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Amylase 2.0

HLFS Ursprung

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In ca. 4 Milliarden Jahren Evolution hat die Natur beinahe für jeden Lebensraum ihren Organismen die überlebensnot-wendigen Enzyme gegeben. Ob in ko-chend heißen Th ermalquellen oder den frostigen Einöden der Antarktis: kein Fleck unseres Planeten ist nicht bedeckt mit einer Fülle von Leben. Einige ‚Pionie-re‘ überleben selbst in den unwirtlichen Höhen der Exosphäre, der letzten Schicht der Erdatmosphäre, die an die unend-lichen Weiten des Universums grenzt.

Meist handelt es sich dabei um primitive Mikroben, die gerade wegen ihrer Trivi-alität die perfekte Anpassung für das Le-ben in den lebensfeindlichsten Regionen unseres Planeten gefunden haben.Doch in der modernen industrialisierten Welt des Menschen kämpfen Bakterien und andere Mikroben nicht mehr unbe-dingt nur für den Fortbestand ihrer Art, sondern sollen in großen Fermentern ihre von der Natur verliehenen Fähigkeiten

dem Menschen zur Verfügung stellen. Sie spalten komplexe Moleküle wie Stärke oder Fette, machen Obst weich (um da-raus mehr Saft pressen zu können) oder vergären Glukose zu Ethanol, der Benzin beigemischt wird.

Die etwa von Bakterien erzeugten En-zyme, die diese Aufgaben erledigen, sind nun mitunter zwar an die Umweltbedin-gungen ihres ursprünglichen Lebens-raumes angepasst, nicht jedoch an die Arbeit im Fermenter. Eine natürliche, selbstständige Anpassung bzw. Evoluti-on ist hierbei kaum möglich, insbeson-dere weil die verwendeten Bakterien im Fermenter keinem Stress zur Anpassung ausgesetzt sind. Die Lebensbedingungen wurden an sie angepasst.

Eine handelsübliche Amylase, ein Enzym zur Spaltung von Stärke zu Glukose, hat derzeit ihre ideale Arbeitstemperatur bei über 80°C. Um die industriell zu verar-

beitenden Mengen an Stärke auf diese Temperatur zu erhitzen, ist ein unglaub-liches Energieaufk ommen nötig. Jedes Grad geringere Arbeitstemperatur einer optimierten Amylase würde viel Ener-gie und somit auch CO2 einsparen. In der Automobil-Industrie zum Beispiel arbeiten Forscherteams monatelang, um einem Verbrennungsmotor ein halbes Prozent mehr Wirkungsgrad herauszu-locken. Warum versucht man also nicht, mit Ingenieurspraktiken Enzyme zu opti-mieren?

Wie groß diese Energieersparnis sein könnte, kann man an folgenden Beispie-len erahnen:Das größte Bio-Ethanolwerk Österrei-chs verarbeitet derzeit jährlich 400.000 t stärkehältige Rohstoff e und ein österrei-chisches Werk zur Produktion von Zitro-nensäure fermentiert 250.000 t Maisstär-ke jährlich mit Amylase. Die verwendete α-Amylase der Firma

EVOLUTION ZUM KLIMASCHUTZ

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Evolution zum Klimaschutz ................................................................................................................................................... 3

Amylase ................................................................................................................................................................................... 5

Laborarbeit ............................................................................................................................................................................. 8 Laborprotokoll .................................................................................................................................................................................. 10

Ergebnisse und Interpretation ............................................................................................................................................. 20 Überprüfung der Funktionalität der synthetischen Amylase durch Photometermessungen ......................................................... 20 Überprüfung der Funktionalität der synthetischen Amylase mittels Stärkeagaroseplattentests ................................................... 22 Vergleich der Amylasen in Speichelproben von Tier und Mensch .................................................................................................. 23 Auft rennung der Amylase mittels Proteingel (SDS-Gel) ................................................................................................................. 24 Massenspektrometrische Analyse der Amylase aus den Medien LBM, M9M, LBN, M9N, LBE und M9E ................................. 24

Abstract ................................................................................................................................................................................. 26

Eindrücke/Statements .......................................................................................................................................................... 27

Sponsoren/Partner ............................................................................................................................................................... 30

Team ...................................................................................................................................................................................... 31

INHALTSVERZEICHNIS

Schuljahre 09/10 10/11

Impressum:Höhere land- und forstwirtschaft liche SchuleHLFS UrsprungUrsprungstr. 45161 Elixhausen0043 662 480301http://www.ursprung.athttp://amylase.ursprung.atKontakt: [email protected]

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AMYLASE

Das Enzym Amylase ist für die Spaltung von Polysacchariden wie Stärke in kurz-kettige Zuckermoleküle zuständig. Im menschlichen Organismus ist Amylase im Speichel und im Sekret der Bauspei-cheldrüse vorhanden. Die Amylase im Speichel ist auch für den Eff ekt zuständig, dass Semmeln nach längerem Kauen süß werden.

Struktur der α-Amylase

Die α-Amylase kommt in unterschied-lichen Lebewesen in abgeänderten For-men vor. Der Mensch hat 5 Isoformen (1A, 1B, 1C, 2A, 2B) im Speichel. Das Molekulargewicht beträgt 57767,8. Die Primärstruktur besteht aus 511 Ami-nosäuren mit folgender Zusammenset-zung:Ala (A) 27 5.3% Arg (R) 28 5.5% Asn (N) 41 8.0% Asp (D) 35 6.8% Cys (C) 12 2.3% Gln (Q) 12 2.3% Glu (E) 20 3.9% Gly (G) 52 10.2% His (H) 12 2.3% Ile (I) 28 5.5% Leu (L) 27 5.3% Lys (K) 24 4.7% Met (M) 11 2.2% Phe (F) 29 5.7% Pro (P) 22 4.3% Ser (S) 33 6.5% Th r (T) 23 4.5% Trp (W) 19 3.7% Tyr (Y) 21 4.1% Val (V) 35 6.8%

Quelle:http://macromoleculeinsights.com/alphaamylase.php

Wirkspezifi sche Amylasen Die auch biotechnisch herstell-bare α-Amylase spaltet die α(1-4)-Glykosidbindung der Stärke. Dadurch entstehen Dextrine und daraus Malto-se, Glukose und verzweigte Oligosac-charide. Beim Menschen gibt es fünf Isoformen der α-Amylase – davon drei als so genannte Speichel-Amylase und zwei als Pankreas-Amylasen. β-Amylase kommt in Bakterien und Pfl anzen, aber nicht direkt im Menschen vor. Sie spaltet jeweils vom Kettenende her ein Maltosemolekül nach dem anderen ab. Je mehr Kette-nenden vorhanden sind, desto besser kann die β-Amylase wirken. Die γ-Amylase kommt nur in Pil-zen vor. Sie spaltet vom Kettenende her jeweils ein β-D-Glucose-Molekül nach dem anderen ab. Sie ist „ver-wandt“ mit der menschlichen Mal-tase-Glucoamylase die im Darm vor-kommt, aber nicht zu den Amylasen gehört.

Novozymes, welche mit Hilfe transgener Bakterien hergestellt wird, hat ihr Tem-peraturoptimum bei 82°-86°C. Eine neue, temperatur-optimierte Amylase, die bei-spielsweise bei 60°C gleich gut arbeiten würde, könnte laut unserer vorsichtigen Berechnungen allein bei den zwei oben genannten Betrieben eine Energieer-sparnis von mehr als 50 Terajoule (1012) bringen. Das entspricht dem Jahres-stromverbrauch von mehr als 3000 öster-reichischen Durchschnittshaushalten.

Doch wie ist es möglich, ein Enzym ganz nach diesen speziellen Bedürfnissen an-zupassen?In der klassischen Gentechnik ist es be-reits Standard, Gene anderer Organismen und die von ihnen codierten Enzyme in ein Bakterium „einzupfl anzen“, womit be-wirkt werden kann, dass das gewünschte Produkt mit den sich schnell teilenden Bakterien sehr einfach und ökonomisch erzeugt werden kann. Auch ist es auf eine ähnliche Art und Weise, mit sogenannten

„starken“ Genschaltern (Promotoren), möglich, die Produktionsrate des Enzyms um ein Vielfaches zu steigern. Doch: direkt an der Struktur der Protei-ne und der damit verbundenen Funktion zu schrauben, ist mit den Werkzeugen der Gentechnik kompliziert. Praktischere Werkzeuge stellt die Synthetische Bio-logie, ein neuer Forschungszweig der modernen Molekularbiologie, zur Ver-fügung. Mit ihrer Hilfe wird es möglich sein, Enzyme und Organismen ganz nach dem für sie vorgesehenen Nutzen zu desi-gnen und zu optimieren. Wir, die SchülerInnen der HLFS Ur-sprung, haben uns in diesem Projekt das Ziel gesetzt, den Bauplan einer Amylase durch das Einbringen von nicht-kano-nischen, synthetischen Aminiosäuren (Ethionin und Norleucin) in die Struktur zu verändern und damit womöglich hin-sichtlich seiner ‚Arbeitstemperatur‘ zu verbessern. Zwei Wissenschaft lerInnen des Max-Planck-Institutes für Biochemie in Martinsried brachten das dazu nöti-

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ge technische Know-How direkt in die Schule, lehrten uns die Grundprinzipien.

Doch ganz einfach ist das mit dem „En-zym-Upgrade“ nicht. Wenn man ein Pro-tein auf diese Weise verändert, können auch unerwünschte Eff ekte eintreten. Das Enzym könnte z.B. einfach nicht mehr funktionieren oder schlechter arbeiten. Wenn der Einbau der für die Amylase neuen Bausteine klappen würde, könnten wir aber jedenfalls zeigen, dass mit der Methode an der Funktionalität der Amy-lase gedreht werden kann.

Wir haben angefangen, in einem For-schungsgebiet zu arbeiten, dem die Ge-sellschaft eben wegen seiner unbegreifl ich vielen Möglichkeiten in Zukunft sowohl wirtschaft lich als auch mit gesetzlichen Grundlagen und Sicherheitsregeln mehr Aufmerksamkeit widmen sollte.

Die α-Amylase von Bazillus subtilis hat 619 Aminosäuren in der Primärstruktur:

An 11 Stellen fi ndet sich Methionin, blau markiert. Die rot markierten Aminosäu-ren sind für die katalytische Wirkung im aktiven Zentrum hauptverantwortlich.

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Zunächst stellt sich die Frage, warum wir die natürliche Amylase überhaupt verän-dern müssen. Für Jahrtausende hat diese bestens funktioniert und all ihre Anforde-rungen gut erfüllt. Doch das stimmt nur zum Teil. Tatsächlich haben zwar Milli-onen Jahre der Evolution das Enzym an seine Aufgabe zur Stärkeaufspaltung zu kleineren Kohlenhydraten in den Zellen eines jeden Organismuses perfekt ange-passt, doch liegen die Interessen der mo-dernen Betriebe in ganz anderen Aspekten. Ein Unternehmen ist dazu verpfl ichtet, möglichst hohe Einnahmen bei möglichst niedrigen Ausgaben zu erwirtschaft en. Und bei den von der heutigen Industrie verarbeiteten Mengen zählen oft schon kleinste Unterschiede um Millionen ins Wanken zu bringen. Es zählen z.B. schon wenige Grad Celsius, die man einen Sud weniger erwärmen muss, um weit ökono-mischer zu wirtschaft en.

