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AGES-Webribo

Systematik in Clostridium difficile PCR-Ribotyping

Alexander Indra

AGES-Institut für medizinische Mikrobiologie und Hygiene Wien

Nationale Referenzzentrale für Clostridium difficile

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Clostridium difficile

Clostridium difficile ist auch in Österreich ein bedeutender nosokomialer

Erreger

• im Jahr 2003 wurden 777 Fälle registriert

– 53 davon mit tödlichem Ausgang

• Im Jahr 2010 wurden von Spitälern 2.186 Clostridium-difficile-Infektionen

gemeldet

– 181 davon mit tödlichem Ausgang

Das ist nur die Spitze des Eisbergs!

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Clostridium-difficile-Diagnostik in der österreichischen Referenzzentrale

•C. difficile Antigen Nachweis aus Stuhlproben

•C. difficile Toxinnachweis aus Stuhl (Tox A/B)

•C. difficile Kulturdiagnostik

– direkte Anzucht

– Flüssig-Anreicherung mit Alkoholschock

– Resistenztestung mittels E-Test

•Molekularbiologischer Nachweis von tcdA, tcdB, tcdC-Deletionen, cdtA und cdtB

•PCR-Ribotyping mittels Kapillar-Gel-Elektrophorese

• Im Bedarfsfall

– MLVA-Typisierung zur Subtypisierung im Ausbruchsfall

– tcdC Sequenzierung

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PCR-Ribotyping

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PCR-Ribotyping

• im Clostridium-difficile-Genom befinden sich bis zu 15 Kopien des

ribosomalen RNA-Operons

– in diesem Operon finden sich Gene für 16s, 23s und 5s RNA

– die Gene der 5s, 16s und 23s-RNA sind durch kurze DNA-

Abschnitte, die Intergenic-Spacer-Regions (ISR), getrennt

– die Abschnitte zwischen 16s und 23s können unterschiedlich

lang sein (zw. 200 und 650bp)

•durch PCR-Amplifikation der 16s-23s-ISR und die Bestimmung der

Fragmentlängen ist eine Typisierung möglich

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PCR-Ribotyping

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PCR-Ribotyping: Was steckt dahinter

Verantwortlich für die für die Unterschiede zwischen verschiednenen PCR Ribotypen sind 9bp langer Repeat im ISR

Dieser Repeat trennt

33 bp

53 bp lange variable DNA Sequenzen

Innerhalb einiger ISR findet man auch eine 172 bp lange spacer sequence die eine tRNA-Ala codiert

Dies ist zeigt eine eine hoch strukturierte Organisation des 16S–23S ISR von C. difficile

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182 bp ISRstart-v1 IB 0 bp IB ISRend-v2

215 bp ISRstart-v1 IB 33 bp v2 IB ISRend-v4








259 bp ISRstart-v5 IB 33 bp v11 IB 33 bp v10 IB ISRend-v3

277 bp ISRstart-v1 IB 33 bp v14 IB IB ISRend-v1

277 bp ISRstart-v1 IB IB 33 bp v1 IB ISRend-v1





498 bp ISRstart-v4 IB IB IB-T:C 33 bp v6 IB ISRend-v1

318 bp ISRstart-v1 IB IB 33 bp v11 IB 33 bp v7 IB ISRend-v5

500 bp ISRstart-v4 IB IB IB 33 bp v8 IB ISRend-v7

321 bp ISRstart-v1 IB IB 33 bp v12 IB 33 bp v9 IB ISRend-v3

363 bp ISRstart-v1 IB-T:G IB 33 bp v12 IB 33 bp v10 IB 33 bp v10 IB ISRend-v3

361 bp ISRstart-v1 IB-T:G IB 33 bp v12 IB 33 bp v10 IB-C:T 33 bp v10 IB ISRend-v8

319 bp ISRstart-v1 IB-T:G IB 33 bp v13 IB 33 bp v10 IB ISRend-v9

397 bp ISRstart-v4 IB IB ISRend-v3172 bp v2

172 bp v1

171 bp v1

172 bp v1

53 bp v2

53 bp v1

53 bp v6

53 bp v6

53bp v8

53bp v8

53bp v8

53bp v9

53 bp v3

53 bp v4

53 bp v5

53 bp v1

53 bp v7

53 bp v1

53 bp v7

53 bp v7

Indra & Blaschitz et al .2010

PCR-Ribotyping: Was steckt dahinter

• slipped-strand mispairing • Homologe intra-chromosomal Rekombination • Homologe inter-chromosomal Rekombination?

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PCR-Ribotyping

• ist derzeit die wichtigste Methode zur Clostridium-difficile-Typisierung

•derzeit sind mehr als 250 PCR-Ribotypen in der Referenzzentrale in

Wales bekannt

•weltweit die wichtigsten PCR-Ribotypen sind 001, 014, 017,078 und

027

– neben dem ersten Nachweis eines Ribotyps 027 in Österreich

konnten auch ca. 350 verschiedene Ribotypen bestimmt werden

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konventionelles PCR-Ribotyping: Probleme

•problematischer Datenaustausch

– keine einheitliche Nomenklatur

•schwer zu beeinflussende Laufbedingungen beeinflussen die Analyse

– DNA Konzentration

– verwendete Agarose

– Temperatur

– Spannung

•schwierige Interpretation von Bandenmustern

– z.B. PCR-Ribotyp 066

– in Literatur mit Toxinotyp V und VI beschrieben

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PCR-Ribotyping

Ribotyping

100

98

96

94

92

90

88

86

PCR-Ribotyping

Probe 118

Probe 195

Probe 124

Probe 182

Probe 32

Probe 41

Probe 160

Probe 104

Probe 350

Probe 143

Probe 100

Probe 129

Probe 342

Probe 349

Probe 212

Probe 112

Probe 156

Probe 123

Probe 132

Probe 101

Probe 159

Probe 201

Probe 202

Probe 30

Probe 40

053

AI-52

078

078

027

AI-14

AI-29

AI-23

AI-50

AI-19

014

014

014

014

AI-9

017

AI-20

AI-27

AI-12

001

001

001

001

001

001

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konventionelles PCR-Ribotyping

• was muss verbessert werden?

