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Versuch 1

ADH: Der enzymatisch-optische Test – Alkoholdehydrogenase-Reaktion

Praktikant: Praktikumnummer: Praktikant: Praktikumnummer:

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I. Einleitung In der enzymatischen Analyse wird die Reaktions- und Substratspezifität von Enzymen ausgenutzt um Substratbestimmungen vorzunehmen. Der Vorteil ist, dass Stoffgemische meist nicht getrennt werden müssen, da das Enzym sein Substrat selektiv umsetzt. Die Konzentrationsänderung während der Umsetzung wird photometrisch verfolgt, häufig durch die Coenzyme NAD+/ NADP+, beziehungsweise deren reduzierte Form (λmax,oxid=264nm und λmax,red=339nm). Eine Bestimmung ist für alle Substrate möglich, die mit diesen Redoxüberträgern reagieren.

Der nukleophile Angriff des Hydridions am C4-Atom des NAD+-Pyridinrings bedingt die Änderung der spektralen Eigenschaft durch Verschiebung des konjugierten Systems. In einigen Mikroorganismen wird das Glykolyse-Produkt Pyruvat durch die Pyruvatdecarboxylase zu Acetaldehyd umgesetzt. Anschließend katalysiert die Alkohol-Dehydrogenase (ADH) die Reaktion zu Ethanol, wobei sie das NAD+/NADH-System anwendet um das bei der Glykolyse verbrauchte NAD+ (nun NADH) zu regenerieren. Das Gleichgewicht der Reaktion liegt deutlich auf Seiten des Ethanols, im Versuch wurde die Reaktion in Richtung des Acetaldehyds betrachtet um später Vergleiche der spezifischen Aktivität gegenüber anderen Alkoholen anzustellen.

*Zu bedenken ist, dass Enzyme lediglich die Einstellung des Gleichgewichts beschleunigen, indem sie die Aktivierungsenergie herabsetzen. Auf die Lage des Gleichgewichts haben sie

keinen Einfluss.

Zur Analyse von Konzentrationen und Reaktiongeschwindigkeiten muss die Ethanolumsetzung zu Ethanal quantitativ werden, d.h. ohne Rückreaktion vollständig ablaufen. Zur Förderung dessen wurden einerseits Überschusskonzentrationen verwendet und andererseits die Rückreaktion über eine Kopplung mit einer Semicarbazid-Reaktion (Bildung des mesomeriestabilisierten Ethanalsemicarbazon) verhindert.

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Die Bestimmung der Konzentration geschieht über die Endwertmethode, sie ist sicherer als eine Michaelis-Menten-Kinetik. Die Berechnung erfolgt mit ΔE, da von vornherein eine

Extinktion bei 339nm zu messen ist (

).

ADH ist ein gruppenspezifisches Enzym, d.h. es setzt Moleküle mit bestimmten stereochemischen Eigenschaften um. Im Fall des ADH bezieht sich das auf seine prochiralen (Co-)Substrate (NAD+/ NADH, Aldehyd/Alkohol). Es gibt zwei Arten der Prochiralität:

planare Moleküle mit drei verschiedenen Substituenten (1)

tetraedische Moleküle mit höchstens zwei gleichen Substituenten (2) Moleküle sind per Definition prochiral, wenn sie (1) durch eine Additionsreaktion oder (2) durch Substitution ein Chiralitätszentrum ausbilden. Das Hefe-ADH ist für die Reaktion mit Ethanol/Acetaldehyd ausgelegt, es kann aber auch andere primäre Alkohole, bzw. Aldehyde in einem verminderten Umfang umsetzen. Eine Aussage über relative Spezifität des ADH ist durch einen Vergleich der Umsatzgeschwindigkeiten in einer Enzymlösung definierter Konzentration möglich. Da stöchiometrisch gleich viel Alkohol abgebaut wird, wie NADH entsteht, lässt sich die Volumenaktivität auch als Geschwindigkeit des entstehenden NADH, anstelle des abgebauten Alkohol-Substrats, darstellen:

Unter Berücksichtigung des Küvettenvolumens der jeweiligen Analysenlösung ergibt sich für die Aktivität/Reaktionsgeschwindigkeit:

