Alexander McLennan, Andy Bates,Phil Turner und Mike White

Molekularbiologie

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Alexander McLennan, Andy Bates, Phil Turner und Mike White

Molekularbiologie

für Biologen, Biochemiker, Pharmazeuten und Mediziner

Übersetzt von Bärbel Häcker

Titel der OriginalausgabeMolecular Biology, BIOS Instant Notes,Fourth Edition© 2013 by Garland Science, Taylor & FrancisGroup, LLCAll Rights Reserved. Authorised translation fromthe English language edition published byGarland, a member of the Taylor & Francis Group.

AutorenAlexander McLennanUniversity of LiverpoolInstitute of Integrative BiologyLiverpoolUnited Kingdom

Andy BatesUniversity of LiverpoolInstitute of Integrative BiologyLiverpoolUnited Kingdom

Phil TurnerUniversity of LiverpoolInstitute of Integrative BiologyLiverpoolUnited Kingdom

Mike WhiteUniversity of ManchesterFaculty of Life SciencesManchesterUnited Kingdom

Übersetzt vonDr. Bärbel HäckerFeuerbacher Straße 1471229 Leonberg

Cover© Depositphotos.com/Daniel Cole;Hintergrund: © Shutterstock

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1. Auflage 2013

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Inhaltsverzeichnis

Vorwort XV

Liste der Abkürzungen XVII

1 Informationsmakromoleküle 11.1 Informationsverarbeitung und Molekularbiologie 11.1.1 Das zentrale Dogma 11.1.2 Rekombinante DNA-Technologie 31.2 Nukleinsäurestruktur und -funktion 51.2.1 Basen 51.2.2 Nukleoside 51.2.3 Nukleotide 61.2.4 Phosphodiesterbindungen 61.2.5 DNA/RNA-Sequenz 71.2.6 DNA-Doppelhelix 71.2.7 A-, B- und Z-Helices 91.2.8 RNA-Sekundärstruktur 111.2.9 Modifizierte Nukleinsäuren 111.2.10 Nukleinsäurefunktion 111.3 Proteinstruktur und -funktion 141.3.1 Aminosäurestruktur 141.3.2 Proteingröße und -formen 161.3.3 Primärstruktur 161.3.4 Nichtkovalente Wechselwirkungen 171.3.5 Sekundärstruktur 181.3.6 Tertiärstruktur 191.3.7 Quartärstruktur 201.3.8 Prosthetische Gruppen 211.3.9 Domänen, Motive, Familien und Evolution 211.3.10 Proteinfunktion 23

V

2 Eigenschaften von Nukleinsäuren und eukaryotische Chromosomen-struktur 29

2.1 Chemische und physikalische Eigenschaften von Nukleinsäuren 292.1.1 Stabilität von Nukleinsäuren 292.1.2 Säureeffekt 302.1.3 Alkalieffekt 302.1.3.1 DNA 302.1.3.2 RNA 302.1.4 Chemische Denaturierung 322.1.5 Viskosität 322.1.6 Schwimmdichte 322.2 Spektroskopische und thermische Eigenschaften von

Nukleinsäuren 342.2.1 UV-Absorption 342.2.2 Extinktion und Struktur 342.2.3 Mengenbestimmung der Nukleinsäuren 352.2.4 Reinheit der DNA 352.2.5 Wärmedenaturierung 362.2.6 Hybridisierung 372.3 DNA-Superspiralisierung 382.3.1 Geschlossen-zirkuläre DNA 382.3.2 Superspiralisierung 382.3.3 Topoisomer 392.3.4 Helikale und superhelikale Windungszahl 392.3.5 Interkalatoren 402.3.6 Superspiralisierungsenergie 412.3.7 Topoisomerasen 412.4 Chromatinstruktur 442.4.1 Chromatin 442.4.2 Histone 442.4.3 Nukleosomen 452.4.4 Die Rolle von H1 462.4.5 Linker-DNA 472.4.6 Die 30 nm-Faser 482.4.7 Höher geordnete Struktur 482.5 Eukaryotische Chromosomenstruktur 502.5.1 Das Mitosechromosom 502.5.2 Das Centromer 512.5.3 Telomere 512.5.4 Interphasechromosomen 512.5.5 Heterochromatin 522.5.6 Euchromatin 522.5.7 DNase-I-Überempfindlichkeit 522.5.8 CpG-Methylierung 522.5.9 Histonvarianten und -modifikation 54

