Athos Felipe de Lima - 16-09-2013-Finalizada-PDF

8/10/2019 Athos Felipe de Lima - 16-09-2013-Finalizada-PDF

1/63

UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL

PROGRAMA DE PS-GRADUAO

MESTRADO EM CINCIAS DO MOVIMENTO HUMANO

O Exerccio Agudo Reduz a Expresso da TRB3 e Melhora

a Produo Heptica de Glicose em Camundongos

Diabticos

ATHOS FELIPE DE LIMA

Orientador: Prof. Dr. Cludio Teodoro de Souza

Dissertao apresentada ao Mestrado emCincias do Movimento Humano, daUniversidade Cruzeiro do Sul, como parte dos

requisitos para a obteno do ttulo de Mestreem Cincias do Movimento Humano.

SO PAULO

2009


2/63

AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTETRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO, PARAFINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELABIBLIOTECA CENTRAL DA


L696eLima, Athos Felipe de.

O exerccio agudo reduz a expresso da TRB3 e melhora a

produo heptica de glicose em camundongos diabticos / AthosFelipe de Lima. -- So Paulo; SP: [s.n], 2009.61 p. : il. ; 30 cm.

Orientador: Cludio Teodoro de Souza.Dissertao (mestrado) - Programa de Ps-Graduao em

Cincias do Movimento Humano, Universidade Cruzeiro do Sul.

1. Exerccio fsico 2. Glicose (Produo) 3. Diabetes mellitus -Camundongos (Experimentos) 4. Insulina (Resistncia)5. Experimentos animais. I. Souza, Cludio Teodoro de.II. Universidade Cruzeiro do Sul. Programa de Ps-Graduao emCincias do Movimento Humano. III. Ttulo.

CDU: 796(043.3)


3/63


PROGRAMA DE PS-GRADUAO

O Exerccio Agudo Reduz a Expresso da TRB3 e Melhora

a Produo Heptica de Glicose em Camundongos

Diabticos

Athos Felipe de Lima

Dissertao de mestrado defendida e aprovada

pela Banca Examinadora em 10/03/2009

Banca Examinadora:

Prof. Dr. Cludio Teodoro de Souza

Universidade Cruzeiro do Sul

Prof. Dr. Maria Fernanda Cury Boaventura

Universidade Cruzeiro do Sul

Prof. Dr Jos Rodrigo Pauli

Universidade Federal de So Paulo


4/63

AGRADECIMENTOS

No meio de toda dificuldade,

sempre existe uma oportunidade(Albert Einstein).

Meu primeiro agradecimento no poderia ser diferente que

para minha famlia (pai, me, irms, sobrinho, tia e av), que foram

indiscutivelmente fundamentais para que obstculos fossem

superados e assim esse dia chegasse.

Tambm agradeo Secretaria de Educao do Estado de

So Paulo, pela oportunidade oferecida aos professores da rede

atravs da bolsa mestrado, oferecendo assim a possibilidade de

todos que possuem este desejo de realiz-lo.

Ao professor Cludio Teodoro de Souza por toda sua ajudadurante todo o processo, por sua orientao e por acreditar que

alcanaramos nossos objetivos.

E a todos aqueles que de alguma maneira contriburam para

que eu pudesse chegar a este momento.


5/63

Lima AF. O exerccio agudo reduz a expresso da TRB3 emelhora a produoheptica de glicose em camundongos diabticos [dissertao]. So Paulo:Universidade Cruzeiro do Sul; 2009.

RESUMO

A TRB3 tem sido identificada como uma protena importante na regulao da

sinalizao da insulina, por ligar-se diretamente ser/thr da protena quinase (akt),

reduzindo sua fosforilao e prejudicando o sinal da insulina. inversamente, o

exerccio fsico tem sido relacionado a uma melhora da homeostase da glicose e um

aumento da sensibilidade insulina. porm, o mecanismo molecular pelo qual oexerccio melhora a homeostase da glicose, particularmente no tecido heptico,

apenas parcialmente conhecido. No presente estudo, demonstramos que o exerccio

agudo reduz a glicose de jejum em dois modelos de camundongos diabticos.

Analises por western blot mostraram que oito horas aps um protocolo de natao a

expresso de TRB3 foi reduzida no tecido heptico de camundongos swiss com

obesidade induzida pela dieta (dio) e camundongos deficientes em leptina (ob/ob),

quando comparados com os respectivos grupos em repouso. atravs do teste detolerncia insulina (kitt) verificou-se um aumento na responsividade insulina em

tecido heptico dos camundongos dio e ob/ob aps o exerccio. a expresso de

pepck foi diminuda no fgado aps o protocolo de exerccios, sugerindo que o

exerccio agudo diminui a produo heptica de glicose atravs da restaurao do

sinal da insulina. Estes resultados mostram novas evidncias sobre o mecanismo

pelo qual a atividade fsica melhora a homeostase da glicose no diabetes tipo 2.

Palavras-chave:Diabetes, Exerccio fsico, Expresso de TRB3, Produo heptica

de glicose, Resistncia insulina.


6/63

Lima AF. Acute exercise reduces insulin resistance-induced TRB3 expressionand amelioration of the hepatic production of glucose in the liver of diabeticmice[dissertao]. So Paulo: Universidade Cruzeiro do Sul; 2009.

ABSTRACT

TRB3 (a mammalian homolog of Drosophila) is emerging as an important player in

the regulation of insulin signaling. TRB3 can directly bind to Ser/Thr protein kinase

Akt, the major downstream kinase of insulin signaling. Conversely, physical exercise

has been linked to improved glucose homeostasis and enhanced insulin sensitivity;

however the molecular mechanisms by which exercise improves glucosehomeostasis, particularly in the hepatic tissue, are only partially known. Here, we

demonstrate that acute exercise reduces fasting glucose in two models diabetic

mice. Western blot analysis showed that eight hours after a swimming protocol,

TRB3 expression was reduced in the hepatic tissue from diet-induced obesity (Swiss)

and leptin-deficient (ob/ob) mice, when compared with respective control groups at

rest. In parallel, there was an increase in insulin responsiveness in the canonical

insulin signaling pathway in hepatic tissue from DIO and ob/ob mice after exercise. Inaddition, the PEPCK expression was reduced in the liver after the exercise protocol,

suggesting that acute exercise diminished hepatic glucose production through

insulin-signaling restoration. Thus, these results provide new insights into the

mechanism by which physical activity improves glucose homeostasis in type 2

diabetes.

Keywords:TRB3 expression, Insulin, Exercise, Liver, Hepatic glucose production.


7/63

LISTA DE ABREVIATURAS

Akt Serina treonina quinase

DIO Camundongo com obesidade induzida por

dieta

DM2 Diabetes mellitus do tipo 2

foxo Fator de transcrio (forkhead)

G6Pase Glicose 6-fosfatase

IR Receptor de insulina

IRS Substrato receptor de insulina

ob/ob Camundongo deficiente de Leptina

PEPCK Fosfoenolpiruvato carboxiquinase

PI 3-K Fosfatidilinositol 3-quinase

PKB Protena quinase B

Psammomy obesus Rato obeso que vive na areia.

PTP1B Protena tirosina fosfatase 1B

RI Resistncia insulina

Ser Serina

TRB Tribbles homolog

Thr Treonina


8/63

SUMRIO

1

INTRODUO ..................................................................................................... 8

2 OBJETIVOS .................................................................................................... 18

2.1 Geral ............................................................................................................... 18

2.2 Especficos..................................................................................................... 18

3 MATERIAIS E MTODOS .................................................................................. 19

3.1 Animais experimentais ................................................................................. 19

3.2 Protocolo de exerccios ................................................................................ 19

3.3 Extrao de tecidos ....................................................................................... 20

3.4 Glicose de jejum, teste de tolerncia insulina (ITT), quantificao

de insulina srica e contedo de glicognio .............................................. 20

3.5 Anlise de protenas por Immunoblotting ................................................... 20

3.6 Anlise estatstica ......................................................................................... 21

4

RESULTADOS ................................................................................................... 22

4.1 Parmetros fisiolgicos e metablicos ....................................................... 22

4.2 O exerccio agudo melhora o sinal da insulina no fgado de

camundongos ob/ob e DIO ........................................................................... 22

4.3 O exerccio agudo suprime a expresso da TRB3 no tecido heptico

de camundongos ob/ob ................................................................................ 23

4.4 O exerccio agudo reduz a expresso heptica de PEPCK de

camundongos DIO e ob/ob ........................................................................... 23

5 DISCUSSO ...................................................................................................... 25

6 CONCLUSO ..................................................................................................... 29

ANEXOS ................................................................................................................... 39


9/63

8

1 INTRODUO

O diabetes mellitus atualmente um dos principais problemas de sade

pblica do mundo. Nas ltimas duas dcadas tem ocorrido um aumento alarmante

no nmero de pessoas com diagnstico deste distrbio (KING et al., 1998; WILD et

al., 2004). A maioria dos casos est associada ao estilo de vida sedentrio e

obesidade (FLIER, 2001; STEPPAN et al., 2001; RABE et al., 2008). O nmero

global de pessoas com diabetes est atualmente em torno de 150 milhes,

estimando-se para 220 milhes em 2010 e 300 milhes entre 2025 e 2030 (KING et

al., 1998; ZIMMET, 2000; WILD et al., 2004). No Brasil, onde doenas infecciosas e

carenciais ainda contribuem para elevada mortalidade precoce, estudos

epidemiolgicos revelam prevalncias de 15% e 9% para obesidade e diabetes

mellitus respectivamente (FILOZOF et al., 2001; FREIRE et al., 2003).

O aumento da prevalncia de diabetes mellitus tipo 2 (DM2) deve-se ao

preocupante aumento nos casos de obesidade (GRIBBLE, 2005). Durante as ltimas

dcadas observou-se um aumento surpreendente na prevalncia de obesidade ediabetes mellitus em populaes de vrias regies do planeta, inclusive no Brasil

(KING et al., 1998; WILD et al., 2004). Ambas as doenas instalam-se de maneira

insidiosa, e freqentemente de forma associada, e comprometem tanto a qualidade

quanto expectativa de vida dos pacientes. Diversos estudos epidemiolgicos

apontam a mudana no padro alimentar associado inatividade fsica como os

fatores de risco mais importantes para o desenvolvimento de obesidade e diabetes

(GUSTAT et al., 2002; LAKKA et al., 2003). Estudos transversais em diferentes

populaes mostram que indivduos com intolerncia glicose tm em geral

sobrepeso ou so obesos, resistentes insulina e apresentam nveis insulinmicos

mais elevados. Assim, alteraes na sensibilidade e na secreo de insulina so

anormalidades que se agravam na evoluo de uma situao de tolerncia glicose

para um quadro de intolerncia, resistncia insulina e finalmente DM2

(KOPELMAN, 2000). Como a obesidade constitui-se num fator com relao direta

com resistncia insulina (BRAY, 1973; PERRIELLO et al., 1995; SUZUKI et al.,

2004) e com o desenvolvimento do DM2 (FLIER, 2001; GRIBBLE, 2005; RABE et

al., 2008), inmeras pesquisas vem sendo realizadas com a preocupao de


10/63

9

entender as mais diversas alteraes moleculares que contribuem para a instalao

da resistncia perifrica ao da insulina (ARAJO et al., 2005; SOUZA et al.,

2005a; SOUZA et al., 2005b; PRADA et al., 2006, ROPELLE et al., 2006,).

