Auswirkungen von psychisch induziertem Stress durch freie ... · Aus der Klinik für Psychosomatik...
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Aus der Klinik für Psychosomatik und Psychotherapie der Universität zu Lübeck Direktor: Prof. Dr. med. F. Hohagen Auswirkungen von psychisch induziertem Stress durch freie Rede auf die Aktivierung von Thrombozyten Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Universität zu Lübeck -Aus der Medizinischen Fakultät- vorgelegt von Trygve Gräntzdörffer aus Lüneburg Lübeck 2009
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Aus der Klinik für Psychosomatik und Psychotherapie
der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. med. F. Hohagen
Auswirkungen von psychisch
induziertem Stress durch freie Rede
auf die Aktivierung von Thrombozyten
Inauguraldissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde der Universität zu Lübeck
-Aus der Medizinischen Fakultät-
vorgelegt
von Trygve Gräntzdörffer
aus Lüneburg
Lübeck 2009
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1. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. phil. Dieter Benninghoven 2. Berichterstatterin: Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Andrea Kruse Tag der mündlichen Prüfung: 15.01.2010 Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 15.01.2010
Gez. Prof. Dr. med. Werner Solbach
- Dekan der Medizinischen Fakultät -
3
Gewidmet:
Meinen Eltern
Ingrid und Eike Gräntzdörffer
4
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ........................................................................................................................................ 4
1 Einleitung ................................................................................................................................................ 8
1.1 Stress ..................................................................................................................10 1.1.1 Der Begriff Stress............................................................................................10 1.1.2 Stressmodelle.................................................................................................12 1.1.3 Die öffentliche Rede („Public Speaking“) ............................................................16 1.1.4 Endokrinologische Veränderungen durch öffentliche Rede ...................................17
1.2 Das thrombozytäre System .....................................................................................19 1.2.1 Thrombozytenmorphologie ...............................................................................20 1.2.2 Thrombozytenfunktion .....................................................................................24
1.3 Veränderungen der Thrombozyten unter dem Einfluss von Stress ...............................34 1.3.1 Einfluss auf die Plättchenaggregation ................................................................35
1.4 Überleitung zur Fragestellung der vorliegenden Arbeit ...............................................39
2 Material und Methoden ...................................................................................................................... 40
2.1 Studienziel............................................................................................................40 2.2 Probanden............................................................................................................40
2.2.1 Ausschlusskriterien .........................................................................................40 2.3 Versuchsaufbau und Ablauf der Stressinduktion........................................................41 2.4 Fragebögen ..........................................................................................................46
2.4.1 Soziodemographischer Fragebogen ..................................................................46 2.4.2 Befindlichkeitsskalierung anhand von Kategorien und Eigenschaftswörtern (BSKE) 46 2.4.3 State-Trait-Angstinventar (STAI) .......................................................................47
2.5 Messung des Blutdrucks.........................................................................................47 2.6 Gewinnung der Blutproben .....................................................................................48
2.6.1 Blutentnahme .................................................................................................48 2.6.2 Weiterverarbeitung des CTAD- Blutes ...............................................................49
2.7 Durchflusszytometrische Bestimmung thrombozytärer Membranglykoproteine ..............49 2.7.1 Prinzip der Durchflusszytometrie .......................................................................49 2.7.2 Präparation der Thrombozyten..........................................................................52
2.8 Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) .......................................................59 2.8.1 Prinzip des ELISA ...........................................................................................59 2.8.2 Durchführung des ELISA..................................................................................60
2.9 Weiterverarbeitung des restlichen Blutes ..................................................................60 2.10 Statistische Auswertung .........................................................................................61
3 Ergebnisse ........................................................................................................................................... 62
3.1 Auswertung der Fragebögen ...................................................................................62 3.1.1 Soziodemographische Auswertung....................................................................62 3.1.2 State-Trait-Angstinventar (STAI) .......................................................................62 3.1.3 Befindlichkeitsskalierung anhand von Kategorien und..........................................63 Eigenschaftswörtern (BSKE) .........................................................................................63
3.2 Auswertung des gemessenen Blutdrucks .................................................................65 3.3 Auswertung der gemessenen Thrombozytenmembranproteine ...................................67
3.3.1 Auswertung des Thrombozytenmarkers Thrombospondin ....................................67 3.3.2 Auswertung des Thrombozytenmarkers Glykoprotein 53 (CD 63)..........................69 3.3.3 Auswertung des Thrombozytenmarkers P-Selectin (CD 62).................................69
3.4 Auswertung der Granulainhaltstoffe .........................................................................70 3.4.1 Auswertung der Messung von Plättchenfaktor 4..................................................70 3.4.2 Auswertung der Messung von β-Thromboglobulin ...............................................71
3.5 Auswertung der Plättchenzahl .................................................................................72
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4 Diskussion ............................................................................................................................................ 73
4.1 Betrachtung der Methodik.......................................................................................73 4.2 Ergebnisdiskussion ................................................................................................75
4.2.1 Probandenkollektiv ..........................................................................................75 4.2.2 Stressinduktion durch Public Speaking ..............................................................75 4.2.3 Einfluß von Public Speaking auf Thrombozyten ..................................................77
4.3 Abschließende zusammenfassende Betrachtung ......................................................80
5 Zusammenfassung ............................................................................................................................. 81
6 Literaturverzeichnis ........................................................................................................................... 82
7 Anhang .................................................................................................................................................. 95
7.1 Instruktionsbögen ..................................................................................................95 7.1.1 Instruktionsbogen 1 .........................................................................................95 7.1.2 Instruktionsbogen 2 .........................................................................................95 7.1.3 Instruktionsbogen 3 .........................................................................................96
7.2 Fragebögen ..........................................................................................................97 7.2.1 Soziodemographische Daten ............................................................................97 7.2.2 State-Trait-Angstinventar (STAI) .......................................................................99 7.2.3 Befindlichkeitsskalierung anhand von Kategorien und Eigenschaftswörtern..........101
7.3 Versuchsprotokoll ................................................................................................103 7.4 Arbeitsanleitung Präparation der Thromboyzyten vor Antikörpermarkierung................105
8 Danksagung ....................................................................................................................................... 106
9 Erklärung ............................................................................................................................................ 107
10 Lebenslauf .......................................................................................................................................... 108
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Generalisiertes Anpassungssyndrom nach Selye ............................................................... 13 Abb. 2: Zweikomponentenmodell nach Pinel ..................................................................................... 14 Abb. 3: Elektronenmikroskopische Aufnahme ruhender, unstimulierter Thrombozyten .............. 21 Abb. 4: Elektronenmikroskopische Aufnahme ruhender, stimulierter Thrombozyten .................. 22 Abb. 5: Thrombozytenmorphologie......................................................................................................23 Abb. 6: Plättchenaggregation mit nachfolgender Thrombusbildung………...………....................26 Abb. 7: Formveränderung eines aktivierten Thrombozyten………………………………………...27 Abb. 8: Funktionen des Thrombozyten bei der Hämostase............................................................. 29 Abb. 9: Schematische Darstellung des Versuchablaufs mit Stressinduktion durch freie Rede.. 42 Abb. 10: Entspannungsphase................................................................................................................. 43 Abb. 11: Freie Rede vor laufender Kamera .......................................................................................... 44 Abb. 12: Schematische Darstellung des Versuchablaufs ohne Stressinduktion............................. 45 Abb. 13: Schematischer Aufbau eines Durchflusszytometers. .......................................................... 51 Abb. 14: Setzen des Gates um eine Thrompozytenpopulation, ........................................................ 56 Abb. 15: Dot-Plot Darstellung einer Thrombozytenpopulation........................................................... 57 Abb. 16: Beispiel für ein Histogramm..................................................................................................... 58 Abb. 17: Ansatz mit Thrombospondin als Marker. ............................................................................... 59 Abb. 18: Mittelwerte der „Subjektiven Stresswahrnehmung“ im BSKE ........................................... 64 Abb. 19: Mittelwerte des Mittleren Arteriellen Blutdrucks (MAD)....................................................... 66 Abb. 20: Mittelwerte der Thrombospondin positiven Plättchen.......................................................... 68
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Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Zusammenfassung der endokrinen Veränderungen unter
Öffentlicher Rede 17-18
Tab. 2: Inhaltsstoffe der thrombozytären Speichergranula 24
Tab. 3: Veränderungen unterschiedlicher Thrombozytenparameter unter
Stressinduktion 37-38
Tab. 4: Verwendete Antikörper, numerische Zuordung der verwendeten
Probenansätze 54
Tab. 5: Mittlerer Arterieller Butdruck 67
Tab. 6: Oberflächenmarker Thrombospondin 67-68
Tab. 7: Oberflächenmarker CD 63 69
Tab. 8: Oberflächenmarker CD 62 70
Tab. 9: Aktivitätsmarker Plättchenfaktor 4 70-71
Tab. 10: Aktivitätsmarker β- Thromboglobulin 71
Tab. 11: Anzahl der Thrombozyten 72
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
ACTH Adrenocorticotropes Hormon
ADP Adenosindiphosphat
Agg. Aggregabilität
AK Antikörper
AT III Antithrombin 3
BCS Behring Coagulation system
BSKE Befindlichkeitsskalierung anhand von Kategorien + Eigenschaftswörtern
β-TG Beta- Thromboglobulin
Ca²+ Kalziumionen
CD Cluster of Differentation
CTAD Citrat, Theophyllin, Adenosin, Dipyridat
CWCT Colour- word- conflict- test
DTS Dense tubular system
EDTA Äthylendiamintetraessigsäure
EIA Enzymimmunoassay
ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
7
FACSScan Fluorescence Activated Cell Scanner
FITC Fluoroscein-Isothiocyanat
FSC Forward Light Scatter
GAS Generalisiertes Anpassungssyndrom
GMP Granulamembranprotein
GP Glykoprotein
HHN Hypothalamus- Hypophysen- Nebennierenrinden- Achse
INR International normalized ratio
KHK Koronare Herzkrankheit
LOT Chargen- Nummer
MAD Mittlerer Arterieller Druck
MMP Metalloprotease
MPV Mittleres Plättchenvolumen
NNH Nebennieren- Hypophysen- Achse
PBS Phosphate buffered saline
PDGF Platelet derived growth factor
PE Phycoerythrin
PECAM-1 Platelet endothelial cell adhesion molecule precursor 1
PF4 Plättchen- Faktor 4
PFA Paraformaldehyd
PS Public speaking
PTT Partielle Thromboplastinzeit
PTCA Percutaneous transluminal coronary angioplasty
RR Blutdruck
SCS Surface connected open canalicular system
SSC Sideward Light Scatter
STAI State-Trait-Angstinventar
Tab. Tabelle
TAT Thrombin-Antithrombin
TF Tissue factor
TGF-β Transforming growth factor β
t-PA Tissue plasminogen activator
TSP Thrombospondin
TxB Thromboxan
TZ Thrombozytenzahl
vWF von- Willebrand Faktor
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1 Einleitung
Das Blutgerinnungssystem des Menschen stellt ein körpereigenes Schutzsystem dar,
welches effektiv dazu beiträgt, im Falle von Verletzungen Gewebeschäden zu
beheben und einen größeren Blutverlust zu vermeiden, sowie das intravasale Blut in
einem flüssigen Zustand zu halten. Dabei handelt es sich nicht um ein erworbenes,
sondern ein angeborenes System, welches über komplexe physiologische
Mechanismen gesteuert wird.
