Acta Biol6gicaColombiana, Vol. 10 No.2, 2005 75·94

EXTRACCION DE PRODUCTOS EXTRACELULARES DEAeromonas hydrophile Y SUS EFECTOS EN TILAPIA ROJA

(Oreochromis spp.) Y CACHAMA BLANCA (Piaractus brachypomus)

Aeromonas hydrophil« Extracelullar Products Extraction and itsEffects on Tilapia Roja (Oreochromis spp.) and Cachama Blanca

(Piaractus brachypomus)

RODRIGUEZ M, BOTERO E, IREGUI CA, FIGUEROAJ

Grupo de Investigaci6n en Fisiopatologla Veterinaria,Departamento de Ciencias para la Salud Anima!,Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia,Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogota.

Presentado abril 29 de 2005, aceptado agosto 22 de 200S, correcciones septiembre 1 de 200S.

RESUMEN

Se obtuvo un extracto crudo toxigenico (ECT) de A. hydrophila en diversos medics de cul-tivo como caldo BHI con extracto de levadura, soya tripticasa (TSB) y medio de salesmfnimas (MSM). Ademas, se usaron diversas tecnicas de concenrracion como la preci-pitacion con solventes acidos y concentracion por deshidraracion a 4°C; como tecnicaintegrada de cultivo y concentraci6n se us6 el cultivo sobre papel celofan. Los extractosse pasaron par columna de cromarografia (QAE)-sephadex A-50 y se les efectuo elec-troforesis en 50S-PAGE. Se midi6 la actividad biologica in vitro (actividad hemolttica yproteolitiea) e in vivo (toxicidad en peees). Los resultados indican que para la cepa detrabajo utilizada y bajo nuestras condiciones de culrivo (28°C) el medio 6ptimo parala obtencion de extracto es el MsM, y [a tecnica de concencracion mas adeeuada es ladeshidratacion a 4 "C. EI extracto obtenido en TBS tuvo una actividad hemolftica de128 UH/~L, proteolitica de 38,4 UP/~L, produjo alta mortalidad en peces y severas le-siones rnultiorganicas. La elecrroforesis revelo bandas nftidas de 50 a 52 kDa y 63 a 68kDa, que pueden corresponder a j3 hemolisina y a a hemolisina y otras tenues de 30 a36 kDa que pueden corresponder a la metaloproteasa terrnoesrable.

Palabras clave: Aeromonas hydrophila, productos extracelulares (PEC), hemolisinas, sept i-cem ia hemorragica.

ABSTRACT

A toxigenic raw extract of A. hydrophila was obtained from diverse culture medium (BHIwith extract of yeast, (TsB) y minimum salt medium (MsM» and diverse concentrationtechniques. Extracts were processed by Sephadex A-50 (QAE) and 50S-PAGE elec-trophoresis. Biological activity was measured in vitro (hemolytic and proteolitic activity)

76 Articulo - &trocci6n de productos extracelutares de Aeromonas hydrophila y sus efectos en ti/apia roja(Oreochromis spp.)y cachama blanca (Piaraccus brachypomus). Rodriguez, et al.

and in vivo (toxicity in fish). The results indicate that the optimal culture condition was28°C and MSM was the optimum medium to extract. Dehydration at 4 °C was themost adequate concentration technique. TBS extract obtained had an hemolytic activityof 128 UH/~L and a proteolitic activity of38.4 LJP/~Land produced high fish mortalityand severe multiorganic lesions. Electrophoresis revealed bands 1T0m50 to 52 kDa y 63to 68 kDa, that could correspond to the P hemolisina or a hemolisina yother from 30to 36 kDa that could correspond to the thermostable metalloprotease.

Key words: Aeromonas hydrophila, extracelular products, hemolisins. haemorragicsepticemia.

INTRODUCCI6N

La Aeromonas hydrophila es un cocobacilo Gram-negative, motil, anaerobic facultative,habitanre normal del agua y del tracto gastrointestinal de animales acuacicos y terres-tres. Sin embargo, bajo condiciones arnbientaies no cornpletarnente conocidas, puedeiniciar procesos patol6gicos en peces y mamfferos. Se afsla frecuenrernente de pecesenfermos y causa mortalidad con grandes perdidas econornicas (CTSA, 1996; Lilleyet al., 1998). En el humano se reportan infecciones con A. hydrophila que inducen gastro-enteritis, meningitis, endocarditis, etc., principalmente en neonatos (Pazzaglia et aI.,1990; Thomas et ot., 1990; Begue et al., 1994; Garcia etal., 1999; Falcon et al., 2001).En peces se describen tres formas de la enfermedad: la septicernica; la cutanea, can le-siones limitadas a pie! y muscuto: y una forma larenre, que es una forma sistemica sinpresenrecion de signas c1fnicos (Grizzle y Kiryu, 1993). La bacteria posee multiples fac-tores de virulencia, como los productos extracelulares (PEC), los factores de superficie,facto res asociados a celulas, plasrnidos y sistemas de restriccion/modificacion, que pa-recen desempefiar un papel importante en la patogenesis de la enfermedad en peees.No obstante, no se ha logrado esclarecer can exactitud cual de todos es el que tiene ma-yor importancia en el desencadenamiento y desarrollo de la enfermedad (Thune et ot.,1986; Khalil y Mansour, 1997).