Genau an diesem Punkt kommt die Syn-thetische Biologie ins Spiel. Mit Hilfe ih-rer Werkzeuge ist es möglich, Enzyme, die etwa in der Biospriterzeugung von großer Bedeutung sind, so zu optimieren, dass sie zum Beispiel bei niedrigeren Tempe-raturen mit gleicher Leistung arbeiten wie das Standardenzym bei sehr hohen. Es können aber auch ganze Verarbeitungs-schritte wegfallen, wenn das neue Enzym es erlaubt, zwei Schritte gleichzeitig zu vollziehen. Dies sind nur zwei von vielen Beispielen, die den Vorteil von synthe-tischen Enzymen in der modernen Ver-fahrenstechnik vorstellbar machen.

Durch die Möglichkeit solcher Optimie-rungen spart das Unternehmen nicht nur an Ausgaben, es werden auch wichtige Ressourcen wie Primärenergie und somit die Umwelt geschont.Alle Lebewesen, vom Bakterium über Pfl anzen bis hin zu den Menschen, ver-wenden die 20 gleichen Aminosäuren für

die Proteinbiosynthese (siehe Abbildung 2). Bekannt sind in der Zwischenzeit je-doch an die 700 Aminosäuren, die zwar eigentlich auch „proteinfähig“ wären, aber von der Natur nicht genutzt werden.In unserem Projekt haben wir versucht, das Enzym Amylase durch den Einbau nicht natürlicher Aminosäuren zu verän-dern oder gar verbessern.Wir entschieden uns, die Aminosäure Me-thionin in der Primärstruktur der Amylase durch synthetisches Ethionin bzw. Norleu-cin zu ersetzen. Eine alte Veröff entlichung aus dem Jahre 1959, in der der Japaner Yo-shida beschreibt, wie er Ethionin erfolg-reich in den Stoff wechsel bei Bacillus sub-tilis einbrachte, diente uns als Basis. Herrn Yoshida war zu dieser Zeit noch nicht die

Idee gekommen, Proteine auf diese Wei-se zu optimieren - er wollte generell die Proteinbiosynthese erforschen, die zu die-sem Zeitpunkt völlig ungeklärt war. Wir vermuteten, dass seine Methode auch mit der Aminosäure Norleucin funktionieren könnte.

Wir möchten zeigen, dass man den Bau-plan von Enzymen durch die Erweiterung auf sogenannte synthetische Aminosäuren gezielt manipulieren kann und man damit die Chance hat, neue Enzyme zu kreieren.

Text frei nach Andreas Kreuzeder

Synthetische Amylase

Das Verdauungsenzym Amylase spielt auch in ganz anderen Bereichen eine Rolle. Die Herstellung der α-Amylase erfolgt groß-technisch durch gentechnisch modifi zierte Bacillus-Arten. Ohne gentechnische Mo-difi kation ist die Herstellung von Amylase über Aspergillus-Pilzkulturen möglich. Da die Effi zienz der Bakterienkulturen aber höher ist und die produzierte Amylase tem-peraturstabiler, werden hauptsächlich Bak-terien zur Produktion verwendet.

Biotechnologisch hergestellte Amylasen werden auch in der Lebensmitteltechnolo-gie eingesetzt. So kann das Gasbildungsver-mögen von Backmischungen erhöht wer-den. Die Amylase lässt dann Mono- und Disaccharide entstehen, welche bei Anwe-senheit von Hefe vergären können. Das ent-stehende CO2 lässt den Teig aufgehen und das entstandene Ethanol entweicht gasför-mig aus dem warmen Brotteig.

Eine der wichtigsten Anwendungen von α-Amylase ist der Abbau von günstig her-zustellender Mais- oder Kartoff elstärke zu Maltose- und Glukosesirupen, die in der Nahrungsmittelindustrie Verwendung fi n-den. So basieren viele Süßspeisen, Backwa-ren und auch Speiseeis auf diesen mit Amy-lase verdauten Zuckern. Als Grundstoff für die weitere Produktion von Lebensmitteln fi nden diese Sirupe aber eine sehr breite Anwendung.

Die Amylasen spielen bei der Alkoholfer-mentation eine wichtige Rolle. Aber nicht nur als natürliche Amylase in der Maische sondern auch durch die Zugabe von künst-

licher α-Amylase kann die Fermentations-leistung gesteigert werden. Z.B. beim Bier verhindert das Reinheitsgebot jedoch sol-che enzymatischen Zusätze in Ländern wie Österreich und Deutschland.

Amylase kommt in vielen Produktionspro-zessen zur Anwendung, in denen es darum geht, billige Ausgangsstärke zu verarbeiten und diese entweder direkt einzusetzen oder für andere Anwendungen weiter zu ver-wenden. Ein Beispiel dafür ist die Zitronensäureher-stellung. Maisstärke wird mit Amylasen zu Zucker zerlegt und dieser an dem Schim-melpliz Aspergillus niger „verfüttert“, der

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Anwendung der Amylase

ihn zu Zitronensäure verstoff wechselt.

Als Futtermittelzusätze werden α-Amylasen verwendet, um den Stärkeaufschluss zu verbessern. Damit können pfl anzliche Fut-termittel, die zu einem Großteil aus lang-kettigen Polysacchariden bestehen, besser verwertet werden. Auch in der Waschmittelherstellung ist die Amylase von Bedeutung: Einige der hartnä-ckigsten Verschmutzungen an Kleidungs-stücken sind langkettige Saccharosen. Um diesen Flecken beizukommen kommt hier die Amylase als Verdauungsenzym zum Einsatz. Kleine Saccharosen sind in weiterer Folge löslich und werden ausgewaschen.

Abb. 2

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Nach langen Recherchen und span-nenden Diskussionen machten wir uns im November endlich auf den Weg ins Labor. Eine Woche lang arbeiteten wir an dem hoch gesetzten Ziel, angelehnt an die Forschungen von Yoshida u. Yamasa-ki* aus dem Jahre 1959, eine synthetische Amylase unter Verwendung von zwei nicht-kanonsichen Aminosäuren (Ethi-onin und Norleucin) zu produzieren. In Bezug auf die Aminosäure Norleucin betraten wir mit unserem Ansatz Neu-land. Das Know-How und tatkräft ige Unterstützung bekamen wir von zwei Wissenschaft lerInnen des Max-Planck-Institutes für Biochemie in Martinsried: Dr. Birgit Wiltschi und Mag. Michael Hösl.

Das verwendete Laborbakterium Bacil-lus subtilis** Stamm 1A55 , bezogen vom Bacillus Genetic Stock Center (http://www.bgsc.org/), sollte dabei Ethionin und/oder Norleucin in seinem Stoff -wechsel miteinbeziehen und schließlich ein synthetisches Enzym ins Nährmedi-um segregieren.

Der von uns verwendete Bacillus subtilis-Stamm war Methionin-, Tryptophan-,

Tyrosin- und Phenylalanin-auxotroph und konnte somit außerhalb des künst-lich hergestellten Nährmediums nicht überleben. Die Methionauxotrophie wollten wir nutzen. Wir mischten sechs verschie-dene Nährmedien: Drei auf Basis des Bakterium-Standardmediums, genannt

LB, und drei auf Basis eines anderen Standardmediums, genannt M9. Bei LBM mischten wir Methion als na-türliche Aminosäure bei, bei LBN erset-zen wir Methionin durch Norleucin, bei LBE durch Ethionin. Nach dem gleichem Schema stellten wir M9M, M9N, M9E her. LBM und M9M (mit der natürlichen Aminosäurenzusammensetzung) sollten unsere Referenzproben sein, ob unser Bacillus-Stamm überhaupt Amylasen erzeugen würde, die sogenannten Null-proben. Die Mischrezepte fi nden sich im Laborprotokoll.

Zuerst mussten die vorhandenen Bakte-rien auf eine für die geplanten Versuche ausreichende Menge vermehrt werden.

Dazu mischten wir unter sterilen Bedin-gungen die Vorkultur mit einem zuvor vorbereiteten Medium in einem Schi-kanenkolben, der dann in einem Schüt-telinkubator mit der Idealtemperatur des Bakteriums, 37°C, gegeben wurde. Durch regelmäßige Photometermes-sungen wurde das Wachstum beobach-tet. So konnten wir feststellen, wann das Bakterium seine Vermehrung beendet

DIE ARBEIT IM LABOR

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hatte. Bei jeder Messung wurde auch eine Probe für spätere Amylaseaktivi-tätstests abpippetiert und eingekühlt. Die „ausgewachsene“ Hauptkultur wur-de zentrifugiert, der dabei entstehende Zellüberstand abgeleert und fi ltriert. Das Filtrat versetzten wir mit Ammo-niumsulfat, um das Ausfallen der Amy-lase herbeizuführen. Dieser Vorgang wurde wiederholt. Mit Hilfe eines Dia-lyseschlauches trennten wir das zuvor zugegebene Ammoniumsulfat von der Amylase. Die Aktivität der Amylase der im Lau-fe der Woche genommenen Proben wurde mittels Photometermessungen bestimmt. Die Probe mit der Amyla-se versetzten wir mit Stärke und dieses

Gemisch ließen wir auf einem Th ermo-block für 30 Minuten bei 37°C inku-bieren, wo die vorhandene Amylase die Stärke zu Zucker abbaute. Nach dieser Inkubationszeit gaben wir ein Iodrea-genz hinzu. Das Iod lagerte sich in die noch nicht abgebauten Stärkekomplexe ein und färbte damit die Lösung dement-sprechend dunkel. Der Grad der Licht-durchlässigkeit und der damit verbun-

dene Abbaugrad konnten mit Hilfe eines Photometers gemessen werden. Eine weitere Möglichkeit zur Abschät-zung der Amylaseaktivität eröff net sich mit einer Stärkeagaroseplatte. Die amyla-sehältige Probe pippetierten wir auf eine solche Platte und die darin enthaltene Stärke wurde zersetzt. Dies konnte nach einigen Stunden durch die Zugabe von Iod sichtbar gemacht werden. Bereiche, in denen die Amylase die Stärke zu Glu-cose umwandelte, verfärbten sich nicht. Je mehr Fläche also ungefärbt blieb, de-sto aktiver war unser Enzym.

