Agarose- Gel-Elektrophorese - · PDF fileEnzymen und Serumprotein weiterhin verwendet. Auch...

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    Agarose-Gel-Elektrophorese

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  • Agarose-Gel-Elektrophorese AppliChem 2009

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    2009 AppliChem Agarose-Gel-Elektrophorese 1

    1 Das Trennmedium Agarose und Alternativen dazu 21.1 Agarose: Die chemische Struktur und ihre Eigenschaften 21.2 Die Alternativen: Strke- und Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese 41.3 Anwendungen: Agarose in der Gel-Elektrophorese 61.4 Native und denaturierende Agarose-Gel-Elektrophorese 81.5 Modifikationen der Agarose-Gel-Elektrophorese 101.6 Isolierung von Nukleinsuren aus der Agarose-Gel-Matrix 12 1.7 Agarosen: Auswahlkriterien 181.8 Die Charakteristika der AppliChem-Agarosen 201.9 Anwendungstipps 26

    2 Puffer-Systeme 282.1 TAE-Puffer 282.2 TBE-Puffer 292.3 MOPS-Elektrophorese-Puffer (10X) 302.4 BPTE-Elektrophorese-Puffer (10X) 312.5 Alkalischer Agarose-Gel-Elektrophorese-Puffer (10X) 322.6 TAFE-Elektrophorese-Puffer 322.7 TPE-Elektrophorese-Puffer 332.8 TTE-Elektrophorese-Puffer 342.9 Low-Molarity Conductive Media 34

    3 Trennkapazitt 35

    4 Farbstoffe 364.1 Nukleinsure-Farbstoffe-bersicht 364.2 Protein-Farbstoffe-bersicht 38

    5 Glossar 40

    6 Verwandte Produkte 41

  • 2 Agarose-Gel-Elektrophorese AppliChem 2009

    1 Das Trennmedium Agarose und Alternativen dazu 1.1 Agarose: Die chemische Struktur und ihre Eigenschaften

    Agarose wird aus den Zellwnden ausgewhlter Rotalgen (Rhodophyceae) gewonnen. Dazu wird

    Agaropektin, ein Klebstoff der Zellwand aus verzweigten, vielfach modifizierten und geladenen

    Polysacchariden, entfernt. Nach der weiteren chemischen Modifizierung erhlt man eine sehr reine

    Agarose mit den erwnschten elektrophoretischen Eigenschaften: Das lineare, ungeladene Molekl

    zeigt wenig Interaktion mit anderen Moleklen wie Proteinen und Nukleinsuren. Diese Eigenschaft

    spiegelt sich in geringen Elektroendoosmose (EEO)-Werten wieder.

    Die durchschnittliche relative Molekularmasse von Agarose betrgt etwa 120.000. Wenn die

    Agarose geschmolzen wird, verflechten sich in den Gelen die langen unverzweigten Agarose-

    Molekle zu Helizes, die wiederum Suprafasern ausbilden (polymerisieren Abb. 1.2). Das so

    entstandene Agarose-Netzwerk bildet Poren mit 100 bis 300 nm Durchmesser (Brown 1988). Die

    Porengre wird durch die Agarose-Konzentration bestimmt. Neben dem Puffersystem ist sie der

    entscheidende Parameter fr das Trennvermgen von Agarose-Gelen (siehe Tabelle Trennkapazitten

    im Abschnitt 3). Die Grenzen des Auflsungsvermgens ergeben sich aus dem kleinsten

    Porendurchmesser; Agarose-Gele liefern gute Auftrennung bei Nukleinsuren >50 Basenpaare

    (bp). Kleinere Nukleinsuren trennt man meist auf Polyacrylamid-Gelen auf (siehe Abschnitt 1.2).

    Die Maximalgre von auftrennbarer DNA liegt bei etwa 25.000 bp. Auch grere Molekle werden

    noch auf Agarose getrennt. Dazu werden aber Anpassungen des Elektrophorese-Protokolls mit

    wechselnden Spannungsfeldern notwendig (siehe hierzu auch Pulsfeld-Gel-Elektrophorese (PFGE)

    im Abschnitt 1.3.4).

    Agarose wird in der Regel als feines Pulver geliefert. Die Lslichkeit der Agarosen ist nicht gleich.

    Manche lsen sich besser, manche schlechter, vor allem wenn sie in hheren Konzentrationen

    Abb. 1.1: Agarose ist aus 1,3-glycosidisch verbundenen Einheiten von 1,4-glycosidisch verknpfter -D-Galacto-pyranose und 3,6-Anhydro--L-Galactopyranose aufgebaut.

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  • 2009 AppliChem Agarose-Gel-Elektrophorese 3

    eingesetzt werden. Speziell Low Melt Agarosen mssen zum Teil autoklaviert werden, damit sie

    berhaupt in Lsung gehen. Wenn die Agarose zum Auflsen autoklaviert wird, ist darauf zu achten,

    dass sie sich nicht in einer Lsung mit einem pH-Wert niedriger als pH 5,5 befindet, da sie dann

    hydrolysiert. Als Folge wird das Gel nicht fest! Die Lsung muss also gepuffert sein reines Wasser

    kann nicht verwendet werden. Aufgrund des niedrigen Gelierpunktes empfiehlt es sich die Gele

    bestimmter Low Melt Agarosen vor Gebrauch fr mindestens eine Stunde, manchmal auch ber

    Nacht bei +4C zu lagern, da dadurch bei der Elektrophorese eine maximale Auflsung erreicht

    wird. Selbst der Gellauf ist dann am besten im Khlraum durchzufhren, damit sie sich nicht wieder

    verflssigt.