Los PEC eorresponden a las diferentes protefnas extracelulares seeretadas por la bacte-ria que se obtienen a partir de un extracto crudo roxigenico, y entre las cuales estan prin-cipalmente la a y p hemolisina, varias proteasas como la metaloproteasa termoestable(MPTE), una serina proteasa termoestable (SPTE) y otra termolabil (SPTL), lipasas, en-terotoxinas como la citoroxica y la citot6nica, sider6foros, quitina-sas yamilasas. LosPEC de A. hydrophila causan muerte en peces al ser inoculados intraperitonealmente ycursan con lesiones extensas en museulo al ser inyectados por esta via. Se considera quedicha accion se debe a la actividad de proteasas y hemolisinas (Allan y Stevenson, 1981;Thune et 01., 1986; Cahill, 1990). Existe controversia referente al papel de la B hemoli-sina en la patogenesis de la enfermedad en peees. En algunos estudios, (revisado porCahill 1990), no encontraron actividad toxica de las hemolisinas en peces, en contradic-cion con los hallazgos de Allan y Stevenson (1981), quienes deseribieron correlaci6nentre la producci6n de hemolisinas y toxieidad en estas espeeies. Khalil y Mansour(1997) atribuyeron la mortalidad en peces a las hemolisinas y proteasas. Estos dos

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factores de virulencia parecen ser los de mayor importancia en el desarrollo de la enfer-medad en peces. EI prop6sito de este trabajo fue obtener un extracto crudo rcxigenicocon los PEe de A. hydrophila, esrandarizar una tecnica para su producci6n determinadolas condiciones de cultivo adecuadas para nuestra cepa de trabajo y verificar su activi-dad hernohtica y proteoljrica in vitro e in vivo; adem as, se intento la extraccion y caracre-rizaci6n de la ~ hemolisina.

MATERIALES Y METODOS

CEPA BACTERIANA

La cepa de A. hydrophila se obtuvo de un brote de septicemia hemorragica en tilapia niJ6-tica (Oreochromis niloticus) en eljapon (amablemente donada por el Doctor. H. Kawatzu}.La cepa se sembr6 en agar soya tripticasa (TSA) y en medio AH (rnedio Aeromonashydrophila) a 28°C durante 18 horas, se hizo tincion de Gram, se c1asific6 por pruebasbioqufrnicas (Imziln et at., 1997; Imbert y Gancel, 2004) y se efectu6 la prueba de CristalBBL® para enterobacterias no ferrnentadoras. Para determinar la actividad hemolfticase cultiv6 en TSA con sangre ovina al 5% (vjv) y se sembr6 en agar con leche descremadaal 5% (vjv) para estimar la actividad proteolftica (Espinosa de los Monreros y Labarta,1988; Esteve et ot., 1995; Wong et al., 1998). Posteriormente Ia bacteria se conserv6 encaldo soya tripticasa (TSB) con glicerol a125% (v/v) a -20°C (Santos etal., 1996, 1999).

VALORACt6N DE LA PATOGENICIDAD DE LA CEPA

Para incrementar el grade de virulencia de la cepa y evaluar su patogenicidad se inocu-laron intraperitonealmente cinco hfbridos de tilapias rojas (Oreochromis spp.) y cinco ca-chamas blancas (Piaractus brachypomus) de 7-10 g de peso a la dosis de 10' UFC en 0,1J.lLde soluci6n salina fisiologica (SSF), previa anestesia con tricarna metasulfonaro [Erilm-aminobenzoato metasulfonato (TMS)J (Dierckens et al., 1998; Moretti, 2002;Outside Microbiology, 2002). Los peces se mantuvieron en acuarios de 70 La 28°C Yse observaron por 72 horas. Los que presentaron signologta se sacrificaron por cortecervical previa anestesia, y se intent6 el reaislamiento de la bacteria en TSA a partir dehrgado, rifion y bazo. Los tejidos se fijaron en formaldehido aI3,7% y se procesaron parala tecnica histol6gica de rutina de hematoxilina y eosina (H&E). Los peces que no pre-sentaron signologfa 72 horas post-infecci6n, se sacrificaron y se manejaron en la mis-ma forma que los enfermos (Grizzle y Kiryu, 1993; Khalil y Mansour, 1997; Matsche yGrizzle, 1999).

PREPARACl6N DEl EXTRACfO CRUDO TOXIGENICO E INTENTO DE PURIACACl6N

DE LA HEMOUSINA

Cultivo para la producci6n de los PEe. Se emplearon combinaciones de medios decultivo y diferentes condiciones para la producci6n de los PEe. Se ensayaron: caldoinfusi6n cerebro-corazon (BHI) mas extracto de levadura (0,2% p/v: Ljungh etal., 1981;Schefferetal., 1988; Barryetal., 2001), TSB con y sin extracto de levadura al 0,2% (p/v);(Burke et 01., 1984; Majeed et al., 1990), medio de sales minimas con glicerol y acido 1-glutamico (MSM); (Allan y Stevenson, 1981; Riddle etal., 1981; Asao etal., 1986) ycul-tivo sobre papel celofan (Liu, 1957; Fackrell y Wiseman, 1976; Fujita etal., 1988). La

78 Articulo - Extraa:i6n de prodoaoe extraceiulares de Aeromonas hydrophilay sus efectos en tilapia roja(Oreochromis spp.)y cachama blanca (Piaractus brachypomus). Rodriguez, ec al.

bacteria previamente cultivada en TSA a 28°C par 18 horas se suspendi6 en 5 ~L deSSF y se sembraron 2 ~L (1 O' UFC) de la suspensi6n bacteriana por mL de cad a unode los medios lfquidcs mencionados a 28°C por40 horas con 0 sin agitaci6n constante(Ljungh et ot., 1981; Asao et 01., 1984). Se inyect6 aire filtrado por membrana deMillipore® 0,22 urn, para oxigenary agitar el medio (Wretlind etal., 1973; Asao eta/.,1984). Al finalizar el perfodo de incubacion los medics se centrifugaron a 6.000 x g poruna hora a 4 °C Yel sobrenadante se filtro en membrana de millipore 0,22 urn.

