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Aus der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. S. G. Gatermann Untersuchung einer MALDI-TOF MS-basierten Speziesidentifizierung von Koagulase-negativen Staphylokokken im Vergleich zu molekularen Referenzmethoden und Entwicklung neuer Spezies- spezifischer Score-„cutoff“-Werte Publikationsbasierte Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät Der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Cindy Richter Luckau 2013

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Aus der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie

der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. S. G. Gatermann

Untersuchung einer MALDI-TOF MS-basierten

Speziesidentifizierung von Koagulase-negativen

Staphylokokken im Vergleich zu molekularen

Referenzmethoden und Entwicklung neuer Spezies-

spezifischer Score-„cutoff“-Werte

Publikationsbasierte

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin

einer

Hohen Medizinischen Fakultät

Der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Cindy Richter

Luckau

2013

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Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla

Referent: PD Dr. med. Florian Szabados

Korreferent: PD Dr. med. Wolfgang Cullmann

Tag der mündlichen Prüfung: 05.06.2014

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Abstract:

Cindy Richter

Untersuchung einer MALDI-TOF MS-basierten Speziesidentifizierung von Koagulase-negativen

Staphylokokken im Vergleich zu molekularen Referenzmethoden und Entwicklung Spezies-

spezifischer Score-„cutoff“-Werte

Problem: Vor einigen Jahren wurde Matrix-assisted laser desorption / ionization time of flight mass

spectrometry (MALDI-TOF MS) als Alternative zu herkömmlichen Verfahren für eine bakterielle

Spezies-Identifizierung vorgestellt. Wenige vorangegangene Publikationen beschrieben diese als

schnelle Methode für die bakterielle Identifizierung. Zu diesem Zeitpunkt gab es nur gering

publizierte Erfahrungswerte zur Identifizierungsgüte des Verfahrens im Allgemeinen. Insbesondere

die Identifizierung von Staphylokokken im Vergleich zu molekularen Referenzmethoden war bislang

noch nicht untersucht. Um dieses Ziel zu erreichen, sollte die Genauigkeit der MALDI Biotyper

Datenbank für die Identifizierung von Staphylokokken im Vergleich zu molekularen

Referenzmethoden evaluiert werden. Besonders der Score-Wert als Instrument zur Beurteilung der

Identifizierungsqualität sollte näher untersucht werden.

Methode:

Insgesamt wurden 697 in der Routinediagnostik isolierte Staphylokokken und 13 Referenzstämme

in diese Arbeit eingeschlossen. Als Referenz dienten molekulare Methoden. Die

Probenvorbereitung erfolgte mittels Ethanol/Ameisensäure-Extraktionsverfahren. Alle Isolate

wurden im Doppelansatz gemessen.

Ergebnis: Die Identifizierung auf dem Spezieslevel ergab eine Genauigkeit von 97,3% (1382/1420): 220 der

Doppelmessungen (15.49%) erreichten einen Score größer oder gleich 2,3; 968 (68,17%) zwischen

2,0 und 2,299; 194 (13,66%) kleiner als 2,0 und 30 Messungen (2,11%) generierten ein „no peaks

found“-Ergebnis. Das MALDI-TOF MS fehlidentifizierte 6 Messungen (0,42%), obwohl die zweite

der Doppelmessungen richtig identifiziert wurde. Bei der Verwendung des 20. Perzentils der Score-

Werte konnten Spezies-spezifische Score-Unterschiede festgestellt werden, sodass neue Score-

„cutoff“-Werte für die Identifizierung einzelner Spezies erarbeitet wurden.

Diskussion:

Die Staphylokokken-Identifizierung ist bei der Verwendung der MALDI Biotyper Datenbank im

Vergleich zu molekularen Referenzmethoden sehr genau. Um die Identifizierungsgüte des

Verfahrens weiter zu verbessern, wurden Spezies-spezifische Score-„cutoff“-Werte für

Staphylokokken definiert und evaluiert. Diese waren dem herkömmlichen

Identifizierungsalgorithmus in der Identifizierungsgenauigkeit, ohne vermehrt Fehlidentifizierungen

zuzulassen, überlegen.

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Meiner Familie in Dankbarkeit gewidmet.

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1

INHALTSVERZEICHNIS

1 Einleitung ............................................................................................... 3

1.1 Das Genus Staphylococcus ................................................................ 3

1.1.1 Koagulase-negative Staphylokokken .................................................. 3

1.1.2 Staphylococcus saprophyticus und Staphylococcus lugdunensis ...... 4

1.1.3 Bedeutung der Speziesidentifizierung ............................................. 6

1.1.4 Herkömmliche Identifizierung Koagulase negativer Staphylokokken . 7

1.2 Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization Time-of Flight

Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) ............................................ 9

1.2.1 Identifizierung von Bakterien mittels MALDI-TOF MS ...................... 11

1.2.2 Von der Idee zur klinischen Anwendung .......................................... 12

2 Zielsetzung .......................................................................................... 15

3 Ergebnisse ........................................................................................... 16

3.1 Studie zur MALDI-TOF MS-basierten Spezies-Identifizierung von

Staphylokokken ................................................................................ 16

3.2 Studie zu Spezies-spezifischen Score-„cutoff“-Werten bei der

Identifizierung von Staphylokokken .................................................. 17

4 Diskussion ........................................................................................... 22

5 Literaturverzeichnis ............................................................................. 28

Danksagung

Lebenslauf

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2

Abkürzungsverzeichnis

Aas Hämagglutinin-Autolysin-Adhäsin

ClfA Clumping-factor A

DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen

ESI Elektrospray Ionisierung

Fbl Fibrinogen-bindendes Adhäsin

GP grampositiv

KoNS Koagulase-negative Staphylokokken

KoPS Koagulase-positive Staphylokokken

MALDI-TOF MS Matrix-assisted laser desorption / ionization time-of

-flight mass spectrometry

MRSA Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus

min. Minute(n)

Nr. Nummer

PCR Polymerase-Kettenreaktion

PCR-RFLP PCR-Restriktionslängen-Polymorphismus

PSM Phenol-lösliches Modulin

rDNA ribosomale Desoxyribonukleinsäure

rRNA ribosomale Ribonukleinsäure

SdrI Kollagen-bindendes Protein

SLUSH Staphylococcus lugdunensis synergistisches

Hämolysin

Ssp Oberflächen-assoziierte Lipase

ssp. Subspezies

Std. Stunden

UafA Urothel-Adhäsions-Faktor A

UafB Urothel-Adhäsions-Faktor B

z.B. zum Beispiel

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1 Einleitung

1.1 Das Genus Staphylococcus

Die Gattung Staphylococcus wird zusammen mit den Gattungen Gemella,

Jeotgilgalicoccus, Macrococcus und Salinicoccus zur Familie der

Staphylococcaceae gezählt. Sie umfasst mindestens 49 wissenschaftlich

untersuchte Spezies [16, 57, 77, 101], von denen sich wiederum 10 in 21

Subspezies unterteilen lassen [56, 83]. Staphylokokken werden als

grampositive, nicht sporenbildende Kokken beschrieben, die eine positive

Katalasereaktion und einen fakultativ anaeroben Stoffwechsel aufweisen.

Traditionell wurde Staphylococcus aureus als potenziell humanpathogener

Keim mittels der Plasmakoagulase von den anscheinend weniger

pathogenen Koagulase-negativen Staphylokokken (KoNS) abgegrenzt.

Neben S. aureus können auch Staphylococcus delphini, Staphylococcus

intermedius, Staphylococcus lutrae, Staphylococcus pseudintermedius

und Staphylococcus schleiferi eine Koagulase positive Reaktion zeigen.