*Yoshida A. und Yamasaki M.: Studies on the Mechanism of Protein Synthesis into α –Amylase of Bacillus Subtilis, Bi-ochimica et Biophysica Acta 1959, 34, 158-165

*Yoshida A.: Studies on the Mechanism of Protein Synthesis; Incorporation of p-Fluiorophenylalanine into α –Amylase of Bacillus Subtilis, Biochimica et Biophysi-ca Acta 1959, 41, 98-103

*Yoshida A.: Studies on the Mechanism

of Protein Synthesis: bacterial α–Amylase containing ethionine, Biochimica et Bio-physica Acta 1958, 29, 213-214

** http://microbio1.biologie.uni-greifswald.de:8080/institute/85

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1 alpha-Amylase aus Bacillus Subtilis

Ziel: Expression der α-Amylase (amyE) in Bacillus subtilis in Gegenwart nichtka-nonischer Aminosäuren und Segregation ins Medium. Aufreinigung der extra-zellulären α-Amylase über fraktionierte Ammoniumsulfat-Fällung. Analyse der Amylaseaktivität und der Reinheit der Proben auf einem SDS-Gel.Datum: 16-19/11/2009

Das Laborprotokoll

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1. Expression der α-Amylase (amyE)1.1 Vorkultur Montag, Mittag – frü-her Nachmittag (über Nacht) LB Medium sterile 50 ml Falconröhrchen Eisbox mit Eis 20 μl Glycerin-Stocks des Bacillus subtilis Stammes 1A55 (wird von den Betreuern gestellt) Sterilarbeitsbank 200 μl Pipette und gelbe Spitzen unter der Sterilarbeitsbank 10 ml LB Medium in ein steriles 50 ml Fal-conröhrchen einfüllen mit 20 μl Glycerin-Stock des Bacillus subtilis Stamms 1A55 beimpfen Der Glycerin-Stock wird von den Betreuern gestellt. Die Röhrchen wer-den auf Eis gelagert. Inkubation im Schüttelinkubator: über Nacht, 37 °C, 200-250 rpm

1.2 Bestimmung der optischenDichte (OD550) der Vorkultur Spektralphotometer bei 550 nm Plastikküvetten Vortex-Mixer LB Medium 200 μl Pipette und gelbe Spitzen 1 ml Pipette und blaue Spitzen Fotometer einschalten und „Absorp-tion“ und 550 nm Messwellenlänge ein-stellen 1 ml LB Medium in eine Plastikkü-vette pipettieren (BLANK)Diese Probe enthält keine Zellen und ist daher die Blindprobe, Referenz oder „Blank“. die Vorkultur im Kulturröhrchen auf dem Vortex-Mixer gut aufschütteln („vortexen“)Die Zellen setzen sich nach einiger Zeit am Boden des Röhrchens ab. Werden sie nicht gut aufgeschüttelt, erhält man einen falschen Wert für die optische Dichte. 100 μl der gut aufgeschüttelten Vor-kultur unter steriler Arbeitsweise in eine Plastikküvette pipettieren 900 μl LB Medium hinzufügen und durch vorsichtiges Auf- und Abpipet-tieren mischen (PROBE). Die Zellsus-pension in der Küvette wird auf diese Weise 1:10 verdünnt. Bei der Berech-nung der optischen Dichte und an-schließend des Volumens für das Ino-

kulum ist dieser Verdünnungsfaktor zu berücksichtigen! Küvette mit BLANK in den Refe-renzhalter des Fotometers einstellen Nullabgleich machen Küvette mit PROBE in den Proben-halter einstellen optische Dichte der PROBE bei ei-ner Wellenlänge von 550 nm (OD 550) messen. Die Trübung der Lösung im Vergleich mit dem BLANK wird be-stimmt.Die Optische Dichtemessung einer Bakteriensuspension beruht auf der Lichtstreuung an den Bakterien. Bakterien sind Partikel mit einer von Wasser abweichenden Dichte. Diese Partikel verursachen eine Ablenkung langwelligen Lichtes (550 nm), wenn sie in einer Küvette in den Strahlen-gang eines Photometers gebracht wer-den. Das Licht wird durch diese Parti-kel also vom Detektor weggestreut. Ein solcher „Lichtverlust“ wird als Absorp-tionswert im Spektralphotometer bei 550 nm bestimmt. OD550 der Vorkultur notieren (Ver-dünnungsfaktor einrechnen!) D.h. 1 ml der Vorkultur hat die gemessene optische Dichte.

1.3 Ansetzen der Hauptkultur Diens-tag, Mittag (24 h) steriles LBM, LBE, LBN, M9M, M9E, M9N Medium (wird von den Betreuern gestellt) je ein steriler 2 L Schikanenkolben pro Gruppe Edding-Stift e zum Beschrift en, Tex-tilband oder durchsichtiges Klebeband Sterilarbeitsbank Vortex-Mixer Taschenrechner Spektralphotometer bei 550 nm Plastikküvetten Eppendorf Plastikgefäße („Eppis“), 1.5 ml Komponenten des Amylase-Tests (siehe weiter unten) 1 ml Pipette und blaue Spitzen benötigtes Volumen für das Inoku-lum berechnen, sodass die Start OD550 der Hauptkultur 0.1 ist Die LB bzw. M9 Medien werden nun mit Zellen aus der Vorkultur beimpft („inokuliert“). Die Vorkultur hat eine OD550, die hö-her ist als 0.1; davon ausgehend kann man nun berechnen, wie stark man die Vorkultur verdünnen muss, damit in der Hauptkultur die Start OD550 0.1 er-reicht wird. Mit folgender Formel kann das Volumen des Inokulums errechnet werden:

V Inokulum= VHK*StartOD550 /OD550VK (Formel)VInokulum , Volumen des InokulumsVHK , Volumen der Hauptkultur (100 ml für LB Medien; 200 ml für M9 Medien)OD550 VK , OD550 der Vorkultur

den sterilen 2 L Schikanenkolben mit der Gruppenbezeichnung gut leserlich beschrift en

Die Beschrift ung sollte auch beim Han-tieren mit dem Kolben nicht abgehen!

das berechnete Volumen der Vor-kultur in das Medium im 2 L Schika-nenkolben unter steriler Arbeitsweise zupipettieren. Sollte es notwendig sein, ein Volumen > 1 ml zu pipettieren, das Ge-samtvolumen in möglichst gleiche Teilvo-lumina einteilen und pipettieren; die Spitze braucht zwischendurch nicht gewechselt zu werden. Um Kontamination der Kulturen mit Fremdorganismen aus der Luft (oder Haut-, Haarschuppen etc.) zu verhindern, sollte der Rand des Gefäßes bei jedem Mal, wenn der Aludeckel entfernt wird, abge-fl ammt werden; genauso ist der Rand wie-derum abzufl ammen, BEVOR der Deckel wieder aufgesetzt wird. Während des Han-tierens mit off enen Kulturgefäßen nicht sprechen, niesen oder husten. Vorkultur auf extrazelluläre Amylaseaktivität te-sten (siehe Abschnitt 3.3); restliche Vorkul-tur bei 4 °C lagern und zur Entsorgung am Ende des Praktikums totautoklavieren. die inokulierte Hauptkultur leicht um-schwenken, um zu mischen 1 ml Hauptkultur unter steriler Arbeits-weise in eine Plastikküvette pipettieren Aludeckel unter steriler Arbeitsweise auf

Gruppe LBM: 100 ml LBM Medium ...Gruppe LBE: 100 ml LBE Medium ...Gruppe LBN: 100 ml LBN Medium ...Gruppe M9M: 200 ml M9M Medium ...Gruppe M9E: 200 ml M9E Medium ...Gruppe M9N: 200 ml M9N Medium ......unter steriler Arbeitsweise in den be-schrift eten, sterilen 2 L Schikanenkol-ben einfüllen. Es ist wichtig hier einen Schikanenkolben zu verwenden, damit die Zellen während des Wachstums gut belüft et werden. 1 ml des jeweiligen Me-diums in eine frische Küvette überführen (BLANK) Küvette gut beschrift en!• die Vorkultur im Kulturröhrchen gut aufschütteln („vortexen“)

den Schikanenkolben aufsetzen Abfl am-men des Gefäßrandes nicht vergessen! OD550 der frisch beimpft en Hauptkul-tur wie unter 1.2 beschrieben messen Start OD550 der Hauptkultur notie-ren die Hauptkultur inkubieren: 24 h, 40 °C, 250-300 rpm nach 1 h, 3 h, 5 h, 7 h, 20 h, 22 h und 24 h je 1 ml Zellsuspension unter steriler Arbeitsweise aus dem Schikanenkolben entnehmen und direkt in eine Küvette pipettieren OD550 messen und in einer Tabelle (Zeit (h) / OD550) notieren Zellsuspension aus der Küvette in ein 1.5 ml Eppi gießen oder pipettieren. Es spielt keine Rolle, wenn nicht die ge-samte Zellsuspension aus der Küvette in das Eppi überführt wird. in der Eppifuge abzentrifugieren: max. Geschwindigkeit, 2 min, RT den abzentrifugierten Zellüberstand in ein frisches Eppi abpipettieren und bei 4 °C bis zur Messung der Amylase-aktivität lagern; -> Nur so viel vom Überstand MIT DER PIPETTE ABHEBEN, dass das (teilwei-se kaum sichtbare) Zellpellet nicht auf-gewirbelt wird; NICHT schütte(l)n! -> Es sollte für jeden Zeitpunkt (nach 1 h, 3 h, 5 h, 7 h, 20 h, 22 h und 24 h) einen abzentrifugierten Zellüberstand geben; Eppis gut beschrift en! -> Das nach der Zentrifugation übrige Zellpellet kann verworfen werden. alle gesammelten Zellüberstände (nach 1 h, 3 h, 5 h, 7 h, 20 h, 22 h und 24 h) auf Amylaseaktivität testen (siehe Abschnitt 3.1)

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2 Aufreinigung der α-Amylase (amyE)

2.1 Zellernte Mittwoch, Mittag Zentrifuge mit 250 ml Zentrifugen-bechern ein 250 ml Zentrifugenbecher pro Hauptkultur 250 oder 500 ml Messzylinder großer Trichter passender Faltenfi lter nach 24 h Inkubation die Zellkultur in einen Zentrifugenbecher abgießenSterile Arbeitstechnik ist hier nicht notwendig. gleich hoch befüllte Zentrifugen-becher an gegenüberliegenden Plät-zen in den Rotor einsetzen. Der Ro-tor muss gut ausbalanciert sein, sonst wird er unwuchtig und das schadet der Zentrifuge! die Zellen abzentrifugieren: 3500 rpm, 10 min, RT in der Zwischenzeit einen Trichter mit passendem Faltenfi lter vorberei-ten und auf einen Messzylinder set-zen. Den Faltenfi lter so wählen, dass er weder zu klein ist, noch zu sehr über den Rand des Trichters ragt. nach der Zentrifugation die Zentri-fugenbecher VORSICHTIG aus dem Rotor entnehmen. Die pellettierten Zellen möglichst nicht aufwirbeln! den ZELLÜBERSTAND vorsichtig, ohne das Pellet aufzuwirbeln über den Faltenfi lter in den Messzylinder abgie-ßen („abdekantieren“) Sterile Arbeits-technik ist hier nicht notwendig. das Volumen des fi ltrierten ZELL-ÜBERSTANDS ablesen und notieren das Zellpellet und den Faltenfi lter verwerfen

2.2 Zweistufi ge Ammoniumsulfat-Fäl-lung Montag, ganzer Tag fi ltrierte ZELLÜBERSTÄNDE von LBM, LBE, LBN, M9M, M9E und M9N Kulturen Eisbox und crushed Eis zwei 500 ml Erlenmeyerkolben ohne Schikanen (oder alternativ 500 ml Be-chergläser) feinpulvriges Ammoniumsulfat(NH4)2SO4; gegebenenfalls in einem Mörser fein verreiben Saugfl asche mit Nutsche und passen-dem Gummiaufsatz Wasserspritzfl asche zwei Rundfi lter Messzylinder zwei 50 ml Falconröhrchen Pinzette mit stumpfen Enden Tris Puff er (mind. 2x 10 ml) 250 ml Glasfl asche mit Deckel Edding-Stift e zum Beschrift en 5 ml Pipette und Pipettierhilfe eine Eisbox mit crushed Eis füllen. Wenn die Eisboxen groß genug sind, können sie von mehreren Gruppen gleichzeitig benutzt werden. den fi ltrierten ZELLÜBERSTAND in einen 500 ml Erlenmeyerkolben überführen, auf Eis stellen. Den Messzy-linder mit Wasser spülen. pro 100 ml Volumen 29 g festes, feinpulvriges Ammoniumsulfat ab-wiegen und zum ZELLÜBERSTAND zugeben. Entsprechend weniger oder mehr Ammoniumsulfat abwiegen, wenn das Volumen des Zellüberstandes kleiner oder größer als 100 ml ist. Be-rechnung und tatsächlich eingewogene Menge notieren. In dieser 1. Fällungs-stufe wird 50% Sättigung mit Ammoni-umsulfat erreicht. umschwenken, bis das Ammonium-sulfat aufgelöst ist. Das kann 5-10 min dauern. inkubieren: Eis, 30 min, gelegentlich umschütteln. Etwaige Beobachtungen protokollieren.