Im Versuch wurden zuerst die Absorptionsspektren von NAD+ und NADH aufgenommen und anhand der Absorptionsmaxima die Exktinktionskoeffizienten errechnet. Anschließend wurden die Konzentrationen unbekannter NAD+- und Ethanol- Lösungen bestimmt. Zudem wurde die Gleichgewichtskonstante der Alkohol-Dehydrogenase-Reaktion bei unterschiedlichen Konzentrationen ermittelt. Zuletzt wurde die spezifische Aktivität von ADH gegenüber unterschiedlichen Alkoholen untersucht.

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II. Durchführung

1. Aufnahme der Absorptionsspektren von NAD+ und NADH

Es wurden 1,95 ml 50 mM Na-Diphosphatpuffer pH 8,8 / Semicarbazid und 0,05 ml absolutes Ethanol in eine 1 cm Quarzküvette gefüllt. Dabei wurde ein Referenzspektrum von 360 bis 240 nm aufgenommen. Nachdem dies gemacht wurde, entleerte man die Küvette und füllte sie wieder mit 1,9 ml desselben Puffers, mit 0,05 ml 5 mM NAD+ und mit 0,05 ml absolutem Ethanol. Es wurde das Absorptionsspektrum des NAD+ zwischen 360 und 240 nm aufgenommen. Nachdem 5 µl Hefe-ADH-Lösung (500 U/mol) hinzugegeben wurde, startete die Reaktion. Nach 15 min nahm man anschließend wieder das Spektrum auf, wobei hier NAD+ zu NADH reagierte.

2. Endpunkt-Bestimmung unbekannter NAD+ - und Ethanol-Konzentrationen

Um die Endpunkt-Bestimmung unbekannter NAD+ - und Ethanol-Konzentrationen durchzuführen, brauchte man jeweils 9 Küvetten (insgesamt 18). Das Spektralphotometer wurde auf eine Wellenlänge von 339 nm eingestellt. Man musste verschiedene Lösungen hinzugeben, welche im folgenden Pipettierschema erläutert werden. Diese Abbildung entspricht der Abbildung auf Seite 12 des Skripts des Biochemischen Grundpraktikums für Studierende der Biologie aus dem Sommersemester 2014.

Pipettierschema für die unbekannte Ethanol-

Lösung

Referenz Kalibrierungswerte (6,25 mM Ethanol)

Unbekannte Ethanol-Lösung

Küvette 1 Küvette 2,3

Küvette 4,5

Küvette 6,7

Küvette 8,9

50 mM Na-Diphosphatpuffer pH = 8,8 mit Semicarbazid

1,85 1,85 1,85 1,85 1,85

5 mM NAD+-Lösung 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

6,25 mM Ethanol-Lösung 0,05 0,05 0,025 - -

unbekannte Ethanol-Lösung

- - - 0,05 0,025

dest. Wasser 0,35 0,30 0,325 0,30 0,325

Hefe-ADH (500 U/ml) - 0,05 0,05 0,05 0,05

Verdünnung der Substratlösung

(Gesamtvolumen: 2,5 ml)

- 1:50 1:100 1:50 1:100

Tabelle 1: Pipettierschema für die unbekannte Ethanol-Lösung

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Pipettierschema für die unbekannte NAD+-Lösung

Referenz Kalibrierungswerte (5 mM NAD+)

Unbekannte NAD+-Lösung

Küvette 1 Küvette 2,3

Küvette 4,5

Küvette 6,7

Küvette 8,9

50 mM Na-Diphosphatpuffer pH = 8,8 mit Semicarbazid

1,85 1,85 1,85 1,85 1,85

5 mM NAD+-Lösung 0,05 0,05 0,025 - -

unbekannte NAD+-Lösung - - - 0,05 0,025

absolutes Ethanol 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05

dest. Wasser 0,55 0,50 0,525 0,50 0,525

Hefe-ADH (500 U/ml) - 0,05 0,05 0,05 0,05

Verdünnung der Substratlösung

(Gesamtvolumen: 2,5 ml)

- 1:50 1:100 1:50 1:100

Tabelle 2: Pipettierschema für die unbekannte NAD+-Lösung

3. Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten für die ADH-Reaktion

Es wurden 9 Küvetten mit folgenden Komponenten benötigt. Dabei beinhaltete die Küvette 1 eine Vergleichslösung zum Nullpunktabgleich am Spektralphotometer. Die Inkubationsdauer betrug 15 min und die Messung war bei der Wellenlänge 339 nm. Folgendes Pipettierschema entspricht ebenfalls der Abbildung auf der Seite 13 des biochemischen Grundpraktikumskripts.

