Aktuelle Aspekte der Risikobewertung von Nanomaterialien...

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NG Aktuelle Aspekte der Risikobewertung

von Nanomaterialien in Lebensmitteln

Prof. Dr. Dr. Alfonso LampenAbteilung LebensmittelsicherheitBundesinstitut für Risikobewertung (BfR), Berlin

Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen – Size Matters – Nano auf dem Teller 27.02.2012 Seite 2

Potentielle Aktionsfelder von Nanotechnologie im Lebensmittelbereich

NANOLM

Land-wirtschaft

Produkte

Sicherheit von Lebensmitteln Zusatz-

stoffe

MaterialVerpack-

ungen

Quelle: eigene Darstellungnach Meili (2005)


Natürliche Nanopartikel in Lebensmitteln

• In Milch

• Im Hühnerei

• Bei Fetten und Fettbegleitstoffen

• Stoffwechsel


Aquanova, DeutschlandNanotechnologie zur Herstellung vonMizellen

- um unlösliche bioakive Substanzen in Lösung zu bringen- um Wasser/Fettlöslichkeit von Inhaltsstoffen zu ändern- Vitamine A, C, D, E, K- -carotin- Isoflavone- Omega-Fettsäuren

Organische Nanopartikel als Trägerstoffe, Carrier, Kapseln

www. Aquanova.de

Oder NutraleaseTM

Co-enzyme Q10 (Ubiquinon)LuteinLycopene PhytosterolVitamin D, E, A, beta-CarotineOmega 3 FSIsoflavone, Phytosterine www.nutralease.com


Bratöl „Canola Active Oil“ enthält Nano-Phytosterolkapseln (30 nm) - Cholesterinsenkung, Hersteller- und Vertriebsland: Israel

Nano-Grüntee - bessere Verfügbarkeit des in Teeblättern enthaltenen Selens: Steigerung der antioxidativen Wirkung(Hersteller- und Vertriebsland: USA im Internet)


Anwendungsbeispiele für Nanobeschichtungen von Verpackungen

• Vermeidung von Schwitzwasserbildung (Anti-Beschlag-Effekt)

• Vereinfachung der Restentleerung von Tuben undFlaschen


Anorganische Nanomaterialien

• Titandioxid(z.B. als Schokoladenüberzug zur Verbesserung des Aussehens von Schokoladen oder zum Aufhellen von Salatdressings)

• Siliziumdioxid bzw. Kieselsäure (zur Verbesserung der Fließeigenschaften z.B. von Ketchup und als Fließhilfsmittel für pulverförmige Lebensmittel)

• Aluminiumsilikate(ebenfalls als Fließhilfsmittel für pulverförmige Lebensmittel)

Laut BLL keine Anwendung i.d. Lebensmittelindustrie

Analytik von Nanomaterialien in Lebensmitteln wird in zentralen Lebensmitteluntersuchungsämtern aufgebaut!

Effekte im Zellkern- Störung der Replikation u. Transkription

TiO2 induziert DNA-Veränderungen

u. genet. Instabilität in vivo (Maus);

Trouiller et al., 2009

Neubewertung bei Verwendung von Nanopartikeln erforderlich

Gefahrenpotenzial


Titanium dioxide*• approved food additive (E171)

• contains a significant fraction (~36%) of the particles in the nano-scale;

• used in cake icings, sweets, chewing gum, etc

• insoluble and persistent material;

• Children have highest intake

• (Adult 1 mg Ti/kg´/day – child 2-4 times more)

* Weir, A., Westerhoff, P., Fabricius, L., Hristovski, K. and von Goetz, N. (2012) Titanium Dioxide Nanoparticles in Food andPersonal Care Products, Environ. Sci. Technol., 46: 2242–2250 ** Dekkers S, Krystek P, Peters RJ, Lankveld DP, Bokkers BG, van Hoeven-Arentzen PH, Bouwmeester H, Oomen AG (2011) Presence and risks of nanosilica in food products, Nanotoxicology 5(3):393-405.

Silica**• approved food additive (E551)

• contains a significant fraction (43 to 50%) in the nano-scale;

• used in e.g. coffee creamers, soup powders, etc


Durch Nanoformulierungen unterschiedlichster Art können Effekte erzielt werden:

• Verbesserung bzw. Veränderung der Löslichkeit und homogenere Verteilung von Substanzen durch Beeinflussung der Polarität

• Dadurch auch eine Erhöhung der Bioverfügbarkeit (Gefahr einer Überdosierung)

• Schutz vor Einflüssen des Produktionsprozesses, z.B. Zerstörung von Substanzen durch Hitzeeinwirkung oder Lagerungseinflüsse (Aroma, Farbe)

• Veränderung der optischen Eigenschaften, z.B. können üblicherweise trübende Substanzen klare Lösungen ergeben, oder es können durch optische Effekte Farbänderungen erfolgen.

