aus dem Institut für Pharmakologie, Toxikologie und ... · Professor Dr. Gerd Bicker Institut für...

ISBN 978-3-86345-151-6

Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375

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Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek

Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der

Deutschen Nationalbibliografie;

Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.

1. Auflage 2013

© 2013 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH,

Gießen

Printed in Germany

ISBN 978-3-86345-151-6

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0641/24466

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www.dvg.de

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

Tierärztliche Hochschule Hannover

Zentrum für Systemische Neurowissenschaften Hannover

Fokale Substanzapplikation und Neurotransplantation zur Therapie

pharmakoresistenter Epilepsien

These

zur Erlangung des Grades eines DOCTOR OF PHILOSOPHY

- PhD-

im Fachgebiet Pharmakologie

durch die

Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von

Sonja Christina Bröer

Bremen

Hannover 2013

Wissenschaftliche Betreuung: Professor Dr. Wolfgang Löscher (Supervisor)

Professor Dr. Gerd Bicker

Professor Dr. Konstantin Wewetzer

1. Gutachten: Professor Dr. Wolfgang Löscher

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und

Pharmazie

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Professor Dr. Gerd Bicker

Institut für Tierökologie und Zellbiologie

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Professor Dr. Konstantin Wewetzer

Institut für Funktionelle und Angewandte

Neuroanatomie

Medizinische Hochschule Hannover

2. Gutachten: Professorin Dr. Angelika Richter

Institut für Pharmakologie, Pharmazie und

Toxikologie

Veterinärmedizinische Fakultät Leipzig

Tag der mündlichen Prüfung: 12. April 2013

unterstützt durch ein Promotionsstipendium der Studienstiftung des deutschen Volkes e.V.

Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht:

BRÖER, S., B. BACKOFEN-WEHRHAHN, M. BANKSTAHL, L. GEY, M. GERNERT und

W. LÖSCHER (2012).

Vigabatrin for focal drug delivery in epilepsy: bilateral microinfusion into the subthalamic

nucleus is more effective than intranigral or systemic administration in a rat seizure model.

Neurobiol Dis 46: 362-76.

Für weitere Veröffentlichungen und Kongressbeiträge s. Publikationsverzeichnis (Ab-

schnitt 11).

Die Arbeit wurde im Rahmen des PhD-Studiengangs „Systems Neuroscience“ des Zentrums

für Systemische Neurowissenschaften Hannover angefertigt und Teile der Arbeit gehören zu

Teilprojekt 5 der DFG-Forschergruppe „Neurodegeneration und -regeneration bei ZNS-

Erkrankungen des Hundes (Forschergruppe 1103).

für meine Eltern

I

INHALTSVERZEICHNIS

1. Einleitung ...................................................................................... 9

2. Stand der Forschung .................................................................. 11

2.1. Epilepsie .................................................................................................................... 11

2.1.1. Definition und Bedeutung .................................................................................. 11

2.1.2. Alternative Therapien ......................................................................................... 12

2.1.3. Tiermodelle ........................................................................................................ 13

2.2. Zielregionen für fokale Therapie ............................................................................... 14

2.2.1. Basalganglien - Anatomie und Physiologie ....................................................... 14

2.2.2. Das nigrale inhibitorische System ...................................................................... 16

2.2.3. Der Hippokampus – Anatomie und Physiologie ................................................ 17

2.3. Studie I: Fokale Substanzapplikation ........................................................................ 19

2.3.1. Substanzen für fokale Therapie .......................................................................... 19

2.3.2. Fokale Substanzapplikation in Basalganglienregionen ...................................... 21

2.3.3. Fokale Substanzapplikation in den Hippokampus ............................................. 24

2.4. Studie II: Neurotransplantation ................................................................................. 26

2.4.1. Zelltransplantation bei Epilepsie ........................................................................ 26

2.4.2. Neurotransplantation in den Hippokampus ........................................................ 27

2.4.3. Neurotransplantation in Basalganglienregionen ................................................ 28

2.4.4. Zellen für die Neurotransplantation ................................................................... 29

3. Zielsetzung und Arbeitshypothesen .......................................... 35

3.1. Studie I: Fokale Substanzapplikation ........................................................................ 35


4. Material und Methoden ............................................................. 39

4.1. Tiere ........................................................................................................................... 39

4.2. Akutes Anfallsmodell ................................................................................................ 41

4.2.1. Ablauf des PTZ-Tests ......................................................................................... 42

4.2.2. Vorabstudie: Einfluss unterschiedlicher Anästhetika auf die Anfallsschwelle .. 43

4.2.3. Einfluss des Zyklusstadiums auf die PTZ-Anfallsschwelle ............................... 43

II

4.3. Studie Ia: Fokale Applikation von Vigabatrin ........................................................... 44

4.3.1. PTZ-Anfallsschwellen ........................................................................................ 44

4.3.2. Systemische Administration von Vigabatrin ...................................................... 45

4.3.3. Fokale Applikation von Vigabatrin .................................................................... 45

4.3.4. Verhaltensbeobachtung auf Nebenwirkungen ................................................... 49

4.3.5. Fokale Vigabatrin-Applikation nach Status epileptikus ..................................... 49

4.4. Studie Ib: Fokale Applikation von Botulinumtoxin .................................................. 50


4.4.2. Botulinumtoxin ................................................................................................... 51

4.4.3. Convection-enhanced delivery ........................................................................... 51

4.4.4. Fokale Applikation von Botulinumtoxin B ........................................................ 52

4.4.5. Verhaltensversuche ............................................................................................ 55

4.4.6. Aufzeichnung des Elektroenzephalogramms (EEG) .......................................... 56



4.5.2. Studie IIa: Gewinnung und Kultivierung von GABAergen Vorläuferzellen ..... 57

4.5.3. Studie IIb: Kultivierung von NT2-Zellen ........................................................... 62

4.5.4. Zelltransplantation .............................................................................................. 63

4.5.5. Ablauf der Zelltransplantation ........................................................................... 64

4.5.6. Nachfolgestudie zu Studie IIa: Vorbehandlung der Zellen ................................ 66

4.5.7. In-vitro Studie .................................................................................................... 67

4.5.8. In-vivo Studie ..................................................................................................... 68

4.6. Histologie................................................................................................................... 68

4.7. Dekapitation............................................................................................................... 69

4.7.1. Botulinumtoxin ................................................................................................... 69

4.7.2. Neurotransplantation .......................................................................................... 70

4.8. Mikroskopie ............................................................................................................... 70

4.9. Immunhistologie ........................................................................................................ 71

4.9.1. GABAerge Vorläuferzellen ................................................................................ 71

4.9.2. NT2-Zellen ......................................................................................................... 73

4.9.3. Konfokale Mikroskopie ...................................................................................... 74

III

4.9.4. Quantitative Auswertung .................................................................................... 74

4.10. Statistische Auswertung ......................................................................................... 75

5. Ergebnisse .................................................................................... 76

5.1. Vorab-Studie: Einfluss des Anästhetikums auf die PTZ-Schwelle ........................... 76

5.2. Einfluss des Zyklusstadiums auf die Anfallsschwellen ............................................. 77

5.3. Studie Ia: Fokale Applikation von Vigabatrin ........................................................... 77

5.3.1. Auswirkungen von Vigabatrin auf die PTZ-Anfallsschwelle ............................ 77

5.3.2. Nebenwirkungen ................................................................................................ 90

5.3.3. Spezifität der Zielregionen bei fokaler Applikation ........................................... 93

5.3.4. Akute fokale Applikation von Vigabatrin nach Status epileptikus .................... 95

5.4. Studie Ib: Fokale Substanzapplikation von Botulinumtoxin B ................................. 97

5.4.1. Schwellenänderungen nach Botulinumtoxin B .................................................. 97

5.4.2. Nebenwirkungen ................................................................................................ 99

5.4.3. Verhaltenstests ................................................................................................. 100

5.4.4. EEG-Aufnahmen .............................................................................................. 101

5.5. Studie IIa: Neurotransplantation GABAerger Vorläuferzellen ............................... 104

5.5.1. Gewinnung, Kultivierung und Transplantation ................................................ 104

5.5.2. Tiergruppen ...................................................................................................... 104

5.5.3. Schwellenmessungen nach Transplantation ..................................................... 105

5.5.4. Verhaltensbeobachtung nach Transplantation ................................................. 107

5.5.5. Histologie ......................................................................................................... 107

5.5.6. Immunhistologie ............................................................................................... 109

5.5.7. Transplantation nach Status epileptikus ........................................................... 113

5.5.8. Nachfolgestudie: Vorbehandlung der GABAergen Vorläuferzellen ............... 115

5.6. Studie IIb: Neurotransplantation von NT2-Zellen ................................................... 119

5.6.1. Schwellenmessungen nach Transplantation von NT2-Zellen .......................... 119

5.6.2. Verhaltensbeobachtungen ................................................................................ 121

5.6.3. Histologie ......................................................................................................... 122

5.6.4. Immunhistologie ............................................................................................... 123

6. Diskussion .................................................................................. 124

6.1. Studie Ia: Fokale Substanzapplikation von Vigabatrin ........................................... 124

IV

6.1.1. Der subthalamische Nukleus als geeignete Zielregion für fokale Therapie ..... 124

6.1.2. Zeitverlauf der antikonvulsiven Wirkung ........................................................ 126

6.1.3. Spezifität der beobachteten Effekte auf die untersuchten Hirnregionen .......... 127

6.1.4. Gewähltes Anfallsmodell ................................................................................. 130

6.1.5. Vor- und Nachteile fokaler gegenüber systemischer Therapie ........................ 132

6.2. Studie Ib: Fokale Substanzapplikation von Botulinumtoxin B ............................... 134

6.2.1. Gewählte Zielregion ......................................................................................... 134

6.2.2. Gewähltes Anfallsmodell ................................................................................. 136

6.2.3. Gewählte Dosierung und Infusion .................................................................... 136

6.2.4. Convection-enhanced delivery ......................................................................... 137

6.2.5. Die gewählte Substanz ..................................................................................... 138

6.2.6. Verhaltensänderungen und epileptische Anfälle /EEG-Veränderungen .......... 139

6.3. Studie IIa: Neurotransplantation GABAerger Vorläuferzellen ............................... 141

6.3.1. Transplantation von GABAergen Zelllinien in Basalganglienregionen .......... 141

6.3.2. Transplantation GABAerger Vorläuferzellen .................................................. 142

6.3.3. Wahl der Zielregion für die Transplantation .................................................... 143

6.3.4. Herkunft der transplantierten Zellen ................................................................ 145

6.3.5. Überleben der transplantierten Zellen .............................................................. 146

6.3.6. Differenzierung der transplantierten Zellen ..................................................... 147

6.4. Studie IIb: Neurotransplantation von NT2-Zellen ................................................... 149

6.4.1. Transplantation von NT2-Zellen bei Epilepsien .............................................. 149

6.4.2. Transplantation von NT2-Zellen in experimentellen Tiermodellen ................ 150

6.5. Probleme der Zelltransplantation und ihrer Translation .......................................... 152

6.6. Ausblick fokale Therapien ....................................................................................... 154

7. Zusammenfassung .................................................................... 156

8. Summary ................................................................................... 158

9. Literaturverzeichnis ................................................................. 160

10. Anhang ....................................................................................... 197

10.1. Geräte und Verbrauchsmaterialien ...................................................................... 197

10.2. Medien für die Zellkultur ..................................................................................... 201

V

10.3. Antikörper ............................................................................................................ 202

10.4. Puffer und Lösungen ............................................................................................ 203

10.4.1. Stereotaktische Operation ............................................................................. 203

10.4.2. Perfusion ....................................................................................................... 203

10.4.3. Zellkultur ...................................................................................................... 204

10.4.4. Histologie...................................................................................................... 204

10.4.5. Immunhistologie ........................................................................................... 205

10.5. Färbeprotokolle .................................................................................................... 206

10.5.1. Histologische Färbungen .............................................................................. 206

10.5.2. Immunhistologische Färbungen ................................................................... 207

11. Publikationen ............................................................................ 210

12. Danksagung ............................................................................... 213

VI

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

A Ampere

Abb. Abbildung

ac anteriore Kommissur

ANOVA „Analysis of Variance“; Varianzanalyse

Aqua dest. destilliertes Wasser

aSNr anteriore Substantia nigra pars reticulata

BHS Blut-Hirn-Schranke

BSA bovines Serumalbumin

BTX Botulinumtoxin

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

CED „convection-enhanced delivery“

CM Creatinmonohydrat

cm2 Quadratzentimeter

CO2 Kohlenstoffdioxid

cp zerebraler Pedunkel

Cy2/ Cy3 Carbocyanin 2/ Carbocyanin 3

DAB 3,3’-Diaminobenzidin

d.h. das heißt

EEG Elektroenzephalogramm

EPN entopedunkulärer Nukleus

g Gramm

GABA Gamma-Aminobuttersäure

GAD Glutaminsäuredecarboxylase

GFAP „Glial Fibrillary Acidic Protein“

ic interne Kapsel

i.d.R in der Regel

KCl Kaliumchlorid

kg Kilogramm

LGE laterale ganglionische Eminenz

M molar

mA Milliampere

VII

mfb mediales Vorderhirnbündel

mg Milligramm

MGE mediale ganglionische Eminenz

min Minute

ml Milliliter

mm Millimeter

mM millimolar

ms Millisekunde

NaCl Natriumchlorid

NT2 Ntera-2

NT2/29 NT2-Zellen, die eine Woche geprimt wurden

NT2/31 NT2-Zellen, die einen Tag geprimt wurden

O2 Sauerstoff

OP Operation

PBS Phosphat-gepufferte Natriumchloridlösung

PLH pedunkulärer Teil des lateralen Hypothalamus

pSNr posteriore Substantia nigra pars reticulata

PTZ Pentylentetrazol

RA Retinsäure

s. siehe

sek Sekunde

SEM Standardfehler des Mittelwerts

SNr Substantia nigra pars reticulata

STN subthalamischer Nukleus

Tab. Tabelle

TBS tris-gepufferte Saline

VPA Valproat

VPM ventraler posteromedialer thalamischer Nukleus

VGB Vigabatrin

z.B. zum Beispiel

ZID dorsaler Teil der Zona incerta

ZIV ventraler Teil der Zona incerta

µl Mikroliter

µM mikromolar

Einleitung

9

1. EINLEITUNG

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit neuen Therapieansätzen für Epilepsien, den

häufigsten chronischen Erkrankungen des zentralen Nervensystems bei Mensch, Hund und

Katze (LÖSCHER 1994; THOMAS 2010). Epilepsien sind durch spontan auftretende,

wiederkehrende Anfälle zentralen Ursprungs charakterisiert. Üblicherweise werden Epilepsie-

patienten lebenslang mit sogenannten Antiepileptika behandelt. Dieser Begriff ist nicht ganz

korrekt, da diese Medikamente Anfälle zwar symptomatisch unterdrücken, aber nicht ursäch-

lich verhindern können. Nachteile einer Dauermedikation sind Nebenwirkungen wie Müdig-

keit, Konzentrationsschwierigkeiten, Übelkeit, ein eingeschränktes Sehvermögen oder Haut-

veränderungen (CRAMER 2012). Trotz intensiver Forschung werden unter Therapie mit mo-

dernsten Antiepileptika etwa 30 % der Patienten nicht anfallsfrei; bei ihnen treten weiterhin

unkontrollierbare schwere Anfälle auf (SCHMIDT u. LÖSCHER 2005; ROGAWSKI u.

HOLMES 2009; SHORVON 2009; BRODIE 2010; LÖSCHER u. SCHMIDT 2011). Sie wer-

den als pharmakoresistent eingestuft. Bei der häufigsten Epilepsieform des Menschen, der

Temporallappenepilepsie, liegt der Anteil pharmakoresistenter Patienten etwa bei 60-70 %

(LEPPIK 1992). Bei Hunden werden etwa 70 % der an Epilepsie leidenden Tiere nicht

anfallsfrei (SCHWARTZ-PORSCHE et al. 1985; RIECK 2002; RIECK et al. 2006). Neuere

Therapieansätze untersuchen Alternativen zur Dauermedikation mit Antiepileptika: Vielver-

sprechend ist die fokale, gerichtete Behandlung, bei der das Therapeutikum direkt auf die

Hirnregionen beschränkt wird, die bei der Anfallsentstehung oder -weiterleitung eine tragende

Rolle spielen. Neben dem epileptischen Fokus, aus dem die Anfallsaktivität hervorgeht,

stellen vor allem die Basalganglien Schlüsselregionen bei der Anfallsweiterleitung und -

modulation dar (GALE 1988; GALE et al. 2008). Wichtige Neurotransmitter sind hier u.a. die

inhibitorisch wirkende Gamma-Aminobuttersäure (GABA) und der exzitatorische Transmitter

Glutamat. Daher habe ich in meiner Arbeit zwei unterschiedliche therapeutische Strategien

verfolgt, denen gemeinsam ist, dass durch die vermehrte Freisetzung von GABA das bei Epi-

lepsie bestehende Ungleichgewicht zwischen erregender und hemmender Neurotransmission

(BOUILLERET et al. 2000; SCHARFMAN 2007) ausgeglichen werden soll. In beiden Stu-

dien wurde eine sehr selektiv auf das GABAerge System wirkende therapeutische Interven-

tion mit einer weniger spezifischen verglichen: In der ersten Strategie haben wir die Effekti-

Einleitung

10

vität einer intrazerebralen Applikation von Vigabatrin mit der bisher üblichen systemischen

Administration dieses Antiepileptikums verglichen (Studie Ia). Die fokale Applikation er-

folgte hierbei in Basalganglienregionen, genauer in die Substantia nigra pars reticulata und

den subthalamischen Nukleus. Vigabatrin verhindert irreversibel den Abbau von GABA, mit

der Konsequenz, dass die GABA-Konzentration im Gehirn steigt (SCHECHTER 1989; BEN-

MENACHEM et al. 1993; LÖSCHER u. HÖRSTERMANN 1994; PETROFF et al. 1996).

Vergleichend hierzu haben wir in Studie Ib fokusnah Botulinumtoxin injiziert, welches

weniger selektiv wirkt und durch eine Inhibition der Neurotransmission an der präsynap-

tischen Membran die Ausschüttung verschiedener Transmitter, u.a. Glutamat, hemmt

(MCMAHON et al. 1992). COSTANTIN und Kollegen (2005) konnten zeigen, dass durch die

Hemmung glutamaterger Neurone ebenfalls epileptische Anfallsaktivität inhibiert werden

kann.

In einem zweiten therapeutischen Ansatz haben wir neuronale GABAerge Vorläuferzellen aus

der Ratte in die genannten Hirnregionen transplantiert (Studie IIa). Analog der fokalen Appli-

kation von Vigabatrin sollten die Transplantate die intrazerebrale GABA-Konzentration erhö-

hen und somit antikonvulsiv wirken. Als Vergleich diente hier die Transplantation von huma-

nen NT2-Vorläuferzellen und ausdifferenzierten NT2-Neuronen (Studie IIb). Bei NT2-Zellen

handelt es sich um eine Zelllinie, die 1984 aus einem Hodentumor eines Menschen isoliert

wurde und die sich in adulte Nervenzellen unterschiedlichen Phänotyps differenzieren lässt,

u.a. in GABAerge, cholinerge, serotonerge oder dopaminerge Neurone (ANDREWS et al.

1984; ANDREWS 1984; LEE u. ANDREWS 1986; PLEASURE et al. 1992; PODRYGAJLO

et al. 2009).

Ziel dieser Arbeit war es, zu testen, welche der untersuchten Hirnregionen sich am besten für

fokale therapeutische Manipulationen eignen, als auch zu evaluieren, ob die fokale Interven-

tion der systemischen Administration von Substanzen überlegen ist. Außerdem sollte über-

prüft werden, ob eine selektive Manipulation des GABAergen Systems effektiv ist, hierfür

dient jeweils der Vergleich mit einem weniger spezifisch wirkenden Eingriff. Zudem sollte

geklärt werden, ob mit der Transplantation GABAerger Zellen ein langfristiger antikonvul-

siver Effekt zu erzielen ist. In den folgenden Kapiteln referiere ich jeweils getrennt zu diesen

beiden Studien als Studie I: Fokale Substanzapplikation und Studie II: Neurotransplantation.

Stand der Forschung

11

2. STAND DER FORSCHUNG

2.1. Epilepsie

2.1.1. Definition und Bedeutung

Epilepsien sind durch wiederkehrende, spontane Anfälle zentralen Ursprungs charakterisiert.

Ein epileptischer Anfall ist in der Regel eine vorübergehende Phase abnormaler, übermäßiger

oder synchroner Aktivität im Gehirn (FISHER et al. 2005). Diese kann sich je nach Anfalls-

fokus im Gehirn und der lokalen oder generalisierten Ausbreitung der Anfallsaktivität im

zentralen Nervensystem unterschiedlich darstellen. Eine präzise Klassifizierung des Anfalls-

typs, der Ursache, des Alters des Patienten bei Erstauftreten der Anfälle, auslösender Faktoren

und elektroenzephalographischer Befunde ist für die erfolgreiche Therapie unerlässlich. Man

unterscheidet fokale von generalisierten Anfällen (BERG et al. 2010). Fokale Anfälle treten

nur in definierten Hirnregionen auf, während sich bei primär generalisierten Anfällen die epi-

leptische Aktivität von Anfang an über beide Hirnhemisphären ausbreitet. Etwa 60 % der neu

diagnostizierten Epilepsien sind durch fokale Anfälle charakterisiert, oft kommt es jedoch

während eines fokalen Anfalls zu einer sekundären Generalisierung (HAUSER et al. 1993;

BANERJEE u. HAUSER 2008). Man unterscheidet weiterhin einfach-fokale Anfälle mit Er-

halt des Bewusstseins von komplex-fokalen Anfällen mit Bewusstseinsbeeinträchtigung. Ein

Anfall hat klinisch verschiedene Erscheinungsbilder, neben Krämpfen, die sich als atonisch,

myoklonisch, tonisch, klonisch oder tonisch-klonisch darstellen, treten auch sogenannte

Absencen auf, bei denen lediglich eine kurze Bewusstseinspause mit anschließender,

vorübergehender Amnesie zu beobachten ist (WESTBROOK 2000).

Um die Diagnose Epilepsie bei einem Patienten zu stellen, genügt ein epileptischer Anfall in

Kombination mit weiteren Befunden, die auf eine Prädisposition für Epilepsie hinweisen

(FISHER et al. 2005). Sowohl beim Menschen als auch beim Hund kommen Epilepsien mit

einer Prävalenz von etwa 1 % in der Bevölkerung bzw. der Hundepopulation vor (ENGEL et

al. 2003; LÖSCHER 1997). Die Ursachen für epileptische Anfälle können vielfältig sein. Sie

reichen von symptomatischen Epilepsien, bei denen die Entstehung der Epilepsie auf eine

Grunderkrankung, wie etwa einen Gehirntumor, zurückzuführen ist, über idiopathische Epi-

lepsien, bei denen genetische Faktoren als Auslöser der Epilepsie diskutiert werden. Des

Stand der Forschung

12

Weiteren bezeichnet man Epilepsien als kryptogen, wenn weder eine pathologische noch eine

genetische Ursache festgestellt werden kann (ENGEL 2006).

2.1.2. Alternative Therapien

In der Regel ist die erste therapeutische Intervention die systemische Einnahme von Anti-

epileptika. Wie eingangs erwähnt, ist neben dem Auftreten von Nebenwirkungen die Pharma-

koresistenz, die bei mindestens einem Drittel der Patienten auftritt, ein stark limitierender

Faktor für den Erfolg der Behandlung (SCHMIDT u. LÖSCHER 2005; ROGAWSKI u.

HOLMES 2009). Pharmakoresistenz bedeutet, dass der Patient nach Behandlungsversuchen

mit zwei verschiedenen Antiepileptika, in Monotherapie oder in Kombination, keine

anhaltende Anfallsfreiheit erreicht (KWAN et al. 2010). Mit dem Einsatz moderner

Antiepileptika kann bei 10-20 % der zuvor als pharmakoresistent eingestuften Patienten

Anfallsfreiheit erreicht werden (LUCIANO u. SHORVON 2007). Trotzdem kann der

Mehrheit der pharmakoresistenten Epilepsiepatienten noch nicht mit medikamenteller

Therapie geholfen werden. Die Konsequenzen sind schwerwiegend: Beim Hund führt eine

pharmakoresistente Epilepsie aufgrund mangelnder Therapiemöglichkeiten häufig zur

Euthanasie und damit zu einer verminderten Lebenserwartung (BERENDT et al. 2007). Beim

menschlichen Patienten treten neben Einschränkungen im Alltag, wie etwa beim Führen von

Kraftfahrzeugen, gehäuft Komorbiditäten wie Depressionen und Angststörungen auf

(TELLEZ-ZENTENO et al. 2007). Zusätzlich kommt es bei einem Teil der Patienten zu Ver-

haltensauffälligkeiten oder Lern- und Gedächtnisdefiziten (POST 2004). Die Lebenserwar-

tung sinkt (RYVLIN u. KAHANE 2003).

Die bislang erfolgreichste Behandlung neben der Pharmakotherapie besteht in der

chirurgischen Resektion des Anfallsfokus: Seit 2001 ist durch eine randomisierte Langzeit-

studie belegt worden, dass die resektive Chirurgie der rein medikamentösen Therapie überle-

gen ist (WIEBE et al. 2001). Hierfür wurden 80 pharmakoresistente Patienten in zwei Grup-

pen eingeteilt; eine Gruppe wurde medikamentös behandelt, die anderen Patienten unterzogen

sich einer Fokusresektion mit anschließender (geringerer) Einnahme von Antiepileptika. In

der Medikamentengruppe erreichten nach einem Jahr lediglich 8 % Anfallsfreiheit gegenüber

58 % in der Operationsgruppe. Zusätzlich stuften die operierten Patienten ihre Lebensqualität

signifikant höher ein. Aufgrund der mit diesem schwerwiegenden Eingriff verbundenen Risi-

Stand der Forschung

13

ken oder wegen eines multifokalen Ursprungs der epileptischen Anfälle ist allerdings nicht

jeder Patient für diese Therapie geeignet (NILSEN u. COCK 2004).

Eine weitere, erst kürzlich zugelassene Option ist die tiefe Hirnstimulation des anterioren

Thalamus. Die tiefe Hirnstimulation geeigneter Hirnregionen wird bereits seit Jahren erfolg-

reich in der Therapie von Schmerz- und Bewegungsstörungen eingesetzt (NGUYEN et al.

2011; FASANO et al. 2012).

Neben der zentralen Stimulation wird klinisch auch die periphere Stimulation des 10. Hirn-

nervs (Nervus vagus) durchgeführt. Diese Behandlungen können bei bis zu 40 % der Patien-

ten zu einer deutlichen Senkung der Anfallsfrequenz führen (BOON et al. 2009; NITSCHE u.

PAULUS 2009; FISHER et al. 2010). Die vagale Stimulation führt auch beim pharmakoresis-

tenten Hund zu einer Anfallsreduktion um etwa 35 % (MUNANA et al. 2002). Allerdings ist

noch relativ wenig zu Risiken einer solchen Behandlung als Dauertherapie bekannt, und es

mangelt an verblindeten, groß angelegten klinischen Studien. Ein Problem stellt zum Beispiel

die Verblindung bei Vagusstimulation dar, da die Patienten die Impulse wahrnehmen können.

Sowohl die tiefe Hirnstimulation als auch die Stimulation des Nervus vagus sind in ihrer

Effektivität gegenüber der konventionellen medikamentösen Therapie nicht überlegen

(LÖSCHER 2009b).

Die ketogene Diät, eine sehr fettreiche, kohlenhydratarme Ernährung, die vor allem bei Kin-

dern eingesetzt wird, kann etwa bei einem Drittel der Patienten eine bis zu 90 %ige Anfalls-

reduktion hervorrufen (KOSSOFF u. RHO 2009). Diese Diät ist allerdings eher als

komplementäre denn als alleinige Therapie einsetzbar; sie ist mit viel Verzicht und gesund-

heitlichen Risiken verbunden (GROESBECK et al. 2006; ENGEL u. MOSHÉ 2009). Alle

weiteren Ansätze, wie etwa die Untersuchung von anderen, effektiveren Applikationsrouten

alternativ zur systemischen Gabe von Antiepileptika, Zell- und Gentherapie oder auch

hormonelle Intervention befinden sich noch im experimentellen Stadium. In meiner Arbeit

habe ich mich mit der fokalen bzw. gerichteten Therapie beschäftigt.

2.1.3. Tiermodelle

Neue therapeutische Ansätze werden u.a. in Versuchstiermodellen getestet, da die komplexe

Verschaltung epileptischer Anfallsaktivität und ihre vielfältigen endo- und exogenen Ein-

flüsse oft nicht zufriedenstellend in alternativen Systemen wie etwa Zellkulturmodellen nach-

Stand der Forschung

14

zubilden sind (RAOL u. BROOKS-KAYAL 2012; STEWART et al. 2012). Die in der

Epilepsieforschung verwendeten Tiermodelle lassen sich grob in zwei Hauptgruppen unter-

teilen: Zum einen werden schnelle und sehr sensitive Screening-Methoden verwendet, um

beispielsweise das antikonvulsive oder prokonvulsive Potential bestimmter Substanzen in der

Wirkstoffentwicklung zu testen (LÖSCHER 2011). Diesen Modellen ist gemeinsam, dass

epileptische Anfälle i.d.R. akut ausgelöst werden, d.h. die Versuchstiere zeigen keine sponta-

nen Anfälle und keine pathologischen Veränderungen des Gehirns (LÖSCHER 1999). An-

fälle werden mithilfe systemisch oder fokal verabreichter, prokonvulsiv wirkender Substanzen

oder durch elektrische Stimulation ausgelöst. Ein viel verwendetes, akutes Anfallsmodell ist

der Pentylentetrazol-Anfallsschwellentest, kurz PTZ-Test (LÖSCHER 2009a; LÖSCHER

2011), der in der vorliegenden Arbeit verwendet wurde (s. Abschnitt 4.2). Weiterhin sind Mo-

delle etabliert, die möglichst genau die klinische Situation des Epilepsiepatienten widerspie-

geln sollen. Hierfür ist neben dem Auftreten wiederholter, spontaner Anfälle mit einem Anteil

pharmakoresistenter Tiere auch eine Pathologie der beteiligten Hirnregionen ein Kriterium

(s. Abschnitt 2.2.3.), um die Translation gewonnener Erkenntnisse im Tiermodell auf den

humanen Patienten übertragen zu können (COULTER et al. 2002). Modelle, mit denen dies

zum Teil erreicht wird, nutzen einen selbsterhaltenden Status epileptikus als Hirninsult, der

elektrisch oder chemisch, mithilfe prokonvulsiver Substanzen, induziert wird und nach einer

gewissen Latenzzeit zu spontanen Anfällen führt (LÖSCHER 1997). Bisher steht kein Modell

zur Verfügung, das alle Kriterien zufriedenstellend erfüllt (SLOVITER 2008; SLOVITER

2009; RUBIO et al. 2010; LÖSCHER 2011). Für die Überprüfung der Wirksamkeit eines

neuen Therapieansatzes, in diesem Fall der fokalen Therapie, ist auch die Determination einer

geeigneten Applikationsroute entscheidend. Um fokal therapieren zu können, müssen zu-

nächst geeignete Hirnregionen als Zielstrukturen identifiziert werden.

2.2. Zielregionen für fokale Therapie

2.2.1. Basalganglien - Anatomie und Physiologie

Ausgehend vom epileptischen Anfallsfokus spielen zahlreiche weitere Hirnregionen eine

Rolle bei der Ausbreitung der Anfallsaktivität bis hin zur sekundären Generalisierung

(LÖSCHER u. EBERT 1996). Seit Jahren ist bekannt, dass besonders den Basalganglien hier-

Stand der Forschung

15

bei eine tragende Rolle zukommt (GALE 1988). Die Basalganglien sind unter der Hirnrinde

(subkortikal) angelegte Kerngebiete des Vorder- und Mittelhirns. Zu den Basalganglien gehö-

ren die Substantia nigra, das Striatum (bestehend aus Nucleus caudatus und Putamen), der

Globus pallidus (anatomische Bezeichnung bei der Ratte, beim Menschen als Globus pallidus

externus bezeichnet), der entopedunkuläre Nucleus (Ratte, beim Menschen Globus pallidus

internus) sowie der subthalamische Nukleus. Diese Regionen sind anatomisch und funktionell

untereinander und mit dem limbischen System verbunden (s. Abb. 1). Bei Defekten innerhalb

der Basalganglien kann es zu komplexen neuropsychiatrischen Symptomen, kognitiven Ver-

änderungen, Verhaltensänderungen und zu hypo- oder hyperkinetischen Bewegungsstörungen

kommen. Die bekanntesten motorischen Symptome treten bei Morbus Parkinson und Chorea

Huntington auf. Charakteristische, pathologische Änderungen der Motorik sind hier Tremor,

Bewegungsarmut, eine gebeugte Körperhaltung und erhöhter Muskeltonus (Parkinson’sche

Krankheit), sowie überschießende, unwillkürliche Bewegungen (Huntington) (DELONG

2000). Physiologisch üben die Basalganglien eine Filterfunktion aus, das sogenannte

„Gating“: die Selektion aktuell gewollter Bewegungsmuster und die Inhibition der momentan

nicht erwünschten Aktivierungsmuster.

Die Verschaltung der Basalganglien besteht aus parallel verlaufenden Regelschleifen, die vom

Kortex über die Basalganglien zum Hirnstamm und Thalamus und vom Thalamus wieder zum

Kortex verlaufen. Die Eingangsstruktur der Basalganglien ist das Striatum, welches Eingänge

aus verschiedenen Bereichen des Kortex (assoziativ, sensorimotorisch und limbisch), des

Thalamus und der Substantia nigra pars compacta (SNc) erhält (DELONG 2000). Aus-

gangstrukturen sind die Substantia nigra pars reticulata (SNr) und der entopendunkuläre

Nukleus (Ratte, beim Menschen Globus pallidus internus), die über motorische Kerngebiete

des Thalamus, den rostralen Colliculus (Mensch: superiorer Colliculus) und den pedun-

kulopontinen Nukleus Informationen weiterleiten (BOLAM et al. 2000). Besonders die

Substantia nigra ist einer der am besten untersuchten Kerne der Basalganglien und in der Ver-

gangenheit sehr gut hinsichtlich ihrer Rolle bei der Weiterleitung und Ausbreitung epilep-

tischer Anfallsaktivität untersucht worden (vgl. GALE et al. 2008).

Stand der Forschung

16

2.2.2. Das nigrale inhibitorische System

Die Substantia nigra besteht zum einen Teil aus einer Pars compacta (SNc) mit dicht gepack-

ten, dopaminergen Neuronen. Diese sind bei Morbus Parkinson degenerativen Prozessen aus-

gesetzt und aus diesem Grund Gegenstand intensiver Forschung (DELONG 2000; YUAN et

al. 2010). Der zweite Teil ist die Pars reticulata (SNr). Ihr wird bei der Anfallsweiterleitung

und -modulation eine „seizure gating function“ zugeschrieben (GALE 1988; GALE et al.

2008).

Die etwa zu 90 % GABAergen Neurone der SNr erhalten Input aus dem Striatum auf zwei

Wegen: Eine Hemmung nigraler Neurone wird direkt, monosynaptisch, durch hauptsächlich

GABAerge Projektionsneurone des Striatums (medium-sized spiny neurons) erreicht

(HATTORI et al. 1973; FONNUM et al. 1978). Eine Aktivierung nigraler Neurone erfolgt

dagegen über einen indirekten, polysynaptischen Input über drei Stationen (s. Abb. 1). Hier

projizieren die „medium-sized spiny neurons“ des Striatums zum Globus pallidus (externus),

von dort über eine GABAerge Projektion zum subthalamischen Nukleus und über eine dritte,

glutamaterge Projektion vom subthalamischen Nukleus (STN) zur SNr (ALEXANDER u.

CRUTCHER 1990; ROBLEDO u. FEGER 1990; SHEN u. JOHNSON 2006; DENIAU et al.

2007). Von der SNr aus verlaufen inhibitorische Efferenzen zu verschiedenen Hirnregionen

im Hirnstamm und Mittelhirn. Im Falle einer Hemmung dieses „nigralen inhibitorischen

Systems“ werden die nachgeschalteten Regionen enthemmt und erhöhen so die Schwelle zur

Auslösung eines Anfalls. Ein antikonvulsiver Effekt kann demzufolge neben der direkten

Hemmung der SNr ebenso mit einer indirekten Hemmung erreicht werden, wenn ihre exzita-

torische Afferenz, der subthalamische Nukleus, gehemmt wird (ROBLEDO u. FEGER 1990;

FEGER u. ROBLEDO 1991). Des Weiteren verlaufen von der SNr reziproke Verbindungen

zum limbischen System, so dass rückwirkend auch der Anfallsfokus unabhängig von der ge-

nauen Lokalisation der Anfallsentstehung sowie des Anfallstyps über eine Manipulation der

SNr zu erwirken ist (DEPAULIS et al. 1994; LÖSCHER et al. 2008; GALE et al. 2008).

Stand der Forschung

17

Abb. 1: Schematische Darstellung der Generalisierung epileptischer Anfallsaktivität bei Temporallappen-

epilepsie. Die Ausbreitung epileptischer Anfallsaktivität verläuft entlang spezifischer anatomischer Bahnen, die

im physiologischen Zustand an der Vermittlung motorischer Aktivität beteiligt sind. Der epileptische Fokus liegt

zumeist im limbischen System (lila). Im Falle einer Generalisierung erfolgt die Ausbreitung der Anfallsaktivität

über den Kortex (blau), die Basalganglien (gelb), sowie deren Zielregionen (grün). In diesem epileptischen

Netzwerk sind verschiedene Transmitter involviert, vor allem aber GABA (rote Pfeile) und Glutamat (blaue

Pfeile). Modifiziert nach LÖSCHER et al. 2008.

2.2.3. Der Hippokampus – Anatomie und Physiologie

Vergleichend zur fokalen Applikation in Basalganglienregionen haben wir eine weitere Sub-

stanz, Botulinumtoxin B, in den Gyrus dentatus des Hippokampus injiziert. Der Hippokampus

gehört zum limbischen System, in welchem bei einem Großteil der Epilepsiepatienten der

Anfallsfokus liegt (ENGEL et al. 1993). Pathologische Veränderungen bei Epilepsien werden

zumeist in Form einer Sklerose im Hippokampus charakterisiert (MARGERISON u.

CORSELLIS 1966; SLOVITER 1994; KÄLVIÄINEN et al. 1998). Eine partielle Resektion

des Temporallappens kann in Anfallsfreiheit resultieren (ENGEL et al. 1993; WIEBE et al.

2001), was die Hypothese stützt, dass auch fokale, therapeutische Manipulationen direkt im

Stand der Forschung

18

Anfallsfokus zu einem Erfolg führen können (EDER et al. 1997a; EDER et al. 1997b;

ROGAWSKI 2009).

Der Hippokampus besteht aus dem Subiculum, dem Ammonshorn und dem Gyrus dentatus

(MCINTYRE u. SCHWARTZKROIN 2008). Der Gyrus dentatus ist die Haupteingangs-

struktur des Hippokampus und erhält Eingänge aus dem entorhinalen Kortex. Er besteht

hauptsächlich aus glutamatergen Neuronen, deren Zellsomata im sogenannten Körnerzellband

liegen (Stratum granulare), ihren Dendriten, die im Stratum moleculare lokalisiert sind und

dem Hilus, in dem sowohl glutamaterge Neurone, die aufgrund ihres Erscheinungsbildes so-

genannten Mooszellen, als auch GABAerge Interneurone liegen (AMARAL 1978; FÖRSTER

et al. 2006). Obduktionen an Patienten mit Temporallappenepilepsie haben gezeigt, dass so-

wohl exzitatorische als auch inhibitorische Neurone degenerieren können, vornehmlich findet

allerdings eine Reduktion der GABAergen Interneurone im Hilus des Gyrus dentatus statt

(DE LANEROLLE et al. 1989; WITTNER et al. 2001). Im Kindling-Modell konnte gezeigt

werden, dass sich durch Kindling die elektrophysiologischen Eigenschaften der glutamatergen

Körnerzellen verändern, und dass eine hohe metabolische Aktivität der Region mit der Ge-

neralisierung von Anfällen einhergehen kann (LOTHMAN 1994). Die enge Verschaltung der

hippokampalen Strukturen untereinander und mit der kontralateralen Hemisphäre kann durch

die hauptsächlich exzitatorischen, glutamatergen Verbindungen Anfallsaktivität amplifizieren

(RIBAK et al. 1985; MCINTYRE u. SCHWARTZKROIN 2008). Der Hippokampus ist wohl

die am besten untersuchte Hirnregion im Hinblick auf die Entstehung epileptischer Anfalls-

aktivität.

Stand der Forschung

19

2.3. Studie I: Fokale Substanzapplikation

2.3.1. Substanzen für fokale Therapie

2.3.1.1. Vigabatrin

Um die effektivste Zielregion innerhalb der Basalganglien für die fokale Substanzapplikation

bzw. die Transplantation GABAerger Vorläuferzellen zu determinieren, haben wir zunächst

ein Strukturanalogon von GABA, Vigabatrin (4-Aminohex-5-ensäure, Gamma-Vinyl-GABA,

s. Abb. 2), als Modellsubstanz lokal in verschiedene

Hirnareale von Ratten mikroinjiziert und dann mit

etablierten Methoden die Anfallsschwelle bestimmt.

Vigabatrin hemmt irreversibel die GABA-

Aminotransferase. Dieses Enzym ist für den Abbau von

GABA zuständig. Wird es durch die systemische

Administration von Vigabatrin gehemmt, so steigt die

intrazerebrale GABA-Konzentration (SCHECHTER

1989; SABERS u. GRAM 1992).

In der Literatur ist beschrieben, dass Vigabatrin außerdem die GABA-Freisetzung fördern

kann (BEN-MENACHEM 2002). Vigabatrin ist ein Antiepileptikum, das in über 50 Ländern

als „Add-on“-Therapeutikum bei Patienten mit refraktären komplex-partiellen Anfällen als

auch als Monotherapie bei Kindern mit infantilen Spasmen zugelassen ist (WILLMORE et al.

2009). Das Arzneimittel (Handelsname Sabril®) wird oral eingenommen und fast komplett

resorbiert. Die Elimination erfolgt renal (BEN-MENACHEM 2002). Bei systemischer

Einnahme treten vorrangig Nebenwirkungen wie sedative Effekte oder Gewichtszunahmen

auf (SABERS u. GRAM 1992; BEN-MENACHEM 2007; WILLMORE et al. 2009).

Vigabatrin-spezifische Nebenwirkungen, die beim menschlichen Patienten auftreten, sind mit

einer Prävalenz von unter 1 % Psychosen und mit einer Prävalenz von 25-50 %

Gesichtsfeldeinschränkungen (SABERS u. GRAM 1992; THOMAS et al. 1996; WERTH u.

SCHADLER 2006; BEN-MENACHEM 2007; WILLMORE et al. 2009). Aus diesem Grund

wurde Vigabatrin in den USA erst 2009 als Antiepileptikum unter der Prämisse zugelassen,

dass ein sehr strenges Monitoring der Patienten auf Gesichtsfeldeinschränkungen vor,

Abb. 2 Strukturformeln von A GABA

und B Vigabatrin

Stand der Forschung

20

während und nach Vigabatrin-Behandlung erfolgen muss (TOLMAN u. FAULKNER 2011).

Eine Möglichkeit, Nebenwirkungen auf ein Minimum zu reduzieren ist die lokale

Verabreichung eines Therapeutikums direkt in die Schlüsselregionen der Anfallsentstehung

und –weiterleitung (FISHER u. HO 2002; NILSEN u. COCK 2004; ROGAWSKI 2009; AL-

OTAIBI et al. 2011).

2.3.1.2. Botulinumtoxin

Im Gegensatz zu Vigabatrin ist der Wirkmechanismus von Botulinumtoxinen im Zentralner-

vensystem weniger spezifisch. Botulinumtoxine sind Neurotoxine, die ihre Wirkung durch

Hemmung der synaptischen Transmission erreichen. Sie gehören zu den giftigsten Proteinen

überhaupt (JOHNSON 1999; ROSSETTO et al. 2006). Durch das Auftreten von Lähmungen

(Paralyse) nach dem Verzehr von belastetem Fleisch wurden die ersten Intoxikationen durch

Botulinumtoxine bereits im 18. Jahrhundert in Deutschland beschrieben (DICKSON 1918),

und Anfang des 19. Jahrhunderts wurde ein Toxin als Ursache für die auftretenden Symptome

von Botulismus identifiziert, die von Kopf- und Gliederschmerzen zu Beginn über Mund-

trockenheit, Lähmungen der Augenmuskeln, Schlundmuskeln, Miktionsstörungen, Obstipa-

tion bis zum Tod der Betroffenen reichten (KERNER 1817; KREYDEN et al. 2000). Es han-

delt sich um bakterielle Toxine (Toxovaren A-G), die unter anaeroben Bedingungen von

grampositiven Clostridien, vornehmlich Clostridium botulinum gebildet werden (VAN

ERMENGEM 1897; SIMPSON 2004; SELBITZ 2011). Seit vielen Jahren ist bekannt, dass

Botulinumtoxine die Vesikelfusion an der präsynaptischen Membran verhindert, indem es

toxovarabhängig bestimmte Fusionsproteine (SNARE, engl. für soluble N-ethylmaleimide-

sensitive-factor attachment receptor) spaltet (HUMEAU et al. 2000). Die peripheren Wirkun-

gen von Botulinumtoxin sind sehr gut untersucht: Die Hemmung der Acetylcholin-Ausschüt-

tung ist für die paralytische Wirkung von Botulinumtoxin verantwortlich. Die auf diesem

Wege inhibierte Neurotransmission resultiert in einer klinisch manifesten, schlaffen Läh-

mung, einer Paralyse. Diese Wirkung wird neben der Anwendung für kosmetische Zwecke

auch klinisch bei verschiedenen Indikationen genutzt, bei denen eine pathologische, unkon-

trollierte, periphere cholinerge Aktivität vorliegt (SIMPSON 2004), u.a. in der Ophthalmolo-

gie, bei Bewegungsstörungen, Hypersekretionsstörungen und Schmerz (LIM u. SEET 2007).

Ziel einer Behandlung mit Botulinumtoxin in sehr geringen Dosen ist nicht die vollständige

Stand der Forschung

21

Hemmung der exzessiven neuronalen Aktivität, sondern die Reduktion auf ein normales Maß

(JANKOVIC u. BRIN 1991; BELL et al. 2000).

In Deutschland gibt es 4 zugelassene Arzneimittel mit Wirkstoffen aus Botulinumtoxinen

(DRESSLER 2012). Botulinumtoxin hemmt nicht nur die cholinerge Transmission, sondern

u.a. auch die glutamaterge (MCMAHON et al. 1992). Somit war anzunehmen, dass durch die

Hemmung zentraler, glutamaterger Neurone epileptische Anfallsaktivität inhibiert werden

kann. Botulinumtoxin A und E erwirken in-vitro erwiesenermaßen eine selektive Hemmung

der glutamatergen Transmission; es wird kein Effekt auf GABAerge Synapsen ausgeübt

(CAPOGNA et al. 1997; VERDERIO et al. 2004). Botulinumtoxine sind Peptide und über-

winden aufgrund ihrer Molekülgröße und Polarität nicht die Bluthirnschranke (SIMPSON

2004). Eine fokale Applikation von Botulinumtoxin in das Zentralnervensystem stellt die ein-

zige Option dar, einen therapeutischen Nutzen bei Epilepsie zu überprüfen. Aus diesem

Grund wurde Botulinumtoxin in der vorliegenden Arbeit in das glutamaterge Körnerzellband

des Gyrus dentatus injiziert.

2.3.2. Fokale Substanzapplikation in Basalganglienregionen

Insgesamt gestaltet sich die lokale Verabreichung eines Therapeutikums, sei es eine Substanz

oder ein Transplantat, als weit spezifischer als die systemische Gabe (BOISON 2007).

Bereits vor 30 Jahren konnte gezeigt werden, dass die Mikroinjektion von Vigabatrin lokal in

das Mittelhirn in einem Ratten-Anfallsmodell antikonvulsiv wirksam ist (IADAROLA u.

GALE 1982). Für eine genauere Lokalisierung der Hirnregion, die für die beobachteten

Wirkungen verantwortlich war, wurde der GABAA-Rezeptor-Agonist Muscimol verwendet

und die SNr als Wirkort identifiziert (GALE 1985). Sie ist an epilepsie-induzierten,

plastischen Netzwerkveränderungen beteiligt, die auch im experimentellen Tiermodell (Kind-

ling als Modell für die Temporallappenepilepsie) hervorgerufen werden (GERNERT et al.

2004; TÖLLNER et al. 2011). Während und bereits vor einem generalisierten Anfall sind

nigrale Nervenzellen vermehrt aktiv (ENGEL et al. 1978; NEHLIG et al. 1998; DUBÉ et al.

2000a). In unterschiedlichen Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass eine vermehrte Hem-

mung nigraler Neurone zu einer Reduktion bzw. Unterdrückung von experimentell ausgelös-

ten Anfällen führt (GALE u. IADAROLA 1980; LE GAL LA SALLE et al. 1983a;

MCNAMARA et al. 1984; DEPAULIS et al. 1988; ZHANG et al. 1991; BLOMS-FUNKE u.

Stand der Forschung

22

LÖSCHER 1996; WINDELS u. KIYATKIN 2004; NOLTE et al. 2006). Neben Arbeiten im

Kindling-Modell (LE GAL LA SALLE et al. 1983a; MCNAMARA et al. 1984; LÖSCHER et

al. 1987) wurde eine antikonvulsive Wirkung GABA-potenzierender Substanzen auch in che-

misch-induzierten, akuten Anfallsmodellen, in denen Anfälle z.B. mithilfe von Antagonisten

des GABAA-Rezeptors ausgelöst werden, belegt. So konnte eine antikonvulsive Wirkung

GABA-potenzierender Substanzen im systemischen Bicucullin-Modell (GARANT u. GALE

1986) bzw. im Flurothyl-Modell (XU et al. 1991; GARANT et al. 1995) gezeigt werden.

Auch nach systemischer und fokaler Auslösung eines Anfalls mit dem Parasympatho-

mimetikum Pilokarpin konnte durch intranigrale Administration von Vigabatrin ein protekti-

ver Effekt erzielt werden (TURSKI et al. 1986; SMOLDERS et al. 1997). Pilokarpin wird

weltweit in der tierexperimentellen Epilepsieforschung genutzt, um sowohl akute Anfälle als

auch einen selbst-erhaltenden Status epileptikus als primären Hirninsult und infolgedessen

nach einer Latenzzeit von einigen Wochen eine chronische Epilepsie auszulösen (TURSKI et

al. 1987; CAVALHEIRO 1995; LÖSCHER 2002; SCORZA et al. 2009). Auch bei genetisch

veränderten Ratten, die spontan Absencen zeigen, konnten diese durch Injektion von GABAA-

Agonisten in die SNr unterdrückt werden (DEPAULIS et al. 1988). Bisher gibt es jedoch

kaum Untersuchungen, die direkt die Wirksamkeit fokaler und systemischer Applikation in

einem Epilepsiemodell miteinander verglichen haben. Neuere Versuche haben zudem gezeigt,

dass die SNr auf lokale Manipulationen nicht einheitlich in ihrer anfallsmodulierenden Eigen-

schaft reagiert. Unterschiede zeigen sich bei der Ratte zwischen dem vorderen (anterioren)

und hinteren (posterioren) Teil der SNr. Beispielsweise führte eine Mikroinjektion von Viga-

batrin in der posterioren SNr (pSNr) zu prokonvulsiven Effekten im Flurothyl-Modell, in der

anterioren SNr (aSNr) hingegen zu einer antikonvulsiven Wirkung (VELÍŠKOVÁ et al.