Küvette 1 Küvette 2,3

Küvette 4,5

Küvette 6,7

Küvette 8,9

50 mM Na-Diphosphatpuffer pH 9,8

- - 2,25 - -

50 mM Na-Diphosphatpuffer pH 8,8

2,30 2,25 - 2,15 2,15

5 mM NAD+-Lösung

0,10 0,10 0,10 0,10 0,20

6,25 mM Ethanol-Lösung

0,10 0,10 0,10 0,20 0,10

ADH-Lösung (500 U/ml)

- 0,05 0,05 0,05 0,05

Verdünnung der NAD+-Lösung (Gesamtvolumen: 2,5 ml)

1:25 1:25 1:25 1:25 1:12,5

Tabelle 3: Pipettierschema für die Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten für die ADH-Reaktion

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4. Bestimmung der relativen spezifischen Aktivität von ADH gegenüber verschiedenen Alkoholen

Bei diesem Versuch wurde eine 1:10 Verdünnung der ADH erstellt. Es wurden 10 µl der ADH-Stammlösung (500 U/ml) in einem 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäß mit 90 µl dest. Wasser vermischt. Danach wurden 4 Küvetten mit jeweils 1,85 ml 50 mM Na-Diphosphatpuffer pH8,8, 0,1 ml 5mM NAD+-Lösung und mit 0,5 ml dest. Wasser gefüllt. Die verschiedenen Alkohole (absolutes Methanol, Ethanol, n-Propanol und n-Butanol) wurden jeweils, mit der Menge von 0,05 ml, in die 4 Küvetten hinzugegeben. Die einzelnen Proben wurden in das Photometer gestellt und mit 5 µl der verdünnten ADH-Lösung versetzt. Dadurch startete die Reaktion in der Küvette und am Photometer wurde unmittelbar ein neuer Leerwert eingestellt. Nach 2 min wurde die Extinktion bei 339 nm notiert.

III. Ergebnisse und Auswertungen

1. Aufnahme der Absorptionsspektren von NAD+ und NADH

Sowohl NAD+ als auch NADH weisen bei 260nm ein Absorptionsmaximum auf, da sie einen identischen Adeninbereich besitzen. Die Absorption des NAD+ liegt höher als die des NADH, weil es weiterhin einen mesomeren Nikotinamidring besitzt, der ebenfalls bei 260nm absorbiert und sich so die Absorptionen überlagern. Das NADH besitzt dafür ein weiteres Absorptionsmaximum bei 339nm, das durch die Übertragung des Hydrid-Anions und damit Reduktion des Nikotinamidrings entsteht. Die Extinktionskoeffizienten werden mit dem Lambert-Beer’schen Gesetz berechnet:

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Zunächst muss die Konzentration in den Küvetten berechnet werden:

Eingesetzt: (Extinktionswerte siehe Abbildung)

2. Endpunkt Bestimmung unbekannter NAD+- und Ethanol-Konzentration

Um die Konzentration des Ethanols zu bestimmen, erfolgte die Reaktion im NAD+-Überschuss. Das gleiche gilt für die Bestimmung des NAD+. Diese Reaktion findet im Überschuss von Ethanol statt. Dadurch wird gewährleistet, dass eine vollständige Umsetzung der Substrate erfolgt. Das Gleichgewicht liegt jedoch stark auf der Eduktseite (Ethanol und NAD+). Aus diesem Grund wurde die ADH-Reaktion mit einer Semicarbazonbildung gekoppelt. Das im Puffer enthaltene Semicarbazid reagierte mit dem Ethanal zu Ethanal-semicarbazon, welches mesomerie-stabilisiert ist. Somit ist eine Rückreaktion verhindert.