Determinacion del pico de actividad hemolrtica. La dinarnica de la actividad hemolfticase determine a traves del tiempo con el fin de identificar el momento 6ptimo de cultivopara la produccion de los PEe. La bacteria se sembr6 en TBS a 28 "C. Se utilizaron lossobrenadantes del medic de cultivo cada 2 horas por un intervalo de 50 horas, previacentrifugaci6n a 3.000 x g por 30 minutos a temperatura ambience (18°C; Khalil yMansour, 1997) y filtraci6n a traves de membrana de Millipore® 0,22 urn. Se usa latecnica de determinacion de la actividad hernohtica reportada por Asao etal. (1984)y Kozaki etal. (1987).

Separacion de [a hemolisina. Para el intento de extraccion de la hemolisina se utilizaronlos extractos crud os obtenidos en TSB. Se concentraron y separaron por cromatografia.Para concentrar los extractos crudos se utilize deshidratacion a 4 °C Y precipitacionacida de prorefnas. La primera se hizo en membranas de dial isis (Sigma) de 12 kDa deramano de poro que se expusieron a flujo de aire rrlo constante a 4 °C por un lapsede 12 a 18 horas (Ljungh et al., 1981; Loghothetis y Austin, 1996). Para la precipitacionacida se ensayaron dos tecnicas: precipiracion con H2S04 3 N mas ARN de levadura tipoVI (Sigma® R~6625) y precipitacion con acido tricloroacetico al 5% (Iwasaki ySakaguchi, 1978; Asao et al., 1984). La separaci6n se efectu6 por cromarografla en co-lumna de aminoetil cuaternario (QAE)-Sephadex A-50 (Pharmacia Fine Chemicals®).Se midio la protefna a una longitud de onda de 280 nm, posteriormente se conservaroncon azida de sodio al 0,02 % a 4 'C (5igma® 5-2002; Loghothetis y Austin, 1996). Alos picas de protelna se les midi6 actividad hemolftica, y al que mostro mayor actividadse Ie hizo electroforesis en gel de poliacrilamida con dodec;1 sulfato de sodio SDS~PAGE.Igualmente se efectu6 esta prueba a los extractos crudos de los cultivos en los mediosde sales mlnimas y TSB, Ya los concentrados por deshidrataci6n: al precipitado conacido tricloroacetico yal pico de protelnas obtenido por cromatograna. Se usa un gelde resolucion 12,5%T-2,5%C y otro de concentraci6n de 3%T-2,5%C con 0,1% de SDSen camara Mini-V 8-10 BRL® Y fuente de poder Kyoritsu KM-86® a 110 V (Towbinet al., 1979; Garda, 2000). Se utilizaron patrones de bajo peso molecular constituidospor lisozima (14 kDa), tripsinogeno (24 kDa), anhidrasa carbonica (31 kDa),ovoalbu-mina (45 kDa) y albumina serica bovina (66 kDa; Neville, 1971). Para la visualizacionde las bandas de proterna se hizo tinci6n con azul brillante de Coomassie R-2S0 al 0,2%(Asao et 01., 1984; 5telma et of., 1986; Kozaki et 01., 1987; Tegtmeier et of., 1995).

DETERMINA06N DE LA ACTIVIDAD BIOl6GICA DE lOS PEePara la determinacion de la actividad hemolrtica se desarro1l6 una prueba cualitativautilizando cultivos en cajas de Petri can TSA can sangre Qvina desrribrinizada al 5% (v/v)

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con el fin de observar halos de hemolisis alrededor de las colonias y una cuantitativa enplaca de microrecnica utilizando globules rojos de diferentes especies (tilapia, cachama,raton, rata, conejo, ovino, canino, caballo, bovino y humano, grupo sangufneo A+)usando volurnenes finales de 200 ~L, que se leyo a una longitud de onda de 540 nm, enun lector de microplaca de ELISA(Kozaki et al., 1989; Ferguson et at., 1997; Xu et al.,1998). Se usaron los PEC sin concentrar y con centrad os por deshidratacion en dilucio-nes al doble desde 1:2 hasta 1:8192. Una unidad hemolitica (UH) se definio como elredproco de la mayor diluci6n eapaz de lisar el 50% de los eritrocitos (+0,4 de absor-bancia; Ljungh et al., 1981). Como la literatura reporta que el tratamiento con tripsinamejora Ia actividad hernohtica se incubo una muestra de PEC con 1 mglmL de tripsinapara probar su efecto (Asao et al., 1986; Ferguson et al., 1997; Krause et 01., 1998;Santos et 01., 1999). Para [a determinacion de la actividad proteolftica se establecio unaprueba eualitativa eultivando la bacteria en TSA con leche descremada al 5% (v/v).Halos translucidos alrededor de las colonias se consideraron un resultado positive.(Ljungh et al., 1981; Sakai, 1985; Paniagua et al., 1990). De forma cuanritariva se em-plec la tecnica descrita por Sakai (1985) empleando casefna. Una unidad prcteolftica(UP) se definio como el incremento de 0,001 en la absorbancia a 280 nm respecto alcontrol negativo (Marsden etal., 1996; Khalil y Mansour, 1997).

PATOGENICIDAD DE lOS PEe EN PECES

Se tomaron htbridos de tilapia roja (Oreochromis spp.) y cachamas blancas (Piaractusbrachypomus) de 7-1 °g de peso, y se inocularon intraperitonealmente can los PEC pro-ducidos en TBS con una concentracion original de protefna de 2,3 pg/mt., 128UH/mL y 38,4 UP/mL. Se hicieron diluciones dobles desde 1:2 hasta 1:64 y se inocu-laron cinco ani males para cada diluci6n y especie de pez, con 0,1 mL/pez; se inoculoun grupo can los PEC sin diluir. Se utiliz6 la misma metodologfa y las condiciones quepara la valoracion de la patogenicidad de la cepa (Allan y Stevenson, 1981; Khalil yMansour, 1997). EI grupo control fue inoculado con SSF esteril. A los peees mori-bundos se les hizo necropsia y los tejidos se fijaron en formaldehido al 3,7% y seprocesaron con la tecnica hisrologica de rutina para H&E; se procesaron dos animalesporcada especie a los 5,15,30,60,120 Y240 min; al cabo de 72 horas los que sobre-vivieron fueron sacrificados.

