Auswirkung von oral verabreichtem Escherichia coli · TGF tumor growth factor...

Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover

und

der Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie

der Medizinischen Hochschule Hannover

Auswirkung von oral verabreichtem Escherichia coli

Nissle 1917 auf das Darm-assoziierte Immunsystem des

Schweins

INAUGURAL DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Swantje Duncker

aus Kiel

Hannover 2005

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Gerhard Breves

Prof. Dr. Stephan C. Bischoff

1. Gutachter: Prof. Dr. G. Breves

2. Gutachter: Prof. Dr. H.-J. Schuberth

Tag der mündlichen Prüfung: 03. Juni 2005

Gefördert durch ein Stipendium der FIRMA ARDEYPHARM GmbH, Herdecke, Deutschland

und den Sonderforschungsbereich SFB 621 „Pathobiologie der Intestinalen Mukosa“ der

DEUTSCHEN FORSCHUNGSGEMEINSCHAFT (DFG)

meinen Eltern und meinem Großvater in Liebe

und tiefer Bewunderung

in liebevollem Gedenken an meine Großmutter

Inhaltsverzeichnis

________________________________________________________________________________

Inhaltsverzeichnis

VERZEICHNISS DER ABKÜRZUNGEN

1 EINLEITUNG UND LITERATURÜBERSICHT..................................................................1

1.1 Physiologische Mikroorganismen des Darms..................................................................2

1.1.1 Darmmikroorganismen beim Schwein.........................................................................4

1.1.2 Intestinale Barriere.......................................................................................................5

1.2 Probiotika ...........................................................................................................................6

1.2.1 Definition .....................................................................................................................6

1.2.2 Anwendung in der Veterinärmedizin und Landwirtschaft...........................................7

1.2.3 Anwendung in der Humanmedizin und Ernährung .....................................................9

1.2.4 Wirkungsmechanismen..............................................................................................12

1.2.4.1 Wirkung von Probiotika auf die Darmmikroorganismen ......................................13

1.2.4.2 Wirkungen auf den Wirt ........................................................................................14

1.3 Escherichia coli Nissle 1917.............................................................................................19

1.3.1 Wirkmechanismen und therapeutische Anwendung von EcN...................................20

1.4 Escherichia coli Stamm “Abbotstown”..........................................................................21

1.4.1 Wirkmechanismen und klinische Bedeutung.............................................................21

1.5 Das darmassoziierte Immunsystem................................................................................21

1.5.1 Anatomischer und histologischer Aufbau des Darms beim Schwein ........................22

1.5.2 Immunzellen des Darms.............................................................................................23

1.5.2.1 Zellen des angeborenen Immunsystems ................................................................23

1.5.2.2 Zellen des adaptiven Immunsystems des Schweins...............................................27

1.5.3 Aufbau des darmassoziierten Immunsystems ............................................................29

1.5.3.1 Intraepitheliale Lymphozyten ................................................................................29

1.5.3.2 Lamina propria Lymphozyten................................................................................31

1.5.3.3 Interleukin-2 Rezeptor (CD25) als Aktivierungsmarker .......................................32

1.5.4 Antimikrobielle Peptide .............................................................................................33

1.6 Ziel der Arbeit ..................................................................................................................34

2 MATERIAL UND METHODE ..............................................................................................36

2.1 Haltung der Versuchstiere ..............................................................................................36

2.1.1 Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN......................36

2.1.2 Infektionsversuche mit und ohne EcN.......................................................................37

2.2 Versuchsdurchführung....................................................................................................39



2.3 Tötung der Tiere ..............................................................................................................43

2.4 Probengewinnung.............................................................................................................44


2.4.1.1 Probenentnahme für mikrobiologische Untersuchungen.......................................44

2.4.1.2 Probenentnahme für die Polymerase-Ketten-Reaktion..........................................44

2.4.1.3 Probenentnahme für histologische und immunhistologische Analysen ................45


2.4.2.1 Plasmagewinnung für Plasma-IgA-Bestimmung...................................................46

2.4.2.2 Probenentnahme für mikrobiologische Untersuchungen.......................................46

2.4.2.3 Probenentnahme für luminale IgA-Bestimmung ...................................................46

2.4.2.4 Probenentnahme für histologische Untersuchungen..............................................47

2.5 Probenbearbeitung und Lagerung .................................................................................47

2.5.1 Einbettung in Paraffin und Anfertigung von Gewebeschnitten .................................47

2.6 Mikrobiologische Untersuchungen.................................................................................48



2.7 Bestimmung von luminalen und Plasma-IgA................................................................49


2.7.2 Auswertung ................................................................................................................49

2.8 Histologische Untersuchung............................................................................................49

2.8.1 Entparaffinierung .......................................................................................................49

2.8.2 Hämalaun-Eosin Färbung ..........................................................................................50

2.8.3 Toluidinblaufärbung ..................................................................................................50

2.9 Immunhistologische Methoden.......................................................................................51

2.9.1 Markierte Streptavidin-Biotin Methode.....................................................................51

2.9.2 Verwendete Antikörper..............................................................................................53

2.9.2.1 Darstellung von CD4 Oberflächenantigen.............................................................54

2.9.2.2 Darstellung von CD8 Oberflächenantigen.............................................................55

2.9.2.3 Darstellung von CD25-Oberflächenantigen und intrazellulärem IgA ...................56

2.9.2.4 Gegenfärbung mit Hämalaun .................................................................................56

2.9.3 Auswertung ................................................................................................................56

2.10 RNA-Isolierung, reverse Transkription und Polymerase Kettenreaktion .................58

2.10.1 RNA-Isolierung und reverse Transkription ...............................................................58

2.10.2 PCR ............................................................................................................................59

2.10.3 Verwendete Primer und PCR-Protokolle...................................................................60

2.10.4 Auswertung ................................................................................................................62

2.11 Statistik .............................................................................................................................62

3 ERGEBNISSE ..........................................................................................................................63

3.1 Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN........................63

3.1.1 Gewicht ......................................................................................................................63

3.1.2 Mikrobiologische Untersuchung................................................................................63

3.1.3 Histologische Untersuchung ......................................................................................64

3.1.3.1 Eosinophile Granulozyten......................................................................................65

3.1.3.2 Neutrophile Granulozyten......................................................................................67

3.1.3.3 Basophile Granulozyten.........................................................................................69

3.1.3.4 Mastzellen ..............................................................................................................70

3.1.4 Immunhistologische Untersuchung ...........................................................................72

3.1.4.1 T-Helfer-Zellen (CD4+).........................................................................................73

3.1.4.2 CD8+ Zellen...........................................................................................................75

3.1.4.3 Aktivierungsmarker (CD25) ..................................................................................81

3.1.4.4 IgA-produzierende Plasmazellen ...........................................................................82

3.1.5 mRNA-Expression von Zytokinen und antimikrobiellen Peptiden ...........................85

3.2 Infektionsversuche mit und ohne EcN ...........................................................................89

3.2.1.1 Klinik .....................................................................................................................89

3.2.1.2 Allgemeine mikrobiologische Untersuchung ........................................................93

3.2.1.3 Wassergehalt im Kot..............................................................................................95

3.2.1.4 Luminale und Plasma-IgA-Bestimmung ...............................................................96

3.2.1.5 Histologie ...............................................................................................................97

4 DISKUSSION...........................................................................................................................99

4.1 Konzeptionelle Überlegungen .........................................................................................99

4.2 Konventionell gehaltene Schweine ...............................................................................100

4.3 Infektionsversuch mit und ohne EcN...........................................................................113

4.4 Neue Erkenntnisse über die Wirkungsweise von EcN................................................119

5 ZUSAMMENFASSUNG .......................................................................................................120

6 SUMMARY ............................................................................................................................122

7 LITERATURVERZEICHNIS..............................................................................................124

8 ANHANG I .............................................................................................................................156

8.1 Futterzusammensetzung des verwendeten Grundfutters ..........................................156

8.1.1 E. coli Nissle 1917-Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen ..................156

8.1.2 Infektionsversuche mit und ohne EcN.....................................................................157

9 ANHANG II............................................................................................................................158

9.1 Bakterienstämme ...........................................................................................................158

9.2 Material und Geräte ......................................................................................................158

9.3 Pharmaka und Substanzen ...........................................................................................161

9.4 Lösungen und Protokolle ..............................................................................................163

9.5 Kits ..................................................................................................................................165

10 ANHANG III ..........................................................................................................................166

10.1 Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN......................166

10.1.1 Gewicht ....................................................................................................................166

10.1.2 Anzahl eosinophiler Granulozyten ..........................................................................167

10.1.3 Anzahl neutrophiler Granulozyten...........................................................................167

10.1.4 Anzahl an Mastzellen...............................................................................................168

10.1.5 Anteil CD4+ Zellen..................................................................................................169

10.1.6 Anzahl CD8+ Zellen ................................................................................................170

10.1.7 Anzahl CD25+ Zellen ..............................................................................................173

10.1.8 Anteil IgA+ Zellen...................................................................................................173

10.2 Infektionsversuche mit und ohne EcN .........................................................................174

10.2.1 Gewicht ....................................................................................................................174

ERKLÄRUNG

DANKSAGUNG

Verzeichnis der Abkürzungen

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® eingetragenes Wahrenzeichen

Abb. Abbildung

AEC 3-Amino-9-ethylcarbazol

Akt-Kinase Protein Kinase B

AMG Arzneimittelgesetz

Aqua dest. Aqua destilata

B.cer. var. toyoi Bacillus cereus Varietas toyoi

bzw. beziehungsweise

CD cluster of differentiation (zelluläre Differenzierungsantigene)

CED chronisch entzündliche Darmerkrankung

CTMC connective tissue mast cell (Bindegewebsmastzellen)

DC dendritic cell (dendritische Zelle)

DNA desoxy ribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

E. coli Escherichia coli

EcN Escherichia coli Nissle 1917

ECP eosinophilic cationic protein (Eosinophiles Kationisches Protein)

EPEC enteropathogene Escherichia coli

EPX Eosines Protein X

et al. et alii (und andere)

ETEC enterotoxische Escherichia coli

Fa. Firma

FMG Futtermittelgesetz

GALT gut associated lymphoid tissue (darmassoziiertes lymphoides Gewebe)

HE Hämalaun Eosin

HRP horseradish peroxidase (Meerrettichperoxidase)

IEL intraepitheliale Lymphozyten

IFN Interferon

Ig Immunglobulin

IL Interleukin


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IL-2R Interleukin-2 Rezeptor

IκB inhibitor of kappa B (Hemmstoff von kappa B)

KBE koloniebildende Einheiten

LCC Laktobazillen

LGG Lactobacillus rhamnosus GG

LMBG Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz

LP Lamina propria

LPL Lamina propria Lymphozyten

LPS Lipopolysaccharid

LSAB-Methode labeled streptavidin biotin (gekennzeichnete Streptavidin-Biotin) Methode

LT Lymphotoxin

mAK monoklonaler Antikörper

pAK polyklonaler Antikörper

MALT mucosa associated lymphoid tissue (mukosaassoziiertes lymphoides Gewebe)

MAP-Kinase Mitogen-aktivierte Protein-Kinase

MBP major basic protein

MC mast cell (Mastzelle)

MCP membrane cofactor protein

MHC major histocompatibility complex

MIP-1 macrophage inflammatory protein (Makrophagen Entzündungsprotein)

MMC mucosal mast cell (mukosale Mastzellen)

mRNA messenger ribo nucleic acid (Boten-Ribonukleinsäure)

NaCl Natriumchlorid

NfE N-freie Extraktstoffe

NFκB Nucleus Faktor Kappa B

PBS Phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)

PGE-2 Prostaglandin E-2

PP Peyer´sche Platten

RT Raumtemperatur

s.c. subcutan

SAB Saccharomyces boulardii

SCF stem cell factor (Stammzellfaktor)


________________________________________________________________________________

SCFA short chain fatty acids (kurzkettige Fettsäuren)

SD standard deviation (Standardabweichung)

sIgA sekretorisches IgA

ST1p Shigatoxin 1p

TBS Tris buffered saline (Tris-gepufferte Kochsalzlösung)

TCR T-cell receptor (T-Zellrezeptor)

TGF tumor growth factor (Tumorwachstumsfaktor)

Th -Zelle T-Helfer-Zelle

TNF Tumornekrosefaktor

u.ä. und ähnliches

WHO World Health Organization (Weltgesundheitsorganisation)

z.B. zum Beispiel

z.T. zum Teil

Chemische Elemente werden entsprechend der internationalen Literatur abgekürzt.

Einleitung und Literaturübersicht

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1

1 Einleitung und Literaturübersicht

Die ersten Lebewesen, die die Evolution hervorgebracht hat, gehörten zur Gruppe der

Mikroorganismen. Noch heute sind verschiedene Formen von Mikroorganismen an der Besiedlung

nahezu jedes Lebensraumes unseres Planeten beteiligt. Häufig haben sich im Laufe der Evolution

Symbiosen zwischen Mikroorganismen und höher entwickelten Lebewesen als äußerst erfolgreich

erwiesen. Eine derartige Symbiose sind auch die Säugetiere mit den ihren Darm besiedelnden

Mikroorganismen eingegangen. Die Anzahl der physiologischerweise den Magendarmtrakt

besiedelnden Mikroorganismen übersteigt dabei die Zahl der Körperzellen des Wirts um ein

Vielfaches. (BRY et al. 1996).

Es wird üblicherweise angenommen, dass zwischen 400 und 500 verschiedene Spezies an der

Besiedlung des Intestinaltraktes beteiligt sind (SIMON und GORBACH 1982). Nachdem ihre

Aufgabe lange Zeit nur auf Seiten der Nährstoffversorgung und Fermentation gesehen wurde,

rückten in den letzten Jahren auch immer häufiger immunmodulatorische Wirkungen der

Darmmikroorganismen in den Blickpunkt der Forschung (BOURLIOUX et al. 2003).

Auf dieser Grundlage erlebte die Erforschung einer Gruppe von Mikroorganismen eine

Renaissance, deren positive Wirkung auf die Gesundheit des Menschen schon Anfang des letzten

Jahrhunderts von METCHNIKOFF (1907) und in den 20er Jahren des vergangenen Jahrhunderts

von NISSLE (1916) untersucht wurde. LILLY et al. (1965) prägten für diese Gruppe von

Mikroorganismen den Begriff „Probiotika“. Das Wissen um die genaue Wirkungsweise dieser

speziellen Mikroorganismen im Ökosystem Darm und den Einfluss auf den Wirtsorganismus ist

aber nach wie vor unzureichend. Dies ist insofern besonders bedauerlich, als Probiotika inzwischen

nicht nur in Form von Futtermittel- bzw. Nahrungsmittelzusatzstoffen eine Rolle spielen, sondern

einzelne Spezies auch als Medikamente zum Einsatz kommen. Vor allem in der Humanmedizin

werden diese Spezies zur Therapie von gastrointestinalen Erkrankungen genutzt und haben sich den

pharmakologischen Therapien als ebenbürtig erwiesen (KRUIS et al. 1997, REMBACKEN et al.

1999, GAON et al. 2003, ALLEN et al. 2004). Allerdings scheint die Zahl der Befürworter

derartiger Therapieansätze ebenso groß wie die ihrer Gegner. Anstoß der Diskussion um den

Einsatz von Probiotika bildet immer wieder das Fehlen befriedigender Erklärung für die Wirkung

der verwendeten Keime.

In der Veterinärmedizin intensiviert der Einsatz von Probiotika als Ersatz für antimikrobielle


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2

Leistungsförderer in der Nutztierhaltung die Diskussion um die Wirkungsweise dieser speziellen

Mikroorganismen zusätzlich.

Eine Aufklärung von probiotischen Wirkmechanismen ist demnach nicht nur in Bezug auf

erweiterte und gezieltere therapeutische Anwendungen wünschenswert, sondern könnte auch helfen

die prophylaktische Anwendung probiotischer Keime sowohl beim Menschen als auch beim Tier

auszuweiten und zu verbessern.

1.1 Physiologische Mikroorganismen des Darms

Um Effekte von Probiotika auf die Mikroökologie des Darms und damit auf den Wirt einordnen

und die Erkenntnisse zu Wirkungsmechanismen bewerten zu können, soll zunächst kurz auf die

physiologischen Mikroorganismen des Darms und ihre Bedeutung für den Wirt eingegangen

werden.

Sowohl umgangssprachlich als auch in vielen Bereichen der wissenschaftlichen Forschung wird

von der sogenannten ”normalen Darmflora” gesprochen. Damit sind in der Regel die

Mikroorganismen gemeint, die bei einem gesunden Individuum im Magen-Darm-Trakt

vorkommen. Es handelt sich dabei sowohl um residente wie auch um transiente Keime. Die

Ansammlung intestinaler Mikroorganismen ist in hohem Maße individuellen Schwankungen

unterworfen. Die Speziesverteilung hängt von vielen Faktoren wie dem Alter, dem Geschlecht, der

Ernährung, sowie den Umwelt- und Hygieneverhältnissen ab. Auch eine genetische Komponente

wird diskutiert. So zeigt die Zusammensetzung der Darmmikroorganismen bei eineiigen Zwillingen

eine größere Übereinstimmung als bei zweieigen Zwillingen (VAN DE MERWE et al. 1983). Ein

”Normalzustand”, der für alle Individuen einer Spezies gilt, ist demnach nur schwer vorstellbar,

weshalb im Folgenden von physiologischer Besiedlung gesprochen werden soll. Die Verwendung

des Wortes Mikroorganismen trägt der Tatsache Rechnung, dass eine Vielzahl verschiedener

Organismen aus verschiedenen Gattungen an der Besiedlung des Säugerdarms beteiligt sind

(ROBINSON et al. 1984, BLEDAY et al. 1993, TANNOCK 2001, FANARO et al. 2003).

Die Anzahl der Mikroorganismen nimmt im Verlauf des Gastrointestinaltrakts von oral nach aboral

stetig zu und beläuft sich bei Nutztieren wie dem Schwein auf einer Gesamtzahl von 1014 KBE im

Darm. Im Vergleich zwischen den Darmabschnitten ist sie im Dickdarm mit 1012 KBE/g Ingesta am

höchsten (GEDEK 1987). Die Gesamtheit der physiologischen Mikroorganismen setzt sich aus


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3

400-500 Spezies zusammen, wobei die Angaben zu diesen Zahlen in der Literatur stark differieren

(FULLER et al. 1978, ROBINSON et al. 1984, TANNOCK 2001). Neueste präliminäre Ergebnisse

für den Menschen lassen allerdings eine sehr viel geringere Zahl von um die 100 Spezies mit einer

extremen Diversität zwischen einzelnen Wirten vermuten (ABBOTT 2004). Jedes Individuum

scheint somit eine ihm eigene physiologische Darmbesiedlung zu besitzen.

Sowohl bei Säugetieren als auch beim Menschen gehören die meisten Darmbakterien dem Genus

Lactobacillus, Bifidobacteria und Bacteroides an (25 bzw. 30%) (FULLER et al. 1978,

ROBINSON et al. 1984, SALMINEN et al. 1998). Als primäre Aufgabe der gastrointestinalen,

mikrobiologischen „Mitbewohner” wird der Abbau von für den Wirt nicht oder nur schwer

verdaulicher Kohlenhydrate (Cellulose, Hemizellulose, Oligosaccharide und Pektine) angesehen.

Sowohl beim Menschen als auch beim Schwein erfolgt der mikrobielle Abbau in erster Linie im

Kolon. Die Produktion kurzkettiger Fettsäuren, besonders von Butyrat, sichert dabei die

Energieversorgung der Enterotzyten ( SAVAGE 1977a, b, COATES 1980, FULLER 1989,

GUARNER und MALAGELADA 2003,). Allerdings ist die Fermentation von Kohlenhydraten

nicht auf den Dickdarm beschränkt. Insbesondere Hemizellulosen und Pektine werden zu einem

nicht unerheblichen Anteil auch schon im Dünndarm mikrobiell verstoffwechselt (DROCHNER

1993). Andere Untersuchungen belegen eine beträchtliche Fermentation der Ingesta im terminalen

Ileum (HOUDIJK 1998).

Neben der Fermentationsleistung synthetisieren einige Darmmikroorganismen B-Vitamine und

Vitamin K (SALMINEN et al. 1998).

Außerdem sorgen sie für eine Stimulation und Regulation des intestinalen Immunsystems,

unterstützen die orale Toleranz gegenüber Nahrungsantigenen und helfen, die Besiedlung des

Darms mit pathogenen Mikroorganismen zu vermeiden (TLASKALOVA-HOGENOVA et al.

2004), indem beispielsweise die Anheftung pathogener Mikroorganismen durch von Kommensalen

besetzte Anheftungsstellen erschwert wird. Des Weiteren bietet die Wechselwirkung (crosstalk)

zwischen den physiologischen Darmbewohnern und der Mukosa des Wirts einen zusätzlichen

Schutz (UMESAKI et al. 1997).

Alle genannten Eigenschaften unterstützen das intestinale Epithel maßgeblich in seiner Funktion als

intestinale Barriere.


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4

1.1.1 Darmmikroorganismen beim Schwein

Die mikrobielle Besiedlung des Schweinedarms beginnt unter der Geburt und setzt sich durch den

nachfolgenden Kontakt mit der Sau und der Umgebung fort. Die Zusammensetzung der

Bakterienspezies hängt dabei zu gleichen Teilen von der Besiedlung des Muttertieres zum Zeitpunkt

der Geburt und den in der unmittelbaren Umwelt vorherrschenden Keimen ab (SMITH 1965,

SCHULZE und BATHKE 1977, SCHULZE et al. 1980). Anders als menschliche Säuglinge, die

zumindest in den Industrieländern meist in eine keimarme Umgebung hineingeboren werden, sind

die Haussäugetiere sofort nach ihrer Geburt mit einer großen Menge an Keimen konfrontiert. Beim

Schwein kommt es schon zwei Stunden nach der Geburt zur Besiedlung des Darms mit koliformen

Keimen. Bereits nach 48 Stunden sind Laktobazillen und Clostridien vorhanden und es können

strikte Anaerobier, wie z.B. Bacteroides Spezies nachgewiesen werden (DUCLUZEAU 1985,

SWORDS et al. 1993). Die Bakteriendichte im Koloninhalt stabilisiert sich ausgehend von Sterilität

bei der Geburt nach 12 Stunden auf 109-1010 koloniebildende Einheiten pro Gramm. Durch die

veränderte Fütterung in Zusammenhang mit dem Absetzen erhöht sich der Anteil der Bacteroides

Spezies als dominierenden Anaerobiern (SWORDS et al. 1993). Im Darm gesunder abgesetzter

Schweine (Läufer) überwiegen jedoch die Laktobazillenspezies. Insbesondere Lactobacillus

acidophilus, macht den größten Teil der bakteriellen Besiedlung aus. Außerdem sind im gesamten

Magen-Darm-Trakt Streptokokken (Streptococcus bovis, Streptococcus fecalis und Streptococcus

faecium) nachweisbar. Die größte Dichte findet sich im Ileum und im Dickdarm (GÄRTNER et al.

1973, KENWORTHY 1973). Im Vergleich zum menschlichen Darm, bei dem mit bis zu 90 % der

Gesamtbakterienzahl Bacteroides-Spezies und Bifidobakterien vorherrschen (HAENEL 1969),

finden sich diese beim Schwein nur zu einem geringen Anteil von ca. 1% (SCHULZE und

BATHKE 1977). E. coli-Spezies tragen sowohl beim Schwein als auch beim Mensch mit 1-5% zur

anzüchtbaren Stuhlflora bei ( SEELIGER und WERNER 1965, HAENEL 1969).

Neben den Bakterien beherbergt der Darm auch Hefen. SCHULZE und BATHKE (1977) konnten

Hefen nur in geringen Mengen aus dem Magen und Dünndarm von Schweinen aber nicht aus dem

Dickdarm isolieren.


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5

1.1.2 Intestinale Barriere

Bei allen Säugetieren stellt der Darm die größte Fläche des Körpers dar, an der sich der Organismus

mit der Außenwelt auseinandersetzen muss. Um pathogenen und potentiell schädlichen Einflüssen

entgegenzuwirken, haben sich im Laufe der Evolution verschiedene Schutzmechanismen

entwickelt. Die Gesamtheit dieser Schutzfunktionen im Darm wird als „intestinale Barriere“

bezeichnet. Sie besteht aus den luminalen und epithelialen physiologischen Darmmikroorganismen

dem Epithel mit der Mukusschicht und Teilen des darmassoziierten Immunsystems (GALT).

Abb. 1 Intestinale Barriere

A =luminale und adhärente, kommensale Mikroorganismen des Darms, B = Mukusschicht, C =

Epithelzellschicht, D = GALT

Die außerordentliche Bedeutung der kommensalen Mikroorganismen für die „intestinale Barriere“

wird deutlich, wenn keimfrei aufgezogene Tiere, deren Darm keine Mikroorganismen enthält, mit

pathogenen Keimen konfrontiert werden. Es genügt dann schon eine geringe Konzentration von

Pathogenen, um letale Infektionen zu verursachen. Dabei handelt es sich um Konzentrationen, bei

denen konventionell gehaltene Tiere mit intakter Darmbesiedlung nicht oder nur sehr schwach

erkranken (NARDI et al. 1989).

AB

C

D


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6

1.2 Probiotika

1.2.1 Definition

Der Begriff Probiotika wurde 1965 eingeführt (LILLY und STILLWELL 1965). Er ist abgeleitet

aus den griechischen Worten „pro” und „bios” und bedeutet soviel wie „für das Leben”. Damit

wurde er dem Begriff „antibiotisch” gegenüber gestellt. LILLY und SPELLWELL (1965)

verwendeten den Begriff zur Beschreibung von „Substanzen, die von einem Mikroorganismus

sezerniert werden und das Wachstum eines anderen stimulieren”. Nach und nach setzte sich eine

mehr und mehr generalisierte Verwendung des Begriffs durch. PARKER (1974) war der erste, der

den Begriff Probiotika in der Weise verwendete, wie er heute benutzt wird. Neben den auf das

Wachstum positiv wirkenden Substanzen schloss diese Definition auch Mikroorganismen mit

positivem Einfluss auf den Wirt ein. Dabei waren nicht nur Wirkungen in bezug auf die

Wachstumsförderung sondern auch die generelle Beeinflussung der intestinalen Flora wichtig.

In dem Bestreben, Probiotika zu den in der Definition von Parker eingeschlossenen Antibiotika

klarer abzugrenzen, betonten verschiedene Untersucher in den folgenden Jahren die Notwendigkeit

der Verwendung lebender Mikroorganismen ( PARKER 1974, HAVENAAR und HUIS IN 'T

VELD 1992). Es stand aber immer noch der direkte Einfluss auf die intestinale Mikroflora des

Wirtes im Vordergrund (HAVENAAR und HUIS IN 'T VELD 1992). Andere Untersucher vertraten

eine generalisiertere Auffassung, in der die Wirkung von Probiotika auf die Gesundheit des Wirtes

und die Ernährung berücksichtigt wurde (SALMINEN 1996, SCHAAFSMA 1996). Diese

Definition schloss demnach fermentierte Milchprodukte mit ein.

SCHRENZENMEIR et al. (2001) kritisierten in diesem Zusammenhang die Verwendung des

Begriffs „Ernährung”. Des Weiteren erschien ihnen die Beschränkung auf Milchprodukte ungenau,

weil andere fermentierte Produkte, wie z. B. Sauerkraut und Salami, nicht mit einbezogen wurden.

Sie veränderten daraufhin die Definition zur heute noch gültigen und von der WHO anerkannten

Version von Probiotika als: „Eine Präparation eines Produktes oder ein Produkt, das lebende,

definierte Mikroorganismen in ausreichender Zahl enthält, die die Mikroflora (durch Implantation

oder Kolonisation) in einem Bereich des Wirtskörpers verändern und dadurch fördernde

Gesundheitseffekte auf den Wirt haben.” (SCHREZENMEIR und DE VRESE 2001)

Diese Definition trägt dem Umstand Rechnung, dass neben Mikroorganismen auch deren


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7

Präparationen, etwa in Form von Medikamenten, verwendet werden. Es wird auf die Wichtigkeit

einer ausreichenden Anzahl an Organismen hingewiesen. Die fehlende Beschränkung von

Einflüssen auf die inhärente Mikroflora trägt der prophylaktischen Anwendung Rechnung, die

heute einen Großteil des probiotischen Einsatzes ausmacht. Zuletzt bezieht sich die aktuelle

Definition nicht nur auf den Bereich des Magen-Darm-Trakts, sondern auf den gesamten

Gastrointestinaltrakt und andere Körperkompartimente, die eine mikrobiologische Flora

beherbergen, wie zum Beispiel die Haut oder der weibliche Genitaltrakt.

Probiotika werden von alters her zur Verbesserung der Gesundheit von Mensch und Tier eingesetzt.

Schon 76 vor Christus empfahl der römische Historiker Plinius die Anwendung von fermentierten

Milchprodukten bei Gastroenteritis (SCHREZENMEIR und DE VRESE 2001). Ende des 19. und

Anfang des 20. Jahrhunderts beschäftigten sich immer wieder Wissenschaftler mit der

gesundheitsfördernden Wirkung bestimmter Bakterienspezies. Neben prophylaktischen

Veränderungen der Zusammensetzung von inhärenten Mikroorganismen (CARRE 1887,

MECHNIKOFF 1907, TISSIER 1984) wurde auch die direkte therapeutische Bekämpfung

pathogener Bakterien diskutiert (NISSLE 1916).

Heute werden Probiotika sowohl in der Veterinärmedizin und Landwirtschaft als auch in der

Humanmedizin und Humanernährung eingesetzt.

1.2.2 Anwendung in der Veterinärmedizin und Landwirtschaft

Man unterscheidet zwischen dem Einsatz von probiotischen Keimen in der Fütterung (1) und dem

prophylaktischen und therapeutischen Einsatz in der Medizin (2).

(1) Der größte Teil der beim Tier verwendeten Probiotika wird in der Nutztierfütterung

eingesetzt und unterliegt damit dem Futtermittelgesetz (FMG). Auf diesen Bereich soll hier wegen

seiner großen Bedeutung für die Veterinärmedizin und die Landwirtschaft kurz eingegangen

werden, obwohl sich die im Folgenden vorgestellten Untersuchungen mit einem Keim beschäftigen,

der als Medikament verwendet wird.

Nach dem weitgehenden Verbot antibiotischer Leistungsförderer wurde in der Intensivtierhaltung

nach neuen Wegen gesucht, diese zu ersetzen, wobei sich Probiotika als Alternative erwiesen. In


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8

der Europäischen Union sind derzeit 21 Probiotikapräparationen als Futterzusatzstoffe für die

verschiedenen Nutztierspezies (Schwein, Wiederkäuer, Geflügel und Fische) zugelassen

(Europäische Union 2003). Sie enthalten als Mono- oder Kombinationspräparate Keime der

Bakteriengattungen Bacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Lactobacillus und Streptococcus,

sowie der Hefe Saccharomyces.

Besonders im Schweinefutter finden sich inzwischen immer häufiger Probiotika. Als deren positive

Wirkung wird bei Monogastriern wie dem Schwein nicht primär eine Leistungssteigerung durch

höhere Mastleistung und bessere Futterverwertung angenommen, sondern die Aufgabe der

Probiotika scheint vielmehr in der Aufrechterhaltung einer physiologischen mikrobiellen

Darmbesiedlung zu liegen. Diese soll dann sekundär zu einer verbesserten Leistung zur Folge haben

(Europäische Union 2000).

So führte die Fütterung von Bifidobacterium pseudolongum und Lactobacillus acidophilus an

neugeborene Ferkel von der Geburt, über das Absetzen hinaus bis zum 56. Lebenstag zu einer

schnelleren Gewichtszunahme, und Bifidobacterium pseudolongum verbesserte zusätzlich die

Futterverwertung. Des weiteren senken bestimmte Bifidobakterienspezies die Mortalitätsrate von

Saugferkeln bis zum 28. Lebenstag um 20 % (ABE et al. 1995). Für mit Bacillus cereus

substituierte Ferkel ist ebenfalls eine Verbesserung der Gewichtszunahme beschrieben

(KIRCHGESSNER et al. 1993). Es wundert nicht, dass Probiotika auf dieser Grundlage heute

insbesondere im Ferkelstarterfutter zu finden sind.

Die Auswirkungen probiotischer Mikroorganismen auf ältere Schweine sind hingegen

widersprüchlich. Während ROSEN (1992) kaum Auswirkungen auf die Leistung (<1%) von

erwachsenen Tieren festgestellt hat, konnten eine neuere Feldstudie nach Fütterung eines Präparates

mit Bacillus lichiniformis Sporen und Bacillus cereus Sporen zeigt, dass sowohl die mittlere

tägliche Gewichtszunahme als auch die Futterverwertung bei Mast- und Endmastschweinen

deutlich verbessert sind. Dabei ist die tägliche Gewichtszunahme bei wachsenden Mastschweinen

bis zu 7,2% höher als bei Kontrolltieren ohne Probiotika. Die Futterverwertung ist mit einer

9,5%igen Erhöhung in der Mast und 5,5%igen Erhöhung in der Endmast besser als die bei Einsatz

von antibiotischen Leistungsförderern als rentable angesehenen 5% (ALEXOPOULOS et al. 2004).

ALEXOPOULOS et al. (2004) konnten außerdem zeigen, dass die Schlachtkörper der mit

Bacillussporen gefütterten Tier in höhere Güteklassen eingeteilt wurden.


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9

(2) Die therapeutische Anwendung von Probiotika in der Veterinärmedizin ist eher gering im

Vergleich zur prophylaktischen Anwendung in der Fütterung und der therapeutischen Anwendung

in der Humanmedizin. Als Medikamente zugelassene Probiotika unterliegen, anders als die

Futtermittelzusatzstoffe, dem Arzneimittelgesetz (AMG) und damit den strengen Richtlinien der

Arzneimittelzulassung. Sie werden zur Behandlung von Gastroenteritiden insbesondere bei

Jungtieren eingesetzt. Allerdings erfolgt die Verwendung weniger zur Monotherapie als zur

Prophylaxe, Substitution- oder Regenerationstherapie (KAHRS 1986, FOX 1988, IBEN und

LEIBETSEDER 1989). Beispielsweise wird, um Salmonella typhimurium Infektionen vorzubeugen,

ein Gemisch aus Lactobacillus acidophilus, Streptococcus faecium und Salmonellen-Antikörper bei

Puten eingesetzt (PROMSOPONE et al. 1998).

1.2.3 Anwendung in der Humanmedizin und Ernährung

Probiotika werden traditionsgemäß beim Menschen schon sehr viel länger eingesetzt als beim Tier.

Im Zuge der Antibiotikaentdeckung Ende des 19. Jahrhunderts gerieten die

Anwendungsmöglichkeiten zum Teil wieder in Vergessenheit, und es wurde nur noch von wenigen

Wissenschaftlern auf diesem Gebiet geforscht. Nicht zuletzt durch das vermehrte Auftreten von

Antibiotikaresistenzen in den letzten Jahren, der Häufung von Allergien, sowie der erhöhten

Sensibilisierung der Bevölkerung für gesunde Ernährung und durch die wachsende Akzeptanz

ganzheitlicher Heilmethoden, erfreuen sich Probiotika wieder wachsender Beliebtheit.

Ähnlich wie beim Tier werden probiotische Mikroorganismen beim Menschen häufiger in der

Ernährung (1), in Form von Lebensmitteln oder Lebensmittelzusatzstoffen, als in der Therapie (2)

von Erkrankungen eingesetzt. Sie unterliegen in diesen Fällen dem Lebensmittel- und

Bedarfsgegenstände-Gesetz (LMBG). Inzwischen beläuft sich der Markt probiotischer Lebensmittel

auf einen weltweiten Umsatz von sechs Mil. US$ (ABBOTT 2004). Die Hersteller versprechen

dabei eine positive Wirkung auf die Gesundheit und das Immunsystem.

(1) Die Verwendung von Nahrungsmitteln mit apathogenen Bakterien, besonders in Form

fermentierter Milchprodukte, hat nicht nur in Europa eine lange Tradition. Dem Verzehr von

Joghurt oder Sauermilch, bei denen die Beimpfung mit Bakterien ursprünglich nur zur

Konservierung erfolgte, wurde mit der Zeit auch mehr und mehr ein gesundheitsfördernder Effekt


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10

nachgesagt. Um diesen noch zu erweitern, setzt man seit dem letzten Jahrhundert diesen

Lebensmitteln neben den klassischen Fermentationskulturen vielfach auch probiotische Keime zu.

Es handelt sich dabei hauptsächlich um Bakterien der Gattungen Bifidobacterium und

Lactobacillus.

Leider gibt es kaum evidenzbasierte Studien über den Nutzen von probiotischen Lebensmitteln für

die Gesundheit des Verbrauchers.

(2) Anders als in der Veterinärmedizin hat die Verwendung probiotischer Keime als

Therapeutikum in der Humanmedizin in den letzen Jahren zugenommen. Die Anwendungen sind

dabei vielfältig. Allerdings liegen nicht für alle Bereiche gesicherte, prospektive, klinische Studien

vor.

Gesicherte Untersuchungen gibt es zu infektiösen Diarrhöen bei Kleinkindern (MCFARLAND et

al. 1995, VANDERHOOF et al. 1999, SZAJEWSKA et al. 2001, SURAWICZ 2003), der

Remmissionserhaltung von Colitis ulcerosa (KRUIS et al. 1997, REMBACKEN et al. 1999), der

Behandlung von Pouchitis (GIONCHETTI et al. 2003) und der Allergievorsorge bei Säuglingen

(MAJAMAA und ISOLAURI 1997, ROSENFELDT et al. 2003).

Behandlungserfolge bei akuten Diarrhöen werden durch Probiotika, insbesondere Lactobacillus

rhamnosus GG (LGG) und Saccharomyces boulardii (SAB), hauptsächlich bei Säuglingen und

Kleinkindern erzielt, also in einem Alter, in dem die Darmbarriere noch nicht voll entwickelt ist.

Auslöser dieser Diarrhöen sind häufig Rotavirus- und Antibiotika-induzierte Clostridium difficile

Infektionen.

Prophylaktisch verringern Laktobazillen das Auftreten von Gastroenteritiden durch Rotaviren um

14,5% (SZAJEWSKA et al. 2001). Es wurde gezeigt, dass nicht etwa die Infektionsrate verringert

wird, sondern seltener Krankheitssymptome auftreten (SZAJEWSKA et al. 2001, ROSENFELDT

et al. 2002a, 2002b). Die Prävention von antibiotikaassoziierten Diarrhöen wird durch LGG um 18

% reduziert (VANDERHOOF et al. 1999). Ähnliche Ergebnisse werden mit SAB erzielt. Die

positiven Effekte zeigen sich bei Einsatz von SAB besonders in der Substitutionstherapie mit

zusätzlicher Antibiotikagabe (MCFARLAND et al. 1995, SURAWICZ et al. 2000, SURAWICZ

2003). Bei Erwachsenen sind die Ergebnisse zur positiven Wirkung von Probiotika gegen

Durchfällen uneinheitlich. Allerdings senkt die Gabe von SAB die Diarrhöerate bei enteral

ernährten Intensivpatienten (BLEICHNER et al. 1997).

Die Modulation der mechanischen und immunologischen Darmbarriere durch Probiotika


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prädestiniert sie geradezu für den Einsatz bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED).

Obwohl man noch kaum etwas über die Wirkungsmechanismen weiß, existieren insbesondere für

die Remmissionserhaltung bei Colitis ulcerosa Studien, die dem probiotischen E. coli Stamm Nissle

1917 (EcN) die gleiche Wirksamkeit wie dem standardmäßig verwendeten Mesalazin bescheinigen

(KRUIS et al. 1997, REMBACKEN et al. 1999, KRUIS et al. 2001). Eine andere Studie zeigt

Evidenzen, dass auch ein Gemisch aus verschiedenen Laktobazillen- und Bakteroidesspezies

(VSL#3) einen positiven Effekt bei der Remmissionserhaltung der Colitis ulcerosa hat (VENTURI

et al. 1999).

