This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

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Alkaloide aus Catharanthus roseus-Zellkulturen, II [1] Alkaloids from Catharanthus roseus Tissue Cultures, II [1]

Werner Kohl*, Barbara Witte und Gerhard Höfle Gesellschaft für Biotechnologische Forschimg mbH, Abteilung Niedermolekulare Naturstoffe, Mascheroder Weg 1, D-3300 Braunschweig

Z. Naturforsch. 86b, 1153-1162 (1981); eingegangen am 20. Mai 1981

Indole Alkaloids, Catharanthus roseus, Cell Cultures

From the extract of Catharanthus roseus tissue cultures 16 different indole alkaloids have been isolated belonging to heteroyohimbane, aspidosperma and iboga types. The structures were deduced by UV, NMR and mass spectrometry.

Ajmalicine (1) and catharanthine (16) were found to be the major constituents, tetra-hydroalstonine (2), akuammigine (3), 3-isoajmalicine (4), pleiocarpamine (6), akuammiline (6), tabersonine (7), 20-hydroxytabersonine (8), lochnericine (9), horhammericine (10), minovincinine (11), vindolinine (12), 20-epivindolinine (18), vindolinine -Nt - oxide (14) and 20-epivindolinine-Nb-oxide (16) could be determined as minor or trace alkaloids.

Einleitung Zellkulturen von Catharanthus roseus werden seit

einigen Jahren intensiv biologisch und biochemisch bearbeitet, mit dem Ziel, einen neuen Zugang zu pharmakologisch interessanten Indolalkaloiden, ins-besondere den Bisindolalkaloiden vom Vinblastin-Typ zu eröffnen. Die in der Therapie einiger maligner Tumore bewährten „Dimeren Indolalkaloide" wer-den von C. rosews-Pflanzen nur in äußerst geringen Mengen gebildet [2], so daß hier ein wirtschaftlich sinnvoller Einsatz von Zellkulturen möglich er-scheint.

Es war deshalb unser Ziel, das von einer Zellinie gebildete Alkaloidspektrum qualitativ und auch quantitativ zu erfassen und damit einen Überblick über das biogenetische Potential von C. roseus-Zellkulturen zu erhalten. Die untersuchte Zellinie entstammt der Sammlung von Prof. Zenk (München), das Zellmaterial wurde von Dr. H. Vogelmann in der Abt. Biotechnologie der Gesellschaft für Bio-technologische Forschung gewonnen. Über die bio-logischen und verfahrenstechnischen Aspekte der Fermentation wird an anderer Stelle berichtet [3].

Ergebnisse Die gefriergetrockneten Zellen wurden dem in

Abb. 1 wiedergegebenen Aufarbeitungsschema fol-gend extrahiert und aufgearbeitet. Der Methanol-

extrakt enthielt nur polare, der Hexanextrakt mittel- bis unpolare Alkaloide. Nur von letzteren soll in dieser Arbeit berichtet werden. Der Hexan-extrakt wurde zu einem basischen CHCl3-Extrakt aufgearbeitet, dessen Zusammensetzung das in Abb. 2 wiedergegebene HPLC-Diagramm zeigt. Da die enthaltenen Komponenten einen relativ großen Polaritätsbereich umfassen, wurde für die präpara-tive Aufarbeitung zunächst durch Chromatographie an Fractogel PVA 2000 und Kieselgel vorfraktio-niert. Aus den so erhaltenen Fraktionen A 1 B 6 -A 6 B 2 wurden durch präparative HPLC die reinen Verbindungen H1-H16 gewonnen.

Von allen isolierten Verbindungen wurden UV-und Massenspektren und, falls es die isolierten Mengen zuließen, auch 1H-NMR-Spektren aufge-nommen und daraus die Strukturen abgeleitet.

Die beiden polarsten Verbindungen H l und H2 aus Fr. A 1 B 6 ergaben sehr ähnliche Massenspektren mit einem schwachen M+ bei m/e 352 und einem sehr starken Fragment bei M+-16. Da dies ein für N-oxide typisches Verhalten ist [4], versuchten wir H1 und H2 mit FeS04 zu reduzieren [5]; aus H l entstand dabei einheitlich eine wesentlich unpolarere Ver-bindung, die mit dem Alkaloid H4 aus Fr. A 2 B 6 identisch war; aus H2 erhielten wir bei der gleichen Umsetzung ein mit H5 identisches Produkt. Es handelt sich bei H l und H2 also um die N-Oxide von H4 und H5.

H4 und H 5 zeigen den für am Aromaten unsubsti-tuierte Dihydroindole charakteristischen UV-Chro-mophor [6]. Anhand ihrer Massen- und 1H-NMR-Spektren konnten diese beiden Verbindungen als

Gef riergetr. Zellen

Extr. mit Hexan

Rückstand

Extr. mit MeOH

MeOH-Extr.(Extr2)

Hexan-E 'xtrakt Extr. mit MeOH/Hj< pH4

saurer MeOH Extr. Extr. mit CHCIj pH9

bas.CH Clj-Extr. Fractogel PVA 2000

KG

A1 A1B6

H1.H2

Präp. DC

A2 A2B6

1' HPLC

H3

KG

A3 A3B2 i

A3B7

HPLC HPLC H4.H5 H6

A4 n

HPLC

H7.HS

KG

A5 A5B1 1 A5B2 HPLC H11.H12.HI3

HPLC H9.HI0

Präp. DC

A6 A6 B2

n HPLC

H14, H15.HI6 Abb. 1. Aufarbeitung und Chromatographie der C.-roseus-Zellen.

Vindolinin (12) und 20-Epivindolinin (13) [7, 8] identifiziert werden.

Beim Stehen in Lösung (CH3OH, CHCI3) entste-hen aus Vindolinin und 20-Epivindolinin schon nach wenigen Tagen beträchtliche Mengen der N-Oxide . Es muß deshalb angenommen werden, daß es sich bei H l und H 2 um Artefakte handelt.