RESULTADOS

AISLAMIENTO DE LA CEPA Y VAlORACION DE SU PATOGENICIDAD

Tanto la morfologla como las pruebas bioqufmieas practicadas a la bacteria coinci-dieron con los patrones descritos para la A hydrophila (Popoff y Veron, 1976; Popoff etal., 1984; Imziln et al., 1997, Popovic et at., 2000). La prueba de Cristal BBL® mostrouna especificidad del 99,9%. En la prueba de patogenicidad, tanto las tilapias comolas cachamas mostraron el cuadro de septicemia hernorragica reportado por la litera-tura (Paniagua et al., 1990; Swann y White, 1991; Grizzle y Kiryu, 1993). Fue evidentela dilatacion abdominal, la asci tis, la protruci6n anal y las multiples hemorrag(as pete-quiales en diversos organos. Algunas tilapias desarrollaron intususcepci6n intestinal.La cepa inoculada se recuper6 de bazo, hfgado y rifi6n de ani males moribundos.

80 Articulo - &tracci6n de productos extracelulares de Aeromonas hydrophilay sus efectos en tilapia roja(Oreochromis spp.)y cachama blanca (Piaractus brachypamus). RtJdrfguez, et al.

PREPARACl6N DE LOS PEe Y EXTRACCI6N DE LA HEMOLISINA

La FIgura 1 indica la dinamica hemohtica de la cepa sobre eritrocitos de conejo, el picomaximo de actividad hemolftica se not6 a partir de las 36 horas de cultivo sin agitaci6n,y se mantuvo hasta las 50 horas, tiempo que se utilize en los ensayos posteriores.

1,2

1,0

0,8

~ 0,'

0,4

0,2

00 , 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50

Tiempo (h) -- Aer. hemol/rica

Figura 1. Dinamica hemolttica de la A hydrophifa sabre eritrociros de conejo. EI pico maximo de acti-vidad hemolitica acurri6 a partir de las 36 horas y se mantuva durante el tiempo evaluado (50 horas).

Las recnicas para la precipitaci6n acida de protefnas no dieron buenos resultados.La tecnica de precipitaci6n proteica con solvenres acidos (H2S04) no mostr6 ningunprecipitado y con la de acido tricloroacetico al 5% (p/v) se obtuvo un volumen muypequeno de precipitado (600 ~L), can concentraci6n baja de proteina (293 pg/mt.).

"En contraste, la deshidratacion a 4 °C produjo 1.900 ug/ul.de protefna y un volumende 4 mL. Este extracto se cargo en columna de cromatografla y rnostro dos picospequeiios de protefna rerenida que fueron elufdos por el gradiente lineal con NaCI(Fig. 2), e! primer pica no tuvo actividad hernolttica y el segundo present6 actividadmuy leve (2 UH/mL), y baja concentraci6n de proteina (108 pg/ml.). En las condi-ciones anoradas, la baja actividad hemolftica de los PEC sumada a la concentraci6nde protelna igualrnente baja no perrnirio la separaci6n de la toxina.

0,12 0,' • Contenido de protefna

0,35 • Concentrilci6n de NaCI0,1

0,3 ~f 0,08

0,25 ~z~ ~~ 0,06 0,2 i. '. ."8 0,'"

0,15............... ........ 0,1 eU

0,020,05

0 00 50 100 '50 200

Numero de fracci6n (2,3 ml)

Figura 2. Cromatograffa de los PEC en (QAE)-Sephadex A-50. Se obtuvieran dos picos pequefios deproteina can el eluido de gradiente lineal de NaCI.

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Como se muestra en la figura 3, cuando se efectuo la prueba de 50S-PAGE a losextractos crudos del cultivo en TBS precipitados con acido tricloroacetico, a losconcentrados por deshidrataci6n y al segundo pico de protefnas de la cromatograffase obtuvieron bandas muy tenues de tres pesos moleculares diferentes: una de 30 a36 kDa, otra de 50 a 52 kDa y la tercera de 63 a 68 kDa. Por otra parte, con el con-centrado a partir del cultivo en MSM se obtuvieron bandas de los mismos pesos peromucho mas nftidas en el gel, especialmente las de 50 a 52 kOa y 63 a 68 kDa.

~J~J""Is

Figura 3. Elecrroforesis de exrracros crudos de A. hydrophila. Se observan band as muy tenues e tr~ ~diferenres pesos obrenidos de cukivo en caldo soya rripricasa (TSB), precipirado can acido •• :roacetico (PA), segundo pico de protemas de cromacografia (Cr): 32 a 36 kDa (v), otra de 50 a .(0) y la tercera de 63 a 68 kDa (v). En el PEC obtenido a partir del cultivo en MSM (MS) se vis , t:

bandas mas notorias: 50 a 52 kDa y 63 a 68 kDa. En orden: MS: PEC a partir de MSM, PA:prec pita 0·-----con acido rricloroacetico, TSB: caldo soya tripticasa {l 5 ~g de prorefna), Cr: segundo pica de prorernade cromarografla, TSB: caldo soya rripticasa (30 IJgde protefna), PM: patron de peso molecular.