Bei der Remissionserhaltung und Therapie des Morbus Crohn sind die Ergebnisse zur Wirksamkeit

von Probiotika widersprüchlich (GUPTA et al. 2000, PRANTERA et al. 2002). Es gibt allerdings

Anzeichen, dass Kinder mit mäßig ausgeprägtem Morbus Crohn von der Behandlung mit LGG

profitieren (GUPTA et al. 2000).

Patienten mit therapierefraktärer Colitis ulcerosa oder Kolonkarzinom wird nach Proktokolektomie

ein Pouch angelegt. Eine der häufigsten Komplikationen ist dabei eine rezidivierende Entzündung.

Patienten mit chronischer Pouchitis werden unter Anwendung von VSL#3 erfolgreich in Remission

gehalten (GIONCHETTI et al. 2000, MIMURA et al. 2004). Außerdem konnte, wenn auch bisher

nur für kleine Fallzahlen, gezeigt werden, dass VSL#3 die Inzidenz einer akuten Pouchitis post

operationem verringert (GIONCHETTI et al. 2003).

Von Allergien sind insbesondere in den Industrieländern große Anteile der Bevölkerung betroffen,

und die Inzidenz ist in den letzten Jahren deutlich steigend (KAY 2001a, 2001b). Besonders Kinder

und Kleinkinder leiden immer häufiger an verschiedenen Formen allergischer Reaktionen. Es hat

sich gezeigt, dass insbesondere Laktobazillen vor Allergien schützen können. So konnte gezeigt

werden, dass LGG und Lactobacillus reuteri klinische Symptome und Laborparameter bei Kindern

mit atopischer Dermatitis verbessern (MAJAMAA und ISOLAURI 1997, ROSENFELDT et al.

2003).

Wenn Mütter ante partum und die Säuglinge postnatal bzw. stillenden Mütter mit LGG behandelt

wurden, konnte das Auftreten atopischer Ekzeme bei Kindern mit hohem familiärem Allergierisiko

halbiert werden (KALLIOMAKI et al. 2001, KALLIOMAKI et al. 2003).

Die Prävention von Allergien oder rezidivierenden Infektionen konnte von anderen Untersuchern

auch für die Behandlung mit einem apathogenen E. coli bestätigt werden (LODINOVA-

ZADNIKOVA et al. 2003). Anzumerken ist, dass die allergieprophylaktische Wirkung nur eintritt,


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12

wenn die Behandlung mit Probiotika in einem Alter erfolgt, in dem sich ein Gleichgewicht in der

Darmbesiedlung noch nicht eingestellt hat. Werden die Probiotika erst an Teenager oder beim

jungen Erwachsenen gegeben, lässt sich keine positive Wirkung mehr beobachten (HELIN et al.

2002). Außerdem ist die Verwendung lebender Bakterien von entscheidender Bedeutung, da oben

genannte Effekte nur mit lebenden, nicht aber mit hitze-inaktivierten Bakterien erzielt werden

können (KIRJAVAINEN et al. 2003).

Neben den Haupteinsatzbereichen der Probiotika in der Behandlung von Gastroenteritiden und

Allergien gibt es auch erste Hinweise auf die Wirksamkeit beim Reizdarmsyndrom vom Diarrhöe-

Typ (KIM et al. 2003). Eine positive Beeinflussung der Laktoseintoleranz (SALTZMAN et al.

1999) und der Stahlenenteritis (URBANCSEK et al. 2001) konnte hingegen nicht nachgewiesen

werden. Für die Tumorprävention bei kolorektalen Karzinomen und die Cholesterinsenkung sind

die Daten widersprüchlich (DE ROOS und KATAN 2000, HIRAYAMA und RAFTER 2000).

1.2.4 Wirkungsmechanismen

Die in der Literatur beschriebenen Verwendungsweisen von Probiotika legen die Vermutung nahe,

dass nur einige wenige Mikroorganismen bei bestimmten Erkrankungen wirksam sind. Ob sich

diese Sichtweise auf Dauer wird halten lassen, ist noch unklar, da es für die entsprechenden Studien

häufig keine Vergleichsuntersuchungen mit anderen probiotischen Mikroorganismen gibt. Ein

allgemein gültiges „probiotisches Wirkprinzip“ erscheint aber schon auf Grund der Unterschiede

zwischen den verwendeten probiotischen Spezies als unwahrscheinlich. Wie die vielen

unterschiedlichen Ansätze in der Erforschung probiotischer Effekte deutlich machen, ist vielmehr

davon auszugehen, dass verschiedene Mechanismen als Grundlage probiotischer Wirksamkeit in

Frage kommen.

Die Erklärungsversuche für die Effekte von Probiotika fokussieren sich auf zwei Möglichkeiten.

Bei der einen handelt es sich um die Wechselwirkung und Beeinflussung der inhärenten

Darmmikroorganismen durch Probiotika, bei der zweiten um den Einfluss, den Probiotika auf ihren

Wirt, insbesondere auf die Epithelbarriere und das darmassoziierte Immunsystem ausüben.


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13

1.2.4.1 Wirkung von Probiotika auf die Darmmikroorganismen

Das Wechselspiel zwischen pathogenen und fakultativ pathogenen Bakterien auf der einen Seite

und physiologischen Darmmikroorganismen und Probiotika auf der anderen Seite wurde am

intensivsten bei LGG und SAB untersucht.

Die physiologischen Mikroorganismen stellen den am weitesten luminal gelegenen Teil der

Darmbarriere dar. Sie schaffen im Normalfall ein stabiles Mikromilieu im Darm, das potentielle

Pathogene abwehrt. Unterschiedliche Probiotika können auf verschiedene Weise in dieses

Gleichgewicht eingreifen und es positiv beeinflussen.

Bifidobacterium bifidum verringert bei Säuglingen den pH-Wert im Stuhl und verschlechtert damit

die Lebensbedingungen für Pathogene (LANGHENDRIES et al. 1995). Ähnliche Ergebnisse liegen

auch für Versuche mit Bifidobacterium longum bei Erwachsenen vor (BENNO und MITSUOKA

1992).

Für die Hefe Saccharomyces boulardii ließ sich ein Einfluss auf den Gehalt und die molaren

Anteile der kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) im Dickdarm nachweisen. Wird Clindamycin, ein

Antibiotikum, von dem bekannt ist, dass es häufig Antibiotika-assoziierte Diarrhöen auslöst, in

einem in vitro Simulationsmodell des Kolonstoffwechsels eingesetzt, sinkt die Gesamt-SCFA-

Produktion. Bei gleichzeitiger Gabe von SAB verändert sich die Gesamt-SCFA-Produktion im

Vergleich zu Kontrollbedingungen ohne Clindamycin jedoch nicht. Ein Clindamycin-bedingtes

Absinken der Butyratkonzentration wird durch SAB allerdings nicht kompensiert (BREVES et al.

2000a). SCFA, insbesondere Butyrat, sind wichtig für die Ernährung und damit die Integrität der

Kolonozyten, sowie eine funktionierende Wasser- und Natriumretention aus dem Darmlumen

(ROEDIGER 1980). Zusätzlich konnten BREVES et al. (2000) zeigen, dass die Anwesenheit von

SAB ein Clindamycin-abhängiges Absinken der mikrobiellen Proteinsynthese verhindert.

Laktobazillen sind in der Lage, die Aktivität verschiedener Enzyme im Kot zu verändern. Sie

verringern beispielsweise die Aktivität von β-Glukuronidase, Nitroreduktase und

Glykocholathydrogenase und verändern dadurch wiederum das intestinale Milieu zu Ungunsten von

Pathogenen (LING et al. 1994).

Bifidobakterien können in vitro unter Neutralisierung freier Radikale Eisen an ihre Zellmembran

binden (KOT und BEZKOROVAINY 1999). Sie sind damit in der Lage, das Redoxpotential im

Darm zu erniedrigen und gleichzeitig eine Verknappung des für die meisten Pathogene wichtigen


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Wachstumsfaktors Eisen zu fördern. Diese Fähigkeit zur Bindung freier Radikale wurde auch bei

einigen Laktobazillenstämmen nachgewiesen (STECCHINI et al. 2001).

Neben Veränderungen der chemischen Bedingungen im Darmlumen treten Probiotika auch in

direkte Wechselwirkung mit anderen Mikroorganismen ihrer Umgebung. Von Laktobazillen weiß

man, dass sie in vitro an die gleichen Mannoserezeptoren binden, die auch von pathogenen

Stämmen der Spezies E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Salmonella, Shigella, Pseudomonas und

Vibrio cholerae benötigt werden, um sich im Darm zu etablieren (ADLERBERTH et al. 1996).

Auch Bifidobakterien adhärieren in vitro an Epithelzellen (BERNET et al. 1993, PEREZ et al.

1998). Wenn Laktobazillen mit Pathogenen um die Bindung an Rezeptoren im Gastrointestinaltrakt

konkurrieren, würde demnach eine Erhöhung der Laktobazillenkonzentration den Konkurrenzdruck

verstärken. Bei einigen wenigen Lactobazillenstämmen konnte auch in vivo eine Adhäsion

nachgewiesen werden ( TANNOCK et al. 1988, NEMCOVA et al. 1997).

Bifidobakterien scheinen jedoch nach der bisherigen Datenlage im Darm nicht zu adhärieren

(BOUHNIK et al. 1992). Allerdings konnte ein von Bifidobakterien produziertes Protein

nachgewiesen werden, das die Anheftung von E. coli verhindert, was eine direkte Konkurrenz der

Bakterien um Rezeptoren überflüssig machen würde (FUJIWARA et al. 1997).

Zusätzlich sezernieren LGG und probiotische Bifidobakterien auch noch andere Substanzen, die in

der Lage sind, durch pathogene Mikroorganismen produzierte Toxine z.B. Aflatoxin B und E. coli–

Endotoxin, zu binden und somit zu inaktivieren (HASKARD et al. 2000, OATLEY et al. 2000).

1.2.4.2 Wirkungen auf den Wirt

Epithel ↔ Probiotika

Der erste vom Wirt gebildete Anteil der intestinalen Barriere ist die Muzinschicht, die von den

Epithelzellen als Schutzfaktor sezerniert wird.

Es hat sich gezeigt, dass Probiotika die Bildung und Zusammensetzung der Muzinschicht sowie die

Anzahl der muzinproduzierenden Becherzellen beeinflussen können. Von LGG und Lactobacillus

plantarum weiß man, dass sie in vitro die mRNA-Expression von MUC2 und MUC3 induzieren

(MACK et al. 1999). MUC2 und MUC3 sind die dominierenden Muzine im Dünn- und Dickdarm

des Menschen (CHANG et al. 1994). Es handelt sich hierbei um hochmolekulare Glykoproteine,

die von Epithelzellen und Becherzellen zum Schutz vor bakterieller und viraler Anheftung und zur


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Bindung proinflammatorischer Moleküle sezerniert werden. Im entzündeten Darm lässt sich

dementsprechend auch eine erhöhte Produktion von Muzinen nachweisen. Bei CED-Patienten

hingegen ist die Zahl an Becherzellen und damit auch die Menge an sezerniertem Muzin deutlich

verringert (MACK et al. 1992), wodurch die Schutzfunktion gegenüber dem Epithel beeinträchtigt

ist. Der Verlust dieses Epithelschutzfaktors wird als ein Grund für die Aufrechterhaltung der

Entzündung durch die Darmflora bei CED angesehen. SAB und Bacillus cereus Varietas toyoi (B.

cer. var. toyoi) führen zu einer Erhöhung der Anzahl von Becherzellen im Dickdarm (BAUM et al.

2002). Es ist also nicht unwahrscheinlich, dass auch weitere probiotische Keime in der Lage sind,

durch eine erhöhte Muzinproduktion die Symptome intestinaler Entzündung zu verringern.

Neben dem Einfluss auf die Muzinproduktion wirken Probiotika auch direkt auf die Epithelzellen.

LGG führt bei der Ratte zu einer erhöhten Mitoserate im Dünndarmepithel und damit zu einer

größeren Anzahl an Epithelzellen in den Zotten (BANASAZ et al. 2002). Auch bezüglich der

Regeneration des Epithels wurden mit LGG gute Erfolge erzielt. So konnte gezeigt werden, dass

LGG durch Blockierung der pro-apoptotischen p38 MAP-Kinase und Produktion eines Akt-Kinase-

aktivierenden, und somit anti-apoptotisch wirkenden Faktors, bei Mäusen die zytokininduzierte

Apoptose intestinaler Epithelzellen in vitro verhindern kann (YAN und POLK 2002).

In einem Milchallergiemodell mit neugeborenen Ratten verringert LGG die Permeabilität des

Darmepithels für Antigene. Damit werden die Art und Qualität der Antigenpräsentation gegenüber

dem intestinalen Immunsystem durch Veränderung von Dosis und Größe der Antigene beeinflusst.

Dies bedingt eine tolerogene Wirkung von LGG (ISOLAURI et al. 1993, GARCIA-LAFUENTE et

al. 2001).

Eine weitere Möglichkeit zur Beeinflussung des Darmepithels bietet sich für Probiotika durch

Veränderung der elektro- und transportphysiologischen Eigenschaften.

Prophylaktisch verabreichte Laktobazillen normalisieren einen durch enteropathogene E. coli

Bakterien (EPEC) erhöhten Kurzschlussstrom in Epithelzellen einer Kolonzelllinie (CaCo2)

(MICHAIL und ABERNATHY 2002). VSL#3 (ein Nahrungsergänzungsmittel für den Menschen

mit probiotischen Spezies der Gattungen Lactobacillus, Streptococcus und Bifidobacterium) führt

im Tierversuch am Kolonepithel von Mäusen eines Kolitismodells (IL-10 knock-out) im Vergleich

mit unbehandelten Tieren ebenfalls zu einer Normalisierung des Kurzschlussstroms. Die cAMP-

abhängige Chloridsekretion erreicht unter VSL#3-Behandlung Werte, die denen genetisch


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unveränderter Tiere entsprechen. Die parazelluläre Wasserleitfähigkeit des Epithels wird unter

VSL#3-Gabe sogar unter die Normalwerte genetisch unveränderter Kontrollen gesenkt (MADSEN

et al. 2001). In In-vitro-Experimenten wurde von MADSEN et al. (2001) außerdem gezeigt, dass

ein von VSL#3-Bakterien produzierter Faktor für die positiven Effekte auf die Epithelpermeabilität

verantwortlich ist.

Auch epitheliale Transportvorgänge werden durch Probiotika beeinflusst. So stimulieren SAB und

B. cer. var. toyoi die Natrium-abhängige Glukoseaufnahme im Jejunum des Schweins (BREVES et

al. 2000b). Damit fördern sie nicht nur die Nährstoffversorgung des Wirts, sondern sorgen auch für

einen beschleunigten Abtransport von Glukose aus dem Darmlumen und verringern so die

Triebkraft für den luminalen Flüssigkeitsaustritt aus dem Gewebe.

Ein interessanter Wirkungsansatz lässt sich aus Versuchen mit apathogenen Salmonellen ableiten.

In In-vitro-Versuchen mit intestinalen Epithelzellen (T 84) und apathogenen Salmonellen ergab sich

eine Hemmung der IL-8 Produktion, unabhängig davon, ob die Zellen unter proinflammatorischen

Stimuli standen oder nicht (NEISH et al. 2000). Eine nähere Untersuchung der Mechanismen durch

NEISH et al (2000) zeigte eine verringerte Freisetzung des NFκB-Regulators IκB-α nach erfolgter

Phosphorylierung und damit eine verminderte Translokation des Transkriptionsfaktors NFκB in den

Zellkern. Dies führte zu einer verminderten Transkription proinflammatorischer Zytokine wie IL-8.

Von Epithelzellen gebildetes IL-8 spielt eine wichtige Rolle am Beginn und bei der

Aufrechterhaltung intestinaler Entzündungen von CED-Patienten (BANKS et al. 2003). Hinweise

darauf, dass auch Probiotika über IL-8 das Entzündungsgeschehen im Darm beeinflussen, ergaben

die Untersuchungen von JIJON et al. (2004). Sie konnten zeigen, dass VSL#3-DNA unter Induktion

mit TNF-α die mRNA-Expression von IL-8 in HT-29 Zellen zwar erhöht, die Sekretion von IL-8

aber verringert. EcN hingegen induziert, im Gegensatz zu LGG, die IL-8 mRNA-Expression in

intestinalen Epithelzelllinien (LAMMERS et al. 2002). Ob dadurch auch die Sekretion von IL-8

erhöht wird, ist allerdings noch nicht bekannt.

Neben dem Einfluss auf IL-8 senkt VSL#3 auch die Produktion des proinflammatorischen Zytokins

INF-γ im Darm von IL-10 knock-out Mäusen (JIJON et al. 2004).

Die weitaus größte Zahl der genannten Mechanismen ist an die Lebensfähigkeit probiotischer

Bakterien gekoppelt.


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Immunsystem ↔ Probiotika

Probiotika beeinflussen sowohl das angeborene als auch das adaptive Immunsystem. Ein Effekt auf

das angeborene Immunsystem zeigt sich insbesondere in einer Beeinflussung der Phagozytose von

Makrophagen und Granulozyten. Die orale Gabe verschiedener Laktobazillenstämme fördert die

Phagozytoseaktivität von murinen Makrophagen (PERDIGON et al. 1986, PERDIGON et al. 1988).

Von Untersuchungen beim Menschen weiß man, dass LGG die Phagozytoseaktivität von

neutrophilen Granulozyten im Blut erhöht (SCHIFFRIN et al. 1995). Werden Makrophagen, die

zuvor mit zellfreien Lactobacillus acidophilus und Bifidobacterium longum Extrakten behandelt

worden sind, in vitro mit pathogenen Salmonellen infiziert, ist ihre Phagozytose gesteigert

(HATCHER und LAMBRECHT 1993). Interessanterweise wird eine bei allergischen Patienten

häufig pathologisch erhöhte Phagozytoseaktivität nach Behandlung mit LGG herunterreguliert,

wohingegen gesunde Probanden eine Hochregulation erkennen lassen (PELTO et al. 1998). Die

Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass die Wirkung eines Probiotikums nicht nur vom

Probiotikum selbst, sondern auch von der immunologischen Ausgangssituation des Organismus

abhängt.

Die Wirkung von Probiotika auf die adaptive humorale Immunantwort wurde besonders im

Zusammenhang mit Infektionskrankheiten und anhand von Vakzinationsstudien untersucht. Dabei

erhöhen Bifidobakterien und LGG bei Mäusen als Antwort auf Choleratoxingabe die lokale

Sekretion von spezifischem IgA im Darm (YASUI et al. 1992). Bei Säuglingen wurde im Darm

nach Behandlung mit Bifidobakterien und LGG eine erhöhte IgA Konzentration gegen Rotaviren

beobachtet (MAJAMAA et al. 1995). In diesem Zusammenhang zeigte sich nicht nur eine erhöhte

lokale IgA-Konzentration, sondern auch eine erhöhte Konzentration von antigenspezifischem IgA

im Serum (KAILA et al. 1992). Im Milchallergie-Modell mit Labornagern werden unter der

Behandlung mit Bifidobakterien bzw. LGG erhöhte Konzentrationen an β-Lactoglobulin-

spezifischen Antikörpern nachgewiesen (ISOLAURI et al. 1993, TAKAHASHI et al. 1998). Diese

Ergebnisse gehen konform mit einer verbesserten Symptomatik der Milch-assoziierten, atopischen

Dermatitis bei Kindern mit Milchallergie (MAJAMAA und ISOLAURI 1997). Probiotika können

demnach die spezifische Abwehr durch vermehrte Bildung sekretorischer IgA-Antikörper

verbessern, ein Mechanismus, den man sich auch bei der Vakzinierung von Kindern zunutze macht

(ISOLAURI et al. 1995, FANG et al. 2000).

Einige Probiotika sind außerdem in der Lage, Antigene zu degradieren. LGG beispielsweise


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18

verändert Milchkasein derart, dass es bei in vitro Versuchen mit PBMC von Milchallergikern keine

Immunreaktion mehr auslöst (SUTAS et al. 1996a, 1996b).

Neben Einflüssen auf die angeborene und adaptiv-humorale Immunantwort gibt es auch zahlreiche

Hinweise auf eine Beeinflussung adaptiver zellulärer Immunvorgänge durch Probiotika.

Experimente haben gezeigt, dass besonders einige Laktobazillenstämme die adaptive, zelluläre

Immunantwort in Richtung einer T-Helferzell-1-Antwort (Th1-Antwort) modulieren können. In

vitro stimulieren sie dendritische Zellen (DC), PBMC und Monozyten zur Produktion von IFN-γ

und IL-12 und fördern so die Bildung von Th1-Zellen (HALLER et al. 2000a, CHRISTENSEN et

al. 2002). Andere Arbeiten zeigten, dass sich verschiedene Probiotika unterschiedlich auf die

Differenzierung von DCs auswirken können, was je nach verwendetem Probiotikum zu einer

Favorisierung verschiedener Th-Zellantworten führen kann (CHRISTENSEN et al. 2002).

Einflüsse auf das Zytokinprofil lassen sich in vivo bei Experimenten an IL-10 knock-out Mäusen

bestätigen. Im Darm dieser Tiere normalisiert das Probiotikagemisch VSL#3 die pathologisch

erhöhte TNF-α und IFN-γ Sekretion. Außerdem wird unter inflammatorischer Stimulation durch

Lipopolysaccharid (LPS) sowohl bei Knock-out-Mäusen als auch bei genetisch unveränderten

Tieren eine überschießende TNF-α und IFN-γ Sekretion im Darm verhindert. Klinisch kommt es

bei IL-10 knock-out- Mäusen zu einer deutlichen Verbesserung der Kolitissymptomatik (MADSEN

et al. 2001).

Eine andere In-vivo-Studie an Mäusen zeigt, dass nach Gabe von Laktobazillen die Konzentration

an IL-10 produzierenden Zellen im Darm steigt. Dies gilt allerdings nicht für alle getesteten

Laktobazillenstämme gleichermaßen. IL-10 ist ein Zytokin, dem antitolerogene und

inflammationsregulatorische Eigenschaften zugeschrieben werden. (MAASSEN et al. 2000).

Der Einfluss von Probiotika auf die adaptive zelluläre Immunität stellt sich in der Literatur als sehr

vielseitig dar und zeigt verschiedene Möglichkeiten für Wirkmechanismen probiotischer

Mikroorganismen auf.

Interessanterweise haben neue Untersuchungen gezeigt, das Probiotika sogar nach subkutaner

Applikation Entzündungssymptome bei IL-10 knock-out Mäusen sowie im Kollagen-induzierten

Arthritismodell der Maus verbessern und in der Milz die Produktion von immunmodulatorisch

wirkendem TGF-β stimulieren (SHEIL et al. 2004).


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Gewebsmorphologie ↔ Probiotika

Nicht zuletzt können Probiotika auch die Architektur der Darmmukosa beeinflussen. SAB und B.

cer. var. toyoi erhöhen beim Schwein die Dicke der Jejunummukosa. Die Villi des Jejunums sind

verlängert. Als Ursache für eine derartige Zottenverlängerung wird eine möglicherweise verringerte

Apoptoserate vermutet. Im Kolon zeigt sich eine Verringerung der Mukosadicke (BAUM et al.

2002).

Die dargestellten Wirkungen von Probiotika auf die verschiedenen Bereiche der intestinalen

Barriere dürfen nicht isoliert betrachtet werden. Epithel, bakterielle Flora und das

Darmimmunsystem stehen nicht nur anatomisch sondern auch physiologisch in enger

Wechselwirkung. So zeigten HALLER et al. (2000), dass sich in vitro nach Zugabe von Probiotika

die Zytokinsekretion intestinaler Kolonepithelzellen unter Anwesenheit von Lymphozyten von der

Zytokinsekretion isolierter Kolonepithelzellen unterscheidet (HALLER et al. 2000b).

Außerdem gibt es Untersuchungen, die zeigen, dass Bakterien in Epithelzellen die Expression von

Molekülen induzieren, die den Keimen wiederum die Besiedlung des Darms erleichtern (BRY et al.

1996, HOOPER et al. 1999).

1.3 Escherichia coli Nissle 1917

Der probiotische Escherichia coli Stamm Nissle 1917 (EcN) wurde Anfang des letzten Jahrhunderts

vom Humanmediziner Dr. Alfred Nissle aus dem Darm eines diarrhöeresistenten Soldaten isoliert.

1917 wurde das von Nissle entwickelte Präparat Mutaflor® mit dem Inhaltsstoff EcN als

geschütztes Warenzeichen eingetragen (LOEW 2000). Unter diesem Namen wird es auch heute

noch von der Firma Ardeypharm GmbH, Herdecke, Deutschland vertrieben.

Der Keim gehört der Serogruppe O6:K5:H1 an. Er verfügt, bedingt durch Typ 1-, F1C-, und Curli-

Adhäsine, sowie Flagellen-abhängiger Bewegungsmöglichkeit über ein gutes Adhäsionsvermögen,

besitzt jedoch keine pathologischen Adhäsionsfaktoren wie F4- oder F6-Fimbrien. EcN bildet fünf

verschiedene Siderophorsysteme, was dem Keim insbesondere im eisenarmen Milieu des Darms

eine optimale Eisenaufnahme ermöglicht (BLUM et al. 1995). Er produziert Mikrozine, um nahe

verwandte Bakterienstämme zu unterdrücken. Entscheidend für eine Verwendung als Probiotikum

ist außerdem seine hohe Mutationsresistenz, die ihn von anderen E. coli-Stämmen unterscheidet.


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1.3.1 Wirkmechanismen und therapeutische Anwendung von EcN

In-vitro-Studien mit intestinalen Epithelzelllinien (INT 407) haben gezeigt, dass EcN die Adhäsion

und Invasion von Salmonellen und verschiedenen anderen invasiven Pathogenen erheblich

reduziert. Dabei ist ein direkter Kontakt mit den Epithelzellen nicht notwendig (ALTENHOEFER

et al. 2004). Dies bestätigt sich in In-vivo-Versuchen mit gnotobiotischen Schweinen (MANDEL et

al. 1995). Bei Experimenten mit invasiven E. coli Stämmen, die aus dem Stuhl von Morbus Crohn

Patienten isoliert wurden, konnte gezeigt werden, dass deren Adhäsion und Invasion um bis zu über

90% verhindert wird. Außerdem wurde nachgewiesen, dass EcN mit bis zu 90% seiner

Inokulationsdosis an INT407-Zellen adhäriert. Die Adhäsionsfaktoren weisen dabei eine höhere

Affinität auf als die anderer Kolikeime (BOUDEAU et al. 2003).

Des Weiteren ist bekannt, dass EcN Mutaflozin, ein spezifisches Mikrozin, bildet, das in Kultur

antibakteriell wirksam ist. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass der Keim resistent gegen

Mikrozine anderer Kolistämme ist (SCHUBERT et al. 1999). EcN ist schon bei 37°C zum

„Quorum sensing“, dem Messen der Bakteriendichte mit Hilfe von Signalmolekülen durch eine

einzelne Zelle, befähigt (HACKER et al. 2000). Andere im Darm vorkommende Kolistämme sind

dazu bei Körpertemperatur nicht in der Lage, sondern können dies erst bei 26°C. Alle genannten

Mechanismen verschaffen dem Keim bei der Besiedlung des Intestinaltrakts einen

Selektionsvorteil.

Obwohl im Vergleich zu anderen Probiotika wenig über mögliche Wirkungsmechanismen von EcN

veröffentlicht wurde, existieren eine Reihe von Untersuchungen zum therapeutischen Potential. So

ergaben doppel-blind, placebokontrollierte Studien mit Colitis ulcerosa Patienten eine

vergleichbare Wirksamkeit von EcN und dem standardmäßig verwendeten Mesalazin (KRUIS et al.

1997, REMBACKEN et al. 1999). EcN verbessert die Stuhlfrequenz und -konsistenz bei Patienten

mit Obstipation (MÖLLENBRINK und BRUCKSCHEN 1994), und wirkt sich bei Ratten positiv

auf die Darmmotilität aus (VODERHOLZER et al. 1995). Bei Neugeborenen, die direkt nach der

Geburt mit EcN behandelt worden sind, finden sich weniger potentielle Pathogene im Stuhl als bei

unbehandelten Kindern. EcN kann bei diesen Kindern noch bis zu fünf Monate nach dem Absetzen

der Therapie nachgewiesen werden, was zumindest beim juvenilen Darm auf eine gute

Kolonisationsfähigkeit des Keims hinweist (LODINOVA-ZADNIKOVA und SONNENBORN

1997). Im Vergleich zu unbehandelten Kindern kommt es bei EcN-behandelten Neugeborenen


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21

außerdem zu einer Erhöhung der Serum-IgA-Konzentration (CUKROWSKA et al. 2002).

Aktuelle neuere Studien zeigen auch einen positiven Effekt von EcN bei kollagener Kolitis

(TROMM et al. 2004).

1.4 Escherichia coli Stamm “Abbotstown”

Der Escherichia coli Stamm „Abbotstown“ (EcA) ist ein enterotoxischer Escherichia coli Stamm

(ETEC) der Serologie O149:K91:K88ac. Er trägt F4– und F6-Fimbrien und bildet die Enterotoxine

LT-1, ST-lp und ST-II sowie Hämolysin.

In der Veterinärmedizin spielen ETEC eine besondere Rolle bei Absetzferkeln. Bei 17,6% der

Absetzferkel mit Diarrhöe sind ETEC im Kot nachweisbar (WIELER et al. 2001). EcA ist ein

schweinespezifischer Keim, der häufig im Zusammenhang mit Diarrhöe zum Zeitpunkt des

Absetzens nachgewiesen wird.

1.4.1 Wirkmechanismen und klinische Bedeutung

Hitzelabiles Enterotoxin (LT) und hitzestabiles Entertoxin (ST) führen im Darm durch vermehrte

Chloridsekretion ins Darmlumen und einem daraus resultierenden Wassereinstrom zu einer

sekretorischen Diarrhöe (CHEN et al. 2003). Die Diarrhöe wird dabei in der Regel nicht von

morphologischen Veränderungen in der Darmmukosa begleitet.

Die immunologischen Veränderungen im Zusammenhang mit meist unkompliziert verlaufenden

ETEC-Monoinfektionen sind beim Schwein gering. Bei humanen Patienten ist bekannt, dass sie auf

eine ETEC-Infektion mit der vermehrten Bildung von sekretorischen IgA-Antikörpern reagieren

(ESTRADA-GARCIA et al. 2002).

1.5 Das darmassoziierte Immunsystem

Der Begriff des Immunsystems umschreibt komplexe Abwehrvorgänge, die den Organismus vor

malignen Prozessen, Noxen und Krankheitserregen schützt sollen. Das darmassoziierte

Immunsystem (GALT) ist ein spezieller Teil des mukosaassoziierten Immunsystems (MALT), das

in unterschiedlicher morphologischer Ausprägung an allen Schleimhautoberflächen des Körpers


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vorkommt. Es übernimmt die Funktion einer Barriere, die den Organismus nach außen hin gegen

schädigende Einflüsse abschirmt. Das GALT ist das umfangreichste dieser speziellen

mukosaassoziierten Immungewebe und bildet das größte Reservoir von Immunzellen im Körper

(ABBAS und LICHTMAN 2003). Es hat als Teil der „intestinalen Barriere“ einen entscheidenden

Anteil am Schutz vor intestinalen Pathogenen. So werden z.B. beim Menschen 60% des täglich im

Körper produzierten Immunglobulins ins Darmlumen entlassen (BRANDTZAEG et al. 1989).

Neben der Immunabwehr steht das darmassoziierte Immunsystem allerdings vor der schwierigen

Aufgabe, zwischen den in großen Mengen vorkommenden ungefährlichen Nahrungsantigenen bzw.

Kommensalen und für den Organismus gefährlichen Stoffen bzw. Pathogenen differenzieren zu

müssen. Erstere führen zur oralen Toleranz und letztere induzieren eine protektive Immunantwort.

Gelingt diese Gratwanderung zwischen „gut“ und „böse“ nicht, kommt es zu pathologischen

Reaktionen, und es wird beispielsweise eine Abwehrreaktion gegen Nahrungsbestandteile oder

physiologische Mikroorganismen initiiert. Beim Menschen kann eine derartige Entgleisung zu

Erkrankungen wie Nahrungsmittelallergien oder chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

führen.

Um die Ergebnisse der vorliegenden Studie besser einordnen zu können, soll das darmassoziierte

Immunsystem des Schweins im Folgenden erläutert werden. Dabei erfolgt eine Beschränkung auf

die anatomischen Strukturen und Zellsysteme, die für die Untersuchungen von Bedeutung sind.

1.5.1 Anatomischer und histologischer Aufbau des Darms beim Schwein

Die Darmlänge des Schweins wird mit dem 15-fachen der Körperlänge angegeben, was bei einem

ausgewachsenen Tier 16-21 m entspricht. Der Darm wird, wie bei allen Säugetieren, in den

Dünndarm und den Dickdarm unterteilt. Am Dünndarm unterscheidet man Duodenum, Jejunum

und Ileum. Der Dickdarm beginnt mit dem Caecum und setzt sich dann im Colon ascendens mit

seinen die Ansa spiralis coli (Grimmdarmspirale) bildenden Gyri centripetales und Gyri

centrifugales fort. Nach der Ansa distalis coli folgen das Colon transversum und das Colon

descendens. Einen dem Colon sigmoidum des Menschen und Wiederkäuers entsprechenden

Darmabschnitt gibt es beim Schwein nur in den ersten Lebenswochen. Der Dickdarm endet mit dem

Rectum und der Ampulla recti am Anus. Die Länge der einzelnen Abschnitte ist in Tabelle 1

dargestellt.


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Tab. 1 Länge verschiedener Darmabschnitte des Schweins

Dünndarm Duodenum Jejunum Ileum Dickdarm CaecumColon/

Rektum

Einheit m m m m m m m

Länge 16-21 0,7-0,95 14-19 0,7-1 3,5-6 0,3-0,4 3,2-5,6

(NICKEL et al. 1999)

Die Darmwand besteht von luminal nach serosal aus der Tunica mucosa (Schleimhaut) mit dem

Epithelium mucosae (Epithel) der Lamina propria mucosae und der Lamina muscularis mucosae.

Es folgt die Tela submucosae (Submukosa), die die Mukosa von der Tunica muscularis

(Muskelschicht) mit dem Stratum circulare (Zirkulärmuskelschicht) und dem Stratum longitudinale

(Längsmuskelschicht) abgrenzt. Den Abschluss bildet die Tunica serosa (Bauchfell) mit der

Lamina propria serosae und dem Mesothelium serosae (NICKEL et al. 1999).

1.5.2 Immunzellen des Darms

1.5.2.1 Zellen des angeborenen Immunsystems

Zellen des angeborenen Immunsystems erkennen und bekämpfen Pathogene anhand ubiquitär

vorkommender Antigene. Sie sind häufig die ersten Zellen am Ort des immunologischen

Geschehens und eliminieren die Infektion oder sorgen durch Entzündung zumindest für deren

Eindämmung, bis das adaptive Immunsystem reagieren kann. Obwohl sich eine Zuteilung der

verschiedenen Immunzellen zur adaptiven oder angeborenen Immunität aus Gründen der Übersicht

bewährt hat, soll an dieser Stelle noch einmal darauf hingewiesen werden, dass es sich bei dieser

Einteilung nicht um ein starres System handelt. Die beiden Verteidigungslinien des Immunsystems

sind vielmehr eng miteinander verknüpft. So sind Zellen des angeborenen Immunsystems z.B. in

der Lage, adaptive Immunzellen chemotaktisch anzulocken und ihnen Antigene zu präsentieren.

Die angelockten Zellen können im Gegenzug die Phagozytoseeffizienz von Zellen des angeborenen

Immunsystems durch Markierung von Pathogenen (Opsonisierung) verbessern. (ABBAS und

LICHTMAN 2003). Von den Zellen des angeborenen Immunsystems werden hier nur Granulozyten

und Mastzellen vorgestellt.


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Granulozyten

Granulozyten werden wegen des Erscheinungsbildes ihres Kerns auch als polymorphkernige

Leukozyten bezeichnet. Unterschieden werden neutrophile, eosinophile und basophile

Granulozyten. Alle Granulozyten reifen unter dem Einfluss hämatopoetischer Wachstumsfaktoren

aus gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen im Knochenmark heran und werden dann ins Blut

freigesetzt. Sie sind morphologisch durch ihren gelappten Kern und die im Zytoplasma liegenden

Granula deutlich zu erkennen (ABBAS und LICHTMAN 2003).

Während eosinophile Granulozyten das Blut schnell wieder verlassen und in verschiedene Gewebe

rekrutiert werden, stellen die neutrophilen Granulozyten mit einem Anteil von 0,7% stabkernigen

und 10-40% segmentkernigen Granulozyten einen Großteil der Leukozyten im Blut (KNICKEL et

al. 1998). Die Lebensdauer von neutrophilen Granulozyten wird für Ratte und Mensch mit 2-3

Tagen angegeben (HILDEBRANDT 1998). Im Darmgewebe kommen sie unter physiologischen

Bedingungen nur in geringer Zahl von 2-4% in der Lamina propria vor. Sie sind aber in der Lage,

chemotaktisch in Entzündungsgebiete einzuwandern. Als Stimulus für die Einwanderung ins

Gewebe fungieren bakterielle Toxine, Zytokine oder Komplementfaktoren (BAGGIOLINI et al.

1993). Die wichtigste Effektorfunktion der neutrophilen Granulozyten ist die Phagozytose.

Zusätzlich bekämpfen sie extrazelluläre Pathogene durch die Abgabe reaktiver

Sauerstoffmetaboliten und Enzymen aus ihren zytoplasmatischen Granula ins umgebende Gewebe

(ABBAS und LICHTMAN 2003).

Eosinophile Granulozyten kommen im Gegensatz zu neutrophilen Granulozyten im porcinen Blut

nur zu einem Anteil von 6% des Differentialblutbildes vor (KNICKEL et al. 1998). Die reifen

Eosinophilen emigrieren nach der Ausschleusung aus dem Knochenmark zügig durch das

Gefäßendothel ins perivaskuläre Bindegewebe. Im gesunden Organismus akkumulieren sie

bevorzugt in der Mukosa des Magen-Darm-Traktes, der Uteruswand, dem Thymus, den

Lymphknoten und der Milz, kommen aber in geringer Konzentration auch in vielen anderen

Geweben vor. Das einzige Gewebe im Organismus, in dem eosinophile Granulozyten auch beim

Gesunden in nennenswertem Ausmaß degranulieren können, ist der Gastrointestinaltrakt (KATO et

al. 1998). Die Rekrutierung ins Darmgewebe erfolgt dabei, anders als bei Lymphozyten,

unabhängig von der intestinalen Besiedlung durch Mikroorganismen (FERGUSON 1976). Eine

besondere Rolle spielt dabei das Eotaxin, das spezifisch eosinophile Granulozyten anlockt und in


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vergleichsweise hohen Konzentrationen in der Lamina propria (LP) vorkommt. Die Überlebenszeit

dieser Zellen im Gewebe wird mit 14 Tagen bis zu einigen Wochen angegeben (SPRY 1988). Die

zytoplasmatischen Granula enthalten charakteristische Enzyme wie eosinophile Peroxidase, ECP

(eosinophil cationic protein), EPX (eosinophil protein X), MBP (major basic protein)

(HENDERSON et al. 1980, GLEICH et al. 1987, LI et al. 1995, TOMASSINI et al. 1996). Neben

diesen klassischen eosinophilen Enzymen bilden die Zellen noch andere Substanzen, wie z.B.

verschiedene Lipidmediatoren (KROEGEL und MATTHYS 1993), reaktive Sauerstoffmetaboliten,

die eine Schlüsselrolle bei der Abwehr von Parasiten spielen (KROEGEL et al. 1989), Zytokine,

von denen viele auch auf Zellen des adaptiven Immunsystems wirken, und Neuropeptide. Die

Freisetzung ihres Inhalts erfolgt anders als bei Mastzellen nicht durch Zerplatzen der Granula,

sondern ausschließlich durch Ausschleusung mit Hilfe des tubulovesikulären Systems (DVORAK

et al. 1991, ERJEFALT et al. 2001). Die Hauptaufgabe eosinophiler Granulozyten liegt in der

Bekämpfung von Parasiten. Außerdem sind sie neben den Mastzellen die klassischen Effektorzellen

der allergischen Entzündung. Durch ihre Fähigkeit zur Zytokin- und Lipidmediatorproduktion sind

sie aber auch in der Lage, als Immunmodulatoren für Zellen des angeborenen und des erworbenen

Immunsystems zu fungieren (ROTHENBERG 1998, ABBAS und LICHTMAN 2003)

Basophile Granulozyten zirkulieren nach der Bildung im Knochenmark in verschwindend

geringen Mengen von unter 1% im Blut. Ihre Lebensdauer beträgt einige Tage. Sie kommen im

gesunden Organismus nicht im Gewebe vor, werden aber bei Entzündungsreaktionen rekrutiert.

