiedlichen Acylresten wurden auf ihre anti-HIV-Aktivität in Wildtyp

CEM/0-Zellen und mutierten Thymidinkinase-defizienten CEM/TK--Zellen untersucht. Durch

die Messung der antiviralen Aktivität in Thymidinkinase-defizienten Zellen können

Rückschlüsse auf die Membranpermeabilität der Prodrugs geschlossen werden. In den

Wildtyp-Zellen zeigen die meisten Prodrugs eine vergleichbare Aktivität gegen HIV wie das

Nucleosidanalogon d4T 74. Bei den Assays mit TK--defizienten Zellen zeigen die

Verbindungen mit kürzeren Ketten einen Verlust ihrer Aktivität. Dieser Aktivitätsverlust ist auf

eine geringe Stabilität im RPMI-1640/FCS-Inkubationsmedium und auf eine geringere

Membranpermeabilität zurückzuführen. Bei den Verbindungen mit langen Acylketten bleibt

jedoch die antivirale Aktivität vollständig erhalten. Diese Ergebnisse belegen, dass eine

Diffusion der Prodrugs durch die Zellmembran gegeben ist und phosphorylierte d4T-

Metabolite intrazellulär freigesetzt werden.[117,121]

Trotz der erfolgreichen Evaluation des Konzeptes, sollte die unerwünschte Nebenreaktion

der Spaltung der Pyrophosphatbindung durch Weiterentwicklung der Prodrugs weiter

minimiert werden. Der Anteil an freigesetztem Monophosphat aus den DiPPro-Verbindungen

korreliert mit der chemischen Stabilität der Prodrugs, die wiederum von der Acylkettenlänge

abhängt. Je länger die Acylkette ist, desto stabiler ist das Prodrug gegenüber chemischer

und enzymatischer Hydrolyse. Mit der Stabilität der DiPPro-Verbindungen steigt jedoch auch

der Anteil an freigesetztem Monophosphat bei der Hydrolyse in Phosphatpuffer und

Zellextrakt. Die Spaltung der Phosphoranhydridbindung wurde jedoch nur bei dem ersten

Schritt der Hydrolyse der DiPPro-Verbindungen beobachtet. Aus dem monomaskierten

Intermediat wurde selektiv das gewünschte Diphosphat gebildet. Somit wurden von

WEINSCHENK nicht-symmetrische DiPPro-Verbindungen mit zwei unterschiedlichen

Maskeneinheiten entwickelt.[124] Hierbei wurde für die erste Maske eine kurze Alkylkette als

Acylrest verwendet. Diese wird schnell chemisch oder enzymatisch abgespalten, sodass


68

schnell eine negative Ladung an der endständigen Phosphatgruppe entsteht. Hierdurch wird

die Stabilität der Phosphoranhydridbindung erhöht. Die zweite Maske trägt als Rest eine

lange Alkylkette, die für eine ausreichende Lipophilie und Stabilität des Prodrugs sorgt.

Durch diesen Ansatz konnte die unerwünschte Nebenreaktion verringert und eine selektivere

Freisetzung des Nucleosiddiphosphats aus den DiPPro-Verbindungen erreicht werden.[124]

Es wurde ebenfalls eine nicht-symmetrische TriPPPro-Verbindung von GOLLNEST publiziert,

die auch vielversprechende Ergebnisse in Bezug auf ihre Hydrolyseeigenschaften in

Zellextrakt und ihre antivirale Aktivität gezeigt hat.[123]

Die bisherigen Ergebnisse sprechen für den Erfolg der DiPPro- und TriPPPro-Konzepte.

Jedoch bietet der Nachweis der Zellaufnahme, über die antivirale Aktivität in Thymidinkinase-

defizienten Zellen, nur einen indirekten Beweis für die erfolgreiche Diffusion der Prodrugs

durch die Zellmembran. Auf die von GOLLNEST durchgeführten Zellaufnahmestudien[120] wird

in Abschnitt 6.6.1 eingegangen. Somit ist dies alleine kein ausreichender Beweis für die

Membranpermeabilität der Verbindungen. Zudem lassen die antiviralen Daten nur geringe

Rückschlüsse auf die Metabolisierung der Prodrugs zu. Es kann damit nicht eindeutig gesagt

werden, ob auch wirklich intrazellulär das Nucleosiddi- bzw. -triphosphat freigesetzt wird. Es

ist somit ein weiterer Ansatz zur Validierung der Eigenschaften der Verbindungen zwingend

erforderlich.

6.6 Evaluierung der Zellaufnahme von Prodrugs

Für die Untersuchung der Zellaufnahmeeigenschaften von Nucleosidanaloga können

verschiedene Methoden verwendet werden. Eine häufig verwendete Methode ist die

radioaktive Markierung. Durch die Nutzung Tritium-markierter cycloSal-Prodrugs, konnte

bereits die erfolgreiche Zellaufnahme der Pronucleotide bestätigt und ihre Metabolisierung

verfolgt werden.[125,126] Jedoch sind Isotopenmarkierungen in der Anwendung meist

aufwendig und teuer, da aufgrund der Radiotoxizität der Verbindungen spezielle

Sicherheitsstandards bei der Synthese, Handhabung, Lagerung und Entsorgung eingehalten

werden müssen. Eine praktische Alternative bietet die Fluoreszenzmarkierung.[127]

Die meisten Biomoleküle, mit Ausnahme einiger Aminosäuren, zeigen keine ausgeprägten

Fluoreszenzeigenschaften. Somit lassen sich fluoreszenzmarkierte Proben ausgezeichnet in

biologischer Umgebung untersuchen und von natürlichen Bestandteilen unterscheiden. Die

Fluoreszenzmarkierung zeichnet sich außerdem durch ihre vielfältige Einsetzbarkeit,

Flexibilität und hohe Sensitivität aus. Gerade die Basen der Nucleoside mit ihren

aromatischen Heterocyclen bieten optimale Voraussetzungen, durch Erweiterung des π-

Systems, geeignete fluoreszierende Analoga zu erhalten.

Die Entstehung von Fluoreszenz basiert auf der optischen Anregung eines Chromophors

und der anschließenden strahlenden Desaktivierung, der Fluoreszenz, die durch Abgabe von


69

Energie in Form von Photonen stattfindet (Abb. 72). Der Chromophor wird durch eine für das

Molekül spezifische Anregungswellenlänge aus seinem Grundzustand in einen angeregten

Zustand angehoben. Aus einem Schwingungszustand des elektronisch angeregten Zustands

findet anschließend, durch Stöße mit der Umgebung, eine strahlungslose Desaktivierung in

den Schwingungsgrundzustand des elektronisch angeregten Zustands statt. Die Relaxation

aus dem Schwingungsgrundzustand des elektronisch angeregten Zustands in den

elektronischen Grundzustand kann entweder strahlungslos oder durch Abgabe von

Photonen erfolgen. Diese Relaxation durch Abgabe von Strahlung wird Fluoreszenz

genannt. Die Fluoreszenzstrahlung ist im Vergleich zur Anregungswellenlänge zu größeren

Wellenlängen verschoben (Stokes-Shift), da durch strahlungslose Relaxation schon ein Teil

der Anregungsenergie an die Umgebung abgegeben wird, bevor eine Emission der

Strahlung stattfindet. Bei typischen organischen Chromophoren erfolgt der Prozess der

strahlenden Desaktivierung nach der optischen Anregung im Nanosekundenbereich. Davon

abzugrenzen ist die Phosphoreszenz. Hierbei erfolgt zunächst ein intersystem crossing (isc)

in einen Triplettzustand und anschließend eine Relaxation in den elektronischen

Grundzustand durch Abgabe von Strahlung. Bei der Phosphoreszenz findet somit eine

zeitverzögerte Relaxation statt.[128]

Abb. 72: Vereinfachtes Jablonski-Diagramm (bearbeitet nach [128]).

Die Fluoreszenzmarkierung von Nucleotid-Prodrugs zur Überprüfung der Zellmembran-

permeabilität und Metabolisierung ist limitiert. Die Lipophilie, Größe und Hydrolyse-

eigenschaften der fluoreszierenden Nucleosidanaloga müssen mit denen, die

pharmazeutische Anwendung finden, vergleichbar sein. Aus diesem Grund können keine

Fluoreszenzmarker, die üblicherweise in der Biochemie eingesetzt werden, verwendet

werden, da diese die Eigenschaften der Pronucleotide zu stark verändern würden. Somit

kommen für diese Anwendung nur fluoreszierende Nucleoside infrage, bei denen die


70

gewünschten photophysikalischen Eigenschaften durch geringe strukturelle Modifikationen

erreicht werden. Eine weitere Herausforderung ist, dass das fluoreszierende

Nucleosidanalogon ein Absorptionsmaximum >300 nm aufweisen muss, um eine

Abgrenzung zu fluoreszenten endogenen Zellbestandteilen zu erreichen. Es gibt eine Reihe

an publizierten fluoreszierenden Nucleosidanaloga, die für die Aufklärung von biologischen

Prozessen entwickelt und genutzt wurden. Eine Klasse sind die Bicyclischen

Nucleosidanaloga (BCNAs).[128,129]

6.6.1 Bicyclische Nucleosidanaloga (BCNAs)

Bicyclische Nucleosidanaloga (BCNAs) tragen eine fluoreszierende bicyclische

Furanopyrimidinbase und wurden erstmals 1981 von ROBINS als Nebenprodukt bei der

Kupplung von terminalen Alkinen mit 5-Iod-2‘-desoxyuridin publiziert.[130,131] Aufgrund ihrer

photophysikalischen Eigenschaften wurden BCNAs bereits mehrfach für die Visualisierung

und Verfolgung biologischer Prozesse eingesetzt[127,132-134] und haben sich auch schon bei

der Untersuchung der Zellaufnahme und Metabolisierung von Nucleosidanaloga bewährt.[129]

Die allgemeine Struktur dieser Nucleoside ist in Abb. 73 dargestellt.

Abb. 73: Allgemeine Struktur der Bicyclischen Nucleosidanaloga (BCNAs).

Von PERTENBREITER wurden bereits die in Abb. 74 dargestellten cycloSal- und DiPPro-

Verbindungen 86 - 96 synthetisiert und auf ihre Lipophilie-, Hydrolyse- und

Fluoreszenzeigenschaften untersucht. Auch wurden Zellaufnahmestudien der Verbindungen

mittels Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt, bei denen intrazelluläre Fluoreszenz detektiert

werden konnte.[135] Allerdings können mit dieser Methode keine Informationen zur

Metabolisierung der Prodrugs erhalten werden.


71

Abb. 74: Von PERTENBREITER und GOLLNEST synthetisierte BCNA-Prodrugs.[120,135]

Mit der TriPPPro-Verbindung 97 (Abb. 74) wurden von GOLLNEST Zellaufnahmestudien

durchgeführt und anschließend das Zelllysat mittels RP-HPLC mit Fluoreszenzdetektion

untersucht. Hierbei konnte das Nucleosidtriphosphat nachgewiesen werden, welches

intrazellulär aus den Prodrugs freigesetzt worden sein muss.[120] Die Wahrscheinlichkeit einer

intrazellulären Phosphorylierung durch zelluläre Kinasen ist sehr gering, da BCNAs keine

Substrate für diese Enzyme sind.[136]

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen unterstreichen die Eignung der BCNAs als Sonden

zur Untersuchung der Zellaufnahme und Metabolisierung von Nucleotid-Prodrugsystemen.

Somit sollten weitere cycloSal-, DiPPro- und TriPPPro-BCNAs in Zellaufnahmestudien

untersucht werden, um ein tieferes Verständnis über diese Prodrug-Konzepte zu erlangen.

Neben der Fluoreszenz wurde 1999 von MCGUIGAN eine weitere interessante Eigenschaft

der BCNAs festgestellt. BCNAs sind selektive und hoch-potente anti-Varizella-Zoster-Virus

(VZV)-Wirkstoffe.[137] VZV gehört zur Familie der Herpes-Viren. Eine VZV-Infektion kann

Windpocken und Gürtelrose verursachen. Zur Behandlung werden hauptsächlich Aciclovir 98

(ACV) und dessen Prodrug Valaciclovir 99 eingesetzt (Abb. 75).[138]

Abb. 75: Aciclovir 98 (ACV) und dessen Valinylester-Prodrug Valaciclovir 99.

R1 = C3H7, R

2 = OH 86

R1 = H, R

2 = OH 87

R1 = C3H7, R

2 = H 88

R1 = H, R

2 = H 89

R1 = C3H7, R

2 = OH, R

3 = C6H13 90

R1 = C3H7, R

2 = OH, R

3 = C9H19 91

R1 = C3H7, R

2 = OH, R

3 = C11H23 92

R1 = C3H7, R

2 = H, R

3 = C6H13 93

R1 = C3H7, R

2 = H, R

3 = C9H19 94

R1 = H, R

2 = H, R

3 = C6H13 95

R1 = H, R

2 = H, R

3 = C9H19 96

97

98 99


72

Im Vergleich zu Aciclovir 98 zeigen 2‘-Desoxy-BCNAs mit einem Alkylrest in C6-Position der

Base eine bis zu 300-fach höhere antivirale Aktivität bei einer halb so hohen Zytotoxizität.[137]

Zudem zeigen diese Verbindungen, im Gegensatz zu anderen anti-Herpes-Wirkstoffen, eine

hohe Selektivität für VZV.

Durch Austausch des linearen Alkylrests gegen eine 4-Alkylarylgruppe, konnte die

Wirksamkeit sogar auf subnanomolare Konzentrationen gesteigert werden. Das

Pentylphenyl-Derivat Cf1743 100 (Abb. 76) ist bis heute der potenteste anti-VZV-Wirkstoff,

der publiziert wurde, und ist 10.000-fach aktiver als Aciclovir 98. Durch dessen geringe

Toxizität erreicht Cf1743 einen Selektivitätsindex von über 100.000.[139]

Abb. 76: Cf1743 100 und dessen Valinylester-Prodrug FV-100 101.

Jedoch hat Cf1743 100, aufgrund der hohen Lipophilie der Verbindung, nur eine sehr

geringe Löslichkeit in Wasser. Dies wirkt sich negativ auf die Plasmakonzentration des

Nucleosids und somit auf die Bioverfügbarkeit und die biologische Anwendbarkeit aus.[133,140]

Dieses Problem konnte, wie bei Aciclovir 98, durch Verwendung des entsprechenden

5‘-Valinylesters gelöst werden. Mit dem Valinylester 101 als Hydrochlorid (Abb. 76), der

FV-100 oder auch ValnivudineTM genannt wird, konnte die Bioverfügbarkeit um das

500-fache gesteigert werden, ohne dadurch die antivirale Aktivität herabzusetzen.[133]

FV-100 101 befindet sich zurzeit in klinischen Studien der Phase III zur Behandlung von

VZV-Infektionen.[141]

Wie bereits erwähnt, zeigen BCNAs eine ungewöhnlich hohe Selektivität gegenüber VZV.

Dies lässt sich damit erklären, dass die BCNAs nur ein Substrat für die VZV-Thymidinkinase

sind. Wie in Abb. 77 dargestellt, sind sie weder ein Substrat von HSV-Kinasen noch von

zellulären Kinasen.[136,142]

Abb. 77: BCNA-Metabolisierung (bearbeitet nach [136]).

100 101


73

Das BCNA wird durch VZV-Kinasen zum Nucleosiddiphosphat phosphoryliert. Da das

BCNADP kein Substrat für die zelluläre NDPK ist, stellt sich allerdings die Frage, ob in den

Zellen überhaupt eine Phosphorylierung zum BCNATP stattfindet, wie der Wirkmechanismus

aussieht und welches Target BCNAs ansteuern. Die Phosphorylierung zum BCNA-

Triphosphat könnte jedoch auch durch andere zelluläre Enzyme katalysiert werden. Somit

sind noch wesentliche Punkte des Wirkmechanismus der BCNAs ungeklärt.[136]

Um nähere Informationen über den Wirkmechanismus der BCNAs zu erlangen, könnten

DiPPro- und TriPPPro-Verbindungen von Cf1743 100 eingesetzt werden. Aufgrund der

antiviralen Aktivität dieser Prodrugs in Zelltests könnte ermittelt werden, ob das Nucleosiddi-

oder -triphosphat für die antivirale Wirksamkeit der BCNAs eine Rolle spielt. Aus diesen

Ergebnissen könnten wiederum Rückschlüsse auf den Wirkmechanismus gezogen werden.

Aufgabenstellung Teil II

74

7 Aufgabenstellung

Das DiPPro- und das TriPPPro-Konzept sind die ersten Ansätze, mit denen eine erfolgreiche

intrazelluläre Freisetzung des Nucleosiddi- bzw. -triphosphats realisiert werden konnte. Der

Nachweis der Zellaufnahme und intrazellulären Freisetzung wurde über die antivirale

Aktivität in Thymidinkinase-defizienten Zellen erbracht.[117,123] Dies ist jedoch nur ein

indirekter Beweis für die erfolgreiche Diffusion der Prodrugs durch die Zellmembran und es

lässt nur geringe Rückschlüsse auf die Metabolisierung der Prodrugs zu. Somit ist ein

weiterer Ansatz zur Überprüfung der Eigenschaften der Verbindungen zwingend erforderlich.

Die fluoreszierenden Bicyclischen Nucleosidanaloga (BCNAs) haben sich, wie bereits in

Abschnitt 6.6.1 beschrieben, bei der Untersuchung der Zellaufnahme und Metabolisierung

von Prodrugs bewährt und sind somit ein geeignetes Tool zur Validierung von

Prodrugkonzepten.

Ziel dieser Arbeit war es, in Zellaufnahmestudien mit BCNAs als Sonden verschiedene

Prodrugkonzepte zu überprüfen. Mit der Untersuchung des cycloSal-, des DiPPro- und des

TriPPPro-Konzepts sollte die gesamte Bandbreite der intrazellulären Freisetzung von

Nucleosidmono-, -di- und -triphosphaten abgedeckt werden. Die BCNAs sollten mit der Wahl

geeigneter Substituenten, mit NRTIs vergleichbare, Lipophilie und Hydrolyseeigenschaften

aufweisen. Zudem sollten jeweils Maskeneinheiten gewählt werden, mit denen bereits gute

Ergebnisse in antiviralen Tests erzielt wurden. Diese Eigenschaften vereinen die in Abb. 78

dargestellten 2‘,3‘-Didesoxy-BCNA-Prodrugs. Zur Überprüfung des DiPPro-Konzepts sollten

ein symmetrisch maskiertes, ein nicht-symmetrisch maskiertes und ein monomaskiertes

Prodrug untersucht werden. In Analogie dazu sollten, nach der bereits von GOLLNEST

untersuchten symmetrisch maskierten TriPPPro-Verbindung 97, ein nicht-symmetrisch

maskiertes und ein monomaskiertes Triphosphat-Prodrug untersucht werden.

Um die gewünschten Zellaufnahmestudien durchführen zu können, sollten die in Abb. 78

dargestellten Prodrugs 89, 94 und 102 - 105 synthetisiert werden.


75

Abb. 78: Zu synthetisierende BCNA-Prodrugs 89, 94 und 102 - 105.

Nach der Inkubation von Zellen mit den ddBCNA-Prodrugs 89, 94 und 102 - 105, sollte das

Zelllysat mittels RP-HPLC mit Fluoreszenzdetektion untersucht werden. Mit diesen

Untersuchungen sollten Informationen über die Zellaufnahme und intra- und extrazelluläre

Metabolisierung der Prodrugs gewonnen werden. BCNAs werden nicht von zellulären

Kinasen phosphoryliert. Es ist somit davon auszugehen, dass, wenn phosphorylierte BCNAs

bei den Zellaufnahmestudien detektiert werden, diese aus den Prodrugs freigesetzt wurden.

Aus diesen Ergebnissen sollte eine Einschätzung über den Erfolg der verschiedenen

Prodrugkonzepte ermöglicht werden.

Ein weiteres Ziel war die Synthese der DiPPro- und TriPPPro-Verbindungen 106 und 107

(Abb. 79) des anti-VZV-aktiven Nucleosids Cf1743 100. Dieses Nucleosidanalogon ist bis

heute der potenteste bekannte VZV-Wirkstoff. Der Wirkmechanismus ist jedoch weitgehend

105

89

94 102

103

104


76

unbekannt. Mit den NDP- und NTP-Prodrugs sollten in antiviralen Test der Einfluss von

intrazellulär freigesetztem Di- bzw. Triphosphat auf die antivirale Aktivität untersucht werden,

um Rückschlüsse auf den Wirkmechanismus ziehen zu können.

Abb. 79: DiPPro- und TriPPPro-Verbindungen 106 und 107 des Nucleosids Cf1743 100.

106 107

Resultate und Diskussion Teil II

77

8 Resultate und Diskussion

8.1 Eignung der BCNAs als Fluoreszenzsonden für Prodrugsysteme

Für die Synthese der verschiedenen Prodrugs mussten zunächst die fluoreszierenden

Bicyclischen Nucleosidanaloga (BCNAs) dargestellt werden. Damit sich diese BCNAs als

Fluoreszenzsonden eignen, sollten sie eine vergleichbare Lipophilie wie NRTIs aufweisen.

Des Weiteren sollten die entsprechenden Prodrugs ähnliche Hydrolyseeigenschaften, wie

übereinstimmende Hydrolysehalbwertszeiten und Metabolisierungsprodukte, zeigen.

PERTENBREITER hat hierzu intensive Untersuchungen von cycloSal-Prodrugs und DiPPro-

Verbindungen mit unterschiedlich substituierten BCNAs durchgeführt, die bereits in

Abschnitt 6.6.1 Abb. 74 vorgestellt wurden.[135] Hierbei lag ein Schwerpunkt auf

2‘,3‘-Didesoxyanaloga, da diese sich am besten eignen sollten, das Diffusionsverhalten von

antiviral aktiven 2‘,3‘-Didesoxynucleosiden zu simulieren. Zudem wurde der Einfluss einer

3‘-Hydroxylfunktion und eines n-Propylrests an der Base auf die Lipophilie und die

Hydrolyseeigenschaften der entsprechenden Prodrugs untersucht. Die Eigenschaften der

Verbindungen wurden mit denen der, ebenfalls in der Dissertation von PERTENBREITER

intensiv behandelten, antiviral aktiven 2‘,3‘-Didesoxy-2‘,3‘-didehydrouridin (d4U)- und 2‘,3‘-

Didesoxyuridin (ddU)-Prodrugs verglichen, um ihre Eignung als Fluoreszenzsonden zu

beurteilen.

Die Lipophilie der Verbindungen wurde anhand ihrer Retentionszeiten bei der RP-HPLC

verglichen. Die durch Coinjektion erhaltenen Chromatogramme sind in Abb. 80 dargestellt.

Abb. 80: RP-HPLC-Chromatogramme der cycloSal-d4U- und -ddU-Prodrugs 108 und 109 und der

entsprechenden BCNA-Verbindungen 86 - 89.[135]

88

108 109

89

86

87


78

Die 3-Me-cycloSal-BCNA-Triester 86 und 88 mit einem 6-Propylrest zeigten deutlich höhere

Retentionszeiten als die Vergleichsverbindungen 108 und 109 von d4U und ddU. Die

Prodrugs 87 und 89 ohne Substituenten in 6-Position wiesen dagegen vergleichbare

Retentionszeiten auf, sodass von einer vergleichbaren Lipophilie ausgegangen werden kann.

Es wurde die 2‘,3‘-Didesoxy-Verbindung 89 verwendet, um eine möglichst hohe strukturelle

Ähnlichkeit zu den NRTIs zu gewährleisten.

Bei den DiPPro-Verbindungen ist, aufgrund der größeren Maskeneinheiten, der Einfluss der

Propylgruppe an der Nucleobase auf die Lipophilie des Gesamtmoleküls nicht so groß, wie

bei den cycloSal-Prodrugs. Dies ist anhand der RP-HPLC-Chromatogramme der von

PERTENBREITER untersuchten Prodrugs zu erkennen (Abb. 81).[135]

Abb. 81: RP-HPLC-Chromatogramme der DiPPro-d4U-Prodrugs 110 - 112 und der entsprechenden

BCNA-Verbindungen 90 - 96.[135]

Auch das von GOLLNEST synthetisierte 6-Propyl-substituierte BCNATP-Prodrug 97

(Abschnitt 6.6.1 Abb. 74) zeigt mit einer Differenz von 0.4 min eine ähnliche Retentionszeit

wie das entsprechende Triphosphat-Prodrug 113 von d4T 74.[123]

Da das 6-Prop-ddBCNA synthetisch leichter zugänglich ist als das unsubstituierte Nucleosid,

wurde in dieser Arbeit das 6-Propyl-substituerte ddBCNA als Fluoreszenzsonde für die

DiPPro- und TriPPPro-Verbindungen verwendet.

Ebenfalls entscheidend für die Eignung der BCNAs als Sonden sind die Stabilität und die

Hydrolyseeigenschaften der BCNA-Prodrugs. Die cycloSal-, DiPPro- und TriPPPro-

Verbindungen 89, 94 und 97 zeigten in Phosphatpuffer und Zellextrakt einen analogen

C9-6-Prop-2‘-dBCNADP 91

C6-d4UDP 110 C9-d4UDP 111


C11-d4UDP 112

C6-6-Prop-ddBCNADP 93


C9-6-Prop-ddBCNADP 94

C6-6-H-ddBCNADP 95

C9-6-H-ddBCNADP 96


79

Hydrolyseverlauf zu den d4U-, ddU- und d4T-Derivaten. Bei dem 3-Me-cycloSal-Prodrug 89

wurde die erfolgreiche Freisetzung des Monophosphats beobachtet. Bei den DiPPro- und

TriPPPro-Verbindungen 94 und 97 erfolgte die Freisetzung des Di- bzw. Triphosphats, wie

angenommen, über das monomaskierte Intermediat. Bei Betrachtung der Hydrolyse-

halbwertszeiten der BCNA-Prodrugs 89, 94 und 97 in Phosphat-Puffer sowie in Zellextrakt

(Tab. 2) liegen diese alle in der gleichen Größenordnung wie die entsprechenden d4U-, ddU-

und d4T-Derivate.[123,135]

Tab. 2: Hydrolysehalbwertszeiten der Prodrugs in Phosphatpuffer und Zellextrakt.[123,135]

Verbindung t1/2

[h]: PBS (pH 7.3) t1/2

[h]: CEM/0

3-Me-cycloSal-d4UMP 108 9 11

3-Me-cycloSal-ddUMP 109 7 16

3-Me-cycloSal-ddBCNAMP 89 10 15

C9-DiPPro-d4UDP 111 63 1.1

C9- DiPPro-ddUDP 114 66 0.7

C9- DiPPro-ddBCNADP 94 78 3.2

C8-TriPPPro-d4TTP 113 52 2.5

C8- TriPPPro-ddBCNATP 97 45 2.1

Das Hydrolyseverhalten sowie die Hydrolysehalbwertszeit der BCNA-Prodrugs stimmen

damit gut mit den Vergleichsdaten überein. Somit sollten unter Berücksichtigung der

Lipophilie für die cycloSal-Prodrugs das 6-H-ddBCNA 115 und für die DiPPro- und TriPPPro-

Verbindungen das 6-Prop-ddBCNA 116 (Abb. 82) als Fluoreszenzsonden ideal geeignet

sein.

Abb. 82: 6-H-ddBCNA 115 und 6-Prop-ddBCNA 116.

8.2 Synthese der Bicyclischen Nucleosidanaloga

Die Synthese der Bicyclischen Nucleosidanaloga 6-H-ddBCNA 115 und 6-Prop-ddBCNA 116

wurde nach der optimierten Syntheseroute von PERTENBREITER durchgeführt,[135] welche

hauptsächlich auf dem von MCGUIGAN entwickelten Syntheseweg beruht.[143] Ein Überblick

über die Retrosyntheseroute der Nucleosidanaloga 6-H-ddBCNA 115 und 6-Propyl-ddBCNA

115 116


80

116 ist in Abb. 83 dargestellt. Die Schlüsselschritte sind für beide Nucleosidanaloga die

Sonogashira-Kupplung und die anschließende 5-endo-dig-Cyclisierung aus dem gleichen

iodierten Nucleosid 117. Bei dem 6-H-ddBCNA 115 erfolgt dies jedoch nicht in einer one-pot-

Reaktion, sondern über das Alkin 118 und das Trimethylsilyl (TMS)-geschützte Nucleosid

119. Das iodierte Nucleosid 117 wurde aus ddU 120 erhalten, welches wiederum durch

Hydrierung von d4U 121 zugänglich ist. d4U 121 lässt sich über die Anhydroverbindung 122

und das mesylierte Nucleosid 123 aus 2‘-Desoxyuridin 124 als Ausgangsverbindung

darstellen.

Abb. 83: Retrosyntheseroute zur Darstellung von 6-H-ddBCNA 115 und 6-Prop-ddBCNA 116.

Die zwei Syntheseschritte zur Anhydroverbindung 122 wurden auf der Grundlage der von

HORWITZ publizierten Route durchgeführt.[144] Die Mesylierung der Hydroxylgruppen von

2‘-Desoxyuridin 124 erfolgte mit Methansulfonylchlorid. Der dabei entstandene

Chlorwasserstoff wurde als Pyridiniumchlorid abgefangen. Durch Ausfällen des Produkts aus

Wasser konnte das mesylierte Nucleosid 123 bereits in einer hohen Reinheit in einer

Ausbeute von 86% erhalten werden (Abb. 84). Die Umsetzung zur Anhydroverbindung

erfolgte mit Natriumhydroxid in Wasser bei 100 °C. Durch Neutralisation und mehrmaliger

Extraktion wurde das Produkt in einer Ausbeute von 87% erhalten. Die anschließende

Ringöffnung erfolgte nach dem Protokoll von PARAMASHIVAPPA.[145] Über eine β-Eliminierung

mit Kalium-tert-butanolat, welches in situ aus Kaliumhydroxid und tert-Butanol entsteht,

121

117 120

123 122

124

116

115 118 119


81

wurde d4U 121 gebildet. Nach Neutralisation und anschließender säulenchromato-

graphischer Reinigung wurde d4U 121 in einer Ausbeute von 62% isoliert (Abb. 84). Die

moderate Ausbeute ist durch die Spaltung der glycosidischen Bindung als Nebenreaktion zu

erklären. Die Hydrierung der Doppelbindung im Glycon von d4U 121 erfolgte in Methanol

durch Wasserstoff mit Palladium auf Aktivkohle als Katalysator, wodurch 2’,3’-Didesoxyuridin

(ddU) 120 nach Reinigung an Kieselgel in einer Ausbeute von 88% gewonnen werden

konnte (Abb. 84).

Abb. 84: Synthese von ddU 120 als Zwischenstufe der Synthese der BCNAs.

Diese Synthese von 2‘,3‘-Didesoxy-5-ioduridin 117 wurde auf zwei verschiedenen Wegen

durchgeführt (Abb. 85). Die erste verwendete Methode wurde von MCGUIGAN publiziert[143]

und die Aufarbeitung von PERTENBREITER optimiert.[135] Hierbei erfolgte die Iodierung in

5-Position durch elektrophile aromatische Substitution mit Iodmonochlorid. Nach Beendigung

der Reaktion wurde mit einer wässrigen Ammoniaklösung neutralisiert und das

überschüssige Iod durch Extraktion mit Dichlormethan entfernt. Bei der Extraktion ist

zunächst ein großer Teil des Produkts in die organische Phase übergegangen, weswegen

wieder mit Wasser extrahiert wurde. Nach mehrmaliger säulenchromatographischer

Reinigung wurde 2’,3’-Didesoxy-5-ioduridin 117 in einer Ausbeute von 50% erhalten. Bei der

Neutralisation mit Ammoniak entstand mit dem im Überschuss eingesetzten Iodmonochlorid

das instabile Stickstofftriiodid, was in trockenem Zustand bei Berührung sofort in einer stark

exothermen Reaktion zu Stickstoff und Iod zerfällt. Dies stellte bei größeren Ansätzen ein

Problem dar, da es selbst in Methanol bei größeren Mengen zu spontanen exothermen

Reaktionen kam.

121 120

124 123 122


82

Abb. 85: Synthese von 2‘,3‘-Didesoxy-5-ioduridin 117.

Für größere Ansätze wurde somit die zweite Methode verwendet.[146,147] Die Iodierung der

Nucleobase von 2’,3’-Didesoxyuridin 120 in 5-Position erfolgte hierbei in Essigsäure unter

Zugabe von Iod, sowie Ammoniumcer(IV)-nitrat (CAN). Nach Aufarbeitung und

säulenchromatographischer Reinigung wurde 2’,3’-Didesoxy-5-ioduridin 117 in einer

Ausbeute von 49% erhalten (Abb. 85). Als Nebenreaktion wurde die Abspaltung der

Nucleobase beobachtet. Das Upscalen der Iodierung unter Verwendung der zweiten

Methode war somit erfolgreich. Es konnte auch mit großen Ansätzen die gleiche Ausbeute

erzielt werden, wie mit den kleinen Ansätzen der ersten Methode.

Die Synthese des 6-Prop-ddBCNA 116 erfolgte durch eine Sonogashira-Kupplung mit

anschließender Cyclisierung in einer one-pot-Reaktion.[135,143] Das iodierte Nucleosid 117

wurde mit Tetrakis(triphenylphosphin)-palladium(0) als Katalysator, Pent-1-in, Kupfer(I)-iodid

als Cokatalysator zur Aktivierung des Alkins und N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA)

umgesetzt. Zum Ablauf der Cyclisierung wurden weiteres Kupfer(I)-iodid und Triethylamin

hinzugegeben (Abb. 86). Die Ringschlussreaktion ist nach BALDWIN eine 5-endo-dig-

Cyclisierung.[148] Die vorangestellte Ziffer beschreibt die Größe des entstehenden Rings,

gefolgt von „exo“ oder „endo“, je nachdem ob die gespaltene Bindung exocyclisch oder

endocyclisch in Bezug auf den kleinsten entstandenen Ring ist und abschließend beschreibt

„tet“, „trig“ oder „dig“ die Hybridisierung des an der Ringschlussreaktion beteiligten

Kohlenstoffatoms. Das erhaltene Rohprodukt musste mehrmals säulenchromatographisch

an Kieselgel gereinigt werden, da sich der Katalysator sehr schwer abtrennen ließ. Das

fluoreszierende 6-Prop-ddBCNA 116 wurde in einer Ausbeute von 71% erhalten.

Abb. 86: Synthese des fluoreszierenden 6-Prop-ddBCNA 116.

Für die Synthese von 6-H-ddBCNA 115 war eine one-pot-Reaktion nicht möglich, da Ethin

als Alkin verwendet werden müsste. Ethin ist gasförmig, was den experimentellen Aufwand

117 120

116 117


83

deutlich erhöht. Zudem kann es zur Kupplung an beiden Kohlenstoffatomen kommen, was

zu Ausbeuteverlusten führen würde. Stattdessen wurde 6-H-ddBCNA 115 über drei Stufen

dargestellt[135] und als Alkin Trimethylsilylacetylen verwendet, was bei Raumtemperatur

flüssig vorliegt. Die Sonogashira-Kupplung erfolgte analog zu der in Abb. 86 dargestellten

Reaktion. Säulenchromatographisch war es nicht möglich, das gebildete 5-((Trimethylsilyl)-

ethinyl)-2’,3’-didesoxyuridin 119 vollständig vom Katalysator zu trennen. Somit wurde das

Produkt im nächsten Schritt leicht verunreinigt eingesetzt.

Zur Durchführung des Ringschlusses zu 6-H-ddBCNA 115 musste zunächst der

Trimethylsilyl-Rest abgespalten werden. Dies wurde durch Zugabe von Tetrabutyl-

ammoniumfluorid als Fluoridionen-Donor realisiert, wodurch 5-Ethinyl-2’,3’-didesoxyuridin

118 nach säulenchromatographischer Reinigung in einer Ausbeute von 46% über zwei

Stufen erhalten wurde. Der Ringschluss erfolgte wieder in einer kupfervermittelten 5-endo-

dig-Cyclisierung mit dem Unterschied, dass hierbei eine äquimolare Menge an Kupferiodid

notwendig war.[149] Nach säulenchromatographischer Reinigung wurde 6-H-ddBCNA 115 in

einer Ausbeute von 22% erhalten (Abb. 87) Ein Grund für die niedrige Ausbeute, die

normalerweise für diese Reaktion laut Literatur bei 66% liegt,[135] war die unvollständige

Umsetzung des Edukts. Die Reaktion ist aufgrund der Salze schwer

dünnschichtchromatographisch zu verfolgen. Es wurden 12% des Edukts reisoliert.

Abb. 87: Synthese des 6-H-ddBCNA 115.

8.3 Synthese des 3-Me-cycloSal-ddBCNA-Prodrugs 89

In Abschnitt 6.4.1 wurde das cycloSal-Konzept bereits ausführlich vorgestellt. Der Einfluss

der Substituenten an der cycloSaligenyl-Einheit auf die Stabilität, das Produktverhältnis bei

der Hydrolyse und der anti-HIV-Aktivität der Prodrugs wurde mit d4T 74 als Modellnucleosid

ermittelt. Die besten Ergebnisse wurden mit dem 3-Methyl-d4TMP-Triester erzielt. Der

118 115

117 119


84

Methyl-Substituent sorgt für eine ausreichende Stabilität mit einer Hydrolysehalbwertszeit in

Phosphatpuffer (pH 7.3) von 17.5 Stunden. Zudem wird bei der Hydrolyse mit einem

Produktverhältnis von 94:6 hauptsächlich das d4T-Monophosphat und nur zu einem

geringen Teil der „falsch“ geöffnete Phenylphosphatdiester gebildet. Diese Tendenz setzt

sich bei den antiviralen Daten fort, bei denen der 3-Methyl-substituierte cycloSal-Triester die

potenteste Verbindung war.[106]

Somit wurde für diese Arbeit die 3-Methyl-substituierte cycloSal-Maske für das BCNA-

Monophosphat-Prodrug ausgewählt. Weiterhin wurde aus den am Anfang dieses Kapitels

(Abschnitt 8.1) dargelegten Gründen das 6-H-ddBCNA 115 als fluoreszierendes

Nucleosidanalogon eingesetzt. Das für die Zellaufnahmestudien verwendete cycloSal-

Prodrug ist in Abb. 88 dargestellt. Diese Verbindung wurde von PERTENBREITER zur

Verfügung gestellt.

Abb. 88: Für die Zellaufnahmestudien verwendetes 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89.

Das 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89 wurde von PERTENBREITER auf dem von MEIER

etablierten Weg[107] durch Kupplung des 6-H-ddBCNA 115 mit 3-Methyl-cycloSaligenyl-

chlorphosphit 125 und anschließender Oxidation mit tert-Butylhydroperoxid synthetisiert

(Abb. 89). Die geringe Ausbeute von 35% wurde auf die notwendige mehrfache Reinigung

und der dabei auftretenden teilweisen Zersetzung der Produkte zurückgeführt.[135]

Abb. 89: Synthese des 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89.[135]

Um das bei der Hydrolyse des Prodrugs 89 entstehende 6-H-ddBCNAMP 126 bei den RP-

HPLC-Untersuchungen per Coinjektion identifizieren zu können, sollte es synthetisch

dargestellt werden. Dies erfolgte über das 5‘-tosylierte Nucleosid 127 mit anschließender

nucleophiler Substitution mit Tetra-n-butylammoniumphosphat.[135]

Nach der Umsetzung des 6-H-ddBCNA 115 mit para-Toluolsulfonsäurechlorid, wässriger

Aufarbeitung und säulenchromatographischer Reinigung wurde das 5‘-tosylierte

Nucleosid 127 in einer Ausbeute von 64% erhalten (Abb. 90).

89

89 115

125


85

Abb. 90: Synthese des 6-H-ddBCNAMP 126.

Die Darstellung von 6-H-ddBCNAMP 126 erfolgte unter Zugabe von Tetra-n-

butylammoniumphosphat (Abb. 90) bei 100 °C unter Mikrowellen-Bedingungen. Nach

Extraktion und säulenchromatographischer Reinigung wurde das gewünschte Produkt 126

leicht verunreinigt erhalten. Die 1H- und 31P-NMR-Spektren der Verbindung stimmten mit den

Literaturdaten[135] überein. Es waren jedoch keine Signale von Tetra-n-butylammonium-Ionen

im 1H-Spektrum zu erkennen, sodass von einem Ionenaustausch während der

Säulenchromatographie auszugehen ist. Nach weiteren NMR-spektroskopischen

Untersuchungen wurde festgestellt, dass sich das Produkt mit der Zeit in D2O zersetzt. Um

die Zersetzungsprodukte abzutrennen, erfolgte eine zweite säulenchromatographische

Reinigung. Jedoch wurde danach eine fast vollständige Zersetzung des Produkts festgestellt.

Somit konnte aus diesem Ansatz kein 6-H-ddBCNAMP 126 als Referenzverbindung

gewonnen werden.

Da nur geringe Mengen des Monophosphats zur Coinjektion benötigt wurden, erfolgte

alternativ die Gewinnung des 6-H-ddBCNAMP 126 durch Hydrolyse von 3-Me-cycloSal-6-H-

ddBCNAMP 89. Dazu wurde das Prodrug 89 in Phosphatpuffer (pH 7.3) drei Stunden bei

37 °C hydrolysiert und anschließend mittels HPLC gereinigt. Durch die schnelle Reinigung

wurde eine Zersetzung des Produkts verhindert. Das 6-H-ddBCNAMP 126 wurde in einer

hohen Reinheit erhalten und diente als Referenzverbindung bei den RP-HPLC-

Untersuchungen.

8.4 Synthese der fluoreszierenden Nucleosiddiphosphat-Prodrugs

Für die Synthese von DiPPro-Verbindungen wurde die in Abb. 91 dargestellte

Phosphoramiditmethode entwickelt.[118,122] Hierbei entsteht die Phosphoranhydridbindung

durch Kupplung eines säureaktivierten Phosphoramidits, welches die Maskeneinheiten trägt,

mit einem Nucleosidmonophosphat und anschließender Oxidation des β-Phosphats. Die

labile Phosphoranhydridbindung wird somit erst im letzten Schritt der Syntheseroute gebildet.

Dies ermöglicht die Synthese von DiPPro-Verbindungen mit einer Vielzahl an

unterschiedlichen Masken und Nucleosidanaloga.

126 127 115


86

Abb. 91: Retrosynthese der DiPPro-Verbindungen.

Für die Synthese der fluoreszierenden Nucleosiddiphosphat-Prodrugs werden somit zwei

Bausteine benötigt, das Phosphoramidit mit den Maskeneinheiten und das fluoreszierende

Nucleosidmonophosphat. Es soll zunächst auf die Synthese des Monophosphats

eingegangen und im Anschluss die Synthese der verschiedenen Masken und finalen

Kupplungsreaktionen zu den Prodrugs beschrieben werden.

8.4.1 Synthese des 6-Prop-ddBCNA-Monophosphats 128

Für die DiPPro- und TriPPPro-Verbindungen wurde, aufgrund der geeigneten Eigenschaften

und leichten Zugänglichkeit, das 6-Propyl-substituierte 2‘,3‘-Didesoxy-BCNA 116 als

fluoreszierende Sonde verwendet (s. Abschnitt 8.1). Da die Synthese des 6-H-ddBCNAMP

126 über das 5‘-tosylierte Nucleosid 127 nicht den gewünschten Erfolg gebracht hat und

PERTENBREITER mit dieser Methode ebenfalls nur moderate Ausbeuten mit unterschiedlich

substituierten BCNAs erzielen konnte,[135] sollte für die Synthese des 6-Prop-ddBCNAMP 128

ein anderer Weg gewählt werden.

Eine Standardmethode für die Darstellung von Nucleosidmonophosphaten ist der

Syntheseweg von SOWA und OUCHI.[150] Jedoch ist dieser Ansatz nicht für BCNAs geeignet,

da es bei diesen Nucleosidanaloga unter den leicht sauren Reaktionsbedingungen zur

Spaltung der glycosidischen Bindung kommt.[135]

Eine erfolgreiche Darstellung von 6-Prop-ddBCNAMP 128 gelang GOLLNEST durch

Verwendung der cycloSal-Technik.[123] CycloSal-Triester finden nicht nur als Prodrugs,

sondern auch als Synthesebausteine Anwendung. Durch den Angriff verschiedenster

Nucleophile auf das elektrophile Phosphorzentrum konnten bereits eine Vielzahl

unterschiedlicher phosphorylierter Verbindungen, wie Nucleosiddi- und -triphosphate[151],

polyphosphorylierte (Oligo-)Nucleotide[152], Nucleosidmono- und -diphosphatglyco-

pyranosen[153-155] und Pyranonucleosid-6‘-triphosphate[156], dargestellt werden. Diese Vielfalt

unterstreicht eindrucksvoll die breite Anwendbarkeit des Konzepts. Bei der synthetischen

Nutzung des cycloSal-Konzepts werden Akzeptorsubstituenten, wie Chlor- und Nitrogruppen,


87

in 5-Position des Salicylalkohols verwendet. Diese labilisieren die Phenylesterbindung, was

zu kürzeren Reaktionszeiten und zur favorisierten Ringöffnung über die Phenylesterbindung

führt.

Der 5-Cl-cycloSal-Triester 129 wurde von GOLLNEST in sehr guten Ausbeuten (94%)

dargestellt. Jedoch bereitete die Öffnung zum Monophosphat Probleme, da auch signifikante

Mengen des „falsch“ geöffneten Phenylphosphatdiester 130 gebildet wurden und dadurch

nur eine moderate Ausbeute von 44% erreicht wurde.[123] Dieser Syntheseweg zur

Darstellung des 6-Prop-ddBCNAMP 128 sollte reproduziert und optimiert werden.

Es wurde zunächst das 5-Chlor-substituierte cycloSal-Reagenz 131 nach der etablierten

Methode dargestellt (Abb. 92).[151,157] Dazu wurde 5-Chlorsalicylsäure 132 mit Lithium-

aluminiumhydrid zum 5-Chlorsalicylalkohol 133 reduziert, der nach Umkristallisation mit einer

Ausbeute von 80% erhalten wurde. Die Umsetzung zum 5-Chlor-cycloSaligenylchlorphosphit

131 erfolgte in zwei SNP-Reaktionen mit Phosphortrichlorid. Durch Zugabe von Pyridin wurde

der gebildete Chlorwasserstoff als Pyridiniumchlorid abgefangen. Das Produkt 131 wies

nach Filtration und Entfernen des Lösungsmittels nur leichte Verunreinigungen auf, so dass

auf eine weitere Reinigung verzichtet wurde. Grundsätzlich ist es aber möglich, das

Chlorphosphit 131 destillativ zu reinigen.[123]

Abb. 92: Synthese des 5-Chlor-cycloSaligenylchlorphosphits 131.

Der zentrale Synthesebaustein, der cycloSal-Phosphattriester 129, wurde durch Kupplung

des Chlorphosphits 131 mit dem 6-Prop-ddBCNA 116 und anschließender Oxidation mit tert-

Butylhydroperoxid dargestellt (Abb. 93). Die Ausbeute von nur 51% ist auf die teilweise

Zersetzung des Produkts bei der chromatographischen Reinigung zurückzuführen. Somit

wäre bei erneuter Synthese die Verwendung von destilliertem 5-Chlor-

cycloSaligenylchlorphosphit 131 zu empfehlen, da nach wässriger Aufarbeitung keine

weiteren Reinigungsschritte notwendig sind und nahezu quantitative Ausbeuten erreicht

werden können.[123]

131 133 132


88

Abb. 93: Synthese des 5-Cl-cycloSal-6-Prop-ddBCNAMPs 129.

Die basische Hydrolyse des cycloSal-Phosphattriesters 129 zum gewünschten BCNA-

Monophosphat 128 wurde zunächst unter den von GOLLNEST publizierten Bedingungen

durchgeführt.[123] Der Triester 129 wurde in einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser gelöst

und Triethylamin langsam zugetropft (Abb. 94). Nach einer Reaktionszeit von einer Stunde

bei Raumtemperatur war das Edukt vollständig umgesetzt.

Abb. 94: Synthese des 6-Prop-ddBCNAMPs 128.

Wie ebenfalls von GOLLNEST beobachtet, wurde nicht nur das Monophosphat 128, sondern

auch der Phenylphosphatdiester 130 gebildet. Jedoch wurden nicht nur „signifikante

Mengen“[123], sondern ein Produktverhältnis von 2:1 von Monophosphat 128 zu

Phenylphosphatdiester 130 erhalten. Zudem war es nicht möglich, die beiden Produkte

säulenchromatographisch voneinander zu trennen. Denkbar wäre, dass durch Austausch der

Gegenionen auf Ammoniumionen eine Trennung der Produkte möglich wird. Dies wurde

jedoch nicht ausprobiert, da aufgrund des unerfreulichen Produktverhältnisses das Erproben

anderer Reaktionsbedingungen vielversprechender erschien. Statt Triethylamin sollten

Natriumhydroxid und Tetra-n-butylammoniumhydroxid als Base verwendet werden.

Bei dem ersten Ansatz wurde der cycloSal-Triester 129 in einem Gemisch aus Acetonitril

und Wasser (1:1 v/v) gelöst, 2 Äquiv. Natriumhydroxid-Lösung (MeCN/H2O 1:1 v/v)

zugegeben und eine Stunde bis zum vollständigen Umsatz des Edukts gerührt. Jedoch

wurde die Bildung einer Vielzahl an Verbindungen beobachtet und es konnte nur eine

geringe Menge des gewünschten Monophosphats 128 isoliert werden.

Beim zweiten Ansatz wurde eine wässrige Tetra-n-butylammoniumhydroxid-Lösung (10%)

zu dem in Acetonitril gelösten Triester 129 gegeben. Bereits nach einer Minute war das

129 116

131

130 128 129


89

Edukt vollständig umgesetzt. Allerdings konnte kein Nucleosidmonophosphat 128, sondern

nur die abgespaltene Nucleobase isoliert werden.

Für diese Arbeit wurde eine große Menge an 6-Prop-ddBCNAMP 128 für die Synthese der

verschiedenen Prodrugs benötigt, um mit diesen Prodrugs Zellaufnahmestudien durchführen

zu können. Daher war eine effektive Methode zu Darstellung des Monophosphats 128

notwendig. Da dies über die cycloSal-Methode nicht möglich war, wurde ein anderer Weg

gesucht.

Wie bereits in Abschnitt 2.4 beschrieben, erfolgt bei Oligonucleotiden die Einführung der

Phosphateinheit über Phosphoramidit-Bausteine, die nach der Kupplung oxidiert werden.

Diese Synthesestrategie sollte für die Nucleosidmonophosphat-Synthese genutzt werden.

Bei der Oligonucleotidsynthese wird als Schutzgruppe für die Phosphateinheit

standardmäßig eine Cyanoethylgruppe verwendet, die sich unter milden, basischen

Bedingungen leicht von dem Phosphattriester abspalten lässt. Bei der Übertragung des

Konzepts auf die Monophosphatsynthese sind zwei Schutzgruppen an der Phosphateinheit

notwendig. Üblicherweise ist es einfach, eine Schutzgruppe vom Phosphatdiester

abzuspalten, die zweite ist jedoch aufgrund der negativen Ladung an der Phosphatgruppe

schwieriger zu entfernen. Dies ist ebenfalls bei den Cyanoethylgruppen der Fall, sodass

harsche Bedingungen für die Abspaltung der zweiten Gruppe notwendig sind.[158,159] Für eine

breite Anwendbarkeit wären dagegen milde Abspaltbedingungen der Schutzgruppen von

Vorteil.

Häufig finden als Phosphatschutzgruppen auch Benzylgruppen Anwendung, die durch

Hydrierung abgespalten werden können. Die Nucleobase der BCNAs ist jedoch nicht

hydrierstabil,[135] weswegen diese ebenfalls nicht als Schutzgruppen in Frage kamen.

Eine weitere erfolgreich eingesetzte Schutzgruppe für Phosphatmonoester ist die

9-Fluorenylmethyl (Fm)-Gruppe, bei der auch die zweite Schutzgruppe durch β-Eliminierung

unter milden basischen Bedingungen abgespalten werden kann.[159-161] Die Phosphorylierung

einer Hydroxylgruppe erfolgt hierbei durch Umsetzung mit Bis(fluorenylmethyl)-

phosphoramidit 134 und anschließender Entschützung mit Triethylamin oder Piperidin.[161,162]

Diese Methode sollte für die Synthese des 6-Prop-ddBCNAMPs 128 erprobt werden. Dafür

wurde zunächst das Bis(fluorenylmethyl)-phosphoramidit 134 durch Umsetzung von

9-Fluorenylmethanol 135 mit Dichloro-N,N-diisopropylphosphoramidit 136 dargestellt

(Abb. 95). Nach wässriger Aufarbeitung und säulenchromatographischer Reinigung mit

einem Zusatz von Triethylamin wurde das Phosphoramidit 134 in einer Ausbeute von 63%

erhalten.


90

Abb. 95: Synthese des Bis(fluorenylmethyl)-phosphoramidits 134.

Da der Umsatz zum Amidit annähernd quantitativ abläuft und die Ausbeuteverluste auf eine

Zersetzung während der Reinigung zurückzuführen sind, sollte in weiteren Synthesen der

Einsatz des Rohprodukts ohne säulenchromatographische Reinigung in Erwägung gezogen

werden.

Die Kupplung des 6-Prop-ddBCNAs 116 erfolgte mit einem Überschuss des Bis(fluorenyl-

methyl)-phosphoramidits 134 und 4,5-Dicyanoimidazol als Aktivator. Anschließend wurde

das Phosphit mit tert-Butylhydroperoxid zum Phosphat 137 oxidiert. Es wurde ein annähernd

quantitativer Umsatz zum gewünschten Produkt 137 beobachtet. Das BisFm-geschützte

Nucleosidmonophosphat 137 wurde nach wässriger Aufarbeitung und säulen-

chromatographischer Reinigung leicht verunreinigt erhalten. Die Abspaltung der

Fluorenylmethylgruppen erfolgte mit Triethylamin in einer β-Eliminierung, wobei die erste

Fm-Gruppe bereits nach 10 Minuten vollständig abgespalten war und die zweite

Entschützung mit 20 Stunden deutlich langsamer verlief (Abb. 96).

Abb. 96: Synthese des 6-Prop-ddBCNAMPs 128 über die Phosphoramiditroute.

Das gebildete 9-Methylidenfluoren wurde durch Extraktion mit Dichlormethan und Petrolether

entfernt und das Produkt an RP-18-Kieselgel gereinigt. Das 6-Prop-ddBCNAMP 128 konnte

als Triethylammoniumsalz über diese Phosphoramiditroute in einer sehr guten Ausbeute von

67% ausgehend vom Nucleosid 116 erhalten werden.