Abb. 2. HPLC-Diagramm des zum basischen CHCI3-Extraktes aufgearbeiteten Hexan-Extraktes von C. roseus (Rohbasengemisch 1). Säule: RP-18, Laufmittel-gradient : CH3OH/H2O/TEA 40:60:0,5 - CH3OH /TEA 100:0,5, Detektion bei 280 nm.

CH3O2C

C(3)-H C(19)-H C(20)-H 1 et ß ß 2 a ß a 3 ß a ß 4 ß ß ß

CH3O2CT X - I

5 ACOCH2 , CO2CH3

% H

6 1

CO2CH3

7: R = H 8:R=0H

9 : R=H 10:R=OH

H CO2CH3

12: R '=CH 3 ,R 2 =H

13: R '=H, R 2=CH 3

14: Nb-0xid, R1 =CH3,R2=H 15: Nb-0xid, R'=H.R2=CH3

Schema 1. Strukturen der aus C. roseus isolierten Al-kaloide.

Die Verbindungen H 8 aus Fr. A4, H10 aus Fr. A 5 B 1 , H13 aus Fr. A 5 B 2 und H15 aus Fr. A 6 B 2 besitzen einen Indolchromophor [6] und ergaben sehr ähnliche Massenspektren mit inten-siven Molekülionen bei m/e 352 und starken Frag-menten bei M+-1. Diese Fragmentierung ist u.a. für Alkaloide vom Ajmalicin-Typ charakteristisch [9]. Nach den iH-NMR-Spektren [10, 11] handelt es sich um die vier stereoisomeren Alkaloide Akuammi-gin (3), 3-Isoajmalicin (4), Ajmalicin (1) und Tetra-hydroalstonin (2).

H 6 aus Fr. A 3 B 7 besitzt ebenfalls einen Indol-chromophor und ein sehr charakteristisches MS, anhand dessen dieses Alkaloid als Pleiocarpamin (5) identifiziert werden konnte [12].

H 3 aus Fr. A 2 B 6 zeigt im UV einen Dihydro-indolchromophor [6]. Das MS ist bis auf einen star-ken M+-42(M+-CH2CO)-Peak mit dem des Akuam-milins (6) identisch [9]. Da auch das iH-NMR-Spektrum mit dieser Struktur im Einklang steht

[13], muß angenommen werden, daß die Keten-eliminierung unter den angewandten Meßbedingun-gen thermisch erfolgte.

Die fünf Verbindungen H 9 aus Fr. A 5 B 1 , H l l und H12 aus Fr. A 5 B 2 sowie H14 und H16 aus Fr. A 6 B 2 besitzen einen ß-Anilinoacry lsäureester-Chormophor [6], und die Massenspektren weisen die für Alkaloide vom Aspidospermin-Typ charakteri-stische Fragmentierung [9] auf. Zusammen mit den 1H-NMR-spektroskopischen Daten konnten wir fol-gende Strukturen zuordnen:

H l l = Hörhammericin (10) [14], H12 = Mino-vincinin (11) [15], H14 = Lochnericin (9) [16] und H16 = Tabersonin (7) [17].

Für H9 wurde aus den spektroskopischen Daten die Struktur des 20-Hydroxytabersonins (8) abge-leitet :

Das MS unterscheidet sich nur wenig von dem des Tabersonins (7) [17]. Der M+ ist um 16 mu nach höherer Masse verschoben; das den Indolring ent-haltende Fragment b (Schema 2) findet man unver-ändert bei m/e 214 und das Fragment a um 16 mu verschoben bei mje 138, d.h. dieses Fragment muß einen zusätzlichen Sauerstoffsubstituenten tragen. Das 1H-NMR-Spektrum (Abb. 3 b) zeigt, daß dieser Substituent nur als eine OH-Gruppe an C(20) lokali-siert sein kann:

Ohl Q m/e 138

Schema 2. MS-Schlüsselfragmente von 20-Hydroxy-tabersonin (8).

Die beiden zu einem AB-System gehörenden Pro-tonen der C(20)H2-Gruppe im Tabersonin bei <3 = 0,91 und 1,04 ppm (Abb. 3 a) sind im Spektrum von H10 verschwunden. Dafür findet man bei ö = 3,35 ppm ein verbreitertes Quartett (1H). Das Triplett der C(21)H3-Gruppe hegt beim Tabersonin bei ö = 0,69 ppm. Das Spektrum von H10 zeigt diese Gruppe um 0,25 ppm verschoben bei <5 =

H A H H

a) 7 C°2CH3

NH

Aw

T - « — ?

IcWIHÖBlH CH6IH Ct17JH

IUI C(7)H CI61H

1 J

-OCH,

CWH*

C09JH C(4)H°

CWH' , CflOJH0 g vw*n 1 wwin j I I wiurr- wmr

Uifei JU CODH» CfTBH*

C(21)H3

i — * r S/jppm Hh

Abb. 3. iH-NMR-Spektren (270 MHz) von a) Tabersonin (7); b) 20-Hydroxytabersonin (8).

0,89 ppm als Dublett. Die übrigen Signale sind bis auf das Doppeldublett des C(4)H(a), das in unmittel-barer räumlicher Nachbarschaft zur OH-Gruppe hegt, nur geringfügig oder gar nicht verschoben.

H8 aus Fr. A 5 B 2 besitzt einen Indolchromophor. iH-NMR- und Massenspektrum stehen mit der Struktur des Catharanthins im Einklang. Da von dieser Verbindung nur spärliche MS- und NMR-Daten [18] veröffentlicht sind, wurde H8 noch zusätzlich mit Catharanthin verglichen, das wir nach bekannten Vorschriften [2] aus Catharanthus roseus-Pflanzen isoliert haben. Wir konnten dabei volle Übereinstimmung in allen Eigenschaften fest-stellen.

Diskussion Die von uns isolierten und identifizierten Alkaloide

(Tab. I) (eine Reihe weiterer Alkaloide konnte nicht

Tab. I. Aus dem Hexanextrakt von C. roseus-Zellkul-turen isolierte und identifizierte Alkaloide. Die Gehalts-angaben beziehen sich auf die Zelltrockenmasse und wurden durch HPLC bestimmt (Abs. bei 280 nm).

