Aus dem Institut für Pflanzenernährung Fachgebiet ... · Aus dem Institut für Pflanzenernährung...

Aus dem Institut für Pflanzenernährung

Fachgebiet Pflanzenernährung (Düngung) Prof. Dr. Volker Römheld

und dem Institut für Botanik

Fachgebiet Biodiversität und pflanzliche Interaktion

Prof. Dr. Otmar Spring

Das Potenzial von Falschem Mehltau als Quelle von

Omega-3-Fettsäuren für die menschliche Ernährung

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors

der Agrarwissenschaften (Dr. sc. agr.)

vorgelegt

der Fakultät Agrarwissenschaften

Universität Hohenheim

von

Ann-Marie Anderle

aus Mutlangen

2009

Die vorliegende Arbeit wurde am 10. Juli 2009 von der Fakultät Agrarwissenschaften

der Universität Stuttgart-Hohenheim als „Dissertation zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Agrarwissenschaften“ angenommen.

Tag der mündlichen Prüfung: 30. Juli 2009

1. Prodekan: Prof. Dr. W. Bessei

1. Prüfer (Betreuer): Prof. Dr. O. Spring

2. Prüfer (Mitberichter): Prof. Dr. V. Römheld

3. Prüfer: Prof. Dr. K. Haas

Eingereicht am 28.01.2009

Mündliche Prüfung am 30. Juli 2009

Für meine Familie

Danksagung

Ich bedanke mich ganz herzlich bei meinen 3 hervorragenden Betreuern, die sich

gegenseitig optimal ergänzten. Zuallererst danke ich Herrn Professor Spring für die

Annahme als Doktorandin und die Vergabe des höchst interessanten Themas. Er

stand mir äußerst zuverlässig mit wissenschaftlichem und menschlichem Rat zur

Seite. Er war der Hauptbetreuer und Förderer dieser Arbeit und führte alle

notwendigen Korrekturen durch. Ganz herzlich bedanke ich mich auch bei Herrn

Professor Haas für das stets entgegengebrachte Vertrauen, das freundschaftliche

Arbeitsklima, seine praktischen Tipps sowie für die zur Verfügung gestellten

Sachmittel und Freiräume für meine Arbeiten am GC. Herrn Professor Römheld

danke ich ganz herzlich für seine Tätigkeit als Gutachter, die wissenschaftlichen

Anregungen, seine stets motivierende Art und für die zur Verfügung gestellte

Klimakammer während meiner Versuche am Institut für Pflanzenernährung.

Mein Dank gilt auch besonders meinen Projektpartnern im „Nahrungskettenversuch“.

Bei Herrn Professor Grashorn bedanke ich mich sehr herzlich für die Kooperation bei

der Umsetzung der Idee. Ebenso danke ich seinen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern

vom Unteren Lindenhof. Herrn Bässler von der Versuchsstation für Gartenbau danke

ich für die Überlassung der Versuchsfläche für die Salatanzucht, Frau Tina Schuster

und dem gesamten Gärtnerteam danke ich herzlich für ihre Arbeit und die sehr gute

Zusammenarbeit während der gesamten Zeit bis zur Ernte. Herrn Blauhorn von der

Staatsschule für Gartenbau danke ich für die vielen Fachgespräche über Salat und

die Überlassung des infizierten Roten Eichblatt Salats für Futterzwecke.

Ich bedanke mich herzlich bei Herrn Professor Müller und Herrn Dr. Heindl für die

Benutzung des Hordentrockners am Institut für Agrartechnik. Ganz besonders

bedanke ich mich bei Frau Amberg für die Trocknungsprozessführung und ihre

engagierte Hilfe.

Ich bedanke mich recht herzlich bei allen Kolleginnen und Kollegen der Institute für

Botanik und für Pflanzenernährung, ganz besonders danke ich Herrn Reinhard

Zipper, der mir stets zuverlässig mit praktischen Ratschlägen zur Seite stand und

Frau Dr. Kania danke ich für die vielen Fachgespräche.

Vor allem danke ich aber meinem Mann Marc Anderle, der psychologisch und

materiell stets hinter mir stand und mich stets in Allem förderte. Ich danke meiner

ganzen Familie, die mich immer bei meinen Vorhaben unterstützte.

I

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ..................................... ......................................................................1

1.1. Omega-3-Fettsäuren in der menschlichen Ernährung und Nahrungsmittel-

produktion ...................................................................................................1

1.1.1. Chemische Definition der n-3-Fettsäuren.............................................2

1.1.2. Die medizinische Wirkung der n-3-Fettsäuren......................................3

1.2. Natürliche Quellen von n-3-Fettsäuren .........................................................5

1.2.1. Öle Höherer Pflanzen........................................................................... 6

1.2.2. Tierische Quellen .................................................................................7

1.3. Problematik natürlicher Quellen.................................................................... 8

1.4. Alternative Quellen für EPA und DHA...........................................................8

1.4.1. Öle Niederer Pflanzen als alternative Quellen für EPA und DHA.........8

1.4.2.Transgene Pflanzen ............................................................................10

1.5. Problematik alternativer Quellen.................................................................10

1.6. Aktueller Stand der Forschung und Zielsetzung der Arbeit.........................11

2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrati onen in Sporan-

gien und infiziertem Pflanzengewebe .................. ..........................................13

2.1. Materialien und Methoden ..........................................................................13

2.1.1 Infektionstechniken und Ernte .............................................................13

2.1.1.1. Keimlingsinfektion bei P. halstedii............................................14

2.1.1.2. Blattinfektion bei B. lactucae.......................................................... 15

2.1.1.3. Ernte und Lagerung von Sporangien und Pflanzenmaterial.....16

2.1.2. Aufbereitung der Fettsäuren für die GC-Analyse................................16

2.1.2.1. Extraktion der Fettsäuren ........................................................17

2.1.2.2. Säure-katalysierte Veresterung der Fettsäuren für die GC-

Analyse ...................................................................................18

2.1.3. GC-FID Messtechnik ..........................................................................19

2.1.3.1. Kalibrieren des Messbereiches ...............................................19

2.1.3.2. Einspritztechnik/Probenaufgabe..............................................20

2.1.3.3. Säulen .....................................................................................20

2.1.3.4. Temperaturprogramme und Gassystem..................................22

2.1.4. Quantifizieren der FAMEs am GC-FID ...............................................23

2.1.5. DC-Technik.........................................................................................25

II

2.2. Ergebnisse..................................................................................................28

2.2.1. Qualitative Analyse der FS-Muster von P. halstedii und B. lactucae ..28

2.2.2. Lipidklassentrennung und FS-Zusammensetzung der einzelnen

Lipidklassen.......................................................................................29

2.2.3. EPA-Konzentrationen von Sporangien und Wirtsgewebe ..................32

2.3. Diskussion ..................................................................................................35

2.3.1. Qualitative FS-Zusammensetzung von P. halstedii und B. lactucae ..35

2.3.2. Lipidklassenzusammensetzung..........................................................35

2.3.3. EPA-Konzentrationen in Sporangien u. infiziertem Pflanzengewebe .37

2.4. Schlussfolgerungen ....................................................................................39

3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeis piel P. halstedii .....40

3.1. Einleitung....................................................................................................40

3.2. Materialien und Methoden ..........................................................................40

3.2.1. Artinternes Screening auf EPA-Gehalte in Sporangien ......................40

3.2.2. Erfassen besonders EPA-reicher Sonnenblumensorten/-linien..........42

3.2.3. Variation des Infektionsdrucks............................................................42

3.2.4. Variation des Stickstoffangebotes ......................................................43

3.2.4.1. Etablieren der Nährlösungskultur ............................................43

3.2.4.2. Wachstum und Gewichte.........................................................45

3.2.4.3. Infektion und Befallsgrad.........................................................46

3.2.4.4. Gesamt-N Bestimmung im Sonnenblumengewebe.................46

3.2.4.5. Analyse der FS-Gehalte im Stickstoff-Steigerungsversuch .....48

3.2.5. Statistische Auswertung .....................................................................49

3.3. Ergebnisse..................................................................................................51

3.3.1. EPA-Gehalte verschiedener Sporangienstämme von P. halstedii......51

3.3.2. Besonders anfällige Sonnenblumensorten und –linien.......................51

3.3.3. Variation des Infektionsdrucks............................................................53

3.3.4. Variation des Stickstoffangebots ........................................................55

3.3.4.1. Wachstum und Gewichte.........................................................55

3.3.4.2. Infektion und Befallsgrad.........................................................57

3.3.4.3. Gesamt-N-Gehaltsbestimmung in Sonnenblumenpflanze.......58

3.3.4.4. EPA-Konzentrationen bei 3 N-Stufen ......................................59

3.4. Diskussion ..................................................................................................62

3.4.1. Optimierungspotenzial durch die Selektion von Pathogenstämmen...62

III

3.4.2. Optimierungspotenzial durch die Selektion von Wirtspflanzen...........62

3.4.3. Optimierungspotenzial durch variierten Infektionsdruck .....................63

3.4.4. Optimierungspotenzial durch variierte N-Düngung.............................63

3.5. Schlussfolgerungen ....................................................................................66

4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3 FS aus B. lactucae in

Hühnereiern........................................ ..............................................................68

4.1. Hintergrund und Zielsetzung des Fütterungsexperiments...........................68

4.2. Materialien und Methoden...........................................................................68

4.2.1. Versuchsaufbau und Aufgabenverteilung..........................................68

4.2.2. FS-Konzentrationen der Salatextrakte, der Futterrationen und der

Dotterlipide ........................................................................................70

4.2.3. Salatproduktion..................................................................................72

4.2.4. Trocknung..........................................................................................74

4.2.5. Fütterungsversuch.............................................................................76

4.2.5.1. Leistungsdaten der Tiere ...........................................................78

4.2.6. Statistische Auswertung der Lipidgehalte in den Dotterproben .........80

4.3. Ergebnisse ..................................................................................................81

4.3.1. Befallsergebnis des Feldversuches zur Ernte....................................81

4.3.2. Temperaturstabilität und Trocknung ..................................................81

4.3.3. Fettsäureanalyse in der Nahrungskette.............................................82

4.3.4. Lipidoxidation und Sensorik...............................................................88

4.3.5. Leistungsdaten der Tiere ...................................................................89

4.4. Diskussion...................................................................................................94

4.4.1. Befallsergebnis vom Feldversuch......................................................94

4.4.2. Temperaturstabilität und Trocknung ..................................................95

4.4.3. FS-Analyse in der Nahrungskette......................................................96

4.4.4. Lipidoxidation und Sensorik...............................................................97

4.5. Zusammenfassung......................................................................................98

5. Bewertung des Potenzials von infizierten Nutzpflanze n als n-3-FS Quellen

für die menschliche Ernährung...................... ................................................99

5.1. Das Potenzial von Sporangien ....................................................................99

5.2. Das Potenzial von infiziertem, essbarem Pflanzengewebe.........................99

5.3. Das Potenzial von Bremia lactucae in der Nahrungskette.........................101

IV

6. Zusammenfassung................................. .......................................................103

7. Summary ......................................... ...............................................................105

8. Literatur ....................................... ...................................................................107

9. Anhang .......................................... .................................................................118

V

Abkürzungsverzeichnis

A Signalfläche

ALA Alpha-Linolensäure (18:3 n-3)

ANOVA Varianzanalyse

AOCS American Oils Chemists Society

ARA Arachidonsäure (20:4 n-6)

B. lactucae Bremia lactucae Regel (1843) (Falscher Mehltau auf Salat)

DC Dünnschichtchromatographie

DG Dottergewicht

DGE Deutsche Gesellschaft für Ernährung

DHA Docosahexaensäure (22.6 n-3)

DP Depositionsrate

EPA Eicosapentaensäure (20:5 n-3)

F-Wert Statistisches Maß zur Bestimmung der Signifikanz

FA Futteraufnahme

FAME(s) Fettsäuremethylester

FE Flächeneinheiten

FG Frischgewicht(e)

FID Flammenionisationsdetektor

FS Fettsäure(n)

GC Gaschromatograph(ie)

GC-MS Gaschromatograph(ie)-Massenspektrometrie

GLA Gamma-Linolensäure (18:3 n-6)

ID Innendurchmesser

IS Interner Standard

LA Linolsäure (18:2 n-6)

LC-PUFAs Langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäuren

LL Legeleistung

m Einwaage

MW Mittelwert

N Stickstoff

n.s. nicht signifikant

N1 Stickstoffkonzentration 0,1 mmol/l Ca(NO3)2



VI

n-3-FS Omega-3-Fettsäure(n)

n-6-FS Omega-6-Fettsäure(n)

p p-Wert, statistische Teststärke

P. halstedii Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. & DeToni (1888)

p.a. pro analysi (chem. Reinheit)

PUFAs Mehrfach ungesättigte Fettsäuren

Rf Retentionsfaktor bei der Dünnschichtchromatographie

rQ relative Quantität

RT Raumtemperatur

TBARS Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen

TBME Tertiärer Butylmethylether

TG Trockengewicht(e)

U Umdrehungen

v/v Volumenanteil

WHO Weltgesundheitsorganisation

1. Einleitung

1

1. Einleitung

1.1. Omega-3-Fettsäuren in der menschlichen Ernähru ng und Nahrungsmittel-

produktion

Derzeit stößt man in den Regalen von Supermärkten auf Margarinen, Fette und

Pflanzenöle, die dafür werben, besonders reich an Omega-3-Fettsäuren (n-3-FS) zu

sein. Es gibt einige Lebensmittel auf dem Markt, die mit n-3-FS angereichert werden

(TRAUTWEIN 2001), unter anderem n-3-FS-Eier und n-3-FS-Brot (KOLANOWSKI &

LAUFENBERG 2006) und als „Funktionelle Lebensmittel“ bzw. „Functional Food“

(HASLER 2002) bezeichnet werden. In Margarinen kommen n-3-FS-reiche Öle von

Höheren Pflanzen zum Einsatz, wie Rapsöl oder Leinöl. Mit einer jährlichen

Produktion von etwa 100 Mio Tonnen haben n-3-FS-reiche Pflanzenöle den größten

Marktanteil als funktionelle Lebensmittel für die menschliche Ernährung (DREXLER et

al. 2003). Als Nahrungsergänzungsmittel in Form von Fischölkapseln, Algen-

ölkapseln oder Pflanzenölkapseln sind n-3-FS in Drogeriemärkten und Apotheken

erhältlich. Doch die Marktbedeutung der n-3-FS geht weit darüber hinaus. Spezielle

n-3-FS aus Algen, Pilzen, Oomyceten, Fischen oder Hühnereiern werden in

manchen Ländern der Kinder- und Säuglingsnahrung zugesetzt (WARD & SINGH

2005). Da der Markt noch Expansionspotenzial besitzt, forschen namhafte Firmen

wie die BASF AG, Abott S.A., Aventis S.A., Nestle S.A. oder Novartis S.A. derzeit

intensiv an neuartigen Organismen, die n-3-FS produzieren und Produkten, denen n-

3-FS zugesetzt werden (WARD & SINGH 2005). Einen weiteren Markt für n-3-FS aus

Algen und Oomyceten stellen Meeres-Aquakulturen dar. Normalerweise nehmen

Larven und Fische im Meer Plankton und Algen auf, welche reich an n-3-FS sind. Die

n-3-FS reichern sich über die Nahrungskette im Fisch stark an, was diesen für den

menschlichen Verzehr so wertvoll macht. In heute üblichen Aquakulturen zur

Anzucht von Lachsen erfolgt die Fütterung meist über Kraftfutter, dem n-3-FS aus

der Nahrungskette fehlt. Daher werden neuerdings zusätzlich n-3-FS-haltige Algen

und Oomyceten für die Aufzucht der Fischlarven eingesetzt (BARCLAY & ZELLER

1996; WARD & SINGH 2005). Auch für den Tierfuttermarkt sind n-3-FS ein aktuelles

Thema. n-3-FS-haltige Öle Höherer Pflanzen, Oomyceten-Präparate sowie Fischöl

und Algenöl werden beispielsweise zu Hühner- und Putenfutter gemischt, um den n-

3-FS-Anteil in Fleisch und Eiern zu erhöhen (SIMOPOULOS & SALEM 1992; WARD &

SINGH 2005).

1. Einleitung

2

1.1.1. Chemische Definition der n-3-Fettsäuren

n-3-Fettsäuren sind Bestandteile der sehr umfangreichen Stoffgruppe der Lipide,

innerhalb derer FS ein zentrales, Struktur gebendes Element darstellen. Als FS

werden Kohlenwasserstoffe bezeichnet, die aus mindestens 4 C-Atomen bestehen

und mit einer Carboxylgruppe enden. Dabei werden in der Natur Kettenlängen von

bis zu 28 C-Atomen gebildet, inzwischen sind über 1000 verschiedene Strukturen

beschrieben (BELITZ et al. 2001; THURNHOFER 2007). Die hohe Variabilität entsteht

nicht nur durch die Anzahl der C-Atome, sondern auch durch die die Bildung von C-

C-Doppelbindungen, Verzweigungen und H-Substitutionen mit anderen funktionellen

Gruppen. Oft sind solche Veränderungen charakteristisch für bestimmte Organis-

mengruppen, da sie besondere Enzyme erfordern.

Abb. 1.1.: Schematische Darstellung der Eicosapentaensäure (20:5 n-3). Die Methylgruppe stellt die

n-Position in n-Schreibweise dar, die Carboxylgruppe enthält das C-1-Atom der Delta-Schreibweise.

Nomenklatorisch wird die strukturelle Vielfalt der FS durch die Angabe der

Kettenlänge (Zahl der C-Atome) und die Anzahl der Doppelbindungen ausgedrückt.

Eine Fettsäure mit 20 C-Atomen und 5 Doppelbindungen wird daher als 20:5

bezeichnet. Nach den Regeln der „International Union of Pure and Applied Chemis-

try“ (IUPAC-IUB 1978) wird das C-Atom der Carboxylgruppe als C1 gezählt. Damit ist

die Position von Doppelbindungen im Molekül eindeutig definiert. Für das Beispiel

der erwähnten FS 20:5 (Eicosapentaensäure) sind das die Positionen 5, 8, 11, 14,

17. Dies wird bei ausführlicher Benennung dem Namen der FS vorangestellt und

durch die Isomerie der Doppelbindungen in cis-(Z)- oder trans-(E)-Form ergänzt, hier

also (5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z)-Eicosapentaensäure (vgl. Abb.1.1.).

Verwirrung stiftet mitunter die Verwendung der unterschiedlichen Schreibweisen, die

sich vor allem auf die funktionell wichtige Position der letzten Doppelbindung

Methylende, n-Nomenklatur

H3C

COOH

Carboxylende, C-1-Position

17Z bzw. n-3 Position

14Z bzw. n-6- Position

1. Einleitung

3

n-3 Fettsäuren Haupt-Vorkommen n-6 Fettsäuren Haupt-Vorkommen 18:3 n-3 (ALA)* Leinöl, Walnussöl, 18:2 n-6 (LA)* Sonnenblumenöl, Rapsöl Distelöl 20:5 n-3 (EPA)* Fisch, Algen, Eumy- 18:3 n-6 (GLA) Borretsch, Nachtkerze, ceten, Moose, Oomyceten Eumyceten, Oomyceten, 22:6 n-3 (DHA)* Fisch, Algen, Eumyceten 20:4 n-6 (ARA) Tierische Fette, Eumycet-

Oomyceten, Eidotter en, Muskelfleisch , Algen,

beziehen. Liegt diese, wie bei Eicosapentaensäure, zwischen dem viert- und dritt-

letzten C-Atom der Kette, so wird die FS als n-3-FS oder ω-3-FS bezeichnet. Diese

Schreibweise ist besonders im medizinischen und pharmakologischen Bereich

gebräuchlich, da FS mit Doppelbindung in der n-3-Position besondere physiologische

Funktionen zugeordnet werden. Ähnliches gilt für die n-6- (ω-6)-Position der letzten

Doppelbindung im Molekül. Die ω-Symbolik ist zwar populär, jedoch veraltet. Im

wissenschaftlichen Bereich wird sie schon länger durch die n-Symbolik ersetzt.

1.1.2. Die medizinische Wirkung der n-3-Fettsäuren

n-3-FS und n-6-FS sind für den Menschen essenziell, d.h. sie können nicht selbst

produziert werden und müssen über die Nahrung aufgenommen werden.

Die Deutsche Gesellschaft für Ernährung (DGE) empfiehlt aktuell eine tägliche

Aufnahme von n-6- und n-3-FS im Verhältnis von 5:1 (DGE 2007) Da in unserer

Nahrung n-6-FS im Anteil sehr stark überwiegen, liegt das Verhältnis von n-6:n-3-FS

oft bei 10:1, 20:1 und schlechter.

Tab. 1.1.: Einige wichtige n-6- und n-3-FS und ihr Haupt-Vorkommen in unterschiedlichen Organis-men. *=essenzielle Fettsäuren für Menschen. Die n-6-und n-3-FS Höherer Pflanzen sind blau darge-stellt.

Dies kann unsere Gesundheit auf Dauer negativ beeinträchtigen, da n-6-FS und n-3-

FS auf molekularer Ebene in einem komplizierten Zusammenspiel immunologische

Vorgänge im Körper regulieren (STULNIG 2003). Das n-6/n-3-FS-Verhältnis ist für die

meisten Körperfunktionen wichtiger als der absolute Gehalt dieser Fettsäuren

(STULNIG 2003; WILLIAMS 2000).

n-6-FS fördern entzündliche und gefäßschädigende Prozesse, n-3-FS steuern

solchen Prozessen entgegen (SANDERS et al. 2006; SIMOPOULOS 1999; SIRTORI 1994).

Daher wird von Gesundheitsbehörden vieler Staaten empfohlen, mehr n-3-FS über

1. Einleitung

4

die Nahrung aufzunehmen, um das n-6/n-3-Verhältnis zu verbessern und Gesund-

heitsrisiken vorzubeugen (KRIS-ETHERTON et al. 2000).

Einige wichtige n-6- und n-3-FS und ihr Vorkommen werden in Tab. 1.1. aufgeführt.

Für die menschliche Ernährung sind besonders die 3 Fettsäuren der n-3-Reihe

Alpha-Linolensäure (ALA, 18:3 n-3), Eicosapentaensäure (EPA, 20:5 n-3) und

Docosahexaensäure (DHA, 22:6 n-3) von Bedeutung. Zur Reihe der n-6-FS gehören

Linolsäure (LA, 18:2 n-6), die seltene Gamma-Linolensäure (GLA, 18:3 n-6) und

Arachidonsäure (ARA, 20:4 n-6).

Da sie mehr als eine Doppelbindung enthalten, werden sie auch als „mehrfach

ungesättigte FS“ („polyunsaturated fatty acids“ bzw. „PUFAs“) bezeichnet. Beträgt

die Kettenlänge der Fettsäuren dabei mehr als 18 C-Atome, so spricht man von

„langkettigen, mehrfach ungesättigten FS“ („long-chain poly unsaturated fatty acids“,

bzw. „LC-PUFAs“) (SIMOPOULOS & SALEM 1992).

Alpha-Linolensäure muss als essenzielle FS vom Menschen über die Nahrung

aufgenommen werden. Aus ALA als Vorstufe können vom Menschen EPA und DHA

gebildet werden (Tab. 1.1.). Diese n-3-FS sind daher im engeren Sinne nicht

essenziell. Die Fettsäuren der n-6- und n-3-Reihe konkurrieren bei der Biosynthese

jedoch um dieselben Enzymsysteme (CLARKE 2001). Wir nehmen im Verhältnis zu

viele n-6-FS zu uns, so dass LA gegenüber ALA stark im Vorteil ist und dadurch

weder EPA noch DHA in ausreichender Menge gebildet werden können. Da dies zu

Mangelerscheinungen führt, werden EPA und DHA ebenfalls als essenziell eingestuft

(BROWNING 2003).

Die wichtigen medizinischen Funktionen der n-3-FS werden nicht ALA selbst sondern

den längerkettigen FS EPA und DHA zugeordnet (FINNEGAN et al. 2003; SANDERSON

et al. 2002). Weil unter Grönland Eskimos, trotz fettreicher Ernährung, Herzkrank-

heiten sehr selten waren, wurden in den 70er Jahren Studien zu den Gründen dieses

Phänomens durchgeführt. Die Herzgesundheit dieser ethnischen Gruppe wurde auf

die hohe Aufnahme von EPA und DHA aus Robben- und Fischöl zurückgeführt

(BANG et al. 1971). EPA und DHA steuern Stoffwechselprozesse, welche die

Blutfettwerte senken, was in der Infarktprophylaxe eine wesentliche Rolle spielt

(KRIS-ETHERTON et al. 2002; SANDERS et al. 2006; WOLFRUM & SPENER 2000). LC-

PUFAs werden daher in der Schlaganfall- und Herzinfarktprophylaxe sowie für die

1. Einleitung

5

Folgetherapie nach einem Infarkt eingesetzt (CALDER 2004). Da Fettsäuren in

Phospholipiden wichtige Membran-Bestandteile von Zellen sind, beeinflussen sie die

Elastizität von Gefäßen (WILLIAMS 2000). Je höher der Anteil an hoch ungesättigten

Fettsäuren ist, desto beweglicher und belastbarer werden die Membranen von

Blutkörperchen und Gefäßen (MEAD 1984). Herzinfarkt und Schlaganfall sind

Konsequenzen von Ablagerungsprozessen, bei denen ein Thrombus die Gefäße

verstopft und die Blutzirkulation verhindert (MARTIN et al. 2005). Sind nur gesättigte

Fettsäuren in die Gefäßmembranen eingebaut, so entstehen aufgrund der starren

Strukturen und in Kombination mit LDL-Cholesterin („low denstiy lipoprotein“)

Ablagerungen an den Gefäßwänden (ERKKILÄ et al. 2008). EPA und DHA sorgen für

eine elastische Struktur der Blutzellen und Gefäßmembranen und verhindern

dadurch Ablagerungen (LICHTENSTEIN et al. 2006). Sie haben zusätzlich vasodila-

tatorische (gefäßerweiternde), sowie Cholesterin senkende (HARRIS 1989;

SIMOPOULOS 1989) und Blutdruck senkende Eigenschaften (MORRIS et al. 1993).

EPA ist außerdem die Vorstufe von Gewebshormonen, den sogenannten Eicosa-

noiden. Zu ihnen gehören Prostaglandine, Leukotriene, Prostacycline und Thrombo-

xane (FUNK 2001). Diese Gewebshormone steuern Prozesse der Immunabwehr.

Eicosanoide wirken Entzündungsprozessen im Körper entgegen (CALDER 2001),

weshalb EPA in der Therapie gegen Psoriasis, Asthma, Allergien und andere

Autoimmunkrankheiten eingesetzt wird (BROWNING 2003; SIMOPOULOS 2002; STULNIG

2003).

DHA ist wesentlich an der Entwicklung von Augen und Neuronalsystem bei

Embryonen beteiligt und wird schwangeren Frauen von Ärzten zur Ergänzung der

Nahrung empfohlen (UAUY & CASTILLO 2003).

1.2. Natürliche Quellen von n-3-Fettsäuren

Als natürliche Quellen von n-3-FS werden in dieser Arbeit Nahrungsmittel

bezeichnet, die vom Menschen in ihrer ursprünglichen Form verzehrt werden können

und nicht genetisch oder technisch in ihrer Zusammensetzung verändert wurden.

Dazu zählen pflanzliche und tierische Öle, Meeresfisch und Hühnereier.

1. Einleitung

6

1.2.1. Öle Höherer Pflanzen

Die wichtigsten Lieferanten der essenziellen n-3-FS sind Öle Höherer Pflanzen.

Höhere Pflanzen produzieren n-3-FS allein in Form von ALA sowie n-6-FS in Form

von LA und GLA, da Enzyme zur weiteren Desaturierung (Einfügen von Doppel-

bindungen) und Elongation (Kettenverlängerung) der n-3-FS fehlen (SAYANOVA &

NAPIER 2004). Die seltene FS GLA wird als taxonspezifisches Merkmal nur von

wenigen Gattungen wie z.B. Oenothera (Nachtkerze) und Borago (Borretsch)

produziert (FROHNE & JENSEN 1992; VELASCO & GOFFMAN 1999).

Da Höhere Pflanzen n-3-FS ab der Kettenlänge von 20 C-Atomen nicht

synthetisieren können (BROOKS & STUMPF 1966), wird im Zusammenhang mit natür-

lichen Pflanzenölen und n-3-FS ausschließlich von ALA gesprochen. Zu den Ölen,

die besonders reich an n-3-FS sind gehören Leinöl, welches in seinem Fettsäure-

muster bis zu 60% ALA enthält, Rapsöl mit Gehalten von 6 bis 14% und Walnussöl

mit 9-15 % ALA (BUNDESMINISTERIUM FÜR VERBRAUCHERSCHUTZ 2006; FUSSENEGGER

& WINDHALM 2003). Zu den Ölen, die von Natur aus sehr reich an n-6-FS sind,

gehören Distelöl mit 68-83% LA, Sonnenblumenöl mit 48-74% LA, Maiskeimöl mit

39-66% LA und Walnussöl mit 54-65% LA. Wiederum spielt das n-6:n-3 Verhältnis

eine Rolle. Bei Rapsöl und Walnussöl ist das Verhältnis recht ausgewogen und liegt

etwa bei 5:1. Distelöl und Sonnenblumenöl enthalten dagegen kaum n-3-FS und

haben daher Verhältniswerte sehr zu Gunsten der n-6-FS. Es gibt allerdings

sogenannte „high oleic“ Sonnenblumensorten auf dem Markt, die so gezüchtet

wurden, dass anstatt hohen Mengen an LA sehr hohe Mengen an Ölsäure (18:1 n-9,

engl.: oleic acid) produziert werden (COLE et al. 1998), was das Verhältnis zu

Gunsten von n-3-FS verbessert. Ölsäure ist mit 60% auch Hauptbestandteil in

Olivenöl, einer Hauptkomponente der „Mittelmeerdiät“, welches mit einem n-6:n-3-

Verhältnis von 5:1 ebenfalls als physiologisch wertvoll gilt (SIMOPOULOS 2001). Nicht

nur Öle sondern auch grüne Pflanzengewebe enthalten hohe Konzentrationen an

ALA. So gilt z.B. Portulak (Portulaca oleracea L.) mit 3-4 mg ALA pro g Frischgewicht

als guter ALA Lieferant (EZEKWE et al. 1999; SIMOPOULOS 1995), auf Verpackungen

von französischem Feldsalat wird aktuell mit der n-3-FS Konzentration von 2,5 mg

pro g Frischgewicht geworben.

1. Einleitung

7

1.2.2. Tierische Quellen

Der Begriff n-3-FS wird selten mit tierischen Produkten in Verbindung gebracht, da

damit meist gesättigte, feste Fette (ERKKILÄ et al. 2008) wie Schweineschmalz, Butter

oder Rinderfett assoziiert werden. Es gibt jedoch auch Tiere wie Meeresfische und

Hühner, die n-3-FS in Form von LC-PUFAs (EPA und DHA) anreichern können.

Meeresfische

Über die natürliche Nahrung nehmen Meeresfische Phytoplankton auf, welches zu

einem erheblichen Anteil von Mikroalgen aus der Gruppe der Heterokontophyta

gebildet wird. Diese Mikroalgen produzieren nennenswerte Mengen an EPA und

DHA (TONON et al. 2002), die sich über die Nahrungskette in Fleisch und Fettgewebe

von Fischen anreichern. Bereits 1-2 Portionen Meeresfisch pro Woche können so

den menschlichen Bedarf an PUFAs decken (KRIS-ETHERTON et al. 2002). Wo Fisch

in unzureichender Menge auf dem Speiseplan steht, werden Nahrungsergänzungs-

mittel wie Fischölkapseln empfohlen (KRIS-ETHERTON et al. 2000). Diese enthalten

EPA und DHA in angereicherter Form, je nach Hersteller in Konzentrationen von

100-300 mg EPA/g ÖL und 100-300 mg DHA/g ÖL (ACKMAN et al. 1989).

Hühnereier

Hühnereier genießen den Ruf, den Cholesterinspiegel im Blut in die Höhe zu treiben

und daher ungesund zu sein. Hühnervögel produzieren jedoch im Eidotter, welches

zu 33% aus Lipiden besteht, etwa 4% DHA (SIMOPOULOS & SALEM 1989). Mit dem

Verzehr eines Eies mit einem Eigewicht von 40 g kann damit fast der komplette

Tagesbedarf an DHA gedeckt werden. Das n-6/n-3-Verhältnis bei Eiern liegt bei

konventionellen Eiern etwa bei 8-10:1, bei „Omega-3-Eiern“ liegt es bei oder unter

5:1, was den Empfehlungen der DGE entspricht. Der mäßige Verzehr von Eiern wird

daher als gesund und empfehlenswert eingestuft (NOBLE et al. 1990; SIMOPOULOS &

SALEM 1992). Der DHA- und Cholesteringehalt von Eiern kann durch die Fütterung

der Hühner, und damit über die Nahrungskette, stark beeinflusst werden (CHUNG et

al. 1965; GRASHORN 1994; OH et al. 1991; SCHOLTYSSEK 1991). Für die Herstellung

von „Omega-3-Eiern“ bekommen Hühner ALA-reiche Pflanzenöle wie z.B. Leinöl

zugefüttert (RICHTER & KÖHLER 1998). Diese werden bei genügend hoher Dosis im

Organismus des Huhnes in DHA umgewandelt und reichern sich als ALA und DHA

im Eidotter an (STEINHILBER 2003). Auch Fischöl, Fischmehl und Robbenöl haben

1. Einleitung

8

einen positiven Effekt auf den EPA und DHA Gehalt im Eidotter und werden dem

Hühnerfutter zugemischt, um „Omega-3-Eier“ zu erhalten (SCHREINER et al. 2004).

Diese Produkte können allerdings den negativen Nebeneffekt haben, dass die Eier

nach Fisch schmecken (MARSHALL et al. 1994).

1.3. Problematik natürlicher Quellen

Die Fischbestände im Meer sinken rapide, da global Überfischung betrieben wird

(NAYLOR et al. 2000). Hinzu kommt die Verschmutzung der Gewässer mit

Industrieabfällen und Schwermetallen, welche sich im Fisch anreichern, was diesen

ungenießbar machen kann. Die beiden Alternativen Hühnereier und Öle Höherer

Pflanzen haben ebenfalls entscheidende Schwachpunkte. So enthalten Hühnereier

von Natur aus viel DHA, sie enthalten jedoch äußerst wenig EPA und auch viele

gesättigte FS, die als nicht so gesund gelten. Die Öle Höherer Pflanzen sind

dagegen reich an ungesättigten Fettsäuren. Mit Hilfe von Ölen Höherer Pflanzen

können Menschen zwar ihren Bedarf an ALA decken, nicht jedoch den Bedarf an LC-

PUFAs der n-3-Reihe, also EPA und DHA. Diese gelten jedoch wegen ihrer

pharmakologischen Eigenschaften als besonders wertvoll und sollten deshalb

zusätzlich über die Nahrung aufgenommen werden.

1.4. Alternative Quellen für EPA und DHA

In Anlehnung an die Definition der geltenden Fassung der „Novel Food Verordnung“

der EU von 1997 (EU 1997) werden in dieser Arbeit solche Organismen als

alternative n-3-FS-Quellen bezeichnet, die in dieser Form in Europa noch nicht

verzehrt werden. Dazu gehören technisch gewonnene Produkte Niederer Pflanzen

und gentechnisch veränderte Pflanzen.

1.4.1. Öle Niederer Pflanzen als alternative Quellen für EPA und DHA

Niedere Pflanzen sind im Gegensatz zu Höheren Pflanzen dazu in der Lage, EPA

und DHA zu produzieren und können uns als alternative Quellen für diese FS dienen.

Zu ihnen zählen marine Mikroalgen der Heterokontophyta, Oomyceten, Eumyceten

und Moose. Oomyceten sind mit den heterokontophyten Algen phylogenetisch eng

verwandt und sind als Saprophyten oder als Krankheitserreger von Tieren und

Pflanzen bekannt. Zur den Oomyceten gehören z.B. die Gattungen Thraustochytrium

und Schizochytrium, die saprophytisch von abgestorbenen Pflanzenteilen im

1. Einleitung

9

Brackwasser leben. Die auf lebende Wirte angewiesenen Falschen Mehltaupilze

(Peronosporaceae), sind dagegen hoch spezialisiert und auf künstlichen Nährmedien

bisher nicht kultivierbar.

Thraustochytrium und Schizochytrium sind bereits wirtschaftlich relevant für die

Produktion von DHA und ARA und werden großtechnisch in Bioreaktoren mit Nähr-

medium gezüchtet, wobei sie, je nach Nährmedium, Stamm und Biomasse, bis zu 10

g DHA pro L und Tag produzieren (WARD & SINGH 2005). Schizochytrium-Arten

werden als Futter für Aquakulturen verwendet und aktuell als Ersatz für Fischmehl im

Futter für Meerbrassen in Aquakultur diskutiert (BARCLAY & ZELLER 1996; GANUZA et

al. 2008).

Mikroalgen mehrerer Gattungen werden bereits wirtschaftlich zur EPA und DHA

Gewinnung in Bioreaktoren gezüchtet und für die Gewinnung von sogenanntem

„Algenöl“ herangezogen. Dabei handelt es sich um einen Lipidextrakt aus

Algenbiomasse, der in lipophilem Lösungsmittel angereichert und aufgereinigt (nur

die gewünschten FS bleiben enthalten) wurde. Es sind sowohl heterotrophe als auch

phototrophe Algen im Einsatz. Die heterotrophe Mikroalge Ulkenia wird z.B. für die

Produktion von Algenöl der Firma Lichtwer (Berlin) verwendet, welches in der

Apotheke in Form von Algenölkapseln (Ameu® Alge) erhältlich ist. DHA ist darin in

aufgereinigter Form enthalten und erreicht Konzentrationen von ca. 300 mg/g ÖL.

Dies entspricht der Menge in konzentrierten Fischölkapseln. Die phototrophe Alge

Phaeodactylum tricornutum wird in Photobioreaktoren gezüchtet und zur EPA

Gewinnung herangezogen, wobei bis zu 40 mg pro L und Tag produziert werden

können (MEISER et al. 2004). Die phototrophe, marine Mikroalge Monodus

subterraneus (HSIAO & BLANCH 2006) wird neben vielen anderen Gattungen ebenfalls

zur EPA Produktion eingesetzt und kommt unter optimalen Bedingungen auf

ähnliche Gehalte wie Phaeodactylum tricornutum (WARD & SINGH 2005). DHA aus

Oomyceten- und Mikroalgenkulturen wird als „Einzelleröl“ bzw. „single cell oil“ in den

USA bereits großtechnisch produziert und Babynahrung zugesetzt (WARD & SINGH

2005), da DHA an der Entwicklung des Nervensystems und des Immunsystems vom

Menschen beteiligt ist. Es wird momentan intensiv nach neuen Organismen gesucht

und es werden laufend neue Gattungen gefunden, die DHA und EPA produzieren

und als Genbank oder auch als Produzenten für LC-PUFAs genutzt werden können

(QI et al. 2002; SANINA et al. 2008). Eumyceten der Gattung Mortierella und

1. Einleitung

10

Oomyceten der Gattung Pythium sind ebenfalls als EPA und DHA Lieferanten

beschrieben, manche Stämme produzieren 25 mg EPA pro g Trockenmasse

(O´BRIEN et al. 1993; SINGH & WARD 1998). Kulturen von Mortierella- und Pythium

werden Rapsöl und Rapsschrot zugesetzt, so dass die Organismen, aus LA und ALA

als Vorstufen, die FS ARA und EPA produzieren (DONG & WALKER 2008).

Auch Moose der Gattung Physcomitrella sind in der Lage EPA und ARA zu

produzieren (SENGER et al. 2005). Sie spielen daher momentan für die Erforschung

der Fettsäurebiosynthese für EPA und ARA eine Rolle (KAEWSUWAN et al. 2006)

1.4.2. Transgene Pflanzen

Für Zwecke der industriellen Nutzung und Ernährung werden derzeit jährlich ca. 100

Mio Tonnen Pflanzenöl produziert (DREXLER et al. 2003). Höhere Pflanzen sind

natürliche „Ölfabriken“, die effizient mit reinem Sonnenlicht arbeiten. In den letzten

Jahren wurde intensiv an den Biosynthesewegen von LC-PUFAs geforscht

(GALANINA & KONOVA 1998; MICHAELSON et al. 1998; SPERLING & HEINZ 2001) und die

DNA- Sequenzen der verantwortlichen Enzyme für die Synthese von DHA und EPA

aus Niederen Pflanzen wurden aufgeklärt (BEAUDOIN et al. 2000a; BEAUDOIN et al.