    Literatur[1] Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) 1995 Current

    Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York.

    [2] Brown, T.A. (1998) Molecular Biology Labfax, 2nd ed., Vol. 1. Academic Press, London

    [3] Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

    Abb. 1.2: Lineare Agarose-Molekle lagern sich zu Doppel helizes und mit einander verwobenen Suprafasern zusammen und bilden die Gelmatrix.

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    4 Agarose-Gel-Elektrophorese AppliChem 2009

    1.2 Die Alternativen: Strke- und Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese

    Leider kommt man im Labor selten mit nur einer Gelmatrix aus, da nicht alle Anwendungen mit

    einer Matrix durchzufhren sind. Jede Methode hat ihre Strken und Schwchen. Weitere Matrizes

    zur Trennung von Makromoleklen sollen hier nur kurz vorgestellt werden: Strke und

    Polyacrylamid.

    1.2.1 Die Strke-Gel-Elektrophorese taucht in den allgemeinen, molekularbiologischen

    Methodenbchern von heute gar nicht mehr auf. Die Zonen-Elektrophorese mit Strke-Gelen wurde

    zur Trennung von Serumprotein eingefhrt (Smithies 1955).

    Hydrolysierte Kartoffelstrke wird zu 10-15 % (w/v) in konzentriertem Puffer gelst und nach

    Erhitzen zu einer 0,5-1 cm dicken Gelmatrix gegossen. Die Herstellung der Gele ist etwas auf-

    wndiger, zudem gelten die Ergebnisse als schlecht reproduzierbar. Strke-Gele sind brchig und

    weniger transparent als Agarose- oder Polyacrylamid-Gele. Allerdings sind Gele aus der ber-

    wiegend naturbelassenen Strke eine enzymfreundliche Matrix und werden in der Aufreinigung von

    Enzymen und Serumprotein weiterhin verwendet. Auch fr Zymogramme, bei denen der Protein-

    Nachweis auf dem Nachweis der Enzymaktivitten im Gel beruht, werden Strke-Gele verwendet

    (z.B. Silva et al. 2008).

    Die ursprngliche Methode nach Smithies wurde vielfach modifiziert; z.B. eine zweidimensionale,

    vertikale Variante (Poulik & Smithies 1958). In Kombination erffnen die Eigenschaften von Strke,

    Agarose und Polyacrylamid zustzliche Mglichkeiten. In der Literatur finden sich zahlreiche

    Beispiele fr solche kombinierten Systeme, beispielsweise Strke-PAGE oder in-Gel Tests (Fontanini

    et al. 2007).

    1.2.2 Die Polyacrylamid-Gel-Elektro phorese (PAGE) ist eine vielseitige und die am weitesten

    verbreitete Methode zur Trennung von Peptiden und Proteinen sowie fr Nukleinsuren. PA-Gele

    werden durch die Polymerisation von Acrylamid-Monomeren zu langen Ketten und deren

    Quervernetzung mittels bifunktionalen Moleklen (Cross-Linkern), wie Bisacrylamid (N,N'-

    Methylenbisacrylamid), hergestellt. Ammoniumpersulfat (APS) dient als Initiator der Polymerisation

    von Acrylamid, TEMED katalysiert die Bildung freier Radikale des Initiators.

    Das Ergebnis der Poylmerisation von Acrylamid und Cross-Linkern ist eine definierte Matrix mit

    regelmiger Porengre. Die Porendurchmesser werden durch die Gesamtkonzentration an

    Acrylamid und durch das Verhltnis von Acrylamid zu Cross-Linker, welches den Vernetzungsgrad

    bestimmt, eingestellt.

  • 2009 AppliChem Agarose-Gel-Elektrophorese 5

    Die PAGE findet in zwei grundstzlich unterschiedlichen Variationen An wendung:

    1. PA-Gele fr die native Gel-Elektrophorese bestehen aus Poly acrylamid und Puffer ohne Zusatz

    von denaturierenden Substanzen. Damit bleiben Sekundrstruktur und Strukturen hherer

    Ordnung whrend der Elektrophorese weitgehend erhalten.

    2. Gele mit Zustzen, die Molekle whrend der Trennung im denaturierten Zustand erhalten,

    werden als denaturierende Gele bezeichnet. Beispielsweise wird die Analyse sehr kleiner RNA

    und Einzelstrang-DNA in Harnstoff-haltigen PA-Gelen durchgefhrt. Harnstoff unterbricht die

    Wasserstoffbrckenbindungen zwischen den Basen der Nukleinsuren und ermglicht damit

    die Trennung von Oligonukleotiden nahezu ausschlielich