Es ist somit gelungen, einen Syntheseweg für BCNA-Monophosphate zu entwickeln, über

den das Monophosphat mit deutlich besseren Ausbeuten zugänglich ist, als über die bis

heute für BCNAMPs publizierte Routen. Die maximal erreichte Ausbeute lag bei 44%

ausgehend vom Nucleosid.[123,133,135] Dies konnte um 50 Prozent auf eine Ausbeute von 67%

(ausgehend vom Nucleosid) gesteigert werden. Diese Reaktionsbedingungen könnten auch

134

136 135

137 116 128


91

für andere säurelabile Nucleoside interessant sein und einen effizienten Zugang zu deren

Monophosphaten ermöglichen.

8.4.2 Synthese des symmetrisch maskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 94

Von SCHULZ wurde anhand der antiviralen Daten von symmetrisch maskierten DiPPro-

Verbindungen von d4T 74 als Modellnucleosid eine optimale Acylkettenlänge mit einem C9-

oder C11-Alkylrest ermittelt.[122] Bei einer Maskeneinheit mit einem C11-Alkylrest kommt es zu

Löslichkeitsproblemen und damit zu Schwierigkeiten bei der Synthese, die bei einer C9-

Maskeneinheit nicht auftreten. Auf dieser Grundlage wurde das C9-DiPPro-6-Prop-

ddBCNADPs 94 synthetisiert und für die Zellaufnahmestudien verwendet.

Der erste Baustein für die Synthese der DiPPro-Verbindung 94 über die

Phosphoramiditmethode (Abschnitt 8.4), das BCNA-Monophosphat 128, konnte bereits

erfolgreich dargestellt werden (Abschnitt 8.4.1). Nun musste noch der zweite Baustein, die

Maskeneinheit, synthetisiert werden. Dies erfolgte über die von JESSEN und SCHULZ

etablierte Syntheseroute ausgehend vom 4-Hydroxybenzylalkohol 138 über das

4-(Hydroxymethyl)-phenyldecanoat 139 und anschließender Umsetzung zum Phosphor-

amidit 140 (Abb. 97).[118,122] Die phenolische Hydroxylgruppe des 4-Hydroxybenzylalkohols

138 wurde durch Umsetzung mit Decanoylchlorid 141 unter basischen Bedingungen

verestert und nach Aufarbeitung und Reinigung in einer Ausbeute von 64% erhalten. Es

wurde, wie in vorherigen Arbeiten,[119,135] ebenfalls die Bildung des zweifach veresterten

Nebenprodukts dünnschichtchromatographisch beobachtet, jedoch auf eine Isolierung

verzichtet. Aufgrund der deutlich unterschiedlichen Rf-Werte ließ sich der zweifach veresterte

4-Hydroxybenzylalkohol leicht vom Produkt abtrennen.

Abb. 97: Synthese des symmetrisch maskierten Acyloxybenzylphosphoramidits 140.

Das 4-(Hydroxymethyl)-phenyldecanoat 139 wurde mit Dichloro-N,N-diisopropylphosphor-

amidit 136 zum symmetrisch maskierten Phosphoramidit 140 umgesetzt (Abb. 97). Durch

Triethylamin-Zusatz wurde ein basischer pH-Wert gewährleistet, um eine Hydrolyse des

säurelabilen Produkts zum H-Phosphonat zu verhindern. Auch bei der Reinigung war ein

139

138

140

136

141


92

Zusatz von Triethylamin zum Laufmittel notwendig, um eine Zersetzung des Produkts zu

verhindern. Für die NMR-spektroskopischen Untersuchungen von Phosphoramiditen wurde

generell über basisches Aluminiumoxid entsäuertes deuteriertes Chloroform verwendet. Das

Phosphoramidit 140 wurde in einer Ausbeute von 85% erhalten.

Die DCI-vermittelte Kupplung des C9-maskierten Phosphoramidits 140 mit dem 6-Prop-

ddBCNAMP 128 und anschließender Oxidation mit tert-Butylhydroperoxid zum C9-DiPPro-6-

Prop-ddBCNADP 94 (Abb. 98) erfolgte nach der von JESSEN und SCHULZ entwickelten und

von WEINSCHENK optimierten Synthesevorschrift.[118,122,163] Hierbei sind die entscheidenden

Punkte der Optimierung das Coevaporieren der Edukte mit Acetonitril, das Verwenden einer

DCI-Lösung (0.25 M in MeCN) und die portionsweise Zugabe des DCIs. Allerdings wurde

das BCNA-Monophosphat als Triethylammoniumsalz anstatt als Tetra-n-butylammoniumsalz

eingesetzt. Das Monophosphat ließ sich auch als Triethylammoniumsalz gut in Acetonitril

lösen, wodurch kein zusätzlicher Ionenaustausch notwendig war.

Abb. 98: Synthese des C9-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 94.

Die Synthese des C9-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 94 wurde bereits von PERTENBREITER

veröffentlicht. Hierbei wurde mittels RP-HPLC-Verfolgung ebenfalls ein vollständiger Umsatz

zur gewünschten DiPPro-Verbindung 94 beobachtet, jedoch konnte auch nach viermaliger

Chromatographie kein reines Produkt isoliert werden.[135] Die Reinigung der DiPPro-

Verbindung 94 erfolgte in dieser Arbeit nach dem von WEINSCHENK optimierten Protokoll.[163]

Dies sah zunächst eine automatisierte RP-Chromatographie mit dem puriFlash®430 der

Firma Interchim vor. Es folgte ein Ionenaustausch auf Ammoniumionen und anschließend

eine erneute automatisierte RP-Chromatographie. Mit diesem Protokoll konnte die

Zielverbindung C9-DiPPro-6-Prop-ddBCNADP 94 in einer sehr guten Ausbeute von 79%

erhalten werden. Die Hauptunterschiede zu den Arbeiten von PERTENBREITER bei der

Reinigung war der Einsatz des puriFlash®430 und die Verwendung eines Acetonitril/Wasser-

Gradienten im Gegensatz zu einem Methanol/Wasser-Gradienten. Wie anhand des

31P-NMR-Spektrums und des HPLC-Chromatogramms zu erkennen ist (Abb. 99), wies das

128

140

94


93

Produkt eine hohe Reinheit auf. Das 31P-NMR-Spektrum zeigt die typische Aufspaltung der

beiden Phosphatsignale für Diphosphate in jeweils ein Dublett durch die 2JP,P-Kopplung. Das

RP-HPLC-Chromatogramm weist bei einer Retentionszeit von 18.8 Minuten die DiPPro-

Verbindung 94 und bei 12.6 Minuten mit <1% als Verunreinigung das monomaskierte

Intermediat auf.

Abb. 99: A: 31

P-NMR-Spektrum des C9-DiPPro-6-Prop-ddBCNADP 94; B: RP-HPLC-

Chromatogramm des C9-DiPPro-6-Prop-ddBCNADP 94 (Methode E, 330 nm).

Injektionspeak 94

B

A


94

8.4.3 Synthese des nicht-symmetrisch maskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADP 102

Für die Synthese der nicht-symmetrischen Maskeneinheiten wurde von WEINSCHENK ein

Syntheseweg entwickelt, der auf der Route der Nucleosidphosphoramidit-Bausteine für die

Oligonucleotidsynthese beruht.[124] Das Retrosyntheseschema ist in Abb. 100 dargestellt. Die

nicht-symmetrischen Phosphoramidite werden durch DCI-vermittelte Kupplung des

monomaskierten Phosphordiamidits mit dem zweiten 4-(Hydroxymethyl)-phenylalkanoat

gewonnen. Das monomaskierte Phosphordiamidit wiederum entsteht aus der Umsetzung

des ersten 4-(Hydroxymethyl)-phenylalkanoats mit Chlorobis(N,N-diisopropylamino)-

phosphoramidit 142 und dem Zusatz von Base.

Abb. 100: Retrosyntheseroute der nicht-symmetrisch maskierten Phosphoramidite.

Es wurden bislang für die schnell spaltbare Maske mit einer kurzen Alkylkette eine Acetyl-

oder eine Pentanoylgruppe verwendet und mit einer Maskeneinheit mit einem Alkylrest

≥C7H15 kombiniert. Als Modellnucleoside wurden d4T 74 und AZT 69 verwendet. Durch

Untersuchung der chemischen und enzymatischen Hydrolyse der nicht-symmetrischen

DiPPro-Verbindungen wurde für alle Prodrugs eine schnelle Hydrolyse zu den

monomaskierten Intermediaten mit der stabileren Maskeneinheit festgestellt, welche exklusiv

das gewünschte Nucleosiddiphosphat freisetzen. Bei der Bestimmung der anti-HIV-Aktivität

der Prodrugs in Thymidinkinase-defizienten Zellen zeigten die Prodrugs mit einer Pentanoyl-

Maskeneinheit allerdings bessere Aktivitäten gegenüber den DiPPro-Verbindungen mit einer

Acetyl-Maskeneinheit.[124]

Aus diesen Gründen wurde in dieser Arbeit ein C4H9-Alkylrest für die labilere Maskeneinheit

verwendet. Um für das nicht-symmetrisch maskierte Prodrug eine möglichst ähnliche

Lipophilie im Vergleich zum symmetrisch maskierten Prodrug 94 (Alkylreste R = C9H19) zu

erreichen, sollte in Summe die gleichen Kettenlängen gewählt werden. Also wurde für die

stabilere Maske ein C14H29-Alkylrest gewählt.

Die entsprechenden 4-(Hydroxymethyl)-phenylalkanoate wurden, wie bereits in

Abschnitt 8.4.2 beschrieben, durch Umsetzung des 4-Hydroxybenzylalkohols 138 mit dem

jeweiligen Säurechlorid dargestellt. Durch Zugabe von Triethylamin wurde ein neutraler bis


95

basischer pH-Wert gewährleistet. 4-(Hydroxymethyl)-phenylpentanoat 143 wurde in einer

Ausbeute von 68% erhalten (Abb. 101). Zudem wurden 9% des zweifach veresterten

4-Hydroxybenzylalkohols isoliert.

Abb. 101: Synthese des 4-(Hydroxymethyl)-phenylpentanoats 143.

Pentadecansäurechlorid 145 wurde aus Pentadecansäure 146 dargestellt (Abb. 102), da es

nur sehr hochpreisig kommerziell erworben werden kann. Die Durchführung der zusätzlichen

Stufe reduzierte die Kosten gegenüber der Nutzung des kommerziell erwerbbaren

Pentadecansäurechlorids 145 um den Faktor 1000. Die Umsetzung erfolgte mit Oxalylchlorid

und N,N-Dimethylformamid zu dem Säurechlorid 145, welches ohne Reinigung weiter

eingesetzt wurde. Durch Reaktion mit 4-Hydroxybenzylalkohol wurde 4-(Hydroxymethyl)-

phenylpentadecanoat 147 in einer Ausbeute von 61%, bezogen auf die Pentadecansäure,

und 14% des zweifach veresterten 4-Hydroxybenzylalkohols erhalten.

Abb. 102: Synthese des 4-(Hydroxymethyl)-phenylpentadecanoats 147.

Die Synthese der nicht-symmetrischen C4/C14-Maskeneinheit 148 erfolgte, wie am Anfang

dieses Abschnitts beschrieben, nach der von WEINSCHENK entwickelten Methode.[124]

4-(Hydroxymethyl)-phenylpentanoat 143 und Triethylamin wurden langsam zu

Chlorobis(N,N-diisopropylamino)-phosphoramidit 142 gegeben. Nach Filtration und

chromatographischer Reinigung wurde das Bis(diisopropylamino)-phosphoramidit 149 in

einer Ausbeute von 72% erhalten (Abb. 103). Bei der chromatographischen Reinigung war

ein 10%-iger Zusatz von Triethylamin notwendig, um die Zersetzung des Produkts zu

verhindern.

144

138 143

145 146

147


96

Abb. 103: Synthese des C4/C14-Maskenphosphoramidits 148.

Durch langsame Zugabe eines Gemisches aus 4-(Hydroxymethyl)-phenylpentadecanoat 147

und 4,5-Dicyanoimidazol (DCI, 0.25 M in MeCN) als saurer Aktivator zu einer Lösung des

Bis(diisopropylamino)-phosphoramidits 149 wurde das nicht-symmetrische Phosphoramidit

148 gebildet (Abb. 103). Es wurde nach Filtration und chromatographischer Reinigung,

wieder mit einem Gemisch aus Petrolether und Triethylamin (9:1 v/v) als Laufmittel, in einer

Ausbeute von 83% gewonnen.

Die Synthese des nicht-symmetrisch maskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 102 erfolgte

analog zu der in Abschnitt 8.4.2 beschriebenen Synthese des symmetrisch maskierten

DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 94. Nach DCI-vermittelter Kupplung und anschließender

Oxidation des β-Phosphats wurde die bewährte Reinigungsmethode aus automatisierter RP-

Chromatographie, Kationenaustausch auf Ammoniumionen und erneuter Chromatographie

durchgeführt (Abb. 104). So konnte die Zielverbindung in einer guten Ausbeute von 48%

erhalten werden.

147

149 148

142

143


97

Abb. 104: Synthese des nicht-symmetrisch maskierten C4/C14-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 102.

Das 31P-NMR-Spektrum und das RP-HPLC-Chromatogramm des nicht-symmetrisch

maskierten C4/C14-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 102 demonstriert die hohe Reinheit in der die

Zielverbindung gewonnen werden konnte (Abb. 105). Die Retentionszeit des Produkts 102

beträgt 18.9 Minuten und ist damit fast identisch mit der der symmetrisch maskierten DiPPro-

Verbindung 94 (18.8 Minuten). Somit wurde das Ziel einer ähnlichen Lipophilie der beiden

Verbindungen erreicht.

Abb. 105: A: 31

P-NMR-Spektrum des C4/C14-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 102; B: RP-HPLC-

Chromatogramm des C4/C14-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 102 (Methode E, 330 nm).

128

148

102

Injektionspeak

102

B

A


98

8.4.4 Synthese des monomaskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 103

Die konsequente Fortsetzung des Ansatzes der nicht-symmetrisch maskierten DiPPro-

Verbindungen ist die vollständige Entfernung der labileren Maske. Dies wäre sinnvoll, da bei

monomaskierten DiPPro-Verbindungen eine selektive Freisetzung des Diphosphats

beobachtet wurde. Denn durch die zusätzliche negative Ladung am β-Phosphat wird die

labile Phosphoranhydridbindung stabilisiert. Um dennoch eine ausreichende Lipophilie für

die Membranpermeabilität der Prodrugs zu gewährleisten, sollte eine möglichst lange

Acylkette an der Maske eingesetzt werden. Die längste bis heute untersuchte Kette bei

TriPPPro-Verbindungen ist der C17H35-Alkylrest.[123] Dieser sollte auch bei der Synthese des

monomaskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs verwendet werden. Wenn diese Verbindungen

eine gute Membranpermeabilität aufweisen, könnte dies zu einer weiteren Verbesserung des

DiPPro-Konzepts führen.

Ein Versuch der Synthese von monomaskierten DiPPro-Verbindungen wurde von SCHULZ

publiziert.[122] Hierbei wurde β-Cyanoethyl-(4-decanoyloxybenzyl)-N,N-diisopropylamino-

phosphoramidit aus β-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorophosphoramidit und dem

entsprechenden Benzylalkohol dargestellt. Dies wurde mit d4TMP zu β-Cyanoethyl-(4-

decanoyloxybenzyl)-d4TDP umgesetzt. Jedoch wurde bei der Abspaltung der

Cyanoethylgruppe mit der starken Base 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) ebenfalls

der Acylester gespalten, sodass nur d4TDP erhalten wurde. Es ist nicht beschrieben, ob

auch mildere Basen, wie Triethylamin, getestet wurden.

Eine erfolgreiche Darstellung von monomaskierten TriPPPro-Verbindung gelang

GOLLNEST[121] und wurde von WEINSCHENK auf DiPPro-Verbindungen übertragen.[163] Hierbei

wurde das bereits in Abschnitt 8.4.1 vorgestellte cycloSal-Konzept eingesetzt. Ein 5-NO2-

cycloSal-Triester mit einer Acyloxybenzyleinheit wurde mit einem Nucleosidmonophosphat

als Nucleophil umgesetzt, anschließend das β-Phosphat oxidiert und auf diesem Weg die

monomaskierte DiPPro-Verbindung gebildet. Von WEINSCHENK wurden jedoch keine

Ausbeuten der Synthese angegeben, da nur sehr geringe Mengen des gewünschten

Produkts isoliert werden konnten. Auch Gollnest konnte die monomaskierten TriPPPro-

Verbindungen nur in moderaten Ausbeuten von 26 - 30% gewinnen.

Da beide publizierten Methoden zur Synthese der monomaskierten DiPPro- bzw. TriPPPro-

Verbindungen kein befriedigendes Ergebnis liefern konnten, sollte eine neue Route

entwickelt werden. Es bot sich an, auf den Ansatz von SCHULZ aufzubauen, da in dieser

Arbeit bereits bei der BCNA-Monophosphat-Synthese (Abschnitt 8.4.1) die Problematik der

basischen Abspaltung von Phosphatschutzgruppen untersucht wurde. Anstatt der

Cyanoethylgruppe sollte eine andere Schutzgruppe verwendet werden, die unter milden

basischen Bedingungen schnell abgespalten wird. Wie bei der Synthese der 6-Prop-


99

ddBCNAMP beobachtet wurde, wird die erste Fluorenylmethylgruppe mit Triethylamin

innerhalb von 10 Minuten vollständig abgespalten. Somit erschien die Fluorenylmethylgruppe

auch für die Synthese der monomaskierten Prodrugs eine geeignete Wahl, da die Spaltung

der Acylgruppe der Maske deutlich langsamer verlaufen sollte. Also sollte zunächst in

Analogie zu der Route von SCHULZ das 9-Fluorenylmethyl-(4-octadecanoyloxybenzyl)-N,N-

diisopropylaminophosphoramidit 150 dargestellt werden. Die Synthese des Phosphoramidits

150 sollte nach der Methode für nicht-symmetrisch maskierte Phosphoramidite

(Abschnitt 8.4.3) erfolgen. Für die Darstellung des 9-Fluorenylmethyl-(4-octadecanoyl-

oxybenzyl)-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 151 sollte nach dem Standardprotokoll für DiPPro-

Verbindungen mit anschließender Spaltung der Fm-Gruppe vorgegangen werden. Das

vollständige Retrosyntheseschema zur Synthese des C17-monomaskierten DiPPro-6-Prop-

ddBCNADPs 103 ist in Abb. 106 dargestellt.

Abb. 106: Retrosyntheseschema des C17-monomaskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 103.

4-(Hydroxymethyl)-phenyloctadecanoat 152 wurde nach einem leicht veränderten

Syntheseprotokoll im Vergleich zu den bereits vorgestellten Synthesen der

4-(Hydroxymethyl)-phenylalkanoate (Abschnitt 8.4.2 und 8.4.3) dargestellt. Es wurde

festgestellt, dass bei der Verwendung von Dichlormethan anstatt Tetrahydrofuran als

Lösungsmittel keine Schlenkbedingungen bei der Synthese notwendig waren, um

vergleichbare Ausbeuten zu erreichen. Dies bedeutete eine deutliche Vereinfachung der

präparativen Durchführung. 4-(Hydroxymethyl)-phenyloctadecanoat 152 wurde in einer

152

142

128

103

153

151

135 150


100

Ausbeute von 65% erhalten (Abb. 107), wobei erneut die Bildung des zweifach veresterten

Nebenprodukts beobachtet wurde. Es wurde auf eine Isolierung verzichtet.

Abb. 107: Synthese des 4-(Hydroxymethyl)-phenyloctadecanoats 152.

Das Bis(diisopropylamino)-phosphoramidit 153 wurde durch langsame Zugabe von

4-(Hydroxymethyl)-phenyloctadecanoat 152 und Triethylamin zu dem Chlorobis(N,N-

diisopropylamino)-phosphoramidit 142 gebildet. Nach Filtration und chromatographischer

Reinigung wurde das Diamidit 153 weiter mit einem Gemisch aus 9-Fluorenylmethanol 135

und 4,5-Dicyanoimidazol (0.25 M in MeCN) zum gewünschten Phosphoramidit-Reagenz 150

umgesetzt (Abb. 108). Es wurde nach Filtration und chromatographischer Reinigung in einer

Ausbeute von 48% über zwei Stufen erhalten. Es wurde diese Synthesereihenfolge

verwendet, da das 9-Fluorenylmethylbis(N,N-diisopropylamino)-phosphoramidit deutlich

basenlabiler ist als das 4 Octadecanoyloxybenzylbis(N,N-diisopropylamino)-phosphoramidit

153 und dadurch, aufgrund der zusätzlichen starken Säurelabilität des Phosphoramidits, eine

chromatographische Reinigung sehr schwierig ist.

Abb. 108: Synthese des 9-Fluorenylmethyl-(4-octadecanoyloxybenzyl)-N,N-

diisopropylaminophosphoramidits 150.

Die Synthese des C17-monomaskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 103 erfolgte analog zu

der in Abschnitt 8.4.2 beschriebenen Synthese des symmetrisch maskierten DiPPro-6-Prop-

ddBCNADPs 94. Nach DCI-vermittelter Kupplung und anschließender Oxidation des β-

Phosphats wurden, abweichend vom Protokoll, die flüchtigen Bestandteile unter

vermindertem Druck entfernt. Nun folgte die Abspaltung der Fm-Gruppe mit Triethylamin in

Acetonitril unter Wasserausschluss, um die Spaltung des Esters der Maskeneinheit zu

verhindern. Es wurde auf eine Isolierung des 9-Fluorenylmethyl-(4-octadecanoyloxybenzyl)-

154

138 152

153

142

150

152


101

DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 151 verzichtet, da durch diese zusätzlichen Reinigungsschritte

Ausbeuteverluste durch Zersetzung des Zwischenprodukts befürchtet wurden. Nach dem

Entfernen der Fm-Gruppe folgte die bewährte Reinigungsmethode aus automatisierter RP-

Chromatographie, Kationenaustausch auf Ammoniumionen und erneuter Chromatographie.

So konnte das monomaskierte Diphosphat-Prodrug 103 in einer Ausbeute von 40% erhalten

werden (Abb. 109). Dies bedeutet eine deutliche Steigerung gegenüber der cycloSal-

Methode, mit der, aufgrund der geringen Mengen der monomaskierten DiPPro-

Verbindungen, keine Ausbeuten angegeben werden konnten.[163]

Abb. 109: Synthese des C17-monomaskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 103.

Wie anhand des 31P-NMR-Spektrums und des HPLC-Chromatogramms zu erkennen ist

(Abb. 110), wies das Produkt eine hohe Reinheit auf. Mit einer Retentionszeit von

15.7 Minuten ist die monomaskierte DiPPro-Verbindung 103 etwas polarer als die beiden

Diphosphat-Prodrugs 94 und 102 (18.8 und 18.9 Minuten). Dies war aufgrund der

zusätzlichen negativen Ladung am β-Phosphat auch erwartet worden.

A

128

150 103


102

Abb. 110: A: 31

P-NMR-Spektrum des C17-monomaskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 103; B: RP-

HPLC-Chromatogramm des C17-monomaskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 103 (Methode E,

330 nm).

8.5 Synthese der fluoreszierenden Nucleosidtriphosphat-Prodrugs

Für die Synthese von TriPPPro-Verbindungen wurden bisher zwei Wege veröffentlicht, die

sogenannte Phosphoramiditroute und die H-Phosphonatroute (Abb. 111).[120,121] Die

Phosphoramiditroute beruht auf der in Abschnitt 8.4 beschriebenen Synthese von DiPPro-

Verbindungen, mit dem Unterschied, dass anstatt des Nucleosidmonophosphats ein

Nucleosiddiphosphat in der DCI-vermittelten Kupplungsreaktion mit dem Phosphoramidit der

Maskeneinheiten eingesetzt wird. Die Oxidation des γ-Phosphats erfolgt ebenfalls mit tert-

Butylhydroperoxid.

Abb. 111: Retrosynthesewege der TriPPPro-Verbindungen.

103

B

Injektionspeak


103

Die Phosphoramiditroute ist jedoch aufgrund der oft schwierigen Synthese der

Nucleosiddiphosphate limitiert.[123] Eine Alternative bietet die H-Phosphonatroute, bei der das

oft leichter darzustellende Nucleosidmonophosphat mit einem Bis(4-acyloxybenzyl)-

pyrophosphat, welches aus dem entsprechenden H-Phosphonat und Tetra-n-

butylammoniumphosphat zugänglich ist, umgesetzt wird. Bei dieser Methode ist nach der

finalen Kupplung kein Oxidationsschritt notwendig, was diese Route besonders für

oxidationsempfindliche Nucleoside interessant macht.

Das von GOLLNEST in Zellaufnahmestudien untersuchte symmetrisch maskierte C8-TriPPPro-

6-Prop-ddBCNATP 97 wurde über die Phosphoramiditroute in einer Ausbeute von 19%

dargestellt. Die niedrige Ausbeute wurde auf Schwierigkeiten bei der Reinigung

zurückgeführt, weswegen mit dem optimierten Reinigungsprotokoll höhere Ausbeuten

möglich sein sollten. Das 6-Prop-ddBCNADP 155 wurde über die cycloSal-Technik in einer

Ausbeute von nur 17% gewonnen, was ebenfalls an Schwierigkeiten bei der Aufarbeitung

lag.[123] Da die Synthese des Triphosphat-Prodrugs 97 über die Phosphoramiditroute bei

GOLLNEST mit zahlreichen Schwierigkeiten verbunden war, sollte in dieser Arbeit für die

Synthese der nicht-symmetrisch maskierten TriPPPro-Verbindung 104 die

H-Phosphonatroute verwendet werden, da bereits eine nicht-symmetrisch maskierte

TriPPPro-Verbindung über diese Methode in einer Ausbeute von 20% erfolgreich dargestellt

werden konnte.[123]

8.5.1 Synthese des nicht-symmetrisch maskierten TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs

104

Um eine Vergleichbarkeit zwischen den DiPPro- und den TriPPPro-Verbindungen zu

gewährleisten, sollten jeweils die gleichen Maskeneinheiten verwendet werden. Somit sollte

als nicht-symmetrisch maskiertes Triphosphat-Prodrug das C4/C14-TriPPPro-6-Prop-

ddBCNATP 104 dargestellt werden.

Die Synthese der benötigten 4-(Hydroxymethyl)-phenylalkanoate wurde bereits in

Abschnitt 8.4.3 beschrieben. Das H-Phosphonat, woraus in der anschließenden Synthese

das Pyrophosphat-Reagenz dargestellt wird, wurde durch Reaktion von Diphenylphosphonat

(DPP) 156 mit den 4-(Hydroxymethyl)-phenylalkanoaten gebildet. Bei -20 °C wurde

4-(Hydroxymethyl)-phenylpentanoat 143, gelöst in Pyridin, langsam zu DPP 156 gegeben.

Die langsame Zugabe bei tiefen Temperaturen sollte eine Zweifachsubstitution vermeiden.

Zum vollständigen Umsatz wurde auf Raumtemperatur erwärmt. Anschließend wurde wieder

bei -20 °C 4-(Hydroxymethyl)-phenylpentadecanoat 147, gelöst in Pyridin, hinzugefügt, um

das nicht-symmetrisch substituierte H-Phosphonat 157 zu erhalten. Die Reinigung des

Rohprodukts mittels Säulenchromatographie stellte eine Herausforderung dar. Um eine

Zersetzung des Produkts zu vermeiden, wurde zum Laufmittel 0.5% Essigsäure zugesetzt.


104

Neben dem gewünschten nicht-symmetrischen Produkt wurden bei der Synthese ebenfalls

die beiden symmetrischen H-Phosphonate gebildet. Diese waren aufgrund ihrer ähnlichen

Laufeigenschaften nur sehr schwer abzutrennen, so dass das gewünschte H-Phosphonat

157 erst nach mehrmaliger Chromatographie in einer sehr geringen Ausbeute von 15%

isoliert werden konnte (Abb. 112). Auch GOLLNEST konnte das C1/C8-H-Phosphonat nur in

einer Ausbeute von 38% darstellen,[123] wobei dabei der Lipophilie-Unterschied der

möglichen Produkte noch größer sein sollte, womit eine chromatographische Trennung

einfacher wird. Es ist damit für die sinnvolle Nutzung der H-Phosphonatroute für nicht-

symmetrisch maskierte TriPPPro-Verbindungen zwingend erforderlich, einen anderen Weg

zur Synthese der entsprechenden H-Phosphonate zu entwickeln. Für die Synthese eines

Triphosphat-Prodrugs reichte die synthetisierte Menge an H-Phosphonat jedoch aus, sodass

in dieser Arbeit auf eine Optimierung der Synthese verzichtet wurde.

Abb. 112: Synthese des C4/C14-Acyloxybenzyl-H-Phosphonats 157.

Das H-Phosphonat 157 wurde durch oxidative Chlorierung mit N-Chlorsuccinimid (NCS) zum

Intermediat 158 umgesetzt. Durch diese Aktivierung konnte anschließend ein nucleophiler

Angriff des Tetra-n-butylammoniumphosphats stattfinden, sodass das Pyrophosphatreagenz

159 gebildet wurde. Das überschüssige Phosphatsalz und NCS bzw. Succinimid konnten

durch wässrige Aufarbeitung abgetrennt werden. Hierbei war es unbedingt notwendig eine

schnelle Phasentrennung durch Zentrifugation zu erreichen, da sich sonst das Produkt

aufgrund der Hydrolyseempfindlichkeit zersetzt. Nach diesem Protokoll wurde das

Pyrophosphatreagenz 159 in einer Ausbeute von 88% erhalten (Abb. 113). Das Reagenz ist

nicht über einen längeren Zeitraum stabil und sollte immer möglichst frisch in weiteren

Synthesen eingesetzt werden.

147

143

157

156


105

Abb. 113: Synthese des C4/C14-Acyloxybenzyl-Pyrophosphatreagenzes 159.

Die Reaktionsabfolge zum Triphosphat-Prodrug wird im Folgenden erläutert und ist in

Abb. 114 dargestellt. Um das instabile Pyrophosphatreagenz in Lösung zu stabilisieren und

eine schnelle Zersetzung zu verhindern, wird es zunächst mit Trifluoressigsäureanhydrid

(TFAA) in ein stabileres gemischtes Anhydrid überführt. Die Entfernung des Überschusses

an TFAA erfolgt unter vermindertem Druck. Um die Elektrophilie des Phosphorzentrums zu

erhöhen und eine Umsetzung mit dem Nucleosidmonophosphat zu begünstigen, wird das

gemischte Anhydrid mit 1-Methylimidazol zu einem Imidazolidat umgesetzt. Der

abschließende Schritt zur TriPPPro-Verbindung erfolgt durch Zugabe des Nucleosid-

monophosphats. Mit dieser Methode konnten meist Ausbeuten um die 40% erreicht werden.

Abb. 114: Stabilisierung und anschließende Aktivierung des Pyrophosphatreagenzes.

Nach der gleichen Reaktionsabfolge wurde bei der Synthese des C4/C14-TriPPPro-6-Prop-

ddBCNATPs 104 vorgegangen. Als Nucleosidmonophosphat wurde das 6-Prop-ddBCNAMP

128 als Triethylammoniumsalz eingesetzt. Mit der optimierten Reinigungsmethode aus RP-

Chromatographie und Ionenaustausch, die auch schon bei den Diphosphat-Prodrugs

eingesetzt wurde, konnte das nicht-symmetrisch maskierte C4/C14-TriPPPro-6-Prop-

ddBCNATP 104 in einer guten Ausbeute von 49% erhalten werden (Abb. 115).

158 159 157


106

Abb. 115: Synthese des nicht-symmetrisch maskierten C4/C14-TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 104.

Das 31P-NMR-Spektrum und das RP-HPLC-Chromatogramm des nicht-symmetrisch

maskierten C4/C14-TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 104 demonstriert die hohe Reinheit in der

die Zielverbindung gewonnen werden konnte (Abb. 116). Bei den Triphosphat-Prodrugs

wurde bei den HPLC-Läufen ein flacherer Acetonitrilgradient gewählt, um bei den

Hydrolysestudien eine bessere Trennung des Nucleosiddi- und des -triphosphats zu

erreichen. Mit dieser Methode wurde eine Retentionszeit von 17.7 Minuten ermittelt. Mit der

Methode E, die für die DiPPro-Verbindungen verwendet wurde, lag die Retentionszeit bei

16.2 Minuten.

A

128

159 104


107

Abb. 116: A: 31

P-NMR-Spektrum des C4/C14-TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 104; B: RP-HPLC-

Chromatogramm des C4/C14-TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 104 (Methode F, 330 nm).

8.5.2 Synthese des monomaskierten TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 105

In Analogie zu der bereits beschriebenen monomaskierten DiPPro-Verbindung 103

(Abschnitt 8.4.4) sollte ebenfalls das C17-monomaskierte TriPPPro-6-Prop-ddBCNATP 105

untersucht werden. Nach den Schwierigkeiten bei der Synthese des nicht-symmetrischen

H-Phosphonats 157 sollte das Prodrug über die Phosphoramiditroute dargestellt werden.

Zumal das 9-Fluorenylmethyl-(4-octadecanoyloxybenzyl)-N,N-diisopropylaminophosphor-

amidit 150 bereits vorlag (Abschnitt 8.4.4). Allerdings musste für diese Route das BCNA-

Diphosphat synthetisiert werden.

Eine Synthese des 6-Prop-ddBCNADP 155 ist bereits beschrieben.[123] Hierbei wurde die

cycloSal-Technik (Abschnitt 8.4.1) verwendet, wobei der cycloSal-Triester mit Tetra-n-

butylammoniumphosphat als Nucleophil zum Nucleosiddiphosphat geöffnet wurde. Jedoch

konnte das 6-Prop-ddBCNADP 155 nur in einer Ausbeute von 17% gewonnen werden, da

durch Schwierigkeiten bei der Aufarbeitung und Reinigung erst der Einsatz verschiedener

Ionenaustauscher und mehrere RP-Chromatographieläufe zur Isolierung des Produkts

führte.[123] Aufgrund dieser unerfreulichen Ausbeute, sollte eine andere Syntheseroute

verwendet werden.

Da das 6-Prop-ddBCNA-Monophosphat 128 unter Verwendung des Bis(fluorenylmethyl)-

geschützten Phosphoramidits 134 und anschließender basischer Abspaltung in sehr guten

Ausbeuten dargestellt werden konnte (Abschnitt 8.4.1), sollte das Diphosphat ebenfalls auf

diesem Weg gewonnen werden.

Injektionspeak

104

B


108

Zudem wurden von CREMOSNIK über diese Route bereits erfolgreich unterschiedliche

Nucleosiddi- und -triphosphate dargestellt.[162] Das beschriebene Protokoll der Kupplung

besteht aus vier Schritten: die saure Aktivierung, die Oxidation, die Entschützung und die

Reinigung durch Kristallisation. Es gab jedoch in unserer Gruppe Probleme bei der

Reinigungsmethode durch Kristallisation, da damit Monophosphat-Verunreinigungen nicht

vollständig abgetrennt werden konnten. Somit wurde in Zusammenarbeit mit JOHANNA

HUCHTING ein alternatives Protokoll entwickelt.

Zunächst erfolgte die Kupplung des 6-Prop-ddBCNAMP 128 mit dem BisFm-Phosphoramidit

134 analog zu der in Abschnitt 8.4.1 beschriebenen Monophosphat-Synthese mit DCI als

saurem Aktivator. Die Oxidation des β-Phosphats wurde ebenfalls mit tert-Butylhydroperoxid

durchgeführt. Die Abspaltung der Fm-Gruppe erfolgte dagegen schrittweise (Abb. 117).

Abb. 117: Synthese des 6-Prop-ddBCNADPs 155.

Nach der Entfernung einer Fm-Einheit unter Wasserausschluss mit 5% Triethylamin und

einer Reaktionszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur folgte eine RP-Chromatographie,

wodurch DCI-Salze und das Nucleosidmonophosphat leicht abgetrennt werden konnten und

das einfach geschützte Diphosphat 160 erhalten wurde. Gerade die Abtrennung des

Monophosphats bereitet bei anderen Synthesemethoden große Probleme, da es aufgrund

der ähnlichen Polarität nur schwer vom Nucleosiddiphosphat separiert werden kann.[123]

Während der Abspaltung der zweiten Fm-Gruppe mit Triethylamin ist keine Spaltung der

Phosphoranhydridbindung zu befürchten, da die Bindung durch die zusätzliche negative

Ladung am β-Phosphat stabilisiert wird. So wurde das 6-Prop-ddBCNADP 155 als

160 155

134

128


109

Triethylammoniumsalz nach chromatographischer Reinigung in einer sehr guten Ausbeute

von 83% isoliert (Abb. 117).

Dies bedeutet eine enorme Steigerung gegenüber den 17%, die über die cycloSal-Technik

erreicht wurden.[123] Die hohe Ausbeute, die über die in dieser Arbeit optimierte

Phosphoramiditroute erreicht wurde, liegt an dem guten Umsatz bei der Kupplung und der

Spaltung der Fm-Gruppe und vor allem in der einfachen Reinigung des Produkts, durch

vorherige Abtrennung der polaren Verunreinigungen. Dieses Syntheseprotokoll sollte auch

auf eine Vielzahl anderer Nucleotide übertragbar sein und das Problem der schwierigen

Diphosphat-Synthese beheben.

Die Kupplung des Nucleosiddiphosphats 155 mit 9-Fluorenylmethyl-(4-octadecanoyloxy-

benzyl)-N,N-diisopropylaminophosphoramidit 150 wurde nach dem gleichen Protokoll

durchgeführt, das sich bereits bei der Synthese des monomaskierten Diphosphat-Prodrugs

103 (Abschnitt 8.4.4) bewährt hatte. Bei der Kupplung wurde DCI als Aktivator eingesetzt,

das γ-Phosphat mit tert-Butylhydroperoxid oxidiert und die Fm-Gruppe mit Triethylamin

abgespalten. Mit der optimierten Reinigungsmethode aus Chromatographie und

Ionenaustausch konnte das C17-monomaskierte TriPPPro-6-Prop-ddBCNATP 105 in einer

Ausbeute von 25% gewonnen werden (Abb. 118).

Abb. 118: Synthese des C17-monomaskierten TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 105.

Warum die Ausbeute vergleichsweise gering ausfiel, konnte nicht ermittelt werden. Da die

Kupplung quantitativ verlief und bei der Oxidation auch keine Ausbeuteverluste zu erwarten

sind, muss entweder die Abspaltung der Fm-Einheit oder die Reinigung optimiert werden.

Dennoch lag die Ausbeute im Bereich der Ausbeuten, die mit der cycloSal-Methode von

GOLLNEST erreicht wurden (26 - 30%).

Wie anhand des 31P-NMR-Spektrums und des HPLC-Chromatogramms zu erkennen ist

(Abb. 119), wies das C17-monomaskierte TriPPPro-6-Prop-ddBCNATP 105 eine hohe

Reinheit auf. Die Retentionszeit des Prodrugs lag bei 16.1 Minuten.

155 150

105


110

Abb. 119: A: 31

P-NMR-Spektrum des C17-monomaskierten TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 105; B: RP-

HPLC-Chromatogramm des C17-monomaskierten TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 105 (Methode F,

330 nm).

Es konnten somit das symmetrisch, das nicht-symmetrisch und das monomaskierte

Diphosphat-Prodrug 94, 102 und 103 und in Analogie dazu das nicht-symmetrisch und das

monomaskierte Triphosphat-Prodrug 104 und 105 erfolgreich in guten bis sehr guten

Ausbeuten dargestellt werden. Diese fluoreszierenden Prodrugs standen nun für Hydrolyse-

und Zellaufnahmestudien zur Verfügung.

Injektionspeak

105

B

A


111

8.6 Cf1743-Prodrugs

Zusätzlich zu den fluoreszierenden Prodrugs für Untersuchungen in Zellaufnahmestudien

sollten eine DiPPro- und eine TriPPPro-Verbindung des hoch potenten anti-VZV-Nucleosids

Cf1743 100 zur Aufklärung des Wirkmechanismus dargestellt werden.

8.6.1 Synthese der Cf1743-Prodrugs

Um Nebenreaktionen bei der Monophosphat-Synthese zu vermeiden, wurde die

3‘-Hydroxylgruppe des Nucleosids mit einer Acetylgruppe geschützt. Die fluoreszierende

Base wurde analog zum 6-Pent-ddBCNA 116 (Abschnitt 8.2) mittels Sonogashira-Reaktion

und anschließender 5-endo-dig-Cyclisierung in einer one-pot-Reaktion gebildet (Abb. 120).

Es wurde vom kommerziell verfügbaren 5-Iod-2‘-desoxyuridin 161 ausgegangen. Die

selektive Schützung der 3‘-Hydroxylgruppe erfolgte durch Einsatz einer orthogonalen

Schutzgruppenstrategie. In einer one-pot-Reaktion wurde erst die 5‘-Hydroxylgruppe mit

tert-Butyldimethylsilylchlorid umgesetzt und anschließend die 3‘-Hydroxylgruppe acetyliert.

Das geschützte Nucleosid 162 wurde in einer Ausbeute von 89% erhalten. Anschließend

erfolgte die Abspaltung der TBDMS-Gruppe mit Triethylamin-Trihydrofluorid als Fluoridionen-

Donor, ohne die Acetylgruppe zu beeinflussen. Das 3‘-Acetyl-geschützte Nucleosid 163

wurde in einer Ausbeute von 93% isoliert. Die Sonogashira-Kupplung dieses Nucleosids 163

mit 4-n-Pentylphenylacetylen erfolgte mit Tetrakis(triphenylphosphin)-palladium(0), Kupfer(I)-

iodid und Diisopropylethylamin. Nach Cyclisierung mit Kupfer(I)-iodid und Triethylamin wurde

3’-Ac-Cf1743 164 gebildet und nach säulenchromatographischer Reinigung und

Kristallisation in Dichlormethan in einer Ausbeute von 76% gewonnen.

Abb. 120: Synthese des 3‘-Ac-Cf1743 164. 164

163

162 161


112

Die Umsetzung des 3’-Ac-Cf1743 164 zum Monophosphat 165 erfolgte über den BisFm-

geschützten Phosphattriester 166 (Abb. 121). Diese Route konnte bereits erfolgreich für die

Darstellung des 6-Prop-ddBCNAMPs 128 (Abschnitt 8.4.1) genutzt werden. Allerdings

bereiteten die Entschützung und die anschließende Reinigung Probleme. Das Fm-

geschützte Nucleotid 166 war nur unzureichend in einem Gemisch aus Acetonitril und

Wasser (1:1 v/v) löslich, weswegen noch Methanol zugesetzt wurde. Zudem lief die

Abspaltung der Acetylgruppe nur sehr langsam ab. Auch war die anschließende

chromatographische Reinigung problematisch. Das Cf1743-Monophosphat 165 war aufgrund

der lipophilen Nucleobase nur schlecht in Wasser löslich. Somit musste Acetonitril zum

Auftragen bei der RP-Chromatographie zugesetzt werden, was die Trennung negativ

beeinflusste und diese darum mehrmals durchgeführt werden musste, was zu hohen

Ausbeuteverlusten führte.

Abb. 121: Synthese des Cf1743-Monophosphats 165.

Die Synthese des Diphosphat-Prodrugs 106 wurde nach der etablierten Phosphoramidit-

Kupplung und anschließender Oxidation mit tert-Butylhydroperoxid durchgeführt (Abb. 122).

Bei der Reaktion konnte mittels HPLC-Verfolgung eine Bildung der monomaskierten DiPPro-

Verbindung durch Abspaltung einer Maskeneinheit beobachtet werden, die durch NMR-

spektroskopische Untersuchungen bestätigt wurde. Aufgrund der starken Zunahme des

Nebenprodukts wurde die Reaktion vor dem vollständigen Umsatz des Monophosphats

abgebrochen, um eine äquimolare Abspaltung der Maske zu verhindern. Auch die

chromatographische Reinigung der DiPPro-Verbindung 106 verlief aufgrund der schlechten

Löslichkeit des Produkts mit Ausbeuteverlusten. Die geringe Ausbeute von nur 5% ist somit

auf die Bildung des Intermediats, den nicht vollständigen Umsatz des Monophosphats und

die Schwierigkeiten bei der Reinigung zurückzuführen.

166 164 165


113

Abb. 122: Synthese des C9-DiPPro-Cf1743DPs 106.

Da schon das Cf1743-Monophosphat 165 nur in einer moderaten Ausbeute erhalten werden

konnte, sollte das Triphosphat-Prodrug 100 über die H-Phosphonatroute synthetisiert

werden. Damit kann die Synthese des Cf1743-Diphosphats umgangen werden.

Die Darstellung des Pyrophosphatreagenzes 167 erfolgte nach der von GOLLNEST

entwickelten Methode.[120] Im ersten Schritt wurde Diphenylphosphonat (DPP) 156 mit

4-(Hydroxymethyl)-phenyldecanoat 139 umgesetzt. Nach Umkristallisation aus Methanol

wurde Bis(4-decanoyloxybenzyl)-phosphonat 168 in einer Ausbeute von 50% erhalten

(Abb. 123). Der Umsatz zum gewünschten H-Phosphonat 168 war deutlich besser als es die

Ausbeute vermuten lässt. Bei der Umkristallisation fiel das Produkt nicht quantitativ aus, so

dass versucht wurde das in Lösung verbliebene Rohprodukt säulenchromatographisch zu

reinigen. Dies führte jedoch zur vollständigen Zersetzung des Produkts. Die problematische

säulenchromatographische Reinigung der H-Phosphonate wurde bereits bei der Reinigung

des nicht-symmetrisch maskierten H-Phosphonats 157 (Abschnitt 8.5.1) beobachtet.

Abb. 123: Synthese des Bis(4-decanoyloxybenzyl)-pyrophosphats 167.

Die Darstellung des Diphosphatreagenzes 167 erfolgte durch Aktivierung des H-Phos-

phonats 168 mit NCS und anschließender Umsetzung mit Tetra-n-butylammoniumphosphat,

165 106

140

168

156

167

139


114

welche quantitativ verlief. Dass das Produkt trotzdem nur ein einer Ausbeute von 52% isoliert

werden konnte, lag an einem präparativen Fehler bei der Aufarbeitung, wodurch sich das

labile Produkt teilweise zersetzt hat. Das instabile Pyrophosphat 167 wurde umgehend in der

TriPPPro-Synthese eingesetzt.

Die Synthese des C9-TriPPPro-Cf1743TPs 107 wurde nach dem in Abschnitt 8.5.1

vorgestellten Protokoll durchgeführt. Zunächst erfolgte eine Stabilisierung des

Pyrophosphats 167 mit Trifluoressigsäureanhydrid, um anschließend durch Umsetzung mit

1-Methylimidazol den nucleophilen Angriff des Nucleosidmonophosphats 165 zu begünstigen

(Abb. 124). Bei der Reaktionsverfolgung mittels HPLC wurde, wie bei der Synthese des

Diphosphat-Prodrugs 106, die Zersetzung des Produkts zur monomaskierten TriPPPro-

Verbindung beobachtet, die durch NMR-spektrospkopische Untersuchungen bestätigt wurde.

Nach dem bewährten Reinigungsprotokoll aus RP-Chromatographie und Ionenaustausch

wurde das C9-TriPPPro-Cf1743TPs 107 als Ammoniumsalz in einer Ausbeute von 19%

gewonnen. Die geringe Ausbeute ist wieder auf die Bildung des monomaskierten

Nebenprodukts und die schwierige Reinigung zurückzuführen.

Abb. 124: Synthese des C9-TriPPPro-Cf1743TPs 107.

Die DiPPro- und die TriPPPro-Verbindung 106 und 107 des Cf1743 100 konnten erstmals

erfolgreich dargestellt werden, wenn auch nur in moderaten Ausbeuten, und standen damit

für antivirale Tests zur Verfügung.

8.6.2 Antivirale Aktivität der Cf1743-Prodrugs

Wie bereits in Abschnitt 6.6.1 beschrieben, sind das Cf1743 100 und das entsprechende

Nucleosid-Prodrug FV100 101 heutzutage die potentesten Verbindungen gegen VZV. Ihre

Selektivität gegen VZV beruht auf der viralen Thymidinkinase, die als einziges bekanntes

Enzym die Phosphorylierung des Nucleosids zum entsprechenden Mono- und Diphosphat

katalysiert. Jedoch ist der Wirkmechanismus noch weitgehend unbekannt. Durch das

Einbringen des Di- bzw. Triphosphats in den intrazellulären Raum, durch die Verwendung

165

167

107


115

der Prodrugs 106 und 107, sollten über die ermittelten antiviralen Aktivitäten neue

Erkenntnisse gewonnen werden. Die antiviralen Tests wurden von J. BALZARINI und D.

SCHOLS, Rega Institute KU Leuven (Belgien), durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tab. 3

zusammengefasst.

Tab. 3: Antivirale Daten der Cf1743-Prodrugs 106 und 107.

EC50 [µM](a) Zytotoxizität [µM]

Verbindung TK+-VZV TK--VZV MCC(b) CC50(c)

C9-DiPPro-Cf1743DP 106 <0.032 2.19 20 20.68

<0.032 8.36 100 21.14

C9-TriPPPro-Cf1743TP 107 <0.032 2.53 20 20.10

<0.032 8.41 100 21.23

(a) 50% effektive Konzentration zur Unterdrückung der Virusreplikation. (b) Minimale zytotoxische Konzentration

bei der mikroskopisch eine Veränderung der Zellmorphologie beobachtet werden kann. (c) Zytotoxische

Konzentration bei der das Zellwachstum um 50% reduziert ist.

Die Verbindungen 106 und 107 zeigen in Zellen, in denen die VZV-Thymidinkinase

vorhanden ist, eine hohe antivirale Aktivität. Allerdings geht diese Aktivität in TK-defizienten

Zellen fast vollständig verloren. Daraus kann gefolgert werden, dass die hohe Aktivität durch

Cf1743 100 hervorgerufen wird, was durch Dephosphorylierung der Metabolite der

Verbindungen entsteht. Hierdurch können keine Rückschlüsse auf dem Wirkmechanismus

der BCNAs gezogen werden. Die Bildung signifikanter Mengen des Nucleosids, nach einer

gewissen Zeit, ist jedoch bei dem Einsatz aller DiPPro- und TriPPPro-Verbindungen zu

erwarten. Dieser Ansatz ist damit für diese Fragestellung nicht geeignet.

8.7 Hydrolyseverhalten der fluoreszierenden Prodrugs

Die Eignung der BCNAs als Fluoreszenzsonden setzt, neben einer ähnlichen Lipophilie und

Stabilität der Prodrugs, auch entsprechende Hydrolyseeigenschaften voraus. Wie in

Abschnitt 6.6.1 beschrieben, wurde bereits die Hydrolyse von verschiedenen BCNA-

Prodrugs in Phosphat-Puffer (pH 7.3) und CEM/0-Zellextrakt von PERTENBREITER und

GOLLNEST mittels HPLC mit UV-Detektion untersucht. Bei den Zellextrakt-Hydrolysen

ermöglicht das unnatürliche Absorptionsmaximum der BCNAs um die 330 nm eine von den

Zellbestandteilen unabhängige Detektion der Metabolite. Dies ist ein großer Vorteil, da die

gebildeten Nucleosidmono- und -diphosphate häufig von Zellbestandteilen überlagert

werden.[123,135] Zu den untersuchten BCNA-Prodrugs gehörten auch das Monophosphat-

Prodrug 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89 und das Diphosphat-Prodrug C9-DiPPro-6-Prop-

ddBCNADP 94, die ebenfalls in dieser Arbeit verwendet wurden.


116

Bei dem 3-Me-cycloSal-Prodrug 89 wurde die erfolgreiche Freisetzung des Monophosphats

in Phosphat-Puffer und CEM/0-Zellextrakt bestätigt. Aufgrund der umfangreichen

Untersuchungen von PERTENBREITER, die die Eignung der BCNA-Monophosphat-Prodrugs

als Modellsystem unterstreichen,[135] wurden in dieser Arbeit die Hydrolysestudien mit dem

3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNA 89 nicht reproduziert.

Bei dem Diphosphat-Prodrug C9-DiPPro-6-Prop-ddBCNADP 94 erfolgt die Freisetzung des

Diphosphats in Phosphat-Puffer und CEM/0-Zellextrakt über das C9-monomaskierte

Intermediat.[135] Um die Eigenschaften dieses Prodrugs mit den anderen DiPPro-

Verbindungen vergleichen zu können, wurde die Hydrolyse in CEM/0-Zellextrakt wiederholt.

Da bereits umfangreiche Untersuchungen der Hydrolyse von etlichen DiPPro- und TriPPPro-

Verbindungen durchgeführt wurden und in allen Fällen die erfolgreiche Freisetzung des

jeweiligen Nucleosiddiphosphats bestätigt werden konnte,[117,118,122,124,164,165] wurde auf die

Durchführung von Hydrolysestudien in Phosphat-Puffer, der in dieser Arbeit synthetisierten

Verbindungen, verzichtet.

8.7.1 Hydrolyse des symmetrisch maskierten C9-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 94

Für die Bestimmung der anti-HIV-Aktivität der Prodrugs wurden CEM-Zellen verwendet,

somit sollte dieser Zelltyp auch für die Zellaufnahmestudien eingesetzt werden. Um die

Metabolisierung der Verbindungen in diesem Zelltyp vorab zu simulieren, wurden die

Zellextrakthydrolysen mit CEM-Zellextrakt durchgeführt.

Die Prodrugs wurden in CEM/0-Zellextrakt bei 37 °C inkubiert. Die verwendeten Zellextrakte

stellten J. BALZARINI und D. SCHOLS zur Verfügung. Für jeden Messwert wurde jeweils eine

Hydrolyselösung angesetzt und für den Nullwert, anstatt des Zellextrakts, Wasser verwendet.

Nach der entsprechenden Inkubationszeit erfolgte die Fällung der Zellbestandteile durch

Zugabe von Methanol. Es folgten eine Behandlung im Ultraschallbad, Zentrifugation und

Filtration. Diese Proben wurden anschließend mittels RP-HPLC mit UV-Detektion mit einer

Anregungswellenlänge von 330 nm untersucht. Die Chromatogramme der Hydrolyse-

verfolgung des C9-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 94 sind in Abb. 125 gezeigt. Es ist deutlich

die Abnahme des Prodrugs 94 und die Bildung des C9-mono-DiPPro-BCNADPs 169, des

BCNADPs 155, des BCNAMPs 128 und des Nucleosids 116 zu erkennen. Die Peaks des

Tri-, Di- und Monophosphats, sowie des Nucleosids, wurden mittels Coinjektion zugeordnet.

Dass es sich bei dem Peak bei 12.6 Minuten um das C9-monomaskierte Intermediat handelt,

wurde aufgrund der Retentionszeit und des bekannten Hydrolysewegs der DiPPro-

Verbindungen angenommen.