1996a). Ursächlich für diese widersprüchlichen Ergebnisse könnten unter anderem ein Unter-

schied in der Rezeptorexpression (VELÍŠKOVÁ et al. 1998), subregionen-spezifische

Efferenzen, das verwendete Tiermodell, das Alter sowie Geschlecht der verwendeten Tiere

sein (SHEHAB et al. 1996; GERNERT u. LÖSCHER 2001). Wir führen daher sowohl die

fokale Substanzapplikation als auch die später beschriebene Neurotransplantation an

mehreren Loci der SNr durch.

Im Vergleich zur SNr ist der subthalamische Nukleus (STN) in seiner Bedeutung für die

Weiterleitung epileptischer Anfallsaktivität weitaus weniger gut untersucht. Der STN liefert

Stand der Forschung

23

monosynaptischen, glutamatergen und damit exzitatorischen Input in die SNr. Folgerichtig

senkte die Injektion des GABAA-Rezeptor-Agonisten Muscimol in den STN die metabolische

und elektrophysiologische Aktivität der Zielstrukturen des STN, und somit u.a. in der SNr

(FEGER u. ROBLEDO 1991). Analog zu den Untersuchungen in der SNr zeigte sich nach

Mikroinjektion von Muscimol in den STN eine antikonvulsive Wirkung im Kindling-Modell

(DERANSART et al. 1998), bei systemisch und fokal appliziertem Bicucullin (DYBDAL u.

GALE 2000), nach Flurothyl-Inhalation (VELÍŠKOVÁ et al. 1996b) und bei genetisch-

bedingten Absencen (DERANSART et al. 1996). Dies belegt, dass sowohl die Hemmung des

direkten striatonigralen als auch des indirekten Pfades bei der Ausbreitung epileptischer An-

fallsaktivität eine Rolle spielen (DEPAULIS et al. 1994; GALE et al. 2008). Konträr zu Stu-

dien an der SNr gibt es keine Untersuchungen zur Wirksamkeit von Vigabatrin nach Appli-

kation in den STN.

Bisher ist die antikonvulsive Wirksamkeit einer Substanz auf die Hemmung des direkten und

indirekten nigrostriatalen Weges nicht miteinander verglichen worden, so dass nicht doku-

mentiert ist, welcher Weg den größten Nutzen für eine fokale, antikonvulsive Therapie haben

könnte. Diese Arbeit soll helfen aufzuklären, welche Hirnregion der Basalganglien potenziell

für die gerichtete, fokale Therapie am erfolgversprechendsten ist. Es gibt mehrere Gründe die

Basalganglien und nicht direkt den Anfallsfokus als Zielregion für eine gerichtete, fokale

Therapie auszuwählen. Einerseits könnte so auch Patienten geholfen werden, deren Anfalls-

fokus operativ nicht zugänglich ist oder die mehrere Foci haben. Somit wird auch die Patien-

tengruppe erreicht, für die eine Fokusresektion als therapeutische Intervention nicht in Frage

kommt. Die Basalganglien, insbesondere der subthalamische Nukleus, werden klinisch für

therapeutische Neurostimulation bei anderen neurologischen Erkrankungen wie beispiels-

weise Morbus Parkinson oder Dystonie bereits genutzt (BENABID et al. 2001; BENABID

2007; AL-OTAIBI et al. 2011), so dass die chirurgische Zugänglichkeit dieser Region kli-

nisch etabliert ist. Tatsächlich wurde auch bei pharmakoresistenten Epilepsiepatienten bereits

erfolgreich im subthalamischen Nukleus stimuliert (CHABARDES et al. 2002). Zusätzlich

spricht für die experimentelle Erforschung der Basalganglien als Zielregion für fokale Thera-

pie, dass teilweise die Fokusdiagnostik ungenau bzw. beim Hund noch nicht etabliert ist, so

dass die Manipulation von gemeinsamen „Endstrecken“ verschiedener Anfallstypen eine

vielversprechende Option darstellt.

Stand der Forschung

24

2.3.3. Fokale Substanzapplikation in den Hippokampus

Der Gyrus dentatus wird analog zur SNr als „Tor zur hippokampalen Erregbarkeit“ bezeich-

net (HEINEMANN et al. 1992). Elektrophysiologische Messungen belegen eine verminderte

GABA-vermittelte Hemmung im Gyrus dentatus von humanen Epilepsiepatienten

(WILLIAMSON et al. 1999). In akuten, experimentellen Anfallsmodellen kommt es analog

nach Injektion von GABAA-Rezeptor-Antagonisten in die Region CA1 des Ammonshornes

zu fokalen und sekundär generalisierenden Anfällen (ANSCHEL et al. 2004). Durch eine

vorausgehende, prophylaktische Injektion von GABA-potenzierenden Substanzen wie Benzo-

diazepinen oder GABA-Agonisten wie Muscimol lassen sich diese Anfälle unterdrücken

(KOHANE et al. 2002; ANSCHEL et al. 2004). Ebenso lassen sich chronische Veränderun-

gen im EEG, die durch systemische Pilokarpin-Injektion bzw. fokale Kobaltchlorid-

Administration ausgelöst wurden, durch eine Diazepam-Injektion in die CA1 des Hippokam-

pus reduzieren (EDER et al. 1997b). Die mögliche Einflussnahme auf die Anfallsaktivität

durch eine Manipulation des GABAergen Systems, sowie die beschriebene pathologische

Reduktion GABAerger Inhibition innerhalb des Hippokampus bei einer manifesten Epilepsie,

lassen vermuten, dass im Umkehrschluss auch eine Reduktion der Glutamat-Freisetzung zu

verminderter Suszeptibilität gegenüber prokonvulsiven Substanzen führt. In-vitro schützt eine

herabgesetzte Glutamat-Freisetzung vor Übererregbarkeit der Neurone und übermäßiger Neu-

rotransmitter-Sekretion (BANCILA et al. 2004). Absicht unserer Studie war es, durch die

Mikroinjektion von Botulinumtoxin die glutamaterge Transmission im Gyrus dentatus in-vivo

zu hemmen und auf diesem Weg antikonvulsive Effekte zu erzielen. Für die Toxovare A, B

und E konnten im Kindling antikonvulsive Eigenschaften nachgewiesen werden

(ROGAWSKI 2009; COSTANTIN et al. 2005). Auch nach fokaler oder systemischer, akuter

Anfallsinduktion sowie nach chronischer Epilepsieinduktion durch Kainsäure kann durch

Injektion von Botulinumtoxin E in die CA1 und CA3 des Hippokampus die Anfallsfrequenz

reduziert werden (COSTANTIN et al. 2005; ANTONUCCI et al. 2009). Zudem ist für

Botulinumtoxin E eine neuroprotektive Wirkung gegenüber Epilepsie-induzierter Neurode-

generation nachgewiesen worden, die auf einer verminderten Aktivität proapoptischer

Proteine beruht, die wiederum durch eine Herabregulation glutamaterger Neurotransmission

bedingt sein könnte (MANNO et al. 2007; CALEO u. SCHIAVO 2009). Der Einsatz von

Toxinen gegenüber herkömmlichen Antiepileptika könnte einen entscheidenden Vorteil

Stand der Forschung

25

haben: Antiepileptika sind kleinmolekülige Substanzen, die bei fokaler Applikation ins Hirn-

gewebe vom Injektionsort in das umliegende Gewebe diffundieren. Botulinumtoxin hingegen

diffundiert aufgrund seiner molekularen Eigenschaften kaum (GASIOR et al. 2007;

ROGAWSKI 2009), und wirkt bis die vom Toxin gespaltenen Vesikelproteine neu synthe-

tisiert werden (RACIBORSKA u. CHARLTON 1999; MEUNIER et al. 2002). Die beobach-

teten antikonvulsiven Effekte halten einige Wochen; im Vergleich liegt die Wirkung nach

Mikroinjektion herkömmlicher Antiepileptika, die i.d.R. nach wenigen Tagen aufgehoben ist,

deutlich darunter (EDER et al. 1997b; ROGAWSKI 2009; unveröffentlichte Daten aus der

AG Rogawski). Fokale Therapieansätze würden für Epilepsiepatienten generell mindestens

einen neurochirurgischen Eingriff bedeuten, der von der chronischen oder intermittierenden

Applikation der antikonvulsiven Substanz gefolgt würde. Im Falle einer klinischen Anwen-

dung der fokalen Therapie mit Botulinumtoxin könnte aufgrund der länger andauernden Wir-

kung eventuell seltener behandelt werden als mit herkömmlichen Antiepileptika

(ROGAWSKI 2009). Generell handelt es sich bei der fokalen Injektion von Substanzen um

einen neurochirurgischen Eingriff mit folgender chronischer Behandlung, bei der das Thera-

peutikum intermittierend oder kontinuierlich freigesetzt werden müsste.

Stand der Forschung

26

2.4. Studie II: Neurotransplantation

Eine weitere Strategie, langanhaltende, antikonvulsive Effekte zu erreichen, könnte die fokale

Transplantation GABAerger Vorläuferzellen darstellen (LÖSCHER et al. 2008). Erste Trans-

plantationsstudien wurden bereits in den 1980er Jahren bei rein neurodegenerativen Erkran-

kungen mit selektivem Zellverlust wie der Parkinson’schen Erkrankung durchgeführt. In den

ersten Studien wurden sowohl fetale Zellen aus der Ratte als auch Zellen, die aus humanen,

abortierten Feten gewonnen wurden, in einem Rattenmodell für Morbus Parkinson transplan-

tiert (BRUNDIN et al. 1985; BRUNDIN et al. 1986). In jenen und darauffolgenden Unter-

suchungen konnte gezeigt werden, dass die transplantierten dopaminergen Vorläuferzellen zu

einer Aufhebung der zuvor induzierten motorischen Asymmetrie führen und die dopaminer-

gen Vorläufer ausdifferenzieren und funktionell in die Zielregion (Striatum) des Empfänger-

tieres integriert werden (BRUNDIN et al. 1985; CLARKE et al. 1988; WICTORIN et al.

1992; OLSSON et al. 1997; BJÖRKLUND u. LINDVALL 2000). Diese vielversprechenden

Ergebnisse führten dazu, dass bereits klinische Studien an Parkinson-Patienten durchgeführt

wurden, die diese Ergebnisse bestätigten (KORDOWER et al. 1995; SCHUMACHER et al.

2000). Allerdings waren diese weder verblindet noch Placebo-kontrolliert oder multizentrisch

angelegt (BJÖRKLUND u. LINDVALL 2000). Diesbezüglich wurden Bedenken geäußert,

jedoch aufgrund der langanhaltenden, positiven Effekte, die 5 bis 10 Jahre anhielten, wieder

verworfen (BJÖRKLUND u. LINDVALL 2000). Neuere Placebo-kontrollierte Studien

konnten diese Effekte nicht reproduzieren (OLANOW et al. 2009b).

2.4.1. Zelltransplantation bei Epilepsie

Der Ersatz von Nervenzellen wäre auch für das epileptische Gehirn eine vielversprechende

Strategie (LÖSCHER et al. 2008). Auch die Neurotransplantation sollte direkt auf Hirn-

regionen beschränkt werden, die bei der Entstehung bzw. Weiterleitung von Anfällen eine

Rolle spielen. Nach TURNER und SHETTY (2003) sollte das perfekte Transplantat folgende

Eigenschaften in sich vereinen: Es sollte 1. eine Überlebensrate der transplantierten Zellen

von mindestens 20 %, 2. eine ausreichende, aber nicht übermäßige Ausbreitung und Migra-

tion der Zellen, um die geschädigten Areale zu ersetzen, 3. eine physiologische Zellent-

wicklung inklusive Regions-spezifischer Dendriten, Synapsen und intrinsischer Eigenschaften

aufweisen, 4. lokale und Regions-übergreifende axonale Verbindungen zu den Wirtszellen

Stand der Forschung

27

bilden und 5. Afferenzen der Wirtszellen aufnehmen. In den letzten Jahren wurden diverse

Transplantationsstudien in verschiedenen Epilepsiemodellen durchgeführt. In den Unter-

suchungen wurden sowohl unterschiedliche Zelltypen als auch Zielregionen im Gehirn ver-

wendet (für eine ausführliche Übersicht s. LÖSCHER et al. 2008); mehrheitlich wurde aller-

dings der Hippokampus als Zielstruktur ausgewählt.

2.4.2. Neurotransplantation in den Hippokampus

Während der Epileptogenese und der manifesten Temporallappenepilepsie finden progressive

Umstrukturierungen innerhalb des epileptischen Netzwerkes statt. Das epileptische Gehirn ist

nicht in der Lage, die funktionellen Defizite, die u.a. durch Degeneration GABAerger Inter-

neurone im Gyrus dentatus des Hippokampus entstehen, durch endogene Neubildung von

Nervenzellen auszugleichen (SHETTY u. HATTIANGADY 2007a). Obwohl seit einigen

Jahren bekannt ist, dass Neurogenese innerhalb des Gyrus dentatus auch im adulten Gehirn

verschiedener Spezies, u.a. bei Mensch und Ratte, stattfindet (KUHN et al. 1996; ERIKSSON

et al. 1998; RAO u. SHETTY 2004; CURTIS et al. 2012), ist die regenerative Kapazität bei

Epilepsie stark eingeschränkt. Bei Vorliegen einer chronischen Epilepsie findet signifikant

weniger Nervenzellentwicklung statt, dies konnte sowohl in Rattenmodellen für Temporal-

lappenepilepsie als auch in humanen Patienten belegt werden (MATHERN et al. 2002;

HATTIANGADY et al. 2004; PIRTTILÄ et al. 2005; FAHRNER et al. 2007). Die

Neurotransplantation kann hier im Sinne einer „cell replacement“-Strategie eingreifen und so

die funktionelle Reparatur der geschädigten Areale ermöglichen (TURNER u. SHETTY

2003; RAEDT et al. 2007; LÖSCHER et al. 2008). Durch Transplantation fetaler, hippokam-

paler Zellen in die CA3 des Hippokampus konnte in einem Rattenmodell für Temporal-

lappenepilepsie (TLE) die pathologisch reduzierte Anzahl an Interneuronen wieder auf das

Ausgangsniveau von Kontrolltieren ohne TLE erhöht werden, was durch den immunhistolo-

gischen Nachweis typischer Marker für GABAerge Interneurone wie Glutaminsäure-Decar-

boxylase 67 (GAD67) und Calbindin belegt wurde (SHETTY u. TURNER 2000; SHETTY u.

HATTIANGADY 2007b). Die Wiederherstellung des physiologischen Netzwerkes ist mit der

fokalen Applikation von Antiepileptika nicht möglich und stellt daher einen entscheidenden

Vorteil für die Transplantation GABAerger Vorläuferzellen dar. Neben der reparierenden

Funktion kann durch die transplantateigene Sekretion von GABA analog zur fokalen

Stand der Forschung

28

Vigabatrin-Applikation eine verstärkte Hemmung innerhalb der Zielregionen erreicht werden;

elektrophysiologische Untersuchungen konnten einen Anstieg der synaptischen Inhibition

nach Transplantation belegen (ALVAREZ-DOLADO et al. 2006; BARABAN et al. 2009;

ZIPANCIC et al. 2010). Hippokampale Zellen, die aus 13 bzw. 14 Tage alten Rattenfeten

isoliert wurden, konnten nach Transplantation in das Stratum oriens nahe der CA2 des Hippo-

kampus im Kindling-Modell die Anfallsdauer reduzieren (MIYAMOTO et al. 1993). Des

Weiteren kann eine Zelltransplantation mit zeitlicher Nähe zum Epilepsie-induzierenden

Hirninsult auf die Epileptogenese Einfluss nehmen: Vier Tage nach einem durch Kainat aus-

gelösten Status epileptikus wurden hippokampale Vorläuferzellen in den Hippokampus ver-

pflanzt, die Tiere entwickelten eine zu 90 % geringere Anfallsfrequenz und um 75 % redu-

zierte Anfallsdauer gegenüber den Kontrolltieren ohne Transplantate. Ein halbes Jahr nach

der Operation waren noch 67 % der transplantierten Zellen vital, 16 % davon waren

GABAerge Interneurone. Zusätzlich zeigten die Tiere Verbesserungen in räumlichem Lernen

und Gedächtnistests (KURUBA et al. 2008; SHETTY 2011).

2.4.3. Neurotransplantation in Basalganglienregionen

Aufgrund massiver Umstrukturierungen im chronisch-epileptischen Hippokampus könnte

sich eine Transplantation in diese stark geschädigte Region als problematisch erweisen. Hin-

gegen erfahren die Basalganglien nicht derart erhebliche durch Epilepsie induzierte Um-

strukturierungen, sind aber in der Lage, die Generierung von Anfällen im limbischen System

zu modulieren. Daher sind sie möglicherweise als Zielregion für Transplantationen bei

Temporallappenepilepsie besser geeignet als der Hippokampus. Die Verwendung intakter

Hirnregionen als Zielregion wird kontrovers diskutiert, da experimentell im epileptischen

Hippokampus, besonders kurz nach einem Hirninsult, eine höhere Anzahl an transplantierten

Zellen überlebt als in den Hippokampi gesunder Versuchstiere (ZAMAN et al. 2001;

ZAMAN u. SHETTY 2002). Zudem kam es nach Transplantation neuraler Vorläuferzellen

aus einer embryonalen Zelllinie in gesunde Tiere zu Tumorbildung, ein Prozess, der bei ge-

schädigten Hippokampi nicht auftrat (CARPENTINO et al. 2008; SEBE u. BARABAN

2011). Entgegen dieser Beobachtungen konnte mit Hilfe von Transplantationen in die

Substantia nigra pars reticulata (SNr) bereits eine antikonvulsive Wirkung bestätigt werden:

Die ersten Transplantationen GABAerger Zellen in die SNr fanden in den 1990er Jahren statt.

Stand der Forschung

29

Nach Transplantation fetaler GABAerger Zellen sank die Suszeptibilität gegenüber der pro-

konvulsiven Substanz Pilokarpin (FINE et al. 1990). Diese Studie weist allerdings einige

Schwachstellen auf, da Effekte auch nach Kontrolltransplantationen mit nicht GABAergen

Zellen beobachtet wurden und keine quantitative Analyse der Überlebensrate der

Transplantate oder der Dauer des antikonvulsiven Effektes durchgeführt wurden. LÖSCHER

et al. konnten daher erstmals 1998 im Kindlingmodell zeigen, dass die Transplantation fetaler,

striataler Zellen aus 14 Tage alten Rattenfeten in die SNr zu einer transienten, signifikanten

Erhöhung der Nachentladungsschwelle und einer verminderten Anfallsschwere führt. Diese

Effekte traten mit nicht-GABAergen Zellen bzw. Zellmedium nicht auf und waren somit

spezifisch auf die Verwendung GABAerger Vorläuferzellen zurückzuführen (LÖSCHER et

al. 1998). Durch spätere Untersuchungen mit zwei verschiedenen, immortalisierten und teil-

weise zusätzlich genetisch veränderten GABAergen Zelllinien konnte bestätigt werden, dass

die bilaterale Transplantation GABAerger Zellen in die SNr in verschiedenen Anfalls-

modellen für einige Tage bis Wochen antikonvulsiv wirkt (THOMPSON u.

SUCHOMELOVA 2004; CASTILLO et al. 2006; CASTILLO et al. 2008; NOLTE et al.

2008). Bisher gibt es nur eine Studie zu Transplantationen in den subthalamischen Nukleus

(STN) in einem akuten Anfallsmodell (HANDRECK et al. 2012). Im Zuge dieser Unter-

suchung ist uns gelungen zu zeigen, dass nach Transplantation einer striatalen GABAergen

Mutterzelllinie und eines GABA-überexprimierenden Klons in den STN deutliche antikon-

vulsive Effekte im PTZ-Modell hervorgerufen werden können (HANDRECK et al. 2012).

Mit einer Effektdauer von lediglich maximal drei Wochen stellt dieser Ansatz jedoch keine

zufriedenstellende Lösung für das Problem der transienten Wirkung dar. Bemerkenswert ist

allerdings, dass sogar eine einseitige Transplantation in den STN die Anfallsschwelle signifi-

kant erhöhen konnte (HANDRECK et al. 2012). Diese aussichtsreichen Ergebnisse lassen

hoffen, dass auch die dauerhafte Suppression von Anfällen nach Auffinden der effektivsten

Zielregion möglich sein könnte.

2.4.4. Zellen für die Neurotransplantation

2.4.4.1. GABAerge Vorläuferzellen

Aus den früheren Parkinson-Studien ist bekannt, dass die Verwendung von Vorläuferzellen

gegenüber der Verwendung von adulten Neuronen bzw. Zelllinien aussichtsreicher sein

Stand der Forschung

30

könnte, da immature Precusorzellen nach Transplantation höhere Überlebensraten zeigen

(BJÖRKLUND u. LINDVALL 2000). Es ist nicht abschließend geklärt, wie lange GABAerge

Zelllinien in der Lage sind post transplantationem zu überleben und langfristig GABA freizu-

setzen (SHETTY 2011). Eine mögliche Erklärung für die in einigen Untersuchungen

beobachtete, transient antikonvulsive Wirkung könnte sein, dass die Zellen bald nach Trans-

plantation apoptotisch werden oder aus bisher nicht geklärten Gründen die GABA-Produktion

einstellen.

Bisher gibt es insgesamt wenige Studien zur Transplantation GABAerger Precursoren in die

SNr bzw. keine zur Transplantation in den STN. Zumeist wurde der Hippokampus als Ziel-

region ausgewählt. Neben den zuvor beschriebenen fetalen Zellen, die aus dem Hippokampus

selbst isoliert wurden, haben in den letzten Jahren vermehrt Transplantationen mit striatalen

Vorläuferzellen stattgefunden: Seit Ende der 90er ist bekannt, dass Zellen des ventralen Sub-

palliums des Telencephalons während der Gehirnentwicklung u.a. in den Kortex, Basal-

ganglienregionen, Hippokampus und Bulbus olfactorius wandern und dort GABAerge

Projektions- und Interneurone bilden (DE CARLOS et al. 1996; TAMAMAKI et al. 1997;

ANDERSON et al. 1997). Diese Regionen werden als mediale und laterale ganglionische

Eminenz (MGE bzw. LGE) bezeichnet (ANDERSON et al. 2001). Die Zellen der MGE

gelten als Hauptquelle kortikaler GABAerger Interneurone (LAVDAS et al. 1999; SUSSEL et

al. 1999; WICHTERLE et al. 2001). Besonders das hohe Potential zu Migration lässt

vermuten, dass sich die Zellen in geschädigten Arealen integrieren bzw. sich dort ansiedeln,

wo sie für eine Wiederherstellung des funktionellen Netzwerkes nützlich sein könnten

(ANDERSON u. BARABAN 2012). Die Zellen migrieren nach Transplantation zwischen 1

und 5 mm im Nagergehirn (WICHTERLE et al. 1999; SEBE u. BARABAN 2011). Die

Arbeitsgruppe um Scott BARABAN et al. (2009) transplantierte MGE-Vorläuferzellen in den

Kortex sehr junger Mäuse (P2) und beobachtete, dass die Zellen 60 Tage nach

Transplantation noch lebten, in dieser Zeit bis zu 3 mm migrierten und zu 69 % in GABAerge

Interneurone differenziert waren. Sie wiesen alle Charakteristika nativer Interneurone auf

(ähnliches Entladungsmuster), erhöhten die tonischen und phasischen GABA-Ströme im

Gehirn und bildeten inhibitorische Synapsen. Eine Verpflanzung dieser Zellen in genetisch-

epileptische Mäuse (Knockout eines Kalium-Kanals, Kv1.1-/-

) führte zu einer An-

fallsreduktion um 86 % (BARABAN et al. 2009). Es wurden weder eine Tumorbildung noch

Stand der Forschung

31

unerwünschte Verhaltensänderungen bei den Tieren beobachtet. In einem chemischen Modell

für akute Anfälle durch Pilokarpin konnte belegt werden, dass die signifikant antikonvulsive

Wirkung der transplantierten MGE-Zellen vergleichbar mit der Wirkung verschiedener

Antiepileptika (Valproat, Phenobarbital, Carbamazepin) war (ANDERSON u. BARABAN

2012). ZIPANCIC et al. (2011) verursachten im Mausmodell durch Ablation einer

GABAergen Subpopulation von Neuronen durch ein neurotoxisches Saporin eine verminderte

synaptische Inhibition, die nach MGE-Zelltransplantation in den anterioren und posterioren

Hippokampus wiederhergestellt werden konnte. Zudem wirkten die Zelltransplantate antikon-

vulsiv nach intraperitonealer Applikation von PTZ. Ein Jahr nach Transplantation konnten

noch 20 % vitale Zellen nachgewiesen werden (ZIPANCIC et al. 2010).

Auch in Rattenmodellen wurden MGE-Vorläuferzellen erfolgreich transplantiert und zeigten

eine funktionelle Integration und erhöhte Inhibition (HATTIANGADY et al. 2011). Die

Gruppe um Ashok Shetty hat in einem chronischen Epilepsiemodell verschiedene neuronale

Precursorzellen aus Rattenfeten in die CA3 des Hippokampus adulter Ratten transplantiert.

Zunächst verwendete die Gruppe LGE-Vorläuferzellen. Diese werden hauptsächlich zu

Projektionsneuronen u.a. des Striatums und Bulbus olfactorius (WICHTERLE et al. 2001).

Aus LGE-Vorläuferzellen differenzierten sich nach Transplantation in die hippkampale CA3

zu einem hohen Prozentsatz GABAerge Neurone (69 %), was sie neben den MGE-generierten

Zellen ebenfalls interessant für unsere Transplantationsversuche macht (HATTIANGADY et

al. 2008). Durch den Zusatz eines Wachstumsfaktors („Fibroblast-Growth-Factor 2“, FGF-2)

und eines Apoptosehemmers (Caspase-1-Inhibitor) in-vitro konnte ein langanhaltender

antikonvulsiver Effekt nach Transplantation der LGE-Zellen erzielt werden

(HATTIANGADY et al. 2008). So vorbehandelte Zellen wurden 4 Tage nach einem Status

epileptikus in die CA3 des Hippokampus transplantiert. In einer Gruppe von Tieren konnte

noch 9 bzw. 12 Monate nach Operation eine Anfallsreduktion von 67 % bzw. 89 % im

Vergleich zu Kontrolltieren, die ebenfalls einen Status epileptikus, aber keine

Zelltransplantation erfahren hatten, nachgewiesen werden. 33 % der Zellen hatten langfristig

im Gehirn überlebt (HATTIANGADY et al. 2008).

Des Weiteren verwendete auch die Arbeitsgruppe Shetty die zuvor genannten MGE-

Vorläuferzellen. Anstelle der Verwendung frisch gewonnener MGE-Vorläufer wurden diese

zunächst in-vitro als neurale Stammzellen („neural stem cells“, NSC) unter Zusatz bestimmter

Stand der Forschung

32

Proliferationsfaktoren als sogenannte Neurosphären kultiviert (WALDAU et al. 2010). Über

einen Zeitraum von drei Monaten konnte in chronisch epileptischen Tieren nach

Transplantation eine Reduktion der Anfallsfrequenz (43 %) und -dauer (51 %) beobachtet

werden. Mit 10 % der transplantierten MGE-NSCs machten auch hier die GABAergen Zellen

den größten Anteil der Neurone aus, allerdings ließen sich etwa 50 % der Zellen als

Astrozyten klassifizieren und waren positiv für den „Glial-derived neurotrophic factor“

(GDNF). GDNF ist im epileptischen Gewebe signifikant weniger vorhanden (WALDAU et

al. 2010) und besitzt selbst antikonvulsive Eigenschaften (KANTER-SCHLIFKE et al. 2007),

so dass ein Vorteil in der Verwendung von MGE-Stammzellen demzufolge darin liegt, dass

sie neben GABAergen Interneuronen auch GDNF-positive Astrozyten hervorbringen

(HATTIANGADY et al. 2007). Stammzellen sind ideale Transplantate insofern, dass sie sich

vergleichsweise einfach in-vitro expandieren lassen und somit beinahe unlimitiert vorliegen

(SHETTY u. HATTIANGADY 2007a).

Erste klinische Transplantationsstudien mit Vorläuferzellen bei epileptischen Menschen wur-

den unter Verwendung fetaler, porciner Zellen durchgeführt, was trotz vielversprechender,

antikonvulsiver Effekte aufgrund einer erhöhten Infektionsgefahr mit Retroviren des

Schweines zunächst nicht weiter verfolgt wurde (SCHACHTER et al. 1998). Durch die

immensen Fortschritte in der Stammzellforschung, wie etwa die kürzlich mit dem Nobelpreis

ausgezeichnete Induktion pluripotenter Stammzellen aus adulten körpereigenen Zellen

(GURDON 1962; TAKAHASHI u. YAMANAKA 2006), wird möglicherweise sogar eine

autologe Neurotransplantation eine zukunftsnahe Option für einen translationalen Ansatz in

der Tier- und Humanmedizin. Offen bleibt, ob die beschriebenen, langfristigen Effekte sich

auf andere Zielregionen wie die Basalganglien übertragen lassen.

2.4.4.2. NT2-Zellen

Vergleichend zur Transplantation hauptsächlich GABAerger Zellen wurden außerdem einer-

seits humane NT2-Vorläuferzellen und andererseits adulte NT2-Neuronen transplantiert, die

eine Mischkultur darstellen und somit neben GABA auch noch andere Neurotransmitter

sekretieren. Bei NT2-Zellen handelt es sich um eine humane Teratokarzinom-Zelllinie, die

1984 aus einem Hodentumor isoliert wurde (ANDREWS et al. 1984). Die Zellen können mit-

hilfe bestimmter Zusätze innerhalb von etwa 7 Wochen in adulte Neurone differenziert wer-

Stand der Forschung

33

den (ANDREWS et al. 1984; ANDREWS 1984; LEE u. ANDREWS 1986; PLEASURE et al.

1992). Differenzierte Neurone gleichen nativen Neuronen in ihrer Morphologie, der Expres-

sion neuronaler Marker, ihrer Fähigkeit funktionelle Synapsen auszubilden und ihrer Sekre-

tion und Antwort auf Neurotransmitter (PLEASURE et al. 1992; MUNIR et al. 1995;

PAQUET-DURAND u. BICKER 2007). Von der Arbeitsgruppe um Professor Bicker konnte

ein Differenzierungsprotokoll erarbeitet werden, mit dem sowohl die Kultur von NT2-Zellen

in einem Vorläuferstadium, als sogenannte “spherical aggregates”, analog der oben beschrie-

benen Neurosphären-Kultur durchgeführt werden kann, als auch die Generierung postmito-

tischer Neurone in kürzerer Zeit (4 Wochen) (PAQUET-DURAND et al. 2003). Adulte NT2-

Neurone stellen eine heterogene Population dar, die verschiedene Neurotransmitter wie

GABA, Glutamat, Dopamin, Acetylcholin und Serotonin sezernieren kann (ZELLER u.

STRAUSS 1995; YOSHIOKA et al. 1997; FISCHER et al. 2000; GUILLEMAIN et al. 2000;

IACOVITTI et al. 2001). Im Anschluss an die Differenzierung mit dem von der Arbeits-

gruppe Bicker entwickelten Protokoll sind die NT2-Neurone zu etwa 40 % glutamaterg, zu

35 % cholinerg, zu 15 % GABAerg und zu 2 % serotonerg (PODRYGAJLO et al. 2009). Die

Kulturen enthalten weniger als 5 % Kontamination mit undifferenzierten, aber postmito-

tischen Zellen (PODRYGAJLO et al. 2009). Mit den adulten Neuronen wurden bereits zahl-

reiche Transplantationsstudien in Krankheitsmodellen für Parkinson, amyotrophe Lateral-

sklerose, Hirntraumata und Schlaganfall durchgeführt: Es konnte in Sicherheits- und Mach-

barkeitsstudien gezeigt werden, dass die Zellen sich erfolgreich experimentell im Nagerhirn

und in klinischen Studien im humanen Gehirn integrieren; in keiner der Studien sind bisher

Tumore ausgehend von den transplantierten Zellen aufgetreten (TROJANOWSKI et al. 1993;

KLEPPNER et al. 1995; GARBUZOVA-DAVIS et al. 2002; SAPORTA et al. 2002;

RAVINDRAN u. RAO 2006; KONDZIOLKA et al. 2005; ZHANG et al. 2005). Die genann-

ten Charakteristika belegen daher den großen Wert der NT2-Modellneurone für experimen-

telle und klinische Forschung. NT2-Zellen könnten eine stets verfügbare Quelle an Neuronen

für Transplantationen darstellen (PAQUET-DURAND u. BICKER 2007). In-vitro ist es

gelungen, durch Zusatz spezifischer Wachstumsfaktoren oder Ko-Kulturen mit anderen Zel-

len bestimmte Subtypen, wie etwa vermehrt dopaminerge oder cholinerge Neurone zu gene-

rieren (IACOVITTI et al. 2001; SCHWARTZ et al. 2005; LUO et al. 2006; ZELLER u.

STRAUSS 1995). Hervorzuheben ist, dass besonders der Vergleich der GABAergen

Stand der Forschung

34

Vorläuferzellen mit den NT2-Vorläufern interessant ist, da gezeigt werden konnte, dass das

Wirtsmilieu entscheidend für die terminale Differenzierung der NT2-Vorläufer ist

(MIYAZONO et al. 1996; SAPORTA et al. 2000).

Zielsetzung und Arbeitshypothesen

35

3. ZIELSETZUNG UND ARBEITSHYPOTHESEN

Trotz intensiver Forschung und Entwicklung in den letzten 25 Jahren gibt es kaum einen Fort-

schritt in der Therapie von Epilepsiepatienten (LÖSCHER u. SCHMIDT 2011). Mit Aus-

nahme des Auftretens schwerer Nebenwirkungen unter systemischer Medikation mit Anti-

epileptika stellt die Pharmakoresistenz, die bei etwa einem Drittel der Patienten auftritt, das

dringend zu überwindende Hindernis einer erfolgreichen Behandlung dar (LÖSCHER u.

SCHMIDT 2011). Eine alternative therapeutische Strategie ist die fokale, gerichtete Therapie.

Hierbei werden Substanzen oder Transplantate direkt in das Gehirn appliziert. Systemische

Nebenwirkungen werden so auf ein Minimum reduziert und die Substanzwirkung auf die

Hirnregionen beschränkt, die bei der Anfallsentstehung, -weiterleitung und -modulation eine

tragende Rolle spielen. Neben dem epileptischen Fokus selbst sind dies vor allem die Basal-

ganglien (GALE 1988; GALE et al. 2008).

In Modellen für experimentelle Epilepsie konnte wiederholt gezeigt werden, dass sich durch

eine Inhibition der SNr, eine der Hauptausgangstrukturen der Basalganglien, unterschiedliche

Anfallstypen modulieren und unterdrücken lassen (GALE et al. 2008). Sie gilt als interessante

Zielstruktur für eine fokale Therapie. Andere Basalganglienregionen sind weniger gut unter-

sucht, wie beispielsweise der STN.

Ziel dieser Arbeit war es, vergleichend verschiedene Basalganglienregionen hinsichtlich ihrer

Eignung für fokale therapeutische Manipulationen zu untersuchen. Außerdem sollte überprüft

werden, ob eine selektive Manipulation des GABAergen Systems mittels geeigneter

Substanzapplikation oder neuronaler Transplantation als therapeutische Intervention effektiv

ist. Beiden Studien, der fokalen Substanzapplikation und der Neurotransplantation ist gemein,

dass durch die vermehrte Freisetzung von GABA oder die Hemmung der Glutamat-Freiset-

zung das bei Epilepsie bestehende Ungleichgewicht zwischen erregender und hemmender

Neurotransmission ausgeglichen werden soll. In beiden Studien wurde eine selektiv auf das

GABAerge System wirkende therapeutische Intervention mit einer weniger spezifischen ver-

glichen.

3.1. Studie I: Fokale Substanzapplikation

In Studie Ia sollte evaluiert werden, ob die fokale, gerichtete Applikation von Vigabatrin der

systemischen in ihrer antikonvulsiven Wirksamkeit und in Bezug auf das Auftreten uner-


36

wünschter Nebenwirkungen überlegen ist. Des Weiteren sollte geklärt werden, ob die Hem-

mung des indirekten Pfades (Untersuchungen des STN) des epileptischen Netzwerkes

ähnliche antikonvulsive Effekte aufweist wie die direkte Hemmung der SNr, und wie spezi-

fisch diese Effekte für einzelne Hirnregionen sind. Vergleichend hierzu haben wir in Studie

IIb fokusnah Botulinumtoxin injiziert, welches durch die Hemmung der Ausschüttung ver-

schiedener Neurotransmitter, u.a. Glutamat, weniger selektiv als Vigabatrin wirkt.

Die Arbeitshypothesen lauteten:

1. Mit fokaler Substanzapplikation in die Basalganglien können ähnlich

antikonvulsive Effekte erreicht werden wie mit der systemischen Gabe von

Vigabatrin, jedoch ohne die in der Literatur beschriebenen Nebenwirkungen.

2. Eine Hemmung des STN durch Vigabatrin führt zu antikonvulsiven Effekten.

3. Antikonvulsive Wirkungen sind spezifisch für die untersuchten Hirnregionen.

4. Botulinumtoxin wirkt nach intrahippokampaler Applikation langfristig

antikonvulsiv.


Ziel der Transplantation neuronaler Vorläuferzellen in die Basalganglien (Studie IIa) war es

zu untersuchen, ob die Zellen die Transplantation langfristig überleben, ob sie einen antikon-

vulsiven Effekt ausüben, und ob sie sich funktionell in das Netzwerk integrieren. Wir haben

neuronale GABAerge Vorläuferzellen aus der Ratte transplantiert, die in einem chronischen

Epilepsiemodell nach Transplantation in den Hippokampus bereits langanhaltende, antikon-

vulsive Effekte hervorrufen konnten (HATTIANGADY et al. 2008; WALDAU et al. 2010).

Als Vergleich diente hier die Transplantation von humanen NT2-Vorläuferzellen und adulten

NT2-Neuronen (Studie IIb), die eine Mischkultur darstellen und somit neben GABA auch

noch andere Neurotransmitter sekretieren (PODRYGAJLO et al. 2009).

Meine Arbeitshypothesen lauteten:

1. Die Transplantation GABAerger Vorläuferzellen in Regionen der Basalganglien

führt zu lang anhaltenden, antikonvulsiven Effekten im PTZ-Modell.


37

2. Die Vorläuferzellen überleben eine Transplantation langfristig und

differenzieren hauptsächlich in GABAerge Neurone.

3. Bei der Verwendung von Vorläuferzellen aus der Ratte gibt es nach

Transplantation in die Basalganglien keine Tumorbildung oder

Verhaltensauffälligkeiten.

4. Die Verwendung hauptsächlich GABAerger Vorläuferzellen ist wirksamer als die

Verwendung von neuronalen Mischkulturen.

Aus den bisher durchgeführten Arbeiten zur fokalen Therapie ergaben sich einige Fragestel-

lungen, die ich in meiner Arbeit untersuchen wollte:

1. Bislang konnte nicht geklärt werden, ob eine gerichtete, intrazerebrale Therapie einer

systemischen Administration von Antiepileptika überlegen ist.

2. Zudem wurden nicht direkt verschiedene Regionen innerhalb der Basalganglien, oder

sogar verschiedene Subregionen innerhalb einer Hirnregion wie im Falle der

Substantia nigra pars reticulata, als therapeutische Targets miteinander verglichen.

3. Der subthalamische Nukleus wurde bisher kaum für fokale Therapieansätze bei

Epilepsie untersucht, dabei sind neurochirurgische Verfahren zur Zugänglichkeit und

therapeutischen Manipulation in Form einer elektrischen Stimulation des STN bereits

klinisch etabliert (CHABARDES et al. 2002).

4. In bisherigen Transplantationsversuchen in die Basalganglienregionen konnte

lediglich ein transienter antikonvulsiver Effekt festgestellt werden (LÖSCHER et al.

2008). Unter Zusatz von Wachstumsfaktoren und Apoptosehemmern ist es allerdings

gelungen, den antikonvulsiven Effekt von neuronalen Precursorzellen zu verlängern,

die fokusnah in den Hippokampus transplantiert wurden (RAO et al. 2007). Zu

untersuchen, ob diese Wirksamkeitsverlängerung auch in Hirnregionen mit weniger

degenerativen Prozessen nötig und effektiv ist, sollte ein Ziel meiner Arbeit sein.

5. Weitere Fragestellungen ergaben sich aus der Beobachtung des erhöhten Risikos für

Entzündungs- und Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen gegenüber fokaler

Substanzadministration (NOLTE et al. 2008). Die Lösung dieses Problems ist vor

einer klinischen Anwendung unumgänglich. Mögliche Ansätze zur Abklärung

beinhalten neben der Verwendung allogener Transplantate eine immunhistochemische


38

Markierung der Zellen, um nach Transplantation evaluieren zu können, wie viele

Zellen in welcher Region überlebt haben.

Die Ergebnisse unserer ersten Transplantation führten dazu (s. Abschnitt 5.5.3), dass in einer

Nachfolgestudie untersucht werden sollte, ob eine Vorbehandlung der Zellen aus der MGE in-

vitro zu einer vermehrten Differenzierung in GABAerge Neurone führen könnte. Trotz des

vermehrten Einsatzes von Stamm- oder Vorläuferzellen in experimentellen Modellen für neu-

rodegenerative Erkrankungen wird deren Einsatz durch geringe Überlebensraten nach Trans-

plantation, sowie durch unzureichende Differenzierung in die gewünschten neuronalen Phä-

notypen limitiert (vgl. BOSCH et al. 2004). In der Vergangenheit wurden bereits einige

Substanzen für die Differenzierung von Vorläuferzellen in den GABAergen Phänotyp unter-

sucht. Die Beeinflussung der Differenzierung der Stammzellen könnte den Ausgang von

Transplantationsstudien verbessern (ANDRES et al. 2005). In unserer in-vitro Studie wurden

mehrere Vorbehandlungsprotokolle (s. Abschnitt 4.5.6) aus der Literatur zur Induktion des

GABAergen Phänotyps miteinander verglichen.

Die Arbeitshypothesen lauteten:

1. Eine Vorbehandlung führt in-vitro zu einer vermehrten Induktion des

GABAergen Phänotyps.

2. Eine Transplantation dieser vorbehandelten Zellen führt aufgrund der erhöhten

Zahl an GABAergen Neuronen zu antikonvulsiven Effekten.

Material und Methoden

39

4. MATERIAL UND METHODEN

Hinweis:

Dieser Arbeit angehängt sind eine Auflistung verwendeter Substanzen und Geräte sowie de-

ren Bezugsquellen, die Herstellungsprotokolle verwendeter Lösungen und die Protokolle

verwendeter Färbungen, soweit diese nicht bereits im Text genauer erläutert werden.

Soweit die verwendeten Materialien und Methoden in beiden Studien übereinstimmen, wer-

den sie gemeinsam beschrieben; Unterschiede werden im Text erläutert.

4.1. Tiere

Alle beschriebenen Tierversuche wurden randomisiert und verblindet durchgeführt. Für die

im Folgenden beschriebenen Studien wurden weibliche Wistar-Ratten der Versuchstierzucht

Harlan (Horst, Niederlande) verwendet. Bei Versuchsbeginn hatten die Tiere ein Gewicht von

200-220 g. Die Verwendung weiblicher Tiere sollte helfen, einen Vergleich zu früheren Stu-

dien zur Manipulation des GABAergen Systems der Arbeitsgruppe herstellen zu können (e.g.,

LÖSCHER u. FREY 1987; LÖSCHER et al. 1989a; LÖSCHER u. HÖRSTERMANN 1994;

GERNERT u. LÖSCHER 2001; SCHWABE et al. 2004a). Die Ratten wurden in 5er Gruppen

in Makrolonkäfigen Typ IV (Ebeco, Castrop-Rauxel) mit einer Einstreu aus Weichholz-

granulat unter standardisierten Umweltbedingungen (Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden,

Hellphase von 6-18 Uhr MEZ, bei einer Umgebungstemperatur von 22-24°C und einer Luft-

feuchtigkeit von 50-60 %) gehalten. Die Ratten erhielten eine Standardnagerdiät (Altromin

1324 Standardnahrung) und Leitungswasser ad libitum. Einmal in der Woche fand eine

Erneuerung des Futters und zweimal eine Erneuerung bzw. ein Auffüllen des Wassers statt.

Einmal wöchentlich wurden die Ratten in Käfige mit frischer Einstreu umgesetzt. An diesen

Tagen fanden keine Experimente statt oder das Umsetzen der Tiere erfolgte erst nach Ab-

schluss des jeweiligen Experimentes, um eine Beeinflussung der Tiere zu vermeiden. Zutritt

zum Tierstall hatten ausschließlich Experimentatoren und Tierpfleger. In dem Raum befanden

sich zu keiner Zeit männliche Tiere, um eine Synchronisierung des Zyklus der Tiere zu ver-

hindern. Eine kürzlich veröffentlichte Studie der Arbeitsgruppe konnte belegen, dass

weibliche Tiere ohne männliche Tiere nicht synchron ovulieren oder sogar gar keine Zyklus-

aktivität aufweisen (KÜCKER et al. 2010).


40

Nach Ankunft der Tiere vom Labortierzüchter hatten die Tiere mindestens eine einwöchige

Akklimatisierungsphase, in der keine Versuche stattfanden. Während dieser Zeit wurden die

Tiere allerdings 2-3 Mal gehändelt, das heißt, sie wurden an das Labor, die Experimentatoren

und allgemeine Prozeduren wie das Wiegen, Hochheben, Fixierung für Injektionen usw. ge-

wöhnt. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Tiere mit einer farbigen Schwanzmarkierung für die

spätere Identifikation versehen. Vor Beginn eines Experimentes wurden die Tiernummern der

Behandlungs- bzw. Kontrollgruppe zugelost. Alle Experimente wurden in Einklang mit der

Richtlinie der Europäischen Gemeinschaft 86/609/EEC durchgeführt und von dem Tier-

schutzbeauftragten der Stiftung Tierärztliche Hochschule begutachtet. Die Nummer der Tier-

versuchsgenehmigung lautet 09/1769.

Die Studie Ib, zur fokalen, intrahippokampalen Applikation von Botulinumtoxin B fand im

Rahmen eines Forschungsstipendiums in der Abteilung für Neurologie der University of

California Davis, Sacramento, Kalifornien, USA, unter der Leitung von Professor Dr. Michael

Rogawski statt. Um Studienergebnisse mit Daten zur antikonvulsiven Wirkung von Botuli-

numtoxinen aus vergleichbaren Studien der Arbeitsgruppe Rogawski vergleichen zu können,

wurden männliche Spraque-Dawley Ratten für diese Versuche verwendet. 35 Tiere wurden

von den Taconic Farms (Germantown, NY) bezogen und hatten bei Ankunft ein Gewicht von

200-225 g. Die Haltung der Tiere erfolgte im universitätseigenen Vivarium, Zutritt hatten nur

Experimentatoren und Tierpfleger. Der Stall wurde von der „Association for Assessment and

Accreditation of Laboratory Animal Care” abgenommen. Die Tiere wurden in 2er Gruppen

gehalten, es sei denn, im Laufe des Versuches fand die permanente Implantation von

Führungsrohren und Ableitelektroden statt; für diesen Fall wurden die Tiere nach Operation

individuell gehalten. Im Tierstall herrschten kontrollierte Umweltbedingungen (22-26 °C, 40-

50 % Luftfeuchte) und ein 12 h Hell-Dunkel-Zyklus. Als Einstreu dienten Holzspäne. Die

Durchführung der Experimente beschränkte sich auf die Vormittage (zwischen 9 und 12 Uhr).

Vor Versuchsbeginn wurden die Tiere regelmäßig gehändelt und am Tag des Experiments

eine halbe Stunde vor Beginn in den Versuchsraum verbracht, um eine Akklimatisierungs-

phase zu gewährleisten. Alle Studien wurden nach Protokollen durchgeführt, die vom

„Institutional Animal Care and Use Committee” (IACUC) in Übereinstimmung mit den

Richtlinien für die Pflege und Gebrauch von Labortieren des National Research Council (Na-


41

tional Academy Press, Washington, DC; http://www.nap.edu/readingroom/books/labrats/)

begutachtet wurden.

4.2. Akutes Anfallsmodell

In beiden Studien wurde das gleiche Anfallsmodell verwendet, um die Ergebnisse der Studien

vergleichen zu können. Es handelt sich hierbei um ein akutes Anfallsmodell, den intravenösen

Pentylentetrazol-Anfallsschwellentest, kurz PTZ-Test. Bei diesem Modell wird mithilfe der

prokonvulsiv wirkenden Substanz Pentylentetrazol ein generalisierter, klonischer Anfall aus-

gelöst. Pentylentetrazol bindet an der Picrotoxin-Bindungsstelle der α-Untereinheit des

GABAA-Rezeptors (RAMANJANEYULU u. TICKU 1984; HUANG et al. 2001) und wirkt

als GABAA-Rezeptor-Antagonist: In hohen Dosen verhindert die Bindung von PTZ eine post-

synaptische Hyperpolarisation der Zelle durch GABA und agiert damit prokonvulsiv

(MACDONALD u. BARKER 1977; LÖSCHER 2009a).

Der PTZ-Test wird in der pharmazeutischen Industrie als schnelle und sehr sensitive

Screening-Methode verwendet, um das antikonvulsive oder prokonvulsive Potential be-

stimmter Substanzen in der Wirkstoffentwicklung zu testen (LÖSCHER 2011). Durch die

intravenöse Administration von PTZ werden epileptische Anfälle akut unter der Infusion aus-

gelöst, d.h. die Versuchstiere zeigen keine spontanen Anfälle und keine pathologischen Ver-

änderungen des Gehirns (LÖSCHER 1999). Es konnte gezeigt werden, dass Vigabatrin durch

die Erhöhung der GABAergen Inhibition die PTZ-Anfallsschwelle dosisabhängig erhöht;

dieser Test reagiert sehr sensitiv auf Manipulationen des GABAergen Systems (LÖSCHER

1980; LÖSCHER 1982). Dieser Test kann mit einem Abstand von mindestens 48 Stunden

wiederholt in demselben Tier durchgeführt werden, ohne dass die vorangegangene

Schwellenbestimmung einen Einfluss auf die folgende Messung ausübt (POLLACK u. SHEN

1985). Dieses Vorgehen erlaubt, eine individuelle Anfallsschwelle für jedes naive Tier bei

Versuchsbeginn zu ermitteln, die im Folgenden als Basisschwelle benannt wird. So wird er-

möglicht, für jedes Tier eine eventuelle Schwellenerhöhung nach Substanzapplikation bzw.