2000b; DOMERGUE et al. 2002; NAPIER & MICHAELSON 2001; SAYANOVA & NAPIER

2004). Es gibt aktuell mehrere Forschergruppen, die versuchen, über den

Gentransfer von Enzymen aus Niederen Pflanzen (Pilzen, Algen oder Moosen) in

Raps und Soja EPA und DHA zu produzieren (NAPIER et al. 2004; QI 2004; ROBERT

2006; TONON et al. 2005). Ins Genom eingebaute Elongasen und Desaturasen sollen

aus ALA die FS EPA und DHA produzieren (URSIN 2003; WU et al. 2005). Auf diese

Weise wird es bald Landpflanzen geben, die LC-PUFAs synthetisieren können

(GRAHAM et al. 2007; URSIN 2003).

1.5. Problematik alternativer Quellen

Niedere Pflanzen sind, was die Quantitäten von DHA angeht, zwar sehr gute

Alternativen zu Meeresfisch. Die Produktion in Bioreaktoren sowie die Aufreinigung

des Öls kosten jedoch sehr viel Energie und setzen ein Höchstmaß an Technik

voraus. Mikroalgen und Oomyceten produzieren vorwiegend nur eine LC-PUFA, d.h.

es wird entweder viel EPA oder viel DHA produziert. Ölkapseln sind zudem keine

Form natürlicher Ernährungsweise und nicht jeder kann sich Ölkapseln aus der

Apotheke leisten, da eine teure Produktion auch teure Produkte hervorbringt.

1. Einleitung

11

Die Biosynthese von EPA oder DHA in Ölen Höherer Pflanzen ist bisher noch im

Forschungsstadium. Das gezielte Einbringen der Gene an die Orte, wo später die

Fettsäurebiosynthese und Speicherung stattfindet, stellt immer noch eine große

Herausforderung dar (CSIRO 2005; DREXLER et al. 2003).

In der Bevölkerung gibt es zudem für gentechnisch modifizierte Nahrungsmittel

wenig Akzeptanz, da die Folgen für Mensch und Umwelt nicht abschätzbar sind.

1.6. Aktueller Stand der Forschung und Zielsetzung d er Arbeit

Der Falsche Mehltau der Sonnenblume Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. & DeToni

(1888) und der Falsche Mehltau auf Salat Bremia lactucae Regel (1843) gehören,

wie die bereits erwähnten Taxa Schizochytrium oder Thraustochytrium, ebenfalls zu

den Oomycota. Sie sind jedoch nicht heterotroph im Reaktor kultivierbar sondern

wirtsspezifisch und von der lebenden Wirtspflanze abhängig (obligat biotroph). Sie

schädigen die Pflanze nur begrenzt und bilden keine Toxine. Die Fettsäure-

zusammensetzungen dieser Gattungen sind taxonspezifisch und können zu

systematischen Zwecken benutzt werden (SPRING & HAAS 2002; SPRING & THINES

2004; SPRING et al. 2005). Sowohl B. lactucae als auch P. halstedii produzieren die

Fettsäure EPA zu einem erheblichen Anteil ihres Fettsäuremusters, lassen sich

jedoch wegen ihrer biotrophen Lebensweise nicht direkt zur Gewinnung von EPA

nutzen.

Bei der bisherigen Suche nach alternativen Quellen zur Produktion von LC-PUFAs

wurden die Organismen isoliert betrachtet. Es wurde nicht berücksichtigt, dass

obligat-biotrophe Oomyceten zusammen mit ihrem Wirt ein mögliches Potenzial für

die menschliche Ernährung mit LC-PUFAs besitzen könnten.

Das Ziel dieser Arbeit war es, die Nutzungsmöglichkeit der Falschen Mehltaupilze

von Sonnenblume und Salat in Kombination mit ihren Wirten als n-3-FS-Lieferanten

zu erforschen. Hintergrund dafür war der Gedanke, eine alternative und gentechnik-

freie Quelle für LC-PUFAs zu finden, deren Produktion durch ein natürliches,

energetisch günstiges, System geschieht. Dabei war der Blick besonders auf die FS

EPA gerichtet. Eventuell konnte mit Hilfe spezieller, optimierter Kultivierungs-

techniken genügend EPA produziert werden, um in der menschlichen Ernährung

genutzt zu werden.

1. Einleitung

12

Als Basis für die Bewertung des Nutzungspotenzials infizierter Nutzpflanzen dienten

die Anwendung und die Weiterentwicklung von Infektions- und Anzuchtmethoden für

genetisch homogenes Sporangienmaterial von P. halstedii und B. lactucae sowie

vergleichende Fettsäureanalysen. Um zusätzlich zum bisherigen Forschungsstand

die Fettsäurezusammensetzung verschiedener Lipidklassen zu untersuchen, wurden

für diese Arbeit für die Aufbereitung von Oomycetenlipiden kombinierte Methoden

der Dünnschichtchromatographie (DC) und Gaschromatographie (GC) angewandt.

Die Fettsäuremuster und -konzentrationen der Modellsysteme Sonnenblume/ P.

halstedii und Salat/B. lactucae wurden mit Hilfe der Gaschromatographie (GC)

qualitativ erfasst und quantifiziert (Kapitel 2), mit dem Ziel, diese für die menschliche

Ernährung qualitativ und quantitativ zu bewerten.

Es wurde angenommen, dass die produzierten EPA-Gehalte von Sporangien und

infiziertem Pflanzengewebe beeinflusst und erhöht werden konnten. Um dies zu

zeigen, wurden verschiedene Versuche zur Erhöhung des EPA-Gehaltes von

Sporangien und infiziertem Blattmaterial in Kapitel 3 durchgeführt. Das Wirt-

/Pathogen-System Sonnenblume/P. halstedii diente als Modellbeispiel, da die

Kultivierungstechnik bekannt und mit vielen Isolaten und Stämmen am Institut für

Botanik etabliert war (ROZYNEK 2000; SPRING et al. 1997). Zunächst wurden über

artinternes Screening zwischen Sporangienstämmen genotypische Unterschiede in

der EPA-Konzentration erforscht. Dann wurde nach besonders anfälligen

Wirtspflanzen gesucht und über die Variation des Infektionsdrucks versucht, den

EPA-Gehalt im infizierten Blattmaterial zu optimieren. Ebenso galt es, die

Auswirkungen von Stickstoff auf Wachstum und EPA-Konzentration infizierter

Pflanzen zu untersuchen.

Um die praktische Relevanz des Systems Wirt/Falscher Mehltaupilz für die

Nahrungskette zu erforschen (Kapitel 4), wurde mit Salat/B. lactucae und Hühnern

ein Versuch zur Anreicherung von EPA über die Nahrungskette durchgeführt. Es

wurde getestet, ob eine 10%ige Futterbeimischung von infiziertem Salat dazu

geeignet ist, über den Stoffwechsel des Huhnes den n-3-FS Gehalt im Eidotter zu

verbessern. Die spezielle Frage war, ob sich EPA aus B. lactucae infiziertem Salat

als Zusatz in Hühnerfutter im Eidotter als EPA oder DHA anreichern würde.

Abschließend wurde das Potenzial von infizierten Nutzpflanzen als n-3-FS-Quellen

für die menschliche Ernährung bewertet (Kapitel 5).

2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe

13

2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrati onen in Spo-

rangien und infiziertem Pflanzengewebe

Mit Hilfe spezieller Anzucht- und Infektionstechniken sollten infiziertes Pflanzen-

gewebe sowie genetisch homogenes Sporangienmaterial produziert werden, um die

enthaltenen EPA-Konzentrationen erfassen zu können. Die Fettsäuremuster der

Gesamtlipidextrakte von Sporangien von B. lactucae und P. halstedii wurden für

taxonomische Zwecke am Institut für Botanik bereits qualitativ und prozentual

aufgeklärt und beschrieben (SCHÄUFFELE 2005). Um genaue Angaben zu den EPA-

Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflanzengewebe machen zu können,

musste für diese Arbeit zusätzlich ein GC-Verfahren erarbeitet werden, mit dem eine

verlässliche Quantifizierung möglich war.

Ergänzend zum bisherigen Forschungsstand wurden Untersuchungen darüber

durchgeführt, wie die Fettsäuren in den einzelnen Lipidklassen von P. halstedii und

B. lactucae verteilt sind. Für Mikroalgen werden solche Analysen auf Grund

chemotaxonomischer und ökonomischer Interessen aktuell durchgeführt (CHEN et al.

2008; SANINA et al. 2008). Am Ende des Kapitels konnte so ein Vergleich der

qualitativen Beschaffenheiten der FS-Muster sowie der FS-Zusammensetzungen der

einzelnen Lipidklassen stattfinden. Zudem wurden die EPA-Produktivitäten verschie-

dener Systeme miteinander verglichen.

2.1. Materialien und Methoden

2.1.1. Infektionstechniken und Ernte

Feldisolate genetisch homogener Einzelsporenisolate von P. halstedii standen am

Institut für Botanik zur Verfügung. Die Stämme BL-11.06-02-A4z, GG-16.10.07-A25,

He-10.01.06-A8, LS-13.12.05-C6 wurden für taxonomische Zwecke mit Einzel-

sporangien oder Einzelsporen aus Feldisolaten generiert und vermehrt (SPRING et al.

1998). Die Inokulation der Pflanzen erfolgte im Keimlingsstadium nach der WSI

(whole seedling infection)- Methode (COHEN & SACKSTON 1973; ROZYNEK 2000). Zur

Anzucht und Vermehrung von P. halstedii wurde die Sonnenblumensorte Giganteus

verwendet, die als besonders anfällig gilt.


14

Ein Feldisolat von B. lactucae konnte im Rahmen dieser Arbeit von Salatpflanzen der

Versuchsstation für Gartenbau (Hohenheim) isoliert werden. Die Salatsorte Cobham

Green diente der Anzucht und Vermehrung von B. lactucae (DATNOFF et al. 1994).

2.1.1.1. Keimlingsinfektion bei P. halstedii

Für die Infektion wurden 20 Sonnenblumensamen verschiedener Sorten bzw. Linien

mit dest. Wasser gewaschen und in Petrischalen auf feuchtem Filterpapier bei 25 °C

im dunklen Wärmeschrank für 24 h angekeimt. Gleichzeitig standen ca. 14 Tage alte,

stark infizierte Sonnenblumen zur Verfügung, deren Keimblätter voll entwickelt

waren.

Abb. 2.1.: P. halstedii. Links: Sporangien mit schlüpfenden Zoosporen. Rechts: Infizierte Sonnenblu-

me nach induzierter Sporulation.

Der Erreger, der sich 14 Tage lang latent im Sonnenblumengewebe vermehrt hatte,

wurde über Nacht in einer nassen, geschlossenen Styroporbox zur Sporulation

gebracht, so dass am nächsten Tag ein weißer Rasen frischer, infektionsfähiger

Sporangien auf den Keimblättern zu sehen war (Abb. 2.1.).

Die angekeimten Sonnenblumensamen wurden mit einer Pinzette von ihren Schalen

befreit, unter dest. Wasser in einem Sieb abgespült und in ein Becherglas mit 20 ml

dest Wasser überführt. Zwei bis vier infizierte Keimblätter der sporulierenden

Sonnenblumen wurden in das Becherglas gegeben und die Sporangien gründlich mit

Wasser vom Blatt gespült. Die Konzentration der Sporangien/ml Inokulum wurde

lichtmikroskopisch mit Hilfe einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer bestimmt und durch

entsprechende Verdünnung auf den gewünschten Wert eingestellt. Die Keimlinge

wurden ca. 4 h abgedunkelt bei 16°C im Infektionsinoku lum belassen, damit die

Zoosporen schlüpfen konnten (Abb. 2.1.). Die Schlüpfrate der Zoosporen wurde

mikroskopisch kontrolliert und lag meist zwischen 70 und 100 %. Die Zoosporen

10 µm


15

bildeten Keimschläuche, die in das Wirtsgewebe eindrangen. Nach 4 h Inkubation

wurden die Keimlinge in eine Pflanzschale mit Einheitserde gepflanzt und mit dest.

Wasser und dem restlichen Inokulum gleichmäßig bewässert. Die Pflanzschalen

wurden eine Nacht abgedunkelt und 14 Tage offen in den Klimaschrank gestellt (16/8

h Tag/Nacht, 16°C, 80% relative Luftfeuchte, Lichtint ensität (Photonenfluss) 30

µmol/m²•s). Nach 14 Tagen waren die Keimlinge bereits voll infiziert und reif für das

nächste Sporulationsereignis.

2.1.1.2. Blattinfektion bei B. lactucae

Für die Infektion mit B. lactucae wurde gesunder Salat im Klimaschrank angezogen,

bis er im 4-6 Blattstadium war (ca. 8 Wochen). B. lactucae wurde dann auf diesen

Salatblättern vermehrt, indem die Methode der Blattscheibeninfektion für Sonnen-

blumen (ROZYNEK & SPRING 2001; SPRING et al. 1997) etwas abgewandelt wurde.

Im Abstand von 3 Wochen wurde Salat der Sorte Cobham Green in 2 Schalen mit

Einheitserde gepflanzt und 8 bis 10 Wochen angezogen, so dass immer frische und

infektionsfähige Blätter zur Verfügung standen.

Aus stark befallenen und sporulierenden Salatblättern vom Feld bzw. aus neusporu-

lierendem, genetisch homogenem Material aus dem Klimaschrank wurde analog zu

den Versuchen mit P. halstedii ein Inokulum hergestellt. Die Sporangienmenge

wurde mit Hilfe einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer auf die optimale Menge von

5000 Sporangien/ml eingestellt. Im Unterschied zu P. halstedii bildeten die Sporan-

gien von B. lactucae unter genannten Bedingungen direkt Keimschläuche und

entließen keine Zoosporen (Abb. 2.2.).

Abb. 2.2.: B. lactucae. Links: Keimendes Sporangium von B. lactucae mit Keimschlauch und Plasma.

Rechts: Sporulierender Erreger mit weißem Sporangienrasen auf der Blattunterseite von jungem

Salat.

5 µm


16

Die Infektion selbst erfolgte in großen, flachen, lichtdurchlässigen und verschließ-

baren Plastikschalen. Diese wurden mit feuchtem Papier ausgelegt, worauf 8

Wochen alte, gesunde Salatblätter platziert wurden. Das Inokulum wurde mit einer

1ml Pipette aufgezogen und tropfenweise, gleichmäßig auf die Salatblätter verteilt.

Die lichtdurchlässigen Plastikschalen wurden geschlossen und in den Klimaschrank

(16/8 h Tag/Nacht, 20°C, 80% relative Luftfeuchte, Li chtintensität (Photonenfluss) 30

µmol/m²•s) gestellt. Nach ca. 7-10 Tagen fand auf der Oberfläche (meist zu 80-100

%) der Salatblätter spontan die Neusporulation statt (Abb. 2.2.).

2.1.1.3. Ernte und Lagerung von Sporangien und Pfla nzenmaterial

Die Sporangien von P. halstedii und B. lactucae mussten, um den Fettsäuregehalt

untersuchen zu können, von den Pflanzenoberflächen möglichst schonend, komplett

und verlustfrei geerntet werden. Dies geschah mit einer Mikroabsaugvorrichtung

(ROZYNEK 2000), die als Deckel auf ein 2 ml Reaktionsgefäß passte. Sie funktionierte

nach dem Unterdruckprinzip mit einem Teflonschlauch, der an eine Wasserstrahl-

pumpe angeschlossen war. Durch den entstehenden Sog wurden die Sporangien der

Pflanzenoberflächen in das Reaktionsgefäß eingesaugt. Die Gefäße mit dem

eingesaugten Sporangien- und Hyphenmaterial wurden in Kryoboxen bei -20°C

gelagert, wo die Erreger haltbar und infektionsfähig blieben.

Um den EPA-Gehalt der infizierten Keimlinge und Salatblätter zu bestimmen, wurden

diese bei voller Infektion aber vor Sporulation geerntet, um keine Verluste während

der Ernte zu haben und gute Vergleichbarkeit zu garantieren. Die infizierten

Pflanzengewebe wurden für die FS-Analyse in einem geöffneten Reaktionsgefäß bei

Raumtemperatur (RT) im Exsikkator 4 Tage getrocknet. Das getrocknete Pflanzen-

gewebe wurde, ebenfalls wie die Sporangien, auf die EPA-Konzentration hin

untersucht.

2.1.2. Aufbereitung der Fettsäuren für die GC-Analy se

Um die verschiedenen Gehalte an EPA und anderen FS verschiedener Proben

miteinander vergleichen zu können, war eine verlässliche Standard-Analytik notwen-

dig. Für die Erfassung der FS-Profile von Oomyceten wurde die Gas-Chromato-

graphie (GC) mit Kapillarsäulen zur Flüssigaufgabe und Flammenionisationsdetektor

(FID) verwendet (SPRING & HAAS 2002). Diese Technik gilt auch in der Lebensmittel-


17

industrie als Standardmethode zur Quantifizierung und Analyse von Fettsäuremethyl-

estern (FAMEs) und wird ausdrücklich von der „American Oil Chemists Society“

(AOCS) empfohlen (SHANTHA & NAPOLITANO 1992). Die Bestimmung und Identifika-

tion der FAMEs in den Proben basierte auf identischen Retentionszeiten von Proben-

peak und externem Standard. Die Probenaufbereitung selbst bestand aus zwei

Schritten: 1. Extraktion der Gesamtlipide mit Lösungsmittel, 2. Abspalten der FS von

ihren Lipidklassen und Derivatisierung in leicht verdampfbare Methylester.

2.1.2.1. Extraktion der Fettsäuren

Materialien: Sporangien, infiziertes Pflanzenmaterial, Stahlkugeln, Vakuumkonzen-

trator (Bachofer, Reutlingen), Waage (sartorius research, Sartorius, Göttingen), Zen-

trifuge (Biofuge 13, Heraeus, Hanau), Schüttelmühle (Retsch, Haan), n-Hexan (p.a.,

Merck, Darmstadt), 2 ml Glasgefäße für chromatographische Zwecke, 2 ml Plastik-

reaktionsgefäße.

Sporangien

Für die GC-Analyse der FS reichten Sporangien in kleinsten Mengen, daher wurde

mit Lösungsmittelmengen im µl Bereich gearbeitet. Da Sporangien in lipophilem

Lösungsmittel sehr schnell aufplatzten und ihren Inhalt freigaben, war eine einmalige

Zugabe von n-Hexan ausreichend, Extraktion und Methylierung erfolgten daher in

einem Schritt (LEPAGE & ROY 1984; MEIER et al. 2006).

Zu ca. 0,5 mg Sporangien wurden 150 µl n-Hexan gegeben. Die Methylierungsrea-

genzien wurden dem Proben/n-Hexan-Gemisch direkt zugesetzt, wonach die Säure-

katalysierte Veresterung der FS für die GC-Analyse durchgeführt wurde. Jeder Probe

wurde vor Extraktion/Methylierung ein 17:0 oder ein 23:0 Standard (vgl. Kap. 2.1.4.)

in definierter Konzentration zugesetzt.

Pflanzenmaterial

Das Pflanzenmaterial wurde dagegen in 2 Schritten extrahiert und methyliert.

Die Proben (0,05-0,5 g) wurden auf einer Analysenwaage eingewogen und in einem

2 ml Plastikreaktionsgefäß mit einer Schüttelmühle 5 min bei 70 Schwingungen/min

mit 2 Stahlkugeln fein zermahlen. Jeder Probe wurden die Fettsäuren 17:0 bzw. 23:0

in einer definierten Konzentration als interner Standard zugesetzt. So konnte man


18

spätere Verluste an Fettsäuren während der Verarbeitung korrigieren. Die Lipide der

Proben wurden 3x30 min mit 150 µl n-Hexan extrahiert. Die Lösungsmittelphasen mit

Lipiden wurden bei 13000 Upm für 2 min abzentrifugiert und in 2 ml Reaktions-

gefäßen vereint. Das Lösungsmittel wurde bei RT für 30 min im Vakuumkonzen-

trator abgedampft. Die Lipide wurden in 150 µl n-Hexan aufgenommen und in 2 ml

Glasgefäße für die GC überführt. Sie wurden anschließend für die GC-Messungen

derivatisiert.

2.1.2.2. Säure-katalysierte Veresterung der Fettsäu ren für die GC-Analyse

Die FS mussten aus ihren Lipidgerüsten abgespalten und in leicht verdampfbare

Fettsäuremethylester (FAMEs) überführt werden. Bortrifluorid in Methanol ist eine

Lewis-Säure und katalysiert die Abspaltung der FS von den Lipidgerüsten sowie die

Neuveresterung der Säuregruppen der FS mit einer Methylgruppe.

Im Gegensatz zur Basen-katalysierten Veresterung werden bei der Säure-kataly-

sierten Veresterung die FS aller Lipidklassen, auch Freie FS, in ihre Methylester

überführt (SHANTHA & NAPOLITANO 1992).

Die Derivatisierung der FS zu FAMEs erfolgte säurekatalysiert mit Bortrifluorid–

Methanolkomplex (SPRING et al. 2005). Da die Veresterung mit Bortrifluorid–Metha-

nolkomplex auch in der Lebensmittelchemie als Standardmethode der AOCS

empfohlen wird (ACKMAN 1998; SHANTHA & NAPOLITANO 1992), konnte diese etablier-

te Methode unter geringer Abwandlung beibehalten werden.

Materialien: Spritze (10 µl ml, SGE, Griesheim) zur Flüssigprobenaufgabe am GC,

Thermoblock (Pierce reacti-therm, Thermo Fisher Scientific, Illinois, USA), Bortri-

fluorid-Methanolkomplex (p.a.,20%, Merck, Darmstadt), Petrolether (Riedel-de Haën,

Taufkirchen), tertiärer Butylmethylether (TBME) (p.a., Merck, Darmstadt), H20 dest,

Isooctan (p.a., Merck, Darmstadt), Stickstoff gasförmig (Reinheit 4.6, 5.0), Pasteur-

pipetten, Eppendorfpipetten, Supelco 37 Komponenten-Standard (Sigma-Aldrich,

Taufkirchen), EPA-Methylester (Sigma-Aldrich, Taufkirchen), Heptadecansäure

(17:0) (Fluka, Taufkirchen).


19

Den Proben wurden 50 µl TBME als Lösungsvermittler und 250 µl Bortrifluorid-

Methanolkomplex zugesetzt. Bei 90°C im Thermoblock wurd en die FS von ihren

Esterbindungen abgespalten (Verseifung) und neu verestert. Die Proben mussten ca.

10 min bei RT abkühlen. Für die anschließende Phasentrennung wurden 500 µl

Petrolether sowie 500µl dest. Wasser zugesetzt und die Proben wurden gründlich

ausgeschüttelt. Die Petroletherphase wurde abpipettiert und im Stickstoffstrom

abgedampft. Die FAMEs wurden in 30-50 µl Isooctan aufgenommen und in 2 ml

Glasgefäßen bei -20°C bis zur Messung am GC gelagert.

2.1.3. GC-FID Messtechnik

Da es für die Quantifizierung der FS entscheidend ist, wie die Proben aufgegeben

werden (SCHREINER 2005), welche Säulen verwendet werden, wie die Temperatur-

programme geregelt sind und welcher Messbereich gewählt wird, soll kurz darauf

eingegangen werden.

2.1.3.1. Kalibrieren des Messbereiches

FID-Detektoren sind massenabhängig (SCHOMBURG 1987). Das elektrische Signal,

das am FID gemessen wird ist proportional zur Probenmenge. Um den linearen

Bereich des FID zu verifizieren und eine verlässliche Quantifizierung zu ermöglichen,

wurde eine bekannte Konzentration EPA-Methylester in unterschiedlicher Menge

eingespritzt (ACKMAN et al. 1963). Die Linearität der Messbereiche war stets mit

einem Bestimmtheitsmaß von über 99% gegeben. Es wurde je nach Proben-

konzentration mit „Range 0“ und „Range 1“ gearbeitet, wobei „Range 0“ das

empfindlichste Detektionsfenster darstellte, mit dem noch pg-Mengen an Substanzen

in Proben nachgewiesen werden konnten. „Range 1“ war um den Faktor 10 weniger

empfindlich und für höher konzentrierte Proben mit Fettsäuremengen im ng-Bereich

und µg-Bereich geeignet. Proben höherer Konzentration belasteten jedoch die

empfindlichen Säulen, was zu deaktivierten Stellen und Säulenbluten führte. Daher

wurde auf niedrigere Empfindlichkeitsstufen (Range 2 etc.) verzichtet, indem die

Proben so verdünnt wurden, dass bei Range 0 oder Range 1 gemessen werden

konnte.


20

2.1.3.2. Einspritztechnik/Probenaufgabe

Die Proben wurden in einer flüssigen Isooctan-Matrix mit einer 10 µl Spritze mit

Stahlkolben aufgegeben. Da jede Probe manuell eingespritzt wurde, war es für eine

reproduzierbare und verlässliche Quantifizierung nötig, eine präzise Einspritztechnik

anzuwenden (ACKMAN et al. 1963). Daher wurde die Probenaufgabe stets von

derselben Person durchgeführt. Es wurde die Kaltnadel-Technik („solvent flush cold

needle“) angewendet (SCHOMBURG 1987). Dazu wurden zwischen 0,5 und 2 µl

Flüssig-Probe aufgezogen. Zur Probe wurde zusätzlich 0,5 µl Luft aufgezogen und

sie wurde ohne Wartezeit in den Injektor gespritzt.

2.1.3.3. Säulen

Für die Fettsäure-Analytik am GC-FID wurden in dieser Arbeit gebundene Silika-

Kapillarsäulen („fused silica“) als stationäre Phasen verwendet. Dieser Säulentypus

gilt aktuell für die Trennung von FS als der Beste (ACKMAN 2002). Die Säulen werden

meist nach dem Polaritätsindex eingeteilt der von 0 (unpolar, Innenbeschichtung mit

Squalan) bis 100 (polar, Innenbeschichtung mit Cyanopropylpolysiloxan oder

Polyethylenglykol) reicht. Für diese Studie wurden polare Säulen verwendet, da

unpolare Säulen die ungesättigten FS der Kohlenstofflänge 18 schlecht bis gar nicht

trennen, ebenso wenig die ungesättigten FS der Kohlenstofflänge 20 und 22

(SHANTHA & NAPOLITANO 1992). Diese ungesättigten FS werden auf polaren Säulen

dagegen gut getrennt. Die Auftrennung auf der Säule erfolgte nach Polarität (Anzahl

der Doppelbindungen) und Kettenlänge der enthaltenen FAMEs. Je länger die Koh-

lenstoffkette und je mehr Doppelbindungen, desto länger die Retentionszeit der

FAMEs. Isomere eluieren schneller, je näher die Doppelbindung an der COOH-

Gruppe liegt, also 18:1 n-9<18:1 n-7<18:2 n-6 <18:3 n-3. Die polaren stationären

Phasen ermöglichen sogar die Trennung von cis- und trans-Isomeren, was sie für die

moderne Fettsäureanalytik besonders attraktiv macht (Abb. 2.3., 2.4.). Jedoch

können auch auf den besten polaren Säulen nicht alle FS voneinander getrennt

werden. Dieses Problem kann jedoch dadurch gelöst werden, dass nacheinander mit

2 verschiedenen Säulen gearbeitet wird. In dieser Arbeit wurde mit den polaren

Säulen CP7419 (Varian, Middelburg, Niederlande) und DB-23 (J&W Scientific,

Folsom, USA) analysiert, die folgende Spezifikationen aufweisen: DB-23: 30 m,


21

Filmdicke 0,25 µm, Innendurchmesser (ID) 0,25 mm. CP7419: 50 m, Filmdicke 0,25

µm, ID 0,25 mm.

Abb . 2.3.: Standardlauf der FAMEs mit 37 Komponenten-Standard, Säule DB-23

1: 8:0+10:0, 2: 11:0, 3: 12:0, 4: 13:0, 5: 14:0, 6: 14:1, 7: 15:0, 8: 15:1, 9: 16:0, 10: 16:1, 11: 17:0, 12:

17:1, 13: 18:0, 14: 18:1 n-9 trans, 15: 18:1 n-9 cis, 16: 18:2 n-6 trans, 17: 18:2 n-6 cis,: 18: 18:3 n-6,

19: 18:3 n-3, 20: 20:0, 21: 20:1, 22: 21:0, 23: 20:2, 24: 20:3 n-6, 25: 20:3 n-3, 26: 20:4 n-6, 27: 20:5 n-

3 + 22:0, 28: 22:1, 29: 23:0. 30: 22:2, 31: 24:0 + 24:1, 32: 22:6 n-3

Abb. 2.4. : Standardlauf der FAMEs mit 37 Komponenten-Standard, Säule CP7419

1: 6:0, 2: 8:0, 3: 10:0, 4: 11:0, 5: 12:0, 6: 13:0, 7: 14:0, 8: 14:1, 9: 15:0, 10: 15:1, 11: 16:0, 12: 16:1, 13:

17:0, 14: 17:1, 15: 18:0, 16: 18:1 n-9 trans, 17: 18:1 n-9 cis, 18: 18:2 n-6 trans, 19: 18:2 n-6 cis, 20:

18:3 n-6, 21: 18:3 n-3 + 20:0, 22: 20:1, 23: 21:0, 24: 20:2, 25: 20:3 n-6, 26: 20:3 n-3 + 20:4 n-6 + 22:0,

27: 22:1, 28: 20:5 n-3 + 23:0, 29: 22:2, 30: 24:0, 31: 24:1, 32: 22:6 n-3

1

2 3

4

5

6

7

8 9 10

11

12 13

14

15

16

17

18

19 21

20 22

24

23

25

26

27

28

29 30

31 32

1

2

3

4

5

6 7

8

9

10

11

12

13

14

15

16 17

18

19

20

21 221-

24-

23-

25- 26

-

27

28 29

30

31

32


22

Beide Säulen-Innenbeschichtungen bestehen zu mindestens 80% aus Cyanopropyl-

polysiloxan. Herstellerangaben zur genauen Beschaffenheit existieren nicht.

Über die Kombination dieser Standardläufe waren alle FAMEs ihren Retentionszeiten

zuordenbar. Der qualitative und quantitative Vergleich der Fettsäuremuster erfolgte

an beiden Säulen über den Supelco 37 Komponenten-Standard (Sigma-Aldrich,

Taufkirchen).

Auf der Säule DB-23 (Abb. 2.3.) waren die FS EPA (20:5 n-3) und 22:0 an Position

27 des Chromatogramms sehr dicht aufeinander. Eine Trennung der Peaks war nur

schwer möglich. Die anderen versuchsrelevanten FS wurden gut getrennt. ALA (18:3

n-3) lief an Position 19.

Auf der Säule CP7419 gab es ebenfalls Koelutionen von FS. EPA koeluierte mit 23:0

an Stelle 28 (Abb. 2.4.). Da 23:0 in biologischem Material aber sehr selten oder gar

nicht vorkommt, spielte das keine Rolle. Als interner Standard konnte 23:0 auf dieser

Säule nur dann nicht verwendet werden, wenn EPA quantifiziert werden sollte. An

Position 26 im Chromatogramm koeluierten die FS 20:3 n-3, ARA (20:4 n-6) und

22:0.

Durch wechselseitiges Einspritzen der Proben an beiden Säulen und die Quantifi-

zierung über einen mitgeführten Internen Standard konnte die Koelutions-Proble-

matik beseitigt werden.

2.1.3.4. Temperaturprogramme und Gassystem

Gassystem: Trägergas: Helium 4.6, Schönungsgas: Wasserstoff 5.0, Brenngase:

Wasserstoff 5.0 und Luft (KW frei).

Software: Class-VP (Shimadzu, Japan).

DB-23: Säulen-Temperaturprogramm: Vorsäulen- und Säulentemperatur 140°C (1

min), Aufheizrate 5°C/min auf 240°C (9 min). Injekt ortemperaturprogramm: 150°C (1

min), Aufheizrate 6°C/min auf 240°C (14 min).

CP7419: Säulen-Temperaturprogramm: Vorsäulen- und Säulentemperatur 120°C,

Aufheizrate 4°C/min auf 240°C. Injektortemperaturpro gramm: 150°C, Aufheizrate

4°C/min auf 240°C (7,5 min).


23

2.1.4. Quantifizieren der FAMEs am GC-FID

Die qualitative und quantitative Bestimmung der FS erfolgte unter Verwendung

Interner Standards und Externer Standards.

Materialien: Supelco 37 Komponenten-Standard (Sigma-Aldrich, Taufkirchen), EPA-

Methylester (Sigma-Aldrich, Taufkirchen), Heptadecansäure/Margarinsäure (17:0,

Fluka, Taufkirchen), Tricosansäure (23:0, Fluka, Taufkirchen).

Interne Standards

Als interne Standards (IS) wurden den Proben in definierten Konzentrationen die FS

17:0 oder 23:0 zugesetzt. Dies sind gängige IS in der Fettsäureanalytik, da sie als FS

mit ungerader Anzahl an Kohlenstoffatomen von Organismen selten produziert

werden. Damit konnte die Extraktionseffizienz ermittelt werden und die FAMEs

konnten ohne Überschneidungen quantifiziert werden. FS-IS wurden als Korrektur-

standards (Wiederfindung) während der Extraktion und der Methylierung zugesetzt

und gewährleisteten eine Kontrolle über die korrekte Probenverarbeitung, ein

korrektes Einspritzvolumen sowie eine exakte Quantifizierung (JOSEPH 1992;

SCHREINER 2005).

Mit Hilfe der IS 17:0 und 23:0 konnte auf die absolute Konzentration der Fettsäuren

bezüglich der Probengewichte zurückgerechnet werden.

FS unterschiedlicher Länge und Anzahl an Doppelbindungen zeigen bei selber

Konzentration verschiedene Signalstärken bzw. Signalflächen („Response“) am FID

(SCHREINER 2005). Die Signalflächen der FS 22:6 sind z.B. bei selber Ausgangs-

konzentration höher, als die der Fettsäure 20:5 und viel höher als die von 17:0. Über

Korrekturfaktoren („Responsefaktoren“) können diese Flächenabweichungen korri-

giert werden. Der Faktor für jede einzelne FS errechnet sich aus dem Konzen-

trations- und Signalflächenabgleich mit einem Mehrkomponentenstandard. Das Si-

gnalfläche zu Konzentrationsverhältnis einer FS mit dem Faktor 1 (meist 20:0) dient

als Basis für die Abweichungen der anderen FS. Da die Korrekturfaktoren für viele

FID-Systeme übereinstimmen, die Gehalte der FS also in selber Weise über- oder

unterbewertet werden, kann man auch nach entsprechender Geräte-Kalibrierung

einen Korrekturfaktor („Theoretischer Responsefaktor“) aus der Literatur verwenden

(ULBERTH et al. 1999).


24

In Kap. 3 dieser Arbeit wurden lediglich Wiederfindungskorrekturen mit dem IS 17:0

durchgeführt, denn ging es um vergleichende Studien unterschiedlicher Behand-

lungen, wobei nicht die absoluten Mengen entscheidend waren, sondern die Unter-

schiede der Mittelwerte. In Kapitel 4 erfolgte dagegen, erfolgte die Bestimmung der

absoluten Konzentrationen der Fettsäuren und EPA in Sporangien, Eidotter und

infiziertem Pflanzenmaterial empirisch mit dem 37 Komponenten-Standard (CRASKE

& BANNON 1987; ULBERTH et al. 1999).

Externe Standards

Die Verwendung externer Standards erfolgte zur Identifizierung der FS über die

Retentionszeiten (KOLB 2003). Es wurden absichtlich Substanzen gewählt, die in der

Probe enthalten waren und deren Retentionszeiten übereinstimmten. Der 37

Komponenten Standard wurde verwendet, da aufgrund der verschiedenen Prozent-

anteile der Einzelfettsäuren eine genaue Zuordnung durch die Retentionszeiten auf

der Säule möglich war. Es war außerdem sehr bequem, nicht jede Fettsäure die man

später identifizieren wollte, als Einzelstandard einspritzen zu müssen.

Um eine eindeutige Identifizierung von EPA oder einzelnen FS zu gewährleisten,

wurden zusätzlich einzelne FAMEs zur Absicherung der Retentionszeiten verwendet.

Mit Hilfe des externen Standards EPA-Methylester wurden die EPA-Gehalte der

Proben in Kapitel 2 über Eichkurven bestimmt und mit Eichkurven wurde auch der

FID kalibriert. Die absoluten EPA-Konzentrationen von Proben konnten durch die

Kombination einer externen Eichkurve mit EPA-Methylester und einem 17:0 oder

23:0 Wiederfindungsstandard ermittelt werden, was vom Prinzip her der Methode

des empirischen Korrekturfaktors entsprach (siehe Interne Standards).

Absicherung der FS-Identitäten

Die Identitäten der FS von Oomyceten der Gattungen Bremia und Plasmopara wur-

den im Rahmen von taxonomischen Arbeiten mittels GC-MS (Gaschromatographie-

Massenspektrometrie) über die molekularen Massenspektren und Retentionszeiten

bereits abgesichert (SPRING et al. 2005). Da mit demselben Säulen- und GC-System

gearbeitet wurde, konnten die GC-MS-Analyse-Ergebnisse auf diese Arbeit über-

tragen werden und es waren keine zusätzlichen Absicherungen nötig.


25

2.1.5. DC-Technik

Vom ernährungsphysiologischen Standpunkt sind die verschiedenen Lipidklassen

von Interesse, da nicht nur FS selbst, sondern auch die Lipidklassen Einfluss auf

Prozesse im menschlichen Körper nehmen (SCHNEIDER 2001). Die Charakterisierung

der Lipidklassen von potenziellen Lebensmitteln nimmt daher, neben der Fettsäure-

zusammensetzung oder –konzentration, eine zentrale Stellung in aktuellen For-

schungsarbeiten ein (CARVALHO et al. 2005; CHEN et al. 2008; PACETTI et al. 2005). So

werden Phospholipide als besonders günstig für die Gesundheit eingeschätzt und als

Zutat für „functional food“ postuliert (SCHNEIDER 2001), Acylglyceride gelten ebenfalls

als positiv, Freie FS sind dagegen aufgrund ihrer starken Oxidationsanfälligkeit nicht

gerne in Lebensmitteln gesehen (MARSHALL et al. 1994). Daher werden Lebensmittel

und potenzielle Lebensmittel, wofür auch die Oomyceten in dieser Arbeit betrachtet

wurden, auf die Zusammensetzung ihrer Lipide untersucht. Da eine diesbezügliche

Untersuchung für obligat-biotrophe Oomyceten aufgrund der schwierigen Kultivier-

barkeit noch nicht durchgeführt wurde, bot sich die Analyse der Lipidzusammen-

setzung für diese Arbeit an.

Um die Lipidklassen von P. halstedii und B. lactucae voneinander zu trennen und

ihre Fettsäurezusammensetzungen zu ermitteln, wurde kombiniert mit DC und GC

gearbeitet.

Es werden 2 Lipidgruppen unterschiedlicher chemischer und biologischer Eigen-

schaften beschrieben. Hierzu gehören die Fettsäurederivate und die Steroidderivate

(LOTTSPEICH & ENGELS 2006). Zur Lipidgruppe der Fettsäurederivate zählen die

Lipidklassen der Freien FS, der Acylglyceride (Mono-, Di-, Tri-, Glyko-), der Phospho-

lipide (PL) und Wachse, da sich von diesen Lipidgruppen, im Gegensatz zu Ste-

roiden, Sphingolipiden und Alkanen, Fettsäuregruppen chemisch abspalten lassen.

Die Lipidklassen wurden über DC nach einem Standardverfahren (BELITZ et al. 2001;

PACETTI et al. 2005; SCHREINER et al. 2005) aufgetrennt und die Banden aus dem

Kieselgel herauspräpariert. Die enthaltenen FS wurden danach in einem Schritt

extrahiert, methyliert und am GC als FAMEs detektiert.

