Analytische Chemie - €¦ · HS 2008 Xiangyang Zhang 9 DB-XLB für Butter Triglycerides Column:...

HS 2008 Xiangyang Zhang 1

Analytische Chemie für Biologie Pharmazie Bewegungs-

wissenschaften und Sport

Teil Chromatographische und Elektrophoretische Trennverfahren

FAME – Kombinierte Übung


Zusammenfassung: GC, LC, EP

GC LC EP

MP He, H2, N2 LM (elutionsmittel) Pufferlösung

SP Film-df/Polarität NP, RP, IC, SEC, … –––––

Säule (Kapillar) ID, L, Kapizität ID, L, df (kompakt) ID, L

Parameters Flussrate (u), T Flussrate (u) pH, Spannung (V)

Gradient- T- Elutions-, (T-) pH-, V-

Prinzip G/L Verteilung L/L Verteilung EP und EOF

Detektor FID (ECD) / MS UV, RI, ELSD / MS UV, Fl / MS

Anwendungen Klein, neutral,

thermostabil,

nicht-zu-polare

Alle (auch polare

bei RP, Polymere

bei SEC)

Ionische (auch

Neutrale bei

MEKC)


Gute Trennung

•! System – Säule (stationäre Phase) und mobile Phase (Polarität) •! Analyteneigenschaften •! Operationsbedingungen (Fliessrate, Temperatur und LM-Gradientenelution)

!

R =" #1

"

$

% &

'

( ) *

k2

1+ k2

*N

4=

tR 2# t

R1

(w2

+ w1) /2

!

tR

=16R

S

2H

u"

#

# $1

%

& '

(

) * "1+ k

2( )3

k2

2

Kurze Retentionszeit tR’ genuge Auflösung R

idealer Peakform (schmal wb und symmetrisch)

!! Online: Vor- (für höhe Trennleistung) und Nach- (mit UV/Fl Marker für selektive und empfindliche Detektion )

!! Offline: bei der GC für flüchtig und zu schwer

!! Schnell, sauber, Reagenzien mischbar mit MP, Produkte löslich in MP

Derivatisierung:

Analysenmethode:


Auswahl einer Chromatographiemethode

!! Polarität

!! Löslichkeit

!! Ionenisch

!! Molekulare Masse

NP RP

Ausschluss

•! Geeignet für Sehr polare und thermisch labile Substanzen

•! Geeignet für Ionische Verbindungen, Biopolymere und Polymere

•! Analytische, Präparative und Produktive

•! Grosse Auswahl und Hohe Trennleistung Selektivität

GC EP

LC


FAME – Ein kombiniertes Beispiel Entwerfen Sie eine Methode, um die Fettsäureverteilung in einem Fett oder Öl quantitativ zu bestimmen. Nehmen Sie an, das Fett sei bereits aus dem Lebensmittel isoliert.

1. Ist eine Aufarbeitung oder Derivatisierung notwendig? 2. Welches Trennverfahren eignet sich? 3. Wie detektieren Sie die Fettsäuren?

With the implementation of the Nutrition Labeling and Education Act of 1990 by the U.S. Food and Drug Administration (FDA), the total

fat and saturated fat contents of a food must be listed on its label."


Wichtige Fettsäuren in Milch, Fleisch, Fish und Gemüse"1 C4:0 (Butryic) "2 C6:0 (Caproic) "3 C8:0 (Caprylic) "

4 C10:0 (Capric) "5 C11:0 (Undecanoic) "6 C12:0 (Lauric) "7 C13:0 (Tridecanoic) "8 C14:0 (Myristic)"

9 C14:1 (Myristoleic) "10 C15:0 (Pentadecanoic) "11 C15:1 (cis-10-Pentadecenoic) "12 C16:0 (Palmitic) "13 C16:1 (Palmitoleic) "

14 C17:0 (Heptadecanoic) "15 C17:1 (cis-10-Heptadecenoic) "16 C18:0 (Stearic) "17 C18:1n9c (Oleic) "18 C18:1n9t (Elaidic) "