Zelltransplantation in Relation zur individuellen Basisschwelle zu setzen (LÖSCHER 2009a).

In dieser Arbeit ist die maximale Anzahl an Schwellen pro Tier auf 6 limitiert, in dieser Zeit

konnten wir keinen Kindling-Effekt feststellen, das heißt, die wiederholten Anfalls-

schwellentests führten nicht zu einer erhöhten Suszeptibilität gegenüber PTZ. In unserer Ar-


42

beitsgruppe konnte kürzlich gezeigt werden, dass wiederholtes Testen von bis zu 8 PTZ-An-

fallsschwellen nicht zum Aufkindeln der Tiere führt (BANKSTAHL et al. 2012).

4.2.1. Ablauf des PTZ-Tests

Die Tiere wurden mindestens eine

halbe Stunde vor Versuchsbeginn in

den Versuchsraum gebracht und aus

ihren Käfigen in das Open-Field um-

gesetzt. Nach dieser Eingewöhnungs-

phase begann der Versuch. Die intra-

venöse Infusion von PTZ erfolgte in

eine der lateralen Schwanzvenen des

Tieres mit einer Flussrate von

1 ml/min und einer Konzentration

von 0,8 % PTZ in isotoner Natriumchloridlösung (NaCl, s. Abb. 3). Dafür wurde eine 24 G

Injektionskanüle in die vorher durch warmes Wasser dilatierte Vene eingeführt und mittels

Klebeband fixiert. Die Kanüle war über einen Polyethylenschlauch (Kleinfeld Labortechnik,

Gehrden, Deutschland) mit einer Infusionspumpe (PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus,

Holliston, Massachusetts) verbunden. Das Tier wurde dann in einen Makrolonkäfig Typ III

verbracht und konnte sich innerhalb des Käfigs frei bewegen, während gleichzeitig die Infu-

sion und die Stoppuhr gestartet wurden. Sobald das Tier einen klonischen Anfall erfuhr,

beendeten wir die Infusion und entfernten die Kanüle. Mithilfe der Infusionsparameter, des

Körpergewichtes der Ratte und der gemessenen Zeit konnte die PTZ-Dosis in mg/kg ermittelt

werden, die für das Auslösen des Klonus erforderlich war. Des Weiteren haben wir die Dosis

bis zum Auftreten eines Myoklonus ermittelt. Der Myoklonus ist die erste sichtbare Muskel-

zuckung, die dem klonischen Anfall immer vorausging. Dieser Zeitpunkt wurde ebenfalls

untersucht, da in früheren Studien gezeigt werden konnte, dass verschiedene Substanzen

einen unterschiedlichen Einfluss auf die beiden untersuchten Anfallstypen, Myoklonus und

Klonus, haben können (LÖSCHER et al. 1991; LÖSCHER 2009a). Außerdem wurden alle

auffälligen Verhaltensweisen und das Auftreten weiterer Anfallstypen nach Ende der PTZ-

Infusion notiert, bis die Tiere wieder normales Verhalten zeigten.

Abb. 3 Aufbau des Pentylentetrazol-Anfallsschwellentests.

LÖSCHER 2009a.


43

Die Schwellenbestimmungen fanden alle zur gleichen Tageszeit, meistens morgens zwischen

9 und 11 Uhr statt. Alle Tiere wurden zu Beginn jeder Schwellenbestimmung gewogen. Der

Versuch wurde in der Botulinumtoxinstudie analog durchgeführt, es unterschieden sich nur

die verwendeten Gerätschaften (s. Abschnitt 10.1).

4.2.2. Vorabstudie: Einfluss unterschiedlicher Anästhetika auf die Anfalls-

schwelle

Vor Beginn der Hauptversuche führten wir eine Vorabstudie zur Wirkung der von uns ver-

wendeten Anästhetika durch, um narkosebedingte antikonvulsive Effekte auf die Anfalls-

schwellen ausschließen zu können. Hierzu wurde in 7 Tieren eine Basisschwelle bestimmt

und dann in einer Gruppe von 3 Tieren eine Anästhesie mit Xylazin (2 mg/kg i.p., Riemser)

und Ketamin (60 mg/kg i.p., medistar) und in 4 anderen Tieren eine Inhalationsnarkose mit

Isofluran (CP-Pharma, Induktion 3 %, Erhaltung 1,5 %, Sauerstoffzufuhr 1 l/min) durchge-

führt. Die Narkose wurde für die Dauer aufrechterhalten, die für die Mikroinjektion einer

Substanz bzw. die Transplantation von Zellen erfahrungsgemäß nötig gewesen wäre, i.d.R.

dauerten diese Art von Operationen zwischen 45 und 60 Minuten. Sechs Stunden nach der

simulierten Behandlung (Mikroinjektion bzw. Transplantation) fand erneut eine Anfalls-

schwellenbestimmung mithilfe des PTZ-Tests statt. Die Dosis für die Auslösung des Myo-

klonus und Klonus wurde für beide Narkoseregimes mit der Basisschwelle verglichen (s.

Abb. 4).

Abb. 4 Studiendesign der Vorabstudie zu anästhesiebedingten Veränderungen der PTZ-Anfallsschwelle.

4.2.3. Einfluss des Zyklusstadiums auf die PTZ-Anfallsschwelle

In einem Teil der weiblichen Tiere erfolgte zusätzlich die Entnahme eines Vaginalabstrichs,

um eventuelle zyklusbedingte Effekte auf die Anfallsschwelle ermitteln zu können. Die Ab-


44

striche wurden auf Objektträgern ausgestrichen und nach Fixierung mit Shorr’s Färbelösung

gefärbt und unter einem Lichtmikroskop untersucht (EVERETT 1989). Neben den Phasen

Proöstrus, Östrus, Metöstrus und Diöstrus konnten auch Zwischenphasen beobachtet werden

(s. Abschnitt 5.2). Es wurde evaluiert, ob der Zyklusstand der Tiere einen Einfluss auf die

Anfallsschwelle hat.

4.3. Studie Ia: Fokale Applikation von Vigabatrin

4.3.1. PTZ-Anfallsschwellen

Für Studie I, den Vergleich systemischer und fokaler Substanzapplikation, wurden in den

meisten Fällen nur 2 Anfallsschwellen, eine Basisschwelle und eine Schwelle nach Viga-

batrin-Injektion bestimmt, so dass nicht jedes Tier zu jedem Zeitpunkt getestet wurde. Zeit-

punkte für die Anfallsschwellenbestimmungen lagen bei 2, 6, 24, 48, 96 und 144 h post

Substanzapplikation (s. Abb. 5). Diese Zeitpunkte wurden aufgrund von Daten aus der Lite-

ratur zur antikonvulsiven Wirkung von Vigabatrin gewählt (JUNG et al. 1977; GALE u.

IADAROLA 1980; LÖSCHER 1980; LE GAL LA SALLE et al. 1983; MCNAMARA et al.

1984; SHIN et al. 1986; LÖSCHER u. FREY 1987; VELÍŠKOVÁ et al. 1996a; SCHWABE

et al. 2004a; SCHWABE et al. 2004b).

Abb. 5 Studiendesign für systemische und fokale Administration von Vigabatrin im PTZ-

Anfallsschwellenmodell. Nicht jedes Tier wurde zu jedem Zeitpunkt getestet, es lagen mindestens 48 Stunden

zwischen den einzelnen Schwellenbestimmungen.


45

4.3.2. Systemische Administration von Vigabatrin

Etwa 3-4 Tage vor Vigabatrin-Administration wurde die PTZ-Basisschwelle bestimmt und

der PTZ-Test zu verschiedenen Zeitpunkten nach Vigabatrin-Behandlung wiederholt (s. Ab-

schnitt 4.2).

Vigabatrin wurde freundlicherweise von Merrell (Merrell International Research Center,

Strasbourg, Frankreich) zur Verfügung gestellt. Für die systemische Administration von

Vigabatrin testeten wir zwei unterschiedliche Dosierungen, die sich aus früheren Studien

ergaben (GALE u. IADAROLA 1980; LÖSCHER 1982; SHIN et al. 1986; LÖSCHER u.

FREY 1987). Bei 15 Tieren erfolgte eine intraperitoneale Injektion mit der Dosis 600 mg/kg,

bei einem Injektionsvolumen von 3 ml/kg. Bei 6 Tieren verabreichten wir die doppelte Dosis

(1200 mg/kg) ebenso i.p. in einem Injektionsvolumen von 3 ml/kg. Bei den Tieren wurde 2,

24, 32 und 56 h nach Vigabatrin-Administration die rektale Körpertemperatur ermittelt und

bei einem deutlichen Temperaturverlust wurden die Käfige über Nacht unter einer Wärme-

lampe platziert. Bei allen Tieren fand eine tägliche Bestimmung des Körpergewichts statt. Als

Kontrolle diente der Gewichtsverlauf bei 18 gleich alten Ratten. Die Tiere wurden täglich

beim Wiegen beobachtet und Verhaltensauffälligkeiten notiert.

4.3.3. Fokale Applikation von Vigabatrin

Die Mikroinjektion von Vigabatrin respektive NaCl im PTZ-Modell wurde insgesamt an 215

Tieren durchgeführt, davon mussten 4 Tiere aufgrund unklarer Lokalisation der Mikroinjek-

tion ausgeschlossen werden, so dass 211 Tiere für die finale Auswertung blieben (s. Abschnitt

5.3.1.1). Die Zuordnung der Ratten zu der Behandlungsgruppe mit Vigabatrin oder der

Kontrollgruppe mit isotoner Natriumchloridlösung (NaCl) erfolgte randomisiert. Der Experi-

mentator war verblindet gegenüber der Zugehörigkeit des Tieres zur Behandlungs- oder Kon-

trollgruppe. Aufgrund der Ergebnisse der Vorabstudie zur Wahl des Anästhetikums haben wir

uns für die Verwendung eines Inhalationsanästhetikums, Isofluran (Cp-pharma, Burgdorf,

Deutschland), entschieden (s. Abschnitt 4.2.2). Für die Mikroinjektion wurden die Tiere mit-

hilfe einer selbstgebauten Atemmaske mit einer Induktionskonzentration von 3 % Isofluran

narkotisiert. Das Fell im Operationsfeld wurde mit einer Schere entfernt und die Tiere wurden

in den stereotaktischen Apparat (Kopf bzw. Stölting) eingespannt. Der stereotaktische

Apparat diente der Fixierung des Schädels; für diesen Zweck wurden Ohrstifte beidseits in


46

den Gehörgang eingeführt und die oberen Schneidezähne der Ratte in eine Oberkieferhalte-

rung eingebracht. Andererseits hat der Stereotakt drei Raumachsen, mit deren Hilfe sehr prä-

zise bestimmte Koordinaten im Operationsfeld angefahren werden können. Der stereotak-

tische Atlas von PAXINOS und WATSON (2007) diente zur Bestimmung der Koordinaten

für die Trepanation der Schädeldecke und die Mikroinjektion von Vigabatrin in die SNr oder

den STN (s. Abb. 6 und Tab. 1).

Abb. 6 Querschnitte des Rattengehirns auf der Ebene des STN respektive der anterioren SNr und

Vergrößerung dieser Teilbereiche des Gehirns. Modifiziert nach NOLTE 2005.

Zusätzlich wurde in einer Gruppe von 10 Tieren in das anterior des Globus pallidus gelegene

dorsale, zentrale Striatum injiziert. Um ein genaues Anfahren der Koordinaten zu ermög-

lichen, wurden zwei Kreuzungspunkte der Schädelnähte als Bezugspunkte in einer Ebene

ausgerichtet, indem die Oberkieferhalterung des Stereotakten auf 3,3 mm ventral der Inter-

aurallinie eingestellt wurde. Entsprechend der Darstellung in einem Atlas des Rattengehirns

mit Koordinaten für spezifische Hirnregionen (PAXINOS u. WATSON 2007) liegen so die

beiden Knochennähte auf einer Ebene. Es handelt sich dabei um den rostralen Kreuzungs-

punkt Bregma und den kaudalen Kreuzungspunkt Lambda (s. Abb. 7).


47

Abb. 7 Abbild eines Ratten-

schädels mit Darstellung der

Orientierungspunkte Bregma und

Lambda für stereotaktische

Operationen. Modifiziert nach

PAXINOS und WATSON 2007.

Wenige Minuten nach dem Einspannen der Ratte in den Stereotakten konnte die Narkose auf

eine Erhaltungskonzentration von 1,5 % Isofluran heruntergefahren werden. Die Narkosetiefe

wurde anhand des Ausbleibens des Zwischenzehenreflexes überprüft und gegebenenfalls an-

gepasst. Die von Fell befreite Kopfhaut wurde mit 70 %igem Ethanol desinfiziert. Danach

erfolgte eine Lokalanästhesie mit 2 %igem Tetracainhydrochlorid (Caesar & Loretz, Hilden,

Deutschland). Nach einer Einwirkzeit von 5 Minuten wurde die Kopfhaut auf einer Länge von

etwa 1,5 cm mit einem Skalpell eröffnet und mit Bulldogklemmen an den Seiten des Opera-

tionsfeldes fixiert. Das nun frei liegende Periost wurde mit Bupivacainhydrochlorid

(Carbostesin® 0,25 %, Astra Zeneca, Wedel, Deutschland) anästhesiert (Einwirkzeit erneut

5 min) und entfernt. Eine Reinigung der Schädeldecke mit 35 %iger Wasserstoff-

peroxidlösung ermöglichte die Darstellung der Knochennähte. Nach Bestimmung der

Koordinaten von Bregma wurden die Koordinaten für die SNr oder den STN in Relation zu

Bregma angefahren und auf der Schädeldecke markiert. Dort erfolgte die Trepanation der

Schädeldecke für die Mikroinjektion mit einem Dentalbohrer (Dremel, Leinfelden-

Echterdingen, Deutschland). Die Koordinaten ergaben sich aus vorherigen Experimenten in

gleich alten Ratten desselben Stammes.

Tab. 1 Stereotaktische Koordinaten für die Zielregionen der Mikroinjektion von Vigabatrin/NaCl.

Hirnregion

Koordinaten STN aSNr pSNr Striatum

Posterior -3,6 -5 -5,7 0

Lateral ±2,6 ±2 ±1,8 ±3

Ventral -7,9/-8 -8,3/-8,4 -8,3/-8,4 -5

Sind zwei Koordinaten für die ventrale Koordinate angegeben, wurden die Koordinaten je nach Wahl des stereo-

taktischen Apparates (Hersteller: David Kopf bzw. Stölting) eingestellt.


48

Das System für die Mikroinjektion basierte auf einem in unserer Arbeitsgruppe etablierten

Protokoll (GERNERT u. LÖSCHER 2001). Es bestand aus einer 0,5 μl Hamiltonspritze

(Hamilton Bonaduz AG, Schweiz), die über einen etwa 30 cm langen, flexiblen Polyethylen-

schlauch mit einer Injektionskanüle aus rostfreiem Stahl (äußerer Durchmesser 350 μm,

innerer Durchmesser 150 μm) verbunden wurde (s. Abb. 8). Das System wurde auf Durch-

gängigkeit und Genauigkeit überprüft. Die Befestigung der Injektionskanüle erfolgte am

beweglichen Arm des Stereotakten. Ein erneutes Anfahren von Bregma diente der Ausrich-

tung der Kanüle auf die Koordinaten für die jeweilige Hirnregion in Relation zu Bregma.

Nach Absenken der Kanüle in die gewünschte Hirnregion warteten wir eine Minute, bevor

wir mit der Mikroinjektion begonnen, um Druckreaktionen des Gewebes abzuwarten. Danach

wurden über 4 Minuten 0,25 μl Vigabatrin (40 μg/μl gelöst in destilliertem Wasser) oder

isotone Natriumchloridlösung (NaCl) bei Kontrolltieren infundiert. Diese Dosiswahl ergab

sich aus früheren Dosis-Wirkungs-Experimenten mit dem gleichen Rattenstamm und -

geschlecht im Kindling-Modell (LÖSCHER u. FREY 1987). Das Injektionsvolumen wurde

anhand der Vorwärtsbewegung eines Markerfarbstoffes (Thionin) kontrolliert, welcher durch

Luftblasen und destilliertes Wasser von Vigabatrin, respektive NaCl, getrennt war.

Nach Abschluss der Mikroinjektion wurde die Kanüle wiederum eine Minute im Gewebe

belassen, um eine ausreichende Diffusion der Substanz zu ermöglichen und einen Rückfluss

entlang des Einstichkanals zu minimieren. Nach Entfernen der Kanüle aus dem Gewebe fand

eine erneute Durchlässigkeitsprüfung statt. Das Verfahren wurde für die kontralaterale Hirn-

hemisphäre wiederholt. Nach bilateral erfolgter Mikroinjektion verschlossen wir die Haut

(teilweise nach Wundauffrischung) mithilfe von Einzelheften mit einem resorbierbaren

Nahtmaterial (Surgicryl PGA, Hünningen, Belgien) und beendeten die Inhalationsnarkose.

Abb. 8 System für die Mikroinjektion.


49

4.3.4. Verhaltensbeobachtung auf Nebenwirkungen

Nach der Operation wurden die Tiere zur weiteren Beobachtung für mindestens eine Stunde

in einen durchsichtigen Plastikkäfig ohne Einstreu gesetzt. Dieses Vorgehen diente neben der

täglichen Gewichtsmessung zur Beobachtung von eventuell auftretenden Nebenwirkungen.

Besondere Aufmerksamkeit galt abnormaler lokomotorischer Aktivität, Sedation, Ataxie oder

Stereotypien wie Zirkeln oder veränderter Körper- und Kopfhaltung (Protokoll modifiziert

nach HÖNACK u. LÖSCHER 1995; POTSCHKA et al. 1998; GERNERT u. LÖSCHER

2001). Zusätzlich wurden die Tiere 30 Minuten vor jeder PTZ-Schwellenmessung in ein

Open-Field gesetzt und auf diese Parameter hin beobachtet. Der Experimentator war verblin-

det gegenüber der Behandlung des Tieres mit Vigabatrin oder Kontrollsubstanz.

4.3.5. Fokale Vigabatrin-Applikation nach Status epileptikus

Bei drei Tieren wurde mithilfe des Muskarin-Rezeptor-Agonisten Pilokarpin einige Wochen

vor Vigabatrin-Mikroinjektion in den STN ein Status epileptikus ausgelöst, um ausblickend

auf künftige Untersuchungen die Wirkung einer fokalen Vigabatrin-Applikation in chroni-

schen Epilepsiemodellen zu testen. Dieser preliminäre Versuch diente primär einem Nachweis

der Machbarkeit. Pilokarpin wurde nach einem etablierten Protokoll in unserer Arbeitsgruppe

fraktioniert injiziert, bis ein selbsterhaltender Status epileptikus eintrat (adaptiert nach GLIEN

et al. 2001).

Um die Pilokarpin-Dosis zu reduzieren und somit die Mortalität der Status-Induktion zu sen-

ken, wurde 12-18 Stunden vor Pilokarpin-Injektion oral Lithiumchlorid (127 mg/kg, gelöst in

2 ml/kg Aqua dest.) verabreicht. Zudem fand 30 Minuten vor Beginn der Status-Induktion

eine Antagonisierung der peripheren Wirkungen des Pilokarpins mit 1 mg/kg Methyl-

scopolamin (gelöst in 2 ml/kg Aqua dest. i.p.) statt. Pilokarpin wurde zunächst als Bolus

(30 mg/kg in 3 ml/kg Aqua dest. i.p.) und dann in dreißigminütigen Abständen in einer

Dosierung von 10 mg/kg (in 1 ml/kg Aqua dest. i.p.) verabreicht, bis ein generalisierter Anfall

auftrat. Wenn dieser nicht selbstständig endete oder das Tier das Bewusstsein zwischen kurz

aufeinander folgenden Anfällen nicht wiedererlangte, wurde dies als selbsterhaltender Status

epileptikus definiert. Die Zahl der auf den Bolus folgenden Injektionen war auf maximal 3

beschränkt. Zur Senkung der Mortalität und einer Vergleichbarkeit des Hirninsultes innerhalb

der Gruppe wurde der Status nach 90 Minuten mit einer Diazepam-Injektion (10 mg/kg, ent-


50

spricht 2 ml/kg Faustan®-Fertiglösung, i.p.) abgebrochen. In den meisten Fällen erfolgte nach

15 Minuten eine zweite und nach insgesamt 30 Minuten eine dritte Diazepam-Injektion, um

die Konvulsionen zu terminieren. Um eine Auskühlung der Tiere nach Diazepam-Behandlung

zu verhindern, wurden sie mit Handschuhen, die mit warmem Wasser gefüllt waren, in

Papiertücher gewickelt. Die Handschuhe wurden alle 30 Minuten erneuert, bis die Tiere wie-

der vollständig wach waren. Nach Status-Induktion ernährten wir die Tiere aufgrund eines

schlechten Allgemeinzustandes einige Tage mit Weichfutter (Babynahrung), in Einzelfällen

verabreichten wir wegen einer Dehydratation isotone Natriumchloridlösung (4 ml/Ratte i.p.).

Etwa 3-4 Wochen nach Status epileptikus wurde die PTZ-Basisschwelle bestimmt und dann

dem Ablauf der vorher beschriebenen Versuche der fokalen Vigabatrin-Applikation gefolgt.

Für diese Gruppe von Tieren erfolgte aufgrund der Ergebnisse der vorausgegangenen Unter-

suchungen nur eine Messung der Zeitpunkte 24 und 96 Stunden nach Vigabatrin-Mikroinjek-

tion im PTZ-Test.

4.4. Studie Ib: Fokale Applikation von Botulinumtoxin


Nach Botulinumtoxininjektion wurden an Tag 1, 2, 3, 4, 7 und 14 PTZ-Schwellen bestimmt

(s. Abb. 9), diese Daten ergaben sich ebenfalls aus der o.g. Literatur zur fokalen

Substanzapplikation als auch aus unveröffentlichten Studien und früheren Daten der Arbeits-

gruppe um ROGAWSKI (2009).

Abb. 9 Studiendesign für die fokale Infusion von Botulinumtoxin B bzw. Vehikel im PTZ-

Anfallsschwellenmodell mit anschließenden Verhaltenstests. Nicht jedes Tier wurde zu jedem Zeitpunkt

getestet, es lagen mindestens 48 Stunden zwischen den einzelnen Schwellenbestimmungen.


51

4.4.2. Botulinumtoxin

Botulinumtoxin B wurde freundlicherweise von Solstice Neurosciences Inc. (San Francisco,

Kalifornien, USA) zur Verfügung gestellt. Botulinumtoxin B war zu 70 % von intra-moleku-

laren Disulfid-Bindungen befreit worden, so dass das Toxin in aktiver Form vorlag. Alle

Hüllproteine wurden ebenfalls entfernt. Als Vehikel diente, wie im Fertigarzneimittel

Myobloc® (USA) bzw. Neurobloc

® (Deutschland), eine Lösung aus 0,05 % humanem Serum-

albumin, 0,01 M Dinatriumsuccinat, 0,1 M Natriumchlorid, destilliertem Wasser und Salz-

säure (DRESSLER 2012). Aufgrund unveröffentlichter Daten und der Ergebnisse aus

früheren Studien der AG ROGAWSKI (2009) wurde initial eine Dosis von 1000 U

Botulinumtoxin B unilateral in den linken Hippokampus der Ratten injiziert. In einer zusätz-

lichen Gruppe von 6 Tieren verwendeten wir aufgrund von beobachteten Verhaltensänderun-

gen und spontanen Anfällen in der ersten Gruppe (s. Abschnitt 5.4.2) eine geringere Dosis

von 500 U.

4.4.3. Convection-enhanced delivery

Anstelle der zuvor beschriebenen konventionellen Mikroinjektion wurde in dieser Studie zur

fokalen Substanzapplikation die sogenannte „convection-enhanced delivery” (CED) genutzt

(s. Abb. 10). Diese Methode ermöglicht durch die Anwendung von hydrostatischem Druck

eine homogene Verteilung von Substanzen im Gewebe (ROGAWSKI 2009) und wird seit

einigen Jahren in der Onkologie zur Chemotherapie von Gehirntumoren eingesetzt

(DEBINSKI u. TATTER 2009; BUONERBA et al. 2011). Für die intrazerebrale Applikation

großmoleküliger Peptide wie Botulinumtoxin ist eine Mikroinjektion wie zuvor beschrieben

nicht geeignet. Bei einer solchen Bolusdeposition ist die Verteilung der Substanz auch von

der substanzeigenen Fähigkeit zur Diffusion im Gehirngewebe abhängig. Antiepileptika sind

kleinmolekülige Substanzen und verteilen sich daher sehr schnell im Gewebe. Allerdings ent-

steht so ein hoher Konzentrationsgradient innerhalb der Hirnregion (ROGAWSKI 2009).

Neurotoxine hingegen haben kaum die Fähigkeit zur Diffusion oder zur Aufnahme in kleine

Kapillaren. Sie müssen durch die Anwendung von Druck verteilt werden, nur so kann eine

homogene Verteilung erreicht werden. Ein Vorteil der Toxine ist allerdings, dass sie länger

am Applikationsort verbleiben, daher ist ihre Wirkung potentiell langfristiger als die der

Antiepileptika (ROGAWSKI 2009).


52

Abb. 10 Vergleich der Substanzkonzentration in der Extrazellulärflüssigkeit nach Bolus-Deposition

(fokaler Mikroinjektion) und Convection-enhanced delivery (CED). Bolus-Deposition führt zu einer in-

homogenen Verteilung durch Diffusion, die zu einem schnell abnehmenden Konzentrationsgradienten innerhalb

der perfundierten Hirnregion (gestrichelte Linien) führt. CED hingegen ermöglicht eine einheitliche Substanz-

konzentration innerhalb des Gewebes mit scharf abfallenden Konzentrationen an den Grenzen der perfundierten

Region. Modifiziert nach ROGAWSKI 2009.

4.4.4. Fokale Applikation von Botulinumtoxin B

Insgesamt wurden für diese Studie 35 Tiere verwendet. Da von einem Teil der Tiere ein

Elektroenzephalogramm aufgezeichnet werden sollte, wurden bei diesen Tieren permanent

Führungsrohre und Ableitelektroden implantiert. Bei allen anderen Tieren fand die CED von

Botulinumtoxin B bzw. Vehikel intra operationem statt und sie erhielten keine permanent

implantierten Aufsätze. Ein Tier starb bei der Bestimmung der PTZ-Basisschwelle, so dass

sich aus den verbliebenen 34 Tieren, wie in Tab. 2 dargestellt, folgende Gruppen ergaben:

Tab. 2 Tiergruppen für die fokale Applikation von Botulinumtoxin B (BTX B).

Gruppengröße Substanz Dosis Experimente

9 BTX B 1000 U PTZ-Anfallsschwellen, Verhaltensversuch

6 BTX B 500 U PTZ-Anfallsschwellen, Verhaltensversuch

8 Vehikel - PTZ-Anfallsschwellen, Verhaltensversuch

6 BTX B 1000 U EEG-Aufnahme, Verhaltensversuch

5 Vehikel - EEG-Aufnahme, Verhaltensversuch

-


53

3-4 Tage vor der fokalen Substanzapplikation wurde bei jedem Tier eine Basisschwelle im

PTZ-Test bestimmt. Die CED von Botulinumtoxin B bzw. Vehikellösung fand unter In-

jektionsanästhesie mit Dexmedetomidin (0,5 mg/kg i.p.) und Ketamin (60 mg/kg i.p.) statt.

Die Injektionsnarkose wurde verwendet, da kein System zur Inhalationsanästhesie verfügbar

war. Zudem fanden die PTZ-Schwellen post Botulinumtoxin B erst mindestens nach 24 h statt

(im Vergleich 2 bzw. 6 h post Vigabatrin). Die stereotaktische Operation lief ab wie zuvor

beschrieben. Die Koordinaten für die unilaterale Applikation von Botulinumtoxin B in den

Gyrus dentatus waren AP – 4 mm, ML + 2mm und DV -3,5 mm (s. Abb. 11).

Bei der CED wurden im Vergleich zur von uns genutzten Mikro-

injektion (Infusionsrate etwa 0,0625 µl/min, Gesamtvolumen

0,25 µl pro Hemisphäre) relativ hohe Infusionsgeschwindigkeiten

und –volumina (Infusionsrate 0,5 µl/min, Gesamtvolumen 2 µl,

nur einseitige Applikation), die über eine Pumpe (Model KDS200,

KD Scientific, Holliston, MA) eingestellt wurden, verwendet. Zu-

dem konnte gezeigt werden, dass ein spezielles Kanülendesign zu

weniger Rückfluss entlang der Injektionskanüle führte; der letzte

Millimeter der Kanüle hatte einen geringeren Innen- und Außen-

durchmesser als der Rest der Kanüle (YIN et al. 2010; s. Abb. 12).

In einer Gruppe von 24 Tieren erfolgte die CED ohne Implanta-

tion eines Führungsrohres, hier senkten wir die Injektionskanüle

direkt in den Gyrus dentatus ab. Die Injektionskanülen wurden

freundlicherweise von Dr. Adrian Kells aus der AG Bankiewicz

Abb. 11 Injektionsort für die fokale

Botulinumtoxin-Infusion. Der Pfeil

zeigt die Injektionsstelle in den Gyrus

dentatus (DG) innerhalb des Hippo-

kampus.

Abb. 12 Injektionskanüle

für CED mit scharfem

Übergang von größerem zu

kleinerem Durchmesser an

der Spitze.


54

(University of California San Francisco) zur Verfügung gestellt. Sie bestanden aus Quarzglas

(Polymicro Technologies, Phoenix, Arizona). Die Kanülenspitze hatte einen äußeren Durch-

messer von 164 µm und einen inneren Durchmesser von 102 µm und war in eine 28-Gauge

Injektionskanüle (PlasticsOne, Roanoke, Virginia, USA) geklebt, so dass ein scharfer Über-

gang von größerem zu kleinerem Durchmesser bestand. Die Kanüle war über einen dickwan-

digen Polyethylen 50-Schlauch (PlasticsOne, Roanoke, Virginia, USA) mit einer 100 µl-

Spritze (NanoFil Syringe, WPI) verbunden, die in einer Pumpe arretiert war. Vor und nach

CED wurde die Kanüle jeweils eine Minute im Gewebe belassen. Nach jeder Injektion fand

eine Dichtigkeits- und Permeabilitätsprüfung des Systems statt. Sobald die Operation abge-

schlossen war, beendeten wir die Anästhesie mit dem α2 Antagonisten Atipamezol (Antise-

dan®, 1 mg/kg i.p.) beendet und beobachteten die Tiere wie zuvor beschrieben für mindestens

eine Stunde.

In einer zweiten Gruppe von 11 Tieren wurden Führungsrohr-Elektroden-Kombinationen

(PlasticsOne, Roanoke, Virginia, USA) implantiert. Die Injektion von Botulinumtoxin B bzw.

Vehikel erfolgte bereits in der Implantationsoperation. Die Elektroden und Führungsrohre

wurden für das Aufzeichnen eines Elektroenzephalogramms sowie für einen weiteren Ver-

such innerhalb eines anderen Projektes benötigt, der hier nicht beschrieben wird. Die Kombi-

nation bestand aus einem 2 mm langen 22-Gauge Führungsrohr aus PEEK (Polyetherether-

keton) mit 2 Ableitelektroden (0,23 mm Durchmesser, Edelstahl) im Abstand von 0,5 mm.

Die Elektroden waren bis auf 0,5 mm an ihrer Spitze mit Polyamid isoliert. Sie projizierten

1 mm über das Ende des Führungsrohres hinaus. Die Elektroden-Führungsrohr-Kombination

wurde mit Zahnzement (Lang Dental, Wheeling, Illinios, USA) mit dem Schädel und zwei

Halteschrauben befestigt. Nach Trocknung des Zahnzementes fand die CED statt. Hierfür

wurde die zuvor beschriebene Kanüle verwendet, die 2,5 mm über das Ende des Führungs-

rohres projizierte und damit, wie zuvor beschrieben, in den Gyrus dentatus zielte. Um Verle-

gungen durch Staub oder aufsteigendes Blut / Sekret vorzubeugen, erfolgte der Verschluss

des Führungsrohrs nach Injektion von Botulinumtoxin B bzw. Vehikel mit einem Dummy

(0,5 mm Projektion über das Ende des Führungsrohres hinaus). Nach dieser Operation wurden

den Tieren mindestens 5 Tage Erholung gewährt, ihr Gewicht wurde täglich überwacht.


55

4.4.5. Verhaltensversuche

Nach CED von Botulinumtoxin B beobachteten wir Verhaltensänderungen und spontane An-

fälle bei den Tieren (s. Abschnitt 5.4.2), was uns dazu veranlasste, Verhaltensversuche

durchzuführen. Die nach RICE et al. (1998) modifizierten Tests überprüfen akustische und

taktile Hyperexzitabilität bei Ratten (s. Abb. 13). In der Literatur ist beschrieben, dass

chronisch epileptische Ratten häufig Abweichungen im Verhalten und beim Handling durch

den Experimentator zeigen (PINEL et al. 1977; MELLANBY et al. 1981; GRIFFITH et al.

1987; LEITE et al. 1990; LIU et al. 1994; POLASCHECK et al. 2010; RATTKA et al. 2011;

HUANG et al. 2012). Drei voneinander unabhängige Beobachter beurteilten verblindet die

Antwort des Versuchstieres auf unterschiedliche Stimuli nach einem Score-System (RICE et

al. 1998). Die Reize waren die sogenannte „approach-response“, bei der ein Stift in die Nähe

der Nase des Tieres gehalten wurde, die „touch-response“, bei der das Tier seitlich mit einem

Stift berührt wurde, der „Finger-snap“, um die Schreckhaftigkeit des Tieres auf akustische

Reize zu testen und der „Pick-up Test“, bei dem das Tier am Rumpf umfasst und hochgeho-

ben wurde. Die verschiedenen Scores reichten von keiner Reaktion bis hin zur Flucht oder

aggressivem Verhalten gegenüber dem präsentierten Stimulus.

Abb. 13 Scoresystem des Hyperexzitabilitätstests. Modifiziert nach RICE et al. 1998.


56

Der Hyperexzitabilitätstest wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach Botulinumtoxin B-

bzw. Vehikel-Applikation mehrmals durchgeführt. Um Effekte wiederholter PTZ-Tests auf

das Verhalten ausschließen zu können, wurde der Test auch mehrmals in einer Gruppe von

Tieren durchgeführt, die keine PTZ-Schwellentests durchlaufen hatten.

4.4.6. Aufzeichnung des Elektroenzephalogramms (EEG)

In den zuvor genannten 11 Tieren wurden keine PTZ-Schwellen vor und nach Botulinumtoxin

B- respektive Vehikel-Administration durchgeführt. Diesen Tieren wurden Elektroden-

Führungsrohr-Kombinationen implantiert (s.o.), da sie noch für einen weiteren, in dieser Ar-

beit nicht beschriebenen Versuch benötigt wurden. Neben der Verwendung für eine Ver-

gleichsgruppe ohne wiederholte Schwellenmessungen im Hyperexzitabilitätstest (s. Abschnitt

4.4.5), zeichneten wir von ihnen EEGs auf, da nach Botulinumtoxin B das Auftreten

spontaner Anfälle beobachtet wurde (s. Abschnitt 5.4.2). An Tag 5 oder 6 nach Botulinum-

toxin B- / Vehikel-Administration wurde die Basislinie für mindestens 5 Minuten aufgezeich-

net und das Tier währenddessen von zwei Experimentatoren beobachtet.

Für die Aufzeichnung wurde ein Grass CP511 AC EEG-Preamplifier (Astro-Med, West

Warwick, RI) verwendet; das digitale EEG wurde mit dem Programm Axotape 9 (Axon In-

struments, Foster City, CA) gespeichert und mithilfe des Programmes AxoScope (Axon In-

struments, Foster City, CA) ausgewertet.

Während dieser Zeit auftretende, spontane Anfälle, Verhaltensauffälligkeiten oder Ähnliches

wurden notiert. Zurück in Deutschland erfolgte die Auswertung der EEG-Aufnahmen von

einer auf diesem Gebiet erfahrenen Wissenschaftlerin, Frau Professorin Dr. Manuela Gernert,

und mir unabhängig voneinander und verblindet. Hierbei wurden epileptische Anfälle und

epileptiforme Spikes gezählt (modifiziert nach ANSCHEL et al. 2004). Die jeweils ersten 10

Sekunden einer jeden Aufzeichnung wurden nicht gezählt, ebenso Zeiträume, in denen Arte-

fakte aufgrund eines Rearrangements des Aufnahmekabels oder Bewegungen des Tieres auf-

traten. Die gezählten Anfälle und Spikes wurden auf eine Minute umgerechnet und Vehikel

und Botulinumtoxin -Gruppe miteinander verglichen. Sofern ein Anfall sich nicht motorisch

manifestierte, wurde ein rein elektroenzephalographischer Anfall definiert durch eine min-

destens zweifach über dem Grundrauschen liegenden Amplitude, eine erhöhte Frequenz von

mindestens 1,5 Hz und eine Dauer von mindestens 5 Sekunden. Spikes wurden analog ab ei-


57

ner zweifach über dem Grundrauschen liegenden Amplitude mit einer Dauer von 30-80 ms in

die Zählung mit einbezogen. Gezählte „sharp waves“ hatten mindestens die gleiche Amplitu-

denhöhe, allerdings eine Dauer von 80-250 ms. Sowohl monophasische, biphasische als auch

polyphasische Spikes und Sharp waves wurden gezählt. Ein clusterartiges Auftreten von

Spikes oder Sharp waves wurde separat notiert, die Spikes bzw. Sharp waves innerhalb eines

Anfalls wurden nicht in die Zählung einbezogen.



In der Neurotransplantationsstudie wurden in den meisten Fällen neben der Basisschwelle

drei weitere Schwellen bestimmt, allerdings mit einem großen zeitlichen Abstand

(1. Schwelle nach Transplantation 9-11 Tage post OP, 2. Schwelle 5 Wochen und 3. Schwelle

3 Monate post OP; s. Abb. 14). Diese Zeitpunkte wurden aufgrund von Daten aus Studien zur

Zelltransplantation unserer Arbeitsgruppe gewählt (LÖSCHER et al. 1998; GERNERT et al.

2002; NOLTE et al. 2008).

Abb. 14 Versuchsdesign für die Neurotransplantation im PTZ-Anfallsschwellenmodell.

4.5.2. Studie IIa: Gewinnung und Kultivierung von GABAergen Vorläufer-

zellen

GABAerge Vorläuferzellen wurden in unserem Institut aus Rattenfeten präpariert und kulti-

viert. Für die Gewinnung der GABAergen Vorläuferzellen wurde die laterale oder mediale

ganglionische Eminenz (LGE bzw. MGE) des sich entwickelnden Telencephalons aus Ratten-

feten präpariert und das Gewebe nach Protokollen der Arbeitsgruppe um Ashok Shetty


58

(HATTIANGADY et al. 2008; WALDAU et al. 2010; s. Abb. 15) aufbereitet. Sie konnten

zeigen, dass sich nach Transplantation in die CA3 des Hippokampus aus LGE-Zellen etwa

70 % der überlebenden Zellen in GABAerge Neurone entwickeln (HATTIANGADY et al.

2008). Aufgrund der Ergebnisse unserer ersten Transplantationsstudien im PTZ-Modell

(s. Abschnitt 5.5.3) und Schwierigkeiten bei der Verpaarung der Spendertiere, verwendeten

wir in der Folge auch Vorläuferzellen aus der MGE nach einem neueren Protokoll der AG

Shetty (WALDAU et al. 2010). Aus MGE-Vorläuferzellen waren drei Monate nach

Transplantation 10 % der überlebenden Zellen positiv für einen anti-GABA Antikörper

(WALDAU et al. 2010). Allerdings differenzierte sich etwa die Hälfte der MGE-Zellen in

GDNF-positive Astrozyten. GDNF selbst besitzt antikonvulsive Eigenschaften (KANTER-

SCHILFKE 2007), so dass auch die Astrozytenpopulation für die Anfallsunterdrückung von

Nutzen sein könnte. Mit beiden Zellpopulationen, aus LGE und MGE, erzielte die Gruppe um

Ashok Shetty deutliche antikonvulsive Effekte in einem chronischen Epilepsiemodell

(HATTIANGADY et al. 2008; WALDAU et al. 2010), so dass wir uns entschieden, beide

Hirnregionen zur Präparation von Vorläuferzellen zu nutzen (s. Abb. 15).

Abb. 15 Verwendete Zellen für die Transplantation GABAerger Vorläuferzellen.


59

Für die Gewinnung von Feten wurden weibliche Wistar-Ratten in unserem Institut terminiert

verpaart (Tag nach der Verpaarung 0,5). Beginnend an Tag 11,5 nach Verpaarung wurde täg-

lich Bromodeoxyuridin (5-bromo-2’-deoxyuridine, BrdU) intraperitoneal injiziert (50 mg/kg).

Die Injektion erfolgte bei einer vertikal gehaltenen Ratte im dorsal gelegenen Abdomen, um

die Feten nicht zu verletzen. BrdU ist ein synthetisches Nukleosid, das als Thymidin-Ana-

logon während der DNA-Replikation in proliferierenden Zellen anstelle von Thymidin in die

DNA integriert wird. Es konnte gezeigt werden, dass auf diese Weise 93 % der Vorläufer-

zellen mit BrdU markiert werden (ZAMAN et al. 2000; HATTIANGADY et al. 2008). So

können die Zellen nach Transplantation immunhistologisch von den Wirtszellen des Empfän-

gertieres unterschieden werden. Für die Entnahme der Feten an Tag 14,5 (WALDAU et al.

2010) wurden die Muttertiere zunächst palpatorisch auf Anzeichen einer Trächtigkeit unter-

sucht und bei positivem Tastbefund für eine Hysterektomie tief anästhesiert (Chloralhydrat,

i.p., 360 mg/kg, gelöst in 0,9 % NaCl, Injektionsvolumen 10 ml/kg). Die Bauchhöhle wurde

eröffnet und der tragende Uterus entfernt. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Muttertier intrakar-

dial euthanasiert (Chloralhydrat nach Wirkung dosiert). Der Uterus wurde eröffnet und die

Embryonen aus Amnion und Chorion herausgelöst und in einer Petrischale mit kaltem Kulti-

vierungsmedium (s. Abschnitt 10.2) gesammelt. Die Embryonen waren zu diesem Zeitpunkt

etwa 1 cm groß. Der Kopf wurde abgetrennt und die Vorderhirnblase (s. Abb. 16) vom Rest

des Gehirns entfernt und in eine weitere Petrischale überführt.

Dort wurde unter Zuhilfenahme eines Stereomikroskops das Telencephalon eröffnet, sodass

beide Hemisphären sichtbar wurden. Nun wurden die laterale und mediale ganglionische

Abb. 16 Schematische Darstellung des

Vorder- und Mittelhirns eines E 14 Ratten-

fetus. Modifiziert nach RALLU et al. 2002.

Abb. 17 Schematische Darstellung des eröffneten

Telencephalons mit Blick auf die laterale und mediale

ganglionische Eminenz. Modifiziert nach FARRIES 2001.


60

Eminenz (LGE bzw. MGE), die sich als zwei basolateral gelegene, unterschiedlich große Bla-

sen vom Restgewebe abhoben (s. Abb. 17), herauspräpariert und separat in Falcons mit eisge-

kühltem Dissoziationsmedium (s. Abschnitt 10.2) aufgefangen.

Auf diese Weise wurde mit allen Embryonen verfahren, die sich im gleichen Entwicklungs-

stadium befanden und keine Zeichen von pathologischen Prozessen aufwiesen. Im Anschluss

an die Präparation wurden die Falcons mit dem so gewonnenen Gewebe unter die sterile Zell-

kulturbank verbracht und das Material durch vorsichtiges Titruieren mit einer Pasteurpipette

mit rund-geschmolzener Öffnung zerkleinert. Ab diesem Schritt haben wir zwei unterschied-

liche Protokolle der AG Shetty verfolgt.

1. Direkte Zelltransplantation, modifiziert nach HATTIANGADY et al. (2008):

Dieses Protokoll wendeten wir zu Beginn unserer Studie an, als wir selbst Ratten terminiert

verpaarten und die tragenden Tiere mit BrdU behandelten. Für eine Übersicht über verwen-

dete Medien und Zusätze, s. Abschnitt 10.2.

Das Gewebematerial wurde nach Gewinnung durch Zugabe von frischem Dissoziationsme-

dium verdünnt und anschließend durch 70 µm-Filter in ein 50 ml Falcon überführt. Es folgte

ein Waschschritt (Zentrifugation bei 200 G für 8 min bei 4 °C). Das Pellet wurde resuspen-

diert und zwei weitere Male durch Zentrifugation gewaschen. Die Zellzahl und Viabilität

wurde anschließend mittels Trypanblaufärbung evaluiert und bei einer Rate an vitalen Zellen

über 75 % eine Inkubation in Proliferationsmedium durchgeführt. Dem Proliferationsmedium

wurde der Caspase-Inhibitor Ac-YVAD-cmk (500 µM, Enzo Life Sciences, Lörrach) und der

neurotrophische Faktor FGF-2 (200 ng/ml, PAN Biotech, Aidenbach) zugesetzt, diese Be-

handlung führte laut HATTIANGADY et al. (2008) zu einer erhöhten Rate an überlebenden

Zellen nach Transplantation. Es folgte eine Inkubation von drei Stunden auf einem Schüttler

im Brutschrank bei 37 °C. Anschließend wurden die Zellen erneut zweimal durch Zentrifuga-

tion wie oben beschrieben gewaschen und gezählt. Die Resuspension des Zellpellets erfolgte

nun mit 40 µl Neurobasal®-Medium (Invitrogen, Darmstadt). Die Viabilität der Zellen wurde

erneut überprüft, danach wurde die Zelldichte für die Transplantation auf 1x105 lebende Zel-

len pro µl eingestellt.

2. Zelltransplantation nach Kultivierung, modifiziert nach WALDAU et al. (2010):

Dieses Protokoll verwendeten wir, nachdem die Generierung tragender Tiere in unserem

Institut nicht mehr möglich war. Mögliche Ursachen für die schlechten Verpaarungsergeb-


61

nisse, das Verwerfen tragender Tiere sowie eine gestörte Embryonalentwicklung könnten

einerseits eine vom Züchter berichtete endemische Keimbelastung des von uns verwendeten

Rattenstammes sein, andererseits auch eine Lärmbelastung der Tiere durch Bauarbeiten in

unserem Institut. Aus diesem Grund bestellten wir terminiert tragende Ratten eines nicht

keimbelasteten Stammes vom Versuchstierzüchter (RccHan®, Harlan, Horst, Niederlande).

Da diese Tiere am Tag der Fetenentnahme (Tag 14 nach Befruchtung) geliefert wurden,

konnten wir keine in-utero Markierung mit BrdU durchführen. Daher haben wir das Protokoll

von WALDAU et al. (2010) verwendet, nach dem die Zellen zunächst als Stammzellen kulti-

viert und während dieser Zeit in-vitro markiert werden können. Für eine Übersicht über die

verwendeten Medien und Zusätze s. Abschnitt 10.2. Dem Protokoll folgend wurden die

Zellen nach Gewinnung in einem Kulturmedium (unter Zusatz von B-27® Supplement ohne

Retinsäure) mechanisch dissoziiert. Danach wurden sie durch Zentrifugation gewaschen (200

G, 8 min, 4-8° C). Die Zellzahl und Viabilität wurde anschließend mittels Trypanblaufärbung

evaluiert. Etwa 300000 Zellen wurden jeweils in eine T25 Zellkulturflasche (Greiner) mit

5 ml angewärmtem Proliferationsmedium überführt und unter Standardbedingungen (37 ° C,

5 % CO2) für etwa eine Woche kultiviert. Während dieser Kultivierungsphase wurde je nach

Bedarf Medium zugegeben und adhärente Zellen wurden durch Schwenken der Flasche vom

Boden gelöst. Durch die Zugabe von bestimmten Wachstumsfaktoren („fibroblast growth

factor 2“, FGF-2, 20 ng/ml und „epidermal growth factor“, EGF, 20 ng/ml) und den Verzicht

auf Retinsäure blieben die Zellen in einem Vorläuferstadium, proliferierten und bildeten

sogenannte “Neurosphären” in Kultur, d.h. einzelne Zellen lagerten sich zu kugeligen

Gebilden zusammen, die frei schwebend im Medium wuchsen. Die Faktoren verhinderten ein

weiteres Differenzieren der Zellen. Während der Zeit der Kultivierung wurden die Zellen

durch Zugabe von BrdU (10 ng/ml) markiert. Nach einer Woche in Kultur konnten die Zellen

für Transplantationsversuche verwendet werden. Die Zellen wurden teilweise vor der

Transplantation vereinzelt (durch Zusatz von 3 ml Accutase® und mechanische

Dissoziation); zum größten Teil wurden sie aber als ganze Neurosphären transplantiert.

Transplantationsmedium war auch hier Neurobasal®-Medium (Invitrogen, Darmstadt).

Alternativ konnten die Zellen nach Aufteilung für 1-2 Passagen weiter kultiviert werden. Für

das Passagieren der Zellen wurde das verbrauchte Medium mit den Neurosphären entnommen

und in ein Falcon überführt. Es wurde etwa 10 Minuten gewartet, bis sich die Neurosphären


62

deutlich sichtbar am Boden des Falcons abgesetzt hatten. Dann wurde der Überstand entfernt.

Zeitgleich wurden in die ehemalige Kulturflasche etwa 3 ml Accutase® (Invitrogen, Darm-

stadt) pipettiert, um bereits adhärent gewordene Sphären abzulösen. Hierfür wurde die

Flasche für einige Minuten zur Inkubation zurück in den Brutschrank gestellt. Nach Ablauf

dieser Zeit wurde mikroskopisch kontrolliert, ob die Zellen sich abgelöst hatten und im posi-

tiven Falle die Accutase® mitsamt den Zellen zu dem abgesunkenen Zellpellet gegeben.

Durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mit kleiner werdendem Pipettenspitzendurch-

messer bis hin zu einer rund-geschmolzenen Pasteurpipette, wurden die Sphären mechanisch

dissoziiert. Danach wurden sie zentrifugiert (200 G, 8 Minuten bei Raumtemperatur) und der

Überstand entfernt. Im Anschluss wurden sie je nach Zelldichte 1:2 bzw. 1:4 auf neue Ge-

webskulturflaschen aufgeteilt. Anstelle einer Passage war auch das Einfrieren der Zellen etwa

1:10 in Gefriermedium (Kulturmedium mit 10 % Dimethylsulfoxid, DMSO) zunächst für 24

Stunden bei – 80 °C und danach in flüssigem Stickstoff möglich.

