Analyitsche Auswertung von Molecular Imprinted Polymeres per Gel-Elektrophorese Henrik Scholz &...

Click here to load reader

  • date post

    05-Apr-2015
  • Category

    Documents

  • view

    104
  • download

    1

Embed Size (px)

Transcript of Analyitsche Auswertung von Molecular Imprinted Polymeres per Gel-Elektrophorese Henrik Scholz &...

  • Folie 1
  • Analyitsche Auswertung von Molecular Imprinted Polymeres per Gel-Elektrophorese Henrik Scholz & Benjamin Wanitschka
  • Folie 2
  • bersicht Grundlagen der Elektrophorese Gel-Elektrophorese Herstellung MIPs Messung eines MIPs und eines NIPs Auswertung mit dem Densitometer Grund fr diese Analyse-Methode Fragen?!?!
  • Folie 3
  • Grundlagen der Elektrophorese unter Elektrophorese versteht man das wandern von gelsten ionischen Verbindungen in einem elektrischen Feld sie findet oft ihren Einsatz um Aminosuren, Proteine, Nucleinsuren oder Lipine zu analysieren Es gibt sowohl eine Elektrophorese die man in freier Lsg. durchfhrt als auch die sog. Trger- Elektrophorese wobei die 2. im Laboraltag berwiegt
  • Folie 4
  • Gel-Elektrophorese Als Trgergel benutzt man hauptschlich Polyacrylamid, es wirkt als eine Art Molekularsieb d. h. sie werden im elektrischen Feld proportional zu Ihrer Molekularmasse langsamer oder schneller wandern Soll das Protein oder die Aminosure nur nach seiner Gre und nicht nach seiner Ladung aufgetrennt werden, wird SDS zugesetzt
  • Folie 5
  • SDS-PAGE Sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel elektrophoreses dabei werden die meisten Proteine und Aminosuren gebunden und erzeugen eine hohe negative Nettoladung der Molekle dadurch unterscheiden sie sich nur noch in der Molekularmasse und werden dann danach aufgetrennt
  • Folie 6
  • Herstellung MIPs - funktionelle Monomere dienen als Anker fr das Templat und halten es whrend der folgenden Polymerization in Position - nach entfernen des Templats aus dem gebildeten Polymer werden Andockstellen frei -> diese soind komplementr zur Form und den funktionellen Gruppen des Templats - die molekular geprgten Polymere kurz MIPs besitzen also ein Gedchtnis fr ihr Templat und knnen es oder nahe Strukturen selektiv binden hnlich den menschlichen Antikrpern
  • Folie 7
  • Herstellung MIPs
  • Folie 8
  • Messung eines MIPs und eines NIPs Prparieren der SDS Gels: 1. Separtion gel Wasser Separation Buffer MBA Lsg. 30% 1 eq. SDS APS TMEDA
  • Folie 9
  • Messung eines MIPs und eines NIPs Prparieren der SDS Gels: 2. Stacking gel Wasser Separation Buffer MBA Lsg. 30% ca. 0.1 eq. SDS APS TMEDA
  • Folie 10
  • Messung eines MIPs und eines NIPs Probenvorbereitung 10 g des NIPs und des MIPs 7 ml Puffer (pH 6,8) 2 ml Glycerin 0.4 ml SDS 500 L -mercaptoethanol Bromophenolblue um es kenntlich zu machen
  • Folie 11
  • Messung eines MIPs und eines NIPs Running Buffer 75,5 g Tris 470 g Glycerin 4 L Wasser 250 ml 10% SDS
  • Folie 12
  • Messung eines MIPs und eines NIPs Vorbereitung der Gels:
  • Folie 13
  • Messung eines MIPs und eines NIPs Zunchst die Separation-Gel Lsg. Zwischen die beiden Glasplatten geben, polymerisieren Dann die Stocking-Gel Lsg darauf geben und den Kamm in der Halterung fest machen
  • Folie 14
  • Kammer fr 2 Gels
  • Folie 15
  • Messung eines MIPs und eines NIPs Nach Ende der Polymerisation kann der Kamm entfernt werden und man kann nun den Marker, das NIP und das MIP auf das Gel aufgeben! Der Marker dient als Vergleich da er eine genau festgelegte Auftrennung hat, die man im Densitometer mit den beiden Proben vergleichen kann
  • Folie 16
  • Messung eines MIPs und eines NIPs Das auftragen der Proben erfolgt mit einer Eppendorf-Pipette
  • Folie 17
  • Messung eines MIPs und eines NIPs Anschlieend gibt man die Gelplatten in das Elektophorese-Gert das mit der Running- Solution befllt wurde
  • Folie 18
  • Messung eines MIPs und eines NIPs
  • Folie 19
  • Folie 20
  • Folie 21
  • Nachdem man die Gels in das Gert gestellt hat, stellt man es an und gibt die entsprechenden Parameter ein Bei 50-60 mA ca. 30 Min.
  • Folie 22
  • Auswertung mit dem Densitometer Nach der Gel-Elektrophorese wird das Gel mit einem Anfrbereagenz anfrbt und ber Nacht stehen gelassen. Am nchsten Tag mit viel Wasser mehrmals gewaschen um die Proteine oder Aminosuren sichtbar zu machen! Wrde man die Gels nicht mit viel Wasser waschen dann htte man ein komplett blaues oder rotes Gel und man knnte nichts erkennen und keine Auswertung vornehmen
  • Folie 23
  • Messung eines MIPs und eines NIPs
  • Folie 24
  • Auswertung mit dem Densitometer Anfrbereagenz:
  • Folie 25
  • Auswertung mit dem Densitometer
  • Folie 26
  • Man legt nun das Gel auf eine spezielle Glasplatte im Densitometer
  • Folie 27
  • Auswertung mit dem Densitometer Das Densitometer misst die Absorption des Gels und daraus kann man die Menge an Substanz errechnen
  • Folie 28
  • Grund fr diese Analyse-Methode Der Grund fr diese Methode ist, dass man berprft ob die Polymere die man hergestellt hat so funktionieren oder wie gut sie funktionieren wie sie es sollen NIPs (Nonimprinted Polymeres) Es ist das Polymer ohne Zustze MIPs (Molecular Imprinted Polymeres) Es bedeutet dass dieses Polymer ein Protein beinhaltet
  • Folie 29
  • Grund fr diese Analyse-Methode Wenn man nun die beiden gegeneinander auf dem Gel auftragt dann kann man genau vergleichen ob und wie gut das Polymer das man Synthetisiert hat funktioniert
  • Folie 30
  • Fragen?!?!
  • Folie 31
  • Vielen Dank fr die Aufmerksamkeit!