117

Abb. 125: Hydrolyseverlauf des symmetrisch maskierten C9-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 94 in

CEM/0-Zellextrakt (HPLC-Methode D, 330 nm).

Zur Berechnung der Hydrolysehalbwertszeit des Diphosphat-Prodrugs wurden die Integrale

der entsprechenden Peaks gegen die Hydrolysedauer aufgetragen. Aufgrund der geringen

Konzentration der Hydrolyselösung wurde eine Reaktion pseudo-erster Ordnung

angenommen und mithilfe eines Kalkulationsprogramms exponentielle Ausgleichskurven

ermittelt. Aus der dadurch bestimmten Geschwindigkeitskonstante k konnte die

Halbwertszeit berechnet werden. Die Halbwertszeit des C9-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 94

betrug 199 Minuten und stimmte gut mit der von PERTENBREITER bestimmten Zeit für dieses

Prodrug überein (192 Minuten)[135].

Die in Abb. 126 dargestellte Auftragung der Peakflächen gegen die Inkubationszeit

veranschaulicht nicht nur die exponentielle Abnahme der Prodrugkonzentration, sondern

auch die Zunahme der verschiedenen Hydrolyseprodukte. Es wurden nur geringe Mengen

des monomaskierten Intermediats 169 detektiert, was für eine in etwa gleich schnelle

Spaltung der zweiten Maske im Vergleich zur ersten Maske unter Freisetzung des BCNA-

Diphosphats 155 spricht. Es wurde zunächst ein starker Anstieg des Diphosphats 155

beobachtet. Die anwesenden Phosphatasen sorgen allerdings für eine schrittweise

Dephosphorylierung zum entsprechenden Monophosphat 128 und schließlich zum Nucleosid

116. Dadurch, dass mit der Zeit immer weniger Diphosphat gebildet wird und die

Dephosphorylierung kontinuierlich abläuft, ist ab etwa 30 Stunden mehr Monophosphat im

Vergleich zum Diphosphat in Lösung vorhanden. Nach 10 Stunden ist erstmals die Bildung

des Nucleosids zu erkennen. Die von PERTENBREITER bestimmte Halbwertszeit des 6-Prop-

C9-mono-DiPPro-BCNADP 169

Injektionspeak

C9-DiPPro-BCNADP 94

BCNADP 155

BCNAMP 128

BCNA 116


118

ddBCNADPs 155 in CEM/0-Zellextrakt von 5 Stunden und des 6-Prop-ddBCNAMPs 128 von

3 Stunden[135] stimmt mit den Beobachtungen überein.

Abb. 126: Verlauf der Hydrolyse des symmetrisch maskierten C9-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 94 in

CEM/0-Zellextrakt.

8.7.2 Hydrolyse des nicht-symmetrisch maskierten C4/C14-DiPPro-6-Prop-

ddBCNADPs 102

Die Hydrolyse des nicht-symmetrisch maskierten C4/C14-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 102

und damit die Freisetzung des BCNA-Diphosphats 155 kann über zwei verschiedene

monomaskierte Intermediate erfolgen, dem C14-monomaskierten Intermediat 170 oder dem

C4-monomaskierten Intermediat 171. Allerdings sollte in Zellextrakt die Spaltung des

kurzkettigen Acylesters schneller ablaufen, sodass hauptsächlich das C14-monomaskierte

Intermediat 170 entstehen sollte, woraus anschließend das Diphosphat 155 freigesetzt

wird.[163]

Der Hydrolyseverlauf des nicht-symmetrisch maskierten C4/C14-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs

102 in CEM/0-Zellextrakt ist in Abb. 127 dargestellt. Es ist wie bei der symmetrisch

maskierten DiPPro-Verbindung 94 eine Abnahme und nach 5 Tagen ein vollständiger

Umsatz des Prodrugs 102 zu erkennen. Zudem wurden das C14-monomaskierte Intermediat

170 und das C4-monomaskierte Intermediat 171 detektiert, wobei das C4-monomaskierte

Intermediat 171 nur eine untergeordnete Rolle spielt. Die Hydrolyse des Prodrugs findet

hauptsächlich durch Spaltung der labileren Maske unter Bildung des C14-monomaskierten

Intermediats 170 statt, woraus anschließend das gewünschte BCNADP 155 freigesetzt wird.


119

Das Diphosphat wird durch Phosphatasen schrittweise erst zum BCNAMP 128 und dann

zum Nucleosid 116 dephosphoryliert. Das BCNAMP 128 kann zudem aus dem Prodrug

durch den Bruch der Phosphoranhydridbindung entstehen. Für das C4/C14-DiPPro-6-Prop-

ddBCNADP 102 wurde eine Hydrolysehalbwertszeit in Zellextrakt von 216 Minuten bestimmt.

Diese ist überraschender Weise fast identisch mit der Hydrolysehalbwertszeit des

symmetrischen Prodrugs 94 (199 Minuten). Eigentlich wurde eine schnellere Hydrolyse des

nicht-symmetrisch maskierten Prodrugs durch eine schnelle Abspaltung der labileren

Pentanoyloxybenzyl-Einheit erwartet.

Abb. 127: Hydrolyseverlauf des nicht-symmetrisch maskierten C4/C14-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs

102 in CEM/0-Zellextrakt (HPLC-Methode D, 330 nm).

Zur Veranschaulichung des Hydrolyseverlaufs sind in Abb. 128 die Peakflächen gegen die

Inkubationszeit aufgetragen. Es ist die exponentielle Abnahme der Konzentration des

Diphosphat-Prodrugs 102 zu sehen. Das C14-monomaskierte DiPProBCNADP 170 wird

gebildet und ist im Vergleich zum C9-monomaskierten Intermediat 169 (Abb. 126) deutlich

stabiler. Das C4-monomaskierte Intermediat 171 wird, wie erwartet, nur in sehr geringem

Maße gebildet. Es ist ein schneller Anstieg des gewünschten Diphosphats 155 zu erkennen,

welcher erfreulicherweise, im Vergleich zur Hydrolyse des symmetrisch maskierten Prodrugs

94, langsamer wieder abnimmt. Dies ist verständlich, da die Freisetzung des Diphosphats

aus dem C14-monomaskierten Intermediat langsamer stattfindet als aus dem C9-

monomaskierten und somit über eine längere Zeit Diphosphat gebildet wird (vgl. Abb. 126

und Abb. 128). Des Weiteren ist wieder ein kontinuierlicher Anstieg des Monophosphats 128

zu beobachten, das durch Dephosphorylierung des Diphosphats 155 entsteht.


Injektionspeak

C4/C14-DiPPro-BCNADP 102

BCNADP 155

BCNAMP 128

BCNA 116



120

Abb. 128: Verlauf der Hydrolyse des nicht-symmetrisch maskierten C4/C14-DiPPro-6-Prop-

ddBCNADPs 102 in CEM/0-Zellextrakt.

Von WEINSCHENK wurde durch die Verwendung nicht-symmetrisch maskierter Diphosphat-

Prodrugs ein verbessertes Diphosphat/Monophosphat-Verhältnis, mit einem höheren

Diphosphat-Anteil nach einer Hydrolysedauer von 10 Stunden in CEM-Zellextrakt,

beobachtet. Mit dem nicht-symmetrisch maskierten Prodrug C1/C9-DiPPro-AZTDP wurde ein

Verhältnis von AZTDP zu AZTMP von 5:1 und mit dem symmetrisch maskierten Prodrug

C9-DiPPro-AZTDP lediglich ein Verhältnis von 1.5:1 bestimmt. Für die Hydrolyse von AZTDP

in Zellextrakt wurde ein Verhältnis für AZTDP zu AZTMP von 3:1 bestimmt. Dies wurde auf

die schnelle Hydrolyse des nicht-symmetrisch maskierten Prodrugs zum monomaskierten

Intermediat zurückgeführt, aus dem selektiv das Diphosphat freigesetzt wird.[163]

Dieser Trend konnte beim Vergleich der Hydrolyse des nicht-symmetrisch maskierten BCNA-

Prodrugs 102 mit dem symmetrisch maskierten BCNA-Prodrug 94 in CEM-Zellextrakt nicht

bestätigt werden. Für das C4/C14-DiPPro-6-Prop-ddBCNADP 102 wurde nach 10 Stunden ein

Verhältnis BCNADP/BCNAMP von 1.8:1 (s. Abb. 128) und für das C9-DiPPro-6-Prop-

ddBCNADPs 94 ein Verhältnis von 2.5:1 (s. Abb. 126) bestimmt. Da ebenfalls fast identische

Hydrolysehalbwertszeiten der beiden Diphosphat-Prodrugs bestimmt wurden, ist das

ähnliche Verhältnis von NDP/NMP allerdings nicht verwunderlich. Damit kann die Bildung

des Monophosphats durch den Bruch der Phosphoranhydridbindung der Prodrugs innerhalb

des gleichen Zeitrahmens stattfinden. Über einen längeren Zeitraum gesehen, verschiebt

sich das NDP/NMP-Verhältnis dagegen leicht zugunsten des nicht-symmetrisch maskierten

Prodrugs. Nach einer Hydrolysedauer von fünf Tagen liegt das Verhältnis NDP/NMP beim


121

symmetrischen Prodrug 94 schon bei 1:2.3, das des nicht-symmetrischen Prodrugs 102

dagegen erst bei 1:1.6. Dies ist wahrscheinlich auf das stabilere C14-monomaskierte

Intermediat 170 des nicht-symmetrisch maskierten Prodrugs 102 und die damit

einhergehende längere Freisetzung des Diphosphats zurückzuführen.

8.7.3 Hydrolyse des C17-monomaskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 103

Die Hydrolyse des C17-monomaskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 103 ist in Abb. 129

dargestellt. Es ist die Abnahme des Prodrugs 103 und die Bildung des BCNADPs 155

und -MPs 128 zu sehen. Ab einer Inkubationszeit von 10 Stunden ist auch die Bildung des

Nucleosids 116 zu erkennen. Wie zu erwarten war, wurde kein Intermediat detektiert, da

durch die Abspaltung der Octadecanoyloxybenzyl-Einheit direkt das BCNA-Diphosphat 155

freigesetzt wird. Der Grund für das Signal bei 9.8 Minuten ist nicht bekannt. Die vollständige

Hydrolyse des Prodrugs war nicht möglich, da bereits nach 24 Stunden eine Verminderung

der Enzymaktivität des Zellextrakts festgestellt wurde.

Abb. 129: Hydrolyseverlauf des C17-monomaskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 103 in CEM/0-

Zellextrakt (HPLC-Methode D, 330 nm).

Zur besseren Veranschaulichung sind in Abb. 130 die Peakflächen gegen die Inkubationszeit

aufgetragen. Hierbei ist keine stetige exponentielle Abnahme, sondern eine schwankende

Prodrugkonzentration zu erkennen. Dies ist auf die schlechte Löslichkeit und Mizellenbildung

des Prodrugs 103 durch die lange Alkylkette zurückzuführen. Bei der Fällung der

Zellbestandteile mit Methanol präzipitiert zum Teil ebenfalls das Prodrug, was durch Filtration

entfernt und somit mittels HPLC nicht detektiert wird. Gleiche Beobachtungen wurden bereits

von GOLLNEST mit langkettigen TriPPPro-Verbindungen gemacht.[123] Zudem ist die schnelle

Injektionspeak


BCNADP 155

BCNAMP 128

BCNA 116


122

Bildung des BCNA-Diphosphats 155 zu sehen. Weiterhin wird das BCNA-Monophosphat 128

erst zeitverzögert gebildet. Diese Ergebnisse zeigen eindrucksvoll, dass aus dem

monomaskierten Prodrug selektiv das Diphosphat freigesetzt wird. Damit konnte die

Annahme bestätigt werden, dass ein Bruch der Phosphoranhydridbindung durch die

zusätzliche negative Ladung am β-Phosphat verhindert werden kann. Die Bildung des

Monophosphats 128 ist somit ausschließlich auf eine Dephosphorylierung des Diphosphats

155 zurückzuführen. Dies schlägt sich auch in einem hervorragenden NDP/NMP-Verhältnis

wieder. Nach 5 Stunden Inkubationszeit liegt ein Verhältnis von 14:1 und nach 10 Stunden

von 3.5:1 vor. Ab einer Inkubationszeit von 24 Stunden ist keine signifikante Veränderung

der Konzentration der Verbindungen mehr zu beobachten. Also ist von einer Verringerung

der Enzymaktivität des Zellextrakts auszugehen, was verwunderlich ist, da für alle

Hydrolysen die gleiche Charge an Zellextrakt verwendet wurde.

Abb. 130: Verlauf der Hydrolyse des C17-monomaskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 103 in CEM/0-

Zellextrakt.

Aufgrund der Löslichkeitsprobleme des Prodrugs 103 und der damit einhergehenden

Schwankungen der detektierten Konzentration musste die Hydrolysehalbwertszeit indirekt,

über die Bildung aller Hydrolyseprodukte, bestimmt werden. Dies ist, im Gegensatz zu der

Untersuchung von Prodrugs anderer Nucleoside, möglich, da bei einer Anregungs-

wellenlänge von 330 nm keine Überlagerung der Signale durch Zellbestandteile auftritt. Es

wurde die Summe aller Metabolite gegen die Hydrolysedauer aufgetragen (Abb. 131), mit

einem Kalkulationsprogramm eine sigmoidale Ausgleichskurve bestimmt und eine

Hydrolysehalbwertszeit des Prodrugs 103 von 250 Minuten berechnet. Dabei ist die


123

Hydrolysehalbwertszeit des Prodrugs der Zeitpunkt, bei dem die halbe maximale

Konzentration der Metabolite erreicht ist.

Abb. 131: Auftragung der Hydrolyseprodukte des C17-monomaskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs

103 in CEM/0-Zellextrakt gegen die Inkubationszeit.

Die Hydrolysehalbwertszeit liegt damit höher als die der beiden anderen Diphosphat-

Prodrugs 94 und 102. Dies war zu erwarten, da mit steigender Kettenlänge der

Acyloxybenzyleinheit die Stabilität des Prodrugs zunimmt.

8.7.4 Hydrolyse des nicht-symmetrisch maskierten C4/C14-TriPPPro-6-Prop-

ddBCNATPs 104

Bei der Hydrolyse des nicht symmetrisch maskierten C4/C14-TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs

104 kann, analog zu dem nicht-symmetrisch maskierten Diphosphat-Prodrug 102

(Abschnitt 8.7.2), das C14-monomaskierte Intermediat 172 oder das C4-monomaskierte

Intermediat 173 entstehen. In Zellextrakt sollte ebenfalls, wie bei der nicht symmetrisch

maskierten DiPPro-Verbindung 102, die Spaltung des kurzkettigen Acylesters schneller

ablaufen und damit hauptsächlich das C14-monomaskierte Intermediat 172 gebildet werden,

woraus anschließend das BCNA-Triphosphat 174 freigesetzt wird.

Der Hydrolyseverlauf des C4/C14-TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 104 ist in Abb. 132

dargestellt. Wie erwartet, wird hauptsächlich aus dem Prodrug 104 das C14-monomaskierte

Intermediat 172 gebildet, wohingegen das C4-monomaskierte Intermediat 173 nur eine

untergeordnete Rolle spielt. Zudem ist die Bildung des gewünschten BCNA-Triphosphats

174 zu erkennen. Ein weiterer Metabolit ist das Diphosphat 155, das aus dem Prodrug 104


124

durch einen Bruch der Phosphoranhydridbindung oder aus dem Triphosphat 174 durch

Dephosphorylierung entstehen kann. Durch schrittweise Dephosphorylierung entstehen

zudem das BCNA-Monophosphat 128 und das Nucleosid 116.

Abb. 132: Hydrolyseverlauf des nicht-symmetrisch maskierten C4/C14-TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs

104 in CEM/0-Zellextrakt (HPLC-Methode E, 330 nm).

Es wurde eine Hydrolysehalbwertszeit von 227 Minuten für die nicht-symmetrisch maskierte

TriPPPro-Verbindung 104 bestimmt, was im gleichen Bereich wie die Halbwertszeit des

nicht-symmetrisch maskierten Diphosphat-Prodrugs 102 liegt (216 Minuten). Diese

Beobachtung, dass die Geschwindigkeit der Abspaltung der Maskeneinheiten unabhängig

davon ist, ob es sich um eine DiPPro- oder eine TriPPPro-Verbindung handelt, wurde

ebenfalls von GOLLNEST durch Vergleich des C8-TriPPPro-d4TTP mit dem C8-DiPPro-d4TDP

gemacht.[123]

Der Hydrolyseverlauf des C4/C14-TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 104 ist in Abb. 133 durch

Auftragung der Peakflächen gegen die Inkubationszeit dargestellt. Es ist eine exponentielle

Abnahme des Prodrugs zuerkennen. Wie bereits beschrieben, dominiert das C14-

monomaskierte Intermediat 172 gegenüber dem C4-monomaskierten Intermediat 173 als

Hydrolyseprodukt und ist ähnlich stabil wie das C14-monomaskierte DiPPro-6-Prop-

ddBCNADP 170. Zudem ist die Bildung des gewünschten Triphosphats zu sehen. Allerdings

wird sehr schnell auch das Diphosphat gebildet und bereits nach 3 Stunden übersteigt die

Konzentration des Diphosphats 155 die des Triphosphats 174, was für eine unerwünschte

Freisetzung des Diphosphats 155 direkt aus dem Prodrug 104 spricht. Weiterhin ist ein

kontinuierlicher Anstieg des Monophosphats 128 zu beobachten.

C14-mono-TriPPPro-BCNATP 172

Injektionspeak

C4/C14-TriPPPro-BCNATP 104

BCNATP 174

BCNAMP 128

BCNA 116


BCNADP 155


125

Abb. 133: Verlauf der Hydrolyse des nicht-symmetrisch maskierten C4/C14-TriPPPro-6-Prop-

ddBCNATPs 104 in CEM/0-Zellextrakt.

8.7.5 Hydrolyse des C17-monomaskierten TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 105

Die Hydrolyse des C17-monomaskierten TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 105 ist in Abb. 134

dargestellt. Es ist die Abnahme des Prodrugs 105, allerdings mit starken Schwankungen, zu

sehen. Als Hydrolyseprodukt sind das gewünschte BCNA-Triphosphat 174 und das

Diphosphat 155 zu erkennen. Erst nach 5 Tagen wird auch das BCNAMP 128 gebildet.


126

Abb. 134: Hydrolyseverlauf des C17-monomaskierten TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 105 in CEM/0-

Zellextrakt (HPLC-Methode E, 330 nm).

Die Hydrolysehalbwertszeit wurde, wie bei der DiPPro-Verbindung 103 diskutiert

(Abschnitt 8.7.3), aufgrund der starken Schwankungen der detektierten Prodrug-

Konzentrationen, durch Auftragung der Summe der Peakflächen der Hydrolyseprodukte

gegen die Inkubationszeit und Kalkulation einer Ausgleichskurve ermittelt (Abb. 135).

Abb. 135: Auftragung der Hydrolyseprodukte des C17-monomaskierten TriiPPPro-6-Prop-ddBCNATPs

105 in CEM/0-Zellextrakt gegen die Inkubationszeit.

Injektionspeak


BCNATP 174

BCNADP 155

BCNAMP 128


127

Die Hydrolysehalbwertszeit des Prodrugs 105 lag mit 719 Minuten überraschend hoch.

Eigentlich sollte die Halbwertszeit analog zur monomaskierten DiPPro-Verbindung 103 um

die 250 Minuten liegen, wie das von GOLLNEST untersuchte C17-monomaskierte TriPPPro-

d4TTP eine Hydrolysehalbwertszeit von 276 Minuten aufwies.[123] Möglicherweise ist die

Mizellenbildung in wässriger Umgebung bei der TriPPPro-Verbindung 105 ausgeprägter als

bei der DiPPro-Verbindung 103, wodurch die Masken weniger zugänglich für Esterasen

werden. Eine weitere Möglichkeit wäre eine geringe Löslichkeit des Prodrugs, wobei der

nicht gelöste Anteil von den Enzymen nicht umgesetzt werden kann und dadurch die

Hydrolysehalbwertszeit verfälscht wird.

Zur Veranschaulichung des Hydrolyseverlaufs des C17-monomaskierten TriPPPro-BCNATPs

105 sind in Abb. 136 die Peakflächen gegen die Inkubationszeit aufgetragen. Deutlich zu

erkennen sind die Schwankungen der detektierten Prodrugkonzentration, die auf die

teilweise Fällung des Prodrugs bei der Aufarbeitung zurückzuführen sind. Erfreulicherweise

ist zunächst als einziges Hydrolyseprodukt das gewünschte BCNA-Triphosphat 174 zu

beobachten und erst zeitverzögert nimmt das BCNADP 155 langsam zu. Dies bedeutet

einen deutlich verbesserten Hydrolyseverlauf gegenüber dem C4/C14-TriPPPro-BCNATP

104. Die zusätzliche negative Ladung am γ-Phosphat verhindert einen Bruch der Phosphor-

anhydridbindung und ermöglicht eine selektive Freisetzung des BCNATPs 174.

Abb. 136: Verlauf der Hydrolyse des C17-monomaskierten TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 105 in

CEM/0-Zellextrakt.


128

8.7.6 Fazit der Hydrolysen der fluoreszierenden Prodrugs

Es wurde bei allen untersuchten DiPPro- bzw. TriPPPro-Verbindungen die gewünschte

Freisetzung des Diphosphats bzw. Triphosphats beobachtet. Zwischen den Hydrolyse-

verläufen des symmetrisch maskierten und des nicht-symmetrisch maskierten Diphosphat-

Prodrugs 94 und 102 konnten keine gravierenden Unterschiede festgestellt und durch

Verwendung des nicht-symmetrisch maskierten Prodrugs 102 das DP/MP-Verhältnis

gegenüber der symmetrisch maskierten DiPPro-Verbindung 94 nicht verbessert werden. Die

gleiche Beobachtung wurde für die nicht-symmetrisch maskierte TriPPPro-Verbindung 104

gemacht, aus der durch Hydrolyse nicht nur das Triphosphat, sondern auch das Diphosphat

freigesetzt wurde. Bei der Hydrolyse der monomaskierten Prodrugs 103 und 105 wurde

dagegen selektiv das Di- bzw. Triphosphat gebildet. Damit konnte die Annahme bestätigt

werden, dass, durch die zusätzliche negative Ladung an der endständigen Phosphateinheit,

ein Bruch der Phosphoranhydridbindung verhindert werden kann.

8.8 Zellaufnahmestudien mit fluoreszierenden Prodrugs

Das in dieser Arbeit verwendete Monophosphat-Prodrug 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89

und das Diphosphat-Prodrug C11-DiPPro-6-Prop-2‘-dBCNADP 92 wurden bereits in

Zellaufnahmestudien mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Dabei konnte eine

Akkumulation der Verbindungen in den Zellen nachgewiesen werden. Allerdings wurde für

alle untersuchten Verbindungen nur ein schwaches Fluoreszenzsignal detektiert, da ein

schnelles Photobleaching der Fluorophore auftrat.[123] Zudem lässt diese Methode keine

Rückschlüsse auf die intra- und extrazelluläre Metabolisierung zu.

Um Informationen über die Metabolisierung zu erhalten, wurde ebenfalls von PERTENBREITER

die Nutzung der HPLC mit ESI-MS-Detektion als Analysemethode erprobt. Dabei erfolgte

zunächst die Inkubation von CEM-Zellen mit dem jeweiligen Prodrug in Zellkulturmedium

(RPMI-1640 Medium, pH 7.5, 10% fötales Kälberserum, 1% Penicillin/Streptomycin, 200 mM

L-Glutamin). Anschließend wurden die Zellen zweimal intensiv mit PBS gewaschen,

zentrifugiert und bei -78 °C gelagert. Die erhaltene Waschlösung wurde vor der weiteren

Analyse filtriert. Das Zellpellet wurde in einem Methanol/Wasser-Gemisch (2:1 v/v)

suspendiert, im Ultraschallbad behandelt, auf Eis gelagert und zentrifugiert. Der Überstand

wurde ebenfalls filtriert. Die Untersuchung beider Filtrate erfolgte mittels HPLC mit ESI-MS-

Detektion. Die Zellaufnahmestudien wurden mit d4UDP-Prodrugs durchgeführt. Jedoch

konnte mit der Methode nur das d4UMP und kein d4UDP nachgewiesen werden.

Auf diesen Arbeiten aufbauend wurde von GOLLNEST die gleiche Inkubations- und

Aufarbeitungsmethode der CEM-Zellen und Analyse des Zelllysats mittels RP-HPLC für die

Analyse des fluoreszierenden C8-TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 97 verwendet. Allerdings

wurde kein Massendetektor, sondern ein UV- oder Fluoreszenzdetektor genutzt und die


129

Peaks mittels Coinjektion zugeordnet. Dies machte das unnatürliche Absorptionsmaximum

und die Fluoreszenzeigenschaften des BCNAs möglich. Mit dieser Methode konnten

erstmalig die Zellaufnahme einer TriPPPro-Verbindung und die intrazelluläre Freisetzung des

Nucleosidtriphosphats nachgewiesen werden. Diese Methode sollte auch für die

Zellaufnahmestudien der in dieser Arbeit synthetisierten Prodrugs eingesetzt werden.

8.8.1 Zellaufnahmestudien mit dem 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89

Die Inkubationen der CEM-Zellen mit den verschiedenen Prodrugs wurden in

Zusammenarbeit mit ILONA HAUBER am Heinrich-Pette-Institut, Leibniz-Institut für

Experimentelle Virologie, durchgeführt. Bei den von PERTENBREITER durchgeführten

Zellaufnahmestudien wurden Inkubationszeiten von 2 Stunden bzw. 6 Stunden und eine

Konzentration des jeweiligen Prodrugs in der Inkubationslösung von 100 µM bzw. 200 µM

verwendet. GOLLNEST konnte mit Inkubationszeiten von 1 Stunde bzw. 3 Stunden und jeweils

einer Konzentration der TriPPPro-Verbindung 97 von 100 µM gute Ergebnisse erzielen.

Für die Zellaufnahmestudien mit dem 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89 wurde eine

Inkubationszeit von 6 Stunden und eine Konzentration des Prodrugs in der Inkubations-

lösung von 100 µM gewählt. Das Monophosphat-Prodrug 89 hat in CEM-Zellextrakt eine

Hydrolysehalbwertszeit von 15 Stunden[135] und somit sollte nach 6 Stunden bereits eine

detektierbare Menge des Monophosphats 126 gebildet worden sein. Die Inkubation und

Aufarbeitung der Zellen wurde nach dem am Anfang dieses Kapitels (Abschnitt 8.8)

beschriebenen Protokoll durchgeführt. Von PERTENBREITER wurde für die in dieser Arbeit

verwendeten BCNAs eine optimale Anregungswellenlänge von 340 nm und eine maximale

Emissionswellenlänge von 410 nm bestimmt,[135] weshalb diese Einstellungen bei der

Fluoreszenzdetektion verwendet wurden.

Das mit dem Zelllysat mittels Fluoreszenzdetektion erhaltene Chromatogramm ist in

Abb. 137 dargestellt. Da als hoch polare Verbindung nur das 6-H-ddBCNA-Monophosphat

126 erwartet wurde, wurde als Laufmittel ein Gradient aus Wasser und Acetonitril (Methode

F) ohne Zusatz von Ionenpaarreagenzien verwendet. Mit diesem Laufmittelgemisch zeigen

Nucleotide keine nennenswerte Retention bei der RP-Chromatographie und eluieren somit

mit der Laufmittelfront. Im Chromatogramm sind deutliche Signale zu sehen, was für eine

Zellaufnahme von BCNA-Verbindungen spricht. Durch die Messung einer Blindprobe, bei der

der Inkubationslösung DMSO anstatt des Prodrugs zugesetzt wurde, konnte ausgeschlossen

werden, dass es sich bei den Signalen um Zellbestandteile handelt. Tatsächlich konnte

durch Coinjektion das Signal bei 13.4 Minuten dem 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89

zugeordnet werden. Zudem wurde die erfolgreiche Freisetzung des gewünschten

Monophosphats 126 und die Bildung des Nucleosids 115 beobachtet. Die Entstehung des

Nucleosids ist vermutlich auf Dephosphorylierung des Monophosphats 126 durch


130

Phosphatasen zurückzuführen. Welche Verbindung bei 9.7 Minuten eluierte, konnte nicht

ermittelt werden. Die Vermutung, dass es sich dabei um die Nucleobase handelt, konnte

nicht bestätigt werden.

Abb. 137: Ergebnisse der Zellaufnahmestudien des 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMPs 89

(Konzentration des Prodrugs in der Inkubationslösung: 100 µM, Inkubationszeit: 6 h, HPLC-

Methode F, λex = 340 nm, λem = 410 nm).

Um zu ermitteln, ob der Peak bei 1.8 Minuten wirklich nur das 6-H-ddBCNAMP 126 ist,

wurde die Probe erneut mittels RP-HPLC untersucht und diesmal eine Tetrabutylammonium-

phosphat-Lösung als Laufpuffer verwendet. Mit Ionenpaarreagenzien werden geladene

Moleküle zu späteren Retentionszeiten verschoben und können damit besser, aufgrund ihrer

Retentionszeit, zugeordnet werden. Der verwendete Laufpuffer verursachte jedoch einen

starken Untergrund. Das erhaltene Chromatogramm ist in Abb. 138 dargestellt. Bei den

Signalen bei 8 - 9, 15 und 18 Minuten handelt es sich um Puffersignale. Die Ursache hierfür

konnte nicht geklärt werden. Trotz des starken Untergrunds konnten durch Coinjektion die

Signale des Prodrugs 89, des Monophosphats 126 und des Nucleosids zugeordnet werden.

Allerdings ist tatsächlich nur ein Anteil des Signals bei 1.8 Minuten des in Abb. 137

dargestellten Chromatogramms das Monophosphat. Die Hauptkomponente des Signals, die

im zweiten Chromatogramm eine Retentionszeit von 5.9 Minuten aufweist, konnte nicht

identifiziert werden, jedoch muss von einer unerwünschten Metabolisierung ausgegangen

werden. Das Signal bei 1.4 Minuten ist das bei der Synthese des 6-H-ddBCNAMP 126

(Abschnitt 8.3) erhaltene Zersetzungsprodukt. Nichtsdestotrotz konnte intrazellulär 6-H-

ddBCNAMP 126 nachgewiesen werden, was die Zellaufnahme des Prodrugs 89 und die

zumindest teilweise erfolgreiche intrazelluläre Freisetzung des Monophosphats 126 bestätigt.

BCNAMP 126

3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89 BCNA 115


131


(Konzentration des Prodrugs in der Inkubationslösung: 100 µM, Inkubationszeit: 6 h, HPLC-

Methode G, λex = 340 nm, λem = 410 nm).

Damit die Zellaufnahmestudien im Konzentrationsbereich liegen, mit denen die antiviralen

Tests durchgeführt werden, wurde die Konzentration des Monophosphat-Prodrugs 89 in der

Inkubationslösung von 100 µM auf 10 µM reduziert. Ein weiterer Grund für die Reduzierung

der Konzentration war, dass der CC50-Wert des cycloSal-Prodrugs 89 in CEM-Zellen bei

112 µM[135] und damit nur leicht über der verwendeten Konzentration liegt und bei der

Inkubation mit dem Prodrug ein verlangsamtes Zellwachstum beobachtet wurde. Es ist nicht

auszuschließen, dass mit der hohen Konzentration auch weitere zelluläre Prozesse

unbeabsichtigt negativ beeinflusst werden. Zudem wurde die Inkubationszeit auf 15 Minuten

bzw. 60 Minuten reduziert. Weiterhin wurde, um einen Vergleich der Aufnahme der

verschiedenen Prodrugs möglich zu machen, der Inkubationslösung als internen Standard

Cf1743 100 zugesetzt. Es wurde zuvor geprüft, dass es zu keiner Überlagerung des

Nucleosids 100 mit den Prodrugs oder deren Metaboliten kommt. Durch die zusätzliche

Durchführung der Zellaufnahmestudien ohne internen Standard, konnte ein Einfluss des

Cf1743 100 auf die Aufnahme der Prodrugs ausgeschlossen werden.

Auch wurde versucht, durch Änderung des Laufpuffers auf Tetrabutylammoniumacetat, eine

Verminderung der Untergrundsignale zu erreichen. Das beste Ergebnis wurde erzielt, wenn

Tetra-n-butylammoniumhydroxid (40% in H2O) von Sigma-Aldrich (Produktnr.: 86854) zum

Ansetzen des Puffers verwendet und der Puffer vor der Verwendung für mindestens

24 Stunden gelagert wurde. Zudem war es zwingend erforderlich, die Äquilibrierungszeit der

HPLC-Säule auf das Anfangsverhältnis des Laufmittels zu minimieren. Mit steigender

Äquilibrierungszeit erhöhte sich die Intensität der Puffersignale um ein Vielfaches.

BCNAMP 126

3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89

BCNA 115


132

Die Chromatogramme der Inkubationslösungen und der Zelllysate sind in Abb. 139

dargestellt. In der Inkubationslösung, also im extrazellulären Medium, konnte 3-Me-cycloSal-

6-H-ddBCNAMP 89, neben dem internen Standard (Cf1743 100), detektiert werden. Das

Signal bei 1.2 Minuten konnte nicht zugeordnet werden. Es ist jedoch zu vermuten, dass es

dem Kulturmedium zuzuordnen ist, da das Signal auch bei den Zellaufnahmestudien mit den

monomaskierten Prodrugs 103 und 105 (Abschnitt 8.8.4 und 8.8.6) beobachtet wurde.

Intrazellulär konnte dagegen aufgrund der geringen Intensitäten und der erwähnten

Puffersignalprobleme nur eindeutig der interne Standard identifiziert werden. Die

Verschiebung der Retentionszeiten ist auf gerätebedingte Schwankungen zurückzuführen.


(Konzentration des Prodrugs in der Inkubationslösung: 10 µM, HPLC-Methode G, λex = 340 nm, λem =

410 nm).

Somit ist möglicherweise die maximale Inkubationszeit von 60 Minuten zu kurz gewählt, um

signifikante Mengen des Monophosphats detektieren zu können. Allerdings ist die geringe

Intensität des detektierten Monophosphat-Prodrugs 89 im Vergleich zum internen Standard

überraschend, was für eine Zersetzung des Prodrugs 89 oder des freigesetzten

Monophosphats 126 zu nicht fluoreszierenden Verbindungen spricht. Die geringe Stabilität

des 6-H-ddBCNAMPs 126 wurde schon bei der Synthese der Verbindung beobachtet

(Abschnitt 8.3). Es wäre sinnvoll, Zellaufnahmestudien mit dem 3-Me-cycloSal-Prodrug des

6-Propyl-substituierten ddBCNAs 116 durchzuführen, um das Ergebnis besser einordnen zu

können. Mit dem 6-Prop-ddBCNA 116 konnten mit den entsprechenden DiPPro- und

TriPPPro-Verbindungen sehr gute Ergebnisse erzielt werden (Abschnitt 8.8.2 - 8.8.6).

3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89

Cf1743 100

Cf1743 100

intrazellulär

intrazellulär

extrazellulär

extrazellulär


133

8.8.2 Zellaufnahmestudien mit dem C9-DiPPro-6-Prop-ddBCNADP 94

Die Zellaufnahmestudien mit dem C9-DiPPro-6-Prop-ddBCNA 94 wurden analog zu dem in

Abschnitt 8.8.1 beschriebenen Protokoll durchgeführt. Es wurden Inkubationszeiten von 15

und 60 Minuten gewählt, da die Halbwertszeit des Prodrugs 94 bei 3.3 Stunden lag

(Abschnitt 8.7.1) und somit nach 60 Minuten die Hydrolyseprodukte eindeutig detektierbar

sein sollten. Es wurde mit einer Prodrugkonzentration von 10 µM inkubiert, da dies deutlich

unter dem CC50-Wert der Verbindung 94 (70 µM[135]) liegt und zudem in den Bereich fällt, in

dem üblicherweise die anti-HIV-Tests in CEM-Zellen durchgeführt werden. Dieses Protokoll

wurde auch für alle weiteren diskutierten Zellaufnahmestudien verwendet. Wie bei allen

Inkubationen der verschiedenen Prodrugs wurde ebenfalls Cf1743 100 als interner Standard

zugesetzt, um eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu ermöglichen.

Die erhaltenen Chromatogramme der Inkubationslösungen und der Zelllysate sind in

Abb. 140 dargestellt. Extrazellulär war neben dem internen Standard hauptsächlich die

DiPPro-Verbindung 94 vorhanden. Intrazellulär wurde dagegen auch nach einer

Inkubationszeit von nur 15 Minuten weder das Diphosphat-Prodrug 94 noch das

monomaskierte Intermediat 169 detektiert. Somit muss das Prodrug 94 nach der

Zellaufnahme umgehend durch zelluläre Enzyme metabolisiert werden. Der Hauptmetabolit

war das gewünschte BCNADP 155 mit einem sehr guten DP/MP-Verhältnis nach 15 Minuten

von 8.6:1. Mit der Zeit nahm das Monophosphat 128 im Vergleich zum Diphosphat 155 zu.

Dies war zu erwarten, da zelluläre Phosphatasen präsent sind.

Abb. 140: Ergebnisse der Zellaufnahmestudien des C9-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 94 (HPLC-


Um eine mögliche Bildung phosphathaltiger Metabolite aus dem 6-Prop-ddBCNA 116 durch

zelluläre Enzyme auszuschließen, wurden von GOLLNEST CEM-Zellen mit dem 6-Prop-

ddBCNA 116 inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von 6 Stunden wurden intra- und

extrazellulär nur das Nucleosid und keine phosphorylierten Metabolite detektiert.[123] Dieses

C9-DiPPro-BCNADP 94

Cf1743 100

BCNADP 155

BCNAMP 128 intrazellulär

intrazellulär

extrazell.

extrazell.

Cf1743 100


134

Ergebnis liegt im Einklang mit den für BCNAs publizierten Untersuchungen, dass BCNAs

ausschließlich Substrate für VZV-Kinasen sind.[136]

Anhand der durchgeführten Zellaufnahmestudien konnte mit dem C9-DiPPro-6-Prop-

ddBCNA 94 die Zellaufnahme des Prodrugs 94 bestätigt und erstmalig die erfolgreiche

intrazelluläre Freisetzung des Diphosphats 155 nachgewiesen werden.

8.8.3 Zellaufnahmestudien mit dem C4/C14-DiPPro-6-Prop-ddBCNADP 102

Die Ergebnisse der Zellaufnahmestudien mit dem C4/C14-DiPPro-ddBCNADP 102 sind in

Form der Chromatogramme der Inkubationslösungen und der Zelllysate in Abb. 141

dargestellt. Extrazellulär ist hauptsächlich das Diphosphat-Prodrug 102 zu erkennen.

Allerdings sind noch weitere Signale vorhanden, die aufgrund der Retentionszeit die

monomaskierten Intermediate 170 und 171, das Diphosphat 155 und das Monophosphat 128

sein können. Aufgrund der geringen Intensität war jedoch keine eindeutige Identifizierung

möglich.

Abb. 141: Ergebnisse der Zellaufnahmestudien des C4-/C14-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 102 (HPLC-


Intrazellulär wurde, wie bei der symmetrisch maskierten DiPPro-Verbindung 94, kein Prodrug

oder Intermediat detektiert. Intrazellulär war der Hauptmetabolit das gewünschte Diphosphat

155 mit einem gegenüber dem symmetrisch maskierten Prodrug 94 leicht verbesserten

DP/MP-Verhältnis nach 15 Minuten von 14:1. Auch hier nahm mit der Zeit der Anteil an

Monophosphat 128 zu. Allerdings war die intrazelluläre Konzentration der Metabolite des

symmetrisch maskierten Prodrugs 94, durch Vergleich mit dem internen Standard, 2.5-mal

höher als die intrazelluläre Konzentration der Metabolite des nicht-symmetrisch maskierten

Prodrugs 102. Da die beiden Verbindungen eine fast identische Lipophilie aufweisen

(Abschnitt 8.7.2), ist eine bessere Zellaufnahme der symmetrischen DiPPro-Verbindung 94

unwahrscheinlich. Eine mögliche Erklärung wäre eine schnellere extrazelluläre Hydrolyse

Cf1743 100

C4/C14-DiPPro-BCNADP 102

BCNADP 155

BCNAMP 128

intrazellulär

intrazellulär

extrazell.

extrazell.

Cf1743 100


135

des nicht-symmetrischen Prodrugs 102 gegenüber dem symmetrischen 94. Extrazellulär

wurde jedoch ein etwa gleiches Verhältnis der Prodrugs zu dem internen Standard erhalten

und die leicht erhöhten Signale der Zersetzungsprodukte erklären nicht die hohe

intrazelluläre Differenz.

Auch bei der nicht-symmetrisch maskierten DiPPro-Verbindung 102 konnte eine erfolgreiche

intrazelluläre Freisetzung des Diphosphats 155 nachgewiesen werden, zudem mit einem

sehr guten DP/MP-Verhältnis.

8.8.4 Zellaufnahmestudien mit dem C17-monomaskierten DiPPro-6-Prop-

ddBCNADP 103

Die Chromatogramme der Zellaufnahmestudien mit dem C17-monomaskierten DiPPro-6-

Prop-ddBCNADP 103 sind in Abb. 142 dargestellt. Die Verschiebung der Retentionszeiten ist

auf gerätebedingte Schwankungen zurückzuführen. Die Zellaufnahme des monomaskierten

Diphosphat-Prodrugs 103 ist deutlich geringer als die der anderen untersuchten DiPPro-

Verbindungen. Extrazellulär liegt doppelt so viel Prodrug 103, bezogen auf den internen

Standard, im Vergleich zu den anderen beiden Diphosphat-Prodrugs 94 und 102 vor.

Intrazellulär ist die Konzentration des Prodrugs 4.5-fach geringer als die nicht-symmetrisch

maskierte DiPPro-Verbindung 102. Dies liegt wahrscheinlich an der geringeren Lipophilie

und der zusätzlichen negativen Ladung. Es wurde allerdings intrazellulär wieder ein sehr

gutes DP/MP-Verhältnis nach 15 Minuten von 14:1 festgestellt, was auch nach 60 Minuten

noch bei 12:1 lag. Dies ist auf die langsamere Zellaufnahme des Prodrugs 103, damit eine

langsamere Freisetzung des Diphosphats 155 und schlussendlich eine geringere

Monophosphat-Konzentration zurückzuführen.

Abb. 142: Ergebnisse der Zellaufnahmestudien des C17-monomaskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs

103 (HPLC-Methode G, λex = 340 nm, λem = 410 nm).

Cf1743 100


BCNADP 155

BCNAMP 128 Cf1743 100

intrazellulär

intrazellulär

extrazellulär

extrazellulär


136

Das monomaskierte Diphosphat-Prodrug 103 weist eine gute extrazelluläre Stabilität auf. Es

wird etwas langsamer in die Zellen aufgenommen als die beiden DiPPro-Verbindungen 94

und 102. Gerade der letzte Punkt ist als ein sehr erfreuliches Ergebnis anzusehen, da

befürchtet wurde, dass die zusätzliche negative Ladung eine Zellaufnahme verhindert. Dies

ist nicht der Fall. Es konnte somit erstmalig die Zellaufnahme einer monomaskierten DiPPro-

Verbindung und die intrazelluläre Freisetzung des entsprechenden Diphosphats

nachgewiesen werden. Mit diesem Ergebnis wurde der Weg für eine Weiterentwicklung des

Diphosphat-Konzepts hin zu monomaskierten Verbindungen aufgezeigt.

8.8.5 Zellaufnahmestudien mit dem C4/C14-TriPPPro-6-Prop-ddBCNATP 104

Es sollen zur Orientierung zunächst kurz die Ergebnisse der Zellaufnahmestudien von

GOLLNEST mit dem symmetrisch maskierten C8-TriPPPro-6-Prop-ddBCNATP 97

zusammengefasst werden. Die von ihm erhaltenen Chromatogramme sind in Abb. 143

dargestellt. Jedoch muss angemerkt werden, dass eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse nur

bedingt möglich ist, da mit einer Prodrugkonzentration von 100 µM anstatt mit 10 µM

inkubiert wurde: Eine Konzentration von 100 μM übersteigt den mittleren CC50-Wert für

TriPPPro-d4TTPs von 45 μM[123] jedoch um mehr als das Doppelte. Toxische Nebeneffekte,

die sich negativ auf das Diffusionsverhalten und die zellulären Enzyme auswirken, sind damit

nicht ausgeschlossen, was die Vergleichbarkeit der Ergebnisse beeinträchtigt.

Abb. 143: Ergebnisse der Zellaufnahmestudien des C8-TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 97 von

GOLLNEST.[123]

C8-TriPPPro-BCNATP 97

BCNAMP 128

BCNADP 155

BCNATP 174


BCNAMP 128

BCNADP 155 BCNA 116


137

Extrazellulär zersetzt sich das Triphosphat-Prodrug 97 überraschend schnell, was auf das

RPMI-Medium und den Zusatz an Fötalem Kälberserum (FCS) zurückgeführt wurde. Nach

einer Stunde hat sich bereits ein Gemisch aus allen phosphorylierten Metaboliten gebildet

und nach drei Stunden ist das Diphosphat 155 das Haupthydrolyseprodukt.[123]

Intrazellulär ist nach einer Stunde das gewünschte BCNATP 174 der Hauptmetabolit. Bereits

nach drei Stunden ist das Triphosphat 174 nahezu vollständig zum BCNADP 155

dephosphoryliert worden. Zudem wurde das Monophosphat 128 und nach drei Stunden

ebenfalls signifikante Mengen des Nucleosids 116 nachgewiesen.[123]

Die Ergebnisse der Zellaufnahmestudien mit dem in dieser Arbeit synthetisierten C4/C14-

TriPPPro-6-Prop-ddBCNATP 104 sind in Form der Chromatogramme der Inkubations-

lösungen und der Zelllysate in Abb. 144 dargestellt. Extrazellulär und intrazellulär wurde eine

mit dem nicht-symmetrisch maskierten Diphosphat-Prodrug 102 vergleichbare Konzentration

des Triphosphat-Prodrugs 104 festgestellt. Es konnte keine so ausgeprägte extrazelluläre

Metabolisierung des Prodrugs 104 im Vergleich zu der symmetrisch maskierten TriPPPro-

Verbindung 97 beobachtet werden. Das Triphosphat-Prodrug 104 ist auch noch nach

60 Minuten extrazellulär die vorwiegend vorhandene Verbindung.

Abb. 144: Ergebnisse der Zellaufnahmestudien des C4-/C14-TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 104

(HPLC-Methode G, λex = 340 nm, λem = 410 nm).

Intrazellulär ist nach 15 Minuten das gewünschte BCNATP 174 der Hauptmetabolit. Zudem

wurden das Diphosphat 155 und das Monophosphat 128 detektiert. Erstaunlicherweise ist

nach 60 Minuten das Monophosphat 128 der Hauptmetabolit. Da bei den Zellaufnahme-

studien der Diphosphat-Prodrugs eine hohe intrazelluläre Stabilität des Diphosphats 155

festgestellt wurde, ist dieser hohe Anteil nicht allein durch die Dephosphorylierung des

Cf1743 100

C4/C14-TriPPPro-BCNATP 104

BCNAMP 128

BCNADP 155

Cf1743 100

BCNATP 174

intrazellulär

intrazellulär

extrazellulär

extrazellulär


138

Diphosphats zum Monophosphat zu erklären. Eine Möglichkeit wäre die Beteiligung von

Pyrophosphatasen, die das Triphosphat direkt zum Monophosphat umsetzen. Diese

Beobachtung der hohen Monophosphat-Konzentration lag ebenfalls nicht im Einklang mit

den von GOLLNEST für das symmetrisch maskierte Triphosphat-Prodrug 97 erhaltenen

Ergebnissen.

Es konnte auch für das nicht-symmetrisch maskierte Triphosphat-Prodrug 104 eine

erfolgreiche Zellaufnahme und die Freisetzung des gewünschten BCNATPs 174

nachgewiesen werden. Eine Erhöhung des Anteils des Triphosphats an den insgesamt

intrazellulär detektierten Metaboliten durch Modifikation der Maskeneinheiten wäre allerdings

wünschenswert.

8.8.6 Zellaufnahmestudien mit dem C17-monomaskierten TriPPPro-6-Prop-

ddBCNATP 105

Die Chromatogramme der Zellaufnahmestudien mit dem C17-monomaskierten TriPPPro-6-

Prop-ddBCNATP 105 sind in Abb. 145 dargestellt. Auch bei diesem Prodrug konnte trotz der

zusätzlichen Ladung am γ-Phosphat eine Zellaufnahme beobachtet werden. Extrazellulär

wurde hauptsächlich das intakte Triphosphat-Prodrug 105 beobachtet. Damit ist es deutlich

stabiler als die nicht-symmetrisch maskierte TriPPPro-Verbindung 104. Extrazellulär ist die

Konzentration des Prodrugs 105 fünfmal höher im Vergleich zu der nicht-symmetrisch

maskierten Verbindung 104, intrazellulär dagegen ist die Summe der Konzentrationen der

Metabolite etwa gleich hoch.

Abb. 145: Ergebnisse der Zellaufnahmestudien des C17-monomaskierten TriPPPro-6-Prop-

ddBCNATPs 105 (HPLC-Methode G, λex = 340 nm, λem = 410 nm).

Cf1743 100


BCNAMP 128

BCNADP 155

Cf1743 100

BCNATP 174

intrazellulär

intrazellulär

extrazellulär

extrazellulär


139

Erfreulicherweise konnte intrazellulär das gewünschte Triphosphat 174 detektiert werden.

Weiterhin sind als Metabolite das Diphosphat 155 und das Monophosphat 128 zu erkennen.

Es wurde, wie auch bereits bei der TriPPPro-Verbindung 104 diskutiert, ein ungewöhnlich

hoher Anteil an Monophosphat 128 beobachtet. Leider konnte keine Erhöhung des

intrazellulären Triphosphat-Anteils durch Verwendung des monomaskierten Triphosphat-

Prodrugs 105 erreicht werden. Interessant wäre die Untersuchung einer längeren

Inkubationszeit, da die monomaskierte TriPPPro-Verbindung 105 eine längere intrazelluläre

Freisetzung des Triphosphats im Vergleich zu den zweifach-maskierten Triphosphat-

Prodrugs ermöglichen sollte.

8.8.7 Fazit der Zellaufnahmestudien mit den fluoreszierenden Prodrugs

Anhand der durchgeführten Zellaufnahmestudien konnte bei allen untersuchten cycloSal-,

DiPPro- und TriPPPro-Verbindungen die Zellaufnahme des Prodrugs bestätigt und

intrazellulär das gewünschte Mono-, Di- bzw. Triphosphats nachgewiesen werden. Bei den

drei DiPPro-Verbindungen 94, 102 und 103 wurde bei allen intrazellulär ein sehr gutes

DP/MP-Verhältnis beobachtet. Besonders hervorzuheben ist hierbei das monomaskierte

Diphosphat-Prodrug 103, bei dem nach einer Inkubationszeit von einer Stunde mit Abstand

das beste Verhältnis erhalten wurde. Dieser Trend konnte bei den Triphosphat-Prodrugs 104

und 105 nicht festgestellt werden, bei denen der Anteil des Triphosphats an den intrazellulär

detektierten Metaboliten etwa gleich hoch war. Mit den durchgeführten Studien konnte

zudem erstmals die erfolgreiche Zellaufnahme von monomaskierten DiPPro- bzw. TriPPPro-

Verbindungen nachgewiesen werden, die ausgesprochen vielversprechende Eigenschaften

zeigten.


140

Experimenteller Teil

141

9 Experimenteller Teil

9.1 Allgemeines

9.1.1 Edukte und Reagenzien

Die Edukte und Reagenzien wurden von den Firmen Acros Organics, Alfa Aesar, Fluka, Glen

Research, Grüssing GmbH, Link Technologies, Molekula, Proligo, Sigma-Aldrich, TCI und

VWR in Synthesequalität bezogen und, abgesehen von den nachstehenden Chemikalien,

ohne weitere Reinigung für die Synthesen verwendet.

Triethylamin und N,N-Diisopropylethylamin wurden über Calciumhydrid mehrere Tage zum

Rückfluss erhitzt, unter Inertgas destilliert und unter Lichtausschluss und unter Inertgas

gelagert.

Phosphor(III)-chlorid wurde unter Inertgas destilliert und unter Lichtausschluss und unter

Inertgas gelagert.

Trifluoressigsäureanhydrid wurde über Phosphorpentoxid eine Stunde zum Rückfluss erhitzt,

unter Inertgas destilliert und gelagert.

9.1.2 Lösungsmittel

Folgende Lösungsmittel wurden in technischer Qualität bezogen und vor der Verwendung

unter Normaldruck destilliert: Dichlormethan, Ethylacetat, Methanol und Petrolether 50-70.

Für die NMR-Spektroskopie wurden deuterierte Lösungsmittel von euriso-top und Deutero

verwendet. Hydrolyselabile und oxidationsempfindliche Substanzen wurden mit über Molsieb

gelagertem, deuterierten Chloroform vermessen.

Für Reaktionen unter Sauerstoff- und/oder Feuchtigkeitsausschluss wurden folgende

Lösungsmittel eingesetzt.

Acetonitril wurde a) mehrere Tage unter Rückfluss über Calciumhydrid erhitzt, unter Inertgas

destilliert und über Molsieb (0.3 nm) aufbewahrt oder b) über eine

Lösungsmittelreinigungsanalge, MB-SPS-800 von der Firma M. Braun Inertgas-Systeme

GmbH, absolutiert und über Molsieb (0.3 nm) gelagert. Hierbei wurde Acetonitril -

CHROMASOLV® von Sigma-Aldrich verwendet.

Dichlormethan wurde a) mehrere Tage unter Rückfluss über Calciumhydrid erhitzt, unter

Inertgas destilliert und über Molsieb (0.4 nm) aufbewahrt oder b) über eine


GmbH, absolutiert und über Molsieb (0.4 nm) gelagert. Hierbei wurde Dichlormethan -

CHROMASOLV® mit Amylen als Stabilisator von Sigma-Aldrich verwendet.


142

Diethylether wurde a) mehrere Tage unter Rückfluss über Kalium erhitzt, unter Inertgas



GmbH, absolutiert und über Molsieb (0.4 nm) gelagert. Hierbei wurde Diethylether, ACS

reagent, von Sigma-Aldrich verwendet.

Absolutes N,N-Dimethylformamid wurde von VWR (max. 0.005% H2O) über Molsieb

bezogen.

Absolutes Methanol wurde von Acros (max. 0.005% H2O) über Molsieb bezogen.

Trockenes Pyridin wurde a) von Sigma-Aldrich (max. 0.005% H2O) über Molsieb bezogen

oder b) über eine Lösungsmittelreinigungsanalge, MB-SPS-800 von der Firma M. Braun

Inertgas-Systeme GmbH, absolutiert und über Molsieb (0.4 nm) gelagert. Hierbei wurde

Pyridin, ACS reagent, von Sigma-Aldrich verwendet.