1~I

lJ

!1r,

DETERMINACI6N DE LA ACTIVIDAD BIOl6GICA DE lOS PEePruebas in vitro. La bacteria cultivada en TSA con sangre al 5% (v/v) present6 zonasclaras de hem61isis alrededor de las colonias despues de 24 horas a 28°C. Del mismomodo, se apreciaron halos claros de prote61isis con leche descremada al 5% (v/v). Losextractos crud os no concentrados producidos en TSB dieron titulo hemolrtico ensangre de conejo de 8 UHjmL y proteolfrico de 1 UPjmL, y los de cultivo sobre papelcelofan, caldo BHI y medic MSM, mostraron 8, 4 Y10 UH/mL, respectivamenre. Losextractos en TSB con centrad os por deshidrataci6n incrementaron en 16 veces la acti-vidad hemolftica (128 UHjmL) y en 38,4 la proteolftica (38,4 UPjmL); los PEe con-centrados por precipitacion acida ruvieron menos de 2 UH/mL, En la tabla 1 se en-cuentran los tftulos hemolfticos de los PEC producidos en TSB y concentrados pordeshid'rataci6n enfrentados a eritrocitos de diferentes especies anirnales. Los gl6bulosrojos de rata demostraron la mejor actividad hemolftica seguidos por los de raton,canino y conejo. A los PEC producidos en MSM no se Jes hizo el anterior procedi-miento debido al bajo volumen disponible.

82 Articulo - Extraccion de productos extracelulares de Aeromonas hydrophilay sus eieaos en tilapia ro]a(Oreochromis spp.)y cachama blanca (Pia-actus brachypomus). Rodriguez, et al.

Pruebas in vivo. De las tilapias y cachamas inoculadas intraperitoneal mente con losPEe, unicamente presentaron signos y lesiones las inoculadas con el extracto crudosin diluir y en diluci6n 1:2. En las cachamas no hubo mortalidad y en general fueronmas resisrenres que las tilapias, aunque se vi6 letargia severa y ascicis marcada. AIcabo de dos horas se recuperaron y no exhibieron cam bios macro ni microsc6picosdespues de este tiempo. Las cachamas que se procesaron antes de las dos horas post-inoculaci6n en general mostraron congestion severa y hemorragias petequiales en lacavidad abdominal. En las que mostraron signos, microsc6picamente se observe de-generaci6n hialina en musculo liso del tracto gastrointestinal, principalmente enesrornago, con conrraccion de las fibras musculares, formaci6n de espacios trans-lucidos entre sf y necrosis multifocal severa de la pared (Fig. 4B), necrosis severa delpancreas (Fig. 40) Yvacuolizaci6n severa en el hrgado. En el rejido hemaropoyeticoesplenico y del rinon anterior hubo alreracion de la arquitectura y acumulo de es-tructuras hialinas, aparentemente gl6bulos rojos en proceso de muerte (Figs. 4F y4H). En el rinon posterior fue frecuente el desprendirniento y la degeneraci6n de lascelulas tubulares por material hialino (Fig. 4J). Se presentaron degeneraci6n hialinaen la pared muscular de ta cavidad abdominal y en el miocardio, y endocarditis. Loscam bios microvasculares fueron leves y se limitaron a la cavidad abdominal, el hlgadoy el tracto gastrointestinal, con [eve congestion, edema y hemorragia (Fig. 4B). Lastilapias tuvieron en los estadios iniciales (1-2 horas posr-inoculacion) signos comonado erratico. oscurecimiento de la piel, excitaci6n con estadios de letargia y episo-dies de aumenro marcado 0 disrninucion de movimientos operculares. En la necrop-sia se via enrojecimiento de las branquias, ascitis con fluido hemorragico (en ocasio-nes oscuro y de mal olor), reblandecimiento de la pared abdominal, y hemorragiaspetequiales en pared y en diversos 6rganos de la cavidad abdominal. En dos casos,una tilapia inoculada con exrracto crudo sin diluir y una con dilucion 1:2, se present6inrususcepcion del intestine.

Especie UH/~L

Ovino <2Humano (A+) 2

!Tilapia 2Cachama 2

I Bovino 2Equine 4

Conejo 128Carrino 256Rat6n 512Rata 1024

Tabla 1. Actividad hernolftica de los PEe de A. hydrophila sabre eritrocitos de diferentes especies.

Acto Bio!6gicaColombiana, Vol. 10 No.2, 2005 83

A. B.

c.

E.

G.

I.

D.

'~~'n ... )

F.

Figura 4. Morfologfa. A. Est6mago normal de cachama blanca. Mucosa gastrica (M), tejido glan-dular (G), muscular (Ms) y serosa (5) H-E (aprox. lOOx). B. Estcmago de cachama blanca inoculadacan PEe. Hialinizacion y vacuolizacion severas del cejido muscular (--t) H-E (aprox. 400x). e. Pan-creas normal de cachama blanca. Se observa la estructura acinar cornpuesca par celulas con cite-plasma basofilo y con numerosos granules secrerorios citoplasmaricos de color eosin6filo (-) H-E(aprox. 200x). O. Pancreas de cachama blanca inoculada con PEe. Necrosis, notese los nucleos pic-notices (-) y separacion entre celulas (t) H-E {aprox. 400x). E. Bazo normal de cachama blanca.Pulpa roja (P), rejido reticular (R) y tejido linfoide (L) H-E (aprox. lOOx). F. Bazo de cachama blancainoculada con PEe. Acumulo severo de escruccuras hialinas, en algunas se aprecia el nucleodesplazado a la periferia (-) H-E (aprox. 400x). G. Rifion anterior normal de cachama blanca. Abun-dantes leucocitos (-) y tejido tiroideo (t) H-E (aprox. 200x). H. Rifton anterior de cachama blancainoculada con PEe. Acumulo de esrructuras hialinas (t) H-E (aprox. 400x). I. Rifton posterior normalde each am a blanca. Tubules renales (-) y escaso rejido hematopoyetico (t) H-E (aprox. 200x). J. Ri-non posterior de cachama blanca inoculada con PEe. Acumulc de estructuras hialinas principal-mente entre el rejido hematopoyetico (-) H-E (aprox. 400x).

84 Articulo - Extraccidn de productos extracelutares de Aeromonas hydrophila y sus eteaos en tilapia roja(Oreochromis spp.)y cachama blanca (Piareccus brachypomus). Rodriguez, et al.