Trotzdem sind sie auch während der Entzündungsreaktion zahlenmäßig wenig prominent. Ähnlich

wie Mastzellen (siehe unten) exprimieren sie den Fcε-Rezeptor I und sind dadurch in der Lage,

hochaffin IgE zu binden. Die Aktivierung von basophilen Granulozyten erfolgt demnach primär

durch Kreuzvernetzung von IgE. Basophile Granulozyten können aber auch durch IgE-unabhängige

Stimuli aktiviert werden. Dazu gehören Produkte des Komplementsystems, sekretorisches IgA,

Bakterienprodukte und Eosinophilenmediatoren wie das ECP (KURIMOTO et al. 1989,

KURIMOTO et al. 1991, KUNA et al. 1993). In der Produktion von Histamin und

proinflammatorischen Lipidmediatoren unterscheiden sie sich nicht von Mastzellen (siehe unten).

Die Zytokinproduktion ist jedoch gegenüber der bei Mastzellen eingeschränkt (hauptsächlich IL-4

und IL-13) (BRUNNER et al. 1993, LI et al. 1996). Anders als beim gesunden Organismus ist die

Anzahl basophiler Granulozyten bei Allergiepatienten erhöht (ABBAS und LICHTMAN 2003).

Obwohl im Gewebe die Anzahl gemessen an der Zahl anderer allergietypischer Zellen wie


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Mastzellen und eosinophiler Granulozyten eher gering ist, sollte ihre Rolle im

Entzündungsgeschehen als sehr potente Quelle für Entzündungsmediatoren nicht unterschätzt

werden (BISCHOFF 1994). Neben der Beteiligung an der Sofortreaktion gibt es auch Hinweise

darauf, dass sie an der Aufrechterhaltung der Entzündung in der Spätreaktion der Allergie beteiligt

sind. Daneben wurde eine co-stimulierende Wirkung von basophilen Granulozyten auf B-Zellen

nachgewiesen und eine Rolle bei der Präsentation von Antigenen wird diskutiert (GAUCHAT et al.

1993). Über regulative Funktionen von basophilen Granulozyten für die adaptive Immunantwort ist

jedoch bisher nur sehr wenig bekannt.

Mastzellen

Mastzellen (MC) entwickeln sich im Knochenmark unter dem Einfluss des Stammzellfaktors SCF

(Mensch und andere Spezies) und IL-3 (nicht beim Menschen) aus denselben hämatopoetischen

Stammzellen wie die Granulozyten (ABBAS und LICHTMAN 2003). Allerdings werden sie nicht

als ausdifferenzierte Zellen in die Blutbahn entlassen, sondern reifen erst im Gewebe zu voll

entwickelten Mastzellen heran (SCHWARTZ und HUFF 1998). Direkte Vorläuferzellen in der

Entwicklung zur adulten Mastzelle sind bis heute noch nicht identifiziert. Die Zellen überleben im

Gewebe mehrere Wochen bis Monate (ABBAS und LICHTMAN 2003). Aus Untersuchungen bei

Mäusen und Ratten stammt die Einteilung der MC in Bindegewebsmastzellen (CTMC) und

mukosale Mastzellen (MMC) je nach ihrer Lage im Gewebe und ihrem metachromatischen

(farbverschiebendem) Färbeverhalten. Diese Einteilung wird auch für die MC des Schweins

verwendet. Die MMC des Schweins zeigen eine deutlich von MMC anderer Spezies abweichende

dendritische Morphologie, wohingegen sich die CTMC abgerundet, oval darstellen und sich damit

kaum von denen anderer Säuger unterscheiden (XU et al. 1993).

Mastzellen üben ihre immunologische Wirkung vorwiegend humoral aus, indem sie präformierte

oder de novo-synthetisierte Mediatoren parakrin ins Gewebe sezernieren. Sie sind in der Lage, je

nach Art der Stimulation und Herkunft der Zellen eine Vielzahl von verschiedenen Mediatoren

auszuschütten. Histamin und Leukotriene (C4, D4, E4) werden bei Aktivierung unabhängig von der

Lokalisation durch alle Mastzellen abgegeben (BISCHOFF 1994, OKAYAMA et al. 1995). Andere

Mastzellprodukte sind neutrale Proteasen, Proteoglykane, Zytokine (IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13,

TNF-α, TGF-β), Chemokine (MIP-1α, MCP-1) und Neutrophine (BISCHOFF und DAHINDEN

1992, GALLI et al. 1993, LORENTZ et al. 2000, BISCHOFF et al. 2001, GEBHARDT et al. 2002).

Die am besten bekannte und untersuchte Rolle der MC ist die des Auslösers der allergischen


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Sofortreaktion. Dabei kommt es durch Vernetzung des auf der Plasmamembran gebundenen IgE zur

Aktivierung der MC und im Folgenden zur Ausschüttung präformierter Mediatoren sowie der

Neusynthese von Effektormolekülen und Immunmodulatoren (ABBAS und LICHTMAN 2003).

Das Verständnis der Mastzelle als reine Effektorzelle hat sich in den letzten Jahren immer mehr hin

zu einer auch immunmodulatorisch und regulatorisch wirksamen Zelle gewandelt. So zeigte sich

beispielsweise, dass MC einen nicht zu unterschätzenden Einfluss auf die Rekrutierung,

Entwicklung und Wirkung von eosinophilen Granulozyten (SHAKOORY et al. 2004) und Zellen

des adaptiven Immunsystems haben (GALLI und WERSHIL 1996, POLOSA und CRIMI 1998).

Andere Untersuchungen konnten zeigen, dass sie costimulatorisch auf B-Zellen wirken und diesen

auch Antigen präsentieren können (GAUCHAT et al. 1993).

1.5.2.2 Zellen des adaptiven Immunsystems des Schweins

Bei Lymphozyten, die klassischerweise dem adaptiven Immunsystem zugeordnet werden, handelt

es sich um die im Thymus gebildeten T-Zellen und die im Knochenmark (bone marrow) gebildeten

B-Zellen. Letztere sollen hier nur in einer ihrer aktivierten Form, nämlich als IgA-produzierende

Plasmazellen, behandelt werden.

T-Lymphozyten

Die T-Lymphozyten sind in ihren Aufgaben in der adaptiven Immunantwort sehr heterogen. Die

verschiedenen Gruppen lassen sich anhand ihrer Oberflächenrezeptoren erkennen. T-Helferzellen

exprimieren CD4, den Corezeptor für MHC II-assoziierte Antigenerkennung und sind die

Regulatoren der adaptiven Immunität. Zytotoxische T-Zellen hingegen exprimieren CD8, den

Corezeptor für MHC I-assoziierte Antigenerkennung. Sie fungieren als Effektorzellen, indem sie

infizierte Zellen erkennen und abtöten (ABBAS und LICHTMAN 2003).

Man unterscheidet bei der Aktivierung von CD4+ T-Helferzellen (CD4+ Zellen) Th1 Antworten

und Th2 Antworten (SCHWARTZ und HUFF 1998, ABBAS und LICHTMAN 2003). Die Th1-

Antwort wird durch die Zytokine IL-12 und IFN-γ induziert, die von Makrophagen und

dendritischen Zellen sezerniert werden. Th1-Zellen produzieren dann ihrerseits wieder IFN-γ und

TNF-α. Sie bewirken so eine Aktivierung der zellabhängigen und zytotoxischen Immunität.

Th2-Zellen entwickeln sich beim Vorhandensein von PGE-2 und IL-4 und sezernieren IL-4, IL-5,

IL-9 und IL-13. Sie fördern damit die Produktion von Antikörpern, besonders von IgE, und sind


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dadurch stark mit der Entstehung von Allergien verknüpft (VAARALA 2003).

Der Vollständigkeit halber sollen hier auch die Th3 oder regulatorischen T-Zellen erwähnt werden,

die wahrscheinlich an der Hemmung überschießender Immunreaktionen beteiligt sind. Sie

sezernieren nach Stimulation die antiinflammatorischen Zytokine IL-10 und TGF-β (INOBE et al.

1998, PRUD'HOMME und PICCIRILLO 2000). Die genaue Rolle dieser Zellen im

immunologischen Netzwerk ist allerdings noch nicht völlig geklärt.

IgA-produzierende Plasmazellen

IgA ist das dominierende Immunglobulinmolekül mukosaler Oberflächen. Es wird von

Plasmazellen gebildet und kommt in zwei Formen im Körper vor. Das Serum-IgA ist ein Monomer,

welches im Vergleich zu anderen Immunglobulinen (z.B. IgG) nur zu einem geringen Prozentsatz

im Blut gefunden wird. Beim Schwein stammt ein nicht unerheblicher Teil des Serum-IgAs aus

dem Darm (VAERMAN et al. 1997). An mukosalen Oberflächen wird IgA als sekretorisches Dimer

abgegeben. Letzteres ist resistent gegenüber intraluminaler Proteolyse und zeigt keine Aktivierung

von Komplement oder Triggerung entzündlicher Reaktionen (HERR et al. 2003). Es hat vor allem

die Aufgabe, Pathogene zu binden und sie so unschädlich zu machen. IgA-produzierende

Plasmazellen gehören zum humoralen Teil des mukosalen Immunsystems. Im Darm entstehen sie

durch den Einfluss von Th2-Zytokinen aus B-Zellen in den Peyer’schen Platten (XU-AMANO et

al. 1992, JAIN et al. 1996,). Der größte Teil von ihnen rezirkuliert über das Lymph- und

Blutgefäßsystem des Körpers wieder in die LP des Darms (homing) (PIERCE und CRAY, Jr. 1982,

PABST und BINNS 1989). Durch die Immunzellen aus den Peyer’schen Platten ist der Körper in

der Lage, an der Mukosa des Darms induzierte Reaktionen auch auf andere mukosale Oberflächen

zu übertragen (ROTHKÖTTER et al. 1999a). Die meisten oral verabreichten Vakzinen oder auch

Probiotika zeigen ihre positiven Effekte deshalb nicht nur im Darm sondern auch in anderen

Körperregionen (BRANDTZAEG 1996).

IgA-produzierende Plasmazellen des Darms kommen zehnmal häufiger in der LP der Krypten vor

als im Epithel (BROWN und BOURNE 1976, BRANDTZAEG und BAKLIEN 1980,

ROTHKÖTTER et al. 1991). Das von ihnen produzierte IgA wird von den Enterozyten über die

Bindung an Poly-Ig-Rezeptoren erkannt und selektiv ins Darmlumen transportiert (BRANDTZAEG

et al. 1988).


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1.5.3 Aufbau des darmassoziierten Immunsystems

Das darmassoziierte Immunsystem setzt sich aus unterschiedlichen Kompartimenten zusammen,

den intraepithelialen Lymphozyten (IEL), den frei in der Lamina propria vorkommenden

Lymphozyten (LPL), den in der Lamina propria und in der Submukosa liegenden Lymphonoduli

solitarii (Einzellymphknötchen) und den Peyer´sche Platten (PP) (NICKEL et al. 1999). IEL und

LPL bilden das diffuse lymphoide Gewebe und die Lymphonoduli solitarii und Peyer´schen Platten

das organisierte lymphoide Gewebe. Der Aufbau des organisierten lymphoiden Gewebes soll hier

nicht weiter erläutert werden, da es in die vorliegenden Untersuchungen nicht mit einbezogen ist.

1.5.3.1 Intraepitheliale Lymphozyten

Als intraepitheliale Lymphozyten (IEL) bezeichnet man mononukleäre Zellen, die innerhalb der

Grenzen des Darmepithels liegen. Pro 100 Epithelzellen kommen in den Villi des Dünndarms 10-20

IEL vor (FERGUSON 1977). Sie wurden bereits 1847 zum ersten Mal beschrieben (WEBER

1847). Mikroskopisch sind sie liegend zwischen den Epithelzellen erkennbar dar. Sie befinden sich

im basalen Bereich des Epithels, in dem sich auch die Epithelzellkerne erkennen lassen, nahe der

Basalmembran und sind dort z.T. regelrecht in diese eingebettet. Sehr viel weniger IEL finden sich

im luminalen Bereichen des Epithels (VEGA-LOPEZ et al. 1993). IEL werden nicht im gleichen

Tempo wie die Epithelzellen abgeschilfert, vielmehr werden die alten Epithelzellen an ihnen vorbei

Richtung Darmlumen geschoben (LEFRANCOISE und PUDDINGTON 1999). Es handelt sich bei

den IEL um T-Zellen, von denen der größte Teil den CD8-Corezeptor auf der Plasmamembran

exprimiert. Der Anteil dieser CD8+ Lymphozyten differiert allerdings zwischen verschiedenen

Tierarten. Bei der Maus sind je nach Stamm 60-90% der IEL im Dünndarm und 30-50% der IEL im

Dickdarm CD8+, beim Menschen 60% der IEL. Der Rest der Zellen ist CD4+, bzw. exprimiert

keinen der beiden Corezeptoren. Letztere Lymphozyten werden als doppelt-negative IEL

bezeichnet. Besonders im Dünndarm finden sich noch eine weitere T-Zellpopulation. Diese Zellen

exprimieren sowohl CD4 als auch CD8 und heißen deshalb doppelt-positive T-Lymphozyten. Die

IEL des Schweins sind abgesehen von einem kleinen Anteil doppelt-negativer Zellen ausschließlich

CD8+ (VEGA-LOPEZ et al. 1993).

Abgesehen von der Verteilung der Corezeptoren weisen die Lymphozyten des Epithels gegenüber

den Lymphozyten aus anderen Geweben weitere Besonderheiten auf. So spielt bei den IEL anders

als im Blut und den lymphatischen Organen, wo die meisten T-Lymphozyten einen aus α- und β-


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Kette bestehenden T-Zellrezeptor (αβ-TCR) exprimieren, der aus einer γ- und einer δ-Kette

bestehende T-Zellrezeptor (γδ-TCR) eine sehr viel größere Rolle. Besonders im Dünndarm sind

nahezu 50% der IEL γδ-TCR+ (GOODMAN und LEFRANCOIS 1988, JARRY et al. 1990). Zum

Vergleich: In der Lamina propria der Maus tragen nur 1-5% der T-Zellen den γδ-TCR.

Als weitere Besonderheit befindet sich auf der Oberfläche von 50-75% der CD8+IEL das CD8

Molekül nicht in Form des αβ-Heterodimers (CD8αβ) sondern als αα-Homodimer (CD8αα).

Besonders Zellen mit dem γδ-TCR exprimieren das Homodimer des CD8 Corezeptors. Es gibt

Hinweise, dass es sich zumindest bei der Maus um Lymphozyten handeln könnte, die sich

außerhalb des Thymus entwickeln (LIN et al. 1994). Es hat sich gezeigt, dass Zellen, die CD8αα auf

ihrer Oberfläche exprimieren, keine MHC I-präsentierten Antigene erkennen. Man geht davon aus,

dass sie mit invarianten und semi-invarianten T-Zell-Rezeptoren Moleküle erkennen können, die

von körpereigenen Zellen nach Infektion oder Transformation auf der Plasmamembran präsentiert

werden (JANEWAY et al. 1988). Eine Entstehung derartiger Rezeptoren im Thymus wäre

unmöglich, da die Zellen dort während der negativen Selektion der Lymphozyten, also dem Test

auf Autoreaktivität, aussortiert würden. Deshalb geht man davon aus, dass sie sich außerhalb des

Thymus entwickeln. Tatsächlich wurden bei Mäusen Lymphozyten nachgewiesen, die im unreifen

Stadium der T-Zelldifferenzierung aus dem Thymus in die Blutbahn abgegeben werden (GUY-

GRAND et al. 2003).

Anders als über die Morphologie der IEL, die in den letzten Jahren intensiv untersucht worden ist,

weiß man über die Aufgaben dieser heterogenen Lymphozytengruppe immer noch relativ wenig.

Nach JANEWAY et al. (1988) gibt es Anzeichen dafür, dass sie geschädigte und transformierte

Epithelzellen beseitigen können. Damit wird nicht nur die frühzeitige Beseitigung von Pathogenen

gefördert, sondern sie verhindern so auch eine Präsentation ungefährlicher Antigene gegenüber dem

systemischen Immunsystem und fördern so die orale Toleranz (FUJIHASHI et al. 1990, KE et al.

1997). Außerdem sind sie in der Lage, die Epithelintegrität der „über sie hinwegwachsenden“

Epithelzellen zu fördern. Insbesondere die γδ-TCR-Zellen produzieren in vitro den

Epithelwachstumsfaktor KGF (keratinocyte growth factor) (CHEN et al. 2002).

Eine weitere Aufgabe ist die Erkennung von Antigenen und die Regulation der lokalen

Immunantwort. IEL zeigten in vitro im Dünndarm nach Aktivierung des CD3-TCR Komplexes

zwar Zytotoxizität, sie proliferierten aber nur in geringem Maße. Auf unspezifische Aktivierung

reagierten IEL aus dem Dünndarm im Gegensatz zu isolierten Blutlymphozyten nur eingeschränkt

und IEL aus dem Dickdarm überhaupt nicht (TREJDOSIEWICZ 1992, SYDORA 1993). In


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Untersuchungen an Schweinen, der einzigen Spezies, bei der bisher γδ-TCR CD8αα+ Lymphozyten

im Blut nachgewiesen wurden, konnte gezeigt werden, dass γδ-TCR CD8αα+ Lymphozyten aus

dem Blut erst nach MHC II-abhängiger Aktivierung, z.B. durch Th-Zellen, proliferieren (WATERS

et al. 2000). Ob dies auch für Lymphozyten des Darms gilt, ist jedoch noch nicht geklärt, ebenso

wenig wie die genauen Mechanismen, mit denen die IEL in die Immunvorgänge des Darms

eingreifen.

1.5.3.2 Lamina propria Lymphozyten

Lamina propria Lymphozyten (LPL) sind mononukleäre Zellen der Lamina propria des Darms. Die

Gesamtzahl an Lymphozyten steigt beim Schwein in diesem Kompartiment zwischen dem ersten

Tag post partum und der vierten Lebenswoche kontinuierlich an, bleibt dann aber konstant. Dabei

unterscheiden sich die LP der Krypten und der Villi des Dünndarms in ihrer

Gesamtlymphozytenzahl bei den verschiedenen Altersgruppen nicht. Am Schwein konnte

außerdem gezeigt werden, dass zumindest ein Teil der LPL in der LP entsteht (ROTHKÖTTER et

al. 1991). Die LPL bestehen aus T-Lymphozyten und B-Lymphozyten bzw. Plasmazellen. In der LP

des Dünndarms befinden sich die B- und Plasmazellen fast ausschließlich in den Krypten (BROWN

und BOURNE 1976), wohingegen die T-Zellen in den Villi dominieren (VEGA-LOPEZ et al.

1993). Im Folgenden beschränkt sich die Bezeichnung LPL auf den T-Zellanteil, da die

Plasmazellen der LP gesondert behandelt werden. Die T-Zellen der LP sind hochspezialisierte

Effektorzellen (ZEITZ et al. 1988). Es kommen sowohl CD4+ Zellen als auch CD8+ Zellen vor.

HAVERSON et al. (1999) gibt das Verhältnis von CD4+T-Zellen zu CD8+T-Zellen mit 0,71:1 für

die LP an. Nach anderen Autoren herrschen die CD4+T-Zellen vor (ROTHKÖTTER et al. 1991,

VEGA-LOPEZ et al. 1993). Die Kombination der Oberflächenmarker auf LPL ist dabei

darmtypisch und kommt in anderen Geweben nur selten vor. Bis zu 88% der Lymphozyten

neugeborener Ferkel haben bis zu einem Alter von fünf Tagen weder CD4- noch CD8-Corezeptoren

auf der Zelloberfläche exprimiert. Die Anzahl dieser doppelt negativen T-Zellen nimmt ab der

zweiten Lebenswoche ab (ROTHKÖTTER et al. 1991) und pendelt sich bei einem Anteil von 7%

ein (HAVERSON et al. 1999). Neben den doppelt-negativen T-Zellen kommen auch 14%

CD4+CD8+ doppelt-positive T-Zellen in der LP vor. Gleichzeitig lässt sich beobachten, dass die

Entwicklung der LPL stark von der mikrobiellen Besiedlung des Darms abhängt. Die LPL keimfrei

gehaltener Schweine differenzieren sich nur verzögert oder gar nicht in die vier T-Zell-

Subpopulationen (ROTHKÖTTER et al. 1991).


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32

Die starke Konfrontation des intestinalen Immunsystems mit harmlosem Antigen wird auch als

Grund für einen ungewöhnlichen Aktivierungsstatus der LPL angesehen. Von humanen LPL ist

bekannt, dass sie Merkmale von immunologischen Gedächtniszellen oder aber zumindest Antigen-

erfahrenen Zellen zeigen (HALSTENSEN et al. 1990). Auch beim Schwein gibt es Hinweise

darauf, dass es sich beim Großteil der LPL um antigenerfahrene Zellen handelt. So fehlt 98% der

LPL der Oberflächenmarker CD45RC, was für eine bereits in der Vergangenheit abgelaufene,

antigenabhängige Aktivierung kennzeichnend ist. Für den antigenerfahrenen Zustand von

Lymphozyten der LP sprechen außerdem Untersuchungen, bei denen LPL vom Schwein und auch

vom Menschen unter antigenspezifischer Aktivierung zwar wie naive T-Zellen die Zahl ihrer IL2-

Oberflächenrezeptoren (IL-2R = CD25) erhöhen, es aber nicht zu einer, in anderen lymphatischen

Geweben üblichen, Proliferation kommt (siehe 3.5.3.3). So sezernieren LPL, im Unterschied zu

naiven T-Zelle nach TCR-spezifischer Stimulation kein IL-2 zur Triggerung der

Immunproliferation (BAILEY et al. 1998). Vielmehr produzieren sie große Mengen an IL-4 wie es

klassische Th2-Effektorzellen tun (VEGA-LOPEZ et al. 1995).

Die von anderen T-Zellen abweichenden Reaktionen auf antigeninduzierte Aktivierung der LPL

eröffnen die Möglichkeit, gewebszerstörende Immunantworten gegen die im Darm

allgegenwärtigen harmlosen Antigene zu unterbinden (BAILEY et al. 1998).

1.5.3.3 Interleukin-2 Rezeptor (CD25) als Aktivierungsmarker

Die T-Zellproliferation ist in erster Linie Folge eines antigeninduzierten autokrinen

Aktivierungsweges. Aktivierte T-Zellen induzieren die vermehrte Expression von IL-2-Rezeptor

(IL-2R) auf der Zelloberfläche. Das Synonym für den IL-2R in der CD Nomenklatur ist CD25.

Antikörper gegen CD25 können deshalb in der Immunhistologie als Marker für den

Aktivierungszustand von T-Zellen eingesetzt werden (SCHWARTZ und HUFF 1998, ABBAS und

LICHTMAN 2003). Nach neueren Untersuchungen scheinen aber nicht nur aktivierte Effektor-T-

Zellen, sondern auch regulatorische T-Zellen vermehrt CD25 zu exprimieren. Die

Gesamtkonzentration an regulatorischen T-Zellen im CD25 exprimierenden T-Zell-Pool des Darms

ist allerdings vergleichsweise gering (THOMPSON und POWRIE 2004).


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33

1.5.4 Antimikrobielle Peptide

Antimikrobielle Peptide (AMP) werden von vielen Tierspezies zur Abwehr von Mikroorganismen

gebildet. Es handelt sich dabei um kleine Peptide von 12-100 Aminosäuren (ANDREU und RIVAS

1998).

Neben Immunzellen produzieren auch Zellen der Haut, Panethzellen des Darms und Epithelzellen

AMP (DIAMOND und BEVINS 1998, GANZ 1999). Sie wurden ursprünglich beim Schwein

entdeckt und werden in vier Gruppen eingeteilt: die Cathelicidine, die Defensine, Nk-Lysin und die

Cepropine (ZHANG et al. 2000).

Die bisher am wenigsten untersuchte Gruppe sind die Cepropine, die Homologien zu von Insekten

produzierten AMP aufweisen, auf diese soll hier jedoch nicht weiter eingegangen werden, da sie in

den vorliegenden Untersuchungen nicht berücksichtigt werden.

Defensine zeichnen sich alle durch Cysteinreste in ihrer Molekularstruktur aus. Bei Säugern werden

sie je nach Lokalisation der durch Cysteinreste gebildeten Disulfidbrücken in α-, β-, und δ-

Defensine unterschieden, von denen beim Schwein nur das β-Defensin vorkommt (ZHANG et al.

1998). Sie werden als Prepro-Peptide unter anderem in Epithelzellen gebildet und erst nach ihrer

Ausschleusung aus der Zelle aktiviert. Im Darm erfolgt diese Aktivierung durch Trypsin. Neben

ihrer antimikrobiellen Wirkung, haben sie auch einen chemotaktischen Effekt auf Immunzellen

(GANZ und LEHRER 1995). Ein besonderer Zusammenhang, scheint zwischen bestimmten

Formen der CED des Menschen und Veränderungen in der Defensinproduktion zu bestehen.

Während die Colitis ulcerosa beim Menschen mit einer spezifisch erhöhten Expression von α-

Defensinen in Verbindung gebracht wird (WEHKAMP et al. 2002b), liegt beim Morbus Crohn im

humanen β-Defensinen HBD-1 eine Defizienz vor. Die Expression der β-Defensine HBD-2 und

HBD-3 verhalten sich bei verschiedenen Formen der CED unterschiedlich (WEHKAMP et al.

2003).

Cathelicidine sind eine sehr heterogene Molekülfamilie, denen aber allen eine konservierte

Proteinsequenz, das „Cathelin“, eigen ist. Zu ihnen gehören auch die porcinen Cathelicidine, das

ursprünglich aus dem Schweinedarm isolierte PR-39 und die Protegrine (AGERBERTH et al.

1991). Die Gene, die für diese AMP codieren, enthalten Bindungsstellen für NF-κB und NF-IL-6,

was sie für eine Aktivierung in der initialen Phase einer Immunantwort empfänglich macht (ZHAO

et al. 1995a, 1995b). Eine Erhöhung der Serum PR-39-Konzentration konnte beim Schwein z. B. im


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34

Zusammenhang mit Salmonelleninfektionen beobachtet werden (ZHANG et al. 1997).

NK-Lysin wurde aus dem Dünndarm des Schweins isoliert und besteht aus 78 Aminosäuren. Es

wird von zytotoxischen T-Zellen und natürlichen Killerzellen produziert (ANDERSSON et al.

1995).

Bei den AMP handelt es sich um phylogenetisch sehr alte Moleküle, die prophylaktisch vor bzw. zu

einem sehr frühen Zeitpunkt einer Infektion oder durch Kontakt mit Bakterien gebildet werden.

Inzwischen ist bekannt, dass EcN und andere probiotische Bakterien nach Co-Kultur in

verschiedenen humanen Darmzelllinien die Bildung von HBD2 induzieren, wohingegen von mehr

als 40 verschiedenen sowohl pathogenen als auch apathogenen E. coli Stämmen keiner Einfluss auf

die Defensinexpression nimmt (WEHKAMP et al. 2004). Es ist somit nicht ausgeschlossen, dass

die Induktion von AMP einen Anteil an der probiotischen Wirkung bestimmter Keime hat.

1.6 Ziel der Arbeit

Über die Wirkmechanismen probiotischer Mikroorganismen ist bisher wenig bekannt. Darüber, wie

einer der ältesten therapeutisch verwendeten Probiotikastämme, das gram-negative Bakterium E.

coli Nissle 1917, seine positiven Effekte erzielt, gibt es nur wenige Hinweise, die zudem meist aus

In-vitro-Untersuchungen stammen. Die wenigen vorhandenen In-vivo-Experimente wurden fast

ausschließlich an kleinen Labornagern durchgeführt, die in der Physiologie ihres Magen-

Darmtraktes nur wenig Gemeinsamkeiten mit den Haustieren und dem Menschen aufweisen.

Außerdem wurden in einem Großteil der Fälle Krankheitsmodelle verwendet, die nur

eingeschränkte Aussagen über die Mechanismen beim gesunden Tier ermöglichen.

Ziel dieser Arbeit war daher, die Wirkung von EcN am Modelltier Schwein zu untersuchen. Das

Schwein ist nicht nur im Hinblick auf die Anwendung von probiotischen Keimen interessant,

sondern es hat sich zudem speziell zur Untersuchung gastrointestinaler Vorgänge als gutes

Modelltier erwiesen.

Der erste Teil der folgenden Untersuchungen sollte zunächst an gesunden Schweinen durchgeführt

werden. Nachdem bei unveröffentlichten Arbeiten der hiesigen Arbeitsgruppe an gesunden Tieren

keine Anzeichen für eine Wirkung von EcN auf die Elektrophysiologie der Darmmukosa vorlagen,


________________________________________________________________________________

35

war es Ziel dieser Versuche, festzustellen, ob und wenn ja, inwieweit die orale Verabreichung von

EcN eine Auswirkung auf die Verteilung von mukosalen Immunzellen im Darm gesunder Schweine

sowie die Expression verschiedener Zytokine und antimikrobieller Peptide in der Darmmukosa hat.

Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit hatte die Untersuchung der prophylaktischen Wirksamkeit

von EcN zum Ziel. Zu diesem Zweck sollte mit der Etablierung eines neuen Infektionsmodells an

ETEC-infizierten Absetzferkeln begonnen werden, um damit zum besseren Verständnis positiver

Effekte von EcN bei bakteriell bedingten Erkrankungen des Schweins beizutragen.

Material und Methoden

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36

2 Material und Methode

Eine alphabetisch geordnete Liste der verwendeten Substanzen und Geräte, Lösungs- und

Pufferrezepte befindet sich in Anhang II.

Alle im Folgenden beschriebenen Versuche wurden durch den Tierschutzbeauftragten der

Tierärztlichen Hochschule geprüft und von der Bezirksregierung des Landes Niedersachsen

entsprechend § 8 des Tierschutzgesetzes genehmigt. Die Versuche werden unter der Aktennummer:

509.6-42502-03/720 bei der Bezirksregierung geführt.

2.1 Haltung der Versuchstiere

2.1.1 Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN

Als Versuchstiere dienten 15 abgesetzte Schweine einer Kreuzung der Rassen ” Deutsche

Landrasse” und „Pietrain” aus dem Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für

Landwirtschaft, Braunschweig. Die Tiere hatten zu Versuchsbeginn ein Gewicht von 16 ± 2,7 kg.

Nach der Ankunft im Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule wurde jedes Schwein

mit Ivermectin 0,3 mg/kg s.c. (Ivomec® 5%, Bayer AG, Leverkusen) entwurmt und erhielt eine

Immunprophylaxe mit 2 ml Baypamun® (Bayer AG, Leverkusen) s.c..

Durch eine zweiwöchige Adaptationsphase wurden Erkrankungen auf Grund der veränderten

stallspezifischen Flora und des Transportstresses ausgeschlossen. Als Grundfutter diente ein

herkömmliches Schweinemastfutter (Zusammensetzung siehe Anhang I), welches auch schon im

Herkunftsbetrieb der Tiere gefüttert worden war. Die Tiere erhielten 400 g Futter pro Tag. Zum

Ende des Versuchszeitraums wurde die Futtermenge unter Berücksichtigung der

Gewichtsentwicklung auf 500 g pro Tag erhöht. Die Fütterung erfolgte zweimal täglich. Sowohl in

der Adaptationszeit als auch während des Versuchs standen die Tiere auf Stroh und hatten freien

Wasserzugang über eine Selbsttränke.


________________________________________________________________________________

37

2.1.2 Infektionsversuche mit und ohne EcN

Für die Infektionsversuche wurden zwei von Ebern der Rasse „Pietrain“ tragende Sauen (Sau I und

II) der „Deutschen Landrasse“ vier bis sechs Wochen vor dem Abferkeltermin in den Stallungen

des Physiologischen Instituts eingestellt. Die Tiere entstammten dem Bestand des Lehr- und

Forschungsgutes der Tierärztlichen Hochschule in Ruthe. Die Sauen wurden auf Stroh gehalten und

hatten freien Zugang zu Wasser. Gefüttert wurden sie zweimal am Tag mit einem Sauenmischfutter

(Anhang I). Heu stand zur freien Verfügung.

Die Abferkelung erfolgte unter Aufsicht. Beide Sauen erbrachten acht lebende Ferkel. Jedes Ferkel

erhielt am dritten und am 18. Lebenstag je 1 ml Eisendextran 20 (Vetoquinol, Oberursel) als

subkutane Injektion in die Kniefalte. Ab dem siebten Lebenstag wurde ihnen ein probiotikafreies

Ferkelfutter ohne Leistungsförderer (Anhang I) zur freien Aufnahme angeboten. Wasser war

jederzeit ad libitum („nach Belieben“) zugänglich.

Die Aufteilung der Würfe in die verschiedenen Versuchsgruppen ist aus Tab. 2 und Tab. 3

ersichtlich.

Tab. 2 Verteilung der Würfe auf die Versuchsgruppen

Ohne E. coli Nissle 1917 (SI2) Mit .E coli Nissle 1917 (SI3)

Mit E. coli Abbotstown Sau I = 4 Ferkel Sau II = 4 Ferkel

Ohne E. coli Abbotstown Sau I = 4 Ferkel Sau II = 4 Ferkel


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Tab. 3 Absetzalter und Gruppenzuordnung einzelner Ferkel

Tier

BezeichnungSau Absatzalter E. coli Nissle 1917 E. coli Abbotstown

SI2-1 I 21. LT nein nein

SI2-2 I 21. LT nein ja







SI3-1 II 21. LT ja nein

SI3-2 II 21. LT ja ja







Abkürzung: LT = Lebenstag, SI = Schweineinfektionsversuch

Ab dem 21. Lebenstag wurden an vier aufeinander folgenden Tagen jeweils zwei Tiere von der

Mutter abgesetzt.

Während der Versuchsdauer waren die Ferkel einzeln in Haustiertransportkisten (Vari-Kennel®

XL, Patmate®,USA) auf staubfreier Weichholzspäne (TierWohl, Super, J. Reppmeier & Söhne,

Rosenberg) untergebracht und erhielten weiterhin Ferkelfutter ad libitum. Wasser war frei

zugänglich. Zur Deckung des Rohfaserbedarfs und zur Beschäftigung erhielt jedes Tier Heu und

Stroh.

Die Transportkisten der Infektions- und Kontrollgruppe wurden in voneinander getrennt gelegenen

Räumen des Physiologischen Instituts untergebracht. Es wurde eine Raumtemperatur von 22°C


________________________________________________________________________________

39

aufrecht erhalten. Die Versorgung und Beobachtung der Tiere erfolgte ausschließlich durch den

Untersucher. Alle Räume wurden nur mit separater Schutzkleidung (Handschuhe, Kittel, Schürze

und Gummistiefel) über Wannen mit 2%iger Lysovet® PA-Lösung (Schülke & Mayer,

Norderstedt) betreten.

2.2 Versuchsdurchführung


Vor Versuchsbeginn wurden drei Gruppen mit je fünf zufällig ausgewählten Schweinen gebildet.

Die Tiere der Versuchsgruppen wurden in Einzelhaltung mit Sichtkontakt, die Kontrolltiere zu

zweit bzw. zu dritt aufgestallt. In beiden Versuchsgruppen wurde mit dem Grundfutter zweimal am

Tag eine Suspension des Escherichia coli Stammes Nissle 1917 (EcN) gefüttert. Die Kontrolltiere

erhielten reinen Puffer (Placebo).

Escherichia coli Nissle 1917 Suspensionsherstellung und Applikation

Die EcN- Suspensionen wurden freundlicherweise von der Firme Ardeypharm, Herdecke,

Deutschland, fertig angemischt zur Verfügung gestellt. Es wurden zwei Suspensionen mit

verschiedenen EcN-Konzentrationen verwendet.

Suspension 1 enthielt: 5,0 x 108 KBE/ml der Charge, Ch.B.:#BF01.1001-1, Lieferung 09.02.01

Suspension 2 enthielt: 5,0 x 1010 KBE/ml der Charge, Ch.B.:#BF01.1001-3, Lieferung 15.02.01

Die Keime wurden in Suspensions–Puffer geliefert. Um die Kontamination bei der Entnahme so

gering wie möglich zu halten, wurde vor Versuchsbeginn, die für die gesamte Versuchsdauer von

21 Tagen benötigte Fütterungsdosis pro Tier (42 ml) in sterile 50 ml Reaktionsröhrchen aliquotiert.

Die Aufbewahrung erfolgte im Kühlschrank bei 4°C. Unmittelbar vor dem Verabreichen wurde die

Suspension durchmischt, um die Bakterien gründlich zu resuspendieren. Die Fütterungsdosis von 1

ml Suspension pro Tier und Mahlzeit wurde anschließend noch im Labor in sterile Einmalspritzen

aufgezogen.

Tiere der Versuchsgruppe I erhielten zweimal am Tag je 1 ml der Suspension 1 (= 109 KBE EcN)

und Tiere der Versuchsgruppe II zweimal am Tag je 1 ml der Suspension 2 (= 1011 KBE EcN). An

die Kontrolltiere wurde das gleiche Volumen reiner Suspensionspuffer gefüttert.


________________________________________________________________________________

40

Damit die Aufnahme sichergestellt war, wurde den Schweinen zunächst eine kleine Menge Futter

mit dem Inokulat angeboten. Erst nachdem diese Menge vollständig aufgenommen worden war,

wurde die Fütterung fortgesetzt. Bei den in Kleingruppen gehaltenen Tieren der Kontrollgruppe

hatte jedes Tier einen eigenen Futtertrog zur Verfügung. Der Versuchszeitraum erstreckte sich über

21 Tage.

Zur Kontrolle der EcN-Besiedlung wurde von den Tieren am 7. und 14. Versuchstag Kotproben

genommen und bei –20 °C eingefroren.


Bei den Infektionsversuchen wurden die Ferkel mit (Wurf der Sau II) oder ohne (Wurf der Sau I)

vorherige, zehntägige EcN-Applikation von der Mutter abgesetzt und dann mit EcA bzw. Placebo

inokuliert.

Anzüchtung und Suspensionsherstellung des Escherichia coli Stamms „Abbotstown“

Die Stammkultur des Escherichia coli Stammes „Abbotstown“ wurde vom Institut für Hygiene und

Infektionskrankheiten der Tiere des Fachbereichs Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität,

Gießen, zur Verfügung gestellt. Die Bakterien wurden auf Comassiblutagar subkultiviert und im

Kühlschrank bei 4°C aufbewahrt. Die Anzüchtung erfolgte in Luria-Bertani (LB) –Medium

(SEMBROOK et al. 1989). Am Vortag der Inokulation wurden unter der Lamina Airflow (NU 440-

400E, NuAire, USA) mit einer abgeflammten Metallöse 4-5 Bakterienkolonien von der

Blutagarplatte abgenommen und in ein 50 ml Reaktionsröhrchen mit 12 ml LB-Medium überführt.

Das Reaktionsröhrchen wurde dann für 16 Stunden in einem Inkubationsschüttler (Innova 4000,

New Brunswick Scientific, USA) bei 180 rpm und 37°C über Nacht inkubiert. Nach

Übernachtkultur wurden der Suspension zweimal 1 ml zur Keimzahlbestimmung entnommen und

in sterilen 1,5 ml Reaktionsgefäßen bei 4°C gelagert. Danach wurde der Rest bei 3000 x g und 4°C

für zehn Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Glaspipette unter der Lamina

Airflow abgenommen, verworfen und das Pellet auf Eis in das Physiologische Institut transportiert.