Tetrahydrofuran wurde a) mehrere Tage unter Rückfluss über Kalium erhitzt, unter Inertgas



GmbH, absolutiert und über Molsieb (0.4 nm) gelagert. Hierbei wurde Tetrahydrofuran -

CHROMASOLV® Plus, von Sigma-Aldrich verwendet.

Absolutes Toluol wurde von Acros (max. 0.005% H2O) über Molsieb bezogen.

9.1.3 Chromatographie

Dünnschichtchromatographie (DC)

Für die Dünnschichtchromatographie wurden mit Kieselgel beschichtete Aluminiumfolien mit

Fluoreszenzindikator der Firma Macherey-Nagel (DC-Fertigfolien ALUGRAM® Xtra SIL

G/UV254) verwendet. Die angegebenen Rf-Werte wurden bei Kammersättigung ermittelt. Die

UV-aktiven Verbindungen wurden mit einer UV-Lampe mit einer Wellenlänge von 254 nm

detektiert oder durch Benetzen mit einer Anisaldehyd-Schwefelsäure-Lösung (135 mL

Ethanol, 5 mL Schwefelsäure (97%), 1.5 mL Essigsäure, 3.7 mL 4-Methoxybenzaldehyd,

Lagerung bei 4 °C) und anschließender Wärmebehandlung angefärbt.

Zur Detektion von Thiolen wurde eine Ellmans-Färbelösung (75 mL Ethanol, 41 mL

demineralisiertes Wasser, 34 mL Tris-HCl (1 M, pH 7.4), 150 mg 5,5‘-Dithiobis(2-

nitrobenzoesäure), Lagerung bei 4 °C unter Lichtausschluss)[44] verwendet.

Zirkuläre präparative Dünnschichtchromatographie (Chromatotron)

Mittels eines Chromatotrons der Firma Harrison Research, Modell 7924 T, wurden

Substanzgemische mit geringem Zeit- und Lösungsmittelaufwand getrennt. Als stationäre


143

Phase diente gipshaltiges Kieselgel 60 PF254 (Merck Nr. 7749) in Schichtdicken von 1, 2

und 4 mm auf Glasplatten (Durchmesser: 20 cm). Die Detektion der UV-aktiven Substanzen

erfolgte mit einer UV-Lampe bei einer Wellenlänge von 254 nm. Die Herstellung der

Kieselgel-beschichteten Platten erfolgte durch Suspension des gipshaltigen Kieselgels in

4 °C-kaltem demineralisierten Wasser (1 mm-Platten: 45 g und 100 mL, 2 mm-Platten: 70 g

und 140 mL, 4 mm-Platten: 120 g und 240 mL). Nach gründlichem Durchmischen wurde die

Suspension auf die Platten gegossen und durch Wellenbewegungen gleichmäßig verteilt.

Das Aushärten erfolgte durch Lagerung über drei Tage an einem kühlen, dunklen Ort.

Anschließend wurde das überschüssige Kieselgel mit entsprechendem Werkzeug

abgetragen, so dass die gewünschte Schichtdicke erreicht wurde. Die Kieselgelplatten

wurden mehrfach verwendet und nach jeder Trennung eines Substanzgemisches mit

Methanol gespült.

Säulenchromatographie

Säulenchromatographische Reinigungen wurden mit MN Kieselgel 60 M der Firma

Macherey-Nagel (0.040 - 0.063 mm, 230 - 400 mesh) als stationäre Phase durchgeführt.

Ionenaustauschchromatographie an DOWEX-NH4+

Zum Austausch der Kationen auf Ammoniumionen des Ionenaustauscherharzes Dowex

50W-X8 in protonierter Form, 50-100 mesh, der Firma Sigma-Aldrich wurde mit dem

5-fachen Säulenvolumen einer Ammoniaklösung (5-10%) gespült. Anschließend wurde mit

Reinstwasser eluiert, bis ein neutraler pH-Wert erreicht wurde. Die entsprechende

Verbindung wurde in Reinstwasser aufgetragen und mit Reinstwasser von der Säule eluiert.

Zur Regeneration wurde wieder mit einer Ammoniaklösung gespült.

Automatisierte normal phase- (NP-)/reversed phase- (RP-)Chromatographie

Sowohl für Normal- als auch für Umkehrphasenchromatographie (RP-18) wurde der

automatisierte puriFlash®430 der Firma Interchim mit UV-Detektor verwendet. Für

Normalphasentrennungen wurden self-packed Kartuschen eingesetzt, die mit Macherey-

Nagel Kieselgel 60 M (siehe Säulenchromatographie) befüllt wurden. Für die RP-18-

Chromatographie wurden Säulen von Macherey-Nagel (Chromabond® Flash RS 40 C18 ec)

verwendet.

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography, HPLC)

Die analytische Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und die Reinigung der

Oligonucleotide wurden an folgenden VWR-Hitachi-Anlagen durchgeführt.


144

VWR-Hitachi Anlage 1 Anlage 2

Software EZChrom Elite D-7000 HSM (HPLC-System

Manager)

Interface D-2000 D-7000

Pumpe L-2130 L-7100

Autosampler L-2200 L-7200

Detektor Diode Array Detector (UV): L-2455 Diode Array Detector (UV): L-7455

Fluoreszenzdetektor: L-7480

Für alle HPLC-Anwendungen wurde Acetonitril von VWR (HPLC grade) sowie Milli-Q-

Wasser (s. 9.1.5 Wasseraufbereitungsanlage) eingesetzt.

IEX-HPLC

Es wurde die Anlage 1 mit der Säule DNAPac PA200 (4 x 250 mm) von Thermo Scientific

verwendet.

Methode A: Von 0 min bis 40 min: Tris*HCl-Puffer (25 mM) mit einem Natriumperchlorat-

Puffer (0.25 M)-Gradienten (0-40%), von 40 min bis 43 min: Tris*HCl-Puffer mit einem

Natriumperchlorat-Puffer-Gradienten (40-100%), von 43 min bis 55 min: isokratisch (100%

Natriumperchlorat-Puffer), von 55 min bis 57 min: Tris*HCl-Puffer mit einem


Tris*HCl-Puffer). Flussrate: 1.0 mL/min, UV-Detektion bei 250 nm.

Methode B: Von 0 min bis 40 min: Tris*HCl-Puffer (25 mM) mit einem Natriumperchlorat-

Puffer (0.5 M)-Gradienten (0-50%), von 40 min bis 43 min: Tris*HCl-Puffer mit einem


Natriumperchlorat-Puffer), von 55 min bis 57 min: Tris*HCl-Puffer mit einem


Tris*HCl-Puffer). Flussrate: 1.0 mL/min, UV-Detektion bei 250 nm.

Puffer

Tris*HCl-Puffer (25 mM): Es wurden 7.57 g (62.5 mmol) Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

(Tris) in 250 mL Acetonitril und 2.25 L Reinstwasser gelöst und mit Salzsäure (2 M) auf

pH 8.0 eingestellt.


145

Natriumperchlorat-Puffer (0.25 M): Es wurden 35 g (0.25 mol) Natriumperchlorat-Monohydrat

in 1.0 L Tris*HCl-Puffer (25 mM) gelöst.

Natriumperchlorat-Puffer (0.5 M): Es wurden 70 g (0.50 mol) Natriumperchlorat-Monohydrat

in 1.0 L Tris*HCl-Puffer (25 mM) gelöst.

RP-HPLC

Für Methode C wurde die Anlage 1 mit der Säule XTerra® MS C18 (4.6 x 250 mm) der Firma

Waters verwendet.

Methode C: Von 0 min bis 20 min: Triethylammoniumacetat-Puffer A (100 mM) mit einem

Triethylammoniumacetat-Puffer B (100 mM)-Gradienten (0-100%), von 20 min bis 50 min:

isokratisch (100% Triethylammoniumacetat-Puffer B), von 50 min bis 55 min:

Triethylammoniumacetat-Puffer A mit einem Triethylammoniumacetat-Puffer B-Gradienten

(100-0%), von 55 min bis 62 min: isokratisch (100% Triethylammoniumacetat-Puffer A).

Flussrate: 1.0 mL/min, UV-Detektion bei 250 nm.

Für die Methoden D und E wurde die Anlage 1 mit der Säule Nucleodur 100-5 C18 ec der

Firma Macherey-Nagel verwendet.

Methode D: Von 0 min bis 20 min: Tetrabutylammoniumacetat-Puffer (2 mM) mit einem

Acetonitril-Gradienten (5-90%), von 20 min bis 26 min: isokratisch (10%

Tetrabutylammoniumacetat-Puffer, 90% Acetonitril), von 26 min bis 31 min:

Tetrabutylammoniumacetat-Puffer mit einem Acetonitril-Gradienten (90-5%), von 31 min bis

38 min: isokratisch (95% Tetrabutylammoniumacetat-Puffer, 5% Acetonitril). Flussrate:

1.0 mL/min, UV-Detektion bei 330 nm.

Methode E: Von 0 min bis 20 min: Tetrabutylammoniumacetat-Puffer (2 mM) mit einem

Acetonitril-Gradienten (5-80%), von 20 min bis 26 min: isokratisch (20%

Tetrabutylammoniumacetat-Puffer, 80% Acetonitril), von 26 min bis 31 min:

Tetrabutylammoniumacetat-Puffer mit einem Acetonitril-Gradienten (80-5%), von 31 min bis

38 min: isokratisch (95% Tetrabutylammoniumacetat-Puffer, 5% Acetonitril). Flussrate:

1.0 mL/min, UV-Detektion bei 330 nm.

Für Methode F und G wurde die Anlage 2 mit der Säule Nucleodur 100-5 C18 ec der Firma

Macherey-Nagel verwendet. Als Detektor wurde entweder der UV- oder der

Fluoreszenzdetektor eingesetzt.


146

Methode F: Von 0 min bis 25 min: Wasser mit einem Acetronitrilgradienten (5% - 100%), von

25 min bis 35 min: isokratisch (5% Acetonitril, 95% Wasser). Flussrate: 0.5 mL/min,

Fluoreszenz-Detektion mit λex= 340 nm und λem= 410 nm.

Methode G: Von 0 min bis 20 min: Tetrabutylammoniumacetat-Puffer (2 mM) mit einem

Acetonitril-Gradienten (5-90%), von 20 min bis 24 min: isokratisch (90% Acetonitril), von

24 min bis 29 min: Tetrabutylammoniumacetat-Puffer mit einem Acetonitril-Gradienten (90-

5%), von 29 min bis 36 min: isokratisch (95% Tetrabutylammoniumacetat-Puffer, 5%

Acetonitril). Flussrate: 1.0 mL/min, UV-Detektion bei 335 nm oder Fluoreszenz-Detektion mit

λex= 340 nm und λem= 410 nm.

Puffer

Triethylammoniumacetat-Puffer A (100 mM): Zu 50 mL Acetonitril und 800 mL Reinstwasser

wurden 13.9 mL (100 mmol) Triethylamin gegeben und mit Essigsäure auf pH 7.0 eingestellt.

Anschließend wurde mit Reinstwasser auf ein Volumen von 1.0 L aufgefüllt.

Triethylammoniumacetat-Puffer B (100 mM): Zu 150 mL Acetonitril und 700 mL

Reinstwasser wurden 13.9 mL (100 mmol) Triethylamin gegeben und mit Essigsäure auf

pH 7.0 eingestellt. Anschließend wurde mit Reinstwasser auf ein Volumen von 1.0 L

aufgefüllt.

Tetrabutylammoniumacetat-Puffer (2 mM): Zu 2.4 L Reinstwasser wurden 12.7 mL

(4.85 mmol) Tetra-n-butylammoniumhydroxid (10% in H2O) gegeben. Mit Essigsäure (1M)

wurde auf pH 6.0 eingestellt. Für die Anlage 2 wurde der Puffer mit Tetra-n-

butylammoniumhydroxid (40% in H2O) von Sigma-Aldrich (Produktnr.: 86854) angesetzt.

Tetrabutylammoniumphosphat-Puffer (0.55 mM): Stammlösung (9.8 mM TBAP): Es wurden

1000 mL Reinstwasser mit 6.6 mL Tetra-n-butylammoniumhydroxid (40% in H2O) versetzt

und mit konz. Phosphorsäure auf pH 3.6 eingestellt. Verwendeter Puffer (0.55 mM TBAP):

Es wurden 60 mL der 9.8 mM Stammlösung mit 1000 mL Reinstwasser verdünnt.

9.1.4 Spektroskopie und Spektrometrie

Kernresonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance, NMR)

Die NMR-Spektren wurden in der NMR-Abteilung des Fachbereichs Chemie der Universität

Hamburg unter der Leitung von Dr. Thomas Hackl und Dr. Young-Joo Lee aufgenommen.

Dies erfolgte an den folgenden Geräten der Firma Bruker: Avance I 400 MHz Spektrometer,


147

Avance II 400 MHz Spektrometer, DRX 500 MHz Spektrometer und Avance III HD 600 MHz

Spektrometer.

Die Kalibrierung zur Ermittlung der chemischen Verschiebungen der Signale (1H/13C) erfolgte

mit Hilfe der Lösungsmittelsignale [CHCl3 7.26/77.16 (in CDCl3); DMSO 2.50/39.52 (in

DMSO-d6), MeCN 1.94/118.26 (in CD3CN), MeOH 3.31/49.00 (in CD3OD), H2O 4.79 (in

D2O)]. Die Verschiebungen der 31P-NMR-Signale wurden gegen einen externen Standard

von 85%iger Phosphorsäure bestimmt. Zur Zuordnung der Signale wurden zweidimensionale

Spektren (H,H-COSY, HSQC, HMBC) aufgenommen. Die NMR-Spektren wurden soweit

möglich als Spektren 1. Ordnung ausgewertet.

Infrarotspektroskopie (IR)

Die IR-Spektren wurden an einem ALPHA Platinum ATR-IR-Spektrometer der Firma Bruker

aufgenommen. Die Messungen erfolgten in einem Messbereich von 400 - 4000 cm-1.

UV/Vis-Spektroskopie

Die UV-Messungen wurden an einem NanoDrop 2000c Spektralphotometer der Firma

Thermo Scientific durchgeführt.

Massenspektrometrie

Die MS-Spektren wurden in der Massenspektrometrie-Abteilung des Fachbereiches Chemie

der MIN-Fakultät der Universität Hamburg unter der Leitung von Dr. Maria Riedner

aufgenommen.

Die hochaufgelösten ESI-Massenspektren wurden an einem Agilent 6224 Accurate-Mass

TOF-Spektrometer der Firma Agilent Technologies im positiven bzw. negativen Modus

gemessen.

Die MALDI-Messungen wurden an einem MALDI TOF-TOF Bruker UltrafleXtreme

Spektrometer (Smartbeam II Laser) der Firma Bruker durchgeführt. Als Matrix diente eine

gesättigte Lösung von 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA) in Wasser/Acetonitril 1:1 (v/v) mit

10 mg/mL Ammoniumdihydrogencitrat. Nach der Kristallisation der Matrix mit der Probe

wurde die Messung im linear negativen Modus vorgenommen.

9.1.5 Weitere Geräte

DNA-Synthesizer

Die automatisierte Festphasensynthese der Oligonucleotide erfolgte mit einem

DNA/RNA/LNA-Synthesizer H-8 standard der Firma K&A Laborgeräte.


148

Gefriertrocknungsanlage

Wässrige Lösungen wurden mit einem Alpha 2-4 LDplus mit einem vertikalen Trockenrechen

(121224) der Firma Christ lyophylisiert.

Mikrowelle

Für mikrowellenunterstützte Reaktionen wurde eine Discover BenchMate Mikrowelle der

Firma CEM eingesetzt.

pH-Messgerät

Zum Einstellen des pH-Werts von Pufferlösungen wurde das pH-Messgerät ProLab 3000 der

Firma Schott verwendet.

Wasseraufbereitungsanlage

Reinstwasser (Milli-Q) wurde durch ein arium® pro UV-Reinstwassersystem der Firma

Sartorius gewonnen.

Schmelzpunktbestimmung

Die angegebenen Schmelzpunkte wurden an einem IA 9200

Schmelzpunktbestimmungsgerät der Firma Electrothermal ermittelt.

Speed-Vac-Probenkonzentrator

Zum Entfernen des Lösungsmittels von Oligonucleotiden wurde ein Speed-Vac-

Probenkonzentrator UNIVAPO 150 H der Firma UniEquip verwendet.

Thermomixer

Zur Inkubation der Hydrolyselösungen und zum Abspalten der Oligonucleotide von der

Festphase sowie Abspaltung der Schutzgruppen wurde ein Thermomixer comfort der Firma

Eppendorf oder ein Thermomixer basic der Firma CellMedia verwendet.

Ultraschallbad

Das Entgasen von HPLC-Lösungsmitteln, das Behandeln von Hydrolyselösungen und

Suspensionen und der Aufschluss von Zellen erfolgte mit dem Ultraschallbad Sonorex Super

RK 512 H der Firma Bandelin.

Zentrifuge

Für Lösungen bis 50 mL wurde eine Heraeus Primo R Centrifuge der Firma Thermo

Scientific bei 0 °C oder 4 °C und 8000 u/min verwendet. Zum Zentrifugieren von Volumina


149

< 1.5 mL in Eppendorftubes wurde eine Biofuge Pico der Firma Heraeus Instuments oder

eine Centrifuge 5418 R der Firma Eppendorf bei 14000 u/min eingesetzt.

9.2 Synthesen

9.2.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften (AAV)

AAV 1 Formamidin-Schützung einer primären Aminogruppe

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 1.0 Äquiv. des entsprechenden Nucleosids dreimal

mit abs. Pyridin coevaporiert und anschließend in abs. Pyridin suspendiert. Unter Rühren

wurden 2.0 Äquiv. N,N-Dimethylformamiddiethylacetal hinzugetropft. Es wurde bis zum

vollständigen Umsatz bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter

vermindertem Druck entfernt und dreimal mit einem Gemisch aus Toluol und Dichlormethan

coevaporiert. Das Rohprodukt wurde säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt

(CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v).

AAV 2 Synthese von tert-Butyldimethylsilylethern


mit abs. Pyridin coevaporiert und anschließend in abs. Pyridin suspendiert. Hierzu wurden

1.1-2.2 Äquiv. tert-Butyldimethylsilylchlorid bei Raumtemperatur zugegeben. Es wurde bis

zum vollständigen Umsatz bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das

Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und dreimal mit einem Gemisch aus Toluol

und Dichlormethan coevaporiert.

AAV 3 Synthese von Tritylethern


mit abs. Pyridin coevaporiert und anschließend in abs. Pyridin gelöst. Zur Reaktionslösung

wurden 1.2 Äquiv. des entsprechenden Tritylchlorids langsam bei Raumtemperatur

zugegeben. Es wurde bis zum vollständigen Umsatz bei Raumtemperatur gerührt. Das

Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, der Rückstand dreimal mit einem

Gemisch aus Toluol und Dichlormethan coevaporiert. Anschließend wurden eine gesättigte,

wässrige Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Dichlormethan zugegeben. Die wässrige

Phase wurde zweimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen

wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem

Druck entfernt.

AAV 4 Dess-Martin-Oxidation mit anschließender Reduktion

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 1.5 Äquiv. Dess-Martin Periodinan in abs.

Dichlormethan suspendiert und auf 0 °C gekühlt. Zur Suspension wurden 1.0 Äquiv. des


150

entsprechenden Nucleosids in abs. Dichlormethan getropft. Es wurde 30-60 Minuten bei 0 °C

und anschließend bei Raumtemperatur bis zum vollständigen Umsatz gerührt. Bei 0 °C

wurde Isopropanol zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde auf -78 °C gekühlt und

2.0 Äquiv. Natriumborhydrid zugegeben. Es wurde bei -78 °C bis zum vollständigen Umsatz

gerührt und dann Aceton zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf die Hälfte des

Volumens eingeengt und in Ethylacetat aufgenommen. Die organische Phase wurde mit

demineralisiertem Wasser, gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und

gesättigter, wässriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über

Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das

Rohprodukt wurde am Chromatotron an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 19:1 v/v).

AAV 5 Mitsunobu-Reaktion

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 3.0 Äquiv. Triphenylphosphin in 1.6 mL abs.

Tetrahydrofuran gelöst und bei 0 °C 3.0 Äquiv. Diisopropylazodicarboxylat zugegeben. Es

wurde bei 0 °C 30 Minuten gerührt. Anschließend wurden 1.0 Äquiv. des entsprechenden

Nucleosids in abs. Tetrahydrofuran und langsam 2.0-3.5 Äquiv. der entsprechenden Säure in

abs. Tetrahydrofuran zugegeben. Es wurde bis zum vollständigen Umsatz gerührt. Dann

wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt.

AAV 6 Nucleophile Substitution mit Natriumthiobenzoat

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 1.0 Äquiv. des entsprechenden Nucleosids in abs.

N,N-Dimethylformamid gelöst und auf 110 °C erhitzt. Dann wurden 2.5 Äquiv.

Natriumthiobenzoat in abs. N,N-Dimethylformamid gelöst und zur Reaktionslösung gegeben.

Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei 110 °C gerührt. Dies wurde dreimal wiederholt,

so dass insgesamt 10 Äquiv. Natriumthiobenzoat hinzugegeben wurden. Anschließend

wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Reaktionsgemisch wurde auf demineralisiertes

Wasser gegeben und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinten organischen Phasen


Druck entfernt.

AAV 7 Sonogashira-Kupplung mit anschließender Cyclisierung

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 1.0 Äquiv. des entsprechenden 5-Iod-substituierten

Nucleosids mit abs. N,N-Dimethylformamid coevaporiert und in abs. N,N-Dimethylformamid

gelöst. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur mit 0.1 Äquiv. Tetrakis(triphenylphosphin)-

palladium(0) und 3.0 Äquiv. des entsprechenden Alkins versetzt. Nachdem eine klare

Lösung entstanden war, wurden 0.2 Äquiv. Kupfer(I)-iodid und 2.0 Äquiv. N,N-

Diisopropylethylamin hinzugegeben. Die Reaktionslösung wurde 24 Stunden bei


151

Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Lösung mit weiteren 0.2 Äquiv. Kupfer(I)-

iodid und 33 - 35 Äquiv. Triethylamin versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei

80 °C gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt.

AAV 8 Synthese von 4-(Hydroxymethyl)-phenylalkanoaten

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 1.0 Äquiv. 4-Hydroxybenzylalkohol in abs.

Tetrahydrofuran gelöst und bei 0 °C 1.0 Äquiv. Triethylamin zugegeben. Anschließend

wurden langsam 0.9 Äquiv. des entsprechenden Säurechlorides in abs. Tetrahydrofuran zur

Reaktionslösung getropft. Es wurde bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das

Reaktionsgemisch filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der

Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und zweimal mit gesättigter

Natriumhydrogencarbonat-Lösung und einmal mit demineralisiertem Wasser gewaschen. Die

organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter

vermindertem Druck entfernt.

AAV 9 Synthese von P,P-Bis(4-alkanoyloxybenzyl)-pyrophosphaten

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 1.0 Äquiv. des entsprechenden Phosphonats in abs.

Acetonitril suspendiert und mit 2.0 Äquiv. N-Chlorsuccinimid versetzt. Die Suspension wurde

auf 50 °C erwärmt, bis sich der Feststoff löste. Die erhaltene Lösung wurde für eine Stunde

bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurden 2.5 Äquiv. Tetra-n-butylammoniumphosphat

langsam zugegeben. Die Lösung wurde für 1.5-2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.

Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, der Rückstand in

Dichlormethan aufgenommen und jeweils einmal mit einer gesättigten Ammoniumacetat-

Lösung (1 M) und Wasser gewaschen. Durch Zentrifugation wurde eine schnellere

Phasentrennung erreicht. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und

das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt.

AAV 10 Synthese von DiPPro-NDP-Prodrugs

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 1.0 Äquiv. des entsprechenden Nucleosid-5’-

monophosphats dreimal mit abs. Acetonitril coevaporiert und in abs. Acetonitril gelöst.

Anschließend wurden bei Raumtemperatur 1.5 Äquiv. des entsprechenden Bis(4-

alkanoyloxybenzyl)-N,N-diisopropylaminophosphoramidits zugetropft und 0.5 Äquiv.

4,5-Dicyanoimidazol (DCI) (0.25 M in Acetonitril) zugegeben. Alle 5 Minuten wurden weitere

0.25 Äquiv. DCI zugegeben bis insgesamt 1.5 Äquiv. DCI zugegeben wurden. Nach 5-

20 Minuten Rühren bei Raumtemperatur wurden bei -10 °C 1.5 Äquiv. tert-Butylhydroperoxid

(5.5 M in n-Decan) zugegeben. Dann wurde erneut 10-40 Minuten bei Raumtemperatur

gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur entfernt.


152

Der Rückstand wurde mittels automatisierter Säulenchromatographie an RP-18-Kieselgel

gereinigt. Das Rohprodukt wurde über eine Kationenaustauschersäule Dowex-NH4+ gegeben

und anschließend wieder mittels automatisierter Säulenchromatographie an RP-18-Kieselgel

gereinigt.

AAV 11 Synthese von Mono(4-octadecanoyloxybenzyl)-NDP- und -NTP-Prodrugs

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 1.0 Äquiv. Nucleosid-5’-monophosphat

bzw. -diphosphat dreimal mit abs. Acetonitril coevaporiert und in abs. Acetonitril gelöst.

Anschließend wurden bei Raumtemperatur 1.7 Äquiv. (9H-Fluoren-9-ylmethyl)-(4-

octadecanoyloxybenzyl)-N,N-diisopropylaminophosphoramidit 150 in abs. Dichlormethan

zugetropft und 0.5 Äquiv. 4,5-Dicyanoimidazol (DCI) (0.25 M in Acetonitril) zugegeben. Alle

5 Minuten wurden weitere 0.25 Äquiv. DCI zugegeben bis insgesamt 1.5 Äquiv. DCI

zugegeben wurden. Nach Rühren bei Raumtemperatur wurden bei -10 °C 1.7 Äquiv. tert-

Butylhydroperoxid (5.5 M in n-Decan) zugegeben. Dann wurde erneut bei Raumtemperatur

gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur entfernt.

Der Rückstand wurde in abs. Acetonitril aufgenommen und bei Raumtemperatur 5 vol%

Triethylamin zugetropft. Nach 10 Minuten Rühren bei Raumtemperatur wurde das

Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde in

Acetonitril/Wasser (1:1, v/v) gelöst und über RP-18-Kieselgel filtriert. Das Filtrat wurde mittels

automatisierter Säulenchromatographie an RP-18-Kieselgel gereinigt. Das Rohprodukt

wurde über eine Kationenaustauschersäule Dowex-NH4+ gegeben und anschließend wieder

mittels automatisierter Säulenchromatographie an RP-18-Kieselgel gereinigt.

9.2.2 Synthese von 2‘-Desoxyguanosinphosphorthioamiditen

Synthese von N2-Dimethylformamidin-2'-desoxyguanosin 44

Die Reaktion wurde gemäß der AAV 1 durchgeführt. Es wurden 100 mg (374 µmol,

1.0 Äquiv.) 2’-Desoxyguanosin-Monohydrat 19 in 10 mL abs. Pyridin mit 0.13 mL (0.11 g,

0.75 mmol, 2.0 Äquiv.) N,N-Dimethylformamiddiethylacetal versetzt und 18 Stunden gerührt.

Ausbeute: Es wurden 109 mg (126 µmol, 91%) eines

farblosen Feststoffes erhalten. Summenformel:

C13H18N6O4 Molekulargewicht: 322.33 g/mol DC: Rf =

0.49 (CH2Cl2/MeOH 4:1 v/v).

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 11.30 (s, 1H, NH), 8.55 (s, 1H, H-a), 8.03 (s, 1H,

H-8), 6.25 (dd, 3JH,H = 7.8 Hz, 3JH,H = 6.2 Hz, 1H, H-1’), 5.29 (d, 3JH,H = 3.9 Hz, 1H, 3’-OH),

4.93 (dd, 3JH,H = 5.5 Hz, 3JH,H = 5.5 Hz, 1H, 5’-OH), 4.41-4.34 (m, 1H, H-3’), 3.86-3.80 (m,


153

1H, H-4’), 3.62-3.47 (m, 2H, H-5’a, H-5’b), 3.16 (s, 3H, H-b), 3.03 (s, 3H, H-c), 2.63-2.54 (m,

1H, H-2’a), 2.23 (ddd, 2JH,H = 13.2 Hz, 3JH,H = 6.2 Hz, 3JH,H = 2.9 Hz, 1H, H-2’b).

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 158.0 (C-a), 157.6 (C-6), 157.2 (C-2), 149.6 (C-4),

136.6 (C-8), 119.7 (C-5), 87.7 (C-4’), 82.7 (C-1’), 70.9 (C-3’), 61.8 (C-5’), 40.6 (C-b), 39.6

(C-2’), 34.6 (C-c).

HRMS (ESI+): m/z = [M+Na]+ ber.: 345.1282, gef.: 345.1287, [M+H]+ ber.: 323.1462, gef.:

323.1467.

IR: �̃� [cm-1] = 3326, 3106, 2921, 2864, 1679, 1634, 1545, 1348, 1068, 941.

Synthese von N2-Dimethylformamidin-2'-desoxy-xylo-guanosin 34

Die Reaktion wurde gemäß der AAV 1 durchgeführt. Es wurden 1.34 g (5.00 mmol,

1.0 Äquiv.) 2’-Desoxy-xylo-guanosin 32 in 125 mL abs. Pyridin mit 1.71 mL (1.47 g,

10.0 mmol, 2.0 Äquiv.) N,N-Dimethylformamiddiethylacetal versetzt und 22 Stunden gerührt.

Ausbeute: Es wurden 1.23 g (3.80 mmol, 76%) eines

leicht orangenen Feststoffes erhalten. Summenformel:


0.29 (CH2Cl2/MeOH 4:1 v/v).


H-8), 6.18 (dd, 3JH,H = 8.6 Hz, 3JH,H = 2.3 Hz, 1H, H-1’), 5.52 (d, 3JH,H = 4.4 Hz, 1H, 3’-OH),


1H, H-4’), 3.77-3.68 (m, 1H, H-5’a), 3.64-3.54 (m, 1H, H-5’b), 3.15 (s, 3H, H-b), 3.03 (s, 3H,

H-c), 2.78-2.68 (m, 1H, H-2’a), 2.19 (dd, 2JH,H = 14.5 Hz, 3JH,H = 1.7 Hz, 1H, H-2’b).


137.2 (C-8), 119.3 (C-5), 85.1 (C-4’), 81.5 (C-1’), 69.0 (C-3’), 59.9 (C-5’), 40.9 (C-2’), 40.6

(C-b), 34.6 (C-c).


323.1466.

IR: �̃� [cm-1] = 3229, 2927, 2363, 1674, 1627, 1538, 1520, 1423, 1342, 1240, 1114, 1044,

847, 784.

Synthese von N2-Isoburyryl-2'-desoxyguanosin 38

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 2.85 g (10.0 mmol, 1.0 Äquiv.) 2’-Desoxyguanosin-

Monohydrat 19 dreimal mit abs. Pyridin coevaporiert und anschließend in 80 mL abs. Pyridin

suspendiert. Bei 0 °C wurden 6.50 mL (5.43 g, 50.0 mmol, 5.0 Äquiv.) Trimethylsilylchlorid

zugetropft und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurden 8.50 mL (7.91 g,


154

50.0 mmol, 5.0 Äquiv.) Isobuttersäureanhydrid bei Raumtemperatur zugegeben und weitere

17 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Bei 0 °C wurden 20 mL kaltes Wasser und nach

15 Minuten 5 mL Ammoniak (25%) hinzugegeben. Es wurden weitere 30 Minuten bei

Raumtemperatur gerührt und anschließend das Lösungsmittel unter vermindertem Druck

entfernt. Der Rückstand wurde in 50 mL demineralisiertem Wasser aufgenommen und mit

50 mL Ethylacetat/Diethylether (1:1 v/v) gewaschen. Der dabei entstandene farblose

Feststoff wurde durch Filtration isoliert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck

eingeengt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt

(CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v). Das Produkt wurde mit dem vorher durch Filtration erhaltenen

Produkt vereinigt.




0.17 (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v).

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 12.04 (s, 1H, NH), 11.69 (s, 1H, NH), 8.22 (s, 1H,

H-8), 6.21 (dd, 3JH,H = 7.5 Hz, 3JH,H = 6.1 Hz, 1H, H-1’), 5.31 (d, 3JH,H = 2.5 Hz, 1H, 3‘-OH),


1H, H-4‘), 3.60-3.47 (m, 2H, H-5’a,b), 2.76 (sept, 3JH,H = 6.8 Hz, 1H, H-b), 2.56 (ddd, 2JH,H =

13.2 Hz, 3JH,H = 7.5 Hz, 3JH,H = 5.8 Hz, 1H, H-2‘a), 2.27 (ddd, 2JH,H = 13.2 Hz, 3JH,H = 6.6 Hz,

3JH,H = 3.3 Hz, 1H, H-2‘b), 1.13 (d, 3JH,H = 0.8 Hz, 3H, C-c), 1.11 (d, 3JH,H = 0.8 Hz, 3H, C-d).


137.7 (C-8), 120.1 (C-5), 87.7 (C-4’), 82.9 (C-1‘), 70.4 (C-3’), 61.4 (C-5’), 39.6 (C-2’), 34.7

(C-b), 18.8 (C-c, C-d).

HRMS (ESI+): m/z = [M+Na]+ ber.: 360.1278, gef.: 360.1276.

IR: �̃� [cm-1] = 3295, 2970, 2934, 1709, 1679, 1598, 1553, 1212, 1189, 1159, 1091, 1059,

1042, 963.

Synthese von 5’-O-tert-Butyldimethylsilyl-2'-desoxyguanosin 40


1.0 Äquiv.) 2’-Desoxyguanosin-Monohydrat 19 in 50 mL abs. Pyridin mit 3.08 g (20.5 mmol,

1.1 Äquiv.) tert-Butyldimethylsilylchlorid versetzt. Es wurde 24 Stunden gerührt. Das

Rohprodukt wurde säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v).


155



C16H27N5O4Si Molekulargewicht: 381.51 g/mol DC: Rf =

0.37 (CH2Cl2/MeOH 4:1 v/v).

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 10.64 (s, 1H,

NH), 7.83 (s, 1H, H-8), 6.50 (s, 2H, NH2), 6.11 (dd, 3JH,H = 6.7 Hz, 3JH,H = 6.7 Hz, 1H, H-1’),

5.32 (d, 3JH,H = 4.1 Hz, 1H, 3‘-OH), 4.35-4.29 (m, 1H, H-3’), 3.84-3.80 (m, 1H, H-4’), 3.73 (dd,

2JH,H = 11.2 Hz, 3JH,H = 4.4 Hz, 1H, H-5’a), 3.68 (dd, 2JH,H = 11.2 Hz, 3JH,H = 4.4 Hz, 1H,

H-5’b), 2.48-2.44 (m, 1H, H-2’a), 2.23 (ddd, 2JH,H = 13.1 Hz, 3JH,H = 6.1 Hz, 3JH,H = 3.5 Hz,

1H, H-2’b), 0.86 (s, 9H, -SiC(CH3)3), 0.03 (s, 6H, -Si(CH3)2).

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 156.9 (C-2), 153.9 (C-6), 151.1 (C-4), 135.0 (C-8),

116.7 (C-5), 87.0 (C-4’), 82.6 (C-1’), 70.4 (C-3’), 63.4 (C-5’), 39.8 (C-2’)*, 26.0 (-SiC(CH3)3),

18.1 (-SiC(CH3)3), -5.4 (-Si(CH3)2). *aus dem HSQC bestimmt

HRMS (ESI+): m/z = [M+H]+ ber.: 382.1905, gef.: 382.1907.

IR: �̃� [cm-1] = 3493, 3301, 3113, 2928, 2857, 1688, 1607, 1532, 1381, 1360, 1251, 1069,

834, 779.

Synthese von N2-Dimethylformamidin-5’-O-(4-methoxytrityl)-2'-desoxy-xylo-guanosin

35

Die Reaktion wurde gemäß der AAV 3 durchgeführt. Es wurden 420 mg (1.30 mmol,

1.0 Äquiv.) N2-Dimethylformamidin-2'-desoxy-xylo-guanosin 34 in 25 mL abs. Pyridin mit

483 mg (1.56 mmol, 1.2 Äquiv.) 4-Methoxytritylchlorid in 4 mL abs. Pyridin versetzt und

15 Stunden gerührt. Es wurde keine wässrige Aufarbeitung durchgeführt. Das Rohprodukt

wurde säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 19:1 v/v, 0.5% Et3N).

Ausbeute: Es wurden 557 mg (937 µmol,

72%) eines farblosen Feststoffes erhalten.

Summenformel: C33H34N6O5

Molekulargewicht: 594.67 g/mol DC: Rf =

0.35 (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v).


H-8), 7.43-7.35 (m, 4H, H-3‘‘), 7.32-7.17 (m, 8H, H-4‘‘, H-5‘‘, H-7‘‘), 6.86-6.81 (m, 2H, H-8‘‘),

6.25 (dd, 3JH,H = 8.6 Hz, 3JH,H = 2.0 Hz, 1H, H-1’), 5.53 (d, 3JH,H = 4.6 Hz, 1H, 3’-OH), 4.35-

4.29 (m, 1H, H-3’), 4.17-4.11 (m, 1H, H-4’), 3.73 (s, 3H, -OCH3), 3.38-3.34 (m, 1H, H-5’a),


156

3.14-3.09 (dd, 2JH,H = 10.2 Hz, 3JH,H = 3.2 Hz, 1H, H-5’b), 3.12 (s, 3H, H-b), 3.03 (s, 3H, H-c),

2.78-2.68 (m, 1H, H-2’a), 2.19 (dd, 2JH,H = 14.5 Hz, 3JH,H = 1.4 Hz, 1H, H-2’b).

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 158.1 (C-9’’), 157.9 (C-a), 157.6 (C-6), 157.2

(C-2), 149.3 (C-4), 144.4, 144.3 (C-2’’), 137.2 (C-8), 135.0 (C-6’’), 130.0 (C-7’’), 128.0

(C-3’’), 127.7 (C-4’’), 126.8, 126.7 (C-5’’), 119.3 (C-5), 113.1 (C-8’’), 85.8 (C-1’’), 83.4

(C-4’), 81.9 (C-1’), 69.4 (C-3’), 63.2 (C-5’), 55.0 (-OCH3), 40.9 (C-b), 40.6 (C-2’), 34.6 (C-c).


595.2661.

IR: �̃� [cm-1] = 2932, 2360, 1679, 1627, 1520, 1422, 1345, 1246, 1113, 1062, 1030, 700.

Synthese von N2-Dimethylformamidin-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2'-desoxyguanosin 43

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 2.85 g (10.0 mmol, 1.0 Äquiv.) 2’-Desoxyguanosin-

Monohydrat 19 dreimal mit abs. Pyridin coevaporiert und anschließend in 250 mL abs.

Pyridin gelöst. Unter Rühren wurden 3.40 mL (2.94 g, 20.0 mmol, 2.0 Äquiv.) N,N-

Dimethylformamiddiethylacetal hinzugegeben. Es wurde 17 Stunden bei Raumtemperatur

gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde

in 200 mL abs. Pyridin gelöst und 4.07 g (12.0 mmol, 1.2 Äquiv.) 4,4‘-Dimethoxytritylchlorid

hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.

Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und dreimal mit

einem Gemisch aus Toluol und Dichlormethan coevaporiert. Der Rückstand wurde in 300 mL

Dichlormethan und 300 mL demineralisiertes Wasser aufgenommen. Die wässrige Phase

wurde zweimal mit je 300 mL Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen


Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt

(CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v, 0.5% Et3N).

Ausbeute: Es wurden 3.56 g

(5.70 mmol, 57%) eines leicht gelben

Feststoffs erhalten. Summenformel:

C34H36N6O6 Molekulargewicht:

624.70 g/mol DC: Rf = 0.40



H-8), 7.36-7.31 (m, 2H, H-3‘‘), 7.27-7.16 (m, 7H, H-4‘‘, H-5‘‘, H-7‘‘), 6.85-6.77 (m, 4H, H-8‘‘),

6.28 (dd, 3JH,H = 6.6 Hz, 3JH,H = 6.6 Hz, 1H, H-1’), 5.36 (d, 3JH,H = 4.3 Hz, 1H, 3‘-OH), 4.43-

4.37 (m, 1H, H-3’), 3.96-3.90 (m, 1H, H-4‘), 3.72 (s, 3H, -OCH3), 3.72 (s, 3H, -OCH3), 3.19


157

(dd, 2JH,H = 10.3 Hz, 3JH,H = 6.5 Hz, 1H, H-5‘a), 3.13-3.09 (m, 4H, H-5’b, H-b), 3.03 (s, 3H,

H-c), 2.71-2.64 (m, 1H, H-2‘a), 2.34-2.27 (m, 1H, H-2‘b).

13C-NMR (150.9 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 158.1, 158.0 (C-9’’), 157.9 (C-a), 157.6 (C-6),

157.2 (C-2), 149.7 (C-4), 144.9 (C-2’’), 135.6 (C-8), 135.5 (C-6‘‘), 129.7, 129.6 (C-7‘‘), 127.8

(C-3‘‘), 127.7 (C-4‘‘), 126.6 (C-5‘‘) 119.8 (C-5), 113.1 (C-8‘‘), 85.8 (C-4’), 85.4 (C-1’’), 82.4

(C-1‘), 70.7 (C-3’), 64.3 (C-5’), 55.0, 55.0 (-OCH3), 40.7 (C-b), 39.3 (C-2’), 34.7 (C-c).


IR: �̃� [cm-1] = 3112, 2931, 1683, 1627, 1538, 1506, 1345, 1246, 1030, 785, 701.

Synthese von N2-Dimethylformamidin-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2'-desoxy-xylo-

guanosin 36


1.0 Äquiv.) N2-Dimethylformamidin-2'-desoxy-xylo-guanosin 34 in 75 mL abs. Pyridin mit

1.50 g (4.47 mmol, 1.2 Äquiv.) 4,4‘-Dimethoxytritylchlorid versetzt und 20 Stunden gerührt.

Die wässrige Aufarbeitung erfolgte mit 130 mL einer gesättigten, wässrigen

Natriumhydrogencarbonat-Lösung und jeweils 130 mL Dichlormethan. Das Rohprodukt

wurde säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 19:1 v/v, 0.5% Et3N).


(2.40 mmol, 65%) eines farblosen

Feststoffes erhalten. Summenformel:

C34H36N6O6 Molekulargewicht: 624.70

g/mol DC: Rf = 0.44 (CH2Cl2/MeOH 9:1

v/v).


H-8), 7.42-7.35 (m, 2H, H-3‘‘), 7.29-7.16 (m, 7H, H-4‘‘, H-5‘‘, H-7‘‘), 6.88-6.77 (m, 4H, H-8‘‘),

6.25 (dd, 3JH,H = 8.5 Hz, 3JH,H = 1.8 Hz, 1H, H-1’), 5.54 (d, 3JH,H = 4.8 Hz, 1H, 3’-OH), 4.34-

4.30 (m, 1H, H-3’), 4.16-4.11 (m, 1H, H-4’), 3.72 (s, 3H, -OCH3), 3.72 (s, 3H, -OCH3), 3.34

(dd, 2JH,H = 10.2 Hz, 3JH,H = 8.0 Hz, 1H, H-5’a), 3.22-3.18 (m, 1H, H-5’b), 3.12 (s, 3H, H-b),

3.03 (s, 3H, H-c), 2.78-2.68 (m, 1H, H-2’a), 2.24-2.16 (m, 1H, H-2’b).

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 158.0, 158.0 (C-9’’), 157.9 (C-a), 157.6 (C-6),

157.3 (C-2), 149.4 (C-4), 145.0 (C-2’’), 137.2 (C-8), 135.7, 135.6 (C-6‘‘), 129.7, 129.7 (C-7‘‘),

127.7 (C-3‘‘), 127.7 (C-4‘‘), 126.6 (C-5‘‘), 119.4 (C-5), 113.1, 113.0 (C-8‘‘), 85.5 (C-1’’), 83.4

(C-4’), 82.0 (C-1’), 69.4 (C-3’), 63.1 (C-5’), 55.0, 55.0 (-OCH3), 40.9 (C-2’), 40.6 (C-b), 34.6

(C-c).



158

IR: �̃� [cm-1] = 2932, 1679, 1628, 1506, 1423, 1345, 1245, 1174, 1029, 828, 701.

Synthese von N2-Dimethylformamidin-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-desoxyguanosin

39


1.0 Äquiv.) 5’-O-tert-Butyldimethylsilyl-2'-desoxyguanosin 40 in 80 mL abs. Pyridin mit

1.80 mL (1.55 g, 10.5 mmol, 2.0 Äquiv.) N,N-Dimethylformamiddiethylacetal versetzt und

18 Stunden gerührt.

Ausbeute: Es wurden 2.09 g (4.78 mmol, 91%)

eines farblosen Feststoffes erhalten.

Summenformel: C19H32N6O4Si Molekulargewicht:

436.59 g/mol DC: Rf = 0.43 (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v).



4.39-3.34 (m, 1H, H-3’), 3.86-3.82 (m, 1H, H-4‘), 3.75 (dd, 2JH,H = 11.2 Hz, 3JH,H = 4.5 Hz, 1H,

H-5’a), 3.68 (dd, 2JH,H = 11.2 Hz, 3JH,H = 4.8 Hz, 1H, H-5’b), 3.16 (s, 3H, H-b), 3.03 (s, 3H,

H-c), 2.62-2.54 (m, 1H, H-2‘a), 2.27 (ddd, 2JH,H = 13.3 Hz, 3JH,H = 6.5 Hz, 3JH,H = 3.6 Hz, 1H,

H-2‘b), 0.86 (s, 9H, -SiC(CH3)3), 0.02 (s, 6H, -Si(CH3)2).


136.0 (C-8), 119.6 (C-5), 87.2 (C-4’), 82.5 (C-1’), 70.5 (C-3’), 63.5 (C-5’), 40.7 (C-b), 39.6

(C-2’), 34.7 (C-c), 25.8 (-SiC(CH3)3), 18.1 (-SiC(CH3)3), -5.4 (-Si(CH3)2).


IR: �̃� [cm-1] = 3125, 2928, 2856, 1674, 1627, 1538, 1520, 1423, 1344, 1156, 1064, 832, 778.

Synthese von N2-Dimethylformamidin-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-desoxy-xylo-

guanosin 41

Die Reaktion wurde gemäß der AAV 4 durchgeführt. Es wurden 1.84 mg (4.34 mmol,

1.5 Äquiv.) Dess-Martin Periodinan in 13 mL abs. Dichlormethan mit 1.26 g (2.89 mmol,

1.0 Äquiv.) N2-Dimethylformamidin-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-desoxyguanosin 39 in 5 mL

abs. Dichlormethan versetzt. Es wurde 30 Minuten und weitere 4 Stunden gerührt.

Anschließend wurden 9.5 mL Isopropanol und 219 mg (5.78 mmol, 2.0 Äquiv.)

Natriumborhydrid zugegeben. Nach 22 Stunden wurde die Lösung mit 9.5 mL Aceton

versetzt. Die wässrige Aufarbeitung erfolgte mit 60 mL demineralisiertem Wasser, 60 mL

gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und 60 mL gesättigter, wässriger

Natriumchlorid-Lösung.


159

Ausbeute: Es wurden 426 mg (977 µmol, 34%)






4.37-4.32 (m, 1H, H-3’), 3.97-3.88 (m, 2H, H-4‘, H-5‘a), 3.75 (dd, 2JH,H = 10.4 Hz, 3JH,H =

6.1 Hz, 1H, H-5’b), 3.14 (s, 3H, H-b), 3.03 (s, 3H, H-c), 2.76-2.69 (m, 1H, H-2‘a), 2.22-2.16

(m, 1H, H-2‘b), 0.85 (s, 9H, -SiC(CH3)3), 0.02 (s, 3H, -Si(CH3)2), 0.02 (s, 3H, -Si(CH3)2).


137.4 (C-8), 119.5 (C-5), 84.8 (C-4’), 81.7 (C-1‘), 69.0 (C-3’), 62.2 (C-5’), 40.9 (C-2’), 40.6

(C-b), 34.6 (C-c), 25.8 (-SiC(CH3)3), 18.1 (-SiC(CH3)3), -5.3, -5.4 (C-Si(CH3)2).


IR: �̃� [cm-1] = 3108, 2932, 1692, 1626, 1534, 1514, 1428, 1336, 1228, 1137, 1047, 973, 856,

841, 778.

Synthese von N2-Isobutyryl-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-desoxyguanosin 21

Die Reaktion wurde gemäß der AAV 2 durchgeführt. Es wurden 1.00 g (2.96 mmol) N2-

Isobutyryl-2'-desoxyguanosin 38 in 15 mL abs. Pyridin mit 491 mg (3.26 mmol, 1.1 Äquiv.)

tert-Butyldimethylsilylchlorid versetzt. Es wurde 18 Stunden gerührt. Das Rohprodukt wurde

säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt


Ausbeute: Es wurden 762 mg (1.69 mmol, 56%)






4.39-4.33 (m, 1H, H-3’), 3.87-3.83 (m, 1H, H-4‘), 3.76 (dd, 2JH,H = 11.3 Hz, 3JH,H = 4.4 Hz, 1H,

H-5’a), 3.69 (dd, 2JH,H = 11.3 Hz, 3JH,H = 4.6 Hz, 1H, H-5’b), 2.76 (sept, 3JH,H = 6.8 Hz, 1H,

H-b), 2.60 (m, 1H, H-2‘a), 2.31 (ddd, 2JH,H = 13.2 Hz, 3JH,H = 6.2 Hz, 3JH,H = 4.0 Hz, 1H,

H-2‘b), 1.12 (d, 3JH,H = 0.9 Hz, 3H, C-c), 1.11 (d, 3JH,H = 0.9 Hz, 3H, C-d), 0.85 (s,

9H, -SiC(CH3)3), 0.02 (s, 6H, -Si(CH3)2).


160


137.7* (C-8), 120.6 (C-5), 87.2 (C-4’), 83.1 (C-1‘), 70.1 (C-3’), 63.2 (C-5’), 40.0 (C-2’), 34.8

(C-b), 25.9 (-SiC(CH3)3), 18.9 (C-c), 18.8 (C-d), 18.0 (-SiC(CH3)3), -5.4, -5.5 (C-Si(CH3)2).

*aus dem HMBC bestimmt


IR: �̃� [cm-1] = 3145, 2929, 2857, 1674, 1605, 1557, 1402, 1252, 1099, 1068, 833, 779.

Synthese von N2-Isobutyryl-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-desoxy-xylo-guanosin 22


1.5 Äquiv.) Dess-Martin Periodinan in 10 mL abs. Dichlormethan mit 600 mg (1.33 mmol,

1.0 Äquiv.) N2-Isobutyryl-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-desoxyguanosin 21 in 5 mL abs.

Dichlormethan versetzt. Es wurde eine Stunde und weitere 4 Stunden gerührt. Anschließend

wurden 4.6 mL Isopropanol und 102 mg (2.70 mmol, 2.0 Äquiv.) Natriumborhydrid

zugegeben. Nach 16 Stunden wurde die Lösung mit 4.6 mL Aceton versetzt. Die wässrige

Aufarbeitung erfolgte mit 50 mL Ethylacetat, 50 mL demineralisiertem Wasser, 50 mL

gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und 50 mL gesättigter, wässriger

Natriumchlorid-Lösung.







4.38-4.35 (m, 1H, H-3’), 4.00-3.93 (m, 2H, H-4‘, H-5‘a), 3.77 (dd, 2JH,H = 10.6 Hz, 3JH,H =

6.4 Hz, 1H, H-5’b), 2.76 (sept, 3JH,H = 6.8 Hz, 1H, H-b), 2.73-2.67 (m, 1H, H-2‘a), 2.26-2.21

(m, 1H, H-2‘b), 1.12 (d, 3JH,H = 0.9 Hz, 3H, C-c), 1.11 (d, 3JH,H = 0.9 Hz, 3H, C-d), 0.85 (s,

9H, -SiC(CH3)3), 0.02 (s, 3H, -Si(CH3)2), 0.02 (s, 3H, -Si(CH3)2).


138.2 (C-8), 120.1 (C-5), 85.4 (C-4’), 82.6 (C-1‘), 68.8 (C-3’), 62.1 (C-5’), 41.0 (C-2’), 34.8

(C-b), 25.8 (-SiC(CH3)3), 18.9 (C-c), 18.8 (C-d), 18.0 (-SiC(CH3)3), -5.3, -5.4 (C-Si(CH3)2).


IR: �̃� [cm-1] = 3128, 2929, 1674, 1604, 1557, 1400, 1250, 1097, 1069, 834, 779.


161

Synthese von N2-Dimethylformamidin-3’-O-methansulfonyl-5’-O-(4-methoxytrityl)-2'-

desoxy-xylo-guanosin 33

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 1.38 g (2.32 mmol, 1.0 Äquiv.) N2-

Dimethylformamidin-5’-O-(4-methoxytrityl)-2'-desoxy-xylo-guanosin 35 dreimal mit abs.

Pyridin coevaporiert und anschließend in 28 mL abs. Pyridin gelöst. Bei -40 °C wurden

0.54 mL (0.80 g, 7.0 mmol, 3.0 Äquiv.) Methansulfonylchlorid langsam hinzugetropft und

30 Minuten bei -40 °C gerührt. Dann wurde 3 Stunden bei 10 °C und 4 Stunden bei

Raumtemperatur gerührt. Es wurden 150 mL demineralisiertes Wasser hinzugegeben und

dreimal mit 150 mL Dichlormethan extrahiert. Die vereinten organischen Phasen wurden

über Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und mit

Toluol und Dichlormethan coevaporiert. Das Rohprodukt wurde säulenchromatographisch an

Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 98:2 v/v, 0.5% Et3N).

Ausbeute: Es wurden 784 mg (1.17 mmol,

50%) eines roten Feststoffes erhalten.

Summenformel: C34H36N6O7S


0.44 (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v).


H-8), 7.43-7.36 (m, 4H, H-3‘‘), 7.33-7.20 (m, 8H, H-4‘‘, H-5‘‘, H-7‘‘), 6.89-6.83 (m, 2H, H-8‘‘),

6.31 (dd, 3JH,H = 8.3 Hz, 3JH,H = 3.0 Hz, 1H, H-1’), 5.43 (dd, 3JH,H = 4.3 Hz, 3JH,H = 4.3 Hz, 1H,

H-3’), 4.45-4.38 (m, 1H, H-4’), 3.73 (s, 3H, -OCH3), 3.41-3.34 (m, 1H, H-5’a), 3.20-3.15 (m,

1H, H-5’b), 3.13 (s, 3H, H-b), 3.07 (s, 3H, Ms-CH3), 3.05-2.99 (m, 4H, H-c, H-2’a), 2.72-2.64

(m, 1H, H-2’b).