En el grupo de tilapias inoculadas con los PEC sin diluir murieron cuatro de cinco,mientras que en el de diluci6n 1:2 murieron tres de cinco. La rnortalidad ocurri6 antesde la hera y media post-inoculaci6n. En esta especie los cam bios hisropatologicosfueron similares a los de las cachamas.

DISCUSI6N

Las pruebas bioqufmicas practicadas a ta cepa junto con la rnorfologia y tincion deGram siempre correspondieron a 10 reportado por la literatura para A. hydrophila(PopoffyWron, 1976; Popoffetal., 1984; Imziln etal., 1997; Popovic et al., 2000).Los sign os chnicos de los peces inoculados con la misma confirmaron su virulencia yfueron compatibles con los reportados por diferentes autores (Paniagua et al., 1990;Swann y White, 1991; Grizzle y Kiryu, 1993). En la mayor parte de la literatura inter-nacional se utilizan temperaturas de cultivo de 37°C para la produccion de los PEe.La cepa en este trabajo se culcivc a 28°C, temperatura en la cual se obtuvieron losPEe. Tsai et 01. (1997) encontraron que las toxinas de A. hydrophila se producen a 37,28 Y 5°C, pero la ~ hemolisina es mas estab!e cuando la bacteria se cultiva a 28°C,10 cual fue confirmado en este trabajo, por esta razon concluimos que esta tempe-ratura es la adecuada para la obtencion de la ~ hemolisina.

En esre trabajo se probaron diferentes medios de cultivo para la produccion de losPEC, entre ellos la ~ hemolisina. En los que se obtuvo la mejor actividad hemolfticafueron el TSB (8 UH(mL) y el MSM (10 UH(mL). Algunos autores recomiendan latecnica de cultivo sobre papel celofan para mejorar el tftulo hernolrtico (Santos et al.,1991 y 1996; Esteve et al., 1995), en nuestros ensayos ni esta tecnica, ni la agitaciondel medio, mejoraron tal actividad (8 UHjmL). Se reporta que los mejores mediospara la produccion de hemolisina son el TSB y el MSM, y algunos rnedios suplemen.tados con extracto 0 RNA de levadura (Wretiind etal., 1973; Riddle etal., 1981, DiPietro et al., 2004). En nuestro case, la actividad hemohtica y Ja producci6n de ban-das de PEC mejcr definidas se mostraron cuando la cepa creci6 en MSM.

EI sistema de concentracion de los PEC por deshidrataci6n con aireaci6n permanentea 4 °c fue el mas efectivo, no solo porque caus,6 la menor perdida de actividad hemo-Iftica comparado con los metodos de precipitaci6n acida, sino porque se obtuvo unvolumen aceptable de extracto concentrado con buena concentraci6n de protefna.En contraste, algunos reportes consideran que la actividad hemolftica puede dismi-nuir a 4 °c (Allan y Stevenson, 1981). Se reportan otras metodos de concentraci6ncomo la precipitaci6n con solventes acidos como HCI 5 N Y H2S04 3 N (Asao et a/.,1984 y 1986), sin embargo, nuestros resultados nos permiten sostener que el me-toda de deshidrataci6n aquf utilizado es sencillo y efectivo. Cuando los PEC concen-trados se pasaron por la columna de (QAE)-Sephadex A-SO se obtuvieron dos picospequenos de protefna de los cuales solo el segundo tuvo actividad hemolftica, aunquedisminuida en comparacion con los PEe concentrados previo a su paso por la colum-na. La purificaci6n y el almacenamiento hacen labiles las toxinas de los extractos, per-diendo sus actividades biol6gicas tanto in vivo como in vitro debido a factores frsicos,

Acta Biol6gicaColombiana, Vol. 10 No.2, 2005 85

como la temperatura, 0 quimicos, que causan desnaturalizaci6n de las proteinas(Allan y-Srevenson. 1981; Stelma et al., 1986; Rose et al., 1989a). Barry et al. (2001)proponen que la hemolisina se une a geles basad os en matrices de agarosa, como losde sephadex, hecho que incrementa su retenci6n y disminuye la actividad hemohtica.Asao etal. (1984) encontraron que en cromatografia en (QAE)-Sephadex A-SO la he-molisina eluye en el segundo pice, 10 que sugeriria que es factible que en nuestroensayo el segundo pico corresponda ala hemolisina reportada por ellos, la cual ten-dria actividad biol6gica disminuida (Fig. 2), Y que no fue posible purificar debido asu baja concentraci6n (108 ug/rnl. de proteina total).

EImejor rendimiento de los PEC se obtuvo con el MSM yen la electroforesis bajo con-diciones desnaturalizantes mostraron bandas de tres pesos moleculares de diferenrerango: una banda muy nfcida, con un peso entre 50 y 52 kDa; otra, igualmente nfcida,con un peso entre 63 y 68 kDa; y varias bandas tenues entre 30 y 36 kDa (Fig. 3). Lade SO-52 kDa coincide con el peso reportado para la B hemolisina (52 kDa aproxima-damenre; Bernheimer et ai., 1975; Chakraborcy et al., 1986, Ferguson et al., 1997;Pemberton etal., 1997; Wong etal., 1998) y la de 63-68 kDa con el reportado parala ~ hemolisina (6S ± S kDa; Ljungh etal., 1981; Thelestam y Ljungh, 1981; Wongetal., 1998). No obstante, tarnbien se describe una serina proteasa termolabil de 68 kDa(Cescon etal., 2000) y otra hemolisina reportada por Potomski et al. (1987) de 63 kDacuyas caracrerrsticas biologicas son iguales a las de la ~ hemolisina. Las band as tenuesde 30-36 kDa pueden ser orras protefnas secretadas por la bacteria 0 liberadasdespues de la lisis de los microorganismos (Santos et al., 1996). Segun el peso, estasprorefnas podrfan corresponder a: DNAasa (25-30 kDa), glicerofosfohpidocolesterolaciltransferasa (30 kDa), metaloproteasa termoestable (36 kDa) y e1astasa (38 kDa;Pemberton et a!., 1997; Casc6n et aI., 2000). En nuestra opinion, en los extractoscrud os de A. hydrophila se encontrarfan las u y ~ hemolisinas y algunas proteasas.Diferentes autores reportan toxinas en rangos cercanos a 50 y 52 kDa con carac-terfsticas hernolfticas, citot6xicas y enterorcxices, que han recibido diferentes nombres.Algunas son la enterotoxina citolftica 0 cicctoxica (Act; Chopra et al., 2000), aerolisina(Buckley, 2001), AHH3, AHHS Y ASA1 (revisado por Wong et a!., 1998), ASHl Y ASH3(revisado por Heuzenroeder et al., 1999), y HlyA Y AerA (Heuzenroeder etal., 1999).Basados en la actividad serol6gica y la secuenciaci6n de aminoacidos, algunos autoresconsideran que son diferentes toxinas (Chopra y Houston, 1999; Chopra et al., 2000),mientras que otres creen que podrfa ser el mismo tipo de molecula can varia-cionesestructurales segun la cepa (Buckley y Howard, 1999).