Während der letzten in-vitro Versuche meiner Arbeit wurden in einer Zelllinie einer Kollegin

innerhalb unseres Zellkulturbereiches eine veränderte Morphologie und ein schlechtes

Wachstumsverhalten nach Auftauen festgestellt. Bis zur Feststellung der Ursache setzen wir

prophylaktisch Antibiotika (Penicillin/Streptomycin, 100 µg/ml, Biochrom AG, Berlin) und

Antimykotika (Fungizone, 0,25 µg/ml, Invitrogen) zu unseren Primärzellkulturen zu

(s. Abschnitt 10.2). Verschiedene Tests ergaben, dass die Zelllinie mit Mykoplasmen befallen

war. Sie wurde entsorgt und die Zellkulturräumlichkeiten gereinigt und desinfiziert. Wir

führten auch an unseren Primärzellen wiederholt Mykoplasmentests (Venor®GeM Advance,

Minerva Biolabs) durch, alle für Versuche verwendeten Zellen waren frei von Mykoplasmen.

4.5.3. Studie IIb: Kultivierung von NT2-Zellen

Die Kultur der NT2-Zellen fand hauptsächlich in der AG von Prof. Dr. G. Bicker, Institut für

Tierökologie und Zellphysiologie der TiHo, statt. Die Zellen wurden uns freundlicherweise

von Frau Saime Tan entweder als sphärische Aggregate oder als adulte Neurone zur Verfü-

gung gestellt. Hierfür wurden in der AG Bicker undifferenzierte Zellen zunächst adhärent

kultiviert und nach Überführung in eine nicht beschichtete Petrischale mit Retinsäure behan-

delt, das sogenannte „Priming” (PAQUET-DURAND et al. 2003). Wir haben die Vorläufer-

zellen zu diesem Zeitpunkt erhalten und einen Teil der frisch mit Retinsäure behandelten


63

Zellen sofort transplantiert, den anderen Teil für weitere 6 Tage mit Retinsäure behandelt. Die

Zellen bilden zu diesem Zeitpunkt frei schwimmende Zellaggregate. Außerdem wurden auch

adulte Neurone transplantiert, die in der AG Bicker durch weitere Behandlung mit Retinsäure

für eine Woche und Zusatz eines “Mitose-Inhibitor-Mediums” und selektiver Trypsinisierung

der Neurone generiert wurden (PAQUET-DURAND et al. 2003).

4.5.4. Zelltransplantation

Für die Transplantationen wurden insgesamt 97 Tiere verwendet, die wie in Abschnitt 5.5.2

und 5.6.1 dargestellt, folgenden Gruppen zugeteilt wurden:

Transplantation von

GABAergen Vorläuferzellen aus der LGE (Einzelzellsuspension) mit

Mediumkontrollen, Zielregion: aSNr, Protokoll adaptiert nach HATTIANGADY et al.

(2008)

GABAergen Vorläuferzellen aus der MGE (Suspension mit ganzen Neurosphären) mit

Mediumkontrollen, Zielregion: STN, Protokoll adaptiert nach WALDAU et al. (2010)

NT2-Neuronen (Einzelzellsuspension) mit PBS-Kontrollen, Zielregion: STN

NT2-Vorläuferzellen (Einzelzellsuspension), 1 Tag nach Retinsäure-Zugabe, mit PBS-

Kontrollen, Zielregion: aSNr

NT2-Vorläuferzellen (Einzelzellsuspension), nach 7-tägiger Retinsäure-Behandlung,

mit PBS-Kontrollen, Zielregion: aSNr

Im Hinblick auf spätere Studien in chronischen Epilepsiemodellen wurden auch in dieser Stu-

die einige Tiere (n=19) einem Status epileptikus ausgesetzt, um preliminär potentielle Effekte

einer Transplantation nach Hirninsult zu evaluieren. Zudem wird kontrovers diskutiert, ob

eine Integration der Zellen im gesunden Hirn ebenso erfolgreich sein könnte, wie die Integra-

tion innerhalb von Hirnregionen, die pathologischen Umstrukturierungen unterliegen (s. Ab-

schnitt 2.4.3) Bei Tieren nach Status erfolgten Transplantationen von GABAergen Vorläufer-

zellen aus der MGE (Einzelzellsuspension/Neurosphären) mit Mediumkontrollen (Ziel-

regionen: aSNr und STN).


64

4.5.5. Ablauf der Zelltransplantation

Der Ablauf der bilateralen Zelltransplantation glich im Wesentlichen der Mikroinjektion.

Nach Trepanation der Schädeldecke wurden die Zellen allerdings nicht über ein Schlauch-

system injiziert sondern über eine Hamiltonspritze. In vorausgegangenen Studien zu Trans-

plantationen in die SNr oder den piriformen Kortex wurden in der AG Löscher bzw. AG

Gernert hierfür zumeist Glaskapillaren mit einem inneren Spitzendurchmesser von 50-70 µm

verwendet (GERNERT et al. 2002; LÖSCHER et al. 1998; NOLTE et al. 2008). In einer

kürzlich veröffentlichten Studie zu Transplantationen in den STN wurde zusätzlich direkt aus

der Kanüle einer Hamiltonspritze transplantiert, da der STN ein wesentlich geringeres Volu-

men aufweist als beispielsweise die SNr oder der piriforme Kortex (HANDRECK et al.

2012). Die Vermutung war, dass in einer sehr kleinen Struktur mit sehr dicht gepackten

Neuronen das Anheften der transplantierten Zellen schwieriger sein könnte als in den zuvor

beschriebenen größeren und lockerer besiedelten Regionen. Eine größere Läsion durch die

Verwendung der Hamiltonspritze könnte eventuell das Überleben und die Integration der

Transplantate erleichtern (HANDRECK et al. 2012). Es konnten abhängig vom Gebrauch

einer Glaskapillare bzw. einer direkten Injektion mittels Hamiltonspritze (s. Abb. 18) keine

Unterschiede bezüglich des Effektes und der Dauer des Überlebens der transplantierten Zellen

festgestellt werden (HANDRECK et al. 2012). In der vorliegenden Arbeit wurden ebenfalls

beide Systeme verwendet. Es fanden Transplantationen von Einzelzellsuspensionen statt, die

mit der Glaskapillare oder der Hamiltonspritze durchgeführt wurden. Andererseits wurden

auch Zellen im Verband, als Neurosphären, transplantiert. Hierfür haben wir uns aufgrund der

Größe der Neurosphären und der damit verbundenen möglichen Verlegung der Glaskapillare

für die direkte Transplantation mittels Hamiltonspritze entschieden.

Beide Systeme wurden vor Gebrauch mit 70 %igem Ethanol, gefolgt von destilliertem Wasser

und sterilem Phosphatpuffer gespült, bevor etwa 2 µl der Zellsuspension aufgezogen wurden.

Die GABAergen Vorläuferzellen wurden in einer Dichte von 100000 Zellen/µl in 20 – 30 µl

Medium aufgezogen, während die NT2-Zellen (ebenfalls 100000 Zellen/µl) in PBS mit Zu-

satz von Calcium und Magnesium aufgenommen wurden. Die Permeabilität des Systems

wurde vor Insertion der Kanüle/Glaskapillare in das Gehirn mehrmals überprüft. Das System

aus Glaskapillare und Hamiltonspritze oder aus Hamiltonspritze alleine wurden nun in die


65

eigens dafür konstruierte Systemhalterung (aus institutseigener Konstruktion) eingebaut und

fixiert.

(a) Transplantation mithilfe der Glaskapillare:

Die Methode wurde aus der Literatur adaptiert, um eine luftfreie Verbindung zwischen einer

2 µl Hamiltonspritze, einem Verbundstück aus Gummi und der Glaskapillare zu

gewährleisten (NIKKHAH et al. 1994; NOLTE et al. 2008). Die Glaskapillare ohne Filament

(Süd-Laborbedarf GmbH, Gauting) wurde an einem horizontalen Mikropipetten-Puller (PC-

84 Sachs-Flaming, Sutter Instruments, San Rafael, Kalifornien, USA) gezogen. Die Spitze

wurde unter mikroskopischer Kontrolle auf den inneren Durchmesser von 50-70 µm gekürzt.

Nach Absenken der Mikrokapillare in die gewünschte Hirnregion wurde 10 Sekunden ge-

wartet, um eine (Druck-)Adaptation des Gewebes nach der Verletzung durch die Kapillare zu

ermöglichen. Nach Ablauf der 10 Sekunden wurden über eine halbe Minute 800 nl Zell-

suspension injiziert. Danach wurde erneut für 10 Sekunden gewartet, bevor die Kapillare aus

dem Gehirn entfernt und anschließend auf Durchlässigkeit überprüft wurde. Nach dem er-

neuten Aufziehen von Zellsuspension erfolgte die Transplantation in der anderen Hemisphäre.

(b) Transplantation mittels Hamiltonspritze:

Für Transplantationen von GABAergen Neurosphären im Zellverband wurde eine 2 µl

Hamiltonspritze verwendet. Die Injektion der Zellen glich der zuvor beschriebenen Methode,

allerdings wurde nach Applikation der Zellen 2 Minuten gewartet, bevor die Spritze aus dem

Hirngewebe entfernt wurde, um einen Rückfluss des Transplantats entlang der sich beim Ent-

fernen aufwärts bewegenden Spritze zu minimieren.

Abb. 18 Systeme für die

Neurotransplantation. A System aus

Hamiltonspritze und Glaskapillare;

B System aus Hamiltonspritze allein.

Mit freundlicher Genehmigung von

Annelie Handreck.


66

4.5.6. Nachfolgestudie zu Studie IIa: Vorbehandlung der Zellen

Die Ergebnisse unserer ersten Transplantation GABAerger Vorläuferzellen (s. Abschnitt 5.5.3

und 5.5.6) führten dazu, dass in einer Nachfolgestudie untersucht werden sollte, ob eine

Vorbehandlung der Zellen aus der MGE in-vitro zu einer vermehrten Differenzierung in

GABAerge Neurone führen könnte. In unserer in-vitro Studie wurden mehrere Vor-

behandlungsprotokolle aus der Literatur zur Induktion des GABAergen Phänotyps mit-

einander verglichen.

1. Protokoll modifiziert nach ANDRES et al. (2005):

Creatin (Cr) wurde ursprünglich als Nahrungsergänzungsmittel zum Muskelaufbau zugelas-

sen (PERSKY u. BRAZEAU 2001). In-vitro und in-vivo wurde gezeigt, dass eine Supplemen-

tierung mit Creatin zu einer Erhöhung an phosphoryliertem Creatin führt, was wiederum eine

Energiereserve für den Zellstoffwechsel darstellt (MATTHEWS et al. 1998; BREWER u.

WALLIMANN 2000). Durch eine Zugabe von 5 mM Creatinmonohydrat (Creapure®,

Alzchem Trostberg GmbH) wurde von ANDRES et al. (2005) ein signifikanter Anstieg

GABAerger Neurone nach Differenzierung einer Kultur aus der ganglionischen Eminenz

(LGE und MGE) von E14 Rattenfeten berichtet.

2. Protokoll modifiziert nach LAENG et al. (2004):

Für eine Zugabe des Antiepileptikums Valproat (VPA, Orfiril®, Desitin Arzneimittel, Ham-

burg) konnte ebenfalls in-vitro belegt werden, dass kortikale und striatale Vorläuferzellen (aus

der LGE) unter 0,5 mM Valproat-Behandlung vermehrt proliferierten, weniger Astrozyten

hervorbrachten und bis zu 10 mal häufiger in GABAerge Neurone differenzierten (LAENG

et al. 2004).

3. Protokoll modifiziert nach BOSCH et al. (2004):

In dieser Studie wurde eine striatale Zelllinie verwendet (ST14A). Eine sequentielle Behand-

lung mit 10 µM Retinsäure (RA, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München) führte zu höheren

Überlebensraten der Zellen und vermehrter Differenzierung. Eine darauffolgende Zugabe von

40 mM Kaliumchlorid (KCl, Sigma-Aldrich) über vier Tage induzierte vermehrt GABAerge

Neurone (74 % aller Zellen) mit auswachsenden Dendriten, reduzierte die Zellproliferation

und die Zahl an Vorläuferstadien, die Stammzellmarker wie Nestin exprimierten (BOSCH et

al. 2004).


67

Das in unseren Händen vielversprechendste Protokoll sollte dann vergleichend zu unbehan-

delten Zellen in einem Transplantationsversuch verwendet werden, um zu evaluieren, ob eine

Vorbehandlung auch in-vivo zu einer Erhöhung des Anteils GABAerger Neurone führen

könnte und ob dies mit Auswirkungen auf potentiell antikonvulsive Effekte verbunden wäre.

4.5.7. In-vitro Studie

Die Vorbehandlung kultivierter Zellen wurde in drei Versuchsdurchgängen unabhängig von-

einander durchgeführt. Für die Vorbehandlung wurden tiefgefrorene MGE-Zellen aus Char-

gen verwendet, die auch schon zuvor für Transplantationen genutzt wurden. Nach dem Auf-

tauen der Zellen erfolgte die Aufnahme in Kultivierungsmedium (DMEM/F12) und eine Zell-

zählung. Etwa 250000 lebende Zellen wurden pro Kammer einer 6-Well-Platte ausgesät. In je

einem Well der Platte befanden sich nebeneinander drei mit Poly-L-Lysin-beschichtete Glas-

plättchen. Nach der Zählung wurden die Zellen in das Proliferationsmedium (s. Ab-

schnitt 10.2) überführt. Je nach vitaler Zellzahl erfolgte eine Aufteilung der Zellen auf zwei

bis vier 6-Well-Schalen. Die Zellen wurden auf diese Weise für 4 Tage kultiviert. An Tag 4

der Kultivierung („day in vitro 4“ =DIV 4) begannen die unterschiedlichen Vorbehandlungen.

Falls die Zellen sich zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollständig abgesetzt hatten, wurde das

Medium inklusive der nicht-adhärenten Zellen abgenommen und kurz zentrifugiert. Das

Zellpellet wurde dann in 50 % des eigenen vorherigen Mediums und 50 % des neuen

Vorbehandlungsmediums aufgenommen und wieder auf die Glasplättchen ausgesät. Im Falle

der vollständigen Adhärenz nahm ich das Medium direkt zur Hälfte ab und ersetze es durch

das Vorbehandlungsmedium. In jeder 6-Well-Schale gab es ein Kontroll-Well, dem nur

Proliferationsmedium zugesetzt wurde, dieses Medium wurde ebenfalls jeden 2. Tag zur

Hälfte ausgetauscht. Es wurden jeweils etwa gleich viele Wells pro Vorbehandlung

verwendet. Der Austausch von 50 % des Mediums erfolgte jeden zweiten Tag. In Anlehnung

an die o.g. Literatur wurden die Creatin-Monohydrat-Vorbehandlung, die Valproinsäure-

Behandlung und die Kontrollkultivierung für eine Dauer von 7 Tagen durchgeführt. Die

Behandlung mit Retinsäure erfolgte für ebenfalls für 7 Tage, an DIV 7 wurde auf

Kaliumchlorid-haltiges Medium umgestellt und bis DIV 11 behandelt. Jeweils am letzten Tag

der Behandlung wurden die Zellen mittels einer Zugabe von Paraformaldehyd zum Medium


68

(4 %) fixiert. Nach mehrmaligem Waschen mit phosphatgepufferter Saline lagerten wir die

Glasplättchen bis zur weiteren Prozessierung bei 4 °C (maximal eine Woche).

Abb. 19 Versuchsdesign zur Vorbehandlung der MGE-Vorläuferzellen in-vitro.

Zusätzlich wurden Kontrollzellen ohne Vorbehandlung unter den gleichen Bedingungen kultiviert, fixiert und

immunhistologisch angefärbt.

4.5.8. In-vivo Studie

Die beiden erfolgreichsten Protokolle für die Vorbehandlung der Zellen in-vitro (s. Abschnitt

5.5.8.1) wurden an nicht adhärenten Neurosphären erneut durchgeführt. Im Anschluss an die

jeweilige Behandlung wurden die Zellen entsprechend des vorher beschriebenen Protokolls

bilateral in den STN von Ratten transplantiert. Entsprechend der vorherigen Transplantations-

studien überprüften wir die Effektivität der Transplantation im PTZ-Modell. Vergleichend

wurde ein Teil der Zellen transplantiert, die so lange kultiviert wurden, dass sie vom Neuro-

spähren-Stadium in das adhärente Stadium übergingen und erste Fortsätze ausbildeten.

4.6. Histologie

Nach Abschluss aller beschriebenen Experimente wurde die korrekte Lokalisation der

Mikroinjektion bzw. Neurotransplantation histologisch überprüft: Die Tiere wurden mit einer

Überdosis Chloralhydrat (360 mg/ml, Injektionsvolumen 5 ml) narkotisiert, bis ein Atemstill-

stand eintrat. Es erfolgte eine Eröffnung der Bauch- und Brusthöhle und eine Durchtrennung

http://en.wikipedia.org/wiki/%C3%9C


69

des Zwerchfells. Dann wurde eine Kanüle durch die Herzspitze in den linken Ventrikel und

von dort in die Aorta eingeführt und das Herz am rechten Herzohr eröffnet, um den Blutab-

fluss sicherzustellen. Die Kanüle war über ein Schlauchsystem mit einer Perfusionspumpe

verbunden, die zu diesem Zeitpunkt eingeschaltet wurde. Es folgte die transkardiale Perfusion

mit 80 ml phosphatgepufferter Natriumchloridlösung (0,01 M, pH 7,4) und anschließend mit

250 ml 4 % Paraformaldehyd in 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,4) als Fixanz. Nach erfolgter

Fixierung wurde das Gehirn des Tieres entnommen und bei 4-8 °C in 10 %iger Saccharose-

lösung über Nacht gelagert. Dann wurde das Gehirn bis zur weiteren Aufarbeitung in 30 %ige

Saccharoselösung überführt und weiterhin bei 4-8 °C aufbewahrt. Die Lagerung in Saccha-

roselösung diente als Gefrierschutz vor dem Schneiden an einem Gefriermikrotom.

Von jedem Gehirn aus Studie I (fokale Substanzapplikation von Vigabatrin) wurden zwei

Serien mit 40 μm dicken koronaren Schnitten im Bereich des sichtbaren Mikroinjektions-

stichkanals angefertigt. Die Gehirne aus Studie II (Neurotransplantation) wurden in drei Se-

rien geschnitten, da eine zusätzliche Serie für immunhistologische Färbungen verwendet

wurde. Anschließend zogen wir die erste Serie dieser Schnitte mithilfe von Chromgelatine auf

entfettete Objektträger auf. Nach Trocknung der Objektträger erfolgte die Anfärbung mit

Thionin, welches die Nisslschollen des endoplasmatischen Retikulums in Zellen anfärbt. Neu-

rone bilden deutlich mehr Nisslschollen aus als Gliazellen, so dass diese Färbung ermöglichte,

einzelne Hirnregionen etwa anhand ihrer Neuronendichte voneinander zu unterscheiden. Nach

erfolgter Färbung wurden die Schnitte mit Eindeckmedium und Deckgläschen eingedeckt.

Die zweite und dritte Serie wurden bis zur weiteren Verwendung bzw. als Reserve in einem

flüssigen Gefriermedium bei – 20 °C eingefroren.

4.7. Dekapitation

4.7.1. Botulinumtoxin

Für die Studie zur fokalen CED von Botulinumtoxin wurde nur vor Beginn des Hauptver-

suches bei 2 Tieren die korrekte Lokalisation der Injektion im Hippokampus überprüft, da

keine etablierte histologische Aufarbeitung für Gehirnmaterial zur Verfügung stand. Hierfür

wurden intra operationem statt Botulinumtoxin bzw. Vehikel ein Farbstoff injiziert und die

Tiere anschließend noch in Anästhesie dekapitiert. Nach Entnahme der Gehirne erfolgte ein


70

Einschnitt in das Gewebe auf Höhe der sichtbaren Einstichstelle mit einem Skalpell und die

Verteilung des Farbstoffes wurde begutachtet.

4.7.2. Neurotransplantation

Eine quantitative Auswertung der für Glutaminsäuredecarboxylase („glutamic acid

decarboxylase“, GAD)-positiven Zellen anhand der 40 µm Schnitte war aufgrund der Dicke

der Schnitte und der damit verbundenen schlechten Penetration des Antikörpers in Verbin-

dung mit Überlagerungen mehrerer Schichten von Zellen nicht möglich. Aus diesem Grund

wurden randomisiert einige Tiere aus der Nachfolgestudie (Transplantation vorbehandelter

Zellen) dekapitiert, ihre Gehirne entnommen und in flüssigen Stickstoff überführt. Anschlie-

ßend wurden sie bis zur weiteren Prozessierung bei – 20 °C eingefroren. Von diesen Gehirnen

wurden 14 µm dünne Schnitte an einem Kryostaten angefertigt.

4.8. Mikroskopie

Falls nicht gesondert erwähnt, wurden nur Tiere mit bilateral korrekt platzierten Injektionen

in die finale Auswertung einbezogen. Für die genaue Lokalisation der Mikroinjektion wurde

die Thionin-gefärbte Serie unter einem Durchlicht-Mikroskop durchgemustert (25- und 100-

fache Vergrößerung) und die Koordinaten des tiefsten Punktes des Einstichkanals mithilfe des

stereotaktischen Atlas von PAXINOS und WATSON (2007), sowie im Bezug zu nahe gele-

genen eindeutigen anatomischen Strukturen bestimmt. Beginn und Ende des STN waren im

histologischen Schnitt aufgrund der dicht gepackten Neurone eindeutig zu identifizieren.

Ebenso verhielt es sich mit dem Beginn der SNr, die Unterscheidung in einen und posterioren

Teil wurde analog zu früheren Studien (SHEHAB et al. 1996; GERNERT u. LÖSCHER

2001; GERNERT et al. 2004) anatomisch am Austritt des 3. Hirnnerven (Nervus

oculomotorius) definiert, dieser liegt nach PAXINOS und WATSON (2007) bei AP -5,52

(s. Abb. 28). Die SNr endet auf derselben anterior-posterioren Ebene wie der einfach zu

identifizierende Nukleus ruber. Auf derselben Höhe des Zusammenschlusses der anterioren

Kommissur beider Hirnhemisphären liegt das zentrale Striatum.


71

4.9. Immunhistologie

4.9.1. GABAerge Vorläuferzellen

Von allen Tieren, denen GABAerge Vorläuferzellen transplantiert worden waren, wurden

randomisiert Tiere für immunhistologische Untersuchungen ausgewählt, um die Transplantate

im Gehirn qualitativ nachzuweisen. Zusätzlich sollte evaluiert werden, ob sich die Zellen dif-

ferenziert hatten und Marker für GABAerge Neurone exprimierten. Außerdem sollten even-

tuelle Entzündungs- und Abstoßungsreaktionen spezifisch sichtbar gemacht werden. Es wur-

den alternierend Fluoreszenz- oder 3,3‘-Diaminobenzidin (DAB)-Anfärbungen gegen Kom-

binationen aus den folgenden Antikörpern im „free-floating“-Verfahren durchgeführt:

ein monoklonaler Anti-BrdU Antikörper (OBT0030, AbD Serotec) aus der Ratte bzw.

in einigen Fällen aus der Maus (MAB 3510, Millipore) zur Anfärbung der vor

Transplantation mit BrdU-markierten Zellen,

ein monoklonaler Anti-NeuN Antikörper (MAB 377, Millipore) aus der Maus zur

Darstellung differenzierter, neuronaler Zellen,

ein polyklonaler Anti-GFAP („Glial Fibrillary Acidic Protein“) Antikörper (Z 0334,

DakoCytomation) aus dem Kaninchen zur Anfärbung von Astrozyten,

ein monoklonaler Anti-GAD67 Antikörper (MAB 5406, Millipore) aus der Maus

gegen das GABA-synthetisierende Enzym Glutaminsäuredecarboxylase Isoform 67

zur Darstellung GABAerger Neurone

Für die jeweiligen Färbungen wurden aus den Transplantationsstudien jeweils die zweiten,

eingefroren Serien genutzt. Für ein genaues Färbeprotokoll, s. Abschnitt 10.5.2.

4.9.1.1. Fluoreszenzfärbung

Nach dem Auftauen bei Raumtemperatur wurden die Schnitte mehrmals in TBS (0,05 M tris-

gepufferte Saline) gewaschen. Danach folgte eine zweistündige Inkubation bei 65 °C in einem

denaturierenden Puffer aus 50 % Formamid und 2x SSC („saline-sodium citrate“, dem

Natriumsalz der Zitronensäure). Nach einer weiteren 10-minütigen Inkubation in 2x SSC bei

Raumtemperatur, überführten wir die Schnitte in 37 °C warme 2 N Salzsäure und inkubierten

erneut für 30 Minuten. Darauf folgend wurden sie für jeweils 5 Minuten zweimal in 0,1 M

Borsäure überführt. Nach diesen Schritten, die dem Aufschluss des Gewebes für die Pene-


72

tration der Antikörper dienten, wurden die Schnitte nach erneutem dreimaligem Waschen in

TBS zunächst für eine Stunde in die Blocking-Lösung verbracht. Die Blocking-Lösung ent-

hielt Serum aus der Ziege, aus der auch der sekundäre Antikörper gewonnen wurde, um un-

spezifische Bindungen zu minimieren. Im Anschluss an eine Inkubation in der Carrier-Lösung

erfolgte die Separation jeweils mindestens eines Schnittes pro Tier; er diente als Negativ-

kontrolle. Alle anderen Schnitte wurden zu diesem Zeitpunkt mit dem jeweiligen primären

Antikörper in Carrier-Lösung über Nacht bei 4 °C auf dem Rüttler inkubiert. Am nächsten

Tag wurde mit der separierten Negativkontrolle wieder wie mit den übrigen Schnitten ver-

fahren. Nach erneutem dreimaligen Waschen, um überschüssigen, nicht gebundenen Anti-

körper zu entfernen, wurden sie für 10 Minuten in Carrier-Lösung adaptiert. Darauffolgend

wurden die Schnitte für eine Stunde in Carrier-Lösung mit dem sekundären Antikörper (aus

der Ziege) überführt. Teilweise lagen die sekundären Antikörper selbst bereits Fluoreszenz-

markiert vor (s. Abschnitt 10.3), teilweise wurde aber auch ein biotinylierter Antikörper

verwendet, der nach wiederholtem Waschen in TBS einen weiteren Schritt essentiell werden

ließ: eine Inkubation in TBS mit Carbocyanin 3 (Cy3)-markiertem Streptavidin für eine

Stunde. Nach erneutem Waschen konnten die immunhistologisch angefärbten Gehirnschnitte

nun in destilliertem Wasser in ihre korrekte Reihenfolge gebracht werden (von rostral nach

kaudal) und auf Glycerineiweiß-beschichtete Objektträger aufgezogen werden. Anschließend

an eine Trocknung an der Luft und eine Inkubation in Toluol für mindestens eine Minute,

erfolgte das Eindecken der Objektträger mit DPX (wasserfreies Eindeckmittel mit geringer

Eigenfluoreszenz) und Glasplättchen.

4.9.1.2. Diaminobenzidin-Färbung

Neben der Fluoreszenzanfärbung wurde in einigen Fällen auch eine 3,3‘-Diaminobenzidin

(DAB)-Färbung durchgeführt. Das zuvor beschriebende Protokoll unterschied sich dabei in

folgenden Arbeitsschritten:

Zur Hemmung endogener Peroxidaseaktivität wurde zu Beginn eine 30-minütige Inkubation

in 0,5%iger Wasserstoffperoxid-Lösung (150 µl 35% H2O2 in 10 ml TBS) durchgeführt.

Nach Inkubation in dem primären und nachfolgend dem sekundären, biotinylierten Anti-

körper (in diesem Fall nicht fluoreszenz-konjugiert), folgte eine 90-minütige Behandlung der

Schnitte mit meerrettichperoxidase-konjugiertem Streptavidin (1:375 in TBS). Die Schnitte


73

wurden anschließend gewaschen (3-mal 5 min in TBS) und zur Sichtbarmachung der Anti-

körper-Konjugate in 4 ml einer Diaminobenzidin-Reaktionslösung (3,3´-DAB-Färbelösung)

überführt. Nach 15 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 µl H2O2 gestartet und

nach 10 min durch 3-maliges Spülen mit TBS beendet. Alle weiteren Arbeitsschritte glichen

denen zuvor beschriebenen.

4.9.1.3. Immunhistologische Anfärbung bei Kryostatschnitten

Von der Nachfolgestudie zu einer Vorbehandlung der Zellen in-vitro wurden ebenfalls

immunhistochemische Anfärbungen angefertigt. Für die fixierten Zellen gab es folgende Ab-

weichungen vom oben beschriebenen Protokoll: Nach dem ersten Waschschritt waren die

unterschiedlichen Denaturierungs- und Aufschlussverfahren nicht nötig, so dass sofort die

Inkubation mit der Blocking-Lösung stattfand. Bis auf die Antikörper-Inkubationen, die

mittels eines 20 µl Tropfens auf einer Parafilm-Folie durchgeführt wurden, fanden die rest-

lichen Inkubationen der Glasplättchen in 24-Well-Platten statt. Die Zellkerne wurden jeweils

mit dem DNA-Farbstoff 4,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) angefärbt und ein weiterer An-

tikörper pro Glasplättchen verwendet. Daraus ergaben sich folgende Kombinationen: DAPI +

anti-GFAP, DAPI + anti-NeuN oder DAPI + anti-GAD67.

Die Kryostatschnitte von den Gehirnen, in die vorbehandelte Zellen transplantiert wurden,

wurden ebenfalls mit Immunfluoreszenzfarbstoffen angefärbt. Diese Färbungen konnten al-

lerdings nicht im „free-floating“-Verfahren durchgeführt werden, da die Schnitte bereits beim

Schneiden auf die Objektträger aufgebracht wurden und zu dünn - und damit zu fragil für die

Prozedur der Färbung in Lösung sind. Stattdessen spannten wir die Objektträger in Kammern

(Shandon CoverplateTM

, Thermo Fisher Scientific, Schwerte) ein und pipettierten die unter-

schiedlichen Puffer und Färbelösungen in die Kammer. Alle zuvor beschriebenen Schritte

wurden hier analog durchgeführt.

4.9.2. NT2-Zellen

Zunächst war geplant, dass freundlicherweise ein Mitarbeiter aus der AG Bicker die immun-

histologische Anfärbung der Zelltransplantate im Rattengehirn für uns durchführen sollte.

Hierfür wurde ein monoklonaler Antikörper gegen humanes nukleäres Matrixprotein aus der

Maus (NL09L, anti-NuMa von Calbiochem®, über Millipore, Darmstadt) verwendet, die


74

nicht zu spezifischen Nachweis der transplantierten Zellen führte (s. Abschnitt 5.6.4). Später

führten wir darum eine Anfärbung an 14 µm dünnen Kryostatschnitten mit einem mono-

klonalen Antikörper gegen humanes Neurofilament (70 kDa) durch (MAB5294, Milipore,

Darmstadt).

4.9.3. Konfokale Mikroskopie

Konfokale Bilder von fixierten Zellen bzw. Gehirnschnitten wurden an einem Leica TCS SP5

Mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar) mit der Software „Leica LAS AF Lite v2.2.1“ auf-

genommen. Hierfür wurden ein Argon-Laser, eine 405-Diode, ein DPSS561 und ein

DPSS442-Laser benutzt. Alle Laser wurden auf eine Intensität von 20-30 % eingestellt. Die

Scans der Objektträger erfolgten sequentiell. Sequentielle Aufnahmen erlauben eine ver-

besserte Trennung bei Verwendung mehrerer Laser, da nur ein Wellenlängenbereich zur

selben Zeit angeregt wird. Auf diese Weise wurden bei Scans mit verschiedenen Fluoreszenz-

markierten Antikörpern Nebensignale minimiert.

Mithilfe der verwendeten Software (s.o.) konnten die dargestellten Zellen mit dem korrekten

Fluoreszenzfarbstoff eingefärbt werden. Es wurden Bilder in den Vergrößerungen 100-fach

bis 400-fach aufgenommen.

4.9.4. Quantitative Auswertung

Für die fixierten Zellen aus der Studie zur Vorbehandlung GABAerger Precursorzellen sowie

für die am Kryostaten geschnittenen Gehirne konnten anhand der Fotos quantitative Auswer-

tungen durchgeführt werden.

4.9.4.1. In-vitro Studie

Jedes mit Zellen bewachsene Glasplättchen wurde in vier Quadranten eingeteilt, aus jedem

dieser Quadranten wurde ein repräsentativer Bereich mit 400-facher Vergrößerung foto-

grafiert. Es erfolgte eine verblindete Zellzählung der unterschiedlich angefärbten Zellen durch

zwei verschiedene Personen.

4.9.4.2. In-vivo Studie

Analog führten wir eine preliminäre, quantitative Auswertung der Kryostatschnitte aus der

Vorbehandlungsstudie durch: Ausgezählt wurden alle Schnitte, auf denen Zellen des Trans-


75

plantates innerhalb der Zielregion (hier STN) zu finden waren. Es wurden nur transplantierte

Zellen gezählt, die innerhalb des STN lagen. Zum Vergleich wurde ein Gehirn mit transplan-

tierten Zellen ohne Vorbehandlung mit zwei zerebralen Transplantaten nach Vorbehandlung

verglichen.

4.10. Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism©

Version

5.02 (La Jolla, CA, USA). Bei allen Tiergruppen, bei denen nur zwei PTZ-Anfallsschwellen

(jeweils einmal vor und nach Substanzapplikation) bestimmt wurden, wurden diese mithilfe

des gepaarten t-Testes verglichen. In den Fällen, in denen mehrere Schwellen in denselben

Ratten bestimmt wurden oder Gruppenvergleiche mit mehr als zwei verschiedenen Gruppen

untersucht wurden, haben wir die Daten mit einer „One-way ANOVA“ analysiert. Nur bei

offensichtlichen Gruppenunterschieden wurde als Post-hoc Test ein Bonferroni-Test oder ein

t-Test durchgeführt. Hierbei wurden stets selektierte Behandlungsgruppen mit der Kontroll-

gruppe verglichen. Das Signifikanzniveau wurde auf p<0,05 festgelegt.

Für die Score-Daten aus den Verhaltenstests der Botulinumtoxin-Studie wurde eine "Two-

way ANOVA" gefolgt von einem Bonferroni-Test verwendet.

Die Überprüfung auf Normalverteilung wurde mit Hilfe des Tests von Kolmogorov-Smirnov

durchgeführt. Alle statistischen Tests wurden zweiseitig durchgeführt.

Ergebnisse

76

5. ERGEBNISSE

5.1. Vorab-Studie: Einfluss des Anästhetikums auf die PTZ-

Schwelle

In einer Vorab-Studie sollte erhoben werden, ob die Wahl der Anästhesie einen Einfluss auf

die PTZ-Schwellenbestimmungen hat. 6 h nach Isofluran-Anästhesie glichen die PTZ-An-

fallsschwellen den Basiswerten, wohingegen 6 h nach Xylazin/Ketamin (2 mg/kg / 60 mg/kg

i.p.) eine signifikante Schwellenerhöhung (P=0,0111) für den Klonus auftrat (s. Abb. 20).

Daher wurde in allen weiteren Experimenten eine Inhalationsnarkose mit Isofluran durchge-

führt.

Abb. 20 Einfluss der verschiedenen Anästhetika auf die PTZ-Anfallsschwelle. Dargestellt ist jeweils der

Mittelwert + Standardfehler des Mittelwertes (SEM) der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen Endpunkt

(Myoklonus oder Klonus) in mg/kg PTZ. Gepaarter t-Test, * P<0,05.

Ergebnisse

77

5.2. Einfluss des Zyklusstadiums auf die Anfallsschwellen

Die Anfertigung von Vaginalabstrichen erfolgte, um zyklusbedingte Effekte auf die PTZ-An-

fallsschwellen zu ermitteln. Die mikroskopische Auswertung der Ausstriche ergab, dass die

weiblichen Tiere in einer Haltung ohne Kontakt zu männlichen Tieren untereinander keinen

synchronen Zyklus zeigten. An den Tagen der Schwellenbestimmungen befanden sich die

Tiere in unterschiedlichen Zyklusstadien. Einige Ratten hatten keinen regelmäßigen Zyklus

oder das Zyklusstadium konnte nicht mit ausreichender Sicherheit bestimmt werden. Für die

statistische Auswertung der Einflussnahme auf die Anfallsschwellen wurden die Kontrolltiere

retrospektiv entsprechend ihres Zyklusstandes in Gruppen eingeteilt und diese Gruppen mit-

einander verglichen. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen, was

Ergebnisse aus einer Studie von FINN u. GEE (1994) bestätigt (s. Abb. 21).

Abb. 21 PTZ-Anfallsschwellen in Tieren mit unterschiedlichem Zyklusstand. Dargestellt ist jeweils der

Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen Endpunkt (Myoklonus oder Klonus) in mg/kg

PTZ. Die Tiere wurden retrospektiv anhand ihres Zyklusstandes in Gruppen eingeteilt. ProE = Proöstrus; ProE-E

= Übergangsstadium zwischen Proöstrus und Östrus (Estrus, E); MetE = Metöstrus; DiE = Diöstrus. One-way

ANOVA jeweils nicht signifikant.

5.3. Studie Ia: Fokale Applikation von Vigabatrin

5.3.1. Auswirkungen von Vigabatrin auf die PTZ-Anfallsschwelle

5.3.1.1. Tiergruppen

Für diese Studie wurden insgesamt 297 Ratten verwendet. Während der PTZ-Schwellen-

bestimmungen starben 10 Tiere. Bei 39 Tieren kam es zur paravenösen Infusion von PTZ.

Diese insgesamt 49 Tiere wurden von der finalen Analyse ausgeschlossen. Weitere 4 Tiere

Ergebnisse

78

wurden ausgeschlossen, da histologisch nicht nachgewiesen werden konnte, dass die Mikro-

injektion in die gewünschte Hirnregion appliziert wurde. Es ergaben sich daher folgende

Tiergruppen:

Tab. 3 Verwendete Versuchstiere für den Vergleich systemischer und fokaler Applikation von Vigabatrin.

Experiment Initiale

Gruppen-

größe

Korrekt bilateral in die

Zielregion getroffene

Tiere

Tiere mit Injektionen

außerhalb der Zielregion

Unilateral Bilateral

Insgesamt 297 - - -

Naive Tiere für ver-

gleichende Gewichts-

messungen

226 - - -

Tiere für die finale Aus-

wertung ohne PTZ-

Schwellenbestimmungen

18 - - -

Systemische Administra-

tion von Vigabatrin

15

- - -

Intrazerebrale Injektion von

Vigabatrin (VGB)

…/von NaCl

130

81

67

54

39

19

24

11

Bilaterale Injektion in den

STN von VGB

../von NaCl

72

39

22

26

30

8

20

5

Bilaterale Injektion in die

anteriore SNr von VGB

…/von NaCl

23

25

19

16

3

9

1

-

Bilaterale Injektion in die

posteriore SNr von VGB

…/von NaCl

25

17

16

12

6

2

3

3

Bilaterale Injektion in das

Striatum von VGB

…/von NaCl

10

-

10

-

-

-

-

-

Ergebnisse

79

5.3.1.2. PTZ-Basisschwellen

Die PTZ-Basisschwelle vor Substanzapplikation lag im Durchschnitt bei 19,1 mg/kg für den

ersten Myoklonus und bei 22,8 mg/kg für den klonischen Anfall (Daten von 226 Ratten,

s. Abb. 22). Die Standardabweichung ist klein, da die intra- und interindividuellen

Unterschiede der Schwellen sehr gering ausfielen,

was einen der Vorteile dieses Modells darstellt.

Mit 3,6 % war die Mortalität niedrig, 10 von 279 Tie-

ren starben in Folge der PTZ-Messung. Bei den

meisten Tieren traten jedoch weitere „Endpunkte“

binnen Sekunden nach Ende der PTZ-Infusion auf,

wie tonisch-klonische Krämpfe bis hin zu einem

Verlust der Stellreflexe, gefolgt von weiteren

Myoklonien für die Dauer einiger Minuten. Darauf-

folgend zeigten die Tiere kurzzeitig ein apathisches

Verhalten mit rascher Wiederkehr zum physio-

logischen Habitus.

5.3.1.3. PTZ-Anfallsschwellenerhöhung nach akuter systemischer Gabe

von Vigabatrin

Die intraperitoneale Administration von 600 mg/kg Vigabatrin erhöhte die PTZ-Anfalls-

schwelle für den ersten auftretenden Anfall, den Myoklonus, bis zu maximal 42 % im Ver-

gleich zur Basisschwelle (s. Abb. 23A). Diese signifikante Erhöhung von 23,1 mg/kg auf

32,7 mg/kg PTZ (P<0,001) für die Auslösung eines Myoklonus trat 6 h nach Vigabatrin-

Administration auf und zeigte sich nicht mehr nach 24, 48, 96 und 144 h. Der Effekt auf den

klonischen Anfall, den Klonus, war mit einer Gesamtdauer von 48 Stunden langanhaltender

und die Anfallsschwelle erhöhte sich maximal um 70 %, von 26,0 mg/kg auf 44,2 mg/kg,

nach 6 h (P<0,001; s. Abb. 23B). Es wurden keine Schwellenerhöhungen 2 h nach Vigabatrin-

Behandlung beobachtet. Basierend auf dieser Observation und dem Wunsch, Anästhetika-

assoziierte Wirkungen auf die Anfallsschwellen für die fokale Studie ausschließen zu können,

begannen die Schwellenmessungen in allen weiteren Experimenten 6 h nach Vigabatrin-

Administration.

Basisschwellen

Myo

klonus

Klo

nus

0

10

20

30

40

n=226 n=226

PT

Z [

mg

/kg

]

Abb. 22 Darstellung der PTZ-Basis-

schwellen für die Endpunkte Myoklonus

und Klonus.

Ergebnisse

80

Nach einer Verdopplung der Dosis (1200 mg/kg) erhöhte sich für den Myoklonus die

Schwelle maximal von 22,2 mg/kg auf 35,7 mg/kg PTZ um 61 % nach 6 h (P<0,001); für den

Klonus maximal von 26,4 mg/kg auf 49,2 mg/kg um 86 % nach 6 h (P<0,01), dieser Effekt

hielt für 96 h an (s. Abb. 23C und D).

Myoklonus

Basis 2 h 6 h 24 h 48 h 96 h 144 h0

20

40

60

***

600 mg/kg Vigabatrin

n=15 n=6 n=5 n=7 n=6 n=6 n=5

PT

Z [

mg

/kg

]

Klonus

Basis 2 h 6 h 24 h 48 h 96 h 144 h0

20

40


***

*** *

n=15 n=6 n=5 n=7 n=6 n=6 n=5P

TZ [

mg

/kg

]

Myoklonus

Basis 6h 48 h 96 h 144 h 0

20

40


***

n=6 n=6 n=5 n=6 n=6

PT

Z [

mg

/kg

]

Klonus

Basis 6h 48 h 96 h 144 h 0

20

40


**

***

n=6 n=6 n=5 n=6 n=6

PT

Z [

mg

/kg

]

A B

C D

Abb. 23 Darstellung der Effekte einer systemischen Vigabatrin-Behandlung.

A und B zeigen die PTZ-Anfallsschwellen für die Endpunkte Myoklonus und Klonus zu verschiedenen Zeit-

punkten nach 600 mg/kg VGB (i.p.); C und D zeigen analog die Anfallsschwellen nach 1200 mg/kg (i.p.). Dar-

gestellt ist jeweils der Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen Endpunkt (Myoklonus

oder Klonus) in mg/kg PTZ. One-way ANOVA, post-hoc: Bonferroni/t-Test. * P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001.

5.3.1.4. Antikonvulsive Effekte nach akuter bilateraler Vigabatrin-

Mikroinjektion in den STN

Wie bereits angesprochen, wurden die ersten Anfallsschwellenmessungen 6 h nach Viga-

batrin-Mikroinjektion erfasst, da Vigabatrin seine maximale Effektivität 6 h nach systemi-

Ergebnisse

81

scher Applikation entfaltete. Zudem konnten wir demonstrieren, dass die gewählte Inhala-

tionsnarkose nach dieser Zeitspanne keinen Einfluss mehr auf die Anfallsschwellen hatte

(s. Abschnitt 5.1). Die Tiere wachten etwa 10 Minuten nach Ende der Mikroinjektion auf und

erholten sich innerhalb von 30 Minuten vollständig von der Narkose, also einige Stunden vor

Beginn der ersten Schwellenmessung. Von 111 Tieren mit Mikroinjektionen in den STN war

die Injektion bei 48 Tieren korrekt bilateral im STN platziert (22 Tiere mit Injektion von

Vigabatrin, 26 Tiere mit Injektion von 0,9 % NaCl, s. Tab. 3). Die Lokalisationen der einzel-

nen Injektionen innerhalb des STN sind in Abb. 24 dargestellt. Auf die Tiere mit einseitig

korrekt platzierter oder beidseits außerhalb des STN platzierter Injektion (s. Tab. 3) wird spä-

ter eingegangen.

Ergebnisse

82

Abb. 24 Hirnquerschnitte mit den Injektionsorten inner- und außerhalb des STN.

● Tiere (n=22), bei denen die Injektionen bilateral korrekt innerhalb des STN platziert waren; ○ Ratten (n=16), bei denen die

Mikroinjektion unilateral korrekt im STN und auf der kontralateralen Seite dorsal oder ventral des STN erfolgte; ∆ Tiere

(n=8) mit bilateral dorsal, außerhalb des STN liegenden Injektionen.

In einem zusätzlichen Experiment erfolgte die Injektion von VGB in das Striatum, hier sind nur die Tiere (n=5) abgebildet

(ebenfalls ∆), die auch in Abb. 35 dargestellt sind (24 h post VGB). 4 Tiere bei denen die Injektion einseitig im STN und auf

der anderen Seite in der SNr lag, sind hier nicht mit abgebildet. Außerdem sind die Tiere nicht erfasst, die nicht für die finale

Analyse genutzt wurden. All diese Tiere sind in Tab. 3 erfasst.

Abkürzungen: ac = anteriore Kommissur; cp = cerebraler Pedunkel; ic = interne Kapsel; mfb = mediales Vorderhirnbündel;

PLH = pedunkulärer Teil des lateralen Hypothalamus; VPM = ventraler posteromedialer thalamischer Nukleus, ZID =

dorsaler Teil der Zona incerta; ZIV = ventraler Teil der Zona incerta. Modifiziert nach PAXINOS und WATSON 2007.

Ergebnisse

83

Beidseitige Injektionen von Vigabatrin in den STN führten im Vergleich zur Basisschwelle zu

einer signifikanten Erhöhung der Anfallsschwelle sowohl für den Myoklonus, als auch für

den Klonus (s. Abb. 25): Der maximale antikonvulsive Effekt zeigte sich 24 Stunden nach

Mikroinjektion mit einer 74 %igen Erhöhung von 19,7 auf 34,4 mg/kg PTZ für die Auslösung

eines Myoklonus (P<0,01) und einer 115 %igen Erhöhung (von 24,0 auf 51,7 mg/kg PTZ) für

die Auslösung eines Klonus (P<0,01) relativ zur Basisschwelle vor Vigabatrin-Applikation

(s. Abb. 25). Die Schwelle für die Auslösung eines Klonus war auch nach 48 Stunden noch

signifikant erhöht (P<0,05), kehrte aber nach 96 Stunden wieder auf das Basisniveau zurück.

Bilaterale Injektionen von isotoner Natriumchloridlösung führten nicht zu einer Schwellen-

änderung für den Myoklonus (s. Abb. 25). Dies galt auch für den Klonus, lediglich 48 Stun-

den nach Mikroinjektion konnten wir einen leichten Anstieg von 23,5 mg/kg auf 28,2 mg/kg

(20 %) in der Anfallsschwelle messen (P<0,01). Bei einem direkten Vergleich zwischen Da-

ten nach Vigabatrin-respektive NaCl-Injektion zeigte sich, dass die beobachteten Anfalls-

schwellenerhöhungen post Vigabatrin zu jedem Zeitpunkt signifikant stärker waren als nach

NaCl. Dies galt sowohl für die Auslösung eines Myoklonus als auch des Klonus (s. Abb. 25).

Ergebnisse

84

Myoklonus0.9% NaCl bilateral in den STN

Basis 6h 24h 48h 96h 0

10

20

30

40

50

60

n=3 n=8 n=10n=26 n=5

PT

Z [

mg

/kg

]

Klonus0.9% NaCl bilateral in den STN

Basis 6 h 24 h 48 h 96 h 0

10

20

30

40

50

60

**

n=3 n=8 n=10n=26 n=5

PT

Z [

mg

/kg

]

MyoklonusVigabatrin bilateral in den STN


10

20

30

40

50

60

n=22

oo

n=4 n=9 n=4n=5

o

PT

Z [

mg

/kg

]

**

KlonusVigabatrin bilateral in den STN


10

20

30

40

50

60

n=22

*

oo

n=4 n=9 n=4n=5

oP

TZ [

mg

/kg

]**

A B

C D

Abb. 25 Darstellung der Effekte einer fokalen Injektion von VGB respektive NaCl in den STN. A und B

zeigen die PTZ-Anfallsschwellen für die Endpunkte Myoklonus und Klonus zu verschiedenen Zeitpunkten nach

0,9 % NaCl; C und D zeigen analog die Anfallsschwellen nach 10 µg VGB pro Hirnhemispähre. Dargestellt ist

jeweils der Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen Endpunkt (Myoklonus oder Klonus)

in mg/kg PTZ. Mit Sternen werden signifikante Unterschiede zwischen den Schwellen zum jeweiligen Zeitpunkt

und der Basisschwelle angezeigt. Die Kreise repräsentieren Unterschiede zwischen dem Effekt nach VGB und

NaCl, die zum selben Zeitpunkt ermittelt wurden. One-way ANOVA, post-hoc: Bonferroni/t-Test. * P<0,05; **

P<0,01; *** P<0,001; ° P<0,05; °° P<0,01.

5.3.1.5. Antikonvulsive Effekte nach akuter bilateraler Vigabatrin-Mikro-

injektion in die SNr

In der Literatur ist beschrieben, dass eine Mikroinjektion in die SNr in Abhängigkeit vom

gewählten Anfallsmodell und insbesondere von der genauen Lokalisation der Mikroinjektion

GABA-potenzierender Substanzen zu unterschiedlichen Ergebnissen führen kann (s. Ab-

Ergebnisse

85

schnitt 2.3.2). Aus diesem Grund haben wir Tiere mit einer beidseits anterior erfolgten und

einer beidseits posterior erfolgten Mikroinjektion getrennt ausgewertet.

5.3.1.5.1. Injektionen in die anteriore SNr

Von insgesamt 90 Ratten, die für diese Studie verwendet wurden, waren die Injektionen bei

35 Tieren (19 Vigabatrin, 16 NaCl) korrekt in der anterioren SNr platziert (s. Tab. 3 und

Abb. 26).

Abb. 26 Hirnquerschnitte mit den Injektionsorten nach fokaler Injektion von VGB in die anteriore SNr

(aSNr). Tiere (n=19) mit bilateral erfolgter Injektion von VGB sind abgebildet, Tiere mit NaCl-Injektionen und

nicht beidseits korrekt platzierten Injektionen sind nicht dargestellt; sie finden sich in Tab. 3. Modifiziert nach

PAXINOS und WATSON 2007.