H muito que a obesidade associada a este tipo de diabetes, isto se deve

a capacidade que a obesidade apresenta em gerar resistncia insulina (FLIER,

2001; TANIGUCHI et al., 2006). Este aspecto caracterstico e fundamental na

etiologia do DM2 (LUCA; OLEFSKY, 2008) que pode inclusive, contribuir para o

aparecimento de outras enfermidades, tais como: hipertenso, hiperlipidemia,

aterosclerose e ovrio polimicrocstico. O termo resistncia insulina denota

resistncia aos efeitos da insulina sobre a captao de glicose, metabolismo e

estoque energtico. A resistncia insulina em obesidade e diabetes mellitustipo II

caracterizada pela diminuio no transporte e metabolismo da glicose dependente

de insulina, em adipcito e msculo esqueltico e pelo prejuzo na supresso da

produo de glicose heptica (FLIER, 2001).

No fgado, a resistncia insulina leva ao aumento da produo heptica de

glicose (DEFRONZO et al., 1992; PERRIELLO et al., 1995; LAM et al., 2003). A

produo heptica de glicose a maior fonte endgena de glicose, durante o jejum,representa 90 por cento do total de glicose liberada (SHAO et al., 2005; Nevado et

al., 2006). Esse mecanismo essencial para a manuteno da homeostase da

glicose no jejum prolongado (SHE et al., 2003). Dessa forma, a sinalizao heptica

da insulina possui um papel central no equilbrio do metabolismo dos carboidratos e

dos lipdios (MATSUMOTO et al., 2006), uma vez que o fgado possui grande

habilidade de produzir glicose durante o jejum e remover glicose da circulao

durante o perodo ps-prandial (SHE et al., 2003; GRIBBLE, 2005; SHAO et al.,2005; NEVADO et al., 2006).

Esta falha da insulina em inibir a produo heptica de glicose uma

caracterstica da resistncia insulina (FISHER; KAHN, 2003) e leva hiperglicemia

ps-prandial, j que a gliconeognese heptica mantm-se estimulada (TANIGUCHI

et al., 2006). Cronicamente, o estado de resistncia heptica insulina, somando-se

a incapacidade das clulas beta pancretica em manter uma adequada secreo de

insulina leva a instalao do (DM2) (ZIMMET et al., 1992; SUZUKI et al., 2004). Em

adio, Ashmore e colaboradores encontraram que no fgado de ratos diabticos


11/63

10

existe um aumento na produo de glicose e uma diminuio da produo de

glicognio e de captao de glicose (ASHMORE et al., 1954). Em indivduos

diabticos, verifica-se que a hiperglicemia e hiperinsulinemia ps-prandial no so

capazes de inibir a produo heptica de glicose e estimular a captao pelo fgado

conduzindo hiperglicemia de jejum verificada no DM2 (ROGNSTAD, 1996;

ALTAMONTE et al., 2003; SHAO et al., 2005 SAMUEL et al., 2006).

Para abordar os mecanismos pelo qual a insulina diminui a produo

heptica de glicose, necessrio inicialmente descrever como a insulina transmite

seu sinal desde seu receptor at os efetores finais.

A insulina um hormnio polipeptdico anablico secretado pelas clulas

beta do pncreas, cuja sntese ativada primariamente pelo aumento dos nveis

circulantes de glicose e modulada tambm por aminocidos, cidos graxos e

estmulos neurais. Uma vez liberada na corrente sangunea, este hormnio age em

diferentes tecidos perifrico, incluindo fgado, msculo esqueltico e tecido adiposo.

Seus efeitos metablicos imediatos incluem: aumento da captao de glicose,

principalmente em tecido muscular e adiposo, sntese de protenas, cidos graxos e

glicognio, bem como bloqueio da produo heptica de glicose, da protelise e daliplise, entre outros (SALTIEL; KAHN, 2001).

A sinalizao intracelular da insulina comea com sua ligao a um receptor

especfico de membrana, uma protena heterotetramrica com atividade quinase,

composta por duas subunidades alfa e duas subunidades beta, denominado

receptor de insulina (IR) (KASUGA, 1982; SALTIEL; KAHN, 2001). A ativao do IR

resulta em fosforilao em tirosina de diversos substratos, incluindo substrato do

receptor de insulina 1 (IRS-1) e 2 (IRS-2) (White, 1998). A fosforilao das protenas

IRSs cria stios de ligao para outra protena citoslica denominada fosfatidilinositol

3-quinase (PI 3-K), promovendo sua ativao. A PI 3-K importante na regulao da

mitogenese, diferenciao celular e efeitos metablicos estimulada pela insulina

(SAAD et al., 1993; SHEPHERD et al., 1998). A PI 3-K foi originalmente identificada

como um dmero composto de uma subunidade cataltica (p110) e uma subunidade

regulatria (p85). A fosforilao dos stios de tirosina das protenas IRSs ao domnio

SH2 da subunidade p85 da PI 3-K ativa o stio cataltico associado (BACKER et al.,

1992; MYERS et al., 1992). A enzima catalisa a fosforilao dos fosfoinositdeos na


12/63

11

posio 3 do anel de inositol produzindo fosfatidilinositol -3 fosfato, fosfatidilinositol

3,4 difosfato e fosfatidilinositol -3,4,5 trifosfato. A ativao da PI -3-q aumenta a

fosforilao em serina da protena quinase B (Akt) (PESSIN; SALTIEL, 2000).

A proteina quinase B, ou Akt, uma serina treonina quinase que possui trs

isoformas (Akt1, Akt2 e Akt3) todas expressas em tecido muscular (DATTA et al.,

1999). Animais deficientes de Akt (Knockout da Akt) demonstraram caractersticas

de diabetes severo, tais como hipertrofia das clulas beta, aumento na produo

heptica de glicose, diminuda homeostase da glicose e exacerbada hiperglicemia. A

protena Akt tem a habilidade de fosforilar e ativar vrios alvos metablicos. A Akt

estimula captao de glicose, sntese de glicognio e de protenas. A Akt possui

outras funes no metablicas, tais como a inibio de apoptose e degradao

protica em msculo esqueltico atravs da fosforilao e inativao da Bad e

fatores de transcrio como a Foxo, respectivamente (OGG et al., 1997).

Figura 1 - Via de sinalizao da insulina.

A Foxo1 foi inicialmente identificada em C elegans como um fator de

transcrio ativado pela insulina e que se localiza distalmente a via da PI 3-K. Este

fator de transcrio fosforilado pela Akt em trs resduos de serina e treonina;

Thr24, Ser256 e Ser319. A fosforilao desses trs stios da Foxo resulta em sua

extruso nuclear e sua consequente inativao (BIGGS et al., 1999; BRUNET et al.,

1999; KOPS et al., 1999; BARTHEL et al., 2001). Tcnicas como o Gel Shift mostrou


13/63

12

que a Foxo1 se liga a sequencia responsiva a insulina no promotor da glicose-6-

fosfatase (G6Pase) e da fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) (Hall et al.,

2000, Schmoll et al., 2000) e a superexpresso da Foxo1 marcadamente aumenta a

expresso endgena da G6Pase (NAKAE, 2001). Por outro lado, a superexpresso

do dominante negativo da Foxo1, resulta em sua no fosforilao pela Akt e

conseqentemente falha em suprimir a transcrio da G6Pase e da PEPCK

(SCHMOLL et al., 2001). Recente trabalho, utilizando a tcnica Knockout, observou

que a Foxo1 controla a homeostase da glicose e da gliconeognese heptica

atravs da via da insulina (NAKAE et al., 2001). Haploinsuficincia da Foxo1

correlaciona com nveis normais de glicose e de insulina sangunea em modelo de

camundongos resistentes insulina, isto se deve em parte a melhora nasensibilidade insulina, que em ltima instncia, leva a diminuio da G6Pase e

PEPCK. Por ltimo, a superexpresso do mutante Foxo1 constitutivamente ativo, no

qual a Foxo1 no ativada pela Akt, ocorre aumento da expresso da G6Pase e da

PEPCK e aumento nas concentraes de glicose sangunea em jejum (NAKAE et

al., 2001).

A produo heptica de glicose em mamferos envolve um nmero de

reaes enzimticas. Na via da gliconeognese a PEPCK altamente expressa no

fgado e uma das enzimas mais importantes (HANSON; GARBER, 1972; She et al.,

2003; SHAO et al., 2005). Diversos fatores mostram-se importantes para a

transcrio e ativao de PEPCK no fgado, alguns estimulantes como Foxo1,

glucagon, glicocorticides e outro inibitrio como a insulina, sendo o papel da

insulina dominante (SASAKI et al., 1984; OBRIEN et al., 1995; SUTHERLAND et al.,

1996; SCOTT et al., 1998; MIYAKE et al., 2002; SHAO et al., 2005). Durante um

jejum prolongado, onde os estoques de glicognio esto exauridos, tem um papel

essencial em converter oxalacetato em fosfoenolpiruvato. No jejum, a atividade

desta enzima aumenta de trs a cinco vezes no fgado (HANSON; GARBER, 1972;

SHE et al., 2003).

Outra enzima gliconeognica, a glicose-6-fosfatase (G6Pase), uma das

enzimas responsveis pela produo heptica de glicose, atravs da converso da

glicose-6-fosfato em glicose. (CORI; CORI, 1952; LANGDON; WEAKLEY, 1955;DANIELE et al., 1999) O jejum aumenta a concentrao e a atividade da G6Pase,


14/63

13

mas a ao da insulina, no perodo ps-prandial, faz com que esses nveis se

normalizem (ASHMORE et al., 1954; DANIELE et al., 1999). Quando a ao da

insulina est prejudicada como na resistncia insulina e no DM2, a atividade desta

enzima encontra-se aumentada no fgado, levando a uma elevao da sntese de

glicose (CLORE et al., 2000). Esta elevao na funo da G6Pase pode ser devido

ao aumento nos nveis enzimticos, pela alterao do potencial cataltico ou pela

combinao dos dois (LANGDON; WEAKLEY, 1955).

Figura 2 - Via gliconeognica

Em estudo acerca de modelos no qual h defeitos na sinalizao da insulina,

controle da PEPCK e G6Pase e consequente desregulao da produo heptica de

glicose, Nevado e colaboradores verificaram que nocaute do IR resulta em

prejudicada tolerncia glicose, hiperinsulinemia e hiperglicemia devido ao aumento

da produo heptica de glicose, resultante de um aumento substancial da

expresso de enzimas gliconeognicas e uma diminuio da expresso de enzimas


15/63

14

glicolticas; a deficincia do IR leva a diminuio de 50% na captao basal de

glicose pelo fgado (NEVADO et al., 2006).