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 158.3 (C-9’’), 158.1 (C-a), 157.6 (C-6), 157.4

(C-2), 149.7 (C-4), 144.0, 143.9 (C-2’’), 135.8 (C-8), 134.7 (C-6’’), 130.0 (C-7’’), 128.0, 128.0

(C-3’’), 127.9 (C-4’’), 127.0 (C-5’’), 119.4 (C-5), 113.2 (C-8’’), 86.2 (C-1’’), 81.7 (C-1’), 80.8

(C-4’), 80.0 (C-3’), 62.0 (C-5’), 55.1 (-OCH3), 40.7 (C-b), 38.6 (C-2’), 37.6 (Ms-CH3), 34.7

(C-c).


673.2429.

IR: �̃� [cm-1] = 2970, 1683, 1628, 1538, 1428, 1345, 1249, 1173, 1070, 894, 702.


162

Synthese von N2-Dimethylformamidin-3’-O-methansulfonyl-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-

2'-desoxy-xylo-guanosin 37


3.0 Äquiv.) Triphenylphosphin in 24 mL abs. Tetrahydrofuran mit 2.13 mL (10.7 mmol,

3.0 Äquiv.) Diisopropylazodicarboxylat versetzt. Anschließend wurden 0.46 mL (7.1 mmol,

2.0 Äquiv.) Methansulfonsäure zugegeben und 2.23 g (3.57 mmol, 1.0 Äquiv.) N2-

Dimethylformamidin-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2'-desoxyguanosin 43 in 15 mL abs.

Tetrahydrofuran langsam zugetropft. Es wurde 16 Stunden bei 40 °C gerührt. Dann wurde

das Reaktionsgemisch filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das

Rohprodukt wurde am Chromatotron an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 19:1 v/v,

Equilibrierung mit Zusatz von 0.5% Et3N).


(2.04 mmol, 57%) eines rötlichen


C35H38N6O8S Molekulargewicht:

702.78 g/mol DC: Rf = 0.49



H-8), 7.43-7.36 (m, 2H, H-3‘‘), 7.32-7.19 (m, 7H, H-4‘‘, H-5‘‘, H-7‘‘), 6.89-6.80 (4H, H-8‘‘),

6.31 (dd, 3JH,H = 8.2 Hz, 3JH,H = 2.9 Hz, 1H, H-1’), 5.45-5.41 (m, 1H, H-3’), 4.42-4.38 (m, 1H,

H-4‘), 3.73 (s, 3H, -OCH3), 3.72 (s, 3H, -OCH3), 3.37 (dd, 2JH,H = 10.1 Hz, 3JH,H = 7.3 Hz, 1H,

H-5‘a), 3.18 (dd, 2JH,H = 10.1 Hz, 3JH,H = 4.3 Hz, 1H, H-5’b), 3.13 (s, 3H, H-b), 3.07 (s, 3H,

H-c), 3.03-2.98 (s, 4H, H-2’a, Ms-CH3), 2.72-2.66 (m, 1H, H-2‘b).

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 158.1, 158.1 (C-9’’), 158.1 (C-a), 157.6 (C-6),

157.4 (C-2), 149.7 (C-4), 144.6 (C-2’’), 135.8 (C-8), 135.3, 135.2 (C-6’’), 129.7, 129.7 (C-7’’),

127.8 (C-3’’), 127.7 (C-4’’), 126.8 (C-5’’), 119.4 (C-5), 113.1 (C-8’’), 85.9 (C-1’’), 81.6 (C-1’),

80.8 (C-4‘), 80.0 (C-3’), 61.8 (C-5’), 55.0, 54.9 (-OCH3), 40.6 (C-b), 38.5 (C-2’), 37.6

(Ms-CH3), 34.7 (C-c).


IR: �̃� [cm-1] = 2932, 1683, 1627, 1538, 1507, 1343, 1246, 1173, 1030, 891, 827, 702.

Synthese von N2-Dimethylformamidin-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-3’-methansulfonyl-2'-

desoxy-xylo-guanosin 42


3.0 Äquiv.) Triphenylphosphin in 1.6 mL abs. Tetrahydrofuran mit 0.14 mL (0.69 mmol,


163

3.0 Äquiv.) Diisopropylazodicarboxylat versetzt. Anschließend wurden 100 mg (229 µmol,

1.0 Äquiv.) N2-Dimethylformamidin-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-desoxyguanosin 39 in 1 mL

abs. Tetrahydrofuran zugegeben und 0.03 mL (0.5 mmol, 2.0 Äquiv.) Methansulfonsäure in

1 mL abs. Tetrahydrofuran langsam zugetropft. Es wurde 24 Stunden bei 40 °C gerührt. Das

Rohprodukt wurde am Chromatotron an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 19:1 v/v).

Ausbeute: Es wurden 52 mg (0.10 µmol, 39%)


Summenformel: C20H34N6O6SSi

Molekulargewicht: 514.67 g/mol DC: Rf = 0.40



H-8), 6.26 (dd, 3JH,H = 8.3 Hz, 3JH,H = 3.3 Hz, 1H, H-1’), 5.40-5.37 (m, 1H, H-3’), 4.21-4.15 (m,

1H, H-4’), 3.92 (dd, 2JH,H = 11.1 Hz, 3JH,H = 4.9 Hz, 1H, H-5‘a), 3.82 (dd, 2JH,H = 11.1 Hz, 3JH,H

= 6.4 Hz, 1H, H-5’b), 3.27 (s, 3H, H-b), 3.15 (s, 3H, H-c), 3.05-2.98 (m, 4H, Ms-CH3, H-2‘a),

2.66 (dd, 2JH,H = 15.3 Hz, 3JH,H = 2.7 Hz, 1H, H-2‘b), 0.85 (s, 9H, -SiC(CH3)3), 0.04 (s,

6H, -Si(CH3)2).


137.1* (C-8), 119.3 (C-5), 82.2 (C-4’), 81.4 (C-1‘), 79.6 (C-3’), 61.1 (C-5’), 40.7 (C-b), 38.6

(C-2’), 37.7 (C-c), 34.7 (Ms-CH3), 25.8 (-SiC(CH3)3), 18.0 (-SiC(CH3)3), -5.4, -5.5 (-Si(CH3)2).

*aus dem HMBC bestimmt

Synthese von Natriumthiobenzoat

Es wurden 5.08 g (127 mmol, 1.0 Äquiv.) Natriumhydroxid in 39 mL demineralisiertem

Wasser gelöst und langsam bei Raumtemperatur 15.0 mL (17.6 g, 127 mmol, 1.0 Äquiv.)

Thiobenzoesäure zugetropft. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt.

Der Rückstand wurde in 50 mL demineralisiertem Wasser aufgenommen, filtriert und das

Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Dies wurde zweimal wiederholt.

Anschließend wurde der Rückstand mehrere Tage im Ölpumpenvakuum getrocknet, bis ein

leicht gelber Feststoff entstanden war.

Summenformel: C7H5NaOS Molekulargewicht: 160.17 g/mol.

1H-NMR (400 MHz, D2O): [ppm] = 8.03 (d, 3JH,H = 8.1 Hz, 2H, H-o), 7.61-7.54 (m, 1H, H-p),

7.51-7.44 (m, 2H, H-m).

IR: �̃� [cm-1] = 3050, 1503, 1202, 1171, 948, 771, 686, 655.


164

Synthese von N2-Dimethylformamidin-3’-S-benzoyl-5’-O-(4-methoxytrityl)-2'-desoxy-3’-

thioguanosin 45


1.0 Äquiv.) N2-Dimethylformamidin-3’-O-methansulfonyl-5’-O-(4-methoxytrityl)-2'-desoxy-

xylo-guanosin 33 in 5 mL abs. N,N-Dimethylformamid mit 1.42 g (8.92 mmol, 10 Äquiv.)

Natriumthiobenzoat in 4 mL abs. N,N-Dimethylformamid versetzt. Die wässrige Aufarbeitung

erfolgte mit 40 mL demineralisiertes Wasser, jeweils 24 mL Ethylacetat und jeweils 12 mL

gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung. Das Rohprodukt wurde

säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 19:1 v/v, 0.5% Et3N).

Ausbeute: Es wurden 371 mg (0.519 mmol,

58%) eines leicht gelben Feststoffes erhalten.

Summenformel: C40H38N6O5S


0.45 (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v).


H-8), 7.91-7.86 (m, 2H, o-H-Bz), 7.76-7.70 (m, 1H, p-H-Bz), 7.62-7.55 (m, 2H, m-H-Bz),

7.33-7.25 (m, 4H, H-3‘‘), 7.21-7.12 (m, 8H, H-4‘‘, H-5‘‘, H-7‘‘), 6.75-6.70 (m, 2H, H-8‘‘), 6.28

(dd, 3JH,H = 8.2 Hz, 3JH,H = 2.8 Hz, 1H, H-1’), 4.89-4.76 (m, 1H, H-3’), 4.19-4.13 (m, 1H, H-4’),

3.65 (s, 3H, -OCH3), 3.31-3.26 (m, 1H, H-5’a), 3.24-3.09 (m, 2H, H-5’b, H-2’a), 3.03 (s, 6H,

H-b, H-c), 2.70-2.60 (m, 1H, H-2’b).

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 190.2 (q-C-Bz), 158.0 (C-9’’), 157.8 (C-a), 157.6

(C-6), 157.0 (C-2), 149.1 (C-4), 144.1, 144.0 (C-2’’), 135.8 (C-8), 134.8 (C-6’’), 134.3

(p-C-Bz), 129.8 (C-7’’), 129.2 (m-C-Bz), 127.9, 127.8 (C-3’’), 127.7 (C-4’’), 126.9 (o-C-Bz),

126.7, 126.7 (C-5’’), 120.6 (C-5), 113.0 (C-8’’), 85.8 (C-1’’), 83.5 (C-1’), 83.1 (C-4’), 63.1

(C-5’), 54.9 (-OCH3), 40.4 (C-b), 40.1 (C-3’), 37.3 (C-2’), 34.7 (C-c).


715.2680.

IR: �̃� [cm-1] = 2926, 2361, 1674, 1626, 1516, 1423, 1344, 1248, 1175, 1114, 1030, 906, 688.

Synthese von N2-Dimethylformamidin-3’-S-benzoyl-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2'-

desoxy-3’-thioguanosin 46


1.0 Äquiv.) N2-Dimethylformamidin-3’-O-methansulfonyl-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2'-desoxy-

xylo-guanosin 37 in 17 mL abs. N,N-Dimethylformamid mit 3.10 g (19.4 mmol, 10 Äquiv.)


165

Natriumthiobenzoat in 10.4 mL abs. N,N-Dimethylformamid versetzt. Die wässrige

Aufarbeitung erfolgte mit 140 mL demineralisiertes Wasser und jeweils 110 mL Ethylacetat.

Das Rohprodukt wurde am Chromatotron an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 19:1 v/v,

Equilibrierung mit Zusatz von 0.5% Et3N).


(1.59 mmol, 82%) eines leicht gelben


C41H40N6O6S Molekulargewicht:

744.87 g/mol DC: Rf = 0.53



H-8), 7.93-7.86 (m, 2H, o-H-Bz), 7.76-7.67 (m, 1H, p-H-Bz), 7.64-7.55 (m, 2H, m-H-Bz),

7.33-7.24 (m, 2H, H-3‘‘), 7.21-7.11 (m, 7H, H-4‘‘, H-5‘‘, H-7‘‘), 6.75-6.67 (m, 4H, H-8‘‘), 6.27

(dd, 3JH,H = 8.1 Hz, 3JH,H = 2.7 Hz, 1H, H-1’), 4.86-4.77 (m, 1H, H-3‘), 4.17-4.12 (m, 1H, H-4‘),

3.65 (s, 6H, -OCH3), 3.29 (dd, 2JH,H = 10.6 Hz, 3JH,H = 5.6 Hz, 1H, H-5‘a), 3.22-3.12 (m, 2H,

H-5’b, H-2’a), 3.04 (s, 3H, H-b), 3.03 (s, 3H, H-c), 2.69-2.60 (m, 1H, H-2‘b).

13C-NMR (151 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 190.2 (q-C-Bz), 158.0, 157.9 (C-9’’), 157.8 (C-a),

157.6 (C-6), 157.0 (C-2), 149.2 (C-4), 144.7 (C-2’’), 135.8 (C-8), 135.4, 135.3 (C-6’’), 134.3

(p-C-Bz), 129.6, 129.5 (C-7’’), 129.3 (m-C-Bz), 127.6 (C-3’’), 127.6 (C-4’’), 126.9 (o-C-Bz),

126.6 (C-5’’), 120.6 (C-5), 113.0 (C-8’’), 85.6 (C-1’’), 83.6 (C-1’), 83.1 (C-4’), 63.0 (C-5’),

54.9, 54.9 (-OCH3), 40.4 (C-b), 37.3 (C-2’), 34.7 (C-c).


IR: �̃� [cm-1] = 2931, 1674, 1626, 1507, 1344, 1246, 1174, 1030, 906, 828, 688.

Synthese von N2-Dimethylformamidin-3’-S-benzoyl-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-

desoxy-3’-thioguanosin 47


3.0 Äquiv.) Triphenylphosphin in 3.2 mL abs. Tetrahydrofuran mit 0.27 mL (1.4 mmol,

3.0 Äquiv.) Diisopropylazodicarboxylat versetzt. Anschließend wurden 200 mg (0.458 mmol,

1.0 Äquiv.) N2-Dimethylformamidin-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-desoxy-xylo-guanosin 41 in

1.2 mL abs. Tetrahydrofuran und 0.19 mL (1.6 mmol, 3.5 Äquiv.) Thiobenzoesäure in 0.8 mL

abs. Tetrahydrofuran zugegeben. Es wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das

Rohprodukt wurde mehrfach am Chromatotron an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v).


166







H-8), 7.96-7.90 (m, 2H, o-H-Bz), 7.75-7.69 (m, 1H, p-H-Bz), 7.62-7.55 (m, 2H, m-H-Bz), 6.25


3.86 (dd, 2JH,H = 11.7 Hz, 3JH,H = 3.6 Hz, 1H, H-5‘a), 3.80 (dd, 2JH,H = 11.7 Hz, 3JH,H = 4.8 Hz,

1H, H-5‘b), 3.16 (s, 3H, H-b), 3.11-3.06 (m, 1H, H-2‘a), 3.05 (s, 3H, H-c), 2.67-2.59 (m, 1H,

H-2‘b), 0.80 (s, 9H, -SiC(CH3)3), -0.03 (s, 3H, -Si(CH3)2), -0.06 (s, 3H, -Si(CH3)2).

13C-NMR (151 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 190.4 (q-C-Bz), 158.0 (C-a), 157.6 (C-2), 157.2

(C-6), 149.2 (C-4), 135.9 (C-8), 134.3 (p-C-Bz), 129.3, 129.1 (m-C-Bz), 126.9, 126.8

(o-C-Bz) 120.2 (C-5), 84.5 (C-4’), 83.3 (C-1‘), 62.9 (C-5’), 40.6 (C-b), 37.9 (C-2‘), 34.7 (C-c),

25.7 (-SiC(CH3)3), 18.0 (-SiC(CH3)3), -5.6, -5.6 (-Si(CH3)2).


IR: �̃� [cm-1] = 2927, 1668, 1625, 1516, 1344, 1112, 906, 835, 774, 687.

Synthese von N2-Isoburyryl-3’-S-benzoyl-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-desoxy-3’-thio-

guanosin 23


3.0 Äquiv.) Triphenylphosphin in 3.2 mL abs. Tetrahydrofuran mit 0.26 mL (0.27 g, 1.3 mmol,

3.0 Äquiv.) Diisopropylazodicarboxylat versetzt. Anschließend wurden 200 mg (0.443 mmol,

1.0 Äquiv.) N2-Isoburyryl-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-desoxy-xylo-guanosin 22 in 1.2 mL

abs. Tetrahydrofuran und 0.18 mL (0.21 g, 1.5 mmol, 3.5 Äquiv.) Thiobenzoesäure in 0.8 mL

abs. Tetrahydrofuran zugegeben. Es wurde 7 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das

Rohprodukt wurde mehrfach am Chromatotron an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 19:1

v/v).

Ausbeute: Es wurden 78 mg (0.14 mmol, 31%)






167


H-8), 7.95-7.90 (m, 2H, o-H-Bz), 7.75-7.70 (m, 1H, p-H-Bz), 7.61-7.57 (m, 2H, m-H-Bz), 6.25


3.93 (dd, 2JH,H = 11.7 Hz, 3JH,H = 3.1 Hz, 1H, H-5‘a), 3.80 (dd, 2JH,H = 11.7 Hz, 3JH,H = 4.0 Hz,

1H, H-5‘b), 3.03-2.96 (m, 1H, H-2‘a), 2.77 (sept, 3JH,H = 6.8 Hz, 1H, H-b), 2.70-2.72 (m, 1H,

H-2‘b), 1.14-1.10 (m, 6H, C-c, C-d), 0.84 (s, 9H, -SiC(CH3)3), 0.02 (s, 3H, -Si(CH3)2), 0.01 (s,

3H, -Si(CH3)2).

13C-NMR (151 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 190.0 (q-C-Bz), 180.2 (C-a), 154.9 (C-2), 148.2

(C-6), 148.1 (C-4), 135.9 (C-8), 134.4 (p-C-Bz), 129.3 (m-C-Bz), 126.9 126.9 (o-C-Bz),

120.4 (C-5), 84.5 (C-4’), 83.2 (C-1‘), 62.5 (C-5’), 40.1 (C-3’), 38.4 (C-2‘), 34.8 (C-b), 25.7

(-SiC(CH3)3), 18.9 (C-c), 18.8 (C-d), 18.0 (-SiC(CH3)3), -5.6, -5.6 (-Si(CH3)2).


IR: �̃� [cm-1] = 3137, 2927, 2855, 1667, 1606, 1554, 1401, 1204, 905, 875, 773, 687.

Synthese von N2-Dimethylformamidin-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2'-desoxy-3’-thio-

guanosin 50

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 150 mg (201 µmol, 1.0 Äquiv.) N2-

Dimethylformamidin-3’-S-benzoyl-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2'-desoxy-3’-thioguanosin 46

14 mL Sauerstoff-freiem MeOH/THF/H2O (4:6:1) gelöst. Bei 0 °C wurden 1.2 mL einer auf

0 °C gekühlten Natriumhydroxid-Lösung (1 M in H2O) langsam zugetropft und 30 Minuten bei

0 °C gerührt. Anschließend wurden 3.0 mL einer auf 0 °C gekühlten Citronensäure-Lösung

(1 M in H2O) langsam zugetropft und 15 Minuten bei 0 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch

wurde mit 40 mL Ethylacetat aufgenommen und mit 40 mL gesättigter, wässriger

Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die wässrige Phase wurde einmal mit 40 mL

Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurde über Natriumsulfat

getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt.

Ausbeute: Es wurden 132 mg eines

leicht verunreinigten farblosen Schaums

erhalten. Summenformel: C34H36N6O5S

Molekulargewicht: 640.76 g/mol DC: Rf

= 0.42 (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v).

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): [ppm]: 8.78 (s, 1H, NH), 8.56 (s, 1H, H-a), 7.79 (s, 1H, H-8),

7.44-7.37 (m, 2H, H-3‘‘), 7.33-7.24 (m, 7H, H-4‘‘, H-5‘‘, H-7‘‘), 6.85-6.78 (m, 4H, H-8‘‘), 6.24

(dd, 3JH,H = 7.3 Hz, 3JH,H = 3.0 Hz, 1H, H-1’), 3.99-3.91 (m, 1H, H-3’), 3.78 (s, 6H, -OCH3),

3.76-3.65 (m, 1H, H-4‘), 3.47 (dd, 2JH,H = 10.6 Hz, 3JH,H = 3.5 Hz, 1H, H-5‘a), 3.38 (dd, 2JH,H =


168

10.6 Hz, 3JH,H = 4.2 Hz, 1H, H-5‘b), 3.15 (s, 3H, H-b), 3.09 (s, 3H, H-c), 2.88 (ddd, 2JH,H =

13.6 Hz, 3JH,H = 7.4 Hz, 3JH,H = 2.9 Hz, 1H, H-2‘a), 2.48-2.34 (m, 1H, H-2‘b), 1.66 (d, 3JH,H =

6.6 Hz, 1H, SH).


Synthese von N2-Dimethylformamidin-5’-O-(4-methoxytrityl)-2‘-desoxy-3’-thio-

guanosin-3’-S-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidit 48


Dimethylformamidin-3’-S-benzoyl-5’-O-(4-methoxytrityl)-2'-desoxy-3’-thioguanosin 45 10 mL

Sauerstoff-freiem MeOH/THF/H2O (4:6:1) gelöst. Bei 0 °C wurden 0.85 mL einer auf 0 °C

gekühlten Natriumhydroxid-Lösung (1 M in H2O) langsam zugetropft und 30 Minuten bei 0 °C

gerührt. Anschließend wurden 2.15 mL einer auf 0 °C gekühlten Citronensäure-Lösung (1 M

in H2O) langsam zugetropft und 15 Minuten bei 0 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde

mit 30 mL Ethylacetat aufgenommen und mit 30 mL gesättigter, wässriger

Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über

Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt.

Der Rückstand wurde in 1 mL abs. Dichlormethan gelöst und 0.31 mL (0.092 mmol)

5-Benzylthio-1H-tetrazol (0.3 M in MeCN) zugetropft und anschließend 59 µL (0.18 mmol,

56 mg) 2-Cyanoethyl-N,N,N’,N’-tetraisopropylphosphordiamidit zugegeben. Es wurde eine

Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Es wurden 0.3 mL Methanol zugegeben und

15 Minuten rühren lassen. Das Reaktionsgemisch wurde in 15 mL Dichlormethan

aufgenommen und mit 15 mL gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung

gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das

Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde

säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v, 0.5% Et3N).

Ausbeute: Es wurden 58 mg eines verunreinigten

gelben Feststoffes als Gemisch zweier Diastereomere

erhalten. Summenformel: C42H51N8O5PS


(CH2Cl2/MeOH 9:1).

31P-NMR (162 MHz, CDCl3): [ppm] = 164.61, 160.93.



169

Synthese von N2-Dimethylformamidin-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2‘-desoxy-3’-

thioguanosin-3’-S-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidit 28


Dimethylformamidin-3’-S-benzoyl-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2'-desoxy-3’-thioguanosin 46

28 mL Sauerstoff-freiem MeOH/THF/H2O (4:6:1) gelöst. Bei 0 °C wurden 2.4 mL (1.2 mmol,

3.0 Äquiv.) einer auf 0 °C gekühlten Natriumhydroxid-Lösung (0.5 M in H2O) langsam über

10 Minuten zugetropft und 30 Minuten bei 0 °C gerührt. Anschließend wurden 1.2 mL

(1.2 mmol, 3.0 Äquiv.) einer auf 0 °C gekühlten Citronensäure-Lösung (1 M in H2O) langsam

über 10 Minuten zugetropft und 15 Minuten bei 0 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde

mit 80 mL Ethylacetat aufgenommen und mit 80 mL gesättigter, wässriger

Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die wässrige Phase wurde einmal mit 80 mL

Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurde über Natriumsulfat

getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand

wurde in 5 mL abs. Acetonitril gelöst und 2.01 mL (605 µmol, 1.5 Äquiv.) 5-Benzylthio-1H-

tetrazol (0.3 M in MeCN) zugetropft und anschließend 0.19 mL (0.61 mmol, 1.5 Äquiv)

2-Cyanoethyl-N,N,N’,N’-tetraisopropylphosphordiamidit langsam über 20 Minuten

zugegeben. Es wurde drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wurden 0.6 mL

Methanol zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde in 40 mL Ethylacetat aufgenommen und

mit 40 mL gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die

wässrige Phase wurde einmal mit 40 mL Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen

Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter

vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde am Chromatotron an Kieselgel

gereinigt (CH2Cl2/MeOH 19:1 v/v, Equilibrierung mit Zusatz von 0.5% Et3N). Das erhaltene

Produkt wurde in Dichlormethan gelöst, in n-Hexan (HPLC grade) getropft und filtriert.

Ausbeute: Es wurden 283 mg

(337 µmol, 83%) eines farblosen


C43H53N8O6PS Molekulargewicht:

840.99 g/mol DC: Rf = 0.52


Fast eluting enantiomer

1H-NMR (600 MHz, CDCl3): [ppm] = 8.62 (s, 1H, NH), 8.57 (s, 1H, H-a), 7.80 (s, 1H, H-8),

7.44-7.40 (m, 2H, H-3‘‘), 7.34-7.29 (m, 4H, H-7‘‘), 7.28-7.23 (m, 2H, H-4‘‘), 7.22-7.18 (m, 1H,

H-5‘‘), 6.83-6.78 (4H, H-8‘‘), 6.29 (dd, 3JH,H = 7.0 Hz, 3JH,H = 3.5 Hz, 1H, H-1’), 4.21-4.15 (m,

1H, H-4‘), 3.78 (s, 6H, -OCH3), 3.68-3.56 (m, 5H, H-3‘, H-a‘, H-a‘‘), 3.51 (dd, 2JH,H = 10.7 Hz,


170

3JH,H = 2.7 Hz, 1H, H-5‘a), 3.39 (dd, 2JH,H = 10.7 Hz, 3JH,H = 5.0 Hz, 1H, H-5’b), 3.15 (s, 3H,

H-b), 3.09 (s, 3H, H-c), 2.83-2.77 (s, 1H, H-2’a), 2.61-2.54 (m, 1H, H-2‘b), 2.44 (t, 3JH,H =

6.2 Hz, 2H, H-b‘‘), 1.19 (d, 3JH,H = 6.8 Hz, 6H, H-b‘), 1.12 (d, 3JH,H = 6.8 Hz, 6H, H-c‘).

13C-NMR (151 MHz, CDCl3): [ppm] = 158.7 (C-9’’), 158.1 (C-a), 157.8 (C-6), 156.7 (C-2),

149.8 (C-4), 144.6 (C-2’’), 136.1 (C-8), 135.9, 135.8 (C-6’’), 130.3, 130.3 (C-7’’), 128.4

(C-3’’), 128.0 (C-4’’), 127.0 (C-5’’), 121.0 (C-5), 117.4 (CN), 113.3 (C-8’’), 86.8 (d, 3JH,P =

5.5 Hz, C-4‘), 86.6 (C-1’’), 83.4 (C-1’), 63.0 (C-5’), 60.5 (d, 2JH,P = 18.6 Hz, C-a‘‘), 55.4

(-OCH3), 46.7 (d, 2JH,P = 12.1 Hz, C-a‘), 42.2 (d, 3JH,P = 2.8 Hz, C-2’), 41.5 (C-b), 40.0 (d,

2JH,P = 24.9 Hz, C-3‘), 35.3 (C-c), 24.4 (d, 3JH,P = 7.4 Hz, C-c‘), 24.2 (d, 3JH,P = 7.4 Hz, C-b‘),

20.2 (d, 3JH,P = 7.8 Hz, C-b‘‘).

31P-NMR (243 MHz, CDCl3): [ppm] = 164.78.

Slow eluting enantiomer

1H-NMR (600 MHz, CDCl3): [ppm] = 8.62 (s, 1H, NH), 8.59 (s, 1H, H-a), 7.78 (s, 1H, H-8),

7.44-7.40 (m, 2H, H-3‘‘), 7.34-7.29 (m, 4H, H-7‘‘), 7.28-7.23 (m, 2H, H-4‘‘), 7.22-7.18 (m, 1H,

H-5‘‘), 6.81-6.76 (4H, H-8‘‘), 6.31 (dd, 3JH,H = 6.8 Hz, 3JH,H = 4.4 Hz, 1H, H-1’), 4.21-4.15 (m,

1H, H-4‘), 3.77 (s, 6H, -OCH3), 3.68-3.56 (m, 5H, H-3‘, H-a‘, H-a‘‘), 3.45 (dd, 2JH,H = 10.5 Hz,

3JH,H = 2.9 Hz, 1H, H-5‘a), 3.36 (dd, 2JH,H = 10.5 Hz, 3JH,H = 5.3 Hz, 1H, H-5’b), 3.15 (s, 3H,

H-b), 3.09 (s, 3H, H-c), 2.89-2.84 (m, 1H, H-2’a), 2.66-2.60 (m, 1H, H-2‘b), 2.56 (t, 3JH,H =

6.3 Hz, 2H, H-b‘‘), 1.18 (d, 3JH,H = 6.9 Hz, 6H, H-b‘), 1.07 (d, 3JH,H = 6.9 Hz, 6H, H-c‘).

31P-NMR (243 MHz, CDCl3): [ppm] = 161.09.

HRMS (ESI+): m/z = [M+H]+ ber.: 841.3619, gef.: 841.3616, [M+Na]+ ber.: 863.3439, gef.:

863.3434.

IR: �̃� [cm-1] = 2962, 2927, 1680, 1627, 1536, 1509, 1345, 1247, 1175, 1030, 829, 701.

9.2.3 Synthese des Thymidin-Bausteins

Synthese von 4-Monomethoxytritylthioacetat 64

Es wurden 114 mg (1.00 mmol, 1.0 Äquiv.) Kaliumthioacetat in 20 mL abs. N,N-

Dimethylformamid gelöst und bei Raumtemperatur 308 mg (1.00 mmol, 1.0 Äquiv.)

4-Methoxytritylchlorid zugegeben. Die Suspension wurde drei Tage bei Raumtemperatur

gerührt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch in 100 mL Dichlormethan aufgenommen

und mit 100 mL gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die wässrige Phase wurde

zweimal mit 100 mL Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden

über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck

entfernt.


171

Ausbeute: Es wurden 337 mg (967 µmol, 97%) eines farblosen

Feststoffes erhalten. Summenformel: C22H20O2S

Molekulargewicht: 348.46 g/mol DC: Rf = 0.69 (PE/EE 6:1 v/v).

Schmelzpunkt: 80 °C.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): [ppm] = 7.22-7.12 (m, 10H, H-3, H-4,

H-5), 7.08-7.03 (m, 2H, H-7), 6.74-6.69 (m, 2H, H-8), 3.71 (s, 3H, -OCH3), 2.17 (s, 3H, SAc-

CH3).

13C-NMR (101 MHz, CDCl3): [ppm] = 193.6 (q-SAc), 158.6 (C-9), 144.4 (C-2), 136.0 (C-6),

131.0 (C-7), 129.7 (C-3), 127.8 (C-4), 127.0 (C-5), 113.0 (C-8), 70.0 (C-1), 55.4 (-OCH3),

30.7 (SAc-CH3).

IR: �̃� [cm-1] = 3056, 2955, 2932, 2854, 1982, 1665, 1506, 1249, 1031, 820, 581.

Synthese von 4-Monomethoxytritylthiol 65

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 11.0 g (31.6 mmol, 1.0 Äquiv.)

4-Monomethoxytritylthioacetat 64 in 160 mL Stickstoff-freiem Aceton gelöst, bei 0 °C 160 mL

(480 mmol, 15.0 Äquiv.) Natriumhydroxid-Lösung (3 M in H2O) zugetropft und vier Stunden

bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde mit Salzsäure (1 M) neutralisiert. Das

Reaktionsgemisch wurde dreimal mit je 200 mL Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten

organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel

unter vermindertem Druck entfernt. Der gelbe Feststoff wurde in Methanol suspendiert und

anschließend filtriert.

Ausbeute: Es wurden 5.90 g (19.2 mmol, 60%) eines leicht gelben

Feststoffes erhalten. Summenformel: C20H18OS Molekulargewicht:

306.42 g/mol DC: Rf = 0.66 (PE/EE 6:1 v/v). Schmelzpunkt: 97 °C.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): [ppm] = 7.33-7.21 (m, 10H, H-3, H-4, H-5), 7.18-7.15 (m, 2H,

H-7), 6.82-6.79 (m, 2H, H-8), 3.80 (s, 3H, -OCH3), 3.07 (s, 1H, SH).

13C-NMR (101 MHz, CDCl3): [ppm] = 158.4 (C-9), 147.6 (C-2), 139.5 (C-6), 130.7 (C-7),

129.4 (C-3), 127.9 (C-4), 126.9 (C-5), 113.2 (C-8), 62.6 (C-1), 55.4 (-OCH3).

IR: �̃� [cm-1] = 3053, 2959, 2931, 2836, 1956, 1606, 1507, 1250, 1029, 817, 577.

Synthese von 4-Monomethoxytritylsulfenylchlorid 66

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 3.37 g (11.0 mmol, 1.0 Äquiv.)

4-Monomethoxytritylthiol 65 in 100 mL abs. Dioxan gelöst und anschließend 1.08 g

(5.50 mmol, 0.5 Äquiv.) 1,3-Dichloro-5,5-dimethylhydantoin zugegeben. Das Reaktions-


172

gemisch wurde für 72 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wurden 300 mL

Dichlormethan und 300 mL Wasser zugegeben. Die organische Phase wurde zweimal mit je

100 mL gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische

Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter

vermindertem Druck entfernt. Anschließend wurde der Rückstand dreimal mit Ethylacetat

coevaporiert.

Ausbeute: Es wurden 3.40 g eines leicht verunreinigten, leicht

gelblichen Feststoffes erhalten. Summenformel: C20H17ClOS



1H-NMR (400 MHz, CDCl3): [ppm] = 7.37-7.16 (m, 12H, H-3, H-4, H-5, H-7), 6.86-6.79 (m,

2H, H-8), 3.78 (s, 3H, -OCH3).

13C-NMR (101 MHz, CDCl3): [ppm] = 159.4 (C-9), 142.3 (C-2), 133.5 (C-6), 131.4 (C-7),

130.0 (C-3), 128.3 (C-4), 128.0 (C-5), 113.7 (C-8), 72.0 (C-1), 55.4 (-OCH3).

IR: �̃� [cm-1] = 3054, 3010, 2956, 2837, 1579, 1486, 1032, 1249, 697, 581, 480, 448.

Synthese von 5‘-O-(4,4‘-Dimethoxytrityl)thymidin 55


1.0 Äquiv.) Thymidin 54 in 25 mL abs. Pyridin mit 2.03 g (6.00 mmol, 1.2 Äquiv.)

4,4‘-Dimethoxytritylchlorid versetzt und 20 Stunden gerührt. Die wässrige Aufarbeitung

erfolgte mit 80 mL einer gesättigten, wässrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung und

jeweils 80 mL Dichlormethan. Das Rohprodukt wurde am Chromatotron an Kieselgel

gereinigt (CH2Cl2/MeOH 29:1 v/v, Equilibrierung mit Zusatz von 0.5% Et3N).




0.56 (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v). Schmelzpunkt: 111 °C.


NH), 7.46 (d, 4JH,H = 1.2 Hz, 1H, H-6), 7.41-7.36 (m, 2H, H-3‘‘), 7.34-7.28 (m, 2H, H-4‘‘),

7.28-7.20 (m, 5H, H-5‘‘, H-7‘‘), 6.93-6.86 (m, 4H, H-8‘‘), 6.20 (dd, 3JH,H = 6.7 Hz, 3JH,H =

6.7 Hz, 1H, H-1’), 5.31 (d, 3JH,H = 4.5 Hz, 1H, 3‘-OH), 4.36-4.28 (m, 1H, H-3’), 3.90-3.86 (m,

1H, H-4‘), 3.74 (s, 6H, -OCH3), 3.24-3.15 (m, 2H, H-5‘), 2.29-2.20 (m, 1H, H-2’a), 2.15 (ddd,

2JH,H = 13.4 Hz, 3JH,H = 6.5 Hz, 3JH,H = 3.6 Hz, 1H, H-2‘b), 1.45 (d, 4JH,H = 1.3 Hz, 3H, T-CH3).


173

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 163.6 (C-4), 158.1, 158.1 (C-9’’), 150.4 (C-2),

144.7 (C-2’’), 135.7 (C-6), 135.4, 135.3 (C-6‘‘), 129.7 (C-7‘‘), 127.9 (C-4‘‘), 127.7 (C-3‘‘),

126.8 (C-5‘‘), 113.2 (C-8‘‘), 109.6 (C-5), 85.8 (C-1’’), 85.5 (C-4’), 83.7 (C-1’), 70.5 (C-3’),

63.8 (C-5’), 55.0 (-OCH3), 39.5* (C-2’), 11.7 (T-CH3). *aus dem HSQC bestimmt


IR: �̃� [cm-1] = 3191, 2856, 1686, 1508, 1246, 1029, 828, 703, 582, 425.

Synthese von 5‘-O-tert-Butyldimethylsilylthymidin 67


1.0 Äquiv.) Thymidin 54 in 23 mL abs. Pyridin mit 980 mg (6.50 mmol, 1.3 Äquiv.) tert-

Butyldimethylsilylchlorid versetzt. Es wurde 21 Stunden gerührt. Der Rückstand wurde in

60 mL Ethylacetat aufgenommen und dreimal mit 40 mL demineralisiertem Wasser

gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das

Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde

säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 19:1 v/v).

Ausbeute: Die Ausbeute betrug 1.48 g (4.14 mmol, 83%) eines

farblosen Feststoffs. Summenformel: C16H28N2O5Si

Molekulargewicht: 356.49 g/mol DC: Rf = 0.66 (CH2Cl2/MeOH

9:1 v/v). Schmelzpunkt: 179 °C.

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 11.30 (s, 1H, NH), 7.46 (d, 4JH,H = 1.2 Hz, 1H, H-6),


4.16 (m, 1H, H-3’), 3.84-3.69 (m, 3H, H-4‘, H-5’), 2.13-2.00 (m, 2H, H-2’), 1.77 (d, 4JH,H =

1.2 Hz, 3H, T-CH3), 0.88 (s, 9H, -SiC(CH3)3), 0.07 (s, 3H, -Si(CH3)2), 0.07 (s, 3H, -Si(CH3)2).


86.8 (C-4‘), 83.8 (C-1‘), 70.5 (C-3‘), 63.3 (C-5‘), 39.4 (C-2‘), 25.8 (-SiC(CH3)3), 18.0

(-SiC(CH3)3), 12.2 (T-CH3), -5.4 (-Si(CH3)2).


IR: �̃� [cm-1] = 3155, 3042, 2927, 2854, 1694, 1360, 1097, 941, 670, 424.

Synthese von 3‘-O-tert-Butyldimethylsilyl-5‘-O-(4,4‘-dimethoxytrityl)thymidin 56


1.0 Äquiv.) 5‘-O-(4,4‘-Dimethoxytrityl)thymidin 55 in 10 mL abs. Pyridin mit 392 mg

(2.60 mmol, 1.5 Äquiv.) tert-Butyldimethylsilylchlorid versetzt. Es wurde 20 Stunden gerührt.

Dann wurden weitere 211 mg (1.40 mmol, 0.7 Äquiv.) tert-Butyldimethylsilylchlorid

zugegeben und weitere 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Rückstand wurde in


174

50 mL Dichlormethan aufgenommen und mit 50 mL demineralisiertem Wasser gewaschen.

Die wässrige Phase wurde zweimal mit je 40 mL Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten


unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde am Chromatotron gereinigt

(CH2Cl2/MeOH 0-5% Vol., Equilibrierung mit Zusatz von 0.5% Et3N).

Ausbeute: Es wurden 982 mg (1.49 mmol, 75%) eines


C37H46N2O7Si Molekulargewicht: 658.87 g/mol DC: Rf

= 0.33 (CH2Cl2/MeOH 19:1 v/v). Schmelzpunkt:


NH), 7.53 (d, 4JH,H = 1.1 Hz, 1H, H-6), 7.42-7.36 (m, 2H, H-3‘‘), 7.35-7.20 (m, 7H, H-4‘‘, H-5‘‘,

H-7‘‘), 6.93-6.85 (m, 4H, H-8‘‘), 6.15 (dd, 3JH,H = 6.5 Hz, 3JH,H = 6.7 Hz, 1H, H-1’), 4.50-4.41

(m, 1H, H-3’), 3.85-3.79 (m, 1H, H-4‘), 3.73 (s, 6H, -OCH3), 3.25 (dd, 2JH,H = 10.7 Hz, 3JH,H =

2.9 Hz, 1H, H-5’a), 3.15 (dd, 2JH,H = 10.7 Hz, 3JH,H = 4.5 Hz, 1H, H-5’b), 2.36-2.27 (m, 1H,

H-2’a), 2.14 (ddd, 2JH,H = 13.4 Hz, 3JH,H = 6.8 Hz, 3JH,H = 4.4 Hz, 1H, H-2‘b), 1.52 (d, 4JH,H =

1.1 Hz, 3H, T-CH3), 0.79 (s, 9H, -SiC(CH3)3), 0.01 (s, 3H, -Si(CH3)2), -0.05 (s, 3H, -Si(CH3)2).

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 163.7 (C-4), 158.2, 158.1 (C-9’’), 150.3 (C-2),

144.5 (C-2’’), 135.8 (C-6), 135.3, 135.2 (C-6‘‘), 129.7 (C-7‘‘), 127.9 (C-4‘‘), 127.7 (C-3‘‘),

126.8 (C-5‘‘), 113.2 (C-8‘‘), 109.5 (C-5), 85.9 (C-1’’), 85.1 (C-4’), 83.7 (C-1’), 71.5 (C-3’),

63.0 (C-5’), 55.0 (-OCH3), 39.5 (C-2’), 25.7 (-SiC(CH3)3), 17.6 (-SiC(CH3)3), 11.8

(T-CH3), -5.1 (-Si(CH3)2).


IR: �̃� [cm-1] = 3057, 2928, 2855, 1685, 1462, 1135, 1031, 966, 776, 632.

Synthese von 5‘-O-tert-Butyldimethylsilyl-3’-O-(4-methoxytritylsulfenyl)thymidin 68

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 0.96 g (2.7 mmol, 1.0 Äquiv.) 5‘-O-(tert-

Butyldimethylsilyl)thymidin 67 dreimal mit abs. Tetrahydrofuran coevaporiert und in 45 mL

abs. Tetrahydrofuran gelöst. Anschließend wurden bei -10 °C 0.16 g (6.8 mmol, 2.5 Äquiv.)

Natriumhydrid zugegeben. Nach 5 Minuten wurden 1.1 g (2.7 mmol, 1.0 Äquiv)

4-Monomethoxytritylsulfenylchlorid 66 hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für

4 Stunden bei -10 °C gerührt. Anschließend wurden 1.5 mL Ammoniak (25%) hinzugegeben.

Zur Reaktionslösung wurden 60 mL Ethylacetat und 60 mL gesättigte, wässrige

Natriumhydrogencarbonat-Lösung gegeben. Die organische Phase wurde dreimal mit je

100 mL Wasser gewaschen. Die organische Phase wurden über Natriumsulfat getrocknet,


175

filtriert und unter vermindertem Druck das Lösungsmittel entfernt. Anschließend wurde das

Rohprodukt säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt

(PE/EE 2:1 v/v).

Ausbeute: Es wurden 0.75 g (1.1 mmol, 43%) eines farblosen

Feststoffes erhalten. Summenformel: C36H44N2O6SSi



1H-NMR (400 MHz, CDCl3): [ppm] = 8.77 (s, 1H, NH), 7.41-

7.19 (m, 13H, H-6, H-3’’, H-4’’, H-5’’, H-7’’), 6.86-6.79 (m, 2H,

H-8‘‘), 6.21 (dd, 3JH,H = 9.2 Hz, 3JH,H = 5.4 Hz, 1H, H-1‘), 3.88-3.85 (m, 1H, H-4‘), 3.78 (s, 3H,

-OCH3), 3.69-3.63 (m, 2H, H-3‘, H-5’a), 3.33 (dd, 2JH,H = 11.4 Hz, 3JH,H = 2.1 Hz, 1H, H-5’b),

2.16 (ddd, 2JH,H = 13.7 Hz, 3JH,H = 5.2 Hz, 3JH,H = 1.2 Hz, 1H, H-2’a), 1.86 (d, 4JH,H = 1.3 Hz,

3H, T-CH3), 1.58 (ddd, 2JH,H = 13.7 Hz, 3JH,H = 9.0 Hz, 3JH,H = 5.5 Hz, 1H, H-2’b), 0.85 (s,

9H, -SiC(CH3)3), 0.03 (s, 6H, -Si(CH3)2).

13C-NMR (101 MHz, CDCl3): [ppm] = 163.9 (C-4), 159.9 (C-9’’), 150.3 (C-2), 143.1, 143.0

(C-2’’), 135.5 (C-6), 134.2 (C-6’’), 131.2 (C-7’’), 130.1 (C-3’’), 128.2 (C-4’’), 127.5 (C-5’’),

113.5 (C-8’’), 110.8 (C-5), 88.1 (C-3’), 85.9 (C-4’), 84.9 (C-1’), 71.8 (C-1’’), 63.9 (C-5’), 55.4

(-OCH3), 39.3 (C-2’), 26.1 (-SiC(CH3)3), 18.3 (-SiC(CH3)3), 12.7 (T-CH3), -5.2 (-Si(CH3)2).


IR: �̃� [cm-1] = 3172, 3046, 2951, 2927, 2855, 1680, 1470, 1360, 1255, 1059, 941, 830, 555.

Synthese von 3‘-O-tert-Butyldimethylsilylthymidin 53

Variante A

Es wurden 947 mg (1.44 mmol, 1.0 Äquiv.) 3‘-O-tert-Butyldimethylsilyl-5‘-O-(4,4‘-

dimethoxytrityl)thymidin 56 in 25 mL Methanol gelöst. Hierzu wurden 3.79 g Amberlite IR-120

bei Raumtemperatur gegeben und 3 Stunden gerührt. Anschließend wurde das

Reaktionsgemisch filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das

Rohprodukt wurde säulenchromatographisch gereinigt (CH2Cl2/MeOH 19:1 v/v).

Variante B

Es wurden 3.59 g (5.59 mmol, 1.0 Äquiv.) 3’-O-tert-Butyldimethylsilyl-5’-O-(4,4’-

dimethoxyltrityl)thymidin 56 mit 50.0 mL (18.3 mmol, 3.3 Äquiv.) Dichloressigsäure (3% in

Dichlormethan) versetzt. Alle 15 Minuten wurden jeweils weitere 25.0 mL (9.13 mmol,

1.6 Äquiv.) Dichloressigsäure hinzugefügt. Dieser Vorgang wurde viermal wiederholt

(insgesamt 54.8 mmol, insgesamt 9.8 Äquiv.). Anschließend wurde die Reaktionslösung mit


176

150 mL einer gesättigten, wässrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung versetzt. Die

wässrige Phase wurde dreimal mit 150 mL Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten


wurde unter verminderten Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde säulenchromatographisch

an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 19:1 v/v).

Ausbeute: Variante A: Es wurden 335 mg (940 µmol, 65%) eines

farblosen Feststoffes erhalten. Variante B: Es wurde 1.60 g (4.49 mmol,

82%) eines farblosen Feststoffes erhalten. Summenformel:

C16H28N2O5Si Molekulargewicht: 356.49 g/mol DC: Rf = 0.34

(CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v). Schmelzpunkt: 106 °C.



4.37 (m, 1H, H-3’), 3.79-3.71 (m, 1H, H-4‘), 3.64-3.48 (m, 2H, H-5‘), 2.24-2.12 (m, 1H,

H-2’a), 2.02 (ddd, 2JH,H = 13.2, 3JH,H = 6.0 Hz, 3JH,H = 3.0 Hz, 1H, H-2’b), 1.77 (d, 4JH,H =

1.2 Hz, 3H, T-CH3), 0.87 (s, 9H, -SiC(CH3)3), 0.08 (s, 6H, -Si(CH3)2).


87.3 (C-4’), 83.7 (C-1’), 72.1 (C-3’), 61.0 (C-5’), 39.5 (C-2’), 25.7 (-SiC(CH3)3), 17.7

(-SiC(CH3)3), 12.2 (T-CH3), -4.8, -4.9 (-Si(CH3)2).


IR: �̃� [cm-1] = 3156, 3005, 2928, 2856, 1692, 1361, 1089, 959, 670, 457.

Synthese von 3’-O-(4-Methoxytritylsulfenyl)thymidin 61

Es wurden 0.35 g (0.53 mmol, 1.0 Äquiv.) 3’-O-(4-Methoxytritylsulfenyl)-5‘-O-(tert-

butyldimethylsilyl)thymidin 68 in 20 mL Tetrahydrofuran gelöst. Dazu wurden 0.80 mL

(0.79 mmol, 1.5 Äquiv.) Tetrabutylammoniumfluorid (1 M in THF) tropfenweise zugegeben.

Das Reaktionsgemisch wurde für zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das

Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und

das Rohprodukt säulenchromatographisch an Kieselgel

gereinigt (CH2Cl2/MeOH 50:1 v/v).


Feststoffs erhalten. Summenformel: C30H30N2O6S


50:1 v/v).


177


7.40-7.25 (m, 10H, H-3’’, H-4’’, H-5’’), 7.18-7.13 (m, 2H, H-7’’), 6.96-6.91 (m, 2H, H-8‘‘),

6.02 (dd, 3JH,H = 8.5 Hz, 3JH,H = 5.7 Hz, 1H, H-1’), 5.00 (dd, 3JH,H = 4.7 Hz, 3JH,H = 4.7 Hz, 1H,

5‘-OH), 3.75 (s, 3H, -OCH3), 3.74-3.71 (m, 1H, H-4’), 3.71-3.68 (m, 1H, H-3‘), 3.42-3.35 (m,

1H, H-5’a), 3.26-3.19 (m, 1H, H-5’b), 1.99 (ddd, 2JH,H = 14.0 Hz, 3JH,H = 5.7 Hz, 3JH,H =

2.1 Hz, 1H, H-2’a), 1.80-1.71 (m, 1H, H-2‘b), 1.74 (d, 4JH,H = 1.2 Hz, 3H, T-CH3).

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 163.6 (C-4), 158.5 (C-9’’), 150.4 (C-2), 142.5,

142.5 (C-2’’), 135.7 (C-6), 133.3 (C-6’’), 130.7 (C-7’’), 129.4 (C-3’’), 128.2 (C-4’’), 127.4

(C-5’’), 113.6 (C-8’’), 109.5 (C-5), 87.2 (C-3‘), 85.2 (C-4‘), 83.4 (C-1‘), 71.2 (C-1’’), 61.3

(C-5’), 55.1 (-OCH3), 37.3 (C-2‘), 12.2 (T-CH3).


IR: �̃� [cm-1] = 3057, 2929, 2835, 1662, 1459, 1357, 1236, 1031, 915, 843, 553.

9.2.4 Synthese eines Dinucleotidphosphorthioamidits

Synthese von 5'-O-(4,4‘-Dimethoxytrityl)-P-(2-cyanoethyl)-2'-desoxy-N-(4-

isopropylphenoxyacetyl)guanylyl-(3'→5')-3'-O-(tert-butyldimethylsilyl)thymidin 59

Unter Stickstoff als Inertgas wurden 132 mg (140 μmol, 2.0 Äquiv.) 5’-O-(4,4’-

Dimethoxytrityl)-N-isopropylphenoxyacetyl-2’-desoxyguanosin-3’-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diiso-

propyl)]-phosphoramidit 57 zweimal mit abs. Acetonitril coevaporiert und in 12 mL abs.

Acetonitril gelöst. Nach Zugabe von 0.50 mL (0.15 mmol, 2.1 Äquiv.) 5-Benzylthio-1H-

tetrazol (0.3 M in Acetonitril) und 25 mg (70 μmol, 1.0 Äquiv.) 3’-O-tert-

Butyldimethylsilylthymidin 53 wurde das Reaktionsgemisch für 75 Minuten bei

Raumtemperatur gerührt und anschließend das Lösungsmittel unter vermindertem Druck

entfernt. Der Rückstand wurde in 17 mL abs. Acetonitril gelöst. Unter Rühren wurden 3.5 mL

(70 μmol, 1.0 Äquiv.) Iod-Lösung (0.02 M in H2O/Pyridin/THF 10:0.4:89.6 v/v/v) zugegeben.

Die Reaktionslösung wurde für 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend

wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das erhaltene Rohprodukt

wurde am Chromatotron gereinigt (DCM/MeOH 19:1 v/v, Equilibrierung mit 0.5% Et3N).

Ausbeute: Die Ausbeute

wurde nicht bestimmt, da zu

verschiedenen Zeiten der

Synthese Aliquote für NMR-

spektroskopische

Untersuchungen

abgenommen wurden.

Summenformel:


178

C61H73N8O15PSi Molekulargewicht: 1217.35 g/mol DC: Rf = 0.32 und 0.34 (CH2Cl2/MeOH

19:1 v/v).

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): [ppm] = 11.93 (s, 1H, 1x N-HG), 11.89 (s, 1H, 1x N-HG), 10.20

(s, 1H, 1x N-HT), 9.92 (s, 1H, 1x N-HT), 9.10 (s, 1H, 1x N-HGPac), 8.64 (s, 1H, 1x N-HGPac),

7.73 (s, 1H, 2x H-8G), 7.38-7.14 (m, 28H, 2x H-DMTr, 2x H-Ar-Pac), 6.90-6.89 (m, 8H, 2x

H-8‘‘), 6.23 (m, 1H, 1x H-1’), 6.19 (m, 2H, 2x H-1’), 6.05 (dd, 3JH,H = 6.64 Hz, 3JH,H = 6.64 Hz,

1H, 1x H-1’), 5.26 (m, 1x H-3’), 4.65 (s, 2H, 2x H-b‘), 4.64-4.62 (m, 2H, 2x H-3’) 4.49-4.45

(m, 1H, 1x H-3’), 4.14-4.12 (m, 1H, 2x H-4’), 4.02-4.01 (m, 1H, 1x H-4’), 3.96-3.94 (m, 1H, 1x

H-4’) 3.76 (s, 12H, 2x -OCH3), 3.42-3.39 (m, 4H, 2x H-5’), 3.31-3.27 (m, 4H, 2x H-5’), 3.15 (t,

3JH,H = 6.9 Hz, 4H, 2x H-a), 2.88 (sept, 3JH,H = 7.18 Hz, 2H, 2x H-CH-iPr), 2.78-2.58 (m, 3H,

2x H-2’), 2.53-2.49 (m, 1H, 1x H-2’), 2.41-2.37 (m, 1H, 1x H-2’), 2.29-2.24 (m, 3H, 2x H-2’),

1.96 (d, 4JH,H = 0.8 Hz, 3H, 1x T-CH3), 1.90 (d, 4JH,H = 0.8 Hz, 3H, 1x T-CH3), 1.42 (t, 3JH,H =

7.20 Hz, 4H, 2x H-b), 1.22 (t, 3JH,H = 6.4 Hz, 12H, 2x iPr-CH3), 0.88 (s, 18H, 2x -SiC(CH3)3),

0.08 (s, 12H, 2x -Si(CH3)2).