Nach bilateraler Mikroinjektion von Vigabatrin in den anterioren Teil der SNr stieg die An-

fallsschwelle für den Myoklonus 6 h nach Injektion signifikant von 19,6 auf 20,8 mg/kg um

6,1 % (P<0,05; s. Abb. 27). Die maximale, aber nicht statistisch signifikante Erhöhung von

16,6 % auf 22,8 mg/kg zeigte sich nach 24 h. Auswirkungen auf den Klonus waren deutlicher;

Ergebnisse

86

die Schwelle war 6, 24 und 48 h nach Mikroinjektion signifikant höher als bei der Basis-

messung. Der maximale Effekt zeigte sich hier nach 48 h mit einer 60,0 % Erhöhung von

23,8 mg/kg auf 38 mg/kg PTZ für die Auslösung des Klonus (P<0,05; s. Abb. 27). Bilaterale

Injektionen von NaCl führten nur einmalig, nach 48 h zu einer robusten Schwellen-

veränderung (P<0,05; s. Abb. 27).

Myoklonus0.9% NaCl bilateral in die anteriore SNr

Basis 6 h 24 h 48 h 96 h 0

10

20

30

40

50

60

n=8 n=5 n=5n=16 n=6

PT

Z [

mg

/kg

]

Klonus0.9% NaCl bilateral in die anteriore SNr

Basis 6 h 24 h 48 h 96 h 0

10

20

30

40

50

60

n=8 n=5 n=5n=16 n=6

*

PT

Z [

mg

/kg

]

MyoklonusVigabatrin bilateral in die anteriore SNr

Basis 6 h 24 h 48 h 96 h 0

10

20

30

40

50

60

n=4 n=9 n=6n=19 n=4

*

PT

Z [

mg

/kg

]

KlonusVigabatrin bilateral in die anteriore SNr

Basis 6 h 24 h 48 h 96 h 0

10

20

30

40

50

60

****

n=4 n=9 n=6n=19 n=4

*°

°

PT

Z [

mg

/kg

]

A B

C D

Abb. 27 Darstellung der Effekte einer fokalen Injektion von VGB respektive NaCl in die anteriore SNr.


punkten nach 0,9 % NaCl; C und D zeigen analog die Anfallsschwellen nach 10 µg VGB pro Hirnhemispähre.

Dargestellt ist jeweils der Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen Endpunkt (Myoklo-

nus oder Klonus) in mg/kg PTZ. Mit Sternen werden signifikante Unterschiede zwischen den Schwellen zum

jeweiligen Zeitpunkt und der Basisschwelle angezeigt. Die Kreise repräsentieren Unterschiede zwischen dem

Effekt nach VGB und NaCl, die zum selben Zeitpunkt ermittelt wurden. One-way ANOVA, post-hoc:

Bonferroni/t-Test. *P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001; °P<0,05.

Ergebnisse

87

5.3.1.5.2. Injektionen in die posteriore SNr

Bei 28 Tieren (16 Vigabatrin, 12 NaCl) lagen die Injektionsorte beidseits in der posterioren

SNr (s. Tab. 3 und Abb. 28). Daten der nicht beidseits korrekt platzierten Mikroinjektionen

wurden aufgrund der kleinen Tierzahl (teilweise nur 1 oder 2 Tiere pro Gruppe, s. Tab. 3)

nicht weiter analysiert.

Abb. 28 Hirnquerschnitte mit den Injektionsorten nach fokaler Injektion von VGB in die posteriore SNr

(pSNr). Tiere (n=16) mit bilateral erfolgter Injektion von VGB sind abgebildet, Tiere mit NaCl-Injektionen und

nicht beidseits korrekt platzierten Injektionen sind nicht dargestellt; sie finden sich in Tab. 3. Eingezeichnet ist

auch der 3. Hirnnerv, N. oculomotorius, der als anatomische Grenze zwischen anteriorem und posteriorem Teil

der SNr gewählt wurde. Modifiziert nach PAXINOS und WATSON 2007.

Beidseits posterior platzierte Injektionen von Vigabatrin erhöhten die Schwelle für den

Myoklonus maximal nach 6 h von 17,3 auf 22,6 mg/kg PTZ um 30,6 % (s. Abb. 29). Eine

signifikante Erhöhung auf 21,6 mg/kg um 24,9 % zeigte sich aber lediglich nach 24 h

(P<0,05) und nach 96 h (P<0,05). Für den Klonus erhöhte sich 24 h nach Injektion die

Anfallsschwelle um 48,1 %, von 21,0 auf 31,1 mg/kg PTZ (P<0,05) und nach 96 h auf 29,4

mg/kg um 40 % (P<0,01; s. Abb. 29). Kontrollinjektionen mit 0,9 % NaCl führten nur 24 h

nach Injektion zu einer Schwellenerhöhung für den Klonus um 26,9 % von 22,3 auf 28,3

mg/kg (P<0,05; s. Abb. 29). Es wurde, abgesehen von den zuvor beschriebenen postoperativ-

assoziierten Nebenwirkungen, weder bei Kontrolltieren noch bei mit Vigabatrin behandelten

Tieren Nebenwirkungen beobachtet.

Ergebnisse

88

Myoklonus0.9% NaCl bilateral in die posteriore SNr

Basis 6 h 24 h 48 h 96 h 0

10

20

30

40

50

60

n=4

n=5n=3

n=12

n=6

n=5 n=3 n=6

PT

Z [

mg

/kg

]

Klonus0.9% NaCl bilateral in die posteriore SNr

Basis 6 h 24 h 48 h 96 h 0

10

20

30

40

50

60

n=5n=3n=6

n=4n=12 n=5 n=3 n=6

*

PT

Z [

mg

/kg

]

MyoklonusVigabatrin bilateral in die posteriore SNr

Basis 6 h 24 h 48 h 96 h 0

10

20

30

40

50

60

*

n=9

n=5n=5

n=16

n=9

n=9n=5 n=5

*

PT

Z [

mg

/kg

]

KlonusVigabatrin bilateral in die posteriore SNr

Basis 6 h 24 h 48 h 96 h 0

10

20

30

40

50

60

*

n=5n=5n=9

n=9n=16 n=9n=5 n=5

**

PT

Z [

mg

/kg

]

A B

C D

Abb. 29 Darstellung der Effekte einer fokalen Injektion von VGB respektive NaCl in die posteriore SNr.


punkten nach 0,9 % NaCl; C und D zeigen analog die Anfallsschwellen nach 10 µg VGB pro Hirnhemispähre.


nus oder Klonus) in mg/kg PTZ. Mit Sternen werden signifikante Unterschiede zwischen den Schwellen zum

jeweiligen Zeitpunkt und der Basisschwelle angezeigt. One-way ANOVA, post-hoc: Bonferroni /t-Test. *

P<0,05; **P<0,01.

5.3.1.6. Vergleich der Wirksamkeit von Vigabatrin nach systemischer und

fokaler Applikation

Um die Daten aus der Studie zur systemischen mit denen aus der fokalen Substanzapplikation

vergleichen zu können, wurden jeweils die maximal erreichten Schwellenerhöhungen in Pro-

zent gegenüber der Basisschwelle (100 %) miteinander verglichen (s. Abb. 30).

Ergebnisse

89

5.3.1.6.1. Anfallsschwellenerhöhungen für den Endpunkt Myoklonus

Im Vergleich zur systemischen Behandlung mit Vigabatrin zeigte sich der maximale antikon-

vulsive Effekt nach Injektionen in den STN später, erst 24 h nach Vigabatrin-Administration

(s. Abb. 30). Für eine Erhöhung der PTZ-Schwelle für die Auslösung des Myoklonus waren

beidseitige Injektionen in den STN effektiver als in die anteriore (P=0,0016) SNr. Tendenziell

waren Injektionen in den STN in ihrer Wirkung auf den Myoklonus auch den bilateralen In-

jektionen in die posteriore SNr überlegen (P=0,0565). Ebenso verhielt es sich mit systemi-

schen Injektionen in der geringeren Dosis, dies erreichte jedoch ebenfalls nicht das statisti-

sche Signifikanzniveau (P=0,0706 beim Vergleich fokal STN gegen systemisch 600 mg/kg

i.p.). Antikonvulsive Effekte nach Mikroinjektion in die anteriore oder posteriore SNr unter-

schieden sich im direkten Vergleich nicht voneinander (s. Abb. 30).

5.3.1.6.2. Anfallsschwellenerhöhungen für den Endpunkt Klonus

In allen Experimenten waren die Schwellenerhöhungen für den Klonus deutlich stärker als für

den Myoklonus (s. Abb. 30); der Klonus scheint der sensitivere Endpunkt für die hier

beschriebene Untersuchung von antikonvulsiven Effekten durch Vigabatrin zu sein. Auch hier

erwies sich eine bilaterale Mikroinjektion in den STN als effektivste Strategie. Analog zu den

Ergebnissen beim Myoklonus wurde ebenfalls ein späterer Eintritt der antikonvulsiven Wir-

kung beobachtet als nach der systemischen Administration von Vigabatrin. Die Anfalls-

schwelle nach Injektionen in den STN war gegenüber Injektionen in die anteriore (P=0,0125)

oder posteriore (0,0349) SNr signifikant erhöht. Zudem konnte mit fokaler Applikation in den

STN eine signifikant erhöhte Schwelle gegenüber der niedrigeren systemischen Dosis

(600 mg/kg i.p.) erreicht werden (P=0,0429), nicht aber für die höhere intraperitoneale Dosis

von 1200 mg/kg (P=0,1450). Es gab wiederum keinen Unterschied zwischen der Wirksamkeit

einer Injektion in die anteriore oder posteriore SNr.

Wie bereits erwähnt, führte in drei Fällen die Injektion von NaCl zu einer Schwellenerhöhung

(s. Abb. 25, Abb. 27 und Abb. 29), für Vigabatrin waren es hingegen 11 von den 24 durchge-

führten Schwellenmessungen. Aus diesem Grund vermuten wir, dass es sich bei den Effekten

durch NaCl um eine Ausnahme handelt, die durch eine Läsion der Zielstruktur oder

Volumeneffekte erklärt werden könnten.

Ergebnisse

90

Myoklonus post Vigabtrin

0

50

100

150

200

Basis (= 100%)

VGB i.p., 600 mg/kg

VGB i.p., 1200 mg/kg

VGB STN

VGB aSNr

VGB pSNr

6 h 6 h 24 h 24 h 6 h Zeitpunkt des max. Effektes

**

*

*o

A

n=5 n=6 n=9 n=9 n=9Sch

wellen

erh

öh

un

g [

%]

n=38

Klonus post Vigabatrin

0

50

100

150

200

250

Basis (= 100%)

VGB i.p., 600 mg/kg


VGB STN

VGB aSNr

VGB pSNr

6 h 6 h 24 h 48 h 6 hZeitpunkt des max. Effektes

**

**

*o o

#

B

n=5 n=6 n=9 n=6 n=9Sch

wellen

erh

öh

un

g [

%]

n=38

Abb. 30 Vergleich der Effekte nach systemischer und fokaler Vigabatrin-Behandlung. Dargestellt ist je-

weils der Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen in % gegenüber der Basisschwelle (= 100 %) für die

Endpunkte Myoklonus und Klonus. Durch Sterne werden signifikante Schwellenerhöhungen gegenüber der

jeweiligen Basisschwelle angezeigt; Kreise repräsentieren einen signifikanten Unterschied zwischen fokalen

Injektionen in den STN oder die Subregionen der SNr. Die Raute zeigt einen signifikanten Unterschied der

Schwellenerhöhung zwischen der fokalen Injektion in den STN und der systemischen Injektion von 600 mg/kg

an. Ungepaarter t-Test, *,°,# P<0,05.

5.3.2. Nebenwirkungen

Die systemische Verabreichung von Vigabatrin rief in beiden Dosierungen ausgeprägte Ne-

benwirkungen hervor, wie Sedation und Ataxie für eine Dauer von etwa 24 h. Zusätzlich kam

es zu einer Senkung der Körpertemperatur und des Körpergewichtes, die vermutlich auf die

Ergebnisse

91

sedativen Effekte zurückzuführen sind. Die Körpertemperatur der Tiere sank nach intraperi-

tonealer Administration von Vigabatrin innerhalb von zwei Stunden um 2 °C, erreichte aber

nach etwa zwei weiteren Stunden wieder die Ausgangstemperatur (s. Abb. 31).

0 20 40 6034

35

36

37

38

39

600 mg Vigabatrin (n=6)


Kontrollen (n=3)

h nach VGB-Administration

Kö

rpert

em

pera

tur

[°C

]

Im Gegensatz zu den beschriebenen unerwünschten Wirkungen nach systemischer Viga-

batrin-Injektion konnten wir nach fokaler Injektion von Vigabatrin keine Nebenwirkungen

beobachten. Während der Aufwachphase aus der Isofluran-Anästhesie zeigten die Tiere Se-

dation, Ataxie und Piloerektion für eine Dauer von etwa 10 Minuten. Es konnte kein Unter-

schied zwischen Tieren, denen Vigabatrin respektive NaCl appliziert wurde, festgestellt wer-

den, so dass die Beobachtungen als normales postoperatives Verhalten interpretiert wurden.

Es wurden weiterhin keine Stereotypien oder Zirkeln beobachtet. Zu den verschiedenen Zeit-

punkten der folgenden Schwellenmessungen waren alle Tiere wach und aktiv ohne Unter-

schied zwischen Behandlungs- und Kontrollgruppe, was sie deutlich von den Tieren nach

systemischer Vigabatrin-Injektion unterschied. Der Gewichtsverlust war langanhaltender, die

Tiere verloren innerhalb eines Tages bei der 600 mg/kg Dosierung 6 % (P<0,01) und bei der

höheren Dosis von 1200 mg/kg bis zu 10 % (P<0,001) ihres Ausgangsgewichtes nach Viga-

batrin-Injektion. Nach etwa einer Woche erreichten sie wieder den Ausgangswert (s. Abb. 32

und 33). Die Gewichtsentwicklung unterschied sich zudem deutlich von der Zunahme der

Kontrollgruppe (P<0,001).

Abb. 31 Köpertemperaturentwicklung nach intraperitonealer Vigabatrin-Injektion. Zum ersten

Messzeitpunkt wurde abweichend von der Legende nur bei zwei Tieren (600 mg/kg VGB) bzw. einem Tier

(1200 mg/kg VGB) die rektale Körpertemperatur ermittelt.

Ergebnisse

92

-200 -100 0 100

210

220

230

240

250



Kontrollen (n=18)

Start Schwellenbestimmungen

Zeit [h] vor und nach Vigabatrin-Administration

Kö

rpe

rge

wic

ht

[g]

Das Körpergewicht der Tiere aus der STN Vigabatrin-Gruppe nahm im Vergleich zum Aus-

gangsgewicht geringgradig ab (um 4 %; P<0,001), was aber keine signifikante Abnahme im

Vergleich mit der Gewichtsentwicklung der Kontrollgruppe darstellte. Nach Mikroinjektionen

in die anteriore oder posteriore SNr änderte sich das Körpergewicht der Tiere nicht signifikant

gegenüber dem Ausganggewicht oder der Gewichtsentwicklung der Kontrollgruppe (s. Abb.

33).

-15

-10

-5

0

5

**

***

VGB i.p., 600 mg/kg


naive Kontrollen

VGB STN

VGB SNr

NaCl SNr

NaCl STN

°°

°

n=6 n=6

n=18

n=9

n=13

n=10n=9

***

*

Än

deru

ng

des

Au

sg

an

gsg

ew

ich

tes [

%]

Abb. 33 Gewichtszunahmen bzw. –abnahmen 24 h nach Vigabatrin- respektive Kontroll-Behandlung.

Dargestellt sind die Gewichtsveränderungen in % gegenüber dem Ausgangsgewicht vor Vigabatrin-/Kontroll-

Injektion. Sterne zeigen signifikante Unterschiede zwischen Ausgangsgewicht und Gewicht post Behandlung an.

Kreise repräsentieren Unterschiede zwischen systemischer und fokaler Vigabatrin-Administration. Zudem er-

niedrigte systemische Vigabatrin-Administration das Gewicht gegenüber Kontrolltieren (P<0,001)-, fokale

Vigabatrin-Applikation führte nicht zu Unterschieden zwischen Behandlungs- und Kontrollgruppe. One-way

ANOVA, post hoc: Bonferroni/t-Test, * P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001; ° P<0,05; °° P<0,01.

Abb. 32 Gewichtsverlauf nach

intraperitonealer Vigabatrin-Injektion.

Ergebnisse

93

5.3.3. Spezifität der Zielregionen bei fokaler Applikation

Bei einigen Tieren aus dem Experiment zur bilateralen Injektion von Vigabatrin in den STN

war nur eine oder keine der Injektionen korrekt platziert (s. Tab. 3), was durch die geringe

Größe des STN der Ratte von etwa 1 mm3 (HARDMAN et al. 2002) begründet ist. Diese

Fehlinjektionen erlaubten uns jedoch, die beobachtete antikonvulsive Wirkung nach bilatera-

ler Injektion in den STN auf ihre Spezifität zu untersuchen. Zusätzlich wurden Experimente

mit einer bilateralen Injektion in eine anterior gelegene Hirnregion, das zentrale Striatum,

durchgeführt (s. Tab. 3 und Abb. 24).

5.3.3.1. Antikonvulsive Effekte nach fokaler Vigabatrin-Injektion in das

Striatum

Bei 10 Ratten wurde Vigabatrin bilateral ins Striatum injiziert und die Anfallsschwelle bei 5

Tieren 6 h und bei 5 Tieren 24 h nach Mikroinjektion bestimmt (s. Abb. 34). Nach 6 h unter-

schied sich die Schwelle für den Myoklonus nicht signifikant von der Basisschwelle (Anstieg

um 6,6 %), die Schwelle für den Klonus hingegen stieg von 20,3 auf 36,1 mg/kg PTZ um

78 % an (P<0,001). Auch nach 24 h zeigte sich kein signifikanter Anstieg der Schwelle für

den Myoklonus, für den Klonus stieg die Schwelle signifikant auf 34,2 mg/kg PTZ um 69 %

(P<0,01).

Myoklonus

Basis 6 h 24 h0

10

20

30

40

n=5n=10 n=5

PT

Z [

mg

/kg

]

Klonus

Basis 6 h 24 h0

10

20

30

40

n=5n=10 n=5

*** **

PT

Z [

mg

/kg

]

A B

Abb. 34 PTZ-Anfallsschwellen nach fokaler Vigabatrin-Injektion in das zentrale Striatum. Dargestellt ist

jeweils der Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen Endpunkt (Myoklonus oder Klonus)

in mg/kg PTZ. Mit Sternen werden signifikante Unterschiede zwischen den Schwellen zum jeweiligen Zeitpunkt

und der Basisschwelle angezeigt. One-way ANOVA, post-hoc: Bonferroni, ** P<0,01; *** P<0,001.

Ergebnisse

94

5.3.3.2. Antikonvulsive Effekte nach Vigabatrin-Injektionen außerhalb der

Zielregion STN

Bei den meisten Tieren mit nicht korrekt platzierten Injektionen wurden 24 oder 48 h nach

Vigabatrin-Injektion die Anfallsschwellen gemessen. Da die Werte sich wenig unterschieden

war eine gemeinsame Analyse möglich (s. Abb. 35). Bei einer Gruppe von Tieren (n=4) er-

folgte die Injektion einseitig im STN und auf der anderen Seite in der anterioren SNr. Der

antikonvulsive Effekt glich in dieser Gruppe dem Effekt einer bilateral in den STN platzierten

Injektion. Bei 10 Tieren wurde die Injektion einseitig korrekt im STN platziert und auf der

kontralateralen Seite innerhalb von 0,5 mm dorsal des STN in angrenzenden Hirnregionen,

hauptsächlich der Zona incerta. Der Einfluss auf die Schwellenänderung des Myoklonus glich

dem der bilateralen Injektion, während die Schwellenerhöhung für den Klonus mit 72 % ge-

genüber 113 % nach bilateraler Injektion weniger deutlich ausfiel. Lag die Injektion einseitig

im STN und auf der anderen Seite hingegen 0,5 mm ventral des STN in angrenzenden Hirn-

regionen (n=6), vor allem im zerebralen Pedunkel, erhöhte sich die Schwelle für den Myoklo-

nus lediglich um 36 % und für den Klonus um 65 %. Diese Werte ähneln denen nach beidseits

nicht im STN platzierten Mikroinjektionen beobachteten Schwellenänderungen von 40 % für

den Myoklonus und 70 % für den Klonus bei 8 Tieren mit beidseits 0,5 mm dorsal des STN

gesetzten Injektionen. Folgende Hirnregionen wurden in dieser Gruppe mit Vigabatrin

injiziert: Zona incerta, pedunkulärer Teil des lateralen Hypothalamus und das mediale Vor-

derhirnbündel. Bei wenigen Tieren wurden andere Zeitpunkte untersucht (6 und 96 h), diese

zeigten aber deutlich geringere Schwellenerhöhungen als die Tiere nach 24 h und 48 h nach

bilateraler Injektion von Vigabatrin (Daten nicht dargestellt).

Ergebnisse

95

Myoklonus

0

50

100

150

200

***Basis (= 100%)

STN bilateral

STN unilat./<0.5 mm dorsal STN

STN unilat./<0.5 mm ventral STN

Striatum

bilat. <0.5 mm dorsal STN

***** ***

*STN/aSNr

n=47 n=14 n=4n=4 n=10 n=6 n=8 n=5Sch

welle

nerh

öh

un

g [

%]

Klonus

0

50

100

150

200

250Basis (= 100%)

STN bilateral

STN unilat./<0.5 mm ventral STN

bilat. <0.5 mm dorsal STN

******

***

Striatum

***** **

STN unilat./<0.5 mm dorsal STN

STN/aSNr

n=47 n=14 n=4 n=10 n=6 n=8 n=5Sch

welle

nerh

öh

un

g [

%]

A

B

Abb. 35 Spezifitätsvergleich der antikonvulsiven Wirkung einer fokalen Vigabatrin-Applikation.

Dargestellt ist jeweils der Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen Endpunkt

(Myoklonus oder Klonus) in % gegenüber der Basisschwelle (=100 %). Mit Sternen werden signifikante

Unterschiede zwischen den Schwellen nach Applikation in die jeweilige Hirnregion und der Basisschwelle

angezeigt. One-way ANOVA, post-hoc: Bonferroni, * P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001.

5.3.4. Akute fokale Applikation von Vigabatrin nach Status epileptikus

Die Statusinduktion erfolgte gemeinsam mit den Tieren für die Neurotransplantation und wird

hier für alle Tiere beschrieben. Insgesamt wurden 26 Tiere verwendet. Bei einem Tier konnte

durch die fraktionierte Pilokarpin-Applikation kein Status epileptikus ausgelöst werden, es

wurde nicht für die Studie verwendet. Alle weiteren Tiere erfuhren nach der Bolus-Injektion

und in den meisten Fällen nach zwei Nachinjektionen von Pilokarpin einen selbsterhaltenden

Status, der nach 90 Minuten unterbrochen wurde. Zwei Tage nach Status wurden zwei Tiere

morgens tot im Käfig aufgefunden. Ein Tier wurde aufgrund eines sehr schlechten Allge-

Ergebnisse

96

meinbefindens und einer hochgradigen Hämaturie euthanasiert. Während des Wiegens und

Fütterns der Tiere erfuhren einige Tiere bereits innerhalb der ersten Tage nach Status spon-

tane oder noch insult-assoziierte Anfälle. Drei Tiere wurden für die Vigabatrin-Studie ver-

wendet, 19 weitere Tiere für die Neurotransplantation (s. Abschnitt 5.5.7).

Die Basisschwelle der Tiere 3-4 Wochen nach Pilokarpin-Status glich der Basisschwelle in

naiven Tieren. Die Basisschwelle für die Auslösung eines Myoklonus lag bei 20,1 mg/kg

PTZ, für den Klonus bei 23,5 mg/kg PTZ. Diese Daten bestätigten unsere frühere Beobach-

tung, dass sich die Dosis PTZ für die Auslösung eines Myoklonus bzw. Klonus in naiven und

in Tieren mehrere Tage (> 2 Tage) nach Pilokarpin-Status nicht unterscheiden (RATTKA et

al. 2011). Eine Bewertung der Anfallsschwere wurde, anders als in der Arbeit von RATTKA

et al. (2011), aufgrund der preliminären Natur des Versuches und der damit verbundenen

kleinen Tierzahl nicht durchgeführt. Eine bilaterale Mikroinjektion von Vigabatrin in den

STN führte in dieser Gruppe von drei Tieren (nicht in Tab. 3 enthalten) nicht zu einer

signifikanten Schwellenerhöhung (s. Abb. 36): Die Schwelle für den Myoklonus erhöhte sich

nach 24 h um 27 % auf 25,6 mg/kg PTZ (P=0,1260) und für den Klonus um 53% auf 36,0

mg/kg PTZ (P=0,1133). Hier ist anzumerken, dass bei 2 Tieren die Schwellenerhöhung

deutlich ausfiel und bei einem Tier nicht. Auch nach 96 h gab es keine Schwellenänderungen.

Es traten keine unerwünschten Nebenwirkungen nach Vigabatrin-Applikation auf. Die Tiere

zeigten allerdings bei der Bestimmung der Basisschwelle und den nachfolgenden Messungen

ein schreckhaftes und aggressives Verhalten, das bekannterweise durch Pilokarpin bzw. die

Epileptogenese ausgelöst wird (s. Abschnitt 4.4.5).

Myoklonus

Basis 24 h 96 h0

10

20

30

40

50

n=3n=3 n=3

PT

Z [

mg

/kg

]

Klonus

Basis 24 h 96 h0

10

20

30

40

50

n=3n=3 n=3

PT

Z [

mg

/kg

]

A B

Abb. 36 Effekte einer fokalen Vigabatrin-Applikation in den STN einige Wochen nach Status epileptikus.


nus oder Klonus) in mg/kg. One-way ANOVA.

Ergebnisse

97

5.4. Studie Ib: Fokale Substanzapplikation von Botulinumtoxin B

5.4.1. Schwellenänderungen nach Botulinumtoxin B

Nach akuter unilateraler Botulinumtoxin B-Injektion in den Hippokampus traten unerwartet

signifikante Schwellenerniedrigungen auf (s. Abb. 37). Während der ersten

Schwellenmessungen post Botulinumtoxin B an Tag 1, 2, 3 und 4 ergaben sich keine Unter-

schiede zu der zuvor ermittelten Basisschwelle. An Tag 7 hingegen sank die Schwelle signifi-

kant für den Myoklonus auf 14,1 mg/kg PTZ, das entspricht einer Erniedrigung um 39 %; die

Basisschwelle lag zuvor bei 23,1 mg/kg (P<0,05). Auch beim Klonus gab es eine Tendenz zu

einem prokonvulsiven Effekt, hier sank die Schwelle von 27,6 mg/kg auf 19,4 mg/kg um

30 %, erreichte allerdings nicht das Signifikanzniveau. Zwei Wochen nach Botulinumtoxin B-

Administration wurden die prokonvulsiven Effekte noch deutlicher, die Schwelle für den

Myoklonus sank auf 10,3 mg/kg (-55,4 %, P<0,001) und auch die Schwellenerniedrigung für

den Klonus wurde mit einer Senkung um 42,4 % auf 15,9 mg/kg signifikant (P<0,01) gegen-

über der Basisschwelle. Im Vergleich dazu gab es für den Myoklonus keine Schwellenverän-

derungen in der Vehikel-Gruppe. Für den Klonus zeigte sich allerdings in der Vehikel-Gruppe

ein antikonvulsiver Effekt an Tag 1, 4 und 7 nach CED (P1 und P4<0,05; P7<0,01). In einem

direkten Vergleich zwischen der Vehikel- und Behandlungsgruppe unterschieden sich die

Schwellenwerte für 7 und 14 Tage signifikant voneinander (Myoklonus: P7<0,05; P14<0,001;

Klonus: P7<0,01; P14<0,001).

Ergebnisse

98

Vehikel Myoklonus

Bas

is

1 Tag

2 Tag

e

3 Tag

e

4 Tag

e

7 Tag

e

14 T

age

0

10

20

30

40

n=9 n=4 n=4 n=4 n=4 n=8 n=7

PT

Z [

mg

/kg

]

Vehikel Klonus

Bas

is

1 Tag

2 Tag

e

3 Tag

e

4 Tag

e

7 Tag

e

14 T

age

0

10

20

30

40 *

n=9 n=4 n=4 n=4 n=4 n=8 n=7

* **

PT

Z [

mg

/kg

]BTX B Myoklonus

Bas

is

1 Tag

2 Tag

e

3 Tag

e

4 Tag

e

7 Tag

e

14 T

age

0

10

20

30

40

n=9 n=5 n=4 n=4 n=3 n=7 n=8

*

***

o

ooo

PT

Z [

mg

/kg

]

BTX B Klonus

Bas

is

1 Tag

2 Tag

e

3 Tag

e

4 Tag

e

7 Tag

e

14 T

age

0

10

20

30

40

n=9 n=5 n=4 n=4 n=3 n=7 n=8

***

oo ooo

PT

Z [

mg

/kg

]

A B

C D

Abb. 37 Effekte einer unilateralen, intrahippokampalen Infusion von Vehikel (A und B) bzw.

Botulinumtoxin B (BTX B, 1000 Units) (C und D) im PTZ-Anfallsschwellenmodell. Dargestellt ist jeweils

der Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen Endpunkt in mg/kg. One-way ANOVA,

post hoc: Bonferroni. Sterne repräsentieren signifikante Unterschiede zwischen der jeweiligen Schwelle nach

CED von BTX B/Vehikel und der Basisschwelle. Die Kreise zeigen Unterschiede zwischen der Vehikel- und

Behandlungsgruppe zum jeweiligen Zeitpunkt an. */° P<0,05, **/°° P<0,01; ***/°°° P<0,001.

In einer weiteren, kleineren Gruppe von Tieren wurde eine geringere Dosis von 500 U

Botulinumtoxin B appliziert und an Tag 7 und 14 eine PTZ-Schwelle bestimmt (s. Tab. 2 und

Abb. 38). Die Applikation von Botulinumtoxin B führte auch hier zu einer erhöhten

Suszeptibilität gegenüber PTZ und reproduzierte die beschriebenen Ergebnisse mit der höhe-

ren Dosis.

Ergebnisse

99

500 U BTX B Myoklonus

Bas

is

6 Tag

e

13 T

age

0

10

20

30

40

**

n=6 n=4 n=6

***PT

Z [

mg

/kg

]

500 U BTX B Klonus

Bas

is

6 Tag

e

13 T

age

0

10

20

30

40

**

n=6 n=3 n=6

PT

Z [

mg

/kg

]

A B

Abb. 38 Effekte nach unilateraler, intrahippokampaler Infusion von BTX B (500 Units) im PTZ-Anfalls-

schwellentest. Dargestellt ist jeweils der Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen End-

punkt in mg/kg. One-way ANOVA, post hoc: Bonferroni. Sterne repräsentieren signifikante Unterschiede

zwischen der jeweiligen Schwelle nach BTX B und der Basisschwelle. ** P<0,01; *** P<0,001.

5.4.2. Nebenwirkungen

Das tägliche Wiegen der Tiere ergab nur einen geringgradigen Gewichtsverlust der mit

Botulinumtoxin B behandelten Tiere im Vergleich zu Kontrolltieren (s. Abb. 39). Insgesamt

entwickelte sich die Gewichtszunahme nach Botulinumtoxin B nicht so homogen wie in der

Vehikelgruppe, der Gewichtsunterschied erreichte aber nur am letzten Tag der Messung, an

Tag 7, statistische Signifikanz. Daten werden hier nur für die erste Behandlungsgruppe ge-

zeigt, sie glichen den anderen Gruppen.

Bas

is

Tag 1

Tag 2

Tag 3

Tag 4

Tag 5

Tag 6

Tag 7

0

50

100

150

Vehikel

BTX B

*

Zu

-/A

bn

ah

me d

es

Kö

rperg

ew

ich

tes [

%]

Abb. 39 Gewichtsverlauf nach Vehikel-/ Botulinumtoxin B (BTX B)-Infusion. Dargestellt sind die Mittel-

werte + SEM des Körpergewichtes in % gegenüber des Basisgewichtes (= 100 %), das vor der CED von BTX

B/Vehikel gemessen wurde. Ungepaarter t-Test, * P<0,05.

Ergebnisse

100

Die Verhaltensanalyse bei Botulinumtoxin B-behandelten und Kontrolltieren ergab jedoch

auffällige Unterschiede: Während des täglichen Wiegens und dem damit verbundenen Hand-

ling der Tiere fiel auf, dass die Toxingruppe insgesamt sehr schreckhaft war und ausweichend

auf Berührungen reagierte. Zudem wurden beginnend in der ersten Woche nach

Botulinumtoxin B-Injektion bei zwei Dritteln der Toxin-behandelten Ratten epileptische An-

fälle beobachtet, die partiell aus der Ruhe heraus, und teilweise während des Handlings der

Tiere auftraten. Dies wurde sowohl in der PTZ-Gruppe als auch in der Gruppe von Tieren

ohne wiederholte Schwellenmessungen beobachtet. Bis Versuchsende (etwa drei Wochen

post Botulinumtoxin-Injektion) wurden weiterhin Anfälle beobachtet. Aufgrund dieser

Observationen wurden die unter Material und Methoden beschriebenen Verhaltenstests auf

Hyperexzitabilität (s. Abschnitt 4.4.5) durchgeführt.

5.4.3. Verhaltenstests

Für den Hyperexzitabilitätstest zeigten sich keine Unterschiede im Approach-response,

Touch-response oder Finger-snap Test. Lediglich im Pick-up Test traten signifikante Unter-

schiede zwischen Vehikel- und Botulinumtoxin B-behandelten Tieren auf (s. Abb. 40):

Während in einer Gruppe von Tieren 4/5 Tage (P=0,0689) post CED das statistische Signifi-

kanzniveau noch nicht erreicht wurde, ergaben sich signifikante Unterschiede zu späteren

Zeitpunkten (11/12 Tage, 2 und 3 Wochen) post CED (P11/12 Tage<0,01; P2Wochen<0,001 und

P3Wochen<0,001) zwischen der Kontrollgruppe und der Botulinumtoxin B-Gruppe. Vehikel-

kontrollen hatten einen durchschnittlichen Score von 1,1 bzw. 1,6. Dieser Score steht für ein

leichtes Handling der Ratte beim Anheben des Tieres, eventuell kommt eine leise Vokalisa-

tion vor. Im Gegensatz dazu erreichten die Toxin-behandelten Tiere einen Score von 4,1 bzw.

4,6. Dies ist gleichbedeutend mit einer erschwerten Handhabung des Tieres, da es sich flucht-

artig von der Hand wegbewegt oder sogar aus dem Käfig springt (s. Abb. 13).

Ergebnisse

101

4/5

Tage

post C

ED

11/1

2 Tag

e post

CED

14/1

5 Tag

e post

CED

21/2

2 Tag

e post

CED

0

2

4

6

******

n=5 n=5 n=8 n=8n=6 n=6 n=8 n=8

*

Sco

re

4 Tag

e post

CED

13 T

age

post C

ED

20 T

age

post C

ED

0

2

4

6Vehikel

BTX B***

n=5 n=5 n=5n=6 n=6 n=6

*

Sco

re

A B

Abb. 40 Ergebnisse des Pick-up Tests zu verschiedenen Zeitpunkten nach Vehikel-/ Botulinumtoxin B

(BTX B)-Infusion. Dargestellt sind die Mittelwerte + SEM der Scores des Pick-up Tests. A Tiere, die eine Dosis

von 1000 Units BTX B in 2 µl Vehikel oder nur 2 µl Vehikel erhalten haben. Hier sind 2 Gruppen von Tieren

zusammengefasst; es handelt sich nicht zu jedem Zeitpunkt um dieselben Tiere. Daher wurde eine Two-way

ANOVA für nicht verbundende Daten durchgeführt. Es ergaben sich signifikante Unterschiede (P<0,0001)

zwischen der Behandlung mit Toxin oder Vehikel, post hoc: Bonferroni. B Tiere, die eine Dosis von 500 Units

BTX B in 1 µl Vehikel respektive nur 1 µl Vehikel erhalten haben. Hier wurden zu jedem dargestellten Zeit-

punkt dieselben Tiere getestet und daher eine Two-way ANOVA für verbundene Daten durchgeführt. Es ergaben

sich signifikante Unterschiede sowohl zwischen der Behandlung mit Vehikel oder Toxin (P<0,0065) als auch

zwischen den verschiedenen Zeitpunkten der einzelnen Behandlungen (P< 0,0065), sowie zwischen den Zeit-

verläufen des Effektes der Toxin- und Vehikelgruppe (P< 0,0029), post hoc: Bonferroni. * P<0,05; *** P<0,001.

In der Gruppe von Tieren, die lediglich die Hälfte der ursprünglichen Dosis an Toxin erhalten

hatten (500 U), ließen sich ebenfalls signifikante Unterschiede im Pick-up Test feststellen, die

noch nicht nach 4 und 13 Tagen, aber nach 20 Tagen (P=0,0018) und somit etwa eine Woche

später gegenüber der Gruppe mit der doppelten Dosis auftraten (s. Abb. 40B).

5.4.4. EEG-Aufnahmen

In beiden Tiergruppen, sowohl in der Gruppe mit wiederholten PTZ-Schwellenbestimmungen

als auch in den Tieren mit permanent implantierten Führungsrohr-Ableitelektroden-Kombi-

nationen ohne wiederholte PTZ-Tests, wurden bei zwei Dritteln der Ratten motorische An-

fälle einige Tage nach Botulinumtoxin B-Applikation beobachtet (s. Tab. 4). Diese Anfälle

traten zum Teil aus der Ruhe heraus, zum Teil Handling-assoziiert, etwa beim täglichen Wie-

Ergebnisse

102

Abb. 41 Spontaner Anfall einer Ratte während der Aufzeichnung des EEGs mittels einer Elektrode.

gen der Tiere oder vor PTZ-Schwellenbestimmungen, auf. Aus diesem Grund wurde in einer

Gruppe von Tieren ein Elektroenzephalogramm (EEG) aus dem Gyrus dentatus aufgezeich-

net. Die Echtzeit-Beobachtung sowie die Auswertung der EEG-Aufnahmen an Tag 5-7 nach

CED ergab, dass motorische, fokale und generalisierte, sowie rein elektroenzephalo-

graphische Anfälle nur bei Toxin-behandelten Tieren auftraten. Sie zeigten im Durchschnitt

2,34 Anfälle während der fünfminütigen Aufnahme (s. Tab. 4 und Abb. 41).

Tab. 4 Spontan auftretende Anfälle während der fünfminütigen EEG-Aufnahme.

Zudem ergab sich, dass signifikant mehr (P=0,0111) epileptiforme Spikes in der Toxingruppe

(17,89 Spikes/min) auftraten als in der Vehikelgruppe (5,17 Spikes/min; s. Abb. 42). Im Falle

der mit Vehikel behandelten Tiere traten die Spikes vereinzelt auf, es kamen sowohl mono-

und biphasische Spikes und Sharp waves als auch polyphasische Sharp waves vor (s. Abb.

Tiernr. Behandlung Anfälle

21 Vehikel -

22 Vehikel -

23 Vehikel -

25 BTX B -

26 BTX B 1

27 BTX B 7

28 BTX B -

29 BTX B 3

30 BTX B 3

Ergebnisse

103

43). Bei den Botulinumtoxin B behandelten Tieren hingegen traten die genannten Spike-

Typen vermehrt im Cluster auf, die eine Frequenz zwischen 1 und 11 Hertz aufwiesen.

Abb. 42 Auftreten von Spikes und Sharp waves nach Botulinumtoxin B (BTX B)-/Vehikel-Infusion.

A Dargestellt sind die Mittelwerte + SEM der Anzahl der Spikes und Sharp waves pro Minute. Ungepaarter t-

Test, P<0,05. B Spikes im EEG bei einem mit BTX B-behandelten Tier. C Vergrößerung einzelner Spikes.

Abb. 43 Häufig aufgetretene

Spike-Typen nach Botulinum-

toxin B (BTX B).

A monophasischer Spike;

B biphasische Sharp wave;

C biphasischer Spike;

D polyphasische Sharp wave;

E Achseneinheiten.

Ergebnisse

104

5.5. Studie IIa: Neurotransplantation GABAerger Vorläuferzellen

5.5.1. Gewinnung, Kultivierung und Transplantation

Aufgrund der Zuchtproblematik und der Umbauarbeiten innerhalb unseres Institutes (s. Ab-

schnitt 4.5.2) konnten wir nur anfänglich selbst züchten und somit direkte Transplantationen

von Zellen aus der LGE durchführen (nach HATTIANGADY et al. 2008). Danach führten

wir größtenteils eine Gewinnung der GABAergen Vorläuferzellen mit darauffolgender Kulti-

vierung im Neurosphärenstadium nach dem Protokoll von WALDAU et al. (2010) durch.

Eine tragende Ratte hatte i.d.R. zwischen 7 und 12 Feten, die für die Präparation der medialen

ganglionischen Eminenz (MGE) geeignet waren und etwa zwischen 60 und 500 x 104 vitale

Zellen lieferten. Nach wenigen Tagen in Kultur unter Zusatz von FGF und EGF (s. Ab-

schnitt 10.2) bildeten die Zellen frei im Medium schwebende Neurosphären aus zwei bis drei

Einzelzellen. In den Folgetagen lagerten sich weitere Zellen an und bildeten Neurosphären.

Unter Standardbedingungen (37 °C, 5 % CO2) wurden die Sphären nach etwa 7 Tagen

adhärent, ließen sich aber durch tägliches „Losschlagen“ für einige Tage weiterhin im

Medium schwebend kultivieren, bevor sie gesplittet wurden. Erfolgte kein mechanisches

Loslösen der adhärenten Zellen, bildeten sie erste Ausläufer und einzelne Zellen wanderten

wieder aus den Neurosphären aus, so dass sich nach einigen weiteren Tagen ein konfluenter

Zellrasen bildete. Für die Transplantation wurden jedoch stets frei im Medium schwebende

Neurosphären verwendet. Die einzige Ausnahme bildete die Verpflanzung adhärenter Zellen

mit Dendriten in der Nachfolgestudie zur Vorbehandlung striataler Vorläuferzellen (s.

Abschnitt 4.5.8).

5.5.2. Tiergruppen

Für die finale Auswertung wurden nur Tiere einbezogen, deren Zelltransplantate bilateral in

der Zielstruktur lagen (s. Tab. 5). Kamen verschiedene Transplantationsprotokolle (s. Ab-

schnitt 4.5.5) zur Anwendung, wurden die Gruppen zusammengefasst, wenn es keinen Unter-

schied zwischen den Einzelgruppen gab.

Ergebnisse

105

Tab. 5 Verwendete Versuchstiere für Studie II: Neurotransplantation GABAerger Vorläuferzellen.

Ursprüngliche

Gruppengröße

Bilateral ge-

troffen

Hirnregion Zellart Transplantationssystem Weiteres?

11 4 aSNr LGE Einzelzellsuspension mit

Glaskapillare

6 5 aSNr Medium Glaskapillare

10 9 STN MGE Ganze Sphären mit Hamil-

tonspritze

11 6 STN Medium Ganze Sphären mit Hamil-

tonspritze

6 5 aSNr MGE Gemischt PILO°

4 4 aSNr Medium Gemischt PILO

6 2 STN MGE Ganze Sphären mit Hamil-

tonspritze

PILO

3 1 STN Medium Hamiltonspritze PILO

° PILO steht für Tiere nach Status epileptikus

5.5.3. Schwellenmessungen nach Transplantation

Post transplantationem von GABAergen Vorläuferzellen aus der LGE und der MGE gab es

keine signifikanten Unterschiede zur Auslösung eines Myoklonus und Klonus zwischen

Basisschwelle und Schwellen im PTZ-Test (s. Abb. 44 und Abb. 45). Tiere mit nicht bilateral

gelegenen Transplantaten wurden aus diesem Grund nicht weiter analysiert.

Ergebnisse

106

LGE Myoklonus

Bas

is

9-11

Tag

e

5 W

ochen

3 M

onate

0

10

20

30

40

n=4 n=4 n=3 n=2

PT

Z [

mg

/kg

] Kontrollen Klonus

Bas

is

9-11

Tag

e

5 W

ochen

3 M

onate

0

10

20

30

40

n=4n=5 n=5 n=3

PT

Z [

mg

/kg

]

LGE Klonus

Bas

is

9-11

Tag

e

5 W

ochen

3 M

onate

0

10

20

30

40

n=4 n=4 n=3 n=2

PT

Z [

mg

/kg

]

Kontrollen Myoklonus

Bas

is

9-11

Tag

e

5 W

ochen

3 M

onate

0

10

20

30

40

n=4n=5 n=5 n=3

PT

Z [

mg

/kg

]

A B

C D

Abb. 44 PTZ-Anfallsschwellen nach Injektion von Medium (A und B) oder Transplantation von

Vorläuferzellen aus der LGE der Ratte (C und D) in die anteriore SNr. Dargestellt sind die Mittelwerte +

SEM der PTZ-Anfallsschwellen in mg/kg. One-way ANOVA.

Ergebnisse

107

MGE Myoklonus

Bas

is

9-11

Tag

e

5 W

ochen

3 M

onate

0

10

20

30

40

n=9 n=9 n=8 n=8

PT

Z [

mg

/kg

]

MGE Klonus

Bas

is

9-11

Tag

e

5 W

ochen

3 M

onate

0

10

20

30

40

n=9 n=9 n=8 n=8

PT

Z [

mg

/kg

]

Kontrollen Klonus

Bas

is

9-11

Tag

e

5 W

ochen

3 M

onate

0

10

20

30

40

n=6 n=6 n=6 n=5

PT

Z [

mg

/kg

]

Kontrollen Myoklonus

Bas

is

9-11

Tag

e

5 W

ochen

3 M

onate

0

10

20

30

40

n=6 n=6 n=6 n=5

PT

Z [

mg

/kg

]

A B

C

Abb. 45 PTZ-Anfallsschwellen nach Injektion von Medium (A und B) oder Transplantation von

Vorläuferzellen aus der MGE der Ratte (C und D) in den STN. Dargestellt sind die Mittelwerte + SEM der

PTZ-Anfallsschwellen in mg/kg. One-way ANOVA.

5.5.4. Verhaltensbeobachtung nach Transplantation

Konform mit den Beobachtungen aus der Studie zur fokalen Substanzapplikation mit Viga-

batrin zeigten die Tiere nach Zelltransplantation bzw. Medium-Injektion keine auffälligen

Verhaltensweisen direkt nach Operation oder zu den Zeitpunkten der Schwellenmessungen.

5.5.5. Histologie

Vergleichend zur Mikroinjektionsstudie wurde die korrekte Position der Transplantate sowie

der Kontroll-Injektionen von Neurobasalmedium in anhand von Thionin-gefärbten Gehirn-

schnitten histologisch überprüft und nur bilateral korrekt platzierte Transplantate oder

Medium-Injektionen in die Auswertung miteinbezogen.

Ergebnisse

108

Die GABAergen Vorläuferzellen ließen sich nach kurzfristiger Inkubation mit Caspase-Inhi-

bitor und FGF-2 und sukzessiver Transplantation (Protokoll nach HATTIANGADY et al.

(2008)) noch bis zu 3 Monate histologisch nachweisen (s. Abb. 46).

Abb. 46 Vorläuferzellen aus der LGE in der anterioren SNr drei Monate post Transplantation in der

Thioninfärbung. A zeigt die Ansammlung stark angefärbter, transplantierter Zellen, B eine Vergrößerung des

Transplantatbereiches. Maßstabsbalken: A = 200 µm, B = 100 µm.

Auch nach einwöchiger Kultur als Neurosphären (Protokoll nach WALDAU et al. (2010)) mit

oder ohne Passagen, nach dem Einfrieren, erneutem Auftauen und anschließender Kultivie-

rung gelang der histologische Nachweis 3 Monate nach Transplantation. Die Zellen zeigten

sich im Thionin-gefärbten Schnitt stark angefärbt. In dieser Anfärbung konnte nicht evaluiert

werden, ob es sich hier um die Transplantate selbst oder zusätzlich auch um wirtseigene Zel-

len handelte. Aufgrund der geringen Größe des STN wurden auch Transplantate als getroffen

gewertet, wenn der Hauptanteil der Zellen innerhalb der Zielstruktur lag (s. z.B. Abb. 55B).

In Medienkontrolltieren war der Nachweis

teilweise schwieriger, da besonders nach

Transplantation mittels Glaskapillare der

Einstichkanal kaum noch im Gewebe zu dif-

ferenzieren war (s. Abb. 48). Es wurde weder

in Kontrolltieren noch in Tieren mit Trans-

plantaten eine Abstoßungsreaktion oder eine

Tumorbildung beobachtet.

Abb. 48 Einstichkanal eines Kontrolltieres 5

Wochen nach Medium-Injektion in die

anteriore SNr. Maßstabsbalken = 200 µm.

Abb. 47 Einstichkanal eines Kontrolltieres

5 Wochen nach Medium-Injektion in die anteriore

SNr. Maßstabsbalken = 200 µm.

Ergebnisse

109

5.5.6. Immunhistologie

Eine genauere Klassifizierung der stark Thionin-gefärbten Zellen im Transplantatbereich er-

möglichte die immunhistologische Differenzierung mittels verschiedener Antikörper (s. Abb.

49 und Abb. 49). Mit einer Anfärbung gegen den Marker BrdU konnten wir belegen, dass die

transplantierten Zellen bis zu 3 Monate nach Transplantation überlebt hatten. Im Bereich des

Transplantates gab es frequent Anhäufungen von Astrozyten, die mit einem spezifischen

Marker (GFAP, s. Abschnitt 4.9.1) angefärbt wurden. Die qualitative Analyse der Gehirn-

schnitte ergab keine auffallenden Unterschiede in der Morphologie und Differenzierung der

transplantierten Zellen aus LGE oder MGE.

Abb. 49 Zelltransplantate aus der LGE fünf Wochen nach Transplantation in die anteriore SNr. A, C und

E zeigen das Transplantat in der linken, B, D und F in der rechten Hirnhemisphäre. A und B Thioninfärbung,

C und D immunhistologische DAB-Färbung gegen BrdU, E und F immunhistologische DAB-Färbung gegen

GFAP. Maßstabsbalken = 100 µm.

Ergebnisse

110

Abb. 50 Immunhistologisch-angefärbte Gehirnschnitte einer Ratte drei Monate nach Transplantation von

MGE-Vorläuferzellen in den STN. A zeigt die sequentielle Aufnahme der BrdU-positiven Vorläuferzellen

innerhalb des STN (Cy2-markiert = grün); B zeigt die GFAP-positiven Zellen inner- und außerhalb des Trans-

plantates; C Überlagerung. Maßstabsbalken = 100 µm.

Die BrdU-positiven Zellen selbst hatten sich zu einem Teil in Neurone (positiv für NeuN,

s. Abb. 51 und Abb. 52) und zu einem Teil in Astrozyten (anti-GFAP markiert, s. Abb. 49)

differenziert. Wir konnten außerdem zeigen, dass sich transplantierte Zellen in GAD67-posi-

tive Zellen differenziert hatten (s. Abb. 53 und Abb. 54). Anhand der 40 µm dicken Schnitte

konnte allerdings keine quantitative Analyse der Zelldifferenzierung durchgeführt werden.