• Diese potentiellen Anwendungen und noch andere stellen ein reichhaltiges Instrumentarium dar für das Designen von Lebensmitteln bzw. neuartigen Lebensmittel, Funktionellen Lebensmittel oder Nahrungsergänzungsmitteln dar. Auch Im Kosmetikbereich werden diese Möglichkeiten und weitere nutzbar sein.


http://www.nanotechproject.org/inventories/

Nanoprodukte in Forschung, Entwicklung und Anwendung


Kaufbereitschaft von Nanoprodukten als Maß der Verbraucherakzeptanz (BfR, 2006)

75

36

20

14

25

64

80

86

0% 20% 40% 60% 80% 100%

Kleidung

Kosmetik

Lebensmittel

Oberflächenversieglung und -pflege


Risikobewertung erforderlich hinsichtlich

Risikoforschung notwendig

Immer noch viele offene Fragen: Physikochemische Eigenschaften industrieller NP als potentielle LM-Zusatzstoffe Binden diese an andere LM-Bestandteile oder bleiben sie als freie NP im GI-Trakt? Haben NP als LM-Zusatzstoffe Effekte auf GI-Funktionen oder auf GI-Mikroflora? Größenbeschreibung der veränderten Absorption und BV und toxikologische Signifikanz Abgrenzung zu Novel Food Risiken durch indirekte Kontamination? Migration aus Verpackungen?

- Zulassung geregelter Stoffe

- Vorhandensein von NP als potentielle Kontaminanten in Lebens- und Futtermitteln

- Allgemeine Anfragen zur Applikation von NT in LM Produktion

– Auswirkungen auf Bioverfügbarkeit, Nährwert etc.


Anorganische Verbindungen - Kupfer

Akute Toxizität von Kupfer: Vergleich von Micro- und NanopartikelHintergrund: - Cu ist ein Mikronährstoff

Cu-Toxizität führt zu Hämolysis und zu Leber sowie Nierenschädigungen

Ziel: Vergleich Akute Toxizität von Cu-Mikro- und Nanopartikel nach oraler Gabe

Nano-Cu (23 nm, SSA 2,95 – 105 cm2/g, 1,7 – 1010 (Partikel Anzahl) /µg)Micro-Cu (17 µm, SSA 3,99- 102 cm2/g, 44/µgMaus, Einzeldosis (oral), Gewebe nach 48 h analysiert)

(Chen et al., 2006)SSA; Specific Surface Area)

Micro-Cu Nano-Cu Kontrolle

Niere keine - Nekrosis, Glomerulitis

-

Milz keine - Atrophie, Fibrosis

-

Leber keine - Schädigung,ALP, Cr ++++

-

Niere

Rel. Toxizität: Ionisch > NP > MP


Anorganische Verbindungen - Kupfer

Die Größenunterschiede hatten unterschiedlichen biologische Effekte zur Folge Wahrscheinlich indirekte Wirkung durch die Freisetzung der Cu Ionen Vergleich der biologischen Aktivitäten zeigt, die Oberfläche/Masse Angaben (SSA) im

Vergleich zu mg/kg erscheinen besser Daten demonstrieren, dass nicht-toxische Substanzen nicht unbedingt nicht-toxisch bleiben,

wenn Partikel verkleinert werden Wenn physikalische Eigenschaften sich ändern, ist es erforderlich, die

biologischen Effekte zu untersuchen

Milz

Toxische Effekte von NP (v.a. Oxide, Metalloxide) nach oraler Aufnahme bisher weniguntersucht; Langzeitstudien/Kanzerogenitätsstudien bisher nicht durchgeführt.