S. pseudintermedius wurde lange Zeit fehlidentifiziert und erst vor kurzem

von S. intermedius abgegrenzt [109]. Beide Spezies sind als Enterotoxin

produzierende Krankheitserreger bei Hunden und Katzen beschrieben

[58].

1.1.1 Koagulase-negative Staphylokokken

Die Gruppe der KoNS wurde lange Zeit als nicht humanpathogene

Kommensalen der Haut und Mukosa beschrieben. Zunehmend stellten

sich diese Erreger jedoch als ernst zunehmende Krankheitserreger heraus

[48]. KoNS sind die wichtigsten Pathogene bei nosokomialen Infektionen

der Blutbahn auf Intensivstationen und bei Knochenmarktransplantationen

[106], sowie bei Infektionen mit vaskulären Kathetern und

Kunststoffprothesen [83]. Wurden die „late-onset“ Sepsis und nosokomiale

Infektionen bei Neugeborenen vor 1980 im Wesentlichen durch S. aureus

und Enterobacteriaceae verursacht, so wurden in den letzten Jahrzehnten

vorwiegend KoNS nachgewiesen [40]. Unter den KoNS sind insbesondere

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Staphylococcus epidermidis [24, 76, 99], Staphylococcus haemolyticus

[69], Staphylococcus lugdunensis [29, 83] und Staphylococcus

saprophyticus als humanpathogene Infektionserreger beschrieben [33, 43,

88]. Als opportunistische Krankheitserreger wurden

Staphylococcus capitis [80], Staphylococcus cohnii [26],

Staphylococcus hominis [45], Staphylococcus saccharolyticus [107],

Staphylococcus simulans [65], Staphylococcus warneri [62] und

Staphylococcus xylosus [15] gewertet.

Viele KoNS produzieren mögliche Pathogenitätsfaktoren wie die DNAse,

Lipase und Esterase, sowie Toxine wie das α-und δ-Hämolysin [55, 93].

Vasconcelos et al. [102] beschrieb 2011 erstmals die Produktion der

Enterotoxine E, G, H und I in S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis,

S. simulans, S. lugdunensis und S. warneri.

1.1.2 Staphylococcus saprophyticus und Staphylococcus lugdunensis

Nachfolgend werden Vorkommen und Pathogenitätsfaktoren zu den

Spezies S. saprophyticus und S. lugdunensis, als häufige

humanpathogene Krankheitserreger, näher beschrieben.

Staphylococcus saprophyticus Torres Periera berichtete 1962 erstmals die Isolation eines KoNS bei

einem akuten Harnwegsinfekt einer Frau, der später als S. saprophyticus

neu klassifiziert wurde [97]. S. saprophyticus kann nach Escherichia coli

die zweithäufigste Ursache eines ambulant erworbenen Harnwegsinfekts

im Kollektiv junger Frauen sein [43]. Andere Studien bestätigen diese

hohe Prävalenz in dieser Altersgruppe nicht [23, 47]. Besonders junge

sexuell aktive Frauen sind durch eine häufig perianale Besiedlung

betroffen [84]. Fast jede dritte Frau leidet bis zu ihrem 25. Lebensjahr an

einem klinisch diagnostizierten Harnwegsinfekt und mindestens die Hälfte

aller Frauen ist ein Mal im Leben von einem Harnwegsinfekt betroffen,

was enorme Kosten für das Gesundheitssystem erzeugt [28]. Durch

S. saprophyticus werden in der Regel unkomplizierte Harnwegsinfektionen

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verursacht, gelegentlich treten auch Komplikationen wie eine akute

Pyelonephritis [33] und Nephrolithiasis [27] auf. Es sind sogar Fälle von

schweren septischen Verläufen [33] und Endokarditis [88] beschrieben.

Die Pathogenität dieses Organismus kann durch eine Vielzahl von

Virulenzfaktoren erklärt werden. Die Urease führt zu einer effizienten

Besiedlung mit Entzündungsreaktion von Blase und Nieren [31]. Des

Weiteren wurde für S. saprophyticus eine Oberflächen-assoziierte Lipase

(Ssp) beschrieben [85], deren Bedeutung bis heute nicht klar erwiesen ist.

Jedoch weiß man, dass Lipasen im S. aureus als Pathogenitätsfaktor

eine wichtige Rolle bei lokalen Infektionen wie Abszessen und Furunkeln

besitzen [38]. Darüber hinaus konnte die Produktion von Lipasen bei

Entzündungsreaktionen in einem Mausmodell für S. aureus bewiesen

werden [64]. Kline et al. [51] zeigten darüber hinaus mit einem

Mausmodell, dass Ssp und das Kollagen-bindende Protein SdrI für die

Persistenz des S. saprophyticus während einer Harnwegsinfektion

ursächlich sein könnten. Dieses Bakterium besitzt eine Reihe von

oberflächen- und zellwandassoziierter möglicher Pathogenitätsfaktoren,

die an Matrixproteine wie Fibronektin und Kollagen binden, wodurch die

Adhärenz und die Invasion des Erregers in epitheliale Zellen ermöglicht

werden. Hierzu zählen Aas, ein zellwandgebundenes Hämagglutinin-

Autolysin-Adhäsin [39] und SdrI [70], sowie die zellwandständigen

Proteine Urothel-Adhäsions-Faktor A (UafA) mit positiver

Hämagglutination [53] und der Urothel-Adhäsions-Faktor B (UafB) [50].

Staphylococcus lugdunensis S. lugdunensis wurde erstmals 1988 in Lyon charakterisiert [30]. In den

letzten zwei Jahrzehnten wurde er als Erreger von Haut- und

Weichteilinfektionen, sowie potentiell tödlich verlaufenden Endokarditiden

beschrieben [29, 78]. Diese sind in der Schwere mit einer S. aureus

Infektion zu vergleichen. Als mögliche Virulenzfaktoren wurden bislang in

wenigen Studien Adhäsine, wie das Fibrinogen-bindende Adhäsin (Fbl)

[66, 74] und das von-Willebrand-Faktor-bindende Protein [75], untersucht.

Diese Pathogenitätsfaktoren weisen eine große Homologie zum

Fibrinogen-bindenden Clumping factor A (ClfA) [32] und Protein A [36] des

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S. aureus auf. So verwundert es nicht, dass viele Infektionen für

S. lugdunensis beobachtet werden, die denen von S. aureus gleichen, wie

Osteomyelitis [95], Protheseninfektionen [91], Sepsis [13], komplizierte

Infektionen der Haut und Weichteilgewebe besonders nach chirurgischen

Eingriffen [100], akute nekrotisierende Sinusitis [68] und Infektionen des

zentralen Nervensystems [29]. Erst durch verbesserte

Identifizierungsstrategien wurde gezeigt, dass S. lugdunensis in der

Vergangenheit oft nicht richtig identifiziert werden konnte.

Mögliche Pathogenitätsfaktoren wie Lipasen [55] und Hämolysine [18]

konnten ebenfalls nachgewiesen werden. Bestimmte Hämolysin-(SLUSH)-

Proteine des S. lugdunensis, die zur Gruppe der Phenol-lösliche Moduline

(PSM) gehören, besitzen eine immunmodulatorische Wirkung und zeigen

in 32% eine Homologie zu einem Teil der Hauptdomäne des SipB

Invasionsproteins von Salmonella enterica [81]. Woraus sich eine

mögliche Funktion der PSM als Invasine ableiten lässt.