Frak-tion

Al-kaloid

Name und Struktur

% der Gesamt-alkaloide

0/ /o Trocken-zellgew.

A 1 B 6 H l Vindolinin-Nb-oxid 14 3,0 0,01

H 2 20-Epivindo-linin-Nb-oxid 15

A 2 B 6 H 3 Akuammilin 6 Spur Spur A 3 B 2 H 4 Vindolinin 12 3,8* 0,014

H 5 20-Epivindo-linin 13 4,0 0,015

A 3 B 7 H 6 Pleio-carpamin 5 2,0 0,008

A 4 H 7 Catharan-thin 16 16,04 0,062

H 8 3-Isoajma-licin 4 8,8 0,033

A 5 B 1 H 9 20-Hydroxy-tabersonin 8 3,0 0,01

H10 Aj malicin 1 35,0** 0,13 A 5 B 2 H 11 Hörham-

mericin 8 H12 Minovincinin 11 1,7 0,006 H13 Akuammigin 3 4,5 0,017

A 6 B 2 H 14 Lochnericin 9 0,008 H15 Tetrahydro-

alstonin 2 9,2 0,035 H16 Tabersonin 7 1,9 0,008

sicher identifiziert werden, da die isolierten Mengen zu gering waren) gehören in ihrer Mehrzahl dem Heteroyohimbin- und biogenetisch verwandten Typen (1-6) und dem Aspidosperma- und verwand-ten Typen (7-13) an. Der Iboga-Typ ist durch Catharanthin (16) vertreten. Quantitativ überwie-gen dabei die Heteroyohimbin-Typen mit zusam-men ca. 60%. Damit konnte gezeigt werden, daß die von uns untersuchten C. rosetw-Zellkulturen in der Lage sind, die für die Biogenese der Bisindol-alkaloide vom Vinblastin-Typ notwendigen Gerüste zu synthetisieren. Bemerkenswert ist der hohe An-teil von Catharanthin (16,4% der Gesamtalkaloide), eines der Bausteine der Bisindolalkaloide vom Vin-blastin-Typ.

Dagegen konnten weder Vindolin, der zweite Baustein der Bisindolalkaloide, noch diese selbst sicher nachgewiesen werden, ein Befund, der kürz-lich auch von mehreren anderen Arbeitsgruppen berichtet wurde [19-21]. Desgleichen deckt sich das von uns beobachtete Alkaloidspektrum mehr oder weniger mit dem anderer Zellinien. So tritt Ajmali-cin (1) meist als Hauptkomponente auf [19-22]; ebenso wurden Hörhammericin (10), Vindolinin (12) und 20-Epivindolinin (13) als Produkte beschrieben [19, 20], in einigen Fällen auch Lochnericin (9), Tabersonin (7) [19, 21] und Catharanthin [19, 22]. Dagegen war 20-Hydroxytabersonin (8) bisher als natürliches Alkaloid nicht bekannt [23]; Pleiocarp-amin (5) und Akuammilin (6) wurden unserer Kennt-nis nach noch nicht aus C. roseus isoliert.

Experimenteller Teil Schmelzpunkte: Kofler-Heiztischmikroskop (Fa.

Reichert), unkorrigiert. UV-Spektren: Spektralphotometer DMR 21 (Fa.

Zeiss); Lösungsmittel Methanol Uvasol. XH-NMR-Spektren: FT-Kernresonanzspektrome-

ter WM 270 bzw. WP400 (Fa. Bruker); Lösungs-mittel CDC13; innerer Standard TMS.

Massenspektren: Massenspektrometer Typ MS 9 bzw. MS 30 (Fa. AEI); Ionisierungsenergie 70 eV; angegeben sind die Daten i.a. für mje > 100 und Intensitäten > 5 % .

Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC): 2 Pumpen M6000A, Einspritzsystem U 6 K und Photometer M440 (Fa. Waters); Detektion bei 280 nm; Säulen: LiChrosorb RP-18, 7 ^m, 25 cm x 4 mm (Fa. Merck) für analytische HPLC und RP-18 10 /um, 25 cm X 16 mm (Fa. Knauer) für präpara-tive HPLC.

Dünnschichtchromatographie: DC- Alufolien Kie-selgel 60 Fzm (Fa. Merck).

Standardlaufmittel A : CH2CI2/CH3OH 90:10, B : 95:5, C: 98:2; Detektion UV-Löschung bei 254nm und nach Ansprühen mit Cer(IV)-Ammoniumsulfat (Sprühreagenz Nr. 39 nach Stahl [24]). Präparative DC: PSC-Fertigplatten Kieselgel 60 F254 (Fa. Merck).

Säulenchromatographie an Kieselgel: Lobar -Fertigsäulen, Größe B, Kieselgel 60 (Fa. Merck).

Extraktion 720 g gefriergetrocknete Zellen von C. roseus (in

Submerskultur in Schüttelkolben und Kleinfermen-tern gezüchtet in der Abt. Biotechnologie der GBF) wurden im Soxhlet-Extraktor mit Hexan und an-schließend mit Methanol jeweils 24 h extrahiert. Nach dem Einrotieren und Trocknen erhielten wir 8,7 g Hexan-Extrakt (Extr. 1) und 239 g Methanol-Extrakt (Extr. 2). Die Extrakte wurden in Methanol aufgenommen, mit dem doppelten Volumen 10-proz. Essigsäure versetzt und zweimal mit Hexan aus-geschüttelt. Die wäßrigen Phasen wurden mit konz. Ammoniaklösung auf pH 10,5 eingestellt und sechs-mal mit CHCI3 extrahiert. Extr. 1 ergab 2,7 g basischen CHCl3-Extrakt (Rohbasengemisch 1); Extr. 2 11,9 g (Rohbasengemisch 2).