Defeitos na expresso do substrato do receptor de insulina (IRS), por nocauteou inibio parcial, resulta em uma regulao positiva das enzimas gliconeognicas

PEPCK e G6Pase e uma inibio da expresso de enzimas glicolticas, levando ao

aumento do nvel de glicose sangunea (PESSIN; SALTIEL., 2000; SUZUKI et al.,

2004; TANIGUCHI et al., 2006). Quando esse defeito atinge nveis equivalentes ao

fgado de obesos ou diabticos, conduz a uma diminuio (50%) da ativao da Akt

em resposta insulina, a uma diminuio (55%) na fosforilao da Foxo1 e a uma

regulao positiva (2 vezes) de genes gliconeognicos, o que leva a uma

inapropriada produo heptica de glicose (TANIGUCHI et al., 2006).

Um bloqueio da ativao da PI 3-K realizado atravs de bloqueadores da

ao da mesma como wortaminnin e LY-294002 ou ainda pela expresso de seu

dominante negativo inibe a fosforilao da Akt e a captao de glicose estimulada

pela insulina e previne o efeito inibitrio da insulina na expresso de PEPCK e

G6Pase (BAND; POSNER, 1997; UEKI et al., 1998; MIYAKE et al., 2002),

mostrando que a PI 3-K contribui para a regulao destes genes in vivo (MIYAKE etal., 2002). Em adio, camundongos ob/ob apresentam hiperglicemia e

hiperinsulinemia de jejum, ps-prandial e ps-absortiva e intolerncia glicose,

devido em parte pela reduzida capacidade da PI 3-K fosforilar a Akt (MIYAKE et al.,

2002).

Conforme explanado anteriormente, a Akt ou protena quinase B (PKB)

uma serina/treonina quinase e compreende 3 isoformas PKB alfa, beta e gama ou

Akt 1, 2 e 3 que so expressas em diversos tecidos e contribuem para diversos

processos biolgicos que resultam em efeitos anti-apoptose ou a favor da

proliferao celular (IYNEDJIAN, 2005). As isoformas Akt1 e Akt2 so amplamente

expressas no crebro, timo, corao e pulmo, j a expresso da isoforma gama

mais encontrada no crebro e testculos e em expresso menor no corao, bao,

pulmo e msculo esqueltico (COFFER et al., 1998). A isoforma PKB beta (Akt1)

principalmente ativada pela insulina no fgado e no msculo esqueltico

(SHEPHERD et al., 1998). Este papel fisiolgico da Akt inclui seu envolvimento no

metabolismo dos nutrientes, crescimento celular, regulao transcricional, regulao


16/63

15

e sobrevivncia celular, possuindo funo central na via de sinalizao da insulina

(DOWNWARD, 1998; CHEN et al., 2001; FAYARD, 2005; IYNEDJIAN, 2005; SONG

et al., 2005; KATO; DU, 2007).

A expresso total de Akt no afetada pelo jejum nem pela re-alimentao, j

a fosforilao da mesma sofre uma regulao positiva durante uma re-alimentao e

uma regulao negativa quando a ao da insulina est diminuda como no jejum ou

em uma falha na via de sinalizao (BOURGERING; MEDEMA, 2003; NAKASHIMA

et al., 2006). Vrias molculas inibitrias agem sobre e afetam a ao da Akt, como

a TRB3, e que podem levar a resistncia insulina.

A TRB3 pertence a uma nova famlia de protenas constituda de 3 membros

(TRB1, TRB2 e TRB3) e que esto associadas a numerosas protenas incluindo

fatores de transcrio, protenas quinases como tambm a Ubiquitina E3 ligase. Por

interagir com fatores diferentes as TRBs regulam um grande nmero de processos

biolgicos incluindo crescimento celular, diferenciao e metabolismo. A TRB1

interage com MAPK modulando sua atividade quinase implicando na proliferao de

clulas musculares (SUNG et al., 2007). A TRB2 interage com os fatores de

transcrio C/EBP e por isso est implicada na diferenciao dos adipcitos (NAIKIet al., 2007). A isoforma TRB3 surge como um importante alvo de estudos por

desempenhar um papel de destaque na regulao do sinal da insulina atravs da

inibio da fosforilao da quinase Akt (DU et al., 2003; IYNEDJIAN, 2005;

Matsumoto et al., 2006; KATO; DU, 2007). O polimorfismo humano da TRB3 (Q84R)

leva a marcante inibio da atividade da Akt e est relacionado resistncia

insulina e aumentado risco cardiovascular (PRUDENTE et al., 2005).

No fgado a expresso de TRB3 induzida durante o jejum com o objetivo de

reduzir o sinal da insulina em um momento no qual a oferta de nutrientes no

abundante, evitando que o organismo alcance um estado de hipoglicemia

(MATSUMOTO et al., 2006; MATSUSHIMA et al., 2006; KATO; DU, 2007). Aps

refeio, quando os nveis circulantes de insulina esto aumentados, verifica-se

reduo de cinquenta por cento na expresso de TRB3 (MATSUSHIMA et al., 2006).

Nveis proticos elevados de TRB3 e maior associao de TRB3 e Akt pode estar

relacionado a resistncia insulina e consequentemente diabetes (DU et al., 2003;

IYNEDJIAN, 2005; MATSUSHIMA et al., 2006).


17/63

16

No fgado diabtico a expresso da TRB3 est aumentada independente do

excesso de nutrientes ou hiperinsulinemia levando a defeito na sntese de glicognio

mediada pela insulina, conduzindo hiperglicemia (DU et al., 2003; IYNEDJIAN,

2005; Matsumoto et al., 2006; MATSUSHIMA et al., 2006; KATO; DU, 2007),

demonstrando sua atividade em inibir a fosforilao da Akt e impedindo as

atividades estimuladas pela insulina como o efeito inibitrio na produo heptica de

glicose e a inativao de fatores e transcrio como a Foxo1 (DU et al., 2003;

MATSUSHIMA et al., 2006). Em sentido contrrio, uma inibio na atividade da

TRB3 eleva a fosforilao de Akt em resposta insulina no fgado (DU et al., 2003;

MATSUSHIMA et al., 2006; KATO; DU 2007). No entanto, nenhum estudo at o

momento tem investigado os efeitos do exerccio fsico sobre a expresso da TRB3nem em modelo animal de diabetes, muito menos em humanos.

A atividade fsica surge como uma importante opo de tratamento no

farmacolgico da obesidade e seus distrbios metablicos como o diabetes mellitus

tipo 2 (MANSON et al., 1992; RICE et al., 1999; TUOMILEHTO et al., 2001;

CASTANEDA et al., 2002; CIOLAC; GUIMARES, 2004; RIBEIRO et al., 2004;

ROPELLE et al., 2005; PAULI et al., 2008), por melhorar a sensibilidade insulina

independente da reduo de peso ou composio corporal (GOODYEAR; KAHN,

1998; BASSUK; MANSON, 2005; ODONOVAN, 2005).

O mecanismo molecular pelo qual o exerccio aumenta a captao de glicose

mediada pela insulina pode ser parcialmente explicado pelo aumento da expresso

e atividade de protenas chave na regulao do metabolismo da glicose no msculo

esqueltico (HOUMARD et al., 1999; CHIABALIN et al., 2000; AOI et al., 2004;

ROPELLE et al., 2006; PAULI et al., 2008). Porm, estudo acerca dos mecanismosmoleculares envolvidos na melhora da resistncia heptica insulina no tem sido

realizado.

Muitos estudos transversais e de interveno demonstram uma relao direta

entre a atividade fsica e a sensibilidade insulina (HOLLOSZY et al., 1986;

MORGADO; SCHNEIDER, 1995; LAKKA et al., 2003) e esta melhora pode ser

alcanada tanto por atividades aerbias quanto por atividades anaerbias, existindo

tanto um efeito agudo (CIOLAC; GUIMARES, 2004; FLORES et al., 2006;

ROPELLE et al., 2006; PAULI et al., 2008) quanto um efeito crnico sobre a


18/63

17

sensibilidade insulina (LUCIANO et al., 2002; PERSEGHIN et al., 1996).

Entretanto, esta melhora revertida em um curto espao de tempo, sugerindo que

grande parte deste efeito esteja relacionado ltima sesso (HOUMARD et al.,

1999; HOLLOSZY, 2005).

Diante do exposto, parece que a relao entre a via da insulina e o controle

das principais enzimas gliconeognicas tem seu elo na Akt e no fator de transcrio

(Foxo1). Estes controlam a expresso de tais enzimas e, por sua vez, so

controlados pela via da insulina. Sendo assim, parece provvel que o exerccio fsico

ao melhorar a resistncia heptica a insulina tende a exercer modulao negativa na

produo heptica de glicose. Por ltimo, esses resultados mostrariam um novo

mecanismo molecular e acrescentaria maior conhecimento acerca dos benefcios da

pratica de atividade fsica regular para portadores de obesidade e diabetes tipo 2.


19/63

18

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Avaliar o papel do exerccio fsico sobre a expresso da protena TRB3 e

sobre a produo de glicose em fgado de camundongos diabticos.

2.2 Especficos

a) Avaliar a expresso da TRB3 em tecido heptico de camundongos ob/ob.

b) Avaliar o envolvimento da TRB3 na sinalizao das vias PI3K/Akt e sua

participao na resistncia heptica insulina.

c) Avaliar a capacidade do exerccio fsico agudo em inibir a TRB3 e

consequentemente a resistncia heptica ao da insulina.

d) Avaliar os efeitos do exerccio fsico sobre a associao da TRB3/Akt e

consequentemente a fosforilao da Foxo1.

e) Avaliar os efeitos do exerccio fsico sobre a expresso da PEPCK e G6Pase

e indiretamente a produo heptica de glicose.


20/63

19

3 MATERIAIS E MTODOS

3.1 Animais experimentais

Foram usados no experimento trs (03) tipos de camundongos machos:

Swiss, provenientes do Centro de Reproduo Animal da Universidade Estadual de

Campinas; deficientes em leptina (ob/ob) e camundongos controle (ob/?),

importados dos Laboratrios Jackson (Bar Harbor, ME). Todos com quatro (04)

semanas de vida.

Os camundongos Swiss foram divididos em trs (03) grupos distintos: o

grupo controle (lean), que foi alimentado com rao padro para roedores; o grupo

obeso (DIO), alimentado com uma dieta rica em gordura por dois (02) meses; e o

grupo (DIO+EXE) alimentado com uma dieta rica emgordura mas submetido ao

exerccio agudo. Os camundongos (ob/ob) foram divididos em dois grupos, ambos

com alimentao padro para roedores: (ob/ob) apenas alimentados e AE,

submetidos ao exerccio agudo. Estes ltimos foram camparados ao grupo padro

(lean) formados pelos camundongos (ob/?).

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comit de tica em Pesquisa

da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).

Os camundongos foram guardados em gaiolas individuais, com a

temperatura controlada em (281C) e sujeitos a um ciclo claro/escuro (06h00 s

18h00 e 18h00 s 06h00) com alimentao e gua ad libitium.

3.2 Protocolo de exerccios

O protocolo de natao empregado j foi descrito previamente (RYDER et

al., 1999). Oito (08) animais nadaram juntos em um continer com quarenta e cinco

(45) centmetros de dimetro e a temperatura da gua foi mantida entre (32-33C).

