Analysen auf Proteinebene

2D-GelelektrophoreseTrennung nach 2 verschiedenen Prinzipien•Isoelektrischer Punkt•Molekülgröße

MatrixAssistedLaserDesorbtionIonisation-Time Of Flight

MALDI-TOF

Analysen auf Nukleinsäureebene

Southernund

Northern Blot

Restriktionsverdau

Radioaktive Markierung von Sonden fürSouthern und Northern Blot

?

Radioaktive 5‘-Markierung von DNA (Oligonukleotide)als Sonden für Southern und Northern Blot

Web Figure 1. Changes in transcript abundance in human NB4 cells treated with 1 mM ATRA. Total RNA was collected at various times up to 72 hours as indicated. RNA wasamplified by PCR-coupled IVT, and cRNAs were hybridized to ink-jet oligonucleotide arrays with 49,218 human UNIGENE clusters each represented by a singleoligonucleotide. (A) 1-D K-means cluster analysis (Hartigan, 1975) of regulations accompanying ATRA-induced differentiation of NB4 cells. From all transcripts measured ateight time points, 432 were selected with > 2 instances of |log10(transcript abundance ratio, treated/untreated)| > 0.5, P < 0.01, and intensity > -1.5 [in arbitrary units; thiscorresponds roughly to 0.5 copies per cell (data not shown)]. K-means clustering was used to cluster the transcripts into seven groups. (B) Seven temporally co-regulatedtranscript groups partitioned by K-means clustering. The mean transcript abundance ratio (log10(treated/untreated)) for each of the groups in (A) is plotted. The error barsrepresent the standard deviation. (C) Detection of induced protein products at the cell surface. From the single-oligonucleotide-per-gene microarray analysis, five genesencoding cell surface proteins were identified that were up-regulated by ATRA treatment. NB4 cells were again treated with ATRA and analyzed for expression of cell surfaceproteins by flow cytometry. Phycoerythrin-conjugated murine monoclonal antibodies (mAbs) reactive with human cell surface antigens were obtained from Pharmingen. ATRA-treated NB4 cells were stained with mAbs and analyzed on an EPIC flow cytometer (Coulter). A total of 10,000 cells were analyzed for each sample.Shown are histograms ofexpression of the indicated cell surface proteins and a negative control (IgG1) after 0 (dotted lines) and 72 hrs (solid lines) of ATRA treatment. (Hughes et al. NatureBiotechnology, 2001.

49,218

(Hughes et al. Nature Biotechnology, 2001.

http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=8&f=goals

http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=8&f=goals

Wie kann man die Expressionunbekannter Sequenzen

untersuchen??

Examples of Viruses Discovered Since 1977

Year Agent Disease Ref 1977 Ebola virus Ebola haemorrhagic fever (Johnson et al., 1977)

1977 Hantaan virus Haemorrhagic fever with renal syndrome (Lee et al., 1978)

1980 Human T-cell lymphotropic virus-I T-cell lymphoma leukaemia (Poiesz et al., 1980)

1982 Human T-cell lymphotropic virus-II Hairy cell leukaemia (Kalyanaraman et al., 1981)

1983 Human papilloma virus types 16 and 18 Cervical Cancer (Durst et al., 1983)

1983 Human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) AIDS (Barre Sinoussi et al., 1983)

1986 Human immunodeficiency virus - 2 AIDS (Clavel et al., 1986)

1988 Human herpes virus 6 (HHV6) Roseola infantum (Yamanishi et al., 1988)

1989 Hepatitis C virus (HCV) Non A non B hepatitis (Choo et al., 1989)

1990 Borna Disease virus NAD (Lipkin et al., 1990)

1990 Hepatitis E virus (HEV) Acute faecal oral hepatitis (Reyes et al., 1990)

1990 Human herpes virus 7 (HHV7) NAD (Frenkel et al., 1990)

1991 Guantanto virus Venezuelan haemorrhagic fever (Salas et al., 1991)

1993 Hantavirus (SNV) Hantavirus pulmonary syndrome (HPS) (Nichol et al., 1993)

1994 Sabia virus Brazilian haemorrhagic fever (Lisieux et al., 1994)

1994 Human herpes virus 8 (HHV8) Kaposi’s sarcoma (Chang et al., 1994)

1995 Hepatitis G virus (HGV)(GBV-C) NAD (Simons et al., 1995)

1997 Multiple sclerosis-associated retrovirus Multiple sclerosis (Perron et al., 1997)

1997 Human retrovirus 5 (HRV5) NAD (Griffiths et al., 1997)

NAD: No Associated (human) Disease 2003 SARS Coronavirus Severe acute respiratory syndrome (Drosten et al., 2003)