Dort erfolgte die Resuspension der Inokulationsdosis mit 5 ml Nissle-Puffer. Die beschriebene

Anzüchtung ergab die Inokulationsdosis für jeweils ein Tier mit einem Keimgehalt von 1,1 x 1010

bis 2,1 x 1010 KBE.


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41

Absetzen und Inokulation mit Escherichia coli Stamm „Abbotstown“

Das Absetzen der Ferkel von der Sau erfolgte morgens um vier Uhr. Die Ferkel wurden gewogen

und zufällig auf die Versuchsgruppen verteilt. Soweit möglich wurde dabei eine gleichmäßige

Geschlechterverteilung berücksichtigt. Vier Stunden nach Absetzen – in dieser Zeit erhielten die

Tiere kein Futter – erfolgte in der Infektionsgruppe die Inokulation mit E. coli Stamm Abbotstown.

Die Kontrollgruppe erhielt Puffer ohne den Keim. Dazu wurden die Tiere von einer Hilfsperson

festgehalten. Eine zweite Hilfsperson öffnete das Maul und fixierte einen Kunststoffkeil Abb. 2,

durch den eine Ernährungssonde (Braun, Deutschland) über den Pharynx und den Oesophagus in

den Magen vorgeschoben wurde. Die korrekte Lage der Sonde wurde durch Gabe von 2 ml

Leitungswasser überprüft. Anschließend erfolgte die Inokulation mit 5 ml EcA-Suspension (1

Inokulationsdosis) in der Infektionsgruppe bzw. 5 ml Nissle-Puffer (Placebo) in der Kontrollgruppe.

Die Inokulation wurde nach 24 Stunden entsprechend dem obigen Protokoll wiederholt.

Abb. 2 Fixierung eines Kunststoffkeils im Maul eines drei Wochen alten Ferkels

Escherichia coli Nissle 1917 Suspensionsherstellung und Applikation

Den Ferkeln des Infektionsversuches mit vorheriger EcN-Applikation (Wurf der Sau II) wurde ab

dem 13. Lebenstag bis zum Absetzen jeden Morgen oral 1 ml einer EcN-Suspension verabreicht.

Dazu wurde im Labor vorsichtig mit einer Kanüle eine 100 mg Kapsel Mutaflor® an einem Pol


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42

geöffnet. Der Inhalt wurde in 1 ml „Nissle“-Puffer suspendiert. Zur besseren Akzeptanz wurden der

Suspension 1-2 Tropfen flüssiger Süßstoff zugesetzt. Nach gründlichem Durchmischen bildete sich

eine homogene Suspension, die dann mit einer Kanüle (1,2 x 40 mm) in eine 2 ml Spritze

aufgezogen wurde. Eine Kapsel entsprach der täglichen Dosis für ein Tier. Zur oralen Applikation

wurden die Ferkel von einer Hilfsperson fixiert, der Spritzeninhalt durch Schütteln noch einmal

resuspendiert und dann langsam im Pharynxsbereich der Ferkel appliziert. Die Ferkel wurden erst

abgesetzt, wenn die Lösung komplett geschluckt worden war.

Vor der Applikation der ersten EcN-Dosis wurde jedem Ferkel ein Rektaltupfer entnommen, um

das Vorhandensein von EcN im Darm der Ferkel vor Beginn der EcN-Gabe ausschließen zu

können.

Während der anschließenden Infektion mit EcA erhielten die Ferkel weiterhin einmal täglich EcN.

Die Eingabe erfolgte zur Vermeidung von Wechselwirkungen mit dem pathogenen

Infektionsstamm vier Stunden vor der Inokulation mit EcA.

Am Tag der Schlachtung wurde kein EcN appliziert.

Beobachtungs- und Messparameter

Die Ferkel wurden vor Versuchsbeginn und vor der Tötung gewogen. Vor jeder Inokulation wurde

die Körpertemperatur mit einem Digitalthermometer (servoprax® GmbH, Wesel) bestimmt.

Vom Zeitpunkt des Absetzens erfolgte alle vier Stunden eine Beurteilung des Allgemeinzustandes

anhand der Parameter Verhalten, Futter- und Wasseraufnahme und der peripheren Durchblutung.

Des Weiteren wurden die Verschmutzung im Bereich des Afters und die Kotkonsistenz kontrolliert.

Um Stress für die Tiere zu minimieren, wurden die Ferkel dabei nach Möglichkeit nicht aus dem

Käfig herausgenommen. Die Beurteilung erfolgte ausschließlich durch den Untersucher nach

folgendem vorab festgelegten Schema (Tab. 4):


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43

Tab. 4 Untersuchungsparameter zur Beurteilung des Krankheitsgrades

Verhalten

1

2

3

aufmerksam an der Umgebung interessiert

gedämpfte Aufmerksamkeit, aber ansprechbar

apathisch

Futter-/Wasseraufnahme

1

2

3

ungestört

eingeschränkt

keine

periphere Durchblutung1

2

rosig

blass

Afterregion

1

2

3

trocken und sauber

stellenweise/in geringem Abstand um den After verschmutzt

stark/großflächig verschmutzt, feucht

Kotbeschaffenheit

1

2

3

4

unauffällig

pastös

semi-flüssig

flüssig

Modifiziert nach (TO et al. 1998)

2.3 Tötung der Tiere

Sowohl die Tiere des ersten Versuchs mit EcN bei konventionell gehaltenen Schweinen als auch die

Ferkel aus den Infektionsversuchen wurden am Ende der Versuchsdauer mittels Bolzenschuss

betäubt und mit einem Kehlschnitt, der die Luftröhre, beide Carotiden und angrenzende Gefäße und

Nerven durchtrennte, getötet. Aus dem ausströmenden Blut wurden bei den Ferkeln der

Infektionsversuche mit und ohne EcN zwei Blutproben zur Plasmagewinnung in Li-Heparin

Monovetten® (Sarstedt, Nümbrecht) entnommen.


________________________________________________________________________________

44

2.4 Probengewinnung


Zur schnellen und kontaminationsfreien Entnahme des Darmkonvoluts wurden die Tiere wie beim

regulären Schlachtvorgang an den Hinterbeinen aufgehängt. Mit einem Schnitt in der Linea alba

wurde die Bauchhöhle eröffnet und der Magen an der Kardia vom Oesophagus getrennt. Nach

Durchtrennung der vorderen und hinteren Gekrösewurzel und Absetzen des Colon descendens am

Übergang zum Rektum, konnte das gesamte Darmkonvolut einschließlich des Magens, der Milz

und der Anhangdrüsen entfernt werden. Die weitere Präparation und Probenentnahme erfolgte

getrennt vom Tierkörper.

Um eine möglichst kontaminationsfreie Probenentnahme für die Polymerase Kettenreaktion (PCR),

Histologie und Immunhistologie zu gewährleisten, wurden jeweils 5-10 cm lange Stücke aus

verschiedenen Darmabschnitten entnommen, am mesenterialen Rand aufgeschnitten und mehrfach

mit 4°C kalter physiologischer Kochsalzlösung gespült, bis die Spülflüssigkeit klar blieb und kein

Darminhalt mehr auf der Mukosa zu erkennen war. Das Gewebe wurde zur Weiterverarbeitung mit

vier Kanülen auf einer Styroporplatte fixiert.

2.4.1.1 Probenentnahme für mikrobiologische Untersuchungen

Aus der im Tierkörper verbliebenen Ampulla recti wurden 2-3g Kot für den Nachweis von EcN in

ein steriles Kotröhrchen entnommen und bei –20°C eingefroren.

2.4.1.2 Probenentnahme für die Polymerase-Ketten-Reaktion

Die Entnahme von Proben zur Analyse der mRNA-Expression von antimikrobiellen Peptiden und

Zytokinen in der Darmmukosa mittels reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR)

erfolgte aus dem Duodenum, dem Ileum und dem Kolon. Von den aufgespannten Geweben wurden

mit dem Plastiklöffel eines sterilen RNAse-freien Kotröhrchens in einem 0,5 x 0,5 cm großer

Bereich die Mukosa von der Submukosa abgeschabt. Der Plastiklöffel wurde dann zusammen mit

der Mukosa zurück in das Röhrchen verbracht und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren.


________________________________________________________________________________

45

Bis zur weiteren Verarbeitung wurden die Proben bei –80°C gelagert.

2.4.1.3 Probenentnahme für histologische und immunhistologische Analysen

Die Probenentnahme für die histologischen und immunhistologischen Untersuchungen erfolgte aus

dem Duodenum, Jejunum, Ileum sowie dem proximalen und distalen Kolon. Es wurden jeweils

zwei transmurale („die ganze Wand erfassend“) Gewebestücke von 1,5 x 0,5 cm Größe entnommen.

Die Entnahmelokalisationen sind in Abb. 3 dargestellt.

Abb. 3 Lokalisation der Entnahmestellen für Gewebeproben

1= Magen, 2 = Milz, 3 = Duodenum, 4 = Jejunum, 5 = Ileum, 6 = Colon ascendens, 7 = Colon descendens,

Plica ileocaecalis (weiße Pfeil), Entnahmelokalisationen für die Gewebeproben (schwarze Pfeile)

Sofort nach Entnahme wurde eine Probe in 3 ml 4%iger Paraformaldehyd-Lösung (Anhang II) und

eine zweite Probe in 3 ml Carnoy-Lösung (Anhang II) fixiert.

Die in Paraformaldehyd fixierten Proben konnten bis zu sieben Tage bei 4°C aufbewahrt werden.

Die in Carnoy-Lösung fixierten Proben wurden über Nacht bei 4°C fixiert und am nächsten Tag

weiter bearbeitet.

Eine dritte Probe von 0,2 x 1 cm Größe wurde in einer Lösung, bestehend aus einer

Saccharoselösung (TissueTec®, Sakura, Finnland) und Aqua dest. im Verhältnis 1:1, für fünf

Plica ileocaecalis

2 m Jejunumentfernt 50 cm

3

1

2

4

5

6

78

Plica ileocaecalis

2 m Jejunumentfernt 50 cm

3

1

2

4

5

6

78


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46

Minuten inkubiert und dann langsam mit 100 % TissueTec® in Crymold®-Einfrierschälchen

(Sakura, Finnland) auf Trockeneis gefroren. Zum Schutz gegen Austrocknung wurden die

gefrorenen Proben einzeln in Alufolie verpackt und bei –20°C aufbewahrt.


Bei den Ferkeln wurde auf Grund der geringen Größe das Darmkonvolut im Tier belassen. Das Tier

wurde in Rückenlage fixiert und die Probenentnahme erfolgte nach Eröffnung in der Linea alba

direkt aus der Bauchhöhle.

2.4.2.1 Plasmagewinnung für Plasma-IgA-Bestimmung

Das heparinisierte Blut wurde in einer Minifuge 2 (Heraeus, Hanau, Deutschland) bei 4000 g zehn

Minuten zentrifugiert. Von dem Plasmaüberstand wurden Aliquots zu je 1,5 ml in ein

Reaktionsgefäß pipettiert und bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert. Die Plasmaproben

wurden nach Ende der Versuche in der Bundesforschungsanstalt für Verbraucherschutz, Ernährung

und Landwirtschaft in Karlsruhe mittels ELISA auf den Gehalt an IgA untersucht.

2.4.2.2 Probenentnahme für mikrobiologische Untersuchungen

Aus einem frischen Anschnitt von Duodenum, Jejunum, Ileum und Kolon erfolgte die Entnahme

einer Tupferprobe des Darminhalts, die in Röhrchen mit Transportagar 0482 (nerbe plus, Winsen)

bis zur Untersuchung zusammen mit den Gewebeproben bei 4°C im Kühlschrank gelagert wurde.

Aus dem Rektum der Tiere wurden außerdem zwei Kotproben gewonnen und bei – 20°C

eingefroren.

2.4.2.3 Probenentnahme für luminale IgA-Bestimmung

Zur Bestimmung des Gehalts an luminalem IgA wurde ein Stück des Jejunums mit einer Länge von

20 cm entnommen und mehrmals mit 5 ml PBS mit 0,01% Na-Azid (PBS/Na-Azid) gespült.

Insgesamt wurde ein Spülvolumen von 20 ml verwendet. Spülflüssigkeit und Darminhalt wurden in

einem Weithalsflasche gesammelt. Die Proben wurden in ein 50 ml Reaktionsröhrchen überführt

und in einer Ultrazentrifuge CLGS56R (Beckman Coulter, Krefeld) bei 800 g für eine Minute

zentrifugiert. Der Überstand wurde in einem 50 ml Reaktionsröhrchen gesammelt und das Pellet

mit 10 ml PBS/ Na-Azid für 30 Sekunden gründlich durchmischt, dann erneut bei 800 g für eine


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47

Minute zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Dieser Schritt wurde ein weiteres Mal

wiederholt. Die Überstände wurden gepoolt und durch Zentrifugation (1800 rpm, drei Minuten)

wurden restliche Partikel entfernt. 15 ml des Überstandes wurden über einen Amicon Ultra 100 kD

Filter (Millipore, USA) bei 2000 g für 40 Minuten zentrifugiert und so auf ein Volumen von 250-

500 µl konzentriert, mit PBS/Na-Azid auf 1 ml verdünnt und bei – 80°C eingefroren.

2.4.2.4 Probenentnahme für histologische Untersuchungen

Für die histologische Untersuchung wurden je zwei Gewebestücke von 2 cm Länge aus dem

Jejunum und dem Ileum entnommen. Das Darmlumen wurde mit physiologischer Kochsalzlösung

partikelfrei gespült. Anschließend wurde das Gewebe in 50 ml Polyethylen-Schraubflaschen mit

4%iger Formalinlösung gegeben. Die Proben wurden bis zum Ende des jeweiligen

Versuchsdurchgangs bei Raumtemperatur aufbewahrt.

Die histologischen Untersuchungen wurde im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule

durchgeführt. Die Proben waren verblindet und wurden unabhängig von zwei Untersuchern

beurteilt.

2.5 Probenbearbeitung und Lagerung

2.5.1 Einbettung in Paraffin und Anfertigung von Gewebeschnitten

Um die Anfertigung von Gewebeschnitten aus den fixierten Proben zu ermöglichen, wurden sie

zunächst auf eine Größe von 1 x 0,2 cm geschnitten und dann mit Hilfe einer Histokinette

(Reichert-Jung, Nussloch, Deutschland) in Paraffin eingebettet. Durch diesen Automaten wurden

die Paraformaldehydproben für je 30 Minuten in Leitungswasser und dann nacheinander in

80%igen und 96%igen Ethanol verbracht. Es folgten zweimal je 30 Minuten in 99%igem Ethanol,

Xylol und Paraffin. Bei dem mit Carnoy-Lösung fixiertem Gewebe wurde wegen des alkoholischen

Charakters der Lösung auf den Schritt mit Leitungswasser in der Prozedur verzichtet und direkt in

80%igem Ethanol begonnen.

Im Anschluss an die Einbettung wurden die erhärteten Proben in einem Paraffinbad bei 62°C

vorgewärmt und dann unter Zuhilfenahme einer Blockstation (Shandon, Frankfurt) und einer

Kühlplatte (-12°C, Shandon, Frankfurt) mit flüssigem Paraffin in Blöcke gegossen.


________________________________________________________________________________

48

Nach dem Herunterkühlen der Blöcke auf –12°C wurden mit einem Mikrotom (HM 335 E Microm,

Walldorf) 2 µm dicke Gewebeschnitte angefertigt, auf der Wasseroberfläche eines vorgeheizten

Wasserbades (42°C) gestreckt und plan auf Objektträger aufgebracht. Für die histologischen

Färbungen wurden unbeschichtete, für die immunhistologischen Färbungen beschichtete

Objektträger verwendet. Die Schnitte wurden über Nacht im Trockenschrank bei 37°C oder über

mindestens 48 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet.

Da auf Paraformaldehy-fixierten Schnitten nicht alle Epitope für Antikörper zugänglich sind,

wurden für den Nachweis einiger Epitope Gefrierschnitte angefertigt. Dazu wurden von den in

TissueTec® eingefrorenen transmuralen Gewebeproben bei –20°C mit einem Cryostaten (HM 500

OM, Microm, Walldorf) 5 µm dicke Schnitte angefertigt und auf beschichtete Objektträger

aufgebracht. Nach einstündiger Trocknung bei Raumtemperatur wurden sie entweder direkt

weiterbearbeitet oder einzeln in Alufolie verpackt bei – 20°C gelagert. Die gelagerten Schnitte

konnten dann später nach langsamem Auftauen und anschließendem erneuten Trocknen bei

Raumtemperatur verwendet werden.

2.6 Mikrobiologische Untersuchungen


Die Untersuchung der Kotproben auf Anwesenheit von EcN wurde mit stammspezifischer

Multiplex-PCR (BLUM-OEHLER et al. 2003) durch die Firma Ardeypharm, Herdecke,

Deutschland, vorgenommen.


Die Untersuchung von Rektaltupfern und Kotproben auf Anwesenheit von EcN erfolgte durch die

Firma Ardeypharm.

Die allgemeine, mikrobiologische Untersuchung der Gewebe- und Tupferproben sowie eine

spezifische Untersuchung auf EcA wurde vom Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der

Tiere des Fachbereichs Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität, Gießen, durchgeführt.


________________________________________________________________________________

49

Die Untersuchung auf Salmonellen erfolgte dabei nach Standardmethoden auf Blutagar- und

Gassnerplatten, sowie nach Anreicherung in den Medien Rappaport-Vissidialis und Thetrathionat.

Auf Lawsonia intracellularis und Brachyspira hyodysenteriae wurde mit PCR, auf virale Erreger

mit Hilfe des Elektronenmikroskops untersucht.

2.7 Bestimmung von luminalen und Plasma-IgA


Die Untersuchung des luminalen und Plasma-IgA wurde in der Bundesforschungsanstalt für

Ernährung in Karlsruhe durchgeführt. Mit Hilfe eines ELISAs (enzym-linked immunesorbent assey)

wurde der Gehalt an IgA im Darminhalt und im Plasma gemessen (ROLLER 2003).

2.7.2 Auswertung

Da kein Standard für porcines IgA zur Verfügung stand, konnten weder für den Serum-IgA-Gehalt

noch für den Gehalt an luminalem IgA absolute Konzentrationen bestimmt werden. Die Werte für

Serum-IgA sind als Optische Dichte (OD) bei 450 nm dargestellt. Um den unterschiedlichen

Ausgangsvolumina bei der Auswertung der OD von intestinaler Spülflüssigkeit Rechnung zu

tragen, wurde die OD entsprechend der Formel: OD x 15 x Vkorr korrigiert. Dabei ist OD die

optische Dichte gemessen bei 450 nm, 15 ist der Verdünnungsfaktor des Messvolumens, und Vkorr

das korrigierte Ausgangsvolumen der aufkonzentrierten intestinalen Spülflüssigkeit (Vkorr = VAusg /

15 x VEluat ; VAusg = Ausgangsvolumen der gepoolten Überstande; 15 = für die Aufkonzentrierung

verwendetes Volumen in ml; VEluat = Eluatvolumen aus 15 ml Überstand).

2.8 Histologische Untersuchung

2.8.1 Entparaffinierung

Die Gewebeschnitte wurden in Glasküvetten nacheinander durch Xylol, Alkohol und Aqua dest.


________________________________________________________________________________

50

geführt. Die Schnitte verblieben dabei zweimal jeweils zehn Minuten in Xylol und zweimal je fünf

Minuten in 99%igem vergälltem Alkohol, sowie je fünf Minuten in 96%igem, 70%igem und

50%igem Alkohol. Den Abschluss bildete fünfminütiges Wässern in Aqua dest.

2.8.2 Hämalaun-Eosin Färbung

Die Färbung diente zur allgemeinen Beurteilung der Gewebestruktur und ermöglichte die

Auszählung von neutrophilen, eosinophilen und basophilen Granulozyten.

Für die Färbung wurden die in Aqua dest. gewässerten Schnitte für fünfzehn Sekunden in

unverdünnter Hämalaunlösung gefärbt und anschließend fünf Minuten in Leitungswasser gebläut.

Nach erneuter Wässerung in Aqua dest. für fünf Minuten folgte eine zweiminütige Inkubation in

wässriger Eosinlösung. Die Schnitte wurden für zehn Sekunden in Aqua dest. gespült und über eine

aufsteigende Alkoholreihe von 70%igem, 96%igem und 100%igem Ethanol, in dem die Schnitte

jeweils für eine Minute verblieben, entwässert. Danach wurden sie für zweimal fünf Minuten in

Xylol verbracht und dann mit Entellan® eingedeckt.

2.8.3 Toluidinblaufärbung

Der Thiazinfarbstoff o-Toluidinblau färbt Mastzellen auf Grund der metachromatischen

Eigenschaften ihrer Granula tief violett. Als Metachromasie bezeichnet man die Eigenschaft

bestimmter Verbindungen, sich mit einem Farbstoff in einer anderen als der nach der Grundfarbe

des Farbstoffs zu erwartenden Farbe, zu färben. Die Mastzellen heben sich dadurch deutlich von

dem sich blau darstellenden Restgewebe ab. Die Schnitte wurden nach der Entparaffinierung

zunächst für 60 Minuten in einer o-Toluidinblau Lösung inkubiert, dann für fünf Minuten in Aqua

dest. verbracht und schließlich für zwei Minuten mit Giemsalösung gegengefärbt, um die Kerne der

restlichen Zellen anzufärben und so später eine leichtere Auswertung zu ermöglichen. Nach

erneutem Wässern in Aqua dest. für fünf Minuten wurden die Schnitte wie bei der Hämalaun-

Eosin-Färbung in einer aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert und nach jeweils zweimal fünf

Minuten in einem Xylolbad mit Entellan® eingedeckt.


________________________________________________________________________________

51

2.9 Immunhistologische Methoden

2.9.1 Markierte Streptavidin-Biotin Methode

Die bei nachfolgenden Untersuchungen verwendete markierte Streptavidin-Biotin (LSAB = labeled

streptavidin biotin) Methode ist eine spezielle Form der indirekten enzymatischen Immunhistologie.

Abb. 4 Schematische Darstellung der Antikörperbindung bei der direkten und indirekten

Immunhistologie.

Im Unterschied zur direkten Immunhistologie, bei der der antigenspezifische Primärantikörper

direkt mit einem Enzym (z.B. Meerrettichperoxidase) gekoppelt ist, sind die Primärantikörper bei

der indirekten Methode nicht enzymgekoppelt sondern unmarkiert. Während das Enzym bei der

direkten Methode nach der Inkubation mit einem entsprechenden Substrat zu einer Farbreaktion

führt (Enzym-Substratkomplex Abb. 4), erfolgt die Farbreaktion bei der indirekten

Immunhistologie erst nach Zugabe eines enzymgekoppelten Sekundärantikörpers (Abb. 4). Durch

die Bindung von mehreren Sekundärantikörpern an den antigenspezifischen Primärantikörper

kommt es zu einer höheren Konzentration von Enzym als bei der direkten Methode und damit zu

Plasmamembran

Primärantikörper Primärantikörper

Sekundärantikörper

Direkt Indirekt

Enzym-Substratkomplex

Antigen


________________________________________________________________________________

52

einer Amplifikation des Farbsignals. Bei der LSAB-Methode wird zusätzlich die hohe Affinität

zwischen dem synthetischen Molekül Streptavidin und Biotin ausgenutzt, um eine zweite

Amplifikation des Signals zu erreichen. Dafür wird das Streptavidin mit mehreren Enzymen

kovalent gekoppelt. Der Sekundärantikörper ist statt nur mit dem Enzym mit mehreren

Biotinmolekülen konjugiert. So können am Antikörper zahlreiche Streptavidinmoleküle und damit

überproportional viel Enzym binden (Abb. 5).

Abb. 5 Schematische Darstellung der Vorgänge bei der markierten Streptavidin- Biotin-

Immunhistologie.

Das Meerrettichperoxidase gekoppelte Streptavidin bindet an Biotin. Die Meerrettichperoxidase

führt dann mit einem Substrat (AEC) zur Farbreaktion.

Abkürzungen: AEC = 3-Amino-9-Ethylcarbazol

Abhängig von der Spezies, aus der das zu untersuchende Gewebe stammt, der Fixierung der

Proben, sowie der Lage des zu untersuchenden Epitops wird die Verwendung unterschiedlicher

Protokolle nötig. Auch bei den im Folgenden verwendeten Antikörpern musste dieser Tatsache

Rechnung getragen werden.

Meerrettichperoxidase

AEC

BiotinSekundärantikörper

Streptavidin


________________________________________________________________________________

53

2.9.2 Verwendete Antikörper

Die verwendeten Antikörper sind in Tab. 5 und Tab. 6 aufgeführt. Die untersuchten Epitope

befinden sich an verschiedenen Stellen in der Zelle. CD4, CD8, und CD25 sind Oberflächenepitope.

IgA ist ein Immunglobulin, das sowohl intrazellulär in Vesikeln als auch extrazellulär auf der

Zellmembran und im Extrazellularraum vorkommt.

Tab. 5 Primärantikörper

Antigen Klon Donor/Isotyp Verdünnung Art Diluent Hersteller

CD4 74-12-4 Maus

IgG2b

1:50 mAk Monet Blue VMRD,

Pullman, USA

CD8 MIL-12 Maus

IgG2a

1:100 mAk Van Gogh

Yellow

Serotec,

Oxford, UK

CD25 231.3B2 Maus

IgG1

1:20 mAk Antikörper

Diluent

Serotec,

Oxford, UK

IgA K61 1B4 Maus

IgG1

1:10 mAk Antikörper

Diluent

Serotec,

Oxford, UK

- DD7 Maus

IgG1

1:20 - Antikörper

Diluent

Chemicon,

Hempshire, UK

- DD1645 Maus

IgG2a

1: 100 - Van Gogh

Yellow

Chemicon,

Hempshire, UK

- DD311 Maus

IgG2b

1:10 - Monet Blue Chemicon,

Hempshire, UK

Abkürzungen: CD = Cluster of Differentiation, Ig = Immunglobulin, mAk = monoklonaler Antikörper,


________________________________________________________________________________

54

Tab.6 Sekundärantikörper

Antigen Klon Donor Verdünnung Art Diluent Hersteller

Anti Maus

IgG1

- Ziege 1:50 pAk Antikörper

Diluent

SouthernBiotech,

Birmingham, USA

Anti Maus

IgG2a


Diluent

SouthernBiotech,

Birmingham, USA

Anti Maus

IgG2b


Diluent

SouthernBiotech,

Birmingham, USA

Abkürzungen: CD = Cluster of Differentiation, Ig = Immunglobulin, pAk = polyklonaler Antikörper,

Die Antikörper gegen IgA und CD25 können auf Paraformaldehyd-fixierten Gewebeschnitten

angewendet werden. Neben der Lage des nachzuweisenden Epitops ist auch die Gewebegängigkeit

des verwendeten Antikörpers von großer Bedeutung. Die Antikörper gegen CD4 und CD8 konnten

nur auf Schnitten aus unbehandelten Gefrierproben verwendet werden.

Sämtliche Inkubationsschritte wurden in einer Klimakammer ausgeführt, um ein Austrocknen der

Schnitte zu verhindern. Alle Inkubationsschritte, bei denen keine näheren Angaben zur Temperatur

gemacht worden sind, wurden bei Raumtemperatur (RT) vorgenommen. Die Waschschritte

erfolgten in Glasküvetten mit einem Flüssigkeitsvolumen von 80 ml. Das zur enzymatischen

Entwicklung verwendete 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC) wurde kurz vor Gebrauch aus einem

kommerziellen Kit (Zymed, Deutschland) frisch angesetzt, da es nur für etwa 20 Minuten stabil

war. Die Farbentwicklung erfolgte in allen Fällen unter Sichtkontrolle am Mikroskop.

TBS wurde mit 350 µl Tween/1000 ml verwendet, um die Benetzungseigenschaften der Lösung zu

verbessern.

2.9.2.1 Darstellung von CD4 Oberflächenantigen

Die aus TissueTec® Gefrierproben angefertigten Gewebeschnitte wurden mit einem

wasserabweisenden DakoPen® (Dako, Deutschland) umrandet, um einem Austrocknen

vorzubeugen. Anschließend wurden die Schnitte für 90 Sekunden in einem Gemisch aus Methanol

und eiskaltem Aceton (Verhältnis 1:1) bei 4°C fixiert, um eine bessere Haftung während der

Immunhistologie zu gewährleisten. Nach der Fixierung wurden die Objektträger mit TBS/Tween

gespült und zweimal fünf Minuten in TBS/Tween gewaschen. Im Anschluss folgte die Inkubation


________________________________________________________________________________

55

mit 30 µl des Primärantikörpers über Nacht bei 4°C. Am nächsten Tag wurden die Schnitte

vorsichtig gewaschen und für fünf Minuten in TBS/Tween gestellt. Danach wurden 30 µl

Sekundärantikörper aufgebracht und die Schnitte damit für 30 Minuten inkubiert. Nach dem

Sekundärantikörper folgte ein Waschschritt mit TBS/Tween. Dann wurden die Schnitte mit 30 µl

eines Streptavidin-Biotin-Komplexes für 20 Minuten bedeckt und wiederum mit TBS/Tween

gewaschen. Die Sichtbarmachung des Signals erfolgte mit 30 µl AEC für zwei bis sechs Minuten.

Die Reaktion wurde anschließend fünf Minuten lang in Aqua dest. gestoppt.

2.9.2.2 Darstellung von CD8 Oberflächenantigen

Die Gewebeschnitte für die Darstellung des CD8 Epitops wurden genauso fixiert wie oben

beschrieben. Sie wurde vor der Inkubation mit dem Primärantikörper für zehn Minuten mit 30 µl

eines 5%igem Schweinenormalserums in TBS geblockt, um unspezifische Bindungen des

Primärantikörpers zu verhindern. Das Serum wurde vorsichtig abgeklopft und 30 µl des Antikörpers

in einer Verdünnung von 1:100 in van Gogh Revival Series aufgetragen und über Nacht bei 4°C auf

dem Objektträger belassen. Am nächsten Tag wurden die Objektträger mit TBS/Tween gewaschen,

erneut dieses Mal für 30 Minuten mit 5%igem Schweinenormalserum geblockt, abgeklopft und

dann mit einem biotinylierten, isotypspezifischen α-Maus IgG2a Sekundärantikörper für 30

Minuten inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde für 20 Minuten 30 µl des

Streptavidin-Meerrettichperoxidase Komplexes (Streptavidin-HRP-Komplex) aufgetragen. Es

folgte ein weiterer Waschschritt, dem sich die Farbreaktion von sechs bis sieben Minuten mit 30 µl

AEC anschloss. Gestoppt wurde die Reaktion durch eine fünfminütige Inkubation der Objektträger

in Aqua dest..

Da weder bei diesem Epitop noch bei dem Nachweis von CD4 unspezifische Färbungen von Zellen

im Isotyp zu erkennen waren, und diese auch nach mehrmaliger Wiederholung nicht nachgewiesen

wurden, konnten auf die sonst bei der Verwendung eines horseradish peroxidase (HRP)-gestützten,

enzymatischen Systems übliche Blockierung endogener Peroxidasen mit H2O2 verzichtet werden,

zumal die Verwendung von Wasserstoffperoxid die Darstellung der Epitope erheblich erschwerte

oder sogar gänzlich verhinderte.


________________________________________________________________________________

56

2.9.2.3 Darstellung von CD25-Oberflächenantigen und intrazellulärem IgA

Für den Nachweis von IgA und CD25 wurden paraformaldehydfixierte Paraffinschnitte verwendet.

Sie mussten zunächst entparafffiniert werden. Um die durch Paraformaldehyd hervorgerufene

Vernetzung von Proteinen (Maskierung) rückgängig zu machen, wurden die Objektträger in Target

Retrieval Puffer® (Dako, Deutschland) für 45 Minuten bei 95°C im Wasserbad inkubiert. Sie

wurden dann langsam im Wasserbad auf 80°C abgekühlt und anschließend außerhalb des

Wasserbades auf Raumtemperatur gebracht. Nach zweimal fünfminütigem Waschen in TBS/Tween

wurden unspezifische Antikörperbindungen für 30 Minuten mit TBS + 5% Schweinenormalserum

(TBS/5% SNS) geblockt. Die Schnitte wurden abgeklopft und mit 30 µl eines der beiden

Primärantikörper über Nacht bei 4°C inkubiert. Am folgenden Tag wurde der Antikörper abgespült

und nach Waschen in TBS/Tween erneut mit 30 µl TBS/5% SNS inkubiert, abgeklopft und 30 µl

Sekundärantikörper aufpipettiert. Dieser wurde für 30 Minuten auf den Schnitten belassen und

danach mit TBS/Tween gewaschen. Damit keine Entwicklung des Farbsubstrats durch die im Darm

ubiquitär vorkommende endogene Peroxidase erfolgen konnte, wurde sie in Methanol mit 1,2%

H2O2 in 30 Minuten geblockt. Nach zweimaligem gründlichen Waschen mit TBS/Tween für jeweils

fünf Minuten wurden die Objektträger für 20 Minuten mit 30 µl Streptavidin-HRP-Komplex

inkubiert und nach erneutem Waschen mit TBS/Tween für 15 Minuten mit AEC entwickelt. Das

Stoppen der Farbreaktion erfolgte mit Aqua dest..

2.9.2.4 Gegenfärbung mit Hämalaun

Um eine bessere Differenzierung und Auswertung der Schnitte zu ermöglichen, erfolgte bei allen

Antikörpern unabhängig von den jeweiligen Protokollen eine Gegenfärbung mit Hämalaun für 15

Sekunden. Das Gewebe wurde danach in Leitungswasser fünf Minuten gebläut und nach einer

weiteren fünfminütigen Inkubation in Aqua dest. eingedeckt. Als Eindeckmedium wurde

Faramount® (Dako, Deutschland) verwendet.

2.9.3 Auswertung

Die Beurteilung der Gewebeschnitte wurde an verblindeten Objektträgern von immer demselben

Untersucher durchgeführt. Auswertung und Darstellung erfolgten mit einem Lichtmikroskop


________________________________________________________________________________

57

(Labophot-2, Nikon, Japan) und einer angeschlossenen Digitalkamera (Coolpix 5000, Nikon,

Japan) und einem digitalen Zähler (Assistent® Counter AC-8, Karl Hecht GmbH &Co. KG,

Sondheim).

Die zu untersuchenden Zellen wurden gegen Restzellen gezählt, dabei wurde jede Zelle, die keine

typischen Merkmale der zu untersuchenden Population aufwies, als Restzelle gewertet.

Die Hämalaun-Eosin-gefärbten Schnitte wurden zunächst in 200facher und 400facher

Vergrößerung unter dem Mikroskop allgemein beurteilt. Es wurde in Schnittbereichen gezählt, in

denen die mikroskopische Struktur des Darms klar zu erkennen war. Im Dünndarm mussten

Krypten und Zotten eindeutig zu differenzieren sein. Im Dickdarm war das Vorhandensein

durchgängiger Lumina der Krypten bis zur Grenze zwischen Submukosa und Mukosa

ausschlaggebend für die Verwendbarkeit des Schnittes. Das Oberflächenepithel sollte sich in beiden

Darmabschnitten weitest gehend einschichtig darstellen.

Es wurden immer mindestens 1000 Gesamtzellen (Zielzellen + Restzellen) gezählt. Einige Zellen

wie z.B. die neutrophilen Granulozyten kamen in bestimmten Darmabschnitten nur in sehr kleiner

Zahl vor. War dies der Fall, wurde über die Gesamtzellzahl von 1000 Zellen hinaus solange

weitergezählt, bis mindestens 30 positive Zellen gezählt waren.

Als positiv wurden nur Zellen gewertet, bei denen die Zellmorphologie eindeutig erhalten war.

Zellkern und Zytoplasmamembran mussten deutlich erkennbar und optisch intakt sein. Bei den hier

verwendeten immunhistologischen Färbungen stellten sich die positiven Zellen rot dar. Als positiv

wurden bei Oberflächenfärbungen (CD4, CD8 und CD25 Zellen) gewertet, bei denen mindestens

die Hälfte bis zu zwei Drittel der Oberfläche angefärbt war. Bei intrazellulären Färbungen (IgA)

war die Zelle positiv, wenn das Zytoplasma deutlich rot gefärbt war und den Zellkern zu 2/3

umschloss.

Granulozyten, Mastzellen, CD4+ und IgA+ Zellen wurden mangels Vorkommen im Epithel nur in

der Lamina propria gezählt. CD25 wurde ebenfalls nur in der Lamina propria gezählt, da sie im

Epithel nur sehr vereinzelt zu finden waren.

Beginnend an der Grenze zwischen Submukosa und Mukosa wurden die Zellen der Lamina propria

in einem Gesichtsfeld bei 1000facher Vergrößerung (10fache Vergrößerung durch das Okular +

100fache Vergrößerung durch ein Ölimmersions-Objektiv) gezählt. Im Anschluss wurde das

Gesichtsfeld um genau eine Breite nach luminal verschoben usw. bis zum luminalen Abschluss der

Mukosa. Dann erfolgte eine Verschiebung um ein Gesichtsfeld nach rechts, um in gleicher Weise in

serosaler Richtung auszuwerten. Auch nach Erreichen der zu zählenden Zellzahl (1000 Zellen oder


________________________________________________________________________________

58

mindestens 30 positive Zellen) wurde die Zählung bis zum nächsten luminalen bzw. serosalen

Gesichtsfeld fortgesetzt.

CD8+ Zellen wurden gesondert in Lamina Propria und Epithel ausgewertet, wobei zusätzlich

jeweils zwischen basalem und apikalem Bereich der Mukosa unterschieden wurde. Als

intraepithelial galten Zellen, die mit mindestens 2/3 ihrer Zelloberfläche an Epithelzellen grenzten.

Der apikale Bereich umfasste im Dünndarm die Zotten von der Zottenspitze bis zur Basis

(Übergang zu den Krypten). Beim basalen Bereich handelte es sich um den Abschnitt vom Beginn

der Krypten bis zur Submukosa.

Im Dickdarm erschwerte das Fehlen von Zotten eine reproduzierbare Differenzierung zwischen

apikal und basal. Per definitionem wurde das erste luminale mikroskopische Gesichtsfeld, das den

Sichtbereich bei 1000facher Vergrößerung komplett ausfüllte, als apikal gewertet. Das erste

serosale Blickfeld an der Grenze zur Submukosa bei 1000facher Vergrößerung wurde als basal

definiert. Die Gesichtsfelder haben sich nicht überschnitten.

Die angefertigten Fotos wurden mit der Adobe® Photoshop® 7 Software bearbeitet.

2.10 RNA-Isolierung, reverse Transkription und Polymerase Kettenreaktion

Es werden verschiedene Formen der PCR unterschieden. Für die nachfolgend beschriebenen

Untersuchungen wurde die reverse Transkriptase-PCR (RT–PCR) verwendet. Dabei wurde aus

Versuchsproben Gesamt-RNA isoliert und mit Hilfe einer Reversen Transkriptase cDNA generiert,

die dann in der PCR als Template Verwendung fand.

2.10.1 RNA-Isolierung und reverse Transkription

Für die Bearbeitung von Proben zur RNA-Gewinnung wurden ausschließlich RNAse-freie

Materialien verwendet. Für sämtliche Inkubationsschritte und Amplifikationen stand ein Peltier

Thermal Cycler (PTC, MJ Research, Watertown, USA) zur Verfügung.