Os camundongos foram aclimatados natao por dez (10) minutos por dois (02)

dias consecutivos.


21/63

20

Durante o protocolo os camundongos nadaram quatro (04) perodos de trinta

(30) minutos com cinco (05) minutos de descanso entre cada perodo, totalizando

duas (02) horas de natao. Aps o protocolo agudo de exerccio os animais foram

alimentados ad libitium por duas (02) horas com a alimentao sendo retirada seis

(06) horas antes da extrao dos tecidos.

3.3 Extrao de tecidos

Oito (08) horas aps o protocolo de exerccios os camundongos foram

anestesiados com uma injeo intraperitoneal de tiopental sdico (40 mg/kg de peso

corporal). Seguindo os procedimentos experimentais os camundongos foram mortossob anestesia (tiopental 200 mg/kg) de acordo com a srecomendaes da

publicao NIH n 85-25.

3.4 Glicose de jejum, teste de tolerncia insulina (ITT), quantificao de

insulina srica e contedo de glicognio

Aps o protocolo de exerccios os camundongos foram submetidos ao ITT

(1,5 U/kg de peso corporal de insulina) aps seis horas de jejum. As amostras de

sangue foram colhidas em 0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos do rabo para a

determinao da glicose srica. A taxa constante de desaparecimento da glicose

plasmtica (Kitt) foi calculada usando ao frmula 0,693/meia vida biolgica (t1/2). A

meia vida da glicose plasmtica foi de acordo com (BONORA, et al., 1989). A glicose

plasmtica foi determinada atravs de um glicosmetro (Advantage, Boehringer

Mannheim, USA).

O plasma foi separado por centrifugao (1500g) por quinze (15) minutos a

quatro graus centgrados (04C) e estocado a (-80C) at ser analisado.

A anlise da insulina srica foi realizada como descrita por (SCOTT, 1981) e

o contedo de glicognio no fgado foi medido de acordo com o mtodo descrito por

(PIMENTA, 1989).

3.5 Anlise de protenas por Immunoblotting


22/63

21

Aps serem anestesiados a cavidade abdominal dos animais foi aberta, a

veia cava exposta e injetado 0,1 ml de soluo salina ou insulina. Aps a injeo o

tecido heptico foi extrado. Este tecido foi picado e homogenizado em buffer de

extrao (mM) (1% Triton-X 100, 100 Tris, pH 7.4, contendo 100 pirofosfato de

sdio, 100 fluoreto de sdio, 10 EDTA, 10 vanadato de sdio, 2 PMSF e 0.1 mg de

aprotinina/ml) a quatro graus centgrados (04C) por um Polytron PTA 20S generator

(Brinkmann Instruments, model PT 10/35) operado a mxima velocidade por trinta

(30) segundos.

Este extrato foi centrifugado a onze mil (11000) rpm e quatro graus

centgrados (04C) em um Beckman 70.1 Ti rotor (Palo Alto, CA) por quarenta (40)

minutos para remover o material insolvel. O sobrenadante foi utilizado para a

quantificao de protenas pelo mtodo de Bradford (BRADFORD, 1976).

As protenas foram desnaturadas por ebulio em Laemmli (LAEMMLI,

1970) e amostras contendo 100 mM DTT correram em SDS-PAGE e foram

transferidas para membranas de nitrocelulose. As membranas foram tratadas como

descrito em (SOUZA et al., 2005). Para a immunoblotting foram usados anticorpos

anti-phospho-Akt, anti-PEPCK, anti-phospho-Foxo1 da (Cell Signaling Technology,MA), anti-Akt, anti-Foxo1, anti-TRB3 e anti- -actin (Santa Cruz Biotecnology, Inc,

CA). A intensidade das bandas foram quantificadas por densitometria ptcia

utilizando (Scion Image software, ScionCorp, Frederick, MD).

3.6 Anlise estatstica

Os resultados foram expressos em mdia desvio padro (DP). As

diferenas entre os grupos controle e os camundongos que no realizaram o

protocolo de exerccios foram avaliadas usando a anlise de varincia one-way

(ANOVA), Quando a ANOVA indicava significncia era realizado o teste de post hoc

de Bonferroni.


23/63

22

4 RESULTADOS

4.1 Parmetros fisiolgicos e metablicos

A tabela um (01) mostra um comparativo de dados referentes aos grupos

lean, (ob/ob) e AE. Os camundongos ob/ob quando comparados aos lean tiveram

um aumento do peso corporal, gordura epididimal, insulina srica em jejum e glicose

em jejum. No encontramos variao significante no peso corporal, gordura

epididimal e insulina srica em jejum ao compararmos os grupos ob/ob e AE, porm,

a glicose em jejum foi reduzida em sessenta e cinco porcento (65%) aps oito horasdo protocolo de exerccios.

A tabela dois (02) compara os dados entre os grupos controle (lean), DIO e

DIO+EXE. Os camundongos DIO quando comparados aos lean tiveram um aumento

do peso corporal, gordura epididimal, insulina srica em jejum e glicose em jejum.

No encontramos variao significante no peso corporal, gordura epididimal e

insulina srica em jejum ao compararmos os grupos DIO e DIO+EXE, embora o

exerccio reverteu a hiperglicemia de jejum do grupo DIO.

4.2 O exerccio agudo melhora o sinal da insulina no fgado de camundongos

ob/ob e DIO

A insulina induziu o aumento da fosforilao da Akt em serina de cinco (05)

vezes no fgado de camundongos DIO e de trs vrgula duas (3,2) vezes no fgado

de camundongos ob/ob, quando comparada injeo de soluo salina (Figuras 1Ae 1C respectivamente). Em ambos os grupos (DIO e ob/ob) a fosforilao de Akt em

serina foi reduzida quando comparada ao grupo controle (Figuras 1A e 1C

respectivamente). No fgado dos camundongos dos grupos DIO+EXE e AE houve

um aumento da fosforilao da Akt em serina de respectivamente uma vrgula oito

(1,8) e dois vrgula seis (2,6) vezes quando comparados aos grupos DIO e ob/ob

respectivamente. Os nveis de Akt encontrados no eram diferentes entre os grupos.

A insulina induziu um aumento na fosforilao da Foxo1 no fgado dos

camundongos de quatro vrgula cinco (4,5) vezes no grupo DIO e de dez vrgula trs


24/63

23

(10,3) vezes no grupo ob/ob quando comparada injeo de soluo salina (Figura

1B e 1D respectivamente). Em ambos os grupos (ob/ob e DIO) a fosforilao de

Foxo1 foi reduzida em duas vrgula duas (2,2) vezes (DIO) e quatro vrgula duas

(4,2) vezes (ob/ob) aps a injeo de insulina quando comparada ao grupo controle

(Figuras 1B e 1D respectivamente). No fgado dos grupos DIO+EXE e AE ocorreu

um aumento na fosforilao da Foxo1 de um vrgula cinco (1,5) e trs vrgula uma

(3,1) vezes ao se comparar com os grupos DIO e ob/ob. No foram encontradas

diferenas nos nveis de protena Foxo1 entre os grupos.

4.3 O exerccio agudo suprime a expresso da TRB3 no tecido heptico de

camundongos ob/ob

A expresso de TRB3 foi determinada no tecido heptico de dois animais

modelos. Os fgados foram bloqueados com anti-TRB3.

Quando comparados aos grupos controles respectivos a expresso de TRB3

aumentou em uma vrgula cinco (1,5) e trs vrgula oito (3,8) vezes no fgado dos

camundongos DIO e ob/ob. Embora, aps uma nica sesso aguda de exerccio a

expresso de TRB3 tenha sido reduzida em uma vrgula cinco (1,5) e duas (2) vezes

nos fgados do grupo DIO+EXE e AE quando comparados aos grupos DIO e ob/ob

(Figura 2A e 2C respectivamente).

O fgado foi imunoprecitado com anticorpos anti-Akt e bloqueado com

anticorpos anti-TRB3. Encontramos uma associao Akt/TRB3 duas vrgula quatro

(2,4) e duas vgula cinco (2,5) vezes maior nos fgado dos camundongos dos grupos

DIO e ob/ob quando comparados com seus respectivos controles. Inversamente, a

associao Akt/TRB3 diminuiu uma vrgula uma (1,1) e uma vrgula seis (1,6) vezes

no fgado do camundongos DIO+EXE e Aequando comparados aos grupos DIO e

ob/ob (Figura 2B e 2D). Os nveis totias de Akt no diferiram entre os grupos.

4.4 O exerccio agudo reduz a expresso heptica de PEPCK de

camundongos DIO e ob/ob


25/63

24

Observamos tambm a expresso de PEPCK heptico nos dois modelos

sob condies de jejum. O tecido heptico extrado foi bloqueado com anticorpos

anti-PEPCK.

Nos tecidos extrados dos camundongos dos grupos DIO e ob/ob ocorreu

um aumento da expresso de PEPCK de uma vrgula quatro (1,4) e duas vrgula trs

(2,3) vezes respectivamente, quando comparados aos grupos controle e, oito (08)

horas aps a sesso aguda de exerccios os nveis de PEPCK diminuram nos

grupos DIO+EXE e AE uma vrgula uma (1,1) e uma vrgula seis (1,6) vezes quando

comparados aos grupos DIO e ob/ob (Figura 3A e 3D).

Apesar da absoro heptica de glicose ser independente da ao da

insulina este hormnio regula fortemente a gliconeognese heptica e por isso

resolvemos avaliar o contedo de glicognio. Nos camundongos DIO e ob/ob o

contedo de glicognio foi reduzido emuma vrgula cinco (1,5) e duas vrgula trs

(2,3) vezes quando comparados a seus respectivos controles. J no fgado dos

camundongos dos grupos DIO+EXE e AE o contedo de glicognio aumentou

quando comparado aos grupos DIO e ob/ob em uma vrgula trs (1,3) e uma vrgula

sete (1,7) vezes.

Finalmente ns observamos uma diminuio na sensibilidade insulina nos

grupos DIO e ob/ob, com um significante prejuzo de sessenta e cinco porcento

(65%) e cinquenta e cinco porcento (55%) na taxa de desaparecimento da glicose

(Kitt), quando comparados seus grupos controle. J o exerccio agudo melhorou

em trinta e nove porcento (39%) e quarenta e dois porcento (42%) a taxa de

desaparecimento da glicose nos grupos AE e DIO+EXE.


26/63

25

5 DISCUSSO

Ao longo dos ltimos anos, temse realizado um grande esforo para avaliar

o papel fisiolgico dos componentes da via de sinalizao da insulina na regulao

da homeostase da glicose. O mecanismo molecular da melhora da sensibilidade

insulina atravs o exerccio fsico pode ser pelo aumento da expresso e/ou ativao

de protenas chave, que regulam o metabolismo da glicose (HOUMARD et al., 1999;

CHIBALIN et al., 2000; ROPELLE et al., 2006; PAULI et al., 2008). A partir da

observao que a via IR/IRS-1/PI 3-K est envolvida na produo heptica de

glicose (KIM et al., 2001), ns sugerimos que o exerccio fsico, aps uma nica

sesso de exerccios reverte parcialmente a resistncia heptica insulina de

camundongos diabticos. No presente estudo, ns demonstramos que uma nica

sesso de exerccios melhora a glicemia de jejum em camundongos diabticos. Oito

horas aps uma sesso de exerccios, a expresso de TRB3 est suprimida no

fgado de camundongos deficientes em leptina. Este fenmeno acompanhado por

um aumento na sensibilidade insulina no fgado, resultando em uma reduo na

produo heptica de glicose no estado alimentado.