in der Zwischenzeit eine Nutsche mit Gummiaufsatz auf eine Saugfl asche ste-cken und an die Vakuumpumpe anschlie-ßen einen Rundfi lter in die Nutsche einle-gen und mit Wasser aus der Spritzfl asche anfeuchten, so dass er gut auf der Nutsche klebt. Wenn hier zu viel Wasser zum An-feuchten verwendet wurde, dieses vor dem Filtrieren weg gießen. wenn die erste Fällung beendet ist, Va-kuum an die Saugfl asche legen. Es ist wichtig, dass schon Vakuum gezogen wird, wenn Flüssigkeit auf den Filter gegossen wird. den Fällungsansatz noch einmal um-schwenken und VORSICHTIG möglichst auf die Mitte des Rundfi lters gießen. Die Flüssigkeit darf nicht in der Nutsche stehen bleiben, sondern soll sofort abge-zogen werden, damit sich das Präzipitat nach dem Abnutschen nur auf dem Filter und NICHT in der Nutsche befi ndet. D.h. LANGSAM & VORSICHTIG NACHGIE-SSEN! wenn der gesamte Fällungsansatz fi l-triert ist, das Vakuum abschalten. Das Fil-trat sollte klar sein. das Filtrat in einen Messzylinder überführen und das Volumen des FÄL-LUNGSÜBERSTANDES Ü1 ablesen und notieren. FÄLLUNGSÜBERSTAND Ü1 in einen frischen 500 ml Erlenmeyerkolben gießen und auf Eis stellen. Alternativ kann auch ein 500 ml Becherglas verwendet werden. 19 g festes Ammoniumsulfat pro 100 ml FÄLLUNGSÜBERSTAND Ü1 abwie-gen und zugeben. Entsprechend weniger oder mehr Ammoniumsulfat abwiegen, wenn das Volumen von Ü1 kleiner oder größer als 100 ml ist. Berechnung und tat-sächlich eingewogene Menge notieren. In dieser 2. Fällungsstufe wird 80% Ammoni-umsulfat-Sättigung erreicht. umschwenken, damit sich das Am-moniumsulfat aufl öst. Das kann 5-10 min dauern.

inkubieren: Eis, 30 min, gelegentlich umschütteln. Etwaige Beobachtungen protokollieren. während der Inkubation den Rund-fi lter mit dem (möglicherweise nicht gut sichtbaren) Präzipitat mit einer Pinzette vorsichtig aus der Nutsche nehmen und in ein 50 ml Falconröhrchen überführen 10 ml Tris Puff er zugeben und das Fal-conröhrchen mit dem Deckel dicht ver-schließen das Falconröhrchen so schwenken, dass das Präzipitat auf dem Filter im Tris Puff er gelöst wird (dauert ein wenig). Unvollstän-diges Aufl ösen des Präzipitates führt zu Ausbeuteverlusten! wenn das Präzipitat vollständig gelöst ist, den Filter mit der Pinzette zusammen-falten und an der Röhrchenwand ausdrü-cken Filter verwerfen die Lösung (PRÄZIPITAT P1) bei 4 °C lagern. Die Lösung kann noch etwas trüb sein. die Nutsche und die Saugfl asche mit entionisiertem H2O gut ausspülen wieder zusammensetzen, an die Vaku-umpumpe anschließen und einen neuen Rundfi lter in die Nutsche einlegen den Rundfi lter mit Wasser aus der Spritzfl asche anfeuchten, so dass er gut auf der Nutsche klebt. Zu viel Wasser vor dem Filtrieren wieder weg gießen. nach Beendigung der zweiten Ammo-niumsulfat-Fällung Vakuum an die Saug-fl asche legen. Es ist wichtig, dass schon Va-kuum gezogen wird, wenn Flüssigkeit auf den Filter gegossen wird. den Fällungsansatz gut umschütteln und wiederum VORSICHTIG möglichst auf die Mitte des Rundfi lters gießen. Die Flüssigkeit darf nicht in der Nutsche ste-hen bleiben, sondern soll sofort abge-zogen werden, damit sich das Präzipitat nach dem Abnutschen nur auf dem Filter und NICHT in der Nutsche befi ndet. D.h. LANGSAM & VORSICHTIG NACHGIE-SSEN!

wenn der gesamte Fällungsansatz fi l-triert ist, das Vakuum abschalten. Das Filtrat sollte klar sein. das klare Filtrat (FÄLLUNGSÜBER-STAND Ü2) in eine 250 ml Glasfl asche mit Deckel überführen und bei 4 °C la-gern. Gefäß gut beschrift en. den Rundfi lter mit dem (mögli-cherweise noch weniger gut sichtbaren) Präzipitat mit einer Pinzette vorsichtig aus der Nutsche nehmen und in ein 50 ml Falconröhrchen überführen 10 ml Tris Puff er zugeben und das Falconröhrchen mit dem Deckel dichtverschließen das Falconröhrchen so schwenken, dass das Präzipitat auf dem Filter im Tris Puff er gelöst wird (dauert ein we-nig)Unvollständiges Aufl ösen des Präzipitat es führt zu Ausbeuteverlusten! wenn das Präzipitat vollständig gelöst ist, den Filter mit der Pinzette zusammenfalten und an der Röhrchen-wand ausdrücken Filter verwerfen die Lösung (PRÄZIPITAT P2) bei 4 °C lagern. Die Lösung kann noch etwas trüb sein. Fällungsüberstand Ü2, Präzipitat P1 und Präzipitat P2 wie in Abschnitt 3.1 beschrieben auf Amylaseaktivität te-sten und auf das Proteingel (Abschnitt 4) auft ragen

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3.1 Photometrische Messung der Amylaseaktivität 2 ml Eppendorf Plastikgefäße („Eppis“) Edding-Stift e zum Beschrift en der Proben Eppifuge Amylase-Test Reagenzien (siehe Me-dien und Lösungen) Th ermoblock oder Brutschrank bei 37 °C (und/oder andere Tempera-turen) Spektralphotometer bei 635 nm Plastikküvetten 1 ml Pipette und blaue Spitzen 250 μl der Amylase-Probe in einem 2 ml Eppi vorlegen (PROBE) 7x 250 μl Zellüberstände (1/3/5/7/20/22/24 h) der Hauptkultur (Abschnitt 1.3)

LB Gruppen: 50 μl FällungsüberstandÜ2 (Abschnitt 2.2) + 200 μl Tris Puff er LB Gruppen: 50 μl Präzipitat P1 (Abschnitt 2.2) + 200 μl Tris Puff er LB Gruppen: 50 μl Präzipitat P2 (Abschnitt 2.2) + 200 μl Tris Puff er M9 Gruppen: 100 μl Fällungsüberstand Ü2 (Abschnitt 2.2) + 150 μl Tris Puff er M9 Gruppen: 100 μl Präzipitat P1 (Abschnitt 2.2) + 150 μl Tris Puff er M9 Gruppen: 100 μl Präzipitat P2 (Abschnitt 2.2) + 150 μl Tris Puff er

50 μl Dialysat (Abschnitt 2.3) + 200 μl Dialysepuff er Alle Proben ordentlich beschrift en!! 250 μl BLINDPROBE in ein 2 ml Eppi pipettieren passende Blindproben: LB oder M9 Medium für die gesammelten Zellüber-stände (2/4/6/8/20/22/24 h) der Haupt-kultur (Abschnitt 1.3); Tris Puff er für den Fällungsüberstand Ü2, Präzipitat P1 & Präzipitat P2 aus der Ammoniumsul-fat-Fällung (Abschnitt 2.2); Dialysepuf-fer für das Dialysat (Abschnitt 2.3) zu PROBE und BLINDPROBE je 1 ml Stärkelösung zupipettieren, vortexen inkubieren: 37 °C, 30 min, gegebe-

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2.3 Dialyse Montag, Abend (über Nacht) Amylase-aktive Fraktion aus der Am-moniumsulfat-Fällung 5 L Becherglas (Glas oder Plastik) Dialysepuff er, 5 L Dialyseschlauch, MWCO 12000-14000 und Klammern zwei 500 ml Bechergläser Eppendorf Plastikgefäße („Eppis“), 1.5 ml Edding-Stift e zum Beschrift en Rührfi sch Magnetrührer zwei 50 ml Falconröhrchen 5 L Dialysepuff er in einem 5 L Be-cherglas vorbereiten einen Rührfi sch hinzufügen Volumen der Fraktion mit der höch-sten Amylaseaktivität aus der Ammo-niumsulfat-Fällung (Abschnitt 2.2) abschätzen. Erfahrungsgemäß sind die Fraktionen P1 oder P2 am aktivsten. Dialyseschlauch auf passende Länge abschneiden Schlauch kurz in entionisiertes Was-ser in einem 500 ml Becherglas einle-gen. Dadurch wird der Schlauch nass und sehr „glibberig“. den Schlauch an einem Ende ver-knoten. Das Fassungsvermögen des Dialyseschlauchs ist auf der Verpackung angegeben. Die benötigte Länge wird für das gewünschte Volumen berechnet und dann verdoppelt.Wenn der Dialy-

seschlauch gedehnt wird kann er reißen, daher beim Verknoten den Knoten fassen und immer zum späteren Reservoir HIN festziehen, d.h., die überstehenden Enden werden gedehnt. die Amylase-aktivste Fraktion in den verknoteten Dialyseschlauch einfüllen. Dazu eignet sich am besten ein kleiner Trichter, es kann aber auch pipettiert wer-den. NICHT direkt aus einem größeren Gefäß, z.B. Falconröhrchen, gießen! Dialyseschlauch am anderen Ende mit einer Klammer so verschließen, dass noch ein wenig Schlauch übersteht. Der Schlauch sollte noch ein wenig Luft ent-halten, damit er schwimmt. Schlauch „markieren“, indem man an das freie Ende hinter der Klammer ein gut beschrift etes Eppi klemmt; dies sollte so fest sitzen, dass es während der Dialyse nicht abgeht.Diese Markierung nicht vergessen, sonst sind die einzelnen Schläuche nach der Di-alyse nicht mehr unterscheidbar! den markierten Schlauch in das Becher-glas einhängen; er sollte frei schwimmenEs können 3 Schläuche pro Becherglas ein-gehängt werden. Becherglas auf einen Magnetrührer im 4 °C Raum stellen Magnetrührer gerade so weit aufdre-hen, dass sich der Rührfi sch ruhig und gleichmäßig mit mittlerer bis langsamer Geschwindigkeit dreht; die Schläuche sol-len sich ruhig im Kreis drehen

dialysieren: über Nacht, 4 °CRaumtemperatur ist auch akzeptabel. nach Beendigung der Dialyse den Schlauch aus dem Becherglas nehmen (die Klammer ist OBEN) Latexhand-schuhe tragen. ein frisches 500 ml Becherglas un-terstellen und die Klammer abneh-men. Den Schlauch gut festhalten, er ist glitschig! Das Becherglas dient als „Auff angbecken“, falls beim Abnehmen der Klammer etwas schiefgeht. den Inhalt des Schlauches vorsichtig in ein beschrift etes 50 ml Falconröhr-chen ausgießen und den Schlauch aus-streifen (DIALYSAT)Der Inhalt kann auch aus dem Schlauch pipettiert werden. zentrifugieren: 4000 rpm, 10 min, RT den (klaren) Überstand in ein frisches 50 ml Falconröhrchen überführen Das leere Falconröhrchen verwerfen. das DIALYSAT bei 4 °C lagern

3 Amylase-Tests Montag - Donnerstag

nenfalls kann auch bei anderen Tempera-turen inkubiert werden. je 500 μl Iodreagenz zugeben und vor-texen

BLINDPROBE und PROBE in ent-sprechend beschrift ete Plastikküvetten überführen Photometer einschalten und „Ab-sorption“ und 635 nm Messwellen-länge einstellen Küvette mit BLINDPROBE in den Referenzhalter einstellen Nullabgleich machen Küvette mit PROBE in den Proben-halter einstellen und Absorption bei 635 nm messen (A635) Im Unterschied zur optischen Dichte wird hier nicht die Lichtstreuung durch Partikel son-dern die Absorption von Licht durch den Stärke-Iod Komplex gemessen. Daher spricht man hier nicht von der OD635 sondern von A635. wenn die Amylase aktiv war, sollte sich ein negativer A635 Wert ergeben; Werte protokollieren. Durch die Ak-tivität der Amylase wird die Stärke sukzessive in ihre Untereinheiten ab-gebaut. Kürzerkettige Stärkemoleküle (Dextrine) können zwar auch einen Komplex mit Iod eingehen, dieser ist aber, abhängig von der Kettenlänge, rot (8-12 Glucoseeinheiten), gelb (6-8 Glucoseeinheiten) oder farblos (<7 Glucoseeinheiten).