Das Rohbasengemisch 1 wurde an Fractoge-PVA 2000 (Säulendurchm. 63 mm, Füllhöhe 72 cm) mit CH2CI2/CH3OH 1:1 als Laufmittel chromato-graphiert. Wir erhielten 6 Fraktionen: A I (83 mg), A2 (194 mg), A3 (378 mg), A4 (148 mg), A 5 (474 mg) und A6 (73 mg).

A I wurde an einer Kieselgelsäule weiter aufge-trennt (Laufmittel: CH2C12/CH30H 80:20, 70:30). Fraktion A 1 B 6 (34 mg) enthielt die Komponenten H l und H2, die im DC (Laufmittel A, Rf 0,2-0,3) mit Cer(IV)-Reagenz intensiv rot anfärben. Durch präparative HPLC (Laufmittel: CH3OH/H2O/TEA* 65:35:0,5) wurden aus A 1 B 6 die Hauptkompo-nenten H l und H2 abgetrennt (6 mg bzw. 8 mg).

H l (Vindolinin-Nb-oxid 14) UV: A max 225, 242, 285 (sh), 293 nm, MS:

m/e ( % ) = 352(7, M+), 337(12), 336(40), 335 (16), 334(30), 333(6), 307(8), 295(6), 285(6), 276(7), 275(12), 274(9), 261(6), 260(6), 259(14), 258(7), 257(6), 249(9), 248(15), 247(29), 246(10), 245(15), 244(7), 243(10), 235(7), 234(13), 233(23), 232(16), 231(16), 230(27), 229(21), 228(10), 222(9), 221(22), 220(22), 219(29), 218(28), 217(22), 216(24), 215(14), 214(15), 209(10), 208(18), 207(30), 206(42), 205(27), 204(37), 203(11), 202(11), 201(6), 198(6), 197(6), 196(9), 195(21), 194(30), 193(28), 192(22), 191(26), 190(11), 189(7), 184(22), 183(32), 182(35), 181(30), 180(42), 179(17), 178(15), 177(8), 175(7), 171(19), 170(92), 169(80), 168(100), 167(75), 166(29), 165(19), 164(14), 158(9), 157(19), 156(68), 155(46), 154(80), 153(18), 152(19), 151(10), 150(9), 149(37), 145(6), 144(20), 143(31), 142(22), 141(25), 140(31), 139(19),

* TEA = Triethylamin.

135(41), 134(48), 133(7), 132(9), 131(12), 130(40), 129(28), 128(34), 127(14), 126(8), 122(13), 121(19), 120(21), 119(9), 118(7), 117(17), 116(15), 115(46), 114(10), 113(7), 109(8), 108(14), 107(22), 106(20), 105(15), 104(11), 103(15), 102(13), 101(8), 97(9), 95(10), 94(12), 93(29), 92(15), 91(40), 90(7), 89(15), 81(16), 80(16), 79(51), 78(19), 77(65), 76(14), 75(11), 74(8).

H2 (16-Epi vindolinin-Nb-oxid 15) UV: A max = 225, 242, 285 (sh), 293 nm. MS:

m/e ( % ) = 352(10, M+), 338(5), 337(18), 336(79), 335(32), 334(100), 333(16), 321(7), 320(7), 319(22), 305(12), 304(7), 303(9), 302(7), 301(8), 287(15), 379(6), 277(8), 276(7), 275(21), 274(8), 273(14), 263(6), 261(13), 260(9), 259(22), 258(9), 257(10), 254(6), 249(9), 248(16), 247(39), 246(12), 245(15), 244(10), 243(12), 242(8), 235(9), 234(13), 233(25), 232(16), 231(16), 230(40), 229(41), 228(12), 227(8), 222(9), 221(15), 220(16), 219(23), 218(18), 217(18), 216(30), 215(16), 214(17), 209(9), 208(16), 207(25), 206(28), 205(18), 204(22), 203(7), 202(13), 201(6), 198(6), 197(7), 196(7), 195(15), 194(21), 193(17), 192(12), 191(10), 190(7), 184(12), 183(22), 182(34), 181(16), 180(22), 179(11), 178(8), 171(22), 170(85), 169(78), 168(94), 167(45), 166(18), 165(12), 164(7), 157(11), 156(43), 155(29), 154(44), 153(8), 152(8), 151(7), 144(14), 143(21), 142(14), 141(15), 140(16), 139(10), 138(11), 137(14), 136(11), 135(63), 134(64), 133(7), 131(9), 130(29), 129(22), 128(28), 127(25), 122(17), 121(17), 120(21), 119(8), 118(7), 117(15), 116(11), 115(25), 114(7), 108(15), 107(22), 106(14), 105(10), 103(10), 102(10), 101(6), 95(8), 94(9), 93(23), 92(14), 91(29), 89(13), 86(7), 81(11), 80(11), 79(34), 78(13), 77(35).

Reduktion von H l und H 2 : Jeweils 5 m g H l bzw. H2 wurden in Methanol gelöst und mit einem Überschuß 10-proz., wäßriger FeS04-Lösung ver-setzt und 1 h am Rückfluß gekocht. Anschließend wurde mit CH2CI2 extrahiert. Das Reduktionspro-dukt von H1 war identisch mit H4 (DC, HPLC), das von H2 mit H5.

Aus Fr. A2, die zahlreiche Komponenten enthielt, wurde durch präp. DC (Laufmittel CH2C12/CH30H 85:15) die Hauptkomponente H 3 abgetrennt (Fr. A2B6, 12 mg) und durch präp. HPLC (Laufmit-tel: CH3OH/H2O/TEA 65:35:0.5) weiter gereinigt (Cer(IV)-Anfärbung ziegelrot, Rf 0,4 in Laufmittel A), Ausb.: 4 mg.