A produo heptica de glicose tem um papel central na homeostase da

glicose. Aps a ingesto de uma refeio rica em carboidratos, a produo heptica

de glicose prontamente suprimida para limitar a excurso ps-prandial de glicose,

enquanto que em resposta ao jejum, a produo heptica aumenta, acompanhada

pela diminuio da utilizao perifrica da glicose. Como a glicose heptica a

maior fonte endgena de glicose, esta produo de glicose tem um papel

fundamental em contrabalancear a hipoglicemia e manter os nveis de glicose

sangunea em uma taxa normal (para reviso ver Postic et al., 2004). A no

supresso heptica de glicose devido a uma deficincia ou uma insuficincia de

insulina um fator contribuinte para a patognese da hiperglicemia ps-absortiva no

diabetes tipo 1 e tipo 2 (ROGNSTAD, 1996; ALTOMONTE et al., 2003; SAMUEL et

al., 2006).

Um mecanismo molecular que pode mediar a resistncia insulina areduo da atividade da Akt induzida pela expresso de TRB3. A TRB3 foi reportada


27/63

26

como um supressor da atividade da Akt, predominantemente em condies de jejum

e diabetes (Du et al., 2003). As TRBs encontram-se consistentemente associadas

com varias protenas incluindo fatores de transcrio, protenas quinases como

tambm a ubiquitina E3 ligase. Por interagir com diferentes fatores, as TRBs

regulam um grande nmero de processos biolgicos incluindo o crescimento celular,

diferenciao e metabolismo. A TRB3 interage com a Akt e inibe sua ativao. Tanto

no fgado (Du et al., 2003; Koo et al., 2004; Matsushima et al., 2006) quanto no

msculo (Koh et al., 2006), a diminuio da expresso da TRB3 resulta em maior

sensibilidade insulina, melhorando assim a tolerncia glicose. Em adio, o

polimorfismo humano da TRB3 (Q84R), que possui uma grande capacidade em

inibir a Akt altamente associado com a resistncia insulina e riscoscardiovasculares (Prudente et al., 2005).

O papel da TRB3 na ativao da Akt tem sido estudado em diferentes

contextos. Tanto no fgado quanto no msculo de ratos, o aumento da expresso de

TRB3 est associado a reduzida ativao da Akt (DU et al., 2003; MATSUSHIMA et

al., 2006; KOH et al., 2006); e uma associao similar foi observada em hepatcitos

primrios (MATSUSHIMA et al., 2006). A TRB3 funciona como um modulador

negativo da Akt e sua expresso induzida no fgado sob condies de jejum,

interrompendo o sinal da insulina por sua ligao direta com a Akt, bloqueando a

ativao da mesma. A quantidade de RNAm e da protena TRB3 est aumentada no

fgado de camundongos diabticos ob/ob quando comparados com camundongos

padro (DU et al., 2003). Uma superexpresso heptica de TRB3 em taxas

comparveis aos de camundongos db/db promovem hiperglicemia e intolerncia

glicose (DU et al., 2003). Diversos autores tm sugerido que, pela interferncia com

a ativao da Akt, a TRB3 contribui para a resistncia insulina em indivduos com

susceptibilidade para o diabetes tipo 2.

Em nossos estudos encontramos que a expresso de TRB3 est

aumentada no fgado de camundongos deficientes em leptina e em camundongos

com obesidade induzida pela dieta. No presente estudo observamos que uma nica

sesso de exerccios inibe a expresso de TRB3 no fgado de camundongos

diabticos. Recentemente foi reportado que uma sesso de exerccios fsicos reduza atividade da protena tirosina fosfatase 1B (PTP1B) e a fosforilao em serina da


28/63

27

IRS-1 (dois mecanismos moleculares que mediam a resistncia insulina),

restaurando a sensibilidade insulina no msculo gastrocnmio de ratos com

obesidade induzida pela dieta (DIO) (ROPELLE et al., 2006), o papel do exerccio

agudo na atividade da PTP1B e na fosforilao em serina do IRS-1 no tecido

heptico no foi investigada e poderia estar envolvida na melhora do sinal da

insulina, mas este mecanismo continua incerto e merece mais investigaes.

No tecido heptico a resistncia insulina relatada como uma reduo da

fosforilao em tirosina do IR e outros substratos (MICHEAL et al., 2000;

PAGLIASSOTI et al., 2002) alm de um aumento na gliconeogenese e liberao

heptica de glicose (BODEN et al., 2001), como resultado da menor inibio da

G6Pase e da PEPCK (KOTANI et al., 1999; CHI et al., 2007). Por outro lado, o

exerccio tem demonstrado melhorar a ao da insulina no fgado (GAO et al., 1994).

O exerccio fsico melhora a resposta ao sinal da insulina em Psammomys

obesus propenso diabetes por inibir a atividade da PEPCK (HELED et al., 2004).

Em adio, o exerccio agudo aumenta a responsividade para a captao de glicose

e a habilidade da insulina em suprimir a produo heptica de glicose em ratos

SHHF/Mcc-facp (GAO et al., 1994). Distal a via da PI 3-K, a Foxo1 um importantefator de transcrio que modula a expresso de genes gliconeognicos no ncleo

(AOYAMA et al., 2006). Quando fosforilada em resposta insulina a Foxo1 se

transloca para o citoplasma e reduz a transcrio de genes gliconeognicos. Ns

observamos altos nveis de PEPCK no fgado de camundongos ob/ob e Swiss

obesos e, estes dados esto de acordo com diversos estudos em camundongos

com resistncia insulina (MICHAEL et al., 2000; XU et al., 2003).

Nossos dados fornecem evidncias de que o exerccio agudo melhora a

ao da insulina; aumenta a fosforilao da Foxo1 no fgado, conduzindo a uma

reduo da expresso heptica de PEPCK em camundongos ob/ob. Coletivamente,

nossos resultados demonstram que uma nica sesso de exerccio melhora o

metabolismo da glicose em jejum em camundongos diabticos por reverter a

resistncia heptica insulina. O efeito do exerccio na ao da insulina suportado

por nossos achados de que camundongos exercitados mostram uma reduo na

expresso da TRB3, um mecanismo pela qual o exerccio pode diminuir a produo

heptica de glicose. Estes resultados proporcionam novos conhecimentos a cerca


29/63

28

dos mecanismos pelos quais o exerccio fsico melhora a homeostase da glicose no

diabetes tipo 2, principalmente na hiperglicemia de jejum.


30/63

29

6 CONCLUSO

Os resultados mostram que o exerccio fsico agudo diminui a expresso da

TRB3 e a associao TRB3/Akt, aumentando a sensibilidade insulina e regulando

a produo heptica de glicose, conduzindo a uma melhora do perfil glicmico em

camundongos obesos deficientes em leptina e em camundongos com obesidade

induzida pela dieta.

O exerccio fsico refora-se como uma alternativa no farmacolgica no

combate e preveno da hiperglicemia.


31/63

30

REFERNCIAS

Altomonte J, Richter A, Harbaran S, Suriawinata J, Nakae J, Thung SN, et al.Inhibition of foxo1 function is associated with improved fasting glycemia in diabeticmice. Am J Physiol Endocrinol Metab2003;285(4):E718-28.

Aoi W. Effect of exercise on hepatic gene expression in rats: a microarray analysis.Life Sci2004;75(26):3117-28.

Aoyama H, Daitoku H, Fukamizu A. Nutrient control of phosphorylation andtranslocation of foxo1 in C57BL/6 and db/db mice.Int J Mol Med2006;18:433-9.

Arajo EP, Souza CT, Gasparetti AL, Ueno M, Boschero AC, Saad MJ, et al. Short-term in vivo inhibition of insulin receptor substrate-1 expression leads to insulinresistance, hyperinsulinemia, and increased adiposity. Endocrinology2005;146(3):1428-37.

Ashmore J, Hastings AB, Nesbett FB. The effect of diabetes and fasting on liverglucose-6-phosphatase. Proc Natl Acad Sci USA1954;40(8):673-8.

Backer JM, Myers MG Jr, Shoelson SE, Chin DJ, Sun XJ, Miralpeix M.

Phosphatydilinositol 3-kinase is activated by association with irs-1 during insulinstimulation. EMBO J 1992;11(9):3469-79.

Band CJ, Posner BI. Phosphatidilinositol 3-kinase and p70s6k are required forinsulin but not bisperoxovanadium 1,10-phenanthroline (bpV(phen) inhibition ofinsulin-like growth factor binding protein gene expression: evidence for MEK-independent activation of mitogen-activated protein kinase by bpV(phen). J BiolChem 1997;272(1):138-45.

Barthel A, Schmoll D, Krger KD, Bahrenberg G, Walther R, Roth RA, et al.Diferential regulation of endogenous glucose-6-phosphatase andphosphoenolpyruvate carboxykinase gene expression by the forkhead transcriptionfactor FKHR in H4IIE hepatoma cells. Biochem Biophys Res Commun2001;285(4):897-902.

Bassuk SS, Manson JE. Epidemiological evidence for the role of physical activity inreducing risk of type 2 diabetes ad cardiovascular disease. J Appl Physiol2005;99(3):1193-204.

Biggs WH 3rd, Meisenhelder J, Hunter T, Cavenee WK, Arden KC.Protein kinaseB/Akt-mediated phosphorylation promotes nuclear exclusion of the winged helixtranscription factor FKHR1. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96(13):7421-6.


32/63

31

Boden G, Chen X, Stein TP; Gluconeogenesis in moderately and severelyhyperglycemic patients with type 2 diabetes mellitus. Am J Physiol EndocrinolMetab2001;280:23-30.

Burgering BM, Medema RH; Decisions on life and death: foxo forkhead transcriptionfactors are in command when PKB / AKT is off duty. J Leukoc Biol2003;73(6):689-701.

Bray GA.New developments in diabetes obesity and insulin resistance. Calif Med1973;119(4):22-6.

Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS, et al. AKT promotes cellsurvival by phosphorylating and inhibiting a forkhead transcription factor. Cell Press1999;96(6):857-68.

Castaneda C, Layne JE, Munoz-Orians L, Gordon PL, Walsmith J, Foldvari M, et al.A randomized controlled trial of resistance exercise training to improve glycemiccontrol in older adults with type 2 diabetes. Diabetes Care2002;25(12):2335-41.

Chen R, Kim O, Yang J, Sato K, Eisenmann KM, McCarthy J, et al. Regulation ofAKT / PKB activation by tyrosine phosphorylation. J Biol Chem 2001;276(34):31858-62.