Stationäre Phase: Kieselgelplatten Alugram Sil G 60, Schicht 0,2 mm (Nr. 818162,

Macherey-Nagel, Düren), DC-Standards: Cholesterin (Nr. 3670, Merck, Darmstadt),

Triolein (Nr. T7140, Sigma-Aldrich Taufkirchen,), Sphingomyelin (Nr. 85615, Fluka,


26

Taufkirchen), L-α-Phosphatidinositol (Nr. P6636, Sigma-Aldrich, Taufkirchen), Hepta-

decaensäure (Nr. 51633, Fluka, Taufkirchen), L-α-Lecithin (Nr. 42556, Fluka, Tauf-

kirchen). Mobile Phase: Petrolether/Diethylether/Essigsäure (90+10+1 v/v/v).

Detektionsreagenz: 2’,7’-Dichlorfluorescein (Nr. 410217, Sigma-Aldrich, Taufkirchen)

0,05% in Methanol (99,8%, Fluka, Taufkirchen,).

Herstellung der Probenextrakte von P. halstedii und B. lactucae

50 mg Sporangienpulver ohne Hyphenanteil von P. halstedii (Stamm GG-16.10.97-

A25) und 40 mg von B. lactucae (Feldisolat der Versuchsstation für Gartenbau,

Hohenheim) wurde mit 100 µl n-Hexan/TBME/Methanol 80+15+5 v/v/v 3mal für je 30

min extrahiert. Die Proben wurden 2 min bei 30000 rpm abzentrifugiert, die

Überstände wurden vereinigt.

Um alle Lipidklassen quantitativ zu extrahieren, wurde ein Gemisch aus polarem

(Methanol), mittelpolarem (TBME) und unpolarem (n-Hexan) Lösungsmittel verwen-

det, da die Lipide selbst verschiedene Polaritäten besitzen und sich danach die

Lösungseigenschaften richten. Phospholipide sind polarer als Freie FS, Freie FS

sind etwas polarer als Acylglyceride.

Herstellung der Standard Lösungen

Für jede Lipidklasse wurden repräsentative Standards gewählt und in der Konzen-

tration 5 mg/ml in Lösungsmittel n-Hexan/TBME/Methanol (80+15+5 v/v/v) gelöst

(PACETTI et al. 2005; SCHREINER et al. 2004):

Cholesterin (Sterine), Triolein (Triacylglyceride), L-α -Phosphatidylcholin (Phospho-

lipide), Sphingomyelin (Sphingophospholipide), L-α-Phosphatidinositol (Glycerophos-

pholipide), C17:0 (Freie FS).

Je 500 µl aus den Standardlösungen wurden entnommen und in einer Standard-

mischung vereint.


27

Durchführung der DC

Die Kieselgelplatten wurden mit Aceton vorgewaschen. Mit Glaskapillaren wurden

die Lipidproben der Oomyceten komplett (je 300 µl) und die Standards in 5 cm

langen Banden im Abstand von 1 cm vom Unterrand der DC-Platte aufgetragen.

Die Detektion erfolgte durch Besprühen mit 2’,7’-Dichlorfluorescein (0,05% in

Methanol) und Betrachten unter UV-Licht (254 nm).

Um herauszufinden in welcher Lipidklasse welche FS vorhanden waren, wurden die

Einzelbanden der Lipide, von denen Fettsäuren abgespalten werden konnten, näm-

lich Phospholipide, Freie FS und Triacylglyceride aus dem Kieselgel präpariert und in

2 ml Glasgefäße für die GC überführt.

Da auf den Ebenen der Di- und Monoacylglyceride kaum Banden sichtbar waren,

wurde auf deren weitere Fettsäure-Charakterisierung verzichtet.

Dem lipidhaltigen Kieselgelpulver wurden 100 µl n-Hexan und 50 µl TBME zugesetzt.

Die Lipide wurden unter Schütteln über Nacht bei RT extrahiert. Am nächsten Tag

wurden 250 µl Bortrifluorid-Methanolkomplex zu den Proben gegeben. Die Methy-

lierung und die Messung der FS am GC erfolgten wie unter Kapitel 2.1.2. bis 2.1.4.

beschrieben.


28

2.2. Ergebnisse

2.2.1. Qualitative Analyse der FS-Muster von P. halstedii und B. lactucae

Das FS-Muster aus dem Gesamtlipidextrakt der Sporangien von P. halstedii des

Stammes GG-16.10.97-A25 ist in Abb. 2.5. dargestellt. Die FS 16:0, 18:2 n-6 und

20:5 waren die 3 typischen Hauptfettsäuren der Sporangien von P. halstedii. EPA

(20:5 n-3) hatte mit ca. 37% Gesamtanteil den größten Anteil im FS-Muster.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

FAME

% a

m G

esam

tant

eil

Area% 2,60 16,88 0,53 0,49 5,04 24,13 0,55 3,04 1,32 0,97 1,55 4,41 36,76 0,22 0,44 0,45

14:0 16:0 16:1 18:0 18:118:2 n-6

18:3 n-6

18:3 n-3

20:1 20:2 20:320:4 n-6

20:5 n-3

22:1 22:222:6 n-3

Abb. 2.5.: FAMEs des Gesamtlipidextraktes aus P. halstedii (Stamm GG-16.10.97-A25).

0

5

10

15

20

25

30

35

FAME

% a

m G

esam

tant

eil

Area% 5,43 17,67 6,27 0,78 11,70 15,43 0,48 4,55 1,70 0,50 1,04 1,88 29,52 1,71 0,00 1,83

14:0 16:0 16:1 18:0 18:118:2 n-6

18:3 n-6

18:3 n-3

20:1 20:2 20:320:4 n-6

20:5 n-3

22:1 22:222:6 n-3

Abb. 2.6.: FAMEs des Gesamtlipidextraktes aus B. lactucae (Feldisolat von der Versuchsstation für

Gartenbau, Stuttgart-Hohenheim).


29

Die FS 18:2 n-6 war mit 24% Anteil am FS-Muster ebenfalls sehr stark vertreten,

gefolgt von 16:0 mit ca. 17% Anteil. ALA (18:3 n-3) war mit 3% am FS-Muster

vertreten. Weitere typische FS für P. halstedii mit ebenfalls hohen Anteilen am FS-

Muster waren 14:0, 20:4 n-6 und 18:1 n-9. Die LC-PUFA 22:6 n-3 war mit 0,4%

Anteil nur sehr schwach vertreten.

Sporangien von B. lactucae enthielten etwa 30% EPA im Gesamtlipidextrakt (Abb.

2.6.). Die FS 18:2 n-6 und 16:0 waren mit je 15-18% Anteil ebenfalls stark am

Gesamtfettsäuremuster vertreten. Die n-3-FS 18:3 n-3 und 22:6 n-3 waren mit ca.

5% und 2% stärker vertreten, als bei P. halstedii. Die FS 20:4 n-6 war im Extrakt von

P. halstedii mit durchschnittlich 4-6 % Anteil am Gesamtfettsäuremuster deutlich

stärker vertreten als bei B. lactucae mit nur ca. 1-2%. Die Verschiedenheit der Fett-

säuremuster ist artspezifisch und da es dazu bereits einschlägige Arbeiten gibt

(SCHÄUFFELE 2005), soll an dieser Stelle nicht näher darauf eingegangen werden.

2.2.2. Lipidklassentrennung und FS-Zusammensetzung d er einzelnen Lipid-

klassen

Um die einzelnen Lipidklassen zu trennen und deren FS-Zusammensetzung zu

untersuchen, wurde die DC mit anschließender GC durchgeführt. Die Gesamtlipid-

extrakte aus 50 mg Sporangien von P. halstedii und B. lactucae wurden mittels DC in

ihre Lipidklassen getrennt. Sowohl P. halstedii als auch B. lactucae zeigten Banden

auf Höhe aller 4 Lipidklassen, die von Standards repräsentiert wurden (Abb. 2.7.).

Die Phospholipide blieben als stark fluoreszierende Banden am Start sitzen, Sterine

(Rf 0,07), Freie FS (Rf 0,14) und Triacylglyceride (Rf 0,25) wurden im gewählten

Laufmittel aufgetrennt. Zusätzlich fluoreszierten Banden der Monoacylglyceride kurz

oberhalb der Phospholipide und der Diacylglyceride kurz oberhalb der Sterine sehr

schwach. Diese wurden auf Grund der geringen Substanzmenge jedoch nicht weiter

untersucht.

Die Breite der Triacylglyceridbanden in den Proben der Oomyceten ließ auf ein

Gemisch aus mehreren Komponenten schließen.

Da Sterine keine Fettsäurereste enthalten, wurde diese Fraktion für den GC-FID

nicht weiterverarbeitet. Von der Leuchtkraft der Lipidbanden her zu schließen, waren


30

bei beiden Arten die Triacylglyceride am stärksten vertreten, gefolgt von den Phos-

pholipiden und Freien FS.

Abb. 2.7. : DC-Banden der Lipide aus Sporangien unter UV 265 nm. Von links nach rechts: Standard-

mischung mit Lipiden in aufsteigender Reihenfolge (L-α-Phosphatidylcholin (Rf 0), Cholesterin Rf 0,07,

17:0 (Rf 0,14), Triolein (Rf 0,25)), Lipide aus P. halstedii und B. lactucae.

Schwache Banden auf Höhe der Mono- und Diacylglyceride zeigten, dass auch diese

Lipidklassen in beiden Arten vertreten waren. Die am GC-FID gemessenen Signale

der FAMEs aus den DC-Lipidbanden von P. halstedii und B. lactucae wurden als

Bestandteile ihrer Lipidklassen in Prozent am Gesamtlipidmuster dargestellt (Abb.

2.8., 2.9.). So entstand, zusätzlich zur groben Bestimmung der Lipidklassen von P.

halstedii und B. lactucae, ein genaues Bild über die Lokalisation der einzelnen

Fettsäuren aus dem Gesamtlipidextrakt.

Beim Vergleich der FS-Muster der Lipidklassen von P. halstedii und B. lactucae

(Abb. 2.8. u. 2.9.) ergibt sich, aus der Senkrechtaddition der Werte jeder einzelnen

FS für Triacylglyceride, Phospholipide und Freien Fettsäuren, der Gesamtanteil der

FS im Gesamtextrakt.

Aus der Waagrechtaddition aller FS-Anteile innerhalb der Triacylglyceride bzw.

Freien FS oder Phospholipide ergibt sich der Gesamtanteil der Lipidklassen am

Gesamtmuster. Die Gesamtgehalte aus der Senkrecht bzw. Waagrechtaddition sind

in den Abb. 2.8. und 2.9. nicht zusätzlich aufgeführt.

Addiert man die FS aus Sporangien von P. halstedii waagrecht (Abb. 2.8.), so lagen

diese insgesamt zu ca. 60,8% als Triacylglyceride, zu 32,4% als Phospholipide und

zu 6,8% als Freie FS vor. Bei Senkrechtaddition lag die FS 20:5 n-3 insgesamt zu

Standard P. halstedii B. lactucae


31

18,89% am Gesamtmuster vor: Mit 12,18% in Triacylglyceriden, mit 6,44% in

Phospholipiden und mit 0,27% in Spuren als Freie FS. Das Balkendiagramm für die

einzelnen FS entstand folgendermaßen: Wurde der Wert 18,89% von z.B. 20:5 n-3

auf 100% gesetzt, so zeigte sich, dass die FS 20:5 n-3 zu einem Anteil von 67,67 in

Triacylglyceriden, zu 34,1 % in Phospholipiden und zu 1,4% in Freien FS vorkam.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

FAME

Pro

zent

im L

ipid

extr

akt

TAG 4,54 12,00 1,21 0,68 6,41 13,12 0,43 2,09 1,22 0,22 0,96 1,62 0,25 12,18 0,52

Freie FS 0,18 1,19 0,00 0,47 0,95 0,21 0,33 0,00 0,16 0,00 0,00 0,00 2,85 0,27 0,00

PL 0,72 11,21 0,33 0,49 1,97 7,35 0,15 0,95 0,57 0,00 0,51 0,89 0,00 6,44 0,28

14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 n-9 18:2 n-6 18:3 n-6 18:3 n-3 20:1 20:2 20:3 n-6 20:3 n-3 20:4 n-6 20:5 n-3 22:6 n-3

Abb. 2.8.: Zusammensetzung des FS-Musters der Lipidklassen von P. halstedii (Stamm GG-

16.10.97-A25). Von links nach rechts ist für jeden FAME im Gesamtlipidextrakt der Anteil (%) in den

Lipid-klassen der Phospholipide (PL, gestreifte Balken), Freien FS (weiße Balken) und der

Triacylglyceride (TAG, schwarze Balken) aufgeführt.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

FAME

Pro

zent

im L

ipid

extr

akt

TAG 5,20 8,87 0,77 1,23 7,48 6,27 0,36 2,60 1,35 0,00 0,45 0,62 0,16 8,22 0,31

Freie FS 5,37 4,80 0,23 1,87 2,14 1,96 0,00 0,94 0,48 0,00 0,08 0,17 0,00 5,38 0,55

PL 2,20 8,15 0,75 0,88 2,30 5,58 0,20 1,81 0,50 0,20 0,00 0,40 0,00 6,36 0,83

14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 n-9 18:2 n-6 18:3 n-6 18:3 n-3 20:1 20:2 20:3 n-6 20:3 n-3 20:4 n-6 20:5 n-3 22:6 n-3

Abb. 2.9.: Zusammensetzung des FS-Musters der Lipidklassen von B. lactucae (Feldisolat der

Versuchsstation für Gartenbau, Hohenheim). Von links nach rechts ist für jeden FAME im Gesamt-

lipidextrakt der Anteil (%) in den Lipidklassen der Phospholipide (PL, gestreifte Balken), Freien FS

(weiße Balken) und der Triacylglyceride (TAG, schwarze Balken) aufgeführt.

In ähnlichen Größenverhältnissen (Triacylglyceride > Phospholipiden > Freie FS) wie

20:5 n-3, lagen auch die FS 16:1, 18:2 n-6, 18:3 n-3, 20:3n-6, 20:3 n-3 und 22:6 n-3

als Triacylglyceride, Phospholipide oder Freie FS vor. Die FS 16:0, 18:0, 18:1 n-9,

18:3 n-6 sowie 20:1 kamen in allen 3 Lipidklassen in nennenswerten Anteilen vor.


32

Besonders auffällig war die FS 20:2, die beinahe ausschließlich als Triacylglycerid

vorlag, sowie die FS 20:4 n-4, die fast nur als Freie FS vorlag.

Addiert man die FS aus Sporangien von B. lactucae waagrecht (Abb. 2.9.), so lagen

diese insgesamt zu ca. 45% als Triacylglyceride, zu 31% als Phospholipide und zu

ca. 24% als Freie FS vor. Bei Senkrechtaddition lag die FS 20:5 n-3 insgesamt zu

19,95% am Gesamtmuster vor: Mit 8,22% in Triacylglyceriden, mit 6,36% in

Phospholipiden und mit 5,38% in Freien FS. Wurde der Wert von 19,95% für das

Balkendiagramm auf 100% gesetzt, so zeigte sich, dass die FS 20:5 n-3 von B.

lactucae zu 41,2% aus Triacylglyceriden, zu 31,9% aus Phospholipiden und zu

26,9% aus Freien FS stammte.

Die Sporangien von B. lactucae enthielten insgesamt deutlich mehr Freie FS als die

Sporangien von P. halstedii. Die Freien FS dominierten besonders bei 14:0 und 18:0.

Als Phospholipide lagen vor allem 16:1 und 22:6 n-3 vor. Bei 16:0, 16:1, 18:1 n-9,

18:2 n-6, 18:3 n-3, 20:1 und 20:3 n-3, waren, wie bei 20:5 n-3, Triacylglyceride und

Phospholipide etwa gleich stark vertreten, wobei beachtliche Anteile an Freien FS zu

finden waren. Deutlich mehr Triacylglyceride als Phospholipide bei einem sehr

geringen Anteil an Freien FS enthielt nur die FS 18:3 n-6. Besonders auffällig waren

die FS 20:3 n-6 und 20:4 n-6, die beinahe nur als Triacylglyceride vorlagen, sowie

die FS 20:2, die hauptsächlich in der Phospholipidfraktion gefunden wurde.

2.2.3. EPA-Konzentrationen von Sporangien und Wirtsgewebe

Die absoluten Konzentrationen an EPA, die mit Hilfe einer EPA-Eichkurve und dem

17:0 IS bestimmt wurden (vgl. Kap. 2.1.4.), betrugen in den Sporangien von P.

halstedii 25-30 mg EPA/g FG. Die absoluten Konzentrationen an EPA in infiziertem

Sonnenblumengewebe lagen bei maximal 1,1 mg pro g TG (Tab. 2.1.).

Die absoluten Konzentrationen an EPA in den Sporangien von B. lactucae betrugen

durchschnittlich 8-13 mg EPA/g FG, in infiziertem Salatgewebe lagen die EPA-

Konzentration jedoch, ähnlich wie bei infiziertem Sonnenblumengewebe, bei maximal

1,0 mg EPA/ g TG.


33

Tab. 2.1.: EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflanzengewebe: P. halstedii (Stamm

BL-11.06.02-A4z), B. lactucae (Feldisolat der Versuchsstation für Gartenbau, Hohenheim) und

Peronospora swinglei (Supermarktware (Isolat 867)).

___________________________________________________________________ Kultursystem Wirtsgewebe Infektionsdauer EPA-Konzentration (Tage) (mg/g TG) Sporangien Inf. Gewebe P. halstedii Sonnenblumenkeimlinge 14 25-30 1,1

B. lactucae adulte Salatblätter 7-10 8-13 1,0

P. swinglei adulte Blätter nicht getestet 30-38 1,4

___________________________________________________________________

Die Analyse der EPA-Gehalte einer weiteren Wirt-Parasit-Kombination, Ocimum

basilicum L. (Basilikum) und Peronospora swinglei, ergab EPA-Konzentrationen in

Sporangien von durchschnittlich 30-38 mg EPA/g FG und EPA-Konzentrationen von

infiziertem Gewebe von maximal 1,4 mg EPA/g TG. Da diese Werte im selben

Produktivitätsbereich wie für P. halstedii und B. lactucae lagen, wurde in dieser

Kombination kein Vorteil im Hinblick auf die Zielsetzung der Arbeit gesehen.

Die im Labormaßstab erzielten EPA-Gehalte wurden für B. lactucae im Großmaßstab

hochgerechnet, um einen Vergleich mit der EPA-Produktivität derzeit verwendeter

Systeme aus dem Bioreaktor zu ermöglichen. Es wurden die Produktivitäten in g

EPA pro Tag im Volumen (Bioreaktormedium) bzw. der Fläche (benötigte Fläche für

Pflanzen) verglichen.

In Tabelle 2.2. erfolgt ein Vergleich der theoretisch erzielbaren EPA-Produktivität von

Sporangien von B. lactucae sowie der theoretisch (unter Laborbedingungen) erziel-

baren EPA-Produktivität von infiziertem Salat (auf einer theoretischen Anbaufläche)

mit den derzeit leistungsfähigsten EPA-Produktivitäten anderer Organismen, die

jedoch in Bioreaktoren gezüchtet werden (WARD & SINGH 2005).

Die höchste EPA-Produktivität von Oomyceten aus optimierten Systemen erreicht die

Gattung Thraustochytrium mit maximal 47 mg EPA/L•Tag. In optimierten Bioreaktor-

Systemen können derzeit von Schizochytrium Stämmen DHA-Konzentrationen von

bis zu 10 g/L•Tag produziert werden, Schizochytrium Stämme sind jedoch bezüglich


34

EPA wenig produktiv. Im Vergleich dazu produziert die Mikroalge Nitzschia alba 100-

300 mg EPA/L•Tag und Phaeodactylum tricornutum produziert im Photobioreaktor 40

mg EPA/L•Tag.

Tab. 2.2.: Vergleich der erzielbaren EPA-Produktivität. Systeme im Bioreaktor (g/L•d) nach WARD &

SINGH 2005 und die theoretisch erzielbare EPA-Produktivität von B. lactucae auf Salat (g/(m²•d).

Hochgerechnete EPA-Mengen sind blau dargestellt.

Kultursystem Erzielbare EPA-Produktivität

B. lactucae Sporangien (FG) 0,047 g/(m²•d)

Inf. Salat (TG) 0,280 g/(m²•d)

Phaeodactylum tricornutum (TG) 0,040 g/(L•d)

Thraustochytrium sp. (TG) 0,047 g/(L•d)

N. alba (TG) 0,1-0,3 g/(L•d)

Für die EPA-Produktivitätsprognosen von B. lactucae wurden folgende Hochrech-

nungen angestellt: Um 1 g Sporangien zu produzieren waren für infizierten Salat

unter genannten Laborbedingungen (vgl. Kap. 2.1.1.) Infektionszeiten von 7-10

Tagen, für infizierte Sonnenblumen von 14-16 Tagen nötig. Für die Produktivität von

47 mg EPA/ m² •Tag aus Sporangien von infiziertem Salat wäre eine absaugbare

Pflanzenoberfläche der Blätter von ca. 26 ausgewachsenen Salatköpfen nötig, wofür

ca. 3 m² Anbaufläche benötigt würden. In infiziertem, getrocknetem Pflanzengewebe

konnte mit Salat etwa 1 mg EPA/g produziert werden. Daher könnten rein

rechnerisch in 7 Tagen (nach vorangegangener 8-wöchiger Salatanzucht) nach

optimierter Infektion und optimierten Sporulationsbedingungen auf 60 m² Fläche ca.

120 kg infizierter Salat gezüchtet werden. Dies entspräche einer Produktivität von

280 mg EPA/ m² •Tag aus B. lactucae infiziertem Salat.


35

2.3. Diskussion

2.3.1. Qualitative FS-Zusammensetzung von P. halstedii und B. lactucae

P. halstedii und B. lactucae wiesen mit 30-40% ähnlich hohe Anteile an EPA wie

andere Systeme auf, die bereits großtechnisch für die menschliche Ernährung

verwendet werden (WARD & SINGH 2005). So produziert Phaeodactylum tricornutum

unter optimalen Bedingungen im Bioreaktor ca. 35 % EPA an seinem FS-Muster, der

Eumycet Mortierella alpina produziert EPA zu 20% seines FS-Musters, Thrausto-

chytrium-Stämme produzieren 30-40% EPA in ihrem FS-Muster.

Vergleicht man die relativen FS-Anteile von P. halstedii und B. lactucae, so hat EPA

in P. halstedii mit durchschnittlich 37 % EPA einen etwas höheren Anteil am FS-

Muster als in B. lactucae mit 29% (Abb. 2.5. u. 2.6.). Trotz etwas geringerer EPA-

Anteile am Gesamtmuster hat B. lactucae gegenüber P. halstedii jedoch den Vorteil,

als Pathogen auf einem Nahrungsmittel zu wachsen, das in großen Mengen roh

verzehrt wird, während die befallenen Teile der Sonnenblumen nicht nahrungs-

relevant für den Menschen sind.

2.3.2. Lipidklassenzusammensetzung

Die FS-Muster sowie die Fettsäuren der einzelnen Lipidklassen wurden für manche

Oomyceten (HUANG et al. 2001; KENDRICK & RATLEGE 1992), Mikroalgen (GALANINA &

KONOVA 1998; SANINA et al. 2008), Pilze (KOCK & VAN DER WALT 1986) und Höhere

Pflanzen (MONGRAND et al. 2001) für taxonomische und industrielle Zwecke intensiv

erforscht. Für die meisten Gattungen und Arten der Oomyceten sind bisher jedoch

weder die Fettsäurezusammensetzungen der einzelnen Lipidklassen noch die

Gesamtlipidmuster bekannt.

Vergleicht man die Gesamtlipidmengen der Abb. 2.5. u. 2.6. mit denen der Abb. 2.8.

u. 2.9., so wurden im Gegensatz zum Gesamtlipidextrakt ohne DC-Auftrennung für

P. halstedii und B. lactucae nicht 37 bzw. 29% EPA im Extrakt sondern lediglich

18,89 % bzw. 19,95% EPA wiedergefunden. Dies lässt sich jedoch dadurch erklären,

dass bei der Auftrennung per DC natürliche Verluste auftraten, die durch oxidative

Prozesse und Verschleppung auf dem Kieselgel verursacht wurden. Diese Verluste

traten bei P. halstedii und B. lactucae in selber Weise auf. Bei den ungesättigten FS


36

verstärkte sich dieser Verschleppungseffekt mit zunehmender Anzahl an Doppel-

bindungen gegenüber den gesättigten FS zusätzlich, was auf wesentlich niedrigere

Siedepunkte und damit verbundener stark erhöhter Flüchtigkeit zurückzuführen war.

Die prozentualen Zusammensetzungen der FS in den einzelnen Lipidklassen unter-

schieden sich zwischen P. halstedii und B. lactucae. Vergleicht man die Zusammen-

setzung dominierender FS wie 20:5 n-3, 18:2 n-6 oder 16:0 von P. halstedii und B.

lactucae, so fällt auf, dass B. lactucae wesentlich mehr Freie FS als P. halstedii

enthält. Die Anteile von Triacylglyceriden und Phospholipiden überwogen jedoch bei

beiden Organismen gegenüber den Freien FS. Lediglich im Gesamtextrakt schwach

vertretene FS (Abb. 2.8. u. 2.9.) wie 20:4 n-6, 20:2, 20:3 n-6 21:0, 22.1 oder 22:6 n-3

unterschieden sich extrem in ihrer Lipidklassenzusammensetzung, was jedoch sehr

wahrscheinlich ein methodisches Problem der verlässlichen Quantifizierung im

Bereich der Nachweisgrenze ist.

Das sehr unterschiedliche Vorhandensein von Einzelfettsäuren in den unterschied-

lichen Lipidklassen könnte zudem an verschiedenen Entwicklungsstadien der Spo-

rangien und auch Umwelteffekten liegen, da bei B. lactucae ein Feldisolat verwendet

wurde, bei P. halstedii dagegen ein regenerierter Laborstamm. Die Unterschiede in

der Zusammensetzung der Freien FS zwischen B. lactucae und P. halstedii,

besonders im Hinblick auf 20:5 n-3 und 20:4 n-6, sollten daher nochmals näher

untersucht und in einem anderen Zusammenhang diskutiert werden. Eventuell ließe

sich durch weitere Messungen bestätigen, dass die Zusammensetzung der einzelnen

Lipidklassen taxonspezifisch ist, dann wäre es mit genügend zur Verfügung

stehendem Sporangienmaterial eventuell auch möglich über einen „FS-Strichcode“

eine Art zu identifizieren. Da Fettsäuremuster taxonspezifisch sind (SPRING & THINES

2004; SPRING et al. 2006), würde ihre weitere Erforschung, neben dem Potenzial zur

industriellen Nutzbarkeit, eine reizvolle Ergänzung zu molekularbiologischen

Untersuchungen bieten.

Die Hauptfettsäuren von P. halstedii und B. lactucae (16:0, 18:1 n-9, 18:2 n-6, 20:5

n-3) lagen zu sehr hohen Anteilen als Neutrallipide (Triacylglyceride) vor, es

existierten jedoch auch nennenswerte Anteile an polaren Lipiden wie Phospholipiden

gefolgt von Freien FS. Ferner wurden per DC geringe Mengen an Mono- und


37

Diacylglyceriden detektiert. Im Vergleich dazu zeigte eine Studie zur Lipidklassen-

verteilung von Thraustochytrium, dass dort Triacylglyceride mit 44-68% am Gesamt-

lipidanteil überwogen, gefolgt von Phospholipiden mit ca. 29% Anteil (KENDRICK &

RATLEGE 1992), was einer sehr ähnlichen Lipidklassenzusammensetzung wie für P.

halstedii und B. lactucae entspricht. Freie FS wurden genannter Studie nicht

behandelt.

Die Anwesenheit von Phospholipiden und Triacylglyceriden konnte für P. halstedii

und B. lactucae als positive potenzielle Lebensmitteleigenschaft bewertet werden,

von den Freien FS musste jedoch befürchtet werden, dass sie sich aufgrund ihrer

hohen Oxidationsanfälligkeit negativ in einem potenziellen Lebensmittel auswirkten.

In ernährungsphysiologisch wertvollen Pflanzenölen sind die ungesättigten FS nur

als Triacylglyceride gespeichert und werden, besonders in Sonnenblumen und Wal-

nussöl, zusätzlich durch die Produktion des Lipidvitamins Tocopherol (Vitamin E) vor

Oxidation geschützt (BÄSSLER 1991).

Tierische Lipide enthalten im Vergleich zu Ölen Höherer Pflanzen neben Triacyl-

glyceriden auch Phospholipide. Eidotterlipide bestehen z.B. zu ca. 67% aus Triacyl-

glyceriden und zu 25 % aus Phospholipiden. Die übrigen Lipide sind Sterole, die zu

98% aus Cholesterin bestehen (SCHREINER et al. 2005). Freie FS finden sich dage-

gen in ranzigem Öl und in verdorbenem Eidotter. Sind Freie FS in einem Lebens-

mittel vorhanden, so tragen zu dessen ernährungsphysiologischer Wertminderung

bei (BELITZ et al. 2001).

2.3.3. EPA-Konzentrationen in Sporangien u. infiziert em Pflanzengewebe

Die beinahe selben EPA-Konzentrationen in infiziertem Pflanzengewebe bei jedoch

recht unterschiedlichen EPA-Konzentrationen in Sporangienlipiden könnten dadurch

erklärt werden, dass die 3 Arten P. halstedii, B. lactucae und P. swinglei ihre

Sporangien zwar in unterschiedlichem Maße mit FS ausstatten, der Mycelanteil im

Pflanzengewebe jedoch verschieden ist. Eine weitere Erklärung wäre, dass die Lipid-

gehalte der Erreger aus entsprechendem Pflanzengewebe in Mycel und Sporangien

stark variieren. Da eine gesonderte Analyse des Mycels auf Grund der Untrenn-

barkeit vom Wirtsgewebe nicht möglich ist, konnte dem Phänomen nicht weiter

nachgegangen werden.


38

Sporangienpulver von P. halstedii bzw. B. lactucae enthielt 25-30 bzw. 8-13 mg EPA/

g FG. Um 1 g Sporangien von B. lactucae zu produzieren wären bei einem Durch-

schnittswert von 10 mg EPA/g TG gemäß Hochrechnung (Tab. 2.2.) die Blätter von

ca. 26 optimal infizierten Salatköpfen auf 3 m² Fläche nötig. Die Realisierung dieser

Mengen scheitert derzeit jedoch an geeigneten Anzucht- und Produktionssystemen,

die auf sehr großer Fläche (mehrere hundert m²) mit optimaler Technik steuerbare

Umweltverhältnisse bieten sollten und gleichmäßige Sporulation sowie eine

ökonomische Ernte der Sporangien gewährleisten müssten.

In Anbetracht der Nutzung von infiziertem Salatgewebe sind die EPA-Produktivitäts-

vergleiche von B. lactucae mit bisher verwendeten Bioreaktor-Systemen recht

vielversprechend. Vergleicht man die im Reaktor erzielbaren EPA-Mengen von 40-

300 mg EPA/ L • Tag mit 280 mg EPA/ m² • Tag aus infiziertem Salat, so läge man in

mengenmäßig konkurrenzfähigen Dimensionen. Das System B. lactucae/ Salat wäre

gegenüber der derzeitigen EPA-Produktion im Bioreaktor konkurrenzfähig, wenn es

betriebswirtschaftlich günstiger wäre, optimiert billiger in der Fläche zu produzieren

als im Bioreaktor. Es bestehen jedoch derzeit keine optimierten Infektions- und

Anzuchtsysteme für infizierten Salat auf Großflächen, die erst entwickelt werden

müssten, um diese Rechnung zu verifizieren, so dass die Diskussion damit hinfällig

wird.

Für den direkten menschlichen Verzehr sind die Gehalte an EPA in infiziertem

Pflanzengewebe mit 1 mg/g TG etwa um den Faktor 10 zu niedrig dosiert, da pro

Tag 150-300 mg EPA aufgenommen werden sollen. Um diese Menge EPA

aufzunehmen müsste man nach bisherigen Rechnungen am Tag z.B. 1,5-3-kg

frischen, infizierten Salat essen. Könnte man den EPA-Gehalt jedoch um Faktor 10

steigern, so wäre die tägliche Aufnahmemenge mit 150 g Salat (eine große Portion)

durchaus realistisch.


39

2.4. Schlussfolgerungen

Sowohl die qualitativen FS-Muster von P. halstedii und B. lactucae als auch die

Fettsäurezusammensetzungen der Lipidklassen von Sporangien wurden für die men-

schliche Ernährung wegen der hohen EPA-Gehalte in Form von Triacylglyceriden

und Phospholipiden als geeignet erachtet. Die EPA-Konzentrationen in Sporangien

(10-30 mg EPA/g FG) und infiziertem Gewebe (ca. 1 mg EPA/g TG) erreichten

ebenfalls nennenswerte Größen. Die theoretisch erzielbare EPA-Produktivität mit

infiziertem Salat pro Flächeneinheit lag mit 0,28 g/(m²•d) im Wertebereich der derzeit

erzielbaren Mengen im Bioreaktor pro Volumeneinheit durch andere Systeme. Es

wurden jedoch keine weitere Studien durchgeführt um diese Rechnung zu

verifizieren, da dies bereits großtechnische Dimensionen annehmen würde und in

dieser Arbeit, im Rahmen der Mittel (Arbeitsaufwand, Zeit, begrenzter Raum,

Kosten), der Fokus auf der natürlichen Produktion lag.

Da EPA-Mengen von 1 mg/g TG in infiziertem Sonnenblumen- bzw. Salatgewebe

nicht genügen, um den täglichen menschlichen Bedarf an EPA zu decken, sollte nun,

im Rahmen der Möglichkeiten und im Labormaßstab, mit Optimierungsversuchen ge-

testet werden, ob eine relevante Steigerung (Faktor 10) der EPA-Produktion auf na-

türlichem Wege möglich war.

3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii

40

3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeis piel P. halstedii

3.1. Einleitung

Nach den Schlussfolgerungen in Kap. 2 galt es die Fragen zu klären, auf welche

Weise und in wieweit man die EPA-Gehalte von P. halstedii bzw. B. lactucae durch

Selektion des Ausgangsmaterials oder Modifikation der Kulturbedingungen steigern

konnte. Da die Biologie von P. halstedii bereits untersucht war (ROZYNEK 2000) und

Infektionstechniken und genetisch homogene Stämme zur Verfügung standen, wurde

P. halstedii als Modellbeispiel für Optimierungsversuche herangezogen. Zunächst

wurde erforscht, ob eine natürliche genetische Variabilität zwischen verschiedenen

Pathogenstämmen existierte, die eine Selektion besonders leistungsfähiger Stämme

ermöglichte. Für Arten der Gattung Thraustochytrium wurden schon mehrere

leistungsfähige Stämme für die Produktion von DHA entdeckt (HUANG et al. 2001).

Analog dazu wurde auf Seite der Wirtspflanze getestet, ob Sorten oder Linien

existieren, die besonders anfällig sind und dadurch eine erhöhte Besiedelung

zulassen, was mehr EPA im Gewebe zur Folge haben könnte. Zusätzlich wurde

versucht, den EPA-Gehalt über den Infektionsdruck zu beeinflussen.

Abschließend sollte die Frage geklärt werden, ob und wie sich die FS-Konzen-

trationen von infizierten und gesunden Pflanzen im Hinblick auf extreme und opti-

male Stickstoffgaben (N) in Form von Calciumnitrat Ca(NO3)2 änderten. Um Boden-

effekte zu vermeiden, wurde eine Nährlösungskultur etabliert. So konnten alle Nähr-

stoffe gezielt verabreicht und bis auf den variierten Makronährstoff N gleichgehalten

werden. Aus Ernährungsstudien von Algen aus de Bioreaktoren war bereits bekannt,

dass über den Faktor Ernährung der EPA-Gehalt positiv beeinflusst werden kann

(KHOZIN-GOLDBERG & COHEN 2006). Aus einer aktuellen Studie ging zudem hervor,

dass der Feldbefall von Wegerich mit dem Oomyceten Peronospora plantaginis

durch hohe N-Düngergaben stark gefördert wurde (MANDAL et al. 2008).

3.2. Materialien und Methoden

3.2.1. Artinternes Screening auf EPA-Gehalte in Spo rangien

Der erste Schritt bestand darin, nach leistungsfähigen, geeigneten Stämmen von P.

halstedii zu suchen, die möglichst hohe Mengen an EPA produzierten. Es sollte

geklärt werden, ob grundsätzlich zwischen den Isolaten signifikante Unterschiede im


41

absoluten EPA Gehalt bestanden und ob sich eine Selektion in diese Richtung

lohnen würde.

Die Anzucht von 4 verschiedenen Stämmen von P. halstedii für die Fettsäureanalyse

erfolgte auf der Sorte Giganteus und 8 weiteren Sonnenblumenlinien. Ziel war es,

Sporangien, die von derselben Wirtssorte/-linie geerntet wurden, auf ihre absoluten

EPA-Gehalte hin zu testen um eventuelle Unterschiede zwischen verschiedenen

Stämmen zu entdecken. Da die Erreger auf derselben Wirtssorte/-linie unter selben

Bedingungen angezogen wurden, konnten Umwelteffekte ausgeschlossen werden.

Materialien: Je 20 Sonnenblumenkeimlinge: Sorte Giganteus, Linien HA821, HA304,

RHA 265, RHA 274, DM2, PM13, 799-2, 803-1; Einheitserde; Saatschalen; genetisch

homogene Isolate von P. halstedii: Stämme LS-13.12.05-C6, BL-11.06.02-A4z, GG-

16.10.97-A25, HE-10.01.06-A8.

20 Sonnenblumensamen der jeweiligen Sorte/Linie wurden 24h im Wärmeschrank

bei 20°C angekeimt und mit der WSI Methode (vgl. Ka p. 2.1.1.1.) infiziert. Für die

Fettsäureanalysen wurden für ein Isolat je 7 Keimlinge geerntet. Da jedes Isolat auf 9

Wirten angezogen wurde, standen pro Isolat 63 Messwerte zur Verfügung. Die

statistische Analyse erfolgte wie in. Kap. 3.2.5. beschrieben.

Mikroskopische Kontrolle und Aufbereitung der Sporangien für die GC-Analyse

Die Sporangien wurden mit einer Mikroabsaugvorrichtung in 2 ml Plastikreaktions-

gefäße überführt. Um eine möglichst gute Vergleichbarkeit der Proben zu

gewährleisten und homogenes Probenmaterial zu schaffen, wurden die Sporangien

einer mikroskopischen Kontrolle unterzogen. Die Hyphenanteile der Proben lagen

unter 5%. Dies wurde dadurch erreicht, dass die Hyphen, die sich nach dem

Absaugvorgang als wolliges Knäuel oberhalb des Sporangienpulvers sammelten, mit

Hilfe einer Pinzette entfernt wurden.

Das Sporangienpulver wurde bis zur Extraktion bei -20°C tiefgefroren.

Die Aufbereitung der Lipide der Sporangien für die qualitative und quantitative GC-

Analyse erfolgte wie in Kapitel 2.1.2.-2.1.4. beschrieben.


42

3.2.2. Erfassen besonders EPA-reicher Sonnenblumens orten/-linien

Bei einem obligat-biotrophen System liegt es auch am Wirt, wie gut sich der Parasit

entwickelt. Daher lag der Schritt nahe, innerhalb der Wirtsart Sonnenblume nach

Genotypen zu suchen, die besonders anfällig für P. halstedii waren und dement-

sprechend viel Mycel und EPA im Gewebe enthielten. Von Arbeiten aus dem

Pflanzenschutz war bekannt, dass es nicht nur besonders virulente Stämme (GULYA

et al. 1991) sondern auch besonders anfällige Sonnenblumensorten bzw -linien für P.

halstedii gab.

Die Materialien und Methoden für Anzucht und Infektion entsprachen im Wesent-

lichen denen von Kapitel 2.1.1.1. bis auf die Infektion, die mit einem Isolat, BL-

11.06.02-A4z von P. halstedii, für 10 Wirtssorten/-linien (zusätzliche Linie PM-17)

durchgeführt wurde.