13C-NMR (101 MHz, CDCl3): [ppm] = 164.1 (2x C-4T), 158.8, 158.7 (2x C-9‘‘), 155.6 (2x

C-6G), 154.7 (2x C-a‘), 150.4 (2x C-2T), 148.1 (2x C-4G), 146.8 (2x C-2G), 144.6 (2x C-2‘‘),

144.3 (2x C-Ar-Pac), 143.3 (2x C-Ar-Pac), 136.8 (2x C-8G), 135.8, 135.7 (2x C-6‘‘), 135.5,

135.6 (2x C-6T), 130.1, 128.2, 128.1, 128.0, 127.9, 127.8, 127.2 (2x C-3‘‘, 2x C-4‘‘, 2x C-5‘‘,

2x C-7‘‘), 121.3 (2x C-5G), 114.9 (2x C-8‘‘), 111.0 (2x C-5T), 86.5 (2x C-1‘‘), 86.2, 85.0, 84.8

(4x C-4’), 83.7 (4x C-1’), 72.6, 71.4, 70.8 (4x C-3’), 67.4 (2x C-3‘), 64.0 (4x C-5’), 55.4

(2x -OCH3), 46.3 (2x C-b), 45.6 (2x CN), 40.4, 40.2, 39.2 (4x C-2’), 33.4 (2x iPr-CH), 25.8

(2x -SiC(CH3)3), 24.2 (2x iPr-CH3), 20.8, 20.0 (2x -SiC(CH3)3), 12.5, 12.4 (2x T-CH3), 8.9 (2x

C-a), -4.7, -4.5 (2x -Si(CH3)2).

Anmerkung: Aufgrund der Überlagerung der Signale konnten die einzelnen Wasserstoff-

Signale der Zucker nicht eindeutig den Nucleobasen zugeordnet werden.

31P-NMR (162 MHz, CDCl3): [ppm] = -1.9, -2.8.


IR: �̃� [cm-1] = 3174, 2955, 2929, 1687, 1605, 1508, 1246, 1029, 827, 582.


179

Versuch der Synthese von N2-Dimethylformamidin-5'-O-(4,4‘-dimethoxytrityl)-P-(2-

cyanoethyl)-2'-desoxy-3’-thioguanylyl-(3'→5')-thymidin 51

Unter Stickstoff als Inertgas wurden 23 mg (27 μmol,

1.5 Äquiv.) N2-Dimethylformamidin-5’-O-(4,4’-dimeth-

oxytrityl)-2‘-desoxy-3’-thioguanosin-3’-S-[(2-cyano-

ethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidit 28 zweimal mit

abs. Acetonitril coevaporiert und in 2 mL abs. Acetonitril

gelöst. Nach Zugabe von 0.10 mL (27 μmol, 1.5 Äquiv.)

5-Benzylthio-1H-tetrazol (0.3 M in Acetonitril) und

10 mg (18 μmol, 1.0 Äquiv.) 3‘-O-(4-Methoxytrityl-

sulfenyl)thymidin 61 wurde das Reaktionsgemisch für

2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 1.2 mL (24 μmol, 2.6 Äquiv.)

Iod-Lösung (0.02 M in H2O/Pyridin/THF 10:0.4:89.6 v/v/v) zugegeben. Die Reaktionslösung

färbte sich gelb und wurde für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wurden 5 mL

einer 5%igen Natriumdisulfitlösung, 10 mL gesättigte Natriumhydrogencarbonat-Lösung und

10 mL Dichlormethan zugegeben und die Phasen getrennt. Die organische Phase wurde

über Natriumsulfat getrocknet filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck

entfernt.

Es konnte das gewünschte Produkt nur stark verunreinigt erhalten werden.

31P-NMR (162 MHz, CD3CN): [ppm] = 25.7, 25.4.

Versuch der Synthese von N2-Dimethylformamidin-5'-O-(4,4‘-dimethoxytrityl)-P-(2-

cyanoethyl)-2'-desoxy-3’-thioguanylyl-(3'→5')-thymidin-3’-O-[(2-cyanoethyl)-(N,N-

diisopropyl)]-phosphoramidit 29

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 8 mg des stark

verunreinigten N2-Dimethylformamidin-5'-O-(4,4‘-

dimethoxytrityl)-P-(2-cyanoethyl)-2'-desoxy-3’-

thioguanylyl-(3'→5')-thymidin 51 zweimal mit abs.

Acetonitril coevaporiert und in 1 mL abs. Acetonitril

gelöst. Nach Zugabe von 26 µL 5-Benzylthio-1H-

tetrazol (0.3 M in Acetonitril) und 29 µL 2-Cyanoethyl-

N,N,N’,N’-tetraisopropylphosphordiamidit wurde das

Reaktionsgemisch für 2 Stunden bei Raumtemperatur

gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem

Druck entfernt. Das mögliche Produkt war stark


180

verunreinigt. Es erfolgte jedoch aufgrund der Labilität des Produktes keine Reinigung und

wurde umgehend zur Oligonucleotidsynthese eingesetzt.

9.2.5 Synthesizer

Die automatisierte Festphasensynthese der Oligonucleotide erfolgte im 1 μmol Maßstab am

DNA-Synthesizer. Es wurden 1000 Å-LCAA-CPG-basierte Synthesesäulen von Biosearch

Technologies verwendet (s. unten). Von den käuflich erworbenen, unmodifizierten

Phosphoramiditen wurden jeweils 0.1 molare Lösungen frisch angesetzt und nach einem

Standardverfahren gekuppelt (s. Anhang). Bei der Kupplung der synthetisierten

Phosphorthioamidite wurden modifizierte Syntheseprotokolle verwendet, welche ebenfalls im

Anhang zu finden sind.

Es wurden folgende Lösungsmittel, Reagenzien und Phosphoramidite bei der

Oligonucleotidsynthese verwendet.

Acetonitril Proligo L010250-04

Dichloressigsäure (3% in CH2Cl2) Glen Research 40-4040-57

Trichloressigsäure (3% in CH2Cl2) Proligo L020250

5-Benzylthio-1H-tetrazol (0.3 M in MeCN) Link Technologies 3160

5-Ethylthio-1H-tetrazol Link Technologies 0237

Iod (0.02 M in H2O/Pyridin/THF 10:0.4:89.6 v/v/v) Link Technologies 4132

Cap Mix A (UltraMILD)

(THF/Pyridin/Pac-Anhydrid 85:10:5 v/v/v) Link Technologies 4210

Cap B (Tetrahydrofuran/N-Methylimidazol/Pyridin

8:1:1 v/v/v) Proligo L850020-06

5‘-DMT-T-Suc-CPG Biosearch Technologies CG1-1300-1

5‘-O-(4,4‘-Dimethoxytrityl)-thymidin-3‘-O-[(2-

cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidit Proligo T111000

N6-Phenoxyacetyl-5‘-O-(4,4‘-dimethoxytrityl)-2‘-

desoxyadenosin-3‘-O-[(2-cyanoethyl)-(N,N-

diisopropyl)]-phosphoramidit

Glen Research 10-1601-05

N2-(4-Isopropylphenoxyacetyl)-5‘-O-(4,4‘-

dimethoxytrityl)-2‘-desoxyguanosin-3‘-O-[(2-

cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidit

Glen Research 10-1621-05


181

Die Abspaltung der letzten DMTr-Gruppe erfolgte automatisch durch Auswahl der „DMT-Off“-

Funktion. Danach wurde die Säule gründlich mit Acetonitril gespült und im Argonstrom

getrocknet. Die Spaltung des Oligonucleotids von der Festphase und Abspaltung der

weiteren Schutzgruppen erfolgte in 1.5 mL Ammoniak (25%) über 18 Stunden bei 23 °C auf

dem Thermomixer. Der Überstand wurde filtriert (CHROMAFIL® RC-20/15 MS der Firma

Macherey-Nagel), dreimal mit je 1 mL Reinstwasser nachgespült und die flüchtigen

Bestandteile im Ölpumpenvakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 100 µL Reinstwasser

aufgenommen, erneut filtriert, mittels IEX- oder RP-HPLC gereinigt (Methode A, B oder C)

und anschließend durch Größenausschlusschromatographie (NAP-5 bzw. NAP-10 Columns

der Firma GE Healthcare) die Salze bzw. Essigsäurerückstände abgetrennt.

Bestimmung der Ausbeute der Oligonucleotidsynthese

Zur Berechnung der Ausbeute wurden die Oligonucleotide nach der Reinigung in einem

bestimmten Volumen Reinstwasser gelöst. Hiervon wurde 1 µL abgenommen und am

NanoDrop im Oligo-DNA-Modus gemessen, woraus mit Hilfe der NanoDrop 2000/2000c-

Software die Konzentration [ng/µL] berechnet wurde. Diese Konzentration wurde durch die

Molmasse des Oligonucleotids dividiert und mit dem Verdünnungsfaktor ((Volumen

Oligonucleotidlösung [μL])/(Aliquot [μL])) multipliziert, um die Molmenge [nmol] für die

gesamte Synthese zu berechnen. Die Gesamtausbeute über alle Syntheseschritte in Prozent

wurde mit folgender Formel ermittelt:

Molmenge [nmol]

Synthesemaßstab [nmol] ∙ 100 = Gesamtausbeute [%]

9.2.6 Synthese des 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotids 27

Sequenz: 5‘-d(ATA AAG TAT AGT GTG* TTA T)-3‘

Molmasse: 5896.9238 g/mol

Retentionszeit (HPLC): Methode A: 24.7 min, Methode B: 20.3 min, Methode C: 20.5 min.

MS (MALDI-): m/z = [M-H]- ber.: 5893.0, gef.: 5889.3.

Bei allen Synthesen wurden die in Abschnitt 9.2.5 angegebenen Bedingungen und das

Standardprotokoll (s. Anhang) für die Kupplung unmodifizierter Phosphoramidite verwendet.

Nur bei der Kupplung der modifizierten Phosphoramidite wurden unterschiedliche Varianten

mit unterschiedlichen Synthesizer Methoden (s. Anhang) durchgeführt, welche im Folgenden

beschrieben sind.


182

Variante A: Für die Synthese wurde die Synthesizer Methode 1 verwendet. Es wurde eine

0.12 molare Lösung von N2-Dimethylformamidin-5’-O-(4-methoxytrityl)-2‘-desoxy-3’-

thioguanosin-3’-S-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidit 48 in abs. Acetonitril

eingesetzt (für die Berechnung wurde ein reines Edukt angenommen). Die Zugabe des

Phosphorthioamidits erfolgte in zwei Schritten mit einer Inkubationszeit von jeweils

6 Minuten. Die Detritylierung wurde am Synthesizer manuell mit Trichloressigsäure (3% in

CH2Cl2) in fünf Zugabeschritten mit jeweils 10 Sekunden Inkubationszeit durchgeführt.

Abweichend von den angegebenen Reinigungbedingungen, wurde das Oligonucleotid nach

Behandlung mit Ammoniak in 1 mL Reinstwasser aufgenommen.

Variante B: Für die Synthese wurde die Synthesizer Methode 2 verwendet. Es wurde eine

0.14 molare Lösung von N2-Dimethylformamidin-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2‘-desoxy-3’-


eingesetzt. Die Zugabe des Phosphorthioamidits erfolgte in drei Schritten mit einer

Inkubationszeit von jeweils 6 Minuten.

Variante C: Für die Synthese wurde die Synthesizer Methode 2 verwendet. Es wurde eine




Inkubationszeit von jeweils 6 Minuten.

Variante D: Für die Synthese wurde die Synthesizer Methode 2 verwendet. Es wurde eine




Inkubationszeit von jeweils 6 Minuten. Als Aktivator wurde 5-Ethylthio-1H-tetrazol (1 M in

Acetonitril) verwendet.

Variante E: Für die Synthese wurde die Synthesizer Methode 3 verwendet. Es wurde eine



eingesetzt, welches zuvor in n-Hexan gefällt wurde. Die Zugabe des Phosphorthioamidits

erfolgte in vier Schritten mit einer Inkubationszeit von jeweils 10 Minuten.

Variante F: Für die Synthese wurde die Synthesizer Methode 4 verwendet. Es wurde eine



183


verwendet, welches zuvor in n-Hexan gefällt wurde. Die Zugabe des Phosphorthioamidits

erfolgte in acht Schritten mit einer Inkubationszeit von jeweils 10 Minuten.

Variante G: Der Kupplungszyklus des N2-Dimethylformamidin-5'-O-(4,4‘-dimethoxytrityl)-P-(2-

cyanoethyl)-2'-desoxy-3’-thioguanylyl-(3'→5')-thymidin-3’-O-[(2-cyanoethyl)-(N,N-

diisopropyl)]-phosphoramidit 29 erfolgte manuell. Hierbei wurde zunächst mit 10 mL

Dichloressigsäure (3% in CH2Cl2) detrityliert. Für die Kupplung wurden 8 mg Phosphoramidit

in 0.5 mL abs. Acetonitril gelöst. Als Aktivator wurde 1 mL 5-Benzylthio-1H-tetrazol (0.3 M in

MeCN) verwendet. Die Inkubationszeit betrug 10 Minuten. Die Oxidation erfolgte am

Synthesizer, wobei zweimal 1.0 Sekunden Iod (0.02 M in H2O/Pyridin/THF 10:0.4:89.6 v/v/v)

auf die Säule gegeben wurde mit jeweils 30 Sekunden Inkubationszeit. Anschließend wurde

zweimal abwechselnd mit abs. Acetonitril und Argongas gespült. Das Capping erfolgte

wieder manuell. Es wurden 5 mL Cap A und 5 mL Cap B gemischt und über 1.5 Minuten

über die Säule gegeben. Abschließend wurde im Wechsel mit abs. Acetonitril und Argongas

gespült.

9.2.7 Synthese von bicyclischen Nucleosidanaloga (BCNA)

Synthese von 3‘,5‘-Di-O-methansulfonyl-2‘-desoxyuridin 123

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 5.01 g (22.0 mmol, 1.0 Äquiv.) 2'-Desoxyuridin 124 in

50 mL abs. Pyridin gelöst und auf 0 °C gekühlt. Über einen Zeitraum von 25 Minuten wurden

4.3 mL (56 mmol, 2.5 Äquiv.) Methansulfonylchlorid langsam hinzugetropft. Im Anschluss

wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmt und für weitere 3 Stunden

gerührt. Anschließend wurde die Reaktionslösung in 100 mL Eiswasser gegeben und bei

4 °C eine weitere Stunde gerührt und dann filtriert. Der Feststoff wurde im Ölpumpenvakuum

getrocknet wurde. Das Filtrat wurde dreimal mit jeweils 150 mL Ethylacetat extrahiert. Die

vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das

Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde dreimal mit einem

Gemisch aus Toluol und Dichlormethan coevaporiert.

Ausbeute: Es wurden 7.28 g (18.9 mmol, 86%) eines leicht gelben

Feststoffes erhalten. Summenformel: C11H16N2O9S2

Molekulargewicht: 384.37 g/mol DC: Rf = 0.60 (CH2Cl2/MeOH 9:1

v/v). Schmelzpunkt: 126 °C.


184


6.20 (dd, 3JH,H = 7.0 Hz, 3JH,H = 7.0 Hz, 1H, H-1'), 5.69 (dd, 3JH,H = 8.1 Hz, 4JH,H = 2.2 Hz, 1H,

H-5), 5.33-5.25 (m, 1H, H-3'), 4.51-4.34 (m, 3H, H-4', H-5'), 3.33 (s, 3H, Ms-CH3), 3.25 (s,

3H, Ms-CH3), 2.56 (dd, 3JH,H = 7.1 Hz, 3JH,H = 5.0 Hz, 2H, H-2').


84.6 (C-1'), 80.6 (C-4'), 79.2 (C-3'), 68.2 (C-5'), 37.7, 36.8 (2 x Ms-CH3), 36.0 (C-2').


IR: �̃� [cm-1] = 3174, 3035, 1683, 1348, 1329, 1169, 938, 920, 816, 806.

Synthese von 3‘,5‘-Anhydro-2‘-desoxyuridin 122

Es wurden 2.27 g (56.8 mmol, 3.0 Äquiv.) Natriumhydroxid in 70 mL demineralisiertem

Wasser gelöst. Portionsweise wurden unter Rühren 7.28 g (18.9 mmol, 1.0 Äquiv.) 3‘,5‘-Di-

O-mesyl-2’-desoxyuridin 123 hinzugegeben. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch

3 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die Reaktionslösung mit

Salzsäure (1 M) neutralisiert. Die Reaktionslösung wurde auf die Hälfte des Volumens

eingeengt und 14-mal mit je 80 mL Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen

Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter

vermindertem Druck entfernt.

Ausbeute: Es wurden 3.48 g (16.6 mmol, 87%) eines gelblichen

Feststoffes erhalten. Summenformel: C9H10N2O4 Molekulargewicht:

210.19 g/mol DC: Rf = 0.64 (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v). Schmelzpunkt:

191 °C.


6.52 (dd, 3JH,H = 5.3 Hz, 3JH,H = 5.3 Hz, 1H, H-1'), 5.71 (d, 3JH,H = 8.2 Hz, 1H, H-5), 5.51-5.47

(m, 1H, H-3'), 4.96-4.88 (m, 1H, H-4'), 4.69 (dd, 2JH,H = 8.2 Hz, 3JH,H = 4.1 Hz, 1H, H-5'a),

4.02 (dd, 2JH,H = 8.2 Hz, 3JH,H = 2.0 Hz, 1H, H-5'b), 2.50-2.43 (m, 2H, H-2').


88.5 (C-1'), 86.9 (C-3'), 80.1 (C-4'), 75.1 (C-5'), 37.2 (C-2').


IR: �̃� [cm-1] = 3160, 3042, 1713, 1683, 1462, 1269, 1088, 966, 860, 803, 754.

Synthese von 2‘,3‘-Didehydro-2‘,3‘-didesoxyuridin 121

Es wurden 3.48 g (16.6 mmol, 1.0 Äquiv.) 3’,5’-Anhydro-2’-desoxyuridin 122 in 140 mL tert-

Butanol gelöst. Anschließend wurde die Reaktionslösung auf 60 °C erwärmt und über einen

Zeitraum von 30 Minuten portionsweise 4.70 g (83.8 mmol, 5.0 Äquiv.) Kaliumhydroxid


185

hinzugegeben. Anschließend wurde für 4 Stunden gerührt. Nach Abkühlen der

Reaktionslösung auf Raumtemperatur wurden 140 mL Methanol hinzugegeben bis der

Niederschlag vollständig gelöst war. Nun wurde mit Salzsäure (37%) neutralisiert und nach

Filtration das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Die Reinigung erfolgte

säulenchromatographisch an Kieselgel (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v).

Ausbeute: Es wurden 2.15 g (10.2 mmol, 62%) eines gelblichen



146 °C.


6.85-6.78 (m, 1H, H-1‘), 6.44-6.37 (m, 1H, H-3‘), 5.96-5.89 (m, 1H, H-2‘), 5.59 (d, 3JH,H =

8.0 Hz, 1H, H-5), 4.97 (dd, 3JH,H = 5.3 Hz, 3JH,H = 5.3 Hz, 1H, 5‘-OH), 4.82-4.74 (m, 1H, H-4‘),

3.63-3.55 (m, 2H, H-5‘).

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 141.1 (C-6), 135.0 (C-3‘), 125.7 (C-2‘), 101.5

(C-5), 89.1 (C-1‘), 87.4 (C-4‘), 62.2 (C-5‘).


IR: �̃� [cm-1] = 3442, 3169, 3100, 3043, 1696, 1672, 1623, 1454, 1393, 1250, 1106, 812, 561,

544, 426.

Synthese von 2‘,3‘-Didesoxyuridin 120

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 2.00 g (9.52 mmol, 1.0 Äquiv.) 2’,3’-Didesoxy-2’,3’-

didehydrouridin 121 in 80 mL abs. Methanol gelöst und 100 mg Pd/C (10%) zugegeben. Das

Reaktionsgemisch wurde 26 Stunden unter Wasserstoffatmosphäre bei Raumtemperatur

gerührt. Anschließend wurde filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck

entfernt. Das Rohprodukt wurde säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt





106 °C.


5.94 (dd, 3JH,H = 6.6 Hz, 3JH,H = 3.5 Hz, 1H, H-1‘), 5.58 (d, 3JH,H = 8.0 Hz, 1H, H-5), 5.02 (s,

1H, 5‘-OH), 4.07-3.96 (m, 1H, H-4‘), 3.67 (dd, 2JH,H = 11.9 Hz, 3JH,H = 3.3 Hz, 1H, H-5‘a), 3.52


186

(dd, 2JH,H = 11.9 Hz, 3JH,H = 3.9 Hz, 1H, H-5‘b), 2.34-2.20 (m, 1H, H-2‘a), 2.01-1.76 (m, 3H,

H-2‘b, H-3‘).


85.1 (C-1‘), 81.5 (C-4‘), 62.0 (C-5‘), 31.8 (C-2‘), 24.8 (C-3‘).


IR: �̃� [cm-1] = 3368, 3166, 3095, 3050, 2909, 1659, 1468, 1409, 1372, 1295, 1270, 1178,

1100, 1065, 1043, 718.

Synthese von 5-Iod-2‘,3‘-Didesoxyuridin 117

Variante A

Es wurden 1.79 g (8.45 mmol, 1.0 Äquiv.) 2’,3’-Didesoxyuridin 120 in 64 mL Methanol gelöst

und 0.97 mL (3.01 g, 18.5 mmol, 2.2 Äquiv.) Iodmonochlorid zugegeben. Das

Reaktionsgemisch wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit

Ammoniak (10%) neutralisiert. Nach Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem

Druck wurde der Rückstand in Wasser aufgenommen und dreizehnmal mit Dichlormethan

gewaschen, bis sich die organische Phase nicht mehr violett verfärbte. Die vereinigten

organischen Phasen wurden mit Wasser extrahiert. Das Lösungsmittel wurde unter

vermindertem Druck entfernt und das Rohprodukt dreimal säulenchromatographisch

gereinigt (CH2Cl2/MeOH 19:1 v/v).

Variante B

Es wurden 4.80 g (22.6 mmol, 1.0 Äquiv.) 2',3’-Didesoxyuridin 120 in 90 mL Essigsäure

gelöst und 6.18 g (11.3 mmol, 0.5 Äquiv.) Cer(IV)-ammoniumnitrat und 3.44 g (13.6 mmol,

0.6 Äquiv.) Iod zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei 80 °C gerührt.

Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und der

Rückstand zweimal mit je 30 mL eines Toluol-Ethanol-Gemisches (2:1 v/v) und zweimal mit

je 30 mL eines Ethanol-Wasser-Gemisches (2:1 v/v) coevaporiert. Das Rohprodukt wurde

zweimal säulenchromatographisch gereinigt (CH2Cl2/MeOH 19:1 v/v).

Ausbeute: Variante A: Es wurden 1.43 g (4.21 mmol, 50%) eines leicht

gelben Feststoffes erhalten. Variante B: Es wurden 3.78 g (11.2 mmol,

49%) eines farblosen Feststoffes erhalten. Summenformel:

C9H11IN2O4 Molekulargewicht: 338.10 g/mol DC: Rf = 0.16

(CH2Cl2/MeOH 19:1 v/v). Schmelzpunkt: 155 °C (Zersetzung).

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 11.61 (s, 1H, NH), 8.57 (s, 1H, H-6), 5.88 (dd, 3JH,H

= 6.6 Hz, 3JH,H = 2.8 Hz, 1H, H-1’), 5.21 (dd, 3JH,H = 4.9 Hz, 3JH,H = 4.9 Hz, 1H, 5’-OH), 4.08-


187

4.02 (m, 1H, H-4’), 3.77-3.72 (m, 1H, H-5’a), 3.55-3.50 (m, 1H, H-5’b), 2.31-2.20 (m, 1H,

H-2’a), 2.05-1.98 (m, 1H, H-2’b), 1.88-1.80 (m, 2H, H-3’).

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 160.6 (C-4), 150.0 (C-2), 145.2 (C-6), 85.8 (C-1’),

82.1 (C-4’), 68.1 (C-5), 61.2 (C-5’), 32.5 (C-2’), 23.9 (C-3’).


IR: �̃� [cm-1] = 3427, 3156, 3046, 2874, 2820, 1678, 1602, 1435, 1388, 1338, 1304, 1274,

1173, 1094, 1063, 670.

Synthese von 5-((Trimethylsilyl)ethinyl)-2’,3’-didesoxyuridin 119

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 1.38 g (4.09 mmol, 1.0 Äquiv.) 2’,3’-Didesoxy-5-

ioduridin 117 in 35 mL abs. N,N-Dimethylformamid gelöst und 1.8 mL (1.2 g, 12 mmol,

3.0 Äquiv.) Trimethylsilylacetylen sowie 538 mg (466 µmol, 0.1 Äquiv.)

Tetrakis(triphenylphosphin)-palladium(0) zugegeben und gerührt bis eine klare Lösung

entstanden war. Anschließend wurden 230 mg (1.21 mmol, 0.3 Äquiv.) Kupfer(I)-iodid und

1.35 mL (1.00 g, 7.75 mmol, 1.9 Äquiv.) N,N-Diisopropylethylamin hinzugegeben. Das

Reaktionsgemisch wurde 43 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das

Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und das Rohprodukt

säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 19:1 v/v).

Ausbeute: Es wurden 1.03 g (3.34 mmol) eines leicht verunreinigten

gelben Öls erhalten. Summenformel: C14H20N2O4Si

Molekulargewicht: 308.41 g/mol DC: Rf = 0.13 (CH2Cl2/MeOH 19:1

v/v).



4.02 (m, 1H, H-4’), 3.78-3.72 (m, 1H, H-5’a), 3.57-3.51 (m, 1H, H-5’b), 2.30-2.23 (m, 1H,

H-2’a), 2.07-1.99 (m, 1H, H-2’b), 1.89-1.81 (m, 2H, H-3’), 0.18 (s, 9H, H-Si(CH3)3).


97.4 (C-a), 96.5 (C-b), 86.0 (C-1’), 82.2 (C-4’), 61.2 (C-5’), 32.4 (C-2’), 23.9 (C-3’), 0.0

(C-Si(CH3)3).


IR: �̃� [cm-1] = 3434, 3188, 3057, 2957, 2160, 1667, 1454, 1315, 1247, 1096, 1067, 838, 758,

700, 574, 534, 421.


188

Synthese von 5-Ethinyl-2’,3’-didesoxyuridin 118

Es wurden 1.03 g (3.34 mmol, 1.0 Äquiv.) 5-((Trimethylsilyl)ethinyl)-2’,3’-didesoxyuridin 119

in 72 mL Tetrahydrofuran gelöst und 9.3 mL (2.4 g, 9.3 mmol, 2.8 Äquiv.)

Tetrabutylammoniumfluorid (1 M in THF) zugetropft. Die Reaktionslösung wurde 75 Minuten

bei Raumtemperatur gerührt und anschließend das Lösungsmittel unter vermindertem Druck

entfernt. Die Reinigung erfolgte säulenchromatographisch an Kieselgel (CH2Cl2/MeOH 5-

10% Vol.).

Ausbeute: Es wurden 457 mg (1.93 mmol, 46% über zwei Stufen)

eines leicht beigen Feststoffes erhalten. Summenformel: C11H12N2O4

Molekulargewicht: 236.23 g/mol DC: Rf = 0.48 (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v).

Schmelzpunkt: 197 °C (Zersetzung).



4.01 (m, 1H, H-4’), 4.04 (s, 1H, H-b), 3.78-3.71 (m, 1H, H-5’a), 3.56-3.51 (m, 1H, H-5’b),

2.31-2.22 (m, 1H, H-2’a), 2.07-1.99 (m, 1H, H-2’b), 1.92-1.79 (m, 2H, H-3’).


86.0 (C-1’), 83.2 (C-b), 82.2 (C-4’), 76.7 (C-a), 61.3 (C-5’), 32.4 (C-2’), 23.9 (C-3’).


IR: �̃� [cm-1] = 3428, 3263, 3176, 3066, 2921, 2876, 2837, 1681, 1450, 1279, 1089, 1056,

842, 539, 465.

Synthese von 3-(2’,3’-Didesoxy-β-D-ribofuranosyl)-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on

(6-H-ddBCNA) 115

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 431 mg (1.82 mmol, 1.0 Äquiv.) 5-Ethinyl-2’,3’-

didesoxyuridin 118 in 17 mL abs. N,N-Dimethylformamid gelöst und 6.1 mL (3.8 g, 38 mmol,

21 Äquiv.) abs. Triethylamin, sowie 460 mg (2.41 mmol, 1.3 Äquiv.) Kupfer(I)-iodid

hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf 80 °C erwärmt und 6.5 Stunden gerührt.

Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und das

Rohprodukt säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v).

Ausbeute: Es wurden 97 mg (4.1 µmol, 22%) eines leicht gelben



225 °C (Zersetzung).


189

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 9.03 (s, 1H, H-4), 7.73 (d, 3JH,H = 2.7 Hz, 1H, H-6),

6.81 (d, 3JH,H = 2.7 Hz, 1H, H-5), 6.00 (dd, 3JH,H = 6.8 Hz, 3JH,H = 2.2 Hz, 1H, H-1’), 5.21 (dd,

3JH,H = 5.3 Hz, 3JH,H = 5.3 Hz, 1H, 5’-OH), 4.20-4.13 (m, 1H, H-4’), 3.87-3.79 (m, 1H, H-5’a),

3.67-3.61 (m, 1H, H-5’b), 2.46-2.40 (m, 1H, H-2’a), 2.07-1.99 (m, 1H, H-2’b), 1.87-1.74 (m,

2H, H-3’).

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 171.2 (C-7a), 153.8 (C-2), 144.5 (C-6), 139.2

(C-4), 105.2 (C-5), 104.2 (C-4a), 88.3 (C-1’), 83.2 (C-4’), 61.3 (C-5’), 33.1 (C-2’), 23.6 (C-3’).

MS (ESI+): m/z = [M+Na]+ ber.: 259.0689, gef.: 259.0699.

IR: �̃� [cm-1] = 3344, 3146, 3117, 3101, 2969, 2939, 2869, 1661, 1621, 1570, 1427, 1381,

1334, 1171, 1078, 1027, 993, 767, 542.

Synthese von 3-(2‘,3‘-Didesoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-propyl-2,3-dihydrofuro[2,3-d]-

pyrimidin-2-on (6-Prop-ddBCNA) 116


1.0 Äquiv.) 5-Iod-2',3’-didesoxyuridin 117 in 10 mL abs. N,N-Dimethylformamid mit 235 mg

(203 µmol, 0.1 Äquiv.) Tetrakis(triphenylphosphin)-palladium(0), 0.60 mL (415 mg, 6.1 mmol,

3.0 Äquiv.) Pent-1-in, 77 mg (0.41 mmol, 0.2 Äquiv.) Kupfer(I)-iodid und 0.67 mL (3.86 mmol,

1.9 Äquiv.) N,N-Diisopropylethylamin versetzt. Zur Cyclisierung wurden weitere 77 mg

(0.41 mmol, 0.2 Äquiv.) Kupfer(I)-iodid und 9.8 mL (70 mmol, 33 Äquiv.) abs. Triethylamin

zugegeben. Das Rohprodukt wurde säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt


Ausbeute: Es wurden 404 mg (1.45 mmol, 71%) eines beigen



1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 8.84 (s, 1H, H-4), 6.43 (t, 4JH,H

= 1.2 Hz, 1H, H-5), 5.99 (dd, 3JH,H = 6.8 Hz, 3JH,H = 2.3 Hz, 1H, H-1’),

5.20 (dd, 3JH,H = 5.4 Hz, 3JH,H = 5.4 Hz, 1H, 5‘-OH), 4.17-4.12 (m, 1H, H-4’), 3.81 (ddd, 2JH,H =

12.2 Hz, 3JH,H = 5.6 Hz, 3JH,H = 3.2 Hz, 1H, H-5’a), 3.63 (ddd, 2JH,H = 12.3 Hz, 3JH,H = 5.2 Hz,

3JH,H = 3.6 Hz, 1H, H-5’b), 2.62 (dt, 3JH,H = 7.4 Hz, 4JH,H = 1.1 Hz, 2H, H-a), 2.47-2.39 (m, 1H,

H-2’a), 2.03-1.97 (m, 1H, H-2’b), 1.87-1.74 (m, 2H, H-3’), 1.63 (sext, 3JH,H = 7.3 Hz, 2H, H-b),

0.93 (t, 3JH,H = 7.3 Hz, 3H, H-c).

13C-NMR (151 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 171.1 (C-7a), 157.8 (C-6), 153.8 (C-2), 137.1

(C-4), 105.8 (C-4a), 99.9 (C-5), 88.0 (C-1’), 83.1 (C-4’), 61.3 (C-5’), 33.1 (C-2’), 29.3 (C-a),

23.6 (C-3’), 19.9 (C-b), 13.3 (C-c).



190

IR: �̃� [cm-1] = 3445, 3110, 2963, 1661, 1623, 1568, 1384, 1327, 1175, 1075, 1054, 922, 788.

Synthese von 5-Iod-3‘-O-acetyl-5‘-O-tert-butyldimethylsilyl-2’-desoxyuridin 162

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 540 mg (1.52 mmol, 1.0 Äquiv.) 5-Iod-2’-desoxyuridin

161 zweimal mit abs. Pyridin coevaporiert, in 7 mL abs. Pyridin gelöst und mit 276 mg

(1.83 mmol, 1.2 Äquiv.) tert-Butyldimethylsilylchlorid versetzt. Die Reaktionslösung wurde

22 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 0.43 mL (4.6 mmol, 0.47 g,

3.0 Äquiv.) Essigsäureanhydrid hinzugetropft und weitere 21 Stunden bei Raumtemperatur

gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und zweimal mit Toluol

coevaporiert. Der Rückstand wurde in 80 mL Ethylacetat aufgenommen und zweimal mit je

50 mL demineralisiertem Wasser und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat-

Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und

das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde

säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (EE).

Ausbeute: Es wurden 693 mg (1.36 mmol, 89%) eines farblosen

Feststoffes erhalten. Summenformel: C17H27IN2O6Si


9:1 v/v).


= 8.6 Hz, 3JH,H = 5.8 Hz, 1H, H-1’), 5.15 (dt, 3JH,H = 6.2 Hz, 3JH,H = 1.7 Hz, 1H, H-3’), 4.09-

4.07 (m, 1H, H-4‘), 3.84 (dd, 2JH,H = 11.5 Hz, 3JH,H = 2.9 Hz, 1H, H-5’a), 3.81 (dd, 2JH,H =

11.5 Hz, 3JH,H = 3.5 Hz, 1H, H-5’b), 2.32 (ddd, 2JH,H = 14.2 Hz, 3JH,H = 5.8 Hz, 3JH,H = 1.6 Hz,

1H, H-2’a), 2.24-2.18 (m, 1H, H-2‘b), 2.06 (s, 2H, OAc), 0.90 (s, 9H, -SiC(CH3)3), 0.13 (s,

3H, -Si(CH3)2), 0.12 (s, 3H, -Si(CH3)2).

13C-NMR (151 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 170.0 (q-OAc), 160.5 (C-4), 150.1 (C-2), 143.7

(C-6), 84.7 (C-1’), 84.6 (C-4’), 74.4 (C-3‘), 70.2 (C-5), 63.2 (C-5‘), 37.3 (C-2’), 26.0

(-SiC(CH3)3), 20.8 (OAc), 18.1 (-SiC(CH3)3), -5.3, -5.4 (-Si(CH3)2).


IR: �̃� [cm-1] = 3201, 2926, 2853, 1720, 1684, 1250, 1120, 1106, 1003, 829, 781.

Synthese von 5-Iod-3‘-O-acetyl-2’-desoxyuridin 163

Es wurden 680 mg (1.33 mmol, 1.0 Äquiv.) 5-Iod-3‘-O-acetyl-5‘-O-tert-butyldimethylsilyl-2’-

desoxyuridin 162 in 15 mL Dichlormethan gelöst und mit 1.30 mL (7.99 mmol, 1.29 g,

6.0 Äquiv.) Triethylamin Trihydrofluorid versetzt. Die Reaktionslösung wurde 24 Stunden bei

Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck


191

entfernt. Das Rohprodukt wurde säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (EE/MeOH

9:1 v/v).

Ausbeute: Es wurden 472 mg (1.19 mmol, 89%) eines farblosen

Feststoffes erhalten. Summenformel: C11H13IN2O6 Molekulargewicht:



= 8.0 Hz, 3JH,H = 6.3 Hz, 1H, H-1’), 5.30 (dd, 3JH,H = 4.8 Hz, 3JH,H = 4.8 Hz, 1H, 5‘-OH), 5.23-

5.19 (m, 1H, H-3’), 4.03-4.01 (m, 1H, H-4‘), 3.67-3.60 (m, 2H, H-5’), 2.35-2.24 (m, 2H, H-2’),

2.06 (s, 3H, OAc).

13C-NMR (151 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 170.04 (q-OAc), 160.5 (C-4), 150.2 (C-2), 144.8

(C-6), 85.0 (C-4‘), 84.5 (C-1‘), 74.6 (C-3’), 69.9 (C-5), 61.1 (C-5’), 37.2 (C-2’), 20.8 (OAc).


IR: �̃� [cm-1] = 3521, 3187, 3043, 1711, 1661, 1608, 1454, 1242, 1203, 1098, 1063, 1024,

957.

Synthese von 3-(3’-O-Acetyl-2’-desoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-(4-n-pentylphenyl)-2,3-di-

hydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on 164


1.0 Äquiv.) 5-Iod-3‘-O-acetyl-2’-desoxyuridin 163 in 7 mL abs. N,N-Dimethylformamid mit

136 mg (0.141 mmol, 0.1 Äquiv.) Tetrakis(triphenylphosphin)-palladium(0), 0.81 mL (729 mg,

4.23 mmol, 3.0 Äquiv.) 4-n-Pentylphenylacetylen, 54 mg (0.282 mmol, 0.2 Äquiv.) Kupfer(I)-

iodid und 0.49 mL (364 mg, 2.82 mmol, 1.9 Äquiv.) N,N-Diisopropylethylamin versetzt. Zur

Cyclisierung wurden weitere 54 mg (0.282 mmol, 0.2 Äquiv.) Kupfer(I)-iodid und 4.94 mL

(5.00 g, 49.4 mmol, 35 Äquiv.) Triethylamin zugegeben. Das Rohprodukt wurde

säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v) und in

Dichlormethan kristallisiert.


farblosen Feststoffs erhalten. Summenformel: C24H28N2O6


9:1 v/v).

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 8.79 (s, 1H, H-4), 7.74

(d, 3JH,H = 7.9 Hz, 2H, H-2‘‘), 7.33 (d, 3JH,H = 7.9 Hz, 2H, H-3‘‘),

7.22 (s, 1H, H-5), 6.23 (dd, 3JH,H = 7.4 Hz, 3JH,H = 6.1 Hz, 1H,


192

H-1’), 5.30 (dd, 3JH,H = 5.2 Hz, 3JH,H = 5.2 Hz, 1H, 5‘-OH), 5.27-5.21 (m, 1H, H-3’), 4.23-4.17

(m, 1H, H-4‘), 3.77-3.63 (m, 2H, H-5’), 2.65-2.54 (m, 3H, H-2’a, H-a), 2.34-2.24 (m, 1H, H-

2’b), 2.09 (s, 3H, OAc), 1.65-1.54 (m, 2H, H-b), 1.36-1.21 (m, 4H, H-c, H-d), 0.86 (t, 3JH,H =

6.8 Hz, 3H, H-e).

13C-NMR (151 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 171.2 (q-OAc), 171.0 (C-7a), 154.1 (C-6), 153.8

(C-2), 144.2 (C-1’’), 137.7 (C-4), 129.0 (C-3‘‘), 125.8 (C-4’’), 124.6 (C-2‘‘), 107.2 (C-4a),

98.7 (C-5), 87.7 (C-1‘), 85.9 (C-4‘), 74.5 (C-3‘), 61.0 (C-5‘), 38.7 (C-2’), 34.9 (C-a), 30.8 (C-

c), 30.4 (C-b), 21.9 (C-d), 20.8 (OAc), 13.9 (C-e).


463.1843.

IR: �̃� [cm-1] = 3378, 3074, 2928, 1735, 1668, 1568, 1382, 1182, 1106, 1007, 783, 694.

Synthese von 3-(2’-Desoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-(4-n-pentylphenyl)-2,3-dihydrofuro[2,3-

d]pyrimidin-2-on (Cf1743) 100

Es wurden 50 mg (0.11 mmol) 3-(3’-O-Acetyl-2’-desoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-(4-n-

pentylphenyl)-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on 164 in 7 mL Methanol gelöst. Bei

Raumtemperatur wurden 0.7 mL Triethylamin zugegeben und 22 Stunden bei

Raumtemperatur rühren lassen. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem

Druck entfernt und das Rohprodukt mittels automatisierter Säulenchromatographie an

Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 0-10% Vol.).

Ausbeute: Es wurden 31 mg (77 μmol, 70%) eines farblosen

Feststoffs erhalten. Summenformel: C22H26N2O5


19:1 v/v).

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 8.83 (s, 1H, H-4), 7.74

(d, 3JH,H = 8.3 Hz, 2H, H-2‘‘), 7.32 (d, 3JH,H = 8.3 Hz, 2H, H-3‘‘),

7.20 (s, 1H, H-5), 6.18 (dd, 3JH,H = 6.2 Hz, 3JH,H = 6.2 Hz, 1H, H-

1’), 5.30 (dd, 3JH,H = 3.5 Hz, 3JH,H = 3.5 Hz, 1H, 3‘-OH), 5.17 (dd,

3JH,H = 5.1 Hz, 3JH,H = 5.1 Hz, 1H, 5‘-OH), 4.30-4.21 (m, 1H, H-3’), 3.96-3.90 (m, 1H, H-4‘),

3.76-3.59 (m, 2H, H-5’), 2.61 (t, 3JH,H = 7.3 Hz, 2H, H-a), 2.46-2.36 (m, 1H, H-2’a), 2.15-2.05

(m, 1H, H-2’b), 1.66-1.53 (m, 2H, H-b), 1.39-1.20 (m, 4H, H-c, H-d), 0.86 (t, 3JH,H = 6.8 Hz,

3H, H-e).

13C-NMR (151 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 171.0 (C-7a), 153.9 (C-6), 153.8 (C-2), 144.1 (C-

1’’), 137.8 (C-4), 129.0 (C-3‘‘), 125.9 (C-4’’), 124.6 (C-2‘‘), 106.9 (C-4a), 98.7 (C-5), 88.2 (C-


193

4‘), 87.6 (C-1‘), 69.5 (C-3‘), 60.7 (C-5‘), 41.2 (C-2’), 34.9 (C-a), 30.8 (C-c), 30.4 (C-b), 21.9

(C-d), 13.9 (C-e).


IR: �̃� [cm-1] = 3279, 2924, 1664, 1614, 1597, 1564, 1381, 1178, 1107, 1091, 1060, 1002,

895, 782.

9.2.8 Synthese von BCNAMP und BCNADP

Synthese von 3-(5’-O-p-Toluolsulfonyl-2’,3’-didesoxy-β-D-ribofuranosyl)-2,3-dihydro-

furo[2,3-d]pyrimidin-2-on (5’-O-Tosyl-6-H-ddBCNA) 127

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 17.9 mg (75.1 µmol) 3-(2’,3’-Didesoxy-β-D-

ribofuranosyl)-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on (6-H-ddBCNA) 115 in 0.6 mL abs. Pyridin

gelöst und auf 0 °C gekühlt. Dazu wurden 23.6 mg (124 µmol, 1.6 Äquiv.) para-

Toluolsulfonsäurechlorid gelöst in 0.2 mL abs. Pyridin über 45 Minuten zugetropft und

24 Stunden bei 0 °C gerührt. Anschließend wurden weitere 5.9 mg (30.9 µmol, 0.4 Äquiv.)

para-Toluolsulfonsäurechlorid in abs. Pyridin zugegeben. Nach weiteren 48 Stunden bei 0 °C

wurde die Reaktionslösung in Eiswasser gegeben und dreimal mit Dichlormethan extrahiert.

Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und anschließend

das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde dreimal mit

Toluol coevaporiert und das Rohprodukt säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt


Ausbeute: Es wurden 19 mg (48 µmol, 64%) eines leicht

gelben Öls erhalten. Summenformel: C18H18N2O6S



1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 8.65 (s, 1H, H-4), 7.80 (d, 3JH,H = 8.1 Hz, 2H, H-2‘‘),

7.38 (d, 3JH,H = 8.0 Hz, 2H, H-3‘‘), 7.34 (d, 3JH,H = 2.8 Hz, 1H, H-6), 6.58 (d, 3JH,H = 2.7 Hz,

1H, H-5), 6.15 (dd, 3JH,H = 6.7 Hz, 3JH,H = 2.7 Hz, 1H, H-1’), 4.53 (dd, 4JH,H = 11.2 Hz, 3JH,H =

2.5 Hz, 1H, H-5’a), 4.40-4.35 (m, 1H, H-4’), 4.17 (dd, 4JH,H = 11.2 Hz, 3JH,H = 3.0 Hz, 1H, H-

5’b), 2.47-2.58 (m, 1H, H-2’a), 2.46 (s, 3H, H-5‘‘), 2.24-2.18 (m, 1H, H-2’b), 2.01-1.94 (m,

1H, H-3’a), 1.89-1.82 (m, 1H, H-3’b).

13C-NMR (126 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 171.8 (C-7a), 154.7 (C-2), 145.6 (C-4’’), 144.3

(C-6), 137.5 (C-4), 132.5 (C-1’’), 130.3 (C-3’’), 128.0 (C-2’’), 105.6 (C-4a), 105.0 (C-5), 89.2

(C-1’), 79.5 (C-4’), 69.2 (C-5’), 33.6 (C-2’), 24.4 (C-3’), 21.7 (C-5’’).


IR: �̃� [cm-1] = 3120, 2923, 1666, 1571, 1334, 1172, 1089, 954, 727, 664, 552.


194

Synthese von 3-(2’,3’-Didesoxy-β-D-ribofuranosyl)-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-

on-5’-monophosphat (6-H-ddBCNAMP) 126

Variante A

Es wurden 14 mg (34 µmol, 1.0 Äquiv.) 3-(5’-O-p-Toluolsulfonyl-2’,3’-didesoxy-β-D-

ribofuranosyl)-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on (5’-O-Tosyl-6-H-ddBCNA) 127 in 0.5 mL

abs. N,N-Dimethylformamid gelöst und 22 mg (49 µmol, 1.4 Äquiv.) Tetra-n-

butylammoniumphosphat zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 20 Minuten bei

100 °C in der Mikrowelle (150 W) erhitzt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem

Druck entfernt und der Rückstand durch Säulenchromatographie an RP-18-Kieselgel

gereinigt (MeOH/H2O 1:2 v/v).

Variante B

Für den 50 mM Phosphatpuffer wurden 155 mg Kaliumdihydrogenphosphat und 601 mg

Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat in 100 mL Reinstwasser gelöst. Der pH-Wert wurde

mit Natronlauge (1 M) auf 7.3 eingestellt. Es wurde 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89 für

3 Stunden bei 37 °C in 100 µL Phosphatpuffer hydrolysiert. Anschließend wurde die

Reaktionslösung lyophilisiert und das Produkt mittels HPLC gereinigt.

Ausbeute: Variante A: Es wurden 8 mg eines leicht

verunreinigten farblosen Feststoffs erhalten. Es konnten keine

Gegenionen im 1H-NMR detektiert werden, somit wurden

Protonen angenommen. Summenformel: C11H13N2O7P

Molekulargewicht: 316.21 g/mol DC: Rf = 0.70 (iPrOH/NH4OAc

(1M) 2:1 v/v).

1H-NMR (400 MHz, D2O): [ppm] = 9.10 (s, 1H, H-4), 7.63 (d, 3JH,H = 2.7 Hz, 1H, H-6), 6.89

(d, 3JH,H = 2.7 Hz, 1H, H-5), 6.23 (dd, 3JH,H = 6.8 Hz, 3JH,H = 2.2 Hz, 1H, H-1’), 4.57-4.40 (m,

1H, H-4’), 4.40-4.35 (m, 1H, H-5’a), 4.18-4.12 (m, 1H, H-5’b), 2.73-2.60 (m, 1H, H-2’a), 2.33-

2.21 (m, 1H, H-2’b), 2.15-2.05 (m, 1H, H-3’a), 2.02-1.90 (m, 1H, H-3’b).

31P-NMR (162 MHz, D2O): [ppm] = 0.29.

Synthese von 5-Chlorsaligenylchlorphosphit 131

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 2.00 g (12.6 mmol, 1.0 Äquiv.) 5-Chlorsalicylalkohol

133 in 50 mL abs. Diethylether gelöst. Bei -20 °C wurden unter Rühren 1.32 mL (2.08 g,

15.1 mmol, 1.2 Äquiv.) Phosphortrichlorid tropfenweise hinzugegeben. Anschließend wurde

über einen Zeitraum von 2 Stunden bei -20 °C 2.37 mL (2.29 g, 29.0 mmol, 2.3 Äquiv.)


195

Pyridin in 12 mL abs. Diethylether hinzugetropft. Danach wurde 2 Stunden bei

Raumtemperatur gerührt. Nach 17 Stunden Lagerung bei -26 °C wurde unter Stickstoff

filtriert. Das Lösungsmittel des Filtrats wurde unter vermindertem Druck entfernt.

Ausbeute: Es wurden 2.43 mg (10.9 mmol, 86%) farblosen Öls

erhalten. Summenformel: C7H5Cl2O2P Molekulargewicht: 222.99 g/mol.

1H-NMR (200 MHz, CDCl3): [ppm] = 7.27-7.18 (m, 1H, H-4), 7.01-6.96 (m, 1H, H-6), 6.93

(d, 3JH,H = 8.6 Hz, 1H, H-3), 5.48-5.35 (m, 1H, H-7a), 5.00 (dd, 2JH,H = 14.4 Hz, 3JH,P = 9.5 Hz,

1H, H-7b).

31P-NMR (81 MHz, CDCl3): [ppm] = 138.8.

Synthese von 5-Chlor-cycloSal-3-(2‘,3‘-didesoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-propyl-2,3-di-

hydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on-5’-monophosphat (5-Cl-cycloSal-6-Prop-ddBCNA) 129

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 50 mg (0.18 mmol, 1.0 Äquiv.) 3-(2‘,3‘-Didesoxy-β-D-

ribofuranosyl)-6-propyl-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on (6-Prop-ddBCNA) 116 dreimal

mit abs. Acetonitril coevaporiert und in 2.5 mL abs. Acetonitril gelöst. Bei -20 °C wurden

langsam 80 mg (0.36 mmol, 2.0 Äquiv.) 5-Chlorsaligenylchlorphosphit 131 in 1.5 mL abs.

Acetonitril und 0.05 mL (0.4 mmol, 2.0 Äquiv.) Triethylamin zugetropft. Es wurde 1.5 Stunden

bei Raumtemperatur gerührt und dann bei -20 °C 65 µL (0.36 mmol, 2.0 Äquiv.) tert-

Butylhydroperoxid (5.5 M in n-Decan) zugegeben. Es wurden weitere 1.5 Stunden bei

Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 20 mL kalte Ammoniumacetat-

Lösung (1 M in H2O) und 20 mL Dichlormethan gegeben und 5 Minuten bei 0 °C zentrifugiert.

Die wässrige Phase wurde zweimal mit je 20 mL Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten


unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde mittels automatisierter

Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 0-10% Vol.).


beigen Schaums als Gemisch zweier Diastereomere im

Verhältnis 1.0:1.2 erhalten. Summenformel:

C21H22ClN2O7P Molekulargewicht: 480.84 g/mol DC: Rf

= 0.52 (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v).

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): [ppm] = 8.37 (s, 1H, 1x

H-4), 8.36 (s, 1H, 1x H-4), 7.32-7.26 (m, 2H, 2x H-4‘‘),

7.10 (d, 4JH,H = 2.5 Hz, 2H, 2x H-6‘‘), 6.99 (dd, 3JH,H = 8.8 Hz, 4JH,H = 1.5 Hz, 2H, 2x H-3‘‘),


196

6.14 (dd, 3JH,H = 6.3 Hz, 3JH,H = 3.1 Hz, 2H, 2x H-1’), 5.99 (s, 1H, 1x H-5), 5.94 (s, 1H, 1x

H-5), 5.42-5.24 (m, 4H, 2x H-7‘‘), 4.61-4.47 (m, 2H, 2x H-4’), 4.47-4.35 (m, 4H, 2x H-5’),

2.73-2.63 (m, 2H, 2x H-2’a), 2.60 (dt, 3JH,H = 7.4 Hz, 4JH,H = 2.3 Hz, 4H, 2x H-a), 2.21-2.01

(m, 4H, 2x H-2’b, 2x H-3’a), 1.88-1.76 (m, 2H, 2x H-3’b), 1.70 (sext, 3JH,H = 7.4 Hz, 4H, 2x

H-b), 0.99 (t, 3JH,H = 7.4 Hz, 6H, 2x H-c).

31P-NMR (162 MHz, CDCl3): [ppm] = -9.11, -9.38.


IR: �̃� [cm-1] = 3110, 2972, 2931, 1668, 1573, 1481, 1248, 1186, 1092, 992, 941, 866.

Synthese von Bis-O-(9H-fluoren-9-ylmethyl)-N,N-diisopropylaminophosphoramidit 134

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 2.64 g (13.1 mmol, 1.0 Äquiv.) Dichloro-N,N-

diisopropylphosphoramidit 136 in 40 mL abs. Tetrahydrofuran gelöst. Anschließend wurden

bei 0 °C langsam 5.13 g (26.1 mmol, 2.0 Äquiv.) 9-Fluorenylmethanol 135 und 3.86 mL

(2.78 g, 27.5 mmol, 2.1 Äquiv.) Triethylamin in 50 mL abs. Tetrahydrofuran zur

Reaktionslösung getropft. Es wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und danach

filtriert. Zu dem Filtrat wurden 200 mL Ethylacetat und 200 mL Phosphatpuffer (1 M, pH 7.0)

geben. Die wässrige Phase wurde einmal mit 200 mL Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten


unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde mittels automatisierter

Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt (PE/EE 96:4 v/v, 1% Et3N Vol.).


farblosen Harzes erhalten. Summenformel: C34H36NO2P

Molekulargewicht: 521.64 g/mol DC: Rf = 0.88 (PE/EE 1:1

v/v).