Dennoch kann die Hämostase bei schon geringer Fehlfunktion Ursache möglicher
Erkrankungen sein, wie z.B. von thrombembolischen Ereignissen bei einer
überschießenden Reaktion oder einer verstärkten Blutungsneigung bei verminderter
Funktion.
In der Ursachenforschung der heutigen „Zivilisationserkrankungen“, wie z.B. der
koronaren Herzkrankheit (KHK) wird der Hämostase bei der Entwicklung von
Gefäßverengungen durch Artherosklerose eine große Rolle zugeschrieben.
Als klassische Risikofaktoren für das Auftreten einer KHK gelten heute:
Bluthochdruck, Hyperglykämie, Hypercholesterinämie, Nikotinabusus sowie eine
familiäre Disposition (positive Familienanamnese) (Dorner und Rieder, 2004).
Auf gerinnungsphysiologischer Ebene zeigt sich bei kardiovaskulären Erkrankungen
eine Aktivierung des hämostatischen Systems, welches in der Pathogenese eine
wichtige Rolle spielt.
Psychischer Stress als weiterer Risikofaktor dieser Erkrankungen wird schon seit
Jahren diskutiert (Contrada, Leventhal & O’Leary, 1990), im Volksmund wurde dem
Myokardinfarkt sogar der Begriff der „Managerkrankheit“ zugeordnet. In der
sogenannten Whitehall- II- Studie konnte aktuell im Zeitraum von 1985 bis 2004 an
einer Zahl von über 10.000 Teilnehmern eine eindeutige Beziehung zwischen
Dauerstress und der Entwicklung einer KHK gezeigt werden (Chandola et al., 2008).
Die Auswirkungen von Stress auf die Gesundheit vollziehen sich auf zwei Ebenen:
Zum einen führt Stress gehäuft zu gesundheitsschädigenden
persönlichkeitsverändernden Verhaltensweisen wie Nikotinkonsum, und zum anderen
nimmt er direkt Einfluss auf Gewebe und Organe.
Zur Prophylaxe von Gefäßerkrankungen wird den betroffenen Patienten heutzutage
eine Änderung ihres Lebensstils angeraten. Dazu zählen nicht nur Gewichtsreduktion
9
durch Ernährungsumstellung und Steigerung der körperlichen Aktivität sowie eine
Nikotinkarenz, sondern auch der Aufbau eines harmonischen sozialen und beruflichen
Umfeldes zur Stressvermeidung (Blumenthal, 1997).
In Studien konnte gezeigt werden, dass eine Steigerung der Plättchenaggregation als
Zeichen einer Aktivierung des Gerinnungssystems in Stresssituationen auftritt
(Frimerman et al., 1997). Zudem wurde deutlich, dass Patienten mit Arterieller
Hypertonie und KHK über eine gesteigerte Plättchenaktivität verfügen (Markovitz,
1991).
In der bisherigen Studienlage wurde die direkte Reaktion von Thrombozyten gesunder
Probanden auf psychischen Stress hauptsächlich anhand von in das Blutplasma
freigesetzten Gerinnungsfaktoren beobachtet.
Mit der modernen Methode der Durchflusszytometrie ist es heutzutage möglich,
Oberflächenveränderungen direkt an den betroffenen Zellen zu messen, um so
direkte Veränderungen qualitativ und quantitativ zu beschreiben.
Um die in den bisherigen richtungweisenden Studien aufgebaute These, psychischer
Stress beeinflusse das Gerinnungssystem mit der Folge einer gesteigerten
Hämostase zu untermauern, nutzten wir die Durchflusszytometrie zur Beobachtung
einer eventuellen direkten Thrombozytenaktivierung unter psychischem Stress.
Bei gesunden Probanden wurde in dieser Studie der Zusammenhang zwischen
akutem Stressereignis und der Aktivierung der zellulären Hämostase unter
standardisierten Versuchsbedingungen beobachtet.
Dabei ist Stress interindividuell sehr unterschiedlich auslösbar und wird
unterschiedlich wahrgenommen. In der experimentellen Stressforschung gibt es viele
Methoden, um diesen zu induzieren und die körperlichen Reaktionen auf die
jeweiligen Stressoren zu messen.
In unserem Versuch wurde als Verfahren der Stressinduktion die freie Rede gewählt,
da sich diese Methode in Studien als effektiv bewiesen hatte (Al´Absi, 1997) und der
Proband keinerlei gesteigerter körperlicher Aktivität unterliegt.
Da der Vorgang der Blutgerinnung von äußeren und inneren Faktoren stark
beeinflusst wird, wurde versucht, in einem kontrollierten Design mit
Messwiederholung und möglichst weitgehender Standardisierung der
Versuchsbedingungen (Versuchsprotokoll, Tageszeit der Untersuchung,
Körperposition des Probanden, Methode der Probenentnahme und deren
Aufbereitung) Störfaktoren zu minimieren.
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Zusätzlich bearbeiteten die Probanden das State- Trait- Angstinventar in der Trait-
Version zur Untersuchung der generellen Ängstlichkeit.
Der Versuchsvorgang „öffentliche Rede“ bedeutet, dass eine Versuchsperson die
Aufgabe erhält, nach einer genau definierten Wartezeit frei über ein vorgegebenes
Thema zu referieren (siehe Kapitel drei). Dem Probanden wird dabei mitgeteilt, seine
Rede werde von anderen Personen (z.B. Professoren) beobachtet und beurteilt.
Diese können real zugegen sein oder z.B. der Versuchsperson nur suggeriert werden
(z.B. über eine Videoaufzeichnung) (Kirschbaum et al., 1993). Letztere Methode war
Grundlage dieser Forschungsarbeit.
Zur Einführung soll zunächst der Begriff „Stress“ definiert und einige Stressmodelle
exemplarisch vorgestellt, sowie vorausgegangene Studien dargestellt werden, die sich
mit Stress, dem Prinzip der freien Rede sowie psychischen Einflüssen auf die
Blutgerinnung befasst haben. Zum Verständnis der Veränderungen der
Thrombozytenaktivität unter dem Einfluss von Stress, wird zudem die Morphologie
und Physiologie von Blutplättchen beschrieben.
1.1 Stress
1.1.1 Der Begriff Stress
Stress ist ein in der heutigen Alltags- und Fachsprache sehr präsenter Begriff. Mit
diesem werden vielfältige Erfahrungen, Sichtweisen, Empfindungen und
Erklärungsmodelle verbunden.
Vom wissenschaftlichen Standpunkt aus wird der Begriff Stress als neutral betrachtet.
Ob er als negativ oder positiv erlebt wird, hängt von der Situation der Person ab, die
diesen erlebt und von den jeweiligen Möglichkeiten und Ressourcen, diesem zu
begegnen.
Der Begriff Stress wurde erstmals 1914 durch Walter B. Cannon in seinem Artikel
“The emergency function of the adrenal medulla in pain and major emotions”
beschrieben und durch die umfangreichen und richtungweisenden Arbeiten (über
1700 Arbeiten und 39 Bücher) des Mediziners Hans Selye (1936) bekannt und
geprägt.
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Cannon entwickelte zunächst das Modell der "Kampf- und- Flucht- Reaktion", nach
dem der Körper blitzartig durch die Herstellung einer „Flucht- oder
Angriffsbereitschaft“ auf Gefahrensituationen reagieren könne.
Als Ausgangspunkt beschrieb er die Auseinandersetzung eines Tieres mit einer
akuten Gefahr, zum Beispiel der Begegnung eines Fressfeindes oder eines
innerartlichen Aggressors.
Den Anstoß zur intensiveren Stressforschung gaben Beobachtungen und Ideen von
Selye, der 1926 im zweiten Jahr seines Medizinstudiums zum ersten Mal auf das
Problem einer stereotypen Reaktion auf belastende Aufgaben stieß. Er fragte sich,
warum Patienten mit höchst unterschiedlichen Krankheiten so viele einheitliche
Anzeichen und Symptome zeigen und definierte dieses Phänomen zunächst als
„Syndrom des Krankseins". Diesen Stresszustand beschrieb er später als ein
Generalisiertes Anpassungssyndrom (GAS, siehe 1.1.2.2.1). So reagiere der
Organismus auf unterschiedliche Belastungen mit unspezifischen Reaktionen (vgl.
Wilker 1994; Tewes 1996; Hennig 1998; Birbaumer & Schmidt 1999; Esch 2002).