H3 (Akuammilin 6) UV: Amax = 226, 268 nm, MS: m/e(%) = 395(24),

394(88, M+), 393(16), 365(6), 353(16), 352(64), 351(12), 336(7), 335(26), 323(5), 322(25), 321(100), 293(12), 292(7), 275(5), 262(8), 261(8), 260(5), 249(12), 248(7), 247(8), 246(6), 238(5), 234(6), 233(9), 232(10), 223(5), 220(6), 218(7), 217(5), 214(6), 207(5), 206(8), 204(6), 195(5), 194(9), 193(5), 192(6), 182(6), 181(6), 180(12), 170(6), 169(9),

168(14), 167(12), 166(9), 156(7), 155(5), 154(10), 149(5), 144(5), 143(5), 138(10), 130(10), 128(6), 127(5), 122(6).

!H-NMR: s. Tab. IIa.

100 mg der Fr. A3 wurden durch SC an Kieselgel (Laufmittel CH2C12/CH30H 90:10 und 85:15) weiter aufgetrennt. Fr. A 3 B 2 (60 mg) enthielt die Kom-ponenten H 4 und H5 (Rf 0.5-0.6 in Laufmittel A, mit Cer(IV)-Reagenz intensiv rot anfärbbar) und Fr. A 3 B 7 (10 mg) die Komponente H6 (Rf 0,4 in Laufm. A, mit Cer(IV)-Reagenz schwach bräunliche Anfärbung).

Aus A 3 B 2 wurden H4 und H5 durch präpara-tive HPLC abgetrennt (Laufm. CH30H/H20/TEA 65:35:0,5). Ausb.: 12 mg H4 und 15 mg H5.

H4 (Vindolinin 12) UV: Amax = 214, 244, 297 nm, MS: m/e ( % ) =

337(15), 336(55, M+), 335(6), 277(7), 249(7), 247(8), 245(6), 234(8), 233(12), 232(9), 231(13), 230(35), 229(31), 228(9), 221(10), 220(13), 219(14), 218(14), 217(13), 216(24), 215(14), 214(14), 208(11), 207(15), 206(25), 205(14), 204(21), 203(8), 202(14), 195(12), 194(21), 193(14), 192(13), 191(13), 190(9), 184(22), 183(29), 182(16), 181(18), 180(25), 171(24), 170(100), 169(59), 168(57), 167(47), 166(13), 165(9), 157(22), 156(86), 155(47), 154(76), 153(16), 152(11), 144(24), 143(38), 142(19), 141(20), 140(21), 139(11), 136(10), 135(68), 134(76), 130(44), 129(28), 128(39), 127(25), 122(27), 121(40), 120(34), 119(12), 118(12), 117(20), 116(15), 115(42), 108(14), 107(23), 106(28), 105(11), 104(9), 103(13), 102(14), 101(9), 95(7), 94(25), 93(54), 92(21), 91(49), 90(9), 89(14), 81(13), 80(36), 79(93), 78(27), 77(81).

iH-NMR: s. Tab. IIb.

H 5 (20-Epivindolinin 13) UV: Amax = 215, 244, 297 nm, MS: m/e (%) =

337(25), 336(100, M+), 335(12), 321(13), 305(10), 293(6), 281(9), 277(12), 263(9), 251(8), 250(6), 249(9), 248(6), 247(12), 245(8), 235(6), 234(9), 233(12), 232(13), 231(14), 230(50), 229(34), 228(13), 221(8), 220(13), 219(16), 218(13), 217(12), 216(29), 215(16), 214(18), 197(14), 196(21), 195(11), 194(16), 193(8), 192(11), 191(9), 184(13), 183(14), 182(12), 181(12), 180(18), 171(12), 170(94), 169(43), 168(46), 167(37), 166(9), 165(8), 156(13), 155(58), 154(47), 153(9), 144(14), 143(25), 142(11), 141(12), 140(16), 139(9), 136(11), 135(67), 134(70), 130(24), 129(18), 128(29), 127(25), 122(22), 121(35), 120(30), 119(8), 117(9), 116(8), 115(26), 108(13), 107(16), 106(14), 105(8), 94(12), 93(29), 92(9), 91(22), 89(9), 80(12), 79(42), 78(12), 77(42).

iH-NMR: s. Tab. IIb.

Aus Fr. A 3 B 7 wurde H6 durch präpara-tive HPLC isoliert (Laufmittel: CH30H/H20/TEA 80:20:0,5). Ausb. 4 mg.

H6 (Pleiocarpamin 5) UV: A max = 227, 278 (sh), 284, 294 (sh) nm, MS:

m/e(%) = 323(13), 322(50, M+), 321(5), 307(5), 264(13), 263(57), 248(6), 247(7), 235(10), 234(25), 233(10), 232(18), 220(13), 219(9), 218(15), 217(6), 216(5), 208(6), 207(9), 206(13), 205(6), 204(14), 195(5), 194(11), 193(10), 192(7), 191(5), 182(7), 181(28), 180(100), 179(10), 178(9), 169(9), 168(16), 167(19), 166(9), 156(10), 155(10), 154(21), 153(6), 152(10), 144(5), 143(6), 141(5), 140(6), 130(5), 129(9), 128(6), 127(13), 126(9), 115(9), 108(7), 102(5).

Aus einem Teil der nur noch zwei Hauptkompo-nenten enthaltenden Fr. A 4 wurde durch präp. HPLC H7 und H8 (4 bzw. 6 mg) abgetrennt (Lauf-mittel CH30H/H20/TEA 70:30:0,5). H7 färbt mit Cer(IV) schwach graublau an (Rf 0,55) und H8 gelb-grün (Rf 0,5 in Laufm. B).

H7 (Catharanthin 16) UV: Amax = 229, 275 (sh), 284, 291 nm, MS:

m/e(%) = 337(25), 336(100, M+), 335(13), 251(6), 230(8), 229(32), 228(19), 218(6), 214(14), 204(8), 197(6), 170(10), 169(8), 168(16), 167(12), 166(6), 155(7), 154(21), 153(6), 149(12), 144(7), 138(14), 137(7), 136(12), 135(98), 134(10), 129(6), 128(9), 127(8), 122(24), 121(21), 108(9), 107(32), 106(7).

iH-NMR: s. Tab. IIb.

