Aktuelle Erkenntnisse aus einer Studie am LGL Erlangen zum ... · teiltransparentes Röhrchen...

Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit

Aktuelle Erkenntnisse aus einer Studie am LGL Erlangen zum Nachweis von BVDV aus OhrgewebeprobenEinflussfaktor Ohrmarkensysteme und Stabilitätsversuche

Stendal, 17.6.2010

Bogner, K.-H., Kupča, A., Christian, J., Drdlicek, J. und Lindner, M.

TF - Landesinstitut Spezialeinheit Tiergesundheit; Futtermittel

Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 2

Ohrstanzen Caisley / Allflex 2008/2009

Caisley Allflex

Probe


Ohrmarkenmodelle 2009 / 2010

Fa. Allflex Fa. Caisley

OhrgewebeOhrgewebe


Öffnung alte Caisley-Stanzen in der ersten Studie Birlbauer, Hellwig und Wolf (2006-2008) :

Zugabe von Lysepuffer in Ohrstanzen kann durch Plastikteile etc. gestört werden

störendePlastikteile


Inhaltskontrolle Caisley-Stanzen

Probe Keine Probe


Ursprünglich angedachte Inhaltskontrolle (Foto: Caisley)


Caisley-Ohrstanzen, Originaleinsendungen


Hängengebliebene Ohrstanze bei manueller Öffnung

Gewebestück

Stanzkegel


Volumen Gefäß: 400µl

Füllhöhe 200µl

Probe hängt im oberen Teil des Gefäßes,oberhalb des Lysepuffers


Caisley neu:alternativ Trocknung mittels Silica-Gelteiltransparentes Röhrchen

Trocknungskügelchen


Gewebestück behindert Einführen der Pipettenspitze


Poolen aus Caisley-Stanzen mit Roboter,Sollvolumen 50 µl

Grund: Aufsaugen der Flüssigkeit durch Trocknungskügelchen / Pipettierfehler

50 µl 40 µl 30 µl 20 µl

50 µl? µl


Neue transparente Caisley-Stanze mit Gewebeprobe

Gewebestanze

hängt am Stanzkegel


Problemlösung: Öffnungsstanze muss tiefer eindringen


Stand zu Ohrmarken der Fa. Caisley im Moment:

Stanzwerkzeug ist angepasstGrößere EintauchtiefeVerändertes Schneideprofil

Verschiedene Trocknungsalternativen erhältlich ohnewenig kleine Kügelchen Silicagel


Allflex-Stanzen neu


Allflex-Röhrchen im 96er Format


Sichere Probenahme?

Stanzerfolg Caisley(Daten aus Studie 2006/2007, LMU+LGL)

Gesamt %beide ok 11.275 97,8eine leer 237 2,1beide leer 13 0,1SUMME gestanzte Tiere 11.525 100,0


Beurteilung der Caisley-Stanzen Daten aus Studie 2006/2007, LMU+LGL


Stanzergebnisse Allflex - Widerlagervarianten

SCHAUM %beide ok 8226 82,7eine leer 1579 15,9beide leer 141 1,4SUMME gestanzte Tiere 9946 100,0

BLAU %beide ok 3802 95,9eine leer 156 3,9beide leer 5 0,1SUMME gestanzte Tiere 3963 100,0

Widerlager = Schaumstoff

Widerlager = grüner oder blauer Kunststoff am „Lochgrund“


Unterschiedliche Bearbeitungszeiten Allflex / Caisley

96 Proben in Racks aufgestellt, Arbeitszeit fürAusstanzen, Scannen, Kontrolle des Inhalts, Lyse, Pooling(ohne Maschinenzeiten):

Allflex: 54 MinutenVorteil: Inhaltskontrolle in Ablauf integriert, sicherer und problemloser Ablauf danach (keine störendenKügelchen und andere Begleitstoffe, größere Öffnung)