Den Begriff Stress hatte Selye aus der Physik entlehnt, um die „unspezifische
Reaktion des Körpers auf jegliche Anforderung“ zu benennen. Stress beschreibt in der
Werkstoffkunde den Zug oder Druck auf ein Material (Spannung, Materialermüdung).
Überträgt man Selyes Theorie, die auf tierexperimentellen Kenntnissen beruht, auf
den Menschen, so können als Stressoren auch Ärgernisse, Anstrengungen und
Belastungen definiert werden, denen ein Individuum täglich ausgesetzt ist. Stress ist
damit die Reaktion auf solche Stressoren im Sinne von Anpassungen, aber auch
Anpassungsstörungen oder Anpassungszwängen, die zu psychischen und
physischen Belastungsreaktionen führen können (Selye, 1946).
Beachtlicherweise betrieb Selye schon 1936 Ursachenforschung und untersuchte
mögliche Mechanismen der Anpassungsreaktionen des Körpers. In seinem
Einachsenmodell schrieb er dem Hypothalamus und den Nebennieren eine
entscheidende Rolle zu.
Eine bedrohliche Situation veranlasst den Organismus zum Rückzug und zur
Energiekonservierung. Hierbei spielt die Sekretion von Cortisol eine wesentliche
Rolle, sowie die ablaufenden kognitiven Bewertungsprozesse und eine Aktivität im
limbischen System. In diesem Zusammenhang ist Selyes wesentliche Grundaussage
zu nennen, dass Stress eine unspezifische Reaktion ist, also ein typisches
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wiederkehrendes Muster, das bei sehr unterschiedlichen Formen der Stressoren
anzutreffen ist (siehe 1.1.2.2.1).
1.1.2 Stressmodelle
Im letzten Jahrhundert bis heute wurde eine Vielzahl von Stressmodellen entwickelt.
Dabei werden die multifaktoriellen psychophysiologischen Anpassungsvorgänge
zusehends genauer beschrieben, die letztendlich auch unter anderem das System der
Blutgerinnung beeinflussen.
Zur weiteren Verständlichkeit sollen hier exemplarisch einige Konzepte und Modelle
vorgestellt werden.
Mason (1975) teilte die durch ihn beschriebenen Stresskonzepte in drei Klassen ein:
1.1.2.1 Stimulus- Konzepte
Die Definition von Stress erfolgt durch die Umgebungsbedingungen. Stressoren
werden klassifiziert (Janke, 1974; Lazarus & Folkmann, 1989; Margraf et al, 1991).
Da es eine Vielzahl von Stimuli unter experimentellen Bedingungen gibt und diese
unterschiedlich differenzierbar sind, lassen sich Ergebnisse nur gering
standardisieren, wodurch die Vergleichbarkeit beeinträchtigt wird.
1.1.2.2 Reaktions- Konzepte
Stress wird über die Reaktion eines Organismus und über das Verhalten einer Person
definiert.
Hierzu zählt nach Mason die Theorie des „Generalisierten Anpassungssyndroms“
(GAS; Selye, 1936) mit Stress als Manifestation in einer unspezifischen
physiologischen Reaktion des Organismus auf Reize:
1.1.2.2.1 Allgemeines Adaptationssyndrom nach Selye
Die Stressreaktionen des GAS bestehen nach Selye aus drei Phasen:
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der Alarmreaktion, der Widerstandsphase und der Erschöpfungsphase (siehe
Abbildung 1).
Abb. 1: Generalisiertes Anpassungssyndrom nach Se lye
(Quelle: Hennig, 1998, S. 73)
Diese Theorie beschreibt, dass nach Einwirken eines Stressors auf den Körper dieser
in seiner Alarmreaktion zunächst in einer Schockphase reagiert, beschrieben durch
eine sinkende Stressresistenz. Diese ist gekennzeichnet durch eine sympathische
Erregung und damit einer erhöhten Konzentration an Noradrenalin und Adrenalin.
In der folgenden Gegenschockphase erreicht der Körper temporär seinen
Normalzustand, anschließend ist er in der Lage, dem Ausgangsstressor, in der
Abbildung 1 dargestellt als durchgezogene Linie, bis zu einem bestimmten Zeitpunkt
Widerstand zu leisten. Diese Resistenzphase ist physiologisch gekennzeichnet durch
eine Erhöhung des Zuckerstoffwechsels, eine Steigerung der Empfindlichkeit der
Gefäßmuskulatur für Katecholamine, der Dämpfung von Schilddrüsen- und
Sexualfunktionen, sowie der Ausschüttung von ACTH und Corticosteroiden.
Persistiert der Ausgangsstressor, so kann der Körper seinen Widerstand nicht
aufrecht erhalten und er erschöpft. Zu diesem Zeitpunkt können körperliche Schäden
auftreten, zudem sinkt die Resistenz gegenüber weiteren Stressoren bis auf ein
Minimum ab, nur in der Gegenschockphase (gestrichelte Linie in der Abbildung)
besteht eine kurzfristig erhöhte Resistenz.
Diese Erschöpfungsphase kann in einem Zusammenbruch der Reproduktions- und
Wachstumsfunktionen sowie der Infektionsabwehr resultieren, eine
Energiemobilisierung ist nur noch kurzzeitig möglich. Anatomisch zeigt sich eine
14
Vergrößerung der Nebennieren und die Bildung von gastralen Ulcera wird in dieser
Phase beobachtet (Hennig, 1998).
Nach Selye gibt es zwei Möglichkeiten der Entstehung von Krankheiten im
Zusammenhang mit dem Generalisierten Anpassungssyndrom:
Schädigung durch mangelnde Adaptation (z.B. Entwicklung eines gastrointestinalen
Stressulcus) oder Schädigung durch überschießende Adaptationsreaktionen (z.B.
Entwicklung einer arteriellen Hypertonie).
1.1.2.2.2 Zweikomponentenmodell nach Pinel
Der Biopsychologe John P. J. Pinel entwickelte 1993 unter Einbeziehung der
Bedeutung des sympathischen Nervensystems ein Zweikomponentenmodell, nach
welchem sich der Körper zum einen über eine hypophysengesteuerte Regulation,
zum anderen dazu parallel über das autonome Nervensystem auf Stressreaktionen
vorbereitet (siehe Abbildung 2).
Abb. 2: Zweikomponentenmodell nach Pinel
(modifiziertes Mehrachsenmodell von Sachar, 1980) ,
(Quelle: in Anlehnung an Hennig, 1998, S. 73)
Stress bewirkt eine Stimulation des Hypophysenvorderlappens und dadurch eine
vermehrte Ausschüttung von adrenocorticotropem Hormon (ACTH), welches weiterhin
eine Ausschüttung von Glucocorticoiden aus der Nebennierenrinde (NNR) stimuliert.
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Parallel dazu erfolgt zeitgleich eine Aktivierung des sympathischen Nervensystems
mit gesteigerter Freisetzung von Adrenalin aus dem Nebennierenmark (NNM) und
Noradrenalin aus Nervenendigungen des Sympathikus. Die Aktivierung wird durch
das Limbische System und den Hypothalamus gesteuert.
1.1.2.3 Interaktionsmodelle
Stress wird als Wechselwirkung zwischen einem Organismus und einem Stimulus,
bzw. einer Person mit seiner Umwelt gesehen. Ein wichtiger Vertreter dieser Gruppe
ist das Interaktionsmodell nach Lazarus:
1.1.2.3.1 Kognitiv- transaktionaler Ansatz von Laz arus (1966)
Dieser beschreibt in der Kritik an Selyes Modell Stresssituationen als komplexe
Wechselwirkungsprozesse zwischen den Anforderungen der Situation und der
handelnden Person.
Er differenziert nach der Frage, ob das Individuum glaubt, die Situation kontrollieren
zu können oder ob die Gefahr höher eingeschätzt wird als die eigenen Kräfte. In
diesem Modell werden Persönlichkeitsfaktoren sowie Variablen der Situationsdeutung
als wichtige vermittelnde Größen berücksichtigt.
Primär bewertet die Person also die Situation subjektiv in ihrer Bedrohlichkeit.
Sekundär beurteilt sie, über welche Ressourcen sie zur Bewältigung der Situation
verfügt. Zur Stressbewältigung dienen laut Lazarus vier Bewältigungsarten:
Informationssuche, direkte Handlung, Unterdrückung von Handlungen und
intrapsychische Prozesse. Nach deren Anwendung wird die Situation jeweils neu
beurteilt.
Manche Menschen können für einen bestimmten Stressor höchst unterschiedlich
anfällig sein. Bedeutsam für den Stressgehalt einer Situation oder eines Ereignisses
sind aber nicht die objektiven Merkmale dieser Situation, sondern die Gedanken,
Empfindungen und Überlegungen der davon betroffenen Person. Ein Reiz ist nicht
deshalb stressend, weil er, wie Selye annahm, eine bestimmte Intensität übersteigt,
sondern er wird erst durch die subjektiven Wahrnehmungen und Bewertungen dessen
der ihn erlebt, zu einem Stressreiz.
16
Heute bezeichnet Lazarus seine Theorie als „cognitive- motivational- relational
theory“. Motivational bedeutet dabei, dass Handeln, Fühlen und Denken generiert
werden (Lazarus, 1991).
1.1.3 Die öffentliche Rede („Public Speaking“)
In zahlreichen Versuchen hat sich das Prinzip der öffentlichen Rede als Mittel der
Stressinduktion bewährt. Maßnahmen zur Stressbewältigung können dadurch
untersucht oder als Therapie gezielt erlernt und beübt werden.
Öffentliches Sprechen führt zu erhöhter Erregbarkeit und gesteigerter
Selbstaufmerksamkeit und löst dadurch soziale Ängste aus (Schwarzer, 1993). Durch
die vermeintliche Beteiligung der Öffentlichkeit und Bewertung der eigenen Leistung
durch Dritte, kann sich ein Gefühl der Selbstwertbedrohung einstellen (Hamilton,
1975). Die Kombination aus Angst und zeitgleicher Leistungsbeanspruchung führt
schon vor Redebeginn zu deutlichen physischen und psychischen Veränderungen
(Boucsein und Wendt- Stuhl, 1980).