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): [ppm] = 7.77-7.72 (m, 4H, H-1,

H-8), 7.67-7.61 (m, 4H, H-4, H-5), 7.41-7.33 (m, 4H, H-2, H-7),

7.28 (dq, 3JH,H = 7.6 Hz, 4JH,H = 1.3 Hz, 4H, H-3, H-6), 4.18 (dd, 3JH,H = 7.0 Hz, 3JH,H = 7.0 Hz,

2H, H-9), 4.00 (dt, 2JH,H = 9.8 Hz, 3JH,H = 6.7 Hz, 2H, -CH2-a), 3.81 (dt, 2JH,H = 9.8 Hz, 3JH,H =

7.3 Hz, 2H, -CH2-b), 3.71-3.59 (m, 2H, iPr-CH), 1.16 (d, 3JH,H = 6.7 Hz, 12H, iPr-CH3).

13C-NMR (101 MHz, CDCl3): [ppm] = 145.1, 144.8 (C-8a, C-9a), 141.5, 141.4 (C-4a, C-4b),

127.5, 127.5 (C-2, C-7), 127.0, 126.9 (C-3, C-6), 125.6, 125.3 (C-4, C-5), 120.0, 119.9 (C-1,

C-8), 66.1 (d, 2JC,P = 17.4 Hz, -CH2), 49.3 (d, 3JC,P = 7.4 Hz, C-9), 43.2 (d, 2JC,P = 12.5 Hz,

iPr-CH), 24.8 (d, 3JC,P = 7.4 Hz, iPr-CH3).

31P-NMR (162 MHz, CDCl3): [ppm] = 146.20.



197

IR: �̃� [cm-1] = 3064, 2964, 2864, 1449, 1362, 1183, 1065, 1007, 973, 884, 734.

Synthese von Bis-O-(9H-fluoren-9-ylmethyl)-3-(2‘,3‘-didesoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-

propyl-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on-5’-monophosphat (Fm-6-Prop-

ddBCNAMP) 137

Unter Stickstoff als Inertgas wurden 150 mg (539 µmol, 1.0 Äquiv.) 3-(2‘,3‘-Didesoxy-β-D-

ribofuranosyl)-6-propyl-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on (6-Prop-ddBCNA) 116 in 8 mL

abs. Dichlormethan gelöst. Bei Raumtemperatur wurden 423 mg (808 µmol, 1.5 Äquiv.) Bis-

O-(9H-fluoren-9-ylmethyl)-N,N-diisopropylaminophosphoramidit 134 zugegeben und 2.58 mL

(648 µmol, 1.2 Äquiv.) 4,5-Dicyanoimidazol (0.25 M in Acetonitril) langsam zugetropft. Die

Reaktionslösung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Bei -10 °C wurden 0.15 mL

(0.81 mmol, 1.5 Äquiv.) tert-Butylhydroperoxid (5.5 M in n-Decan) zugegeben und eine

Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 20 mL kalte

Ammoniumacetat-Lösung (1 M in H2O) und 20 mL Dichlormethan gegeben und 5 Minuten

bei 0 °C zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde zweimal mit je 20 mL Dichlormethan

extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert

und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde mittels

automatisierter Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 0-10% Vol.).


farblosen Schaumes erhalten. Summenformel:

C42H39N2O7P Molekulargewicht: 714.75 g/mol DC: Rf

= 0.42 (CH2Cl2/MeOH 19:1 v/v).

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): [ppm] = 8.21 (s, 1H, H-

4), 7.78-7.65 (m, 4H, H-1‘‘, H-8‘‘), 7.54-7.43 (m, 4H,

H-4‘‘, H-5‘‘), 7.43-7.30 (m, 4H, H-2‘‘, H-7‘‘), 7.30-7.15 (m, 4H, H-3‘‘, H-6‘‘), 6.05 (dd, 3JH,H =

6.6 Hz, 3JH,H = 3.1 Hz, 1H, H-1’), 5.80 (s, 1H, H-5), 4.38-4.31 (m, 4H, -CH2-Fm), 4.31-4.23

(m, 1H, H-4’), 4.18-4.08 (m, 2H, H-9‘‘), 4.05-3.97 (m, 1H, H-5’a), 3.90-3.82 (m, 1H, H-5’b),

2.59-2.47 (m, 3H, H-2’a, H-a), 2.07-1.97 (m, 1H, H-2’b), 1.84-1.74 (m, 1H, H-3’a), 1.70-1.51

(m, 3H, H-3’b, H-b), 0.95 (t, 3JH,H = 7.3 Hz, 3H, H-c).

31P-NMR (162 MHz, CDCl3): [ppm] = -1.33.


IR: �̃� [cm-1] = 3040, 2959, 2891, 2325, 1668, 1572, 1478, 1256, 1012, 984, 738.


198


pyrimidin-2-on-5’-monophosphat als Triethylammoniumsalz (6-Prop-ddBCNAMP) 128

Es wurden 346 mg (484 µmol) Bis-O-(9H-fluoren-9-ylmethyl)-3-(2‘,3‘-didesoxy-β-D-

ribofuranosyl)-6-propyl-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on-5’-monophosphat 137 in 9 mL

Acetonitril und demineralisiertem Wasser (1:1) gelöst und 0.9 mL Triethylamin bei

Raumtemperatur zugetropft. Die Reaktionslösung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur

gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 20 mL demineralisiertes Wasser und 20 mL

Dichlormethan gegeben und 5 Minuten zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde einmal mit

20 mL Dichlormethan und einmal mit 20 mL Petrolether gewaschen. Das Lösungsmittel der

wässrigen Phase wurde unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde mittels

automatisierter Säulenchromatographie an RP-18-Kieselgel gereinigt (H2O/MeCN 0-90%

Vol., 0-30 min, Flussrate 20 mL/min).

Ausbeute: Es wurden 166 mg (339 µmol, 67% über zwei

Stufen) eines farblosen Öls erhalten. Die Anzahl der

Triethylammoniumionen wurde anhand des 1H-NMR-

Spektrums bestimmt und bei dem Molekulargewicht

berücksichtigt. Summenformel: C14H18N2O7P-

Molekulargewicht: 489.84 g/mol RP-HPLC: tR= 8.64 min

(Methode D).

1H-NMR (400 MHz, D2O): [ppm] = 8.85 (s, 1H, H-4), 6.47 (s, 1H, H-5), 6.16 (dd, 3JH,H =

6.7 Hz, 3JH,H = 1.8 Hz, 1H, H-1’), 4.49-4.40 (m, 1H, H-4’), 4.24 (ddd, 2JH,H = 11.7 Hz, 3JH,H =

4.8 Hz, 3JH,H = 2.7 Hz, 1H, H-5’a), 4.03 (ddd, 2JH,H = 11.7 Hz, 3JH,H = 5.3 Hz, 3JH,H = 4.4 Hz,

1H, H-5’b), 3.17 (q, 3JH,H = 7.3 Hz, 8H, H-A), 2.66 (t, 3JH,H = 7.3 Hz, 2H, H-a), 2.63-2.51 (m,

1H, H-2’a), 2.22-2.12 (m, 1H, H-2’b), 2.08-1.98 (m, 1H, H-3’a), 1.95-1.82 (m, 1H, H-3’b),

1.68 (sext, 3JH,H = 7.3 Hz, 2H, H-b), 1.24 (t, 3JH,H = 7.3 Hz, 12H, H-B), 0.93 (t, 3JH,H = 7.3 Hz,

3H, H-c).

13C-NMR (126 MHz, D2O): [ppm] = 171.5 (C-7a), 161.1 (C-6), 156.2 (C-2), 137.8 (C-4),

109.5 (C-4a), 100.3 (C-5), 89.6 (C-1’), 82.5 (d, 3JH,H = 9.1 Hz, C-4’), 65.6 (d, 3JH,H = 5.1 Hz,

C-5’), 47.1 (C-A), 33.3 (C-2’), 29.8 (C-a), 24.0 (C-3’), 20.0 (C-b), 13.2 (C-c), 8.6 (C-B).

31P-NMR (162 MHz, D2O): [ppm] = 1.37.

HRMS (ESI-): m/z = [M-H]- ber.: 357.0857, gef.: 357.1529.

IR: �̃� [cm-1] = 3418, 3108, 2961, 2877, 2365, 1666, 1570, 1382, 1165, 1096, 1063, 1041,

913, 784, 517.


199

Synthese von β-O-(9H-Fluoren-9-ylmethyl)-3-(2‘,3‘-didesoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-

propyl-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on-5’-diphosphat als Triethylammoniumsalz

160

Unter Stickstoff als Inertgas wurden 50 mg (0.10 mmol, 1.0 Äquiv.) 3-(2‘,3‘-Didesoxy-β-D-

ribofuranosyl)-6-propyl-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on-5’-monophosphat als

Triethylammoniumsalz (6-Prop-ddBCNAMP) 128 in 4 mL abs. Dichlormethan gelöst. Bei

Raumtemperatur wurden 82 mg (0.16 mmol, 1.5 Äquiv.) Bis-O-(9H-fluoren-9-ylmethyl)-N,N-

diisopropylaminophosphoramidit 134 zugegeben und alle 5 Minuten 0.2 Äquiv.

4,5-Dicyanoimidazol (DCI) (0.25 M in Acetonitril) zugetropft bis insgesamt 0.50 mL

(0.13 mmol, 1.2 Äquiv.) DCI zugegeben wurden. Die Reaktionslösung wurde 30 Minuten bei

Raumtemperatur gerührt. Bei -10 °C wurden 0.03 mL (0.2 mmol, 1.5 Äquiv.) tert-

Butylhydroperoxid (5.5 M in n-Decan) zugegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur

gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in

5 mL abs. Acetonitril gelöst. Bei Raumtemperatur wurden 0.25 mL Triethylamin zugetropft,

10 Minuten gerührt und anschließend das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt.

Der Rückstand wurde in Wasser/Acetonitril (1:1 v/v) aufgenommen und über RP-18-

Kieselgel filtriert. Das Filtrat wurde mittels automatisierter Säulenchromatographie an RP-18-

Kieselgel gereinigt (H2O/MeCN 5-100% Vol., 0-35 min, Flussrate 20 mL/min).

Ausbeute: Es wurden 87 mg eines leicht

verunreinigten, farblosen Feststoffs. Die Anzahl

der Triethylammoniumionen wurde anhand des

1H-NMR-Spektrums bestimmt und bei dem

Molekulargewicht berücksichtigt.

Summenformel: C28H28N2O10P22-

Molekulargewicht: 798.65 g/mol.

1H-NMR (600 MHz, D2O): [ppm] = 8.41 (s, 1H, H-4), 7.67-7.56 (m, 4H, H-1‘‘, H-4‘‘, H-5‘‘,

H-8‘‘), 7.38-7.21 (m, 1H, H-2‘‘, H-3‘‘, H-6‘‘, H-7‘‘), 5.88 (dd, 3JH,H = 6.8 Hz, 3JH,H = 1.4 Hz, 1H,

H-1’), 5.86 (s, 1H, H-5), 4.45-4.40 (m, 1H, H-5’a), 4.39-3.34 (m, 1H, H-4’), 4.19-4.13 (m, 3H,

-CH2-Fm, H-9‘‘), 4.12-4.07 (m, 1H, H-5’b), 3.19 (q, 3JH,H = 7.3 Hz, 10.5H, H-A), 2.54-2.45 (m,

1H, H-2’a), 2.42-2.31 (m, 2H, H-a), 2.02-1.90 (m, 2H, H-2’b, H-3’a), 1.81-1.71 (m, 1H,

H-3’b), 1.45-1.32 (m, 2H, H-b), 1.27 (t, 3JH,H = 7.3 Hz, 16H, H-B), 0.88 (t, 3JH,H = 7.4 Hz, 3H,

H-c).

31P-NMR (162 MHz, D2O): [ppm] = 11.22.


200


pyrimidin-2-on-5’-diphosphat als Triethylammoniumsalz (6-Prop-ddBCNADP) 155

Es wurden 85 mg β-O-(9H-Fluoren-9-ylmethyl)-3-(2‘,3‘-didesoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-propyl-

2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on-5’-diphosphat 160 in 4 mL Acetonitril und

demineralisiertem Wasser (1:1) gelöst und 1 mL Triethylamin bei Raumtemperatur

zugetropft. Die Reaktionslösung wurde 22 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das

Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 1 mL

demineralisiertem Wasser aufgenommen und über RP-18-Kieselgel filtriert. Das Filtrat wurde

mittels automatisierter Säulenchromatographie an RP-18-Kieselgel gereinigt (H2O/MeCN 0-

100% Vol., 0-30 min, Flussrate 20 mL/min).


farblosen Öls erhalten. Die Anzahl der

Triethylammoniumionen wurde anhand des 1H-NMR-

Spektrums bestimmt und bei dem Molekulargewicht

berücksichtigt. Summenformel: C14H18N2O10P22-

Molekulargewicht: 640.64 g/mol RP-HPLC: tR= 9.47 min

(Methode D).

1H-NMR (600 MHz, D2O): [ppm] = 8.84 (s, 1H, H-4), 6.55 (s, 1H, H-5), 6.19 (dd, 3JH,H =

6.7 Hz, 3JH,H = 2.3 Hz, 1H, H-1’), 4.53-4.46 (m, 1H, H-4’), 4.41-3.36 (m, 1H, H-5’a), 4.23-4.16

(m, 1H, H-5’b), 3.20 (q, 3JH,H = 7.3 Hz, 12H, H-A), 2.70 (t, 3JH,H = 7.4 Hz, 2H, H-a), 2.65-2.56

(m, 1H, H-2’a), 2.24-2.17 (m, 1H, H-2’b), 2.12-2.05 (m, 1H, H-3’a), 1.98-1.89 (m, 1H, H-3’b),

1.72 (sext, 3JH,H = 7.4 Hz, 2H, H-b), 1.28 (t, 3JH,H = 7.3 Hz, 18H, H-B), 0.96 (t, 3JH,H = 7.4 Hz,

3H, H-c).

13C-NMR (151 MHz, D2O): [ppm] = 171.3 (C-7a), 160.6 (C-6), 156.1 (C-2), 137.5 (C-4),

109.5 (C-4a), 100.1 (C-5), 89.2 (C-1’), 82.0 (d, 3JC,P = 8.7 Hz, C-4’), 65.9 (d, 2JC,P = 5.6 Hz,

C-5’), 46.6 (C-A), 32.9 (C-2’), 29.4 (C-a), 23.6 (C-3’), 19.7 (C-b), 12.7 (C-c), 8.2 (C-B).

31P-NMR (162 MHz, D2O): [ppm] = -10.69 (d, 2JP,P = 21.6 Hz, P-α), -11.16 (d, 2JP,P =

21.6 Hz, P-β).

HRMS (ESI-): m/z = [M-H]- ber.: 437.0520, gef.: 436.8024.

IR: �̃� [cm-1] = 3397, 3110, 2981, 2636, 2474, 2217, 1666, 1572, 1384, 1219, 1167, 1063,

912, 785, 503.


201

Synthese von Bis-O-(9H-fluoren-9-ylmethyl)-3-(3’-O-acetyl-2’-desoxy-β-D-ribofurano-

syl)-6-(4-n-pentylphenyl)-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on-5’-monophosphat 166

Unter Stickstoff als Inertgas wurden 84 mg (0.19 mmol, 1.0 Äquiv.) 3-(3’-O-Acetyl-2’-desoxy-

β-D-ribofuranosyl)-6-(4-n-pentylphenyl)-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on 164 in 5 mL abs.

Dichlormethan suspendiert. Bei Raumtemperatur wurden 148 mg (285 µmol, 1.5 Äquiv.) Bis-

O-(9H-fluoren-9-ylmethyl)-N,N-diisopropylaminophosphoramidit 134 zugegeben und

insgesamt 2.58 mL (228 µmol, 1.2 Äquiv.) 4,5-Dicyanoimidazol (0.25 M in Acetonitril), alle

5 Minuten 0.2 Äquiv., zugetropft. Die Reaktionslösung wurde eine Stunde bei

Raumtemperatur gerührt. Bei -10 °C wurden 52 µL (0.29 mmol, 1.5 Äquiv.) tert-

Butylhydroperoxid (5.5 M in n-Decan) zugegeben. Das Rohprodukt wurde mittels

automatisierter Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 0-10% Vol.).

Ausbeute: Es wurden 188 mg eines leicht

verunreinigten farblosen Feststoffes erhalten.

Summenformel: C52H49N2O9P Molekulargewicht:


1H-NMR (400 MHz, CDCl3): [ppm] = 8.09 (s, 1H, H-4),

7.67-7.13 (m, 20H, H-2‘‘, H-3‘‘, -Fm-Aryl), 6.27 (dd,

3JH,H = 8.3 Hz, 3JH,H = 5.5 Hz, 1H, H-1’), 6.12 (s, 1H,

H-5), 5.09-5.05 (m, 1H, H-3‘), 4.45-4.20 (m, 4H, -CH2-

Fm), 4.16-4.13 (m, 1H, H-4‘), 4.13-4.04 (m, 2H, H-9‘‘),

4.03-3.92 (m, 2H, H-5‘), 2.75 (ddd, 4JH,H = 14.5 Hz, 3JH,H

= 5.6 Hz, 3JH,H = 1.2 Hz, 1H, H-2’a), 2.67 (t, 3JH,H = 7.7 Hz, 2H, H-a), 2.11 (s, 3H, OAc), 1.79-

1.61 (m, 3H, H-2’b, H-b), 1.43-1.31 (m, 4H, H-c, H-d), 0.92 (t, 3JH,H = 6.9 Hz, 3H, H-e).

31P-NMR (162 MHz, CDCl3): [ppm] = -1.19.


Synthese von 3-(2’-Desoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-(4-n-pentylphenyl)-2,3-dihydrofuro[2,3-

d]pyrimidin-2-on-5’-monophosphat als Triethylammoniumsalz 165

Es wurden 173 mg Bis-O-(9H-fluoren-9-ylmethyl)-3-(3’-O-acetyl-2’-desoxy-β-D-ribofuranosyl)-

6-(4-n-pentylphenyl)-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on-5’-monophosphat 166 in 10 mL

Acetonitril, Methanol und demineralisiertem Wasser (2:1:2) gelöst und 2 mL Triethylamin bei

Raumtemperatur zugetropft. Die Reaktionslösung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur

gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, in 5 mL

H2O aufgenommen und über RP-18-Kieselgel filtriert. Das Filtrat wurde mittels



202

Vol., 0-25 min, Flussrate 20 mL/min). Da die Acetylgruppe nicht vollständig abgespalten war,

wurde der Feststoff erneut in 8 mL Acetonitril und demineralisiertem Wasser (1:1) gelöst,

2 mL Triethylamin zugetropft und 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das

Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mittels


Vol., 0-25 min, Flussrate 20 mL/min).


eines leicht gelben Feststoffes erhalten. Die

Anzahl der Triethylammoniumionen wurde anhand

des 1H-NMR-Spektrums bestimmt und bei dem

Molekulargewicht berücksichtigt. Summenformel:

C24H28N2O9P- Molekulargewicht: 549.27 g/mol

DC: Rf = 0.20 (MeCN/H2O 7:1 v/v).

1H-NMR (600 MHz, D2O): [ppm] = 8.57 (s, 1H,

H-4), 7.37 (d, 3JH,H = 5.9 Hz, 2H, H-3‘‘), 6.93 (s, 1H, H-5), 6.90-6.83 (d, 3JH,H = 8.1 Hz, 2H, H-

2‘‘), 6.13-6.06 (m, 1H, H-1’), 4.48-4.43 (m, 1H, H-3‘), 4.18-4.14 (m, 1H, H-4‘), 4.14-4.03 (m,

2H, H-5‘), 3.14 (q, 3JH,H = 7.3 Hz, 4.4H, H-A), 2.64-2.54 (m, 1H, H-2’a), 2.25-2.13 (m, 3H, H-

2’b, H-a), 1.35-1.28 (m, 2H, H-b), 1.23 (t, 3JH,H = 7.3 Hz, 6.6H, H-B), 1.15-1.09 (m, 2H, H-d),

1.09-1.01 (m, 2H, H-c), 0.70 (t, 3JH,H = 6.9 Hz, 3H, H-e).

13C-NMR (151 MHz, D2O): [ppm] = 170.9 (C-7a), 155.0 (C-6), 143.6* (C-1’’), 137.4** (C-4),

128.4 (C-2’’), 124.5 (C-3’’), 109.4 (C-4a), 98.3** (C-5), 88.5 (C-1’), 86.0 (C-4’), 70.2 (C-3’),

64.4 (C-5’), 46.5 (C-A), 40.3 (C-2’), 35.2 (C-a), 31.5 (C-c), 30.3 (C-b), 22.2 (C-d), 13.7 (C-e),

8.2 (C-B). *aus dem HMBC bestimmt, **aus dem HSQC bestimmt

31P-NMR (243 MHz, D2O): [ppm] = 0.22.


IR: �̃� [cm-1] = 2954, 2927, 2856, 1666, 1573, 1169, 1055, 1002, 918, 779, 510.

9.2.9 Synthese von Nucleosiddi- und Triphosphatprodrugs

Synthese von 4-(Hydroxymethyl)-phenylpentanoat 143


1.0 Äquiv.) 4-Hydroxybenzylalkohol in 50 mL abs. Tetrahydrofuran mit 4.53 mL (32.2 mmol,

1.0 Äquiv.) Triethylamin und 3.46 mL (29.0 mmol, 0.9 Äquiv.) Valeroylchlorid in 30 mL abs.

Tetrahydrofuran versetzt und 2.5 Stunden gerührt. Die wässrige Aufarbeitung erfolgte mit

150 mL Dichlormethan, jeweils 70 mL gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und


203

70 mL demineralisiertem Wasser. Das Rohprodukt wurde säulenchromatographisch an


Ausbeute: Es wurden 4.08 g (19.6 mmol, 68%) eines farblosen Öls

erhalten. Summenformel: C12H16O3 Molekulargewicht: 208.26 g/mol

DC: Rf = 0.05 (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v).

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): [ppm] = 7.34 (d, 3JH,H = 8.4 Hz, 2H, H-3), 7.05 (d, 3JH,H =

8.4 Hz, 2H, H-2), 5.20 (t, 3JH,H = 5.8 Hz, 1H, OH), 4.48 (d, 3JH,H = 5.8 Hz, 2H, -CH2-Ph), 2.56

(t, 3JH,H = 7.4 Hz, 2H, H-b), 1.67-1.57 (m, 2H, H-c), 1.44-1.32 (m, 2H, H-d), 0.92 (t, 3JH,H = 7.4

Hz, 3H, H-e).


121.3 (C-2), 62.3 (-CH2-Ph), 33.2 (C-b), 26.4 (C-c), 21.5 (C-d), 13.6 (C-e).


IR: �̃� [cm-1] = 3361, 2959, 2933, 2873, 1755, 1507, 1198, 1164, 1143, 1101, 1015.

Synthese von 4-(Hydroxymethyl)-phenyldecanoat 139


1.0 Äquiv.) 4-Hydroxybenzylalkohol in 50 mL abs. Tetrahydrofuran mit 4.53 mL (32.2 mmol,

1.0 Äquiv.) Triethylamin und 6.74 mL (32.2 mmol, 1.0 Äquiv.) Decanoylchlorid in 30 mL abs.

Tetrahydrofuran versetzt und 2.5 Stunden gerührt. Die wässrige Aufarbeitung erfolgte mit

200 mL Dichlormethan, jeweils 100 mL gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und

100 mL demineralisiertem Wasser. Das Rohprodukt wurde säulenchromatographisch an



farblosen Feststoffs erhalten. Summenformel: C17H26O3





(t, 3JH,H = 7.5 Hz, 2H, H-b), 1.67-1.58 (m, 2H, H-c), 1.38-1.20 (m, 12H, H-d, H-e, H-f, H-g, H-

h, H-i), 0.86 (t, 3JH,H = 7.0 Hz, 3H, H-j).


121.3 (C-2), 62.3 (-CH2-Ph), 33.4 (C-b), 31.2, 28.8, 28.7, 28.6, 28.4, 22.1 (C-d, C-e, C-f,

C-g, C-h, C-i), 24.3 (C-c), 13.9 (C-j).


204


301.1643.

IR: �̃� [cm-1] = 3326, 2955, 2917, 2849, 1748, 1508, 1383, 1250, 1214, 1148, 1013, 925, 848.

Synthese von 4-(Hydroxymethyl)-phenylpentadecanoat 147

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 5.00 g (20.6 mmol, 0.9 Äquiv.) Pentadecansäure in

100 mL abs. Dichlormethan gelöst. Bei 0 °C wurden 2.12 mL (24.8 mmol, 1.2 Äquiv.)

Oxalylchlorid und 3 Tropfen abs. N,N-Dimethylformamid zugegeben und eine Stunde bei

0 °C und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel

unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur entfernt. Der Rückstand wurde in 21 mL abs.

Tetrahydrofuran aufgenommen und bei 0 °C langsam zu einer Lösung aus 2.84 g

(22.9 mmol, 1.0 Äquiv.) 4-Hydroxybenzylalkohol und 3.22 mL (22.9 mmol, 1.0 Äquiv.)

Triethylamin in 35 mL abs. Tetrahydrofuran getropft. Es wurde 2.5 Stunden bei

Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch filtriert und das Lösungsmittel

unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 150 mL Dichlormethan

aufgenommen und zweimal mit 80 mL gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und

einmal mit 80 mL demineralisiertem Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über

Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt.

Das Rohprodukt wurde säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 0-

10% Vol.).

Ausbeute: Es wurden 4.39 g (12.6 mmol,

61%) eines farblosen Feststoffes erhalten.

Summenformel: C22H36O3


0.06 (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v).




h, H-i, H-j, H-k, H-l, H-m, H-n), 0.85 (t, 3JH,H = 6.8 Hz, 3H, H-o).


121.3 (C-2), 62.3 (-CH2-Ph), 33.4 (C-b), 31.3, 29.0, 29.0, 28.9, 28.8, 28.7, 28.6, 28.4, 22.1

(C-d, C-e, C-f, C-g, C-h, C-i, C-j, C-k, C-l, C-m, C-n), 24.3 (C-c), 13.9 (C-o).


371.2548.

IR: �̃� [cm-1] = 3327, 2954, 2914, 2848, 1747, 1509, 1463, 1221, 1151, 1015, 719.


205

Synthese von 4-(Hydroxymethyl)-phenyloctadecanoat 152

Es wurden 4.00 g (32.2 mmol, 1.0 Äquiv.) 4-Hydroxybenzylalkohol in 50 mL Dichlormethan

suspendiert und bei 0 °C 4.53 mL (32.2 mmol, 1.0 Äquiv.) Triethylamin zugegeben.

Anschließend wurden langsam 9.76 mL (29.0 mmol, 0.9 Äquiv.) Octadecanoylchlorid in

30 mL Dichlormethan zur Reaktionslösung getropft. Es wurde 3 Tage bei Raumtemperatur

gerührt. Die Reaktionslösung wurde in 200 mL Dichlormethan aufgenommen und zweimal

mit 100 mL gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und einmal mit 100 mL

demineralisiertem Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat

getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das

Rohprodukt wurde säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (CH2Cl2/MeOH 0-10%

Vol.).




C25H42O3 Molekulargewicht:

390.61 g/mol DC: Rf = 0.10





h, H-i, H-j, H-k, H-l, H-m, H-n, H-o, H-p, H-q), 0.85 (t, 3JH,H = 7.0 Hz, 3H, H-r).


121.3 (C-2), 62.3 (-CH2-Ph), 33.4 (C-b), 31.3, 29.0, 28.9, 28.8, 28.7, 28.6, 28.4, 22.1 (C-d,

C-e, C-f, C-g, C-h, C-i, C-j, C-k, C-l, C-m, C-n, C-o, C-p, C-q), 24.3 (C-c), 13.9 (C-r).


IR: �̃� [cm-1] = 3360, 2914, 2848, 1747, 1510, 1463, 1218, 1151, 1016, 719.

Synthese von Bis(4-decanoyloxybenzyl)-N,N-diisopropylaminophosphoramidit 140

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 348 mg (1.63 mmol, 1.0 Äquiv.) Dichloro-N,N-

diisopropylphosphoramidit 136 in 5 mL abs. Tetrahydrofuran gelöst. Anschließend wurden

bei 0 °C langsam 1.00 g (3.59 mmol, 2.2 Äquiv.) 4-(Hydroxymethyl)-phenyldecanoat 139 und

0.53 mL (3.76 mmol, 2.3 Äquiv.) Triethylamin in 7 mL abs. Tetrahydrofuran zur

Reaktionslösung getropft. Es wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und danach

unter Inertgas filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur zur


206

Trockne eingeengt. Das Rohprodukt wurde am Chromatotron an Kieselgel gereinigt (PE/Et3N

9:1 v/v).


farblosen Öls erhalten. Summenformel: C40H64NO6P

Molekulargewicht: 685.93 g/mol DC: Rf = 0.78 (PE/Et3N

9:1 v/v).

1H-NMR (600 MHz, CDCl3): [ppm] = 7.35 (d, 3JH,H = 8.3

Hz, 4H, H-2), 7.03 (d, 3JH,H = 8.3 Hz, 4H, H-3), 4.74 (dd,

2JH,H = 12.7 Hz, 3JH,P = 8.1 Hz, 2H, -CH2-Ph-a), 4.67 (dd,

2JH,H = 12.7 Hz, 3JH,P = 8.6 Hz, 2H, -CH2-Ph-b), 3.74-3.63

(m, 2H, iPr-CH), 2.54 (t, 3JH,H = 7.5 Hz, 4H, H-b), 1.75 (quint, 3JH,H = 7.5 Hz, 4H, H-c), 1.44-

1.37 (m, 4H, H-d), 1.37-1.23 (m, 20H, H-e, H-f, H-g, H-h, H-i), 1.20 (d, 3JH,H = 6.7 Hz, 12H,

iPr-CH3), 0.88 (t, 3JH,H = 7.0 Hz, 6H, H-j).

13C-NMR (151 MHz, CDCl3): [ppm] = 172.5 (C-a), 150.0 (C-4), 137.1 (d, 3JC,P = 7.5 Hz,

C-1), 128.1 (C-2), 121.5 (C-3), 65.0 (d, 2JC,P = 17.4 Hz, -CH2-Ph), 43.3 (d, 2JC,P = 13.3 Hz,

iPr-CH), 34.6 (C-b), 32.0, 29.6, 29.4, 29.3, 22.8 (C-d, H-e, C-f, C-g, C-h, C-i), 25.1 (C-c),

24.8 (d, 3JC,P = 7.1 Hz, iPr-CH3), 14.3 (C-j).

31P-NMR (243 MHz, CDCl3): [ppm] = 147.88.


IR: �̃� [cm-1] = 2961, 2924, 2854, 1759, 1507, 1460, 1364, 1197, 1164, 1137, 1106, 1026,

1005, 801.

Synthese von 4-Pentanoyloxybenzylbis(N,N-diisopropylamino)-phosphoramidit 149

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 805 mg (3.02 mmol, 1.2 Äquiv.) Chlorobis(N,N-

diisopropylamino)-phosphoramidit 142 in 20 mL abs. Diethylether gelöst. Anschließend

wurden bei 0 °C langsam 500 mg (2.40 mmol, 1.0 Äquiv.) 4-(Hydroxymethyl)-

phenylpentanoat 143 und 0.47 mL (0.34 g, 3.4 mmol, 1.4 Äquiv.) Triethylamin in 8 mL abs.

Diethylether zur Reaktionslösung getropft. Es wurde 15 Stunden bei Raumtemperatur

gerührt und danach unter Inertgas filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei

Raumtemperatur zur Trockne eingeengt. Das Rohprodukt wurde am Chromatotron an

Kieselgel gereinigt (PE/Et3N 9:1 v/v).


farblosen Öls erhalten. Summenformel: C24H43N2O3P


207

Molekulargewicht: 438.59 g/mol DC: Rf = 0.55 (PE/Et3N 9:1 v/v).

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): [ppm] = 7.36 (d, 3JH,H = 8.2 Hz, 2H, H-2), 7.03 (d, 3JH,H =

8.2 Hz, 2H, H-3), 4.63 (d, 3JH,P = 7.3 Hz, 2H, -CH2-Ph), 3.65-3.48 (m, 4H, iPr-CH), 2.55 (t,

3JH,H = 7.6 Hz, 2H, H-b), 1.74 (quint, 3JH,H = 7.6 Hz, 2H, H-c), 1.45 (sext, 3JH,H = 7.6 Hz, 2H,

H-d), 1.18 (d, 3JH,H = 6.7 Hz, 12H, iPr-CH3-a), 1.17 (d, 3JH,H = 6.7 Hz, 12H, iPr-CH3-b), 0.97

(t, 3JH,H = 7.6 Hz, 3H, H-e).

13C-NMR (101 MHz, CDCl3): [ppm] = 172.3* (C-a), 149.9* (C-4), 137.8* (C-1), 127.9 (C-2),

121.5 (C-3), 65.8 (d, 2JC,P = 23.2 Hz, -CH2-Ph), 44.7 (d, 2JC,P = 12.5 Hz, iPr-CH), 34.3 (C-b),

27.2 (C-c), 24.8 (d, 3JC,P = 8.0 Hz, iPr-CH3-a), 24.0 (d, 3JC,P = 5.7 Hz, iPr-CH3-b), 22.4 (C-d),

13.9 (C-e). *aus dem HMBC bestimmt

31P-NMR (162 MHz, CDCl3): [ppm] = 123.51.

Synthese von (4-Pentadecanoyloxybenzyl)-(4-pentanoyloxybenzyl)-N,N-diisopropyl-

aminophosphoramidit 148

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 750 mg (1.71 mmol, 1.5 Äquiv.)

4-Pentanoyloxybenzylbis(N,N-diisopropylamino)-phosphoramidit 149 dreimal mit abs.

Acetonitril coevaporiert und in 8.5 mL abs. Acetonitril gelöst. Anschließend wurden bei 0 °C

langsam 397 mg (1.14 mmol, 1.0 Äquiv.) 4-(Hydroxymethyl)-phenylpentadecanoat 147 und

4.56 mL (1.14 mmol, 1.0 Äquiv.) 4,5-Dicyanoimidazol (0.25 M in Acetonitril) in 6.5 mL abs.

Acetonitril und 4 mL abs. Tetrahydrofuran zur Reaktionslösung getropft. Es wurde 5 Stunden

bei Raumtemperatur gerührt und dann das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt.

Der Rückstand wurde in Petrolether und Triethylamin (9:1 v/v) aufgenommen und unter

Inertgas filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur zur

Trockne eingeengt. Das Rohprodukt wurde am Chromatotron an Kieselgel gereinigt (PE/Et3N

9:1 v/v).


83%) eines farblosen Öls erhalten.

Summenformel: C40H64NO6P


0.77 (PE/Et3N 9:1 v/v).

1H-NMR (600 MHz, CDCl3): [ppm] = 7.35 (d,

3JH,H = 8.3 Hz, 4H, H-2, H-2‘), 7.03 (d, 3JH,H =

8.3 Hz, 4H, H-3, H-3‘), 4.74 (dd, 2JH,H =

12.9 Hz, 3JH,P = 8.4 Hz, 2H, -CH2-Ph-a, -CH2-


208

Ph-a‘), 4.67 (dd, 2JH,H = 12.9 Hz, 3JH,P = 8.7 Hz, 2H, -CH2-Ph-b, -CH2-Ph-b‘), 3.74-3.63 (m,

2H, iPr-CH), 2.57-2.52 (m, 4H, H-b, H-b‘), 1.78-1.71 (m, 4H, H-c, H-c‘), 1.45 (sext, 3JH,H =

7.6 Hz, 2H, H-d), 1.42-1.37 (m, 2H, H-d‘), 1.37-1.23 (m, 20H, H-e‘, H-f‘, H-g‘, H-h‘, H-i‘, H-j‘,

H-k‘, H-l‘, H-m‘, H-n‘), 1.20 (d, 3JH,H = 6.8 Hz, 12H, iPr-CH3), 0.97 (t, 3JH,H = 7.4 Hz, 3H, H-e),

0.88 (t, 3JH,H = 7.0 Hz, 3H, H-o‘).

13C-NMR (151 MHz, CDCl3): [ppm] = 172.5, 172.5 (C-a, C-a‘), 150.0 (C-4, C-4‘), 137.1 (d,

3JC,P = 7.4 Hz, C-1, C-1‘), 128.1 (C-2, C-2‘), 121.5 (C-3, C-3‘), 65.0 (d, 2JC,P = 17.7 Hz, -CH2-

Ph, -CH2-Ph‘), 43.3 (d, 2JC,P = 13.1 Hz, iPr-CH), 34.6, 34.3 (C-b, C-b‘), 32.1, 29.8, 29.8,

29.8, 29.8, 29.7, 29.5, 29.4, 29.3, 22.8 (C-d‘, H-e‘, C-f‘, C-g‘, C-h‘, C-i‘, C-j‘, C-k‘, C-l‘, C-m‘,

C-n‘), 27.2 (C-c), 25.1 (C-c‘), 24.8 (d, 3JC,P = 7.2 Hz, iPr-CH3), 22.4 (C-d), 14.3 (C-o‘), 13.9

(C-e).

31P-NMR (243 MHz, CDCl3): [ppm] = 147.89.

HRMS (ESI+): m/z = [M+H]+ ber.: 686.4544, gef.: 687.4213, [M+K]+ ber.: 724.4103, gef.:

724.5727.

IR: �̃� [cm-1] = 2962, 2924, 2854, 1759, 1507, 1460, 1364, 1198, 1164, 1138, 1006, 973, 756.

Synthese von (9H-Fluoren-9-ylmethyl)-(4-octadecanoyloxybenzyl)-N,N-

diisopropylaminophosphoramidit 150

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 411 mg (1.54 mmol, 1.2 Äquiv.) Chlorobis(N,N-

diisopropylamino)-phosphoramidit 142 in 10 mL abs. Diethylether gelöst. Anschließend

wurden bei 0 °C langsam 500 mg (1.28 mmol, 1.0 Äquiv.) 4-(Hydroxymethyl)-

phenyloctadecanoat 152 und 0.25 mL (1.8 mmol, 1.4 Äquiv.) Triethylamin in 5 mL abs.

Diethylether und 4 mL abs. Tetrahydrofuran zur Reaktionslösung getropft. Es wurde

16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und danach unter Inertgas filtriert. Das Filtrat wurde

unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur zur Trockne eingeengt. Das Rohprodukt

wurde am Chromatotron an Kieselgel gereinigt (PE/Et3N 9:1 v/v).

Die erhaltenen 677 mg (1.09 mmol, 1.5 Äquiv.) 4-Octadecanoyloxybenzylbis(N,N-

diisopropyl)-phosphoramidit 153 wurden unter Stickstoff als Inertgas dreimal mit abs.

Dichlormethan coevaporiert und in 5 mL abs. Dichlormethan gelöst. Anschließend wurden

bei 0 °C langsam 143 mg (0.727 mmol, 1.0 Äquiv.) 9-Fluorenylmethanol und 2.92 mL

(0.727 mmol, 1.0 Äquiv.) 4,5-Dicyanoimidazol (0.25 M in Acetonitril) in 4 mL abs.

Dichlormethan zur Reaktionslösung getropft. Es wurde 1.5 Stunden bei Raumtemperatur

gerührt und dann das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand

wurde in Petrolether und Triethylamin (9:1 v/v) aufgenommen und unter Inertgas filtriert. Das

Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur zur Trockne eingeengt. Das

Rohprodukt wurde in Petrolether gelöst und mittels automatisierter Säulenchromatographie

an Kieselgel gereinigt (PE/EE 0-5% Vol., 1% Et3N).


209



Öls erhalten. Summenformel:

C45H66NO4P Molekulargewicht:

716.00 g/mol.

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): [ppm] =

7.78-7.72 (m, 2H, H-1‘, H-8‘), 7.68-

7.59 (m, 2H, H-4‘, H-5‘), 7.41-7.36

(m, 2H, H-2‘, H-7‘), 7.34 (d, 3JH,H = 8.3 Hz, 2H, H-3), 7.31-7.27 (m, 2H, H-3‘, H-6‘), 7.03 (d,

3JH,H = 8.3 Hz, 2H, H-2), 4.74-4.59 (m, 2H, -CH2-Ph), 4.20 (dd, 3JH,H = 7.0 Hz, 3JH,H = 7.0 Hz,

1H, H-9‘), 4.03 (dt, 2JH,H = 9.8 Hz, 3JH,P = 6.7 Hz, 1H, -CH2-a-Fm), 3.83 (dt, 2JH,H = 9.8 Hz,

3JH,P = 7.3 Hz, 1H, -CH2-b-Fm), 3.73-3.61 (m, 2H, iPr-CH), 2.54 (t, 3JH,H = 7.4 Hz, 2H, H-b),

1.75 (quint, 3JH,H = 7.5 Hz, 2H, H-c), 1.45-1.22 (m, 28H, H-d, H-e, H-f, H-g, H-h, H-i, H-j, H-k,

H-l, H-m, H-n, H-o, H-p, H-q), 1.19 (d, 3JH,H = 6.9 Hz, 6H, iPr-CH3-a), 1.16 (d, 3JH,H = 6.9 Hz,

6H, iPr-CH3-b), 0.88 (t, 3JH,H = 6.9 Hz, 3H, H-r).

13C-NMR (151 MHz, CDCl3): [ppm] = 172.5 (C-a), 150.1 (C-4), 145.1, 144.8 (C-8a‘, C-9a‘),

141.5, 141.4 (C-4a‘, C-4b‘), 137.2 (d, 3JH,H = 7.1 Hz, C-1), 128.1 (C-3), 127.6, 127.5 (C-2‘, C-

7‘), 127.0, 126.9 (C-3‘, C-6‘), 125.6, 125.3 (C-4‘, C-5‘), 121.5 (C-2), 120.0, 119.9 (C-1‘, C-

8‘), 66.2 (d, 2JC,P = 16.3 Hz, -CH2-Fm), 64.9 (d, 2JC,P = 18.7 Hz, -CH2-Ph), 49.3 (d, 3JC,P = 7.8

Hz, C-9‘), 43.2 (d, 2JC,P = 12.5 Hz, iPr-CH), 34.6 (C-b), 32.1, 29.8, 29.8, 29.6, 29.5, 29.4,

29.3, 22.8 (C-d, C-e, C-f, C-g, C-h, C-i, C-j, C-k, C-l, C-m, C-n, C-o, C-p, C-q), 25.1 (C-c),

24.8 (d, 3JC,P = 7.3 Hz, iPr-CH3-a), 24.7 (d, 3JC,P = 7.3 Hz, iPr-CH3-b), 14.3 (C-r).

31P-NMR (202 MHz, CDCl3): [ppm] = 148.42.

HRMS (ESI+): m/z = [M+H]+ ber.: 716.4802, gef.: 716.5061, [M+K]+ ber.: 754.4361, gef.:

754.5209.

IR: �̃� [cm-1] = 2963, 2922, 2852, 1761, 1507, 1451, 1363, 1198, 1007, 973, 737.

Synthese von Bis(4-decanoyloxybenzyl)-phosphonat 168

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 500 mg (1.80 mmol, 2.2 Äquiv.) 4-(Hydroxymethyl)-

phenyldecanoat 139 dreimal mit abs. Pyridin coevaporiert und in 5 mL abs. Pyridin gelöst.

Bei Raumtemperatur wurden 0.16 mL (0.19 g, 0.82 mmol, 1.0 Äquiv.) Diphenylphosphit

zugetropft und 2.5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das

Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde aus Methanol

umkristallisiert.


210


farblosen Feststoffs erhalten. Summenformel: C34H51O7P

Molekulargewicht: 602.75 g/mol DC: Rf = 0.44 (PE/EE 2:1

v/v).

1H-NMR (600 MHz, CDCl3): [ppm] = 7.36 (d, 3JH,H = 8.7 Hz,

4H, H-2), 7.08 (d, 3JH,H = 8.7 Hz, 4H, H-3), 6.93 (d, 1JH,P =

708.3 Hz, 1H, H-P), 5.06 (dd, 2JH,H = 11.8 Hz, 3JH,P = 9.9 Hz,

2H, -CH2-Ph-a), 5.01 (dd, 2JH,H = 11.8 Hz, 3JH,P = 9.5 Hz, 2H, -CH2-Ph-b), 2.55 (t, 3JH,H =

7.6 Hz, 4H, H-b), 1.75 (quint, 3JH,H = 7.6 Hz, 4H, H-c), 1.44-1.37 (m, 4H, H-d), 1.37-1.22 (m,

20H, H-e, H-f, H-g, H-h, H-i), 0.88 (t, 3JH,H = 7.0 Hz, 6H, H-j).

13C-NMR (151 MHz, CDCl3): [ppm] = 172.3 (C-a), 151.1 (C-4), 133.1 (d, 3JC,P = 6.0 Hz,

C-1), 129.4 (C-2), 122.1 (C-3), 66.8 (d, 2JC,P = 5.5 Hz, -CH2-Ph), 34.5 (C-b), 32.0, 29.6, 29.4,

29.2, 22.8 (C-d, H-e, C-f, C-g, C-h, C-i), 25.0 (C-c), 14.2 (C-j).

31P-NMR (243 MHz, CDCl3): [ppm] = 7.71.

HRMS (ESI+): m/z = [M+H]+ ber.: 603.3445, gef.: 603.3195, [M+NH4]+ ber.: 620.3711, gef.:

620.3458, [M+Na]+ ber.: 625.3265, gef.: 625.2996.

IR: �̃� [cm-1] = 2917, 2849, 1756, 1748, 1250, 1218, 1149, 1060, 997, 834.

Synthese von (4-Pentadecanoyloxybenzyl)-(4-pentanoyloxybenzyl)-phosphonat 157

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 500 mg (2.40 mmol, 1.0 Äquiv.) 4-(Hydroxymethyl)-

phenylpentanoat 143 und 837 mg (2.40 mmol, 1.0 Äquiv.) 4-(Hydroxymethyl)-

phenylpentadecanoat 147 jeweils dreimal mit abs. Pyridin coevaporiert. Dann wurden

0.46 mL (0.56 g, 2.4 mmol, 1.0 Äquiv.) Diphenylphosphit in 5 mL abs. Pyridin gelöst und

bei -30 °C 4-(Hydroxymethyl)-phenylpentanoat 143 in 5 mL abs. Pyridin langsam zugetropft.

Die Reaktionslösung wurde innerhalb von 15 Minuten auf Raumtemperatur erwärmt.

Anschließend wurde wieder auf -30 °C gekühlt und langsam 4-(Hydroxymethyl)-

phenylpentadecanoat 147 in 5 mL abs. Pyridin zugetropft und 2 Stunden bei

Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck

entfernt und der Rückstand zweimal mit Toluol und zweimal mit Dichlormethan coevaporiert.

Das Rohprodukt wurde mittels automatisierter Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt

(PE/EE 1:1 v/v, 0.5% Essigsäure).


211


22%) eines farblosen Feststoffs erhalten.

Summenformel: C34H51O7P


0.46 (PE/EE 2:1 v/v).

1H-NMR (600 MHz, CDCl3): [ppm] = 7.36

(d, 3JH,H = 8.5 Hz, 4H, H-2, H-2‘), 7.08 (d,

3JH,H = 8.5 Hz, 4H, H-3, H-3‘), 6.93 (d, 1JH,P

= 708.5 Hz, 1H, H-P), 5.09-4.98 (m, 4H, -CH2-Ph, -CH2-Ph‘), 2.58-2.52 (m, 4H, H-b, H-b‘),

1.78-1.71 (m, 4H, H-c, H-c‘), 1.45 (sext, 3JH,H = 7.5 Hz, 2H, H-d), 1.42-1.37 (m, 2H, H-d‘),

1.37-1.21 (m, 20H, H-e‘, H-f‘, H-g‘, H-h‘, H-i‘, H-j‘, H-k‘, H-l‘, H-m‘, H-n‘), 0.97 (t, 3JH,H =

7.5 Hz, 3H, H-e), 0.88 (t, 3JH,H = 7.0 Hz, 3H, H-o‘).

13C-NMR (151 MHz, CDCl3): [ppm] = 172.3, 172.3 (C-a, C-a‘), 151.1 (C-4, C-4‘), 133.1 (d,

3JC,P = 6.1 Hz, C-1, C-1‘), 129.4 (C-2, C-2‘), 122.1 (C-3, C-3‘), 66.8 (d, 2JC,P = 6.3 Hz, -CH2-

Ph, -CH2-Ph‘), 34.5, 34.2 (C-b, C-b‘), 32.1, 29.8, 29.8, 29.8, 29.7, 29.6, 29.4, 29.3, 22.8

(C-d‘, H-e‘, C-f‘, C-g‘, C-h‘, C-i‘, C-j‘, C-k‘, C-l‘, C-m‘, C-n‘), 27.1, 25.1 (C-c, C-c‘), 22.4

(C-d), 14.3 (C-o‘), 13.9 (C-e).

31P-NMR (162 MHz, CDCl3): [ppm] = 7.72.

HRMS (ESI+): m/z = [M+H]+ ber.: 603.3445, gef.: 603.3387, [M+NH4]+ ber.: 620.3711, gef.:

620.3664, [M+Na]+ ber.: 625.3265, gef.: 625.3213.

IR: �̃� [cm-1] = 2956, 2915, 2849, 1748, 1511, 1220, 1151, 1062, 997, 834.

Synthese von P,P-Bis(4-decanoyloxybenzyl)-pyrophosphat als Tetra-n-

butylammoniumsalz 167


1.0 Äquiv.) Bis(4-decanoyloxybenzyl)-phosphonat 168 in 4.5 mL abs. Acetonitril mit 59 mg

(0.44 mmol, 2.0 Äquiv.) N-Chlorsuccinimid versetzt und eine Stunde gerührt. Ausgefallenes

Edukt wurde durch erneutes Erwärmen wieder gelöst. Nach Zugabe von 1.25 mL

(0.538 mmol, 2.5 Äquiv.) Tetra-n-butylammoniumphosphat (0.4 M in Acetonitril) wurde

1.5 Stunden gerührt. Die wässrige Aufarbeitung erfolgte mit 20 mL Dichlormethan, 20 mL

gesättigter Ammoniumacetat-Lösung (1 M) und 20 mL demineralisiertem Wasser.

Ausbeute: Es wurden 106 mg (113 µmol, 52%) eines leicht verunreinigten farblosen Öls

erhalten. Die Anzahl der Tetra-n-butylammoniumionen wurde anhand des 1H-NMR-


212

Spektrums bestimmt und bei dem


Summenformel: C34H51O11P2-

Molekulargewicht: 940.19 g/mol.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): [ppm] = 7.41-

7.30 (m, 4H, H-2), 7.01-6.92 (m, 4H, H-3),

5.18-5.10 (m, 4H, -CH2-Ph), 3.29-3.12 (m,

8H, H-A), 2.51 (t, 3JH,H = 7.3 Hz, 4H, H-b),

1.72 (quint, 3JH,H = 7.3 Hz, 4H, H-c), 1.64-1.51 (m, 8H, H-B), 1.44-1.20 (m, 32H, H-d, H-e, H-

f, H-g, H-h, H-i, H-C), 0.93 (t, 3JH,H = 7.2 Hz, 12H, H-D), 0.87 (t, 3JH,H = 7.1 Hz, 6H, H-j).

31P-NMR (162 MHz, CDCl3): [ppm] = -9.9 (d, 2JP,P = 20.3 Hz, P-α), -13.3 (d, 2JP,P = 20.3 Hz,

P-β).

Synthese von P-(4-Pentadecanoyloxybenzyl)-P-(4-pentanoyloxybenzyl)-pyrophosphat

als Tetra-n-butylammoniumsalz 159


1.0 Äquiv.) (4-Pentadecanoyloxybenzyl)-(4-pentanoyloxybenzyl)-phosphonat 157 in 4 mL

abs. Acetonitril mit 67 mg (0.50 mmol, 2.0 Äquiv.) N-Chlorsuccinimid versetzt und

eine Stunde gerührt. Nach Zugabe von 310 mg (0.625 mmol, 2.5 Äquiv.) Tetra-n-

butylammoniumphosphat in 8 mL abs. Acetonitril wurde 2 Stunden gerührt. Die wässrige

Aufarbeitung erfolgte mit 20 mL Dichlormethan, 20 mL gesättigter Ammoniumacetat-Lösung

(1 M) und 20 mL demineralisiertem Wasser.


88%) eines leicht verunreinigten

gelblichen Öls erhalten. Die Anzahl der

Tetra-n-butylammoniumionen wurde

anhand des 1H-NMR-Spektrums bestimmt

und bei dem Molekulargewicht

berücksichtigt. Summenformel:

C34H51O11P2- Molekulargewicht:

940.19 g/mol.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): [ppm] = 7.42-7.29 (m, 4H, H-2, H-2‘), 7.04-6.93 (m, 4H, H-3,

H-3‘), 5.20-5.10 (m, 4H, -CH2-Ph, -CH2-Ph‘), 3.35-3.17 (m, 8H, H-A), 2.59-2.48 (m, 4H, H-b,

H-b‘), 1.80-1.68 (m, 4H, H-c, H-c‘), 1.68-1.52 (m, 8H, H-B), 1.49-1.17 (m, 32H, H-d, H-d‘, H-


213

e‘, H-f‘, H-g‘, H-h‘, H-i‘, H-j‘, H-k‘, H-l‘, H-m‘, H-n‘, H-C), 0.97 (t, 3JH,H = 7.4 Hz, 15H, H-e, H-

D), 0.88 (t, 3JH,H = 7.0 Hz, 3H, H-o‘).

Synthese von β-Bis(4-decanoyloxybenzyl)-3-(2‘,3‘-didesoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-

propyl-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on-5’-diphosphat als Ammoniumsalz 94


1.0 Äquiv.) 3-(2‘,3‘-Didesoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-propyl-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-

on-5’-monophosphat als Triethylammoniumsalz (6-Prop-ddBCNAMP) 128 in 3 mL abs.

Acetonitril mit 122 mg (0.178 mmol, 1.5 Äquiv.) Bis(4-decanoyloxybenzyl)-N,N-diisopropyl-

aminophosphoramidit 140 und 0.71 mL (0.18 mmol, 1.5 Äquiv.) 4,5-Dicyanoimidazol (0.25 M

in Acetonitril) versetzt. Nach 5 Minuten wurden 0.03 mL (0.2 mmol, 1.5 Äquiv.) tert-

Butylhydroperoxid (5.5 M in n-Decan) zugegeben und erneut 40 Minuten gerührt.

Bedingungen der Säulenchromatographie: H2O/MeCN, 5-80% Vol., 0-40 min, Flussrate

20 mL/min.


(0.10 mmol, 85%) einer

hygroskopischen, farblosen Watte

erhalten. Es wurde ein

Ammoniumgegenion angenommen und

bei dem Molekulargewicht


C48H67N2O14P2- Molekulargewicht:

976.05 g/mol RP-HPLC: tR= 18.80 min

(Methode D).