Caisley: 44 Minuten *)Vorteil: einfacherer StanzvorgangNachteil: Kontrolle der Ohrstanze (Qualität, Lage im Röhrchen)

problematisch, störende (z.T. hängende) Bestandteile*) laut Ausführungen von Dr. Bock und Dr. Schwarz entsteht hier aber zusätzlicher Arbeitsaufwand durch Einsatz einer „Vorlageplatte“ zur Sicherstellung der korrekten Pipettierung


Weitere Erkenntnisse: Kombination Röhrchen-Schnelllysemethode

Das AnDiaTec-System wird im Vergleich zu Allflex-Röhrchen durch Caisley-Röhrchen mit und ohne Trocknungsmittel negativ beeinflusst (8- bis 10 cts und mehr!)

Bei Lagerung wird das Problem verstärkt!

Einflüsse von Röhrchen, Trocknungsmittel und „Autolyse???“ bei der Schnelllyse



Es wurde ein Lagerungsversuch mit frischen Proben durchgeführt

Die Proben wurden in verschiedenen Röhrchen bei verschiedenen Temperaturen gelagert

Die Röhrchen wurden mit verschiedenen Methoden untersucht


No Ct**39,3No Ct**No Ct***No Ct**No Ct**31,229,530,8x37°C

No Ct**No Ct**No Ct**No Ct***34,332,925,430,825,4xRT

23,929,324,923,831,225,518,222,422,329,22 -8°CCaisley

neu mit Silica als Trocken-

mittel

No Ct**32,5No Ct**No Ct***No Ct**23,135,1No Ct**26,9x37°C

32,4No Ct**No Ct**NoCt/41,

1***31,7No

Ct/35,525,7No Ct**34,1xRT

24,2No Ct**No Ct**No Ct***31,6No

Ct/44,125,5No Ct**No Ct*22,82 -8°C

Caisley neu mit

minimaler Menge an Molekular

sieb

42,832No Ct**31,229,2No Ct**28,241,732,2x37°C

38No Ct**38,2NoCt/36,

1***30,8No Ct**26,6No Ct**No Ct*xRT

24,624,926,32628,8282023,324,2242 -8°CCaisley

neu ohne Molekular

sieb

35,5No

Ct/39,6No

Ct/32,433,63032,831,13526x37°C

27,632,132,931,42729,326,726,825,3xRT

27,322,125,623,319,924,421,822,724,719,6

Ct-Wert BVD

2 -8°C

Allflex 96

nach 9 Woch.KW08

nach 8 Wochen KW07

nach 7 Wochen KW06

nach 6 Woch. KW05

nach 5 Woch. KW04

nach 4 Woch.KW03

nach 3 Woch. KW02Sekund.-Gefäß

nach 12 Tagen KW01

nach 5 Tagen KW53

frisch KW52

Schnelllyse

AnDiaTec


xxxxx3832,639,626,127x37°C

29,826,725,229,128,929,225,823,230,424,4xRT

23,525,123,92830,723,623,732,523,524,1242 - 8°CCaisley neu mit Silica

als Trockenmittel

xxx31,326,725,326,220,92526,3x37°C

27,423,425,825,324,227,929,319,722,820,4xRT

1919,320,323,424,921,922,420,222,919,123,12 - 8°CCaisley neu mit minima

ler Menge

an Molekularsieb

xxxx27,629,637,824,524,821,5x37°C

2224,324,626,92225,1262123,820,8xRT

22,721,619,724,423,522,722,822,523,821,623,72 - 8°CCaisley neu ohne

Molekularsieb

xxx37,731,824,735,928,425,621,2x37°C

26,821,338,123,21924,324,722,921,221,3xRT

19,518,920,324,128,423,122,421,122,120,923,2

Ct-Wert BVD

2 - 8°C

Allflex 96

nach 10 Wochen (KW09)








nach 12 Tagen (KW01)

nach 5 Tagen (KW53)

frisch (KW52)