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Berechnung der unbekannten Ethanolkonzentrationen:

Ethanol-Bestimmung Cber bzw. Cunb

[*10-3M]

Extinktion ΔE

Mittelwert der

Extinktion ΔE

Cspektr,2-5

Bzw. Cspektr,6-9

[mM]

CPr [*10-3 M]

Küv. 2 6,25 mM Lösung;

1:50

0,125 1,023 0,950 0,153 -

Küv. 3 0,877

Küv. 4 6,25 mM Lösung; 1:100

0,0625 0,740 0,775 0,066 -

Küv. 5 0,810

Küv. 6 unbekannte Lösung;

1:50

0,126 0,914 0,956 0,154 6,3

Küv. 7 0,998

Küv. 8 unbekannte Lösung; 1:100

0,063 0,799 0,726 0,117 6,3 Küv. 9 0,725

Tabelle 4: Bestimmung der unbekannten Ethanolkonzentration Aus der Tabelle ist eine Ethanolkonzentration von 6,3 mM zu entnehmen. Die jeweiligen Schritte der Berechnungen werden nun erläutert, wobei immer nur ein Beispiel vorgerechnet wird. Berechnung von cber: Zunächst wird die Konzentration der verdünnten Lösung anhand der ersten Verdünnung berechnet.

, wobei Vf der Verdünnungsfaktor ist.

Berechnung von cspektr,2-5: Mithilfe des Lambert-Beersche Gesetz wird cber überprüft.

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Berechnung von cspektr,6-9: Mithilfe des Lambert-Beersche Gesetz wird cber überprüft:

Berechnung von cunb

:

[ ]

Berechnung von cPr:

Berechnung der unbekannten NAD+-Konzentration:

NAD+-Bestimmung Cber bzw. Cunb [*10-3M]

Extinktion ΔE

Mittelwert der Extinktion ΔE

Cspektr,2-5

Bzw. Cspektr,6-9

[mM]

CPr [*10-3 M]

Küv. 2 5 mM Lösung; 1:50

0,1 0,496 0,524 0,085

-

Küv. 3 0,552

Küv. 4 5 mM Lösung; 1:100

0,05 0,255 0,266 0,043 -

Küv. 5 0,276

Küv. 6 unbekannte Lösung; 1:50

0,072 0,383 0,379 0,061

3,6

Küv. 7 0,375

Küv. 8 unbekannte Lösung; 1:100

0,035 0,178 0,185 0,030 3,5

Küv. 9 0,192

Tabelle 5: Bestimmung der unbekannten NAD+-Konzentration Aus der Tabelle ist eine NAD+-Konzentration von 3.55 mM zu entnehmen. Die Rechenschritte entsprechend hierbei genau den Schritten für die Konzentrationsbestimmung des Ethanols.

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3. Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten der ADH-Reaktion Nach dem Massenwirkungsgesetz gilt für die Gleichgewichtskonstante der ADH-Reaktion:

[ ] [ ] [ ]

[ ] [ ]

Der pH-Wert ist der negative dekadische Logharithmus der Protonenkonzentration:

[ ] Damit ergibt sich für [H+]:

[ ] Der zugegebene Puffer stellt den pH-Wert und damit die Konzentration der Protonen ein:

Küvette 1,2,3,6,7,8,9:

[ ]

Küvette 4,5:

[ ]

Für die Berechnung von [NADH] wird das Lambert-Beer’sche Gesetz verwendet und die Mittelwerte der gemessenen Extinktionen aus den jeweils gleichen Mischungen eingesetzt:

[ ]

Da Ethanal und NADH stöchiometrisch im selben Verhältnis gebildet werden gilt: [ ] [ ]

[NAD+] errechnet sich aus der eingesetzten Menge und dem entstehenden NADH:

[ ] [ ] [ ] [NAD+]Stammlösung = 5 mM Küvetten 1-7:

[ ]

Küvetten 8,9:

[ ]

Genauso errechnet man [Ethanol] aus der zu Beginn eingesetzten Menge und dem entstehenden Ethanal (bzw. [NADH], aufgrund des stöchiometrischen Verhältnisses):

[ ] [ ] [ ] [Ethanol]Stammlösung = 6,25 mM Küvetten 1,2,3,4,5,8,9:

[ ]

Küvetten 6,7:

[ ]

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Beispielrechnung Küvetten 2+3:

[ ]

[ ]

[ ]

[ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]

Analog werden die restlichen Werte berechnet, sie sind in der nachfolgenden Tabelle einzusehen.