Iod an sich löst sich in Wasser eher schlecht, daher wird eine Lösung aus I2 mit KI hergestellt; in der KI-Lösung löst sich I2 durch Bildung von Triiodid-Ionen (I3−). Die in der Stärke vorhan-dene Amylose besitzt eine helixförmige Konformation mit einem kanalartigen Hohlraum in der Mitte. In diesen kön-nen sich Polyiodidketten (I 3−, I5−, I7−, I9−) einlagern. Der Komplex absor-biert Licht aus dem langwelligeren-Bereich und erscheint blau-schwarz. Durch die Salzsäure (HCl) im Iodre-agenz wird die Aktivität der Amylase gestoppt. Ist der Farbumschlag bei Zugabe des Iodreagenz nicht blau sondern rot, gelb oder farblos (Erklärung siehe weiter unten), so kann man sich die spektro-photometrische Messung ersparen, da die Amylaseaktivität zu hoch ist, um innerhalb des linearen Messbereichs zu liegen. In solchen Fällen reicht die Angabe der beobachteten Farbe.

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3.2 Visualisierung der Amylaseakti-vität auf Stärkeagarose Stärkeagarose Korkbohrer Edding-Stift e zum Beschrift en Gram’s Iodreagenz Brutschrank bei 37 °C 200 μl Pipette und gelbe Spitzen mit dem Korkbohrer Löcher in die Stärkeagarose stanzen

Höchstens 4 Löcher pro Platte, bes-ser nur 3, sonst laufen die Höfe in-einander.Sterile Arbeitstechnik ist nicht un-bedingt nötig.

100 μl Amylase-Probe in je ein Loch pipettieren. Geeignete Amylase Proben sind:Kommerzielle Amylase-Präparation (Verdünnungsreihe: unverdünnt, 1:10,1:100, 1:1000) Speichel (Verdün-nungsreihe in destilliertem H2O: un-verdünnt, 1:10, 1:100, 1:1000) Dialysat (Abschnitt 2.3; eventuell auch Verdün-nungsreihe unverdünnt, 1:10, 1:100) Zellüberstände (1/3/5/7/20/22/24 h) unverdünnt aus Abschnitt 1.3Fällungsüberstand Ü2 sowie Präzipi-tate P1 & P2 unverdünnt aus der Am-moniumsulfat-Fällung (Abschnitt 2.2) Inkubation: 5 h, 37 °C. Alternativ kann auch über Nacht inkubiert werden. Stärkeagarose mit 5 ml Gram’s Io-dreagenz überfl uten. Sterile Arbeits-

3.3 Extrazelluläre Amylaseaktivität Dienstag oder Mittwoch, tagsüber Vorkultur LB Stärkeplatten Gram’s Iodreagenz Brutschrank bei 37 °C Edding-Stift zum Beschrift en 5 ml Pipette und Pipettierhilfe 2 μl der Vorkultur in steriler Ar-beitsweise auf eine LB Stärkeplatte pipettieren. Platte vorher entspre-chend beschrift en und Auft ropfort mit einem Punkt markieren. Inkubation: über Nacht, 37 °C LB Stärkeplatte mit 5 ml Gram’s Io-dreagenz überfl uten. Sterile Arbeits-weise ist nicht nötig. Inkubation: 1 min, RT Iodreagenz abgießen. Iodlösungen sammeln und entsorgen. wenn die Zellen aktive Amylase ins Medium segregiert haben, sollte sich rund um die Kolonie ein farbloser Halo bilden

Gelapparatur 12% SDS Gel Laufpuff er SDS Probenpuff er Eppendorf Reaktionsgefäße („Eppis), 1.5 mlTh ermoblock bei 95 °C Protein Molekulargewichtsstandard Coomassie Färbelösung Fixierlösung Entfärber 200 μl Pipette und gelbe Spitzen Gelapparaturen nach Anweisung der Betreuer vorbereiten fünf Eppis“ mit der Gruppenbe-zeichnung und folgenden Zahlen be-schrift en:

20 μl der jeweiligen Probe in das ent-sprechend beschrift ete Eppi pipettieren. Darauf achten, dass die richtige Probe in jedes beschrift ete Eppi gefüllt wird!!!

4 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese Donnerstag, >3 h

zu jeder Probe 5 μl 5x SDS Probenpuf-fer hinzu pipettieren, vortexen die Proben nach unten schütteln oder in der Eppifuge kurz abzentrifugieren, um die Flüssigkeit in der Spitze des Eppis zu sammeln Inkubation: 5 min, 95 °C vortexen und kurz in der Eppifuge ab-zentrifugieren die Proben vollständig in der folgenden Reihenfolge von links nach rechts auf das Gel auft ragen; Auft ragsreihenfolge proto-kollieren:

Elektrophorese: 130 V, ca. 2 h nach Beendigung der Elektrophorese das Gel aus der Apparatur nach Anwei-sung der Betreuer entnehmen. Die blaue Lauff ront sollte am unteren Ende des Gels

noch sichtbar sein. eine Ecke des Gels zur Orientierung markieren in ein geeignetes Plastikschälchen einlegen mit Fixierlösung bedecken und 15 min bei RT mit gelegentlichem Um-schwenken inkubieren. Das Gel kann bis zu 30 min fi xiert werden. Fixierlösung abgießen. Darf in den Ausguss entsorgt werden. das Gel mit Coomassie Färbelösung bedecken und so lange (ca. 30 min) bei RT unter gelegentlichem Umschwenken inkubieren, bis blaue Banden auf hellem Hintergrund sichtbar werden wenn die Bandenfärbung zufrieden-stellend ist, die Coomassie Färbelösung abgießen und das Gel in destilliertes H2O einlegen und scannen oder foto-grafi eren. Die Coomassie Färbelösung ist wieder verwendbar.

1 = Zellüberstand (24 h) der Haupt-kultur (Abschnitt 1.3)2 = Präzipitat P1 (Abschnitt 2.2)3 = Fällungsüberstand Ü2 (Abschnitt 2.2)4 = Präzipitat P2 (Abschnitt 2.2)5 = Dialysat (Abschnitt 2.3)

1. Probentasche: Molekulargewichts-standard (5 μl)2. Probentasche: 13. Probentasche: 24. Probentasche: 35. Probentasche: 46. Probentasche: 57. Probentasche: Molekulargewichts-standard (5 μl)

weise ist nicht nötig. Inkubation: 1 min, RT Iodreagenz abgießen. Iodlösungen sammeln und entsorgen. je nach Aktivität der Amylase bil-den sich um die Löcher mehr oder we-niger große farblose Halos die Durchmesser der Halos sind ein Maß für die Amylaseaktivität. Ver-gleiche zwischen einer kommerziellen Amylase und eigenen Präparationen bzw. Speichel sind möglich.

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5x M9 KonzentratNa2HPO4·2 H2O 42.5 g/lKH2PO4 15 g/lNH4Cl 5 g/lNaCl 2.5 g/lpH Wert mit NaOH auf 7.0 einstel-len; autoklavieren und bei Raum-temperatur lagern.

100x SpurenelementelösungMnCl2·4 H2O 100 mg/lZnCl2 170 mg/lCuCl2·2 H2O 43 mg/lCoCl2·6 H2O 60 mg/lNa2MoO4·2 H2O 60 mg/lSterilfi ltrieren und lichtgeschützt bei Raumtemperatur lagern.

100 mM CaCl2CaCl2·2 H2O 1.47 g / 100 mlAutoklavieren und bei Raumtempe-ratur lagern.

1M MgSO4MgSO4·7H2O 24.6 g / 100 mlAutoklavieren und bei Raumtempe-ratur lagern.

50 mM FeCl3FeCl3·6H2O 1.35 g / 100 mlAutoklavieren und bei Raumtempe-ratur lagern.

M9M Medium

M9 Medium 200 mlL-Methionin 50 mg/lMethionin in M9 Medium auf-lösen und sterilfi ltrieren; 2 ml in ein steriles 2 ml Eppi aliquotieren („Blank“) & bei 4 °C lagern; bald verbrauchen; kann über Nacht bei 4 °C gelagert werden.

M9E Medium

M9 Medium 200 mlL-Ethionin 50 mg/lEthionin in M9 Medium aufl ö-sen und sterilfi ltrieren; 2 ml in ein steriles 2 ml Eppi aliquotieren („Blank“) & bei 4 °C lagern; bald verbrauchen; kann über Nacht bei 4°C gelagert werden.

M9N Medium

M9 Medium 200 mlL-Norleucin 50 mg/lNorleucin in M9 Medium aufl ö-sen und sterilfi ltrieren; 2 ml in ein steriles 2 ml Eppi aliquotieren („Blank“) & bei 4 °C lagern; bald verbrauchen; kann über Nacht bei 4 °C gelagert werden.

M9 Medium

5x M9 Konzentrat 200 ml/l100x Spurenelementelösung 10 ml/l100 mM CaCl2 1 ml/l1 M MgSO4 1 ml/l50 mM FeCl3·6H2O 1 ml/lL-Phenylalanin 50 mg/lL-Tyrosin 50 mg/lL-Tryptophan 50 mg/lGlucose 5 g/lMit destilliertem H2O auf 1 l auf-füllen, Glucose und Aminosäuren aufl ösen, sterilfi ltrieren und bald ver-brauchen; kann über Nacht bei 4 °Cgelagert werden.

Zellzucht

LB Medium

0.5% (w/v) Yeast Extract 5 g/l 1% (w/v) Bacto tryptone 10 g/l 1% (w/v) NaCl 10 g/l

LB+ Medium

0.1% (w/v) Glucose 1 g/l L-Phenylalanin 50 mg/l L-Tyrosin 50 mg/l L-Tryptophan 50 mg/l 0.5% (w/v) Yeast Extract 5 g/l 1% (w/v) Bacto Tryptone 10 g/l 1% (w/v) NaCl 10 g/l

LBM Medium

LB+ Medium 100 ml L-Methionin 50 mg/l Methionin in LB+ Medium auf-lösen und sterilfi ltrieren; 2 ml in ein steriles 2 ml Eppi aliquotieren („Blank“) & bei 4 °C lagern; bald verbrauchen; kann über Nacht bei 4 °C gelagert werden.

LBE Medium

LB+ Medium 100 ml L-Ethionin 10 g/l Ethionin in LB+ Medium aufl ö-sen und sterilfi ltrieren; 2 ml in ein steriles 2 ml Eppi aliquotieren („Blank“) & bei 4 °C lagern; bald verbrauchen;kann über Nacht bei 4 °C gelagert werden.