Toxicity studies with nanoparticle after oral uptake in vivo

Gold 4, 10, 28, 58, nm mice Intestinal uptakeDistribution

Hillyer and Albrecht, 2001

CopperCu-Ions23,5 nm17 µm

miceacute toxicityliver, kidney, spleen injuryBlood diagnostics

Chen et al., 2006

Zinc 58 nm250-1000 nm mice

Blood diagnosticsBlood coagulationhistopathology

Wang et al., 2006

Selenium 20-60 nm mice

acute toxicityliver injurybioavailabilityDistributionEffect on Se-Enzymes

Zhang et al., 2007

Zinc, Iron, Silicium

300 nm, 100 nm10 -20 nm40 - 50 nm90 – 110 nm

mice acute toxicity Cha and Muyung, 2007

Titanium Dioxid 21 nm mice

Genotoxicity(DNA deletion, Comet, micronuclei, strand breaks, oxidative damage)

Trouillier et al., 2009


Generelle Aspekte “nanoskaliert im Vergleich zu mikroskaliert”

- Höhere Exposition hinsichtlich Teilchenanzahl pro Masseneinheit- Geringe Größe, große Oberfläche könnte vermehrt ROS (reaktive Sauerstoff Radikale)produzieren

- Expositionswege können differieren z.B. olfaktorischer Transport- Verschiedene Verteilung im Gewebe aufgrund verschiedener Größe oder Oberflächen-Chemie(z.B. inflammat. Immunantwort ist mehr induziert durch feines und ultrafeines (~21 nm) TiO2)

- Neue Eigenschaften von nanoskalierten Material kann einen neuen Wirkmechanismus zur Folgehaben.

1. nanoskalierte Substanzen können durchaus im Vergleich zum Ursprungsmaterial verschiedene physikalische und chem. Eigenschaften besitzen Folge: mögliche Änderungen der toxikologischen Eigenschaften

2. Dosis-Wirkungsbeziehungen von nanoskaligen Material adäquat experimentell untersuchen(inklusive sehr guter Charakterisierung)

Notwendigkeit einer Risikoforschung für Risikobewertung


Aufnahme, Distribution, Elimination = Toxikokinetik nach oraler Aufnahme


Faktoren, die die orale Aufnahme von NP beeinflussen

Durchmesserunter 1 µm, abnehmender Durchmesser führt zu zunehmender Aufnahme

Oberflächenladungnicht ionische NP werden besser aufgenommen

Form und ElastizitätForm hat keinen klaren Effekt, Elastizität fördert Durchgang durch Kapillaren

Physikalische und chemische StabilitätAggregatbildung; chemische Stabilität beeinflusst die Abbaubarkeit und die Freilassung von eingekapseltem Material

Physiologie der GI-Traktes (normal vs geschädigt)

Verteilung im Körper – Größenabhängigkeit

Elimination – wenig bekannt


Artificial digeston of Nanoparticles

• Ag core diameter about 17 nm

• spherical particles

Tagat TOTM

TweenTM 20


• Hydrodynamic radius (rH) DLS(dynamic light scattering)

• Core‐dimensions (rSAXS) SAXS(small‐angle X‐ray scattering)

• Separation of NP`s based on their hydrodynamic diameter A4F (asymmetric flow field‐flow

fractionation)• element concentrations ICP‐MS

CooperationPhysico-Chemical Characterization I(prior to digestion)


0 5 10 15 20 25 30 35 400.000000

0.000002

0.000004

0.000006

0.000008

qy

R (nm)

p1

in water

0.1 1

10-9

10-8

10-7

10-6

10-5

10-4

10-3

10-2

10-1

Inte

nsity

(a. u

.)

q (nm-1)

p1

water

AgPurebefore digestion

0 10 20 30 40 50 600.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

UV

-abs

orpt

ion

(a.u

.)

Time (min)


1 10 100 10000.0

0.5

1.0

Inte

nsity

(a.u

.)

Hydrodynamic radius (nm)


Prior to Digestion

Hydrodynamic Radius: 14 nm

Core Radius: 7 nm


• artificial digestion based on DIN 19738

Artificial Digestion


After Digestion

Hydrodynamic Radius: in saliva: 25 nmin gastric juice: 100 nmin intestinal juice: 76 nm

Core Radius: 7‐8 nm (main part, 60%) + fractions of di‐ and trimers

Physico-Chemical Characterization II(after digestion)


only digestion fluid (all three fluids together)

digested nanoparticles

undigested nanoparticles

Results

1. cells loose cell‐cell contacts2. cells become spherical

3. cells die (at about 15‐25 µg/mL Ag)

BUTdigestion reduces toxicity

Cytotoxicity Tests(X-celligence impedance measurements)

Böhmert et al., 2013: Nanotoxicology (in press)


Scientific Opinion of the Scientific CommitteeQuestion No EFSA-Q-2007-124a, Adopted on 10 February 2009

Scientific opinion on potential risks arising from nanoscience and nanotechnologies on food and feed safety.