Cuando la bacteria se cultiv6 en agar can sangre ovina al 5%, predujo zonas de he-m61isis translucidas como las que reporta la literatura para las cepas productoras de~ hemolisina. Aun as!, no podemos descartar la presencia de u hemolisina, ya que laa hem61isis es una hem61isis incompleta que se manifiesta como zonas opacas, yla actividad de B hem61isis puede enmascarar la de la u. Aun mas, los resultados dela electroforesis mostraron bandas de pesos moleculares muy cercanos para ambashemolisinas. En nuestro caso, los extractos crudos sin concentrar produjeron activi-dad hemoHtica baja (8 UHjmL en TSB) que mejor6 cuando se sometieron a deshi-

86 Articulo - Extracci6n de productos extracelufares de Aeromonas hydrophila y sus efectos en ti/apia roja{Oreochrornis spp.)y cachama blanca (Piaractus brachypomus). Rodriguez, et al.

dratacion (128 UH). Asao et a/. (1984) encontraron un titulo de 980 UH/mL enmedic TSB sin concentrar, Ljungh etal. (1981) describieron un titulo de 1024 UH/mL,Riddle et a/. (1981) 156,5-400 UH/mL y Asao et al. (1986) 1410 UH/mL. Dado queen este estudio se utilizaron diversos medios para la producci6n de la 13 hernolisina,creemos que la escasa producci6n no dependeria del medio de cultivo, sino mas biende que la cepa no sea buena productora de exotoxinas in vitro e in vivo. La escasaactividad hemoHtica podrfa deberse a la baja concentracion de estas toxinas en losextractos, Algunos invesrigadores reportan diferencias en la actividad biologica de la~ hernolisina y en la cantidad de toxina producida dependiendo de la cepa, con dife-rencias de hasta 30 veces mas actividad hemolftica entre una cepa de alta producci6nfi-ente a otra de poca actividad (Asao et al., 1986). Tambien se han encontrado cepasque son mas sensibles a cam bios de temperatura para que su roxina se adhiera aeritrocitos de diferentes especies; Kozaki et 01. (1987) demostraron que ta toxina dela cepa AH-1 se une mejor a ericrociros equines a 25°C que a 37°C y que la toxinade la cepa CA-11 es mucho mas hemolitica para esros eritrocitos que la de la AH-1.

Se utitiza ta tripsina para incrementar la actividad hemolltica de los PEC considerandoque una buena proporci6n de las toxinas hernolfricas se encuentran en forma deprotoxina y que la adici6n de tal enzima las activarfa (Krause et at., 1998; Santos etal.,1999). En nuestro experimento no encontramos un aumenro en la actividad hernoh-tica cuando se trataron los PEe con dicha enzima. Como se demostr6, los PEe obte-nidos en esta investigacion tienen actividad proteohtica; esto permitirfa suponer quegran parte de las toxinas hemoltcicas ya se encontraban en forma activa, y no comoprotoxina; pequefias cantidades de proteasa de A hydrophila pueden ser tan efectivaspara activar la proroxina como la tripsina (Howard y Buckley, 1985; Cahill, 1990).Kozaki et 01. (1989) demostraron que la cepa AH-6 de A. sobria a las nueve horas decultivo no mostraba actlvidad hemolitica, y que solo se manifestaba cuando la toxinase rrataba con tripsina; sin embargo, a las 24 horas cuando la cepa liberaba su propiaproteasa, la actividad hemolftica era identica que al agregar la tripsina. Estos hechosapoyan, aun mas, la hip6tesis de que la cepa utilizada en este trabajo no es buena pro-ducrora de hemolisina. Cuando la bacteria se cultiv6 en agar leche, los PEC produjeronhalos tenues de aclaramiento, los cuales correspondieron a 38,4 UP/mL en los extrac-ros concentrados por deshidrataci6n, de manera similar a 10 documentado por otrosinvestigadores (Sakai, 1985; Paniagua et al., 1990). Estos hallazgos sugieren que lacepa aquf utilizada produce proteasas que corresponderfan a las bandas cercanasa 30-36 kDa mencionadas anteriormente como la MPTE (35-38 kDa).