In der Forschungsarbeit lässt sie sich als Instrument der experimentellen
Belastungssituation standardisiert einsetzen. Aufgrund der Bewertungsangst des
Probanden und der Anforderung, die Selbstkontrolle vor einem vermeintlichen
Publikum zu behalten, entspricht das Prinzip der öffentlichen Rede eher den
Stresssituationen des alltäglichen Lebens als die nur kognitiven oder
psychomotorischen Stressoren (Gerritsen et al., 1996; Al´ Absi et al., 1997).
Erstmalig wurde das Prinzip des „Public Speaking“ durch Janke 1977 experimentell
genutzt (Erdmann, Janke und Bisping, 1984) und wurde seitdem weiterentwickelt.
In vielen Studien hat sich das Prinzip der öffentlichen Rede als ein sehr intensiver
Stressstimulus erwiesen, und es hat sich gezeigt, dass dieser sowohl auf physischer
Ebene hämodynamisch (Blutdruck, Herzfrequenz, elektrodermale Spontanaktivität
u.a.) (Erdmann et al., 1984; Baumann et al., 1992; Kirschbaum et al., 1993) und
endokrinologisch (siehe Kapitel 1.1.4), als auch auf psychischer Ebene (Reduktion
der Selbstsicherheit, Angst, Ärger, Erregung) (Erdmann, 1983; Baumann et al., 1992)
zu starken Reaktionen führen kann.
Erdmann et al. konnten 1984 demonstrieren, dass Public Speaking im Vergleich zur
Gabe eines Schmerz- oder eines Lärmreizes zu deutlich stärkeren physiologischen
17
Veränderungen führt. Al´ Absi (1997) demonstrierte dies im Vergleich mit dem „Mental
Arithmic- Test“ (Kopfrechnen- Test).
1.1.4 Endokrinologische Veränderungen durch öffentl iche Rede
Mehrere Untersuchungen haben sich bisher mit den endokrinologischen
Veränderungen unter Public Speaking befasst.
Nachfolgende Tabelle soll einen Überblick über erfolgte Studien und deren
richtungweisende Ergebnisse geben:
Messzeitpunkt Kortisol ACTH Adrenalin Noradrenalin Quelle
nach PS ↔ ↑ Taggart et al., 1973
direkt vor PS ↑ ↑ Levine et al., 1985
3 Minuten nach
Redebeginn
15 Minuten nach
Redebeginn
↑ ↔
↑ ↑
Dimsdale & Moss, 1980
vor der Rede
nach Abschluß der
Rede
↑
↑ ↑
↑ ↑
Bolm- Audorff et al., 1986
vor Redebeginn
während Rede
nach Rede
↑
↑ ↑
↓
↑
↑
Voigt, 1994
nach PS und
Kopfrechnen
↑
↑ Kirschbaum et al., 1993
nach PS ↑ ↑ Al´ Absi et al., 1997
vor PS
nach PS
↑ ↑
↑
↔ ↔
Bassett et al., 1987
nach PS ↑ Gerritsen et al., 1996
nach PS ↑ ↑ ↑ Hennig, 2000
nach PS ↑ Rohrmann, 1998
18
Tab. 1: Zusammenfassung der endokrinen Veränderun gen unter Öffentlicher Rede
PS: Public speaking, ACTH: adrenocorticotropes Horm on, *=Speichel, **=Urin, ↔ = keine
Veränderung, ↓ = Abnahme, ↑ = Zunahme
Bisherige Studien zeigen, dass insbesondere das sympatho- adrenerge System und
die Hypothalamus- Hypophysen- Nebennierenrindenachse unter öffentlicher Rede
aktiviert werden. Dabei kommt es unmittelbar vor der Rede zu Anstiegen des
Adrenalins (Voigt, 1994, Bassett et al., 1987, Levine et al., 1985) und des
Noradrenalins (Dimsdale & Moss, 1980), welche eine Blutdrucksteigerung und
Tachykardie zur Folge haben (Moss, & Wynar, 1970).
Dieser Adrenalinspiegel fällt jedoch in einigen Untersuchungen während der Rede
wieder ab (Voigt, 1994; Dimsdale & Moss, 1980; Taggart et al., 1973). Anschließend
ist nur noch ein erhöhter Noradrenalinspiegel feststellbar (Taggart et al., 1973).
Abweichend zu diesen Ergebnissen findet sich bei Bassett et al. (1987) kein Anstieg
des Noradrenalins und bei den untersuchten Probanden in der Studie von Bolm-
Audorff et al. (1986) ließ sich noch nach der Rede eine deutlich erhöhte Konzentration
an Adrenalin nachweisen.
Bassett et al. (1987) und Gerritsen et al. (1996) beschreiben erhöhte Cortisolspiegel
schon während der Redevorbereitung. In der Antizipationsphase, damit circa in den
fünf Minuten nach Bekanntgabe der Aufgabe des Probanden, wird durch Bassett et al.
(1987) ein erniedrigter Noradrenalin-/ Adrenalin- Quotient festgestellt.
Zusammenfassend muss davon ausgegangen werden, dass zu diesem Zeitpunkt das
sympathoadrenerge System und das Hypothalamus- Hypophysen-
Nebennierenrinden- System (Bassett et al., 1987) aktiviert sind.
Die Betrachtungen des Adrenocorticotropen Hormons (ACTH) zeigen, dass schon
vor dem eigentlichen Redebeginn Ausschüttungen von ACTH erfolgen (Voigt, 1994;
Hennig, 2000).
Gerritsen et al. (1996) sowie Bassett et al. (1987) wiesen einen in der
Antizipationsphase erhöhten Cortisolspiegel im Speichel nach. Einen weiter erhöhten
Spiegel zu Ende der Rede wurde durch May (1989), Gerritsen et al. (1996), Hennig
(2000), Voigt (1994), Kirschbaum et al. (1993) und Al´Absi et al. (1997) beschrieben.
Die Stresshormonausschüttung verändert sich bei wiederholter Stressexposition. So
zeigt sich nach erstmaliger öffentlicher Rede der zuvor beschriebene Anstieg von
19
Adrenalin, Noradrenalin und Cortisol, während bei wiederholter Rede nur noch eine
gesteigerte Katecholaminantwort festgestellt wird (Hennig, 2000; Bassett et al., 1987).
Durch Wiederholung der öffentlichen Rede und der damit beginnenden Gewöhnung
an die Stresssituation kommt es zu einem Rückgang von Angst und
Situationsunsicherheit, ein gleichzeitiger Rückgang der Aktivität der NNH- Achse wird
beschrieben (Erdmann & Voigt, 1995; Hennig, 2000):
Nach erstmaligem Public Speaking zeigt sich der Anstieg in Kortisol, ACTH, Prolaktin,
Adrenalin und Noradrenalin. Bei wiederholtem Public Speaking kommt es lediglich zu
einer erhöhten Katecholaminantwort, Werte von Kortisol, ACTH und Prolaktin bleiben
unbeeinflusst.
Erdmann & Voigt (1995) schließen daraus, dass die HHN- Achse eher auf emotionale
Funktionen (Angst, Situationsunsicherheit) reagiere.
Der Grund für die Aktivierung dieser Systeme kann in der Bereitstellung von
Energiereserven zur Bewältigung der anstehenden Aufgabe und der kognitiven
Belastung gesehen werden. Adrenalin sei eher assoziiert mit psychischer
Anstrengung, Noradrenalin eher mit physischen Anstrengungen (Fibiger et al., 1984;
Bassett et al., 1987). Dies könnte eine Erklärung dafür sein, warum das Adrenalin in
der Vorbereitungsphase auf ein Maximum ansteigt und während der Rede abfällt, der
Noradrenalinspiegel sich jedoch noch während der Rede erhöht.
1.2 Das thrombozytäre System
Mit dem Begriff Hämostase wird das komplexe Zusammenspiel von Prozessen,
Geweben, Zellen und löslichen Substanzen verstanden, durch das die Fließfähigkeit
des Blutes und seine Gerinnbarkeit nach Verletzungen an jedem Ort und zu jeder Zeit
gewährleistet wird. Dies ermöglicht die Wiederherstellung von Gefäß- und
Gewebestrukturen. Hämostase lässt sich nicht allein als ein Kaskadensystem
erklären, sondern stellt vielmehr ein komplexes Netzwerk dar, nämlich ein
Zusammenspiel von Blutgefäßen, Blutströmung, Blutplättchen und anderen Blutzellen
sowie den löslichen Gerinnungsproteinen.
Die gebräuchliche Untergliederung der Hämostase in ein exogenes oder extrinsisches
System einerseits und ein endogenes oder intrinsiches System andererseits ist primär
didaktisch motiviert. Was in den Schemata getrennt dargestellt wird, verläuft in vivo
20
wesentlich verzahnter und zeitlich enger bis hin zur Nichttrennbarkeit (v. Depka
Prondzinski, 2002).
Das unmittelbare Abdichten eines Gefäßes nach Verletzung gelingt durch einen
schnell ablaufenden Mechanismus, der als primäre Hämostase bezeichnet wird. Von
wesentlicher Bedeutung ist dafür die Interaktion aus Vasokonstriktion,
Endothelreaktion sowie Plättchenadhäsion und –aggregation. Zugleich wird die
plasmatische Gerinnung als sekundäre Hämostase aktiviert, die entscheidend die
Verfestigung eines Thrombus durch Fibrin bestimmt.
Im Sinne der oben beschriebenen Grundsätze eng verzahnter Systeme darf diese
Einteilung jedoch nicht strikt angewandt werden, da ihr Zusammenspiel durch
zahlreiche Faktoren, wie z.B. der Beschaffenheit der unterschiedlichen
Gefäßabschnitte und der Blutströmung beeinflusst wird.