1.1.3 Bedeutung der Speziesidentifizierung

Staphylokokken sind ein physiologischer Bestandteil der Hautflora, ferner

verursachen Sie aber als opportunistische und invasive Pathogene die

verschiedensten Infektionen des Menschen. Um bei besonders

gefährdeten Patienten wie Neugeborenen, Menschen mit

Protheseninfektionen, intravaskulären Kathetern, Wundinfektionen und

Immunsupprimierten wirksame Therapien anzuwenden, ist eine

Speziesdifferenzierung aus verschiedenen Probenmaterialen sinnvoll.

Kann aus verschiedenen Untersuchungsmaterialen die gleiche Spezies

nachgewiesen werden, so ist eine Infektion durch diesen Erreger sehr

wahrscheinlich und die Therapie kann mit Bedacht der natürlichen

Antibiotikaresistenzen zeitnah gezielt angepasst werden [72]. Dagegen

weist der Nachweis unterschiedlicher Staphylokokkenspezies häufig auf

eine Kontaminierung der Proben durch Bakterien der Hautflora hin. Aus

der Gruppe der KoNS sind beispielsweise S. saprophyticus und

S. lugdunensis eher selten resistent. Akute unkomplizierte

Harnwegsinfekte werden aus diesem Grund häufig mit Co-trimoxazol,

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Trimethoprim und Chinolonen behandelt. S. haemolyticus hingegen ist

häufig multiresistent. In Studien der Paul-Ehrlich-Gesellschaft aus dem

Jahr 2001 waren die untersuchten Isolate zu mehr als 70% resistent

gegen ß-Lactam-Antibiotika, Makrolide und Chinolone. Sicher wirksame

Chemotherapeutika waren hingegen Vancomycin, Linezolid und die

Streptogramin-Kombination Quinupristin/Dalfopristin.

1.1.4 Herkömmliche Identifizierung Koagulase negativer Staphylokokken

Die kulturelle Anzucht der Erreger auf zum Beispiel Blutagarplatten ist

eine wichtige Voraussetzung für eine Bakterienidentifizierung. Aufgrund

der Koloniemorphologie und dem Ergebnis einfacher Untersuchungen wie

der Katalase-, Oxidase- und Koagulase-Reaktion kann das Genus als

wahrscheinlich angenommen werden. Daraufhin wird anschließend eine

vereinfachte Staphylokokken-Differenzierung vorgenommen. Die

Staphylokokken-Differenzierung nach Kloos und Schleifer [52] basiert auf

folgenden 13 Schlüsselreaktionen: Koagulase-Reaktion, Hämolyse,

Nitratabbau, anaerobe Säureproduktion aus Fructose, Xylose, Arabinose,

Ribose, Maltose, Lactose, Sucrose, Trehalose, Mannitol und Xylitol

(Abb. 1). Nach Kloos und Schleifer wird zuerst in Koagulase-positive

Staphylokokken (KoPS), meist S. aureus, und Koagulase-negative

Staphylokokken (KoNS) unterschieden. Die Differenzierung der KoNS

erfolgt durch eine Reihe weiterer biochemischer Reaktionen, welche in

Abbildung 1 ersichtlich sind. Eine besonders starke Hämolyse-Aktivität

auf Blutagar von Rind oder Mensch ist beispielsweise charakteristisch für

S. haemolyticus. Eine Hämolyse mit einem geringeren Hämolysehof weist

hingegen auf das Vorliegen der Spezies S. simulans, S. epidermidis oder

S. capitis hin. Mit der vereinfachten Staphylokokkenidentifizierung nach

Kloos und Schleifer von 1975 können die KoNS-Spezies S. capitis,

S. haemolyticus, S. cohnii, S. epidermidis, S. hominis, S. saprophyticus,

S. simulans und S. xylosus unterschieden werden.

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Abbildung 1: Vereinfachte Staphylokokkenidentifizierung nach Kloos & Schleifer 1975 (+ = Reaktion positiv, +/- = variables Reaktionsergebnis, - = Reaktion negativ)

Diese Differenzierungsmethode wurde inzwischen in den Laboren durch

kommerzielle meist automatisierte Identifizierungssysteme wie das API

STAPH (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankreich) oder das VITEK-2

(bioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankreich) abgelöst. Diese Systeme testen je

nach Hersteller eine unterschiedliche Anzahl biochemischer Reaktionen

wie Enzymausstattung und Substratverstoffwechselung. Diese Reaktionen

benötigen jedoch Zeit, bis sie zu einem verwertbaren Ergebnis führen. Die

durchschnittliche Identifizierungszeit für das API STAPH liegt bei 12-

24 Std. und für das VITEK-2 bei 5-12 Std. für die aktuelle Identifizierungs-

Karte, abhängig vom Reaktionsprofil der Spezies. Zudem werden von

mindestens 49 Staphylokokkenspezies nur 21 durch das API STAPH und

26 (davon zwei Subspezies) durch das VITEK-2 (bioMérieux, GP-

Produktinformationen 2008) erkannt [7], sodass deren Genauigkeit stark

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von der zu identifizierenden Spezies abhängt [60, 63]. Keine oder

Fehlidentifizierungen von selteneren Spezies sind somit keine Seltenheit

[4, 8, 71]. Molekularbiologische Methoden wie die Spezies-spezifische-

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) [67] können ebenfalls eingesetzt

werden und sind als Referenzmethode etabliert. Der PCR-

Restriktionslängen-Polymorphismus (PCR-RFLP) nach Hauschild et al.

[37] ist ebenfalls eine molekulare Referenzmethode zur

Speziesidentifizierung. Hierbei werden PCR-Produkte des gleichen

Primers mit Restriktionsenzymen versetzt, die je nach Spezies

unterschiedliche Produkte liefern. Die höchste Güte weisen die

Amplifikation und Sequenzierung der 16S rDNA [82] oder anderer Gene

wie sodA [79] und rpoB [19] auf. Eine speziesspezifische PCR ist mit

einem Zeitaufwand von ca. 3-4 Std. deutlich schneller als automatisierte

Identifizierungssysteme, deren Vorteil dagegen in einem wesentlich

geringeren Preis liegt. Für den RFLP verlängert sich die Diagnostik nach

der speziesunspezifischen PCR um noch einmal 3-4 Std. Sequenzbasierte

Methoden werden hingegen in der Routinediagnostik aufgrund eines

zeitlichen Aufwand von 3 bis 5 Tagen kaum eingesetzt. Sie gelten aber als

akzeptierte Referenzmethode.

Wo herkömmliche Identifizierungsmethoden an ihre Grenzen stoßen, sind

neue und innovative Methoden wie das MALDI-TOF MS gefragt. Eine

Vielzahl von Anwendungsstudien bestätigen die schnellere und

kostengünstigere mikrobiologische Identifizierung durch das MALDI-

TOF MS gegenüber herkömmlichen biochemischen und molekularen

Referenzmethoden [10, 73, 87].

1.2 Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization Time-of Flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS)

Die Geschichte der Massenspektrometrie beginnt im Jahr 1899, in dem

J. Thomson die ersten Experimente zur Massenspektrometrie

veröffentlichte [96]. Durch die Einführung und Etablierung von

Ionisierungstechniken wie der Elektrospray Ionisierung (ESI) und der

Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) wurde die

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Massenspektrometrie zum Ende der 1980er Jahre zur wichtigsten

Analysemethode in der Proteomforschung.