Chi TC, Chen WP, Chi TL, Kuo TF, Lee SS, Cheng JT, et al. Phosphatidylinositol-3-

kinase is involved in the antihyperglycemic effect induced by resveratrol instreptozotocin-induced diabetic rats. Life Sci2007;80:1713-1720.

Chibalin AV, Yu M, Ryder JW, Song XM, Galuska D, Krook A, et al. Exercise-inducedchanges in expression and activity of proteins involved in insulin signal transductionin skeletal muscle: differential effects on insulin-receptor substrates 1 and 2. ProcNatl Acad Sci USA2000;97(1):38-43.

Ciolac EG, Guimares GV; Exerccio fsico e sndrome metablica. Rev Bras MedEsporte2004;10(4):319-24.

Clore JN, Stillman J, Sugerman H. Glucose-6-phosphatase flux in vitro is increasedin type 2 diabetes. Diabetes2000;49(6):969-74.

Coffer PJ; Jin J; Woodgett JR; Protein kinase B (c-AKT): a multifunctional mediator ofphoshatidylinositol 3-kinase activation. Biochemical J1998;335 (Pt 1):1-13.

Cori GT, Cori CF Glucose 6-phosphatase of the liver in glycogen storage. J BiolChem1952;199(2):661-7.

Daniele N, Rajas F, Payrastre B, Mauco G, Zitoun C, Mithieux G.Phosphatidylinositol 3-kinase translocates onto liver endoplasmic reticulum and may


33/63

32

account for the inhibition of glucose-6-phosphatase during refeeding. J Biol Chem1999;274(6):3597-601.

Datta SR, Brunet A, Greenberg ME.Cellular survival: a play in three Akts. Genes Dev

1999;13(22):2905-27.

De Luca C, Olefsky JM; Inflammation and insulin resistance. FEBS Lett2008;582(1):97-105.

Defronzo RA, Bonadonna RC, Ferrannini E. Pathogenesis of NIDDM. A balancedoverview. Diabetes Care1992;15(3):318-68.

Downward J, Mechanism and consequences of activation of protein kinase/B AKT.Curr Opin Cell Biol1998;10(2):262-7.

Du K, Herzig S, Kulkarni RN, Montminy M. TRB3: a tribbles homolog that inhibitsAkt/PKB activation by insulin in liver. Science2003;300(5625):1574-7.

Fayard E, Tintignac LA, Baudry A, Hemmings BA. Protein kinase B/AKT at glance. JCell Sci2005;118(Pt 24):5675-8.

Filozof C, Gonzalez C, Sereday M, Mazza C, Braguinsky J. Obesity prevalence andtrends in Latin-American countries. Obesity Review2001;2(2):99-106.

Fisher SJ, Kahn CR,Insulin signaling is required for insulin's direct and indirectaction on hepatic glucose production.J Clin Invest2003;111(4):463-8.

Flier JS. Diabetes. The missing link with obesity? Nature 2001;409(6818):292-3.

Flores MB, Fernandes MF, Ropelle ER, Faria MC, Ueno M, Velloso LA, et al.Exercise improves insulin and leptin sensitivity in hypothalamus of wistar rats.Diabetes2006;55(9):2554-61.

Freire RP, Guimares RM, Henriques RL, Mauro MY. Integrated curriculum of theState University of Rio de Janeiro (UERJ) nursing school: reflection on humanresource training for the Brasilian public health system (SUS). Rev Bras Enferm.2003;56(4):381-4.

Gao J, Sherman WM, McCune SA, Osei K. Effects of acute running exercise onwhole body insulin action in obese male SHHF/Mcc-facp rats. J Appl Physiol1994;77:534-41.

Goodyear LJ, Kahn BB. Exercise glucose transport, and insulin sensitivy. Annu Rev

Med1998;49:235-61.

Gribble FM. Metabolism: a higher power for insulin. Nature2005;434(7036):965-6.


34/63

33

Gustat J, Srinivasan SR, Elkasabany A, Berenson GS. Relation of self-ratedmeasures of physical activity to multiple risk factors of insulin resistance syndrome inyoung adults: the Bogalusa Heart study. J Clin Epidemiol2002;55(10):997-1006.

Hall RK, Yamasaki T, Kucera T, Waltner-Law M, O'Brien R, Granner DK. Regulationof phosphoenolpyruvate carboxykinase and insulin-like growth factor-binding protein-1 gene expression bu insulin:the role of winged helix / forkhead proteins. J BiolChem2000;275(9):30169-75.

Hanson RW, Garber AJ.Phosphoenolpyruvate carboxikinase:its role ingluconeogenisis. Am J Clin Nutr1972;25(10):1010-21.

Heled Y, Shapiro Y, Shani Y, Moran DS, Langzam L, Barash V. Physical exerciseenhances hepatic insulin signaling and inhibits phosphoenolpyruvate carboxykinase

activity in diabetes-prone psammomys obesus. Metabolism2004;53:836-41.

Holloszy JO, Schultz J, Kusnierkiewicz J, Hagberg JM, Ehsani AA. Effects ofexercise on glucose tolerance and insulin resistance. Acta Med Scand Suppl1986;711:55-65.

Holloszy JO.Exercise-induced increase in a muscle insulin sensitivity. J ApplPhysiol2005;99(1):338-43.

Houmard JA, Shaw CD, Hickey MS, Tanner CJ.Effect of short-term exercise training

on insulin-stimulated PI 3-kinase activity in human skeletal muscle. Am J Physiol277(6 Pt 1):1999;1055-60.

Iynedjian P. Lack of evidence for a role of TRB3/NIPK as an inhibitor of PKB-mediated insulin signalling in primary hepatocytes. Biochem J2005;386(Pt 1):113-8.

Kasuga M, Zick Y, Blith DL, Karlsson FA, Hring HU, Kahn CR. Insulin stimulation ofphosphorylation of the beta subunit of the insulin receptor:formation of bothphosphoserine and phosphotirosine. J Biol Chem 1982;257(17):9891-4.

Kato S, Du K. TRB3 modulates C2C12 differentiation by interfering with Aktactivation. Biochem Biophys Res Commun2007;353(4):933-8.

King H, Aubert RE, Herman WH. Global burden of diabetes, 1995-2025: prevalence,numerical estimates, and projections. Diabetes Care1998;21(9):1414-31.

Koh HJ, Arnolds DE, Fujii N, Tran TT, Rogers MJ, Jessen N, et al. Skeletal muscle-selective knockout of LKB1 increases insulin sensitivity, improves glucosehomeostasis, and decreases TRB3. Mol Cell Biol2006;26:8217-27.

Koo SH, Satoh H, Herzig S, Lee CH, Hedrick S, Kulkarni R, et al. PGC-1 promotesinsulin resistance in liver through PPAR-alpha-dependent induction of TRB-3. NatMed2004;10:530-4.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10600795?ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSumhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10600795?ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSumhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10600795?ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSumhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10600795?ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum


35/63

34

Kopelman PG. Obesity as a medical problem:review. Nature2000;404(6778):635-43.

Kops GJ, De Ruiter ND, De Vries-Smits AM, Powell DR, Bos JL, Burgering BM.Direct control of the forkhead transcription factor AFX by protein kinase B. Nature

1999;398(6728):630-4.

Kotani K, Ogawa W, Hino Y, Kitamura T, Ueno H, Sano W, et al. Dominant negativeforms of Akt (protein kinase B) and atypical protein kinase clambda do not preventinsulin inhibition of phosphoenolpyruvate carboxykinase gene transcription. J BiolChem1999;274: 21305-12..

Lakka TA, Laaksonen DE, Lakka HM, Mnnikk N, Niskanen LK, Rauramaa R, et al.Sedentary life style, poor cardiorespiratory fitness, and the metabolic syndrome. MedScie Sports Exerc2003;35(8):1279-86.

Lam TK, Carpentier A, Lewis GF, Van de Werve G, Fantus IG, Giacca A.Mechanisms of the free fatty acid-induced increase in hepatic glucose production.Am J Physiol Endocrinol Metab2003;284(5):E863-73.

Langdon RG, Weakley DR.The influence of hormonal factors and diet upon hepaticgluco-6-phosphatase activity. J Biol Chem1995;214(1):167-74.

Lessard SJ, Rivas DA, Chen ZP, Bonen A, Febbraio MA, Reeder DW, et al. Tissue-specific effects of rosiglitazone and exercise in the treatment of lipid-induced insulin

resistance.Diabetes2007;56(7):1856-64.

Luciano E, Carneiro EM, Carvalho CR, Carvalheira JB, Peres SB, Reis MA, et al.Endurance training improves responsiveness to insulin and modulates insulin signaltransduction through the phosphatidylinositol 3-kinase/ Akt-1 pathway. Eur JEndocrinol2002;147(1):149-57.

Manson JE, Nathan DM, Krolewski AS, Stampfer MJ, Willett WC, Hennekens CH. Aprospective study of exercise and incidence of diabetes among US male physicians.JAMA1992;268(1):63-7.

Matsumoto M, Han S, Kitamura T, Accili D. Dual role of transcripition factor FoxO1 incontrolling hepatic insulin sensitivity and lipid metabolism. J Clin Invest2006;116(9):2464-72.

Matsushima R, Harada N, Webster NJ, Tsutsumi YM, Nakaya Y. Effect of TRB3 oninsulin and nutrient-stimulated hepatic p70 s6 kinase activity. J Biol Chem2006;281(40):29719-29.

Michael LF, Asahara H, Shulman AI, Kraus WL, Montminy M. The phosphorylation

status of a cyclic amp-responsive activator is modulated via a chromatin-dependentmechanism. Mol Cell Biol 2000;20:1596-1603.


36/63

35

Miyake K, Ogawa W, Matsumoto M, Nakamura T, Sakaue H, Kasuga M.Hyperinsulinemia, glucose intolerance, and dyslipidemis induced by acute inhibitionof phosphoinositide 3-kinase signaling in the liver. J Clin Invest 2002;110(10):1483-91.

Morgado A, Schneider SH. Effects of fitness and physical training on carbohydratemetabolism and associated cardiovascular risk factors in patients with diabetes. JMed Soc New J1988;88(9):1483-91.

Myers MG Jr. IRS-1 activates phosphatidilinositol 3-kinase by association with srchomology 2 domains of p85. Proc Natl Acad Sci USA1992;89(21):10350-4.

Naiki T, Saijou E, Miyaoka Y, Sekine K, Miyajima A. TRB2, a mouse tribles ortholog,suppresses adipocyte differentiation by inhibiting AKT and C/EBPbeta. J Biol Chem

2007;282(33):24075-82.

Nakae J, Kitamura T, Silver DL, Accili D. The forkhead transcription factor foxo1(fkhr) confers insulin sensitivity onto glucose-6-phosphatase expression. J ClinInvest2001;108(9):1359-67.

Nakashima K, Yakabe Y, Yamazaki M, Abe H. Effect os fasting and refeeding onexpression of atrogin-1 and Akt/Foxo signaling pathway in skeletal muscle of chicks.Biosci Biotchnol Biochem2006;70(11):2775-8.

Nevado C, Valverde AM, Benito M. Role of insulin receptor in the regulation ofglucose uptake in neonatal hepatocytes. Endocrinology 2006;147(8):3709-18.