Nach 12 Tagen waren die Sonnenblumenkeimlinge bereits sehr stark befallen und

mussten geerntet werden. Die Biomasse jedes Keimlings mit Keimblättern und 2 cm

Stängel wurde an der Analysenwaage bestimmt.

Ernte und Lagerung von getrocknetem Pflanzenmaterial erfolgten wie unter 2.1.1.3.

beschrieben. Die Extraktion, Methylierung und Quantifizierung der FS aus dem

Pflanzengewebe erfolgten wie in Kapitel 2.1.2.-2.1.4 beschrieben.

3.2.3. Variation des Infektionsdrucks

Der Infektionsdruck wurde über das Sporangieninokulum definiert. Anhand der

Biomasse und der EPA-Konzentrationen des Pflanzengewebes wurde die Auswir-

kung des Infektionsdrucks gemessen. Je 25 Sonnenblumenkeimlinge der Sorte

Giganteus wurden mit 3 verschiedenen Inokuli des genetisch homogenen Erreger-

stammes BL-11.06.02-A4z (vgl. Kap. 2.1.1.) infiziert. 2000 Sporangien/ml sollten

schwach infizieren, 5000 Sporangien/ml eine mittelschwere Infektion auslösen und

10000 Sporangien/ml sollten zu einer schweren Infektion, bis hin zum Absterben von

Pflanzen, führen. Die entsprechend infizierten Keimlinge wurden nach 16 Tagen

Infektion gleichmäßig oberirdisch abgeerntet und gewogen. Die Frischgewichte (FG)

und die Letalität der Pflanzen nach Behandlung mit 2000, 5000 und 10000

Sporangien/ml wurden verglichen.


43

3.2.4. Variation des Stickstoffangebotes

3.2.4.1. Etablieren der Nährlösungskultur

Die Pathogenanzucht erfolgte wie unter 2.1.1.1. beschrieben. Im Unterschied dazu

fand die Infektion jedoch nicht in Erd- sondern in Hydrokultur statt, wofür die

Sonnenblumen daher speziell angezogen wurden.

Materialien: Sonnenblumensaatgut der Sorte Giganteus, Bechergläser (100 ml),

stumpfe Pinzette, Sieb, destilliertes Wasser, frische Sporangien von P. halstedii

Erregerisolat BL-11.06.02-A4z, Wärmeschrank, Klimakammer (16°C, 80% Luft-

feuchte), Filterpapier DIN A 2, verschließbare, transparente Anzuchtboxen.

Gesunde (Kontrollpflanzen) und mit P. halstedii infizierte Sonnenblumenpflanzen

wurden räumlich getrennt, jedoch zeitgleich, angezogen.

Aussaat und Keimung: Sonnenblumensaatgut der Sorte Giganteus wurde sorgfältig

in einem Sieb mit destilliertem Wasser abgespült. Die Keimlinge wurden in flachen

Plastikschalen auf feuchtem Papier verschlossen und dunkel im Wärmeschrank für

12 h bei 23°C angekeimt.

Am nächsten Tag wurden alle Sonnenblumenkerne von Hand mit einer stumpfen

Pinzette von ihren Schalen befreit. Die angekeimten Samen kamen am 1. Tag nach

Aussaat ohne Schale in Bechergläser mit destilliertem Wasser. Das Saatgut wurde in

2 x 120 Keimlinge in 100 ml Bechergläser mit dest. Wasser aufgeteilt. Eine Hälfte

wurde infiziert, die andere Hälfte blieb ohne Infektion.

Am 2. Tag nach Aussaat bzw. nach einem Tag im Becherglas wurden das infizierte

und gesunde Saatgut nicht in Erde gepflanzt, sondern auf Filterpapier ausgelegt. Das

Filterpapier war mit destilliertem Wasser getränkt und wurde so gefaltet, dass die

Keimlinge darin ein Hypokotyl ausbilden konnten, das lang genug war, um die

Pflanzen später mit Schaumstoff in Hydrokultur zu pflanzen. Infiziertes und gesundes

Saatgut wurden je mit sterilen Gerätschaften und zeitlich um eine Stunde getrennt

behandelt, um einer eventuellen Infektion des gesunden Kontrollsaatgutes vorzu-

beugen. Das Filterpapier mit den Sonnenblumenkeimlingen wurde mit Bodenkontakt


44

in eine transparente Plastikwanne mit Deckel gestellt, die zu 2 cm mit destilliertem

Wasser gefüllt war.

Gesundes und infiziertes Pflanzenmaterial wurden in getrennte Wannen gestellt und

an verschiedenen Orten über Nacht mit geschlossenen Deckeln bei 15°C gelagert.

Am 3.Tag nach Aussaat wurden die transparenten Gefäße in geschlossenem

Zustand (Schutz vor Läusen und anderen Schädlingen) ins Gewächshaus überführt,

damit die Pflanzen ergrünen konnten.

Am 4. Tag nach der Aussaat wurden die Pflanzen in eine belüftete Nährlösungskultur

in die Klimakammer überführt (Abb. 3.1.).

Materialien: Klimakammer, 24 Nährlösungstöpfe a 2,5 l, 240 Schaumstoffstreifen, 24

Silikonschläuche mit Glasausgang für die Töpfe, Nadeln für den Pumpenanschluss,

Luftpumpe, Nährlösungen.

Abb. 3.1.: Nährlösungskultur mit Sonnenblumen. Links: Belüftete Nährlösungskultur in der Klima-

kammer. Mitte: Mit BL-11.06.02-A4z infizierte Keimlinge der Sorte Giganteus nach 14 Tagen

Infektionszeit. Rechts: Giganteus-Kontrolle ohne Infektion nach 14 Tagen.

Die Pflanzen wurden bis zum 15. Tag nach Aussaat unter kontrollierten Bedingungen

in einer Klimakammer (16/8 h Tag/Nacht, 20°C, 70% re lative Luftfeuchte,

Lichtintensität (Photonenfluss) 250 µmol/m²•s) kultiviert.

In jedes Gefäß (Fassungsvermögen 2,5 l), welches bis 2 cm unter den Rand mit

Nährlösung befüllt war, wurden 10 Keimlinge gesetzt. Jeder Gefäßdeckel hatte 10

runde Löcher, in welche die Keimlinge, in Schaumstoffstreifen gewickelt, in das

Gefäß gepfropft werden konnten. Die Zusammensetzung der Nährlösung (mmol/L)

für Sonnenblumen folgte den Angaben von Dannel bzw. Pfeffer (DANNEL et al. 1995;

PFEFFER 1999): 0,7 K2SO4, 0,1 KCl, 0,5 MgSO4, 0,1 KH2PO4, 0,5 x 10-3 MnSO4, 0,5 x

10-3 ZnSO4, 0,2 x 10-3 CuSO4, 0,01 x 10-3 (NH4)6Mo7O24, 0,02 NaFe(III)-EDTA, 0,01

H3BO3.


45

Stickstoff wurde in Form von Ca(NO3)2 zugegeben und variiert. Um Effekte zu sehen,

wurden die Stickstoffstufen (N-Stufen) im Minimum, Optimum und Maximum gewählt.

Die erste Stufe (N1) mit 0,1 mmol/L Ca(NO3)2 sollte deutlichen N-Mangel hervorrufen,

die zweite N-Stufe (N2) mit 1,0 mmol/L Ca(NO3)2 sollte im optimalen Versor-

gungsbereich liegen, die dritte N-Stufe (N3) mit 5,0 mmol/L Ca(NO3)2 sollte eine

Überversorgung der Pflanzen gewährleisten. Die prozentualen N-Grenzwerte (%TG),

die von Jungpflanzen aufgenommen werden können und die daraus berechneten

Mengen an Ca(NO3)2 wurden aus der Literatur entnommen (REUTER et al. 1997).

Ein Wechsel der Nährlösungen erfolgte am 8. Tag, und am 11. Tag nach Aussaat,

um eine dauerhaft gute Nährstoffversorgung zu garantieren. Die Ernte erfolgte am

15. Tag nach Aussaat.

Es existierten insgesamt 6 Behandlungen: 3 N-Stufen mit 2 Varianten (infizierte und

gesunde Pflanzen). Von jeder Behandlung (N- Stufe) gab es 4 Töpfe mit je 10

Pflanzen, sodass 40 Pflanzen pro Ansatz zur Auswertung zur Verfügung standen.

Zur Ernte wurden alle 40 Pflanzen fotografiert und gewogen um das FG zu ermitteln.

Die Pflanzen wurden anschließend mit einer Schere in die Einzelteile Wurzel,

Spross, Keimblätter und Primärblätter zerlegt und erneut gewogen.

Von 28 willkürlich ausgewählten Pflanzen pro Behandlung wurden die Keimblätter für

Sporulationsversuche geerntet, die restlichen Pflanzenteile wurden, nachdem sie

gewogen waren, als Rückstellmuster eingefroren. Die restlichen 12 Pflanzen pro

Behandlung wurden komplett, jedoch in ihre Einzelteile zerlegt, in Trockentütchen

gepackt und 3 Tage bei 60°C im Wärmeschrank getrocknet. D ie getrockneten

Keimblätter von 8 Pflanzen wurden für die Fettsäureanalysen verwendet, 4 Gesamt-

pflanzen wurden zur Elementaranalyse verwendet, wobei der N-Gehalt in %

Trockengewicht ermittelt wurde.

3.2.4.2. Wachstum und Gewichte

Wachstum und FG von je 40 Pflanzen pro Behandlung wurden mit einer zwei-

stelligen Analysenwaage ermittelt. Das Wachstum wurde zudem mit Fotos doku-

mentiert.


46

3.2.4.3. Infektion und Befallsgrad

Die Sporulation wird im Pflanzenschutz als gängiger Infektionsbeweis und als Maß

zur Bestimmung von Pathotyp und Infektionsgrad bei obligat-biotrophen Oomyceten

benutzt (GARIBALDI et al. 2007; GULYA et al. 1991; ILOTT et al. 1987; MANDAL et al.

2008). Dabei wird der Prozentsatz an Pflanzen mit Befallssymptomen (Sporulation)

gegenüber den Pflanzen ohne Befallssymptome ausgewertet. Befallsgrad und

Infektion sollten mit Hilfe der Sporulation von 28 Keimblattpaaren pro Behandlung

ermittelt werden.

Material: Sporulationsgitter, Styroporbox, destilliertes Wasser, Pinzette, Fuchs-

Rosenthal-Zählkammer, Lichtmikroskop.

Um den Befallsgrad zu ermitteln und den Befall zu bestätigen, wurden Sporulations-

versuche mit Keimblattpaaren von 28 Pflanzen pro Behandlung durchgeführt. Um

Verluste an Sporangien zu vermeiden, wurden die Keimblätter der befallenen

Pflanzen in unsporuliertem Zustand geerntet und auf umgedrehte Spitzenhalter von

Reaktionsgefäßboxen gelegt, sodass sie nur an wenigen Punkten auflagen und

beidseitig sporulieren konnten. Die Keimblätter wurden über Nacht in einer Styropor-

box zur Sporulation gebracht. Am nächsten Morgen wurden die Keimblätter

fotografiert. Jedes Keimblattpaar wurde vorsichtig mit einer spitzen Pinzette in ein 10

ml Gefäß mit 3 ml destilliertem Wasser überführt. So konnten die Sporangien

verlustfrei mit einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer ausgezählt werden. Die ermittelte

Zahl der Sporangien für die Keimblattpaare der Pflanzen aus einem Behandlungs-

ansatz diente so als Beweis für eine Infektion und als Maß für den Befallsgrad der

jeweiligen Probe.

Anschließend erfolgte für jedes Keimblattpaar zusätzlich eine Blattflächenmessung

am Tageslichtprojektor mit der Computersoftware „WinDias“ (UP GmbH, Osnabrück),

um eventuell bestehende Korrelationen zwischen Sporangienanzahl und Blattfläche

zu ermitteln.

3.2.4.4. Gesamt-N Bestimmung im Sonnenblumengewebe

Die Elementaranalyse diente zur Abschätzung des Ernährungszustandes der

Pflanzen mit Hilfe von Grenzwerttabellen (Gesamt-N%) und zusätzlich zur

Berechnung der tatsächlichen N-Bilanz. Die Prozentanteile an Stickstoff von der


47

Pflanzeneinwaage (TG) wurden am Elementaranalysator nach der Dumas-Methode

gemessen. Die Proben wurden dafür im Gasstrom verbrannt und die Elementar-

zusammensetzung wurde mit einem Wärmeleitfähigkeitsdetektor über einen Refe-

renzgasstrom gemessen.

Material: Waage, Wärmeschrank, Trockentüten, Pflanzenproben von 4 Pflanzen pro

Behand-lung, Schüttelmühle (Retsch GmbH, Haan), 2 ml Reaktionsgefäße,

Stahlkugeln, Feinwaage, Zinnkartuschen (5x9 mm, Hekatech GmbH, Wegberg) für

den Elementaranalysator, Elementaranalysator (NCS 2500, CE Instruments,

Mailand, Italien), Pinzetten, Feinspatel.

Vier Proben ganzer Pflanzen pro Behandlung (N-Stufe), bestehend aus getrock-

netem Keimblattpaar, Hypokotyl, Wurzel und Primärblattpaar, wurden mit der

Schüttelmühle in 2 ml Gefäßen mit 2 Stahlkugeln fein zermahlen. Pro Probe wurden

zwischen 1 und 5 mg in die Zinnkartuschen an der Feinwaage eingewogen. Die

Gehalte an Stickstoff wurden am Analysator ermittelt und in Prozent am Gesamt-

probenanteil angegeben.

Auf Basis der Trockengewichte sowie der N-Gehalte (% TG) der untersuchten

Pflanzen wurde nach folgender Beispiel-Rechnung eine N-Bilanz (Angebot/Auf-

nahme-Verhalten) erstellt:

In einer 1 molaren Ca(NO3)2- Lösung befanden sich 28 g/l reines N. In 2,5 l

Nährlösung (c= 1 mM) befanden sich folglich 0,07 g N. In 0,1 mM Nährlösung waren

0,007 g N vorhanden, in 5 mM Nährlösung befanden sich 0,35 g N. Da pro Topf 10

Pflanzen wuchsen, standen pro Pflanze in 0,1 mM Lösung 0,0007 g N zur

Verfügung, in 1,0 mM Lösung 0,007 g und in 5,0 mM Lösung 0,035 g N.

Enthielt die Pflanze beispielsweise 6,3% N im TG von 3,3 g (=0,006 g N) und wurde

in einer 1,0 mM Lösung mit 10 anderen Pflanzen aufgezogen, so entsprach das einer

Aufnahme von 0,006 g N bei einem Angebot von 0,007 g N und damit einer

ausgeglichenen N-Bilanz bzw. optimalen Düngung.


48

3.2.4.5. Analyse der FS-Gehalte im Stickstoff-Steig erungsversuch

Die Fettsäureanalysen wurden zur Analyse der EPA-Konzentrationen nach unter-

schiedlichen N-Behandlungen sowie zum genaueren Nachweis des Infektions-

stadiums durchgeführt. Die infizierten Keimblätter der Sonnenblumen sowie Keim-

blätter der 3 N-Stufen der Kontrollpflanzen wurden, wie in Kap. 2.1.1.3. beschrieben,

geerntet und getrocknet. Die Proben für die Fettsäureanalyse verblieben bis zur

Verarbeitung bei RT im Exsikkator. Die Fettsäurekonzentrationen wurden qualitativ

und quantitativ wie in Kap. 2.1.2.-2.1.4. beschrieben ausgewertet.

Korrektur mit dem IS für die Wiederfindung und Vergleichbarkeit

Allen Proben wurde eine definierte Konzentration der FS 17:0 zugesetzt, womit

Aufar-beitungs- bzw. Einspritzverluste über die Peakflächen des 17:0 Peaks

korrigiert werden konnten. Der Mittelwert des elektrischen Signals von 17:0 aller

Proben (selbe Konzentration) wurde bestimmt und einer Konzentration zugeordnet.

Die Signal-flächen jeder Probe wurden in Relation zur Abweichung an diesem 17:0

Mittelwert angepasst:

Die Konzentrationen der FS in der Probe wurden daher wie folgt berechnet:

Es galt:

C FS = A FS

C17:0 IS A 17:0 (MW)

Daraus folgte:

C FS = C 17:0 IS • A FS

A 17:0 (MW)

Wobei: C FS = Konzentration der FS in der Probe, C 17:0 = bekannte Konzentration

des IS, A FS = Signalfläche der FS in der Probe, A 17:0 (MW) = auf Mittelwert

korrigierte Signalfläche des IS.


49

3.2.5. Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Statistikpaket SAS (SACHS & HEDDERICH

2006). Die Daten wurden in Excel aufgenommen und in SAS Datenblätter

transformiert (DUFNER et al. 1992). Die Auswertung erfolgte mit der SAS Methode

„Mixed“, da mit dieser Prozedur alle Rechenoperationen wie für das GLM (general

linerar model) durchgeführt werden konnten. Mit SAS standen graphische Verfahren

zur Überprüfung von Varianzhomogenität und Normalverteilung (WEBSTER 2001) der

Proben zur Verfügung.

Design zum Vergleich der Sporangienstämme und Wirtspflanzen

Die Mittelwertsvergleiche bei der einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) erfolgten

über einen multiplen t-Test. Die Schätzung der Mittelwerte und Varianzen erfolgte

nach der REML-Methode (restricted maximum likelyhood), die derzeit als beste

Schätzmethode gilt (PIEPHO et al. 2003). Bestanden innerhalb des Faktors „Fett-

säurekonzentration“ Unterschiede, so wurde ein multipler t-Test nachgeschaltet, der

signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Faktorstufen (Sporangienstämme

bzw. Wirtspflanzen) aufdeckte.

Statistisches Design zum Stickstoffversuch

Es sollte überprüft werden, ob sich Wachstum und Fettsäuregehalt infizierter und

gesunder Sonnenblumen, die in hydroponischer Kultur aufsteigend viel Stickstoff

erhielten, positiv änderten. Für alle 3 Stickstoff-Stufen (N1, N2, N3) und beide

Varianten (infiziert/gesund) wurden je 4 Wiederholungen angelegt. Pro Topf wuchsen

10 Pflanzen, pro N-Stufe und Variante standen somit 40 Pflanzen zur Verfügung, die

als eine Parallele gewertet wurden. Damit stellte eine Parallele grundsätzlich eine

Mischprobe mehrerer Individuen dar.

Alle Töpfe wurden bei Nährlösungswechsel örtlich randomisiert, so dass keine

Standorteffekte auftreten konnten.

Tabellen und Grafiken wurden mit Software Excel 2003 (Microsoft) erstellt. Es

wurden immer Mittelwerte und Standardfehlerbalken angegeben. In den Standard-

fehler (SF=√(s²)/√n) geht, verglichen mit der Standardabweichung, neben der

Varianz (s²) noch die Anzahl der Proben (n) mit ein, was ab einem Stichproben-

umfang von 4 Proben empfohlen wird (SACHS & HEDDERICH 2006). Es wurde eine

zweifaktorielle Varianzanalyse (Einfluss der N-Stufe und der Variante infiziert/gesund


50

auf die Faktoren EPA-Konzentration bzw. Wachstum) durchgeführt. Bei der zwei-

faktoriellen ANOVA zeigte ein F-Test, ob überhaupt signifikante Unterschiede

zwischen Faktoren bestanden. Bestanden Unterschiede zwischen Faktoren, wurde

ein multipler t-Test nachgeschaltet, der signifikante Unterschiede zwischen den

einzelnen Faktorstufen aufdeckte. Unterschiede zwischen den Faktorstufen innerhalb

des Faktors wurden auf dem 5%igen Signifikanzniveau (p<0,05%) mit Hilfe eines

multiplen t-Tests festgestellt.


51

3.3. Ergebnisse

3.3.1. EPA-Gehalte verschiedener Sporangienstämme v on P. halstedii

Es galt die Frage zu klären, ob Stämme existieren, die besonders leistungsstark in

der n-3-FS-Produktion sind. Der Stamm BL-11.06.02-A4z enthielt mit durchschnittlich

fast 25 mg EPA/g Sporangien signifikant mehr EPA als die Stämme GG-16.10.97-

A25, LS-13.12.05-C6 und HE-10.01.06-A8, die durchschnittlich 20 und 18 mg EPA/g

Sporangien enthielten (Abb. 3.2.).

0

5

10

15

20

25

30

BLA4 GGA25 HEA8 LSC6P. halstedii Stämme

mg E

PA

/g S

pora

ngie

n

Abb. 3.2.: EPA-Gehalte der untersuchten P. halstedii Stämme: BL-11.06.02-A4z (BL-A4), GG-

16.10.97-A25 (GGA25), HE-10.01.06-A8 (HE-A8), LS-13.12.05-C6 (LS-C6). Dargestellt sind die

Mittelwerte aus n=63 Messungen und die Standardfehler. Verschiedene Buchstaben stellen signifi-

kante Unterschiede dar.

Da BL-11.06.02-A4z die höchste EPA-Konzentration aufwies, wurde dieser Stamm

für die Untersuchung von weiteren Optimierungsschritten verwendet.

3.3.2. Besonders anfällige Sonnenblumensorten und - linien

In infiziertem Zustand zeigten die Sorte Giganteus und die Linie DM-2 die höchsten

Biomassen (Abb. 3.3.), wogegen die Linien 799-2 und 803-1 sehr wachstums-

schwach waren. Die Produktion von EPA korrelierte sehr stark mit der Biomasse der

Wirtspflanze (vgl. Abb. 3.3. u. 3.4.). Es gab bei einer Infektion im selben Zeitraum

stark anfällige Wirte wie Giganteus und DM-2, die bei viel Biomasse viel EPA

enthielten, es gab jedoch auch wenig anfällige Linien wie PM17, die bei viel

a

b b b


52

Biomasse wenig EPA enthielten. Als dritte Variante gab es noch Linien, die nicht viel

Biomasse bilden konnten und dementsprechend wenig EPA enthielten wie 803-1 und

799-2.

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

Sorte/Linie

TG

[g]

Mittleres TG [g] 0,05 0,02 0,04 0,04 0,02 0,02 0,01 0,04 0,01 0,04

Giganteus

HA 821

HA 304

RHA 265

RHA 274

PM 13 799-2 PM 17 803-1 DM-2

Abb. 3.3.: Mittlere Trockengewichte TG (g) mit Standardfehler von 20 P. halstedii-infizierten Keim-

lingen einer Sonnenblumensorte bzw. -Linie. Unterschiedliche Buchstaben stehen für statistisch

signifikante Unterschiede in der Biomasse.

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

Sorte/Linie

EPA [m

g/g

TG

)

EPA [mg/g TG] 0,98 0,88 1,07 0,87 0,72 0,86 0,68 0,28 0,31 1,10

Giganteus

HA 821

HA 304

RHA 265

RHA 274

PM 13 799-2 PM 17 803-1 DM-2

Abb. 3.4.: Mittlere EPA-Gehalte mit Standardfehler (mg/g TG) von je 20 P. halstedii-infizierten Keim-

lingen einer Sorte bzw. Linie. Unterschiedliche Buchstaben stehen für statistisch signifikante

Unterschiede in der EPA-Produktion.

Die Sorte Giganteus und die Linien HA304 und DM-2 konnten vom Stamm BL-

11.06.02-A4z bei den höchsten EPA-Durchschnittsgehalten pro g Biomasse am

besten infiziert werden. Die höchst erzielbaren Konzentrationen an EPA im Wirt

a a

b b b

c c c

d d

a b

c

b

a

b

c

d d

a


53

betrugen bei voller Infektion und vor Sporulation bei Giganteus im Mittel 0,98 mg

EPA/g TG, bei HA 304 1,07 und bei DM-2 sogar 1,10 mg/g TG, wobei jedoch keine

statistischen Unterschiede zwischen den 3 Wirten festgestellt werden konnten (Abb.

3.4.).

3.3.3. Variation des Infektionsdrucks

Ziel war es, das Optimierungspotenzial von Biomasse und EPA-Gehalt durch den

Infektionsdruck über die Variation des Erregerinokulums zu untersuchen. Eine

Infektionszeit von etwa 2 Wochen war erwünscht, da ab diesem Zeitraum unter

gegebenen Bedingungen (vgl. Kap. 2.1.1.1.) die Biomassen der Keimblätter der

Sonnenblumen maximal ausgebildet waren.

Bei einem Inokulum von 10000 Sporangien/ml wurde ein Durchschnittsgewicht von

2,7 g/Keimling erreicht (Abb. 3.5.), alle Pflanzen der Infektionsstufe zeigten nach 16

Tagen und Inkubation über Nacht Sporulation. Die Keimlinge bei einer Inokulation

von 5000 Sporangien/ml erreichten mittlere Gewichte von 3,02 g, 3 Pflanzen zeigten

keine Sporulation.

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

c(Sp.)/ml

FG

[g]

FG (g) 3,68 3,34 3,03 2,77

gesund (0) 2000,00 5000,00 10000,00

Abb. 3.5.: Mittlere Frischgewichte von 25 infizierten (Stamm BL-11.06.02-A4z) Sonnenblumen (Sorte

Giganteus) mit Standardfehler bei versch. Sporangieninokuli (16 Tage Infektionszeit): c=2000

Sporangien/ml, 5000 Sporangien/ml, 10000 Sporangien/ml. Verschiedene Buchstaben stellen statis-

tisch signifikante Unterschiede dar.

Mit einem mittleren Gewicht von 3,34 g waren die Biomassen der Keimlinge bei 2000

Sporangien/ml am besten ausgeprägt, jedoch gab es bei dieser Behandlung 10 von

25 Pflanzen, die nach Inkubation keine Sporulation zeigten und damit nicht sichtbar

a

b a

b


54

infiziert waren. Nach 16 Tagen Infektionszeit, bei einem Sporangieninokulum von

10000 Sporangien/ml starben 7 von 25 Keimlingen vor der Ernte (Abb.3.6.). Bei

einem Inokulum von 5000 Sporangien/ml starben nur 3 Pflanzen, bei 2000

Sporangien/ml starben nur 2 von 25 Pflanzen frühzeitig ab.

Die höchsten Biomassen bei geringer Letalität und guter allgemeiner Infektion (wenig

gesunde Pflanzen) erreichten die Keimlinge bei einer Infektion mit 5000 Sporan-

gien/ml. Bei steigender Sporangienanzahl nahmen die FG von infizierten Sonnen-

blumen deutlich ab und die Letalität stieg, bei niedrigerer Sporangienzahl gab es zu

viele Pflanzen ohne Befallssymptome.

0

5

10

15

20

25

30

c(Sp.)/ml

Stü

ck

Letale Pfl. 0 2 3 7

gesunde Pfl. 25 10 3 0

gesund (0) 2000 5000 10000

Abb. 3.6. : Letalität bei versch. Sporangieninokuli (16 Tage Infektionszeit): c=2000 Sporangien/ml,

5000 Sporangien/ml, 10000 Sporangien/ml. Sonnenblumen der Sorte Giganteus, gesund und nach

Infektion mit dem Stamm BL-11.06.02-A4z.

Eine Infektionsdauer über 20 Tage hinaus führte unter gegebenen Bedingungen im

Klimaschrank meist zu Totalausfall, da die Pflanzen durch fortschreitende Infektion

umkippten und faulten.

Die besten Infektionsergebnisse bezüglich Biomasse der Keimblätter und Infektions-

grad (= Ausbreitungsfläche für den Erreger bei gleichzeitigem Anstieg des EPA-

Gehaltes) zeigten sich daher nach etwa 2 Wochen Infektionszeit bei dem Inokulum

von 5000 Sporangien/ml.


55

3.3.4. Variation des Stickstoffangebotes

3.3.4.1. Wachstum und Gewichte

In diesem Kapitel sollte geklärt werden, ob mit Hilfe der N-Düngung die

Wirtsbiomasse oder die EPA-Konzentrationen in infiziertem Gewebe gesteigert

werden konnten. Das Wachstum der infizierten Pflanzen in Hydrokultur zeigte die

Erreger-typischen Symptome (ROZYNEK 2000): P. halstedii verursachte Wuchs-

hemmung, Blattchlorosen und verdickten Wurzelhals bei infizierten Sonnenblumen.

Befallene Pflanzen waren somit bereits visuell von den Kontrollpflanzen ohne

Infektion deutlich zu unterscheiden.

Verglich man die N-Stufen 1, 2 und 3 der infizierten Pflanzen miteinander, so fiel auf,

dass die oberirdischen Teile aller N-Stufen ähnlich klein blieben und wenige optische

Unterschiede zwischen den Behandlungen feststellbar waren (Abb. 3.7. oben).

Abb. 3.7.: Vergleich des Wachstums 15 Tage alter Sonnenblumen bei 3 N-Stufen. Oben: Infizierte

Sonnenblumen, unten: Gesunde Sonnenblumen. Von links nach rechts sieht man das Wachstum bei

0,1 mM, 1 mM und 5 mM Ca(NO3)2 pro Topf.

Die Wurzelfarbe der infizierten Pflanzen war bei der niedrigsten N-Stufe 0,1 mM

Ca(NO3)2/Topf weiß, bei der mittleren N-Stufe 1,0 mM Ca(NO3)2 gelblich und bei der

höchsten N-Stufe mit 5,0 mM Ca(NO3)2/Topf braun. Dies war ein Indiz dafür, dass

sich hohe Ca(NO3)2-Gaben toxisch auf das Wurzelwachstum der infizierten Pflanzen

auswirkten. Im Vergleich zu den gesunden Kontrollpflanzen waren alle infizierten

Pflanzen deutlich kleiner und schwächer entwickelt.

0,1 mM 1,0 mM 5,0 mM

0,1 mM 1,0 mM 5,0 mM


56

Verglich man die N-Stufen der gesunden Variante untereinander, dann wiesen die

Kontrollpflanzen zwischen allen 3 N-Stufen deutliche Unterschiede im Wachstum der

oberirdischen und der unterirdischen Pflanzenteile auf (Abb. 3.7. unten). Mit 0,1 mM

Ca(NO3)2 waren die Keimblätter ausgewachsen, die Primärblätter waren jedoch, im

Vergleich mit den beiden höheren N-Stufen unterentwickelt. Das Wurzelwachstum

der Mangelvariante stand ebenfalls sichtbar hinter dem Wurzelwachstum bei

höheren N-Gaben zurück. Von der optimalen N-Stufe mit 1,0 mM Ca(NO3)2 pro Topf

zur überdüngten Variante mit 5,0 mM Ca(NO3)2/Topf war eine leichte Abnahme der

Wurzelmasse und der oberirdischen Pflanzenmasse zu sehen.

Die Frischgewichte von 40 gesunden und infizierten Pflanzen derselben Düngungs-

stufe wurden miteinander verglichen und statistisch mit einem multiplen Mittelwerts-

vergleich überprüft (Abb.3.8.). Die mittleren Frischpflanzengewichte der

Stickstoffstufen N1 und N3 innerhalb der gesunden Variante (Kontrolle) lagen mit 2,2

bzw. 2,17 g signifikant (p<0,01) unter den Frischgewichten der optimal gedüngten

Stufe N2 mit 3,3 g.

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

Ca(NO3)2/Topf

FG

[g]

K [g] 2,21 3,32 2,71

I [g] 0,66 0,77 0,68

0,1 mM 1 mM 5 mM

Abb. 3.8.: Mittlere FG (mit Standardfehler) von je 40 gesunden (K) und infizierten (I), 15 Tage alten

Sonnenblumen. Von links nach rechts sieht man nebeneinander die Gewichte der N-Stufen 1 bis 3 mit

0,1m 1 und 5 mM Ca(NO3)2 pro Topf. Unterschiedliche Buchstaben stellen statistisch signifikante

Unterschiede dar.

Die mittleren FG der infizierten Pflanzen lagen mit etwa 0,7 g insgesamt signifikant

unter denen der gesunden, gleichaltrigen Kontrollpflanzen, die Gewichte bis zu 3,3 g

b

a

c

d e e


57

pro Pflanze erreichten. Innerhalb der infizierten Pflanzen ließ sich zusätzlich

beweisen, dass die Pflanzen der mittleren Düngungsstufe mit durchschnittlich 0,77 g

signifikant mehr Biomasse aufwiesen, als die Pflanzen der anderen beiden

Düngungsstufen.

3.3.4.2. Infektion und Befallsgrad

Es wurden Sporulationsversuche ausgeführt, um Infektion und Befallsgrad der 3 N-

Stufen zu testen. Hierzu wurden von 28 Pflanzen die Keimblattpaare abgenommen

und zur Sporulation gebracht (vgl. Kap. 2.1.1.1.). Es gab statistisch signifikante

Unterschiede zwischen den Sporangienzahlen der Keimblattpaare der verschie-

denen Düngerstufen (Abb. 3.9.). Die mittlere Stufe N2 wies mit 72708 Sporangien

pro Keimblattpaar einen statistisch signifikant höheren Mittelwert auf, als die nicht

optimal gedüngten Stufen N1 und N3 mit mittleren Sporangienzahlen von 33088 und

36428 Sporangien pro Keimblattpaar.

0

20000

40000

60000

80000

100000

N-Stufe

Sp

oran

gien

pro

K

eim

blat

tpa

ar

Sp/KB-Paar 33088 72708 36428

0,1 mM 1 mM 5 mM

Abb. 3.9. : Mittlere Sporangienzahlen von 28 Keimblattpaaren infizierter Pflanzen bei 3 N-Stufen mit

Standardfehlerbalken. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistisch signifikante Unterschie-

de zwischen den Behandlungen.

Zusätzlich durchgeführte Messungen der Blattflächen der Keimblattpaare zeigten,

dass die Sporangienzahlen eine positive Korrelation zur durchschnittlichen Blatt-

fläche der Keimblattpaare aufwiesen. Je größer die durchschnittliche Blattfläche war,

umso mehr Sporangien wurden gefunden. So wiesen Keimblattpaare der Mangel-

a

b

a


58

Stufe N1 die kleinsten durchschnittlichen Oberflächen mit 2,0 cm²/Keimblattpaar auf,

Keimblattpaare der Stufe N2 hatten mit 2,6 cm²/Keimblattpaar die größten Blatt-

flächen und die Stufe N3 zeigte einen mittlere Blattfläche von 2,2,cm²/Keimblattpaar.

3.3.4.3. Gesamt-N-Gehaltsbestimmung in Sonnenblumen pflanzen

Grenzwerte für die optimale N-Düngung wurden aus der Literatur entnommen

(REUTER et al. 1997) und mit vorliegenden Werten der N-Analyse verglichen. Für

Sonnenblumenkeimlinge wird der Literatur-Grenzwert für ausreichende N-Versor-

gung bei 5,21 N(%) angesetzt. In diesem Versuch wurden Gesamt-N Gehalte von 4

bis 7,5 N(%) erreicht. Mit der Elementaranalyse konnte für die Kontrolle gezeigt

werden, dass die Pflanzen der Töpfe der Stufe N1 mit durchschnittlich 4 % N unter

der Grenze von 5% lagen und damit als unterversorgt eingestuft werden konnten

(Abb. 3.10.). Die Pflanzen der Stufe N2 lagen mit 6,3% N im Trockengewicht daher

im optimal versorgten Bereich (Abb. 3.10). Die Pflanzen der Stufe N3 waren mit

7,41% Gesamt-N im Stickstoffüberschuss.

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

N-Stufe

Ge

sam

t N in

Ge

wic

hts-

%

Kontrolle 3,94 6,31 7,41

Befallen 6,84 6,16 5,88

0,1 mM (N1) 1 mM (N2) 5 mM (N3)

Abb. 3.10.: Gesamt-N Gehalte (% TG) von gesunden (Kontrolle, gestreifte Balken) und P. halstedii-

befallenen Sonnenblumen (weiße Balken) bei 3 N-Stufen.

Bei den infizierten Pflanzen der Stufe N1 waren die Prozentanteile von N am TG sehr

viel höher als bei der Kontrolle, wobei sich ein deutlicher N-Verdünnungseffekt von

N-Stufe 1 nach N-Stufe 3 zeigte. Es wurde zwar N angeboten, die ansteigenden

Mengen konnten jedoch nicht assimiliert werden.


59

Die N-Bilanz (vgl. Kap. 3.2.4.4.) bestätigte die Aussage der Literatur-Grenzwerte. So

nahmen die gesunden Pflanzen bei optimaler N-Versorgung (N2) etwa soviel

Stickstoff auf (0,006 g pro Pflanze), wie in der Nährlösung angeboten wurde (0,007

g). Bei einem Überangebot von 0,035 g N/Pflanze in den Nährlösungen konnte von

den Pflanzen ebenfalls nur 0,006 g N/Pflanze aufgenommen werden. Im N-Mangel

Nährmedium stand mit 0,0007-0,0014 g N/Pflanze weniger N zur Verfügung als pro

Pflanze/Topf durchschnittlich assimiliert wurde (0,0015 g N/Pflanze).

Die N-Bilanz für die infizierten Pflanzen ergab, dass mit steigendem N-Angebot zwar

mehr N assimiliert wurde (N-Aufnahme: Stufe N1 0,00041 g N/Pflanze, Stufe N2

0,00049 g N/Pflanze, Stufe N3 0,00058 g N/Pflanze), die Gesamtaufnahme jedoch

stark unter dem Niveau der gesunden Sonnenblumenpflanzen lag und das Angebot

an N in der Nährlösung bei allen 3 N-Stufen nicht ausgeschöpft werden konnte.

3.3.4.4. EPA-Konzentrationen bei 3 N-Stufen

Für die infizierten und gesunden Pflanzen der 3 N-Stufen wurden qualitative und

quantitative Vergleiche der FS mit den höchsten Anteilen am FS-Muster durchgeführt

Diese wurden zunächst exemplarisch als Signalflächenmuster dargestellt (Abb. 3.11.

u. 3.12.). Es folgten die Analyse und der Vergleich der FS-Konzentrationen der

Behandlungen in mg pro g TG für die N-Stufen 1 bis 3 (Abb. 3.13.).

Bei gesunden Pflanzen bestand das Fettsäuremuster hauptsächlich aus den Fett-

säuren 18:3 n-3 mit über 50% Anteil am Gesamtmuster, 18:2 n-6 mit etwa 30%, 18:1

n-9 mit etwa 5% und 16:0 mit etwa 10 % am Gesamtanteil des Fettsäuremusters

(Abb. 3.11.). Die FS 14:0, 16:0, 16:1, 18:1 n-9, 18:2 n-6, 18:3 n-3 und 20:5 n-3 waren

die dominierenden FS der P. halstedii-infizierten Pflanzen (Abb. 3.12.), wobei von

gesunden Sonnenblumen weder 16:1 noch 20:5 n-3 produziert wurden. Die Flächen-

signale der FSME aus infizierten Pflanzen waren, trotz ähnlicher Pflanzeneinwaagen,

deutlich stärker als die aus gesunden Pflanzen.


60

Abb. 3.11.: Fettsäuremuster von gesundem Sonnenblumenkeimblatt. Sorte Giganteus mit den FS

16:0, 18:1 n-9, 18:2 n-6 und 18:3 n-3 auf der Säule CP7419.

Abb. 3.12.: FS-Muster von den Keimblättern einer P. halstedii-infizierten Sonnenblume. Sorte

Giganteus mit dem kombinierten Muster von P. halstedii und Sonnenblume auf der Säule CP7419.

Die Fettsäurekonzentrationen stiegen innerhalb der gesunden Variante bei den

ungesättigten FS 18:2 n-6 und 18:3 n-3 von Stufe N1 (0,1 mM) nach Stufe N3 (5

mM) signifikant an (vgl. Abb. 3.13.). Die Stufen N1 und N2 zeigten keine signifikanten

Unterschiede.

Auch bei den infizierten Sonnenblumen lagen die Konzentrationen der FS bei N-

Stufe 1 insgesamt deutlich niedriger, als bei der höchsten Stufe N3 (Abb. 3.14.).

Bei den FS 16:0, 18:2 n-6 und 20:5 n-3, die für P. halstedii typisch sind, waren diese

Unterschiede zwischen den Stickstoffstufen N1 und N3 ebenfalls signifikant (p<0,01).

Die höchsten Fettsäuregehalte für 20:5 n-3 und 18:2 n-6 mit 1,8 und 2,2 mg/g TG

wurden von infizierten Pflanzen der höchsten Stufe N3 mit 5,0 mM Ca(NO3)2/Topf

erzielt (vgl. Tab. 3.14.).