19 C18:2n6c (Linoleic) "

20 C18:2n6t (Linolelaidic) "21 C18:3n6 (!-Linolenic)"22 C18:3n3 ("-Linolenic) "

23 C20:0 (Arachidic) "24 C20:1n9 (cis-11-Eicosenoic) "25 C20:2 (cis-11,14-Eicosadienoic) "26 C20:3n6 (cis-8,11,14-Eicosatrienoic) "27 C20:3n3 (cis-11,14,17-Eicosatrienoic) "

28 C20:4n6 (Arachidonic) "29 C20:5n3 (cis-5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic) "30 C21:0 (Henicosanoic) "31 C22:0 (Behenic) "32 C22:1n9 (Erucic) "

33 C22:2 (cis-13,16-Docosadienoic) "34 C22:6n3 (cis-4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic)"35 C23:0 (Tricosanoic) "36 C24:0 (Lignoceric) "37 C24:1n9 (Nervonic) "

Je 2 C14-C17/C24; je 7 C18/C20, 4 C22 Isomere


Der erste Schritt

Unfortunately for the food analyst, determining the fatty acid composition is

difficult because a food can contain many different fatty acids of various carbon chain lengths. "

Wichtige Punkte: •! Viele Komponenten, davon es ähnliche Isomere zu entstehen sind

•! Triglyceriden mit sehr höhen Siedpunkt

•! Carboxylic Gruppe: nicht empfindlich bei UV; wenn Elutionsgradient nötig, RI-Detektion ist auch nicht geeignet.

•! Ist der Triglyceride möglich zu derivatisieren?


DB-5ht Säule für Butter Triglyceriden (5%-Phenyl)-methylpolysiloxane, unpolar

30 m x 0.32 mm I.D., 0.1 µm Carrier: Hydrogen at 55 cm/sec, measured at 250°C Oven: 35-250°C at 70°/min, 250-400°C at 5°/min

400°C for 20 min Injector: Cool On-column 1 µL of 9 µg/µL in toluene (approx. 1% w/w solution) Detector: FID, 400°C

T= Total number of Carbons


DB-XLB für Butter Triglycerides Column: DB-XLB 15 m x 0.25 mm I.D., 0.1 µm Carrier: Hydrogen at 50 cm/sec Oven: 255-365°C at 5°/min 365°C for 10 min Injector: Split 1:50, 365°C 1 µL of 10 µg/µL Detector: FID, 365°C Nitrogen makeup gas at 30 mL/min

Exceptionally Low Bleed (XLB) Low polarity Extended temperature limit of

340/360°C


Eine polarere Säule

DB-17ht: (50%-Phenyl)-methylpolysiloxane

!"#-polarity; Extended upper temperature limit of 365°C

Excellent peak shape and faster elution times for high boilers Improved resolution for triglycerides

Ideal for confirmational analyses

30 m x 0.32 mm I.D., 0.15 µm

Carrier: Hydrogen at 40 cm/sec

Oven: 250-365°C at 5°/min; 365°C for 1 min

Injector: Cool On-column

1 µL of 9 µg/µL in toluene (approx. 1% w/w solution)

Detector: FID, 400°C, Nitrogen makeup gas at 30 mL/min

Baseline Corrected


DB-17ht für Butterfett


DB-17ht für Kokosfett

(50%-Phenyl)-

methylpolysiloxane

30 m x 0.25 mm I.D., 0.15 µm Carrier: Hydrogen at 50 cm/sec Oven: 255-365°C at 5°/min 365°C for 10 min Injector: Split 1:50, 365°C 1 µL of 10 µg/µL