La inoculaci6n intraperitoneal del extracto crudo sin diluir y con la diluci6n 1:2 indujosignos cHnicos en la mayona de los ani males y ocasion6 leslones en distintos tejidos y6rganos. En general, las cachamas fueron mas resistentes en cuanto a letalidad que lastilapias, aunque histol6gicamente presentaron lesiones similares en intensidad y calidad(Fig. 4). Allan y Stevenson (1981) inocularon truchas intraperitonealmenre con PEe yencontraron que las truchas de 4 g eran mas resistentes que las de 9 g. La mortalidaden truchas fue muy similar (80%) a la de las tilapias en nuestro ensayo (80%), pero apa-rentemenre estas ultimas son mas susceptibles que las primeras, porque algo menDs de

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la mitad de la concentraci6n de protefna indujo mayor mortalidad en la diiucion 1:2.En nuestro trabajo murieron cuatro tilapias de cinco con los PEC sin diluir, can 12,8UH, 3,84 UP Y 230 ~g de protefna por dosis; y murieron tres de cinco para la dilucion1:2 en las primeras dos horas. Por el conrrario en el experimento de Allan y Stevenson(1981) los PEC sin diluir (5,3 UH, 34,6 UP Y490 ~g de proteina por dosis) produjeronmortalidad en cuatro de cinco truchas; y en una de cinco para la diluci6n 1:2. Con unacepa deficiente en proteasas (10,84 UH Y460 IJgde protefna por dosis), los anterioresautores obtuvieron mortalidad total con in6culos no diluidos y en diluci6n 1:2. Santoset 01. (1991) encontraron alta mcrtalidad en truchas entre las 24 y 48 horas post-inoculaci6n intraperitoneal a dosis de 108-350 ~g de proteina. Khalil y Mansour (1997)reportaron mortalidad entre las 12 y 72 horas para rilapias. y encontraron que los PECcausan mayor mortalidad que las bacterias vivas completas, elias 10 explican porlas actividades proteolrticas y hemolrticas de los PEC, puesto que la inactivaci6n de lastoxinas can calor disminuy6 la mortalidad en un 100%. Las mayares lesiones par losPEC se produjeran en el sistema gastrointestinal y sobre los eritrocitos de las cachamasy tilapias (Fig. 4). Debida a la actividad biologica de las exotoxinas sabre el tejido, se Ieha dado gran impartancia a la ~ hemolisina (aerolisina 0 citotoxina enterot6xica), quesegun multiples autores posee actividad hemolftica, enteroroxica y citot6xica (Abramiet al., 1998; Gordon et a!., 1999; Field y Menon, 2000; Nelson y Buckley, 2000). Tal pare-ce ser el caso nuestro, en que el reblandecimiento de la pared abdominal, el acumulode fluido ascftico fetido, y la degeneraci6n del musculo lisa de tracto gastrointestinalfueron la expresi6n citolltica de la B hemolisina, 0 la expresi6n de la propuesta meralo-prateasa termoestable (banda entre 30 y 36 kDa), evidenciada par el redondeamientoy la deformacion de los globules rajas de una forma hemolrrica incompleta.

En rnamfferos, la hemolisina de A. hydrophila induce la producci6n de factor de necrosisrumoral a (TNF-a) e interleuquina 1~ (IL-1~) por los macr6fagos y celulas epitelialesdel intestine. Esto conduce al aumento en la perrneabifidad vascular, causanda edemay rnuerte celular (Cahill, 1990; Chopra y Houston, 1999; Matsche y Grizzle, 1999;Matsuyama elida, 1999); es pasible que este mecanisma tam bien funcione en lospeces. Adicionalmente, esta molecule induce apoprosis en ciertos tipos de celulas(Fivaz eta!., 1999). Esteve eta/. (1995) encontraron licuefaccion de la pared abdo-minal en anguilas inoculadas con PEC y relacionaron la lesi6n can alta actividadproteolftica. Sakai (1985) demostr6 estrecha relaci6n entre la actividad proteoliticade A. sa!monicida y su patogenicidad, cepas mutantes deficientes en la producci6n deproteasas fueron menos pat6genas que la misma cepa de campo. Khalil y Mansour(1997) conduyen alga similar y consideran que las exotoxinas, hemolisinas, y pro tea-sas de A ~ydrophiJa son letales para tilapia, puesto que cepas con alta producci6n deelias son mas letates que otras con menor producci6n. Nuestros PEC perdieroncompletamente su actividad hemolrtica y proteolitica, y dejaron de ser letales para lospeces cuando se expusieron a temperatura de ebullici6n del agua por 30 min. Hallaz-gos similares son reportados a temperaturas superiores de 56°C por 10 min parahemolisinas (Donta y Haddow, 1978; LJungh et 01., 1981; Khalil y Mansour, 1997) y de98-100 °C por 10-15 min para proteasas (Allan y Stevenson, 1981; Rose et al., 1989b;Khalil y Mansour, 1997).

88 Articulo - Extracci6n de productos extracelulares de Aeromonas hydrophilay sus erectos en tilapia rojo(Oreochromis spp.)y cachama blanca (Piaractus brachypomus). Rodriguez, er al.

En resumen, se obtuvo un extracto crudo roxrgenicc que contenfa los PEe de la A.hydrophilo con actividad hemolftica de 128 UH/mL y prcteolftica de 38,4 UP/mL, y queprodujeron band as entre 30 a 36, 50 a 52 y 63 a 68 kDa, capaces de inducir dartos entejidos de cachama y tilapia, y letalidad en esta ultima; aparentemente la actividadproteolltica serta mas marcada que la hemolftica. EI medio de eleccion para la pro-ducci6n de los PEC es el MSM, que mostr6 band as rntidas de protefna en SDS-PAGE.La recnica de deshidratacion a 4 °C result6 ser la mas adecuada para concentrar elextracto crude. Los intentos de extracci6n de la hemolisina fueron infructuosos posi-blemente debido a la baja concentraci6n de toxina en los PEe. Se deben adelantartrabajos tendientes a buscar recnicas que permitan manejar volumenes mayores de PEC.

AGRADECIMIENTOS

A los Doctores Gerardo Perez y Nohora Vega del Grupo de Investigaci6n en Protein as,Departamento de Qufmica, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia,por su valiosa colaboraci6n y gufa.

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