14:0

16:0

17:0 IS

18:1 n-9

18:2 n-6

18:3 n-3

20:5 n-3

16:0 18:1 n-9

18:2 n-6

18:3 n-3

17:0 IS


61

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

FAME

mg

FS

/g T

G

0,1 mM 0,25 0,19 0,58 0,94

1 mM 0,23 0,09 0,47 0,84

5 mM 0,28 0,09 0,85 1,42

16:0 18:1 18:2 n-6 18:3 n-3

Abb. 3.13.: FS-Gehalte von gesunden Sonnenblumen (15 Tage) bei 3 N-Stufen: 0,1 mM, 1,0 mM und

5,0 mM Ca(NO3)2 pro Topf. Dargestellt sind Mittelwerte mit Standardfehler.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

FAME

mg F

S/g

TG

0,1 mM 0,18 0,98 0,02 0,75 1,74 0,22 0,69

1 mM 0,39 1,79 0,26 1,05 1,94 0,58 1,23

5 mM 0,30 1,53 0,07 0,96 2,26 0,43 1,80

14:0 16:0 16:1 18:1 18:2 n-6 18:3 n-3 20:5 n-3

Abb. 3.14.: FS-Gehalte von P. halstedii-infizierten Sonnenblumen (15 Tage) bei 3 N-Stufen: 0,1 mM,

1,0 mM und 5,0 mM Ca(NO3)2 pro Topf. Dargestellt sind Mittelwerte mit Standardfehler.

Verglich man die FS-Konzentrationen zwischen den Behandlungen gesund/infiziert,

(Abb. 3.13. u. 3.14.) so produzierten die gesunden Keimblätter im Gesamtmittel 2,6

mg FS/g TG bei Stufe N3, bei der infizierten Variante war es auf derselben N-Stufe

mit 7,0 mg FS/g TG mehr als das Doppelte. Dabei fiel jedoch die FS 18:3 n-3 etwas

aus dem Rahmen, da die Gehalte in gesunden Pflanzen von Stufe N1 nach Stufe N3

signifikant stiegen, wogegen sie in infizierten Keimblättern bei der höchsten N-Stufe

absanken.


62

3.4. Diskussion

3.4.1. Optimierungspotenzial durch die Selektion von Pathogenstämmen

Das artinterne Sporangienscreening zeigte, dass Stämme von P. halstedii existier-

ten, die im Durchschnitt statistisch signifikant mehr EPA produzieren konnten als

andere Stämme. Mit BL-11.06.02-A4z stand ein Stamm zur Verfügung, der 25-30 mg

EPA/g Sporangien produzieren konnte. Es war eine Steigerung von 25% zwischen

den untersuchten Stämmen möglich. Diese geringe Steigerungsmöglichkeit des

EPA-Gehaltes innerhalb der Art P. halstedii genügte jedoch nicht, um den EPA-

Gehalt in geforderter Weise so zu steigern, dass der Verzehr von infizierten Sonnen-

blumenkeimlingen einen erheblichen EPA-Gewinn durch das potenzielle Nahrungs-

mittel darstellen würde. Es muss allerdings bemerkt werden, dass lediglich 4 unter-

schiedliche Stämme verschiedener Feldisolate auf ihre EPA-Gehalte untersucht

wurden. Es kann zu diesem Zeitpunkt daher nicht ausgeschlossen werden, dass

leistungsfähigere Stämme oder Isolate von P. halstedii oder auch anderer Arten wie

z.B. B. lactucae existieren, bei denen deutlichere Leistungsunterschiede vorhanden

sind.

3.4.2. Optimierungspotenzial durch die Selektion von Wirtspflanzen

Erwünscht war ein möglichst geringes Biomasse/EPA-Verhältnis, da möglichst viel

EPA pro Biomasse im Pflanzengewebe enthalten sein sollte.

Mit der Sorte Giganteus konnte man aufgrund der großen Samen besonders gut

arbeiten. Sie gehörte mit der Linie DM-2 zu den Wirten, mit der besten Biomasse-

entwicklung und dem besten Biomasse/EPA-Verhältnis, wenn mit dem besonders

EPA-haltigen Sporangienisolat BL-11.06.02-A4z infiziert wurde (Abb. 3.3. u. 3.4.),

jedoch auch andere Isolate erzielten gute EPA-Gehalte auf der Sorte Giganteus.

Die Wirt/Pathogen-Kombination Giganteus/BL-11.06.02-A4z schien für weitere Opti-

mierungsversuche besonders geeignet. Da jedoch, aufgrund genannter Vorzüge,

bereits im Vorfeld der Optimierungsversuche (Kap. 2.2.) mit der Sorte Giganteus

gearbeitet wurde, war der Optimierungsspielraum durch einen besonders anfälligen

Wirt bereits ausgereizt, und infiziertes Gewebe erreichte lediglich die bisher

gemessenen EPA-Gehalte von durchschnittlich 1 mg/g TG.


63

3.4.3. Optimierungspotenzial durch variierten Infekt ionsdruck

Über den Infektionsdruck konnte der Infektionsverlauf gesteuert werden. Mit Hilfe der

Inokulation definierter Sporangienkonzentrationen wurde in einem definierten Zeit-

raum eine relativ homogene, gleichmäßige Infektion von Sonnenblumenkeimlingen

derselben Sorte erreicht. Dies war Voraussetzung für vergleichbare Ergebnisse und

optimale Erntemöglichkeiten von Sporangien und infiziertem Pflanzengewebe. Der

Spielraum für eine Optimierung des Infektionsdrucks war jedoch sehr begrenzt, da im

selben Zeitraum bei zu hohem Inokulum die Infektion schneller verlief und zu

statistisch vermehrtem Pflanzenausfall führte, wogegen ein zu niedrig gewähltes

Inokulum für eine Infektion innerhalb des gewähltes Zeitraumes nicht genügte.

Infizierte Pflanzen bei zu hohem Sporangieninokulum zeigten daher verfrühte

Letalität, Pflanzen bei zu niedrigem Sporangieninokulum wurden entweder nicht

infiziert oder konnten, trotz Infektion (Nachweis über EPA-Gehalt), nach dem

definierten Infektionszeitraum nicht mehr zur Sporulation gebracht werden.

Zur Optimierung des EPA-Gehaltes war der Infektionsdruck daher zwar indirekt

wichtig, um einen gleichmäßigen Infektionsverlauf und gute Ernteergebnisse zu

erzielen, direkte EPA-Steigerungsmöglichkeiten waren damit jedoch nicht möglich.

3.4.4. Optimierungspotenzial durch variierte N-Düngu ng

Das Wachstum verlief für gesunde und infizierte Pflanzen bei den 3 N-Stufen sehr

unterschiedlich. Die gesunde Variante verhielt sich bezüglich der gebildeten Bio-

masse gemäß den Düngeregeln. Je mehr N den gesunden Pflanzen angeboten

wurde, umso mehr N wurde in das Pflanzengewebe eingelagert (MARSCHNER 1995).

Die infizierte Variante blieb im Wachstum bei allen N-Stufen stark hinter der Kontrolle

zurück und konnte den zusätzlichen Stickstoff nicht umsetzten. Dieses Wachs-

tumsverhalten stimmte sowohl mit der Elementaranalyse des Anteils an N im

Pflanzengewebe, als auch mit der N-Bilanz überein. Für Sonnenblumenkeimlinge

wird dort der Literatur-Grenzwert für ausreichende N-Versorgung bei 5,21 N(%)

angesetzt. In diesem Versuch wurden Gesamt-N Gehalte von 4 bis 7,5 N(%) erreicht.

Bei infizierten Sonnenblumen zeigte sich dabei ein negativer Verdünnungseffekt

(Abb. 3.10.), trotz steigendem N-Angebot konnte kein zusätzlicher Stickstoff

assimiliert werden. Auffällig waren zudem die deutlich höheren N-Gehalte der

infizierten Variante der Stufe N1 im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 3.10.). So lagerten


64

infizierte Pflanzen der Stufe N1 ca.7 % N ins Gewebe ein, die gesunden Kontrollen

jedoch nur ca. 4 % N. Bei der optimal gedüngten Stufe N2 gab es mit ca. 6 % N im

Pflanzengewebe keine Unterschiede zwischen infizierter und gesunder Variante. Bei

der hoch gedüngten Stufe N3 enthielt die Kontrolle mit ca. 7 % N signifikant mehr N

als die infizierte Variante mit nur 6 % N.

Eventuell löste die Infektion als „Stressfaktor“ eine gesteigerte N-Assimilation aus.

Solche Reaktionen sind aus der Literatur bekannt, bei moderatem Salzstress wurden

z.B. für Gossypyrum hirsutum L. (PESSARAKLI & TUCKER 1985) und für Solanum

melongena L. (PESSARAKLI & TUCKER 1988), trotz Wachstumsdepression der

Pflanzen, signifikante Anstiege in der N-Assimilation ins Gewebe registriert, wobei

dieser Effekt bei sehr hohem Salzstress nicht mehr nachgewiesen wurde und die

Kontrollpflanzen mehr N pro Trockenmasse zeigten. Dieses Ergebnis deckt sich

auch mit den Beobachtungen dieser Arbeit. Von den infizierten Pflanzen der höheren

N-Stufen wurde gegenüber der Kontrolle weniger N ins Gewebe assimiliert. Dies

stand wohl mit dem zusätzlichen Stressfaktor der zunehmenden Wurzelschädigung

bei steigender N-Düngung in Zusammenhang.

Bei den Sporulationsversuchen zu Infektion und Befallsgrad zeigte sich, dass optimal

gedüngte Pflanzen deutlich mehr Sporulation aufwiesen als die Pflanzen der niedrig

und hoch gedüngten N-Variante. Es zeigte sich jedoch, dass sowohl die mittlere

Biomasse, als auch die mittlere Blattfläche der infizierten Pflanzen bei optimaler N-

Stufe signifikant höher waren, als die der beiden anderen N-Stufen. Da mit

vermehrter Biomasse mehr Keimblattfläche und damit mehr Sporulationsfläche zur

Verfügung stand, konnten aufgrund dieser positiven Korrelation bei der mittleren N-

Stufe am meisten Sporangien geerntet werden.

Die Fettsäuremessungen zeigten, dass hohe Gaben an Ca(NO3)2 hohe Konzen-

trationen an n-3-FS in Pflanzengewebe förderten. Der ALA (18:3 n-3) Gehalt stieg

mit zunehmender N-Stufe bei gesunden Pflanzen signifikant an. Diese Ergebnisse

stimmten mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen überein, die versuchten

Fettsäuregehalte von Pflanzen über den Weg der N-Düngung zu beeinflussen. Bei

hohen Stickstoffgaben in hydroponischer Kultur ließen sich z.B. auch die n-3-FS-

Gehalte von Portulak signifikant steigern (FONTANA et al. 2006; RANI PALANISWAMY et

al. 2000).


65

In infizierten Pflanzen stiegen die EPA Gehalte mit steigenden N-Konzentrationen in

der Nährlösung ebenfalls deutlich an. Untersuchte Keimblätter der höchsten N-Stufe

mit 5,0 mM (CaNO3)2 zeigten dabei die höchsten EPA-Gehalte. Eventuell förderten

hohe Stickstoffgaben den Befall mit Falschem Mehltau. Dass hohe Stickstoffgaben

den Befall mit Falschem Mehltau fördern, wurde aktuell für Wegerich gezeigt

(MANDAL et al. 2008). Gegenüber vorherigen Optimierungsversuchen bei denen

höchstens 1 mg EPA/g TG erzielt werden konnte, war es mit Hilfe von N immerhin

möglich, die EPA-Konzentration in infiziertem Gewebe um Faktor 2 auf ca. 2 mg/g

TG zu steigern.

Auffällig war dabei, dass die FS-Gehalte in infizierten Pflanzen, außer für 18:3 n-3,

insgesamt deutlich höher waren als in gesunden Pflanzen. Die zusätzlichen FS

wurden wohl von P. halstedii gebildet, denn es waren hauptsächlich die Hauptfett-

säuren von P. halstedii, wie 16:0, 18:2 n-6 und 20:5 n-3, die in infizierten Pflanzen

vermehrt vorkamen. Dass allein die FS 18:3 n-3 bei infizierten Pflanzen in deutlich

geringerem Maße vorkam, als bei Kontrollpflanzen, war interessant. Ein Grund dafür

könnte die Verwendung von 18:3 n-3 als Substrat für die Synthese von EPA sein

(SAYANOVA & NAPIER 2004; TRIPODI et al. 2006), von der, vor allem von der infizierten

der Stufe N3, erhebliche Mengen (1,8 mg/g TG) produziert wurden. Für manche

Mikroalgen wurde bereits bewiesen, dass 18:3 n-3 als Substrat für die Biosynthese

von EPA oder DHA dient (TONON et al. 2005).

Im Rahmen von Optimierungsstudien bezüglich der Produktion von EPA bei

Mikroalgen und heterotrophen Oomyceten führten andere Forschergruppen bereits

Ernährungsstudien mit Stickstoff durch, für obligat-biotrophe Oomyceten ist die

vorliegende Studie diesbezüglich die erste.

Zählt man die Ergebnisse anderer Studien auf, so produzieren die heterotrophen

Oomyceten Schizochytrium und Thraustochytrium in N-Mangel-Medium mehr EPA

und DHA als in N-reichem Medium (HUANG et al. 2001; WARD & SINGH 2005). Die

Mikroalge Pavlova lutheri hat unter N-Mangel ebenfalls eine verbesserte EPA-

Produktion (CARVALHO et al. 2005) und auch Eismeerdiatomeen erhöhen die EPA-

Produktion in Phospholipiden bei N-Mangel (MOCK & KROON 2002). Bei N-Mangel ist

zudem die EPA-Produktion von Nitzschia laevis erhöht.


66

Es existieren jedoch auch Studien zu Mikroalgen mit gegenteiligen Ergebnissen.

Diese Arten erhöhen ihre EPA-Produktion, wenn viel Stickstoff im Nährmedium ist.

Phaeodactylum tricornutum produziert bei viel N im Medium mehr EPA

(YONGMANITCHAI & WARD 1991), ebenso verhalten sich Nannochloropsis oculata und

Thalassiosira pseudonana (TONON et al. 2002). Im Widerspruch zu dem phylo-

genetisch näher verwandten Oomyceten Schizochytrium und Thraustochytrium

produzierte P. halstedii bei höheren N-Gaben an den Wirt mehr EPA und verhielt

sich daher ähnlich wie die phototrophen Algen Phaeodactylum tricornutum,

Nannochloropsis oculata und Thalassiosira pseudonana, die ebenfalls mehr EPA

produzieren, je mehr N im Nährmedium vorhanden war (TONON et al. 2002).

Beim Wirt/Pathogen System Sonnenblume/P. halstedii konnte das Pathogen nicht

direkt in einem Nährmedium gezogen werden, da es sich vom lebenden Wirt ernährt.

Daher mussten die Zusammenhänge komplexer betrachtet werden. Wurde dem Wirt

mehr N zur Verfügung gestellt, so konnte auch im infizierten Gewebe deutlich mehr

EPA nachgewiesen werden. Da EPA allein von P. halstedii stammt, kann festgestellt

werden, dass hohe N-Gaben den Erreger wohl fördern. Dies konnte zum Einen mit

der dichteren Ausbreitung des Erregers in Pflanzengewebe in Verbindung stehen,

dem zu Gunsten von Proteinen und Aminosäureverbindungen die stabilisierenden

Strukturelemente verloren gingen. Eine weitere Erklärung wäre eine verbesserte

EPA-Synthese im Mycel von P. halstedii wegen des Vorhandenseins von mehr FS-

Substrat für die EPA-Synthese im Pflanzensaft, denn auch gesunde Pflanzen

erhöhten bei vermehrter N-Gabe ihren ALA-Anteil im Gewebe.

3.5. Schlussfolgerungen

Die Grenzen der Optimierbarkeit innerhalb geeigneter Parasitenstämme und

Wirtspflanzen waren mit 30 mg EPA/FG für Sporangien und 1 mg EPA/g TG für

Pflanzengewebe erreicht. Mithilfe des Faktors Stickstoffernährung und gesteigerten

N-Gaben an die Wirtspflanzen konnten die EPA-Gehalte des genetisch homogenen

Stammes BL-11.06.02-A4z immerhin um Faktor 2 von 1 mg EPA/g TG auf 2 mg

EPA/g TG gesteigert werden. Um in realistische Dimensionen für die direkte mensch-

liche Ernährung zu kommen, wäre eine Steigerung der EPA-Konzentrationen in

Sporangien oder infiziertem Wirtsgewebe um Faktor 10 nötig gewesen (vgl. Kap. 2.).


67

In der Studie einer anderen Arbeitsgruppe, wobei es im die Erhöhung der Produktion

von Docosapentaensäure (DPA, 22:5 n-3) in einer Pilzkultur von Pythium acanthicum

im Bioreaktor ging, blieb die erreichbare Menge an n-3-FS nach Optimierungs-

versuchen ebenfalls auf 1-5 mg DPA/g Biomasse beschränkt (SINGH & WARD 1998).

Die Möglichkeit der direkten Nutzung von EPA aus infizierten Pflanzen für die

menschliche Ernährung bleibt somit weiterhin fraglich. Da aus Kap. 2 jedoch hervor-

ging, dass eventuell erzielbare Mengen auf großer Fläche mit den gewonnenen

Mengen aus Bioreaktoren konkurrenzfähig waren und in infiziertem Gewebe immer-

hin 1-2 mg EPA/g TG erreicht wurde, schien es denkbar und realistisch die FS EPA

aus B. lactucae zwar nicht durch technische Anreicherung in Kapseln, jedoch durch

natürliche Anreicherung über die Nahrungskette nutzbar zu machen.

4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier

68

4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in

Hühnereiern

4.1. Hintergrund und Zielsetzung des Fütterungsexper iments

Als Futterzusätze zur Steigerung der Gehalte von DHA und EPA im Eidotter werden

derzeit n-3-FS-haltige Pflanzenöle wie Leinöl (CASTON & LEESON 1990; STEINHILBER

2003) aber auch Robbenöl und Fischöl (SCHREINER et al. 2004) verwendet. Analog

zur Nahrungskette im Meer sollte versucht werden, über die Nahrungskette mit

infiziertem Salat, der an Hühner verfüttert wurde, den EPA- oder DHA-Gehalt im

Eidotter zu erhöhen.

Da Salat in großen Mengen von Hühnervögeln verzehrt werden kann und B. lactucae

unter beschriebenen Bedingungen in infiziertem, getrocknetem Pflanzengewebe bis

zu 1mg EPA/g produzierte (vgl. Kap. 2.2.3.), stand ein Wirt/Parasit-System mit

geeignetem FS-Muster für einen Nahrungskettenversuch zur Verfügung. Hierzu

waren mehrere, bisher ungeklärte Voraussetzungen zu überprüfen: 1.) Lässt sich für

eine Fütterung genügend infiziertes Pflanzenmaterial gewinnen? 2.) Wie hoch sind

die erzielbaren EPA-Gehalte in infiziertem Salat vom Freiland? 3.) Sind Trocknung

und Lagerung von großen Salatmengen ohne Verlust an EPA realisierbar? 4.) Wie

wirkt Bremia-infizierter Salat als Futterbeimischung auf die Tiere und die Eiqualität?

4.2. Materialien und Methoden:

4.2.1. Versuchsaufbau und Aufgabenverteilung

Für die Bearbeitung der komplexen Fragestellung war die Kooperation mit mehreren

Instituten Hohenheims notwendig.

Die Umsetzung des Versuches wurde in 5 generelle Schritte untergliedert (Abb. 4.1.),

die mit Hilfe der Kooperationspartner ausgeführt wurden.


69

Abb. 4.1.: Flussdiagramm der Projekteinheiten und die dafür zuständigen Kooperationspartner.

Die Feldanzucht von genügend gesundem und infiziertem Salat mit starkem B.

lactucae-Befall erfolgte auf der Versuchsstation für Gartenbau des Landes Baden-

Württemberg (Stuttgart-Hohenheim). Der langfristige Anbau- und Pflegeplan wurde,

nach Abstimmung mit den Futterberechnungen von Herrn Grashorn, von Frau

Anderle erstellt und von Gärtnern der Versuchstation durchgeführt.

Die Trocknung von infiziertem und gesundem Salat im Großmaßstab erfolgte am

Institut für Agrartechnik, wo mit freundlicher Unterstützung von Herrn Professor

Müller ein Hordentrockner zur Verfügung stand, mit dem die großen Salat-mengen

für die Hühnerfütterung fachgerecht und definiert getrocknet werden konnten. Die

Trocknung musste sofort nach der Ernte erfolgen, um Qualitätsverluste (Oxidations-

und Abbauprozesse) zu verhindern. Kurze Wege waren erforderlich, da infizierter

Salat schnell welkte und die Oxidationsanfälligkeit auf Grund des hohen Gehaltes an

n-3-FS von B. lactucae (BELITZ et al. 2001) stark erhöht war. An den Instituten für

Botanik und Agrartechnik wurden Vorversuche mit infiziertem Salat gefahren, um

eine optimale Trocknungsprozessführung zu gewährleisten.

Feldanzucht von Bremia lactucae-infiziertem Salat und gesundem Kontrollsalat

Versuchsstation für Gartenbau, Institut für Botanik

Bestimmung der Trocknungsparameter im Labor, Trocknung der Fütterungsversuche im

Hordentrockner

Qualitätskontrolle der Futterproben Bestimmung der Omega-3-Fettsäuren

Herstellung von Futtermischungen Fütterungsversuche mit Legehennen Produktion von Hühnereiern

Analyse der Eidotter Überprüfung der Hühnergesundheit

Institut für Botanik Institut für Agrartechnik

Institut für Botanik Institut für Tierhaltung und Tierzüchtung

Versuchsstation für Tierzüchtung „Unterer Lindenhof“

Institut für Tierhaltung und Tierzüchtung


70

Die Herstellung der Futterrationen für die einzelnen Tier-Versuchsgruppen erfolgte

unter Leitung von Herrn Professor Grashorn auf der Versuchsstation für Tierhaltung,

Tierzüchtung und Kleintierzucht „Unterer Lindenhof“.

Die Aufzucht und die Haltung von Hühnern als Multiplikatoren der n-3-FS aus dem

Futter ins Ei erfolgten ebenfalls unter Leitung von Herrn Prof. Grashorn auf der

Versuchsstation für Tierzüchtung „Unterer Lindenhof“. Alle Gesundheits- und

Leistungsdaten der Tiere sowie alle weiteren Qualitätsmerkmale der Legeabschnitte

wurden am Unteren Lindenhof vom Institut für Tierhaltung und Tierzüchtung

erhoben. Es wurden 5 Fütterungsgruppen gebildet, die jeweils 8 Tiere umfassten.

Die Versuchsdauer betrug 21 Tage.

Um eine verlässliche Quantifizierung der n-3-FS in Salat, Futter und Eidotter zu

garantieren, wurden die Fettsäureanalysen am Institut für Botanik und am Institut für

Tierhaltung und Tierzüchtung (Zentrallabor „Unterer Lindenhof“) durchgeführt. So

konnten die Ergebnisse verglichen und abgesichert werden.

4.2.2. FS-Konzentrationen der Salatextrakte, der Fut terrationen und der Dotter-

lipide

Materialien: Infizierte und gesunde Salatblätter von Grünem Kopfsalat (Sorte Nadine

Fa. Rijkzwaan, Niederlande), Roter Eichblattsalat (Mischung der Sorten Murai, Fa.

Rijkzwaan, Niederlande, Ribai (Fa. Rijkzwaan, Niederlande), Nun7816 (Fa. Nunhems

Zaden BV, Niederlande), Stromboli (Fa. Seminis, USA)). Futtermischungen der 5

Varianten: Kraftfutter+ 10% Grüner Kopfsalat infiziert; Kraftfutter+ 10% Grüner Kopf-

salat gesund; Kraftfutter+ 10% Roter Eichblattsalat infiziert; Kraftfutter + 10% Roter

Eichblattsalat gesund; Kraftfutter ohne Salat als Kontrolle; Eidotter von Hühnern, die

mit den 5 Futtervarianten versorgt wurden.

Die qualitativen und quantitativen Analysen der Fettsäuremuster am Institut für

Botanik erfolgten mit geringen Abwandlungen wie in den Kapiteln 2.1.2.-2.1.4.

beschrieben. Für Wiederfindung und Vergleichbarkeit erfolgte die Korrektur mit dem

IS 17:0 (vgl. Kap. 3.2.4.5.).

Am „Unteren Lindenhof“ erfolgte die Extraktion der Proben unter Verwendung des

20:0 IS nach der Standardmethode von Folch (FOLCH et al. 1957).


71

Die Korrektur der absoluten FS-Konzentrationen erfolgte mit Hilfe des externen

Supelco 37 Komponenten-Standards, dessen Signalfläche/Konzentration-Verhältnis

von 20:0 (Faktor 1) bezüglich der anderen FS ins Verhältnis gesetzt wurde (vgl. Kap.

2.1.4.). Dazu wurde der 37-Komponenten-Standard siebenmal injiziert. Da sich die

FS im 37 Komponentenstandard bezüglich ihrer Signalfläche/Konzentrationsverhält-

nisse (bekannte relat. Konzentration, bekannte Signalfläche) ebenso verhalten wie

der FS-Standard in der Probe, galt für die Korrekturfaktoren der FS folgende Formel

(HAASMANN 1998):

Korrekturfaktor = (rQIS/rQS)/(AIS/AS), wobei galt: rQIS = Flächenprozentanteil der FS

im internen Standard, rQS = Flächenprozentanteil der FS im externen Standard, AIS =

FS-Signalfläche der FS im internen Standard, AS = FS-Signalfläche der FS im

externen Standard.

Bsp.: Bei gegebener Konzentration bekommt der interne Standard 20:0 den Faktor 1

zugeordnet, FS mit selber Konzentration jedoch abweichender Signalfläche im

externen Standard, bekommen Faktoren < oder > 1 zugeordnet, die FS 20:5 z.B.

0,89, 22:6 z.B. 1,06 (Anhang I).

Für die Quantifizierung der Lipidgehalte der Dotterproben erfolgte ein Flächen-

vergleich des 20:0 IS mit jeder einzelnen Fettsäure unter Verwendung dieser

berechneten Korrekturfaktoren. Die hierfür verwendete Formel lautete (HAASMANN

1998):

CFS = Korrekturfaktor•(mIS/mPR)•(AFS/AIS), wobei galt: CFS =korrigierte Konzentration

FS, mIS= Einwaage interner Standard, mPR = Einwaage Probe,

AIS = Peakfläche interner Standard, AFS = Peakfläche FS Probe.

Bsp. C20:5 = 0,89•(1g/4g)•(18000 PFE 20:5)/14000 PFE 20:0), EPA ist in einer

Konzentration von 0,17 mg pro g Probe enthalten.

Da dies dem derzeitigen Standard in der Wissenschaft zur absoluten Konzentrations-

berechnung von FS in Lebensmitteln am GC-FID entspricht, wurden für die statis-


72

tische Auswertung (Kap. 4.2.6.) die empirisch über den 37-Komponenten-Standard

korrigierten FS-Konzentrationswerte vom Institut für Tierzüchtung verwendet.

4.2.3. Salatproduktion

Aus Forschungsarbeiten (STEINHILBER 2003) war bekannt, dass Leinölzusatz zum

Futter (einer Menge von 17,6 mg ALA/g entsprechend) die Produktion von ALA und

DHA im Eidotter erheblich steigerte. Auf 1 kg Futter wurden 40 g Leinöl (4%)

zugemischt. Ein kg Futter enthielt 17,6 g n-3-FS in Form von ALA.

Infizierter Kopfsalat produzierte im Labor bei optimaler Infektion (Sporulation von

100% der Fläche) 1 mg EPA/g TG. Für den besten Infektionsfall galt daher die

Annahme, dass ein kg getrockneter Salat mit B. lactucae-Infektion 1 g EPA enthielt.

Da Salat dem Hühnerfutter nur in eingeschränkter Konzentration zugemischt werden

sollte, um die Legeleistung der Hennen nicht zu beeinträchtigen, wurde eine

Zumischung von 10 % infiziertem Salat zum Kraftfutter festgelegt. Damit konnten

EPA Mengen von höchstens 0,1 g EPA/kg TG erreicht werden. Da aber Salat selbst

erhebliche Mengen an ALA produzierte (ca. 5-7 mg/g TG), konnte die ALA-Menge

aus Salat den Gesamtgehalt an n-3-FS im Futter wesentlich erhöhen. Somit war von

einer n-3-FS Menge von 7,1 g n-3-FS/kg TG (7 g ALA/kg + 0,1 g EPA/kg Futter)

auszugehen, was nur noch etwas weniger als der Hälfte der Menge der ALA

Beimischung aus Leinöl (17,6 g/kg) entsprach. Eventuell würde ALA aus Salat zu

einer Sättigung an ALA im Eidotter beitragen, was wiederum zum Anstieg von DHA

führen könnte, das aus dem überschüssigen ALA und EPA synthetisiert werden

konnte. Dann würden die EPA-Mengen aus B. lactucae schon in kleinen Mengen ins

Gewicht fallen.

Ein Huhn benötigte etwa 100 g Trockenfutter/Tag, 8 Hühner bildeten eine Gruppe.

Der Versuch wurde auf 21 Tage angelegt. Gruppe 1 bekam Kontrollfutter, die

Gruppen 2, 3, 4 und 5 erhielten Kontrollfutter mit 10 % getrockneten Salat mit oder

ohne B. lactucae. Um diese Mischung zu erhalten, mussten für diesen Zeitraum pro

Gruppe 30 kg Frischsalat bzw. 3 kg Trockensalat eingeplant werden.

Um diese Menge an getrocknetem Salat auf jeden Fall zu erhalten, wurden etwa

2000 Köpfe für die infizierte Variante und ca. 1000 Köpfe für die Kontrolle gepflanzt.

Dafür standen 2x2 Beete (räumlich getrennt) mit je 150 m² zur Verfügung.


73

Anbau, Infektion und Ernte des Futtersalates

Da das Feldisolat in dem Laborversuch identisch mit dem bodenbürtigen Pathogen

auf der Versuchsstation für Gartenbau war und dies zusätzlichen Genehmigungs-

aufwand verhinderte, wurde auf eine Zusatzinfektion verzichtet und mit dem natür-

lichen Befall gearbeitet. Alle Jungpflanzen wurden vor der Pflanzung einmal mit dem

Pflanzenschutzmittel Polyram (Wirkstoff: Ethylen(bis)-dithiocarbamat) behandelt, um

eine Frühinfektion mit B. lactucae und einen dadurch bedingten Pflanzenverlust zu

vermeiden. Die Beete mit B. lactucae-infiziertem und die Beete mit „gesundem“ Salat

waren räumlich durch ein Kohlfeld getrennt (Abb. 4.2.), Beete auf denen Falscher

Mehltau erwünscht war, wurden abends zusätzlich bewässert, da dies die Verbrei-

tung förderte.

Abb. 4.2. : Feldanbau von infiziertem Salat. Links: Früher und später Satz von Grünem Kopfsalat,

Rechts: Sortenversuch der Staatsschule für Gartenbau mit infiziertem und gesundem Roten Eichblatt-

salat.

Die Beete, die infektionsfrei bleiben sollten, wurden nach der Pflanzung zusätzlich

mit Ortiva (Wirkstoff: Azoxystrobin) und Aliette (Wirkstoff: Fosetyl) behandelt, um eine

Infektion auszuschließen.

Der Anbau von Rotem Eichblattsalat erfolgte im Rahmen eines Sortenversuches von

Herrn Blauhorn von der Staatsschule für Gartenbau (Abb. 4.2.) und durfte mit freund-

licher Genehmigung für den Bremia-Versuch zusätzlich geerntet werden. Da von ein-

er Sorte des Roten Eichblatt Salats nicht genügend infiziertes bzw. gesundes Mate-

rial zur Verfügung stand, wurde je eine Mischung mehrerer Sorten vorgenommen

(vgl. Kap. 4.2.2.).


74

Die Ernte erfolgte in Etappen über 3 Wochen, wobei gleichzeitig die Trocknung

stattfand. Zunächst wurde im Zeitraum von einer Woche gesunder Salat geerntet und

getrocknet. Zeitlich versetzt, um Kontaminationen vorzubeugen, erfolgten Ernte und

Trocknung des infizierten Salates.

Der Salat wurde, um eine kurze Ernte- und Verarbeitungsdauer zu gewährleisten,

stets mit mehreren Personen geerntet. Die Kisten mit Salat wurden mit dem Auto

direkt zur Trocknungshalle gefahren und dort weiterverarbeitet.

4.2.4. Trocknung

Trocknung im Kleinmaßstab

Die wichtigste Voraussetzung war eine gewisse Temperaturstabilität der FS im infi-

zierten Salatgewebe während der Trocknung. Um allgemein zu testen, wie tempera-

turstabil die Lipide von B. lactucae waren, wurde zunächst am Institut für Botanik ein

Trocknungsversuch im Kleinmaßstab durchgeführt.

Material:

Ein vollständig infiziertes, frisch sporulierendes Salatblatt von Grünem Kopfsalat, 3

Trockenschränke mit Thermometer, Exsikkator bei RT 20°C, 2 ml Reaktionsgefäße.

Methode:

Von einem gleichmäßig sporulierenden Salatblatt wurden mit einer Rasierklinge acht

0,5 cm² große Stücke ausgeschnitten. Die beiden der Hauptblattader gegenüber-

liegenden Stücke vom Blattgrund zur Blattspitze wurden bei 20°C (RT) für je 24 und

48 h im Exsikkator und bei 40°C, 60°C bzw. 80°C für j e 24 und 48 h im

Wärmeschrank einzeln getrocknet. Anschließend wurden die EPA-Gehalte der 8

Proben nach der Methode von Kapitel 2.1.2.-2.1.4. bestimmt.

Trocknung der Salatmenge für Futterzwecke im Großmaßstab

Der Salat für das Fütterungsexperiment wurde im Großmaßstab, anhand der

Erfahrungswerte aus dem Kleinversuch, in einem Hordentrockner, nach dem

Umluftprinzip getrocknet (Abb. 4.3.).


75

Zuerst wurde 2 h bei 60°C getrocknet, wobei die Oberfl ächentemperatur des Salates

ca. 40°C betrug. Danach folgte eine Trocknungszeit von 15 h bei 40°C.

Abb. 4.3. : Trocknung des Salats auf Blechen im Hordentrockner. Links: Entfernen des Strunks. Mitte:

Befülltes Blech für den Hordentrockner. Rechts: Abfüllen des getrockneten Salates in ein geeignetes

Behältnis bis zur Fütterung.

Damit der Trocknungszeitraum nicht unnötig verlängert wurde und der Salat keine

Stellen mit erhöhter Restfeuchte aufwies, sollten keine ungleichmäßig getrockneten

Stellen entstehen. Daher entfernte man den Strunk mit dem Handmesser und legte

die Blätter einschichtig auf die Trockenbleche (Abb. 4.3.). Um 120 kg Frischsalat zu

trocknen wurden 8 Trockner-Ladungen mit jeweils ca. 17 h Trockenzeit benötigt. Der

getrocknete Salat wurde an zwei Terminen gewogen und die Restfeuchte, die unter

10% liegen sollte, wurde bestimmt.


76

4.2.5. Fütterungsversuch

Versuchstiere und Haltungsbedingungen

Für den Versuch standen 40 Legehennen der Rasse „Lohmann Selected Leghorn“

(LSL, Rhein-Main, Groß-Umstadt) im Alter von 38 Wochen zu Verfügung, die in

Einzelkäfighaltung (Grundfläche 40 x 50 cm) untergebracht waren. Die Eier wurden

von Hand gesammelt. Die Belüftung des Stalles erfolgte über eine Unterdrucklüftung,

wobei eine RT von 18-20°C und eine rel. Luftfeuchte von 60 % angestrebt wurde.

Der Stall war ohne Tageslichteinfall, die Beleuchtungsdauer betrug 14 h bei 10

Stunden Dunkelheit. Die Beleuchtungsintensität lag bei 20 Lux.

Futter

Die Herstellung der Versuchsrationen erfolgte auf der amtlich zugelassenen

Mischfutteranlage (DE BW 4 000 01) der Versuchsstation „Unterer Lindenhof“. Für

die Versuchsrationen wurde eine gemeinsame Grundration erstellt, bei der die Nähr-

stoffverdünnung durch die 10%ige Salatzugabe berücksichtigt wurde (Tab. 4.1.).

Für die Kontrollgruppe wurde eine eigene Ration ohne Salat hergestellt. Die

Nährstoffgehalte der Rationen wurden auf der Basis der Empfehlungen des Lege-

hennenzüchters (Lohmann Tierzucht, Cuxhaven) eingestellt.


77

Tab. 4.1.: Futterzusammensetzung und wichtigste kalkulierte Nährstoffgehalte (g/kg)

Komponenten Kontrollgruppe Versuchsgruppe

Sojaextraktionsschrot 210 200

Weizen 528 430

Mais 120 100

Salat - 100

Sojaöl 24 55

Futterkalk grob 52 50

Futterkalk fein 44 43

Mono-Calciumphosphat 8,0 10

Natrium-Bikarbonat 2,4 2,4

Kochsalz 2,4 2,4

Cholinchlorid 1,0 1,0

Methionin 1,6 1,6

Kalzium-Propionat 4,0 4,0

Antioxidans Loxidan 0,2 0,2

Farbstoff Avizant Y 20S 0,6 0,6

Farbstoff Avizant R 20S 0,8 0,8

Spurenelement-VM* 0,8 0,8

Vitamin-VM** 2,0 2,0

Kalkulierte Nährstoffe

Rohprotein 171 171

Methionin 3,9 3,9

L-Lysin 7,8 7,8

Umsetzbare Energie (MJ/kg)* 11,4 11,3

Ca 39 4,0

Pges 5,8 5,9

* Spurenelement-Vormischung (mg/kg): 120.000 Mn, 80.000 Zn, 90.000 Fe, 15.000 Cu, 1.600 J, 500 mg Se, 600

mg Cu. ** Vitamin-Vormischung (/kg): 6.000.000 I.E. A, 1.500.000 I.E. D3, 15.000 mg E, 1.500 mg B1, 3.000 mg

B2, 3.000 mg B6, 15.000 µg B12, 1.200 mg K2, 25.000 mg Nikotinsäure, 7.000 mg Ca-Panthotenat, 500 mg

Folsäure, 50.000 µg Biotin


78

4.2.5.1. Leistungsdaten der Tiere

Die Legeleistung wurde täglich erfasst, der Futterverbrauch wöchentlich. Die Eige-

wichte wurden am Versuchsende im Rahmen der Bestimmungen zu Eiqualität

(Dotterfarbe, Dotter- und Schalenanteil, n-3-FS Depositionsrate) und FS-Muster

ermittelt. Zur Bestimmung der Fettsäuremuster im Dotter wurden zwei Eier pro

Henne gesammelt. Die Dotter wurden einzeln bis zum Analysentermin tiefgefroren.

Der Dotteranteil wurde berechnet. Je ein Dotter wurde für die Analysen am Institut für

Botanik und eines für die Analysen am Institut für Tierhaltung und Tierzüchtung

verwendet. Vom Institut für Tierhaltung und Tierzüchtung wurden zusätzlich die

Oxidationsprodukte (TBARS) im Dotter bestimmt.

Eigewichte, Dotter- und Schalenanteil, Dotterfarbe

Es wurde untersucht, wie sich die Fütterung auf die Eigewichte, den Dotter- und

Schalenanteil sowie die Dotterfarbe auswirkte. Es wurden die Farben von frischen

und gekochten Eidottern bestimmt. Zusätzlich wurde ein Sensoriktest zur visuellen

und geschmacklichen Konsistenz gekochter Eier durchgeführt.

Depositionsraten der n-3-FS im Dotter

Die Berechnung der Depositionsraten der n-3-FS erfolgte am Institut für Tierhaltung

und Tierzüchtung nach der Beschreibung von Steinhilber (STEINHILBER 2003). Die

Depositionsrate beschreibt die prozentuale Einlagerung an n-3-FS aus dem Futter in

die Dotterlipide. Sie ist ein Maß für die Verwertung der Hühner von n-3-FS aus dem

Futter.