Abb. 51 Immunhistologisch-angefärbte Gehirnschnitte einer Ratte 3 Monate nach Transplantation von

Vorläuferzellen aus der MGE in den STN. A zeigt die sequentielle Aufnahme der BrdU-positiven Vorläufer-

zellen innerhalb des STN (Cy2-markiert = grün); B zeigt die NeuN-positiven Neurone innerhalb des STN (Cy3-

markiert = rot); C Überlagerung, es wird deutlich, dass nur sehr wenige BrdU-positive Zellen auch positiv für

den Neuronenmarker NeuN gefärbt sind (gelb). Maßstabsbalken = 100 µm.

Ergebnisse

111

Abb. 53 Immunhistologisch-angefärbte Gehirnschnitte einer Ratte drei Monate nach Transplantation von

Vorläuferzellen aus der MGE in den STN. A zeigt BrdU-positive Zellen im STN (Cy2-markiert = grün);

B zeigt, dass nur wenige der Zellen positiv für GAD67 sind (Cy3-markiert = rot); C Überlagerung.

Maßstabsbalken = 100 µm.

Abb. 52 Immunhistologisch-angefärbte Gehirn-

schnitte desselben Tieres aus Abb. 51 in einem

anderen Bereich. A zeigt die sequentielle Aufnahme

der BrdU-positiven Vorläuferzellen innerhalb des STN

(Cy2-markiert = grün); B zeigt die NeuN-positiven

Neurone innerhalb des STN (Cy3-markiert = rot);

C Überlagerung; D Vergrößerung, es wird deutlich,

dass nur sehr wenige transplantierte Zellen positiv für

den Neuronenmarker NeuN gefärbt sind (gelb; Pfeile).

Maßstabsbalken = 100 µm.

Ergebnisse

112

Abb. 54 Immunhistologisch-angefärbte Gehirnschnitte einer Ratte 3 Monate nach Transplantation von

Vorläuferzellen aus der MGE in den STN. A zeigt die sequentielle Aufnahme der BrdU-positiven Vorläufer-

zellen innerhalb des STN (Cy2-markiert = grün); B zeigt die GAD67-positiven Neurone innerhalb des STN;

C Überlagerung, es wird deutlich, dass nur wenige transplantierte Zellen positiv für GAD67 gefärbt sind. Maß-

stabsbalken = 100 µm.

Innerhalb der Transplantate und im Einstichkanal waren zudem sehr häufig Blutzellen vor-

handen (s. Abb. 55A). Ferner konnten wir regelmäßig eine Migration der Zellen aus der Ziel-

struktur beobachten (s. Abb. 55B). Besonders auffällig war dies nach Transplantationen in

den dicht gepackten STN. Eine akzidentielle Platzierung der Zellen in andere Regionen

konnte hier ausgeschlossen werden, da einerseits ein Teil des Transplantates innerhalb der

Zielregion lag, andererseits die Zellen zumeist einer nicht linearen Route in die jeweilige

Hirnregion folgten, die durch die Injektion mit einer starren Kanüle nicht beschreibbar gewe-

sen wäre.

Abb. 55 Thioninfärbungen von Zelltransplantaten fünf Wochen nach Transplantation in den STN. A zeigt

Erythrozyten innerhalb des Einstichkanals und des STN; in Aufnahme B ist die erwähnte Migration der trans-

plantierten Zellen aus dem STN in den zerebralen Pedunkel zu sehen. Maßstabsbalken = 100 µm.

Ergebnisse

113

5.5.7. Transplantation nach Status epileptikus

Im Hinblick auf spätere Arbeiten in chronischen Epilepsiemodellen wurden auch in dieser

Studie Tiere einem Pilokarpin-induzierten Status epileptikus ausgesetzt, um preliminär poten-

tielle Effekte einer Transplantation nach Hirninsult zu evaluieren, da es in der Literatur Hin-

weise auf eine bessere Überlebensrate und Integration von Zelltransplantaten in Gehirn-

regionen gibt, die nicht intakt sind, sondern pathologische Umstrukturierungen erfahren haben

(s. Abschnitt 2.4.3). Für allgemeine Informationen zur Statusauslösung s. Abschnitt 5.3.4. Bei

Tieren nach Status erfolgten einzelne Transplantationen von Vorläuferzellen aus der MGE

bilateral in die aSNr oder den STN. Die Zelltransplantationen in die aSNr wurden teilweise

als ganze Neurosphären, teilweise jedoch in einer Einzelzellsuspension durchgeführt. Die

einzelnen Gruppen bestanden nur aus 1-3 Tieren, unterschieden sich untereinander nicht und

wurden deshalb gemeinsam ausgewertet. Nach Transplantation der GABAergen Zellen erga-

ben sich keine Unterschiede im Vergleich zu den Basisschwellen (s. Abb. 56). Histologisch

und immunhistologisch glichen die Gehirne in STN / aSNr und die Zelltransplantate dem zu-

vor beschriebenen Bild.

Ergebnisse

114

Abb. 56 PTZ-Anfallsschwellen nach Injektion von Medium (A und B) oder Transplantation von MGE-

Vorläuferzellen in die anteriore SNr (C und D) bzw. Transplantation in den STN (E und F). Dargestellt

sind die Mittelwerte + SEM der PTZ-Anfallsschwellen in mg/kg. One-way ANOVA. Die Kontrolltiere wurden

aufgrund der kleinen Gruppengröße für die anteriore SNr und den STN zusammengefasst. Ein Tier aus der Kon-

trollgruppe zog sich während der Basisschwellenmessung nach dem ersten Endpunkt die PTZ-Infusionskanüle

aus der Schwanzvene, so dass es einen Wert für den Endpunkt Myoklonus, nicht aber für den Klonus gibt.

Ergebnisse

115

5.5.8. Nachfolgestudie: Vorbehandlung der GABAergen Vorläuferzellen

5.5.8.1. In-vitro Studie

5.5.8.1.1. Kultivierung

Ohne Behandlung und nach Zugabe von Creatinmonohydrat oder Retinsäure setzten sich die

GABAergen Vorläuferzellen aus der MGE der Ratte innerhalb von 1-2 Tagen auf den Glas-

plättchen innerhalb der 6-well-Schalen ab. Valproat führte zu einer späteren Adhärenz, hier

dauerte es etwa 4 Tage. Aus adhärenten Neurosphären wanderten innerhalb kurzer Zeit ver-

schiedene Zelltypen aus, darunter morphologisch identifizierbar waren Astrozyten sowie Neu-

rone. Beide Zelltypen formten Ausläufer. Bei Neuronen wurden nach wenigen Tagen

Wachstumskegel sichtbar.

5.5.8.1.2. Immunhistologische Auswertung

Die Auswertung der Fluoreszenz-markierten Zellen auf den Glasplättchen ergab, dass in un-

behandelten Zellen nach 7 Tagen etwa 22,3 % der DAPI-markierten Zellen positiv für den

Astrozytenmarker GFAP waren. 13,9 % der Zellen exprimierten den neuronalen, nukleären

Marker NeuN. Die Färbung gegen GAD67 lieferte keine auswertbaren Ergebnisse (s. Abb.

57). In vorbehandelten Zellen lieferte die Vorbehandlung mit Creatinmonohydrat signifikant

weniger Astrozyten (12,1 %) als die Kontrolle (7 Tage kultiviert) (P<0,001). Auch eine Be-

handlung mit Retinsäure und Kaliumchlorid führte zu signifikant weniger Astrozyten im Ver-

gleich zu unbehandelten Zellen (11 Tage kultiviert) (P<0,05). Den größten Anteil an

Neuronen (36,4 %) zählten wir nach Behandlung der Zellen mit Valproat; hier ergab sich ein

signifikanter Unterschied zu unbehandelten Zellen (7 Tage kultiviert) (P<0,001). In diesem

Versuchsdurchgang war auch die Anfärbung für GAD67 erfolgreich: Das Protokoll für die

Generierung der größten Anzahl GAD67-exprimierender Zellen war die Behandlung mit Val-

proat, die zu 32,1 % GAD67-positiven Zellen führte. Die Behandlung mit Retinsäure und

Kaliumchlorid führte zu signifikant mehr GAD67-positiven Zellen (47,4 %) als unbehandelte

Kontrollzellen (11 Tage kultiviert), die zu 33,8 % GAD67-positiv waren (P<0,05; s. Abb. 57).

Da für die Verwendung des Protokolls nach BOSCH et al. (2004) mit einer sequenzierten

Retinsäure-Vorbehandlung und anschließender Kaliumchlorid-Depolarisation 11 Tage be-

nötigt wurden (s. Abschnitt 4.5.7), kultivierten wir auch unbehandelte Zellen für diese Zeit-

Ergebnisse

116

spanne. 21,5 % der DAPI-positiven Zellen waren ohne Behandlung nach 11 Tagen zu Astro-

zyten differenziert (s. Abb. 57). Neurone bildeten einen Anteil von 23,4 % der gesamten Zel-

len und 33,8 % exprimierten GAD67. Im Vergleich führte der Zusatz von Retinsäure und

Kaliumchlorid zu folgenden Anteilen: 14,3 % GFAP-positive Zellen, 29,1 % NeuN-positive

Zellen und 47,8 % GAD67-positive Zellen.

NeuN

Kontr

olle 7

dCM

VPA

RA/K

Cl

Kontr

olle 1

1d

0

20

40

60

***

n=24 n=47 n=39 n=24 n=8

% N

eu

N-p

osit

ive Z

ellen

GFAP

Kontr

olle 7

dCM

VPA

RA/K

Cl

Kontr

olle 1

1d

0

20

40

60

*** *

n=24 n=47 n=39 n=24 n=8% G

FA

P-p

osit

ive Z

ellen

GAD67

Kontr

olle 7

dCM

VPA

RA/K

Cl

Kontr

olle 1

1d

0

20

40

60

*

n=20 n=23 n=23 n=8% G

AD

67-p

osit

ive Z

ell

en

A B

C

5.5.8.2. In-vivo Studie

5.5.8.2.1. Schwellenmessungen nach Transplantation vorbehandelter Zellen

Es gab keine signifikanten Effekte auf die PTZ-Schwelle nach Transplantation von Zellen, die

7 Tage mit Valproat oder insgesamt 11 Tage mit Retinsäure/KCl vorbehandelt wurden (s.

Abb. 58). Auch eine Transplantation länger kultivierter, adhärenter MGE-Zellen, die bereits

erste Ausläufer bildeten, zeigte weder anti- noch prokonvulsive Wirkung (s. Abb. 58). In die-

Abb. 57 Immunhistologische Auswertung der in-vitro

Kultivierung. Anfärbung gegen NeuN (A), GFAP (B)

und GAD67 (C). Dargestellt sind die Mittelwerte + SEM

der Auszählungen von Fotos der auf Glasplättchen

kultivierten Zellen in %. Sterne zeigen signifikante

Unterschiede zwischen der jeweiligen Vorbehandlung

und der dazugehörigen Kontrolle (für CA und VPA 7

Tage; für RA/KCl 11 Tage) an. One-way ANOVA, post

hoc: Bonferroni, * P<0,05; *** P<0,0001.

7d = 7 Tage; 11d = 11 Tage; CM = Creatinmonohydrat;

VPA = Valproat; RA/KCl = Retinsäure/Kaliumchlorid.

Ergebnisse

117

sen Gruppen wurden ebenfalls Kontrolltiere mit Medium injiziert, diese sind in die Kontroll-

gruppe aus Abb. 45 integriert.

Abb. 58 PTZ-Anfallsschwellen nach Transplantation vorbehandelter Vorläuferzellen aus der MGE,

Vorbehandlung mit Valproinsäure (A und B) oder Retinsäure und Kaliumchlorid (C und D). Dargestellt

sind die Mittelwerte + SEM der PTZ-Anfallsschwellen in mg/kg. One-way ANOVA.

Ergebnisse

118

5.5.8.2.2. Verhaltensbeobachtungen

Die Tiere zeigten analog der Transplantation GABAerger Vorläuferzellen ohne Vorbehand-

lung kein abweichendes Verhalten.

5.5.8.3. Quantitative Auswertung

Die Behandlung mit RA/KCl war die erfolgreichste im in-vitro Versuch (s. Abschnitt

5.5.8.1.2), um eine vermehrte Differenzierung in GABAerge Zellen zu forcieren. Daher

wurde in dieser Studie exemplarisch ein Gehirn mit Transplantat aus nicht vorbehandelten

Zellen und ein Gehirn mit vorbehandeltem (RA/KCl) Zelltransplantat an einem Kryostaten

geschnitten, um an den dünnen Präparaten eine Zellzählung auf GAD67-positive Zellen durch-

führen zu können. In dem Kontrollgehirn befand sich das Transplantat nur unilateral im STN,

darum wurde nur diese Seite ausgezählt: 11,9 % der BrdU-positiven, und damit transplan-

tierten Zellen, exprimierten GAD67 (s. Abb. 59). Im Vergleich lag die Rate an GABAergen

Zellen in den beiden Transplantaten vorbehandelter Zellen deutlich höher, bei 31,0 % aller

transplantierten Zellen innerhalb des STN. Insgesamt fanden sich lediglich etwa zwischen 500

und 3000 Zellen innerhalb des STN. Ursprünglich wurden 80000 Zellen pro Hemisphäre ein-

gesetzt. Zellen außerhalb des STN, z.B. im Einstichkanal, wurden nicht mitgezählt.

GAD67

Kontr

olle

RA/K

Cl

0

10

20

30

40

***

% G

AD

67-p

osit

ive Z

ell

en

n=16 n=85

Abb. 59 Immunhistologische Auswertung der Transplantation mit Retinsäure und Kaliumchlorid vorbe-

handelter Vorläuferzellen aus der MGE, Anfärbung gegen GAD67. Dargestellt sind die Mittelwerte + SEM

der Auszählung GAD67-positiver Zellen in % der transplantierten (BrdU-positiven) Zellen innerhalb des STN 5

Wochen nach Transplantation. Ausgezählt wurden unilateral 16 Schnitte eines Kontrollgehirnes nach Trans-

plantation unbehandelter Zellen und bilateral insgesamt 85 Schnitte eines Gehirnes nach Transplantation vorbe-

handelter Zellen. Sterne zeigen signifikante Unterschiede zwischen vorbehandelten und unbehandelten Zellen

an. Ungepaarter t-Test, *** P<0,0001.

Ergebnisse

119

5.6. Studie IIb: Neurotransplantation von NT2-Zellen

Die Kultivierung der NT2-Zellen fand größtenteils in den Laboratorien der AG Bicker statt.

5.6.1. Schwellenmessungen nach Transplantation von NT2-Zellen

Für die Transplantation von NT2-Zellen ergaben sich folgende Gruppen:

Tab. 6 Verwendete Versuchstiere für Studie II: Neurotransplantation von NT2-Zellen.

Ursprüngliche

Gruppengröße

Bilateral

getroffen

Hirnregion Zellart Transplantationssystem

12 8 (5 sicher)* STN Adulte NT2 Einzelzellsuspension mit

Glaskapillare/Hamiltonspritze

8 7 (3 sicher)* STN PBS + Ca, Mg Glaskapillare/Hamiltonspritze

8 7 (6 sicher)* aSNr NT2-Precursor

1 Tag geprimt

Hamiltonspritze

7 5 aSNr NT2-Precursor

1 Woche geprimt

Hamiltonspritze

5 4* aSNr PBS + Ca, Mg Hamiltonspritze

* histologisch nicht mehr nachweisbar, darum in Klammern die Anzahl der Tiere angegeben, bei denen die bi-

lateral korrekt gelegene Transplantation histologisch verifiziert werden konnte; ° PILO steht für Tiere nach Sta-

tus epileptikus

Die Transplantation adulter NT2-Neurone in den STN führte nicht zu signifikanten Schwel-

lenänderungen gegenüber der Basisschwelle (s. Abb. 60). Auch die Injektion von Vehikel

alleine (PBS mit Zusatz von Calcium und Magnesium) verursachte keine pro- oder antikon-

vulsiven Effekte.

Ergebnisse

120

Abb. 60 PTZ-Anfallsschwellen nach Transplantation adulter NT2-Neurone in den STN (A und B Kon-

trollinjektionen mit PBS + Ca und Mg, C und D Zelltransplantation. Dargestellt sind die Mittelwerte + SEM

der PTZ-Anfallsschwellen in mg/kg. One-way ANOVA.

Ebenso verhielt es sich nach Transplantation von NT2-Vorläuferzellen, die eine Woche mit

Retinsäure geprimt wurden (s. Abb. 61C und 61D). Auch eine Transplantation von nur einem

Tag geprimten NT2-Precursoren führte nicht zu signifikanten Schwellenänderungen (s. Abb.

61E und 61F).

Ergebnisse

121

Abb. 61 PTZ-Anfallsschwellen nach Transplantation von NT2-Vorläuferzellen. Kontrollinjektionen von

PBS + Ca und Mg (A und B), Zelltransplantation NT2-Vorläufern, die eine Woche (C und D) oder nur

einen Tag mit Retinsäure geprimt wurden (E und F). Dargestellt sind die Mittelwerte + SEM der PTZ-An-

fallsschwellen in mg/kg. One-way ANOVA.

5.6.2. Verhaltensbeobachtungen

Die Tiere zeigten nach Transplantation von adulten NT2-Neuronen oder –Vorläuferzellen

kein auffälliges Verhalten. Bei zwei Tieren mit Zelltransplantaten (NT2-Vorläuferzellen,

einen Tag mit Retinsäure geprimt) wurde jeweils ein generalisierter Anfall vor der Anfalls-

Ergebnisse

122

schwellenmessung fünf Wochen bzw. drei Monate nach Transplantation beobachtet, an die-

sem Tag wirkten die Tiere ängstlicher. Allerdings wurde in einem anderen Versuch ebenfalls

ein naives Tier vor Beginn von PTZ-Schwellenbestimmungen bzw. einer Neurotransplanta-

tion mit einem generalisierten epileptischen Anfall gesehen, so dass wir hier nicht von einem

Zusammenhang mit der Transplantation ausgehen.

5.6.3. Histologie

Die histologische Auswertung mit standardisierten Protokollen erwies sich als problematisch.

Besonders im Fall der Kontrolltiere konnte nach 3 Monaten in einigen Fällen (s. Tab. 6) kein

Einstichkanal mehr ausgemacht werden. Sicher als „nicht-getroffen“ klassifizierte Tiere

wurden aus der Auswertung ausgeschlossen, jedoch wurden in der Kontrollgruppe einige

Tiere mit unsicherer Histologie in die Auswertung miteinbezogen, da sonst die Gruppengröße

für eine statistische Auswertung zu stark reduziert worden wäre. Als absehbar war, dass es

keinen Effekt auf die Anfallsschwelle gab, wurden in einer späteren Transplantationsserie die

Tiere bereits nach 5 Wochen getötet, um die histologischen Befunde vor Verschwinden der

Gewebeverletzung durch die Glaskapillare rechtzeitig auswerten zu können (s. Abb. 62). In

einem Fall zeigte sich 5 Wochen nach Transplantation histologisch eine Abstoßungsreaktion

(s. Abb. 63).

Abb. 62 Thioninfärbung fünf Wochen nach Transplantation adulter NT2-Zellen in den STN. Aufnahme

A zeigt den STN eines Kontrolltiers (PBS + Ca und Mg) mit Erythrozyten an der Einstichstelle; B zeigt den STN

nach Zelltransplantation. Es wird deutlich, dass die Bilder sich, anders als nach der Transplantation GABAerger

Vorläuferzellen aus der Ratte, sehr ähneln, so dass die Vermutung nahe liegt, dass wenige NT2-Zellen überlebt

haben. Maßstabsbalken = 100 µm.

Ergebnisse

123


Es gab zunächst einige Schwierigkeiten mit dem immunhistologischen Nachweis der NT2-

Zellen sowohl in der AG Bicker als auch in unserem Institut. Mithilfe des monoklonalen An-

tikörpers gegen humanes Neurofilament (70 kDa) aus der Maus gelang uns aber der Nachweis

der adulten transplantierten Neurone im Nagerhirn (s. Abb. 64).

Abb. 63 Thioninfärbung fünf Wochen

nach Transplantation adulter NT2-

Zellen in den STN. Gewebereaktion

innerhalb und oberhalb des STN.

Maßstabsbalken = 100µm.

Abb. 64 Immunhistologisch-gefärbter Gehirnschnitt eines

Tieres 5 Wochen nach Transplantation von adulten NT2-

Neuronen. Die Zellen liegen innerhalb des Einstichkanals

oberhalb des STN. Maßstabsbalken = 100 µm.

Diskussion

124

6. DISKUSSION

6.1. Studie Ia: Fokale Substanzapplikation von Vigabatrin

Die Hypothese, dass durch fokale Applikation ähnlich antikonvulsive Effekte wie mit sys-

temischer Administration von Vigabatrin erzielt werden können, ist bestätigt worden. Die

maximale antikonvulsive Wirkung nach systemischer Vigabatrin-Injektion trat nach 6 Stun-

den auf. Die Effekte nach fokaler Applikation erreichten erst nach 24 bzw. 48 Stunden ihr

Maximum. Eine fokale, bilaterale Mikroinjektion in den STN war die effektivste Maßnahme

zur Erhöhung der PTZ-Anfallsschwelle. Diese fokale Intervention führte anders als die sys-

temische nicht zum Auftreten ausgeprägter Nebenwirkungen.

6.1.1. Der subthalamische Nukleus als geeignete Zielregion für fokale

Therapie

Die vorliegenden Daten belegen, dass der STN eine geeignete Zielstruktur für fokale Thera-

pieansätze mit Manipulation des GABAergen Systems darstellt. Interessanterweise war im

PTZ-Anfallsschwellentest die bilaterale Mikroinjektion von Vigabatrin in den STN deutlich

stärker antikonvulsiv wirksam als jeweils eine bilaterale Injektion in die Subregionen der SNr,

für die aufgrund literarischer Daten das Auftreten eines antikonvulsiven Effektes sehr wahr-

scheinlich war (LE GAL LA SALLE et al. 1983a; MCNAMARA et al. 1984; TURSKI et al.

1986; LÖSCHER et al. 1987; XU et al. 1991; SMOLDERS et al. 1997): Vor allem durch die

Arbeiten von VELÍŠKOVÁ et al. (1996a; 1998) gab es ambivalente Hinweise bezüglich der

Eignung der anterioren oder posterioren SNr als Zielregion für fokale Therapie. In unserer

Arbeit wirkte eine Injektion in die SNr antikonvulsiv, allerdings waren nur die Effekte einer

Mikroinjektion in den anterioren Teil der SNr gegenüber einer Kontrollinjektion mit NaCl

statistisch signifikant. Die aSNr konnte auch in einem elektrischen Anfallsmodell (Kindling)

als effektive Zielregion für die Erhöhung der Nachentladungsschwelle identifiziert werden

(NOLTE et al. 2006).

Vigabatrin wurde in der vorliegenden Studie erstmals in den STN appliziert, jedoch gab es

Vorgängerstudien, in denen andere antikonvulsiv wirkende Substanzen wie Muscimol, ein

GABAA-Rezeptor-Agonist, in verschiedenen Modellen für epileptische Anfälle bzw. Epilep-

sie eine antikonvulsive Wirkung entfaltete (DERANSART et al. 1996; VELÍŠKOVÁ et al.

1996b; DERANSART et al. 1998; DYBDAL u. GALE 2000). Der antikonvulsive Effekt wird

Diskussion

125

auf die Hemmung des indirekten Pfades des nigrostriatalen Systems zurückgeführt; durch

eine Inhibition des STN wird indirekt die SNr gehemmt. Die SNr erhält ihren exzitatorischen,

glutamatergen Input aus dem STN (ROBLEDO u. FEGER 1990; SLAGHT et al. 2002;

SHEN u. JOHNSON 2006; GALE et al. 2008) und eine bilaterale Hemmung des STN führt

zu einer reduzierten Aktivität der SNr (ROBLEDO u. FEGER 1990; FEGER u. ROBLEDO

1991). Unsere Beobachtung, dass eine Inhibition des STN wirksamer ist als eine direkte

Inhibition der SNr lässt weitere Wirkmechanismen annehmen:

1. Wir vermuten die Beteiligung anderer, zum STN efferent liegender, Hirnregionen.

Tatsächlich konnte in elektrophysiologischen Untersuchungen gezeigt werden, dass eine

Hemmung des STN Änderungen der elektrischen Entladungen während eines

epileptischen Anfalls im frontalen Kortex verursacht, die nicht über die SNr verschaltet

sind (USUI et al. 2005). Zusätzlich ist bekannt, dass der STN auch glutamaterge

Projektionen an den entopedunkulären Nukleus sendet (ROBLEDO u. FEGER 1990;

NAKANISHI et al. 1991). DYBDAL und GALE (2000) belegten dies durch die

Feststellung, dass eine einseitige Inhibition des entopedunkulären Nukleus, genau wie

die unilaterale Hemmung des STN, eine asymmetrische Haltung mit Drehung zur

kontralateralen Seite bei Versuchstieren hervorruft.

2. Im Vergleich zur SNr handelt es sich beim STN um ein sehr kleines Kerngebiet mit

dicht gepackten Neuronen. Das Volumen des STN der Ratte beträgt lediglich 0,8 mm3

mit 22,7x10³ Neuronen, während die gesamte Substantia nigra (inklusive der Pars

compacta) etwa 7 mal so groß ist und nur etwa 47,2x10³ Neurone in der Pars reticulata

aufweist (HARDMAN et al. 2002, s. Abb. 24, Abb. 26 und Abb. 28). Beide

Subregionen der SNr sind somit jeweils deutlich größer, haben aber eine geringere

Neuronendichte als der STN. Für den STN und die anteriore respektive posteriore SNr

wurden jedoch die gleichen Infusionsmengen an Vigabatrin verwendet. Wir vermuten

einen Unterschied in der Wirksamkeit darin, dass die Neurone des STN größtenteils von

Vigabatrin erreicht wurden, während dies eventuell in der anterioren bzw. posterioren

SNr nicht der Fall war. Zudem liegt Vigabatrin im Gehirn aufgrund des pH-Wertes

ionisiert vor, was die Diffusion durch das Gewebe erschwert (HAMMOND u. WILDER

1985).

Diskussion

126

Die geringe Größe des STN wäre also insofern ein Vorteil, als dass geringere Dosen und Vo-

lumina an Wirkstoff nötig wären, um antikonvulsive Effekte zu erzielen. Zudem ist der neu-

rochirurgische Zugang zum STN klinisch etabliert und wird bereits erfolgreich als Zielregion

für Hochfrequenzstimulationen bei Epilepsie und anderen das Zentralnervensystem betreffen-

den Krankheiten verwendet (BENABID et al. 2000a; BENABID et al. 2000b; CHABARDES

et al. 2002; KAHANE u. DEPAULIS 2010; AL-OTAIBI et al. 2011; LEHMAN u.

AUGUSTINE 2012; VONCK et al. 2012). Die hochfrequente Stimulation führt zu einer

signifikanten Reduktion der Anfallsfrequenz, allerdings erreichen die Patienten keine Anfalls-

freiheit (LÖSCHER 2009b). Es bleibt zu klären, ob eine pharmakologische Inhibition des

STN der elektrischen Inhibition überlegen sein könnte.

Für eine klinische Translation wäre eine kontinuierliche Vigabatrin-Applikation nötig, hier

bleibt zu evaluieren, ob es nach fokaler Applikation zu Toleranzentwicklung kommen kann,

denn nach systemischer Gabe wurde dieses Phänomen tierexperimentell beobachtet

(LÖSCHER et al. 1987). Zudem wurde durch Läsion des STN eine subsequente Hochregula-

tion von NMDA-Rezeptoren in der SNr beobachtet, die wiederum zu einer erhöhten

Empfindlichkeit gegenüber exzitatorischen Impulsen führen könnte und die durch den STN

vermittelte Hemmung aufhebt (PRICE et al. 1993). Außerdem könnten nach Manipulationen

des Netzwerkes Veränderungen auftreten, da der STN über reziproke Verbindungen mit der

SNr verbunden ist (GRAYBIEL 1999). Wie bei HANDRECK et al. (2012) diskutiert, könn-

ten eine Hemmung des STN und die folgende indirekte Hemmung der SNr in einer verzöger-

ten Enthemmung des STN resultieren.

6.1.2. Zeitverlauf der antikonvulsiven Wirkung

Wir beobachteten nach fokaler Vigabatrin-Injektion einen späteren Wirkeintritt im PTZ-Mo-

dell als nach systemischer Administration. Eventuell wird die Substanz nach systemischer

Gabe im zentralen Nervensystem schneller verteilt als nach fokaler Applikation, wo sie von

Diffusionsvorgängen abhängig ist. So konnte das systemisch verabreichte Vigabatrin auch auf

andere anfallsmodulierende Hirnregionen wirken als lediglich auf die Zielstruktur selbst. Die

Verteilung von Vigabatrin im Gehirn erfolgt nicht gleichmäßig (TONG et al. 2009): Viga-

batrin konnte bereits 15 Minuten nach intraperitonealer Applikation in der Extrazellular-

flüssigkeit des frontalen Kortex und Hippokampus nachgewiesen werden. Im Kortex wurden

doppelt so hohe Konzentrationen wie im Hippokampus erreicht. Außerdem resultiert die

Diskussion

127

Hemmung des Abbaus von GABA nicht in einem gleichmäßigen Anstieg des synaptosomalen

GABA über verschiedene Hirnregionen (LÖSCHER et al. 1989b). Eine Messung 4 und 48

Stunden nach intraperitonealer Vigabatrin-Injektion (1200 mg/kg) ergab, dass beispielsweise

im Hippokampus schon 4 h nach Behandlung ein Maximum an GABA in Nervenendigungen

vorlag, während dies etwa im Thalamus erst nach 48 h geschah. Dies ist wahrscheinlich auf

die ungleichmäßige Verteilung des physiologischen GABA-Levels und der GABA-Trans-

aminase über die Hirnregionen zurückzuführen (LÖSCHER et al. 1989b). Zudem war in der

vorliegenden Arbeit die systemische Dosierung wesentlich höher als die fokale, so dass trotz

eines ungünstigen Hirn/Plasma-Verhältnisses von 0,025 (SILLS et al. 2003) eine höhere

Vigabatrin-Konzentration das ZNS erreicht haben könnte. Ungeachtet dessen wurde durch die

spezifische Manipulation des STN ein stärkerer bzw. vergleichbarer antikonvulsiver Effekt

erzielt, was rückschließen lässt, dass das Vigabatrin erst nach Diffusion durch die Zielstruktur

seine volle antikonvulsive Potenz entfaltete. Durch den hohen Ionisierungsgrad diffundiert

Vigabatrin nur langsam durch das Gewebe, zudem konkurriert es mit endogenem GABA um

die Bindungsstelle an der GABA-Transaminase (HAMMOND u. WILDER 1985). Diese

These wird gestützt durch Arbeiten der Gruppe von Karen Gale, in denen ein höheres Injek-

tionsvolumen (1 µl) verwendet wurde, das zu einem schnelleren Wirkeintritt führte (CASU u.

GALE 1981; IADAROLA u. GALE 1982). Nach intranigraler Mikroinjektion wurde auch im

Kindling-Modell ein später Wirkeintritt berichtet (LE GAL LA SALLE et al. 1983a;

MCNAMARA et al. 1984; LÖSCHER et al. 1987).

Neben diesen Erklärungsansätzen könnte der Zeitverlauf der antikonvulsiven Wirkung außer-

dem einerseits von der Wirkung über andere, anatomisch nahe gelegene Hirnregionen oder

vom gewählten Anfallsmodell abhängig sein.

6.1.3. Spezifität der beobachteten Effekte auf die untersuchten Hirn-

regionen

Ein zur systemischen Injektion vergleichsweise später Wirkeintritt nach fokaler Injektion in

den STN könnte kausal auf die Interaktion von Vigabatrin mit verschiedensten Hirnregionen

zurückgeführt werden. In bisherige Studien zur fokalen Applikation von Vigabatrin und deren

Effekte auf die GABA-Konzentration wurde der STN nicht einbezogen, so dass nicht auszu-

schließen ist, dass die Erhöhung des synaptosomalen GABA im STN 24 Stunden nach Injek-

tion von Vigabatrin höher ist als in den anderen untersuchten Regionen (LÖSCHER et al.

Diskussion

128

1989b; TONG et al. 2009). Obwohl in dieser Arbeit keine GABA-Gehalte in freien Nerven-

endigungen gemessen wurden, könnte die starke antikonvulsive Wirkung nach intrasubthala-

mischer Mikroinjektion auf einen Anstieg von GABA im STN zurückzuführen sein.

Wie angesprochen, könnte die verzögerte Wirkung nach fokaler Vigabatrin-Injektion durch

die langsame Diffusion der Substanz durch die Zielregion begründet sein. IADAROLA und

GALE (1981; 1982) zeigten, dass innerhalb von 6 Stunden nach fokaler Vigabatrin-Injektion

die maximale GABA-Konzentration in einem Radius von 1,5 mm im Hirngewebe um den

Injektionslocus messbar war, 24 Stunden post injectionem war es ein Radius von 3 mm. Wer-

den diese Ergebnisse in Betracht gezogen, könnten die starken antikonvulsiven Effekte, die

erst 24 Stunden nach intrasubthalamischer Mikroinjektion eintraten, auch auf eine Wirkung

von Vigabatrin in anderen, anatomisch nahe gelegenen Hirnregionen zurückzuführen sein.

Der Injektionsort wäre in diesem Fall nicht gleichzustellen mit dem Wirkort von Vigabatrin.

Möglicherweise lässt sich die Wirkung nach Injektion in den STN durch eine Diffusion oder

durch eine nachfolgende Erhöhung von GABA in der SNr erklären: Die GABAergen Projek-

tionsneurone, welche die SNr vom Striatum erreichen, verlaufen tatsächlich entlang des STN

(HAMANI et al. 2004). So könnte eine Erhöhung von GABA in der Nähe dieser GABAergen

Projektionen zu einer direkten Aktivierung membranaler Kanäle dieser Axone führen, die

wiederum die Ausschüttung von GABA innerhalb der SNr und damit eine postsynaptische

Inhibition bedingen könnte (vgl. BÄHNER et al. 2011). Dennoch ist eine Wirkung über die

SNr unwahrscheinlich, da der beobachtete Effekt nach Injektion in den STN stärker war als

nach Injektion in die SNr. Um die Spezifität des Effektes weiter zu testen, analysierten wir

zusätzlich Injektionen, die nur einseitig korrekt im STN platziert waren und kontralateral in

eine direkt dorsal oder ventral gelegene Hirnregion platziert wurden. Es wurden auch

Injektionen in die Auswertung miteinbezogen, die beidseits außerhalb des STN lagen. Für den

ersten Endpunkt der PTZ-Infusion, den Myoklonus, waren folgende Injektionen zur Erhöhung

der Anfallsschwelle am effektivsten:

bilateral in den STN

einseitig: STN, kontralateral: SNr

einseitig STN, kontralateral <0,5 mm dorsal des STN.

Diskussion

129

Einzig eine Injektion, die einseitig im STN und auf der anderen Seite in der SNr platziert war,

vermochte hingegen die deutliche Wirkung auf die Schwelle zur Auslösung eines Klonus ei-

ner bilateralen Mikroinjektion in den STN reproduzieren. Einseitig dorsal gelegene In-

jektionen waren wirksamer als ventrale, was den Schluss legitimiert, dass eine Diffusion in

den STN der dorsal gelegenen Injektionsareale für den Effekt verantwortlich sein könnte. Zu

einem großen Teil lagen dorsal des STN platzierte Injektionen in der Zona incerta. Die Zona

incerta bildet Verbindungen zu Strukturen der Basalganglien aus, vor allem zur SNr und dem

Pedunkulopontinen Nukleus (MITROFANIS 2005). Ein großer Teil dieser Verbindungen ist

glutamaterg, so dass die Zona incerta ähnlich dem STN einen exzitatorischen Eingang in die

SNr hat (HEISE u. MITROFANIS 2004). Eine Hemmung der Zona incerta könnte demzu-

folge auch zu antikonvulsiven Effekten geführt haben, dennoch ist der Effekt nach bilateraler

Mikroinjektion in den STN deutlicher, so dass davon auszugehen ist, dass die antikonvulsive

Wirkung hauptsächlich über eine Inhibition des STN erzielt wurde. Bilateral dorsal außerhalb

des STN platzierte Injektionen waren weniger effektiv als einseitige, wiederum ein Beleg für

die Spezifität des antikonvulsiven Effektes nach intrasubthalamischer Injektion. Ähnliche

Ergebnisse erzielten auch DYBDAL und GALE (2000) für Muscimol-Injektionen in den STN

im Bicucullin-Modell.

Zusätzlich wurde in einer Gruppe von Tieren Vigabatrin bilateral in das zentrale, rostral des

Globus pallidus gelegene, Striatum injiziert, ebenfalls eine Region, in der nach Mikroinjek-

tion antikonvulsive Effekte im Kindling-Modell beobachtet wurden, die allerdings weniger

ausgeprägt waren als nach intranigraler Injektion (LE GAL LA SALLE et al. 1983b). Gegen

eine Induktion generalisierter Anfälle mit Pilokarpin zeigte die prophylaktische, intrastriatale

Injektion von Vigabatrin jedoch keinen protektiven Effekt (TURSKI et al. 1986). Ähnlich der

ambivalenten Ergebnisse zur Eignung der Subregionen der SNr sind hier sicherlich Dosie-

rungs-, Modell- und Tiervariationen, sowie die genaue Lokalisation innerhalb des Striatums

für den unterschiedlichen Ausgang der Studien verantwortlich. Anzumerken ist, dass keine

der uni- oder bilateral außerhalb des STN gelegenen Injektionen zu einem schnelleren Eintritt

des maximalen Effektes führte als eine bilaterale Mikroinjektion. Insgesamt war eine bilate-

rale Injektion in den STN allen anderen Applikationsrouten in ihrer antikonvulsiven Wirkung

überlegen, was einen Beweis für die Spezifität des Effektes darstellt.

Diskussion

130

6.1.4. Gewähltes Anfallsmodell

Im PTZ-Test wurden bereits früher für systemische und fokale Vigabatrin-Administration

antikonvulsive Effekte gezeigt: LÖSCHER (1982) berichtete einen signifikanten Schwellen-

anstieg nach 490 mg/kg Vigabatrin (i.p.) im PTZ-Anfallsschwellentest bei Mäusen. Auch bei

subkutaner Bolusdeposition von PTZ konnte LÖSCHER (1980) sechs Stunden nach Viga-

batrin-Administration (ED50 = 940 mg/kg) Anfälle bei 50 % der Mäuse verhindern. Ähnliche

Ergebnisse wurden auch in anderen Arbeitsgruppen erzielt - eine Untersuchung ergab bei-

spielsweise, dass die ED50 für Vigabatrin 4 Stunden nach intraperitonealer Applikation bei

Mäusen bei 622,4 mg/kg lag (LUSZCZKI et al. 2008). Bei Ratten induzierte eine prophylakti-

sche, systemische Administration von 1000-1500 mg/kg Vigabatrin zu verschiedenen Zeit-

punkten vor wiederholten, intraperitonealen PTZ-Injektionen bzw. einer Bolusinjektion ana-

log einen antikonvulsiven Trend bzw. antikonvulsive Effekte (MYSLOBODSKY et al. 1979;

SAYIN et al. 1993). Ebenso wirkte die intraperitoneale Injektion von hohen Dosen Vigabatrin

(1200 mg/kg) 24 Stunden vor subkutaner PTZ-Injektion antikonvulsiv bei adulten und juve-

nilen Ratten. Dagegen konnten HOLLAND et al. (1992) keinen antikonvulsiven Effekt von

Vigabatrin auf PTZ-induzierte Anfälle demonstrieren.

Ähnlich diskrepante Daten wurden auch nach fokaler Injektion von Vigabatrin in die Sub-

stantia nigra pars reticulata generiert: Die ersten Studien stammen von IADAROLA und

GALE (1982), die einen antikonvulsiven Effekt auf intravenös verabreichtes PTZ berichteten

und diesen auf eine Erhöhung von GABA in der SNr zurückführten. Wenig später wurde je-

doch in einer anderen Arbeitsgruppe aus den USA berichtet, dass intranigrale Injektionen von

Vigabatrin nicht gegen PTZ-induzierte Anfälle wirkten (MILLER et al. 1987). Zusammen-

fassend gibt es keine Studie, in der die systemische Administration von Vigabatrin mit einer

fokalen Applikation im PTZ-Modell miteinander verglichen wurde. Dies ist ein entscheiden-

der Ansatz für Kritik gegenüber einem Großteil der genannten Arbeiten, denn für das Treffen

einer Aussage über die Effektivität der fokalen Manipulation ist der Vergleich mit systemi-

schen therapeutischen Manipulationen unabdingbar. Als „proof-of-principle“ für die höhere

Effektivität einer fokalen Therapie mit Phenytoin im Vergleich zur systemischen Administra-

tion gilt eine Studie von KELSO et al. (2005): Systemische Phenytoin-Administration hatte

keinen Einfluss auf fokal durch Tetanustoxin induzierte Anfälle, während eine intrazerebrale

Applikation von Phenytoin zu einer reversiblen Anfallsreduktion führte und im Gegensatz zur

Diskussion

131

systemischen Therapie keine Nebenwirkungen hervorrief. Die einzige Arbeit, die systemische

und lokale Wirkungen von Vigabatrin gegenüberstellte, ist eine Studie von SMOLDERS et al.

(1997). Hier wurde zur Anfallsauslösung Pilokarpin intrahippokampal infundiert. Die syste-

mische Vigabatrin-Injektion war effektiver in der Anfallsunterdrückung als eine fokale Injek-

tion in die SNr oder in den Hippokampus (keine genaue Region genannt, die Koordinaten

waren nach dem Atlas von Paxinos und Watson: AP – 5,6; L 4,6; DV -4,6). In unseren

Untersuchungen im PTZ-Anfallsschwellentest zeigte sich eine fokale Injektion in die SNr

nicht effektiver als eine systemische Vigabatrin-Administration. Des Weiteren sind unsere

Daten mit Resultaten aus früheren Kindling-Studien unserer Arbeitsgruppe konsistent

insofern, dass eine bilaterale Mikroinjektion von Vigabatrin (10 µg) in die SNr die

Anfallsschwere und -dauer 24 bis 48 Stunden senkt (LÖSCHER et al. 1987). Zudem führten

in einer Studie von NOLTE et al. (2006) Injektionen von Vigabatrin in die aSNr ebenfalls zu

einer Erhöhung der Nachentladungsschwelle in gekindelten Ratten. Des Weiteren konnten wir

und andere Gruppen zeigen, dass die Transplantation einer striatalen GABAergen Zelllinie in

Basalganglienregionen sowohl im Kindling-, Kainat- als auch im PTZ-Modell zu antikonvul-

siven Effekten führt (NOLTE et al. 2008; CASTILLO et al. 2008; HANDRECK et al. 2012).

Die Übereinstimmung dieser modellübergreifenden Ergebnisse lässt den Schluss zu, dass Er-

gebnisse zu einer Manipulation des GABAergen Systems mittels Vigabatrin aus dem PTZ-

Test sich auf weitere experimentelle Epilepsiemodelle und somit auch auf andere Anfalls-

typen übertragen lassen.

Ausblickend auf künftige Arbeiten wäre es nun sinnvoll, die gewonnenen Ergebnisse in ei-

nem Modell für Temporallappenepilepsie zu validieren. Daher haben wir bereits überprüft, ob

der PTZ-Test und Vigabatrin-Injektionen auch einige Wochen nach Status epileptikus durch-

führbar wären. In der Vergangenheit konnten wir bereits in einem anderen Rattenstamm zei-

gen, dass sich die Dosis an PTZ, die für die Auslösung eines generalisierten Krampfanfalls

nötig ist, ab einem bestimmten Zeitpunkt nach Status nicht verändert (RATTKA et al. 2011),

was in der vorliegenden Studie für die verwendeten Wistarratten bestätigt werden konnte.

Nach fokaler Verabreichung von Vigabatrin erreichten die Schwellenänderungen nicht das

statistische Signifikanzniveau, jedoch ist wahrscheinlich, dass dies an der geringen Gruppen-

größe (n=3) dieses preliminären Versuches lag. Die nächsten Schritte werden nun Untersu-

Diskussion

132

chungen in chronisch epileptischen Tieren mit einer kontinuierlichen Gabe von Vigabatrin

beinhalten.

6.1.5. Vor- und Nachteile fokaler gegenüber systemischer Therapie

Ein Hauptvorteil einer fokalen, gerichteten Therapie gegenüber der konventionellen, systemi-

schen Behandlung ist das reduzierte Potential für schwere Nebenwirkungen. Die Substanz-

wirkung erstreckt sich nicht auf den Gesamtorganismus, sondern nur auf Hirnregionen, die an

der Anfallsentstehung, -weiterleitung und -modulation beteiligt sind (FISHER u. HO 2002;

NILSEN u. COCK 2004; ROGAWSKI 2009; AL-OTAIBI et al. 2011; BRÖER et al. 2012).

Antiepileptika wie Vigabatrin müssen systemisch in relativ hohen Dosierungen verabreicht

werden, um in ausreichender Menge die Bluthirnschranke zu überwinden und somit wirksame

Konzentrationen im Gehirn zu erreichen (PAULSON et al. 1982; SILLS et al. 2003). Fokal ist

durch das Umgehen der Bluthirnschranke eine wesentlich geringere Dosis an Vigabatrin nö-

tig, um die gewünschten Effekte zu erzielen, so dass wiederum die Gefahr für das Auftreten

von unerwünschten Nebenwirkungen gesenkt wird. In dieser Arbeit konnte im direkten Ver-

gleich belegt werden, dass die systemische Administration von Vigabatrin zu Sedation führt

und signifikante Gewichts- und Temperaturverluste verursacht, während diese Nebenwirkun-

gen nach fokaler Therapie, die eine vergleichbare bzw. sogar bessere Wirksamkeit aufwies,

nicht auftraten bzw. moderater verliefen. Im Dosisvergleich unserer Studie und dem Abgleich

mit Literaturdaten wird deutlich, dass für einen vergleichbaren antikonvulsiven Effekt sys-

temisch ein Vielfaches der fokalen Dosis verabreicht wurde (JUNG et al. 1977; GALE u.

IADAROLA 1980; LÖSCHER 1980): Bei einer Dosierung von 1200 mg/kg erhielt in dieser

Arbeit eine durchschnittlich 250 g schwere Ratte 300 mg Vigabatrin systemisch, aber bei fo-

kaler Applikation nur je 10 µg Vigabatrin pro Hirnhemisphäre. Eine Erklärung für die hohe

systemische Dosis im Vergleich zur fokalen Dosis ist das schlechte Hirn/Plasma-Verhältnis

von Vigabatrin, das bei etwa 0,025 liegt (SILLS et al. 2003). Somit erreichen nur 2,5 % der

Plasmakonzentration das Gehirn, da Vigabatrin bei physiologischen pH-Werten vornehmlich

ionisiert vorliegt und nicht über passive Diffusion die Bluthirnschranke passieren kann

(HAMMOND u. WILDER 1985).

Zudem besagt eine der Hypothesen zur Entstehung von Pharmakoresistenz, dass das Nichtan-

sprechen auf Antiepileptika auf eine Überexprimierung von Efflux-Transportern an der Blut-

Diskussion

133

hirnschranke zurückzuführen sein könnte (LÖSCHER u. POTSCHKA 2005). Durch die intra-

zerebrale Substanzapplikation werden diese Multi-Drug-Transporter umgangen.

Die schnelle Diffusion der Antiepileptika durch das Gewebe führt jedoch zu einer schnellen

Aufnahme in die Zerebrospinalflüssigkeit. Über den sogenannten „bulk flow“ gelangen

Substanzen an den arachnoidalen Villi aus der Zerebrospinalflüssigkeit in das periphere Blut

(PARDRIDGE 2011). Für die Verwendung von Antiepileptika wäre daher eine chronische

Applikation unverzichtbar. Selbst eine potentiell längerfristig wirkende, fokale Therapie mit

Neurotoxinen, die kaum Diffusion zeigen, müsste intermittierend wiederholt werden.

Hier liegt der Nachteil der fokalen Therapie, denn die dauerhafte Implantation eines Katheters

in die Zielregion ist im Vergleich zur systemischen Therapie ein invasiver operativer Eingriff.

Aus diesem Grund kann die fokale Therapie nur für Patienten eine Option darstellen, für die

aufgrund von Pharmakoresistenz nur noch die resektive Chirurgie als mögliche Alternative

zur Wahl steht. Konträr zur partiellen Resektion von Hirngewebe ist jedoch die fokale,

pharmakologische Therapie reversibel und kann bei Nichtansprechen des Patienten oder

unerwünschten Nebenwirkungen modifiziert bzw. beendet werden.

Diskussion

134

6.2. Studie Ib: Fokale Substanzapplikation von Botulinumtoxin B

In der vorliegenden Arbeit traten entgegen der Hypothese keine antikonvulsiven Effekte nach

intrahippokampaler Injektion von Botulinumtoxin B auf. In den ersten Tagen nach CED gab

es keine Schwellenänderungen, 7 Tage nach Behandlung kam es erstmals zu prokonvulsiven

Effekten. Zudem wurden spontane Anfälle und Verhaltensänderungen beobachtet. Für diese

Wirkungen gibt es verschiedene Erklärungsansätze, die sich auf das Tiermodell, die gewählte

Substanz und Dosierung sowie, am wahrscheinlichsten, auf den Injektionsort beziehen.

6.2.1. Gewählte Zielregion

Konträr zu dem Ergebnis der vorliegenden Studie wurden in anderen Anfalls- oder Epilep-

siemodellen antikonvulsive Effekte nach intrazerebraler BTX-Infusion verschiedener

Toxovare beobachtet. Wie bereits erwähnt, zeigten unveröffentlichte Daten der AG Rogawski

einen antikonvulsiven Effekt nach BTX B-Infusion im Amygdala-Kindling-Modell. Die

wahrscheinlichste Erklärung für die diskrepanten Ergebnisse ist die Wahl der Zielregion für

die fokale Behandlung mit BTX B. In der Kindling-Studie von Rogawski und Kollegen wurde

BTX B fokusnah in die basolaterale Amygdala infundiert. Die extrinsischen Projektionen des

basolateralen Kerns der Amygdala, die vor allem in temporale und extra-temporale

Hirnregionen verlaufen, sind hauptsächlich glutamaterg (ARONIADOU-ANDERJASKA et

al. 2007). Eine Erregung dieser Neurone spielt bei der Entstehung von epileptischer

Anfallsaktivität eine große Rolle; die genauen Mechanismen sind noch nicht genau aufgeklärt

(ROGAWSKI et al. 2003; ARONIADOU-ANDERJASKA et al. 2007).