Referenzmethode


3,25653,3192,23352,55451,50551,5562,33953,4863,22x37°C

3,32853,7522,72253,11053,18652,7712,58153,323,386xRT

3,37253,4253,20753,30853,05153,0942,90253,3863,6693,3142 -8°C

Caisley neu mit

Silica als Trockenmi

ttel

3,17651,752,57351,35553,11553,3832,82153,393,34x37°C

3,20653,652,89253,11553,10553,242,91553,2793,615xRT

3,48053,463,46853,16553,02953,1452,76453,3423,4913,1642 -8°C

Caisley neu mit

minimaler Menge an Molekular

sieb

2,96653,1991,01152,21853,05251,9872,69253,4093,203x37°C

3,53053,6473,27353,08053,20253,1972,85753,4233,373xRT

3,63953,8323,36353,62853,15153,5143,22653,6973,4553,0062 -8°CCaisley

neu ohne Molekular

sieb

1,42750,6770,51850,86752,63352,7142,14453,6743,456x37°C

3,16453,3843,25753,13752,98753,4512,64153,93,273xRT

2,89153,43,05653,3252,56453,4062,79453,6423,1053,191

OD-Wer

tBVD

(optisch

e Dichte)

2 -8°C

Allflex 96




Nach6 Wochen (KW05)



nach 3 Wochen (KW02)**

**

nach 12 Tagen (KW01)

nach 5 Tagen (KW53)

frisch (KW52)ELISA

LAGERUNGSVERSUCH ELISA


Röhrchenvergleich mit Qiagen Cador® (vorgefrorene Proben)Streuung der Werte

CAISLEY wenig Trocknungsmittel CAISLEY ohne Trocknungsmittel

Allflex-RöhrchenUntersuchungen im Mehrfachansatz

3 Proben

3 verschiedene Röhrchen

Allflex, 2x Caisley

Puffer A Puffer B


Einflüsse aus Caisley-Bestandteilen auf ct-Werte bei AnDiaTec:

Trocknungskügelchen: Einfluss erwiesen

Verschiedene Kombinationen aus Trocknungskügelchen, PP-Material, Schneidring, Polycarbonat-Projektil (Linse) und Siegelfolie scheinen eine Rolle zu spielen, die noch nicht eindeutig zugeordnet ist


ct > 30ct 25-30ct 20-25ct <20

29,56 (10 / 0)26,27 (10 / 0)28,16 (9 / 1)19,97

Sarstedt mit Caisley-Trockenmittel. + C.-Schneidring

24,25 (10 / 0)26,08 (10 / 0)26,41 (9 / 1)25,27

Sarstedt (anderes Lysegefäß) mit Caisley-Trockenmittel

23,3 (10 / 0)24,74 (10 / 0)22,37 (10 / 0)21,01Caisley ohne Trockenmittel

27,95 (10 / 0)26,72 (10 / 0)32,45 (7 / 3)22,99Caisley mit Trockenmittel

24,46 (10 / 0)24,28 (10 / 0)19,28 (10 / 0)19,65Allflex 96-Gefäße

LD Leipzig TRL-Puffer

Virotype BVD

QIAGENENLB-PufferCador-PCR

AndiatecBoVir-SL BVDV Lyse + PCR

"Referenzmethode" (modif. nach

Hoffmann et al., 2006)

SchnelllysenMethode mit Aufreinigung

Gefäßart:

jeweils 10 Proben einzeln analysiert, dargestellt sind Ct-Mittelwerte der positiven Proben

(Anzahl der pos. / neg.)Einzelproben

Ct-Werte des BVDV-Nachweises mit verschiedenen Verfahren (alle Proben stammen aus demselben Ohr eines PI-Rindes):