In Abbildung 2 ist ein schematischer Aufbau des MALDI-TOF MS

abgebildet. MALDI bedeutet, dass die in Matrix eingebettete

Analysenprobe durch Laserbeschuss angeregt wird. Anschließend gehen

die Proben- und Matrixmoleküle durch eine Art lokale Mikroexplosion in

die Gasphase über. Eine an den Probenteller angelegt Spannung und

Stoßprozesse in der sich entwickelnden Gaswolke bewirken die

Ionisierung eines Teils der Moleküle. Durch eine

Beschleunigungsspannung, welche nach dem Laserimpuls angeschaltet

wird, werden die Ionen in einer Röhre in Richtung des Detektors

beschleunigt. Diese Ergänzung der Anordnung wird als

Massenanalysegerät (Time-of-Flight = TOF) bezeichnet, welche die

Auftrennung der Teilchen entsprechend ihrer individuellen

Masse/Ladungs-Verhältnisse (m/z) ermöglicht. Die kinetische Energie aller

Ionen mit gleicher Ladung ist nach der Beschleunigung gleich, sodass ihre

Geschwindigkeit nur von ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) abhängt.

Wobei das Verhältnis von Molekülmasse und Ladung proportional zu dem

Quadrat der Flugzeit ist [25]. Ein Detektor erstellt anschließend ein

Massenspektrum (MS), welches mit einer Datenbank abgeglichen wird

und zur Identifizierung der Probe führt. Durch diese Technik kann sehr

genau die Masse von großen und labilen Molekülen bestimmt werden.

Abbildung 2: Funktionsweise des MALDI-TOF MS (mit Genehmigung von Bruker Daltonics)

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1.2.1 Identifizierung von Bakterien mittels MALDI-TOF MS

Das MALDI-TOF MS zur mikrobiologischen Identifizierung arbeitet mit

extrahierten Proteinlysaten intakter Bakterien. Um diese zu gewinnen,

müssen Bakterienkolonien ebenfalls auf Blutagarplatten über Nacht

angezüchtet werden. Anschließend werden die Proben der Bakterien nach

einem Ethanol/Ameisensäure-Extraktionsprotokoll aufgeschlossen

(Extraktionsverfahren) oder mit einem Holzspatel direkt auf das Target

aufgetragen (Direktauftrag). Die 96 Analysefelder des Targets werden,

nachdem die Bakterienproben getrocknet sind, mit einer Matrix

überzogen. Anschließend kann die Messung im MALDI-TOF MS erfolgen.

In einem Vakuum erfolgt die Verdampfung der Matrix durch

Laserbeschuss der Analysefelder, wobei ebenfalls Proteine der zu

untersuchenden Isolate ionisiert werden (Abb. 2). Diese Ionen werden in

einem elektrischen Feld mit einer Spannung von ca. 20 kV beschleunigt.

Aus der Flugzeit und dem Ionisierungsgrad errechnet das Flexcontrol 3.0

Masse und Geschwindigkeit der einzelnen Teilchen. Durch das

Zusammenfügen von allen berechneten Teilchenmassen entsteht ein

Gesamtmassenspektrum, welches bei einem Masse-Ladungs-Verhältnis

(m/z) von 3.000 – 15.000 Da für die Identifizierung der Mikroorganismen

verwendet wird. Jede Bakterienspezies besitzt ein spezifisches Spektrum,

welches aus 25 wiederholt gemessenen Spektren als Summenspektrum

errechnet wird. Dieses Summenspektrum wird mit der Biotyper 2.0

Datenbank (Bruker Daltonics) abgeglichen und führt zur Identifizierung

des Isolats (Abb. 3) [7].

Abbildung 3: Peakprofil eines Staphylococcus lugdunensis

Der Score-Wert beschreibt die Übereinstimmung des Peakprofils in der

MALDI Biotyper 2.0 Datenbank mit dem ermittelten Profil des Isolats. Die

Scores 0 – 3 wurden aus dem 10er Logarithmus der Werte 1 – 1 000

errechnet. Jedoch ist der Algorithmus, nach dem die Software diese Werte

ermittelt, nicht bekannt.

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Die Scores wurden nach dem Hersteller Bruker Daltonics in ihrer

Wertigkeit folgendermaßen klassifiziert:

3,000 – 2,300 = sehr hohe Wahrscheinlichkeit der Speziesidentifizierung

2,299 – 2,000 = sichere Genus- und wahrscheinliche Speziesidentifizierung

1,999 – 1,700 = wahrscheinliche Genusidentifizierung

1,699 – 0 = keine zuverlässige Speziesidentifizierung

1.2.2 Von der Idee zur klinischen Anwendung

1975 beschrieb Anhalt et al. erstmals die Identifizierung von Bakterien

mittels Massenspektrometrie [3]. Diese Versuche litten jedoch unter

mangelnder Reproduzierbarkeit der Spektren aufgrund der Varianz bei

Wachstumsbedingungen und Medien. Mit der Entwicklung des MALDI-

TOF MS in den 1980er Jahren wurde die Analyse vergleichsweise großer

Biomoleküle, ribosomale Proteine eingeschlossen, möglich [41]. Weitere

Studien zu diesem Thema folgten jedoch erst im Jahr 1996 [14, 42]. Die

Schwierigkeit bestand vor allem darin, dass nicht alle Proteine

gleichermaßen Energie und Ladung von der Matrix übernehmen und somit

das Peakprofil nur einen kleinen Teil des Proteoms des Bakteriums

abbildet. Viele der ursprünglich gewählten Massenbereiche waren in

erheblichem Maße von Umgebungsbedingungen abhängig [5], somit

ließen sich Peakprofile nicht immer reproduzieren und führten zu

diskrepanten Ergebnissen. Ebenso galt es, besonders kleine und leicht zu

ionisierende Proteine als Fehlerquellen zu umgehen. Die Austestung

unterschiedlicher Substanzen als Matrix und ein Massenbereich von 3.000

– 15.000 Da ermöglichten schließlich die Ionisierung von vorwiegend

ribosomalen Proteinen. Diese unterliegen im Gegensatz zu

Oberflächenproteinen weniger den äußeren Einflüssen und verbesserten

die Reproduzierbarkeit erheblich [90]. Ein weiterer Ansatz war die

Modifizierung der Probenvorbereitung. Um Proteinlysate für die

Messungen zu gewinnen stehen mittlerweile zwei evaluierte Verfahren zur

Auswahl: das Extraktionsverfahren und der Direktauftrag [1]. Des

Weiteren wurden drei unterschiedliche Typen von Targets entwickelt:

„polished steel“, „ground steel“ und AnchorChip® Targets. In der

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klinischen Routine am häufigsten verwendet wird das konventionelle

„polished steel“ Target. Für das „ground steel“ Target wird ein verstärktes

Schmierphänomen beschrieben [6]. Durch den geringen Abstand der

Messfelder auf den Targets können die Proben der Felder sich mischen,

wenn zu viel Probenmaterial oder Matrix aufgetragen wird. AnchorChip®

Targets haben durch den hydrophilen Anker in einer hydrophoben

Umgebung ein deutlich vermindertes Schmierphänomen, wodurch

Kreuzkontaminationen besser verhindert werden können als bei

konventionellen Targets. Diese sind aber kostenintensiver [34].