– Vergleichbarkeit von Ergebnissen

– Datenzuverlässigkeit

– jedes Labor produziert vergleichbare Daten

– eine Datenbank zur Dateninterpretation

» Unabhängigkeit von Stammsammlungen

– einheitliche Nomenklatur

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Capillary gel electrophoresis based PCR ribotyping

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• hohe Reproduzierbarkeit durch Verwendung

– eines Flureszenz markierten Primers

– eines vorgegebenen Größenstandards, der gleichzeitig mit jeder Probe

mitläuft

– reproduzierbare Laufbedingungen

• höherer Proben-Durchsatz bei

niedrigeren Kosten

• Vergleichbarkeit der Ergebnisse

• einfache Datenanalyse

• höhere Diskreminationsfähigkeit

– Fragmente mit 1.5 Basen Abstand

und mehr können

unterschieden werden

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Capillary gel electrophoresis based PCR ribotyping: Diskreminationsfähigkeit

6 verschiedene 014 Subtypen

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Capillary gel electrophoresis based PCR ribotyping: Reproduzierbarkeit

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AGES-WEBRIBO

•AGES-Webribo

– ist eine kostenlose Web-Datenbank zur Interpretation von

Clostridium-difficile-Typisierungsergebnissen, die mittels Kapillar-

Gel-Elektrophorese basierenden PCR-Ribotyping gewonnen wurden

– Die Fragmentlängen und die dazugehörenden Peakhöhen der

Proben können direkt durch AGES-WEBRIBO oder mittels

GENESCANNER-, GENEMAPPER- oder PEAKSCANNER-Software

bestimmt werden

– Der Datenimport erfolgt mittels FSA, CSV- oder Excel-Files

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AGES-WEBRIBO

•Aufgrund vorgegebener Analysekriterien wird ein Qualitätscheck der Ergebnisse durch die AGES-Webribo-Software durchgeführt

– z.B. eine maximal erlaubte Peakhöhe verhindert die falsche Interpretation von „Split-peaks“

– Eine minimale Peakhöhe verhindert die falsche Interpretation von „Pull-Ups“

– Ergebnisse werden sofort als E-Mail versandt

– Informationen zu jedem PCR-Ribotyp sind online verfügbar

– neue PCR-Ribotypen müssen durch erneute Analyse bestätigt werden

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AGES-WEBRIBO

AGES-WEBRIBO verwendet einen neu entwickelten Algorithmus

zum Vergleich von neuen Proben mit der Datenbank

•dies erlaubt den Vergleich

von Daten unabhängig von

– Größenstandard

– dieser muss den Analysebereich (150-650Basen) umfassen

– Sequencer

– jedweder Kapillarlänge

– der verwendeten Gele

– Primer

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•52 Ausbruchsfälle werden identifiziert

• 38 PCR-Ribotype-027-CDI-Fälle allein im Spital HX

– 9 von 10 Pavillons des Spitals sind betroffen

– alleine 25 PCR-Ribotype-027-CDI-Fälle in einem der 9

• die 14 anderen Fälle traten in 4 weiteren Wiener Spitälern auf

– alle 14 waren eindeutig mit dem Spital HX assoziiert

10

9

8

7 ONE CASE

6

5

4

3

2

1

45 46 47 48 49 50 51 52 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Nov Dec Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug

THE INDEX CASE

AGES-WEBRIBO: PCR-Ribotyp 027 Ausbruch in Wien

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zwischen März und August wurden 720 Proben allein aus Wiener Spitälern an die Referenzzentrale übersandt

insgesamt wurden 1320 C.-difficile-Proben in dieser Zeit untersucht

1042 C.-difficile-Proben konnten angezüchtet werden

die Typisierung erfolgte mittels Capillar Gel Electrophorese PCR-ribotying in Kombination mit AGES-WEBRIBO

152 unterschiedliche PCR-Ribotypen wurden identifiziert

alle 52 PCR-Ribotype-027-Proben wurden auch MLVA-typisiert

die Arbeit wurde von nur 2 Teilzeit-BMAs zusätzlich zur weiteren Routinearbeit durchgeführt

• die durchschnittliche Zeit bis zum Befund betrug 6 Tage

AGES-WEBRIBO: PCR-Ribotyp 027 Ausbruch in Wien

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Die häufigsten Ribotypen in Österreich 2011

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Das Team

Fr. BMA. Hasenberger

Fr. BMA. Kunczer

Fr. BMA. Herold

Fr. BMA Fiedler

Hr. Dr. Hufnagl

Fr. Mag. Pecavar

Fr. Dr. Blaschitz

Fr. Dr. Huhulescu

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