VI Inhaltsverzeichnis

3 DNA-Replikation 593.1 DNA-Replikation: eine Übersicht 593.1.1 Semikonservativer Mechanismus 593.1.2 Replikons, Ursprünge und Termini 613.1.3 Semidiskontinuierliche Replikation 623.1.4 RNA-Primer 633.2 Bakterielle DNA-Replikation 643.2.1 Experimentelle Systeme 643.2.2 Initiation 653.2.3 Strangentwindung 673.2.4 Elongation 673.2.5 Termination und Aufteilung 693.3 Eukaryotische DNA-Replikation 703.3.1 Experimentelle Systeme 703.3.2 Ursprünge und Initiation 703.3.3 Replikationsgabeln 713.3.4 Kernmatrix 723.3.5 Telomerreplikation 72

4 DNA-Schäden, -Reparatur und -Rekombination 774.1 DNA-Schäden 774.1.1 DNA-Defekte 774.1.2 Oxidative Schäden 784.1.3 Alkylierung 794.1.4 Sperrige Addukte 794.2 Mutagenese 814.2.1 Mutation 814.2.2 Replikationsgenauigkeit 824.2.3 Physikalische Mutagene 834.2.4 Chemische Mutagene 834.2.5 Direkte Mutagenese 834.2.6 Indirekte Mutagenese und Transläsions-DNA-Synthese 844.3 DNA-Reparatur 874.3.1 Photoreaktivierung 874.3.2 Alkyltransferase 874.3.3 Reparatur von Strangbrüchen 874.3.4 Exzisionsreparatur 884.3.5 Fehlpaarungsreparatur 904.3.6 Erbliche Reparaturdefekte 90

5 Transkription in Bakterien 955.1 Grundlagen der Transkription 955.1.1 Transkription: eine Übersicht 955.1.2 Initiation 955.1.3 Elongation 97

Inhaltsverzeichnis VII

5.1.4 Termination 975.2 Escherichia coli-RNA-Polymerase 995.2.1 RNA-Polymerase-Holoenzym von E. coli 995.2.2 a-Untereinheit 995.2.3 b-Untereinheit 995.2.4 b’-Untereinheit 1005.2.5 s-Faktor 1005.3 Der s70-Promotor von E. coli 1015.3.1 Promotorsequenzen 1015.3.2 Promotorgröße 1025.3.3 −10-Sequenz 1025.3.4 −35-Sequenz 1025.3.5 Promotoreffizienz 1035.4 Transkriptionsinitiation, -elongation und -termination 1045.4.1 Promotorbindung 1045.4.2 DNA-Entwindung 1055.4.3 Initiation der RNA-Kette 1055.4.4 Elongation der RNA-Kette 1055.4.5 Termination der RNA-Kette 1065.4.6 Rho-abhängige Termination 108

6 Regulation der Transkription in Bakterien 1136.1 Das lac-Operon 1136.1.1 Das Operon 1136.1.2 Das Lactose(lac)-Operon 1136.1.3 Der Lac-Repressor 1146.1.4 Induktion 1156.1.5 Katabolit-Aktivatorprotein 1166.2 Das trp-Operon 1176.2.1 Das Tryptophan(trp)-Operon 1176.2.2 Der Trp-Repressor 1186.2.3 Der Attenuator 1186.2.4 Struktur der RNA-Leitsequenz 1196.2.5 Das Leitpeptid 1196.2.6 Attenuation 1196.2.7 Die Bedeutung der Attenuation 121

7 Transkription in Eukaryoten und Regulation der eukaryotischenTranskription 125

7.1 Die drei RNA-Polymerasen: Charakterisierung und Funktion 1257.1.1 Eukaryotische RNA-Polymerasen 1257.1.2 RNA-Polymerase-Untereinheiten 1267.1.3 Aktivitäten eukaryotischer RNA-Polymerasen 1267.1.4 Die CTD der RNA-Pol II 126

VIII Inhaltsverzeichnis

7.2 RNA-Pol-I-Gene: die ribosomale Wiederholung 1287.2.1 Ribosomale RNA-Gene 1287.2.2 Die Rolle des Nukleolus 1287.2.3 RNA-Pol-I-Promotoren 1297.2.4 Upstream binding factor 1297.2.5 Selektivitätsfaktor 1 1297.2.6 TBP und TAFIs 1317.3 RNA-Pol-III-Gene: 5S- und tRNA-Transkription 1327.3.1 RNA-Polymerase III 1327.3.2 tRNA-Gene 1327.3.3 5S-rRNA-Gene 1337.3.4 Alternative RNA-Pol-III-Promotoren 1357.3.5 RNA-Pol-III-Termination 1357.4 RNA-Pol-II-Gene: Promotoren und Enhancer 1367.4.1 RNA-Polymerase II 1367.4.2 Promotoren 1377.4.3 Stromaufwärtige Regulationselemente (URE) 1377.4.4 Verstärkerelemente (Enhancer) 1387.5 Allgemeine Transkriptionsfaktoren und RNA-Pol-II-Initiation 1397.5.1 Basale RNA-Pol-II-Transkriptionsfaktoren 1397.5.2 TFIID 1397.5.3 TBP 1417.5.4 TFIIA 1417.5.5 TFIIB- und RNA-Polymerasebindung 1417.5.6 Nach der RNA-Polymerase bindende Faktoren 1417.5.7 CTD-Phosphorylierung durch TFIIH 1427.5.8 Der Initiatortranskriptionskomplex 1427.6 Eukaryotische Transkriptionsfaktoren 1437.6.1 Transkriptionsfaktordomänenstruktur 1437.6.2 DNA-Bindungsdomänen 1447.6.2.1 Die Helix-Kehre-Helix-Domäne 1447.6.2.2 Die Zinkfingerdomäne 1457.6.2.3 Die basische Domäne 1467.6.3 Dimerisierungsdomänen 1467.6.3.1 Leucin-Zipper 1467.6.3.2 Die Helix-Schleife-Helix-Domäne 1477.6.4 Transkriptionsaktivierungsdomänen 1477.6.4.1 Saure Aktivierungsdomänen 1477.6.4.2 Glutaminreiche Domänen 1477.6.4.3 Prolinreiche Domänen 1477.6.5 Repressordomänen 1487.6.6 Ziele von Transkriptionsregulatoren 1487.6.7 Chromatinmodifikation 149