H8 (3-Isoajmalicin 4) UV: A max = 225, 274 (sh), 282, 289 nm, MS:

m/e(%) = 353(24), 352(100, M+), 351(55), 350(7), 337(14), 336(5), 321(7), 265(7), 225(10), 222(5), 221(5), 209(11), 185(8), 184(32), 183(10), 180(7), 171(12), 170(11), 169(23), 168(11), 167(14), 157(12), 156(65), 155(16), 154(16), 153(7), 149(8), 144(11), 143(14), 142(8), 135(12), 130(10), 129(11), 128(8), 127(5), 123(7), 121(7), 115(11), 109(5), 107(8), 105(5), 97(8), 95(11), 93(7), 91(8), 87(12), 85(10), 83(12), 82(7), 81(18), 80(7), 79(7), 78(7), 77(14).

iH-NMR: s. Tab. IIa.

100 mg Fr. A 5 wurden durch SC an Kieselgel weiter aufgetrennt (Laufm. CH2C12/CH30H 95:5 und 90:10). Die Fraktion A 5 B 1 (35 mg) enthielt H9 (4 mg) und H10 (18 mg) (Cer(IV)-Anfärbung blau, Rf 0,8; bzw. gelbgrün, tf/0,9); A 5 B 2 (34 mg) enthielt H l l (Cer(IV)-Anf. blau, Rf 0,7), H12 (Cer(IV)-Anf. blau, Rf 0,45) und H13 (Cer(IV)-Anf. gelbgrün, Rf 0,6, alle im Laufmittel B). Durch prä-parative HPLC wurden aus A 5 B 1 die reinen Komponenten H9 und H10 erhalten (Laufmittel: CH30H/H20/TEA 70:30:0,5).

H9 (20-Hydroxytabersonin 8) UV: A max = 224, 299, 328 nm, MS: m/e(%) =

353(21), 352(85, M+), 351(8), 321(7), 307(8), 279(6), 275(8), 267(6), 259(6), 247(10), 246(7), 245(7),

233(6), 232(12), 231(6), 230(11), 229(46), 228(28), 221(7), 220(12), 219(23), 218(17), 217(12), 216(8), 215(6), 214(22), 206(9), 205(13), 204(13), 197(6), 196(6), 193(6), 192(6), 191(8), 190(6), 180(6), 171(6), 170(16), 169(11), 168(30), 167(18), 166(6), 165(6), 155(7), 154(17), 153(6), 152(14), 151(100), 150(13), 149(8), 144(7), 141(7), 139(8), 138(32), 137(31), 128(7), 127(8), 124(13), 123(28), 122(6), 115(6), 111(6), 109(6), 108(13).

iH-NMR : s. Abb. 3 b.

H10 (Ajmalicin 1) Schmp. 252-254 °C (254-256 °C [25]). UV: Amax =

229, 274 (sh), 279 (sh), 282, 290 nm, MS: wi/e(%) = 353(25), 352(100, M+), 351(64), 350(8), 337(7), 321(7), 225(8), 209(12), 185(11), 184(46), 183(8), 176(8), 171(10), 170(11), 169(17), 168(9), 167(6), 157(13), 156(65), 155(8), 154(8), 144(9), 143(10), 130(6), 129(7), 128(7).

iH-NMR: s. Tab. II.

Aus A 5 B 2 wurden durch präparative HPLC (Laufmittel CHsOH^O/TEA 75:25:0,5) die Kom-ponenten H l l (6 mg), H12 (2 mg) und H13 (7 mg) isoliert.

H l l (Hörhammericin 10) UV: Amax = 224, 297, 326 nm, MS: m/e(%) =

369(13), 368(65, M+), 367(10), 353(13), 352(8), 351(15), 350(88), 338(10), 337(8), 324(20), 322(6), 310(8), 308(6), 294(6), 293(8), 292(10), 281(8), 280(6), 277(6), 267(10), 266(8), 264(11), 263(8), 262(8), 256(6), 253(11), 252(8), 247(8), 245(8), 239(6), 238(13), 237(10), 236(11), 235(21), 234(6), 233(10), 229(15), 228(13), 227(13), 222(13), 221(13), 220(8), 219(11), 218(8), 216(8), 215(18), 214(92), 209(10), 208(13), 207(13), 206(29), 205(16), 204(11), 196(8), 195(13), 194(16), 193(8), 192(8), 191(10), 190(8), 184(8), 182(10), 181(8), 180(25), 179(10), 177(8), 170(8), 169(10), 168(30), 167(40), 166(16), 156(8), 155(24), 154(100), 153(10), 149(8), 143(8), 142(8), 140(8), 139(10), 138(15), 137(11), 136(10), 127(8), 126(10), 123(8), 116(8), 114(11), 102(8).

iH-NMR: s. Tab. IIb.

H12 (Minovincinin 11) UV: Amax = 225, 298, 327 nm, MS: m/e(%) =

355(9), 354(33, M+), 253(5), 222(7), 221(6), 180(5), 168(7), 167(7), 154(6), 141(11), 140(100), 110(6).

H13 (Akuammigin 3) UV: Amax = 232, 273 (sh), 279 (sh), 282, 290 nm,

MS: m/e(%) = 353(24), 352(100, M+), 351(81), 350(27), 349(10), 337(79), 336(19), 335(12), 323(10),

321(17), 319(10), 307(7), 295(8), 294(8), 293(24), 291(10), 265(22), 263(10), 261(10), 251(39), 249(20), 247(10), 237(7), 235(8), 225(7), 224(17), 223(58), 222(14), 221(29), 209(24), 208(10), 207(10), 206(8), 198(15), 197(39), 184(20), 183(10), 182(8), 171(10), 170(15), 169(24), 168(17), 167(12), 157(12), 156(40), 155(8), 154(14), 144(12), 143(12), 142(12), 130(10), 129(15), 128(12), 115(10).

iH-NMR: s. Tab. II.