Im Vergleich ist der Hippokampus eine sehr heterogene Hirnregion, in der sowohl

inhibitorische als auch exzitatorische Neurone vorliegen. Anfallsaktivität kann durch die

glutamatergen Neurone amplifiziert werden (RIBAK et al. 1985; MCINTYRE und

SCHWARTZKROIN 2008). Die intrahippokampale Injektion prokonvulsiver Substanzen wie

Kainat oder Pilokarpin ist seit Jahren eine etablierte Methode, um fokale Anfälle auszulösen

und chronisch epileptische Tiere für die experimentelle Forschung zu generieren (s. Abschnitt

2.1.3). Nach Auslösen eines Status epileptikus (primärer Hirninsult) führen diese fokalen

Epilepsiemodelle nach einer gewissen Latenzzeit zu spontan auftretenden Anfällen und

neurodegenerativen Veränderungen in der Zielstruktur. Eine Substanz, die ebenfalls seit

Jahrzehnten in Tiermodellen für Epilepsie genutzt wird, ist das Tetanustoxin. Hippokampale

Diskussion

135

Injektion von Tetanustoxin verursacht ein transientes epileptiformes Syndrom mit spontanen

Anfällen, Hyperkinesie und intermittierendem aggressivem Verhalten in Ratten

(MELLANBY et al. 1977). In der ersten Studie zur Generierung epileptischer Anfälle durch

Tetanustoxin zeigten MELLANBY et al. (1977), dass dosisabhängig innerhalb von 2 Wochen

post injektionem spontane Anfälle auftraten. Eine Erklärung für das Auftreten prokonvulsiver

Effekte könnte demnach das Auslösen eines Insults im Hippokampus durch die Applikation

von Botulinumtoxin B darstellen, der subsequent zur Entwicklung eines epileptischen Fokus

führte. Es lässt sich kontrovers diskutieren, ob es sich bei den Anfällen nach Tetanustoxin und

ebenso bei den von uns beobachteten Anfällen nach Botulinumtoxin B tatsächlich um

spontane oder vielmehr um insult-assoziierte Anfälle handelt, da kaum eine Latenzperiode bis

zum Auftreten der Anfälle stattfindet (SLOVITER 2008).

Tetanustoxin ist wie Botulinumtoxin ein von Clostridien produziertes Toxin und wirkt über

eine präsynaptische Hemmung vor allem inhibitorischer Neurone; das spezifische Substrat ist

ebenfalls Synaptobrevin (BERGEY et al. 1987; CALEO u. SCHIAVO 2009). Sollte demzu-

folge das Botulinumtoxin B tatsächlich vermehrt auf GABAerge Neurone wirken (s. Ab-

schnitt 6.2.5), könnte die CED von Botulinumtoxin B mit der hippokampalen Tetanustoxin-

Injektion verglichen werden. Dafür spräche, dass ähnliche Verhaltens-änderungen auftraten

(s. Abschnitt 5.4.3). In der vorliegenden Arbeit wurden die Tiere direkt nach Abschluss der

Experimente (etwa 3 Wochen nach CED) getötet, so dass keine Aussage über die Dauer des

epileptischen Syndroms getroffen werden kann.

Eine weitere Möglichkeit, die zur Entstehung eines Fokus bzw. plastischer Netzwerkverände-

rungen geführt haben könnte, ist das Einbringen von Serumalbumin in das Gehirn durch die

Trägersubstanz. Es wurde belegt, dass pathologische Störungen der Bluthirnschranke zu einer

Extravasation von Albumin in das Gehirn führen und die Bildung eines epileptischen Fokus

innerhalb von 4-7 Tagen bedingen können (SEIFFERT et al. 2004; FRIEDMAN et al. 2009).

Auch die direkte, kortikale Applikation von 0,1 mM, 0,2 mM und 0,4 mM (analog 25-100 %

normaler Serumlevel) Albumin führte zu paroxysmaler Aktivität an Slice-Kulturen aus Rat-

ten-Gehirnen (SEIFFERT et al. 2004). Kürzlich wurde gezeigt, dass Albumin von Astrozyten

aufgenommen wird und rapide zu Veränderungen an Ionenkanälen und Transmittern führt,

die wiederum Hyperaktivität und eine beginnende Epileptogenese bedingen können

(BRAGANZA et al. 2012). In der Studie von SEIFFERT et al. (2004) gab es nach Applika-

Diskussion

136

tion von 10 % des Serumspiegels an Albumin keine Unterschiede zu Sham-operierten Tieren.

In der vorliegenden Arbeit lag die Konzentration an Albumin bei 0,05 %, das entspricht

0,0077 mM und damit deutlich unter der Konzentration von 0,1 mM, die nötig war, um epi-

leptische Aktivität auszulösen. Zudem entwickelten Kontrolltiere, denen lediglich Vehikel

ohne Toxin appliziert wurde, weder Verhaltensänderungen noch epileptische Anfälle (s. Abb.

40 und Tab. 4). Im PTZ-Test verursachte die Vehikel-Applikation hingegen sogar antikonvul-

sive Effekte (s. Abb. 37). Wir vermuten als Ursache einen Volumeneffekt, der auch einmalig

nach Injektionen von NaCl in die Basalganglienregionen auftrat (s. Abb. 25). Ebenfalls denk-

bar wäre eine Immunreaktion, die auf den Gebrauch von humanem Serumalbumin zurückzu-

führen sein könnte und die zu verminderter Erregbarkeit führte. Da auch in der Toxinlösung

gleiche Mengen an Vehikel vorhanden waren, ist der prokonvulsive Effekt von

Botulinumtoxin B möglicherweise sogar durch das Vehikel maskiert. Besonders hervorzuhe-

ben ist dieser gegenteilige Effekt an Tag 7 nach Injektion, an dem die reine CED von Vehikel

antikonvulsiv wirkte, die CED von Botulinumtoxin B dagegen prokonvulsiv (s. Abb. 37).

6.2.2. Gewähltes Anfallsmodell

Während für eine Reihe von Substanzen, die über das GABAerge System wirken, ein anti-

konvulsiver Effekt im PTZ-Test beschrieben ist (s. Abschnitt 4.2), gibt es in der Literatur Be-

lege dafür, dass Antiepileptika mit anderen Wirkmechanismen gar nicht oder sogar prokon-

vulsiv wirken. Beispiele sind Phenytoin und Carbamazepin (LÖSCHER et al. 1991;

MECARELLI et al. 1997). Diese Substanzen agierten hingegen in anderen Modellen protek-

tiv gegen Anfälle und wurden daher klinisch getestet und zugelassen. Ein prokonvulsives

Potential im PTZ-Test allein reicht daher nicht aus, um eine Vorhersage zu der klinischen

Wirkung der Substanz am Patienten treffen zu können (BANKSTAHL et al. 2012). In der

vorliegenden Studie kann durch das Auftreten insult-assoziierter und spontaner Anfälle, sowie

der beschriebenen Verhaltensänderungen, davon ausgegangen werden, dass die im PTZ-Mo-

dell beobachtete Anfallsschwellensenkung prädiktiv für die prokonvulsiven Effekte einer

intrahippokampalen Applikation von Botulinumtoxin B waren.

6.2.3. Gewählte Dosierung und Infusion

Möglicherweise wurde die Botulinumtoxin B-Dosis von uns zu hoch gewählt, so dass es zu

toxischen Effekten kam, die subsequent durch unbekannte Mechanismen zu einer erhöhten

Diskussion

137

Anfälligkeit gegenüber PTZ führten. Auch von Antiepileptika ist bekannt, dass eine extreme

Überdosierung prokonvulsive Effekte haben kann, zum Beispiel für Carbamazepin

(MECARELLI et al. 1997). Laut einer Studie aus der AG Rogaswki (Zolkowska, Ancona,

Rogawski; unveröffentlichte Daten) kam es in der Vergangenheit nach der intrazerebroventri-

kulären Applikation sehr hoher, außerhalb der therapeutischen Breite liegender Dosen Botu-

linumtoxin B zum Auftreten spontaner Anfälle bei Ratten desselben Stammes und Ge-

schlechts. Ein unerwünschtes Entweichen von Substanz nach CED in die Zerebrospinal-

flüssigkeit ist beschrieben (VARENIKA et al. 2008) und stellt gerade für die Verwendung

systemisch toxischer Substanzen ein Risiko dar. In der AG Rogawski wurde daher in einer

Toxizitätsstudie ermittelt, welche Dosierung an Botulinumtoxin B zu Verhaltensänderungen

oder anderen Auffälligkeiten führte. Zu diesem Zweck wurden wiederholt steigende Dosen

infundiert, bis es zu Verhaltensänderungen oder spontanen Anfällen kam. Für die Auslösung

dieser Nebenwirkungen waren immer wiederholte Injektionen von Botulinumtoxin B nötig,

unter einer Dosis von 2500 Units kam es nicht zu den beschriebenen Auffälligkeiten. In der

vorliegenden Arbeit wurde eine 2,5-fach geringere Dosis (1000 Units) verwendet und nur

einmalig appliziert. Auch nach einer Dosierung von 500 Units Botulinumtoxin B traten die

prokonvulsiven Effekte im PTZ-Test beginnend nach etwa einer Woche auf (s. Abb. 38). Die

Wahl der Dosis beruhte zudem nicht nur auf der genannten Toxizitätsstudie, sondern auch auf

der Amygdala-Kindling-Studie aus der AG Rogawski (unveröffentlichte Daten), in der umge-

rechnet eine CED von 896 Units in die basolaterale Amygdala effektiv war, um die Anfalls-

dauer, -schwere und –schwelle signifikant zu senken. Die beobachteten prokonvulsiven

Effekte sind daher vermutlich nicht auf die verwendete Dosis zurückzuführen.

6.2.4. Convection-enhanced delivery

Die CED wird nicht nur bereits in der Onkologie als neue therapeutische Strategie genutzt,

um eine homogene Diffusion einer Substanz in ausgewählten Hirnbereichen zu ermöglichen.

Auch zur Verwendung bei Epilepsie werden zurzeit Patienten für eine klinische Studie an den

Kliniken der „National Institutes of Health“ der USA (Bethesda, Maryland) rekrutiert. Unter

der Leitung von Dr. John Heiss soll Muscimol in den Hippokampus pharmakoresistenter

Patienten infundiert werden

(http://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT00005925?term=muscimol+epilepsy&rank=1).

Er demonstrierte bereits in nicht humanen Primaten, dass eine CED von Muscimol zu einer

Diskussion

138

Verteilung im hippokampalen Gewebe führt und in therapierelevanten Konzentrationen nicht

zu toxischen Effekten führt (HEISS et al. 2005). Außerdem gelang in einer späteren Arbeit

die Nachverfolgung der Verteilung des Therapeutikums mittels Tracer (HEISS et al. 2010).

Die Behandlung des epileptischen Fokus mittels Antiepileptika müsste in der Praxis

kontinuierlich oder zumindest häufig intermittierend durchgeführt werden, da die Wirkung

nur kurzzeitig anhält. Eine Infusion mit Toxinen könnte längerfristig wirken, was bereits von

ROGAWSKI (2009) im Kindling-Modell belegt werden konnte. Er erreichte einen über

mehrere Wochen anhaltenden antikonvulsiven Effekt nach CED von Botulinumtoxin A und B

in die basolaterale Amygdala.

6.2.5. Die gewählte Substanz

Eventuell liegt die Erklärung für das Auftreten prokonvulsiver Effekte in der Wahl der Sub-

stanz selbst. Für das Toxovar Botulinumtoxin E konnten COSTANTIN et al. (2005) nach

Injektion in den dorsalen Hippokampus (CA1 und CA3) im Kindling-Modell eine antikonvul-

sive Wirkung belegen. Unter in-vitro Bedingungen wurde gezeigt, dass Botulinumtoxin E

(und A) hauptsächlich die exzitatorische Neurotransmission hemmen (CAPOGNA et al.

1997; VERDERIO et al. 2004). Der Grund für die präferentielle Wirkung auf glutamaterge

Neurone liegt in der spezifischen Bindung von Botulinumtoxin E an SNAP-25, welches ver-

mehrt in exzitatorischen Neuronen vorkommt (VERDERIO et al. 2004). Da SNAP-25 kaum

von GABAergen Neuronen exprimiert wird, ist die Sekretion von GABA gegenüber einer

Hemmung durch Toxovar A und E relativ resistent (VERDERIO et al. 2007; GARBELLI et

al. 2008).

Wir haben uns aufgrund vielversprechender Untersuchungen aus der AG Rogawaski (s. Ab-

schnitt 6.2.3) für das Toxovar B entschieden. Ein Vorteil des Botulinumtoxin B gegenüber

Botulinumtoxin E liegt darin, dass Botulinumtoxin B bereits eine Zulassung als Arzneimittel

hat und eine eventuelle weitere Zulassung für die Indikation Epilepsie einfacher wäre, als eine

Neuzulassung für Botulinumtoxin E anzustreben. Der Bindungs- und Wirkmechanismus von

Botulinumtoxin B hingegen unterscheidet sich etwas von Botulinumtoxin E. Das Toxovar B

besteht aus einer schweren (100 kD) und einer leichten Kette (50 kD), die durch Disulfid-

brücken miteinander verbunden sind (DONG et al. 2007). Über den Kohlenstoff-Terminus

der schweren Kette wird die Bindung an Polysialoganglioside und Proteinrezeptoren und die

nachfolgende Endozytose vermittelt. Für die Bindung von Botulinumtoxin B ist hier ein

Diskussion

139

Doppelrezeptor aus Gangliosiden und Synaptotagmin I und II nötig (DONG et al. 2007). Die

leichte Kette wird von der inneren Membran ins Zytosol translokalisiert, dort fungiert sie als

Protease (Zink-Endopeptidase), die Vesikelproteine spaltet. Im Falle des Botulinumtoxin B

spaltet die leichte Kette Synaptobrevin (JIN et al. 2006). VERDERIO et al. (2004) zeigten in

einer in-vitro Studie, dass in GABAergen Neuronen das Recycling des Vesikelproteins

Synaptotagmin I durch Botulinumtoxin B, nicht aber durch Botulinumtoxin E (und A) ge-

hemmt wird. In Konsequenz könnte das von uns verwendete Botulinumtoxin B nicht nur wie

erwünscht die glutamatergen Neurone gehemmt haben, sondern auch die inhibitorisch wir-

kenden GABAergen Neurone. Gegen diese Annahme spricht jedoch, dass die prokonvulsive

Wirkung sich erst nach einer gewissen Latenz nach Injektion von Botulinumtoxin B ent-

wickelte. Unveröffentlichte Daten der AG Rogawski hingegen belegten bereits nach 3 Tagen

einen antikonvulsiven Effekt, so dass eine reine Substanzwirkung, wenn auch in diesem Fall

prokonvulsiv, früher als nach 7 Tagen zu erwarten gewesen wäre.

6.2.6. Verhaltensänderungen und epileptische Anfälle /

EEG-Veränderungen

Eine statistisch signifikante Verhaltensänderung im Pick-up Test trat erstmals 2 Wochen nach

Botulinumtoxin B-Behandlung auf. In chemischen Modellen für Temporallappenepilepsie

wird häufig von angstassoziiertem Verhalten und Hypo- oder Hyperlokomotionsstörungen der

chronisch epileptischen Tiere berichtet. Angststörungen treten auch beim Patienten auf

(KANNER 2011). Sollte demnach durch die CED von Botulinumtoxin B ein epileptischer

Fokus generiert worden sein, würde dies eventuell auch die aufgetretene Übererregbarkeit

erklären. In dieser Arbeit wurden keine weiterführenden Verhaltensversuche zu Lern- und

Gedächtnisstörungen oder angstassoziiertem Verhalten durchgeführt, die ebenfalls bei chro-

nisch epileptischen Tieren und in der klinischen Situation als Komorbidität des Menschen mit

Epilepsie auftreten (D'HOOGE u. DE DEYN 2001; GRÖTICKE et al. 2007; HOPPE et al.

2007; GRÖTICKE et al. 2008; RATTKA et al. 2011; KERNAN et al. 2012; TYLER et al.

2012). Allerdings wird Botulinumtoxin B in der experimentellen Demenz-Forschung genutzt,

um Synapsen-spezifische Läsionen im entorhinalen Kortex zu verursachen und auf diese

Weise im Tiermodell kognitive Dysfunktionen zu untersuchen (ANDO et al. 2002), so dass

Diskussion

140

wir vermuten, dass auch die Leistung unserer Botulinumtoxin B-Tiere in Lern- und Gedächt-

nistests beeinträchtigt sein könnte.

In chemischen Epilepsiemodellen ist während der Latenzzeit weiterhin das vermehrte Auf-

treten abnormer EEG-Aktivität in Form interiktaler Spikes beschrieben (STALEY u. DUDEK

2006; BORTEL et al. 2010; ISAEV et al. 2011). Eine Hypothese lautet, dass die interiktalen

Spikes zur Epileptogenese beitragen (STALEY et al. 2005). Bei den Botulinumtoxin B-Tieren

traten vermehrt epileptiforme Spikes und Slow waves auf, zudem wurden spontane Anfälle

im EEG detektiert. Um eine Aussage treffen zu können, ob diese Tiere nun dauerhaft chro-

nisch epileptisch geworden wären oder es sich lediglich um insult-assoziierte Veränderungen

handelte, sollten weitere Experimente durchgeführt werden. Neben der simultanen

Botulinumtoxin B-Injektion und EEG-Überwachung in den ersten Tagen nach Injektion, wäre

besonders das langfristige und wiederholte Aufzeichnen eines EEGs erforderlich. Da es sich

hier mehr um einen Zufallsbefund handelte und mein Aufenthalt an der UC Davis begrenzt

war, konnten solche Studien noch nicht zeitnah durchgeführt werden. Zudem wäre die histo-

logische Untersuchung der Gehirne der Tiere unabdingbar, um sowohl die Injektionslokalisa-

tion zu verifizieren als auch zu überprüfen, ob neurodegenerative Prozesse stattfanden, die für

chronische Epilepsiemodelle typisch sind. Mit der zukünftigen Durchführung solcher Arbei-

ten könnte eventuell mit der hippokampalen Injektion von Botulinumtoxin B ein neues Epi-

lepsiemodell etabliert werden. Die bislang etablierten Modelle haben bereits zu einem großen

Fortschritt der Epilepsieforschung beigetragen, dennoch gibt es einige Schwachstellen für die

Translation zur Temporallappenepilepsie des Menschen, so dass die Verbesserung bestehen-

der Modelle, sowie die Entwicklung und Validierung neuer Modelle, durchaus von einem

hohen Interesse für die experimentelle Epilepsieforschung ist (SLOVITER 2008).

Für den Einsatz von Botulinumtoxinen als antikonvulsive Substanzen könnten die Ergebnisse

meiner Studie bedeuten, dass die prokonvulsive Wirkung von Botulinumtoxin B möglicher-

weise modell- oder dosisabhängig war und in anderen Versuchsanordnungen eventuell ab-

weichende Ergebnisse erzielt werden könnten. Durch den Einsatz anderer Toxovare, prä-

ferentiell A und E, oder Änderungen an Botulinumtoxin B könnten eventuell auch im PTZ-

Modell antikonvulsive Effekte gemessen werden. Für Botulinumtoxin A konnte in der Ver-

gangenheit die chemische Struktur so verändert werden, dass die spezifische Bindung an ei-

nen Neuronentyp erfolgte (DUGGAN et al. 2002; CHADDOCK et al. 2004).

Diskussion

141

6.3. Studie IIa: Neurotransplantation GABAerger Vorläuferzellen

6.3.1. Transplantation von GABAergen Zelllinien in Basalganglienregionen

Anhand der Untersuchungen mit Vigabatrin konnten wir im PTZ-Test belegen, dass eine er-

höhte GABA-Konzentration in den beschriebenen Zielregionen deutliche, antikonvulsive

Effekte hervorruft (s. Abb. 35). Auch mit Transplantationen GABAerger Zelllinien ist dies

bereits anderen und unserer Gruppe gelungen (GERNERT et al. 2002; CASTILLO et al.

2008; NOLTE et al. 2008; HANDRECK et al. 2012). Der Vorteil in der Verwendung von

Zelllinien liegt einerseits in der Möglichkeit, diese genetisch so zu verändern, dass sie nur

einen Neuronentyp hervorbringen und, für unsere Zwecke, sogar größere Mengen an GABA

sezernieren als die Ursprungszelllinie.

Nach Transplantationen mit immortalisierten Zellen ließen sich transiente antikonvulsive

Effekte erzielen: In einer Arbeit von GERNERT et al. (2002) im Kindling-Modell konnte

erstmals gezeigt werden, dass GABAerge, gentechnisch veränderte, murine Zellen in be-

stimmten Hirnregionen (hier im zentralen piriformen Kortex) die Fähigkeit besaßen, die An-

fallsschwelle deutlich zu erhöhen. Auch in spontanen Anfallsmodellen konnte die antikonvul-

sive Wirkung der Zellen nach Transplantation in Basalganglien reproduziert werden

(THOMPSON u. SUCHOMELOVA 2004; CASTILLO et al. 2006). Die hier transplantierten

Mausneurone zeichneten sich vor allem durch einen sogenannten „Tet-on/Tet-off“-Mecha-

nismus aus; die GABA-Sekretion war durch die exogene Administration von Doxyzyklin

steuerbar. Ein antikonvulsiver Effekt ließ sich hier direkt auf die GABA-Freisetzung zurück-

führen, da Doxyzyklin-gehemmte Zellen keinen antikonvulsiven Effekt hervorriefen

(THOMPSON u. SUCHOMELOVA 2004). Neben der beschriebenen Xenotransplantation

(von Maus zu Ratte) wurden in der Arbeitsgruppe Löscher/Gernert in der Vergangenheit auch

Allotransplantationen (von Ratte zu Ratte) durchgeführt (NOLTE et al. 2008). Hierzu wurden

freundlicherweise immortalisierte, striatale Rattenneurone von William J. Freed (National

Institute of Neurological Disorders and Stroke, kurz NINDS, Baltimore, USA) zur Verfügung

gestellt: Die 2008 von NOLTE et al. durchgeführten Transplantationen der GABAergen Zell-

linie in die SNr führten zwar zu antikonvulsiven Effekten im Kindling-Modell, allerdings nur

mit einer transienten Wirkung. Kürzlich konnten wir mit einer Transplantation in den STN im

PTZ-Modell ebenfalls transient auftretende, antikonvulsive Effekte beobachten

Diskussion

142

(HANDRECK et al. 2012). Ein GABA-überexprimierender Klon der Mutterzelllinie (CL4),

der mithilfe eines episomalen Epstein-Barr Virus mit dem humanen GABA-produzierenden

Enzym Glutaminsäuredecarboxylase 67 (hGAD67) transfiziert wurde, war in der Lage, die

GABA-Konzentration bis zum 50-fachen gegenüber der Ursprungszelllinie steigen zu lassen

(GIORDANO et al. 1996; CONEJERO-GOLDBERG et al. 2000). Nach Transplantation die-

ses Klons wurden in verschiedenen Studien in unterschiedlichem Ausmaß Abstoßungs- und

Entzündungsreaktionen beobachtet (NOLTE et al. 2008; CASTILLO et al. 2010;

HANDRECK et al. 2012).

Ein weiterer Nachteil bei der Nutzung der zuvor beschriebenen, genetisch veränderten, GAD-

überexprimierenden Zelllinien besteht in der tonischen GABA-Freisetzung. Die hohe Kon-

zentration an GABA kann zu einer verminderten Rezeptorexpression an postsynaptischen

Zellen führen (KOKAIA et al. 1994; FENELON u. HERBISON 1996; LÖSCHER et al.

1998). Währenddessen ist die funktionelle Integration GABAerger Vorläuferzellen

wahrscheinlicher, in diesem Falle sezernieren sie GABA nach einem physiologischen Sekre-

tionsmuster, wie bei NOLTE et al. (2008) diskutiert. Dies wäre ein möglicher Erklärungs-

ansatz für die beobachtete Transiens der antikonvulsiven Effekte in den genannten Studien

zur Transplantation immortalisierter GABA-produzierender Zelllinien. Des Weiteren könnten

die Zellen bald nach Transplantation absterben oder aus bisher nicht geklärten Gründen die

GABA-Produktion einstellen. Dieses Problem könnte möglicherweise durch die Verwendung

von Vorläuferzellen gelöst werden. Des Weiteren ist eine Abstoßungsreaktion bei Verwen-

dung allogener Vorläuferzellen unwahrscheinlich.

6.3.2. Transplantation GABAerger Vorläuferzellen

Vorausgegangene Untersuchungen belegten, dass die Transplantation GABAerger, ganglio-

nischer Precursorzellen in den epileptischen Fokus in spontanen Anfallsmodellen zu antikon-

vulsiven Effekten führt (HATTIANGADY et al. 2008; WALDAU et al. 2010). Auch Trans-

plantationen von Vorläuferzellen aus der MGE in den Kortex in einem genetischen Maus-

modell für Epilepsie führten zu einer signifikanten Anfallsreduktion (BARABAN et al. 2009).

Die SNr wurde in einer Arbeit von LÖSCHER et al. (1998) ebenfalls erfolgreich als Ziel-

struktur für Transplantationen von fetalen Zellen verwendet. Die Transplantation von Zellen

Diskussion

143

aus der ganglionischen Eminenz führte im Kindling-Modell zu einem transienten, protektiven

Effekt.

In der vorliegenden Arbeit führte die bilaterale Transplantation GABAerger Vorläuferzellen

aus der Ratte in den STN oder die SNr nicht zu antikonvulsiven Effekten im PTZ-Modell

innerhalb des dreimonatigen Beobachtungszeitraumes. Hierfür gibt es zahlreiche mögliche

Gründe, die einerseits transplantat- und andererseits wirtsspezifisch sein können.

6.3.3. Wahl der Zielregion für die Transplantation

Ein möglicher Grund für das Ausbleiben eines antikonvulsiven Effektes in unserer Studie

könnte die Wahl der Zielregion für die Transplantation darstellen. In der Literatur ist be-

schrieben, dass exogene Zellen sich erfolgreicher in Gehirne integrieren, die pathologischen

Prozessen unterliegen (ZAMAN et al. 2001; ZAMAN u. SHETTY 2002). So lassen sich

eventuell die vielversprechenderen Resultate der AG Shetty erklären, die die Zellen in den

geschädigten Hippokampus transplantierten (HATTIANGADY et al. 2008). Es wird ange-

nommen, dass das geschädigte Gewebe trophische Faktoren freisetzt, die das Auswachsen

von Axonen und das Überleben transplantierter Zellen unterstützen oder sogar erst ermög-

lichen (NIETO-SAMPEDRO et al. 1982; GAGE u. BJÖRKLUND 1986).

Analog ließen sich auch nach Transplantationen fetaler striataler Zellen in die denervierte SNr

protektive Effekte auf akute Pilokarpin-induzierte Anfälle erzielen (FINE et al. 1990). Die

Läsion der GABAergen Eingangssignale der SNr aus dem kaudalen Putamen erfolgte mithilfe

einer Injektion von Ibotensäure. FINE et al. (1990) konnten in dieser Studie allerdings keinen

signifikanten Unterschied zwischen einer Transplantation GABAerger Vorläuferzellen und

einer als Kontrolle dienenden Transplantation von Zellen aus dem N. ischiadicus (hauptsäch-

lich Schwannzellen) feststellen. Dies lässt vermuten, dass der antikonvulsive Effekt nicht auf

die GABA-Produktion des Zelltransplantates zurückführen war.

Im Hinblick auf unser Studiendesign (maximal 4 PTZ-Schwellen mit langen dazwischen

liegenden Zeitintervallen) war keine Neurodegeneration oder Denervation innerhalb des STN

oder der SNr zu erwarten. Daher transplantierten wir die Zellen auch in Tiere nach Status

epileptikus. Für die SNr ist beschrieben, dass es nach Status-Induktion durch Pilokarpin zu

metabolischen Veränderungen und Schäden der Neurone und Gliazellen kommt (SCHMIDT-

KASTNER et al. 1991; DUBÉ et al. 2000a; DUBÉ et al. 2000b). Möglicherweise sind diese

aber im Vergleich zu den umfassenden funktionellen Umstrukturierungen des Hippokampus

Diskussion

144

zu mild, um die funktionelle Integration verpflanzter Zellen zu fördern. Auch in diesem Mo-

dell erzielten die Transplantate keinen antikonvulsiven Effekt.

Es gibt jedoch zahlreiche Hinweise, die die Bedeutung der Zielregion für eine gerichtete The-

rapie herausstellen: Im STN liegen größtenteils glutamaterge Neurone, in der SNr hauptsäch-

lich GABAerge Neurone. Möglicherweise ist eine solche Umgebung zu einheitlich, um eine

Integration und Induktion der Differenzierung in GABAerge Neurone zu forcieren. Im

Hippokampus hingegen sind unterschiedliche Neuronenpopulationen angesiedelt (s. Abschnitt

2.2.3).

Möglicherweise ist das adulte Gehirn weniger empfänglich für die Aufnahme und erfolg-

reiche Einbindung fremder Vorläuferzellen. Transplantationen von MGE-Vorläufern in den

Neokortex neonataler Empfängertiere zeigten eine vermehrte kortikale Inhibition und protek-

tive Effekte im Maximal-Elektroschock-Test und in genetisch epileptischen Mäusen

(ALVAREZ-DOLADO et al. 2006; BARABAN et al. 2009; CALCAGNOTTO et al. 2010).

Ein antikonvulsiver Effekt könnte auf die nicht ausgereifte Umgebung, das neonatale Gehirn,

zurückzuführen sein. In diesen Studien migrierten die Zellen über weite Strecken

(ALVAREZ-DOLADO et al. 2006; BARABAN et al. 2009) und könnten so zusätzlich in

anderen Regionen, abweichend von der ursprünglichen Zielregion, anfallsunterdrückende

Eigenschaften entwickelt haben. Es wurde zudem gezeigt, dass die Zellen in funktionelle

GABAerge Interneurone differenzieren.

Im Umkehrschluss ist gezeigt worden, dass Interneuronopathien Epilepsien hervorrufen kön-

nen (ANDERSON u. BARABAN 2012): So entwickeln genetisch veränderte Mäuse, denen in

der Embryonalentwicklung ein Transkriptionsfaktor (Dlx1) innerhalb der ganglionischen

Eminenz fehlt, altersabhängig signifikant weniger GABAerge Interneurone, eine daraus re-

sultierende verminderte Hemmung in Hippokampus und Kortex und schlussendlich spontane

epileptische Anfälle (COBOS et al. 2005). Bei Kindern mit Mutationen eines Gens (ARX), das

für Migration und Differenzierung GABAerger Interneurone eine tragende Rolle spielt, treten

analog Myoklonien und klonische Krämpfe auf (KATO u. DOBYNS 2005). BARABAN et

al. (2009) konnten mithilfe einer Transplantation von Zellen aus der MGE in einem gene-

tischen Mausmodell für Epilepsie eine Anfallsreduktion um 86 % erreichen. Diese Wirkung

konnten wir mit der Transplantation GABAerger Vorläuferzellen aus der LGE bzw. MGE in

Basalganglienregionen im PTZ-Modell nicht reproduzieren (s. Abb. 44 und Abb. 45). Für das

Diskussion

145

Ausbleiben eines antikonvulsiven Effektes gibt es neben der Wahl der Zielregion verschie-

dene Erklärungsansätze, die sich auf verschiedene Faktoren zurückführen lassen, wie Her-

kunft, Überleben, Differenzierung und funktionelle Integration der Transplantate.

6.3.4. Herkunft der transplantierten Zellen

Die Herkunft der Zellen spielt für den Transplantationserfolg eine große Rolle. Eventuell eig-

nen sich die von uns verwendeten ganglionischen Vorläuferzellen nicht für eine intrasubtha-

lamische oder intranigrale Verpflanzung. ZAMAN et al. (2000) konnten zeigen, dass die Zell-

spezifität sehr wichtig für das Überleben der Zellen ist: Wurden hippokampale Zellen in den

Hippokampus transplantiert, überlebten 42 – 69 % der Zellen, je nach ihrem genauen Ur-

sprungsort im Hippokampus. Dagegen überlebten nur 12 % ganglionisch generierter Zellen

(E15) eine Transplantation in den Hippokampus. In einer Folgestudie wurden fetale, hippo-

kampale Zellen mit FGF-2 und Caspase-Inhibitor vorbehandelt und nach 2 Monaten lebten

noch 98 % der injizierten Zellen (RAO et al. 2007). HOLMES et al. (1991) vermuteten sogar,

dass der Zelltyp gegenüber der Wahl der Zielregion eine entscheidendere Rolle spielte: Sie

transplantierten vier verschiedene Zelltypen aus Hippokampus, Neokortex, Cerebellum und

Locus coeruleus entweder intrazerebroventrikulär oder intrahippokampal im Kainat-Modell.

Es wurde ein milder antikonvulsiver Effekt auf die Häufigkeit spontaner Anfälle nach Trans-

plantation von Zellen aus Hippokampus respektive Locus coeruleus beobachtet. Die Gesamt-

zahl an Tieren mit spontanen Anfällen war jedoch in allen Gruppen und einer Kontrollgruppe

gleich. Auch gab es keinen robusten Effekt im Kindling-Modell. Interessanterweise wurde

kein Unterschied zwischen Tieren beobachtet, deren Transplantate innerhalb des Ventrikels

oder innerhalb des Hippokampus lagen, was darauf schließen lässt, dass der Wahl des Donor-

gewebes eine höhere Bedeutung zukam als der Wahl der Akzeptor-Hirnregion (HOLMES et

al. 1991). In der vorliegenden Studie haben wir in Anlehnung an Studien aus der AG Shetty

(HATTIANGADY et al. 2008; WALDAU et al. 2010) zunächst Vorläuferzellen aus der LGE

als auch nachfolgend aus der MGE transplantiert, da in den genannten Arbeiten mit beiden

Zellpopulationen nach Transplantation in den Hippokampus deutliche antikonvulsive Effekte

im Kainat-Modell auftraten. An den Untersuchungen der AG Shetty lässt sich allerdings kri-

tisch anmerken, dass die Analyse der Anfallshäufigkeit und –typen lediglich durch Beobach-

tung und nicht durch kontinuierliche EEG- und Videoüberwachung erfolgte,

(HATTIANGADY et al. 2008; WALDAU et al. 2010) und zudem der Observator wusste, bei

Diskussion

146

welchen Tieren eine „sham“ Operation bzw. eine Zelltransplantation erfolgt war

(HATTIANGADY et al. 2008). Weder mit LGE- noch mit MGE-Zellen konnten wir die

Schwelle zur Auslösung eines Anfalls im PTZ-Modell erhöhen. Mögliche Erklärungsansätze

beinhalten für beide Zelltypen niedrige Überlebensraten der transplantierten Zellen oder eine

mangelnde Differenzierung in GABAerge Neurone.

6.3.5. Überleben der transplantierten Zellen

Möglicherweise reichte die Zahl vitaler Zellen innerhalb der Zielregionen nicht aus, um die

endogene Inhibition zu erhöhen und signifikante Schwellenerhöhungen hervorzurufen. Tat-

sächlich setzten die Mitarbeiter aus der AG Shetty in ihren Transplantationsstudien 4 Depots

aus LGE- bzw. MGE-Zellen pro Hemisphäre in den Hippokampus (HATTIANGADY et al.

2008; WALDAU et al. 2010), was in unserer Studie aufgrund des kleinen Volumens des STN

sowie der Unterscheidung der SNr in einen anterioren und posterioren Teil nicht möglich war.

Eine Zählung aller transplantierten Zellen gestaltete sich schwierig, da die Zellen teilweise

migrierten oder im Einstichkanal dorsal der Zielregion verloren gingen. Insgesamt waren

wenige Zellen nach Transplantation in der jeweiligen Zielregion auffindbar. Laut

HATTIANGADY und Kollegen (2008) überlebten etwa 33 % der mit FGF-2 und Caspase-

Inhibitor behandelten LGE-Zellen eine hippokampale Transplantation mehrere Monate. Ähn-

liche Zahlen brachte die Arbeit von WALDAU et al. (2010) nach Transplantation von Vorläu-

ferzellen aus der MGE nach Kultur im Neurosphärenstadium hervor. Leider konnten wir nur

an wenigen Tieren eine quantitative Analyse der Transplantate durchführen, hier überlebten

jedoch lediglich zwischen 500 und 3000 Zellen innerhalb der Zielregion die Transplantation,

was einer Überlebensrate innerhalb der Region von 0,625 - 3,75 % entspricht.

Auch LÖSCHER et al. (1998) berichteten eine sehr geringe Überlebensrate fetaler Zellen aus

der ganglionischen Eminenz drei Monate nach Transplantation in die SNr: Nach ursprüng-

licher Injektion von acht Depots à 50000 Zellen überlebten innerhalb der SNr lediglich 135-

888 Neurone. Wurden außerhalb der SNr liegende Zellen miteingerechnet, ergab sich eine

Zahl von 419 bis 1621 Neuronen. Trotzdem führte die Transplantation zu einem transienten

antikonvulsiven Effekt im Kindling-Modell; die Autoren vermuteten, dass der deutliche pro-

tektive Effekt zu Beginn der Studie darauf hindeuten könnte, dass die Zellen erst nach dieser

Zeit untergingen und der Effekt folglich abnahm.

Diskussion

147

Eine weitere, mögliche Erklärung für die niedrige Zahl an vitalen Zellen in der vorliegenden

Studie könnte die von uns durchgeführte Markierung der Zellen mit BrdU darstellen: In-vitro

wurde gezeigt, dass das Markieren der Zellen mit BrdU einen negativen Einfluss auf den

Zellzyklus, die Differenzierung und das Überleben der Zellen hat (LEHNER et al. 2011).

Diese Ergebnisse wurden jedoch bis zum jetzigen Zeitpunkt nicht in in-vivo Experimenten

bestätigt.

6.3.6. Differenzierung der transplantierten Zellen

In der vorliegenden Studie könnte zusätzlich die ausgebliebene Differenzierung der Zellen in

GABAerge Neurone eine Ursache für die Wirkungslosigkeit der Transplantate darstellen.

Insgesamt war von den BrdU-positiven Zellen jeweils nur ein geringer Anteil positiv für

GAD67. Quantitativ konnten wir dies für die MGE-Zellen in-vivo, bisher nur anhand eines

Tieres, belegen und zeigten, dass 5 Wochen nach Transplantation in den STN in-vivo ledig-

lich etwa 12 % der Zellen in GABAerge Neurone differenzierten. Dieses Ergebnis ist kon-

form mit den Beobachtungen von WALDAU et al. (2010): 10 % der aus der MGE generierten

Zellen waren 3 Monate post transplantationem in den Hippokampus positiv für einen anti-

GABA Antikörper. Nach Vorbehandlung mit Retinsäure und Kaliumchlorid zählten wir

höhere Zahlen an transplantierten, GABAergen Zellen innerhalb des STN (etwa 30 %), aller-

dings war die Gesamtzahl an überlebenden Zellen nicht größer. Es wurde wiederum nur eine

Zählung an einem Tier durchgeführt. In der Studie von HATTIANGADY et al. (2008) waren

es hingegen 69 % aller BrdU-markierten Zellen, allerdings wurden hier in den geschädigten

Hippokampus transplantiert und die Tiere wurden erst 1 Jahr nach Transplantation getötet und

die Zellzahl erhoben.

Möglicherweise war die Evaluation antikonvulsiver Effekte nach Transplantation in unserem

experimentellen Design zu früh angesetzt. HATTIANGADY et al. (2008) begannen erst

9 Monate nach Status epileptikus und subsequenter Transplantation (4 Tage post Status)

fetaler Zellen mit der Aufzeichnung von EEGs, um spontane Anfälle und ihre Häufigkeit zu

dokumentieren.

In der vorliegenden Arbeit sind die quantitativen Daten noch preliminär. Um weitere Aus-

sagen bezüglich des Überlebens und der Differenzierung der transplantierten Zellen treffen zu

können, sind weitere Studien nötig: Es fehlt eine in-vitro Evaluation des Anteils an

Oligodendrozyten, die wahrscheinlich den verbleibenden Anteil der Zellen (neben Neuronen

Diskussion

148

und Astroyzten) ausmachen. Wir zählten in-vitro einen Anteil von etwa 20 % astrozytären

Zellen ohne Vorbehandlung und nach Retinsäure und Kaliumchlorid-Behandlung von etwa

14 %. Bisher wurden zudem keine Zählungen der Astrozyten in-vivo, nach Transplantation,

durchgeführt. In den Studien von WALDAU et al. (2010) differenzierten sich etwa 50 % der

transplantierten Zellen in GDNF-positive Astrozyten. GDNF selbst werden antikonvulsive

Eigenschaften zugeschrieben (KANTER-SCHLIFKE et al. 2007). Da keine Anfärbung gegen

GDNF durchgeführt wurde, können wir nicht davon ausgehen, dass die Astrozyten diesen

Faktor produzierten.

Außerdem bleibt zu klären, aus welchem Grund im in-vitro Versuch eine höhere Anzahl an

GAD-positiven Zellen gegenüber NeuN-positiven Zellen gezählt wurde. Eventuell wird die

GAD zeitlich früher exprimiert als NeuN. Es gibt in der Literatur Hinweise dazu, dass GABA

und GAD sogar transient in der Embryonalentwicklung in Astrozyten exprimiert werden

(OCHI et al. 1993), was eine mögliche Erklärung für unsere Beobachtung darstellen könnte.

Für eine sichere Aussage zur Differenzierung in-vitro wäre eine weitere Versuchsreihe not-

wendig, in der die Zellen nach Vorbehandlung ohne den Zusatz der Wachstumsfaktoren FGF-

2 und EGF bis zur vollständigen Ausdifferenzierung kultiviert werden.

Diskussion

149

6.4. Studie IIb: Neurotransplantation von NT2-Zellen

Transplantationen von NT2-Vorläuferzellen und adulten NT2-Neuronen führten im PTZ-Mo-

dell nicht zu antikonvulsiven Effekten. Für die Bewertung des Transplantationserfolges von

NT2-Vorläuferzellen und adulten NT2-Neuronen liegen leider keine verlässlichen immun-

histologischen Auswertungen vor. Die ausbleibende PTZ-Anfallsschwellenerhöhung nach

Transplantation in die SNr bzw. den STN spricht dafür, dass die NT2-Zellen keine Verstär-

kung der GABAergen Inhibition hervorrufen konnten. Ursächlich konnten sich die transplan-

tierten Zellen wahrscheinlich nicht erfolgreich in das Wirtsgehirn integrieren oder wurden

abgestoßen, da keine Immunsuppression durchgeführt wurde.

Bisher gibt es nur eine Studie zur Transplantation von NT2-Zellen im Kainat-Modell, in der

es nach Transplantation von NT2-Zellen in den rechten dorsalen Hippokampus weder zu einer

Anfallsreduktion, noch zu einer verbesserten Lernleistung kam (HASEGAWA et al. 2004).

Dafür sind zahlreiche Transplantationsstudien in experimentellen Modellen für Schlaganfall

und bereits einige Untersuchungen an Schlaganfall-Patienten durchgeführt worden: NT2-

Zellen wurden am menschlichen Schlaganfall-Patienten in Basalganglienregionen

transplantiert (KONDZIOLKA et al. 2000): Die motorischen Fähigkeiten der Patienten

verbesserten sich und auch die metabolische Aktivität der geschädigten Hirnregion wurde

teilweise wiederhergestellt. Diese Ergebnisse wurden in einer Phase 1 Studie bestätigt

(MELTZER et al. 2001). Einer der Patienten aus der Studie starb 27 Monate nach

Transplantation vermutlich aufgrund eines myokardialen Infarktes; die histopathologische

Untersuchung seines Gehirnes ergab, dass transplantierte NT2-Neurone überlebt hatten und es

zu keiner Tumorformation gekommen war (NELSON et al. 2002). Eine quantitative Analyse

der Überlebensrate wurde nicht durchgeführt.

6.4.1. Transplantation von NT2-Zellen bei Epilepsien

In der genannten Studie von HASEGAWA et al. (2004), in der eine hippokampale

Transplantation von NT2-Zellen, wie in der vorliegenden Arbeit, nicht zu antikonvulsiven

Effekten führte, gelang der immunhistologische Nachweis der transplantierten Zellen 12

Wochen nach Transplantation nur in etwa 60 % der Tiere. Des Weiteren existiert eine Arbeit

von WILLING et al. (2002), in der NT2-Neurone in einem Modell für Schlaganfall kortikal

transplantiert wurden und 4-6 Wochen nach Transplantation Anfallsschwellen mittels

Diskussion

150

subkutaner Injektion von PTZ ermittelt wurden. Mögliche Effekte einer Zelltransplantation

auf die Empfindlichkeit gegenüber Anfällen ist auch für die Schlaganfall-Forschung von Be-

deutung, da in 5-10 % der Schlaganfallpatienten epileptische Anfälle auftreten (ASCONAPE

u. PENRY 1991). Generell gab es in Tieren nach Schlaganfall eine Tendenz zu gesenkten

Anfallsschwellen, jedoch keinen Unterschied zwischen Tieren mit und ohne NT2-Transplan-

taten (WILLING et al. 2002). Analog zu der vorliegenden Arbeit gab es Probleme mit dem

immunhistochemischen Nachweis der NT2-Zellen im Rattengehirn (WILLING et al. 2002):

Eine Anfärbung mit einem Antikörper gegen nukleäres Matrixprotein (NuMa) gelang in zwei

von fünf Tieren, bei zwei anderen war trotz histologisch deutlichem Kanüleneinstich keine

Anfärbung möglich. Die NuMa-Färbung zeigte geringe Zellzahlen, diese wurden nicht quanti-

fiziert. WIILING et al. (2002) vermuteten, dass entweder eine Abstoßung der Zellen oder die

PTZ-induzierten Anfälle zu einer geringen Überlebensrate geführt haben könnten. Eine Ver-

bindung zwischen der wiederholten, intravenösen Administration von PTZ und dem Abster-

ben/Abstoßen der Zellen ist auch in der vorliegenden Arbeit möglich. Zudem führten wir,

anders als in den Studien von WILLING et al (2002) und HASEGAWA et al. (2004), trotz

des Einsatzes humaner NT2-Zellen keine Immunsuppression durch, um eine Vergleichbarkeit

zu den Studien an Vorläuferzellen aus Rattenfeten zu bewahren, für die keine

Immunsuppression nötig ist. Es ist nicht geklärt, ob immunsuppressive Therapien einen

Einfluss auf PTZ-Anfallsschwellenbestimmungen haben. Dieser Zusammenhang wird gerade

in einem anderen Projekt von unserer Arbeitsgruppe untersucht. Obwohl alle anderen

beschriebenen Studien Immunsuppressiva einsetzten, sahen wir ohne Immunsuppression nur

in einem Fall eine deutliche Abstoßungsreaktion nach Transplantation humaner Zellen. Durch

den Vergleich mit unseren Erfahrungen mit deutlichen Abstoßungsreaktionen nach

Transplantation des Clone 4 der genetisch veränderten GABAergen Rattenneurone (M213-

2O) war diese Beobachtung unerwartet.

6.4.2. Transplantation von NT2-Zellen in experimentellen Tiermodellen

Es gibt bereits erste Ergebnisse zum erfolgreichen Einsatz der Zellen in Tiermodellen für

ischämische Hirninfarkte (BORLONGAN et al. 1998a; BORLONGAN et al. 1998b;

SAPORTA et al. 1999). Die Studien zeigten, dass Lern- und Gedächtnis-, sowie motorische

Defizite, die nach einseitiger Ligation der A. carotis und subsequentem ischämischen Hirn-

insult auftraten, durch Transplantation humaner NT2-Neurone positiv beeinflusst werden

Diskussion

151

konnten und eine funktionelle Wiederherstellung erreicht werden konnte. SAPORTA et al.

(1999) zeigten, dass eine bestimmte Anzahl an Neuronen transplantiert werden und überleben

muss, um einen Effekt hervorzurufen: Unilaterale Transplantationen in die vom Schlaganfall

betroffene Hemisphäre von 40000 oder mehr Zellen waren effektiv, während geringere Men-

gen keine Verbesserung der beschriebenen Defizite in verschiedenen Tests bedeuteten. Wur-

den 40000 Zellen verpflanzt, überlebten etwa 5 % die dreimonatige Versuchsphase. Inte-

ressanterweise überlebten bei Transplantation von 80000 oder 1600000 Zellen sogar 12-15 %,

was darauf schließen lassen könnte, dass eine kritische Zellmenge nötig ist, um Überlebens-

raten zu verbessern. Die Autoren zeigten, dass ab einer Zahl von 124 überlebenden Neuronen

signifikante Effekte auftraten. Dies ist vergleichbar mit einer Transplantations-Studie in ei-

nem Parkinson-Modell, in dem etwa 100-200 dopaminerge Neurone aus dem ventralen

Mesencephalon nötig waren, um signifikante Verbesserungen (50 %) in einem Rotationstest

zu erzielen (BRUNDIN et al. 1988).

Obwohl wir bisher keine quantitative Analyse der Zahl an vitalen Zellen drei Monate nach

Transplantation durchführen konnten, waren jeweils auf mehreren Schnittebenen transplan-

tierte Zellen sichtbar, was darauf hindeutet, dass es sich ebenfalls um mehr als 100 überle-

bende Neurone handelte. Die ursprüngliche Transplantationsmenge betrug 80000 Zellen. In

der Studie von SAPORTA et al. (1999) wurden ebenfalls 80000 NT2-Neurone transplantiert,

was zu einer Überlebensrate von etwa 9800 Zellen drei Monate nach Transplantation führte.

Allerdings vereinen NT2-Zellen mehrere neuronale Phänotypen mit unterschiedlichen Trans-

mittern (s. Abschnitt 2.4.4.2). Für eine Anfallsunterdrückung innerhalb der Basalganglien ist

jedoch eine verstärkte GABAerge Hemmung nötig (DEPAULIS et al. 1994; LÖSCHER et al.

2008; GALE, 2008). Möglicherweise reichte die absolute Zahl GABAerger Neurone inner-

halb der überlebenden NT2-Zellen nicht aus, um antikonvulsive Effekte zu erzielen. Diese

Erklärung ist rein spekulativ, denn aufgrund der Schwierigkeiten in der Anfärbung der NT2-

Zellen im Nagergehirn konnten wir bisher keine spezifischen Anfärbungen mit Markern ge-

gen Subtypen neuronaler Zellen, in diesem Fall vornehmlich gegen GABAerge Neurone,

durchführen. Dies wäre besonders für die NT2-Vorläuferzellen interessant gewesen, da bei

ihnen der Anteil GABAerger Neurone nach Differenzierung innerhalb des Wirtsgehirns (in

diesem Fall innerhalb der Zielregion) nicht bekannt ist. Die Transplantate aus NT2-Vor-

läufern werden aus ähnlichen Gründen wie die Precursoren aus der Ratte unwirksam gewesen

Diskussion

152

sein, darunter fallen die mangelnde Befähigung zum Überleben im intakten Gewebe und feh-

lende Integration und Differenzierung.

6.5. Probleme der Zelltransplantation und ihrer Translation

Wie bereits diskutiert, bietet insgesamt der Einsatz von Vorläuferzellen gegenüber der Trans-

plantation genetisch veränderter Zelllinien einige Vorteile, u.a. ein geringeres Risiko der Ab-

stoßung. In einer Pilotstudie wurden bereits Vorläuferzellen aus dem Schwein in drei humane

Epilepsie-Patienten transplantiert und auf diese Weise für eine klinische Anwendung getestet,

allerdings wurde diese Studie trotz einer antikonvulsiven Wirkung wegen eines Infektions-

risikos der Patienten mit porcinen Retroviren nicht ausgedehnt (SCHACHTER et al. 1998).