1H-NMR (600 MHz, MeOD): [ppm] = 8.91 (s, 1H, H-4), 7.37 (d, 3JH,H = 8.3 Hz, 2H, H-2‘‘a),

7.36 (d, 3JH,H = 8.3 Hz, 2H, H-2‘‘b), 7.02 (d, 3JH,H = 8.6 Hz, 2H, H-3‘‘a), 7.01 (d, 3JH,H =

8.6 Hz, 2H, H-3‘‘b), 6.47 (s, 1H, H-5), 6.10 (dd, 3JH,H = 6.6 Hz, 3JH,H = 2.2 Hz, 1H, H-1’), 5.12

(d, 3JH,P = 8.5 Hz, 4H, -CH2-Ph), 4.44-4.39 (m, 1H, H-5’a), 4.37-4.31 (m, 1H, H-4‘), 4.18-4.12

(m, 1H, H-5’b), 2.61 (t, 3JH,H = 7.3 Hz, 2H, H-a), 2.56 (t, 3JH,H = 7.3 Hz, 4H, H-b‘), 2.54-2.46

(m, 1H, H-2’a), 2.13-2.07 (m, 1H, H-2’b), 1.94-1.88 (m, 2H, H-3’), 1.76-1.65 (m, 6H, H-c‘, H-

b), 1.46-1.25 (m, 24H, H-d‘, H-e‘, H-f‘, H-g‘, H-h‘, H-i‘), 0.98 (t, 3JH,H = 7.3 Hz, 3H, H-c), 0.91

(t, 3JH,H = 7.3 Hz, 6H, H-j‘).

13C-NMR (151 MHz, MeOD): [ppm] = 173.6 (C-a’), 172.9 (C-7a), 160.4 (C-6), 156.9 (C-2),

152.4 (C-4’’), 138.9 (C-4), 134.8 (d, 3JC,P = 6.7 Hz, C-1’’), 134.8 (d, 3JC,P = 6.7 Hz, C-1’’),

130.4 (C-2’’), 122.9, 122.8 (C-3’’), 109.4 (C-4a), 101.6 (C-5), 90.5 (C-1’), 82.9 (d, 3JC,P =


214

9.7 Hz, C-4’), 70.3 (d, 2JC,P = 5.4 Hz, -CH2-Ph), 70.3 (d, 2JC,P = 5.4 Hz, -CH2-Ph‘), 67.3 (d,

2JC,P = 6.1 Hz, C-5’), 35.0 (C-b’), 34.7 (C-2’), 30.9 (C-a), 33.0, 30.6, 30.4, 30.4, 30.2, 23.7

(C-d‘, H-e‘, C-f‘, C-g‘, C-h‘, C-i‘), 26.0 (C-c‘), 24.7 (C-3’), 21.4 (C-b), 14.4 (C-j‘), 13.9 (C-c).

31P-NMR (243 MHz, MeOD): [ppm] = -11.87 (d, 2JP,P = 21.3 Hz, P-α), -12.71 (d, 2JP,P =

21.3 Hz, P-β).


IR: �̃� [cm-1] = 2914, 2849, 2358, 1747, 1665, 1574, 1508, 1471, 1379, 1250, 1216, 1168,

1148, 1065, 1008, 955, 833.

Synthese von β-(4-Pentadecanoyloxybenzyl)-β-(4-pentanoyloxybenzyl)-3-(2‘,3‘-

didesoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-propyl-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on-5’-

diphosphat als Ammoniumsalz 102




Acetonitril mit 168 mg (0.245 mmol, 1.5 Äquiv.) (4-Pentadecanoyloxybenzyl)-(4-pentanoyl-

oxybenzyl)-N,N-diisopropylaminophosphoramidit 148 und 0.98 mL (0.25 mmol, 1.5 Äquiv.)

4,5-Dicyanoimidazol (0.25 M in Acetonitril) versetzt. Nach 5 Minuten wurden 45 µL

(0.25 mmol, 1.5 Äquiv.) tert-Butylhydroperoxid (5.5 M in n-Decan) zugegeben und erneut

40 Minuten gerührt. Bedingungen der Säulenchromatographie: H2O/MeCN, 5-100% Vol., 0-

50 min, Flussrate 20 mL/min.


48%) einer hygroskopischen, farblosen

Watte erhalten. Es wurde ein


bei dem Molekulargewicht berücksichtigt.


Molekulargewicht: 976.05 g/mol RP-

HPLC: tR= 18.91 min (Methode D).

1H-NMR (600 MHz, MeOD): [ppm] = 8.91 (s, 1H, H-4), 7.42-7.35 (m, 4H, H-2‘‘, H-2‘‘‘), 7.02

(d, 3JH,H = 8.5 Hz, 2H, H-3‘‘), 7.01 (d, 3JH,H = 8.5 Hz, 2H, H-3‘‘‘), 6.47 (s, 1H, H-5), 6.10 (dd,

3JH,H = 6.7 Hz, 3JH,H = 2.2 Hz, 1H, H-1’), 5.12 (d, 3JH,P = 8.3 Hz, 4H, -CH2-Ph), 4.44-4.39 (m,

1H, H-5’a), 4.37-4.31 (m, 1H, H-4‘), 4.18-4.12 (m, 1H, H-5’b), 2.61 (t, 3JH,H = 7.4 Hz, 2H,

H-a), 2.59-2.55 (m, 4H, H-b‘, H-b‘‘), 2.55-2.49 (m, 1H, H-2’a), 2.14-2.07 (m, 1H, H-2’b),

1.94-1.88 (m, 2H, H-3’), 1.76-1.65 (m, 6H, H-b, H-c‘, H-c‘‘), 1.49-1.40 (m, 4H, H-d‘, H-d‘‘),


215

1.40-1.23 (m, 20H, H-e‘, H-f‘, H-g‘, H-h‘, H-i‘, H-j‘, H-k‘, H-l‘, H-m‘, H-n‘), 0.99 (t, 3JH,H =

7.4 Hz, 3H, H-e‘), 0.98 (t, 3JH,H = 7.3 Hz, 3H, H-c), 0.90 (t, 3JH,H = 7.3 Hz, 3H, H-o‘‘).

13C-NMR (151 MHz, MeOD): [ppm] = 173.6, 173.6 (C-a’, C-a‘‘), 172.9 (C-7a), 160.4 (C-6),

156.9 (C-2), 152.4 (C-4’’, C-4‘‘‘), 138.9 (C-4), 134.8 (d, 3JC,P = 7.2 Hz, C-1’’), 134.8 (d, 3JC,P =

7.2 Hz, C-1‘‘‘), 130.4 (C-2’’, C-2‘‘‘), 122.9, 122.8 (C-3‘‘, C-3‘‘‘), 109.4 (C-4a), 101.6 (C-5),

90.5 (C-1’), 82.9 (d, 3JC,P = 9.0 Hz, C-4’), 70.3 (d, 2JC,P = 4.7 Hz, -CH2-Ph), 70.3 (d, 2JC,P =

4.7 Hz, -CH2-Ph‘), 67.3 (d, 2JC,P = 6.2 Hz, C-5’), 35.0, 34.7 (C-b’, C-b‘‘), 34.7 (C-2’), 30.9 (C-

a), 33.1, 30.9, 30.8, 30.8, 30.8, 30.7, 30.6, 30.5, 30.4, 30.2, 23.7, 23.2 (C-d‘, C-d‘‘, H-e‘‘, C-

f‘‘, C-g‘‘, C-h‘‘, C-i‘‘, C-j‘‘, C-k‘‘, C-l‘‘, C-m‘‘, C-n‘‘), 28.1 (C-c‘), 25.9 (C-c‘‘), 24.7 (C-3’),

21.4 (C-b), 14.4 (C-o‘‘), 14.1 (C-e‘), 13.9 (C-c).


20.5 Hz, P-β).


IR: �̃� [cm-1] = 2923, 2853, 1757, 1668, 1573, 1509, 1463, 1381, 1257, 1201, 1140, 1008,

959, 783, 505.

Synthese von β-(4-Octadecanoyloxybenzyl)-3-(2‘,3‘-didesoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-

propyl-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on-5’-diphosphat als Ammoniumsalz 103




Acetonitril mit 157 mg (0.219 mmol, 1.75 Äquiv.) (9H-Fluoren-9-ylmethyl)-(4-octadecanoyl-

oxybenzyl)-N,N-diisopropylaminophosphoramidit 150 in 1.5 mL abs. Dichlormethan und

0.75 mL (0.19 mmol, 1.5 Äquiv.) 4,5-Dicyanoimidazol (0.25 M in Acetonitril) versetzt. Nach

5 Minuten wurden 0.04 mL (0.2 mmol, 1.75 Äquiv.) tert-Butylhydroperoxid (5.5 M in n-Decan)

zugegeben und erneut 10 Minuten gerührt. In 5 mL abs. Acetonitril wurden 0.25 mL

Triethylamin zugetropft und

10 Minuten gerührt. Bedingungen der

Säulenchromatographie: H2O/MeCN,

5-100% Vol., 0-40 min, Flussrate

20 mL/min.


(50 µmol, 40%) einer


erhalten. Es wurden zwei

Ammoniumgegenion angenommen


216

und bei dem Molekulargewicht berücksichtigt. Summenformel: C39H58N2O12P22-

Molekulargewicht: 844.91 g/mol RP-HPLC: tR= 15.68 min (Methode D).

1H-NMR (600 MHz, MeOD): [ppm] = 8.98 (s, 1H, H-4), 7.42 (d, 3JH,H = 8.5 Hz, 2H, H-2‘‘),

6.96 (d, 3JH,H = 8.5 Hz, 2H, H-3‘‘), 6.56 (s, 1H, H-5), 6.10 (dd, 3JH,H = 6.6 Hz, 3JH,H = 2.3 Hz,

1H, H-1’), 5.06 (d, 3JH,P = 5.8 Hz, 2H, -CH2-Ph), 4.47-4.41 (m, 1H, H-5’a), 4.39-4.34 (m, 1H,

H-4‘), 4.23-4.18 (m, 1H, H-5’b), 2.62 (t, 3JH,H = 7.4 Hz, 2H, H-a), 2.55 (t, 3JH,H = 7.5 Hz, 2H,

H-b‘), 2.53-2.49 (m, 1H, H-2’a), 2.16-2.08 (m, 1H, H-2’b), 2.00-1.91 (m, 2H, H-3’), 1.75-1.66

(m, 4H, H-b, H-c‘), 1.45-1.23 (m, 28H, H-d‘, H-e‘, H-f‘, H-g‘, H-h‘, H-i‘, H-j‘, H-k‘, H-l‘, H-m‘,

H-n‘, H-o‘, H-p‘, H-q‘), 0.99 (t, 3JH,H = 7.3 Hz, 3H, H-c), 0.90 (t, 3JH,H = 7.3 Hz, 3H, H-r‘).


151.6 (C-4’’), 139.2 (C-4), 137.2* (C-1’’), 129.6 (C-2’’), 122.4 (C-3‘‘), 109.5 (C-4a), 101.9

(C-5), 90.6 (C-1’), 83.2 (d, 3JC,P = 7.5 Hz, C-4’), 68.2 (d, 2JC,P = 5.2 Hz, -CH2-Ph), 67.0 (d,

2JC,P = 5.5 Hz, C-5’), 35.0 (C-b’), 34.7 (C-2’), 30.9 (C-a), 33.1, 30.8, 30.7, 30.6, 30.5, 30.4,

30.2, 23.7 (C-d‘, C-e‘, C-f‘, C-g‘, C-h‘, C-i‘, C-j‘, C-k‘, C-l‘, C-m‘, C-n‘, C-o‘, C-p‘, C-q‘), 26.0

(C-c‘), 24.9 (C-3’), 21.4 (C-b), 14.4 (C-r‘‘), 13.9 (C-c). *aus dem HMBC bestimmt


20.7 Hz, P-β).


IR: �̃� [cm-1] = 2956, 2918, 2850, 2359, 1760, 1668, 1570, 1508, 1380, 1206, 1117, 1058,

940, 783.

Synthese von β-Bis(4-decanoyloxybenzyl)-3-(2’-desoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-(4-n-

pentylphenyl)-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on-5’-diphosphat als Ammoniumsalz

106


1.0 Äquiv.) 3-(2’-Desoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-(4-n-pentylphenyl)-2,3-dihydrofuro[2,3-

d]pyrimidin-2-on-5’-monophosphat als Triethylammoniumsalz 165 in 6 mL abs. Acetonitril mit

82 mg (0.12 mmol, 1.5 Äquiv.) Bis(4-decanoyloxybenzyl)-N,N-diisopropylaminophosphor-

amidit 140 und 0.48 mL (0.12 mmol, 1.5 Äquiv.) 4,5-Dicyanoimidazol (0.25 M in Acetonitril)

versetzt. Nach 20 Minuten wurden 22 µL (0.12 mmol, 1.5 Äquiv.) tert-Butylhydroperoxid

(5.5 M in n-Decan) zugegeben und erneut 10 Minuten gerührt. Vor der

säulenchromatographischen Reinigung wurde der Rückstand in Acetonitril/H2O (1:1 v/v)

aufgenommen und über PR-18-Kieselgel filtriert. Bedingungen der Säulenchromatographie:

H2O/MeCN, 5-100% Vol., 0-40 min, Flussrate 20 mL/min.


217

Ausbeute: Es wurden 4.5 mg

(4.1 µmol, 5%) einer hygroskopischen,

farblosen Watte erhalten. Es wurde ein


bei dem Molekulargewicht



1096.20 g/mol.

1H-NMR (600 MHz, MeOD): [ppm] =

8.91 (s, 1H, H-4), 7.65 (d, 3JH,H = 8.1 Hz, 2H, H-3‘‘), 7.39-7.34 (m, 4H, H-2‘‘‘), 7.28 (d, 3JH,H =

8.1 Hz, 2H, H-2‘‘), 7.04 (s, 1H, H-5), 7.01-6.97 (m, 4H, H-3‘‘‘), 6.33 (dd, 3JH,H = 6.0 Hz, 3JH,H

= 6.0 Hz, 1H, H-1’), 5.13 (d, 3JH,P = 8.6 Hz, 4H, -CH2-Ph), 4.47-4.43 (m, 1H, H-3‘), 4.38-4.32

(m, 1H, H-5‘a), 4.26-4.21 (m, 1H, H-5‘b), 4.17-4.13 (m, 1H, H-4‘), 2.66 (t, 3JH,H = 7.8 Hz, 2H,

H-a), 2.59-2.51 (m, 5H, H-2’a, H-b‘), 2.24 (ddd, 2JH,H = 13.8 Hz, 3JH,H = 6.0 Hz, 3JH,H = 6.0 Hz,

1H, H-2’b), 1.77-1.62 (m, 6H, H-b, H-c‘), 1.47-1.23 (m, 28H, H-c, H-d, H-d‘, H-e‘, H-f‘, H-g‘,

H-h‘, H-i‘), 0.92 (t, 3JH,H = 7.0 Hz, 3H, H-e), 0.90 (t, 3JH,H = 7.3 Hz, 6H, H-j‘).

13C-NMR (151 MHz, MeOD): [ppm] = 173.6 (C-a’), 172.8* (C-7a), 156.9 (C-6), 152.4

(C-4‘‘‘), 146.1* (C-4‘‘), 139.4 (C-4), 134.7* (C-1‘‘‘), 130.4 (C-2‘‘‘), 130.1 (C-2‘‘), 127.5 (C-1‘‘),

125.9 (C-3‘‘), 122.9 (C-3‘‘‘), 110.3 (C-4a), 99.9 (C-5), 89.7 (C-1’), 88.0** (C-4’), 71.1 (C-3’),

70.4 (d, 2JC,P = 5.7 Hz, -CH2-Ph), 66.6** (C-5’), 42.6 (C-2’), 36.8 (C-a), 35.0 (C-b’), 32.2

(C-b), 33.1, 32.7, 30.6, 30.4, 30.2, 23.7, 23.6 (C-c, C-d, C-d‘, H-e‘, C-f‘, C-g‘, C-h‘, C-i‘),

26.0 (C-c‘), 14.4 (C-j‘), 14.4 (C-e). *aus dem HMBC bestimmt, **aus dem HSQC bestimmt


21.1 Hz, P-β).


Synthese von γ-(4-Pentadecanoyloxybenzyl)-γ-(4-pentanoyloxybenzyl)-3-(2‘,3‘-

didesoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-propyl-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on-5’-

triphosphat als Ammoniumsalz 104

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 208 mg (0.218 mmol, 1.0 Äquiv.) P-(4-

Pentadecanoyloxybenzyl)-P-(4-pentanoyloxybenzyl)-pyrophosphat als Tetra-n-

butylammoniumsalz 159 in 2 mL abs. Acetonitril gelöst und bei 0 °C mit einer auf 0 °C

gekühlten Lösung aus 0.15 mL (1.1 mmol, 5.0 Äquiv.) Trifluoressigsäureanhydrid und

0.25 mL (1.7 mmol, 8.0 Äquiv.) Triethylamin in 2 mL abs. Acetonitril versetzt. Nach zehn

Minuten wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und mit Acetonitril


218

coevaporiert. Der Rückstand wurde in 2 mL abs. Acetonitril aufgenommen und bei 0 °C mit

0.15 mL (1.1 mmol, 5.0 Äquiv.) Triethylamin und 0.05 mL (0.7 mmol, 3.0 Äquiv.)

1-Methylimidazol zugegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend

wurden 52 mg (0.11 mmol, 0.5 Äquiv.) 3-(2‘,3‘-Didesoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-propyl-2,3-

dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on-5’-monophosphat als Triethylammoniumsalz (6-Prop-

ddBCNAMP) 128 in 2 mL abs. Acetonitril langsam zugetropft. Nach einer Stunde Rühren bei

Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das

Rohprodukt wurde in Acetonitril/Wasser (1:1, v/v) gelöst und mittels automatisierter

Säulenchromatographie an RP-18-Kieselgel gereinigt (H2O/MeCN, 5-100% Vol., 0-45 min,

Flussrate 20 mL/min). Das Rohprodukt wurde über eine Kationenaustauschersäule Dowex-

NH4+ gegeben und anschließend wieder mittels automatisierter Säulenchromatographie an

RP-18-Kieselgel gereinigt.


49%) einer hygroskopischen, farblosen

Watte erhalten. Es wurden zwei


bei dem Molekulargewicht berücksichtigt.


Molekulargewicht: 1073.05 g/mol RP-

HPLC: tR= 17.68 min (Methode E).

1H-NMR (600 MHz, MeOD): [ppm] =

8.99 (s, 1H, H-4), 7.38 (d, 3JH,H = 8.5 Hz, 4H, H-2‘‘, H-2‘‘‘), 7.02 (d, 3JH,H = 8.5 Hz, 4H, H-3‘‘,

H-3‘‘‘), 6.58 (s, 1H, H-5), 6.08 (dd, 3JH,H = 6.6 Hz, 3JH,H = 2.4 Hz, 1H, H-1’), 5.16 (d, 3JH,P =

7.9 Hz, 2H, -CH2-Ph), 5.15 (d, 3JH,P = 7.9 Hz, 2H, -CH2-Ph‘), 4.47-4.43 (m, 1H, H-5’a), 4.34-

4.29 (m, 1H, H-4‘), 4.25-4.20 (m, 1H, H-5’b), 2.61-2.54 (m, 6H, H-a, H-b‘, H-b‘‘), 2.54-2.47

(m, 1H, H-2’a), 2.14-2.07 (m, 1H, H-2’b), 2.00-1.89 (m, 2H, H-3’), 1.76-1.64 (m, 6H, H-b, H-

c‘, H-c‘‘), 1.49-1.39 (m, 4H, H-d‘, H-d‘‘), 1.39-1.23 (m, 20H, H-e‘, H-f‘, H-g‘, H-h‘, H-i‘, H-j‘,

H-k‘, H-l‘, H-m‘, H-n‘), 0.99 (t, 3JH,H = 7.3 Hz, 3H, H-e‘), 0.97 (t, 3JH,H = 7.4 Hz, 3H, H-c), 0.90

(t, 3JH,H = 7.2 Hz, 3H, H-o‘‘).

13C-NMR (151 MHz, MeOD): [ppm] = 173.7, 173.7 (C-a’, C-a‘‘), 172.9 (C-7a), 160.3 (C-6),

156.9 (C-2), 152.3 (C-4’’, C-4‘‘‘), 139.2 (C-4), 134.9 (d, 3JC,P = 8.0 Hz, C-1’’, C-1‘‘‘), 130.4

(C-2’’, C-2‘‘‘), 122.8 (C-3‘‘, C-3‘‘‘), 109.5 (C-4a), 101.9 (C-5), 90.6 (C-1’), 83.2 (d, 3JC,P =

9.0 Hz, C-4’), 70.3 (d, 2JC,P = 5.7 Hz, C-CH2-Ph), 67.1 (d, 2JC,P = 5.3 Hz, C-5’), 35.0, 34.7

(C-b’, C-b‘‘), 34.6 (C-2’), 30.9 (C-a), 33.1, 30.8, 30.8, 30.8, 30.7, 30.6, 30.5, 30.4, 30.2, 23.7,


219

23.3 (C-d‘, C-d‘‘, H-e‘‘, C-f‘‘, C-g‘‘, C-h‘‘, C-i‘‘, C-j‘‘, C-k‘‘, C-l‘‘, C-m‘‘, C-n‘‘), 28.1 (C-c‘),

26.0 (C-c‘‘), 25.0 (C-3’), 21.4 (C-b), 14.4 (C-o‘‘), 14.1 (C-e‘), 13.9 (C-c).


18.2 Hz, P-γ), -23.68 (t, 2JP,P = 18.2 Hz, P-β).


IR: �̃� [cm-1] = 2923, 2853, 1756, 1669, 1572, 1509, 1459, 1382, 1255, 1217, 1168, 1129,

1080, 1058, 1001, 918, 501.

Synthese von γ-(4-Octadecanoyloxybenzyl)-3-(2‘,3‘-didesoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-

propyl-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on-5’-triphosphat als Ammoniumsalz 105



on-5’-diphosphat als Triethylammoniumsalz (6-Prop-ddBCNADP) 155 in 2 mL abs. Acetonitril

mit 95 mg (0.13 mmol, 1.7 Äquiv.) (9H-Fluoren-9-ylmethyl)-(4-octadecanoyloxybenzyl)-N,N-

diisopropylaminophosphoramidit 150 in 1.5 mL abs. Dichlormethan und 0.47 mL (0.12 mmol,

1.5 Äquiv.) 4,5-Dicyanoimidazol (0.25 M in Acetonitril) versetzt. Nach einer Stunde wurden

24 µL (0.13 mmol, 1.7 Äquiv.) tert-Butylhydroperoxid (5.5 M in n-Decan) zugegeben und

erneut 10 Minuten gerührt. In 5 mL abs. Acetonitril wurden 0.25 mL Triethylamin zugetropft

und 10 Minuten gerührt. Bedingungen der Säulenchromatographie: H2O/MeCN, 5-100% Vol.,

0-40 min, Flussrate 20 mL/min.




erhalten. Es wurden drei

Ammoniumgegenion angenommen

und bei dem Molekulargewicht



941.92 g/mol RP-HPLC: tR= 16.05

min (Methode E).


7.00 (d, 3JH,H = 8.5 Hz, 2H, H-3‘‘), 6.61 (s, 1H, H-5), 6.09 (dd, 3JH,H = 6.6 Hz, 3JH,H = 2.3 Hz,

1H, H-1’), 5.07 (d, 3JH,P = 6.1 Hz, 2H, -CH2-Ph), 4.47-4.42 (m, 1H, H-5’a), 4.37-4.32 (m, 1H,

H-4‘), 4.28-4.23 (m, 1H, H-5’b), 2.64 (t, 3JH,H = 7.5 Hz, 2H, H-a), 2.55 (t, 3JH,H = 7.4 Hz, 2H,

H-b‘), 2.54-2.49 (m, 1H, H-2’a), 2.17-2.08 (m, 1H, H-2’b), 2.00-1.92 (m, 2H, H-3’), 1.76-1.67


220

(m, 4H, H-b, H-c‘), 1.46-1.23 (m, 28H, H-d‘, H-e‘, H-f‘, H-g‘, H-h‘, H-i‘, H-j‘, H-k‘, H-l‘, H-m‘,

H-n‘, H-o‘, H-p‘, H-q‘), 1.00 (t, 3JH,H = 7.4 Hz, 3H, H-c), 0.90 (t, 3JH,H = 7.1 Hz, 3H, H-r‘).

13C-NMR (151 MHz, MeOD): [ppm] = 173.9* (C-a’), 172.9* (C-7a), 160.3 (C-6), 156.9 (C-2),

151.6 (C-4’’), 139.2 (C-4), 137.3* (C-1’’), 129.7 (C-2’’), 122.4 (C-3‘‘), 109.5 (C-4a), 101.9

(C-5), 90.6 (C-1’), 83.3 (d, 3JC,P = 8.7 Hz, C-4’), 68.2 (d, 2JC,P = 5.4 Hz, -CH2-Ph), 67.2 (d,

2JC,P = 5.4 Hz, C-5’), 35.0 (C-b’), 34.6 (C-2’), 31.0 (C-a), 33.1, 30.8, 30.8, 30.7, 30.6, 30.5,

30.4, 30.2, 23.7 (C-d‘, C-e‘, C-f‘, C-g‘, C-h‘, C-i‘, C-j‘, C-k‘, C-l‘, C-m‘, C-n‘, C-o‘, C-p‘,

C-q‘), 26.0 (C-c‘), 25.0 (C-3’), 21.5 (C-b), 14.4 (C-r‘‘), 13.9 (C-c). *aus dem HMBC bestimmt


20.5 Hz, P-γ), -22.55 (t, 2JP,P = 20.5 Hz, P-β).

HRMS (ESI+): m/z = [M+K]+ ber.: 929.2916, gef.: 929.4616; (ESI-): m/z = [M-H]- ber.:

889.3212, gef.: 888.9340.

IR: �̃� [cm-1] = 2917, 2850, 1756, 1669, 1569, 1508, 1466, 1386, 1217, 1066, 917.

Synthese von γ-Bis(4-decanoyloxybenzyl)-3-(2’-desoxy-β-D-ribofuranosyl)-6-(4-n-

pentylphenyl)-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on-5’-triphosphat als Ammoniumsalz

107

Es wurden unter Stickstoff als Inertgas 106 mg (113 µmol, 1.0 Äquiv.) P,P-Bis(4-

decanoyloxybenzyl)-pyrophosphat als Tetra-n-butylammoniumsalz 167 in 5 mL abs.

Acetonitril gelöst und bei 0 °C mit einer auf 0 °C gekühlten Lösung aus 0.10 mL (0.70 mmol,

6.2 Äquiv.) Trifluoressigsäureanhydrid und 0.13 mL (0.92 mmol, 8.2 Äquiv.) Triethylamin in

2 mL abs. Acetonitril versetzt. Nach 10 Minuten wurde das Lösungsmittel unter

vermindertem Druck entfernt und mit Acetonitril coevaporiert. Der Rückstand wurde in 2 mL

abs. Acetonitril aufgenommen und bei 0 °C mit 0.08 mL (0.6 mmol, 5.0 Äquiv.) Triethylamin

und 30 µL (0.38 mmol, 3.3 Äquiv.) 1-Methylimidazol zugegeben und 10 Minuten bei

Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 36 mg (66 µmol, 0.6 Äquiv.) 3-(2’-Desoxy-β-

D-ribofuranosyl)-6-(4-n-pentylphenyl)-2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2-on-5’-monophosphat

als Triethylammoniumsalz 165 in 2 mL abs. Dichlormethan langsam zugetropft. Nach zwei

Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck

entfernt. Das Rohprodukt wurde in Acetonitril/Wasser (1:1, v/v) gelöst und mittels

automatisierter Säulenchromatographie an RP-18-Kieselgel gereinigt (H2O/MeCN, 5-100%

Vol., 0-35 min, Flussrate 20 mL/min). Das Rohprodukt wurde über eine

Kationenaustauschersäule Dowex-NH4+ gegeben und anschließend wieder mittels

automatisierter Säulenchromatographie an RP-18-Kieselgel gereinigt.


221




erhalten. Es wurden zwei

Ammoniumgegenion

angenommen und bei dem



Molekulargewicht:

1193.21 g/mol.


7.36-7.30 (m, 4H, H-2‘‘‘), 7.24 (d, 3JH,H = 8.2 Hz, 2H, H-2‘‘), 7.22 (s, 1H, H-5), 7.01-6.93 (m,

4H, H-3‘‘‘), 6.32 (dd, 3JH,H = 5.8 Hz, 3JH,H = 5.8 Hz, 1H, H-1’), 5.19-5.08 (m, 4H, -CH2-Ph),

4.58-4.53 (m, 1H, H-3‘), 4.43-4.38 (m, 1H, H-5‘a), 4.35-4.30 (m, 1H, H-5‘b), 4.15-4.11 (m,

1H, H-4‘), 2.64 (t, 3JH,H = 7.7 Hz, 2H, H-a), 2.59-2.52 (m, 5H, H-2’a, H-b‘), 2.27 (ddd, 2JH,H =

13.6 Hz, 3JH,H = 5.9 Hz, 3JH,H = 5.9 Hz, 1H, H-2’b), 1.71 (quint, 3JH,H = 7.2 Hz, 4H, H-c‘), 1.65

(quint, 3JH,H = 7.2 Hz, 2H, H-b), 1.46-1.24 (m, 28H, H-c, H-d, H-d‘, H-e‘, H-f‘, H-g‘, H-h‘,

H-i‘), 0.94-0.88 (m, 9H, H-e, H-j‘).


152.3 (C-4‘‘‘), 145.9 (C-4‘‘), 139.9 (C-4), 134.9 (C-1‘‘‘), 130.4, 130.4 (C-2‘‘‘), 130.1 (C-2‘‘),

127.6 (C-1‘‘), 125.9 (C-3‘‘), 122.8 (C-3‘‘‘), 110.4 (C-4a), 100.3 (C-5), 89.7 (C-1’), 88.2 (C-4’),

70.8 (C-3’), 70.4 (d, 2JC,P = 5.7 Hz, -CH2-Ph), 66.0 (C-5’), 42.3 (C-2’), 36.8 (C-a), 35.0 (C-b’),

32.2 (C-b), 33.1, 32.7, 30.6, 30.4, 30.2, 23.8, 23.6 (C-c, C-d, C-d‘, H-e‘, C-f‘, C-g‘, C-h‘, C-

i‘), 26.0 (C-c‘), 14.5 (C-j‘), 14.4 (C-e).


17.6 Hz, P-γ), -23.53 (t, 2JP,P = 17.9 Hz, P-β).


1181.5205.

9.3 Hydrolysestudien in CEM/0-Zellextrakt

Die verwendeten Zellextrakte wurden von J. BALZARINI und D. SCHOLS, Katholieke

Universiteit Leuven (Belgien), zur Verfügung gestellt. Es wurden 120 μL der 10 mM

Stammlösungen mit 80 μL DMSO verdünnt, um die Hydrolysestammlösungen zu erhalten.

Für die Hydrolyselösungen wurden 50 μL des CEM/0-Zellextrakts und 10 μL Reinstwasser


222

(Milli-Q) zusammen gegeben und die Hydrolyse durch Zugabe von 10 μL der

Hydrolysestammlösung gestartet. Nach kurzem Vortexen wurde die Lösung bei 37 °C im

Thermomixer inkubiert. Für jeden Messwert wurde eine separate Hydrolyselösung angesetzt.

Für den Nullwert wurde anstatt des Zellextrakts 50 µL Reinstwasser verwendet. Für den

Abbruch der Hydrolyse wurden 150 μL Methanol hinzugegeben. Nach kurzem vortexen

wurde die Probe für 5 Minuten auf Eis gelagert und 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt.

Anschließend wurde 5 Minuten zentrifugiert (13.000 rpm) und der Überstand durch einen

Spritzenfilter filtriert (Chromafil® RC-20/15 MS, 0.2 μm). Die Proben wurden bis zur Analyse

mittels analytischer RP-18-HPLC in flüssigem Stickstoff (-196 °C) gelagert, einzeln aufgetaut

und vermessen (Methode D für DiPPro-Verbindungen und Methode E für TriPPPro-

Verbindungen, Injektionsvolumen: 80 μL).

Für die Auswertung wurden die HPLC-Chromatogramme bei einer Wellenlänge von 330 nm

verwendet. Die Integrale der entsprechenden Peaks wurden gegen die Hydrolysedauer

aufgetragen. Aufgrund der geringen Konzentrationen kann eine Reaktion pseudo-erster

Ordnung angenommen werden. Mithilfe des Kalkulationsprogramms OriginPro 9.1G wurden

exponentielle Ausgleichskurven ermittelt. Die Exponentialfunktion lässt sich dabei wie folgt

beschreiben:

[A]t= [A]

0 ∙ e-kt

[A]t = Konzentration zum Zeitpunkt t

[A]0 = Anfangskonzentration

k = Geschwindigkeitskonstante

Aus der dadurch bestimmten Geschwindigkeitskonstante k konnte mit nachstehender Formel

die Halbwertszeit t1/2 berechnet werden:

t12

= ln2

k

9.4 Zellaufnahmestudien

Die Zellinkubationen wurden von DR. ILONA HAUBER am Heinrich-Pette-Institut, Leibniz-

Institut für Experimentelle Virologie in Hamburg durchgeführt. Dafür wurden CEM-SS Zellen

im Zellkulturmedium (RPMI-1640 Medium, pH 7.5, 10% fötales Kälberserum, 1%

Penicillin/Streptomycin, 200 mM L-Glutamin) in T175-Zellkulturflaschen expandiert, bis ca.

109 Zellen vorlagen. Die Zellen wurden in 20 mL des Zellkulturmediums aufgenommen und

15 Minuten, 60 Minuten bzw. 6 Stunden mit einer Konzentration von 10 µM bzw 100 µM des

entsprechenden Prodrug inkubiert (37 °C, 5% CO2, 90% RH). Anschließend wurden die

Zellen zweimal intensiv mit PBS gewaschen, zentrifugiert und bei -78 °C gelagert. Die


223

erhaltene Waschlösung wurde vor der weiteren Analyse filtriert (Chromafil® RC-20/15 MS,

0.2 μm). Das Zellpellet wurde in 150 μL eines Methanol/Wasser-Gemisches (2:1 v/v, auf Eis

gekühlt) suspendiert, 10 Minuten im Ultraschallbad behandelt, 10 Minuten auf Eis gelagert

und für 10 Minuten zentrifugiert (8000 rpm). Der Überstand wurde ebenfalls durch einen

Spritzenfilter filtriert. Beide Filtrate wurden mittels analytischer RP-18-HPLC (Methode F oder

Methode G, Injektionsvolumen: 80 µL) untersucht.

Literaturverzeichnis

224

10 Literaturverzeichnis

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Anhang

237

Anhang

Gefahrstoffverzeichnis

In der folgenden Tabelle sind Verbindungen, Reagenzien und Lösungsmittel aufgeführt, die

im Rahmen dieser Promotion verwendet wurden. Diese Gefahrstoffe sind nach GHS (CLP

Verordnung 1272/2008/EG) eingestuft und die entsprechenden Gefahrensymbole sowie die

H- und P-Sätze angegeben. Die Stoffe, für die keine bekannte Einstufung existiert, sind als

gefährlich einzustufen. Es ist unbedingt zu vermeiden, sich oder andere Personen mit diesen

Substanzen zu kontaminieren und diese Stoffe in die Umwelt einzubringen.

Substanz Gefahren-

piktogramme

Gefahrenhinweise

H-Sätze

Sicherheitshinweise

P-Sätze

Aceton

EU066-225-319-336 210-240-305+351+338-

403+233

Acetonitril

225-302-312-319-

332

210-240-302+352-

305+351+338-403+233

Amberlite IR-120 Plus

318 280i-305+351+338-310

Ammoniak (25%)

290-314-335-400

260-273-280-

301+330+331-

303+361+353-

305+351+338

Ammoniumacetat

315-319-335 261-280-304+340-

305+351+338

Argon

280 410+403

5-Benzylthio-1H-

tetrazol (0.3 M in

CH3CN)

225-302+332-318 210-280-305+351+338

tert-Butanol

225-319-332-335 210-305+351+338-

403+233

tert-Butyldimethylsilyl-

chlorid 228-314

210-280-305+351+338-

309-310

Anhang

238

Substanz Gefahren-

piktogramme

Gefahrenhinweise

H-Sätze

Sicherheitshinweise

P-Sätze

tert-Butylhydroperoxid

(5.5 M in n-Decan)

301-311-330-314-

226-242

210-301+310-

303+361+353-304+340-

305+351+338-320-330-

410

Cer(IV)-

ammoniumnitrat 272-315-319-335

210-220-221-

305+351+338

Chloroform

302-315-319-331-

351-361d-372

201-202-260-264-280-

281-301+312-302+352-

304+340-305+351+338-

308+313-311-321-330-

332+313-337+313-362-

403+233

Citronensäure

318-335-315 261-280-304+340-

305+351+338

2-Cyanoethyl-

N,N,N’,N’-

tetraisopropyl-

phosphordiamidit

315-319-335

261-264-280-302+352-

304+340-305+351+338-

312-321-332+313-

337+313-362-403+233

Decanoylchlorid

290-314 280-301+330+331-

305+351+338-309+310

Dess-Martin Periodinan

272-315-319-335-

EU044

210-220-221-

305+351+338

Dichloressigsäure (3%

in CH2Cl2)

314-400

260-264-273-280-

301+330+331-

303+361+353-304+340-

305+351+338-310

Dichlormethan

351 201-202-281-308+313

1,3-Dichloro-5,5-

dimethylhydantoin

272-314-302 210-221-303+361+353-

305+351+338

4,5-Dicyanoimidazol

(0.25 M in CH3CN) 318-302-335-315 280-305+351+338

Anhang

239

Substanz Gefahren-

piktogramme

Gefahrenhinweise

H-Sätze

Sicherheitshinweise

P-Sätze

Diethylether

224-302-336-

EU019-EU066 210-240-403+235

Diisopropylazo-

dicarboxylat 315-319-335-411

261-280-304+340-

305+351+338

N,N-Diisopropyl-

ethylamin

225-331-314-302-

412

210-260-303+361+353-

305+351+338

4,4‘-Dimethoxy-

tritylchlorid 315-319-335

261-280-304+340-

305+351+338

N,N-Dimethylformamid

360D-226-332-312-

319

201-302+352-

305+351+338-308+313

N,N-Dimethyl-

formamiddiethylacetal 225-315-319-335

210-261-303+361+353-

305+351+338

Dimethylsulfoxid Kein gefährliches Produkt im Sinne der

CLP Verordnung 1272/2008/EG

Dioxan

EU019-EU066-225-

319-335-351

201-202-210-240-241-

242-243-261-264-280-

303+361+353-304+340-

305+351+338-308+313-

312-337+313

Diphenylphosphit

318-314 280-301+330+331-

305+351+338-310

Dowex 50W-X8

315-319-335

261-264-280-302+352-

304+340-305+351+338-

312-332+313-337+313

Essigsäure

226-314

280-301+330+331-

303+361+353-304+340-

305+351+338-310

Essigsäureanhydrid

226-302-314-332

280-301+312-

301+330+331-

303+361+353-304+340-

305+351+338-309+310

Anhang

240

Substanz Gefahren-

piktogramme

Gefahrenhinweise

H-Sätze

Sicherheitshinweise

P-Sätze

Ethanol

225 210-233-240-241-242-

243-280-303+361+353

Ethylacetat

225-319-336-

EUH066 210-240-305+351+338

9-Fluorenylmethanol Kein gefährliches Produkt im Sinne der

Verordnung (EG) Nr. 1272/2008

n-Hexan

225-304-315-336-

361f-373-411

210-240-241-242-243-

260-264-273-280-281-

301+310-302+352-

303+361+353-308+313-

321-331-332+313

4-Hydroxybenzyl-

alkohol 315-319-335

261-280-304+340-

305+351+338

Iod

312-332-400 261-273-280-302+352-

304+340-312-322-363

Iodmonochlorid

314-302-312

260-301+310+331-

303+361+353-

305+351+338

Isobuttersäureanhydrid

314-302-312

260-301+310+331-

303+361+353-

305+351+338

Isopropanol

225-319-336

210-233-240-241-242-

243-264-280-

303+361+353-

305+351+338-337+313

Kaliumhydroxid

302-314

260-264-280-

301+310+331-

303+361+353-304+340-

305+351+338-310-321

Kaliumthioacetat

315-319-335 261-280-304+340-

305+351+338

Kieselgel - - 260

Kupfer(I)-iodid

400-410-302-315-

319-335

261-280-304+340-

305+351+338

Anhang

241

Substanz Gefahren-

piktogramme

Gefahrenhinweise

H-Sätze

Sicherheitshinweise

P-Sätze

Methanol

225-331-311-301-

370

210-233-280-302+352-

309+310

Methansulfonsäure

314

260-264-301+310+331-

303+361+353-304+340-

305+351+338-310

Methansulfonylchlorid

330-312-301-314-

335

304+340-302+352-

301+330+331-

305+351+338

4-Methyoxytritylchlorid

315-319-335

261-280-304+340-

305+351+338

1-Methylimidazol

302-312-314

260-264-280-

301+330+331-302+352-

303+361+353-304+340-

305+351+338-310-321

Natriumborhydrid

260-301-311-330-

314

231+232-301+310-

303+361+353-320-330

Natriumchlorid Kein gefährliches Produkt im Sinne der


Natriumhydrid

260 223-231+232-280-

335+334-370+378

Natriumhydrogen-

carbonat 319

264-280-305+351+338-

337+313

Natriumhydroxid

314

260-264-280-

301+330+331-

303+361+353-304+340-

305+351+338-310

Natriumsulfat Kein gefährliches Produkt im Sinne der


Octadecanoylchlorid

EU014-314

260-264-280-

301+330+331-

303+361+353-304+340-

305+351+338-310

Anhang

242

Substanz Gefahren-

piktogramme

Gefahrenhinweise

H-Sätze

Sicherheitshinweise

P-Sätze

Oxalylchlorid

331-314-302-

EU014-EU029

280-303+361+353-

305+351+338-310

Palladium/Kohle

228 210-240-241-280

Pentadecansäure

315-319-335 261-280-304+340-

305+351+338

Pent-1-in

225-304-315-319-

335

210-280g-301+310-

305+351+338-315

4-n-Pentylphenyl-

acetylen

Kein gefährliches Produkt im Sinne der


Petrolether 50-70

225-304-315-336-

361f-373-411

210-243-273-280-281-

301+310-302

Phosphortrichlorid

EU014-EU029-300-

314-330-373

260-264-280-284-

301+310-301+330+331-

303+361+353-304+340-

305+351+338-314-320

Pyridin

225-302-312-332

210-233-240-241-

302+352-303+361+353-

304+340-330

Salzsäure (37%)

314-335

260-264-280-

301+330+331-

303+361+353-304+340-

305+351+338-310

Tetrabutylammonium-

fluorid (1 M in THF)

225-314-351-302-

335-EU019

210-260-303+361+353-

305+351+338

Tetrabutylammonium-

hydroxid (40% in H2O) 314

260-301+330+331-

303+361+353-

305+351+338

Anhang

243

Substanz Gefahren-

piktogramme

Gefahrenhinweise

H-Sätze

Sicherheitshinweise

P-Sätze

Tetrahydrofuran

EU019-225-319-

335-351

201-202-210-240-241-

242-243-261-264-280-

281-303+361+353-

304+340-305+351+338-

308+313-312-337+313

Tetrakis(triphenyl-

phosphin)-palladium(0) 302-315-317-319

280-302+352-

305+351+338

Thiobenzoesäure

315-319-335 261-280-304+340-

305+351+338

Thymidin

315-319-335-341 261-280-281-302+352-

305+351+338

Toluol

225-304-315-336-

361d-373

201-202-210-223-240-

241-242-243-261-264-

280-281-301+310-

302+352-303+361+353-

308+313-321-331

p-Toluolsulfonsäure-

chlorid

314

260-301+330+331-

303+361+353-

305+351+338

Triethylamin

225-302-312-314-

332

210-233-240-241-242-

243-261-264-280-

301+312-301+330+331-

302+352-303+361+353-

304+340-305+351+338-

310

Triethylamin

Trihydrofluorid 300-310-330-314

280-303+361+353-

305+351+338-310

Trifluoressigsäure-

anhydrid 314-332-412-EU014

260-301+330+331-

303+361+353-

305+351+338

Trimethylsilylacetylen

225 210-240-280-

303+361+353

Anhang

244

Substanz Gefahren-

piktogramme

Gefahrenhinweise

H-Sätze

Sicherheitshinweise

P-Sätze

Trimethylsilylchlorid

225-314-312-EU014 210-260-303+361+353-

305+351+338

Triphenylphosphin

302-317-413 261-273-280-301+312-

363

Valeroylchlorid

314-226-302-332 210-260-303+361+353-

305+351+338

Wasserstoff

220 210-377-381

Anhang

245

Synthesizer Methoden

Allgemeine Bezeichnungen: ACN: Acetonitril, AMD: entsprechendes Amidit, CP_A: CAP A,

CP_B: CAP B, COL: Column, CTOP: reversed flow GAS, GAS: Argongas, M_W: Waste,

OXI: Iod-Oxidizer, TCA: TCA oder DCA, TET: BTT oder ETT, TRM: Tritylmonitor

Standardmethode für unmodifizierte Phosphoramidite

Schritt Aktion Zeit [s] Schritt Aktion Zeit [s]

1 TCA to TRM 2.2 37 ACN to M_W 1.0

2 Wait 20 38 ACN to COL 1.0

3 TCA to TRM 1.7 39 GAS to COL 3.5

4 Wait 18 40 GAS to M_W 2.0

5 TCA to TRM 1.7 41 OXI to COL 9.0

6 Wait 20 42 Wait 25

7 TCA to TRM 2.4 43 OXI to COL 3.0

8 Wait 20 44 ACN to M_W 1.0

9 GAS to TRM 1.8 45 Wait 9.0

10 ACN to M_W 0.2 46 Wait 35

11 ACN to COL 1.9 47 GAS to COL 3.0

12 Wait 4.0 48 ACN to M_W 0.2

13 GAS to TRM 3.0 49 ACN to COL 1.6

14 ACN to M_W 0.2 50 Wait 2.0

15 ACN to COL 3.5 51 GAS to COL 3.0

16 Wait 5.0 52 ACN to M_W 0.2

17 GAS to M_W 1.0 53 ACN to COL 1.5

18 GAS to COL 3.5 54 Wait 4.0

19 ACN to M_W 0.2 55 ACN to COL 1.5

20 ACN to COL 2.5 56 Wait 5.0

21 Wait 5.0 57 GAS to M_W 1.0

22 GAS to M_W 1.0 58 GAS to COL 3.0

23 GAS to COL 3.5 59 CP_A+CP_B to COL 3.0

24 TET to COL 0.3 60 Wait 25

25 Wait 2.0 61 CP_A+CP_B to COL 1.5

26 AMD to COL 0.1 62 Wait 25

27 AMD+TET to COL 1.4 63 CP_A+CP_B to COL 1.5

28 Wait 60 64 Wait 25

29 AMD+TET to COL 1.2 65 GAS to COL 2.5

30 Wait 90 66 ACN to M_W 0.2

31 AMD+TET to COL 1.0 67 ACN to COL 4.5

32 Wait 90 68 GAS to COL 4.0

Anhang

246


33 ACN to M_W 2.0 69 ACN to M_W 0.2

34 GAS to M_W 2.0 70 ACN to COL 4.0

35 GAS to CTOP 0.1 71 Wait 4.0


37 ACN to M_W 1.0 73 Wait 2.0

38 ACN to COL 1.0 74 ACN to COL 4.0

39 GAS to COL 3.5 75 Wait 3.0

40 GAS to M_W 2.0 76 GAS to M_W 1.5

41 OXI to COL 9.0 77 Wait 2.0


Methoden für die Kupplung modifizierter Phosphoramidite: Der Zyklus erfolgte falls nicht

anders angegeben nach der Standardmethode, bis auf die Schritte 26 - 34, die durch

folgende Varianten ersetzt wurden.

Synthesizer Methode 1

Schritt Aktion Zeit [s]

A AMD to COL 0.1

B AMD+TET to COL 1.0

C Wait 360

D AMD+TET to COL 1.0

E Wait 360

F ACN to M_W 2.0

G GAS to M_W 2.0

Beim nächsten Zyklus wurde Schritt 1 - 23 übersprungen. Die Detritylierung wurde am

Synthesizer manuell mit Trichloressigsäure (3% in CH2Cl2) in fünf Zugabeschritten mit jeweils

10 Sekunden Inkubationszeit durchgeführt.



A AMD to COL 0.1


C Wait 360


E Wait 360

F AMD+TET to COL 0.4

Anhang

247


G Wait 360

H ACN to M_W 2.0

I GAS to M_W 2.0



A AMD to COL 0.1


C Wait 600


E Wait 600

F AMD+TET to COL 0.4

G Wait 600

H AMD+TET to COL 0.4

I Wait 600

J ACN to M_W 2.0

K GAS to M_W 2.0



A AMD to COL 0.1 J AMD+TET to COL 0.4

B AMD+TET to COL 1.0 K Wait 600

C Wait 600 L AMD+TET to COL 0.4

D AMD+TET to COL 0.4 M Wait 600

E Wait 600 N AMD+TET to COL 0.4

F AMD+TET to COL 0.4 O Wait 600

G Wait 600 Q Wait 600

H AMD+TET to COL 0.4 R ACN to M_W 2.0

I Wait 600 S GAS to M_W 2.0

Anhang

248

Verbindungsübersicht Teil I

40 R = H 44

R = DMTr 43

R = TBDMS 39

R = MMTr 33

R = DMTr 37

R = TBDMS 42

R = H 38

R = TBDMS 21

22 R = H 34

R = MMTr 35

R = DMTr 36

R = TBDMS 41

R = MMTr 45

R = DMTr 46

R = TBDMS 47

23 50

R = MMTr 48

R = DMTr 28

R = Ac 64

R = H 65

R = Cl 66

R1 = DMTr, R

2 = H 55

R1 = TBDMS, R

2 = H 67

R1 = DMTr, R

2 = TBDMS 56

R1 = TBDMS, R

2 = MMTrS 68

R1 = H, R

2 = TBDMS 53

R1 = H, R

2 = MMTrS 61

59 51 29

Anhang

249

Verbindungsübersicht Teil II

123 122 121 120 117

119 118 115 116 127

126 131 129 134

137 128 160

155 R = C4H9 143

R = C9H19 139

R = C14H29 147

R = C17H35 152

149 R1 = R

2 = C9H19 140

R1 = C4H9, R

2 = C14H29 148

150

Anhang

250

162 163 164 100

166 165

R1 = R

2 = C9H19 168

R1 = C4H9, R

2 = C14H29 157

R1 = R

2 = C9H19 167

R1 = C4H9, R

2 = C14H29 159

R1 = R

2 = C9H19 94

R1 = C4H9, R

2 = C14H29 102

103 104 105

Anhang

251

106 107

Anhang

252

Danksagung

Herrn Prof. Dr. Chris Meier gilt mein besonderer Dank für die interessante Themenstellung

und die hervorragenden Arbeitsbedingungen. Zudem danke ich für das entgegengebrachte

Vertrauen, die Ermöglichung der spannenden Konferenzteilnahmen und die fachlichen

Anregungen.

Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Wittko Francke danke ich für die freundliche Übernahme des

Zweitgutachtens. Herrn Prof. Dr. Wolfgang Maison und Herrn Prof. Dr. Ralph Holl danke ich

für die Teilnahme am Dissertationskolloquium.

Prof. Dr. Jan Balzarini und Prof. Dr. Dominique Schols danke ich für die Durchführung der

antiviralen Tests und die Bereitstellung der Zellextrakte. Dr. Ilona Hauber danke ich für die

Züchtung der Zellen, die Anleitung bei der Durchführung der Zellinkubationen und die

Erlaubnis der Nutzung der Labore des Heinrich-Pette-Instituts. Dr. Ivo Sarac danke ich für

die stete Hilfsbereitschaft, die Unterstützung bei der Synthese der Oligonucleotide, die vielen

hilfreichen Tipps, die Durchführung der MALDI-Messungen und die HPLC-Einführung.

Allen Mitgliedern der NMR- und MS-Abteilung unter der Leitung von Dr. Thomas Hackl und

Dr. Maria Riedner danke ich sehr herzlich für die Messung unzähliger Spektren.

Für die Unterstützung bei den praktischen Arbeiten danke ich den ISP-Praktikanten und den

Forschungspraktikanten Kristine Cordsen, Denise Oetzmann, Patrick Sakrausky, Valentina

Jazkiv, Nils Jeschik und insbesondere Hiba Nasser, die fast vier Monate lang an dem Oligo-

Thema mit gearbeitet hat.

Allen aktuellen und ehemaligen Mitgliedern der Familie Ackermeier danke ich für die

großartige Arbeitsatmosphäre, die hervorragende Zusammenarbeit und die schöne Zeit. Ihr

wart der beste Arbeitskreis, den man sich wünschen kann. Mein besonderer Dank geht an

meine Laborpartnerin Katharina Pahnke und an Thiago Dinis de Oliveira für die fachlichen

Diskussionen, den Austausch über die Forschungsthemen und die Unterstützung in allen

Belangen. Den Salonmitgliedern danke ich für den fortwährenden Zuspruch und die schönen

Abende. Dr. Florian Pertenbreiter danke ich dafür, dass er mir das BCNA-Thema vererbt und

mir zu einem guten Start in dem Arbeitskreis verholfen hat.

Ich danke meinen Freunden, die mich während des Studiums und der Promotion begleitet

und die Zeit zu etwas ganz Besonderem gemacht haben. Insbesondere danke ich den

Mitgliedern der Donnerstagsrunde: Alex, Dirk, Jule, Kristina, Heiner und Jim.

Für die fachliche Durchsicht dieser Arbeit danke ich Katharina Pahnke und für die

Rechtschreib- und Grammatikprüfung Dr. Manuel Reimer.

Mein größter Dank gilt meinen Eltern und meiner Schwester Kirstin. Danke, dass ihr immer

für mich da seid.

Anhang

253

Eidesstattliche Versicherung

Hiermit versichere ich an Eides statt, die vorliegende Dissertation „3'-S-phosphorthiolat-

verbrückte Oligonucleotide und Fluoreszierende Nucleotid-Prodrugs für Zellaufnahme-

studien“ selbst verfasst und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt zu haben.

Die eingereichte schriftliche Fassung entspricht der auf dem elektronischen

Speichermedium. Ich versichere, dass diese Dissertation nicht in einem früheren

Promotionsverfahren eingereicht wurde.

Ort, Datum Inga Susanne Reimer, M. Sc.

Anhang

254

1 2

3

4 5

6 7

8

9 10

11 12

13 14

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17

18

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20

21

22

23

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25

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29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

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85

86

87

88

89

90

91

92

93

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100

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