Eingesetzte Konzentration

Mittelwert der Extinktion ΔE

Berechnete Gleichgewichtskonzentration

Berechnete Konstante

NAD+

5*10-3

Ethanol 6,25*10-3

[NADH]= [Ethanal]

[

]

[NAD+]

[

]

[Ethanol]

[

]

[H+]

[

]

K

[

]

Küv. 2,3

0,1ml 0,1ml 0,0845 0,0136 0,1864 0,2364 1,58 4,66

Küv. 4,5

0,1ml 0,1ml 0,142 0,0229 0,1771 0,2271 0,158 2,06

Küv. 6,7

0,1ml 0,2ml 0,079 0,0127 0,1873 0,4873 1,58 2,79

Küv. 8,9

0,2ml 0,1ml 0,212 0,0342 0,3658 0,2158 1,58 23,41

Tabelle 6: Berechnung der Gleichgewichtskonstante K bei verschiedenen Konzentrationen

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4. Bestimmung der relativen spezifischen Aktivität von ADH gegenüber verschiedenen Alkoholen

Berechnung der Reaktionsgeschwindigkeit:

Alkohol Extinktion (t = 2 min)

Extinktionsänderung [ΔE/min]

V [*10-2 µmol/min]

Ethanol 0,360 0,18 7,27

Methanol 0,004 0,002 0,08

1-Propanol 0,182 0,091 3,68

1-Butanol 0,058 0,029 1,17

Tabelle 7: Bestimmung der relativen spezifischen Aktivität von ADH Aus der Tabelle ist zu erkennen, dass das Enzym ADH die größte Aktivität mit dem Ethanol besitzt. Daraus schließt man, dass es sich hierbei um das Hauptsubstrat handelt. Methanol wird kaum umgesetzt. Dies liegt an der fehlenden Prochiralität. Dadurch wird Methanol nicht durch das Enzym umgesetzt und es entsteht auch kein NADH. Somit ist keine Extinktion zu notieren. Die Aktivität von ADH bzgl. Propanol ist höher als bzgl. Butanol. Dies ist mit der Kettenlänge zu erklären. Dadurch dass das Butanol eine CH2-Gruppe mehr besitzt, ist seine räumliche Anordnung flexibler und verhindert aus räumlichen Gründen teilweise die Reaktion mit dem ADH.

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IV. Diskussion

Allgemein Die Messwerte unterliegen den üblichen Fehlerquellen. Ergebnisse die nicht den Erwartungen entsprechen können durch unsauberes Arbeiten wie Pipettierfehler verfälscht worden sein. Es mussten Küvetten benutzt werden, die vorher schon einmal benutzt worden waren. Es kann also sein, dass die Küvetten nicht ausreichend gewaschen wurden und somit Rückstände vorhanden waren. Ein weiterer Grund für die Verfälschung der Ergebnisse kann die Zeit sein. Man sollte mit Enzymen schnell und sauber arbeiten. Dies war nicht immer der Fall. Extinktionsspektren von NAD+ und NADH Im Nikotinamidring des oxidierten NAD+ liegen das C4-und das N- Atom trigonal-planar sp2-hybridisiert vor (siehe mesomere Grenzformel in der Einleitung). Bei der Reduktion greift das Hydridion an das C4-Atom nukleophil an, welches dadurch sp3-hybridisiert (keine Doppelbindung oder unbesetzte Orbitale gleichmäßige Ladungsverteilung in den Orbitalen) wird und eine tetraedische Form einnimmt. Das N-Atom erhält ein freies Elektronenpaar, die mesomere Struktur des konjugierten Systems ist nicht mehr vorhanden. Die neue chinoide Struktur hat andere Absorptionseigenschaften. In der Literatur:

Gemessen und berechnet:

Die Abweichung von 14,7% ist nicht gering, aber auch nicht sehr hoch. Die Annahme ist, dass kleine Fehler gemacht wurden oder das Gefäß verschmutzt war. Zudem war die Quarzküvette beschädigt, was zusätzlich eine Verfälschung der Ergebnisse verursacht haben könnte. Bestimmung der Konzentration einer unbekannten NAD+- und Ethanollösung Die ermittelten Konzentration aus beiden Verdünnungen (1:50, 1:100) sind in Tabelle 4 identisch und in Tabelle 5 kaum unterschiedlich, was ein schönes Ergebnis ist – es weist darauf hin, dass sauber gearbeitet wurde und keine Fehler unterlaufen sind. Die Konzentrationen von 6,3 mM (Ethanol) und 3,55 mM (NAD+, Mittelwert) erscheinen realistisch. Derartige Konzentrationen finden häufig in Laboren Anwendung, die geringe Streuweite der Ergebnisse bestätigt den Erfolg des Versuchs.

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Gleichgewichtskonstante K der ADH-katalysierten Reaktion Die Gleichgewichtskonstante K beschreibt das Verhältnis von Produkt- und Eduktkonzentrationen einer Reaktion im Gleichgewicht. Zur Bestimmung von K wurden verschiedene Konzentrationen der an der Reaktion beteiligten Stoffe verwendet.

Ist K<1, dann liegen mehr Edukte (Ethanol und NAD+) vor.

Im Fall K>1 liegt das Gleichgewicht auf Seiten der Produkte (Ethanal, NADH und H+).

Jeder der errechneten Werte liegt weiter unter 1, was bedeutet, dass die Reaktion kaum in Richtung des Ethanals stattfindet. Literaturwert von K der ADH-Reaktion: K = 8*10-12

Die Abweichungen streuen in einem großen Bereich (einer der Werte scheint sehr unrealistisch – eine Verfehlung um 193%). Interessanterweise beträgt der Mittelwert der errechneten K-Werte 8,23*10-12, was dem Literaturwert sehr nahe kommt. Der Grund für die starken Abweichungen sind die einzelnen Versuchsaufbauten. In den Küvetten 4 und 5 wurde ein Puffer mit einem höheren pH-Wert eingesetzt, dem Gemisch werden Protonen entzogen. Das daraus resultierende K ist deshalb besonders klein. Eine Reduzierung der Abweichung erreicht man durch Einsetzen von Ethanol- und NAD+-Überschusskonzentrationen, die Reaktion ist dann nicht limitiert und kann frei ablaufen. Dadurch sollte es möglich sein, dem Literaturwert nahe zu kommen. Weitere Abweichungen ergeben sich durch Rundungen in der Berechnung. Leider konnten keine Ergebnisse mit nur geringen Abweichungen (geringste: 41,75%) erzeugt werden. Aus den oben beschriebenen Gründen und wie immer fehlerhaftem, unsauberem Arbeiten lassen sich die groben Abweichungen erklären. Der Erfolg des Versuchs war daher mäßig. 7 Relative spezifische Aktivität der ADH bei verschiedenen Alkoholen Aus Tabelle 7 lässt sich für die Umsetzungsgeschwindigkeiten folgende Beziehung ablesen:

Ethanol besitzt als Hauptsubstrat die höchste Umsatzgeschwindigkeit. Im Fall von 1-Propanol und 1-Butanol sinkt die Umsatzgeschwindigkeit mit der Länge des Moleküls. Als prochirale, primäre Alkohole sind sie zwar auch als Substrat geeignet, jedoch steigt die sterische Hinderung mit der Größe des Moleküls, es kommt seltener zu wirksamen Zusammenstößen der Moleküle und einer Bindung an das aktive Zentrum des Enzyms. Methanol wird mit einer kaum messbaren Geschwindigkeit umgesetzt, weil dem Molekül der prochirale Charakter (zwar tetraedisch, aber 3 gleiche Substituenten; siehe Definition in der Einleitung) für die Umsetzung durch das stereospezifische ADH fehlt.