Ein allogener Transplantationsansatz wäre hier sicherlich zielführender, jedoch werden auch

ethische Fragen bezüglich der Quelle der fetalen Zellen beim menschlichen Patienten aufge-

worfen. Die neue Technologie aus adulten, körpereigenen Zellen wieder pluripotente Stamm-

zellen zu generieren, wäre eine Alternative, die eine ethisch einwandfreie Gewinnung und

eine autologe Transplantation der Zellen ermöglichen und zudem den Einsatz von Immun-

suppressiva unnötig werden lassen würde. Jedoch gibt es Studien mit unterschiedlichen Aus-

sagen zu dem Verhalten solcher Zellen nach Transplantation, besonders im Hinblick auf ihre

Differenzierung und mögliche Entartung (WERNIG et al. 2004; FUJIKAWA et al. 2005;

BREDERLAU et al. 2006). In einer kürzlich veröffentlichten Studie wurden hippokampale

Vorläuferzellen aus murinen, embryonalen Stammzellen generiert und in den Gyrus dentatus

adulter Mäuse transplantiert. Vier Wochen später kam es zur Ausbildung eines Terato-

karzinoms (GERMAIN et al. 2012) Die Autoren folgerten, dass vor einer Verwendung von

Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen auf persistierende, pluripotente Zellen unter-

sucht werden muss, um das Risiko einer Tumorformation einzugrenzen. Insgesamt gibt es

noch zu wenige Informationen zu möglichen Risiken der Verwendung pluripotenter Stamm-

zellen oder Vorläuferzellen, die aus diesen generiert wurden (ZHU et al. 2012).

Des Weiteren wird diskutiert, ob die Transplantation von Zellen nicht einen Hirninsult per se

darstellt und somit letztendlich proepileptogen wirken könnte (BUZSÁKI et al. 1988;

BUZSÁKI et al. 1989; MUDRICK et al. 1990; BUZSÁKI et al. 1991). Sieben bis zehn Mo-

nate nach Transplantation hippokampaler Vorläuferzellen aus E15 und E16-Feten in den

Hippokampus naiver Ratten wurde das Auftreten von interiktalen Spikes mit sehr hoher

Diskussion

153

Amplitude (bis zu 10 mV) sowie von motorischen Anfällen bei einigen Tieren beobachtet

(BUZSÁKI et al. 1991). Zudem reagierten die Tiere auf hochfrequente Stimulation zum Teil

mit konvulsiven Anfällen bis hin zum Verlust der Stellreflexe. BUZSÀKI et al. (1991)

berichteten außerdem, dass lediglich in 6 von 10 Tieren am Ende der Studie hippokampale

Transplante überlebt hatten; eine quantitative Analyse wurde nicht durchgeführt. Die Autoren

beschreiben diese geringe Überlebensrate als dramatisch geringer als in vergleichbaren,

vorausgegangen Transplantationsstudien, in denen der Hippokampus selektiv vor Zellver-

pflanzung geschädigt wurde (BUZSÁKI et al. 1988; BUZSÁKI et al. 1989). Keins der

Kontrolltiere oder Tiere ohne überlebende Zelltransplantate zeigten spontane epileptiforme

Aktivität oder induzierte motorische Anfälle nach Stimulation. Bei fünf Tieren wurden

zerebelläre Vorläuferzellen transplantiert, hier konnte lediglich bei einem Tier zehn Monate

nach Operation ein überlebendes Zelltransplantat nachgewiesen werden (BUZSÁKI et al.

1991).

Auch die zunächst sehr vielversprechend gestarteten Studien zu Neurotransplantation an

Parkinson-Patienten werden zunehmend kritisiert: Insgesamt scheiterten doppelt verblindete

und kontrollierte klinische Studien (FREED et al. 2001; OLANOW et al. 2003; OLANOW et

al. 2009b). In einigen Fällen traten sogar, wahrscheinlich durch die Transplantation verur-

sachte, Dyskinesien auf, die nicht auf Nebenwirkungen zusätzlicher Medikamentengaben zu-

rückgeführt werden konnten (HAGELL et al. 2002; OLANOW et al. 2009a). Weiterhin gehen

OLANOW et al. (2009) davon aus, dass zahlreiche der bei Parkinson-Patienten auftretenden

Symptome nicht durch einen Dopaminmangel hervorgerufen werden, und weder mit medi-

kamentellen, dopaminergen Therapien noch mit der Transplantation dopaminerger Neurone

zu behandeln sind. Zudem wurde eine abnehmende Exprimierung dopaminerger Transporter

und eine Anhäufung von Lewy-Körperchen innerhalb der Transplantate festgestellt, was be-

deuten könnte, dass die Zellen ebenfalls von pathologischen Parkinson-Veränderungen betrof-

fen sein könnten (KORDOWER et al. 2008b; KORDOWER et al. 2008a; LI et al. 2008).

OLANOW et al. (2009) ziehen den Schluss, dass die Neurotransplantation in naher Zukunft

keine Vorteile gegenüber anderen therapeutischen Strategien (tiefe Hirnstimulation, langwirk-

same Medikamente) bieten wird. Ähnlich der Situation bei Epilepsie ist einzig das Potential

zur funktionellen Reparatur geschädigter Hirnregionen ein deutlicher Vorteil der Neurotrans-

plantation. Es bleibt jedoch anzumerken, dass neuroprotektive Therapien während der Epi-

Diskussion

154

leptogenese prophylaktisch zwar in der Lage sind, die Schädigung im Hippokampus zu ver-

ringern, es aber trotzdem zu der Ausbildung einer chronischen Epilepsie kommt (WALKER

2007). Zudem sind für Patienten mit Epilepsie langfristig wirksame Therapien von

entscheidender Bedeutung, da - anders als bei der Parkinson’schen Erkrankung, bei der die

Symptome erst in der zweiten Lebenshälfte auftreten - sehr junge Patienten an Epilepsie lei-

den, die ihr ganzes Leben therapiert werden müssen (BOISON 2007).

6.6. Ausblick fokale Therapien

Fokale Therapien sind durch die beschriebenen Vorteile gegenüber der systemischen Therapie

gekennzeichnet (s. Abschnitt 6.1.5). In dieser Arbeit war die fokale Applikation eines

Antiepileptikums die erfolgreichste Strategie, um Anfallsschwellen im PTZ-Modell zu erhö-

hen. Für eine klinische Translation sind aber noch einige Untersuchungen nötig. So ist nicht

geklärt, ob sich diese Ergebnisse auch in chronischen Epilepsiemodellen mit kontinuierlicher

Vigabatrin-Infusion reproduzieren lassen. Besonders eine Toleranzentwicklung stellt hier ein

Hindernis für die dauerhafte, fokale Applikation dar (LÖSCHER u. FREY 1987). Vorteile in

der Nutzung von Vigabatrin gegenüber dem GABA-Agonisten Muscimol könnten darin be-

stehen, dass Vigabatrin in unseren Studien eine höhere antikonvulsive Potenz als Muscimol

aufwies (GERNERT u. LÖSCHER 2001; NOLTE et al. 2006) und intranigrale als auch in-

trasubthalamische Muscimol-Injektionen unerwünschte Nebenwirkungen wie stereotype Ver-

haltensweisen (Zirkeln, Schnüffeln, Nagen), Hyperaktivität oder Kopf- und Körperschräg-

haltung hervorriefen (GALE 1992a; DYBDAL u. GALE 2000). Nach Vigabatrin-Injektionen

wurden in dieser und anderen Studien keine derartigen Nebenwirkungen beobachtet

(LÖSCHER et al. 1987; GERNERT u. LÖSCHER 2001; NOLTE et al. 2006). GALE

(1992a,b) vermutete, dass der Unterschied im Nebenwirkungsprofil von Muscimol und Viga-

batrin im Wirkmechanismus begründet liegt: Während Muscimol kontinuierlich GABA-Re-

zeptoren stimuliert, wirkt Vigabatrin über eine Erhöhung des präsynaptischen Speichers an

GABA, das dann in physiologischen Mengen ausgeschüttet wird (GALE 1992b).

Inzwischen gibt es allerdings EEG-gestützte Anfallsdetektoren (SKARPAAS u. MORRELL

2009), die für Neurostimulation bei Epilepsie eingesetzt werden, und lediglich bei Bedarf, vor

Auftreten eines Anfalls, eine Stimulation auslösen. Analog wäre auch eine fokale Substanz-

applikation als Reaktion auf beginnende epileptiforme Aktivität denkbar. Neben Infusions-

Diskussion

155

systemen gibt es alternative Systeme, wie etwa Polymermatrizen, die GABA freisetzen

(KOKAIA et al. 1994).

Der Einsatz von Substanzen für fokale Therapie sollte zunächst sorgfältig in Tiermodellen

geprüft werden. Hier sind vor allem Modelle interessant, in denen pharmakoresistente Tiere

selektiert werden (LÖSCHER u. RUNDFELDT 1991; EBERT et al. 1999).

Ebenso verhält es sich mit der Neurotransplantation, die in dieser Studie nicht zu einem anti-

konvulsiven Effekt führte. Die Erklärungsansätze hierfür sind vielfältig; in der Zukunft sollen

in unserer Arbeitsgruppe Zelltransplantationen in chronischen Modellen für Epilepsie durch-

geführt werden, in denen Transplantationen GABAerger Vorläuferzellen erfolgreicher waren.

Das Vorbehandlungsprotokoll soll verbessert werden und zusätzlich werden Vorläuferzellen

aus dem Mesencephalon verwendet, aus denen sich GABAerge Neurone differenzieren lassen

(WEGNER et al. 2008). Neben einer allogenen Transplantation sind auch Xenotransplanta-

tionen aus dem Schwein und dem Menschen in der AG Löscher geplant. In beiden Fällen

werden wir eine immunsuppressive Therapie durchführen, zunächst werden allerdings Effekte

einer Immunsuppression auf die PTZ-Anfallsschwelle evaluiert. Im Falle der Verwendung

porciner Zellen werden wir „humanisierte“ Schweinezellen einsetzen, die uns freundlicher-

weise von Prof. Dr. H. Niemann (FLI Mariensee) zur Verfügung gestellt werden, um die Ge-

fahr potentiell zoonotischer, viraler Infektionen zu umgehen. Der Einsatz von porcinen Zellen

wäre auch translational interessant, da es weniger ethische Bedenken und limitierende Ge-

setze als bei der Gewinnung der Zellen aus menschlichen Feten gibt. Hier liegt auch ein gro-

ßer Vorteil in der Verwendung von Zelllinien wie den NT2-Zellen. Es existiert ein Subklon

der Zellen, der genetisch so manipuliert wurde, dass vermehrt GABAerge Neurone entstehen

(EATON et al. 2007; VAYSSE et al. 2011). Die zukünftige Nutzung dieser Zellen für Trans-

plantationen ist geplant.

Zusammenfassung

156

7. ZUSAMMENFASSUNG Sonja Bröer

Fokale Substanzapplikation und Neurotransplantation zur Therapie pharmako-

resistener Epilepsien

Epilepsien gehören bei Mensch und Tier zu den häufigsten chronischen Erkrankungen des

zentralen Nervensystems. Etwa 30 % der menschlichen und 70 % der caninen Patienten sind

pharmakoresistent; trotz Behandlung mit modernsten Antipepileptika wird keine Anfallsfrei-

heit erreicht. Neue therapeutische Strategien sind daher essentiell, um die Situation der er-

krankten Patienten zu verbessern.

Eine vielversprechende Alternative zur systemischen Therapie ist die fokale, gerichtete Mani-

pulation des epileptischen Netzwerkes. Für den Behandlungserfolg ist es unabdingbar, zu-

nächst geeignete Zielregionen im Zentralnervensystem zu determinieren. Eine der Ausgangs-

strukturen der Basalganglien, die Substantia nigra pars reticulata (SNr), ist hinsichtlich ihrer

anfallsmodulierenden Eigenschaften gut untersucht. Sowohl eine Inhibition der SNr selbst, als

auch ihrer exzitatorischen Eingangsstruktur, des subthalamischen Nukleus (STN), führen ex-

perimentell zu antikonvulsiven Effekten. Bisher wurden die Wirkungen fokaler und syste-

mischer Therapie kaum vergleichend untersucht, was für die Einschätzung der Effektivität der

Behandlung von enormer Wichtigkeit wäre. Ich habe die gerichtete Therapie anhand von zwei

Strategien, der fokalen Pharmakotherapie und der Neurotransplantation, untersucht. Beiden ist

gemein, dass durch eine Verstärkung der GABAergen Inhibition das bei Epilepsie existie-

rende Ungleichgewicht zwischen erregender und hemmender Neurotransmission egalisiert

werden soll.

In der ersten Studie habe ich daher das Antiepileptikum Vigabatrin in die angesprochenen

Basalganglienregionen mikroinjiziert und auftretende Effekte im Pentylentetrazol-Anfalls-

schwellentest (PTZ-Test) mit einer systemischen Administration verglichen. Vigabatrin er-

höht durch irreversible Inhibition der GABA-Transaminase die Konzentration von GABA.

Bilaterale Injektionen in den STN zeigten sich als effektivste Maßnahme, um die Anfalls-

schwelle signifikant zu erhöhen. Ähnlich starke antikonvulsive Wirkungen ließen sich weder

mit systemischer noch mit bilateraler Injektion in eine der Subregionen der SNr, das Striatum

oder an den STN angrenzende Strukturen reproduzieren. Die systemische Behandlung führte

zudem zu ausgeprägten Nebenwirkungen (Sedation, Verlust der Körpertemperatur und des -

Zusammenfassung

157

gewichtes), die nach fokaler Therapie nicht beobachtet wurden. Zukünftige Studien sollten

die Wirkung einer kontinuierlichen fokalen Infusion in chronischen Modellen für Temporal-

lappenepilepsie untersuchen. Die Vorteile einer fokalen Therapie liegen in der Reduktion von

Nebenwirkungen, der Umgehung der Bluthirnschranke (BHS), sowie einem reversiblen Ein-

griff. Des Weiteren können Substanzen intrazerebral appliziert werden, die systemisch eine

hohe Toxizität aufweisen oder nicht die BHS überwinden können. In meiner Arbeit habe ich

Botulinumtoxin B in den Hippokampus, der experimentell und klinisch häufig den epilep-

tischen Fokus darstellt, mikroinjiziert. Hierfür wurde die „convection-enhanced delivery“

genutzt, die eine homogene Verteilung der Substanz innerhalb der Zielregion ermöglicht.

Botulinumtoxin B führte zu prokonvulsiven Effekten im PTZ-Modell, spontanen Anfällen

und einem hyperexzitablen Verhalten, was wahrscheinlich durch das Setzen eines epilep-

tischen Fokus und plastische Netzwerkveränderungen erklärt werden kann. Die Wirkung von

Botulinumtoxin B sollte in weiteren Modellen für Epilepsie untersucht werden.

Der zweite experimentelle Ansatz war die Transplantation verschiedener Zelltypen. Frühere

Studien zeigten antikonvulsive, aber transiente Effekte nach Transplantation GABAerger

Zellen. Weder die Transplantation einer Mischkultur aus humanen, adulten NT2-Neuronen,

noch die Verwendung von NT2- oder GABAergen Precursorzellen aus der lateralen oder

medialen ganglionischen Eminenz von E14 Rattenfeten in den STN oder die SNr führten zu

antikonvulsiven Effekten. Preliminäre Daten belegten ein geringes Überleben der Zellen so-

wie eine niedrige Zahl an ausdifferenzierten GABAergen Neuronen. Eine Vorbehandlung der

Zellen mit Retinsäure und Kaliumchlorid vermochte zwar den Anteil an GABAergen Zellen

zu erhöhen, jedoch trat kein protektiver Effekt im PTZ-Test auf. Mögliche Ursachen sind ne-

ben der Integrität und neuronalen Zusammensetzung der Zielstruktur auch die Herkunft der

GABAergen Zellen und modellabhängige Faktoren.

Insgesamt leistet diese Arbeit einen Beitrag zur Strategiefindung für zukünftige Therapien

pharmakoresistener Epilepsien. In der vorliegenden Studie war die fokale Substanzapplikation

erfolgreicher als eine Neurotransplantation. Es ist die erste Untersuchung, die den STN als

vielversprechendste Zielregion innerhalb der Basalganglien für Manipulationen des

GABAergen Systems identifiziert hat. Neurochirurgisch ist die Verwendung des STN als

Zielstruktur bereits für tiefe Hirnstimulationen etabliert, was eine Translation der fokalen

Pharmakotherapie in die Klinik erleichtern würde.

Summary

158

8. SUMMARY

Sonja Bröer

Focal pharmacotherapy and neurotransplantation to treat pharmacoresistant epilepsies

Epilepsies are among the most common chronic neurological disorders, affecting both

humans and animals. Thus far, about 30 % of human as well as 70 % of canine patients do not

achieve seizure freedom under medication with modern antiseizure drugs. Novel treatment

approaches are mandatory in order to improve the situation of patients suffering from

pharmacoresistant epilepsy.

One promising alternative to systemic treatment is focal therapy of the epileptic network,

which requires the determination of appropriate target regions within the brain. One option is

to manipulate regions downstream of the seizure focus such as the basal ganglia, which are

known to be involved in seizure propagation and modulation. Inhibition of one of the output

structures, the substantia nigra pars reticulata, SNr, or its excitatory input, the subthalamic

nucleus, STN, have been shown to act anticonvulsant in different seizure models. Most of

these studies lack a direct comparison of efficiency of focal and systemic treatment. I have

examined two promising approaches of targeted therapy, focal pharmacotherapy and

neurotransplantation of different cell types. Both strategies have in common that GABAergic

inhibition is enhanced, based on the concept of restoring the imbalance between excitatory

and inhibitory neurotransmission in the epileptic brain.

In the first study, anticonvulsant effects after focal microinjection or systemic administration

of the antiseizure drug vigabatrin were assessed in the pentylenetetrazole seizure threshold

test (PTZ-test). Vigabatrin enhances the intracerebral concentration of GABA by irreversibly

inhibiting the GABA-degrading enzyme GABA-transaminase. I could demonstrate that

bilateral subthalamic injection is the most effective treatment to increase the seizure threshold

significantly. The specifity of this outcome was affirmed by evaluation of effects following

injections into anterior and posterior SNr, striatum, and adjacent structures of the STN, which

were not as pronounced. Systemic injections were less effective and caused severe side effects

(sedation, loss of body temperature and weight), which were not seen in focally treated

animals. Future studies will have to assess feasibility and efficiency of continuous

microinfusion in chronic models of temporal lobe epilepsy. The obvious benefits of focal

therapy are reduction of side effects, circumvention of the blood brain barrier (BBB), and its

Summary

159

reversible nature. Furthermore, it enables the usage of substances that are not eligible for

systemic treatment because of toxicity or their inability to pass the BBB. In additional

experiments, I have injected botulinum toxin B into the hippocampus, which frequently is the

seizure focus in clinical and experimental epilepsy. Injection was performed by convection-

enhanced delivery to allow a more homogenous distribution among the target region than

bolus deposition. Botulinum toxin B led to a significant, proconvulsant effect in the PTZ-test,

as well as to spontaneous seizures and hyperexcitability in rats, which might have been

induced by producing an epileptic focus and subsequent plastic network changes. The effects

of botulinum toxin B should be investigated in different seizure models in the future.

The second strategy was based on transplantation of different cell types. Earlier investigations

had shown anticonvulsant, but transient effects after grafting of GABA-producing cells. In

our experimental set-up, neither a mixed culture of human NT2-cells nor its precursors or

GABAergic precursors, derived from medial or lateral ganglionic eminences of E14 rat

fetuses, could alter the seizure threshold. Preliminary data indicate low survival and differen-

tiation of the transplanted cells. A stimulation of rat precursors with retinoic acid and

potassium chloride did produce a higher proportion of GABAergic cells; however no anti-

convulsant effects were obtained. Reasons might include the integrity and neuronal content of

the target region as well as transplant cell type and source and animal model dependent

factors.

In summary, this work contributes to the growing knowledge of alternative treatment

approaches in pharmacoresistant epilepsy. In our hands, focal pharmacotherapy was more

effective than neurotransplantation. This is the first study to identify the STN as the most

promising target region for manipulations of the GABAergic system among the basal ganglia.

The STN is already clinically used as a target in a number of neurosurgical applications like

deep brain stimulation, which makes it feasible to target the STN for focal pharmacotherapy.

Literaturverzeichnis

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seizure susceptibility.


Anhang

197

10. ANHANG

10.1. Geräte und Verbrauchsmaterialien

Gerät bzw. Verbrauchsmaterial Bezugsquelle

Tierhaltung

Einstreu (Weichholzgranulat Altromin) Altromin, Lage

Makrolonkäfig (Typ III und IV) Ebeco, Caustrop-Rauxel

Milchbrei (Früchte oder Banane) Milupa GmbH, Friedrichsdorf

Standardnagerdiät (Altromin 1324) Altromin, Lage

PTZ-Anfallsschwellentest

Gewebsklebeband Tesa SE, Hamburg

Infusionspumpe (PHD 2000) Harvard Apparatus, Holliston, USA

Injektionskanüle (24 G) Terumo® Europe n.V., Leuven, Belgien

Isotonische Natriumchloridlösung (NaCl, 0,9%) Braun Vet Care GmbH, Tuttlingen

Pentylentetrazol Caesar & Loretz, Hilden

Polyethylenschlauch Kleinfeld Labortechnik, Gehrden

Vorabstudie: Wahl der Anästhesie

Isofluran Cp-pharma®, Burgdorf

Ketamin 10 % medistar, Holzwickede

Narkosemasken (Eigenbau)

Herr Baum, Institut für Pharmakologie,

Toxikologie und Pharmazie, Tierärztliche

Hochschule Hannover

Sauerstoff Linde AG, Pullach

Xylazin 2 % Riemser Greifswald

Studie I: Fokale Substanzapplikation

Botulinumtoxin B und Vehikel Solstice Neurosciences Inc. (San Francisco, Kali-

fornien, USA)

Vigabatrin Merrell International Research Center, Stras-

bourg, Frankreich

Studie II: Neurotransplantation

Medien und Antikörper s. gesonderte Tabellen

Anhang

198

Zellkultur

6-well-Platten Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

70 µm-Filter (Zellsieb) (BD FalconTM

) BD Biosciences, Erembodegem, Belgien

Accutase® Invitrogen, Darmstadt

Brutschrank (Heraeus BBD6220) Kendro (Heraeus), Hanau

Deckgläschen (Ø 12 mm) Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Digitalcamera (Canon Powershot A640) Canon Deutschland GmbH, Krefeld

Falkon-Tubes (15 ml und 50 ml) Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

Gewebskulturflaschen 75 cm2 und 25 cm

2 Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

Konfokales Mikroskop Leica TCS SP5 mit der

Software „Leica LAS AF Lite v2.2.1“

Leica Microsystems, Wetzlar

Lichtmikroskop, invers (Axiovert 25) Carl Zeiss Jena GmbH, Jena

Lichtmikroskop, invers (Nikon eclipse TS100) Carl Zeiss, Oberkochen

NT2-Vorläufer- und adulte Zellen AG Bicker, TiHo Hannover

Objektträger Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig

Plastikpipetten (5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

Precursorzellen aus der Ratte Selbst präpariert

Stickstofftank (MVE Cryosystem 2000) Chart/MVE, Burnsville, USA

Zentrifuge (Typ 4123) Heraeus Christ GmbH, Osterode

Stereotaktische Operation (MI= Mikroinjektion; CED; T = Transplantation)

AxoScope (CED) Axon Instruments, Foster City, CA

Axotape 9 (CED) Axon Instruments, Foster City, CA

Bepanthen Augen- und Nasencreme Bayer Vital, Leverkusen

Bupivacainhydrochloridlösung (Carbostesin) Astra Zeneca, Wedel

Dentalbohrer (Mod. 732 T1) Dremel, Leinfelden-Echterdingen

Draht für Injektionsnadel 18 mm (MI) Schoeller Werke, Hellenthal

Führungsrohr-Elektroden-Kombinationen,

22 G Führungsrohr (CED)

PlasticsOne, Roanoke, Virginia, USA

Führungsrohr aus PEEK (Polyetheretherketon),

Glaskapillaren (Micropipettes) (T) Drummond Scientific Company, Broomall, USA

Grass CP511 AC EEG-Preamplifier (CED) Astro-Med, West Warwick, RI

Hamiltonspritze (0,5 µl) (MI)

(Mod. 7000.5 KH, pst 3)

Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Schweiz

Hamiltonspritze (2 µl) (T) (Mod. 7002 KH pst 2) Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Schweiz

Anhang

199

Horizontalpuller (Sachs-Flaming PC-84) (T) Sutter Instrument Corp., Novato, USA

Infusionspumpe (CED) Model KDS200, KD Scientific, Holliston, MA

Injektionskanülen, 28 G (CED) PlasticsOne, Roanoke, Virginia, USA

Mikroinjektionsschlauch (MI) CMA Microdialysis, Schweden

Nahtmaterial (Ethicon VICRYL® V994H (4-0)) Johnson-Johnson Intl., New Brunswick, USA

Parafilm Pechiney Plastic Packaging, Chicago, USA

Polyethylenschlauch (CED) PlasticsOne, Roanoke, Virginia, USA

Quarzglas-Injektionskanüle innerhalb der In-

jektionskanüle aus Plastik (CED)

Polymicro Technologies, Phoenix, Arizona

Skalpellklingen Rüttgers GmbH & Co. KG, Solingen

Stereotakt I Kopf David Kopf, Tujunga, CA, USA

Stereotakt II Stölting Wood Dale, USA

Systemhalterung für Glaskapillar- und

Hamiltonspritzensystem (Eigenbau) (T)

Herr Baum, Institut für Pharmakologie,

Toxikologie und Pharmazie, Tierärztliche

Hochschule Hannover

Tetracainhydrochlorid Ceasar & Loretz GmbH, Hilden

Wasserstoffperoxid (35%) AppliChem GmbH, Darmstadt

Zahnzement (CED) Lang Dental, Wheeling, Illinios, USA

Status-Induktion

Diazepam (Faustan®)

Temmler Pharma GmbH & Co. KG,

Marburg

Lithiumchlorid Sigma Aldrich, Steinheim

Methylscopolamin Sigma Aldrich, Steinheim

Pilocarpin Sigma Aldrich, Steinheim

Perfusion

Chloralhydrat AppliChem GmbH, Darmstadt

Paraformaldehyd-Pulver Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Schlauchpumpe (ISM897A)

Ismatec®, IDEX Health & Science GmbH,

Wertheim-Mondfeld

Histologie und Immunhistologie

3,3’-Diaminobenzidin (DAB) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Aqua ad injectabilia Braun, Tuttlingen

Bildanalysesoftware AxioVision® Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Göttingen

Anhang

200

BSA Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München

Deckgläser Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig

Digitalkamera (CCD, Axiocam MR3) Zeiss, Göttingen

Eindeckmedium (Entellan®) Merck AG, Darmstadt

Gefriermikrotom (CM 1325) Leica, Wetzlar

Gefrierschutzmedium

(Tissue Freezing Medium®)

Jung GmbH, Nussloch

Kammern (Shandon CoverplateTM

) Thermo Fisher Scientific, Schwerte

Lichtmikroskop Leica DM LB Leica, Wetzlar

Lichtmikroskop Zeiss Axioskop Zeiss, Göttingen

Serum (Rabbit, Goat) Dianova GmbH, Hamburg

Streptavidin-Cy3 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München

Streptavidin-Meerettichperoxidase Dianova GmbH, Hamburg

Terpineol Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Thionin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München

Tris AppliChem GmbH, Darmstadt

Triton X-100 AppliChem GmbH, Darmstadt

Wasserstoffperoxid Riedel de Häen, Hannover

Xylol-Ersatzmedium (XEM) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Anhang

201

10.2. Medien für die Zellkultur

Tab. 7 Verwendete Medien für die Gewinnung, Dissoziation, Proliferation und direkt anschließende

Transplantation von Vorläuferzellen aus der LGE.

Kultivierungsmedium Dissoziationsmedium Proliferationsmedium Transplantations-

medium

1:1 DMEM/F12

(Life Technologies)

1:1 DMEM/F12

(Life Technologies)

1:1 DMEM/F12

(Life Technologies)

Neurobasal®

(Invitrogen)

1xB27® Supplement

(ohne Retinsäure)

(Life Technologies)

1x B27® Supplement

(ohne Retinsäure)

(Life Technologies)

200 ng/ml FGF2

(PAN Biotech)

500 µM Caspase-

Inhibitor Ac-YVAD-

cmk

(Enzo Life Sciences)

Tab. 8 Verwendete Medien für die Gewinnung, Kultivierung und Transplantation von Vorläuferzellen

aus der MGE.

Kultivierungsmedium Proliferationsmedium Transplantationsmedium

1:1 DMEM/F12

(Life Technologies)

1:1 DMEM/F12

(Life Technologies)

Neurobasal® (Invitrogen)

1x B27® Supplement (ohne Retinsäure)

(Life Technologies)

20 ng/ml FGF2 (PAN Biotech)

20 ng/ml EGF (PAN Biotech)

10 ng/ml BrdU (Sigma)

100 µg/ml Penicillin/Streptomycin

(Biochrom AG)

0,25 µg/ml Fungizone (Invitrogen)

Anhang

202

Tab. 9 Zusätze für die Vorbehandlung der Zellen in-vitro.

Zusatz Bezugsquelle

5 mM Creatinmonohydrat (Creapure®) Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von

Alzchem Trostberg GmbH, Trostberg

40 mM Kaliumchlorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München

10 µM Retinsäure Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München

0,5 mM Valproinsäure (Orfiril®) Desitin Arzneimittel, Hamburg

10.3. Antikörper

Tab. 10 Verwendete Antikörper und ihre Bezugsquellen.

Antikörper Verdünnung Bezugsquelle

Alexa-Fluor 488-konjugierter Goat-anti-Rat

Antikörper

1:1000 Dianova GmbH, Hamburg

Anti-BrdU (MAB 3510) (Maus) 1:1000 Millipore, Schwallbach/Ts

Anti-BrdU (OBT 0030) (Ratte) 1:20 Abd serotec, Düsseldorf

Anti-GAD67 (MAB 5406) (Maus) 1:500 Millipore, Schwallbach/Ts.

Anti-GFAP (Kaninchen) 1:1000 DAKO, Hamburg

Anti-NeuN (MAB 377) (Maus) 1:500 Millipore, Schwallbach/Ts

Anti-Neurofilament (70 kDa) (Maus) 1:1000 MAB5294, Milipore, Darm-

stadt

Biotinylierter Goat-anti-Mouse Antikörper 1:500 Dianova GmbH, Hamburg

Biotinylierter Goat-anti-Rabbit Antikörper 1:1000 Dianova GmbH, Hamburg

Biotinylierter Rabbit-anti-Mouse Antikörper 1:500 Dianova GmbH, Hamburg

Cy2-konjugierter Goat-anti-Rabbit Antikör-

per


Cy2-konjugierter Goat-anti-Rat Antikörper 1:1000 Dianova GmbH, Hamburg

Cy3-konjugierter Goat-anti-Mouse Anti-

körper


Cy3-konjugiertes Streptavidin 1:1000

In Klammern ist die Tierart angegeben, aus der der primäre Antikörper gewonnen wurde. Cy = Carbocyanin.

Anhang

203

10.4. Puffer und Lösungen

10.4.1. Stereotaktische Operation

Tetracainhydrochlorid-Lösung (2%)

227 mg Tetracainhydrochlorid

In 10 ml Aqua bidest. lösen

Über eine 0,22 µm Millipore-Filtereinheit filtrieren

10.4.2. Perfusion

0,4 M Phosphatpuffer (Stammlösung)

800 ml Aqua dest.

57 g Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat

12,48 g Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat

Mit 1 M Natronlauge auf pH 7,4 einstellen

Ad 1000 ml Aqua dest.

0,2 M Phosphatpuffer

0,4M Phosphatpuffer 1:1 mit Aqua dest. verdünnen


0,2M Phosphatpuffer 1:1 mit Aqua dest. verdünnen


9 g Natriumchlorid

100 ml 0,1 M Phosphatpuffer

Mit 0,1 M Salzsäure auf pH 7,6 einstellen

Add 1000 ml Aqua dest.

16 % Paraformaldehydlösung

800 ml Aqua dest. auf 60-70°C erhitzen

160 g Paraformaldehyd-Pulver unter Rühren hinzugeben

Mit 1 M Natronlauge bis zur Klärung titrieren

Auf Raumtemperatur abkühlen lassen und dann filtrieren


Anhang

204

4 % Paraformaldehydlösung

16 %ige Paraformaldehydlösung mit 0,2 M PBS auf eine 4 %igen Lösung verdünnen

10 %ige Saccharoselösung (pro Rattengehirn)

3 g Zucker

Ad 30 ml 0,1M PBS

30 %ige Saccharoselösung (pro Rattengehirn)

9 g Zucker

Ad 30 ml 0,1M PBS

10.4.3. Zellkultur

Phosphatpuffer

40 g Natriumchlorid

1 g Kaliumchlorid

3,815 g Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat

1 g Kaliumdihydrogenphosphat

In 4 L Aqua dest. lösen

pH-Wert auf 7,3 einstellen

Ad 5 L Aqua dest.

Einfriermedium

Kulturmedium

Versetzt mit 10 % DMSO

10.4.4. Histologie

Chromgelantine

7 g Gelantine in 1.000 ml Aqua dest. auf 60 °C erwärmen

Etwas Thymol (wenige mg) zugeben

0,7 g Chrom-(III) Kaliumsulfat-Dodecanhydrat nach dem Erwärmen hinzugeben

Auf Eis auf 20 °C abkühlen

filtrieren

Anhang

205

Gefriermedium

85,6 g Glucose-Monohydrat

1,4 g Magnesium-Chlorid-Hexahydrat

In 500 ml 0,1 M PBS lösen

Mit 87 %igem Glyzerin auf 1000 ml auffüllen

Thionin-Lösung

100 ml 1 M Essigsäure

36 ml 1 M Natronlauge


Auf 60-70 °C erhitzen

1,25 g Thionin darin lösen

1 Stunde bei 60-70 °C rühren und dann heiß filtrieren

Bei 60 °C lagern (bis zu drei Monate haltbar)

0,05 M tris-gepufferte Saline (TBS)

9 g Natriumchlorid

6,057 g Tris

800 ml Aqua dest.

Mit 37 %iger Salzsäure auf pH 7,6 einstellen

Ad 1.000 ml Aqua dest.


Carrierlösung

100 ml TBS

1 ml Serum des Tiers aus dem der 2. AK gewonnen wurde (Goat Serum)

1 g bovines Serumalbumin (BSA)

1,5 ml 20 %iges Triton X-100

Blockinglösung

4,5 ml Carrierlösung

0,5 ml Serum des Tiers aus dem der 2. AK gewonnen wurde (Goat Serum)

100 mg BSA

Tris/Nickel-Lösung

0,3 g Ammonium-Nickel(II)-Sulfat-Hexahydrat

50 ml TBS

Anhang

206

3,3’-Diaminobenzidin-Lösung (DAB)

500 mg 3,3’-DAB

7,5 ml TBS

3,3’-DAB-Färbelösung

30 µl 3,3’-DAB Stammlösung

4 ml Tris/Nickel-Lösung

Zum Starten der Reaktion 1 µl 35 %iges Wasserstoffperoxid hinzugeben

10.5. Färbeprotokolle

10.5.1. Histologische Färbungen

Thioninfärbung (zur Lokalisationsbestimmung in Studie I und II verwendet)

3 min in 100 % Ethanol inkubieren




3 min in Aqua dest. inkubieren

75-90 sek. in Thionin-Färbelösung (42- 48 °C) inkubieren





3 min in Terpineol/Xylol-Ersatzmedium 1:1 inkubieren

3 min in Xylol-Ersatzmedium inkubieren

3 min in frischem Xylol-Ersatzmedium inkubieren

Sofortiges Eindecken der Schnitte mit Entellan® und Trocknen an der Luft

Färbung nach Shorr (zur Färbung der Vaginalabstriche für die Zyklusbestimmung)

10-mal in 70 % Ethanol eintauchen

10-mal in Aqua dest. Wässern

2 min in Meyers Hämalaun inkubieren

10-mal in Aqua dest. Wässern

1 min in Lithium-Carbonat (gesättigte Lösung 1:1 mit Aqua dest. verdünnt) inkubieren

Anhang

207

10-mal in Aqua dest. wässern

10-mal in 70 % Ethanol inkubieren

6 min in Shorr‘scher Färbelösung inkubieren

10-mal in 95 % Ethanol eintauchen

30 sek. In 95 % Ethanol inkubieren

Lufttrocknen lassen

10.5.2. Immunhistologische Färbungen

Es wurden sowohl immunhistologische Färbungen von fixierten Vorläuferzellen aus der Ratte als auch

von histologischen Schnittpräparaten der Gehirne nach Transplantation angefertigt.

10.5.2.1. Immunhistologische Färbung von fixierten Zellen auf Deck-

gläschen

1. Tag:

3x in Tris-gepufferter 0,9 % NaCl-Lsg. (TBS; pH 7,6; ca. 5 ml) waschen, je Waschgang 5 min

60 min in Blocklösung inkubieren

10 min in Carrierlösung inkubieren

1 Tropfen Antikörperlösung auf Parafilm auftragen und Deckgläschen 18-24 h in diesem Tropfen bei

4 °C inkubieren [Antikörperlösung z.B. primärer Antikörper anti-NeuN aus Maus in Carrierlösung

(1:500)]

2. Tag:

3x je 5 min in TBS waschen


Negativkontrolle entnehmen, keine Inkubation in primärem Antikörper durchführen!

60 min in Antikörperlösung inkubieren [in diesem Fall z.B. biotinylierter Goat-anti-Mouse in

Carrierlösung (1:500)]


60 min in Streptavidin/Fluoreszin (Cy3-konjugiert) in TBS (1:1000) inkubieren

Ab diesem Zeitpunkt erfolgen alle weiteren Inkubationen abgeschirmt von Licht


3 min in DAPI in TBS (1:5000) inkubieren


1x mit Aqua dest. waschen

Lufttrocknen

Anhang

208

Mit Mowiol eindecken

10.5.2.2. Immunhistologische Färbung von 40 µm-Gehirnschnitten im free-

floating Verfahren

10.5.2.2.1. DAB-Färbung

Das Protokoll entspricht im Wesentlichen dem nachfolgend beschriebenen Protokoll der

Immunfluororeszenz-Färbung. Ab Tag 2 werden jedoch abweichend nach der Inkubation mit

dem sekundären Antikörper und dem anschließenden Waschschritt die Schnitte für 90 min in

HRP-konjugiertem Streptavidin in TBS (1:375) inkubiert. Nach einem erneuten Waschschritt

folgt die 15 minütige Inkubation in 4 ml Tris/Nickel-Lösung + 30 µl DAB. Es wird 1 µl 35

%ige Wasserstoffperoxidlösung hinzugegeben und für weitere 10 min inkubiert. Danach wird

erneut gewaschen und wie beschrieben weiter verfahren (Aufziehen der Schnitte auf Objekt-

träger, Trockung und Eindecken).

10.5.2.2.2. Immunfluoreszenz-Färbung

1.Tag:

Schnitte in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) auffangen

[(3x in Tris-gepufferter 0,9 % NaCl-Lsg. (TBS; pH 7,6; ca. 5 ml) waschen, je Waschgang 5 min)

durchführen, wenn Schnitte gefroren im Glycerin aufbewahrt waren]

2 h bei 65° C in 50 % Formamid/2x SSC (2 ml 100 % Formamid + 2 ml (4x SSC)) inkubieren

10 min in 3 ml (2x SSC) inkubieren

30 min bei 37° C in 3 ml 2N HCl inkubieren

10 min in 3 ml 0,1 M Borsäure (pH 8,5) inkubieren, 1 mal Borsäure wechseln

3 x in TBS waschen, je Waschgang 5 min

60 min in 2 ml Blocklösung inkubieren

10 min in Carrierlösung (1,5 ml) inkubieren

Negativkontrolle entnehmen, keine Inkubation in primärem Antikörper durchführen!

18 - 24 h in 1,5 ml Carrierlösung + primärer Antikörper [z.B. anti-BrdU aus Ratte (1:20) und anti-

GAD67 aus Maus (1:500)] auf dem Rüttler bei 4°C inkubieren

2. Tag

3 x in TBS (ca. 5 ml) waschen (pro Waschschritt 10 min)


Anhang

209

60 min in 1,5 ml Carrierlösung + sekundärer Antikörper [in diesem Beispiel etwa Cy2-konjugiert anti-

Ratte aus Ziege [Cy2 GaR] (1:1000) und biotinylierter anti-Maus aus Ziege [bGaM] (1:500)] auf

dem Rüttler inkubieren

Ab diesem Zeitpunkt erfolgen alle weiteren Inkubationen abgeschirmt von Licht


60 min in TBS + Cy3-konjugiertes Streptavidin/Fluoreszin (1:1000)


aus dest. Wasser auf mit Glycerineiweiß - bestrichene Objektträger aufziehen

Lufttrocknen

1 min in Toluol inkubieren

mit DTX eindecken

10.5.2.3. Immunhistologische Färbung von 12 µm-Gehirnschnitten auf

Objektträgern

Im Allgemeinen erfolgte die Färbung analog des unter Abschnitt 10.5.2.2.2 beschriebenen Protokolls,

mit dem Unterschied, dass die Schnitte auf den Objektträgern zunächst für 10 min mit frisch ange-

setztem 4 %igen Paraformaldehyd fixiert wurden und anschließend kein „free-floating-Verfahren“ zur

Anwendung kam, sondern die Objektträger bis zum ersten Auftragen der Carrier-Lösung in Glas-

küvetten behandelt wurden und ab diesem Zeitpunkt in Kammern eingespannt wurden, um das

benötigte Volumen für die Antikörper möglichst gering zu halten.

Publikationen

210

11. PUBLIKATIONEN

Originalarbeiten BRÖER, S., D. ZOLKOWSKA, M. GERNERT und M. ROGAWSKI (2013).

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anticonvulsant in an acute seizure model.

8th FENS Forum of European Neuroscience, Barcelona; FENS Abstr. vol. 6, p060.12.

BRÖER, S. C., B. BACKOFEN-WEHRHAHN, F. ROLOFF, G. BICKER, M. BANKSTAHL, W.

LÖSCHER und M. GERNERT (2011).

Cell transplantation in experimental epilepsy - Identification of target regions and suitable cell sources

in an acute seizure model.

Abstract No 1.277, American Epilepsy Society Annual Meeting, Baltimore, www.aesnet.org.

http://www.aesnet.org/

http://www.aesnet.org/

Publikationen

211

BRÖER, S., B. BACKOFEN-WEHRHAHN, F. ROLOFF, G. BICKER, W. LÖSCHER und M.

GERNERT (2011).

Comparison of targets for neural transplantation in the basal ganglia and identification of suitable cell

sources in an acute seizure model.

Epilepsia 52, Issue Supplement s6: 159/p514.

BACKOFEN-WEHRHAHN, B., S. BRÖER, W. LÖSCHER und M. GERNERT (2011).

Microinjection of the GABA-enhancing drug vigabatrin in an acute seizure model as a strategy for

identifying targets for neural transplantation with GABA-producing cells.

Cell Transplantation 20:557.

BRÖER, S., B. BACKOFEN-WEHRHAHN, M. BANKSTAHL, W. LÖSCHER und M. GERNERT

(2011).

Anticonvulsant efficacy of systemic versus focal application of vigabatrin – Investigations in an acute

seizure model.

Neuroforum Februar 2011 (1) Volume XVII (Suppl.: Proceedings of the 9th Göttingen Meeting of the

German Neuroscience Society / 33rd Göttingen Neurobiology Conference): T11-8A.


Alterations in seizure threshold to the GABAA-receptor antagonist pentylenetetrazole after pilocarpine-

induced status epilepticus.

40th Annual Meeting Society for Neuroscience, San Diego, 350.2/K14.


Alterations in pentylenetetrazole seizure threshold after pilocarpine-induced status epilepticus. 7th

FENS Forum of European Neuroscience, Amsterdam; FENS Abstr., vol.5, 106.36.

Sonstige Vorträge BRÖER, S. (2012).

Auslandaufenthalt an der UC Davis, Kalifornien, wärend der Dissertation: Untersuchungen zur

Verwendung von Toxinen als Therapie für Epilepsie.

Pharmakologisches Kolloquium des Institutes für Pharmakologie, Pharmazie und Toxikologie der

TiHo Hannover, Hannover.

BRÖER, S. (2012).

Neurotransplantation gegen das Gewitter im Gehirn?

Doktorandenforum der Studienstiftung des Deutschen Volkes e.V., Bad Homburg.

BRÖER, S. (2012).

Fokale Therapie als Alternative bei pharmakoresistenter Epilepsie? Vergleich systemischer und

fokaler Applikation von Vigabatrin in einem akuten Anfallsmodell.

Wahlpflichteveranstaltung des Zentrums für canine Neurowissenschaften: Neurowissenschaften in der

Tiermedizin: Grundlagen und Klinik, Hannover.

BRÖER, S., BACKOFEN-WEHRHAHN, B., BANKSTAHL, M., GERNERT, M. und W.

LÖSCHER (2011).

Focal therapy as an alternative treatment in pharmacoresistant epilepsy? Comparison of systemic and

focal administration of vigabatrin in an acute seizure model.

4th Graduate School Day der HGNI, Bad Salzdetfurth.

Publikationen

212

BRÖER, S., B. BACKOFEN-WEHRHAHN, M. BANKSTAHL, W. LÖSCHER und M.

GERNERT (2011).

Fokale Therapie als Alternative bei pharmakoresistenter Epilepsie? Vergleich systemischer und

fokaler Injektion von Vigabatrin in einem akuten Anfallsmodell.

21. VetPharm-Symposium, Leipzig.

BACKOFEN-WEHRHAHN, B. und S. BRÖER (2010).

Neurotransplantation in epilepsy.

Jährliches Treffen der DFG-Forschergruppe „Neurodegeneration und –regeneration bei ZNS-

Erkrankungen des Hundes“ (FOR 1103), Hannover.

BRÖER, S. (2010).

Neurotransplantation bei Epilepsien – ein neuer Therapieansatz?

Pharmakologisches Kolloquium des Institutes für Pharmakologie, Pharmazie und Toxikologie der

TiHo Hannover, Hannover.

Sonstige Poster BRÖER, S., B. BACKOFEN-WEHRHAHN, G. BICKER, M. GERNERT und W. LÖSCHER (2012).

Focal therapy in experimental epilepsy – Identification of target regions and anticonvulsant efficacy in

an acute seizure model.

5th Graduate School Day der HGNI, Hannover.

BRÖER, S., B. BACKOFEN-WEHRHAHN, M. BANKSTAHL, W. LÖSCHER und M. GERNERT

(2011).

Microinjection of the GABA-enhancing drug vigabatrin in an acute seizure model as a strategy for

identifying targets for neural transplantation with GABA-producing cells.

First International Workshop of Veterinary Neuroscience, Hannover.

BACKOFEN-WEHRHAHN, B., S. BRÖER, F. ROLOFF, G. BICKER, M. GERNERT und W.

LÖSCHER (2011).

Comparison of different cell sources for neural transplantation into regions of the basal ganglia in

experimental epilepsy.

First International Workshop of Veterinary Neuroscience, Hannover.

BRÖER, S. und D. M. Noden (2007).

FGF8-mediated Control of Putative Muscle-Specific Transcription Factors.

2007 Merck-Merial-NIH National Veterinary Scholars Symposium, Bethesda, Maryland, USA.

Danksagung

213

12. DANKSAGUNG

Herrn Prof. Dr. Wolfgang Löscher gilt mein größter Dank für die freundliche Überlassung des

Themas, und die intensive fachliche Betreuung. Außerdem danke ich ihm für die Unterstüt-

zung meines Forschungsaufenthaltes an der UC Davis sowie der Teilnahme an zahlreichen

nationalen und internationalen Kongressen.

Außerdem danke ich Herrn Prof. Dr. Gerd Bicker und Herrn Prof. Dr. Konstantin Wewetzer

für die fachliche Supervision meiner Arbeit und eine nette, angenehme Atmosphäre während

unserer Treffen und der Zwischenprüfung.

Frau Prof. Dr. Manuela Gernert danke ich für die exzellente wissenschaftliche Betreuung und

Anleitung zum experimentellen Arbeiten, sowie für ihr ständig offenes Ohr für Versuchs-

ergebnisse aber auch auftretende Probleme. Des Weiteren danke ich ihr für die Hilfe bei der

Auswertung der EEG-Daten und die perfekte Korrektur zahlreicher Abstracts und

Manuskripte sowie der ersten Version dieser Arbeit, die sie aus psychologischen Gründen

nicht mit dem Rotstift durchführt.

Frau Dr. Bianca Backofen-Wehrhahn danke ich für für die Weitergabe ihrer vielfältigen

methodischen Fähigkeiten, vor allem für die geduldig wiederholten Erklärungen der Präpara-

tion der fetalen Hirnregionen, die sich dem ungeübten Beobachter manches Mal lediglich als

verschieden grau erscheinende Areale darstellten. Außerdem danke ich ihr für viele lustige

Stunden im Labor, die auch teilweise dadurch bedingt waren, dass manche Menschen

häufiger in ungewöhnliche Situationen verwickelt werden als andere…

Außerdem danke ich allen Kollegen und Praktikanten des Institutes für Pharmakologie, die

durch ihre Hilfe diese Arbeit erst möglich gemacht haben. Besonders Edith Kaczmarek,

Franziska Kaiser und Michael Weissing gilt mein Dank für zahlreiche Hilfestellungen.

Ebenso danke ich meinen Mitdoktoranden für eine angenehme Arbeitsatmosphäre, sowie für

die lustigen Stunden außerhalb des Institutes!

Danksagung

214

Zudem möchte mich bei Prof. Dr. Michael Rogawski für die freundliche Aufnahme in seiner

Arbeitsgruppe an der University of California Davis, sowie für die Freiheit mir selbst ein

spannendes Forschungsprojekt zu erarbeiten, bedanken. Des Weiteren danke ich Dorota

Zolkowska, Gregory Cooke und Jorge Sanchez für Ihre Hilfe bei der Durchführung meiner

Experimente in Kalifornien. Christoph Lossin half mir mit allen Formalien für einen

erfolgreichen Visumsantrag.

Vielen Dank auch meiner Familie und meinen Freunden, die mir immer unterstützend zur

Seite standen und stehen und gelegentlich auch mal einen Vortrag probehören durften bzw.

mussten. Besonders meine Eltern haben mir immer den Rücken freigehalten, um meine Ziele

zu verfolgen.

Ich danke meinem Freund Igor für seine liebevolle Unterstützung und seine wohlwollend und

doch kritische Durchsicht meiner Arbeit, in der er seine Aversion gegen simple und

verständliche Syntax für mich ein wenig gezügelt hat.

Zu guter Letzt danke ich der Studienstiftung des deutschen Volkes für die finanzielle und

ideelle Förderung, ohne die diese Arbeit nicht von mir hätte durchgeführt werden können und

der Forschergruppe „Neurodegeneration und –regeneration bei ZNS-Erkrankungen des

Hundes“ (FOR 1103) für die Finanzierung des Projektes und konstruktive Kritik und Anre-

gungen bei Versammlungen.

ISBN 978-3-86345-151-6

Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375

E-Mail: [email protected] · Internet: www.dvg.de

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