LBN Medium

LB+ Medium 100 ml L-Norleucin 10 g/l Norleucin in LB+ Medium auf-lösen und sterilfi ltrieren; 2 ml in ein steriles 2 ml Eppi aliquotieren („Blank“) & bei 4 °C lagern; bald verbrauchen; kann über Nacht bei 4 °C gelagert werden.

Medien und Lösungen

Amylasetest

1 M Tris/Cl pH 6.8

Tris Base 60.6 g / 500 mlmit HCl auf pH 6.8 einstellen; autoklavieren und bei Raumtempe-raturlagern.

100 mM CaCI2

CaCI2·2 H2O 7.4 g / 500 mlauf 500 ml mit destilliertem H2O auff üllen; autoklavieren und bei Raumtemperatur lagern.

Stärkelösung

0.05% (w/v) lösliche Stärke 0.05 g / 100 ml25 mM CaCI2 100 mM CaCI2 25 ml / 100 ml50 mM Tris/Cl pH 6.8 1 M Tris/Cl pH 6.8 5 ml / 100 mlFrisch herstellen.

1 N HCl

Roth Cat. No. K025.1, 1 l, 10 €Beachte: 1 N HCl 1 M HCl

Iodreagenz

0.01% (w/v) Iod (I2) 0.01 g / 100 ml0.1% (w/v) Kaliumiodid (KI) 0.1 g / 100 mlin 1 N HCI

I2 und KI in ca. 25 ml 1 N HCl lösen; sobald alles vollständig gelöst ist, mit 1 N HCl auf 100 ml auff üllen; gut verschlossen bei Raumtempera-tur lagern.

LB Stärkeagarplatten

1% (w/v) lösliche Stärke 10 g/l0.5% (w/v) Yeast Extract 5 g/l1% (w/v) Bacto Tryptone 10 g/l1% (w/v) NaCl 10 g/l1.5% (w/v) Agar 15 g/lGram’s Iodreagenz 0.5% (w/v)Iod (I2) 0.5 g / 100 ml1% (w/v) Kaliumiodid (KI) 1.0 g / 100 mlBei Raumtemperatur lagern.

Stärkeagarose

1% (w/v) lösliche Stärke 10 g/l2 mM CaCI2·2 H2O 0.3 g/l1% (w/v) Agarose 10 g/lin 20 mM Tris/Cl pH 6.8 zubereitet.

Ammoniumsulfat-Fällung

1 M Tris/Cl pH 6.8

Tris Base 60.6 g / 500 mlmit HCl auf pH 6.8 einstellen; auto-klavieren und bei Raumtemperatur lagern.

Tris Puff er

20 mM Tris/Cl pH 6.8 1 M Tris/Cl pH 6.8 5 ml / 250 ml2 mM CaCI2·2 H2O 100 mM CaCI2·2 H2O 5 ml / 250 mlauf 250 ml mit destilliertem H2O auf-füllen; bei Raumtemperatur lagern.

Dialyse

Dialysepuff er

1 M Tris/Cl pH 6.8 100 ml / 5 l100 mM CaCI2·2 H2O 100 ml / 5 lauf 5 l mit entionisiertem H2O auffüllen; bei 4 °C lagern; 5 ml in ein

steriles Falconröhrchen aliquotieren(„Blank“); bei 4 °C lagern.

SDS-Polyacrylamid Gelelektropho-rese (SDS-PAGE)

Laufpuff er

0.1% (w/v) SDS 1 g/l192 mM Glycin 14.4 g/l25 mM Tris Base 3 g/lBei Raumtemperatur lagern.

5x SDS Probenpuff er

10% (w/v) SDS 20 g / 50 ml0.08 M Tris/Cl pH 6.8 1 M Tris/Cl pH 6.8 4 ml / 50 ml12.5% (v/v) Glycerin 6.25 ml / 50 ml0.2% (w/v) Bromphenolblau 0.1 g / 50 ml4% (v/v) β-Mercaptoethanol 2 ml / 50 mlBei 4 °C lagern.

Fixierlösung

25% (v/v) Isopropanol 125 ml / 500 ml10% (v/v) CH3COOH 50 ml / 500 mlBei Raumtemperatur lagern.

Coomassie Färbelösung

0.006% (w/v) Coomassie Blue G250 30 mg / 500 ml10% (v/v) CH3COOH 50 ml / 500 mlBei Raumtemperatur lagern.

MOLEKULARGEWICHTE EI-NIGER CHEMIKALIEN

CaCl2·2H2O 147.01 g/molI2 253.81 g/molKI 166.00 g/molTris Base 121.14 g/molMgSO4·7H2O 246.47 g/molFeCl3·6H2O 270.30 g/mol

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Überprüfung der Funktionalität der synthetischen Amylase durch Photometermessungen Überprüfung der Funktionalität der synthetischen Amylase mittels Stärkeagaroseplattentests Vergleich der Amylasen in Spei-chelproben von Tier und Mensch Auft rennung der Amylase mittels Proteingel (SDS-Gel) Massenspektrometrische Analyse der Amylase aus den Medien LBM, M9M, LBN, M9N, LBE und M9E

Amylase 2.0 ‒ Pimp my Enzyme! HLFS Ursprung 2009 -2011

Abbildung 3 (Tabelle 3): Diese Darstellung vergleicht die Amylaseaktivität in den ver-schiedenen Nährmedien (vgl. Laborproto-koll) für den Bacillus s. bei 37° und 70°C. Es ist deutlich erkennbar, dass die Aktivität bei 70°C um einiges höher ist, aber auch, dass in allen Nährmedien eine funktions-tüchtige Amylase produziert wurde.Man beachte: die Proben mit den syn-thetischen Aminosäuren Ethionin (LBE, M9E) und Norleucin (LBN) zeigen höhere Aktivität als die Referenzproben mit dem natürlichen Methion (LBM, M9M).Dies könnte nun durch eine funktions-tüchtigere synthetische Amylase oder auch

durch eine höhere Konzentration der syn-thetischen Amylase in den Proben erklärt werden. Hierüber gibt diese Messmethode keinen genaueren Aufschluss. Da aber bei allen Proben die selben Ausgangskonzen-trationen von Bakterien und Medien an-gesetzt bzw. alle Kulturen parallel gleich behandelt wurden sowie die selben Pro-benmengen entnommen wurden, ist eine höhere Funktionalität der synthetischen Amylase anzunehmen. Diese Messungen deuten also darauf hin, dass die Amylase 2.0 aktiver ist als die natürliche: Amylase 2.0 dürft e besser ar-beiten.

Abbildung 2 (Tabelle 2): Man sieht, wie sich die Amylaseaktiviät bei laufender Entwicklung der Hauptkultur, der lau-fenden Vermehrung des Bacillius s., er-höht. Der Nullpunkt war die Jodlösung in der Nullprobe, die Trübung nimmt also mit der Aktivität der Amylase ab, weil mit ihr Stärke abgebaut wird und sich Jod nicht mehr an das Abbaupro-dukt Glucose anlagern kann. Der mathe-matische Betrag der Messwerte zeigt die Aktivität.

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ERGEBNISSE

Überprüfung der Funktionalität der synthetischen Amylase durch Photometermessungen

Um die Amylaseaktivität unserer Proben zu bestimmen benötigten wir eine Methode, die schnell und einfach durchzuführen war. Wir kamen auf die Messung mittels Photometer, mit der zügig eine große Menge an Proben analysiert werden konnte. Der Ablauf funktioniert folgendermaßen:Man pipettiert 200 μl des vorbereiteten TRIS-Puff ers in ein Eppi. Hinzu gibt man 50 μl der zu messenden Flüssigkeit. Für die nötige Blindprobe werden nur 250 μl Puff er genom-men. In alle Eppis gibt man 1 ml Stärkelö-sung, welche zuvor hergestellt werden muss. Anschließend gibt man alle Reaktionen für 30 min bei 37 °C in den Heizblock. In die-ser Zeit zerlegt die Amylase - falls vorhanden und aktiv - die enthaltene Stärke zu Glukose.Nach diesem Vorgang werden 500 μl einer Iodlösung dazugegeben und mit dem Vor-texer gut eingemischt. Das Iod lagert sich an die noch enthaltenen Stärkekomplexe an und färbt diese violett. Bei höherer Amy-laseaktivität (und damit höherer Menge an abgebauter Stärke) wird die Probe nun nicht so stark verfärbt. Das heißt: je aktiver die ent-haltene Amylase, desto heller die Lösung. Die Helligkeit, genauer gesagt: die Lichtdurchläs-sigkeit der Probe, kann mit dem Photometer bestimmt werden. Die Lichtdurchlässigkeit erhöht sich, wenn Stärke abgebaut wird. Je nachdem, wo man den Nullpunkt setzt,

sind die Ergebnisse positive oder negative Werte. Interessant ist aber einfach der Betrag vom Zahlenwert.Es ist klar, dass mit dieser Methode keine An-gaben in absoluten Zahlen über die Amylase-aktivität gemacht werden können. Jedoch ist eindeutig feststellbar, ob das Enzym arbeitet oder nicht. Zusätzlich lässt sich ein Trend feststellen, ob die Probe besonders aktiv ist.

Abbildung 1 (Tabelle 1): In dieser Grafi k sieht man die verschiedenen Aktivitäten des Dialysates, d.h. des Ergebnisses der Prote-inaufreinigung, bei verschiedenen Konzen-

trationen und Temperaturen. Je höher die Konzentration der Probe, desto höher ist die Aktivität der Amylase, und je wärmer die Pro-be, desto aktiver ist sie. Es handelt sich um einen eindeutigen Beweis dafür, dass unsere synthetische Amylase arbeitet.

Abb. 1

Tab. 1

Abb. 2

Abb. 3

Tab. 2

Tab. 3

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Um unsere synthetischen Amylasen auch noch auf eine weitere Art zu testen, stellten wir Stärkeagaroseplatten (gelierende Inhaltsstoff e einer Alge vermischt mit Stärkelösung) her. Herstellung der Stärkeagaroseplatten (laut Dr. Eduard Taufratzhofer, Zuckerforschung Tulln): Man benötigt 11,5 g Nähragar, 10 g Kartoff elstärke und 500 ml destilliertes Was-ser. Das Gemisch wird autoklaviert und an-schließend vor dem Abkühlen unter einer Reinraumbank in sterile Petrischalen gefüllt.Die Probelösungen wurden in 3-4 Löcher ge-füllt, die mit Hilfe eines Apfelentkerners aus den Agaroseplatten ausgestochen wurden. Nach 5 Stunden Inkubationszeit bei 37°C wurden die Platten mit Gram‘s Iodreagenz gefärbt. Das Iod band sich an die Stärke-komplexe, wodurch nur stärkehältige Flä-chen eine dunkelviolette Farbe annahmen. Nach einer kurzen Einwirkzeit wurde das Reagenz wieder abgegossen und mit destil-liertem Wasser abgespült. Je nach Aktivität der aufgetragenen Amylaseproben blieben verschieden große, kreisförmige „Höfe“ um die Löcher farblos, da die Amylase hier die Stärke bereits zu Glukose abgebaut hatte. Man konnte anhand der unterschiedlichen Größen der Kreise mit freiem Auge leicht feststellen, ob bzw. wie aktiv die einzelnen Amylaseproben im Vergleich waren. Neben unseren synthetischen Amylasen haben wir auch noch eine kommerzielle Variante, die in der stärkeverarbeitenden Industrie verwen-det wird, getestet und qualitativ verglichen.Einzelne viel zu klein oder viel zu groß ge-ratene Kreise hätten es notwendig gemacht, den Versuch mit einer optimierten Verdün-nung zu wiederholen.Die Ergebnisse sind ein weiterer Beweis, dass die Amylase 2.0 gut funktioniert.