O'Brien RM, Noisin EL, Suwanichkul A, Yamasaki T, Lucas PC, Wang JC, et al.Hepatic nuclear factor-3 and hormone-regulated expression of thephosphoenolpyruvate carboxykinase and insulin-like growth factor-binding protein-1genes. Mol Cell Biol1995;15(3):1747-58.

O'Donovan G, Kearney EM, Nevill AM, Woolf-May K, Bird SR. The effects of 24weeks of moderate-or-high-intensity exercise on insulin resistance. Eur J Appl

Physiol2005;95(5-6):522-8.

Ogg S, Paradis S, Gottlieb S, Patterson GI, Lee L, Tissenbaum HA,et al. The forkhead transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevitysignals in C. elegans. Nature1997;389(6654):994-9.

Pagliassotti MJ, Kang J, Thresher JS, Sung CK, Bizeau ME. Elevated basal PI 3-kinase activity and reduced insulin signaling in sucrose-induced hepatic insulinresistance. Am J Physiol Endocrinol Metab2002;282:E170-6.

Pauli JR, Ropelle ER, Cintra DE, Carvalho-Filho MA, Moraes JC, Souza CT, et al.Acute physical exercise reverses S-nitrosation of the insulin receptor, insulin receptor


37/63

36

substrate 1 and protein kinase B/Akt in diet-induced obese wistar rats. J Physiol2008;586(2):659-71.

Perriello G, Misericordia P, Volpi E, Pampanelli S, Santeusanio F, Brunetti P, et al.

Contribution of obesity to insulin resistance in noninsulin-dependent diabetesmellitus. J Clin Endocrinol Metab1995;80(8):2464-9.

Perseghin G, Price TB, Petersen KF, Roden M, Cline GW, Gerow K, et al.Increasedglucose transport-phosphorylation and muscle glycogen synthesis after exercisetraining in insulin-resistant subjects. N Engl J Med1996;335(18):1357-62.

Pessin JE, Saltiel AR. Signaling pathways in insulin action: molecular targets ofinsulin resistance. J Clin Invest2000;106(2):165-9.

Postic C, Dentin R, Girard J. Role of the liver in the control of carbohydrate and lipidhomeostasis. Diabetes Metab2004;30:398-408.

Prada PO, Pauli JR, Ropelle ER, Zecchin HG, Carvalheira JB, Velloso LA, et al.Selective modulation of the Cap/Cbl pathway in the adipose tissue of high fat diettreated rats. FEBS Lett2006;580(20):4889-94.

Prudente S, Hribal ML, Flex E, Turchi F, Morini E, Cosmo S, et al. The functionalQ84R polymorphism of mammalian Tribbles homolog TRB3 is associated with insulinresistance and related cardiovascular risk in caucasians form Italy. Diabetes

2005;54(9):2807-11.

Rabe K, Lehrke M, Parhofer KG, Broedl UC. Adipokines and insulin resistance. MolMed2008;14(11-12):741-51.

Ribeiro L, Calhau C, Pinheiro-Silva S, Santos A, Alada M, Guimares J, et al.Exerccio fsico e insulina, hormona do crescimento e somatostina. Acta Med Port2004;17:199-204.

Rice B, Janssen I, Hudson R, Ross R. Effects of aerobic or resistance exerciseand/or diet on glucose tolerance and plasma insulin levels in obese men. DiabetesCare 1999;22(5):684-91.

Rognstad DR. Glucose-6-phosphatase flux and the hepatic glucose balance model. JAppl Physiol1996;271(6 Pt 1):E1125-7.

Ropelle ER, Pauli JR, Carvalheira J BIOL CHEM. Efeitos moleculares do exercciofsico sobre as vias de sinalizao insulnica. Motriz2005;11(1):49-55.

Ropelle ER, Pauli JR, Prada PO, De Souza CT, Picardi PK, Faria MC, et al. Reversalof diet-induced insulin resistance with a single bout of exercise in the rat: the rola ofPTP1B and IRS-1 serine phosphorylation. J Physiol2006;577(Pt 3):997-1007.


38/63

37

Saad MJ, Folli F, Kahn JA, Kahn CR. Modulation of insulin receptor, insulin receptorsubstrate-1 and phosphatidylinositol 3-kinase in liver and muscle of dexamethasonetreated rats. J Clin Invest1993;92(4):2065-72.

Saltiel AR, Kahn CR. Insulin signaling and the regulation of glucose and lipidmetabolism. Nature2001;414(6865):799-806.

Samuel VT, Choi CS, Phillips TG, Romanelli AJ, Geisler JG, Bhanot S, et al.Targeting foxo1 in mice using antisense oligonucleotide improves hepatic andperipheral insulin action. Diabetes2006;55(7):2042-50.

Sasaki K, Cripe TP, Koch SR, Andreone TL, Petersen DD, Beale EG, et al.Multihormonal regulation of phosphoenolpyruvate carboxykinase gene transcription:the dominant role of insulin. J Biol Chem1984;259(24):15242-51.

Schmoll D, Walker KS, Alessi DR, Grempler R, Burchell A, Guo S,et al. Regulation ofglucose-6-phosphatase gene expression by protein kinase Balpha and the forkheadtranscription factor FKHR. Evidence for insulin response unit-dependent and -independent effects of insulin on promoter activity. J Biol Chem2000;275(46):36324-33.

Scott DK, O'Doherty RM, Stafford JM, Newgard CB, Granner DK. The repression ofhormone-activated PEPCK gene expression by glucose is insulin-independent butrequires glucose metabolism. J Biol Chem1998;273(37):24145-51.

Shao J, Qiao L, Janssen RC, Pagliassotti M, Friedman JE. Chronic hyperglycemiaenhances PEPCK gene expression and hepatocellular glucose production viaelevated liver activating protein/liver inhibitory protein ratio. Diabetes2005;54(4):976-84.

She P, Burgess SC, Shiota M, Flakoll P, Donahue EP, Malloy CR, et al. Mechanismsby wich liver-specific PEPCK knockout mice preserve euglycemia during starvation.Diabetes2003;52(7):1649-54.

Shepherd PR, Withers DJ, Siddle K. Phosphoinositide 3-kinase: the key switchmechanism in insulin signalling. Biochem J1998;333 ( Pt 3):471-90.

Song G, Ouyang G, Bao S. The activation of Akt/PKB signaling pathway and cellsurvival. J Cell Mol Med2005;9(1):59-71.

Souza CT, Araujo EP, Bordin S, Ashimine R, Zollner RL, Boschero AC, et al.Consumption of a fat-rich diet activates a proinflamatory response and inducesinsulin resistance in the hypothalamus. Endocrinology2005;146(10):4192-9.

Souza CT, Arajo EP, Prada PO, Saad MJ, Boschero AC, Velloso LA, et al. Short-term inhibition of peroxisone proliferators activated receptor-gamma coactivator-1


39/63

38

alpha expression reverses diet-induced diabetes mellitus and hepatic steatosis inmice. Diabetologia2005;48(9):1860-71.

Steppan CM, Bailey ST, Bhat S, Brown EJ, Banerjee RR, Wright CM,et al. The

hormone resistin links obesity to diabetes. Nature2001;409(6818):307-12.

Sung HY, Guan H, Czibula A, King AR, Eder K, Heath E, et al. Human tribbles-1controls proliferation and chemotaxis of smooth muscle cells via MAPK signalingpathways. J Biol Chem2007;282(25):18379-87.

Sutherland C, O'Brien RM, Granner DK. New connections in the regulation of PEPCKgene expression by insulin. Philo Trans R Soc Lond B Biol Sci1996;351(1336):191-9.

Suzuki R, Tobe K, Aoyama M, Inoue A, Sakamoto K, Yamauchi T, et al. Both insulinsignaling defects in the liver and obesity contribute to insulin resistance and causediabetes in Irs2(-/-) mice. J Biol Chem2004;279(24):25039-49.

Taniguchi CM, Emanuelli B, Kahn CR. Critical nodes signaling pathways: insightsinto insulin action. Nat Rev Mol Cell Biol2006;7(2):85-96.

Tuomilehto J, Lindstrm J, Eriksson JG, Valle TT, Hmlinen H, Ilanne-Parikka P,et al, Prevention of type 2 diabetes mellitus by changes in life-style among subjectswith impaired glucose tolerance. N Engl J Med2001;344(18):1343-50.

Ueki K, Yamamoto-Honda R, Kaburagi Y, Yamauchi T, Tobe K, Burgering BM, et al;Potential role of protein kinase B in insulin-induced glucose transport, glycogensynthesis, and protein synthesis. J Biol Chem1998;273(9):5315-22.

White MF; The IRS-singnalling system a network of docking proteins that mediateinsulin action. Review. Mol Cell Biochem1998;182(1-2):3-11.

Wild S, Roglic G, Green A, Sicree R, King H. Global prevalence of diabetes:estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care2004;27(5):1047-53.

Zimmet P. Globalization, coca-colonization and the chronic disease epidemic: canthe Doomsday scenario be averted? J Inter Med2000;247(3):301-10.

Zimmet PZ, Collins VR, Dowse GK, Knight LT. Hyperinsulinaemia in youth is apredictor of type 2 (non-insulin-dependent)diabetes mellitus. Diabetologia1992;35(6):534-41.


40/63

39

ANEXOS

ANEXO A

Artigo submetido a publicao

Acute exercise reduces insulin resistance-induced TRB3 expression and

amelioration of the hepatic production of glucose in the liver of diabetic

mice.

1Athos F. Lima, 1Agberto Matos, 2Eduardo R. Ropelle, 2Jos R. Pauli, 2Dennys E.

Cintra, 3Marisa JS Fredrico, 3Ricardo A. de Pinho, 2Lcio A. Velloso, 1,3Cludio T.

De Souza*

1Universidade Cruzeiro do Sul, Unicsul, So Paulo, SP, Brazil

2Departamento de Clnica Mdica, FCM, Universidade Estadual de Campinas

(UNICAMP), Campinas, SP, Brazil.

3Laboratrio de Fisiologia e Bioqumica do Exerccio, Programa de Ps-graduao

em Cincias da Sade, Universidade do Extremo Sul Catarinense, SC, Brazil

RUNNING TITLE:Exercise-reduced liver TRB3 expression in diabetic mice.

Keywords:TRB3 expression, insulin, exercise, liver, hepatic glucose production.

Total number of figures 3 and table 2

*Please address correspondence to: Claudio Teodoro de Souza, PhD.