Die Aktivierung zirkulierender Thrombozyten ist Teil des zellulären
Hämostaseprozesses. Zirkulierende Thrombozyten erzielen durch Interaktionen mit
der subendothelialen Matrix (Adhäsion) und untereinander (Aggregation) eine
schnelle Abdichtung der verletzten Gefäßwand und des zerstörten Endothels.
Diese Wechselwirkungen werden durch adhäsive Glykoproteine der Plättchen
vermittelt.
Thrombozyten können auch direkt an aktiviertes Endothel anbinden.
Thrombozytenadhäsion und –aggregation an rupturierten arteriosklerotischen Plaques
lösen eine Thrombusbildung aus und sind somit entscheidend an der Entstehung von
Herzinfarkten und Schlaganfällen beteiligt.
Neben den Kernprozessen der Hämostase und Thromboseentstehung sind
Thrombozyten an weiteren wichtigen physiologischen und pathologischen Prozessen
beteiligt. Sie sind spezialisierte Zellen der innaten Immunabwehr, werden von
Leukozyten mit in entzündetes Gewebe getragen und sind an der hämatogenen
Metastasierung von Tumoren beteiligt.
1.2.1 Thrombozytenmorphologie
Die kernlosen Thrombozyten sind die kleinsten zellulären Elemente des Blutes.
Gebildet werden sie durch Abschnürung aus den Megakaryozyten des Knochenmarks
(Dodds & Kaneko, 1989) unter Einwirkung des Wachstumsfaktors Thrombopoeitin.
Jede dieser größten aller Knochenmarkszellen bringt etwa 500 Thrombozyten hervor.
Die mittlere Lebensspanne eines menschlichen Blutplättchens liegt bei ca. 10 Tagen,
21
seine Halbwertszeit bei etwa 70 Stunden (Hofbrand et al, 1997). Alte Plättchen
werden im reticuloendothelialen System der Milz und Leber durch
Gewebemakrophagen entfernt. Ungefähr ein Drittel aller Thrombozyten sind
normalerweise in der Milz gespeichert. Dieser stationäre Anteil befindet sich im
ständigen Austausch mit dem Blut.
Die Plättchenkonzentration im zirkulierenden Blut liegt zwischen 150 und 350 x 109 /l.
Unter der Annahme einer Überlebenszeit von 10 Tagen, einer Konzentration von 250
x 109 /l und 5 Liter Blutvolumen, beträgt die tägliche Produktion ca. 250 x 109
Thrombozyten.
Im unstimulierten Zustand weisen sie eine diskoide Form mit einem Durchmesser von
1-3 µm, ein durchschnittliches Zellvolumen von 4-8 fl und ein Gewicht von etwa 10 pg
auf (siehe Abbildung 3).
Abb. 3: Elektronenmikroskopische Aufnahme ruhende r, unstimulierter
Thrombozyten (Quelle: Universitä t Heidelberg)
Nach Stimulation der Plättchen kommt es durch Ausstülpung der Plasmamembran
und des offenen kanalikulären Systems zur Bildung von Pseudopodien. Das offene
kanalikuläre System besteht aus gewundenen Kanälen, die bis weit ins Innere der
Zelle reichen und mit der Plasmamembran verbunden sind. Durch Porenöffnungen
sind sie vom Extrazellulärraum aus zugänglich (Gawaz, 2001).
22
Abb. 4: Elektronenmikroskopische Aufnahme ruhende r, stimulierter
Thrombozyten (Quelle: Universitä t Heidelberg)
Ultrastrukturell lassen sich vier morphologische Bereiche des Thrombozyten
unterscheiden (siehe Abbildung 5):
1.2.1.1 Periphere Zone Sie besteht aus der Zytoplasmamembran und den verschiedenen darauf befindlichen
Glykoproteinen, Proteinen und Mukopolysacchariden, welche zusammengenommen
die Glykokalix bilden. Die Zytoplasmamembran selbst besteht aus einer
Phospholipiddoppelschicht, in die Membranproteine eingelassen sind, welche
Rezeptoren für Agonisten wie ADP, Thrombin oder spezielle Adhäsionsproteine sein
können. Hier hat die Signalübertragung in die Plättchen hinein ihren Ursprung.
1.2.1.2 Strukturelle Zone Dieser Bereich setzt sich aus verschiedenen Strukturproteinen zusammen, den
submembranös gelegenen Mikrotubuli sowie den Aktin- und Myosinfilamenten. Diese
Strukturproteine sind an der Formveränderung des ruhenden diskoiden Blutplättchens
in die aktive Form mit Ausbildung von Pseudopodien und der
Oberflächenvergrößerung beteiligt.
1.2.1.3 Zone der Organellen Dazu gehören die im Zytoplasma vorkommenden Mitochondrien, der Golgi-Apparat,
Ribosomen und plättchenspezifische Granula. Die Plättchengranula werden unterteilt
in dichte Granula, α-Granula und Lysosomen und dienen als Speicherort für Proteine
und andere Substanzen, die für die Plättchenfunktion essentiell sind.
23
Die α-Granula sind mit einem Durchmesser von 100-180 nm die größten
Thrombozytenorganellen mit vielfältigen Inhaltsstoffen. Im nicht aktivierten
Thrombozyten liegen sie zentral, durch Zytoplasma voneinander getrennt.
Die elektronendichten Granula zeichnen sich durch ihren elektronendichten Inhalt aus.
In den lysosomalen Granula sind saure Hydrolasen gespeichert. Einen Überblick über
die Inhaltsstoffe gibt Tabelle 2.
1.2.1.4 Membransystem Das Membransytem setzt sich aus dem offenen kanalikulären System („surface
connected open canalicular system“, SCS) und dem dichten tubulären System
(„dense tubular system“, DTS) zusammen. Das SCS ist über Kanäle mit der
Plasmamembran verbunden und bietet zusätzliche Membrankapazität bei Aktivierung
und Oberflächenvergrößerung.
Darüber hinaus können Granula durch Verschmelzung mit dem SCS ihre Inhaltsstoffe
in den Extrazellulärraum abgeben. Das DTS, ein Abkömmling des rauhen
endoplasmatischen Retikulums, ist einer der Hauptspeicherorte für freie Kalziumionen
(Ca²+), welche ab einer bestimmten Konzentration im Zytoplasma Formveränderung
und Degranulierung des Thrombozyten auslösen (Kehrel, 2003).
Abb. 5: Thrombozytenmorphologie (modifiziert nach Gawaz, 1999)
24
Dichte Granula α- Granula Lysosomen
ATP ADP Calcium Magnesium Serotonin Phosphat Guaninnukleotide Thromboxan A2
Adhäsive Proteine: Fibrinogen Fibronectin Thrombospondin Glykoprotein IIb-IIIa P-Selectin (CD 62) Vitronectin von-Willebrand-Faktor Cytokin-ähnliche Moleküle β-Thromboglobulin Plättchenfaktor 4 Enzyme: α1-Antitrypsin α2-Antiplasmin α2-Makroglobulin C1-Esterase-Inhibitor Koagulationsfaktoren: Faktor V Faktor IX Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (PAI-1) Plasminogen Protein S Wachstumsfaktoren: Platelet derived growth factor (PDGF) Transforming growth factor β (TGF-ß)
Saure Hydrolasen: α-Arabinoside β-Galactosidase β-Glucusonidase Kollagenase Elastase Protein CD 63
Tab. 2: Inhaltsstoffe der thrombozytären Speicher granula
(modifiziert nach Gawaz 1999; Reuter, 1992)
1.2.2 Thrombozytenfunktion
Wie unter 1.2 erwähnt, erfüllen Blutplättchen eine Vielzahl physiologischer Aufgaben.
Hier soll die Hauptfunktion der Thrombozyten, die Beteiligung bei der Hämostase mit
abschließender Bildung eines Thrombus, detaillierter betrachtet werden.
Dies läuft in mehreren charakteristischen Phasen ab:
Plättchenaktivierung, Degranulation/ Aktivierung, Adhäsion, Formwandel,
Plättchenaggregation und Retraktion (siehe auch Abbildungen 6-8).
25
Abb. 6: Plättchenaggregation mit nachfolgender Th rombusbildung
(Quelle modifiziert nach http: / www.med.monash.edu.au, Stand Mai 2006)
1.2.2.1.1 Plättchenaktivierung und Adhäsion
Die Plättchenadhäsion ist der erste Schritt in dem mehrstufigen Prozess der
Hämostase. Mit spezifischen Membranproteinen erkennen die Plättchen bei
Gefäßverletzungen die Adhäsionsproteine der freigelegten subendothelialen Matrix
und bedecken diese.
Auf die Adhäsion folgt die Aktivierung. Sobald eine Bindung an einen
korrespondierenden Plättchenrezeptor erfolgt, wird über die Plasmamembran ein
Signal induziert, das das Plättchen aktiviert. Die Plättchenaktivierung kann durch
verschiedenartige mechanische und biochemische Stimuli ausgelöst werden.
Die Wichtigsten sind: Thrombin, Kollagen, ADP, Thromboxan A2, Adrenalin, Matrix-
Metalloprotease (MMP) 2, Serotonin, Immunkomplexe, Komplementfaktoren,
Vasopressin, Plasmin, gewebsspezifischer Plasminogenaktivator und Streptokinase
(B. Coller, 1990).
Die Aktivierung beginnt mit dem Anbinden der Agonisten, dem Quervernetzen von
Rezeptoren oder mit Veränderungen der Plättchenmembran.
Die Plättchenaktivierung ist assoziiert mit der Stimulierung von verschiedenen
Stoffwechselwegen, dem Formwandel der Plättchen, der Aktivierung des
Glykoproteinrezeptorkomplexes GPIIb/IIIa, die die Bindung von Fibrinogen und damit
26
die Aggregation ermöglichen und der Induktion des prokoagulatorischen Zustandes
der Plättchen.
Das aktivierte Plättchen setzt ADP, Serotonin und Thromboxan A2 frei. Diese geben
den Reiz – zusammen mit anderen Agonisten – zu der Aktivierung weiterer
Blutplättchen (Kehrel, 2003).