Abbildung 1:Auf diesem Bild sind die farb- bzw. stärke-losen Ringe rund um die Löcher deutlich erkennbar. Das linke obere Loch verwende-ten wir als Blindprobe, so konnten wir sicher gehen, dass wirklich unsere Amylase in den Proben aktiv arbeitete und es keine Konta-mination gab. Diese Platte zeigt ein sehr er-freuliches Ergebnis, da wir in jedes der drei Löcher eine andere Probe (LBE, M9E, LBN) mit unserer synthetischen Amylase einge-füllt haben und jede von ihnen eine deut-liche Aktivität aufweist.

Abbildung 2:Diese Abbildung zeigt den deutlichen Unter-schied einer Probe (LBE) bei zwei verschie-denen Konzentrationen. Die Probe im oberen Loch wurde stärker verdünnt als die im un-teren. Das rechte Loch ohne Ring wurde nicht befüllt und diente wieder als Blindprobe.

Neben unseren unterschiedlichen synthe-tischen Amylasen verglichen wir auch die Amylase des Speichels verschiedener Tier-arten und des Menschen. Wir erzielten dabei überaus interessante Ergebnisse.Uns lagen keinerlei direkte Informationen über die Unterschiede der Amylaseaktivi-tät von Tierart zu Tierart vor. Auf Grund der verschiedenen Ernährungsweisen von Pfl anzen- und Fleischfressern mussten di-ese Unterschiede laut unserer Hypotese je-doch existieren und messbar sein. Wir wa-ren etwa davon überzeugt, dass ein Hund weniger aktive Amylase als ein Pfl anzen-fresser haben müsste, da seine Nahrung weit weniger stärkehaltig ist. Die von uns durchgeführten Messungen zeigten je-doch das Gegenteil. Vor allem Schaf und Kuh, aber auch das Pferd, hatten in ihrem Speichel eine deutlich geringere Amylase-aktivität als Mensch und Hund.Wir machten uns also auf die Suche nach einer Erklärung. Fündig wurden wir in unserem Tierzuchtbuch: Kühe und Scha-fe sind Wiederkäuer und haben in ih-rem Pansen Mikroben, die den Abbau der Stärke in der Nahrung ermöglichen. Pferde, die ebenfalls schwer verdauliches Pfl anzenmaterial fressen, haben anstelle von einem Pansen einen größeren Blind-darm, der ihnen als Gärkammer dient und dadurch auch mit dem Stärkeabbau in Verbindung stehen kann. Damit ist die geringe Amylaseaktivität im Speichel wie-derum einleuchtend.

Die Auswertungen unserer Photomet-ertests lieferten mehrere spannende Ergeb-nisse. So wirkte sich etwa der Zeitpunkt der Probennahmen aus: Wurde der Speichel vor oder nach dem Zähneputzen entnom-men, vor oder nach dem Essen, bei Hun-ger, wenn man gutes Essen roch etc. ?Genaue, absolute Werte, um wie vieles die eine oder andere Amylase tatsächlich ak-tiver ist, konnten wir dennoch nicht auf-stellen, da dafür die Messmethoden bzw. die Probennahmen zu ungenau waren. Au-ßerdem schwankt die Amylasekonzentrati-on im Speichel sehr im Laufe des Tages.

Überprüfung der Funktionalität der synthetischen Amylase mittels Stärkeagaroseplattentests.

Abbildung 3:In diesem Bild ist gut zu erkennen, welche Auswirkung die Temperatur auf die Wir-kung eines Enzyms hat. Die linke Platte wur-de bei 37 °C inkubiert, die rechte nur bei 20 °C. In jedes Loch wurden die Proben (M9E) mit unterschiedlichen Verdünnungsverhält-nissen pipettiert. Auf beiden Platten wurden dieselben Konzentrationen in die jeweiligen Löcher pipettiert. Bei der linken Platte wur-de das rechte obere Loch nicht befüllt, da wir aus vorherigen Versuchen bereits wussten, dass diese Verdünnung bei gegebener Tem-peratur einen zu großen Kreis bildet. Dieser hätte wiederum die Auswertung der anderen Proben auf derselben Platte gestört. Es ist gut zu erkennen, dass die Ringe der linken, wär-mer inkubierten Platte deutlich größer sind. Das heißt, bei 37°C ist die Amylase deutlich aktiver als bei 20°C.

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Vergleich der Amylasen in Speichelproben von Tier und Mensch

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Neben der Katalase segregiert Bacillus subtilis auch Amylase E ins Kulturme-dium. Diese hat eine Masse von ca. 70 kDa und ist in Abbildung 5 mit einem roten gestrichelten Kasten gekennzeich-net. Aufgrund des geringen Anteils im Vergleich zum Gesamtproteingehalt der einzelnen Proben ist ein Vergleich der Amylasemengen untereinander kaum

Abbildung 7. Massenspektrometrische Analyse von Norleucin-Amylase. Die in der massenspektrometrischen Analyse gefun-denen Peptide sind blau unterlegt. Schnitt-stellen der Protease Trypsin sind schwarz unterstrichen. Methionine sind in der Ami-nosäuresequenz rot markiert. Methionin-positionen, an denen ein Einbau von Nor-leucin nachgewiesen werden konnte, sind mit einem roten Stern gekennzeichnet.

Auft rennung der Amylase mittels Proteingel (SDS-Gel)

Abbildung 5. Auft ragung der verschie-denen Proteinproben nach 80 % Am-moniumsulfatfällung und Dialyse. S (Standard): Fermentas Prestained protein marker (#Sm0671), Auft ragsmenge: 5μl; LB: Vollmedium LB; M9: Minimalmedi-um M9; M: Methionin; E: Ethionin; N: Norleucin. Es wurden jeweils 20 μl Kul-turüberstand auf das Gel aufgetragen (+ 5μl 5 x SDS Auft ragspuff er). Die Amy-lasebanden sind durch den roten gestri-chelten Kasten gekennzeichnet.

möglich. Hier muss eine effi zientere Me-thode zur Aufreinigung gefunden wer-den. Dies könnte eventuell durch spezi-fi sche Ethanol Glykogen Fällung gelingen und wird derzeit am Max-Planck-Institut für Biochemie weiter untersucht. Das Gel zeigt aber, dass eine synthetische Amylase mit Ethionin bzw. Norleucin in den Pro-ben vorhanden ist.

Massenspektrometrische Analyse der Amylase aus den MedienLBM, M9M, LBN, M9N, LBE und M9E

Abbildung 6. Massenspektrometrische Analyse von Methionin-Amylase. Die in der massenspektrometrischen Analy-se gefundenen Peptide sind blau unter-legt. Schnittstellen der Protease Trypsin sind schwarz unterstrichen. Methionine sind in der Aminosäuresequenz rot markiert.

Abbildung 8. Massenspektrometrische Analyse von Ethionin-Amylase. Die in der massenspektrometrischen Analyse gefundenen Peptide sind blau unterlegt. Schnittstellen der Protease Trypsin sind schwarz unterstrichen. Methionine sind in der Aminosäuresequenz rot markiert. Methioninpositionen, an denen ein Ein-bau von Ethionin nachgewiesen werden konnte, sind mit einem roten Stern ge-kennzeichnet. Positionen, an denen der Einbau fraglich ist, sind mit roten Frage-zeichen markiert.

Abbildung 6, Abbildung 7 und Abbil-dung 8 zeigen die Zusammenfassung der massenspektrometrischen Ana-lysen der Amylasen aus LBM, M9M, LBN, M9N, LBE und M9E Kulturen. Die roten Sterne kennzeichnen die Po-sitionen im Protein, an denen Norleu-cin- oder Ethionineinbau nachgewiesen werden konnte. Positionen, an denen

der Einbau fraglich ist, sind mit roten Fra-gezeichen markiert.Allgemein lässt sich sagen, dass der Anteil an Norleucin und Ethionin in den einzel-nen Amylasepräparationen im Vergleich zum Methioninanteil noch gering ist (siehe Analysedetails im Anhang). Aber es hat geklappt und das ist Grund genug zum Jubeln!

Der Einbaugrad soll nun im weiteren Verlauf des Projekts am Max-Planck-Institut für Biochemie verbessert wer-den. Hierfür soll als erster Schritt die Amylase in ein plasmidbasiertes Expres-sionssystem überführt werden, was für Bacillus subtilis im Zusammenhang mit nichtnatürlichen Aminosäuren bisher noch nicht untersucht wurde.

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Enzyme spielen heutzutage in verschie-densten Zweigen der Industrie eine im-mense Rolle. Um möglichst effi zient zu produzieren ist es besonders wichtig, dass sämtliche Fermentationsprozesse exakt auf sie angepasst werden, was oft mals hohe Temperaturen notwendig macht. Das ist auch bei dem von uns ausgewählten En-zym, der α-Amylase, der Fall. Sie spaltet Stärke zu Glukose und kommt z.B. natür-licherweise im Speichel aller Lebewesen vor. Da der entstehende Zucker zu Alkohol vergärt werden kann, spielt sie in der Etha-nolproduktion (Bio-Treibstoff ) eine große Rolle. Das Arbeitsoptimum der zur Zeit kommerziell erhältlichen, in der Industrie verwendeten Amylase liegt zwischen 82 und 86°C. In Österreich verarbeitet allei-ne das größte Bioethanolwerk schon ca. 400.000t stärkehaltige Rohstoff e pro Jahr, was bedeutet, dass die gesamte Masse an Mais, Weizen, etc. auf diese hohen Tempe-raturen aufgeheizt und dort über Stunden gehalten werden muss. Würde es gelingen, eine Amylase zu kreieren, die womöglich schon bei geringeren Temperaturen - und wenn es sich auch nur um wenige Grad Celsius handeln würde - ihre volle Leistung erbringt, hätte man dadurch viel CO2 ge-spart. Nimmt man den Gesamtdurchsatz pro Jahr von nur zwei österreichischen stärkeverarbeitenden Betrieben, sind es vorsichtig berechnet 50 Terajoule an En-ergieersparnis, was dem Jahresstromver-brauch von 3000 österreichischen Durch-schnittshaushalten entspricht.

Die Synthetische Biologie, eine neu auf-strebende Wissenschaft , macht nun die strukturelle Veränderung von Enzymen möglich. Tauscht man eine oder mehrere der kanonischen Aminosäuren aus (das sind jene 20 Sorten, welche das Leben ver-wendet) und ersetzt diese durch synthe-tische Aminosäuren, so können Eiweiße mit völlig neuen Eigenschaft en geschaff en werden. Um einen Organismus dazu zu bringen, nicht-kanonische Aminosäuren in seinen Stoff wechsel miteinzubeziehen, ist in den meisten Fällen eine Umpro-grammierung des genetischen Codes, dem

Übersetzungsschlüssel für die Proteinsyn-these, notwendig.Die Technik dieses Teilbereiches der Synthetischen Biologie wurde in dem Schulprojekt „Synthetische Biologie am Prüfstand der Schule“ von zwei Wissen-schaft lerInnen des Max-Planck-Instituts für Biochemie in Martinsried den Schü-lerInnen beigebracht. Im Rahmen dieses Projektes kam den SchülerInnen die Idee, eine synthetische Amylase zu produzieren. Dr. Nediljko Budisa berichtete in einem Vortrag an der HLFS Ursprung, mit Hilfe der Methoden der SynBio bereits eine Li-pase (= ein Enzym, dass in der Fettverdau-ung eine wichtige Rolle spielt) optimiert zu haben, die nun tatsächlich schon bei gerin-geren Temperaturen eine bedeutend besse-re Leistung erbringt, als die in der Industrie verwendete natürliche.