Zur Berechnung der Depositionsraten (%) wurde folgende Formel eingesetzt:

DP = ((DG•FSD)•LL)/(FA•FSF), wobei: DP=Depositionsrate (%), DG=Dottergewicht

(g), FSD=Fettsäuregehalt Dotter (mg/g), FA=Futteraufnahme (g), FSF=Fettsäure-

gehalt Futter (mg/g), LL=Legeleistung (%).

Lipidoxidation - TBARS-Bestimmung in Eidotter

EPA und DHA neigen wegen ihrer hohen Anzahl an Doppelbindungen sehr leicht zur

Oxidation, wobei kurzkettige, aromatische Verbindungen entstehen. Diese Verbind-

ungen sind für Fehlaromen im Ei verantwortlich und unerwünscht (MARSHALL et al.


79

1994). Ein Maß für die Oxidation und die damit verbundene Qualität stellte der

TBARS-Test dar (vgl. Kap. 4.2.5).

Beim TBARS-Test reagieren 2 Moleküle Thiobarbitursäure mit einem Molekül Malon-

dialdehyd. Dies führt zur Bildung eines roten Farbkomplexes, der photometrisch zwi-

schen 532-538 nm nachgewiesen werden kann (SINNHUBER & YU 1958). Die Intensi-

tät der gemessenen Farbe hängt vom PUFA-Gehalt der Probe ab. Eine Probe mit

hohen Gehalten an mehrfach-ungesättigten FS weist deutlich höhere TBARS-Werte

auf, als eine Probe mit nur gesättigten Fettsäuren (DAHLE 1962). Die TBARS-

Bestimmung erfolgte unter Leitung von Herrn Grashorn am Unteren Lindenhof nach

einer modifizierten Methode von Kornbrust und Mavis (KORNBRUST & MAVIS 1980).

Die Berechnung der TBARS erfolgte photometrisch als Malondialdehyd unter

Zuhilfenahme des molaren Extinktionskoeffizienten nach folgender Formel:

Malondialdehyd (nmol/mg Dotter) = (6,410•1000•3•Extinktion)/100.

Für die Analyse der TBARS wurde 1g Dotter in ein Reagenzgefäß eingewogen. Der

Probe wurden 9 ml KCl (1,15 %ig) hinzugefügt. Um eine homogene Lösung zu

erhalten, wurde die Probe bei 9000 Umdrehungen ca. 15 sec. gründlich homogeni-

siert. Anschließend wurde in 10 ml Schraubgefäße 0,5 ml 80 mM Tris-Malat-Puffer

(pH 7,4), 0,2 ml 5 mM Eisensulfatlösung, 0,2 ml 2mM Ascorbinsäure und 0,1 ml

Probenhomogenat vorgelegt. Als Blindwert für die spätere photometrische Be-

stimmung wurde in 2 Röhrchen, anstelle des Probenhomogenats, 1,15% KCl

pipettiert. Den Proben wurde nun 2 ml des Probenreagenz (150 g Trichloressigsäure

und 3,75 g Thiobarbitursäure, die in 1Liter 0,25 n HCl gelöst wurden) gegeben. Nach

dieser Zugabe wurden die Röhrchen fest verschlossen und 30 s kräftig geschüttelt.

Es folgte ein 30minütiges Kochen und ein anschließendes Abkühlen der Proben auf

Eis, um die Reaktion zu stoppen. Bei 2200 U/min und 4°C wurden die Proben 20 min

zentrifugiert und danach in 1 cm Glasküvetten bei einer Wellenlänge von 535 nm in

einem Photometer (PM 2 DL, Zeiss, Jena) vermessen.


80

4.2.6. Statistische Auswertung der Lipidgehalte in den Dotterproben

Der Test des Einflusses der Faktoren Salatsorte und Futtervariante auf den Gehalt

an n-3-FS im Dotter, in Abhängigkeit vom Faktor Futterbehandlung, erforderte über

die klassische Varianzanalyse hinaus, die Formulierung eines statistischen Modells.

Das Modell wurde in Zusammenarbeit mit Jens Möhring vom Institut für Biometrie

(Prof. Dr. Piepho) an der Universität Hohenheim entwickelt und mit Hilfe der

Prozedur für Gemischte Modelle mit SAS ausgewertet.

Modell mit fixen Effekten:

Y(ijkl) = µ + αi + βj (αi) + γk (αi) + βγjk (αi) + eijkl

Wobei:

Y= Fettsäure (z.B. 22:6 n-3 bzw. 18:3 n-3)

µ= geschätzter wahrer Gruppen-Mittelwert

αi= Faktor Futterbehandlung (Salat ja/nein)

βj (αi)= Faktorstufe Futterbehandlung (Salatsorte) innerhalb des Faktors αi

γk (αi)= Faktorstufe Bremia-Befall ja/nein innerhalb des Faktors αi

βγjk (αi)= Wechselwirkungen der Faktorstufen innerhalb des Faktors αi

eijkl= Restfehler

Die Signifikanzgrenze wurde mit Hilfe des p-Wertes (Teststärke) ausgedrückt. Sie lag

bei p<0,05%, was der Vertrauenswahrscheinlichkeit von α=5% entspricht. Bei p>0,05

(α>5%) wurde die Nullhypothese (es existieren keine Unterschiede) angenommen,

bei p<0,05 (α<5%) wurde die Nullhypothese abgelehnt und die Alternativhypothese

(es existieren Unterschiede) trat in Kraft. Bei p<0,01 waren die Unterschiede als

hochsignifikant einzustufen.


81

4.3. Ergebnisse

4.3.1. Befallsergebnis des Feldversuches zur Ernte

Die Ernte von Rotem Eichblatt- und Grünem Kopfsalat erfolgte vom 25.09.-

15.10.2007. Der Befall mit B. lactucae erfolgte bei Rotem Eichblattsalat massiv

schon ab Mitte September 2007. Zuerst wurden einzelne ältere Blätter befallen, die

Kontakt mit dem Boden hatten. B. lactucae verbreitete sich von einem Intercostalfeld

zum nächsten, so dass innerhalb von 2 Wochen Die Salatköpfe komplett infiziert

waren, was sich an einem weißen Sporulationsbelag von B. lactucae auf den Blatt-

unterseiten zeigte. Ein infizierter Salatkopf wog durchschnittlich 350 g, gesunde

Köpfe wogen etwa 500 g. Ab Anfang Oktober zeigte auch der 3 Wochen jüngere

Grüne Kopfsalat ersten Befall mit B. lactucae. Ab Anfang Oktober konnte der Grüne

Kopfsalat geerntet werden, der jedoch deutlich weniger Biomasse aufwies und

schlechter befallen war, als der Rote Eichblattsalat. Infizierte Köpfe wogen im

Durchschnitt 150 g, gesunde Köpfe wogen ca. 200 g. Der frühere Satz des Grünen

Kopfslates (Aussaat am 07.08.) war zu 20% besser mit Falschem Mehltau befallen

als der spätere Satz (Aussaat am 22.08.) und wies fast doppelt soviel Biomasse auf.

Insgesamt war der Grüne Kopfsalat nur zur Hälfte sichtbar infiziert, wobei nur die

ältesten Blätter Sporulation zeigten. Der Rote Eichblattsalat dagegen wies

Sporulation bis in die jüngsten Blätter hinein auf, wobei ältere infizierte Blätter

teilweise schon faulten. Von beiden Salattypen konnten infizierte und gesunde Köpfe

in ausreichender Menge geerntet werden. Grüner Kopfsalat vom Feld enthielt 150-

200 mg EPA/kg TG, Roter Eichblattsalat vom Feld enthielt 300-400 mg EPA/kg TG.

4.3.2. Temperaturstabilität und Trocknung

Die Voruntersuchungen zur Trocknung (Abb. 4.4.) von infiziertem Salat zeigten, dass

die EPA-Konzentrationen bei RT nach 24 h bei 0,7 mg EPA/g TG lagen, wobei nach

48 h nur noch 0,35 mg EPA/g TG nachgewiesen werden konnten. Bei 40°C waren

die EPA-Gehalte mit ca. 1 mg EPA/g TG am höchsten und blieben über den

Zeitraum von 48 h stabil.

Bei 60°C lagen die EPA Gehalte sowohl nach 24 h als a uch nach 48 h nur noch bei

etwa 0,7 mg/g TG, bei 80°C lagen die EPA-Gehalte fü r beide Trocknungszeiträume

nur noch bei ca. 0,5 mg/g TG.


82

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

[°C]

EP

A-G

ehal

t [m

g/g

TG

]

24 h 0,71 1,06 0,62 0,53

48 h 0,36 1,01 0,70 0,60

20°C 40°C 60°C 80°C

Abb. 4.4.: Vergleich der EPA-Gehalte innerhalb eines gleichmäßig sporulierenden Salatblattes bei 4

Temperaturen (20°C, 40°C, 60°C, 80°C) und 2 Zeiträu men (24 h und 48 h).

An diese Werte angepasst wurde der Salat im Hordentrockner auf Blechen für 2 h

bei einer Ofentemperatur von 60°C getrocknet, wobei die Oberflächentemperatur

vom Salat ca. 40°C betrug. Danach folgte eine Trocknung szeit von 15 h bei 40°C.

Der Restfeuchtegehalt des getrockneten Salates lag durchschnittlich und stabil

zwischen 5 und 9 %. Nach etwa 17 h konnte der getrocknete Salat von den Blechen

genommen und gewogen werden. Danach wurde der Salat in doppelwandige Papier-

säcke überführt, die in verschließbaren, blauen 60 l Plastiktonnen gelagert wurden.

Das Fassungsvolumen einer Tonne wurde von ca. 1,5 kg Trockensalat ausgefüllt.

Stichproben nach 1 und 2 Wochen Lagerung zeigten, dass es weder Veränderungen

gegenüber der Anfangsfeuchte gab und keine nachträgliche Durchfeuchtung

stattfand, noch dass sich FS-Gehalte verschlechterten.

4.3.3. Fettsäureanalyse in der Nahrungskette

Zunächst wurden die qualitativen Muster der FS von infiziertem und gesundem Salat,

den Futtermischungen und den Eidottern mit ihren relativen Anteilen an FAME am

Gesamtmuster miteinander verglichen. In Abb. 4.5. sind die relativen Anteile der

relevanten FS der verschiedenen Nahrungsmittel einander gegenübergestellt. Der

Übersichtlichkeit wegen wurde die Darstellung auf das Beispiel des Roten Eichblatt-

salates beschränkt. Grüner Kopfsalat wies dasselbe Fettsäuremuster mit nicht

signifikant unterscheidbaren relativen Anteilen auf. Die Qualität der Fettsäuremuster

der Eidotter änderte sich nach unterschiedlicher Fütterung nicht. Das Muster blieb

konstant, es wurden keine zusätzlichen oder fehlenden FS detektiert.

83

0

10

20

30

40

50

60

70

FAME

Sig

nalfl

äche

nant

eile

der

FA

ME

[%

]

Fläche % RE- 0,11 11,27 0,11 2,20 1,95 28,73 55,63 0,00 0,00 0,00

Fläche % RE+ 3,83 25,66 2,03 3,28 2,91 17,27 43,28 0,00 1,73 0,00

Fläche % FK 0,09 9,97 0,11 2,37 23,71 57,81 5,94 0,00 0,00 0,00

Fläche % FRE- 0,16 11,22 0,16 2,99 22,45 54,96 8,05 0,00 0,00 0,00

Fläche % FRE+ 0,14 11,38 0,20 3,04 22,69 54,54 7,97 0,00 0,04 0,00

Fläche % Dok 0,18 28,11 1,71 13,18 31,07 17,36 0,49 4,81 0,00 3,08

Fläche % DoRE- 0,20 24,06 1,45 14,66 28,53 21,61 1,04 5,67 0,00 2,78

Fläche % DoRE+ 0,16 23,92 1,27 14,63 28,06 22,71 0,93 4,93 0,00 3,40

14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 n-6 18:3 n-3 20:4 n-6 20:5 n-3 22:6 n-3

Abb. 4.5. : Vergleich der relativen Signalflächenanteile der FAME in der Nahrungskette. Infizierter Salat (RE+), gesunder Salat (RE-), Futter

(Kontrolle (FK), mit inf. Salat (FRE+), mit gesundem Salat (FRE-)) und Dotter (nach Fütterung mit Kontrollfutter (DoK), mit Beimischung von inf.

(DoRE+) und gesundem (DoRE-) Salat).


84

Im Fettsäuremuster von gesundem Salat dominierte die Fettsäure ALA (18:3 n-3) mit

über 50% Anteil, gefolgte von LA (18:2 n-6) und Palmitinsäure (16:0) mit je ca. 25%

Gesamtanteil. Infizierter Salat enthielt sowohl FS von B. lactucae als auch von Salat

und war von gesundem Salat dadurch eindeutig unterscheidbar, dass EPA zu einem

Anteil von 1-2 % am Fettsäuremuster beteiligt war. Eine Infektion mit B. lactucae

konnte bei einem EPA-Anteil von 0,01 % noch nachgewiesen werden.

Das Fettsäuremuster von Kontrollfutter ohne Salatzusatz wurde deutlich vom

enthaltenen Sojaöl geprägt (Abb. 4.5.). Sojaöl enthält zu 60% und mehr die n-6-FS

LA (vgl. Kap. 1), was sich im Fettsäuremuster vom Kontrollfutter (Abb. 4.5.) wider-

spiegelte. Die n-3-FS ALA war nur zu einem Anteil von ca. 5-6 % im FS-Muster

enthalten. Im Kontrollfutter waren zudem hohen Mengen an Ölsäure (18:1 n-9) mit

ca. 23% und Palmitinsäure (16:0) mit ca. 10% Anteil nachweisbar. Kontrollfutter mit

Beimischung von 10% Salat (infiziert bzw. gesund) enthielt als Hauptfettsäure

ebenfalls LA (18:2 n-6), durch die Beimischung sank der LA-Anteil im Futter jedoch

von 57 auf 54%. Der ALA-Anteil in Futter mit Salatzusatz war mit durchschnittlich 8

% gegenüber dem ALA-Gehalt im Kontrollfutter mit nur 5,9 % statistisch signifikant

erhöht.

EPA konnte in Futter mit 10% infiziertem Salat nachgewiesen werden, jedoch mit nur

noch sehr geringen Anteilen von 0,02-0,04%, die aus Abb. 4.5. grafisch nicht mehr

ersichtlich sind.

Der Anteil von ALA im Dotter war nach Fütterung mit Kontrollfutter mit 0,5% sehr

gering und konnte mit Salatbeimischung auf 1% gesteigert werden. EPA konnte in

Dotter nicht bzw. nur in Spuren nachgewiesen werden. Von der n-6-FS-Reihe waren

LA (18:2 n-6) mit 17% und ARA (20:4 n-6) in Dotter aus Kontrollfütterung weniger

stark vertreten wie in Dotter aus Salatfütterung mit 21 und 22%. Ölsäure (18:1 n-9)

hatte ca. 30% den höchsten Anteil am FS-Muster im Eidotter, gefolgt von

Palmitinsäure (16:0), Linolsäure (18:2 n-6) und Stearinsäure (18:0). DHA und ARA

waren, im Gegensatz zu Futter oder Salat, nur in Dotter vorhanden. DHA war die

dominante n-3-FS im Eidotter. Sie hatte einen durchschnittlichen Gesamtanteil von

etwa 4-5% am Fettsäuremuster. Die gesättigten FS 16:0 und 18:0 hatten im Dotter

einen gemeinsamen Anteil von etwa 40%.


85

Die absoluten n-3-FS-Konzentrationen in Form von ALA, EPA und DHA aus

Sporangien von B. lactucae, Salat, Futter und Dotter sowie die n-6/n-3-Verhältnisse

wurden in Tab. 4.2. zusammengefasst, um einen vergleichenden Überblick zu

ermöglichen. Je kleiner der n-6/n-3-Wert der Tabelle, umso besser war das n-6/n-3-

Verhältnis.

Tab. 4.2.: Die Konzentrationen der n-3-FS in der Nahrungskette

EPA mg/g

(20:5 n-3)

ALA mg/g

(18:3 n-3)

DHA mg/g

(22:6 n-3)

n-3 Gesamt

(mg/g)

n-6/n-3-

Verhältnis

Bremia lactucae Sporangien FG 10 1,5 0,5 12 0,72

Infizierter Grüner Kopfsalat TG 0,14

5,02 - 5,16 0,75

Gesunder Grüner Kopfsalat TG - 7,15 - 7,15 0,52

Infizierter Roter Eichblattsalat TG 0,27

5,00 - 5,27 0,59

Gesunder Roter Eichblattsalat TG - 7,26 - 7,26 0,52

Futter mit 10% inf. Grünem

Kopfsalat TG

0,019 5,43 5,45 6,5

Futter mit 10% ges. Grünem

Kopfsalat TG

- 4,93 - 4,93 5,3

Futter mit 10% inf. Rotem

Eichblattsalat TG

0,026

5,43 - 5,46 6,8

Futter mit 10% ges. Rotem

Eichblattsalat TG

- 4,49 4,49 6,8

Kontrollfutter ohne Salat TG - 2,42 - 2,42 9,7

Dotter mit inf. Grünem Kopfsalat

FG

- 4,62

3,39

8,01 8,71

Dotter mit ges. Grünem Kopfsalat

FG

- 4,34

3,63

7,98 8,48

Dotter mit inf. Rotem

Eichblattsalat FG

- 4,05

3,71

7,76 8,69

Dotter mit ges. Rotem

Eichblattsalat FG

- 4,26

3,54

7,80 8,42

Dotter mit Kontrollfutter FG - 2,12 2,92 5,04 9,82

ALA

Sporangien enthielten nur 1,5 mg ALA/g FG. Da auch hier durch den 10%igen

Futterzusatz die Konzentrationen bis in den µg Bereich hinein verdünnt wurden,


86

spielte ALA aus B. lactucae wohl keine Rolle für den ALA Gehalt im Dotter. Salat

dagegen zeigte Mengen an ALA im einstelligen mg-Bereich. Gesunder Grüner

Kopfsalat produzierte durchschnittlich 7,15 mg ALA/g TG, gesunder Roter Eichblatt-

salat produzierte durchschnittlich 7,26 mg ALA/g TG. Futter ohne Salatzusatz enthielt

nur 2,42-3 mg ALA/g TG. In Futter mit 10%iger Beimischung von infiziertem und

gesundem Salat wurden zwischen 4,5 und 5,5 mg ALA/g TG gemessen. Diese

Mengen wirkten sich bereits signifikant auf die ALA-Gehalte im Eidotter aus, denn

Hühner, denen Futter mit Salatbeimischung gegeben wurde, produzierten mit bis zu

4,6 mg/g FG im Dotter signifikant höhere ALA-Gehalte, als Hühner, denen nur

Kontrollfutter gegeben wurde (2,12 mg ALA/g FG). Dabei war es nicht entscheidend,

ob der Salat infiziert war oder nicht. Bezüglich der n-3-FS ALA aus Salat zeigten sich

somit signifikante Anreicherungseffekte über die Nahrungskette.

EPA

Enthielten Sporangien noch EPA Gehalte von ca. 10 mg/g FG, so enthielt infizierter

Grüner Salat im Trockengewicht nur noch 0,14 mg EPA/g TG. Der etwas besser

befallene Rote Eichblatt Salat wies durchschnittlich 0,27 mg EPA/g TG auf. Futter mit

10% Grünem Kopfsalat enthielt daher durchschnittlich 0,019 mg EPA/g TG, Roter

Eichblattsalat enthielt im Schnitt 0,026 mg EPA/g TG. Im Dotter war EPA nur in

Spuren nachweisbar. Bezüglich EPA aus B. lactucae zeigten sich daher keine

Anreicherungseffekte über die Nahrungskette.

DHA

DHA war mit 0,5 mg/g in Sporangien von B. lactucae nachweisbar und stellte die n-3-

FS mit dem höchsten Anteil im Eidotter dar. Eidotter aus Fütterung mit Kontrollfutter

enthielt mit nur 2,92 mg DHA/g FG statistisch signifikant weniger DHA als die

Eidotter aus Fütterung mit Salatbeimischung mit bis zu 3,71 mg DHA/g FG. Es gab

keinen Beweis dafür, dass eine Infektion mit B. lactucae den Gehalt an DHA

beeinflusste. Bezüglich der FS DHA zeigten sich durch Zufütterung von Salat zwar

nicht ebenso starke, jedoch gleichfalls statistisch signifikante Anreicherungseffekte

wie für ALA.


87

n-6/n-3-Verhältnisse

Sporangien und Mycel von B. lactucae zeigten ein n-6/n-3-FS-Verhältnis von 0,72

(Tab. 4.2.).

Die n-6/n-3-FS Gehalte von Salat lagen zwischen 0,5 und 0,75. Infizierter Salat wies

tendenziell höhere n-6/n-3-Verhältnisse auf als gesunder Salat.

Im Kontrollfutter ohne Salatbeimischung zeigte sich ein n-6/n-3-Verhältnis von 9,7-

10. Die n-6/n-3-Verhältnisse von Futter mit 10% Salatbeimischung lagen mit einem

durchschnittlichen Verhältnis von 6 in einem signifikant besseren Bereich, als die des

Kontrollfutters. Es spielte keine Rolle, ob der Salat infiziert war oder nicht.

Die FS-Muster von Eidotter nach Fütterung mit 10%iger Salatbeimischung enthielten

signifikant mehr ALA und DHA als Kontrollfutter. Das n-6/n-3-Verhältnis im Dotter

änderte sich nach unterschiedlicher Fütterung signifikant positiv (Tab. 4.2.) von 9,82

bei Fütterung ohne Salatzusatz nach durchschnittlich 8,5 bei Fütterung mit

Salatzusatz.

Gesamt-n-3-FS-Gehalte

Sporangien von B. lactucae enthielten einen Gesamtgehalt an n-3-FS von 12 mg/g.

Gesunder Salat enthielt je nach Typus 7,15 (Grüner Kopfsalat) bzw. 7,26 (Roter

Eichblattsalat) mg n-3-FS/g TG (Tab. 4.2.). infizierter Salat wies mit 5,16 bzw. 5,27 n-

3-FS/g TG statistisch signifikant weniger n-3-FS im Gewebe auf als gesunder Salat.

Kontrollfutter enthielt nur 2,42, mg n-3-FS/g TG. Futter mit 10% Beimischung von

gesundem Salat enthielt mit 4,49 bzw. 4,93 mg n-3 FS/g TG etwas niedrigere n-3-

FS-Gehalte als Futter mit Beimischung von infiziertem Salat mit 5,46 bzw. 5,45 mg n-

3-FS/g TG. Eine 10%ige Salatbeimischung zum Kontrollfutter brachte einen

signifikanten Gewinn an n-3-FS im Eidotter. Enthielten die Dotter der Kontrollgruppe

in Schnitt 5,04 mg n-3/g FG, so waren es bei den Salatgruppen bis zu 8,01 mg n-3/g

FG. Dies bedeutete eine statistisch signifikante Verbesserung des Gesamt-n-3

Fettsäuregehaltes des Dotters um ca. 60%. Es gab keine statistisch signifikanten

Unterschiede zwischen Fütterung mit gesundem oder infiziertem Salat.


88

4.3.4. Lipidoxidation und Sensorik

Die Oxidation startete erst nach etwa 60 min Inkubation (Abb. 4.6., Zeitstufe 4). Die

Oxidationsstufen in den Behandlungen mit infiziertem Salat waren von Anfang an

niedriger und bewegten sich danach auf einem insgesamt geringeren Niveau,

parallel zu den anderen Behandlungsgruppen.

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

Zeitstufen

MD

A [n

mol

/mg]

Kontrolle 0,21 0,30 0,31 0,33 0,39 0,76 1,11 1,55 1,62 1,83

RE- 0,30 0,32 0,39 0,45 0,48 0,85 1,25 1,47 1,68 1,82

RE+ 0,28 0,37 0,41 0,36 0,38 0,67 0,90 1,18 1,39 1,60

SN- 0,26 0,31 0,33 0,37 0,56 0,96 1,24 1,41 1,60 1,77

SN+ 0,25 0,32 0,36 0,33 0,34 0,44 0,72 0,95 1,15 1,47

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Abb. 4.6. : Verlauf der Oxidation bis zur Inkubationszeit von 135 min in den Dottern der 5

Fütterungsgruppen: 10%Roter Eichblattsalat gesund (RE-) bzw. infiziert (RE+), 10%Grüner Kopfsalat

gesund (SN-) bzw. infiziert (SN+) und 100% Kontrolle. Die Zeitstufen sind in 15 min-Schritten von 1

bis 10 aufgeteilt.

So ergab die Bestimmung der Oxidationsprodukte (TBARS) in den Eiern tendenziell

höhere Inkubations-Endwerte für die Kontrollgruppe und die Futtergruppen mit

gesundem Salat (Abb. 4.6., Zeitstufe 10). Eidotter aus Fütterung mit infiziertem Salat

neigten daher weniger zur Oxidation, als Eidotter aus Fütterung mit konventionellem

Futter oder gesundem Salat. Die Unterschiede zwischen den Futterbehandlungen

waren wegen hoher Standardabweichungen der Mittelwerte jedoch nicht signifikant.

10 Eier jeder Versuchsgruppe wurden gleichmäßig abgekocht und in einem Blindtest

verkostet. Alle Teilnehmer des Sensoriktests bewerteten die Eier, die von Hühnern

aus Fütterung mit infiziertem Salat stammten, als geschmacklich am besten.


89

4.3.5. Leistungsdaten der Tiere

Die Hühner wurden durch keine Fütterungsvariante in ihrer Gesundheit oder

Leistungsfähigkeit beeinträchtigt.

Nährstoffgehalte von Salat und Futter

Die Analyse der Salatproben offenbarte deutliche Unterschiede. Bei infiziertem Salat

waren Asche- und Kalziumgehalte deutlich erhöht, während bei infiziertem Grünem

Kopfsalat geringe Stärke- und keine Zuckergehalte ermittelt wurden. Die erhöhten

Asche- und Kalziumgehalte bei infiziertem Salat (Grüner Kopfsalat und Roter

Eichblattsalat) konnten auf starke Verunreinigungen mit Erdreich zurückgeführt

werden. Die Abweichungen des infizierten Grünen Kopfsalates bezüglich der Zucker-

und Stärkewerte entstanden eventuell durch Fehler bei Probenahme des Salates,

der sehr inhomogen strukturiert und unterschiedlich befallen war.

Die umsetzbare Energie von Rotem Eichblattsalat lag mit 5,05 und 6,73 MJ/kg

deutlich über Grünem Kopfsalat mit nur 3,47 und 3,51, MJ/kg.

Tab. 4.3.: Analyse der Nährstoffgehalte der getrockneten Salate (%).

Salatvariante/ Nährstoffe

Was

ser

Eiw

eiß

Fet

t

Asc

he

Roh

fase

r

Zuc

ker

Stä

rke

Cal

cium

Pho

spho

r

Um

setz

bare

E

nerg

ie

(MJ/

kg)

RE inf. (TG) 7,63 20,2 3,27 20,2 10,3 6,05 0,00 1,12 0,53 5,05

RE ges. (TG) 9,48 18,5 2,77 13,7 8,87 22,5 0,00 0,99 0,44 6,73

GK inf. (TG) 8,10 13,4 2,51 34,4 7,10 4,39 0,00 2,16 0,41 3,51

GK ges. (TG) 10,2 17,6 1,43 12,2 8,48 0,00 1,49 0,66 0,50 3,47

RE = Roter Eichblattsalat, GK = Grüner Kopfsalat, inf. = infiziert, ges. = gesund; MJ = Megajoule


90

Die Nährstoffanalyse der eingesetzten Futterrationen stimmte weitgehend mit den

geplanten Gehalten (vgl. Kap. 4.2.5.) überein. So lag die umsetzbare Energie der

Futterrationen zwischen 11,5 und 11,8 MJ/kg, der Richtwert war bei 11,3 MJ/kg an-

gesetzt (Tab. 4.4.). Die Eiweißgehalte lagen mit 13,4 bis 20,2 % ebenfalls im gefor-

derten Bereich von 17,1%. Die Kalziumgehalte lagen etwas unterhalb der geforder-

ten Menge von 3,9%, die Phosphorgehalte lagen dagegen wieder im geforderten Be-

reich von 0,58%.

Tab. 4.4.: Analyse der Nährstoffgehalte (%) der Versuchsrationen (* Erklärung siehe Tab. 4.1. in

Abschnitt 4.2.5.) Futtervariante / Nährstoffe

Was

ser

Eiw

eiß

Fet

t

Asc

he

Roh

fase

r

Zuc

ker

Stä

rke

Cal

cium

Pho

spho

r

Um

setz

bare

E

nerg

ie

(MJ/

kg)

Futter + RE inf. (TG)

9,87 17,5 7,46 14,5 3,69 4,55 33,6 4,28 0,60 11,5

Futter + RE ges. (TG)

9,78 17,3 7,58 13,6 3,76 5,41 33,8 4,09 0,57 11,6

Futter + GK inf. (TG)

9,43 16,7 7,45 17,2 13,8 4,29 35,0 4,70 0,61 11,5

Futter + GK ges. (TG)

9,86 17,5 7,81 14,4 3,78 6,15 33,6 4,29 0,62 11,8

Kontrollfutter ohne Salat TG

10,9 17,1 4,73 13,6 2,72 4,07 40,5 4,39 0,53 11,6


91

Legeleistung

Die Fütterung mit dem gesunden Salat führte zu einem geringeren Futterverzehr bei

höherer Legeleistung gegenüber der Kontrollfütterung.

Tab. 4.5.: Mittelwerte und Standardabweichungen für Legeleistung und täglichen Futterverzehr Futtervariante Legeleistung (%) Täglicher Futterverzehr (g)

Futter + RE inf. (TG) 92,5±8,18 111±15,8

Futter + RE ges. (TG) 95,2±6,23 111±12,5

Futter +GK inf. (TG) 91,7±7,53 117±9,38

Futter + GK ges. (TG) 96,4±2,20 108±8,37

Kontrollfutter ohne Salat (T)G 94,1±6,10 118±7,08

F-Werte (Sign.) 0,73 (n.s.) 1,13 (n.s.) Futter mit infiziertem Salat führte zu einem tendenziellen Rückgang der Legeleistung

der Hennen, während die Futteraufnahme bei infiziertem Grünem Kopfsalat etwa so

hoch war wie beim Kontrollfutter (Tab. 4.5.). Die Unterschiede zwischen den

Behandlungen waren jedoch nicht signifikant.

Eigewichte, Dotter- und Schalenanteil, Dotterfarbe

Für keines der untersuchten Qualitätskriterien wie Eigewichte, Dotter- und Schalen-

anteil oder Dotterfarbe (ungekocht), konnten signifikante Effekte der Fütterung

beobachtet werden (Tab. 4.6.).

Mit durchschnittlich 68,2 und 67,6 g waren die Eigewichte bei Fütterung mit

infiziertem Salat etwas höher als die Eigewichte bei Fütterung mit gesundem Salat

mit 66,7 und 66 g. Bei den Dotteranteilen verhielt es sich umgekehrt, diese waren bei

Fütterung mit gesundem Salat mit 25,7 und 26,8 % höher als die von infiziertem

Salat mit 25,0 und 25,5%. Alle durchschnittlichen Schalenanteile waren bei

Zufütterung von Salat niedriger als bei Fütterung mit Kontrollfutter. Die Fütterung

wirkte sich nicht auf die Dotterfarbe von frischem Eidotter aus.

Ein Sensoriktest zeigte jedoch, dass die Eier nachdem sie gekocht und verzehrt

wurden, deutliche Unterschiede zeigten. Die Dotter von Eiern aus Salatfütterung

wurden von allen Testpersonen als „sattgelb“, geschmacklich sehr gut und von


92

angenehmerer Konsistenz bewertet. Eier aus konventioneller Fütterung sowie aus

einer Vergleichsgruppe aus dem kommerziellen Handel wurden im Vergleich dazu

als „blass“, „künstlich orange“ und „schmierig“ eingestuft.

Tab. 4.6.: Mittelwerte und Standardabweichungen für Eigewichte (g), Dotteranteil (%), Schalenanteil

(%), Dotterfarbe (Fächerwert).

Futtervariante Eigewicht Dotteranteil Schalenanteil Dotterfarbe

Futter + RE inf. (TG) 68,2±4,03 25,0±1,03 9,71±0,69 12,0±0,00

Futter + RE ges. (TG) 66,7±5,55 25,7±1,12 9,65±0,50 12,0±0,00

Futter + GK inf. (T) 67,6±4,82 25,5±1,11 9,64±0,59 12,3±0,46

Futter + GK ges. (TG) 66,0±2,53 26,8±1,22 9,60±0,79 12,0±0,00

Kontrollfutter ohne Salat

(TG)

66,9±4,00 25,7±1,35 9,94±0,55 12,0±0,00

F-Werte 0,33 n.s. 2,42 n.s. 0,37 n.s. 2,33 n.s.

Depositionsraten und Gesamtgehalte an n-3-FS im Gesamtei

Die n-3-Aufnahme war bei Fütterung mit infiziertem Salat deutlich höher als für

gesunden Salat oder Kontrollfutter, was mit dem höheren Futterverbrauch korrelierte.

Die Aufnahme an Gesamt-n-3-FS mit 1020 mg/Ei war bei Fütterung mit infiziertem

Grünem Salat am höchsten (Tab. 4.7.). Sie war höher, als bei Fütterung mit

infiziertem Roten Eichblatt Salat (934 mg/Ei), mit gesundem Roten Eichblatt Salat

(858 mg/Ei) und bei Fütterung mit gesundem Grünem Kopfsalat (896 mg/Ei). Die

geringste n-3-Aufnahme mit nur 553 mg/Ei lag bei der Kontrollgruppe vor.

Die n-3-FS-Gehalte pro Ei waren mit 122,6 und 118 mg/Ei bei Zufütterung von

Rotem Eichblattsalat deutlich geringer als bei Zufütterung von Grünem Kopfsalat mit

130 und 135,7 mg/Ei.

Bei den Hühnern, die mit Salat gefüttert wurden, wiesen die Eidotter mit bis zu 135,7

mg/Ei beinahe um das Doppelte höhere n-3-FS-Gehalte auf, als die Eidotter der

Kontrollgruppe mit nur 81,8 mg n-3-FS/Ei (Tab. 4.7.). Die Aufnahme an n-3-FS sowie

die n-3-FS-Gehalte der Eier korrelierten mit den vergleichsweise hohen n-3-FS-

Gehalten von Futter mit Salatbeimischung gegenüber Kontrollfutter.


93

Die Depositionsrate für n-3-FS variierte zwischen 13,1 und 15,1 % und lag im

Durchschnitt bei 13,9 %. Im Vergleich dazu lag die durchschnittliche Depositionsrate

von n-3-FS verschiedener Hühnerrassen bei einer Studie mit Leinöl als Futterzusatz

in derselben Größenordnung bei 17,4% (STEINHILBER 2003). Die n-3-FS aus Salat

konnten folglich genau so gut „verwertet“ werden wie die FS aus Leinöl mit ähnlich

guter „Einlagerungsbilanz“.

Die Depositionsraten waren bei Fütterung mit infiziertem Salat nicht signifikant von

denen bei Fütterung mit gesundem Salat oder Kontrollfutter verschieden.

Tab. 4.7.: Berechneter durchschnittlicher Futterverbrauch (FV, g/Ei), Dottergewicht (DG, g/Ei), n-3-FS-

Aufnahme (mg/Ei), n-3-FS-Gehalt (mg/Ei), und n-3-Deposition (%)

Futtervariante FV DG n-3-FS-Aufnahme n-3-FS-Gehalt n-3-Deposition

Futter + RE inf. (TG)

120,4 15,8 934 122,6 13,1

Futter + RE ges. (TG)

117,0 16,1 858 118,0 13,8

Futter + GK inf. (TG)

127,4 16,2 1020 130,0 12,7

Futter + GK ges. (TG)

112,3 17,0 896 135,7 15,1

Kontrollfutter ohne Salat (TG)

125,6 16,2 553 81,6 14,8

Futterverbrauch, Dottergewichte, n-3-Aufnahme und Depositionsraten unterschieden

sich nicht signifikant, wohingegen die Unterschiede im n-3-FS-Gehalt bei der

Salatfütterung gegenüber der Kontrollfütterung statistisch signifikant erhöht waren.


94

4.4. Diskussion

4.4.1. Befallsergebnis vom Feldversuch

Verglichen mit dem im Labor 100%ig infizierten Salat und erzielten EPA-Gehalten

von 1 mg/g, wies der zur Hälfte infizierte Grüne Kopfsalat vom Feld mit 0,2 mg EPA/g

FG nur etwa 1/5 des erzielbaren EPA-Gehaltes auf. Der Rote Eichblattsalat war, trotz

Sporulation auf der kompletten Blattfläche, mit 0,4 mg EPA/g TG um 60% schlechter

als Laborsalat und doch doppelt so gut befallen wie der Grüne Kopfsalat. Die

anfänglich abgeschätzte Menge an EPA für das Fütterungsexperiment entsprach

somit nicht dem aus Laborversuchen erwarteten Wert von 1 g EPA/kg TG Salat. In

einem Kilogramm Trockensalat war mit Konzentrationen von nur 200-400 mg

lediglich genauso viel EPA enthalten, wie in einer handelsüblichen Fischölkapsel.

Dieser geringe EPA-Gehalt des Salates vom Feldversuch lag wohl an mehreren

Faktoren. Zuallererst war wohl das Pflanzdatum für den schlechten Befall des

Grünen Kopfsalates mit B. lactucae verantwortlich, im Labor wurden sowohl der Rote

Eichblatt- als auch der Grüne Kopfsalat etwa gleich gut und gleich schnell infiziert.

Sorteneffekte wurden ausgeschlossen, da bei verschiedenen Sorten und beiden

Salattypen unter Laborbedingungen dieselben EPA-Durchschnittsgehalte gemessen

wurden. Der Rote Eichblattsalat konnte wohl aufgrund des früheren Pflanzdatums

eine bessere Biomasse und einen stärkeren Bremia-Befall ausbilden. Dafür spricht

auch das Ergebnis, dass die Biomasse und der Befall des früheren Satzes des

Grünen Kopfsalates ebenfall besser ausgeprägt waren, als beim späteren Satz. Die

Faktoren Licht, Feuchtigkeit und Temperatur, welche die Infektion mit B. lactucae

steuern (DATNOFF et al. 1990; SCHERM et al. 1993; SU et al. 2000; SU et al. 2004)

konnten auf dem Feld nicht beeinflusst werden. Die durchschnittlich schlechteren

EPA-Gehalte des Salates vom Freiland wurden wohl auch vom zeitlich verzögerten

Befall von älteren zu jüngeren Blättern mit verursacht. Da die Zellstruktur des Salates

bei Infektion mit Falschem Mehltau durch die Besiedelung verändert wurde, waren

die älteren Blätter teilweise schon braun und faulig, während die jüngeren Blättern

noch in der Anfangsphase einer Infektion waren oder frisch sporulierten. Daher

schwankten die Fettsäuregehalte innerhalb eines Salatkopfes sehr stark. Ein

Freilandfeld war, aufgrund der schlechten Optimierbarkeit des Befalls, wegen kaum

regulierbarer Umweltbedingungen, nicht für den Erhalt optimaler EPA-Gehalte in


95

infiziertem Salat geeignet. Infiziertes Pflanzenmaterial für einen Fütterungsversuch

ließ sich zwar in genügender Menge, jedoch nicht in genügender Qualität gewinnen.