Vor der Isolierung der Gesamt-RNA wurde das in RNA-Later gelagerte Gewebe in ein steriles 5 ml

Reaktionsröhrchen mit 1 ml RLT-Puffer (siehe Anhang II) überführt und mit einem Homogenisator

(Ultra Turrax, IKA® Werke, Staufen) 15-20 Sekunden auf höchster Stufe homogenisiert, dabei

erfolgte eine Zerstörung der Gewebezellen, so dass eine Suspension aus Zellwand- und

Zellplasmabestandteilen vorlag. Um Zelltrümmer zu entfernen, wurde das Homogenisat in ein 1,5


________________________________________________________________________________

59

ml Reaktionsröhrchen pipettiert und bei 15400 g in einer Ultrazentrifuge (Centrifuge 5451c,

Eppendorf) für fünf Minuten zentrifugiert. Danach wurde der Überstand zu je 350 µl Aliquots in

Reaktionsgefäße pipettiert und bis zur weiteren Bearbeitung bei –80°C eingefroren.

Aus 350 µl der Überstände wurde die RNA mit einem RNA-Isolationskit (RNeasy® Kit, Qiagen,

Hilden) isoliert. Dabei wurde nach Angaben des Herstellers zur Isolierung von Gesamt-RNA aus

tierischen Zellen verfahren.

Eine Kontrolle der RNA-Qualität erfolgte mit Hilfe einer Gel-Elektrophorese in einem Agarosegel

(1%) mit 500 ng/ml Ethidiumbromid in einer Elektrophoresekammer ( Power Pac 3000, BioRad,

USA) bei 120 mV für 45 Minuten. Anschließend wurde die RNA durch reverse Transkription (RT)

in cDNA umgeschrieben.

Um möglichst identische Mengen an RNA umschreiben zu können, wurde der Gehalt in den

Isolaten photometrisch bestimmt (Lamda Scan 200e, MWG AG Biotech, Ebersberg). Die reverse

Transkription erfolgte anschließend mit ein µg Gesamt-RNA. Vor der Transkription musste

zunächst die genomische DNA bei 37°C für 15 Minuten verdaut werden. Dafür wurden dem RNA-

Isolat 1U RNAse-freie DNAse und 5 µl 5fach First Strand Puffer zugesetzt, dann wurde das

Reaktionsvolumen mit RNAse-freiem H2O auf 25 µl aufgefüllt. Danach wurde mit 2,5 µl EDTA

(25 mM) die RNA bei 70°C zehn Minuten lang denaturiert, und die Proben anschließend auf Eis

gestellt. Unter Zugabe von 200 U Superskript® III Reverse Transkriptase, 2,5 µl Oligo dT Primer

(20 pmol/ µl), 4 µl dNTP Mix (2,5 mM), 5 µl DTT (100 mM), 5 µl 5fach First Strand Puffer und

sowie Ergänzung des Volumens auf 50 µl mit RNAse-freiem H2O wurde für eine Stunde bei 49°C

cDNA synthetisiert und anschließend sofort für die PCR eingesetzt oder bis zur späteren

Verwendung bei -20°C gelagert.

2.10.2 PCR

Mit der PCR konnte unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase, zweier

Oligonukleotid-Primer (Primer), Desoxynukleotiden und einer geringen Menge an DNA-Vorlage

(Template) spezifisch ein DNA-Fragmente amplifizieren werden. Die Probe wurde dabei einem

Ablauf von Denaturierungs-, Anlagerungs- (Annealing) und Verlängerungsschritten (Elongation)

unterzogen. Das Ablaufen dieser drei Schritte nacheinander wird als „Cycle“ (Zyklus) bezeichnet.


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60

2.10.3 Verwendete Primer und PCR-Protokolle

Tab. 7 verwendete Primer

Primer Lage Nukleotidsequenz Fragmentgröße

GAPDHSense

Antisense

5’ ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3’

5’ TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA 3’452 bp

INF-γSense

Antisense

5´ GCA AGT ACC TCA GAT GTA CC 3´

5´ TGG CCT TGG AAC ATA GTC TG 3´359 bp

TNF-αSense

Antisense

5´ ACT GCA CTT CGA GGT TAT CG 3´

5´ AGA GGA CCT GGG AGT AGA TG 3´266 bp

TGF-βSense

Antisense

5´ CAG AGA GGC TAT AGA GG G TT 3´

5´ TGT CTA GGC TCC AGA TGT AG 3´371 bp

IL-4Sense

Antisense

5´ GTG CGA CAT CAC CTT ACA AG 3´

5´ TGG CTT CAT GCA CAG AAC AG 3´254 bp

IL-10Sense

Antisense

5´ TTG CCA AGC CTT GTC AGA GA 3´

5´ TCA CCC ATG GCT TTG TAG AC 3´243 bp

Prepro-Defensin β1Sense

Antisense

5´ CCT CCT TGT ATT CCT CCT CA 3´

5´ TTG CAG CAT TTG ACT TGG GG 3´168 bp

PR-39Sense

Antisense

5´ ACC CAT CCA TTC ACT CAC 3´

5´ AGC CAC AAC AAT AAG ATC C 3´262 bp

ProtegrineSense

Antisense

5´ TGG ATC AGA TCA AGG ACC 3´

5´ ACA CAG ACG CAG AAC CTA C 3´100 bp

NK-LysinSense

Antisense

5´ GAG CAG TTC TGC CAG AAC CT 3´

5´ GCA GGA GTT AGG TGA GAG AA 3´479 bp

Abkürzungen: bp = Basenpaare, GAPDH = Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, IL = Interleukin,

INF = Interferon, TGF = Tumorwachstumsfaktor (tumor growth factor), TNF = Tumornekrosefactor

Im Einzelnen wurden für die PCR 1,5 µl des RT-Produktes eingesetzt. Zusammen mit 2,4 µl 10 x

PCR Puffer, 1µl dNTP (2,5 mM), 0,5 µl Magnesiumchlorid (MgCl) (50 mM), 0,75 U Platinum

Taq-Polymerase, 5 pmol Sense-Primer und 5 pmol Antisense-Primer (Tab. 7) wurde das

Reaktionsvolumen mit H2O zuletzt auf 25 µl aufgefüllt. Die Amplifikation erfolgte im


________________________________________________________________________________

61

Thermalcycler mit einer initialen Denaturierung und Aktivierung der Polymerase für fünf Minuten

bei 94°C. Je nach dem zu amplifizierenden Fragment wurden verschiedene Annealingtemperaturen

und eine unterschiedliche Anzahl Cycle benötigt (Tab. 8).

Tab. 8 verwendete Protokolle und Temperaturen bei verschiedenen Primern

Primer Denaturierung Annealing Elongation Cycle-Zahl

°C s °C s °C s

GAPDH 94 30 56 45 72 35 28

INF-γ 94 30 58 45 72 35 34

TNF-α 94 30 58 45 72 35 35

TGF-β 94 30 58 45 72 35 32

IL-4 94 30 56 45 72 35 28

IL-10 94 30 58 45 72 35 40

Prepro-

Defensin β194 30 58 45 72 35 39

PR-39 94 30 55 45 72 35 42

Protegrine 94 30 55 45 72 35 42

NK-Lysin 94 30 55 45 72 35 36

Zum Abschluss jeder PCR erfolgte eine abschließende Elongation bei 72°C für zwei Minuten.

Zu den 25 µl PCR-Produkten wurden 5 µl eines DNA-Laufpuffers gegeben, und 11 µl davon in

einem Agarosegel (1%) mit 500 ng/ml Ethidiumbromid elektrophoretisch aufgetrennt und im

ultravioletten Licht fotografiert (Gel Doc 1000, BioRad, USA). Als Standard diente 11µl einer 100

bp DNA-Ladder Lösung. Die Fotos wurden mittels Molecular Analyst® Software digitalisiert.

Die PCR erfolgte semiquantitativ. Für jeden verwendeten Primer wurde zunächst die Cycle-Zahl

bestimmt, bei der Unterschiede in der Bandenintensität gerade erkennbar waren. Dazu wurden

während der PCR nach dem Ablaufen unterschiedlich vieler Cycle Proben entnommen und so die

Cycle-Zahl bestimmt, bei der eine Bande gerade erkennbar war. Als Vergleich für den gesamten

mRNA-Gehalt der Probe diente die mRNA-Expression von GAPDH („housekeeping gene“).


________________________________________________________________________________

62

Um eine Kontamination auszuschließen, wurde bei jeder PCR eine Probe mit allen Reagenzien

ohne RT Produkt als Negativkontrolle mitgeführt. Transmurale Gewebeproben aus dem Dünndarm

von drei Wochen alten Ferkeln dienten bei den antimikrobiellen Peptiden PR-39 und den

Protegrinen als Positivkontrolle. Es wurden jeweils vier bzw. fünf Tiere einer Gruppe untersucht,

und die PCR für die verschiedenen Gene wurden im Duplikat durchgeführt.

2.10.4 Auswertung

Die Auswertung der PCR-Ergebnisse erfolgte semiquantitativ vergleichend. Die Banden der PCR-

Proben wurden mit dem mRNA-Gehalt von GAPDH der gleichen Proben abgeglichen und danach

die Ergebnisse der unterschiedlichen Versuchsgruppen einander gegenübergestellt.

2.11 Statistik

In den Graphen des Ergebnisteils stellen die Balken, wenn nicht anders angegeben, die Mittelwerte

der entsprechenden Gruppen dar. Bei den angegebenen Mittelwerten handelt es sich um

arithmetische Mittel. Zusätzlich ist im Text in Klammern die Standardabweichung (SD) angegeben

(Mittelwerte und Standarbweichungen sind im Anhang III tabellarisch aufgeführt.)

Der Unterschied der Zellanzahl zwischen den Darmabschnitten wurde mittels t-Test, die

Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen mit einfaktorieller Varianzanalyse statistisch

überprüft. Die Berechnungen erfolgten mit SAS® System 8e.

Ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit von kleiner 5% (p<0,05) wurde ein Ergebnis als signifikant

bezeichnet. Die Signifikanzniveaus wurden wie folgt festgelegt: n.s. = nicht signifikant; * = p ≤

0,05; ** = P ≤ 0,01; *** = p ≤ 0,001.

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

63

3 Ergebnisse

Die Wirkung von EcN als Probiotikum wird nicht nur auf die Verdrängung anderer Bakterien der

Darmflora zurückgeführt, sondern auch auf die Beeinflussung des darmassoziierten Immunsystems.

Deswegen wurden die Auswirkungen von EcN auf die Anzahl und Verteilung von Immunzellen im

Darm untersucht, und die mRNA-Expression verschiedener Entzündungsmediatoren bestimmt.

3.1 Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN

Um den Einfluss von EcN auf das GALT des Schweins zu bestimmen, wurden 15 Läuferschweine

untersucht, von denen jeweils fünf Tiere für drei Wochen 109 KBE EcN, 1011 KBE EcN oder

Placebo erhalten hatten (4.2.1). Die Gewichtszunahme der Tiere unter EcN-Fütterung wurde

dokumentiert.

Aus dem Duodenum, Jejunum, Ileum und Kolon wurden transmurale Gewebeproben mit

Hämalaun-Eosin-Färbung, Toluidinfärbung und LSAB-Immunhistologie untersucht. Die

Mittelwerte sowie die Standardabweichung für alle untersuchten Zellpopulationen sind tabellarisch

im Anhang III zusammengefasst.

Die mRNA-Expression verschiedener Zytokine im Darm wurde mittels semiquantitativer PCR

untersucht. Die Ergebnisse sind im Folgenden dargestellt:

3.1.1 Gewicht

Um Veränderungen im Verlauf der Gewichtsentwicklung festzustellen, wurden die Versuchstiere

einmal pro Woche sowie zu Versuchsbeginn und vor der Schlachtung gewogen. Die

Gewichtsveränderung war individuell unterschiedlich. Die Fütterung von EcN hatte keinen Einfluss

auf die Gewichtszunahme (Tab. 12 Anhang III).

3.1.2 Mikrobiologische Untersuchung

Um sicherzustellen, dass EcN im Darm der Versuchstiere vorhanden war, und die Kontrolltiere frei

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

64

von EcN waren, wurden Kotproben der Tiere auf das Vorhandensein des Keims untersucht.

Die Untersuchung erfolgte bei der Firma Ardeypharm mittels Multiplex-PCR. Die Kontrolltiere

waren frei von EcN. Im Unterschied dazu ließ sich bei allen EcN gefütterten Versuchstieren EcN im

Kot nachweisen. Bei den Tieren der Dosisgruppe 1011 KBE EcN war der Kot zu jedem

Probenzeitpunkt EcN-positiv. Bei zwei Tieren (S2-10, S2-11) der Dosisgruppe 109 KBE EcN

wurde EcN am Tag der Schlachtung nur schwach oder gar nicht mehr nachgewiesen. Bei dem Tier

(S2-11), das am Schlachttag kein EcN mehr im Kot hatte, waren auch am 14. Versuchstag nur sehr

geringe Mengen an EcN nachweisbar (Tab. 9).

Tab. 9 EcN im Kot bei konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN-Fütterung

Gruppe Tier 7. Versuchstag 14. Versuchstag SchlachtungKontrolle S2-3 - - -

S2-4 - - - S2-8 - - - S2-12 - - - S2-13 - - -

109 KBE EcN S2-1 + + + S2-2 + + + S2-9 + + + S2-10 + + (+) S2-11 + (+) -

1011 KBE EcN S2-5 + + + S2-6 + + + S2-7 + + fehlt S2-14 + + + S2-15 + + +

Abkürzungen: EcN = E. coli Nissle 1917, KBE = koloniebildende Einheit, + = EcN deutlich im Duplikat

nachgewiesen, (+) = EcN nachgewiesen, eventuell erst bei Wiederholung der PCR nachgewiesen, - = EcN

nicht nachgewiesen

3.1.3 Histologische Untersuchung

Der Hypothese folgend, dass EcN Auswirkungen auf die Zahl an Immunzellen haben könnte,

wurden zunächst Zellen der unspezifischen Abwehr in der Darmmukosa untersucht. Im Blickpunkt

standen insbesondere Granulozyten und Mastzellen, die in Gewebeproben histologisch untersucht

wurden.

In den Hämalaun-Eosin-gefärbten Schnitten wurde die Anzahl von eosinophilen, neutrophilen und

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

65

basophilen Granulozyten und mit Toluidinblaufärbung die Anzahl an Mastzellen bestimmt.

3.1.3.1 Eosinophile Granulozyten

Eosinophile Granulozyten waren anhand der leuchtend rosarot gefärbten Granula im Zytoplasma

deutlich zu erkennen. Das Zytoplasma färbte sich schwach rosa. Der Zellkern stellte sich violett dar.

Bei porcinen eosinophilen Granulozyten heben sich die Granula im Vergleich zu anderen Tieren

und dem Menschen durch eine besonders intensive Färbung vom Zytoplasma ab (Abb. 6).

Abb. 6 Eosinophile Granulozyten in der Lamina propria des Ileums (schwarzer Pfeil) eines

Tieres aus der 1011 KBE EcN Gruppe

Hämalaun-Eosin-Färbung, 1000fach vergrößert, Messbalken = 10 µm.

Bei allen untersuchten Tieren wurden eosinophile Granulozyten nur in der Lamina propria der

Mukosa gefunden. Im Epithel waren sie nicht nachzuweisen.

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

66

0

10

20

Duodenum Jejunum IleumColon ascendens Colon descendens

n.s. n.s.

Kontrollgruppe

Eosi

noph

ile G

ranu

lozy

ten/

Ges

amtz

elle

n LP

in %

Abb. 7 Verteilung eosinophiler Granulozyten in der Lamina propria verschiedener

Darmabschnitte bei gesunden Läuferschweinen der Kontrollgruppe (n=5), n.s. = nicht

signifikant

Zwischen allen nicht mit n.s. bezeichneten Darmabschnitten ist die Anzahl eosinophiler Granulozyten

signifikant verschieden.

In Abb. 7 ist beispielhaft das Verteilungsmuster eosinophiler Granulozyten entlang der Darmachse

bei Tieren der Kontrollgruppe dargestellt. Dieses Muster bestätigte sich auch bei den EcN

gefütterten Tieren. Die Anzahl an eosinophilen Granulozyten nahm vom Duodenum bis zum Ileum

deutlich zu. Im Duodenum fand sich im Vergleich zu den anderen Dünndarmabschnitten eine

geringere Zahl von Eosinophilen (p<0,05). Zwischen Ileum und Jejunum war kein Unterschied

erkennbar. In allen drei Dünndarmabschnitte ließ sich eine signifikant (p<0,05 und p<0,005) höhere

Zahl an eosinophilen Granulozyten als im Kolon beobachten (Abb. 7).

Die meisten befanden sich bei allen drei Versuchsgruppen im Ileum. Sie machten zwischen 11%

und 13,7% (11% ± 2,2% Kontrolle, 13,7% ± 0,5% 109 KBE EcN und 11,3% ± 8,3% 1011 KBE

EcN) der gesamten Zellzahl in der LP aus. Im Kolon hingegen kamen eosinophile Granulozyten

beim Schwein nur in verschwindend geringen Mengen (0,6% ± 0,3% Kontrolle, 0,2% ± 0,2% 109

KBE EcN und 0,2% ± 0,2% 1011 KBE EcN) vor ( Tab. 13, Anhang III).

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

67

0

10

20

Duodenum Colondescendens

Colonascendens

IleumJejunum

Kontrolle109 KBE1011 KBE

Eosi

noph

ile G

ranu

lozy

ten/

Ges

amtz

elle

n LP

in %

Abb. 8 Verteilung eosinophiler Granulozyten in der Lamina propria gesunder

Läuferschweine der Kontrollgruppe, nach Fütterung mit 109 KBE EcN/d (109 KBE) oder mit

1011 KBE EcN/d (1011 KBE) (n=5)

Die Tiere der Kontrollgruppe und der beiden EcN gefütterten Gruppen unterschieden sich

hinsichtlich des Anteils eosinophiler Granulozyten in der Darmmukosa nicht. Die

Gruppenzugehörigkeit hatte keinen Einfluss auf die Verteilung entlang der Darmachse (Abb. 8).

3.1.3.2 Neutrophile Granulozyten

Neutrophile Granulozyten waren in der Hämalaun–Eosin-Färbung an ihrem tief violetten, gelappten

Kern zu erkennen. Das Zytoplasma war zart rosa ohne deutliche Granula (Abb. 9).

Diese Zellen wurden genau wie eosinophile Granulozyten ausschließlich in der Lamina propria der

Mukosa gefunden.

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

68

Abb. 9 Neutrophile Granulozyten in der Lamina propria des Ileums (schwarzer Pfeil) eines

Tieres aus der 1011 KBE EcN Gruppe

Hämalaun-Eosin-Färbung, 1000fach vergrößert, Messbalken = 10 µm.

0

10

20

Duodenum Jejunum Ileum

Colon ascendens Colon descendens

*

* *

Kontrollgruppe

Neut

roph

ile G

ranu

lozy

ten/

Ges

amtz

elle

n LP

in %

Abb. 10 Verteilung neutrophiler Granulozyten in der Lamina propria verschiedener

Darmabschnitte bei gesunden Läuferschweinen der Kontrollgruppe (n=5)

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

69

Zur Veranschaulichung der Verteilung der neutrophilen Granulozyten in den einzelnen

Darmabschnitten dienten die Werte für die Kontrollgruppe. Die Anzahl an neutrophilen

Granulozyten in der Lamina propria der Kontrollgruppe war insgesamt gering (zwischen 0,4% ±

0,2% im Jejunum und 3,7% ± 1,4% im Duodenum und Colon ascendens), wobei die Zahlen im

Jejunum am geringsten waren (Abb. 10).

0

10

20


Colonascendens

IleumJejunum


Neut

roph

ile G

ranu

lozy

ten/

Ges

amtz

elle

n LP

in %

Abb. 11 Verteilung neutrophiler Granulozyten in der Lamina propria gesunder


1011 KBE EcN/d (1011 KBE) (n=5)

Durch die Fütterung von EcN ergaben sich keine Unterschiede bei der Anzahl neutrophiler

Granulozyten in den untersuchten Darmabschnitten. Auch die Verteilung entlang der Darmachse

war durch die EcN Fütterung nicht beeinflusst (Abb. 11).

3.1.3.3 Basophile Granulozyten

Basophile Granulozyten hätten mit Hämalaun-Eosin violette Granula in hellrosa Zytoplasma und

einem dunklen gelappten Kern. Im Darm wurden sie bei keinem der untersuchten Tiere gefunden.

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

70

3.1.3.4 Mastzellen

Durch metachromatische Eigenschaften des Zytoplasmas färbten sich Mastzellen nach Fixierung

mit Carnoy-Lösung durch Toluidinblau violett.

Der Zellkern war oval von tief violetter bis schwarzer Farbe und das Zytoplasma dunkelviolett.

Mastzellen kamen im porcinen Darmgewebe in der Lamina propria der Mukosa, der Submukosa

und in den bindegewebigen Septen zwischen der Längs- und Zirkulärmuskelschicht der Muskularis

vor. Im Epithel wurden keine Mastzellen gefunden.

Die Mastzellen der Lamina propria hatten eine dendritische Morphologie, mit langgestreckten

Zellkörpern und fingerförmigen Zytoplasmafortsätzen (Abb. 12). Sie waren gleichmäßig in der

Lamina propria verteilt. Die Fütterung von EcN veränderte diese Morphologie nicht.

Die Mastzellen der Submukosa waren stärker abgerundet als die in der Mukosa und befanden sich

häufig in der Nähe von Blutgefäßen (Abb. 13). Im Duodenum kamen sie auch im Bindegewebe

zwischen den Lieberkühn`schen Drüsen vor. Im Kolon nahm die Anzahl an submukosalen

Mastzellen deutlich ab (nicht gezeigt).

Abb. 12 Mastzellen in der Lamina propria des Kolons (schwarzer Pfeil) eines Tieres der

Kontrollgruppe

Toluidinblau-Färbung, 1000fach vergrößert, Messbalken = 10 µm.

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

71

Abb. 13 Mastzellen in der Submukosa des Jejunums (schwarzer Pfeil) eines Tieres aus der 1011 KBE

EcN Gruppe, BG = Blutgefäßes

Toluidinblau-Färbung, 1000fach vergrößert, Messbalken = 10 µm.

0

10

20

Duodenum Jejunum IleumColon ascendens Colon descendens

Kontrollgruppe

Mas

tzel

len/

Ges

amm

tzel

len

LP in

%

Abb. 14 Verteilung von Mastzellen in der Lamina propria verschiedener Darmabschnitte bei

gesunden Läuferschweinen der Kontrollgruppe (n=5)

BG

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

72

Die Zahl an Mastzellen in der Darmmukosa war insgesamt gering. Mit Anteilen an der

Gesamtzellzahl von 2,3% (± 1,4%) im Jejunum bis 3,1% (± 1%) im Colon ascendens unterschieden

sich die Darmabschnitte nicht. Dies galt sowohl für die Kontrolltiere (Abb. 14) als auch für die

beiden EcN-gefütterten Gruppen (nicht dargestellt).

Nicht nur die Verteilung der Mastzellen entlang der Darmachse, sondern auch der Anteil in der LP

der einzelnen Darmabschnitte blieb von EcN unbeeinflusst (Abb. 15).

0

10

20


Colonascendens

IleumJejunum


Mas

tzel

len/

Ges

amm

tzel

len

LP in

%

Abb. 15 Verteilung von Mastzellen in der Lamina propria gesunder Läuferschweine der

Kontrollgruppe, nach Fütterung mit 109 KBE EcN/d (109 KBE) oder mit 1011 KBE EcN/d

(1011 KBE) (n=5)

3.1.4 Immunhistologische Untersuchung

Um die Anzahl und Verteilung von T-Helfer-Zellen, CD8+ Zellen, CD25+ Zellen und IgA-

produzierenden Plasmazellen im Darm EcN-gefütterter Tiere und von Tieren der Kontrollgruppe

untersuchen zu können, wurden Gewebe immunhistologisch mit der LSAB-Methode untersucht.

Bedingt durch das, für die Farbreaktion verwendete Substrat (AEC) stellten sich positive Zellen im

Gewebeschnitt rot dar.

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

73

3.1.4.1 T-Helfer-Zellen (CD4+)

CD4 positive Zellen kamen in der Lamina propria der Mukosa, jedoch nicht im Epithel vor. Sowohl

im Duodenum als auch im Jejunum waren in den Villi vergleichsweise mehr Zellen zu finden als im

Krypentbereich (Abb. 16). Ileum und Kolon zeigten eine gleichmäßige Verteilung der CD4+ Zellen

über den gesamten Querschnitt der Mukosa.

In der Submukosa waren CD4+ Zellen in nennenswerter Zahl nur im Ileum vorhanden. Sie

schlossen sich direkt der Mukosa an und lagen hauptsächlich interfollikulär im Bereich der

Peyer´schen Platten. In der Submukosa der anderen Darmabschnitten wurden nur vereinzelt CD4+

Zellen gefunden. Auch in der Peripherie der in der Kolonsubmukosa vorkommenden Lymphfollikel

waren im Gegensatz zur Peripherie der Peyer´schen Platten des Ileums kaum CD4+ Zellen

vorhanden.

Tab. 10 Gruppen für CD4+ Zellen

Gruppe Zellzahl

1 < 25% der Lamina propria Zellen CD4+

2 25% bis 49% der Lamina propria Zellen CD4+

3 50% bis 75% der Lamina propria Zellen CD4+

4 > 75% der Lamina propria Zellen CD4+

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

74

Abb. 16 CD4+ Zellen in der Lamina propria des Jejunums (rot) eines Tieres aus der 1011 KBE EcN/d

Gruppe

LSAB-Methode (Antikörper 74-12-4) mit anschließender Hämalaun-Färbung, 100fach vergrößert,

Messbalken = 100 µm.

CD4+ Zellen machten in vielen Fällen einen erheblichen Teil der Lamina propria Zellen aus. Da

zum Zeitpunkt der Untersuchungen keine Antikörper existierten, die eine Verwendung auf

Paraffinschnitten erlaubten, wurden Gefrierschnitte verwendet. Die bei Gefrierschnitten sinnvoll

erzielbare Schnittdicke von 5µm ließ dabei keine sichere Differenzierung einzelner Zellen mehr zu.

Deshalb wurde die Zellzahl hier abweichend von den anderen Zellarten semiquantitativ bestimmt.

Die Gruppeneinteilung ist in Tab. 10 dargestellt.

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

75

0

25

50

75

100

Duodenum Jejunum Ileum Colonascendens

Colondescendens

Kontrolle 109 KBE 1011 KBE

CD

4+ Z

elle

n/G

esam

tzel

len

LP in

%*

*

Abb. 17 Verteilung von CD4+ Zellen in der Lamina propria gesunder Läuferschweine der


(1011 KBE) (n=5)

Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte semiquantitativ (siehe Tab. 10). Das Fehlen einer

Standardabweichung im Colon descendens in der 1011 KBE-Gruppe ist die Folge gleicher Werte für alle fünf

Tiere.

Die Fütterung von EcN veränderte den Anteil CD4+ Zellen in den Darmabschnitten im Vergleich

der drei Versuchsgruppen nicht. In der Kontrollgruppe und der 109 KBE EcN gefütterten Gruppe

gab es auch entlang der Darmachse innerhalb einer Gruppe keinen Unterschied. Die hohe EcN

Dosierung (1011 KBE EcN) führte im Ileum und Colon ascendens im Vergleich zum Colon

descendens der selben Gruppe zu einem signifikant geringeren Anteil an CD4+ Zellen (Abb. 17).

3.1.4.2 CD8+ Zellen

Anders als CD4+ T-Helfer-Zellen kommen CD8+ Zellen sowohl in der Lamina propria als auch im

Epithel des Darms vor. Man bezeichnet sie dort auf Grund ihrer Lage auch als intraepitheliale

Lymphozyten (IEL). Die IEL lagen dabei hauptsächlich in der Nähe der Basalmembran zwischen

den Zellkernen der Epithelzellen (Abb. 18a + b).

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

76

Abb. 18a+b CD8+ Zellen in der Mukosa des Duodenum (rot) eines Tier aus der 1011 KBE EcN

Gruppe

LSAB-Methode (Antikörper MIL-12) mit anschließender Hämalaun-Färbung (18a) und Isotypkontrolle

LSAB-Methode (Antikörper Maus IgG2a) mit anschließender Hämalaun-Färbung (18b), 400fach vergrößert,

Messbalken = 10 µm.

Die Verteilung der CD8+ Zellen in den verschiedenen Bereichen der Darmmukosa und den

untersuchten Darmabschnitten ist im Folgenden beispielhaft für die Kontrollgruppe dargestellt.

Im luminalen Epithel war der Anteil an CD8+ Zellen deutlich höher als im basalen Epithel (Abb.

19a + b). Das galt für alle Darmabschnitte und alle Gruppen, wobei die Unterschiede zwischen

luminalen und basalen IEL im Duodenum und Jejunum stärker ausgeprägt waren als im Ileum und

im Kolon. Insgesamt waren im luminalen Epithel des Duodenums mit 33% (± 9,9%) die meisten

CD8+ Zellen zu finden. Entlang der Darmachse nahm der Anteil luminal bis zum Kolon (12,1% ±

2,9%) stetig ab. Im basalen Epithel waren keine Unterschiede zwischen den Darmabschnitten zu

erkennen. Der Anteil lag zwischen 2,8% und 4,1%.

18a)

18b)

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

77

Abb. 19a IEL luminal Abb. 19b IEL basal

Abb. 19a-d Verteilung von CD8+ Zellen im Epithel (19a + b) und der Lamina propria (19c

+ d) verschiedener Darmabschnitte bei gesunden Läuferschweinen der Kontrollgruppe (n=5)

Anteil CD8+ Zellen im Epithel des luminalen Bereichs (19a) und des basalen Bereichs (19b) der Mukosa,

Anteil CD8+ Zellen in der Lamina propria des luminalen Bereichs (19c) und des basalen Bereichs (19d) der

Mukosa.

0

10

20

30

40

50

* * ** * *

* * ** * *

* **

*

Kontrollgruppe

CD

8+ Z

elle

n/G

esam

tzel

len

basa

les

Epith

el in

%

0

10

20

30

40

50

Kontrollgruppe

CD

8+ Z

elle

n/G

esam

tzel

len

bas

ales

Epi

thel

in %

0

10

20

30

40

50

* * *

Kontrollgruppe

CD8+

Zel

len/

Ges

amtz

elle

n lu

min

ale

LP in

%

0

10

20

30

40

50

** * *

* * *

Kontrollgruppe

CD

8+ Z

elle

n/G

esam

tzel

len

lum

inal

e LP

in %

Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens


Abb. 19c LPL luminal Abb. 19d LPL basal

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

78

Zwischen der luminalen und basalen Lamina propria waren die Unterschiede im Anteil der CD8+

Zellen bei Weitem weniger ausgeprägt als im Epithel. Der Anteil luminaler CD8+ Zellen lag

zwischen 10,3% (± 1,3%) im Colon ascendens und 19,1% (± 7,3%) im Jejunum. Der Anteil basaler

LP CD8+ Zellen lag zwischen 11,7% (± 1,8%) im Ileum und 6,4% (± 0,8%) im Colon ascendens.

Signifikante Unterschiede konnten entlang der Darmachse in der luminalen LP nur zwischen dem

Duodenum und Jejunum und in der basalen LP zwischen den Dünndarmabschnitten festgestellt

werden (Abb. 19c + d).

Die Verteilung CD8+ Zellen zwischen luminaler und basaler Mukosa sowie zwischen den

untersuchten Darmabschnitten gilt, wie für die Kontrolltiere dargestellt, auch für die Schweine der

beiden EcN-gefütterten Gruppen.

Der Vergleich der Anzahl CD8+ Zellen zwischen den Versuchsgruppen soll im Folgenden zur

besseren Übersicht nach Darmabschnitten getrennt erfolgen. Im Duodenum und im Colon

descendens unterschieden sich die EcN gefütterten Tiere weder untereinander noch im Vergleich

mit der Kontrollgruppe. Dies gilt für alle vier untersuchten Lokalisationen im Darmquerschnitt

(Abb. 20a + e).

Im Jejunum war eine signifikante Veränderung zwischen basalen IEL im Vergleich von

Kontrollgruppe und 109 KBE EcN Gruppe zu erkennen, die jedoch nicht für den Vergleich mit der

hochdosierten EcN-Gruppe galt (Abb. 20b).

Das Ileum zeigte einen signifikanten Anstieg bei den LP CD8+ Zellen zwischen den Tieren der

hochdosierten Gruppe (1011 KBE EcN/ Tag) und den Kontrollen (Abb. 20c).

Die ausgeprägtesten Veränderungen ergaben sich im Colon ascendens. Dort war in der

hochdosierten EcN-Gruppe, verglichen mit den Tieren der Kontrollgruppe, die Zahl der CD8+

Zellen in allen Bereichen der Mukosa mit Ausnahme des basalen Epithelbereichs signifikant erhöht.

In der luminalen LP ergab sich auch für die niedrig dosierte EcN-Gruppe (109 KBE EcN/ Tag) eine

signifikant höhere Anzahl CD8+ Zellen im Vergleich zu den Kontrollen (Abb. 20d).

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

79

Abb. 20a Duodenum Abb. 20b Jejunum

0

10

20

30

40

50

0

10

20

30

40

50

luminale LP basales Epithel basale LPluminales Epithel

CD8+

Zel

len/

Ges

amtz

elle

n Ep

ithel

in %

CD8+

Zel

len/

Ges

amtz

elle

n LP

in %

0

10

20

30

40

50

0

10

20

30

40

50


*

CD8+

Zel

len/

Gesa

mtz

elle

n Ep

ithel

in %

CD8+

Zel

len/

Ges

amtz

elle

n LP

in %

0

10

20

30

40

50

0

10

20

30

40

50


*

CD8+

Zel

len/

Gesa

mtz

elle

n Ep

ithel

in %

CD8+

Zel

len/

Ges

amtz

elle

n LP

in %

0

10

20

30

40

50

0

10

20

30

40

50


* * **

CD8+

Zel

len/

Gesa

mtz

elle

n Ep

ithel

in %

CD8+

Zel

len/

Ges

amtz

elle

n LP

in %

0

10

20

30

40

50

0

10

20

30

40

50


CD8+

Zel

len/

Gesa

mtz

elle

n Ep

ithel

in %

CD8+

Zel

len/

Ges

amtz

elle

n LP

in % Kontrolle

109 KBE

1011 KBE

Abb. 20a-e Verteilung von CD8+ Zellen in der intestinalen Mukosa gesunder


1011 KBE EcN/d (1011 KBE) (n=5)

Abb. 20c Ileum Abb. 20d Colon ascendens

Abb. 20e Colon descendens

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

80

Um einen Eindruck über die Zusammenhänge zwischen intraepithelialen Lymphozyten und Lamina

propria Lymphozyten im luminalen und basalen Teil der Mukosa zu bekommen, wurde das

Verhältnis zwischen IEL und LPL bestimmt und die Quotienten anschließend verglichen (Abb. 21a

+ b).

Abb. 21a-c luminale Mukosa

Abb. 21a Kontrolle Abb. 21b 109 KBE EcN Abb. 21c 1011 KBE EcN

0

1

2

3

4

*

**

*

*

Quo

tient

IEL/

LPL

lum

inal

0

1

2

3

4

*

**

*

Quo

tient

IEL/

LPL

lum

inal

0

1

2

3

4

**

Quo

tient

IEL/

LPL

lum

inal

0

1

2

3

4

Quo

tient

IEL/

LPL

basa

l

0

1

2

3

4

*

Quo

tient

IEL/

LPL

basa

l

0

1

2

3

4

Quo

tient

IEL/

LPL

basa

l



Abb. 21a – f Verhältnis von epithelialen und Lamina propria CD8+ Zellen im luminalen und

basalen Bereich der Mukosa von fünf Darmabschnitten gesunder Läuferschweine der


(1011 KBE) (n=5)

Das Verhältnis zwischen luminalen IEL und LPL war in allen Darmabschnitten unabhängig von der

EcN-Fütterung eins oder größer (Abb. 21a-c). Der Grund dafür ist ein identischer bzw. höherer

Abb. 21d Kontrolle Abb. 21e 109 KBE EcN Abb. 21f 1011 KBE

Abb. 21d-f basale Mukosa

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

81

Anteil an IEL im Vergleich zu den CD8+ LPL dieses Mukosabereichs. Im basalen Bereich der

Mukosa verhielt es sich umgekehrt. Die Quotienten waren kleiner eins (Abb. 21d-f), was einen

Überschuss an CD8+ LPL gegenüber IEL deutlich macht.

Bei der hochdosiert EcN-gefütterten Gruppe war der Quotienten (IEL:LPL) für die Zotten des

Duodenums zu den Quotienten der anderen Darmabschnitte nicht signifikant unterschiedlich (Abb.

21c). Während bei den anderen beiden Versuchsgruppen die luminalen Quotienten des Duodenums

verglichen mit den Quotienten der anderen Darmabschnitte einen signifikanten Unterschied

aufwiesen (Abb. 21a+b).

3.1.4.3 Aktivierungsmarker (CD25)

0

10

20



Kontrollgruppe

CD25

+ Ze

llen/

Ges

amtz

elle

n LP

in %

Abb. 22 Verteilung von CD25+ Zellen in der Lamina propria verschiedener Darmabschnitte

bei gesunden Läuferschweinen der Kontrollgruppe (n=5)

CD25+ Zellen kamen fast ausschließlich in der Lamina propria vor. Im Epithel waren sie nur

vereinzelt zu finden und zeigten dort weder Abschnitts- noch Gruppenabhängigkeit. Die Anteile

waren in der LP aller Darmabschnitte mit Werten zwischen 2,4% und 3,7% niedrig und wiesen

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

82

entlang des Darmverlaufs keine Unterschiede auf (Abb. 22). Dies galt ebenfalls für die EcN-

gefütterten Gruppen.

0

10

20

Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens

Colondescendens

Kontrolle 109 KBE 101 1 KBE

CD25

+ Ze

llen/

Ges

amtz

elle

n LP

in %

Abb. 23 Verteilung von CD25+ Zellen in der Lamina propria gesunder Läuferschweine der


(1011 KBE) (n=5)

Auf den Anteil der CD25+ Zellen in den einzelnen Darmabschnitten hatte die Fütterung von EcN

bei den untersuchten Schweinen keinen Einfluss (Abb. 23).

3.1.4.4 IgA-produzierende Plasmazellen

Im Gegensatz zu den vorangegangenen Markern handelt es sich bei IgA um ein sowohl

extrazellulär als auch intrazellulär gelegenes Antigen. Die Zellen zeigen deshalb auch eine

zytosolische Färbung (Abb. 24). IgA+ Plasmazellen kommen ausschließlich in der LP vor. Die

Zellen waren insbesondere im Dünndarm nicht gleichmäßig verteilt, sondern befanden sich

vermehrt in der LP der Zottenbasis und in der LP der Krypten (Abb. 25).

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

83

Abb. 24 IgA+ Plasmazellen in der Lamina propria des Colons descendens (schwarzer Pfeil) eines

Tieres der Kontrollgruppe (n=5)

LSAB-Methode (K61 1B4) mit anschließender Hämalaun-Färbung, 1000fach vergrößert, Messbalken = 10

µm, rote Färbung im Epithel kennzeichnet sezerniertes IgA (offener Pfeil).

Abb. 25 IgA+ Plasmazellen in der Lamina propria des Duodenums (rot) eines Tieres aus der 109

KBE EcN/d Gruppe (n=5)

LSAB-Methode (K61 1B4) mit anschließender Hämalaun-Färbung, 200fach vergrößert, Messbalken = 100

µm.

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

84

0

10

20

30



1011 KBE EcN/Tag

IgA+

Zel

len/

Ges

amtz

elle

n LP

in %

Abb. 26 Verteilung von IgA+ Zellen in der Lamina propria verschiedener Darmabschnitte bei

gesunden Läuferschweinen nach Fütterung mit 1011 KBE EcN/d (1011 KBE) (n=5)

Der größte Anteil IgA+ Zellen befand sich mit 21,1% (± 3,1%) im Duodenum der hochdosiert EcN-

gefütterten Schweine, der geringste Anteil mit 3,9% (± 3,4%) im Ileum. In der hochdosierten

Gruppe war der Anteil im Duodenum gegenüber dem in den anderen Darmabschnitten signifikant

erhöht (Abb. 26). Das gleiche Verteilungsmuster der IgA+ Zellen ließ sich auch in den anderen

beiden Versuchsgruppen beobachten. Die Unterschiede zwischen dem Duodenum und den

restlichen Abschnitten des Darms waren aber nicht signifikant (nicht dargestellt).