In wissenschaft lichen Papers aus dem Jahre 1958 des Japaners Yoshida lasen wir, dass das harmlose Bakterium Bacillus subtilis die nicht-kanonische Aminosäure Ethio-nin einbauen kann, wenn das natürliche, strukturell sehr ähnliche Methionin zur Gänze im Nährmedium fehlt. Yoshida hat sein Experiment jedoch unter völlig ande-ren Zielsetzungen durchgeführt. Er wollte Details zur Proteinbiosynthese verstehen, da zu dieser Zeit natürlich der Stand des Wissens auf diesem Gebiet noch weit von dem heutigen entfernt war. Es ließ sich je-doch aus seinen Beobachtungen schließen, dass Bacillus subtilis für die Produktion einer synthetischen Amylase geeignet sein müsste.Und tatsächlich gelang es den SchülerInnen, in Eigenregie eine funktionstüchtige Amy-lase mit den synthetischen Aminosäuren Ethionin und - und das ist nun weltweit einmalig! - Norleucin herzustellen. Selbst die beiden Wissenschaft lerInnen des Max-Planck-Instituts staunten, als sie das Ergeb-nis am Massenspektrometer verifi zierten. Die Amylase 2.0 der SchülerInnen arbeite-te, baute wie ihr natürliches Pendant Stärke ab. Vorversuche ließen erahnen, dass sie aktiver ist und also besser arbeitet als das natürliche Modell.

Weitere Tests und Untersuchungen sind allerdings noch nötig: Bei welchen Tempe-raturen hat sie ihr Optimum? Kann sie au-toklaviert werden, ist sie hitzestabil? „Lebt“ sie länger als die kommerzielle Amylase? Und vieles mehr ...Dies wird nun am Max-Planck-Insitut weiter erforscht. Die inno-vativen Vorabeiten der SchülerInnen wur-den nun von den ExpertInnen aufgegriff en und weitergeführt. In der anstehenden Publikation werden die SchülerInnen Co-AutorInnen sein, auf gleicher Augenhöhe wie die Wissenschaft lerInnen.

Die jungen ForscherInnen zeigten, dass man den Bauplan von Enzymen gezielt verändern kann und Enzym-Evolution so-gar im Schullabor möglich ist.

Welche Chancen ergeben sich noch? Pimp my Enzymes!

Max:Hochrangige Wissenschaft betreiben und auch noch das Klima schützen? Das gefällt mir doch sehr gut! Dazu zwei Forsche-rInnen, die selbst meiner Flut an Fragen standhielten. So viel über dieses span-nende Th ema werde ich sehr lange nicht mehr erfahren können ...

Simone:Eine Woche Labor - echt voi cool!!! Su-per-Teamwork, jeder brachte seine Ideen ein, alle waren voll motiviert ... Die Wis-senschaft lerInnen vom MPI, Birgit und Miche, gaben uns einfach Spitzen-Er-klärungen. Einfach unglaublich, was wir „SchülerInnen“ hier zustande gebracht haben: Einmal eine ganz andere Art, unser Klima zu schützen - mit sicherlich keinem geringen Potential!

Norbert:Ich fi nde es sehr wichtig, viel Aufmerksam-keit in der Forschung auf den Klimaschutz zu richten. Dafür haben wir in unserem Projekt einen wichtigen Grundstein gelegt. Das Potenzial, das im Bereich der Synthe-tischen Biologie liegt, kann sich heute noch keiner vorstellen, aber ich denke, dass es nicht mehr lange dauern wird, bis die For-scherInnen ihre Fähigkeiten so ausgeweitet

haben, dass sie die Synthetische Biologie zum Vorteil für die Umwelt nutzen können.

Martin:Die Optimierung von Bakterien für den Fermenter ist sicher ein wichtiger Bei-trag zur Reduzierung der Klimaerwär-

mung und des technischen Aufwandes zur Herstellung verschiedenster Pro-dukte wie Medikamenten - die für jeden Menschen leistbar sein sollten.

Michael:Ein wirklich tolles Projekt. Lehrreich, sinnvoll und mit einem gewaltigen Po-tential. Unsere veränderte Amylase ist ja nur ein winziger Bruchteil von dem, was man alles optimieren kann. Ich hoff e, Österreich verschläft diese Tech-nik nicht, sondern macht sie sich zu Nutze.

Katharina:Ich konnte leider heuer nicht im Labor dabei sein, habe mich jedoch mit den ethischen Fragen der SynBio auseinan-der gesetzt. Und man stößt wirklich an Grenzen. Es gibt eine Spannweite von Fragen, auf die es nicht wirklich Ant-worten gibt ... Die SynBio hat sicher in gewissen Bereichen sehr großes Zu-kunft spotential, jedoch muss ich ein-gestehen, dass nicht alle Möglichkeiten für mich ethisch vertretbar sind.

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ABSTRACT EINDRÜCKE / STATEMENTS

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Sepp:Als Prof. Steiner sagte, SynBio sei unser heuriges Projekt, dachte ich mir nur: Wel-chen „Widerspruch in sich“ dieses Th ema darstellt! Synthetisch heißt künstlich und Biologie bedeutet etwas in der Natur Vor-kommendes.Also sprang ich sofort darauf an - und nicht nur, weil uns klar wurde, dass wir ein Th ema behandelten, für welches es keine gesetzlichen Regelungen gab. Al-les in allem ist das ganze Projekt sehr spannend, da ich meine Kenntnisse im ethischen Bereich extrem erweitern konnte.

Pilot:Die Natur hat über Milliarden von Jah-ren die Enzyme und andere Biomoleküle durch Evolution optimiert - für deren Nutzung in einer natürlichen Umgebung. Die Industrie arbeitet dagegen viel mit En-zymen in grossen Fermentern, oft unter „künstlichen“ Temperatur- und Druckbe-dingungen. Für diese Anwendungen sind die Enzyme oft nicht angepasst und man benötigt viel Primär-Energie, um die pas-senden Umgebungsbedinungen zu schaf-fen. Die Synthetische Biologie eröff net nun neue Möglichkeiten, diese Biokataly-

satoren zu verbessern, sodass womöglich viel Energie in der Produktion gespart werden kann.Die Wissenschaft erInnen vom Max-Planck-Institut Martinsried BRD lehrten uns die Labortechniken und wir alle waren erstaunt, was in einem Schulla-bor alles möglich ist. Unglaublich: meine SchülerInnen schafft en es tatsächlich, eine

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Amylase zu kreieren, die nun an mehreren Stellen synthetische Aminosäuren einge-baut hat und haben damit einen Biokata-lysator erschaff en, den es so in der Natur nicht gibt - Wahnsinn, ist das aufregend! Ich hatte die ganze Woche im Labor fast

durchgehend Gänsehaut. Die freundliche und kompetente Art der ExpertInnen Bir-git Wiltschi und Michael Hösl trieb die Kiddies zu Höchstleistungen. Im Regel-unterricht habe ich noch nie solchen Ein-satz und v.a. solches Duchhaltevermögen erlebt. Diese Leistungsbereitschaft treibt dann auch an, jedes Jahr wieder GBT-Projekte zu organisieren. (Obwohl meine Freundin meint, ihr wäre ein Lehrer lieber, der zu Mittag heim kommt oder am Wo-chenende frei hat.)

Andi:Gespannt blickten wir auf unser heuri-ges Projekt, allein schon der Titel „Syn-thetische Biologie“ warf bei uns Fragen auf. Doch wir fanden schnell in das Gebiet hinein und beschäft igten uns mit der Materie. In den Tagen im Labor

lernten wir viel und ich fi nde, dass dieses Projekt eine Andeutung zukünft iger Technologien ist und wir alle viel davon lernen können. Alles in allem ein tolles Projekt!

Hemets Flo:Ein Enzym im Labor selbst zu verän-dern - es ist klar, dass dies nur spannend sein kann. Die Arbeit im Labor war sehr interessant und lehrreich. Umso besser, wenn mit unserem Ergebnis auch noch große Mengen an Energie eingespart werden könnten.

Markus:Dieses Projekt fand ich sehr spannend, da wir möglicherweise aufgezeigt haben, welch riesiges Potential die Synthetische Biologie für den Umweltschutz bietet. Noch dazu selbst im Labor eine synthe-tische Amylase zu erzeugen ist etwas ganz besonderes.

Lorenz:Am Anfang des Schuljahres hieß es, wir würden uns heuer im Freifach Gen- und Biotechnologie mit dem Th ema „Syn-thetische Biologie“ beschäft igen. Was ist denn das? Nach dem Studieren einiger wissenschaft licher Publikationen hatte ich eine ungefähre Ahnung bekommen, worum es denn da gehen könnte. Da ich im Sommer bereits in einem gentech-nischen Labor gearbeitet hatte, interes-sierte ich mich besonders für die neuen Labortechniken, die wir nun erlernen sollten. Ich begann mich sofort in die Materie zu vertiefen und war fasziniert, welch ungeahnte Möglichkeiten die Syn-thetische Biologie bietet. Dieses Projekt lehrte mich, dass wir noch lange nicht alles wissen, was die Natur bereits weiß und dass es noch vieles zu entdecken gibt, das selbst die Natur in ihrer 3,5 Mil-liarden Jahre dauernden Evolution nicht entdeckt hat.

Rupi:Ganz besonders spannend fand ich dieses Jahr die Zusammenarbeit mit dem

Max-Planck-Institut, welches minde-stens einmal in der Woche bei „Galileo“ vorkommt. Mit diesem renommierten Institut ein Projekt zu gestalten macht mich wirklich stolz.

Gratza:Ich fand das nahe Zusammenarbeiten von SchülerInnen und Experten des Max-Planck-Institutes faszinierend. Alle Fragen wurden beantwortet. Wir lernten neue Labortechniken und hatten eine Super-Woche.

Klinga:Da ich nun schon zum zweiten Mal im Gen- und Biotechnologieteam dabei sein durft e, wusste ich bereits, wie viel Arbeit die Recherche, Planung, Dokumentation und Ausführung eines solchen Projektes machen würde. Da ich in dieser Hinsicht jedoch leicht masochistisch veranlagt bin, war ich auch bei Amylase 2.0 wie-der live dabei! Anlass für das Projekt waren einige Papers über einen neuen Forschungszweig. Synthetische Biologie heißt die Lehre, in der Lebewesen mit völlig neuen Eigenschaft en designed werden sollten. Die Th ematik ließ mich bereits nach kurzer Zeit nicht mehr kalt.

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SPONSOREN / PARTNER

Anna und Univ.Prof. Dr. Hans Adam

Bildungsförderungsfonds für Gesundheit und Nachhaltige Entwicklung

TEAM

HLFS URSPRUNG Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried BRD

Martin AignerMartin Brunschmid Anton Gimpl Julian Gratzer Michael Grömer Maximilian Habl Andreas Harz Florian Hemetsberger Norbert Hemetsberger Florian Klinger Markus Pendl Johanna Pfl eger Prof. Dr. Konrad Steiner, ProjektleitungSimone Reiter Lorenz SchwaigerKatharina LichtmannspergerSepp Strobl

PD Dr. Nediljko BudisaDr. Birgit WiltschiMag. Michael HöslLena Strube

Graphik, Film, Web

Mag. (FH) Sonnleitner DanielaStockinger Markus

Kontakt: [email protected]

3130

Gemeinde Elixhausen

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