Das Paradigma der Risikobewertung (hazard identification, hazard characterization, exposure assessment and risk characterization) ist auf Nanomaterialien anwendbar.

Wesentliches Ergebnis:

Die spezifischen Eigenschaften der Nanomaterialien sollten berücksichtigt werden.

Feststellung, dass nur sehr wenige Daten über eine orale Aufnahme existieren.

• Übersicht über das gegenwärtige Wissen, • definiert die Erfordernisse für die Risikobewertung von hergestellten

Nanomaterialien, • identifiziert Lücken

jedoch ,


EFSA Scientific Committee

The guidance complements existing guidance documents for substances and products submitted for risk assessment in view of their possible authorisation in food and feed.

Guidance is provided on the physico-chemical characterisation requirements of engineered nanomaterials and the testing approaches to identify and characterise hazards arising from the nanoproperties.

Question No EFSA-Q-2009-00942, Adopted on 06 April 2011

Guidance on the risk assessment of the application of nanoscience and nanotechnologies in the food and feed chain


Nanopartikel für Ernährungszwecke

• Träger für Mikronährstoffe und andere Substanzen (Liposomen, Mizellen, Vesikel) zwecks Erhöhung ihrer Bioverfügbarkeit aus Lebensmitteln

• „Funktionelle Lebensmittel“ und Nahrungsergänzungsmitteln („Nanoceuticals“)

• Inverkehrbringen als Lebensmittel ohne vorherige Genehmigung?


Novel Food Verordnung (EG) 258/97

Umfasst a) ….. …... (f) Lebensmittel und Lebensmittelzutaten die mit neuartigen Prozessen hergestellt wurden, die zu signifikanten Änderungen in der Zusammensetzung oder Struktur der Lebensmittel bzw. der Zutaten führen können, die Einfluss auf ihren Nährwert oder ihren Metabolismus haben können.

….. müssen vor dem Inverkehrbringen einer Risikobewertung im Rahmen eines Genehmigungsverfahrens unterzogen werden.


Novel Food Revision (failed in March 2011)

Draft definition of engineered nanomaterials:

• Any intentionally produced material

• One or more dimensions of the order of 100 nm or less that is composed of discrete functional parts, many of which have one or more dimensions of the order of 100 nm or less

• Including structures, agglomerates or aggregates which may have a size above the order of 100 nm but retains properties that are characteristics of the nanoscale


Zusammenfassung und Schlussfolgerungen Nanotechnologie kann die Formulierung wie die Löslichkeit von Stoffen ändern –

bei gleichen oder anderen physiologischen Eigenschaften Nanotechnologie kann die Bioverfügbarkeit von schlecht absorbierbaren Lebensmittel-

inhaltstoffen verbessern Anwendung der gültigen Risk Assessment Paradigmen hier möglich (EFSA) Lebensmittel mit neuen Eigenschaften – durch Verwendung von Nanotechnologie fallen

unter der Novel Food VO Aktuelle Fortschritte: Analytik von Nanopartiel in Lebensmitteln – Expositionsmessungen werden möglich Erste Informationen zur ADME nach orale Aufnahme

Es bleiben noch viele offene Fragen Definition und Unterscheidung (NP, synthetisch vs natürliche NM, matrixgebunden, frei) validierte Methoden zur Analyse/Erfassung notwendig hinsichtlich Risikoabschätzung Bedarf hinsichtlich Standardierung und Referenzmaterialien (EU-Projekte) Notwendigkeit von toxikologischen Daten (v.a. nach oraler Exposition, Toxikodynamik) Notwendigkeit von Expositionsdaten Risikokommunikation (Lernen aus den Erfahrungen mit „grüner Gentechnik“)


Thank you very much

Prof. Dr. Dr. Alfonso LampenAbteilung LebensmittelsicherheitBundesinstitut für RisikobewertungThielallee 88-92 D-14195 BerlinTel. 0 30 - 84 12 - 3747 Fax 0 30 - 84 12 - 36 [email protected] www.bfr.bund.de

Acknowledgement:U. HansenL. Böhmert


•DIN 19738 (2004)

•5min spittel (15mL)• 25mg NaCl• 7,5mg NaSCN• 27,5mg NaSO4

• 7,5mg NaHCO3

• 22,5mg KCl• 30mg KH2PO4

• 7,5mg CaCl2∙2H2O• 12,5mg α‐Amylase• 0,5mg Harnsäure• 5mg Harstoff• 37,5mg Mucin