*

******

***

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

85

0

10

20

30

Duodenum Jejunum Ileum Colonascendens

Colondescendens

Kontrolle 109 KBE 101 1 KBE

IgA+

Zel

len/

Ges

amtz

elle

n LP

in %

Abb. 27 Verteilung von IgA+ Zellen in der Lamina propria gesunder Läuferschweine der


(1011 KBE) (n=5)

Die Fütterung von EcN führte bei den Versuchstieren zu keiner signifikanten Änderung des Anteils

der IgA+ Zellen. Bei den Ergebnissen für diese Werte fielen besonders hohe Streuungen innerhalb

der Versuchsgruppen auf (Abb. 27).

3.1.5 mRNA-Expression von Zytokinen und antimikrobiellen Peptiden

Nachdem sich bei den histologischen und immunhistologischen Untersuchungen nur geringe

Veränderungen im Anteil der untersuchten Zellpopulationen ergeben hatten, sollte mit Hilfe

semiquantitativer RT-PCR eine Veränderung des Zytokinmusters von Immunzellen überprüft

werden. Um zusätzlich einen Einfluss von EcN auf die Abwehr durch das angeborene

Immunsystem zu untersuchen, wurde auch die mRNA-Expression von antimikrobiellen Peptiden

wie Cathelicidinen und Defensinen überprüft. Dafür wurde aus Mukosaproben von 15 Tieren

Gesamt-RNA isoliert und mit RT-PCR auf die Zytokine (IFN-γ, TNF-α, TGF-β, IL-4 und IL-10)

und AMP (Prepro-Defensin β1, PR-39, NK-Lysin und Protegrine) untersucht.

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

86

Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte semiquantitativ im Vergleich mit der mRNA-Expression

von GAPDH als „housekeeping gene“. Es wurden jeweils vier bzw. fünf Tiere einer Gruppe

untersucht. Die PCR für die untersuchten Gene wurden im Duplikat durchgeführt. Die

Negativkontrollen für die verschiedenen PCR, in denen die PCR-Reagenzien ohne cDNA-Template

eingesetzt wurden, zeigten keine Banden.

Die Ergebnisse sind im Folgenden dargestellt.

Für IFN-γ, TNF-α, TGF-β und IL-10 ergaben sich in der Mukosa der untersuchten Darmabschnitte

keine Unterschiede zwischen der mRNA-Expression bei Tieren der Kontrollgruppe und der

hochdosiert gefütterten EcN-Gruppe (Abb. 28).

Abb. 28 mRNA-Expression von INFγ, TNF-α, TGF-β, IL-4 und IL-10 in der Mukosa von

Duodenum, Ileum und Colon ascendens zweier repräsentativer Tiere der Kontrollgruppe

(Kontrolle) und nach Fütterung mit 1011 KBE EcN/d (1011 KBE EcN) (n=4 bzw. n=5)

Vergleichende Darstellung mit GAPDH als „housekeeping gene“, Zahlen am Ende der Zeilen geben die

Zyklusanzahl an.

A B DC A B DC A B DC

Duodenum Ileum Colon ascendens

GAPDH

IFN -γ

TNF - α

TGF - β

Kontrolle 1011 KBE EcN Kontrolle 1011 KBE EcN Kontrolle 1011 KBE EcN

IL-10

28

34

35

32

40IL-4 28

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

87

Abb. 28a mRNA-Expression von IL-4 in der Mukosa des Duodenums aller untersuchten

Tieren der Kontrollgruppe und nach Fütterung mit 1011 KBE EcN/d (1011 KBE EcN) (n=4)


Zyklusanzahl an.

Verglichen mit der Expression bei Kontrolltieren war die mRNA-Expression von IL-4 in der

Mukosa des Duodenum hochdosiert gefütterter Tiere erhöht (Abb. 28 und Abb. 28a). Wohingegen

in der Mukosa des Ileums und Colon ascendens keine EcN-abhängigen Veränderungen der IL-4

mRNA-Expression erkennbar waren. Mit Ausnahme der Ergebnissen für IL-4 im Duodenum fiel

für alle untersuchten Zytokine eine hohe individuelle Variabilität der mRNA-Expression auf. Diese

war im Duodenum besonders ausgeprägt dabei jedoch gruppen- und einzeltierunabhängig.

GAPDH

Duodenum

28

28IL-4

1011 KBE EcNKontrolle

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

88

Abb. 29 mRNA-Expression von Prepro-Defensin β1 (Prepro-Def.) , PR-39, Protegrine und

NK-Lysin in der Mukosa von Duodenum, Ileum und Colon ascendens zweier repräsentativer

Tiere der Kontrollgruppe (Kontrolle) und nach Fütterung mit 1011 KBE EcN/d (1011 KBE

EcN) (n=4 bzw. n=5)


Zyklusanzahl an.

Die mRNA-Expression von Prepro-Defensin β1 ließ sich in allen Darmabschnitten nachweisen,

wobei die Expression im Colon ascendens geringer war als im Ileum. Die Expression im

Duodenum war genau wie schon bei den anderen untersuchten Zytokinen heterogen. Ein Einfluss

von EcN war nicht erkennbar.

Eine mRNA-Expression von PR-39 war unabhängig von der EcN-Fütterung nur vereinzelt im

Duodenum und im Colon ascendens vorhanden. Für Protegrine wurden in der Mukosa beider

Gruppen keine mRNA gefunden. Positivkontrollen für PR-39 und Protegrine ergaben jedoch klare

Banden (nicht dargestellt).

NK-Lysin-mRNA war in allen untersuchten Darmabschnitten nachweisbar, wurde aber durch EcN-

Fütterung nicht beeinflusst (Abb. 29).

Duodenum Ileum Colon asc.

GAPDH

Kontrolle 1011 KBE EcN Kontrolle 1011 KBE EcN Kontrolle 1011 KBE EcN

PreproDefensin-β

PR39Protegrine

NK-Lysin

28

39

42

42

36

A B C D A B C D A B C D

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

89

3.2 Infektionsversuche mit und ohne EcN

Nachdem die Fütterung von EcN an gesunde Läuferschweinen in Bezug auf das darmassoziierte

Immunsystem nur wenige Anhaltspunkte für eine Beeinflussung der untersuchten zellulären und

humoralen Abwehr lieferte, ergab sich die Frage nach der Wirkung von EcN im infizierten Darm.

Zu diesem Zweck wurde im Zuge dieser Arbeit im Physiologischen Institut der Tierärztlichen

Hochschule Hannover mit der Etablierung eines Infektionsmodells bei Absetzferkeln begonnen.

Zur Untersuchung des EcN Einflusses wurden in einer Pilotstudie Gruppen mit jeweils acht

(insgesamt 16) Saugferkeln ab dem 11. Lebenstag für zehn Tage prophylaktisch ohne oder mit EcN

behandelt und ab dem 21. Lebenstag paarweise abgesetzt. Danach wurde jeweils eines der beiden

Tiere über zwei Tage mit dem pathogenen EcA infiziert bzw. mit Placebo behandelt. Die

Ergebnisse der klinischen, mikrobiologischen, histopathologischen und labordiagnostischen

Untersuchungen werden im Folgenden dargestellt. Verglichen werden jeweils EcN-gefütterte mit

nicht EcN-gefütterten Tieren, aber auch EcA-infizierte mit Placebo-behandelten Tieren der gleichen

EcN-Gruppe.

3.2.1.1 Klinik

Die klinische Untersuchung erfolgte anhand allgemeiner klinischer Parameter zur Diagnostik von

Durchfallerkrankungen sowie weiterer der Literatur entnommener, erprobter Parameter (TO et al.

1998).

Gewichtsverlauf

Die Bestimmung des Gewichtsverlaufs zwischen dem Absetzen und dem Zeitpunkt des Tötens

diente auf der einen Seite der Überprüfung beider Würfe in Bezug auf Vergleichbarkeit der Ferkel

hinsichtlich ihres Entwicklungsstandes und auf der anderen Seite als Parameter für den Grad der

Erkrankung bei EcA-infizierten im Vergleich zu Placebo-behandelten Tieren.

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

90

Abb. 30a Gewichtsverlauf ohne EcN

Absetzen Töten5

6

7

8

9

10

Placebo EcA

Körp

erge

wic

ht in

kg

Abb. 30b Gewichtsverlauf mit EcN

Absetzen Töten5

6

7

8

9

10

EcAPlacebo

Körp

erge

wic

ht in

kg

Abb. 30a-b Gewichtsentwicklung drei Wochen alter, abgesetzter Ferkel über 2 Tage, nach

Inokulation mit EcA (1,1 x 1010 bis 2,1 x 1010 KBE/d) bzw. Placebo ohne zehntägige

prophylaktische EcN-Applikation (30a) und mit zehntägiger prophylaktischer EcN-

Applikation (100 mg Mutaflor®/d) (30b), (n=4)

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

91

Beide Würfe waren mit einem mittleren Absetzgewicht von 7,4 kg (± 0,6 kg) in dem Wurf ohne

EcN und 8,1 kg (± 0,6 kg) mit EcN homogen. Das Körpergewicht der Tiere änderte sich zwischen

dem Absetzen und dem Zeitpunkt des Tötens nach 48 Stunden nicht signifikant. Zu beiden

Messzeitpunkten bestand weder zwischen den EcN-gefütterten Tieren (Abb. 30b) bzw.

unbehandelten Tieren (Abb. 30a) noch zwischen den mit EcA-infizierten bzw. Placebo behandelten

Ferkeln ein Unterschied.

Verhalten, Futter- und Wasseraufnahme

Das Verhalten der Tiere war weitestgehend ungestört (Abb. 31). Bei den Tieren, die ohne vorherige

EcN-Prophylaxe mit EcA infiziert wurden und Durchfall entwickelten, fiel initial vier bis acht

Stunden nach der EcA-Infektion eine mittelgradig verringerte Aufmerksamkeit auf (nicht

dargestellt). Diese hielt bis zu 24 Stunden an und verschwand dann trotz erhaltener

Durchfallsymptomatik wieder. Die Futteraufnahme war bei diesen Tieren ebenfalls eingeschränkt.

Die Wasseraufnahme war unbeeinträchtigt. Alle anderen Ferkel zeigten weder bei der Futter- noch

bei der Wasseraufnahme Beeinträchtigungen (nicht dargestellt).

Kontrolle Infektion Kontrolle EcN Infektion EcN

gedämpft

apatisch

aufmerksam

Abb. 31 Verhalten drei Wochen alter, abgesetzter Ferkel nach Inokulation mit EcA (1,1 x 1010

bis 2,1 x 1010 KBE/d) bzw. Placebo, ohne und mit zehntägiger prophylaktischer EcN-

Applikation (100mg Mutaflor®/d), (n=4)

Die Symbole entsprechen den Mittelwerten für jeweils ein Tier über den gesamten

Versuchszeitraum von zwei Tagen.

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

92

Kotkonsistenz und Verschmutzung der Afterregion

Abb. 32a Verschmutzung der Afterregion


keine

mittelgradig

hochgradig

Abb. 32b Kotkonsistenz


pastös

flüssig

wässrig

unauffällig

Abb. 32a-b Verschmutzung des Afterbereichs (32a) und Kotkonsistenz (32b) drei Wochen

alter, abgesetzter Ferkel nach Inokulation mit EcA (1,1 x 1010 bis 2,1 x 1010 KBE/d) bzw.

Placebo, ohne und mit zehntägiger prophylaktischer EcN-Applikation (100mg Mutaflor®/d),

(n=4)

Die Symbole entsprechen den Mittelwerten für jeweils ein Tier über den gesamten

Versuchszeitraum von zwei Tagen.

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

93

Die Kotkonsistenz war bei 2/4 Tieren der Infektionsgruppe ohne vorherige prophylaktische EcN–

Applikation deutlich pastös bis flüssig verändert. Bei diesen Tieren wurde auch eine mittelgradig,

vermehrte Verschmutzung der Afterregion festsgestellt, die mit dem Durchfall einherging.

Zusätzlich konnte bei den betroffenen Ferkeln eine Verschmutzung der Boxenwände beobachtet

werden (Abb. 33). Die Tiere der Kontrollgruppen mit und ohne EcN waren unauffällig. Bei der

EcN vorbehandelten Infektionsgruppe konnte trotz EcA-Infektion keine veränderte Kotkonsistenz

oder Verschmutzung des Afters beobachtet werden.

Abb. 33 Drei Wochen altes Ferkel der EcA-Infektionsgruppe (1,1 x 1010 bis 2,1 x 1010 KBE/d)

ohne vorherige EcN-Applikation 24 Stunden post infectionem

Das Tier war im Allgemeinbefinden gedämpft und zeigte deutliche Durchfallsymptomatik. An der

Wand der Box sind Kotspuren zu erkennen.

3.2.1.2 Allgemeine mikrobiologische Untersuchung

Es wurden von allen Tieren zur Bestimmung der Darmmikrobiologie Tupfer aus dem Duodenum,

Jejunum, Ileum und dem Kolon entnommen und kulturell auf Salmonellen, mittels PCR auf

Brachyspira hyodysenteria und Lawsonia intracellularis und elektronenmikroskopisch auf Viren

untersucht. Die Ergebnisse sind in Tab. 11 dargestellt.

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

94

Tab. 11 Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung

Tier Gruppe Salmonellen, Lawsonia intracellularisBrachyspirs Hyodysenterica, Viren EcA EcN

SI2-1 Placeboohne EcN - - -




SI2-2 Infektionohne EcN - + -




SI3-1 Placebomit EcN - - -



SI3-7 Placebomit EcN - - +

SI3-2 Infektionmit EcN - + -

SI3-4 Infektionmit EcN - + -

SI3-6 Infektionmit EcN - - +

SI3-8 Infektionmit EcN - - +

Allgemeine Mikrobiologie

Bei keinem der Tiere wurden Salmonellen, Lawsonia intracellularis, Brachyspira hyodysenteria

oder Viren nachgewiesen.

Die bakteriologische Untersuchung nach Anzüchtung auf Blutagar- und Gassnerplatte war bei den

Ferkeln ohne vorherige EcN–Applikation unauffällig.

Von den Tieren mit prophylaktischer EcN-Applikation wurde bei je einem Tier der EcA-

Infektionsgruppe hochgradig Clostridium perfringens Typ A bzw. mittelgradig E. coli des Serotyps

O8:K87 nachgewiesen. Ein Tier der EcN behandelten, nicht EcA infizierten Gruppe wies

mittelgradig E. coli Serotyp O147:K89 und geringgradig nicht typisierbare, hämolysierende E. coli

auf. Bei den nachgewiesenen E. coli Stämmen wurden in der PCR keine schweinetypischen

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

95

Virulenzfaktoren gefunden.

EcA im Darminhalt

Alle acht (2 x 4) Tiere, die statt EcA Placebo erhalten hatten, waren frei von EcA.

Bei den Ferkeln der EcA-Infektionsgruppe ohne vorherige EcN-Applikation wurde hingegen bei

allen vier Tieren EcA nachgewiesen. In der EcA-Infektionsgruppe mit EcN-Applikation waren nur

zwei von vier Tieren EcA-positiv.

EcN im Darminhalt

EcN konnte zum Zeitpunkt des Todes nur bei drei der insgesamt acht behandelten Tiere im Kot

nachgewiesen werden.

3.2.1.3 Wassergehalt im Kot

0

25

50

75

100

Placebo Infektion Placebo EcN Infektion EcN

Was

serg

ehal

t in

%

Abb. 34 Wassergehalt im Kot drei Wochen alter Ferkel zum Zeitpunkt des Tötens, nach

zweitägiger Inokulation mit EcA (1,1 x 1010 bis 2,1 x 1010 KBE/d) bzw. Placebo, ohne und mit

zehntägiger prophylaktischer EcN-Applikation (100mg Mutaflor®/d), (n=4)

Der Wassergehalt des Kots betrug in beiden Placebogruppen zwischen 65% (±8%, Placebo) und

66% (±7%, Placebo + EcN). Der Mittelwert in der EcA-Infektionsgruppe + EcN von 66% (± 4%)

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

96

entsprach dem der beiden Placebogruppen. Die EcA-Infektionsgruppe ohne EcN hatte mit 74% (±

8%) einen höheren Wasseranteil im Kot als die drei anderen Gruppen (Abb. 34). Der Unterschied

erreichte jedoch nicht das Signifikanzniveau.

3.2.1.4 Luminale und Plasma-IgA-Bestimmung

Um einen Einfluss von EcN auf die IgA-Konzentration im Plasma und im Darmlumen bewerten zu

können, wurde sie mit ELISA untersucht. Weil ein Standard für porcines, sekretorisches IgA nicht

zur Verfügung stand, konnte die Auswertung nur vergleichend zwischen den getesteten Gruppen

erfolgen. Auf grund des fehlenden Standards konnten keine absoluten IgA-Konzentrationen

berechnet werden, weshalb ein Vergleich zwischen den Plasma-IgA-Werten und den Werten für

luminales IgA nicht möglich war. Da alle Proben am gleichen Tag in derselben Messung untersucht

wurden, könnten jedoch sowohl die Tiere der Placebo- und Infektionsgruppe ohne EcN, die Tiere

der Placebo- und Infektionsgruppe mit EcN als auch der beiden Placebo- und Infektionsgruppen

miteinander verglichen werden.

0

10

20

30


volu

men

korr

igie

rte

OD

(450

nm

)

Abb. 35 Luminales IgA im Jejunum (20 cm) drei Wochen alter, abgesetzter Ferkel nach

Inokulation mit EcA (1,1 x 1010 bis 2,1 x 1010 KBE/d) bzw. Placebo, ohne und mit zehntägiger

prophylaktischer EcN-Applikation (100mg Mutaflor®/d), (n=4)

Die Korrektur der OD-Messwerte wurde entsprechend der Formel: OD x Verdünnung x

Ausgangsvolumen berechnet.

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

97

0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.55

**


OD

(450

nm

)

Abb. 36 Plasma-IgA drei Wochen alter, abgesetzter Ferkel nach Inokulation mit EcA (1,1 x

1010 bis 2,1 x 1010 KBE/d) bzw. Placebo, ohne und mit zehntägiger prophylaktischer EcN-

Applikation (100mg Mutaflor®/d), (n=4)

Beim luminalen IgA im Jejunum lassen sich keine Unterschiede zwischen den verschiedenen

Gruppen erkennen. Insgesamt fällt eine sehr hohe Standardabweichung als Zeichen einer starken

individuellen Streuung auf (Abb. 35).

Das Plasma-IgA der infizierten Ferkel ohne EcN war gegenüber dem der infizierten Tiere mit

vorheriger EcN Applikation signifikant erhöht (Abb. 36). Zwischen den mit Placebo behandelten

Gruppen gab es keinen signifikanten Unterschied.

3.2.1.5 Histologie

Um eine Aussage über eventuelle Gewebeveränderungen im Darm bei Tieren der vier untersuchten

Gruppen machen zu können, wurden transmurale Gewebeschnitte aus dem Jejunum und Ileum nach

Hämalaun-Eosin Färbung beurteilt. Die histologische Untersuchung erfolgte durch Mitarbeiter des

Instituts für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Sie wurde verblindet und

unabhängig von zwei verschiedenen Untersuchern durchgeführt.

Bei den Tieren, die nicht mit EcA infiziert worden waren, war die Mukosa des Jejunums

Ergebnisse

________________________________________________________________________________

98

unauffällig. Gleiches galt für die Mukosa des Ileums mit Ausnahme eines Tieres der nicht mit EcN

gefütterten Gruppe, bei dem sich eine minimale Verkürzung und Fusion der Ileumzotten darstellen

ließ.

Alle Tiere der EcA-infizierten Gruppe ohne vorherige EcN-Applikation zeigten geringgradige

Zottenverkürzungen und –fusionen und/oder eine leichte bis geringgradig vermehrte Infiltration mit

Lymphozyten oder neutrophilen Granulozyten im Jejunum. Das Ileum war ohne besonderen

Befund.

Zottenveränderungen traten bei der EcA-infizierten Gruppe mit vorheriger EcN-Applikation im

Jejunum nicht auf. Allerdings enthielt die jejunale LP bei zwei Tieren geringgradig vermehrt

Lymphozyten. Die Mukosa des Ileums war unverändert.

Alle beobachteten Veränderungen in der Mukosa waren dezent, und es fanden sich keine Hinweise

auf manifeste entzündliche Abweichungen.

Von den Tieren mit vorheriger EcN-Applikation fand sich bei je einem Tier der EcA-infizierten

und nicht EcA-infizierten Gruppe eine gering- bis mittelgradige follikuläre und parafollikuläre

Hyperplasie in den Peyer’schen Platten des Ileums.

Diskussion

________________________________________________________________________________

99

4 Diskussion

4.1 Konzeptionelle Überlegungen

Der Darm und seine Mikroökologie rücken immer mehr in den Blickpunkt der medizinischen

Forschung. Beim Menschen ist in den letzten Jahren die Inzidenz verschiedener

Darmerkrankungen, wie CED oder Nahrungsmittelallergien stetig gestiegen. Während diese

Erkrankungen in der Tiermedizin vor allem bei Hund und Katze eine Rolle spielen, wird bei

Großtieren eine Häufung von gastrointestinalen Infektionskrankheiten beobachtet. Die Pathogenese

all dieser Erkrankungen wird in hohem Maße von Darmbakterien beeinflusst, dabei ist die

Interaktion der Bakterien mit dem intestinalen Immunsystem eine wichtiger Faktor (GUARNER

und MALAGELADA 2003). Das intestinale Immunsystem stellt das größte immunologische Organ

des Körpers dar. Mit Hilfe von am Darm gewonnenen Erkenntnissen lassen sich somit

entscheidende Einblicke in den Ablauf immunologischer Vorgänge an mukosalen Oberflächen

erlangen.

Die Einflüsse der Darmmikroorganismen auf die Entwicklung und Aufrechterhaltung des

Darmimmunsystems sind zahlreich (GRONLUND et al. 2000, KALLIOMAKI und ISOLAURI

2002, UMESAKI und SETOYAMA 2000). Dementsprechend sind die Einflussmöglichkeiten durch

Probiotika vielfältig. Ein großer Teil der Einsatzgebiete dieser, für den Wirt vorteilhaften,

speziellen Mikroorganismen, basiert allerdings nach wie vor nicht auf gesicherten

wissenschaftlichen Untersuchungen. Zum einen ist die Pathogenese von Darmerkrankungen oder

mit dem Darm assoziierter Erkrankungen unzureichend geklärt, und zum anderen liegen über die

Wege und Mechanismen des Probiotikaeinflusses noch zu wenig Erkenntnisse vor.

Bei den meisten zum Thema Probiotika vorliegenden Untersuchungen handelt es sich um In-vitro-

Studien, denen der Ruf eines artifiziellen Systems anhängt, oder um In-vivo-Studien an

Labornagern, deren Ergebnisse in bezug auf das Darmimmunsystem nicht uneingeschränkt auf den

Menschen und andere Säuger übertragbar sind.

Hinzu kommt, dass viele Ergebnisse auf der Verwendung von Krankheitsmodellen beruhen (ALAK

et al. 1999) und deshalb über die Wirkung auf das Immunsystem gesunder Individuen nur wenige

Aussagen vorliegen. Gerade Letzteres ist für die Veterinärmedizin aber von besonderem Interesse,

Diskussion

________________________________________________________________________________

100

um Probiotika sinnvoll z.B. in der Nutztierhaltung einsetzen zu können.

Im Mittelpunkt des ersten Teils der vorliegenden Arbeit standen deshalb Untersuchungen über

Einflüsse des Probiotikums EcN auf das Darmimmunsystem gesunder Schweine in einer

verblindeten Placebo-kontrollierten Fütterungsstudie.

Im zweiten Teil sollte anhand eines neu etablierten ETEC-Diarrhöemodells der Einfluss von EcN

auf die Darmgesundheit von frisch abgesetzten Ferkeln untersucht werden.

Bei dem verwendeten Probiotikum handelt es sich mit Escherichia coli Nissle 1917 um einen Keim,

der seit längerem in der Humanmedizin eingesetzt wird. Als Wirkstoff eines zugelassenen

Medikaments (Mutaflor®) hat dieser Keim somit die harten „Qualitätskontrollen“ der

Arzneimittelzulassung bestanden und gilt als gut charakterisiert und sicher.

Das Schwein wurde als Versuchstier für die Untersuchung der immunologischen und klinischen

EcN-Wirkung gewählt, weil es zum einen in der Landwirtschaft und Veterinärmedizin eine

wichtige Rolle spielt und zum anderen ein den Labornagern in mancher Hinsicht überlegenes

Modelltier für den Menschen darstellt.

Mensch und Schwein weisen in Magen-Darm- und Ernährungsphysiologie, sowie der mikrobiellen

Darmbesiedlung viele Parallelen auf. Diese spiegeln sich weniger in der Konzentration der im Darm

vertretenen Mikroorganismenarten (siehe 1.1.1) als im Artenspektrum der Mikroorganismen wieder

(HAENEL 1969, GÄRTNER et al. 1973, KENWORTHY 1973). Somit eignet sich das Schwein

trotz höherer Haltungskosten, längerer Generationszeiten und nur teilweise etablierter

Labormethoden insbesondere als Modelltier für Fragestellungen zu Darmmikroorganismen und

zum Einfluss von pathogenen und probiotischen Keimen.

4.2 Konventionell gehaltene Schweine

Als probiotisches Wirkkonzept von EcN wird in der Literatur nicht nur eine Beeinflussung des

Darmfloragleichgewichts zur Diskussion gestellt, sondern auch die direkte Beeinflussung des

darmassoziierten Immunsystems durch EcN (1.2.4.2.). Die Tatsache, dass sich die

Studienergebnisse bei gesunden und kranken Patienten unterscheiden, führt zu der Frage, ob der

individuelle Gesundheitszustand die Art der Wirkung beeinflussen kann, und ob auch bei gesunden

Tieren Veränderungen in Verteilung und Anzahl der Darmimmunzellen erkennbar sind.

Diskussion

________________________________________________________________________________

101

Unter der Hypothese, dass das gram-negative Probiotikum EcN bei gesunden Schweinen einen

Einfluss auf das Immunsystem hat, wurden 15 Tiere auf die Anzahl und Verteilung von Zellen des

angeborenen und adaptiven Immunsystems, sowie die mRNA-Expression von Zytokinen und AMP

in der Darmmukosa untersucht. Dabei wurden zwei Fragestellungen berücksichtigt:

1. Unterscheidet sich die Anzahl von Zellen bzw. die mRNA-Expression von

Zytokinen (IFN-γ, TNF-α, TGF-β, IL-4 und IL-10) und AMP (Prepro-Defensin

β1, PR-39, Protegrine und NK-Lysin) zwischen den Fütterungsgruppen in einem

definierten Darmabschnitt oder einer Lokalisation der Darmmukosa?

2. Verändern sich unter der Fütterung von EcN die Unterschiede zwischen den

verschiedenen Darmabschnitten innerhalb derselben Fütterungsgruppen?

Methodendiskussion

Bei Studien mit Großtieren können sich schnell Schwierigkeit mit der verwendeten Tierzahl

ergeben. Anschaffung und Haltung der Tiere sind im Vergleich zu denen von Labornagern mit

einem nicht unerheblichen Kosten- und Arbeitsaufwand verbunden, trotzdem ist eine ausreichende

Tierzahl für den Erhalt statistisch signifikanter Ergebnisse notwendig. Bei den hier vorgestellten

Untersuchungen an konventionell gehaltenen Schweinen, wurde deshalb als Kompromiss zwischen

statistischer Notwendigkeit und Praktikabilität eine Gruppengröße von fünf Tieren gewählt. Diese

relativ kleinen Gruppen führen dazu, dass Unterschiede in der Veränderung von Anzahl und

Verteilung der Immunzellen sehr deutlich sein müssen, um das Signifikanzniveau zu erreichen. Es

werden deshalb im Folgenden auch Tendenzen mit in die Diskussion einbezogen, worauf an den

entsprechenden Stellen gesondert hingewiesen wird.

Da beim Schwein anders als bei den klassischerweise verwendeten Labortieren keine

Inzuchtstämme verfügbar sind, handelt es sich bei den konventionell gehaltenen Schweinen zwar

um Tiere aus demselben Herkunftsbetrieb mit einem regulierten Zuchtprogramm, nicht aber um

genetisch identische Tiere. Bedingt durch die Anzahl an benötigten Versuchstieren ist es außerdem

nicht möglich, nur mit Wurfgeschwistern zu arbeiten, was bei der Beurteilung der statistischen

Auswertungen zu berücksichtigen ist.

Um die Aufnahme von EcN durch die Versuchstiere überprüfen zu können und sicher zu sein, dass

die Kontrolltiere nicht während des Versuchs mit EcN in Kontakt waren, wurde der Kot aller Tiere

Diskussion

________________________________________________________________________________

102

über den gesamten Versuchszeitraum einmal pro Woche auf EcN untersucht. Die Tiere der

Kontrollgruppe waren dabei ausnahmslos EcN-negativ. Wohingegen bei allen Tieren der

Interventionsgruppen, während des Versuchszeitraums EcN im Kot nachgewiesen werden konnte

(Tab. 9).

EcN zeigt keinen Einfluss auf Anzahl und Verteilung von Granulozyten und Mastzellen in der

Darmmukosa gesunder Schweine.

Die Untersuchung von Anzahl und Verteilung eosinophiler Granulozyten in der LP des Dünn-

und Dickdarms bei Tieren mit und ohne EcN-Fütterung ergab keinen Unterschied zwischen den

drei untersuchten Gruppen (Abb. 13).

Ein Einfluss der Darmbesiedlung auf die Zahl eosinophiler Granulozyten konnte bisher auch von

anderen Untersuchern nicht festgestellt werden. So unterschied sich beispielsweise in Versuchen

mit keimfrei gehaltenen Mäusen die Zahl eosinophiler Granulozyten in der LP des Darms nicht von

der bei besiedelten Kontrolltieren (ROTHENBERG et al. 2001). Einflüsse probiotischer Keime auf

eosinophile Granulozyten in vivo sind allerdings als Folge von Laktobazillengabe bei Patienten mit

atopischer Dermatitis beschrieben worden, wobei ihre Wirkung weniger in einer Reduktion der

Zahl eosinophiler Granulozyten als vielmehr in einer Verminderung ihrer Aktivität besteht

(ROSENFELDT et al. 2003). Ob ein derartiger Einfluss auch durch EcN erfolgt, müssen

weiterführende Untersuchungen klären.

Unabhängig von der EcN-Fütterung fiel eine Besonderheit in der Verteilung der eosinophilen

Granulozyten des Schweins auf. Eosinophile Granulozyten gab es in allen fünf untersuchten

Darmabschnitten, wobei die Anteile an der Gesamtzellzahl sehr unterschiedlich waren (Abb. 12).

Die geringsten Konzentrationen wurden im Kolon beobachtet, wo die Werte mit einem Anteil von

0,6% deutlich unter den für den Menschen beschriebenen Werten von 3-5% liegen (BISCHOFF et

al. 1996). Im porcinen Ileum war der Anteil mit 13,7% am höchsten. Die eosinophilen

Granulozyten waren beim Schwein hauptsächlich in der LP der Krypten lokalisiert. Bei der Maus

ist eine Ansammlung eosinophiler Granulozyten hingegen nur im Kryptenbereich des Jejunums und

Ileums beschrieben. In den anderen Darmabschnitten sind sie gleichmäßig in der LP verteilt

(MISHRA et al. 1999).

Da alle in den vorliegenden Untersuchungen verwendeten Tiere sowohl im Herkunftsbetrieb als

auch beim Einstellen im Physiologischen Institut gegen Darmparasiten behandelt worden waren,

Diskussion

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103

können Parasiten als Grund für die hohen Zahlen an eosinophilen Granulozyten im Dünndarm

nahezu ausgeschlossen werden.

Als Ursachen für physiologische Unterschiede in der Verteilung porciner, eosinophiler

Granulozyten im Vergleich mit dem Menschen und der Maus könnten differierende

Konzentrationen an Eotaxin oder IL-5 diskutiert werden. Eotaxin wirkt spezifisch chemotaktisch

auf eosinophile Granulozyten und fördert die Akkumulation im Gewebe. IL-5 wird von Th2-Zellen

und Mastzellen gebildet und wirkt proliferativ (SANDERSON 1992, ROTHENBERG 1998,

ROTHENBERG et al. 2001).

Es ist bekannt, dass eosinophile Granulozyten durch die Abgabe von Enzymen und

Sauerstoffmetaboliten nicht nur Effektorzellen darstellen, sondern durch die Produktion von

Zytokinen auch immunmodulatorisch wirken. Ob dies auch für eosinophile Granulozyten im Darm

gilt, ist noch nicht eindeutig geklärt, da die meisten Versuche zur Wanderung und Aktivierung von

eosinophilen Granulozyten im Respirationstrakt durchgeführt wurden. Es gibt Anzeichen, dass sich

Eosinophile im Darm anders verhalten als in anderen Geweben. Im Darm erfolgt demnach auch im

nicht entzündeten Zustand eine spontane minimale bis moderate Degranulation von eosinophilen

Granulozyten, die in anderen Geweben nicht beobachtet wird (MCGOVERN et al. 1991, TALLEY

et al. 1992).

Die erhöhte Konzentration eosinophiler Granulozyten im Dünndarm des Schweins könnte also

neben der Abwehr von Parasiten auch regulatorisch auf andere Zellen des Immunsystems wirken.

Weiter Untersuchungen zur Physiologie der eosinophilen Granulozyten im Darm sind nötig, um

diese Hypothese zu untermauern.

Die Zahl neutrophiler Granulozyten in der Lamina propria des Darms war bei allen untersuchten

Tieren gering. Entlang der Darmachse befanden sich die meisten neutrophilen Granulozyten im

Duodenum und im Kolon (Abb. 15) und damit in Bereichen des Darms, die auf Grund ihrer Lage

(Duodenum) oder Besiedlung (Kolon) besonders anfällig für mikrobielle Infektionen sind. Mit

3,7% der LP-Zellen lagen die Werte dabei im Normbereich für gesunde Tiere. Für den Menschen

werden Anteile von 0,4%, wie sie im Jejunum untersuchter Tiere beobachtet wurden, als unauffällig

angesehen (OGRA et al. 1999). Höhere Anteile neutrophiler Granulozyten im Duodenum und

Kolon bei Schweinen und anderen Haustieren im Vergleich mit dem Menschen könnten auf eine

höhere Konzentration an Keimen im Darmlumen zurückgeführt werden. Während der Darm des

Menschen beispielsweise im Duodenum nur sehr schwach besiedelt ist (SONNENBORN und

Diskussion

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104

GREINWALD 1991), findet man beim Schwein zwischen 106 und 107 KBE/ml (SCHULZE und

BATHKE 1977, SCHULZE et al. 1980). Des Weiteren leben Schweine in einer Umgebung, in der

sie mit mehr potentiellen Pathogenen in Berührung kommen, als dies bei Menschen der westlichen

Industrieländer der Fall ist, in denen die Untersuchungen von OGRA et al. (1999) durchgeführt

wurden. Dieser Umstand wäre ebenfalls als Ursache für eine geringfügig höhere Grundpräsenz von

neutrophilen Granulozyten denkbar.

Die EcN-Fütterung in den Interventionsgruppen hatte keinen Einfluss auf die Verteilung und den

Anteil der neutrophilen Granulozyten in der LP des Darms (Abb. 16).

Bei einem probiotischen Keim wie EcN ergibt sich aus dem Fehlen einer Rekrutierung von

neutrophilen Granulozyten eine Bestätigung der Apathogenität. Bakterien der gleichen Gattung mit

pathogenen Eigenschaften, z.B. aus der Gruppe der EPECs oder ETECs, führen zur Rekrutierung

von neutrophilen Granulozyten. Einige ETEC-Stämme verursachen bei Ferkel eine Transmigration

von neutrophilen Granulozyten ins Darmlumen (ROSE und MOON 1985). Auch nach EPEC-

Infektion von Epithelzelllinien in In-vitro-Modellen wird sowohl eine Anreicherung neutrophiler

Granulozyten im einschichtigen Epithelzellverband als auch eine Migration durch diesen hindurch

beobachtet (MICHAIL et al. 2003). Werden vor der Infektion mit EPECs Laktobazillen zu den

Zellen gegeben, verringert sich die transepitheliale Migration der neutrophilen Granulozyten

(MICHAIL und ABERNATHY 2003). Es gibt demnach Hinweise darauf, dass Probiotika die

Migration von neutrophilen Granulozyten beeinflussen können.

Ob EcN bei prophylaktischer Gabe und anschließender Infektion in der Lage ist, einen ebensolchen

Effekt hervorzurufen, muss in weiteren Untersuchungen geklärt werden.

Die in der Lamina propria der untersuchten Tiere vorkommenden Mastzellen waren von

polymorpher Gestalt mit dendritischen Zellausläufern, so wie sie auch von XU et al. (1993) für

MMC beschrieben werden. Der Anteil der Mastzellen mit 2,4-3,1% der LP-Zellen in allen

untersuchten Darmabschnitten entsprach den von XU et al. (1993) ermittelten Normalwerten für das

Schwein und lagt nur wenig unter den physiologischen Werten im Darm des Menschen von 4%

(BISCHOFF et al. 1999).

Die Fütterung von EcN hatte in keiner der Gruppen Auswirkungen auf die Mastzellzahl in der

Darmmukosa.

Basophile Granulozyten wurden im Darm erwartungsgemäß weder bei EcN-gefütterten

Diskussion

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105

Schweinen noch bei den Kontrolltieren gefunden.

Bei gesunden Schweinen lassen sich unter EcN-Fütterung bei keiner der untersuchten Zellgruppen

des angeborenen Immunsystems Veränderungen in der Zellzahl oder der Verteilung der Zellen in

der Mukosa erkennen. Es soll jedoch nicht unerwähnt bleiben, dass Veränderungen in der Menge

und Verteilung von Immunzellen nicht die einzigen Einflussmöglichkeiten auf die angeborene

Immunantwort darstellen. Über Einflüsse auf andere Parameter wie das Migrationsverhalten oder

die Stimulierbarkeit, wie sie für andere Probiotika und andere Zellpopulationen nachgewiesen sind

(ISOLAURI et al. 1997, PELTO et al. 1998), bzw. die Mediatorproduktion der entsprechenden

Zellen können aus diesen Versuchen keine Aussagen gemacht werden.

Es gibt Anzeichen für eine Beeinflussung der Verteilung von T-Zellen durch EcN in der

Darmmukosa gesunder Schweine.

Stellvertretend für die adaptive Immunantwort wurden CD4+T-Zellen, CD8+ Zellen und IgA-

produzierende Plasmazellen sowie der Aktivitätsmarker CD25 untersucht.

CD8+ Zellen kamen sowohl im Epithel als auch in der LP vor. Ein Großteil der Zellen, die den

CD8-Corezeptor exprimieren, werden auf Grund ihrer MHC-Klasse-I-restringierten

Antigenerkennung mit anschließender Sekretion zelltötender Mediatoren auch als zytotoxische T-

Zellen bezeichnet.

Die meisten CD8+ Zellen befanden sich, unabhängig von der Gruppenzugehörigkeit der

untersuchten Tiere, im luminalen Epithel (Abb. 19a). Dieses Ergebnis entspricht denen aus

Untersuchungen am Schwein durch andere Arbeitsgruppen (VEGA-LOPEZ et al. 1993, PABST

und ROTHKÖTTER 1999, VEGA-LOPEZ et al. 2001). Im luminalen Epithel des Duodenums war

der Anteil der CD8+ Zellen mit etwa einem Drittel der Gesamtzellzahl am höchsten (Abb. 24a).

Insgesamt befanden sich im luminalen Bereich der Mukosa mehr CD8+ Zellen als im Bereich der

Krypten (Abb. 19a-d). Eine derartige Zellverteilung könnte nach VEGA-LOPEZ et al. (1993)

durch die Expression spezifischer Migrationsfaktoren verursacht sein.