4.4.2. Temperaturstabilität und Trocknung

Die EPA-Gehalte bei den Messungen der Temperaturstabilität in den Vorversuchen

unterschieden sich etwas bei unterschiedlichen Trocknungstemperaturen und

Trocknungszeiten. Dabei konnte ein nicht sichtbarer Befallsgradient vom Mycel im

Salatblatt jedoch nicht ausgeschlossen werden, da nur ein (äußerlich homogen

sporulierendes) Salatblatt beprobt wurde und für jede Temperatur mit zugehörigem

Trocknungszeitraum immer Blattstücke links und rechts der Hauptblattader verwen-

det wurden. Es konnte jedoch auch nicht ausgeschlossen werden, dass die mittleren

Blattteile besonders gut infiziert waren und folglich bei 40°C die höchsten EPA-

Konzentrationen aufwiesen. Die blattinterne Befallsdichte konnte jedoch nicht weiter

untersucht werden, da Mycel vom Blattgewebe nicht trennbar war. So konnte nicht

gesagt werden, ob die niedrigen FS-Gehalte bei 20°C auf eine sehr niedrige

Befallsdichte am Blattgrund zurückzuführen waren oder ob enzymatische Abbau-

prozesse bei vergleichsweise erhöhtem Wassergehalt dafür verantwortlich waren,

denn bei RT enthielten die Blattstücke nach 48 h mehr Restfeuchte als bei 40°C. Die

niedrigeren FS-Gehalte bei 60°C bzw. 80°C Trocknung ko nnten ebenfalls sowohl am

niedrigen Befall der Blattspitze liegen, als auch am Verlust der flüchtigen FS durch zu

hohe Trocknungstemperatur wegen hitzebedingtem Aufplatzen von Zellen. Auf jeden

Fall galt: 1. Je Kürzer der Trocknungszeitraum und je geringer die Temperatur, umso

geringer die Energie- und Sachkosten. 2. Für stabil getrocknetes Gewebe war eine

Restfeuchte höher als 10% unerwünscht, da enzymatischer FS-Abbau in engem

Zusammenhang mit dem Wassergehalt steht (BELITZ et al. 2001). Eine Restfeuchte

kleiner als 10% konnte mit 20°C Trocknungstemperatur na ch 48 h Trocknung nicht

erreicht werden. Als Fazit aus dem Vorversuch ging daher hervor, dass eine

Trocknungstemperatur bei 40°C über einen möglichst kurzen Zeitraum optimale

EPA-Gehalte bei vertretbarem Energieaufwand ermöglichte. Diese Parameter

wurden bei der Trocknung im Hordentrockner umgesetzt und eine Lagerung ohne

Verluste an FS konnte gewährleistet werden.


96

4.4.3. FS-Analyse in der Nahrungskette

Die FS-Messungen zeigten, dass in infiziertem Salat weniger ALA und damit

insgesamt weniger n-3-FS enthalten waren als in gesundem Salat. Dies war wohl auf

Oxidationsprozesse während des Feldbefalls zurückzuführen, da ältere infizierte

Blätter meist schon faulig waren. Auch die geringen zusätzlichen Mengen an EPA

und ALA aus B. lactucae konnten dieses ALA-Defizit im infizierten Salat nicht

wettmachen. In den Futterproben konnte dieser Trend nicht nachgewiesen werden.

Futter mit infiziertem Salat unterschied sich im n-3-FS-Gehalt nicht signifikant vom

Futter mit gesundem Salat, was an einer sehr großen Varianz zwischen den

einzelnen Futterproben lag. Dass das Futter eher grobkörnig strukturiert war und

schon beim Salat große Unterschiede von Infektionsgrad und Beschaffenheit (älteres

oder jüngeres Blatt) vorhanden waren, wirkte sich auf die Beprobung aus. Futter mit

Salatbeimischung enthielt jedoch insgesamt doppelt soviel n-3-FS wie Kontrollfutter,

was sich statistisch signifikant auswirkte. So zeigten auch die Dotter der Hühner aus

Fütterung mit infiziertem und gesundem Salat um ein Drittel höhere n-3-FS-Gehalte

als Dotter von Hühnern aus Kontrollfütterung, was sich als statistisch signifikant

belegen ließ. Eine Beimischung von 10% Salat wirkte sich folglich positiv auf den n-

3-FS-Gehalt im Eidotter aus, wobei es keine Rolle spielte, ob dieser infiziert oder

gesund war. Es konnte nicht bewiesen werden, dass sich EPA über die

Nahrungskette auswirkte, da die Gehalte in infiziertem Salat bei einer Beimischung

von 10% zum Futter für einen Effekt nicht genügten. Dies lag wohl auch mit an den

geringeren EPA-Gehalten des Freilandsalates. Die FS, die einen nachweisbaren

Einfluss auf den n-3-FS-Gehalt in der Nahrungskette „Salat-Futter-Dotter“ hatte, war

ALA aus Salat, da diese FS mengenmäßig genügend ins Gewicht fiel. ALA aus Salat

erhöhte den ALA-Anteil im Dotter um das Doppelte und den DHA-Anteil um etwa

20%.

Infizierter Salat wies trotz niedrigerer ALA-Konzentrationen ein besseres n-6/n-3-

Verhältnis auf als gesunder Salat. Dies war dadurch zu erklären, dass gesunder

Salat mehr von der n-6-FS LA produzierte. Im Futter war dieser Effekt nicht

nachweisbar. Das verbesserte FS-Verhältnis im Futter mit Salatbeimischung war, wie

der höhere n-3-FS-Gehalt, auf ALA aus Salat zurückzuführen. Das verbesserte n-

6/n-3 Verhältnis im Eidotter, nach Salatbeimischung zum Futter, war durch signifikant

erhöhte ALA und DHA Gehalte im Eidotter gegenüber der Kontrollgruppe begründet.


97

Eine Infektion mit B. lactucae wirkte sich auf das n-6/n-3-Verhältnis im Dotter

statistisch gegenüber Fütterung mit gesundem Salat nicht aus.

Als exzellente Quelle von ALA, die positiv zum FS-Muster von Eidotter beitragen

kann, wurde Portulak beschrieben. Portulak enthält in 1 g Frischgewicht 3-4 mg ALA

(SIMOPOULOS & SALEM 1986; SIMOPOULOS 1995). Die Zufütterung von Portulak kann

den n-3-FS Gehalt von Hühnereiern daher deutlich verbessern (SIMOPOULOS &

SALEM 1992; SIMOPOULOS 1995). In Salat wurden im Vergleich zu Portulak nur 5-7

mg ALA/g TG bzw. 0,5-0,7 mg ALA auf 1 g Frischgewicht gemessen. An dieser

Stelle sollte zusätzlich bemerkt werden, dass bei der Herstellung von „Omega-3-

Eiern“ ALA- und DHA-Steigerungen um Faktor 5-10 gefordert werden (Professor

Grashorn mündlich), die bisher nur durch massive Zufütterung von n-3-FS-haltigen

Ölen erreicht werden können.

4.4.4. Lipidoxidation und Sensorik

Für die Dotter der Hühner der Salatgruppen wurden höhere Oxidationswerte

erwartet, da aus Fütterungsversuchen mit Leinöl bekannt ist, dass die Dotterlipide

wegen des höheren n-3-FS-Gehaltes schneller zu Oxidation neigen, als Dotterlipide

aus Kontrollfütterung (LEESON et al. 1998). Zudem sind in Sporangien Freie FS

enthalten, die Oxidationsprozesse theoretisch ebenfalls beschleunigen sollten (vgl.

Kap. 2). Insgesamt waren die Dotter jedoch wohl alle gut gegen Oxidation geschützt,

so dass erst nach 60 Minuten Oxidationsprozesse messbar waren. Interessant war,

dass die Eidotter aus Fütterung mit infiziertem Salat die starke Tendenz aufwiesen,

weniger gegen Oxidation anfällig zu sein, als Dotter aus Kontrollfütterung oder

Fütterung mit gesundem Salat. Diese Unterschiede waren jedoch wegen zu hoher

Standardabweichungen knapp unter der Signifikanzgrenze von 5 % und daher nicht

mehr signifikant. Eventuell produziert infizierter Salat jedoch vermehrt Stoffe, die

Oxidationsprozesse verhindern. Dem Tierfutter wurden insgesamt wohl genügend

Antioxidantien beigemischt, sodass Oxidationsvorgänge allgemein verhindert werden

konnten. Dieses Ergebnis belegte deutlich, dass sich EPA aus B. lactucae, trotz

massiver Zufütterung, nicht negativ auf die Eiqualität auswirkte.

Der Sensoriktest war eine zusätzliche Bestätigung für die Richtigkeit der Oxidations-

Messungen, da die massive Verfütterung von infiziertem Salat keineswegs zu Fehl-


98

aromen im Eidotter beitrug, der Geschmack der Eier aus Fütterung mit infiziertem

Salat sogar als sehr gut bewertet wurde.

4.5. Zusammenfassung

Die Studie zur Anreicherung von EPA aus B. lactucae über die Nahrungskette in

Hühnerdotter zeigte, dass die eingesetzten EPA-Mengen aus B. lactucae bei Zusatz

von 10% infiziertem Salat zum Futter offensichtlich zu gering waren, um sich über

Nahrungskette die im ALA oder DHA-Gehalt des Dotters niederzuschlagen.

Hierbei muss allerdings bemerkt werden, dass mit dem Freilandversuch nicht die

optimalen EPA-Gehalte in infiziertem Salat erreicht werden konnten.

Gegenüber der Fütterung mit gesundem Salat brachte infizierter Salat keine Vorteile,

jedoch auch keine Nachteile für den n-3-FS-Gehalt von Eiern. In einem Sensoriktest

wurden Eier aus Fütterung mit infiziertem Salat sogar mit am besten bewertet.

Auf Grund der hohen ALA-Gehalte von Salat und den damit verbundenen erhöhten

n-3-FS-Gehalte des Futters, war nach Fütterung mit salatversetztem Futter eine

deutliche Anreicherung der n-3-FS im Eidotter zu beobachten. Die Salat-Menge im

Futter bewirkte im Hühnerdotter gegenüber der Kontrollfütterung, dass doppelt soviel

ALA und 20% mehr DHA synthetisiert wurden. Verglichen mit etwa 17 mg ALA/kg TG

in Futter mit Leinöl, lag Futter mit 10% Salat (7 mg ALA/kg TG) daher schon in dem

Bereich, der für eine Anreicherung der DHA-Gehalte im Dotter relevant war. Durch

die Verbesserung des n-3-FS- Anteils im Futter mit Salatbeimischung wurden auch

die n-6/n-3-Verhältnisse im Eidotter signifikant positiv beeinflusst.

Negative Auswirkungen von infiziertem Salat auf Qualität oder Tierleistung konnten

für keines der untersuchten Merkmale festgestellt werden. Das Experiment belegte

erstmalig, dass die Zufütterung von Pflanzenmaterial mit Infektion durch einen

obligat-biotrophen Oomyceten keine toxischen oder leistungsmindernden Einflüsse

auf die Versuchstiergruppe hatte.

5. Bewertung des Potenzials von infizierten Nutzpflanzen als n-3-FS-Quellen für die menschliche Ernährung

99

5. Bewertung des Potenzials von infizierten Nutzpflanze n als n-3-FS-

Quellen für die menschliche Ernährung

5.1. Das Potenzial von Sporangien

In Sporangien von B. lactucae und P. halstedii konnten EPA-Konzentrationen von 10

bis 30 mg/g FG gemessen werden. Neben den Empfehlungen für Aufnahmeraten

von n-6 und n-3-FS existieren Empfehlungen für die täglichen Aufnahmekonzentra-

tionen für EPA und DHA, die in den USA bei 650 mg/Tag und in Großbritannien bei

200 mg/Tag liegen. Die NATO empfiehlt sogar 800 mg EPA + DHA täglich. Die DGE

empfiehlt eine EPA- und DHA-Aufnahme von 300 mg pro Person und Tag.

Fischölkapseln und Algenölkapseln, in denen hoch ungesättigte FS stark aufkon-

zentriert werden, enthalten zwischen 100 und 300 mg EPA und zusätzlich 100 bis

300 mg DHA pro Kapsel. Um eine tägliche Aufnahme von 100-300 mg EPA zu

gewährleisten, müssten statt einer Fischölkapsel täglich 10 g Sporangien von B.

lactucae oder P. halstedii verzehrt werden. Ein Produktivitätsvergleich in Kap. 2 (Tab.

2.2.) zeigte zwar, dass die theoretisch erzielbaren EPA-Gehalte pro Fläche von

sporu-lierenden Pflanzen durchaus mit den EPA-Gehalten pro Volumen aus

Bioreaktorsystemen konkurrenzfähig wären. Dafür wären jedoch sehr große

Anbauflächen (mehrere hundert m²) notwendig, deren Umwelt steuerbar sein sollte

und Fach-personal mit guten Kenntnissen im Umgang mit Erreger und Wirt wäre

unabdingbar. Da B. lactucae und P. halstedii obligat-biotroph sind und noch kein

Nährmedium für Kultivierung existiert, ist eine direkte Gewinnung der FS auf diese

Art bisher ausgeschlossen. Zudem gibt es schon Oomyceten-Gattungen wie Ulkenia

oder Thraustochytrium, die in Nährmedium alleine ohne Wirt wachsen und sehr hohe

Anteile an EPA oder DHA produzieren können. Das Potenzial von Sporangien als

direkte Quelle für die menschliche Ernährung wird daher derzeit als gering eingestuft.

5.2. Das Potenzial von infiziertem, essbarem Pflanzen gewebe

In infiziertem Pflanzengewebe fand man nach Optimierungsversuchen EPA-Höchst-

gehalte von etwa 2 mg EPA/g TG. Um den Tagesbedarf von 200-300 mg EPA zu

decken, müssten daher 100 g getrocknetes, infiziertes Pflanzengewebe gegessen

werden, was etwa einer Menge von 1 kg Frischgewicht entspricht. Bezieht man diese


100

Menge auf z.B. Salat, so müssten vier komplett infizierte Salatköpfe mit je 250 g FG

von einer Person am Tag verzehrt werden.

Dies sind Mengen, die nicht der natürlichen Nahrungsaufnahme entsprechen. Es

kann nun natürlich bemerkt werden, dass die empfohlenen Tagesmengen an EPA

sehr hoch angesetzt sind, da sie an klinische Studien zur Wirksamkeit angelehnt

sind. Würde pro Person nur ein infizierter Salatkopf pro Tag verzehrt, käme man

schon auf eine nennenswerte Dosis von etwa 50 mg EPA. Fraglich bliebe allerdings

die Akzeptanz der Verbraucher für infizierten Salat. Die Tatsache, dass sich B.

lactucae in Salat latent ausbreitet und bis zum Zeitpunkt der Sporulation nicht

sichtbar ist, könnte die Akzeptanz der Verbraucher steigern, zumal die gesundheits-

fördernde Wirkung der n-3-FS hervorgehoben werden könnte. Das Potenzial von

großtechnisch produzierten Nutzpflanzen als Quelle für die menschliche Ernährung

wurde in dieser Arbeit relativ hoch eingeschätzt. Die theoretische Produktivität von

infizierten Pflanzen pro Fläche war im Vergleich zu Bioreaktorsystemen hoch (vgl.

Kap. 2). Allerdings sollte die Infektion nicht im Freiland sondern in Gewächshäusern

stattfinden. Dort könnten Luftfeuchtigkeit und Temperatur geregelt werden, um die

Infektion ohne Nachteile für EPA-Gehalt, Aussehen oder Geschmack des Salates

optimal zu steuern. Die Infektion müsste standardisiert mit ausgewählten, besonders

EPA-haltigen Stämmen von B. lactucae geschehen. Zudem müssten Gefahren für

die menschliche Gesundheit über zusätzliche Biotests ausgeschlossen werden.

Das Potenzial von mit Oomyceten infizierten Pflanzen als n-3-FS-Quellen für die

menschliche Ernährung wird unter den genannten Vorbehalten, als bedingt möglich

eingestuft.


101

5.3. Das Potenzial von Bremia lactucae in der Nahrungskette

Zunächst müsste das Potenzial von B. lactucae als EPA-Lieferant für die Nahrungs-

kette besser ausgeschöpft werden, indem die Anbau- und Infektionstechniken auf

Großflächen mit steuerbarer Umwelt optimiert würden, so dass die EPA-Mengen im

Futter von bisher nur 0,2 mg EPA/g TG um Faktor 5 auf mindestens 1 mg EPA/g TG

(Laborwerte) gesteigert werden könnten. Zudem könnte versucht werden, analog

zum Optimierungsversuch für P. halstedii bei Sonnenblumen (vgl. Kap. 3), den EPA-

Gehalt in infiziertem Salat über gesteigerte Stickstoffgaben zusätzlich um den Faktor

2 zu erhöhen. Um deutliche Effekte von B. lactucae im Dotter zu sehen, müssten die

EPA-Mengen von Futter mit Beimischung von infiziertem Salat wohl mindestens um

den Faktor 10 erhöht werden, was mit optimierten Infektions- und Anbaumethoden

eventuell möglich wäre. Hier besteht noch pflanzenbaulicher Forschungsbedarf.

Der Versuch zur Anreicherung von EPA aus B. lactucae in Hühnereier brachte zwar

den gewünschten Effekt erhöhter ALA- bzw. DHA-Konzentration, dieser war jedoch

nicht auf B. lactucae sondern auf Salat zurückzuführen. Ein Zusatz von nur 10%

stark infiziertem Salat zum Futter zog einen Verdünnungseffekt des EPA-Gehaltes im

Futter nach sich, so dass sich EPA selbst nicht im Dotter anreicherte und es auch

keine Hinweise dafür gab, dass EPA vom Huhn für die DHA-Synthese verwendet

wurde.

Das Potenzial von absichtlich produziertem, infiziertem Salat für die Produktion von

n-3-FS-Eiern oder für die direkte menschliche Ernährung kann derzeit noch nicht

abgeschätzt werden. Angesichts existierender, leistungsfähiger und bewährter

Alternativen (Algen, heterotrophe Oomyceten, Grünfutter, gut dosierbare n-3-FS-

haltige Öle), erscheint eine Weiterentwicklung des hier getesteten Versuchsansatzes

als wirtschaftlich wenig sinnvoll.

Infizierter Salat fällt großflächig jedoch öfters an und stellt einen enormen Ernte-

verlust für Landwirte dar, die Arbeit, Geld und Zeit in die Anzucht und Pflege

verwendeten. Da es sich bei B. lactucae um einen landwirtschaftlichen Erreger

handelt, dessen Einfluss auf die menschliche Ernährung bisher nicht erforscht wurde,

ist der Salat nicht marktfähig und muss vernichtet werden.


102

Wenn Salat großflächig von B. lactucae befallen wird, könnte er aufgrund der

Ergebnisse der vorliegenden Arbeit jedoch an Tiere verfüttert werden. Um B.

lactucae-infizierten Salat als Futtermittel zulassen zu können, bedürfte es

eindeutiger, ernährungsmedizinischer Studien bezüglich der Nahrungskette, die

zweifelsfrei belegen, dass der Verzehr von großen Mengen an B. lactucae für Tiere

und Menschen ungefährlich ist. Das Potenzial von infiziertem Salat in dieser Hinsicht

wird als relativ vielversprechend eingestuft, zumal DHA-reiche, getrocknete

Schizochytrium-Präparate bereits als Tierfutterzusatz zugelassen sind und als sicher

und unbedenklich gelten (WARD & SINGH 2005).

6. Zusammenfassung

103

6. Zusammenfassung

Obligat-biotrophe Systeme wurden bisher nicht auf ihre Eignung als Omega-3-

Fettsäure-Quellen (n-3-FS-Quellen) untersucht. Das Ziel dieser Arbeit war es, das

Potenzial der Nutzpflanzen-Pathogene Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. & DeToni

(1888) und Bremia lactucae Regel (1843) auf ihre Eignung als alternative Quellen

von n-3-FS für die menschliche Ernährung zu erforschen, da die Lipide dieser

Oomyceten zu über 30% aus diesem Fettsäuretyp bestehen.

Die Methodik der quantitativen Fettsäureanalytik wurde im Rahmen der vorliegenden

Arbeit angewandt und für die Testsysteme adaptiert.

Die Fettsäure Eicosapentaensäure (EPA) wurde für beide Erreger mittels

Gaschromatographie quantifiziert. EPA war nicht nur in Triacylglyceriden gespei-

chert, sondern stammte zu großen Teilen auch aus anderen Lipidklassen wie z.B.

Phospholipiden und Freien FS (vgl. Kap. 2). Die Ergebnisse wurden mit der

Produktivität von EPA aus anderen Systemen verglichen. Bei optimierter EPA-

Produktion pro Fläche könnte B. lactucae nach Hochrechnungen mit 0,28 g/(m²•d)

durchaus mit der EPA-Produktion derzeit bestehender Bioreaktorsysteme (z.B.

Nitzschia alba) konkurrieren. Infizierte Pflanzen produzierten durchschnittlich 1 mg

EPA/g Trockengewicht (TG). Dies ist jedoch für den direkten Einsatz in der

menschlichen Ernährung um etwa den Faktor 10 zu wenig.

Daher wurden die Grenzen der natürlichen Optimierbarkeit von EPA in Kap. 3 am

bereits gut erforschten Modellorganismus P. halstedii in Sonnenblumen getestet. In

Sporangien waren maximale EPA-Konzentrationen von 25-30 mg/g FG erreichbar,

es gab Stämme, die unwesentlich mehr EPA produzierten als andere.

Bezüglich des Wirtes gab es spezielle Sonnenblumensorten und –linien, die bei guter

Biomasseentwicklung besonders gut infiziert werden konnten, was sich in vergleichs-

weise höheren EPA-Gehalten pro Biomasse zeigte. In infiziertem Gewebe fand man

im Optimalfall weiterhin lediglich etwa 1 mg EPA/g TG. Über die Variation des In-

fektionsdruckes (verschiedene Sporangieninokuli) konnten die EPA-Konzentrationen

in infiziertem Sonnenblumengewebe nicht gesteigert werden.

Hohe Gaben von Stickstoff an die Wirtspflanzen trugen dagegen statistisch signifi-

kant zur Steigerung der EPA-Gehalte im Pflanzengewebe bei, sodass bis zu 2 mg

6. Zusammenfassung

104

EPA/g TG erreicht werden konnten. Da die erreichten EPA-Konzentrationen bei

normalen Ernährungsgewohnheiten immer noch nicht ausreichten, um den in

Deutschland empfohlenen Tagesbedarf von 150-300 mg EPA zu decken, wurde

versucht, EPA über die Nahrungskette aus infiziertem Salat in Hühnerdotter

anzureichern (vgl. Kap. 4).

Ein Kooperationsprojekt mit dem Institut für Tierhaltung und Tierzüchtung, der

Versuchsstation für Gartenbau und dem Institut für Agrartechnik ermöglichte die

Durchführung eines komplexen Versuches zur Anreicherung von EPA aus B.

lactucae-infiziertem Salat in Dotterlipiden von Hühnereiern. Die Studie ergab, dass

bei einem Zusatz von 10% Salat (stark infiziert bzw. gesund) zum Hühnerfutter, im

Dotter die Gehalte der n-3-FS Alpha-Linolensäure (ALA) und Docosahexaensäure

(DHA) um das Doppelte bzw. um 20% gesteigert werden konnten. Gleichzeitig

verschob sich das n-6/n-3-Verhältnis zu günstigeren Werten für die menschliche

Ernährung. Für diese Effekte war es nicht relevant, ob der Salat infiziert oder gesund

war. Der Geschmack der Eier wurde durch Fütterung mit infiziertem Salat positiv

beeinflusst. Bezüglich der Eiqualität und der Leistungsdaten der Tiere konnten im

untersuchten Zeitraum keine negativen Einflüsse durch B. lactucae festgestellt

werden.

7. Summary

105

7. Summary

The potential of downy mildew as source of omega-3-fatty acids for human

nutrition

Obligate-biotrophic systems have yet not been tested for their suitability as sources

for omega-3-fatty acids (n-3-FA). The aim of this work was, to explore the potential of

the crop-plant pathogens Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. & DeToni (1888) and

Bremia lactucae Regel (1843) to serve as alternative sources of n-3-FA for human

nutrition, as the lipids of these oomycetes consist of 30% or more n-3-FA.

Methods of quantitative fatty acid analysis were applied in this work and adapted for

the test systems.

The fatty acid eicosapentaenoic acid (EPA) of both pathogens was quantified by

means of gas chromatography. The study showed that EPA was not only stored in

triacylgycerides but was also part of other lipid classes, e.g. phospholipids and free

fatty acids (see chapter 2). The results were compared with the productivity of EPA

from other systems. The estimated EPA-production of B. lactucae per area (0,28

g/(m²•d)) could compete with the EPA-production of existing bioreactor systems (e.g.

Nitzschia alba). Infected plants produced an average of 1 mg EPA/g dry weight

(DW). This, however, is only about 10% of the amount which would be required for

direct use in human nutrition.

In consequence, the possibility of enhancing EPA production through genotype

selection and growth conditions was tested with the already well explored model

organism P. halstedii in sunflowers (chapter 3). Sporangia of different pathogen

strains slightly varied in their EPA content, reaching maximum concentrations of 25-

30 mg/g DW. With respect to the host, several sunflower cultivars and –lines were

tested for susceptibility and biomass development in infected plant tissue. A

maximum of 1 mg EPA/g DW was found. Variation of infection pressure (different

doses of sporangia) could not influence the EPA-production.

In contrast, high amounts of nitrogen during host plant cultivation raised the EPA-

contents in infected plant tissue up to 2 mg EPA/g DW. This was still insufficient to

7. Summary

106

meet the recommended daily uptake of 150-300 mg EPA within normal dietary

habits.

Hence an enrichment of EPA or n-3-FA in hens´ egg yolk was attempted, using

infected lettuce in hens´ food (chapter 4).

This experiment was carried out in colaboration with the “Institut für Tierhaltung und

Tierzüchtung (Universität Hohenheim)”, the “Versuchsstation für Gartenbau (Hohen-

heim)” and the “Institut für Agrartechnik (Universität Hohenheim)”. B. lactucae

infected lettuce was produced in a field trial, dried and added to commercial hens´

food with a ratio of 10%. Uninfected lettuce served as control. The study showed,

that a supplementation of 10 % lettuce (strongly infected or healthy) to hens´ food

doubled the content of the n-3-FA alpha-linolenic acid (ALA, 18:3 n-3) and raised

docosahexaenoic acid (DHA) by 20 % in egg yolk. Simultaneously the n-6/n-3-ratio

with respect to the physiological requirement of human nutrition improved. The plants

cultivated in the field contained only about 20% of the maximum EPA-contents of

plants in the laboratory. It was not relevant for the n-3-FA content of egg yolk, if the

lettuce was infected or healthy. The flavour of the eggs was influenced positively by

feeding hens with infected lettuce. With respect to the egg quality and the perfor-

mance data of the hens, there could not be seen any negative influences.

8. Literatur

107

8. Literatur ACKMAN, R.G., BURGHER, R.D., SIPOS, J.C. (1963). Quantitative gas-liquid chromato-

graphy of the higher fatty acids. Nature 4908: 777-778.

ACKMAN, R.G., RATNAYAKE, W.M.N., MACPHERSON, E.J. (1989). EPA and DHA con-tents of encapsulated fish oil products. Journal of the American Oil Chemists Society 66: 1162-1164.

ACKMAN, R.G. (1998). Remarks on official methods employing boron trifluoride in the preparation of methyl esters of the fatty acids of fish oils. Journal of the American Oil Chemists Society 75: 541-545.

ACKMAN, R.G. (2002). The gas chromatograph in practical analyses of common and uncommon fatty acids for the 21 st century. Analytica Chimica Acta 465: 175-192.

BANG, H.O., DYERBERG, J., NIELSEN, A.B. (1971). Plasma lipid and lipoprotein pattern in Greenlandic West-coast Eskimos. Lancet 1: 1143-1145.

BARCLAY, W.R., ZELLER, S. (1996). Nutritional enhancement of n-3 and n-6 fatty acids in rotifers and Artemia napuli by feeding spray-dried Schizochytrium sp. Journal of the World Aquacultural Society 27: 314-322.

BÄSSLER, K.H. (1991). On the problematic nature of vitamin E requirements: net vita-min E. Zeitschrift für Ernährungswissenschaft 30: 174-180.

BEAUDOIN, F., MICHAELSON, L.V., HEY, S.J., LEWIS, M.J., SHEWRY, P.R., SAYANOVA, O.V., NAPIER, J.A. (2000a). Heterologous reconstitution in yeast of the poly-unsaturated fatty acid biosynthetic pathway. Proceedings in the National Academic Sciences 97: 6421-6426.

BEAUDOIN, F., MICHAELSON, L.V., LEWIS, M.J., SHEWRY, P.R., SAYANOVA, O.V., NAPIER, J.A. (2000b). Production of C20 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) by pathway engineering: identification of a PUFA elongase component from Caenorhabditis elogans. Biochemical society transactions 28: 661-663.

BELITZ, H.-D., GROSCH, W., SCHIEBERLE, P., Eds. (2001). Lehrbuch der Lebensmittel-chemie. Berlin, Heidelberg, New York, Springer Verlag.

BROOKS, J.L., STUMPF, P.K. (1966). Fat metabolism in higher plants. Biochemistry and Biophysics 116: 108-116.

BROWNING, L.M. (2003). n-3 Polyunsaturated fatty acids, inflammation and obesity-related disease. Proceedings in the Nutrition Society 62: 447-453.

BUNDESMINISTERIUM FÜR VERBRAUCHERSCHUTZ, E.U.L., Ed. (2006). Speisefette, aid.

CALDER, P.C. (2001). Polyunsaturated fatty acids, inflammation and immunity. Lipids 36: 1007-1024.

CALDER, P.C. (2004). n-3 fatty acids and cardiovascular disease: evidence explained and mechanisms explored. Clinical Science 107: 1-11.

8. Literatur

108

CARVALHO, A.P., PONTES, I., GASPAR, H., MALCATA, X. (2005). Metabolic relationships between macro- and micronutrients, and the eicosapentaenoic acid and doco-sahexaenoic acid contents of Pavlova lutheri. Enzyme and Microbial Technology 38: 358-366.

CASTON, L., LEESON, S. (1990). Research note: Dietary flax and egg composition. Poultry Science 69: 1617-1620.

CHEN, G., JIANG, Y., CHEN, F. (2008). Variation of lipid class composition in Nitzschia laevis as a response to growth temperature change. Food Chemistry 109: 88-94.

CHUNG, R.A., ROGLER, J.C., STADELMAN, W.J. (1965). The effect of dietary cholesterol and different dietary fats on cholesterol content and lipid composition of egg yolk and various body tissues. Poultry Science 44: 221-228.

CLARKE, S.D. (2001). Polyunsaturated fatty acid regulation of gene transcription: a molecular mechanism to improve the metabolic syndrome. Journal of Nutrition 131: 1129-1132.

COHEN, Y., SACKSTON, W.E. (1973). Factors affecting infection of sunflowers by Plasmopara halstedii. Canadian Journal of Botany 51: 15-22.

COLE, G., COUGHLAN, S., FREY, N., HAZEBROEK, J., JENNINGS, C. (1998). New sun-flower and soybean cultivars for novel vegetable oil types. Fett/Lipid 100: 177-181.

CRASKE, J.D., BANNON, C.D. (1987). Gas liquid chromatography analysis of the fatty acid composition of fats and oils: a total system for high accuracy. Journal of the American Oil Chemists Society 64: 1413-1417.

CSIRO (2005). Healthy new future for omega-3 grains. CSIRO, http://www.csiro.au/files/mediaRelease/mr2005/Omega3.htm.

DAHLE, L.K. (1962). The thiobarbituric acid reaction and the autoxidations of polyun-saturated fatty acid methyl esters. Archives of Biochemistry and Biophysics 98: 253-261.

DANNEL, F., PFEFFER, H., MARSCHNER, H. (1995). Isolation of apoplasmatic fluid from sunflower leaves and its use for studies on influence of nitrogen supply on apo-plasmic pH. Journal of Plant Physiology 146: 273-278.

DATNOFF, L.E., NAGATA, R.T., RAID, R.N., SCHETTINI, T.M., MICHELMORE, R.W. (1990). Field evaluation of crisphead and butterhead lettuce for downy mildew resistance and characterization of virulence phenotype. Proceedings in the Florida State Horticulture Society 103: 140-142.

DATNOFF, L.E., NAGATA, R.T., RAID, R.N. (1994). Pathotyping of Bremia lactucae in Florida. Plant Disease 78: 854-857.

DGE (2007). Fett. 14. Ernährungsfachtagung der Deutschen Gesellschaft für Ernähr-ung. Universität Hohenheim, DGE Baden-Württemberg.

8. Literatur

109

DOMERGUE, F., LECHL, J., ZÄHRINGER, U., HEINZ, E. (2002). Cloning and functional characterization of Phaeodactylum tricornutum front-end desaturases involved in eicosapentaenoic acid biosynthesis. European Journal of Biochemistry 269: 4105-4113.

DONG, M., WALKER, T.H. (2008). Addition of polyunsaturated fatty acids to canola oil by fungal conversion Enzyme and Microbial Technology 42: 514-520.

DREXLER, H., SPIEKERMANN, P., MEYER, A., DOMERGUE, F., ZANK, T., SPERLING, P., ABBADI, A. (2003). Metabolic engineering of fatty acids for breeding of new oilseed crops. Journal of Plant Physiology 160: 779-802.

DUFNER, J., JENSEN, U., SCHUMACHER, E., Eds. (1992). Statistik mit SAS, Teubner Verlag.

ERKKILÄ, A., DEMELLO, V.D.F., RISERUS, U., LAAKSONEN, D.E. (2008). Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach. Progress in Lipid Research 3: 172-187.

EU (1997). Verordnung (EG) Nr. 258/97 des Europäischen Parlaments und des Rates über neuartige Lebensmittel und neuartige Lebensmittelzutaten, Amt für amtliche Veröffentlichungen der Europäischen Gemeinschaften. CONSLEG: 1997R0258 - 18/04/2004: 9.

EZEKWE, M.O., OMARA-ALWALA, T.R., MEMBRAHTU, T. (1999). Nutritive characterization of purslane accessions as influenced by planting date. Plant Foods for Human Nutrition 54: 183-191.

FINNEGAN, Y.E., MINIHANE, A.M., LEIGH-FIRBANK, E.C., KEW, S., MEIJER, G.W., MUGGLI, R., CALDER, P.C., WILLIAMS, C.M. (2003). Plant- and marine-derived n-3 polyunsaturated fatty acids have differential effects on fasting and postprandial blood lipid concentrations and on the susceptibility of LDL to oxidative modification in moderately hyperlipidemic subjects. American Journal of Clinical Nutrition 77: 783-95.

FOLCH, J., LEES, M., STANLEY, S. (1957). A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry 226: 497-509.

FONTANA, E., HOEBERECHTS, J., NICOLA, S., CROS, V., PALMEGIANO, G.B., PEIRETTI, P.G. (2006). Nitrogen concentration and nitrate/ammonium ratio affect yield and change the oxalic acid concentration and fatty acid profile of purslane (Portulaca oleracea L.) grown in a soilless culture system. Journal of the Science of Food and Agriculture 86: 2417-2424.

FROHNE, D., JENSEN, U., Eds. (1992). Systematik des Pflanzenreichs. Stuttgart, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH.

FUNK, C.D. (2001). Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoids biology. Science 294: 1871-1875.

FUSSENEGGER, D., WINDHALM, K. (2003). Welches Fett das Kraut fett macht: Rapsöl und andere. Journal für Ernährungsmedizin 5: 31-35.

8. Literatur

110

GALANINA, L.A., KONOVA, I.V. (1998). Synthesis of eicosapolyenoic acids in microscopic fungi of the genus Saprolegnia. Microbiology 68: 418-422.

GANUZA, E., BENITEZ-SANTANA, T., ATALAH E., VEGA-ORELLANA, O., GANGA, R., IZQUIERDO, M.S. (2008). Crypthecodinium cohnii and Schizochytrium sp. as potential substitutes to fisheries-derived oils from seabream (Sparus aurata) microdiets. Aquaculture109-116.

GARIBALDI, A., BERTETTI, D., GULLINO, M.L. (2007). Effect of leaf wetness duration and temperature on infection of downy mildew (Peronospora sp.) of basil. Journal of Plant Diseases and Protection 114: 6-8.

GRAHAM, I.A., LARSON, T.R., NAPIER, J.A. (2007). Rational metabolic engineering of transgenic plants for biosynthesis of omega-3 polyunsaturates. Current Opinion in Biotechnology 18: 142-147.

GRASHORN, M.A. (1994). Einfluss verschiedener Futterfette auf den Blut- und Dottercholesteringehalt von Legehennen. Archiv der Geflügelkunde 58: 224-230.

GULYA, T.J., MILLER, J.F., VIRANYI, F., SACKSTON, W.E. (1991). Proposed internationally standardized methods for race identification of Plasmopara halstedii. Helia 14: 11-20.

HAASMANN, S.O. (1998). Analytical characterization of camel meat and milk fat. Chemistry, Brunel.

HARRIS, W.S. (1989). Fish oils and plasma lipid and lipoprotein metabolism in humans: a critical review. Journal of Lipid Research 30: 785-807.

HASLER, C.M. (2002). Functional foods: benefits, concerns and challenges- a position paper from the american council on science and health. Journal of Nutrition 132: 3772-3781.

HSIAO, T.Y., BLANCH, H.W. (2006). Physiological studies of eicosapentaenoic acid production in the marine microalga Glossomastix chrysoplasta. Biotechnology and Bioengineering 93: 465-475.

HUANG, J., AKI, T., HACHIDA, K., YOKOCHI, T., KAWAMOTO, S., SHIGETA, S., ONO K., SUZUKI, O. (2001). Profile of polyunsaturated fatty acids produced by Thraustochytrium sp. KK17-3. Journal of the American Oil Chemists Society 78: 605-610.

ILOTT, T.W., DURGAN, M.E., MICHELMORE, R.W. (1987). Genetics of virulence in californian populations of Bremia lactucae (lettuce downy mildew). Phytopathology 77: 1381-1386.

IUPAC-IUB (1978). The Nomenclature of Lipids. Journal of Lipid Research 19: 114-128.

JOSEPH, J.D., ACKMAN, R.G. (1992). Capillary column gas chromatographic method for analysis of encapsulated fish oils and fish oil ethyl esters: collaborative

8. Literatur

111

study. Journal of the Association of Official Analytical Chemists International 75: 488-506.

KAEWSUWAN, S., CAHOON, E.B., PERROUD, P.-F., WIWAT CHANPEN, PANVISAVAS, N., QUATRANO, R.S., COVE, D.J. (2006). Identification and functional characteri-zation of the moss Physcomitrella patens ∆5-desaturase gene involved in ara-chidonic and eicosapentaenoic acid biosynthesis. Journal of Biological Chemistry 281: 21988-21997.

KENDRICK, A., RATLEGE, C. (1992). Lipids of selected molds grown for production of n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids. Lipids 27: 15-20.

KHOZIN-GOLDBERG, I., COHEN, Z. (2006). The effect of phosphate starvation on the lipid and fatty acid composition of the fresh water eustigmatophyte Monodus subterraneus. Phytochemistry 67: 696-701.

KOCK, J.L.F., VAN DER WALT, J.P. (1986). Fatty acid composition of Schizosaccharo-myces Lindner. Systematics and Applied Microbiology 8: 163-165.

KOLANOWSKI, W., LAUFENBERG, G. (2006). Enrichment of food products with polyun-saturated fatty acids by fish oil addition. European Journal of Food Research and Technology 222: 472-477.

KOLB, B., Ed. (2003). Gaschromatographie in Bildern, Wiley-VCH Verlag.

KORNBRUST, D.J., MAVIS, R.D. (1980). Relative susceptibility of microsomes from lung, heart, liver, kidney, brain and testes to lipid peroxidation: correlation with vitamin E content. Lipids 15: 315-322.

KRIS-ETHERTON, P.M., SHAFFER TAYLOR, D., YU-POTH, S., HUTH, P., MORIARTY, K., FISHELL, V., HARGROVE, R.L., ZHAO, G., ETHERTON, T.D. (2000). Polyunsaturated fatty acids in the food chain in the United States. American Journal of Clinical Nutrition 71: 179S-188S.

KRIS-ETHERTON, P.M., HARRIS, W.S., APPEL, L.J. (2002). Fish consumption, fish oil, omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Circulation 106: 2747-2757.

LEESON, S., CASTON, L., MACLAURIN, T. (1998). Organoleptic evaluation of eggs produced by laying hens fed diets containing graded levels of flaxseed and vitamin E. Poultry Science 77: 1436-1440.

LEPAGE, G., ROY, C.C. (1984). Improved recovery of fatty acid through direct trans-esterification without prior extraction or purification. Journal of Lipid Research 25: 1391-1396.