RNA Probe 1 RNA Probe 2

cDNA 2 cDNA 2

Vergleich voncDNA Population1mit cDNA Population2

Identifizierung von Unterschieden

Lösung: Amplification aller cDNA‘s

Sensitivität??

gtccaggctaccacgcggccatagAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTT5‘

gtccaggctaccacgcggccatagAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3‘TTTTTTTTTTTTTTT5‘3‘TTTTTTTTTTTTTTT5‘3‘TTTTTTTTTTTTTTT5‘3‘TTTTTTTTTTTTTTT5‘3‘TTTTTTTTTTTTTTT5‘3‘TTTTTTTTTTTTTTT5‘3‘TTTTTTTTTTTTTTT5‘3‘TTTTTTTTTTTTTTT5‘

CTTTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTT

2. Runde10-fache Mengean Driver DNA

Ligation und Klonierung

von RDA Produkten

Identifizierung differentiell exprimierter Transkripte

gtccaggctaccacgcggccatagtctagggctgcctgAAAAAAAAAAAAA3‘CTTTTTTTTTTTTTTT5‘

RNase HBehandlung

Auffüllen

Ligieren

DNA Polymerase

Ligation und Klonierung

von SSH Produkten

Identifizierung differentiell exprimierter Transkripte

Protease protection assay

Nachweis neuer Viren

Nachweis und Identifizierung neuer humaner Retroviren

Retrovirus?

Retrovirus?Retrovirus?

Retrovirus?

Lupuserythematodes

RheumatischeArthritis Mycosis

fungoides

MultipleSklerose

FLG 29.1 cell line:

osteoclast precursor cells (Bernabei et al. 1989)

¨ 1985 established from leukemia patient¨ 1985 suspected retrovirus infection¨ 1993 short sequence with homologies to retrovirus? ¨ 1999 ?

MS 1533MS 1845

FLG 29.1Molt

Molt + HIV

Mn++

Mg++0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

cation dependence of RT acitvity(Medium was concentrated 10 times, except Molt/HIV)(Assay was incubated 24 h, Molt/HIV was incubate 2 h)

Mn++ Mg++

Im Überstand von FLG 29.1 Zellen ließ sich eine RT Aktivität nachweisen. Die gemessene enzymatische Aktivität zeigte eine starke Abhängigkeit von Mg++ Kationen

d1d2

d3d7

d10blank/HIV+

293

293 + FLG sup0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Infection of 293 cells with FLG supernatant

293 293 + FLG sup

Mit dem RT-Test ließ sich zeigen, dass der Überstand von FLG Zellen infektiöse Retroviren enthielt, mit denen humane 293 Zellen infiziert werden konnten (293 + FLG sup).

A B

?

A B

FLG 29.1 Kultur

?

K 37 Zellen

RNA aus der infizierten Zellkultur (rot) und der nicht-infizierten Kontrolle (blau) wurden vergleichend im Differential Display untersucht.

AP2A G CC

AP1 AP2A G CC

AP1

Banden, die nur in den infizierten Proben auftraten (Pfeile) wurden ausgeschnitten, die DNA eluiert, reamplifiziert, kloniert und sequenziert.

Reamplifikation

Ligation und Klonierung

von DD Produkten

AAGTCCAGATTCG

Scre

ening

mit

Klonie-

PCR

Sequenzierung derklonierten Fragm

ente

Auswertung dererhaltenen Sequenzen

Im Blast search wurden die klonierten PCR Fragmente als Mycoplasmen-spezifisch identifiziert.Tatsächlich stellte sich heraus, dass die untersuchten Kulturen mit Mycoplasmen verseucht waren.Da Mykoplasmen Untersuchungsergebnisse auf verschiedenen Ebenen beeinflussen können, sollteimmer darauf achten, dass Zellkulturen Mycoplasmen-frei sind.

gag prt pol envLTR LTR

•PCR mit verschiedenen pol Konsensus-Primern•1 Primerkombination ergab ein Amplifikat•Hohe Homologie zu Squirrel Monkey Retrovirus

AAGTCCAGATTCG

PCR

Blast search

Gene

ric R

T pr

imer

sSM

RV R

T pr

imer

s

Abgeleitet von der mit Konsensus-Primerngewonnenen und mittels Sequenzvergleich alsSqirrel Monkey Retrovirus (SMRV) identifizierteSequenz wurden spezifische Primer synthetisiert und in die PCR eingesetzt.

before after

M. h

yorh

ins

SMR

V po

l

M. h

y orh

ins

SMR

V po

l

Mycoplasm treatment

FLG 29.1

Durch Bakterizid-Behandlung wurden die Mycoplasmen ausder Zellkultur eliminiert. Währendvor der Behandlung sowohl die SMRVPCR als auch die Mycoplasmen PCR positiv waren, war nach derBehandlung nur noch die SMRVPCR positiv.