Anders als von VEGA-LOPEZ et al. (1993) beschrieben, waren die in der LP gelegenen CD8+

Zellen bei der vorliegenden Untersuchung nicht in der Nähe der Basalmembran konzentriert.

Möglicherweise beruht diese Diskrepanz in den Ergebnissen auf einer unterschiedlichen

Diskussion

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106

Einordnung basalmembrannaher Zellen in die IEL- bzw. LP-Gruppe. Leider werden sowohl von

VEGA-LOPEZ et al. (1993) als auch von ROTHKÖTTER et al. (1991) nur Angaben zum Anteil

der IEL an der mukosalen Gesamtlymphozytenzahl und nicht zum Anteil an der

Epithelgesamtzellzahl gemacht, so dass ein direkter Vergleich der Zellzahlen aus den hier

durchgeführten Versuchen mit den Ergebnissen der beiden genannten Arbeiten zwecks

Überprüfung dieser Hypothese nicht möglich ist.

Im Vergleich der untersuchten Tiere fällt besonders im Colon ascendens ein Einfluss von in hoher

Dosierung gefüttertem EcN auf die Zahl an CD8+ Zellen auf (Abb. 20d).

Resttoxizität von EcN ist als Ursache für die erhöhte Anzahl an CD8+ Zellen insbesondere im

Epithel der Kolonmukosa unwahrscheinlich, da beim Vorliegen einer entzündlichen Reaktion durch

EcN auch andere Darmabschnitte betroffen wären. Außerdem wären auch andere Anzeichen einer

Entzündung zu erwarten, wie z.B. die Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten oder die

Erhöhung der CD25-Expression von IEL als Zeichen einer Aktivierung. Es ließ sich jedoch weder

eine erhöhte Zahl von neutrophilen Granulozyten (Abb.11) nachweisen, noch kamen CD25+ Zellen

bei EcN-gefütterten Tieren in größerer Anzahl vor (Abb. 23). Eine mukosale Entzündungsreaktion

durch EcN als Grund für eine erhöhte Zahl CD8+ Zellen ist also auszuschließen.

Es ist jedoch denkbar, dass durch Verbesserung der mechanischen und immunologischen Integrität

des Epithels eine Schutzfunktion auf das Epithel ausgeübt wird. EcN würde demnach durch eine

vermehrte Rekrutierung CD8+ T-Zellen zur Verbesserung der intestinalen Pathogenabwehr führen.

Eine erhöhte Anzahl im Kolon könnte sich auf die Prävention von Kolitiden auswirken und einen

Erklärungsansatz für die von KRUIS et al. (1997) und REMBACKEN et al. (1999) beschriebene,

positive EcN-Wirkung in der Remissionserhaltung der Colitis ulcerosa liefern.

Des Weiteren gibt es Hinweise, dass CD8+ T-Zellen eine Aufgabe in der Aufrechterhaltung und

Verbesserung der Epithelintegrität übernehmen, dabei wird besonders einer Subpopulation von

CD8+ T-Zellen, den γδTCR-Zellen, eine entscheidende Rolle zugeschrieben (CHEN et al. 2002).

Im Gegensatz zur Maus (GUY-GRAND et al. 1991) und zum Menschen (SPENCER et al. 1989)

fehlen diese Zellen im Darmepithel des Schweins (ROTHKÖTTER et al. 1999b). Das bedeutet aber

nicht zwangsläufig, dass eine Wirkung auf die Epithelintegrität beim Schwein nicht denkbar ist.

Sowohl eine verbesserte Abwehrreaktion als auch eine verbesserte Epithelintegrität würde die

Stabilität der „intestinalen Barriere“ erhöhen. Ob sich eine solche Hypothese bestätigen lässt,

müssen weitere Untersuchungen zeigen.

Zusätzlich zum Vergleich der Anzahl CD8+ Zellen zwischen den Versuchsgruppen wurde in den

Diskussion

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107

einzelnen Darmabschnitten der Quotient aus IEL und LPL als Maß für die unterschiedliche

Konzentration an CD8+ Zellen in Epithel und LP der luminalen und basalen Mukosa ermittelt und

nach Gruppen und Darmabschnitten verglichen.

In der luminalen Mukosa gab es bei hoch dosierter EcN-Fütterung, anders als bei den Kontrolltieren

und niedrig dosierter EcN-Fütterung, keinen signifikanten Unterschied zwischen dem Quotienten

im Duodenum und dem in den restlichen Darmabschnitten (Abb. 21c). Da sich daraus im

Duodenum trotz fehlender signifikanter Veränderung der Gesamtzahl an CD8+ Zellen (Abb. 20a)

eine Tendenz für einen Anstieg in der luminalen LP ergibt, scheint eine Beeinflussung der

Verteilung von CD8+ Zellen auch in anderen Darmabschnitten nicht unrealistisch. Mit der

Untersuchung einer größeren Tierzahl könnte diese Hypothese überprüft werden.

Anders als CD8+T-Zellen kamen CD4+T-Zellen nur in der Lamina propria vor. Im Epithel

konnten sie nicht nachgewiesen werden. Bei Zellen, die den CD4-Corezeptor auf der Oberfläche

exprimieren, handelt es sich um T-Helferzellen und T-Regulatorzellen. Eine Unterscheidung der

beiden Populationen oder auch von Subpopulationen der T-Helferzellen (siehe 1.5.2.2) ist anhand

der Monofärbung mit CD4-Antkörpern nicht möglich. Deshalb werden im Folgenden die sich in

ihrer Aufgabe z.T. unterscheidenden Subpopulationen gemeinsam als CD4+T-Zellen diskutiert.

Die Beschränkung des Vorkommens CD4+T-Zellen auf die LP wird beim Schwein auch von

anderen Arbeitsgruppen beschrieben (BIANCHI et al. 1992, VEGA-LOPEZ et al. 2001). Im

Unterschied dazu kommen CD4+T-Zellen beim Menschen auch im Epithel vor (LUNDQVIST et

al. 1995).

Bei allen untersuchten Tieren zeigten CD4+T-Zellen deutliche Unterschiede hinsichtlich ihrer

Lokalisation in der Lamina propria. Im Duodenum und Jejunum waren die meisten im Kernbereich

der Zotten zu finden. Damit entsprach ihre Verteilung der von VEGA-LOPEZ et al. (1993) in der

Mukosa beschriebenen. Anders als dort beschrieben, war bei den in der vorliegenden Arbeit

untersuchten Tieren eine Konzentration von CD4+T-Zellen in den Ileumzotten nicht zu beobachten.

Die Zellen waren vielmehr gleichmäßig verteilt. Auch im Kolon kamen die CD4+T-Zellen

gleichmäßig in der LP verteilt vor. Unterschiedliche Ergebnisse zur Verteilung CD4+ T-Zellen in

der LP des Ileums können zum einen auf Rasseunterschiede zurück zu führen sein und, was noch

wahrscheinlicher ist, auf das Alter. Die Schweine waren im vorgestellten Versuch wesentlich jünger

als bei den Untersuchungen von VEGA-LOPEZ et al. (1993), wo sie ein Durchschnittsalter von

Diskussion

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108

sechs Monaten hatten. Es ist bekannt, dass sich die Immunzellverteilung im Darm altersabhängig

verändert. Dabei sind die Unterschiede in den ersten sechs Lebensmonaten z.T. erheblich

(ROTHKÖTTER et al. 1991).

Die Anzahl der CD4+ Zellen wurde durch die Fütterung von EcN nicht signifikant verändert (Abb.

22). Das Ergebnis deckt sich mit den bei Hunden unter Fütterung von probiotischen Enterokokken

gemachten Beobachtungen, bei denen die Zahl intestinaler CD4+T-Zellen unbeeinflusst bleibt

(BENYACOUB et al. 2003). Allerdings sind die in der Literatur beschriebenen Ergebnisse zu

diesem Thema nicht einheitlich. In In-vitro-Versuchen mit humanem Darmgewebe konnte

nachgewiesen werden, dass die Zugabe von Laktobazillen zur Gewebskultur die Anzahl CD4+T-

Zellen senkt (BORRUEL et al. 2002). Andererseits führt die Fütterung von verschiedenen

Laktobazillenstämmen an Mäuse zu einer Erhöhung der Zahl CD4+T-Zellen im Darm (PERDIGON

et al. 1999). Die unterschiedlichen Ergebnisse zum Einfluss von Probiotika auf die Zahl an CD4+T-

Zellen in der Darmmukosa weisen auf eine spezies- oder stammspezifische Wirkung hin.

Obwohl signifikante Veränderungen in den hier gemachten Versuchen fehlen, lässt sich bei den

EcN-gefütterten Tieren in allen Darmabschnitten, mit Ausnahme des Colon descendens, eine

tendenzielle Erniedrigung des Anteils von CD4+T-Zellen beobachten. Die tendenzielle

Verminderung der T-Helferzellen in den EcN-gefütterten Gruppen könnte ein Hinweis auf eine

EcN-bedingte Verringerung des Anteils an CD4+T-Zellen in der LP sein. Zumal sie konstant

sowohl bei der niedrig dosierten als auch bei der hoch dosierten Gruppe auftrat. Dass der Anteil

dieser Zellen, bedingt durch die Morphologie der Gewebeschnitte und das Färbeverhalten des

Antikörpers, semiquantitativ bestimmt wurde (siehe 3.1.4.1), könnte dazu geführt haben, dass die

eingangs in der Diskussion schon erwähnten Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der

statistischen Auswertung der Versuche noch verstärkt werden. Um eine genauere Aussage zu

ermöglichen, wäre eine quantitative Zellzahlbestimmung in zukünftigen Versuchen Vorraussetzung.

Durch die Verwendung von Paraffinschnitten, anstatt von Gefrierschnitten wäre z. B. eine

Verringerung der Schnittdicke (2µm) und damit eine Verbesserung der mikroskopischen

Zelldifferenzierung möglich. Zudem wäre eine Vergrößerung der Versuchstiergruppen zur

statistischen Absicherung geringgradiger Veränderungen sinnvoll.

Diskussion

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109

EcN zeigt keinen Einfluss auf IgA -produzierende Plasmazellen in der Darmmukosa gesunder

Schweine

IgA kann besser als jedes andere Immunglobulin an Mukosaoberflächen sezerniert werden. Damit

bildet es die erste Verteidigungslinie des Immunsystems. IgA-produzierende Plasmazellen kamen in

der Darmmukosa in Übereinstimmung mit Angaben anderer Autoren nur in der LP und dort speziell

im Bereich der Krypten vor (ROTHKÖTTER et al. 1991, BIANCHI et al. 1992). Die höchste

Konzentration befand sich in der LP des Duodenums (Abb. 26). Es ergaben sich als Folge von

EcN-Fütterung keine signifikanten Unterschiede in der Zahl IgA-produzierender Plasmazellen

(Abb. 27). Damit lässt sich ein aus der Literatur bekannter Einfluss anderer Probiotika auf die

Anzahl IgA-produzierender Plasmazellen für EcN in vivo beim gesunden Schwein nicht bestätigen.

Im Unterschied zu den in der vorliegenden Studie gemachten Beobachtungen ist bekannt, dass

einige Laktobazillen- und Bifidobakterienstämme die Anzahl IgA-produzierender Plasmazellen in

der intestinalen LP von gesunden Mäusen erhöhen können (PERDIGON et al. 1999, PARK et al.

2002). Ergebnisse von KAILA et al. (1992) bestätigen für Laktobazillen auch im Zusammenhang

mit Rotavirusinfektionen bei menschlichen Säuglingen eine gesteigerte Zahl IgA-produzierender

Plasmazellen im Darm. Bei der Fütterung der probiotischen Hefe Saccharomyces boulardii an

gesunde Absatzferkel erhöhte sich die Zahl der IgA+ Plasmazellen im Zottenbereich des

Duodenums (VAN BRIEL 2002). Das Ausbleiben von Veränderung in der IgA+ Plasmazellzahl

nach Fütterung von EcN im Vergleich zu anderen Probiotika weist erneut darauf hin, dass

Probiotika nicht als eine homogene Gruppe von Mikroorganismen angesehen werden dürfen,

sondern jedes Probiotikum seine Wirkungen spezies- und stammspezifisch zu erzielen scheint.

PERDIGON et al. (1999) konnten zeigen, dass die Erhöhung der Zahl an IgA-produzierenden

Plasmazellen dosis- und zeitabhängig erfolgt. Ob dies bei den hier untersuchten EcN-gefütterten

Tieren auch der Fall war, lässt sich anhand des verwendeten Versuchsaufbaus nicht klären.

Allerdings könnte die im Vergleich mit den beiden anderen Gruppen festgestellte tendenzielle

Erhöhung der Zahl IgA+ Plasmazellen im Jejunum, Ileum und Kolon der niedrigdosierten EcN-

Gruppe (Abb. 27) ein Hinweis auf eine Dosisabhängigkeit sein.

Diskussion

________________________________________________________________________________

110

EcN beeinflusst die mRNA-Expression von IL4 in der Duodenummukosa gesunder Schweine.

Eine unveränderte Anzahl bei den histologisch und immunhistologisch untersuchten Zellgruppen

bedeutet nicht zwingend einen fehlenden Einfluss von EcN. So können Veränderungen in den

Subpopulationen der untersuchten Zellen mit den verwendeten Antikörpern nicht detektiert werden.

Außerdem ist anhand der immunhistologischen Untersuchungen keine Aussage über die

Zellphysiologie, z.B. die Produktion von Mediatoren, möglich. Es ist bekannt, dass Probiotika auf

diese Weise Immunzellen beeinflussen können (MAASSEN et al. 2000, MADSEN et al. 2001). So

konnten MAASSEN et al. (2000) zeigen, dass verschiedene Laktobazillenstämme unterschiedliche

Zytokinexpressionsmuster in den Zellen der Darmzotten induzieren. MADSEN et al. konnten

außerdem zeigen, dass ein Gemisch verschiedener Laktobazillenstämme (VSL#3) in der Lage ist,

die erhöhte Expression von TNF-α und INF-γ im Darm von IL10-knock out Mäusen zu

normalisieren. Auch für EcN ist bekannt, dass es im Dextran-Natrium Sulfat (DSS) Kolitismodell

der Maus die Expression der proinflammatorischen Zytokine IFN-γ und IL6 verringert (SCHULTZ

et al. 2004). Untersuchungen zur EcN-induzierten Zytokinexpression in der Mukosa des gesunden

Darms fehlen jedoch bisher. Zur Bestimmung der Expressionen verschiedener Zytokin wurde

deshalb in der Mukosa des Duodenums, Ileums und Kolons semiquantitative RT-PCR durchgeführt.

Da sich in den histologischen und immunhistologischen Untersuchungen Hinweise ergeben hatten,

dass mit einem Einfluss von EcN am wahrscheinlichsten bei hoher Dosierung zu rechnen ist,

wurden nur diese Gruppe und die Kontrollgruppe untersucht. Dies gilt im Folgenden auch für die

Untersuchung der Expression antimikrobieller Peptide.

Nachdem die Zellzahlbestimmungen von CD4+T-Zellen kaum Hinweise auf eine Beeinflussung

durch EcN erbracht hatte, wurde insbesondere die Expression von für Subpopulationen der CD4+T-

Zellen typischen Zytokinen bestimmt, um eventuelle Verschiebungen im Gleichgewicht dieser

Populationen zu detektieren. Dabei werden INF-γ und TNF-α vermehrt im Zusammenhang mit

einer Th1-Antwort und IL-4 im Zusammenhang mit Th2-Antworten exprimiert (siehe 1.5.2.2).

Erhöhte TGF-β und IL-10 Expression gelten als Zeichen einer durch regulatorische T-Zellen

bestimmten Immunantwort (siehe 1.5.2.2).

Eine Beeinflussung der untersuchten Zytokine war nur bei IL-4 zu erkennen. Die hochdosierte EcN-

Fütterung führte im Duodenum zu einer Induktion von IL-4 (Abb. 28 +28a). Im Ileum und Kolon

war kein Einfluss feststellbar. IL-4 spielt als Zytokin der Th2-Antwort im Darm eine besondere

Diskussion

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111

Rolle. So ist nachgewiesen, dass es sich bei CD4+T-Zellen in der Darmmukosa um

antigenerfahrene Zellen handelt. Diese exprimieren im Gegensatz zu klassischen Gedächtniszellen

zwar nach TCR-spezifischer Stimulation vermehrt IL-2 Rezeptoren, sezernieren aber kaum IL-2,

eines der wichtigen Zytokine der initialen T-Zell-Reaktion. Stattdessen kann man eine deutliche

Steigerung der IL-4 Sekretion nach spezifischer Stimulation erkennen (BAILEY et al. 1998).

Werden LPL hingegen in vitro unspezifisch z.B. mit Concavalin A stimuliert, produzieren sie große

Mengen an IL-2 (JAMES et al. 1990, BAILEY et al. 1994). Dieses Verhalten wird als Zeichen für

eine spezielle Regulationsfunktion im stark antigenbeladenen Milieu des Darms gewertet, welches

überschießende Immunreaktionen gegen ungefährliche Antigene und damit einhergehende

Gewebszerstörung verhindern soll (MEUER et al. 1996). Eine erhöhte Expression von IL-4 in der

LP des Duodenums EcN-gefütterter Schweine könnte ein Hinweis auf die Stimulation von Th2-

Zellen sein. Allerdings kann von der mRNA-Expression nicht automatisch auch auf eine vermehrte

Produktion und Sekretion von IL-4-Protein geschlossen werden, so dass eine Messung der IL-4-

Konzentration nötig wäre, um Aussagen über die biologische Relevanz der erhöhten mRNA-

Expression zu erlauben.

Anzeichen für eine erhöhte Aktivierung von LPL liegen bei den EcN-gefütterten Tieren nicht vor,

da sich die Zahl der CD25+ Zellen in der LP nach EcN-Fütterung im Duodenum nicht verändert

(Abb. 23).

In jüngster Zeit gibt es aus Untersuchungen an Mäusen Hinweise darauf, dass es sich bei einem

geringen Teil der T-Zellen im Darm, die in hoher Konzentration den CD4-Corezeptor und in

niedriger Konzentration CD25 exprimieren (= CD4highCD25low), nicht um ruhende T-Helferzellen,

sondern um eine spezielle Population regulatorischer T-Zellen handelt. Diesen Zellen soll eine

hemmende Funktion in der intestinalen Immunantwort zukommen (THOMPSON und POWRIE

2004).

Beim Schwein wurde eine derartige Population aber bisher noch nicht beschrieben. Da bei einer

Immunzellaktivierung die Zahl der CD25+ Effektorzellen die der regulatorischen T-Zellen bei

weitem übersteigt und letztere CD25 außerdem nur schwach exprimieren, kann beim Schwein nach

wie vor der vermehrte Nachweis von CD25+Zellen als Zeichen einer Immunaktivierung gewertet

werden. Ein Marker wie etwa das beim Menschen als Aktivierungsmaker verwendete CD69 ist zur

Zeit beim Schwein nicht bekannt.

Diskussion

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112

EcN beeinflusst die mRNA-Expression antimikrobieller Peptide in der Darmmukosa

gesunder Schweine nicht.

In der vorliegenden Studie wurde die mRNA-Expression der mit dem Darmgewebe des Schweins

assoziierten AMP (PR-39, Protegrine, Nk-Lysin und Prepro-Defensin β1) anhand semiquantitativer

RT-PCR untersucht.

PR-39 wirkt gegen gram-positive und gram-negative Bakterien. Es verhindert effektiv das

Wachstum von E. coli durch Blockierung der DNA-Synthese (BOMAN et al. 1993). Obwohl PR-39

ursprünglich aus dem Darm des Schweins isoliert wurde, kann bei gesunden Tieren im Jejunum und

Kolon ab dem 28. Lebenstag keine PR-39-Expression mehr nachgewiesen werden (WU et al.

1999). Anders als bei den Untersuchungen von WU et al. (1999) wurde im Duodenum und Kolon

sowohl bei EcN-gefütterten Tieren als auch bei Kontrolltieren vereinzelt eine schwache Expression

von PR-39 gefunden. Ein Unterschied zwischen den beiden Gruppen ergab sich hingegen nicht

(Abb. 29). Im Ileum wurde PR-39 nicht exprimiert.

Protegrine wurden bei keiner Gruppe in der Mukosa der untersuchten Darmabschnitte exprimiert

(Abb. 29). Als Positivkontrolle für PR-39 und die Protegrine diente transmurales Mukosagewebe

von drei Wochen alten Ferkeln eines anderen Versuchs. Diese Kontrollproben waren positiv, so

dass eine fehlende Expression nicht auf methodische Mängel zurückzuführen war.

Die Expression von NK-Lysin war in allen drei Darmabschnitten nachweisbar, zeigte aber keine

Unterschiede bei hochdosiert EcN-gefütterten Tieren und Kontrolltieren (Abb. 29).

Prepro-Defensin β1 war im Ileum stärker exprimiert als im Duodenum und Kolon. Ein Einfluss

von EcN ließ sich aber auch hier nicht feststellen (Abb. 29). Außerdem war bei allen untersuchten

Tieren, eine hohe individuelle Variabilität der Prepro-Defensin β1 Expression zu beobachten. Damit

konnten In-vitro-Untersuchungen, die eine Induktion des humanen β-Defensins HBD-2 durch EcN

in humanen Kolonepithelzelllinien nachweisen (WEHKAMP et al. 2002a), in vivo für das Prepro-

Defensin β1 beim Schwein nicht bestätigt werden.

EcN führt demnach in der Mukosa von gesunden Tieren nicht zu einer veränderten Expression der

untersuchten AMP. Es ist aber denkbar, dass ein Einfluss auf die mukosale AMP-Expression durch

EcN-Gabe nur im Zusammenhang mit intestinaler Entzündung erfolgt. Auch das Alter der Tiere

könnte von Bedeutung sein.

Diskussion

________________________________________________________________________________

113

Fazit für die Fütterung von EcN an konventionell gehaltene Schweine

Die EcN-Fütterung an gesunde, konventionell gehaltene Schweine zeigte keinen signifikanten

Einfluss auf die Verteilung von Mastzellen und Granulozyten in der Darmmukosa. Ebenso wenig

verändert sich die mRNA-Expression von IFN-γ, TNF-α, TGF-β, IL-10 und die der AMP (Prepro-

Defensin β1, PR-39, NK-Lysin und Protegrine).

Die hohe Dosierung von EcN bewirkt im Kolon eine Erhöhung des Anteils CD8+ Zellen, was eine

verbesserte Epithelintegrität zur Folge haben könnte und so den Schutz vor luminalen Pathogenen

erhöhen würde. Eine signifikante Veränderung des Anteils CD4+T-Zellen ist durch EcN-Fütterung

nicht festzustellen. Es erfolgt jedoch eine tendenzielle Erhöhung der Zellzahl.

Obwohl mit den hier verwendeten Untersuchungsmethoden keine Erhöhung der aktivierten

Lymphozytenzahl gefunden wurde (CD25), zeigten sich im Duodenum Hinweise auf eine

vermehrte Th2-Aktivität (erhöhte Expression von IL-4 mRNA), der eine Verschiebung des

Gleichgewichts zwischen Th1 und Th2-Antwort in der Mukosa zugrunde liegen könnte. Diese

Hypothese bedarf aber noch einer näheren Untersuchung und Klärung der funktionellen Relevanz.

4.3 Infektionsversuch mit und ohne EcN

Wie schon eingangs der Diskussion erwähnt, wurde ein Großteil der Untersuchungen zur Wirkung

von EcN an Entzündungsmodellen mit Mäusen gemacht. Den meisten dieser Modelle liegen stark

inflammatorische Pathomechanismen zu Grunde (HOCKERTZ 1997, SCHULTZ et al. 2004),

weshalb sich die Ergebnisse nur schlecht auf weniger immunzelldominierte Infektionen, wie z.B.

ETEC-Infektionen, übertragen lassen. Außerdem sind Untersuchungen am Epithel und den

epithelialen Immunmechanismen in diesen teilweise mit erheblicher Gewebsdestruktion

einhergehenden Modellen nur schwer oder gar nicht möglich.

Deshalb wurde EcN im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit hinsichtlich seiner Wirkung bei

bakteriellen Erkrankungen des Schweins näher charakterisiert. Dazu wurde eine Pilotstudie mit

einem neuen Krankheitsmodell an abgesetzten Ferkeln durchgeführt, in dem der ETEC-Stamm E.

coli „Abbotstown“ eine sekretorische Diarrhöe induziert.

Diskussion

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114

Methodendiskussion

Für diese Pilotstudie wurden je acht Ferkel (insgesamt 16 Tiere) aus den Würfen zweier Sauen

verwendet. Die acht Ferkel des einen Wurfs wurden zehn Tage lang oral mit EcN behandelt

(EcN+). Die acht Ferkel des anderen Wurfs blieben unbehandelt (EcN-). Nach dem Absetzen

wurden je vier Tiere aus beiden Würfen (insgesamt acht) zusätzlich mit EcA infiziert (EcN+ EcA+

bzw. EcN- EcA+) und je vier Tiere (insgesamt acht) mit Placebo behandelt (EcN+ EcA- bzw. EcN-

EcA-).

Da es sich bei diesem, in der Pilotstudie verwendeten Tiermodell, um ein neues Infektionsmodell

handelt, sollen zunächst Methodik und Versuchsaufbau kurz diskutiert werden.

Die Applikation der EcN-Suspension erfolgte bei den Ferkeln nicht, wie für die Verabreichung von

Bakterien üblich, per Magensonde, sondern direkt ins Maul. Eine tägliche Sondenverwendung hätte

für die Tiere einen unnötigen Stressfaktor bedeutet. Die gesüßte EcN-Suspension wurde gut

akzeptiert und von den Ferkeln bereitwillig aus der Spritze aufgenommen.

Die Tiere wurden immer paarweise im Abstand von einem Tag abgesetzt. Daraus ergab sich eine

drei Tage längere Fütterungsdauer mit EcN für die letzten Tiere. Eine nach Absetzterminen

gestaffelte Fütterung von EcN konnte nicht realisiert werden, weil die Wurfgeschwister der

behandelten Tiere in diesem Fall den Keim über die Umwelt, in nicht kontrollierbarer Dosis

aufgenommen hätten. Um eine konstante Dosierung zu gewährleisten, wurde deshalb mit der

Fütterung von EcN bei allen Tieren zum gleichen Zeitpunkt begonnen.

Bei Ferkeln verändert sich das mukosale Immunsystem im Zusammenhang mit der post natalen

Differenzierung in den ersten 14 Lebenstagen rapide. Die Differenzierung des Immunsystems hat

sich in einem Alter von 21 Tagen aber soweit verlangsamt (BIANCHI et al. 1992), dass über einen

Zeitraum von drei Tagen keine Unterschiede bezüglich des Immunstatus zu erwarten sind.

Die Gruppen können somit trotz eines geringen Altersunterschiedes der Tiere von bis zu drei

Tagen, hinsichtlich der Entwicklung des Darmimmunsystems als homogen angesehen werden.

Die Fütterung von EcN schützt Absetzferkel vor einer EcA-induzierten Diarrhöe.

Die klinische Beurteilung der Ferkel erfolgte anhand von Gewichtsüberprüfung, des Verhaltens, der

Futter- und Wasseraufnahme sowie der Verschmutzung des Afterbereichs und der Kotkonsistenz.

Diskussion

________________________________________________________________________________

115

Das Durchschnittsgewicht der Ferkel war beim Absetzen in beiden Würfen homogen. Auch nach

dem Absetzen und der Infektion mit EcA veränderte sich das Körpergewicht der Tiere kaum (Abb.

30a+b). Damit konnte der schon bei den Versuchen mit älteren Tiere fehlende Einfluss von EcN

auf das Körpergewicht (siehe 3.1.1) ebenfalls bei Saugferkeln bestätigt werden (Abb. 30a+b). Eine

direkte anabole Wirkung von EcN bei gesunden Tieren ist demnach unwahrscheinlich. Dieses

Ergebnis deckt sich mit Überlegungen aus der Literatur, wonach Probiotika ihre anabolen Effekte

nicht direkt sondern indirekt durch eine Verbesserung der Gesundheit erreichen, und damit

verbunden zu einer konstanteren Leistung der Tiere beitragen (ROSEN 1992).

Einen weiteren Anteil der klinischen Bewertung bildeten das Verhalten, sowie die Futter- und

Wasseraufnahme der Tiere. In allen drei Parametern unterschieden sich die untersuchten Tiere

nicht.

Ferkel mit Diarrhöe aus der EcN-EcA+ Gruppe zeigten initial vier bis acht Stunden nach Infektion

vor dem Einsetzen der Diarrhöe ein gedämpftes Verhalten, das sich mit Einsetzen des Durchfalls

wieder normalisierte (Abb. 31). Dieser geringe Einfluss der EcA-Infektion auf das

Allgemeinbefinden ist typisch für eine unkompliziert verlaufende ETEC-Infektion (KRSNIK et al.

1999). Auch in der Praxis leiden Ferkel in der Regel nicht an direkt durch E. coli hervorgerufenen

Veränderungen, sondern an den Folgen der durch die Diarrhöe verursachten Exsikose (ROLLE und

MAYR 2002).

Bei der Kotkonsistenz und der Verschmutzung der Afterregion fielen zwei Tiere der EcN–EcA+

Gruppe durch gelblichen, pastösen bis flüssigen Durchfall auf. Dies entsprach einem Anteil an

Diarrhöe erkrankter Tiere von 50 %. In der EcN+EcA+ Gruppe gab es keine Anzeichen von

Durchfall, ebenso wenig wie in den beiden EcA- Gruppen (Abb. 32a+b).

Diese Ergebnisse werden durch die Messungen des Wassergehaltes im Kot der Tiere bestätigt

(Abb. 34). Das Fehlen einer Signifikanz bei der Erhöhung des Wassergehalts von Tieren der EcN-

EcA+ Gruppe lässt sich darauf zurückführen, dass nur zwei der Tiere Durchfall und somit einen

deutlich erhöhten Wassergehalt im Kot hatten, die beiden anderen Tiere aber unauffällig waren.

Es ergeben sich somit Hinweise, dass die prophylaktische Behandlung mit EcN zu einer

verminderten Anfälligkeit von Ferkeln für EcA-bedingte Diarrhöen führt.

Die histologische Untersuchung EcA-infizierter Tiere ergab, wie für eine sekretorische Diarrhöe zu

erwarten, kaum inflammatorische Veränderungen. Es fiel aber auf, dass EcN-EcA+ Tiere zu einer

geringgradigen Zottenverkürzung und –fusion im Jejunum neigten. EcN verhinderte eine

Diskussion

________________________________________________________________________________

116

Veränderung der Zotten bei EcA-Infektion. Das bei EcN-EcA+ Tieren gezeigte geringgradig

vermehrte Vorkommen von Lymphozyten wurde durch EcN um die Hälfte verringert, und die bei

EcN-EcA+ Ferkeln z.T. beobachteten leicht erhöhten Granulozytenzahlen fehlten bei EcN+EcA+

Tieren völlig (siehe 3.2.1.5).

Ob EcN ursächlich die Gewebsinfiltration verringert oder durch Verdrängung des pathogenen

Keims indirekt die morphologischen Veränderungen einschränkt, bleibt zu klären. Eine

Herunterregulierung der intestinalen Immunreaktion im Zusammenhang mit der Abwehr eines

pathogenen Keims ist allerdings unwahrscheinlich, da kontraproduktiv.

Wahrscheinlicher ist eine Verdrängung von EcA durch EcN auf Grundlage des Konkurrenzprinzips.

Auch ein Einfluss auf mechanische und immunologische Abwehrmechanismen des intestinalen

Epithels der Ferkel ist denkbar. In der histologischen Untersuchung fand sich bei zwei der EcN-

gefütterten Tiere eine gering- bis mittelgradige, follikuläre und parafollikuläre Hyperplasie der

Peyer’schen Platten, die bei keinem der nicht EcN-gefütterten Tiere beobachtet wurde. Ob die

gemachten Beobachtungen ein Hinweis auf eine immunmodulatorische Wirkung von EcN im Darm

von EcA-infizierten Ferkeln sind, müssen weitere Untersuchungen klären.

EcN führt zu einer verminderten Ausscheidung von EcA bei infizierten Ferkeln.

Um eine Beeinträchtigung der Darmgesundheit der Versuchstiere durch andere pathogene Erreger

als EcA ausschließen zu können, wurden alle Tiere mit praxisüblichen Methoden mikrobiologisch

untersucht. Alle untersuchten Ferkel waren frei von klassischen porcinen Enteritiserregern wie

Lawsonia intracellularis, Brachyspira hyodysenteriae oder Salmonellen, die die Interpretation der

Ergebnisse hätten beeinträchtigen können. Die bei einigen EcN+ Tieren nachgewiesenen E. coli

wiesen keine Virulenzfaktoren auf. Einzig der hochgradige Clostridienbefall eines der EcN+EcA+

Tiere stellte ein Problem dar. Da dieses Tier aber keinerlei Auffälligkeiten im Vergleich mit den

anderen Gruppenangehörigen zeigte, gab es keinen Grund, es aus der Studie auszuschließen.

Am Versuchsende konnte EcA bei allen EcN-EcA+ Tieren aus dem Darm nachgewiesen werden.

Bei EcN+EcA+ Tieren gelang der Nachweis von EcA nur bei zwei Tieren. Die Placebokontrollen

waren alle EcA-negativ (Tab. 11).

Die Untersuchung auf EcN ergab bei allen nicht EcN-gefütterten Tiere einen negativen Kotbefund.

Es konnte aber auch im Kot von fünf der acht EcN-gefütterten Tiere bei Versuchende kein EcN

nachgewiesen werden.

Diskussion

________________________________________________________________________________

117

Es ist bekannt, dass die Verabreichung von EcN an noch nicht besiedelte humane Neugeborene zu

einer unterschiedlich lang anhaltenden Kolonisation führen kann (LODINOVA-ZADNIKOVA und

SONNENBORN 1997). Dies gilt jedoch nur für Kinder, die direkt nach der Geburt mit EcN

besiedelt wurden. Die EcN-Fütterung der Ferkel begann am 11. Lebenstag. Zu diesem Zeitpunkt ist

der Darm bereits mit Bakterien besiedelt, was beim Schwein auf Grund der keimreichen Umgebung

innerhalb der ersten Stunden bis wenige Tage nach der Geburt erfolgt (SCHULZE et al. 1980). Eine

dauerhafte Besiedlung des Darms durch EcN ist also zu diesem Zeitpunkt nicht mehr zu erwarten.

Dass EcN generell nach Fütterung im Kot von Schweinen nachweisbar ist, zeigen die Ergebnisse

der drei EcN-positiven Tiere (Tab. 11) und die Ergebnisse aus dem Versuch mit konventionell

gehaltenen Schweinen (Tab. 9). Bei letzteren wurde EcN allerdings zweimal am Tag verabreicht,

so dass die letzte Applikation zum Zeitpunkt der Probenentnahme am Schlachttermin erst maximal

12 Stunden zurücklag. Bei den Ferkeln waren es auf Grund der täglich nur einmal stattfindenden

Applikation 28 Stunden. Ferkel haben mit einer Dauer von 16 Stunden eine kurze Darmpassage. Es

ist somit wahrscheinlich, dass EcN lediglich zum Zeitpunkt der Probennahme bei einigen Tieren

nicht mehr in ausreichender Konzentration im Kot vorhanden war, um es erfolgreich zu detektieren.

Für eine erfolgreiche Behandlung mit EcN sprechen außerdem die drei EcN-positiven Tiere und die

deutlich positive Wirkung auf die Durchfallsymptomatik sowie die Histologieergebnisse.

Bei weiteren Versuchen sollte aber dazu übergegangen werden, zusätzliche Kotproben während des

Versuchsverlaufs zu nehmen, um Aussagen über die Kinetik von EcN im Darm der Versuchstiere

machen zu können. Unter Umständen könnte eine zweimalige EcN-Applikation pro Ferkel und Tag

die positiven Effekte von EcN noch verstärken.

Beim Vergleich der Nachweise von EcN und EcA im Kot fällt auf, dass genau die Tiere der

EcN+EcA+ Gruppe kein EcN im Kot haben, bei denen EcA nachgewiesen wurde und umgekehrt

(Tab. 11). Eine große Anzahl an EcN im Darm könnte demnach den pathogenen Keim verdrängen.

Eine Verringerung der Anzahl pathogener Keime durch EcN wurde von LODINOVA-

ZADNIKOVA et al. (1997) schon für Säuglinge beschrieben. Auch andere probiotische

Mikroorganismen verringern die Zahl an pathogenen Erregern wie EPEC (DAI und WALKER

1998) und Rotaviren (GAON et al. 2003) im Stuhl von Kindern.

Diskussion

________________________________________________________________________________

118

EcN beeinflusst die Plasma-IgA-Konzentration, zeigt jedoch keinen Einfluss auf die

intestinale, luminale IgA-Konzentration bei EcA-infizierten Schweinen.

IgA ist das wichtigste Immunglobulinmolekül zum Schutz mukosaler Oberflächen. Es wird als

sekretorisches IgA (sIgA) in Form eines Dimers sezerniert. IgA kommt aber auch im Blut vor. Dort

liegt es fast ausschließlich als Monomer vor (siehe 1.5.2.2). Etwa 31% des im Blut vorkommenden

IgAs wird im Darm gebildet (VAERMAN et al. 1997).

Bei den untersuchten Schweinen des Infektionsmodells wurden der Serum-IgA-Wert und die

luminale IgA-Konzentration bestimmt. Da Nachweismethoden zur Bestimmung absoluter

Konzentrationen für porcines IgA nicht zur Verfügung standen, konnten mit der verfügbaren

Methode nur relative Werte ermittelt werden. Diese Werte erlaubten einen Vergleich nur zwischen

den Gruppen des vorliegenden Versuchs. Ein Vergleich mit Werten anderer Arbeitsgruppen war

nicht möglich (siehe 3.2.1.4).

Die Konzentration des Plasma-IgAs unterschied sich nicht zwischen den EcA-infizierten und den

Placebo-behandelten Tieren derselben EcN-Fütterungsgruppe. Demgegenüber war der Plasma-IgA-

Gehalt der EcN+EcA+ Tiere deutlich niedriger als der Plasma-IgA-Gehalt der EcN-EcA+ Tiere.

Zwischen den Placebo-behandelten Tieren der beiden EcN-Fütterungsgruppen ergab sich kein

Unterschied für den IgA-Gehalt im Plasma (Abb. 36).

Beim luminalen IgA-Gehalt konnte kein Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt werden

(Abb. 35).

Die Ergebnisse für den Plasma-IgA-Gehalt bei den nicht EcA-infizierten Ferkeln stehen im

Einklang mit denen für humane Säuglinge unter der Behandlung mit EcN (CUKROWSKA et al.

2002). Hingegen erscheint das Absinken der IgA-Plasmakonzentration EcN+EcA+ Tiere gegenüber

der IgA-Plasmakonzentration von EcN-EcA+ Tieren zunächst paradox. Eine Erklärungsmöglichkeit

besteht darin, dass das normalerweise aus dem Darmgewebe ins Blut abgegebene IgA (bis zu 31%)

an Ort und Stelle zur Abwehr von EcA benötigt wird, und deshalb für das Plasma nicht mehr zur

Verfügung steht. Es müsste dann im Darmgewebe vorhanden sein, da sich der luminale Gehalt an

IgA nicht erhöht (Abb.35).

Bei Untersuchungen an humanen Neugeborenen führt die Gabe von E. coli O83, einem

apathogenen Stamm mit probiotischen Eigenschaften, anders als die Applikation von EcN im

vorliegenden Versuch, zu einer Erhöhung von IgA sowohl im Serum als auch im Stuhlfiltrat

(LODINOVA-ZADNIKOVA et al. 1991). Verschiedene E. coli Stämme scheinen demnach in

Diskussion

________________________________________________________________________________

119

unterschiedlichem Maße zur Aktivierung der IgA-Produktion in der Lage zu sein.