Inhaltsverzeichnis IX

8 Der genetische Code und tRNA 1558.1 Der genetische Code 1558.1.1 Grundlagen 1558.1.2 Entschlüsselung 1568.1.3 Degeneriertheit, Universalität und Doppeldeutigkeit 1568.1.4 Mutationswirkung 1588.1.5 Offene Leseraster (ORFs) 1598.1.6 Überlappende Gene 1598.2 tRNA-Struktur und -funktion 1618.2.1 tRNA-Primärstruktur 1618.2.2 tRNA-Sekundärstruktur 1618.2.3 tRNA-Tertiärstruktur 1638.2.4 tRNA-Funktion 1638.2.5 Aminoacylierung der tRNAs 1648.2.6 Aminoacyl-tRNA-Synthetasen 1648.2.7 Korrekturlesen 166

9 Proteinsynthese 1699.1 Aspekte der Proteinsynthese 1699.1.1 Codon-Anticodon-Wechselwirkung 1699.1.2 Wobble 1699.1.3 Ribosomenbindungsstelle 1719.1.4 Initiator-tRNA 1719.1.5 Polysomen 1719.2 Proteinsynthesemechanismus 1739.2.1 Übersicht 1739.2.2 Initiation 1749.2.3 Elongation 1789.2.4 Termination 1799.3 Initiation in Eukaryoten 1819.3.1 Übersicht 1819.3.2 Abtasten 1829.3.3 Initiation 1829.3.4 Elongation 1849.3.5 Termination 1859.4 Translationskontrolle und posttranslationale Ereignisse 1869.4.1 Translationskontrolle in Bakterien 1869.4.2 Translationskontrolle in Eukaryoten 1879.4.3 Polyproteine 1899.4.4 Protein-Targeting 1899.4.5 Proteinfaltung und -modifikation 1919.4.6 Proteinabbau 192

X Inhaltsverzeichnis

10 Genmanipulation 19710.1 DNA-Klonierung: eine Übersicht 19710.1.1 DNA-Klonierung 19710.1.2 Wirte und Vektoren 19810.1.3 Subklonierung 19910.1.4 DNA-Bibliotheken 20010.1.5 Durchsuchen von Bibliotheken 20010.1.6 Analyse eines Klons 20110.2 Präparation von DNA-Plasmiden 20310.2.1 Plasmide als Vektoren 20310.2.2 Plasmid-Minipräparation 20310.2.3 Alkalische Lyse 20310.2.4 Plasmidreinigung 20510.2.5 Ethanolfällung 20510.2.6 Cäsiumchlorid-Gradient 20510.3 Restriktionsenzyme und Elektrophorese 20710.3.1 Restriktionsendonukleasen 20710.3.2 Erkennungssequenzen 20710.3.3 Kohäsive Enden 20810.3.4 Restriktionsverdau 20910.3.5 Agarose-Gelelektrophorese 21010.3.6 Isolierung der Fragmente 21210.4 Ligation, Transformation und Analyse von Rekombinanten 21310.4.1 DNA-Ligation 21310.4.2 Rekombinante DNA-Moleküle 21410.4.3 Alkalische Phosphatase 21510.4.4 Transformation 21610.4.5 Selektion 21710.4.6 Transformationseffizienz 21710.4.7 Überprüfung auf Transformanten 21710.4.8 Wachstum und Aufbewahrung der Transformanten 21810.4.9 Gelanalyse 21810.4.10 Fragmentausrichtung 21810.4.11 Neue Subklonierungsmethoden 219