LICHTENSTEIN, A.H., APPEL, L.J., BRANDS, M., CARNETHON, M., DANIELS, S., FRANCH, H.A., FRANKLIN, B. (2006). Summary of american heart association diet and lifestyle recommendations revision 2006. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 26: 2186-2191.

LOTTSPEICH, F., ENGELS, J.W., Eds. (2006). Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag.

8. Literatur

112

MANDAL, K., SARAVANAN, R., MAITI, S. (2008). Effect of different levels of N, P and K on downy mildew (Peronospora plantaginis) and seed yield of isabgol (Plantago ovata). Crop Protection 27: 988-995.

MARSCHNER, H., Ed. (1995). Mineral nutrition of higher plants. London, Academic Press.

MARSHALL, A.C., SAMS, A.R., VAN ELSWYK, M.E. (1994). Oxidative stability and sen-sory quality of stored eggs from hens fed 1,5% menhaden oil. Journal of Food Science 59: 561-563.

MARTIN, J., LEHLE, P., ILG, W., Eds. (2005). Fertigarzneimittelkunde. Stuttgart, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH.

MEAD, J.F. (1984). The non-eicosanoid functions of the essential fatty acids. Lipid Research 25: 1517-1521.

MEIER, S., MJOS, S., JOENSEN, H. (2006). Validation of a one-step extraction/methyl-ation method for determination of fatty acids and cholesterol in marine tissues. Journal of Chromatography 1104: 291-298.

MEISER, A., SCHMID-STAIGER, U., TRÖSCH, W. (2004). Optimization of eicosapenta-enoic acid production by Phaeodactylum tricornutum the flat panel airlift (FPA) reactor. Journal of Applied Phycology 16: 215-225.

MICHAELSON, L.V., NAPIER, J.A., LEWIS, M.J., GRIFFITHS, G., LAZARUS, C.M., STOBART, A.K. (1998). Functional characterization of a fatty acid ∆5 desaturase gene from Caenorhabditis elegans. FEBS letters 439: 215-218.

MOCK, T., KROON, B.M.A. (2002). Photosynthetic energy conversion under extreme conditions-I: important role of lipids as structural modulators and energy sink under N-limited growth in Antarctic sea ice diatoms. Phytochemistry 61: 41-51.

MONGRAND, S., BADOC, A., PATOUILLE, B., LACOMBLEZ, C., CHAVENT, M., CASSAGNE, C., BESSOULE, J.-J. (2001). Taxonomy of gymnospermae: multivariate analyses of leaf fatty acid composition. Phytochemistry101-115.

MORRIS, M.C., TAYLOR, J.O., STAMPFER, M.J., ROSNER, B., SACKS, F. (1993). The effect of fish oil on blood pressure in mild hypersensitive subjects: a randomized crossover trial. American Journal of Clinical Nutrition 57: 59-64.

NAPIER, J.A., MICHAELSON, L.V. (2001). Towards the production of pharmaceutical fatty acids in transgenic plants. Journal of the Science of Food and Agriculture 81: 883-888.

NAPIER, J.A., BEAUDOIN, F., MICHAELSON, L.V., SAYANOVA, O.V. (2004). The production of long chain polyunsaturated fatty acids in transgenic plants by reverse-engineering. Biochimie 86: 785-793.

NAYLOR, R.L., GOLDBURG, R.J., PRIMAVERA, J.H., KAUTSKY, N., BEVERIDGE, M.C.M., CLAY, J., FOLKE, C., LUBCHENCO, J., MOONEY, H., TROELL, M. (2000). Effect of aquaculture on world fish supplies. Nature 405: 1017-1024.

8. Literatur

113

NOBLE, R.C., COCCHI, M., TURCHETTO, E. (1990). Egg fat - a case for concern? World´s Poultry Science Journal 46: 109-118.

O´BRIEN, D.J., KURANTZ, M., KWOCZAK, R. (1993). Production of eicosapentaenoic acid by the filamentous fungus Pythium irregulare. Applied Microbiology and Biotechnology 40: 211-214.

OH, S.Y., RYUE, J., HSIEH, C.-H., BELL, D.E. (1991). Eggs enriched in n-3 fatty acids and alterations in lipid concentrations in plasma and lipoproteins and in blood pressure. American Journal of Clinical Nutrition 54: 689-695.

PACETTI, D., HULAN, H.W., SCHREINER, M., BOSELLI, E., FREGA, N.G. (2005). Positional analysis of egg triacylglycerols from hens fed diets enriched with refined seal blubber oil. Journal of the Science of Food and Agriculture 85: 1703-1714.

PESSARAKLI, M., TUCKER, T.C. (1985). Uptake of nitrogen-15 by cotton under salt stress. Journal of the Soil Science Society of America 49: 149-152.

PESSARAKLI, M., TUCKER, T.C. (1988). Nitrogen-15 uptake by eggplant under sodium chloride stress. Journal of the Soil Science Society of America 52: 1673-1676.

PFEFFER, H. (1999). Aufnahme von Bor in die Wurzel und Translokation von Bor in den Spross von Sonnenblumen (Helianthus annuus L.) mit unterschiedlichem Borversorgungsgrad: Mögliche Mechanismen und Regulation. Institut für Pflanzenernährung. Stuttgart-Hohenheim, Universität Hohenheim.

PIEPHO, H.P., BÜCHSE, A., EMRICH, K. (2003). A hitchhiker´s guide to mixed moldels for randomized experiments. Journal of Agronomy and Crop Science 189: 310-322.

QI, B., BEAUDOIN, F., FRASER, T., STOBART, A.K., NAPIER, J.A., LAZARUS, C.M. (2002). Identification of a cDNA encoding a novel C18-∆9 polyunsaturated fatty acid-specific elongating activity from the docosahexaenoic acid (DHA)-producing microalga, Isochrysis galbana. FEBS letters 510: 159-165.

QI, B. (2004). Production of very long chain polyunsaturated omega-3 and omega-6 fatty acids in plants. Nature Biotechnology 22: 739-745.

RANI PALANISWAMY, U., MCAVOY, R.J., BIBLE, B.B. (2000). Omega-3-fatty acid concen-tration in Portulaca oleracea is altered by nitrogen source in hydroponic solu-tion. Journal of the American Society of Horticultural Science 125: 190-194.

REUTER, D.J., ROBINSON, J.B., DUTKIEWICZ, C., Eds. (1997). Plant analysis: an inter-pretation manual. Collingwood, VIC 3066, CSIRO.

RICHTER, G., KÖHLER, H. (1998). Leinsaat erhöht Omega-3-Fettsäuren im Ei. Deutsche Gesellschaft für Saatgut intern 50: 5-6.

ROBERT, S.S. (2006). Production of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acid-containing oils in transgenic land plants for human and aquaculture nutrition Marine Biotechnology 8: 103-109.

8. Literatur

114

ROZYNEK, B. (2000). Biologie des falschen Mehltaus (Plasmopara halstedii) der Sonnenblume (Helianthus annuus) und seine Verbreitung in Süddeutschland. Institut für Botanik. Stuttgart-Hohenheim, Hohenheim: 107.

ROZYNEK, B., SPRING, O. (2001). Leaf disk inoculation, a fast and precise test for the screening of metalaxyl tolerance in sunflower downy mildew. Journal of Phytopathology 149: 309-312.

SACHS, L., HEDDERICH, Eds. (2006). Angewandte Statistik, Springer Verlag.

SANDERS, T.A.B., LEWIS, F., SLAUGHTER, S., GRIFFIN, B.A., GRIFFIN, M., DAVIES, I., MILLWARD, D.J., COOPER, J.A., MILLER, G.J. (2006). Effect of varying the ratio of n-6 to n-3 fatty acids by increasing the dietary intake of α-linolenic acid, eicosapentaenoic and docosahexaenoic acid, or both on fibrinogen and clotting factors VII and XII in persons aged 45-70 y: the OPTILIP Study1-3. American Journal of Clinical Nutrition 84: 513-522.

SANDERSON, P., FINNEGAN, Y.E., WILLIAMS, C.M., CALDER, P.C., BURDGE, G.C., WOOTTON, S.A., GRIFFIN, B.A., MILLWARD, D.J., PEGGE, N.C., BERNELMANS, W.J.E. (2002). UK food standards agency α-linolenic acid workshop report. British Journal of Nutrition 88: 573-579.

SANINA, N.M., GONCHAROVA, S.N., KOSTETSKY, E.Y. (2008). Seasonal changes of fatty acid composition and thermotropic behavior of polar lipids from marine macrophytes. Phytochemistry 69: 1517-1527.

SAYANOVA, O.V., NAPIER, J.A. (2004). Eicosapentaenoic acid: biosynthesis routes and the potential for synthesis in transgenic plants. Phytochemistry147-158.

SCHÄUFFELE, D. (2005). Taxonomische und phylogenetische Nutzung von Fettsäure-mustern in der Systematik von Peronosporomycetidae. Institut für Botanik. Stuttgart-Hohenheim, Hohenheim.

SCHERM, H., PRYOR, B., VAN BRUGGEN, A.H.C. (1993). Effects of ozonated water on sporangial germination of Bremia lactucae in vitro and in vivo. Tests of agro-chemicals and cultivars: TAC/ Association of Applied Biologists 14: 40-41.

SCHNEIDER, M. (2001). Phospholipids for functional food. European Journal of Lipid Science and Technology 103: 98-101.

SCHOLTYSSEK, S. (1991). Fütterungseinflüsse auf den Cholesteringehalt im Ei. Lohmann Information. 11/12: 13-16.

SCHOMBURG, G., Ed. (1987). Gaschromatographie. Weinheim, Verlag Chemie.

SCHREINER, M., HULAN, H.W., RAZZAZI-FAZELI, E., BÖHM, J., IBEN, C. (2004). Feeding laying hens seal blubber oil: effect on egg yolk incorporation, stereospecific distribution of omega-3 fatty acids and sensory aspects. Poultry Science 83: 462-473.

SCHREINER, M. (2005). Quantification of long chain polyunsaturated fatty acids by gas chromatography - Evaluation of factors affecting accuracy. Journal of Chromatography 1095: 126-130.

8. Literatur

115

SCHREINER, M., MOREIRA, R.G., HULAN, H.W. (2005). Positional distribution of fatty acids in egg yolk lipids. Journal of Food Lipids 13: 36-56.

SENGER, T., WICHARD, T., KUNZE, S., GÖBEL, C., LERCHL, J., POHNERT, G., FEUSSNER, I. (2005). A multifunctional lipoxygenase with fatty acid hydroperoxide cleaving activity from the moss Physcomitrella patens. The Journal of Biological Chemistry 280: 7588-7596.

SHANTHA, N.C., NAPOLITANO, G.E. (1992). Gas chromatography of fatty acids. Journal of Chromatography 624: 37-51.

SIMOPOULOS, A.P., SALEM, N. (1986). Purslane: A terrestrial source of omega-3-fatty acids. New England Journal of Medicine 315: 833.

SIMOPOULOS, A.P. (1989). Summary of the NATO advanced research workshop on dietary n-3 and n-6 fatty acids: Biological effects and nutritional essentiality. Journal of Nutrition 119: 521-528.

SIMOPOULOS, A.P., SALEM, N. (1989). n-3 fatty acids in eggs from range-fed Greek chickens. New England Journal of Medicine 321: 1412-1415.

SIMOPOULOS, A.P., SALEM, N. (1992). Egg yolk as a source of long-chain polyunsaturated fatty acids in infant feeding. American Journal of Clinical Nutrition411-4.

SIMOPOULOS, A.P. (1995). Purslane in human nutrition and its potential for world agriculture. World Review of Nutrition and Diet 77: 47-74.

SIMOPOULOS, A.P. (1999). Essential fatty acids in health and chronic disease. American Journal of Clinical Nutrition 70: 560S-569S.

SIMOPOULOS, A.P. (2001). The mediterranean diets: What is so special about the diet of Greece? The scientific evidence. Journal of Nutrition 131: 3065S-3073S.

SIMOPOULOS, A.P. (2002). Omega-3 fatty acids in inflammation and autoimmune diseases. Journal of the American College of Nutrition 21: 495-505.

SINGH, A., WARD, O.P. (1998). Docosapentaenoic acid (C22:5, ω-3) production by Pythium acanthicum. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 20: 187-191.

SINNHUBER, R.O., YU, T.C. (1958). Characterization of the red pigment formed in the 2-thiobarbituric acid determination of oxidative rancidity. Food Research 23: 626-634.

SIRTORI, C.R., Ed. (1994). Effects of unsaturated fatty acids on high density lipopro-tein metabolism. Effects on fatty acids and lipids in health and disease. Basel, Karger Verlag.

SPERLING, P., HEINZ, E. (2001). Desaturases fused to their electron donor. European Journal of Lipid Science and Technology 103: 158-180.

8. Literatur

116

SPRING, O., ROZYNEK, B., ZIPPER, R. (1997). Leaf disk inoculation - a useful tool for selecting infections of sunflower downy mildew at low inoculum concentration, but inappropriate to pathotype characterization. Journal of Phytopathology 145: 189-191.

SPRING, O., ROZYNEK, B., ZIPPER, R. (1998). Single spore infections with sunflower downy mildew. Journal of Phytopathology 146: 577-579.

SPRING, O., HAAS, K. (2002). The fatty acid composition of Plasmopara halstedii and its taxonomic significance. European Journal of Plant Pathology 108: 263-267.

SPRING, O., THINES, M. (2004). On the necessity of new characters for classification and systematics of biotrophic Peronosporomycetes. Planta 10.1007: 1-7.

SPRING, O., HAAS, K., LAMLA, I., THURNHOFER, S., VETTER, W. (2005). The composition and taxonomic significance of fatty acid patterns in three white rust species: Albugo amaranthi, A. candida and A. tragopogonis (Peronosporales, Albuginaceae). Mycological Progress 4: 179-184.

SPRING, O., BACHOFER, M., THINES, M., RIETHMÜLLER, A., GÖKER, M., OBERWINKLER, F. (2006). Intraspecific relationship of Plasmopara halstedii isolates differing in pathogenicity and geographic origin based on ITS sequence data. European Journal of Plant Pathology 114: 309-315.

STEINHILBER, S. (2003). Einfluss von genetischem Typ, Legeabschnitt und Futterfett auf die Anreicherung von Hühnereiern mit Omega-3-Fettsäuren und die Auswirkungen auf die Produktqualität. Institut für Tierhaltung und Tierzüchtung, Fachgebiet Nutztierethologie und Kleintierzucht. Stuttgart-Hohenheim, Stuttgart-Hohenheim: 113.

STULNIG, T.M. (2003). Immunomodulation by polyunsaturated fatty acids: mechan-isms and effects. International Archives of Allergy and Immunology 132: 310-321.

SU, H., VAN BRUGGEN, A.H.C., SUBBARAO, K.V. (2000). Spore release of Bremia lactucae on lettuce is affected by timing of light initiation and decrease in relative humidity. Phytopathology 90: 67-71.

SU, H., VAN BRUGGEN, A.H.C., SUBBARAO, K.V., SCHERM, H. (2004). Sporulation of Bremia lactucae affected by temperature, relative humidity, and wind in con-trolled conditions. Phytopathology 94: 396-401.

THURNHOFER, S. (2007). Concentrations and enantioselectivity of anteiso-fatty acids in food. Institut für Lebensmittelchemie. Stuttgart-Hohenheim, Stuttgart-Hohen-heim.

TONON, T., HARVEY, D., LARSON, T.R., GRAHAM, I.A. (2002). Long chain polyunsatu-rated fatty acid production and partitioning to triacylglycerols in four microalgae. Phytochemistry15-24.

TONON, T., SAYANOVA, O.V., MICHAELSON, L.V., QING, R., HARVEY, D., LARSON, T.R., NAPIER, J.A., GRAHAM, I.A. (2005). Fatty acid desaturases from the microalga Thalassiosira pseudonana. FEBS Journal 272: 3401-3412.

8. Literatur

117

TRAUTWEIN, E.A. (2001). n-3 fatty acids - physiological and technical aspects for their use in food. European Journal of Lipid Science and Technology 103: 45-55.

TRIPODI, K.E.J., BUTTIGLIERO, L.V., ALTABE, S.G., UTTARO, A.D. (2006). Functional characterization of front-end desaturases from trypynosomatids depicts the first polyunsaturated fatty acid biosythetic pathway from a parasitic protozoan. FEBS Journal 273: 271-290.

UAUY, R., CASTILLO, C. (2003). Lipid requirements of infants: implications for nutrient composition of fortified complementary foods. Journal of Nutrition 133: 2962S-2972S.

ULBERTH, F., GABERNIG, R.G., SCHRAMMEL, F. (1999). Flame-Ionization detector res-ponse to methyl, ethyl, propyl, and butyl esters of fatty acids. Journal of the American Oil Chemists Society 76: 263-266.

URSIN, V.M. (2003). Modification of plant lipids for human health: development of functional land-based omega-3 fatty acids. Journal of Nutrition 133: 4271-4274.

VELASCO, L., GOFFMAN, F.D. (1999). Chemotaxonomic significance of fatty acids and tocopherols in Boraginaceae. Phytochemistry 52: 423-426.

WARD, O.P., SINGH, A. (2005). Omega-3/6 fatty acids: Alternative sources of produc-tion. Process Biochemistry 40: 3627-3652.

WEBSTER, R. (2001). Statistics to support soil research and their presentation. Euro-pean Journal of Soil Science 52: 331-340.

WILLIAMS, C.M. (2000). Dietary fatty acids and human health. Annals of Zootechno-logy 49: 165-180.

WOLFRUM, C., SPENER, F. (2000). Fatty acids as regulators of lipid metabolism. European Journal of Lipid Science and Technology 102: 746-762.

WU, G., TRUSKA, M., DATLA, N., VRINTEN, P., BAUER, J., ZANK, T., CIRPUS, P., HEINZ, E., QIU, X. (2005). Stepwise engineering to produce high yields of very long-chain polyunsaturated fatty acids in plants. Nature Biotechnology 23: 1013-1017.

YONGMANITCHAI, W., WARD, O.P. (1991). Growth of and omega-3 fatty acid production by Phaeodactylum tricornutum under different culture conditions. Applied Environmental Microbiology 57: 419-25.

9. Anhang

118

9. Anhang I: Berechnete und in der Untersuchung verwendeten Responsefaktoren von 7 Injektionen und deren Mittelwert mit der Bezugsbasis C 20:0.

Fettsäure Injektionen Mittelwert

1 2 3 4 5 6 7 C12:0 0,67 0,59 0,57 0,59 0,62 0,60 0,59 0,60 C13:0 0,71 0,65 0,64 0,64 0,67 0,65 0,63 0,66 C14:0 0,74 0,70 0,68 0,71 0,73 0,69 0,69 0,71 C14:1 0,72 0,68 0,68 0,68 0,73 0,71 0,67 0,69 C15:0 0,83 0,74 0,73 0,73 0,82 0,74 0,73 0,76 C15:1 0,77 0,73 0,72 0,73 0,79 0,73 0,72 0,74 C16:0 0,85 0,79 0,79 0,80 0,83 0,79 0,80 0,81 C16:1 0,84 0,77 0,76 0,79 0,78 0,77 0,77 0,78 C17:0 0,90 0,83 0,82 0,85 0,88 0,83 0,82 0,85 C17:1 0,86 0,84 0,83 0,81 0,87 0,84 0,80 0,84 C18:0 0,94 0,90 0,88 0,91 0,93 0,89 0,90 0,91 C18:1n9t 0,90 0,89 0,87 0,91 0,94 0,91 0,91 0,90 C18:1n9c 0,92 0,89 0,87 0,90 0,93 0,90 0,89 0,90 C 18:2n6t 0,88 0,87 0,84 0,87 0,92 0,86 0,87 0,87 C18:2n6c 0,87 0,87 0,86 0,86 0,89 0,84 0,87 0,87 C18:3n6 0,93 0,82 0,86 0,83 0,88 0,84 0,84 0,86 C18:3n3 0,87 0,82 0,84 0,83 0,84 0,84 0,84 0,84 C20:0 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 C20:1n9 1,04 0,99 0,96 1,00 0,97 0,98 0,99 0,99 C20:2 0,97 0,96 0,98 0,98 0,98 0,97 0,99 0,97 C 20:3n6 1,04 1,00 0,94 0,98 1,04 1,00 0,99 1,00 C21:0 1,00 0,98 0,94 0,97 1,02 0,96 0,97 0,98 C20:4n6 1,00 0,91 0,90 0,90 0,91 0,89 0,90 0,91 C20:3n3 0,96 0,93 0,92 0,92 0,98 0,92 0,92 0,94 C20:5n3 0,91 0,91 0,91 0,87 0,87 0,89 0,89 0,89 C22:0 1,11 1,14 1,09 1,09 1,13 1,11 1,11 1,11 C22:1n9 1,23 1,10 1,07 1,10 1,08 1,12 1,11 1,12 C 22:2 1,00 1,06 1,04 1,05 1,02 1,05 1,08 1,04 C23:0 1,20 1,15 1,12 1,14 1,15 1,16 1,13 1,15 C 24:0 1,19 1,25 1,22 1,18 1,23 1,20 1,20 1,21 C22:6n3 1,16 1,09 0,76 1,12 1,12 1,07 1,09 1,06 C24:1 1,05 1,10 1,36 1,10 1,09 1,11 1,07 1,12

119

V 507

RF

Fatty Acid 20.01.05 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8STAR 108 109 110 111 116 113 114 115 108 109 110 111 116 113 114 115C 12:0 0,59C 13:0 0,65C 14:0 0,71 153 217 185 229 292 160 162 182 0,38 0,47 0,63 0,47 0,54 0,46 0,45 0,55C 14:1n5 0,69C 15:0 0,75C 15:1n5 0,78C 16:0 0,82 18839 21521 15099 22069 25448 15477 16334 14830 53,97 54,37 59,51 52,11 54,32 52,05 52,75 52,45C 16:1n9cC 16:1n7tC 16:1n7c 0,77 2052 2579 1916 3069 3098 1872 2059 1648 5,48 6,07 7,04 6,75 6,16 5,87 6,20 5,43C 17:0 0,76 144 149 97 147 221 138 154 149 0,38 0,35 0,35 0,32 0,44 0,43 0,46 0,49C 17:1n7 0,86 65 242 59 92 64 35 0,19 0,64 0,24 0,23 0,22 0,13C 18:0 0,92 7091 8002 5956 7855 8339 6401 6038 5880 22,68 22,57 26,21 20,71 19,87 24,03 21,77 23,22C 18:1n9t 0,91C 18:1n9c 0,94 33830 37920 26020 40014 39818 28941 30947 24726 110,51 109,24 116,94 107,74 96,92 110,98 113,96 99,72C 18:1n7C 18:2n6t 0,93 31 30 0,10 0,11C 18:2n6c 0,88 13543 16433 9601 17292 20600 12829 15132 11724 41,53 44,44 40,50 43,70 47,06 46,18 52,30 44,38C 18:3n6 0,81 111 94 124 55 82 78 0,27 0,22 0,26 0,18 0,26 0,27C 18:3n3 0,87 651 767 442 824 966 593 721 600 1,98 2,05 1,85 2,06 2,19 2,11 2,47 2,25C 18:4n3C 20:0 1,00 7183 8145 5221 8715 9640 6119 6372 5818 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00C 20:1n9 1,01 112 148 164 168 112 131 74 0,39 0,46 0,48 0,44 0,46 0,52 0,32C 20:2n6 1,01 84 172 161 170 99 115 82 0,30 0,53 0,47 0,45 0,41 0,46 0,36C 20:3n6 1,16 103 96 70 0,37 0,32 0,33C 21:0 0,88 32 121 0,10 0,28C 20:4n6 0,82 1417 1860 1192 1909 1972 1318 1507 1168 4,06 4,70 4,70 4,51 4,21 4,44 4,87 4,13C 20:3n3 0,99C 20:5n3 0,87C 22:0 1,15C 22:1n9 1,11C 22:2n6 1,12C 23:0 1,20C 24:0 1,27 95 184 172 269 169 125 104 72 0,42 0,71 1,04 0,98 0,55 0,65 0,52 0,39C 22:5n3 127 200 92 132 237 52 139 148C 22:6n3 0,89 887 1078 710 1309 1280 865 592 784 2,76 2,96 3,04 3,36 2,97 3,16 2,08 3,01C 24:1n9 1,23

Kontrolle Kontrolle

A R E A mg / g DotterII:

Am

GC

-FID

gem

esse

ne S

igna

lfläc

hene

inhe

iten

(AR

EA

) un

d ab

solu

te F

etts

äure

konz

entr

atio

nen

(mg/

g D

otte

r) d

er E

idot

ter

der

5 H

ühne

rgru

ppen

mit

je 8

Hüh

nern

nac

h 5

Füt

teru

ngsv

aria

nten

(K

ontr

olle

, Grü

ner

Sal

at i

nfiz

iert

(S

N+

), G

rüne

r S

alat

ges

und

(SN

-),

Rot

er E

ichb

latt

infiz

iert

(R

E+

), R

oter

Eic

hbla

tt ge

sund

(R

E-)

.

9. A

nhan

g __

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

___

120

V 507

RF

Fatty Acid 20.01.05 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8STAR 134 136 137 138 139 140 141 142 134 136 137 138 139 140 141 142C 12:0 0,59C 13:0 0,65C 14:0 0,71 212 181 168 164 265 0,40 0,49 0,44 0,44 0,00 0,72C 14:1n5 0,69C 15:0 0,75C 15:1n5 0,78C 16:0 0,82 24936 15725 13909 15184 14561 10810 15021 15974 54,30 49,12 47,07 46,60 44,87 49,78 47,42 54,97C 16:1n9cC 16:1n7tC 16:1n7c 0,77 2168 1744 1392 1570 1687 1227 1818 1292 4,40 5,08 4,39 4,49 4,84 5,27 5,35 4,14C 17:0 0,76 355 189 183 198 152 130 159 186 0,71 0,55 0,57 0,56 0,43 0,55 0,46 0,59C 17:1n7 0,86 83 73 69 68 69 0,27 0,26 0,22 0,33 0,23C 18:0 0,92 23274 7418 5817 7512 5967 4882 6198 6442 56,58 25,87 21,98 25,74 20,53 25,10 21,84 24,75C 18:1n9t 0,91C 18:1n9c 0,94 41212 31037 22609 28334 26084 20205 26978 22916 102,33 110,56 87,26 99,16 91,65 106,11 97,12 89,92C 18:1n7C 18:2n6t 0,93C 18:2n6c 0,88 30582 21516 16955 19974 17302 13229 17272 15610 71,28 71,94 61,42 65,61 57,06 65,21 58,36 57,49C 18:3n6 0,81 155 110 79 88 98 60 0,33 0,34 0,26 0,26 0,30 0,19C 18:3n3 0,87 2099 1528 1174 1436 1160 835 1191 1125 4,85 5,06 4,21 4,67 3,79 4,08 3,99 4,11C 18:4n3 33C 20:0 1,00 9450 6587 6080 6705 6678 4468 6518 5980 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00C 20:1n9 1,01 116 86 121 98 55 100 88 0,45 0,36 0,46 0,37 0,31 0,39 0,37C 20:2n6 1,01 240 203 148 146 127 97 127 100 0,64 0,78 0,62 0,55 0,48 0,55 0,49 0,42C 20:3n6 1,16 111 47 62 88 67 70 0,49 0,22 0,27 0,38 0,31C 21:0 0,88C 20:4n6 0,82 1976 1570 1069 1342 1201 935 1208 1181 4,31 4,91 3,62 4,12 3,70 4,31 3,82 4,07C 20:3n3 0,99C 20:5n3 0,87C 22:0 1,15C 22:1n9 1,11C 22:2n6 1,12C 23:0 1,20C 24:0 1,27 78 77 112 71 56 87 88 0,37 0,40 0,53 0,34 0,40 0,42 0,47C 22:5n3 105 107 100 121 94 98 127C 22:6n3 0,89 1779 1097 905 1198 1128 737 911 861 4,21 3,72 3,33 4,00 3,78 3,69 3,13 3,22C 24:1n9 1,23

SN - SN -


Am

GC

-FID

gem

esse

ne S

igna

lfläc

hene

inhe

iten

(AR

EA

) un

d ab

solu

te F

etts

äure

konz

entr

atio

nen

(mg/

g D

otte

r) d

er E

idot

ter

der

5 H

ühne

rgru

ppen

mit

je 8

Hüh

nern

nac

h 5

Füt

teru

ngsv

aria

nten

(K

ontr

olle

, G

rüne

r S

alat

inf

izie

rt (

SN

+),

Grü

ner

Sal

at g

esun

d (S

N-)

, R

oter

Eic

hbla

tt in

fizie

rt (

RE

+),

Rot

er E

ichb

latt

gesu

nd

(RE

-).

9. A

nhan

g __

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

_

121

V 507

RF

Fatty Acid 20.01.05 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8STAR 126 127 128 129 130 131 132 133 126 127 128 129 130 131 132 133C 12:0 0,59C 13:0 0,65C 14:0 0,71 210 156 164 152 0,44 0,39 0,43 0,40C 14:1n5 0,69C 15:0 0,75 32 0,07C 15:1n5 0,78C 16:0 0,82 21163 16241 16221 15759 14307 12830 15089 16038 51,27 50,30 46,76 47,93 41,74 51,55 50,05 49,24C 16:1n9cC 16:1n7tC 16:1n7c 0,77 2118 1655 1537 1486 1391 1211 1461 1673 4,78 4,78 4,13 4,21 3,78 4,53 4,52 4,79C 17:0 0,76 272 214 214 214 189 155 188 232 0,61 0,61 0,57 0,60 0,51 0,58 0,58 0,66C 17:1n7 0,86 104 80 69 72 0,26 0,26 0,21 0,23C 18:0 0,92 9218 7722 8034 7296 6845 5772 6425 6966 24,93 26,70 25,86 24,78 22,30 25,89 23,79 23,88C 18:1n9t 0,91C 18:1n9c 0,94 35811 29696 31096 27349 25120 21656 26746 29843 98,93 104,88 102,22 94,86 83,57 99,23 101,16 104,49C 18:1n7C 18:2n6t 0,93C 18:2n6c 0,88 26033 19751 19626 18899 17096 15593 17620 20548 67,50 65,47 60,56 61,53 53,39 67,06 62,55 67,53C 18:3n6 0,81 149 84 81 87 80 63 58 81 0,35 0,25 0,23 0,26 0,23 0,25 0,19 0,24C 18:3n3 0,87 1718 1210 1256 1208 1072 1005 1172 1396 4,41 3,97 3,84 3,90 3,32 4,28 4,12 4,55C 18:4n3C 20:0 1,00 8494 6644 7138 6765 7053 5121 6204 6702 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00C 20:1n9 1,01 147 83 110 111 91 93 106 136 0,44 0,32 0,39 0,41 0,33 0,46 0,43 0,51C 20:2n6 1,01 213 102 130 156 134 115 130 192 0,63 0,39 0,46 0,58 0,48 0,57 0,53 0,72C 20:3n6 1,16 114 119 72 97 56 97 0,46 0,51 0,29 0,55 0,26 0,42C 21:0 0,88 154 0,40C 20:4n6 0,82 2003 1421 1540 1340 1237 1178 1176 1223 4,86 4,40 4,44 4,08 3,61 4,74 3,90 3,76C 20:3n3 0,99 41 0,12C 20:5n3 0,87 41 0,13C 22:0 1,15 50 0,22C 22:1n9 1,11C 22:2n6 1,12C 23:0 1,20C 24:0 1,27 95 50 86 89 0,35 0,22 0,40 0,42C 22:5n3 216 122 70 30 117 152C 22:6n3 0,89 1487 1444 941 1069 965 903 902 1246 3,91 4,86 2,95 3,53 3,06 3,94 3,25 4,16C 24:1n9 1,23

RE + RE +


Am

GC

-FID

gem

esse

ne S

igna

lfläc

hene

inhe

iten

(AR

EA

) un

d ab

solu

te F

etts

äure

konz

entr

atio

nen

(mg/

g D

otte

r) d

er E

idot

ter

der

5 H

ühne

rgru

ppen

mit

je 8

Hüh

nern

nac

h 5

Füt

teru

ngsv

aria

nten

(K

ontr

olle

, G

rüne

r S

alat

infiz

iert

(S

N+

), G

rüne

r S

alat

ges

und

(SN

-), R

oter

Eic

hbla

tt in

fizie

rt (

RE

+),

Rot

er E

ichb

latt

gesu

nd

(R

E-)

.

9. A

nhan

g __

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

_

122

V 507

RF

Fatty Acid 20.01.05 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8STAR 117 119 120 121 122 123 124 125 117 119 120 121 122 123 124 125C 12:0 0,59C 13:0 0,65C 14:0 0,71 125 164 103 117 134 126 0,37 0,50 0,30 0,31 0,36 0,40C 14:1n5 0,69C 15:0 0,75 91 0,28C 15:1n5 0,78 26 0,08C 16:0 0,82 13024 14593 14198 14829 14795 14499 14715 11828 44,31 51,24 48,68 52,21 45,86 45,64 53,82 45,27C 16:1n9cC 16:1n7tC 16:1n7c 0,77 1503 1505 1392 1347 1222 1537 1259 1265 4,76 4,92 4,45 4,42 3,53 4,51 4,29 4,51C 17:0 0,76 216 187 173 106 233 220 206 187 0,68 0,61 0,55 0,35 0,67 0,64 0,70 0,66C 17:1n7 0,86 134 51 34 26 69 40 0,48 0,18 0,13 0,09 0,26 0,16C 18:0 0,92 6079 6603 6341 6039 6863 6439 6435 5505 23,09 25,89 24,27 23,74 23,75 22,63 26,28 23,52C 18:1n9t 0,91C 18:1n9c 0,94 24071 26567 23867 24827 24682 25638 22901 19739 93,39 106,38 93,31 99,69 87,24 92,03 95,52 86,16C 18:1n7C 18:2n6t 0,93 31 0,12C 18:2n6c 0,88 16155 17124 13759 15701 19333 18743 18427 14609 58,83 64,36 50,49 59,17 64,14 63,15 72,14 59,85C 18:3n6 0,81 118 87 74 81 99 94 41 0,39 0,30 0,25 0,25 0,31 0,34 0,15C 18:3n3 0,87 1169 1234 918 987 1365 1304 1362 1009 4,22 4,60 3,34 3,69 4,49 4,35 5,28 4,10C 18:4n3C 20:0 1,00 6048 5860 6002 5844 6639 6537 5626 5376 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00C 20:1n9 1,01 139 103 86 97 123 102 83 0,58 0,44 0,36 0,42 0,47 0,39 0,37C 20:2n6 1,01 177 135 129 137 207 137 149 95 0,74 0,58 0,54 0,59 0,79 0,53 0,67 0,45C 20:3n6 1,16 30 103 72 99 124 84 88 65 0,14 0,51 0,35 0,49 0,54 0,37 0,45 0,35C 21:0 0,88 102 0,37C 20:4n6 0,82 1236 1459 1049 1137 1344 1236 1137 1125 4,21 5,13 3,60 4,01 4,17 3,89 4,16 4,31C 20:3n3 0,99 49 0,20C 20:5n3 0,87 23 0,08C 22:0 1,15C 22:1n9 1,11C 22:2n6 1,12C 23:0 1,20C 24:0 1,27 100 33 64 53 0,00 0,54 0,17 0,31 0,31C 22:5n3 152 128 86 196 79 63C 22:6n3 0,89 1010 1028 810 843 958 1077 955 900 3,73 3,92 3,02 3,23 3,23 3,68 3,80 3,74C 24:1n9 1,23

RE - RE -


Am

GC

-FID

gem

esse

ne S

igna

lfläc

hene

inhe

iten

(AR

EA

) un

d ab

solu

te F

etts

äure

konz

entr

atio

nen

(mg/

g D

otte

r) d

er E

idot

ter

der

5 H

ühne

rgru

ppen

mit

je 8

Hüh

nern

nac

h 5

Füt

teru

ngsv

aria

nten

(K

ontr

olle

, G

rüne

r S

alat

infiz

iert

(S

N+

), G

rüne

r S

alat

ges

und

(SN

-), R

oter

Eic

hbla

tt in

fizie

rt (

RE

+),

Rot

er E

ichb

latt

gesu

nd

(RE

-).

9. A

nhan

g __

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

_

123

V 507

RF

Fatty Acid 20.01.05 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8STAR 143 145 146 147 148 149 150 151 143 145 146 147 148 149 150 151C 12:0 0,59C 13:0 0,65C 14:0 0,71 157 127 110 144 117 159 142 138 0,38 0,38 0,37 0,49 0,45 0,50 0,49 0,45C 14:1n5 0,69C 15:0 0,75 41 0,15C 15:1n5 0,78C 16:0 0,82 16654 14977 13317 14142 11825 14822 13279 14350 46,79 52,15 52,43 56,33 52,74 53,91 52,85 53,83C 16:1n9cC 16:1n7tC 16:1n7c 0,77 1787 1281 1367 1488 1226 1533 1404 1295 4,68 4,16 5,02 5,52 5,09 5,20 5,21 4,53C 17:0 0,76 205 159 146 147 102 166 93 136 0,53 0,51 0,53 0,54 0,42 0,56 0,34 0,47C 17:1n7 0,86 66 59 66 0,27 0,25 0,26C 18:0 0,92 7842 5820 5837 5753 4737 5875 4921 5585 24,60 22,63 25,66 25,58 23,58 23,86 21,87 23,39C 18:1n9t 0,91C 18:1n9c 0,94 31616 24314 22348 23546 19758 24378 22436 23785 101,29 96,55 100,34 106,95 100,48 101,12 101,83 101,75C 18:1n7 21C 18:2n6t 0,93C 18:2n6c 0,88 19485 18234 16383 15849 14967 16190 13785 16581 58,59 67,96 69,04 67,57 71,44 63,03 58,73 66,58C 18:3n6 0,81 73 113 73 73 41 0,20 0,39 0,28 0,26 0,16C 18:3n3 0,87 1964 1165 1150 1026 1076 1058 906 1177 5,85 4,30 4,80 4,33 5,09 4,08 3,82 4,68C 18:4n3C 20:0 1,00 7324 5909 5226 5166 4614 5657 5170 5485 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00C 20:1n9 1,01 122 129 97 102 88 104 95 97 0,42 0,55 0,47 0,50 0,48 0,46 0,46 0,45C 20:2n6 1,01 175 166 131 120 115 146 114 140 0,60 0,71 0,63 0,59 0,63 0,65 0,56 0,65C 20:3n6 1,16 137 82 98 82 54 0,67 0,46 0,50 0,46 0,28C 21:0 0,88C 20:4n6 0,82 1520 1305 1068 1199 965 1312 992 1178 4,27 4,55 4,21 4,78 4,31 4,78 3,95 4,42C 20:3n3 0,99C 20:5n3 0,87C 22:0 1,15C 22:1n9 1,11C 22:2n6 1,12C 23:0 1,20C 24:0 1,27 68 43 67 44 47 76 0,36 0,26 0,41 0,25 0,29 0,44C 22:5n3 89 96 112 70 100 112 55C 22:6n3 0,89 990 932 797 877 665 922 776 771 3,02 3,53 3,41 3,80 3,22 3,64 3,36 3,14C 24:1n9 1,23

SN + SN +


Am

GC

-FID

gem

esse

ne S

igna

lfläc

hene

inhe

iten

(AR

EA

) un

d ab

solu

te F

etts

äure

konz

entr

atio

nen

(mg/

g D

otte

r) d

er E

idot

ter

der

5 H

ühne

rgru

ppen

mit

je 8

Hüh

nern

nac

h 5

Füt

teru

ngsv

aria

nten

(K

ontr

olle

, G

rüne

r S

alat

infiz

iert

(S

N+

), G

rüne

r S

alat

ges

und

(SN

-), R

oter

Eic

hbla

tt in

fizie

rt (

RE

+),

Rot

er E

ichb

latt

gesu

nd

(R

E-)

.

9. A

nhan

g __

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

__

Aus dem Institut für Pflanzenernährung Fachgebiet ... · Aus dem Institut für Pflanzenernährung...

Documents

Transcript of Aus dem Institut für Pflanzenernährung Fachgebiet ... · Aus dem Institut für Pflanzenernährung...