Fazit für die Infektionsversuche mit und ohne EcN

Im zweiten Teil der Arbeit konnte anhand einer Pilotstudie gezeigt werden, dass E. coli Nissle 1917

Ferkel zum Zeitpunkt des Absetzens vor einer EcA-induzierten Diarrhöe zu schützen vermag. Die

Mechanismen, mit deren Hilfe EcN diesen positiven Effekt erzielt, sollten Gegenstand zukünftiger

Untersuchungen sein.

4.4 Neue Erkenntnisse über die Wirkungsweise von EcN

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten gezeigt werden, dass EcN einen Einfluss auf die

Anzahl CD8+ Zellen in der Darmmukosa gesunder Schweine hat. Die Wirksamkeit von EcN kann

deshalb nicht alleine durch die Verdrängung pathogener Keime unter Infektionsdruck erklärt

werden. Die Erhöhung der Zahl CD8+ Zellen im Colon ascendens gesunder Schweine ist ein

Hinweis darauf, dass durch EcN unabhängig von einer Infektion Abwehrmechanismen des Wirtes

aktiviert werden. Ob es sich dabei um eine direkt Interaktion zwischen EcN und der Darmmukosa

oder um eine indirekte Einflussnahme durch Veränderung der Zusammensetzung der inhärenten

Darmflora handelt, müssen weitere Untersuchungen klären.

Die Pilotstudie zur Wirksamkeit von EcN im ETEC-Infektionsmodell beim Absetzferkel zeigte,

dass EcN eine EcA-induzierte Diarrhöe wirksam verhindert. Ob dieser positive Effekt auf einer

reinen Verdrängung des pathogenen durch den probiotischen E. coli beruht, kann anhand dieser

Ergebnisse nicht beantwortet werden. Ein direkter oder indirekter Einfluss von EcN auf das

Darmimmunsystem scheint aber unter Berücksichtigung der Ergebnissen bei gesunden Schweinen

nicht ausgeschlossen. Da es sich bei der Diarrhöe im neu etablierten EcA-Infektionsmodell um eine

sekretorische Diarrhöe mit erhaltener Epithelintegrität handelt, bietet sich in Zukunft die

Möglichkeit in vivo am Schwein weiter Untersuchungen zur EcN Wirkung auf die Darmbarriere

durchzuführen.

Zusammenfassung

________________________________________________________________________________

120

5 Zusammenfassung

Swantje Duncker: Auswirkungen von oral verabreichtem Escherichia coli Nissle 1917 auf das

darmassoziierte Immunsystem des Schweins

Über die Wirkmechanismen probiotischer Mikroorganismen ist bisher wenig bekannt. Es gibt nur

wenige Hinweise darüber, wie einer der ältesten therapeutisch verwendeten Probiotikastämme, das

gram-negative E. coli Bakterium Nissle 1917 (EcN), seine positiven Effekte erzielt. Diese

Ergebnisse stammen zudem meist aus In-vitro-Untersuchungen. Die wenigen vorhandenen In-vivo-

Experimente wurden fast ausschließlich an kleinen Labornagern durchgeführt. Diese Arbeit soll

dazu beitragen, die Wirkung von EcN auf die Immunzellverteilung und mRNA-Expression von

Zytokinen und antimikrobiellen Peptiden in der Darmmukosa gesunder Schweine zu klären, und die

Auswirkung der EcN-Fütterung im ETEC-Infektionsmodell bei Absetzferkeln zu untersuchen.

Es wurden zunächst 15 junge Schweine (Gewicht 16 ± 2,7 kg) in Gruppen zu je fünf Tieren über

drei Wochen mit 109 KBE/d, 1011 KBE/d oder Placebo gefüttert. Nach der Tötung wurden

Gewebeproben aus verschiedenen Darmabschnitten histologisch (Granulozyten und Mastzellen)

und immunhistologisch (CD4, CD8, CD25 und IgA) auf die Verteilung von Immunzellen

untersucht. Mit RT-PCR erfolgte die Bestimmung der mRNA-Expression verschiedener Zytokine

(IFN-γ, TNF-α, TGF-β, IL-4 und IL-10) sowie antimikrobieller Peptide (Prepro-Defensin β1,

Protegrine, PR-39 und NK-Lysin). In einem zweiten Versuch wurden von acht Absetzferkeln nach

vorheriger zehntägiger EcN-Gabe (1010 KBE/d) und acht unbehandelten Tieren jeweils vier an zwei

aufeinanderfolgenden Tagen mit Escherichia coli „Abbotstown“ (EcA) infiziert. Es erfolgte eine

klinische Beurteilung des Krankheitsverlaufs, mikrobiologische Kotuntersuchungen und eine

Bestimmung des Serum- und luminalen IgA-Gehalts.

Die Verteilung der Immunzellen in der Darmschleimhaut gesunder Schweine entsprach der von

anderen Autoren beschriebenen. Eosinophile Granulozyten wiesen die geringste Konzentration im

Kolon und die höchste im Ileum auf. Neutrophile Granulozyten und Mastzellen kamen in allen

Darmabschnitten nur in geringer Anzahl und basophile Granulozyten überhaupt nicht vor. Bei

keiner der untersuchten Zellgruppen des angeborenen Immunsystems ließen sich Veränderungen

Zusammenfassung

________________________________________________________________________________

121

durch EcN-Fütterung feststellen. Anders verhielt es sich bei Zellen des adaptiven Immunsystems.

Die Zahl CD8+ Zellen im Epithel des Colon ascendens war in der hochdosiert gefütterten EcN-

Gruppe signifikant höher als bei Kontrolltieren, was eine verbesserte Abwehrbereitschaft im Epithel

zur Folge haben könnte und so den Schutz vor luminalen Pathogenen erhöhen würde. Mit

Ausnahme einer Erhöhung der mRNA-Expression von IL-4 im Duodenum hochdosiert EcN-

gefütterter Schweine lies sich kein Einfluss auf die mRNA-Expression der untersuchten Zytokine

und antimikrobiellen Peptide erkennen. Die funktionelle Relevanz der vermehrten IL-4 mRNA-

Expression im Ileum muss erst noch untersucht werden. Sie könnte ein Hinweis auf eine

Verschiebung des Gleichgewichts der T-Helfer-Zellen in der Darmmukosa in Richtung Th2-

Antwort sein.

Im Infektionsmodell vermag eine zehntägige Prophylaxe mit EcN die Tiere zum Zeitpunkt des

Absetzens vor einer EcA-induzierten Diarrhöe zu schützen.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Hinweise erbracht, dass die Wirkung von EcN nicht,

wie häufig vermutet wurde, nur auf einer Verdrängung pathogener Keime beruht. Die Erhöhung der

Zahl CD8+ Zellen im Colon ascendens gesunder Schweine legt nahe, dass ein

Informationsaustausch zwischen Darmmukosa und dem probiotischen Keim erfolgt, der auch

Abwehrmechanismen des Wirtes aktiviert. Die Entwicklung einer Diarrhöe bei erhaltener

Epithelzellintegrität im EcA-Infektionsmodell bietet die Möglichkeit, Untersuchungen zur EcN

Wirkung auf die Darmbarriere in Zukunft auch in vivo durchzuführen.

Summary

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122

6 Summary

Swantje Duncker: The effects of orally administered Escherichia coli Nissle 1917 on the gut-

associated-lymphoid-tissue of the pigs.

The mechanisms used by probiotic microorganisms to achieve their beneficial effects have not yet

been elucidated. There is only partial knowledge how one of the oldest used probiotic strain E. coli

Nissle 1917 (EcN) influences the host. Most investigations were done by in vitro experiments. The

few in vivo experiment, were mostly carried out in rodents. It was the aim of the present study to

gain a better knowledge about the effects of EcN on the distribution of immune cells, the cytokine

expression and the expression of antimicrobial peptides in the intestinal mucosa of healthy young

pigs. Further more the influence of EcN on an ETEC-infection model in weaned piglets should be

investigated.

Fifteen young pigs (weight 16 ± 2,7 kg ) were divided into three groups of five animals each. They

were either fed with 109 CFU EcN/d, 1011 CFU EcN/d or placebo for three weeks. Following

stunning and exsanguination tissue samples were taken and histological (granulocytes and mast

cells) and immunohistochemical (CD4, CD8, CD25 and IgA) investigations of immune cell

distribution in the intestinal mucosa were performed. The mRNA expression of cytokines (IFN-γ,

TNF-α, TGF-β, IL-4 and IL-10) and antimicrobial peptides (prepro-defensine β1, protegrine, PR-39

and NK-lysin) were analyzed by RT-PCR. The second experiment focused on the influence of EcN

in a piglet infection model with E. coli “Abbotstown” (EcA). For that purpose eight animals were

fed with 1010 CFU EcN/d for ten days. Eight other piglets served as control. Four animals of each

group were subsequently infected with EcA on two consecutive days. The clinical symptoms were

recorded, feces microbiology was investigated and serum- and intestinal luminal IgA concentration

were analyzed.

The general distribution of immune cells in the pigs intestine confirmed results achieved by other

groups. Eosinophils were less concentrated in the colon compared to the ileum, which harbors the

highest number of eosinophils in the porcine intestine. Neutrophiles and mast cells were equally

distributed in small numbers, but basophiles were absent. In none of the investigated cells,

Summary

________________________________________________________________________________

123

associated with the innate immune system, changes were detected following EcN treatment. The

results for cells of the adaptive immune system were different. The number of CD8+ in the

epithelium of the ascending colon was significantly higher in pigs fed high doses EcN than in

controls. This may contribute to higher resistance of these animals to luminal pathogens. The

investigation of cytokine- and antimicrobial peptide-mRNA-expression showed no differences

between feeding groups except IL4. The IL-4 mRNA-expression was increased in the duodenum of

high doses EcN-fed animals. To clarify the functional relevance of these findings further

investigations are necessary. A shift in IL-4 mRNA-expression might be due to a shift in T-helper

cell balance towards a Th2 response.

In response to ten days prophylactic administration of EcN the incidence of diarrhea in EcA

infected piglets decreased. The EcN treatment therefore seems capable of protecting piglets from

EcA-induced diarrhea around weaning.

From the present study it may be concluded that the effects of EcN are not limited to the

displacement of pathogenic microorganisms in the intestine, even though this may play an

important role in intestinal defense. The increase of CD8+ cells in the ascending colon of healthy

pigs suggests an influence of EcN on the epithelial part of the intestinal barrier and thereby on the

adaptive immunity of the host. The new EcA-infection model gives an appropriate basis to further

investigate the influence of EcN on the intestinal barrier in vivo.

Literaturverzeichnis

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Anhang I

________________________________________________________________________________

156

8 Anhang I

8.1 Futterzusammensetzung des verwendeten Grundfutters

8.1.1 E. coli Nissle 1917-Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen

Tab. 12 Futterzusammensetzung für den Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen

Ferkelfutter

Einzelkomponenten Mischfuttermenge Rohprotein Rohfett Rohfaser NfE

% kg % % % %

Gerste 48,50 48,50 12,50 2,70 5,70 76,40

Hafer 15,00 15,00 12,30 5,20 11,30 67,90

Weizen 9,50 9,50 13,80 2,00 2,90 79,40

Erbsen 8,50 8,50 25,90 1,50 6,80 62,10

Maiskleber 12,50 12,50 70,50 5,10 1,30 21,00

Sojaöl 1,00 1,00 0,00 99,90 0,00 0,00

Lysinmonohydrochl. 0,85 0,85 93,33 0,00 0,00 0,00

DL-Methionin 0,05 0,05 99,00 0,00 0,00 0,00

L-Threonin 0,10 0,10 99,00 0,00 0,00 0,00

L-Tryptophan 0,10 0,10 99,00 0,00 0,00 0,00

Schweinemin. (pro fit) 3,00 3,00 0,10 0,00 0,00 8,00

Futterkalk 0,90 0,90 0,00 0,00 0,00 0,00

100,00 100,00

Abkürzungen: NfE = nicht-Fett Enegie, Schweinemin. = Schweinemineralfutter

Anhang I

________________________________________________________________________________

157


Tab. 13 Futterzusammensetzung für Tiere der Infektionsversuche

Sauenfutter / Probiotikafreies Ferkelfutter

Einzelkomponenten Mischfuttermenge Rohprotein Rohfett Rohfaser NfE

% kg % % % %

Gerste (geschrotet) 40,50 40,50 10,40 2,20 6,00 76,40

Weizen (geschrotet) 35,00 35,00 11,90 1,80 2,60 79,40

Soja (geschrotet) 20,00 20,00 45,30 1,30 6,20 62,10

Sojaöl 1,00 1,00 0,00 99,90 0,00 0,00

Schweinemin. (Phoskana 580) 3,50 3,50 0,10 0,00 0,00 8,00

100,00 100,00

Abkürzungen: NfE = nicht-Fett Enegie, Schweinemin. = Schweinemineralfutter

Anhang II

________________________________________________________________________________

158

9 Anhang II

9.1 BakterienstämmeEscherichia coli Stamm Nissle 1917 Fa. Ardeypharm, Herdecke, Deutschland

→ Suspension 1: 5,0 x 108 KBE/ml Charge: Ch.B.:#BF01.1001-1

→ Suspension 2: 5,0 x 1010 KBE/ml Charge: Ch.B.:#BF01.1001-3

Mutaflor® 100 mg Kapseln Fa. Ardeypharm, Herdecke, Deutschland

Escherichia coli Stamm „Abbotstown“ AG Prof. Baljer, Justus-Liebig Universität,

Gießen, Deutschland

9.2 Material und Geräte

Amicon Ultra 100 Fa. Millipore, Bedford, USA

Analysewaage Satorius RP 221 S Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG,

Gehrden, Deutschland

Analysewaage Satorius Typ 1475 Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG,


Assistent® Counter AC-8 Karl Hecht GmbH &Co. KG, Sondheim,

Deutschland

Blockstation Fa. Shandon, Frankfurt, Deutschland

Brucheisautomat Fa. Ziegra, Hannover, Deutschland

chirurgische Pinzetten Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG,


chirurgische Schere, gerade Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG,


Columbia Blutagarplatten Fa. Oxoid GmbH, Wesel, Deutschland

Coolpix MDC Lens Fa. Nikon GmbH, Düsseldorf, Deutschland

Coolpix5000 Digitalkamera Fa. Nikon GmbH, Düsseldorf, Deutschland

Cryostat HM 500 OM Fa. Microm, Walldorf, Deutschland

Deckgläser 24 x 50 mm Fa. Menzel GmbH & Co KG, Braunschweig,

Digi-Clock Timer TR 119 OS Fa. Oregon Scientific, Villingen, Deutschland

DIGItempTM Digitales Fieberthermometer Fa. Servoprax® GmbH, Wesel, Deutschland

Anhang II

________________________________________________________________________________

159

Einmalspritzen 10 ml Fa. Codan Medical ApS, Rødby, Dänemark



Electrothermal Praffin Section Mounting Bath Fa. Barnstead International, Dubuque, USA

EnghalsspritzflaschenPE-LD 500ml Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG,


Eppendorf Centrifuge 5451c Fa. Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Ernährungssonde 1,5 x 2,1 mm Fa. Braun Melsungen AG, Melsungen,

Deutschland

Färbekästen nach Hellendahl 60 x 55 x 105 mm Fa. Karl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe,

Deutschland

Reaktionsröhrchen 50 ml Fa. Becton Dickinson GmbH, Heidelberg,

Deutschland

Gasprofi 1 SCS Fa. WLD-Tec, Göttingen, Deutschland

Gefrierschrank –20°C Einzelhandel

Gefrierschrank –80°C Einzelhandel

Gel Doc 1000 Fa. BioRad, Hercules, USA

Glaspipetten 20 ml Fa. Ochs, Bovenden, Deutschland

Heidelberg, Deutschland

Histokinette Fa. Reichert-Jung, Nussloch, Deutschland

Inkubations-Schüttler Innova 4000 Fa. New Brunswick Scientific, Großbritannien

Kanülen 0,4 x 20 mm Fa. Terumo Europe N.V., Leuven, Belgien

Kanülen 1,2 x 40 mm Fa. Terumo Europe N.V., Leuven, Belgien

Kühlplatte Fa. Shandon, Frankfurt, Deutschland

Kühlschrank 4°C Einzelhandel

Labophot-2 Mikroskop Fa. Nikon GmbH, Düsseldorf, Deutschland

Laborflaschen Schott Duran®1000ml Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG,






Anhang II

________________________________________________________________________________

160



Labor pH-Meter „ Knick“ 766 Calimatic Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG,


Lambda Scan 200e Photometer Fa. MWG AG Biotech, Ebersberg, Deutschland

Lamina Airflow NU 440-400E Fa. NuAire, Plymouth, USA

Latex-Untersuchungshandschuhe Fa. Kimberly-Clark, Zaventem, Belgien

Li-Heparin LH/9 ml Monovette® Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Magnetrührer RET basic Fa. IKA®-Werke GmbH & Co KG, Staufen,

Deutschland

Microtom HM 335 E Fa. Microm, Walldorf, Deutschland

Mikroskopobjektive 10x, 20x, 40x, 100x Fa. Nikon GmbH, Düsseldorf, Deutschland

Minifuge 2 Fa. Heraeus, Hanau, Deutschland

Nikon EH 21 Netzadapter Fa. Nikon GmbH, Düsseldorf, Deutschland

Nikon View software Fa. Nikon GmbH, Düsseldorf, Deutschland

NuncTM Cryo TubeTM Vials Fa. Nunc, Roskilde, Dänemark

Objektträger unbeschichtet Fa. Menzel GmbH & Co KG, Braunschweig,

Parrafinbad Medax WB24 Fa. Medax Nagel KG, Kiel, Deutschland

pH-Meter Einstabmesskette „ Knick“ SE 100 Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG,


PIPETBOY acu Fa. Integra Bioscience, Fernwald, Deutschland

Pipetten Eppendorf 10 µl Fa. Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Pipetten Eppendorf 10 ml Fa. Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland




Pipetten PE 10 ml Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland



Pipettenspitzen 10 ml Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Pipettenspitzen 10µl Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Pipettenspitzen 1000 µl Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Anhang II

________________________________________________________________________________

161

Pipettenspitzen 200 µl Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Power Pac 3000 Gel-Elektrophoresekammer Fa. BioRad, Hercules, USA

Reaktionsgefäß 50 ml Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Reaktionsgefäße 1500 µl Fa. Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Reaktionsgefäße 200 µl Fa. Biozym Diagnostic GmbH, Hessisch

Oldendorf, Deutschland

Reaktionsgefäße 500µl Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Rosenberg, Deutschland

SuperFrost®Plus Objektträger Fa. Menzel GmbH & Co KG, Braunschweig,

TierWohl Super Weichholzspäne Fa. J. Reppmeier + Söhne GmbH&Co

Transportagar 0482 Fa. Nerbe plus, Winsen/Luhe, Deutschland

Ultra-Thurax T8 Fa. IKA®-Werke GmbH & Co KG, Staufen,

Deutschland

Vari-Kennel® XL Fa. Patmate®, Arlington, USA

Vortexer „Vortex-Genie 2 Fa. Scientific Industries Inc., Bohemia, USA

Wasserbad Fa. GFL m.b.H., Burgwedel, Deutschland

Weithalsflaschen PP Kautex Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG,


Weithalsgläser Glas 250 ml Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG,


Zentrifuge CLGS56R Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland

Zentrifuge ZK 380 Fa. Hermle, Buckley, USA

9.3 Pharmaka und Substanzenβ-Mercaptoethanol Fa. Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland

10x PCR-Buffer Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

5x First-strand-Buffer Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

Ampuwa® für Spülzwecke Plastipur® Fa. Ardeypharm, Herdecke, Deutschland

Antikörper Diluent Fa. Zymed, San Francisco, USA

Baypamun ® Fa. Bayer AG, Leverkusen, Deutschland

Bromphenolblau Fa. Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland

Anhang II

________________________________________________________________________________

162

Chloroform Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland

d(T)12_18 5`-PO4,Na+Salt oligo dt Primer Fa. Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg,

Deutschland

dNTP-Mix 2,5 mM Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

DTT 0,1 M Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

EDTA Ethylenediaminetetraaceticacid Fa. Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland

Eisendektran 20 Fa. Vetoquinol, Oberursel, Deutschland

Eisessig Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland

Entellan Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland

Eosin Y(wässrig) Fa. Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland

Ethanol 100 % Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland

Ethidium-Bromid Fa. Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland

Paraformaldehyd Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland

Giemsa Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland

Glycerol Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland

Handedesinfektion „Sterilium®“ Fa. Bode Chemie, Hamburg, Deutschland

Ivomec 5% Schwein Injektionslösung Fa. Bayer AG, Leverkusen, Deutschland

Kalium-dihydrogenPhosphat (KH2PO4) Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland

Lysovet® PA als 2% Lösung Fa. Schülke & Mayer, Norderstedt, Deutschland

Meyer’s Hämalaun Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland

Magnesiumchlorid (MgCl2) 50 mM Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

Monet Blue Fa. Biocare Medical, Hamburg, Deutschland

Natriumchlorid (NaCl) Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland

Platinum® Taq DNA-Polymerase Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

RLT-Puffer Fa. Quiagen, Hilden, Deutschland

RNA-Later Fa. Quiagen, Hilden, Deutschland

RQ1 Rnase-free DNAse Fa. Promega, Madison, Wisconsin

Süßstoff handelsüblich

SuperscriptTM III Reverse Transkriptase Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

o-Toluidinblau Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland

Tris(hydroxymethyl)aminomethan Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland

Tween® 20 Fa. Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland

Anhang II

________________________________________________________________________________

163

vanGogh Yellow Fa. Biocare Medical, Hamburg, Deutschland

Wasserstoffperoxid 30 % (H2O2) Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland

Xylencyanol Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland

Xylol Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland

9.4 Lösungen und ProtokolleWenn nicht anders angegeben, wurde zur Einstellung des pH-Wertes bei allen Lösungen 5 M

NaOH bzw. 18%ige HCl verwendet.

Alle Puffer wurden bei 4°C im Kühlschrank gelagert.

Tab. 14 Puffer und Lösungsrezepte

100 bp DNA Ladder-Lösung:DNA-Laufpuffer100 bp Ladder DNA Ladder (1µg/ml)Aqua dest.

80µl 20µlad 300 µl

Agarose-Gel (1%):AgaroseEthidiumbromidTAE-Puffer

3g 15 µlad 1000 ml

Carnoy Lösung: Ethanol 100 % Chloroform Eisessig

60 ml 30 ml 10 ml

DNA Laufpuffer:GlycerolEDTA (0,5 M, pH 8)BromphenolblauXylencyanolAqua dest.

30 ml 4 ml 50µl 50 µlad 100 ml

Nissle -Puffer:(Ferkelinfektionsversuche mit und ohne EcA)NaClKClMgSO4CaCl2MgCl2 x 6 H2ONaOH (32%)Aqua dest.pH-Wert 8,8; 152 mosmol/l

2,5 g 2,5 g 0,2 g 0,2 g 0,2 g 20 µlad 1000 ml

Anhang II

________________________________________________________________________________

164

Paraformaldehyd (4%):ParaformaldehydPBS-Puffer (einfach)unter Rühren auf einer Wärmeplatte lösen, vollständige Lösung erstnach Einstellung auf pH 7,4

4 gad 1000 ml

PBS mit 0,01% Natrium-Azid:Na- AzidPBS-Puffer (einfach)

100 mgad 1000 ml

PBS-Puffer (einfach):PBS (20x)Aqua dest.pH-Wert auf 7,4 einstellen.

50 mlad 1000 ml

PBS-Puffer (20-fach):NaClKH2PO4Na2HPO4*2H2OAqua dest.pH-Wert auf 6,4-6,6 einstellen

180 g 5,34 g 28,66 gad 1000 ml

Physiologische Kochsalzlösung:NaClAqua dest.

9 gad 1000 ml

RLT-Puffer:RNA- Lysis-bufferβ-MercaptoethanolLagerung bei RT

20 ml 200 µl

Suspensions -Puffer: (Versuche mit konventionellgehaltenen Tieren)NaClNaH2PO4 x H2ONa2HPO4 x 2H2OAqua dest.

8,18 g 0,276 g 1,42 gad 1000 ml

TAE (1x):TrisEisessigEDTA (0,5 mM, pH 8)Aqua dest.

4,84 g 1,142 g 2 mlad 1000 ml

TBS-Puffer (10x):NaClTRISAqua dest.pH-Wert auf 7,4 einstellen

87,66 g 60,55 gad 1000 ml

TBS/Tween:TBS (1x)Tween 20

1000 ml 350 µl

Anhang II

________________________________________________________________________________

165

Tris Buffered Saline (TBS) (1x):TBS (10x)Aqua dest.pH-Wert kontrollieren und bei Abweichung auf 7,4 einstellen

100 mlad 1000 ml

Wässrige Eosinlösung:Wässriges EosinEisessig

70 ml 2-3 Tropfen

9.5 KitsRNeasy Kit Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland

AEC Substrat Chromogen Kit Fa. Zymed, San Francisco, USA

Anhang III

________________________________________________________________________________

166

10 Anhang III

10.1 Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN

10.1.1 Gewicht

Tab. 15 Gewichtsverlauf konventioneller Schweine

Tier Gruppe Einstallung Versuchsbeginn Schlachtung Zunahme imVersuch Gesamtzunahme

kg kg kg kg kgS2-3 K 23,0 23,9 25,4 1,5 2,4S2-4 K 15,3 16,6 17,4 0,8 2,1S2-8 K 12,8 12,3 12,5 0,2 -0,3

S2-12 K 15,6 16,1 16,8 0,7 1,2S2-13 K 13,0 13,1 17,4 4,3 4,4S2-1 109 KBE/Tag 15,3 15,7 17,1 1,4 1,8S2-2 109 KBE/Tag 13.0 13,1 15,0 1,9 2,0S2-9 109 KBE/Tag 17,1 16,5 16,7 0,2 -0,4

S2-10 109 KBE/Tag 19,0 18,5 19,0 0,5 0,0S2-11 109 KBE/Tag 18,2 17,6 18,2 0,6 0,0S2-5 1011 KBE/Tag 18,0 17,5 19,0 1,5 1,0S2-6 1011 KBE/Tag 15,0 15,2 12,5 -2,7 -2,5S2-7 1011 KBE/Tag 16,2 15,2 15,0 -0,2 -1,2

S2-14 1011 KBE/Tag 16,0 17,5 18,2 0,7 2,2S2-15 1011 KBE/Tag 13,5 15,1 18,0 2,9 4,5Abkürzungen: KBE = koloniebildende Einheit, S2 = Schweineversuch 2

Anhang III

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167

10.1.2 Anzahl eosinophiler Granulozyten

Tab. 16 Anteil eosinophiler Granulozyten in mukosaler LP (Mittelwert und SD)

Gruppe DarmabschnittMittelwert

(positive Zellen/100 LP-Zellen) SDKontrolle Duodenum 0,012 0,011

Jejunum 0,083 0,028Ileum 0,110 0,022

Colon ascendens 0,005 0,005Colon descendens 0,006 0,003

109 KBE/Tag Duodenum 0,016 0,003Jejunum 0,092 0,003

Ileum 0,137 0,005Colon ascendens 0,001 0,001Colon descendens 0,002 0,002

1011 KBE/Tag Duodenum 0,014 0,015Jejunum 0,080 0,035

Ileum 0,113 0,083Colon ascendens 0,005 0,007Colon descendens 0,002 0,002

Abkürzungen: KBE = koloniebildende Einheit, SD = Standardabweichung

10.1.3 Anzahl neutrophiler Granulozyten

Tab. 17 Anteil neutrophiler Granulozyten in mukosaler LP (Mittelwert und SD)


(positive Zellen/100 LP-Zellen SDKontrolle Duodenum 0,037 0,014

Jejunum 0,004 0,002 Ileum 0,019 0,015 Colon ascendens 0,025 0,026 Colon descendens 0,037 0,019

109 KBE/Tag Duodenum 0,027 0,023 Jejunum 0,006 0,008 Ileum 0,016 0,014 Colon ascendens 0,016 0,007 Colon descendens 0,048 0,020



Anhang III

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168

10.1.4 Anzahl an Mastzellen

Tab. 18 Anteil an Mastzellen in mukosaler LP (Mittelwert und SD)







Anhang III

________________________________________________________________________________

169

10.1.5 Anteil CD4+ Zellen

Tab. 19 Anteil CD4+ Zellen in mukosaler LP (Mittelwert und SD)

Gruppe Darmabschnitt Mittelwert* SD

Kontrolle Duodenum 2,8 0,447

Jejunum 2,6 0,548

Ileum 2,8 0,837

Colon ascendens 2,6 0,895

Colon descendens 2,8 0,447

109 KBE/Tag Duodenum 2,4 0,548

Jejunum 2,8 0,447

Ileum 2,2 0,447



1011 KBE/Tag Duodenum 2,6 0,548

Jejunum 2,8 0,447

Ileum 2,2 0,447



*Bestimmung semiquantitativ


Anhang III

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170

10.1.6 Anzahl CD8+ Zellen

Tab. 20a Anteil CD8+ Zellen, IEL luminal (Mittelwert und SD)







Tab. 20b Anteil CD8+ Zellen, LPL luminal (Mittelwert und SD)




109 KBE/Tag Duodenum 0,167 0,050 Jejunum 0,202 0,042 Ileum 0,156 0.037 Colon ascendens 0,144 0,021 Colon descendens 0,172 0,050



Anhang III

________________________________________________________________________________

171

Tab. 20c Anteil CD8+ Zellen, IEL basal (Mittelwert und SD)







Tab. 20d Anteil CD8+ Zellen, LPL basal (Mittelwert und SD)







Anhang III

________________________________________________________________________________

172

Tab. 21a Anteil CD8+ Zellen, Verhältnis IEL:LPL luminal (Mittelwert und SD)


(positive Zellen/100 LP-Zellen SD

Kontrolle Duodenum 2,00 0,67 Jejunum 1,30 0,24 Ileum 1,47 0,28 Colon ascendens 1,18 0,30 Colon descendens 1,19 0,26




Tab. 21b Anteil CD8+ Zellen, Verhältnis IEL:LPL basal (Mittelwert und SD)


(positive Zellen/100 LP-Zellen SD

Kontrolle Duodenum 0,29 0,08 Jejunum 0,36 0,11 Ileum 0,34 0,18 Colon ascendens 0,65 0,36 Colon descendens 0,52 0,23




Anhang III

________________________________________________________________________________

173

10.1.7 Anzahl CD25+ Zellen

Tab. 22 Anteil CD25+ Zellen in mukosaler LP (Mittelwert und SD)







10.1.8 Anteil IgA+ Zellen

Tab. 23 Anteil IgA+ Zellen in mukosaler LP (Mittelwert und SD)







Anhang III

________________________________________________________________________________

174

10.2 Infektionsversuche mit und ohne EcN

10.2.1 Gewicht

Tab. 24 Durchschnittsgewicht Ferkel aus den verwendeten Würfen (Mittelwert und SD)

Wurf Mittelwert Gewicht SDkg kg

ohne EcN 7,4 0,62mit EcN 8,1 0,64

Abkürzungen: EcN = Escherichia coli nissle 1917, SD = Standardabweichung

Tab. 25 Gewichtsentwicklung der Ferkel im Infektionsversuch ohne EcN

Tier Gruppe Absetzen Schlachtung Gesamtzunahme kg kg kg

SI2-1 K 7,2 7,0 -0,22SI2-3 K 6,9 6,8 -0,08SI2-5 K 6,2 6,0 -0,20SI2-7 K 8,7 9,1 0,36SI2-2 I 6,8 6,3 -0,54SI2-4 I 7,3 7,7 0,38SI2-6 I 7,5 7,1 -0,40SI2-8 I 8,4 8,1 -0,30

Abkürzungen: I = Infektion, K = Kontrolle, SI =Schweineinfektionsversuche

Tab. 26 Gewichtsentwicklung der Ferkel im Infektionsversuch mit EcN

Abkürzungen: I = Infektion, K = Kontrolle, SI =Schweineinfektionsversuche

Tier Gruppe Absetzen Schlachtung Gesamtzunahme kg kg kg

SI3-1 K 6,9 6,2 -0,69SI3-3 K 7,9 7,8 -0,04SI3-5 K 7,9 7,6 -0,30SI3-7 K 8,9 8,0 -0,96SI3-2 I 9,1 8,4 -0,70SI3-4 I 8,2 7,9 -0,32SI3-6 I 7,3 7,2 -0,08SI3-8 I 8,8 8,7 -0,14

Erklärung

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Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Auswirkung der oralen Gabe von Escherichia coli

Nissle 1917 auf das darm-assoziierte Immunsystem des Schweins“ selbstständig verfasst habe. Bei

der Anfertigung wurden folgende Hilfen dritter in Anspruch genommen:

- Materialien und Geräte wurden von der Arbeitsgruppe Bischoff aus der Abteilung für

Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule

Hannover und dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule zur Verfügung

gestellt.

- Die Gefrierschnitte für immunhistologische Untersuchungen wurden von Frau Ute Peters

aus der Arbeitsgruppe Bischoff Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und

Endokrinologie der medizinischen Hochschule Hannover angefertigt.

- Histologische Untersuchungen von Darmgewebe der Tiere des Enteritismodells wurden

vom Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt.

- Die bakteriologischen Untersuchungen wurden von Frau Dr. Stephanie Barth aus dem

Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere der Justus-Liebig Universität,

Gießen (allgemeine Mikrobiologie und EcA), dem diagnostischen Labor des Instituts für

Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover und der Firma

Ardeypharm GmbH, Herdecke (EcN) durchgeführt.

- Die Anzüchtung von EcA erfolgte durch Frau Dr. Stefanie Barth aus dem Institut für

Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere der Justus-Liebig Universität, Gießen und Frau

Sabine Jeckstadt aus dem Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen

Hochschule Hannover.

- Die Bestimmung der luminalen und Plasma-IgA-Konzentration wurde von Frau Stephanie

Erklärung

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Girrbach aus dem Institut für Ernährungsphysiologie der Bundesforschungsanstalt für

Ernährung und Lebensmittel, Karlsruhe durchgeführt.

- Diese Arbeit wurde mit einer finanziellen Hilfe in Form eines Promotionsstipendiums von

der Firme ARDEYPHARM GmbH, Herdecke unterstützt.

Ich habe keine entgeldliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater

oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar

entgeldliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der

vorgelegten Dissertation stehen.

Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt:

Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule

Hannover und dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover.

Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen

Zweck zur Beurteilung eingereicht.

Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der

Wahrheit entsprechend gemacht habe.

Hannover, den 28. Februar 2005 Swantje Duncker

Danksagung

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Danksagung

Mein ausdrücklicher Dank gilt den beiden Betreuern dieser Arbeit, Prof. Dr. Gerhard Breves und

Prof. Dr. Stephan C. Bischoff, ohne deren Kooperationsbereitschaft und gutes Einvernehmen diese

Arbeit sicher nicht möglich gewesen wäre. Sie haben mir nicht nur zu diesem Thema verholfen,

sondern mir auch bei meinem „Doppelarbeitsplatz“ jegliche Freiheit gelassen.

Prof. Breves danke ich besonders für das Vertrauen in meine Arbeit und die Bemühungen, mich

und damit die Anfertigung dieser Dissertation finanziell auf feste Füße zu stellen.

Prof. Bischoff sei herzlich gedankt für die überaus freundliche Aufnahme in seine Arbeitsgruppe

und dafür, dass er mir immer ein bisschen mehr zugetraut hat als ich mir selbst.

Dr. Axel Lorentz war immer wieder bereit meine mäßigen Grundkenntnisse der Molekularbiologie

aufzubessern und meine allzu enthusiastischen Interpretationsversuche von PCR-Ergebnissen in

realistische Bahnen zu lenken. Das Korrekturlesen dieser Arbeit wurde nicht zuletzt dadurch so

wertvoll. Vielen Dank dafür!

Vielen Dank auch an Prof. Dr. Bernd Schröder für die geduldige Hilfe bei technischen Problemen

und viele wertvolle Tipps.

Bei PD Dr. Korinna Huber bedanke ich mich für die Unterstützung in tiermedizinischen Fragen.

Einen ganz besonders lieber Dank geht an die „guten Seelen“ der beiden Labore.

In der Medizinischen Hochschule: Gisela Weier, die immer auch noch bei der fünften Nachfrage für

Auskünfte zur Verfügung stand und mich uneingeschränkt an ihrem großen Pool technischen

Wissens teilhaben ließ. Ute Peters, die auch wenn mal wieder „ganz schnell noch“ eine

Gewebefärbung nötig war, ohne zu murren, den Kryostaten angeschmissen hat. Brigitte Markfeldt,

die mir immer wieder ihren Arbeitsplatz zur Verfügung stellte, wenn ich als Arbeitsnomade mit

meinem Laptop mal wieder jemandem im Weg war.

In der Tierärztlichen Hochschule: Frau Gerhild Becker, ohne deren taktisches Eingreifen ich wohl

mehr als einmal im Organisationssumpf stecken geblieben wäre. Frau Marion Burmester und Ulrike

Dringenberg für ihre jederzeit vorhandene Hilfsbereitschaft.

Danksagung

________________________________________________________________________________

Ein ganz lieber Dank geht an meine Mitdoktoranden von denen die meisten inzwischen auch zu

Freunden geworden sind: Jörn, Fabian, Leif, Nicole, Seza, Hans, Frank und Mirjam.

Mikel: ohne Deinen Fundus an Computerwissen, wäre diese Arbeit wohl irgendwann in den Tiefen

der Festplatten und Dateien verschollen und die „Ausbildung“ meiner „Singstimme“ verkümmert.

Gernot: für die brillanten Ideen und Lösungsvorschläge und die unglaublich mitreißende gute

Laune zu jeder Tages- und Nachtzeit. Thomas: für die immer konstruktive und wohlwollende Kritik

und die Gespräche auf den vielen gemeinsamen Fahrten in die Südstadt. Sigrid: für die

Aufmunterungen und Deine Bereitschaft immer noch „mal eben“ den Fehlerteufel in diesen Seiten

zu jagen. Anne: für Deine selbstverständliche Freundschaft und uneingeschränkte Hilfe in jeder

Lebenslage. Die Picknicks in, vor und außerhalb der MHH waren großartig.

Die Laborfeste, Feuerzangenbowlen und sonstigen Feierlichkeiten mit Euch allen sind jetzt schon

legendär! Danke, dass wir immer ein Team waren!

Auch meinen Mitdoktoranden an der TiHo sei herzlich gedankt: Magnus, Eva, Sonja, Julia, Alex,

Johanna, Diana, Melle, Mirja und Balazc. Gundula: Danke dass Du den wohl während jeder Arbeit

aufkommenden, Frust gepuffert und immer dafür gesorgt hast, dass ich auch noch was esse.

Michael Rohde und Yvonne Armbrecht möchte ich für ihre Hilfe mit den Versuchstieren danken

und für Eure wunderbare Art, mit den vierbeinigen Mitgliedern der Physiologie umzugehen (I did it

my way!). Das ist ganz großartig! Dirk Voigtländer: Danke für Deinen trockenen Humor. Ich werde

bei jedem „Bauer Nussjoghurt“ an Dich denken.

Mein besonderer Dank geht an die fachexternen Helfer und Freunde. Frau Dagmar und Hanni Lass-

Hennemann. Ihr habt dafür gesorgt, dass der Leser dieser Arbeit zu dem Eindruck kommen könnte,

ich verstünde etwas von deutscher Grammatik und Rechtschreibung. Matthias Silberkuhl, der als

Architekt für ein gelegentliches Ablegen der naturwissenschaftlichen Scheuklappen meinerseits

gesorgt hat. Safty, für seine professionelle Rettung der Fotos in letzter Minute. Susi Westphal für

unzählige Problemtees und Spaziergänge. Sandra Gaupels, die immer zugehört und mir hin und

wieder den Kopf zurechtgerückt hat. („Ich sach ma ........ Danke.“)

Danksagung

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Zuletzt danke ich meiner großartigen Familie, besonders meinen Eltern Christiane und Peter

Duncker und meinem Großvater Friedl Sander. Ihr habt immer uneingeschränkt an mich geglaubt

und mir gezeigt, dass die Welt nicht groß genug für mich sein kann.

Auswirkung von oral verabreichtem Escherichia coli · TGF tumor growth factor...

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