Laboratrio de Fisiologia e Bioqumica do Exerccio, Programa de Ps-Graduao

em Cincias da Sade, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-000

Cricima, SC, Brazil

Fax: + 55 48 3431-2539; E-mail: [email protected]


41/63

40

ABSTRACT

TRB3 (a mammalian homolog of Drosophila) is emerging as an important

player in the regulation of insulin signaling. TRB3 can directly bind to Ser/Thr protein

kinase Akt, the major downstream kinase of insulin signaling. Conversely, physical

exercise has been linked to improved glucose homeostasis and enhanced insulin

sensitivity; however the molecular mechanisms by which exercise improves glucose

homeostasis, particularly in the hepatic tissue, are only partially known. Here, we

demonstrate that acute exercise reduces fasting glucose in two models diabetic

mice. Western blot analysis showed that eight hours after a swimming protocol,

TRB3 expression was reduced in the hepatic tissue from diet induced obesity(Swiss) and leptin-deficient (ob/ob) mice, when compared with respective control

groups at rest. In parallel, there was an increase in insulin responsiveness in the

canonical insulin signaling pathway in hepatic tissue from DIO and ob/ob mice after

exercise. In addition, the PEPCK expression was reduced in the liver after the

exercise protocol, suggesting that acute exercise diminished hepatic glucose

production through insulin-signaling restoration. Thus, these results provide new

insights into the mechanism by which physical activity improves glucose homeostasisin type 2 diabetes.

INTRODUCTION

Type 2 diabetes results from a complex interplay between genetic and

environmental conditions. It is associated with impaired glucose clearance by the

liver in the postprandial state, and with elevated glucose production in the post-absorptive state. Thus, insulin has a potent inhibitory effect on hepatic glucose

production by direct actions on hepatic receptors. The insulin receptor (IR) is a

protein with intrinsic tyrosine kinase activity that, following activation by insulin,

undergoes rapid autophosphorylation and, subsequently, phosphorylates intracellular

protein substrates, including IRS-1 and IRS-2 (Cheatham and Kahn, 1995). IRS

proteins act as messenger molecule-activated receptors to signaling with Src

homology 2 domains, which are important steps in insulin action. After stimulation by

insulin, IRS-1 and -2 associate with several proteins, including phosphatidylinositol 3-

kinase (PI 3-K) (Folli et al., 1992; Saad et al., 1993; Williamson et al., 2003).


42/63

41

Downstream to PI 3-K the serine/threonine kinase, Akt is activated and plays a

pivotal role in the regulation of various biological processes, including apoptosis,

proliferation, differentiation, and intermediary metabolism (Downward, 1998; Chen et

al., 2001).

TRB3, a mammalian homolog of Drosophila tribbles, was proposed as a

suppressor of Akt activity, predominantly in conditionsof fasting and diabetes (Du et

al., 2003). TRB3 is emerging as an important player in the regulation of insulin

signaling. Firstly, TRB3 can directly bind to Ser/Thr protein kinase Akt, the major

downstream kinase of insulin signaling. TRB3 binds the kinase domain of Akt in the

activation loop and inhibits phosphorylation of Akt at, Thr308 and Ser473, the criticalevents for Akt activation, induced by growth factors and insulin (Du et al., 2003).

Secondly, TRB3 expression is induced in normal liver following fasting and its levels

are significantly higher in livers and hearts of db/db mice compared to those of wild-

type mice (Du et al., 2003). Thirdly, overexpression of TRB3 decreases, and

knockdown of TRB3 expression increases Akt activation by insulin in the liver and

muscle (Koo et al., 2004; Matsushima et al., 2006). Correspondingly, knockdown of

TRB3 expression by shRNA in mouse diabetic liver increases insulin sensitivity.

Conversely, increased TRB3 expression via adenoviral transfer in the normal liver

leads to decreased insulin sensitivity and glucose intolerance.

Insulin modulates nuclear forkhead box O1 (Foxo1) activity in an Akt-

dependent manner (Barthel et al., 2001).In loss- and gain-of function experiments in

mice, Foxo1 has been shown to promote hepatic glucose production (Pagliassotti et

al., 2002; Puigserver et al., 2003). Previous studies show that a negative modulation

of insulin signal transduction through insulin PI 3-K/Akt/Foxo1 is involved ingluconeogenesis (Barthel et al., 2001; Cintra et al., 2008). Insulin signaling plays an

important role in controlling gluconeogenic gene expression, including that of

phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK), which catalyses the rate-limiting step

of hepatic gluconeogenesis (Sutherland et al., 1996). A number of observations

indicate that the activation of PI 3-K/Akt is a major pathway through which insulin

modulates hepatic genes. Thus, blocking insulin-induced PI 3-K activation with

wortaminnin and LY-294002 prevents the inhibitory effect of insulin on PEPCK


43/63

42

expression (Band and Poster, 1997). Expression of a dominant negative mutant of PI

3-K induces the expression of PEPCK (Miyake et al., 2002).

Increased physical exercise has been linked to improved glucose homeostasisand enhanced insulin sensitivity. After an acute bout of exercise, the insulin

sensitivity is enhanced in insulin-sensitive tissues, such as, skeletal muscle, liver and

hypothalamus (Luciano et al., 2002; Flores et al., 2006; Ropelle et al., 2006; Pauli et

al., 2008). The molecular mechanism for enhanced insulin-mediated glucose uptake

with exercise training may be partly related to increased expression and activity of

key proteins known to regulate glucose metabolism in skeletal muscle (Chibalin et

al., 2000; Aoi et al., 2004; Ropelle et al., 2006). However, the molecular basisunderlying the beneficial effects of exercise on hepatic production glucose in type 2

diabetes remains unclear. The current study was designed to investigate the effects

of an acute bout of exercise on TRB3 expression in the insulin-signaling hepatic

tissue and, consequently, hepatic production glucose in obese diabetic mice.

MATERIALS AND METHODS

Experimental animals

Male Swiss mice from the University of Campinas Central Animal Breeding

Center were used in the experiments. The 4-wk-old Swiss mice were divided into

three groups; control mice (lean) fed standard rodent chow; obese mice, fed on an

high fat diet for 2 months (DIO) and a third group, which also received an high fat

diet, but was submitted to acute exercise (DIO+EXE). Also, male leptin-deficient

(ob/ob) and lean control mice (ob/?), originally imported from the Jackson

Laboratories (Bar Harbor, ME), were used in the experiments. All experiments were

approved by the Ethics Committee of the State University of Campinas (UNICAMP).

Room temperature was maintained stable (281C), and mice were housed in

individual cages, subjected to a standard light-dark cycle (6:00 a.m. to 6:00 p.m./6:00

p.m. to 6:00 a.m.), and provided with standard rodent chow and water ad libitum.

Exercise protocol

The swimming protocol employed was described previously (Ryder et al.,

1999), with minor modifications. Adult mice were acclimated to swimming for 10

minutes for 2 days. Eight animals swam together in plastic containers measuring 45


44/63

43

cm in diameter. Water temperature was maintained at 3233C. Mice swam for four

30-min periods, with 5-min rest periods for a total swimming time of 2 h. After the

acute exercise protocol (DIO+EXE - Swissor AEgroup - ob/ob), animals were fed ad

libitum for 2 hours and food was withdrawn six hours before the tissue extractions.

Eight hours after the exercise protocol, the mice were anesthetized with

intraperitoneal (i.p.) injection of sodium thiopental (40 mg/kg body weight). Following

the experimental procedures, the mice were killed under anesthesia (thiopental 200

mg/kg) following recommendations of the NIH publication n 85-23.

Fasting glucose, insulin tolerance test (ITT), serum insulin quantification and

glycogen content.

After the exercise protocol, the mice were submitted to an insulin tolerance

test (ITT; 1.5 U/kg body weight of insulin) after six hours fasting. Briefly, 1.5 IU/kg of

human recombinant insulin (Humulin R) from Eli Lilly (Indianapolis, IN, USA) was

infused intraperitoneally to anesthetized mice, the blood samples were collected at 0,

5, 10, 15, 20, 25 and 30 minutes from the tail for serum glucose determination. The

rate constant for plasma glucose disappearance (Kitt) was calculated using the

formula 0.693/biological half life (t1/2). The plasma glucose t1/2 was calculated from

the slope of the last square analysis of the plasma glucose concentration during the

linear phase of decline (Bonora et al., 1989). Plasma glucose was determined using

a glucose meter (Advantage, Boehringer Mannheim, USA). Plasma was separated

by centrifugation (1500 g) for 15 minutes at 4C and stored at 80C until assay. RIA

was employed to measure serum insulin, according to a previous description (Scott,

1981). Glycogen content in liver fragments was measured according to a previously

described method (Pimenta, 1989).

Protein analysis by immunoblotting

As soon as anesthesia was assured by the loss of pedal and corneal reflexes,

the abdominal cavity was opened, the cava vein exposed, and 0.1 ml of normal

saline or insulin (10-6 mol/l 0,1ml) were injected. After insulin injection, hepatic

tissue was excised. The tissue was pooled, minced coarsely and homogenized

immediately in extraction buffer (mM) (1% Triton-X 100, 100 Tris, pH 7.4, containing

100 sodium pyrophosphate, 100 sodium fluoride, 10 EDTA, 10 sodium vanadate, 2

PMSF and 0.1 mg of aprotinin/ml) at 4 C with a Polytron PTA 20S generator

(Brinkmann Instruments, model PT 10/35) operated at maximum speed for 30 sec.


45/63

44

The extract was centrifuged at 11000 rpm and 4C in a Beckman 70.1 Ti rotor (Palo

Alto, CA) for 40 min to remove insoluble material, and the supernatant was used for

protein quantification, using the Bradford method (Bradford, 1976). Proteins were

denatured by boiling in Laemmli (Laemmli,1970) sample buffer containing 100mM

DTT, run on SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose membranes. Membranes

were blocked, probed and developed, as described previously (De Souza et al.,

2005). Antibodies used for immunoblotting were anti-phospho-Akt, anti-PEPCK, anti-

phospho-Foxo1 (Cell Signaling Technology, MA), anti-Akt, anti-Foxo1, anti-TRB3 and

anti- -actin (Santa Cruz Biotecnology, Inc, CA). Band intensities were quantitated by

optical desitometry (Scion Image software, ScionCorp, Frederick, MD) of the

developed autoradiographs.

Statistical analysis

The results were expressed as the means SEM. Differences between the

lean groups and mice at rest (ob/ob or Swiss) and after exercise protocol were

evaluated using one-way analysis of variance (ANOVA). When the ANOVA indicatedsignificance, a Bonferronipost hoc test was performed.

RESULTS

Physiological and metabolic parameters

Two diabetic models were evaluated in present study, deficient leptin (ob/ob)

and diet induced obesity. In table 1 shows comparative data regarding lean

controls, leptin-deficient (ob/ob) mice at rest and after acute exercise. The ob/ob

mice at rest have a greater body weight, epididymal fat, fasting serum insulin and

fasting glucose than age-matched controls (lean). No significant variations were

found in body weight, epididymal fat and fasting serum insulin of ob/obmice after

acute exercise, when compared diabetic mice at rest. However, the fasting glucose

was reduced (65%) in ob/ob mice at eight hours after the exercise protocol (AE

group).

Table 2 shows comparative data regarding control, diet-induced obesity mice(DIO) and DIO mice submitted to exercise protocol (DIO +EXE). The DIO micehad a


46/63

45

greater body weight, epididymal fat and fasting serum insulin and fasting glucose,

than age matched controls. No significant variations were found in

Athos Felipe de Lima - 16-09-2013-Finalizada-PDF

Documents

Transcript of Athos Felipe de Lima - 16-09-2013-Finalizada-PDF