Von den ersten Studien bis zum Einsatz in den Laboren der klinischen

Mikrobiologie vergingen letztendlich Jahre [6, 87], was mitunter den

vergleichsweise teuren Anschaffungskosten geschuldet war. Um diese

Technik für die klinische Anwendung nutzbar zu machen, wurden wenige

kommerzielle und nicht-kommerzielle Datenbanken mit Referenzspektren

relevanter Mikroorganismen erstellt [9, 87]. Die wesentlichen Unterschiede

dieser Datenbanken bestanden im Massenbereich der Datenbankeinträge

und der Anzahl der Referenzspektren pro Spezies. Die ersten Firmen, die

Komplettsysteme für die medizinisch-mikrobiologische Diagnostik

anboten, waren AnagnosTec und Bruker Daltonics. Diese Systeme

unterscheiden sich in der zugehörigen Software und den entsprechenden

Datenbanken. Von der Firma BioMérieux wird die Software Saramis

(ursprünglich AnagnosTec) und von Bruker Daltonics der MALDI Biotyper

2.0 (aktuell 3.0) vertrieben. Als Maß für die Qualität der Identifizierung mit

der Biotyper-Datenbank wurde ein Score-Wert festgelegt, welcher unter

1.2.1 genauer beschrieben ist. Bis zum heutigen Zeitpunkt ist nicht

eindeutig offengelegt, wie dieser Score-Wert von der Software des MALDI

Biotyper berechnet wird. Um diese Technik weiterhin zu verbessern, sind

Evaluationsstudien unverzichtbar. Die MALDI Biotyper 2.0 Datenbank

wurde in vorherigen Veröffentlichungen als sehr genau beschrieben [6, 35,

73, 87]. Viele der vorangegangene Studien variierten jedoch in der

Probenvorbereitung, den verwendeten Targettypen, der Anzahl der

getesteten Isolate, den verwendeten Spektren um ein Summenspektrum

zu erzeugen und den durchgeführten Wiederholungen. Insbesondere die

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14

Grenzwerte der Scores, welche von besonderer Bedeutung für die

Genauigkeit der Speziesidentifizierung sind, wurden nicht immer nach den

Empfehlungen des Herstellers angewendet [6, 11, 20, 35, 73]. Bei allen

vorhergehenden Studien legte man dennoch die gleichen Score-„cutoff“-

Werte für alle untersuchten Spezies an. Nur Szabados et al.

veröffentlichte 2012 eine Studie, in der Spezies-spezifische

Scoreunterschiede für klinisch relevante Bakterien, darunter auch eine

geringe Anzahl von Staphylokokken, beschrieben wurden [94]. Hier setzt

unsere Studie mit der Evaluation des MALDI Biotyper 2.0 und der

zugehörige Datenbank V2.0.4.0 von Bruker Daltonics zu Spezies-

spezifischen Score-„cutoff“-Werten bei der Identifizierung von

Staphylokokken an.

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15

2 Zielsetzung

Die bisherigen Veröffentlichungen beschreiben das MALDI-TOF MS bei

der Verwendung der MALDI Biotyper Datenbank als eine schnelle und

kostengünstige Methode in der Mikrobiologischen Diagnostik. Um die

Genauigkeit des MALDI Biotyper 2.0 in der Speziesidentifizierung von

KoNS zu testen, sollte im ersten Schritt die Identifizierungsgüte im

Vergleich zu anerkannten molekularen Referenzmethoden bei KoNS

ermittelt werden. Um Limitationen des Verfahrens aufzuzeigen, sollte

weiterführend die Reproduzierbarkeit der Messungen anhand von

Referenzisolaten zu den Datenbankeinträgen getestet werden. Um die

Identifizierung von Staphylokokken zu verbessern, sollten Spezies-

spezifischen Score-Werte untersucht und Spezies-spezifische Score-

„cutoff“-Werte festgelegt werden.

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16

3 Ergebnisse

3.1 Studie zur MALDI-TOF MS-basierten Spezies-Identifizierung von Staphylokokken

Nachfolgend wird die Publikation „Identification of molecularly defined

Staphylococcus aureus strains using matrix-assisted laser

desorption/ionization time of flight mass spectrometry and the Biotyper 2.0

database” (A2) für die Identifizierung von KoNS zusammengefasst. Die

Fragestellung der S. aureus Identifizierung wurde von Herrn Jaroslaw

Woloszyn bearbeitet und zählt nicht zu meiner Dissertation.

Um den MALDI Biotyper 2.0 in der täglichen Diagnostik einzusetzen,

führten wir eine der größten Evaluationsstudien mit 1014 molekular

charakterisierte Staphylokokken-Stämme, davon 602 S. aureus und 412

KoNS, durch. Drei vorausgegangene Studien, welche sich mit der

Identifizierung von Staphylokokken Isolaten mittels MALDI-TOF MS

beschäftigten, divergierten im Studiendesign stark. So wurde der Eindruck

erweckt, dass die Genauigkeit des MALDI-TOF MS von der verwendeten

Datenbank, sowie von dem für die Identifizierung verwendeten

Algorithmus abhängt. Das für den Peak-Abgleich ausgewählte Masse-

Ladungs-Verhältnis zwischen Datenbank und gemessenem

Gesamtspektrum variierte ebenfalls. Um die Genauigkeit des MALDI

Biotyper 2.0 für die Identifizierung von Staphylokokken zu evaluieren, war

eine neue Studie unter klar definierten Bedingungen erforderlich.

Alle Stämme der Koagulase-negativen Staphylokokken wurden primär

durch das Vitek-2-System (bioMérieux) identifiziert und nachfolgend bei

diskrepanten Ergebnissen molekularbiologisch mittels Spezies-

spezifischer PCR, PCR-Restriktionslängen-Polymorphismus, sodA oder

rpoB Sequenzierung getestet. Für die Identifizierung mit dem MALDI-TOF

MS erfolgte die Probenvorbereitung nach dem Ethanol/Ameisensäure-

Extraktionsverfahren. Alle Isolate wurden in Doppelmessungen

charakterisiert. Für den Abgleich der Peakprofile wurde ein Masse-

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17

Ladungs-Verhältnis von 3.000 – 15.000 Da ausgewählt, welches

hauptsächlich ribosomale Proteinpeaks abbilden sollte. Zur Auswertung

wurde jeweils der höchste Score-Wert verwendet. Die Grenzwerte für die

ermittelten Scores zur Beurteilung der Identifizierungsgüte wurden nach

den Vorschriften des Herstellers angelegt.

Für 412 eingeschlossene KoNS Isolate wurde eine Genauigkeit von 100%

auf dem Spezieslevel bei der MALDI-TOF MS basierten Identifizierung

erreicht. Mit einer durchschnittlichen Arbeitszeit von 22 min. war das

MALDI-TOF MS deutlich schneller als die Referenzmethoden.

3.2 Studie zu Spezies-spezifischen Score-„cutoff“-Werten bei der Identifizierung von Staphylokokken

Es folgt eine Zusammenfassung meiner Veröffentlichung „Evaluation of

species-specific score cut-off values for various Staphylococcus species

using a MALDI Biotyper-based identification“ (A1) für KoNS. Die

Evaluation der Identifizierung von S. aureus Isolaten wurde ebenfalls

durch Herrn Jaroslaw Woloszyn durchgeführt und wird hier nicht

beschrieben.

Diese Studie war die erste, die Spezies-spezifische Scoreunterschiede für

Staphylokokken bei der Anwendung des Biotyper 2.0 untersucht hat.

Vorangegangene Studien zeigten, dass für die Grenzwerte des Herstellers

nicht alle Spezies gleich gut identifiziert werden konnten [9, 87]. Doch

legten alle vorhergehenden Studien die gleichen Grenzwerte für alle

untersuchten Spezies an. Nur Szabados et al. [94] veröffentlichte 2012

eine Studie, in der Spezies-spezifische Scoreunterschiede für klinisch

relevante Bakterien, darunter auch eine geringe Anzahl von

Staphylokokken, beschrieben wurden.

Es wurden insgesamt 710 Staphylokokken-Isolate, darunter 592 KoNS,

105 S. aureus und 13 Referenzstämme, nach dem

Ethanol/Ameisensäure-Extraktionsverfahren aufgereinigt und mit dem

Biotyper 2.0 des MALDI-TOF MS identifiziert. Jedes Isolat wurde in

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18

Doppelmessungen aus dem selben Extraktionsmaterial bestimmt. Um

neue Score-„cutoff“-Werte zu implementieren, wurden alle richtig

identifizierten Messungen in die Studie einbezogen, auch wenn der Score-

Wert unter 1,7 lag. Wurde eine der Doppelmessungen falsch identifiziert,

wurde diese als Fehlmessung und die andere als richtige Identifizierung

gewertet. Die Evaluation der MALDI-TOF MS-basierten KoNS-

Identifizierung erfolgte ebenfalls im Vergleich zum Vitek-2-System und zu

molekularen Referenzmethoden, wie unter 2.1 beschrieben.