Aus Fr. A 6 wurde durch präparative DC (Lauf-mittel: CH2C12/CH30H 95:5) die stärkste Zone ab-getrennt (A6B2, 14 mg). Sie enthielt die Kompo-nenten H14 (mit Cer(IV) blau, Rf 0,9), H15 (mit Cer(IV) gelbgrün, Rf 0,6) und H16 (mit Cer(IV) blau, Rf 0,8, alle im Laufmittel C), die durch prä-parative HPLC isoliert wurden (Laufmittel CH3OH/ H2O/TEA 80:20:0,5).

H14 (Lochnericin 9) UV: A max = 226, 297, 327 nm, MS: m/e(%) =

353(15), 352(57, M+), 351(7), 325(7), 324(7), 323(6), 229(5), 228(7), 227(7), 221(5), 215(9), 214(35), 207(5), 206(5), 195(6), 194(6), 193(5), 180(9), 176(8), 169(5), 168(13), 167(15), 166(5), 155(5), 154(15), 152(6), 151(9), 149(11), 140(5), 139(18), 138(100), 137(9), 135(6), 128(5), 127(5), 123(8), 121(7), 110(5), 109(12), 108(51), 86(18), 84(29).

iH-NMR: s. Tab. IIb.

H15 (Tetrahydroalstonin 2) Schmp. 227-228 °C (230-231 °C [25]), UV: Amax =

233, 273 (sh), 282, 290 nm, MS: m/e(%) = 353(20), 352(100, M+), 351(64), 350(6), 338(8), 337(34), 323(5), 321(6), 293(7), 265(5), 251(14), 249(6), 225(5), 224(8), 223(19), 222(6), 221(8), 209(8), 198(7), 197(13), 184(12), 183(7), 182(5), 180(5), 171(7), 170(14), 169(22), 168(13), 167(8), 157(11), 156(44), 155(10), 154(13), 153(5), 144(8), 143(10), 142(11), 130(8), 129(8), 128(11), 127(5), 115(10).

iH-NMR: s. Tab. IIa.

H16 (Tabersonin 7) UV: Amax = 224, 299, 328 nm, MS: m/e(%) =

337(11), 336(44, M+), 335(5), 305(6), 259(8), 247(5), 229(25), 228(20), 227(10), 221(6), 220(5), 219(9), 218(9), 217(7), 214(18), 206(6), 205(7), 204(10), 197(6), 196(6), 195(10), 194(6), 193(6), 192(5), 191(7), 180(6), 170(14), 169(10), 168(32), 167(22), 166(7), 156(5), 155(8), 154(23), 153(6), 144(7), 140(8), 139(5), 138(6), 136(10), 135(100), 134(9), 130(6), 128(8), 127(7), 123(6), 122(44), 121(35), 115(7), 108(10), 107(32), 106(5), 93(19).

iH-NMR: s. Abb. 3a.

Tab. IIa. 1 H-NMR spektroskopische Daten von:

C - H A j m a l i c i n (1 ) ( v g l . [ 10 ] ) ö [ p p m ] J [ H z ]

T e t r a h y d r o a l s t o n i n (2) ( v g l . [10 ] ) 6 [ p p m ] J [ H z ]

A k u a m m i g i n (3) ( v g l . [ 1 1 ] ) 6 [ p p m ] J [ H z ]

3 - I s o a j m a l i c i n (4) ( v g l . [11 ] ) 6 [ p p m ] J [ H z ]

A k u a m m i l i n ( 6 )

( v g l . [ 13 ] ) <5 [ p p m ] J [ H z ]

4 ,71 s b r 2,62 d d d 14, 14, 2,69 m 1,69 m 2,13 d d 15, 3 ,5 7,55 od . 7,60 d 8 7,17 od . 7,29 d d 7, 7 7,17 o d . 7,29 d d 7, 7 7,55 o d . 7,60 d 8 1,92 d b r 14,5 2,48 d b r 14,5 3,24 s b r

1,65 d d 7, 1 5 ,55 q b r

3 ,21 d b r 14,5 4 ,14 d b r 14,5 4 ,13 s 2,19 s

3 5 a 5 ß 6 a 6 ß 9

10 11 12

14 a 14 ß 15 a 16 a 17 18 19 20

21 a 21 ß C 0 2 M e O A c N H

3,37 d b r 2,65 2,89 2,75 ' m

3,06. 7,45 d b r 7,08 d d 7.14 d d 7.30 d b r 3,23 d d d 1.31 d d d 2,45 d d b r

7,55 s 1,19 d 4,43 d q 2.15 d d d d 2,25 d d 2,99 d d 3,75 s

7,99

3 3,37 d b r 4 3 ,80

l 2 ,5-3,0 m l 2 , 8-3 ,2 m

l 2 ,5-3,0 m l 2 , 8-3 ,2 m

J 2,5—2,7 m 8 7 ,45 d b r 8 7,46 d b r 8 7,5, 7 ,5 7,07 d d 7,5, 7 ,5 7,08 d d 7,5, 7,5 7,5, 7,5 7 ,13 d d 7,5, 7 ,5 7 ,14 d d 7,5, 7,5 8 7,27 d b r 8 7 ,35 d b r 8 12, 3, 3 2 , 5 1 m 2,14 m 12, 12, 12 1,55 d d d 11, 11, 11 2 ,8-3 ,2 m 12, 12 2 ,73 d t 12, 4 ,5 , 4 ,5 2 ,75 m

7,56 s 7 ,54 s 7 1,42 d 7 1,37 d 7 3,5, 7 4 ,49 d q 7, 11 4 ,44 q d 7,6 12, 12, 3, 3 1 ,71 m 1,86 m 12, 12 2 ,73 d d 12, 5 2 ,8-3 ,2 m 12, 3 3 , 1 1 d d 12, 3 2 ,5-2 ,7 m

3 ,75 s 3 ,75 s

7,64 7,84

4,54

3,35 m

3 ,01 d d d 16, 10, 8 2,60 m 7,47 d b r 8 7,10 d d 7,5 7,16 d d 7,5 7,39 d b r 8 3,19 d d d 12, 2, 2 1,65 2,01 m

7,49 s 0,94 d 4 ,33 q d 2 ,03 m

2,60 m

3,74 s

8,23

7 7, 3

Tab. II b.