•2h gastric juice (35mL)• 145mg NaCL• 35mg KCl• 13,5mg KH2PO4

• 150mg Mucin• 50mg Pepsin

•2h intestinal juice (50mL)• 15mg KCl• 25mg CaCl2∙2H2O• 10mg MgCl2∙6H2O• 50mg NaHCO3

• 450mg Galle• 15mg Harnstoff• 450mg Pankreatin• 15mg Trypsin

5 min, pH 6,4 2 h, pH 2 2 h, pH 7,5

15 mL saliva 35 mL gastric juice 50 mL intestinal juice

analytics + cytotoxicity

37 °C

AgPure

in vitro digestion of AgPure


Substanzen zugelassen als LebensmittelkontaktmaterialSiliciumdioxid (SiOX)nanopartikuläre Oberflächenbeschichtung für Kunststoffflaschen < 100 nm

Herstellung: in situ aus Hexamethyldisiloxan und HexamethyldisilazanVerwendung: an Innenseite von Polyethylenterephthalat (PET)-FlaschenZweck: als Gasbarriere

Siliciumdioxid wurde als Oberflächenbeschichtung für diese Applikation von der EFSA bewertet (The EFSA Journal (2007) 452 - 454).

TitannitridVerwendung als Additiv in Materialien für den Lebensmittelkontakt

Herstellung: inerte Titaniumnitrid Nanopartikel, unlöslich in allen getesteten Lebensmittelsimulantien

Verwendung: Additiv für Lebensmittelkontaktmaterialien, in PET-Flaschen (bis zu 20mg/kg)

Zweck: zur Produktionssteigerung

Titannitrid wurde als Nanopartikel für diese Applikation von der EFSA bewertet (The EFSA Journal (2008) 888 - 890).


Einfluss physikalischer Eigenschaften von anorganischen Nanopartikeln auf die Bioaktivität – Berücksichtigung bei der Risikobewertung

• Form

• Verhältnis Größe zu Oberfläche

• Elektrische Leitfähigkeit

• Feldstärke

• Ladung

• Zusammensetzung

• Löslichkeit

Quelle: verändert nach S.T. Stern and S.E. McNeil, 2007

Biodispersion

Lösung von tox.Substanzen

Clearance


Aufnahme und Lokalisation von Nanopartikeln aus Metalloxiden in zellulären Modellen der Darmbarriere

Forschungsschwerpunkte im BfR:

Aufklärung potentiell toxischer molekularer Mechanismen mittels Transkriptomic‘s und Proteomic‘s-Techniken

Abteilung Lebensmittelsicherheit:


Eigenschaften von NP, welche die biologische Wirkung beinflussen können

FormGröße/Oberflächeelektr. LeitfähigkeitFeldstärkeLadungKompositionKristall-Struktur

Löslichkeit

Biodispersion

Lösung von tox.Substanzen

Clearance

Quelle: verändert nach S.T. Stern and S.E. McNeil, 2007


Anorganische Verbindungen• SiO2 (Siliziumdioxid), Synthetisch amorphe Kieselsäure:

Verwendung als Lebensmittelzusatzstoff (E 551)• Als Fließhilfsmittel von Bedeutung (Tomatenpulver, Speisesalz, Gewürze)• Als Eintrags- u. Dispergierhilfe (z.B. Vitaminzusätze)• Spezifikation enthält keine Beschränkungen hinsichtlich Partikelgröße• Bericht, dass SiO2-Materialien (amorphe Kieselsäure) im Organismus von

Enzymen aufgelöst werden können.

Herstellungsverfahren (Flammhydrolyse) erzeugen größere Agglomerate (1-25 µm)Nassverfahren (ca. 500 µm), Gelverfahren (ca. 1 µm).

> Neubewertung bei Verwendung von Nanopartikeln erforderlich

GefährungspotentialIn vitro Hinweise – Effekte auf ZellkernAnsammlung von NP (40-70 nm) im Zellkern, Störung Replikation undTranskription, Cytotox Assay jedoch negativ. Herstellerfirmen bezweifeln, dass NP vorliegen

TiO2 (Titandioxid): Verwendung als Lebensmittelzusatzstoff (E 171)Hinweise auf ein Verfahren, bei dem TiO2-Nanopartikel auf

Oberfläche von Schokoriegeln aufgetragen werden – Haltbarkeit Verbesserung

TiO2 induziert DNA-Veränderungen u. genet. Instabilität in vivo (Maus); Trouiller et al., 2009

Aktuelle Aspekte der Risikobewertung von Nanomaterialien...

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