Weiterführend wurde die Reproduzierbarkeit der Messungen anhand von

Referenzisolaten der Datenbank getestet. Die Spezies-spezifischen

Score-„cutoff“-Werte wurden mit Hilfe des 20. Perzentils festgelegt,

sodass 80% der ermittelten Score-Werte über dem Grenzwert lagen.

Mit einer Genauigkeit von 97,68 % (1387/1420) auf dem Genuslevel und

97,32 % (1382/1420) auf dem Spezieslevel bei der Identifizierung von 710

Staphylokokken-Isolaten, in Doppelmessungen (n=1420), erreichten nach

den Herstellerkriterien 220 Messungen (15,49 %) einen Score ≥ 2,3; 968

(68,17 %) Messungen einen Score ≥ 2,0 und < 2,3; und 194 Messungen

(13,66 %) blieben < 2,0. Bei 2,25 % der Messungen (32/1420) konnten

keine Peaks gefunden werden, obwohl die zweite Messung aus dem

gleichen Extraktionsmaterial richtig identifiziert worden war. Eine der

Doppelmessungen lieferte in 0,42 % (6/1420) eine falsche Identifizierung,

obwohl die zweite Messung eine richtige Identifizierung ergab. Die

Fehlidentifizierungen betrafen vier Isolate des S. saprophyticus, welche

als Staphylococcus equorum (Score: 1,687), Staphylococcus

piscifermentans (2,040), S. xylosus (1,842) und Pseudomonas balearica

(1,318) fehlidentifiziert wurden. Das einzige Isolat des

Staphylococcus carnosus wurde ein Mal als S. piscifermentans (1,767)

und ein Isolat des S. cohnii als S. xylosus (1,842) fehlidentifiziert. Eine

Zusammenfassung der Ergebnisse ist in Tabelle 1 ersichtlich.

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Tabelle 1: MALDI-TOF MS basierte Identifizierung von Staphylokokken im Vergleich zu biochemischen und molekularen Referenzmethoden

Anzahl Referenz-

identifizierung MALDI-TOF MS in Doppelmessungen

Stap

hylo

cocc

us s

peci

es

Rou

tinei

sola

te

Ref

eren

zsta

mm

Spez

iess

pezi

fisch

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peak

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und

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der

Feh

l-id

entif

izie

rung

Scor

e

S. arlettae 1 0 1 1 2/2 2/2 0

S. aureus 105 0 105 105 209/210 209/210 1

S. capitis 22 0 1 22 40/44 40/44 4

S. caprae 3 1 0 3 7/8 7/8 1

S. carnosus 1 0 1 1 2/2 1/2 0 S. piscifermentans 1,767

S. chromogenes 2 0 0 2 3/4 3/4 1

S. cohnii 7 1 1 7 16/16 15/16 0 S. xylosus 1,509

S. epidermidis 59 1 5 59 116/120 116/120 4

S. haemolyticus 41 1 41 41 82/84 82/84 2

S. hominis 37 1 16 37 75/76 75/76 1

S. hyicus 0 1 0 0 2/2 2/2 0

S. intermedius 2 1 0 2 5/6 5/6 1

S. lugdunensis 107 1 107 107 216/1216 216/216 0

S. pasteuri 1 0 0 1 2/2 2/2 0

S. saprophyticus 281 1 281 281/281 548/564 545/564 15

Pseudomanas

balearica,

S. equorum,

S. piscifermentans,

S. xylosus

1,318

1,687

2,04

1,842

S. schleiferi 6 1 2 6 14/14 14/14 0

S. scuiri 4 0 1 4 8/8 8/8 0

S. simulans 5 1 0 5 12/12 12/12 0

S. succinus 4 0 4 4 8/8 8/8 0

S. warneri 9 1 3 9 20/20 20/20 2

S. xylosus 0 1 0 0 2/2 2/2 0

Gesamt 697 13 569 714 1387/1420 1382/1420 32 6

Legt man hingegen die Identifizierungskriterien des Herstellers an, so

wurden nur 15,49 % mit einer „sehr hohen Wahrscheinlichkeit auf dem

Spezieslevel“ und nur 68,17% als „sicher im Genus und wahrscheinlich in

der Spezies“ identifiziert. Die Score-Verteilung ist für jede Spezies in

Abbildung 4 zusammengefasst.

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Abbildung 4: Score-Verteilung der getesteten Staphylokokken-Isolate und Vorschlag neuer Score-„cutoff“-Werte anhand des 20. Perzentils (rot = Mittelwert, blau = Score-„cut-off“-Werte des Herstellers, * = aufgrund zu geringer Anzahl keine Berechnung)

Um neue Spezies-spezifische Score-„cutoff“-Werte zu finden, haben wir

willkürlich das 20. Perzentil von allen getesteten Spezies bestimmt, die

mehr als drei Isolate hatten. Ausgeschlossen und mit Sternchen

gekennzeichnet wurden die Spezies Staphylococcus arlettae, S. carnosus,

S. chromogenes, S. hyicus, S. pasteuri und S. xylosus. Sieben von 15

Spezies (S. caprae, S. intermedius, S. warneri, S. sciuri, S. schleiferi,

S. succinus und S. epidermidis) hatten einen errechneten Grenzwert < 2,0

und die Spezies S. cohnii sogar < 1,7. Der höchste errechnete Grenzwert

lag bei 2,170 für S. lugdunensis. Alle Spezies, ausgenommen S. xylosus

(99,8%), wurden zu 100% nicht als Ergebnis einer Fehlidentifizierung

angeben. Um die Genauigkeit des MALDI-TOF MS auf dem Level der

Isolat-Erkennung zu testen wurden 13 Referenzstämme der MALDI

Biotyper 2.0 Datenbank vergleichend gemessen. Im Idealfall sollte der

identische DSM-Datenbankeintrag als höchstes Score-Ergebnis dem

getesteten DSM-Stamm zugeordnet werden. Obwohl die Stämme

identisch mit denen der Datenbankeinträge waren, wurden keine Scores

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21

von 3.0 erreicht. Der höchste Score-Wert lag bei 2,290 für S. lugdunensis

(DSM 20260). Nur eine Messung des S. epidermidis DSM 1798 lieferte

keine Peaks zur Identifizierung, alle anderen Messungen (96,15%)

ergaben richtige Ergebnisse auf dem Spezieslevel. Für sieben

Referenzstämme (DSM 4804, DSM 20229, DSM 20322, DSM 20328,

DSM 20373, DSM 20459 und DSM 20608) ergaben die

Doppelmessungen in beiden Fällen die höchste Übereinstimmung mit dem

richtigen DSM-Datenbankeintrag (53,85 %). Bei zwei Referenzisolaten

(DSM 20267, DSM 20316) ergab nur eine der beiden Doppelmessungen

die richtige DSM-Übereinstimmung (15,38 %). Die DSM-Identifizierung

scheiterte bei beiden Messungen (30,77%) für vier Referenzstämme

(DSM 1798, DSM 4807, DSM 20260 und DSM 20263).