Die Adhäsion der Plättchen an Kollagen, dem Hauptprotein der subendothelialen
Matrix, spielt eine entscheidende Rolle in der primären Hämostase (Kehrel, 1995).
Wichtigster Adhäsionsrezeptor ist der GPIa/IIa- Komplex, auch α2β1-Integrin genannt.
Unter statischen Bedingungen (offene Wunde), oder bei Einwirkung nur geringer
Scherkräfte binden Plättchen direkt über GPIa/IIa an Kollagenfasern. Das
Quervernetzen des GPIa/IIa-Komplexes mit anderen GPIa/IIa-Komplexen auf dem
Thrombozyten führt zur Plättchenaktivierung.
Bei Aktivierung der Plättchen werden GPIIb/IIIa-Komplexe aktiv. Über die Bindung an
Fibrinogen kann sich das Plättchen dann auf der verletzten Oberfläche ausbreiten und
an andere Plättchen binden.
1.2.2.2 Formwandel und Degranulation
Gleichzeitig mit ihrer Aktivierung verlieren die Thrombozyten ihre diskoide Form und
bilden über eine Aktivierung der Myosin- und Aktinelemente im Thrombozyten
Pseudopodien aus (siehe Abbildung 4 und Abbildung 6). Mit Hilfe des Zytoskeletts
werden Granula bei der Plättchenaktivierung zentralisiert und ihre Inhaltsstoffe
ausgeschüttet.
Zusammen mit dem adhäsiven Membranglykoproteinkomplex GPIIb/IIIa und seinem
Bindungspartner Fibrinogen entsteht eine Gerinnselretraktion, die dem Blutpfropfen
Festigkeit verleiht.
27
Abb. 7: Formveränderung eines aktivierten Thrombo zyten (Gawaz, 1999)
Zur Freisetzung der Granulainhaltsstoffe werden diese zunächst aus dem Zellinneren
in die Peripherie an die Thrombozytenmembran transportiert, anschließend
verschmelzen sie mit der Granulamembran und es erfolgt die Ausschüttung des
Inhaltes.
Plättchensekretionsprodukte haben grundsätzlich eine verstärkende Wirkung auf die
Plättchenaktivierung, sie fördern in erster Linie die Adhäsion. Die Inhaltsstoffe der
elektronendichten Granula fördern vorwiegend die Thrombozytenaggregation. Die
Aktivierung der Thrombozyten führt zu einer vermehrten Dichte von
Oberflächenrezeptoren wie etwa des Fibrinogenrezeptors GP IIb-IIIa, der sich in
erheblicher Zahl in der Membran des offenen kanalikulären Systems befindet. Der
GPIIb-IIIa-Rezeptor kann eine Vielzahl von unterschiedlichen Matrix- und
Plasmaproteinen binden. Der wichtigste Ligand ist dabei das Fibrinogen. Über
Bindung mit Fibrinogen an das Thrombospondin des Subendothels sorgt der GPIIb-
IIIa-Rezeptor für eine irreversible Thrombozytenverankerung am Ort der
Endothelläsion (siehe auch 1.2.2.1).
Als weiterer bei Aktivierung exprimierter Oberflächenrezeptor sei beispielhaft das P-
Selectin (CD 62) aus den α-Granula genannt, welches neben dem oben genannten
28
Thrombospondin und dem Glykoprotein 53 (CD 63) durch uns als Aktivierungsmarker
durchflußzytometrisch bestimmt wurde (siehe Kapitel Material und Methoden). Bei der
Fusion der Granulamembran mit der Zytoplasmamembran kommt es zu einer
Inkorporation von Komponenten der Granulamembran in die Zytoplasmamembran.
Dies führt u.a. zur Exposition von P- Selectin (Glykoprotein GMP-140, CD62), das aus
den α-Granula stammt und als Adhäsionsrezeptor fungiert. Das P-Selektin beeinflusst
die Interaktion des aktivierten Thrombozyten mit neutrophilen Granulozyten und
Monozyten (Ware & Coller, 1995; Scharf, 1997).
1.2.2.3 Plättchenaggregation und Retraktion
Als Aggregation wird die Anlagerung weiterer Thrombozyten an die subendothelial
gebundenen Thrombozyten bezeichnet.
Von den umgebenden Zellen werden Thrombozytenagonisten sezerniert, so unter
anderem ADP und Thromboxan A2. Diese fördern die Bildung reversibler
Thrombozytenaggregate. Der stärkste Agonist der Plättchenaggregation ist neben
Kollagen das Thrombin. Durch diese vermittelt bilden sich unter Anwesenheit von
Kalziumionen Fibrinogen- Brücken zwischen den Glykoproteinrezeptoren IIb-IIIa
verschiedener Thrombozyten. Nur aktivierte Thrombozyten sind in der Lage, lösliches
Fibrinogen zu binden. Auf der Oberfläche eines ruhenden Plättchens befinden sich
etwa 40000 bis 50000 Moleküle des GP IIb/IIIa- Komplexes. Die Anzahl der Komplexe
wird durch die Fusion der α-Granula mit der Plasmamembran noch erhöht. Die
reversiblen Aggregate werden so im Zusammenspiel mit plasmatischen
Koagulationsfaktoren und in Abhängigkeit des initialen Reizes der
Endothelschädigung in irreversible Aggregate überführt, die letztendlich der
Ausbildung von festen Fibrinbrücken zwischen den einzelnen Zellen dienen.
Im Rahmen der Thrombozytenaktivierung findet auch eine Aktivierung der
plasmatischen Gerinnungskaskade statt. Nach der klassischen Kaskadentheorie der
Blutgerinnung werden verschiedene Gerinnungsfaktoren sequenziell aktiviert, was zur
Bildung des Prothrombinase- Komplexes (FXa/FVa), zur Bildung von aktivem
Thrombin und schließlich zur Fibrinpolymerisierung führt.
Nach der klassischen Vorstellung werden zwei Aktivierungswege (intrinsisches bzw.
extrinsisches System) unterschieden (siehe auch 1.2). Nach heutigen Vorstellungen
verläuft die Blutgerinnung nicht über zwei parallel verlaufende Aktivierungswege,
sondern findet als eine zeitliche Abfolge von drei nacheinander folgenden
29
Gerinnungsphasen statt. In der Startphase der Blutgerinnung kommt es durch die
Endothelverletzung zu einer Interaktion von im Blut zirkulierendem aktiven Faktor VII
mit dem in der Gefäßwand lokalisierten Gewebsthromboplastin (tissue factor, TF). Der
Faktor VII/TF-Komplex führt zur Aktivierung von Faktor X und zur Bildung kleiner
Mengen von Thrombin. In der Vorbereitungsphase ist dieses initial gebildete Thrombin
in der Lage, die molekularen und zellulären Voraussetzungen zur Bildung großer
Mengen von Thrombin zu schaffen.
In der anschließenden Propagationsphase findet auf der Oberfläche aktivierter
Thrombozyten eine effiziente Bildung von Thrombin statt, die schließlich zur
Entstehung eines Thrombus führt (Monroe et al., 2002).
Abb. 8: Funktionen des Thrombozyten bei der Hämos tase (Quelle: B. Kehrel, 2003)
1.2.2.4 Thrombozytenmembranproteine
Wie zuvor beschrieben werden bei Aktivierung der Thrombozyten Membranproteine
exprimiert, die im ruhenden Zustand nicht auf der Membran vorhanden sind.
Dabei handelt es sich um Glykoproteine, bzw. Glykoproteinrezeptoren.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde exemplarisch die Dichte folgender Membranproteine
nach Markierung mit monoklonalen Antikörpern durchflusszytomertrisch als Marker für
die Aktivität der Thrombozyten bestimmt :
30
1. P- Selectin aus der α-Granula, synonym CD 62, GMP-140
(Granulamembranprotein 140) oder PADGEM (platelet- activation- dependent-
granuleexternal- membran),
2. Glykoprotein 53, synonym CD 63, das hauptsächlich in den elektronendichten
Granula und den Lysosomen der Thrombozyten lokalisiert ist und
3. Thrombospondin- 1 (TSP).
Um die quantitative Bestimmung und damit einen möglichen Rückschluss auf den
Aktivierungsgrad der Plättchen zu erhalten, nutzt man Antikörper, die mit den
Membranproteinen Reaktionen eingehen.
Bereits wenige Sekunden nach Stimulation der Thrombozyten mit Thrombin, findet
eine Umverteilung der Membranproteine aus der Granulamembran auf die
Zytoplasmamembran statt.
Tschöpe et al. (1993) konnten bereits durch submaximale Thrombinstimulation (0,2
U/ml) in vitro die Zunahme an aktivierten Thrombozyten und die Abnahme der
ruhenden Thrombozyten nachweisen.
Daraus ergab sich die Möglichkeit, die Thrombozyten entweder als nicht aktiviert
(Marker-negativ) oder als aktiviert (Marker-positiv) zu klassifizieren und somit deren
jeweilige prozentuale Verteilung in einer Thrombozytenpopulation anzugeben (siehe
Material und Methoden).
1.2.2.4.1 CD 62 P (GMP-140, P-Selectin, PADGEM)
Der am häufigsten untersuchte Antikörper gegen α- Granula- Proteine auf der
Thrombozytenoberfläche ist P- Selectin (CD62P). Der monoklonale Antikörper anti-
CD 62 (clone CLB-Thromb/6) bindet sich an Epitope eines α- Granula-
Membranproteins mit der internationalen Antigenklassifikation CD 62. Dieses 140-
Kilodalton Protein gehört zur Genfamilie der Selektine und befindet sich bei ruhenden
Plättchen in der Membran der α-Granula, konnte aber auch in Membranen der d-
Granula, in den Palade- Weibel- Körperchen von Endothelzellen und in Zellen des
lymphatischen Gewebes nachgewiesen werden (Metzelaar et al., 1991a; Nurden und
Nurden, 1993).