Detector: FID, 365°C


HPLC: Olivenöl

ELSD Detektor

UV bei 225 nm

Säule: Hypersil BDS C18,

5 !m, 250 mm x 4.6 mm

Mobile Phase: CH3CN : EtOH

Gradient: 80:20 bis 0:100 während 60 min

Flussrate: 1.5 ml/min

Detektor: UV bei 225 nm und ELSD


Triglycerides in 100% Olive Oil

•! Alltima™ C18, 3!m, 150 x 4.6mm

•! Mobile Phase: –! A: Dichloromethane –! B: Acetonitrile

•! Gradient: –! Time (min): 0 10 18 20

%B: 70 55 70 70

•! Flowrate: 1.5mL/min

•! Detector: ELSD 2000

1. LLO

2. LLP

3. OOL

4. POL

5. PPL

6. OOO

7. OOP

8. PPO

9. OOS


Derivatisierung

O

O

O

C (CH2)n1CH3

C (CH2)n2CH3

C (CH2)n3CH3

O

O

O

3 NaOHHO

HO

HO

C (CH2)n1CH3

C (CH2)n2CH3

C (CH2)n3CH3

O

O

OOH

OH

OH

+HCl


Ionenchromatographie

1 Oxalsäure "

2 Weinsäure "3 Citronensäure "

4 Malonsäure "5 Ameisensäure "

6 Milchsäure "

7 Bernsteinsäure "8 Essigsäure "

9 Fumarsäure!

Säule: Jordi Organic Acid Column, 500 mm x 10 mm, 5 !m

Mobile Phase: 0.01 M Phosphorsäure, pH 3 mit NaOH

Flussrate: 1.5 ml/min

Detektor: UV bei 210 nm RI


GC-FID: DB-FFAP 1 Aceton "2 Ameisensäure "3 Essigsäure "

4 Propionsäure "5 Isobuttersäure "6 Buttersäure "7 Isovaleriansäure "8 Valeriansäure "

9 Isocapronsäure "10 Capronsäure "11 Heptansäure "12 Caprylsäure "13 Caprinsäure "

14 Laurinsäure "15 Myristinsäure "16 Palmitinsäure "17 Stearinsäure "18 Arachidinsäure "

High polarity, Nitroterephthalic acid modified polyethylene glycol Säule: 30 m x 0.25 mm, 0.25 !m Filmdicke

Flussrate: 40 cm/s Helium

T: 100° für 5 min, 100°–250° bei 10°/min, dann stationär Injektor: 250°, "split" 1:50 Detektor: FID, 300°


HPLC: Alltima C-18

1 Linolensäure (C18:3) 2 Linolsäure (C18:2) 3 Ölsäure (C18:1) 4 Stearinsäure (C18:0)

Säule: Alltima C18, 5 µm, 150 x 4.6 mm "

Mobile Phase: Tetrahydrofuran :

Acetonitril : 0.1 % Phosphorsäure "

(24:58:18) "Flussrate: 1.5 ml/min "

Detektor: UV bei 220 nm!


CZE für Carbonsäuren


Derivatisierung – FAME

Die beste Lösung des Problems liegt in der Umesterung der Triglyceride mit

Natriummethanolat. Die entstehenden Fettsäure-methylester (fatty acid methyl

esters, FAMEs) lassen sich leicht mittels Gaschromatographie trennen. Die

Detektion mit dem FID ist problemlos möglich. Der leichte Anstieg der Basislinie

infolge des Temperatur- programmes stört die Quantifizierung nicht. Die meisten

Peaks sind basisliniengetrennt.!

O

O

O

C (CH2)n1CH3

C (CH2)n2CH3

C (CH2)n3CH3

O

O

O

3 NaOCH3H3CO

H3CO

H3CO

C (CH2)n1CH3

C (CH2)n2CH3

C (CH2)n3CH3

O

O

OONa

ONa

ONa

+


DB-Wax Säule: 34 FAMEs

•! Polyethylene glycol (PEG)

•! Close equivalent to USP Phase G16

•! High polarity

•! Lower temperature limit of 20°C is lowest of any bonded PEG phase; improves resolution of low boiling point analytes

•! Column-to-column repeatability

•! Bonded and cross-linked; solvent rinsable

•! Exact replacement of HP-WAXcement of HP-WAX



17/18

(50%-Cyanopropylphenyl-dimethylpolysiloxane

H2, T-Gradient, FID, 13 min

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