Page 26: Aus der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie Direktor ... · Abstract: Cindy Richter Untersuchung einer MALDI-TOF MS-basierten Speziesidentifizierung von Koagulase-negativen

22

4 Diskussion

Um konkurrenzfähig zu sein, stehen mikrobiologische Labore zunehmend

unter dem Druck einen zuverlässigen und kostengünstigen Service mit

hohem Durchlauf anzubieten. Alle herkömmlichen

Identifizierungsmethoden und antimikrobielle Testungen basieren auf

einer vorhergehenden Bakterienkultivierung und phänotypischen

Klassifizierung, die mit einer Dauer von 24 Std. zeit- und arbeitsaufwändig

ist. Automatisierte Identifizierungssysteme sind vergleichsweise

preisgünstig mit einem geringen Arbeitsaufwand, benötigen aber auch

mehrere Stunden und sind nicht für alle Speziesidentifizierungen reliabel.

Molekularbiologische PCR-basierte Verfahren hingegen sind dazu

geeignet, die Durchlaufzeiten zu verbessern und ein zuverlässiges

Ergebnis zu liefern. Trotzdem werden sie nur selten in der Routine

eingesetzt, da sie mit hohen Kosten verbunden und nicht universell

einsetzbar sind. Bei weitem nicht für alle Spezies sind bereits spezifische

Primer beschrieben worden. Extrem zeitaufwändige sequenzbasierte

Methoden gelten als sehr genau. Die kostenintensive Real-time-PCR

bleibt ebenso nur bestimmten Fragestellungen wie dem schnellen

Nachweis von Pathogenen im Liquor oder dem Direktnachweis aus

positiven Blutkulturen vorbehalten [46].

Besonders Staphylokokken haben in den letzten Jahren an Bedeutung bei

nosokomialen Infektionen zugenommen. Insbesondere ist an die

Zunahme der Antibiotikaresistenzen bei Methicillin-resistenten S. aureus

(MRSA) und den KoNS als Erreger bei kunststoffassoziierten und

Protheseninfektionen zu denken [91, 104]. Eine schnelle Identifizierung

von Bakterien und deren Resistenzen kann einen wesentlichen Einfluss

auf die Erkrankungsverläufe haben, indem durch gezielten Gebrauch von

Antibiotika multiresistente Erreger weniger erzeugt und die Letalität

gesenkt wird. Das MALDI-TOF MS, eine neue Identifizierungsmethode,

wurde in vorhergehenden Veröffentlichungen als schnell und effizient

beschrieben [44, 87]. Diese Aussage konnte in der Verwendung der

Biotyper 2.0 Datenbank mit einer Genauigkeit von 97,3% für

Staphylokokken auf dem Spezieslevel in der vorliegenden Arbeit bestätigt

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23

werden. Dagegen unterliegen automatisierte Identifizierungssysteme wie

das VITEK-2 mit 86,3% [22] - 87,5% [49], das BD Phoenix mit 76,9% [22],

das MicroScan mit 82,5% [49] und das Crystal GP mit 67,5% [49] in der

Genauigkeit für Staphylokokken auf dem Spezieslevel deutlich. Ein

entscheidender Vorteil in der Identifizierung neu entdeckter Organismen

ist eine schnelle Ergänzung und Weiterentwicklung der Datenbank [17,

105]. Updates werden alle 3-6 Monate realisiert [59].

Das Besondere dieser Studie ist die Auswertung der Doppelmessungen,

wodurch es möglich ist auch „no peaks found“-Ergebnisse (32/1420) als

Fehlidentifizierungen zu werten, wenn das zweite Feld ein richtiges

Ergebnis liefert. Dieses Vorgehen ermöglicht eine interne Kontrolle. Der

erzielten Fehlmessung liegt auf diese Weise nicht ein Fehler in der

Probenvorbereitung, sondern im Auftrag der Proben oder der Messung im

MALDI-TOF MS selbst, zugrunde. Im Umkehrschluss sollte jedoch

erwähnt werden, dass durch Doppelmessungen die statistische

Gewichtung der Ergebnisse verändert wird.

Insbesondere die Probenvorbereitung für grampositiven Bakterien und

Pilze wird kontrovers diskutiert [1, 6, 94]. Der Direktauftrag wird als

einfacher und schneller angesehen [86], jedoch werden beim

Ethanol/Ameisensäure-Extraktionsverfahren die Organismen abgetötet.

Dies vermindert das Risiko von Labor-assoziierten Infektionen durch

pathogene Bakterien. Des weiteren wird die Qualität der erzeugten

Spektren für grampositive Bakterien und Pilze beim Extraktionsverfahren

als hochwertiger im Vergleich zum Direktauftrag beschrieben [2, 12],

sodass insgesamt höhere Score-Werte erzielt werden können [1, 86]. Die

zu evaluierenden Score-„cutoff“-Werte des Herstellers Bruker Daltonics

wurden für das Ethanol/Ameisensäure-Extraktionsverfahren festgelegt.

Nach den Empfehlungen des Herstellers steht ein Score ≥ 2,3 für eine

sehr wahrscheinlich Speziesidentifizierung. In vorausgegangenen Studien

wurde diese Grenze bereits auf ≥ 1,7 und < 2,0 herabgesetzt [6, 20, 35,

73]. Noch geringere Score-„cutoff“-Werte wurden für die direkte

Identifizierung von Bakterien aus Blutkulturflaschen vorgeschlagen [54,

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24

89, 92], was die Forderung nach neuen Grenzwerten aufkommen lässt

[73].

Um die Genauigkeit des MALDI-TOF MS auf dem Spezieslevel zu

verbessern, wurden Spezies-spezifische Score-„cutoff“-Werte mit Hilfe des

20. Perzentils berechnet. Diese Werte können auf jede Spezies einzeln

oder in einem vereinfachten Identifizierungsschema auf übereinstimmende

Gruppen angewandt werden. Das 20. Perzentil wurde ausgewählt, weil die

meisten Fehlidentifizierungen sich unter dieser Grenze befanden. Ein

Score ≥ 2,0 ist für eine sichere Speziesidentifizierung bei S. aureus,

S. capitis, S. epidermidis, S. hominis, S. lugdunensis, S. saprophyticus,

S. simulans und S. xylosus anzulegen. Ein Score ≥ 1,7 ist ausreichend für

S. caprae, S. intermedius, S. schleiferi, S. sciuri, S. succinus und

S. warneri. Für die Spezies S. cohnii ist sogar ein Score ≥ 1,6 genügend.

In Anbetracht dieser Spezies-spezifischen Scoreunterschiede ist eine

Implementierung von festgesetzten Spezies-spezifischen Variablen in das

Klassifizierungssystem des Herstellers wünschenswert. Ein geringer

Score-Mittelwert zeigt, für welche Spezies die Datenbank verbessert

werden sollte. Dennoch wurde durch diese und vorhergehende Studien

aufgezeigt, dass das MALDI-TOF MS auf dem Spezieslevel für

Staphylokokken sehr genau ist [21, 87, 94]. Mit Ausnahme von S. xylosus

wurden alle getesteten Spezies nicht als falsch positives Ergebnis einer

Fehlidentifizierung angegeben, was die Anwendung niedriger Score-

„cutoff“-Werte befürwortet. Schon in vorausgegangenen Studien wurden

S. equorum, S. piscifermentans [21] und S. saprophyticus [20] mit initialen

Fehlidentifizierungen im MALDI-TOF MS beschrieben. In einem

Phylogramm [56] basierend auf der 16S rRNA und den dnaJ-

Genfragmenten sind sowohl S. xylosus als auch S. equorum sehr nahe

verwandt mit S. saprophyticus, wodurch die Ergebnisse der

Fehlidentifizierungen erklärt werden können. Dies trifft ebenso für die

Fehlidentifizierung von S. carnosus als S. piscifermentans zu.