L o c h n e r i c i n (9 ) H ö r h a m m e r i c i n (10 ) V i n d o l i n i n (12) 2 0 - E p i v i n d o l i n i n (13) C a t h a r a n t h i n (16 ) C - H ( v g l . [ 8 ] ) ( v g l . [8 ] ) ( v g l . [ 18 ] )

<5 [ p p m ] J [ H z ] <5 [ p p m ] J [ H z ] <5 [ p p m ] J [ H z ] 6 [ p p m ] J [ H z ] ö [ p p m ] J [ H z ]

1 8,92 ( N H ) 8 ,95 ( N H ) _ _ a 1,79 d d 14, 3 ,5 2 — — — ß 2 ,71 m

2 ,71 m 3 - 3,02 d d 6, 12 3,00 d d 6, 12 5 ,91 m 4 a 2,61 d d 16, 1,5 a 2,87 d d 15, 15 a 1,84 d d d 14, 13 a 1,84 d d 14, 13 -

K ß 2,51 d 16 ß 2,69 d 15 ß 2,46 d d d 14, 6, 2 ß 2,50 d d 14, 6 4 ,16 s b r

O 6 3,12 d 3,5 3,22 d 4 6 ,11 d d 9,5, 3 6,16 d d 9,5, 3 a 2,93 d d d 16, 5, 5 * 7 3,55 m 3 ,45 d d 5, 4 5 ,74 d d d 9,5, 5, 2 5,77 d d d 9,5, 5, 2 ß 3,38 d d d 16, 12, 5» 8 a 3,55 m a 3,58 d d 13, 5 a 3,45 d d d 17, 3,2 a 3,44 d d d 17, 3, 2 a 3,56 d d d 15, 12, 4 ,5*

ß 2,90 m ß 2,93 d b r 13 ß 3,92 d d 17, 5 ß 3,90 d d 17, 5 ß 3,34 15, 5, 5 * 10 a

ß

2,48 m 2,89 m

a

ß

2 ,51 d d d 2 ,95 d d

11,5, 9, 5 9, 6 ,5

»1 I 3,27 m 13,40 m

«1 ß\

13,25 m [3 ,40 m -

11 a 1,73 d d 12, 4 ,5 a 1,79 d d 11,5, 5 a 1,80 d d d 15, 9,5, 9 ,5 a 1,75 d d d 15, 9,5, 9 ,5 7,49 d b r 8 ß 1,96 d d d 12, 11,5, 6 ,5 ß 2,02 d d d 11,5, 11,5, 6,5 ß 2,14 d d d 15, 7, 2 ß 2,20 d d d 15, 7, 2 7,09 od . 7,15 d d b r 7, 7

12 - - - -

13 - - - - 7,15 od . 7,09 d d b r 7, 7 14 7,13 d b r 8 7 ,15 d b r 8 7 ,24 d b r 7 7,17 d b r 7 7,23 d b r 8 15 6,86 d d 7, 7 6 ,90 d d 7, 7 6,84 d d b r 7, 7 6,84 d d b r 7, 7 -

16 7,13 d d 7, 7 7,15 d d 7, 7 7,03 d d 8, 7 7,05 d d 8, 7 7 ,61 ( N H ) 17 19

6 ,81 d b r 2,43 s b r

8 6,84 d b r 8 6 ,79 d b r 3 ,45 s b r

8 6,79 d b r 3,74 s b r

8 «1 ß\

^2,83 m m

20 1 [0 ,92 m [ 1 , 1 6 m

3,62 q 6 ,5 2 ,14 q d 6,5, 2 2,08 q 6,5 \ [ 2 ,12 [2 ,29

m

2 1 0,78 t 7 1,15 d 6,5 0 ,96 d 6,5 0,57 d 6,5 1,06 t 7 C 0 2 M e 3,80 s 3 ,85 s 3,68 s 3,69 s 3 ,71 s O H - 3,52 s - - -

Wir danken Herrn Prof . M. H. Zenk und Herrn Dr. H . Vogelmann, die durch Bereitstellung der Zellinie und des Zellmaterials diese Untersuchung ermöglicht haben.

Außerdem danken wir der Abt . Physikalische Meßtechnik der Gesellschaft für Biotechnologische

Forschung für die Aufnahme v o n Massen- und NMR-Spektren und Herrn Prof . F . Bohlmann, Berlin, für die Bereitstellung von Meßzeit am Bruker W H 270.

D e m Fonds der Chemischen Industrie danken wir für Sachbeihilfen.

[1] I. Mitteil.: W. Kohl, H. Vogelmann und G. Höfle, Planta Med. 39, 283 (1980).

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[21] W. G. W. Kurz, K. B. Chatson, F. Constabel, J. P. Kutney, L. S. L. Choi, P. Kolodziejczyk, S. K . Sleigh, K. L. Stuart und B. R. Worth, Helv. Chim. Acta 63, 1891 (1980).

[22] A. I. Scott, H. Mizukami, T. Hirata und S. Lee, Phytochemistry 19, 488 (1980).

[23] Langlois et al. erhielten 2 diastereomere 20-Hydroxytabersonine bei Umwandlungsreaktionen an Vindolinin [26], Nach den angegebenen XH-NMR-Daten ist 8 mit der 20-R-Verbindung identisch; von Kutney et al. wurde kürzlich das entsprechende 20-Acetoxytabersonin gefunden [14].

[24] E. Stahl (Herausg.), Dünnschicht-Chromatogra-phie, Springer-Verlag, Berlin 1967.

[25] M. Hesse, Indolalkaloide in Tabell, Bd. I, Sprin-ger* Verlag, Berlin 1964.

[26] N. Langlois und R. Z. Andriamialiosa, J. Org. Chem. 44, 2468 (1979).