25,71 (10 / 0)32,36 (10 / 0)29,44 (10 / 0)13,95

Sarstedt (anderes Lysegefäß) mit Caisley-Trockenmittel

24,08 (9 / 1)30,89 (10 / 0)28,48 (10 / 0)14,82Caisley ohne Trockenmittel

26,71 (10 / 0)31,63 (10 / 0)30,11 (10 / 0)15,42Caisley mit Trockenmittel

33,62 (4 / 6)Mittelwert

ohne Ausfälle32,07 (9 / 1)28,02 (10 / 0)13,98Allflex 96-Gefäße

LD LeipzigTLR-Puffer

VIROTYPE®BVDV

QIAGENENLB

Cador-PCR

AnDiaTecBoVir-SL BVDV

Lyse+PCR„Referenzmethode“

(modif. nach Hoffmann et al.,

2006)

SchnelllysenMethode mit Aufreinigung

Gefäßart:

jeweils 10 Proben einzeln analysiert, dargestellt sind Ct-Mittelwerte der positiven Proben

(Anzahl der pos. / neg.)Einzelproben

Ct-Werte der jeweiligen Internen Kontrollen in verschiedenen Verfahren(alle Proben stammen aus demselben Ohr eines PI-Rindes):


15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

PI Ref er enz

NPI Ref er enz

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

Anzahl

Ct-Werte

Erstuntersuchung von Ohrstanzen

PI Referenz PI Andiatec NPI Referenz NPI Andiatec

n=161

Methodenvergleich Schnelllyse vs. Lyse + AufreinigungUrsprünglicher Vorschlag für die Klassifizierung als PI-Tier (2009)

„Referenzmethode“:Ct=31 als Grenzwert PI / NPI ?


FRÜHERE BETRACHTUNGSWEISE

TESTSYSTEM ERGEBNIS

Daher Vorschlag FLI:

PI cutoff :

Grenzwert PI / Nachuntersuchung


JETZT NEUE BETRACHTUNGSWEISE

TEST

ERGEBNIS

OHRSTANZE


Anzahl der viralen Genomkopien / µl Lysat oder Eluat aus Ohrgewebeproben in Allflex-Gefäßen nach Quantifizierung anhand des FLI-Standardmaterials

96.140199.564214no Ct

174.700135.64136no Ct

216.900118.13525no Ct

87.530104.15913no Ct

17.83072.8679no Ct

241.40052.6604no Ct

449.30051.9173no Ct

123.6001.200.28470.75018.8062no Ct

491.800992.750287.30010.0180no Ct

1.469.000712.365120.1006.9878771011

703.000404.18922.6402.10756820

186.900232.2147.38371160

Eluat b

(Kopien/ µl)Lysat a

(Kopien/ µl)Eluat b

(Kopien/ µl)Lysat a

(Kopien / µl)Eluat b

(Kopien / µl)Lysat a

(Kopien / µl)

Material von PI-Tieren*:Material von NPI-Tieren*:

* die Klassifizierung in PI- und NPI-Tiere wurde durch die Nachuntersuchung aus Blut vorgenommena Schnelllyse-Verfahren der Fa. Andiatecb „Referenzmethode“ (modif. nach Hoffmann et al., 2006; Methode mit Nukleinsäureextraktion)



Schlussfolgerung:

Testen Sie Ihre vorgegebene Ohrstanze mit verschiedenen Schnelllysemethoden an Hand von nicht gefrorenen PI-Ohren aus, einschließlich Lagerungsversuch über mehrere Wochen bei 2-8° / RT / 37°

Unter Berücksichtigung des FLI-Standards kann ggf. ein Grenzwert PI / NPI für diese Methodenkombination laborspezifisch erstellt werden!


Unser Dank gilt:

Doris Göbel, Christine Müller-Boushaba

Amt für Landwirtschaft und Forsten AnsbachBayerisches Staatsministerium für Umwelt und Gesundheit

Bayerische TierseuchenkasseLandeskuratorium der Erzeugerringe für tierische Veredelung in Bayern e. V.

Rinderzuchtverband Mittelfranken


Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!

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