11 Klonierungsvektoren 22311.1 Plasmidvektor-Design 22311.1.1 Ligationsprodukte 22311.1.2 Blau-weiß-Screening 22311.1.3 Mehrfachklonierungsstellen 22411.1.4 Transkription klonierter eingefügter Abschnitte 22511.1.5 Expressionsvektoren 22511.1.6 Gateway® – Subklonierung durch Rekombination 22611.2 Bakteriophagen, Cosmide, YACs und BACs 22911.2.1 Bakteriophage l 229

Inhaltsverzeichnis XI

11.2.2 l-Ersatzvektoren 23011.2.3 Verpackung und Infektion 23111.2.4 Plaquebildung 23211.2.5 l-Lysogene 23211.2.6 M13-Phage-Vektoren 23311.2.7 Klonierung großer DNA-Fragmente 23311.2.8 Cosmidvektoren 23411.2.9 YAC-Vektoren 23411.2.10 Selektion in Hefe 23611.2.11 BAC-Vektoren 23711.3 Eukaryotische Vektoren 23911.3.1 Klonierung in Eukaryoten 23911.3.2 Transfektion eukaryotischer Zellen 23911.3.3 Pendelvektoren 24011.3.4 Episomale Hefeplasmide 24011.3.5 Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens 24111.3.6 Virale Transduktion 24211.3.7 Baculoviren 243

12 Analyse und Verwendung klonierter DNA 24712.1 Charakterisierung von Klonen 24712.1.1 Charakterisierung 24712.1.2 Restriktionskartierung 24812.1.3 Markierung von Nukleinsäuren 24912.1.4 Southern und Northern Blot 25012.2 Nukleinsäuresequenzierung 25212.2.1 DNA-Sequenzierung nach Sanger 25212.2.2 Schrotschusssequenzierung 25412.2.3 Emulsion-PCR 25512.2.4 Reversible Fluoreszenz-Abbruchsequenzierung 25512.2.5 Pyrosequenzierung 25612.2.6 Sequenzierung durch Ligation und andere Methoden 25712.2.7 RNA-Sequenzierung 25712.3 Polymerase-Kettenreaktion 25912.3.1 PCR 25912.3.2 Der PCR-Zyklus 25912.3.3 Matrize und Primer 26112.3.4 Enzyme 26212.3.5 PCR-Optimierung 26312.3.6 RT-PCR und RACE 26312.3.7 Echtzeit- und quantitative PCR 26412.4 Analyse klonierter Gene 26612.4.1 Sequenzorganisation 26612.4.2 S1-Nuklease-Kartierung 26712.4.3 Primer-Verlängerung 268

XII Inhaltsverzeichnis

12.4.4 Gelverzögerung 26812.4.5 DNase-I-Fußabdruck 26912.4.6 Reportergene 26912.5 Mutagenese klonierter Gene 27112.5.1 Mutagenesearten 27112.5.2 Ortsgerichtete Mutagenese 27112.5.3 Insertions-/Deletionsmutagenese 27212.5.4 Zufallsmutagenese durch PCR 273

13 Funktionelle Genomik und die neuen Technologien 27713.1 Einführung in die ’Omik-Wissenschaften 27713.1.1 Genomik 27713.1.2 Transkriptomik 27813.1.3 Proteomik 27913.1.4 Metabolomik 28013.1.5 Andere ’Omik-Wissenschaften 28013.2 Allgemeine Genexpressionsanalyse 28213.2.1 Genomweite Analyse 28213.2.2 DNA-Mikroarrays 28313.2.3 Chromatinimmunpräzipitation 28513.2.4 Gen-Knockouts 28613.2.5 RNA-Knockdown 28813.3 Proteomik 29013.3.1 Proteomik 29013.3.2 Protein-Protein-Wechselwirkungen 29213.3.3 Zwei-Hybrid-Analyse 29313.3.4 Protein-Arrays 29513.4 Zelluläre und molekulare Bildgebung 29613.4.1 Zelluläre Bildgebung 29613.4.2 Bildgebung biologischer Moleküle in fixierten Zellen 29613.4.3 Detektion von Molekülen in lebenden Zellen und Geweben 29813.4.4 Fluoreszierende Proteine und Reportergene 29913.5 Transgene und Stammzelltechnologie 30113.5.1 Genetisch veränderte und transgene Organismen 30113.5.2 Stammzellen 30213.5.3 Induzierte pluripotente Stammzellen 30313.5.4 Gen- und Zelltherapie 30413.6 Bioinformatik 30613.6.1 Definition und Anwendungsbereich 30613.6.2 Anwendungen der Bioinformatik 30713.6.3 Suche nach Sequenzähnlichkeiten 30913.6.4 Mehrfachsequenzvergleich 31213.6.5 Phylogenetische Bäume 31313.6.6 Strukturelle Bioinformatik 31413.7 System- und synthetische Biologie 318

Inhaltsverzeichnis XIII