Nach Plättchenaktivierung kann es an der Oberflächenmembran nachgewiesen
werden. CD 62 setzt sich aus 789 Aminosäuren zusammen und ragt mit seinem
31
größten Anteil aus der Zellmembran heraus, besitzt aber zusätzlich auch eine
transmembranöse und eine zytoplasmatische Domäne. CD 62 wird im weiteren
Verlauf nicht wieder ins Zytosol aufgenommen (Collins et al., 1993).
Als „Shedding“ bezeichnet man das Phänomen, dass sich Leukozyten an stark
aktivierte CD 62 positive Thrombozyten vermehrt anlagern. Dies tritt vornehmlich bei
chronischen Aktivierungsreizen auf und kann folglich eine quantitative Analyse mittels
monoklonaler Antikörper verfälschen (Tschöpe et al., 1988; Tschöpe, 1991).
CD 62 bindet an verschiedene Leukozyten- Subtypen, wie neutrophile Granulozyten
und Monozyten und vermittelt auch Interaktionen zwischen Endothelzellen und
Leukozyten (Furie et al., 1991). Insbesondere nach schweren Gefäßtraumata scheint
CD 62 ein verlässlicher und schneller Marker für die Plättchenaktivierung zu sein.
Auch im Rahmen akut- ischämischer Ereignisse ließ sich eine signifikante Zunahme
der Expression von CD 62 nachweisen (Inoue et al., 1996; Kolarov et al., 1996).
1.2.2.4.2 CD 63 (Glykoprotein 53)
Der monoklonale Antikörper anti-CD 63 (clone CLB-gran 12) ist gegen Anteile eines
hauptsächlich lysosomal sezernierten Proteins mit der internationalen
Antigenklassifikation CD 63 gerichtet.
Das Glykoprotein wiegt 53 Kilodalton, besteht aus 237 Aminosäuren und besitzt vier
transmembranöse Regionen (Metzelaar et al., 1991b; Azorsa und Hildreth, 1995).
Es ist in der Membran der thrombozytären Lysosomen lokalisiert und kann nach
erfolgter Sekretion dieser auf der Plasmamembran der Thrombozyten nachgewiesen
werden (Niewenhuis et al., 1987). Obwohl die exakte gerinnungsphysiologische
Funktion von CD 63 bislang nicht vollständig aufgeklärt wurde, wird angenommen,
dass CD 63 eine wichtige Rolle bei der Adhäsion der Thrombozyten an
Gefäßwanddefekte und bei der Bildung von Thrombozytenaggregaten spielt
(Chesebro et al, 1997).
Tschöpe et al. (1997) konnten mit dem monoklonalen Antikörper AK 2.28 bei Typ-1-
Diabetikern mit thrombembolischen Komplikationen eine im Vergleich zu Typ-1-
Diabetikern ohne Komplikation signifikant gesteigerte Thrombozytenaktivierung
anhand CD 63 nachweisen. Im Vergleich zu Gesunden war CD 63 um das 3,8fache
gesteigert.
32
1.2.2.4.3 Thrombospondin- 1
Das 450 Kilodalton schwere Glykoprotein aus der Gruppe adhäsiver Makromoleküle
kann mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers anti-Thrombospondin-1 (clone P10), der
sich gegen das Epitop des menschlichen Thrombospondinmoleküls richtet, dargestellt
werden (McLaren, 1983; Clezardin et al., 1986; Legrand et al., 1988).
Thrombospondin ist ein wichtiger Kofaktor der Blutgerinnung, besonders der
Thrombozytenaggregation. In-vitro-Studien ergaben, dass monoklonale
Thrombospondin-1 -Antikörper die Thrombozytenaggregation hemmen (Boukerche et
al.,1988) und dass die Zugabe von Thrombospondin oder dessen carboxy- terminalen
Ende die Aggregation stimulieren (Tuszynski et al., 1988; Dorahy et al., 1997). Es kommt überall in der Extrazellulärmatrix vor und kann mit einer Vielzahl von
Bindegewebsproteinen Verbindungen eingehen. Im Ruhezustand der Plättchen sind
nur wenige oder keine Thrombospondinmoleküle auf der Oberfläche nachweisbar.
Der Hauptanteil ist zu diesem Zeitpunkt in den α- Granula gespeichert, in denen es
mit 25% den quantitativ stärksten Proteinanteil darstellt. Durch
Thrombozytenaktivierung wird Thrombospondin sezerniert und in einer Calcium-
abhängigen Reaktion über seinen Rezeptor Glykoprotein-IV an die Plättchenmembran
gebunden. Es stabilisiert die Brückenbildung zwischen GP IIb-IIIa und Fibrinogen und
damit den Zell- Zell- Kontakt.
In der Literatur wurde eine erhöhte Expression von Thrombospondin bei Patienten mit
länger bestehendem Diabetes mellitus ohne diabetische Mikroangiopathie und bei
Inselzell- Antikörper- positiven Verwandten von Patienten mit Diabetes mellitus (2,8-
fache Erhöhung gegenüber der Norm) gezeigt, wobei Thrombospondin vermutlich vor
allem eine andauernde Thrombozytenaktivierung anzeigt (Tschöpe et al., 1997).
Auch im Rahmen akut-ischämischer Ereignisse mit nachfolgender
Koronarangiographie (PTCA) und bei Patienten mit Multiorganversagen im Rahmen
eines septischen Geschehens konnte eine signifikante Vermehrung der
Thrombospondin- Expression gezeigt werden (Kolarov et al., 1996).
33
1.2.2.5 Plättchenspezifische Proteine
Die hier beschriebenen plättchenspezifischen Proteine Plättchenfaktor 4 und ß-
Thromboglobulin werden bei Aktivierung aus den Granula der Thrombozyten
freigesetzt und in das Blutplasma abgegeben, wobei sie die Blutgerinnung
beeinflussen.
Ihre quantitative Bestimmung lässt Rückschlüsse auf den Grad der
Thrombozytenaktivierung zu.
1.2.2.5.1 Plättchenfaktor 4 (PF 4)
Plättchenfaktor 4 ist ein plättchenspezifisches Protein und wird von aktivierten
Thrombozyten aus den α-Granula ausgeschüttet, in denen es seit der Bildung in den
Megakaryozyten gespeichert vorliegt. PF 4 ist ein Tetramer mit einem
Molekulargewicht von 32 Kilo- Dalton. Seine Konzentration im Blut beträgt 4-10 µg/ l
bzw. 0-5 IU/ ml. Nach Aktivierung der Plättchen in vitro steigt die PF 4- Konzentration
im Plasma um das 10- 50fache an (Walz, 1984).
In vivo wird PF 4 gleichfalls durch Thrombin und andere Plättchenaktivatoren, wie
Kollagen, ADP, Immunkomplexe sowie erhöhte Scherkräfte freigesetzt und dann
rasch mit einer Halbwertszeit von ca. 20 min reversibel an Glukosaminoglykane an
der Oberfläche der Endothelzellen gebunden.
PF 4 besitzt eine sehr hohe Affinität zu Heparin, welches in besonders hoher
Konzentration in Gewebsmastzellen im perikapillären Bindegewebe vorkommt.
Zusammen mit seinen niedermolekularen Spaltprodukten aktiviert Heparin das die
Gerinnung hemmende Antithrombin. PF 4 unterstützt somit durch seine hohe Affinität
zu Heparin die Thrombinbildungsrate. Endothelzelldefekte können dadurch schnell
gedeckt werden. Dieser Reparaturprozess ist aber auch pathophysiologisch von
Bedeutung, weil rezidivierende Endotheldefekte via Plättchenanlagerung und
Freisetzung von proliferationsinduzierenden Faktoren aus Plättchen zu einer
Proliferation von glatten Muskelzellen der Gefäßwand mit Einlagerung in die Intima
führen. Dies entspricht dem Initialstadium der Arteriosklerose.
34
1.2.2.5.2 ß-Thromboglobulin (ß-TG)
ß- Thromboglobulin ist ein Protein und Abbauprodukt des Platelet Basic Protein. Es
verhält sich ähnlich wie Plättchenfaktor 4. Es wird wie PF 4 in den Megakaryozyten
gebildet, in den α- Granula gespeichert und bei der Aktivierungsreaktion aus
aktivierten Plättchen freigesetzt.
ß-TG ist ebenfalls ein plättchenspezifisches Produkt (Niewiarowski et al., 1976) und
weist ein Molekulargewicht von 36 Kilo-Dalton auf (Taomoto et al., 1983).
Die bisher bekannte Funktion besteht in der Kontrolle verschiedenster
Regulationsmechanismen. Diese beinhalten proteolytische Prozesse von
Chemokinvorläufern, Oligomerformationen und rezeptorvermittelte Bindung an
neutrophile Granulozyten.
1.3 Veränderungen der Thrombozyten unter dem Einflu ss von Stress
Im Folgenden wird eine Übersicht über stressbedingte Veränderungen der
Thrombozyten unter den verschiedensten psychischen Stressbedingungen gegeben.
Diese Zusammenhänge wurden in vielen Studien untersucht, jedoch zeigen sich sehr
unterschiedliche Ergebnisse, da unterschiedliche Stressoren und auch sehr
unterschiedliche Arten und Zeiterfassungen der abhängigen Variablen vorgenommen
wurden.
Die Darstellung erhebt nicht den Anspruch auf Vollständigkeit, sondern dient dem
Überblick über die Vielzahl der verwendeten Stressinduktionen, den jeweils
gemessenen Thrombozytenparametern, des Untersuchungskollektivs und der
differierenden Ergebnisse.