Wohingegen ein Pseudomonas balearica eine sehr entfernte

phylogenetische Verwandtschaft mit S. saprophyticus aufweist.

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S. piscifermentans ist dem S. saprophyticus phylogenetisch ebenfalls weit

entfernt, doch stimmt bei dieser Fehlidentifizierung das Genus.

Hohe Score-Werte bis 2,04 bei Fehlidentifizierung weisen ebenso darauf

hin, dass Verbraucher mehr auf kritische Spezies wie S. equorum,

S. piscifermentans und S. xylosus achten sollten, wohinter sich

S. saprophyticus, S. carnosus oder S. cohnii verbergen können.

Vorwiegend ist dabei auf die Herkunft der Proben und den

Untersuchungskontext zu achten. S. carnosus, S. equorum und

S. piscifermentans treten mit Lebensmitteln assoziiert auf. Bei der Suche

nach einem humanpathogenen Keim, sollte bei diesen

Identifizierungsergebnissen die erneute Prüfung auf eine S. saprophyticus

oder S. cohnii-Infektion bedacht werden. S. xylosus ist als

opportunistischer Krankheitserreger des Menschen zu werten, wird aber

auch als traditionelle Starterkultur bei Fleischerzeugnissen verwendet.

In der gegenwärtigen Studie fällt ebenfalls auf, dass der höchste erzielte

Score-Wert bei 2,580 lag, obwohl 3,0 als höchstmöglicher Score vom

Hersteller angeben wird. Es ist davon auszugehen, dass

Referenzstämme, die in der Datenbank gespeichert wurden, diesen

Höchstwert erreichen sollten, wenn der identische Stamm gemessen wird.

Dies wurde auch durch Harris et al. [35] nachgewiesen. Dennoch blieben

die Score-Werte der Referenzstämme dieser Arbeit weit unter dem

Höchstwert und erreichten noch nicht einmal den Grenzwert für eine „sehr

wahrscheinliche Speziesidentifizierung“. Ebenso ist anzumerken, dass

trotz richtiger Spezieserkennung für nur 53,85% der getesteten DSM-

Referenzisolate eine Zuordnung des identischen DSM-

Datenbankeintrages gelang. Die Proteinexpression scheint von

Umgebungsfaktoren wie den Kultivierungsbedingungen, darin inbegriffen

die verschiedenen Wachstumsphasen, Agarplatten, pH-Werte und

Temperaturen abhängig zu sein [98, 108]. Um ein wirklich repräsentatives

Peakprofil einer Spezies zu erhalten, sollte eine große Anzahl von

identischen Stämmen unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen

analysiert werden. Niedrige Score-Werte sowohl bei Routineisolaten als

auch bei Referenzstämmen lassen vermuten, dass es noch viele

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unbekannte Faktoren in der Präparation, bei den Messinstrumenten und

Umgebungsfaktoren gibt, durch welche die Messungen beeinflusst

werden. Diese Faktoren sollten in nachfolgenden Studien untersucht

werden, um deren Bedeutung für die tägliche Diagnostik zu verstehen. Ein

Einsatz des MALDI-TOF MS in der Epidemiologie sollte erst erwogen

werden, wenn eine Zuordnung identischer Isolate unabhängig von

äußeren Umgebungsfaktoren möglich ist.

Das MALDI-TOF MS hat durch seine deutliche Zeitreduktion den Ablauf in

den diagnostischen Laboratorien verändert. Es lässt sich feststellen, dass

die MALDI Biotyper Datenbank für eine hochpräzise und schnelle

Identifizierung von Staphylokokken geeignet ist [61]. Der Score-„cutoff“-

Wert ist ohne eine Spezies-spezifische Korrektur nur eingeschränkt zur

Beurteilung der Identifizierungsqualität zu verwenden. In der Gruppe der

KoNS variierten die mittleren Score-Werte stark. Niedrige Score-Werte

können bei bestimmten Spezies durchaus für eine sichere Identifizierung

verwendet werden. Durch einen hohen Score-Wert kann nicht

ausgeschlossen werden, dass eine Fehlidentifizierung vorliegt. Zur

Verbesserung der Identifizierungsgüte können Spezies-spezifische Score-

„cutoff“-Werte, ohne dadurch einen erhöhten Anteil an

Fehlidentifizierungen zuzulassen, eingeführt werden. Diese Arbeit zeigt,

dass Datenbanken, die bereits kommerziell zur Identifizierung von

Mikroorganismen vertrieben werden, dennoch regelmäßig auf ihre

Genauigkeit untersucht werden sollten. Diese neue Technik ermöglicht

eine Beschleunigung der Befundbereitstellung in der medizinischen

Diagnostik um mindestens 12-24 Stunden. Durch eine deutlich frühere

Kenntnis der Spezies kann die Antibiotikatherapie frühzeitig an typische

Empfindlichkeiten angepasst und eine unwirksame Therapie zeitnah

beendet werden [103]. Durch das MALDI-TOF MS ist es ebenfalls

möglich, S. aureus Isolate mit untypischen Reaktionsmustern sicher zu

identifizieren, woran herkömmliche biochemische Methoden häufig

scheiterten. Auf diese Weise können nicht nur unnötige Kosten für

unwirksame Therapien gespart, sondern auch schwere

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Infektionskrankheiten frühzeitig bekämpft und die Letalität gesenkt

werden.

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28

5 Literaturverzeichnis

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Danksagung

Mein besonderer Dank gilt …

… Herrn Professor Dr. med. Sören G. Gatermann, meinem

Doktorvater, für seine Förderung, kritische Diskussionen und

wegweisende Kommentare.

… Herrn Dr. med. Florian Szabados, meinem Betreuer der

Dissertation, für die Bereitstellung des Themas und seine

uneingeschränkte Unterstützung.

… Frau Susanne Friedrich für die ausgezeichnete und

persönliche Betreuung im Labor.

… allen Mitgliedern des Instituts der Medizinischen

Mikrobiologie für ihre Hilfsbereitschaft und das freundliche

Arbeitsklima.

… von Herzen meiner Familie für die Förderung meiner

Interessen und die liebevolle Unterstützung.

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Lebenslauf

Persönliche Daten Name: Cindy Richter

Geboren: 25.11.1985 in Luckau

Berufliche Tätigkeiten Seit 05/2013 Assistenzärztin in der Klinik für Neurologie,

Prof. Dr. Schlegel, Universitätsklinikum

Knappschaftskrankenhaus Bochum

01/2013 – 03/2013 Assistenzärztin in der Klinik für Neurochirurgie,

Prof. Dr. Scholz, Klinikum Duisburg

Studium

2006 – 2012 Studium der Medizin, Ruhr-Universität Bochum

Herbst 2012 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

Sommer 2008 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

Stipendium 2013 – 2015 mQuadrat@RUB

2010 – 2011 Bronnbacher Stipendium (Programm zur

Förderung der kulturellen Kompetenz künftiger

Führungskräfte)

Schulische Ausbildung 0971999 – 07/2005 Bohnstedt Gymnasium Luckau

Abschluss: Allgemeine Hochschulreife

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Richter C, Hollstein S, Woloszyn J, Kaase M, Gatermann S, Szabados F.

„Evaluation of species-specific score cut-off values of various staphylococci

species using a Biotyper-based identification“

J Med Microbiol. 2012 Oct;61(Pt 10):1409-16.Epub 2012 Jun 28

Szabados F, Woloszyn J, Richter C, Kaase M, Gatermann S.

„Identification of molecularly defined Staphylococcus aureus strains using matrix-

assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry and the

Biotyper 2.0 database”

J Med Microbiol. 2010 Jul;59(Pt 7):787-90. Epub 2010 Apr 1