Durch Känel et al. wurde 2001 eine Metaanalyse durchgeführt, die 86 Studien aus
den Jahren 1966 bis 2001 auswertete. Zusammenfassend zeigt sich, dass die
Mehrzahl der Studien sowohl eine Verstärkung der Blutgerinnung, als auch eine
Verstärkung der Fibrinolyse bei gesunden Menschen ohne Risikofaktoren als
Reaktion auf mentalen Stress aufweist. Als gerinnungsaktivierende Parameter wurden
erhöhte Blutgerinnungsfaktoren, wie z.B. Fibrinogen und von- Willebrandfaktor (vWF)
bestimmt, als fibriolytische Parameter z.B. D-Dimere. Kommt ein Risikofaktor wie eine
35
kardiovaskuläre Erkrankung hinzu, überwiegt in der Mehrzahl der Studien das
gerinnungsförderne gegenüber dem fibrinolytischen System. Die genauen
Interaktionen sind dabei noch nicht bekannt.
Stressoren aus der Umwelt einer Person haben nachgewiesenermaßen einen
Einfluss auf verschiedene Thrombozytenparameter wie Aggregation,
Thrombozytenanzahl und Mittleres Plättchenvolumen (MPV) (Joeckel, 2005, Thaulow
et al., 1991, Mundal & Rostrup, 1996, Zucker & Nachmias, 1985, Kaplan & Owen,
1986, Ludlam, 1994, Karpatkin, 1978a,b).
In Stresssituationen werden durch den Körper Kortisol und Katecholamine freigesetzt
(siehe auch Kapitel 1.1.4).
Die Verbindung zwischen erhöhtem Spiegel der zirkulierenden Katecholamine
(Dimsdale & Moss, 1980a,b) und Thrombozytenparametern ist bereits mehrfach
aufgezeigt worden (O`Brien, 1963, Ardlie et al., 1985, Hjemdahl et al., 1994, Mundal &
Rostrup, 1996, Lande et al., 1988, Larsson et al., 1989, Kjeldsen, 1988, Bierman et
al., 1952, Dawson & Ogston, Wadenwik & Kutti, 1987, Arkel, 1977).
Untersuchungen, die sich mit den Auswirkungen von Stressinduktion durch
Öffentliche Rede direkt auf die Thrombozyten befassen, gibt es bisher nur wenige. Die
direkte zelluläre thrombozytäre Aktivierung wurde nicht beschrieben.
1.3.1 Einfluss auf die Plättchenaggregation
Der Einfluss von mentalen Stressoren und psychosozialen Faktoren auf die
Plättchenaggregation ist schon lange Gegenstand der Forschung. Dabei wurden
verschiedenste Methoden mit differierenden Ergebnissen genutzt (Kamarck &
Jennings, 1991). Siehe dazu Tabelle 1.
So wurde mit Hilfe eines Filtrationssystems die Aggregabilität bestimmt
(Filtragometrie) und Fleischman, Bierenbaum und Stier berichteten 1976 über eine
erhöhte Aggregabilität während präoperativer Untersuchungen von Patienten.
Larsson et al. (1989a) zeigten eine erhöhte Aggregabilität nach dem „colour- word
conflict test“ (CWCT) im Vergleich zur Ausgangsmessung .
Als weitere Variante wurden Plättchen vor Messung ihrer Aggregation mittels
Agonisten wie z.B. ADP in vitro stimuliert. Gordon et al. zeigten so 1973 eine
vermehrte Aggregation bei Probanden während einer medizinischen Untersuchung.
Levine et al. konnten schon 1985 ähnliche Ergebnisse nach einer öffentlichen Rede
nachweisen. Im Gegensatz dazu stehen die Ergebnisse von O`Brien et al. (1972) und
36
Haft & Arkel (1976), die nach einer Operation beziehungsweise nach einer
öffentlichen Rede eine verminderte Plättchenaggregation in vitro feststellten.
Als weitere Methode wurden Konzentrationen der Plättchensekretionsprodukte
gemessen. Auch diese Untersuchungen ergaben widersprüchliche Ergebnisse.
Eine Zunahme der Konzentration der Plättchensekretionsprodukte β-Thromboglobulin
(β–TG), PF-4, ADP oder Thromboxan B2 (TxB2) zeigte sich nach, beziehungsweise
während öffentlicher Rede, nach Abspielen eines angstinduzierenden Films, unter
Kältestress, dem „colour word conflict test“, nach Adrenalininfusion, insulininduzierter
Hypoglykämie, nach Lösen einer arithmetischen Aufgabe, während der
Stresssituation eines Examens oder einer Operation. (Levine et al., 1985, Arkel et al.,
1977, Malkoff et al., 1993, Naesh et al., 1993, Patterson et al., 1994, Tomoda et al.,
1999, Grignani et al., 1992, Patterson et al., 1995, Trovati et al., 1986, Mest et al.,
1982, Naesh et al., 1985, Musumeci et al., 1987).
Im Gegensatz dazu wiesen andere Autoren keine Veränderungen des β–TG oder PF-
4 nach (während/nach CWCT, Lärmstress: Larsson et al., 1989b, Naesh et al., 1993,
Andrén et al., 1983, Naesh et al., 1985) oder es zeigte sich eine Verminderung des
ADP (nach öffentlicher Rede: Haft & Arkel, 1976), bzw. des des β–TG (nach dem
„hand cold pressor test“ bei Diabetikern: Maiello et al., 1988).
Die Untersuchungsergebnisse differieren nicht nur im Hinblick auf die
Untersuchungsmethoden zum Nachweis der Aggregation, sondern auch teilweise in
den Ergebnissen bei gleich verwendeten Stressinduktionen.
So stellen 1985 Levine et al. nach öffentlicher Rede Zeichen einer
Thrombozytenaktivierung im Sinne einer Erhöhung der Sekretionsprodukte β-TG und
PF4 fest. Die Konzentrationen von β-TG und PF4 wurden jedoch erst fünf Tage nach
der Stressinduktion durch die öffentliche Rede untersucht. So ist fraglich, ob es einen
unmittelbaren Effekt des Public speaking gegeben hat.
Gegensätzlich zeigen sich die Ergebnisse von Arkel et al. (1977), die nach öffentlicher
Rede eine erhöhte Konzentration von ADP und ATP in den Thrombozyten im Sinne
einer verminderten Aggregabilität feststellten. Sie führten dies auf die Ausschüttung
von insgesamt jüngeren Plättchen, die einen höheren ATP-Gehalt aufwiesen, zurück.
Differente Ergebnisse liegen auch für den „colour word conflict test“ vor. Larsson et al.
(1989b) sahen keine Veränderungen der β-TG- und PF-4-Sekretion, während Naesh
et al. (1993) nach dem CWCT einen erhöhten β-TG-Spiegel nachwiesen.
37
Patterson et al. (1995) und Grignani et al. (1992) nutzten die Induktion von mentalem
Stress durch fordernde Aufgaben im Kopfrechnen und wiesen dabei eine
Plättchenaktivierung nach. Bei Grignani et al. (1992) zeigten sich die Ergebnisse
jedoch nicht bei Gesunden, sondern bei Probanden mit essentieller Hypertonie.
Grignani et al. (1992) fanden bei gesunden Probanden im Vergleich zu Patienten
nach einem Herzinfarkt geringere Anstiege der Thrombozytenaggregation.
Die unterschiedlichen Ergebnisse der erwähnten Studien können auf Unterschieden
bei der Verwendung von in vivo-Techniken und in vitro-Techniken beruhen. Malkoff et
al. (1993) haben Vergleiche zwischen in vivo- und in vitro-Techniken zur Messung der
Thrombozytenaggregation mit dem Ergebnis durchgeführt, dass eine in vivo
gemessene vermehrte Aggregation der Thrombozyten nicht immer ausreichend in
vitro erfasst werden kann.
Eine Ausnahme hierzu bildet nach Malkoff et al. (1993) die Thrombozytensekretion, in
welcher sich in vitro-Techniken als adäquates Mittel zur Erfassung der
Thrombozytenfunktion zeigten.
Folgende Tabelle soll zusammenfassend exemplarisch Untersuchungsergebnisse
hinsichtlich thrombozytärer Veränderungen unter verschiedenen Stressinduktionen
darstellen:
Stressinduktion Probanden β-TG PF-4 ADP TZ Aggr. Quelle
Public
speaking
Medizin. Personal
↑ ↑ ↔ ↑ Levine et al., 1985
Public
speaking
Medizin. Personal
↓ Haft & Arkel, 1976
Public
speaking
Medizin. Personal
↑ ↓ Arkel et al., 1977
CWCT Gesunde ↑ Musumeci et al., 1987
CWCT Gesunde
↑ ↑ Malkoff et al., 1993 Patterson et al., 1994
CWCT
Adrenalin- Infusion
Gesunde ↔ ↔
↔ ↔
↑ ↑
Larsson et al., 1989
während CWCT Gesunde ↔ ↔ ↔ Naesh et al., 1993
38
nach CWCT ↑ ↓ Arithmetische
Aufgabe
Gesunde
↑ ↑ Patterson et al., 1994
Arithmetische
Aufgabe
Gesunde inform. uninform.
↑ ↑↑
Mundal & Rostrup, 1996
Arithmetische
Aufgabe
Gesunde Pat. mit Art. Hypertonie
↔ ↑
↔ ↑
Tomoda et al., 1999
Arithmetische
Aufgabe
Pat. mit Z.n. Myokard-infarkt
↑ Grignani et al., 1992
Examensstress Gesunde (Studenten)
↓ ↑ Mest et al., 1982
Kältestress Gesunde ↑ ↑ Patterson et al., 1995
Kältestress Gesunde ↑ Opper et al., 1995
„Hand cold
pressure Test“
Pat. mit KHK ↑
Fitchett et a., 1983
„Hand cold
pressure Test“
Pat. mit Diabetes
↓ Maiello et al., 1988
„Hand cold
pressure Test“
Gesunde Informiert uninformiert
↑ ↑↑
↔ ↔
Mundal & Rostrup, 1996
Lärm Gesunde ↔ ↔ Andrén et al., 1983
Insulininduzierte
Hypoglykämie
Gesunde ↑
↑
↑
Trovati et al., 1986
Adrenalingabe Gesunde ↑
↑
↑ Larsson et al., 1989
Adrenalingabe Gesunde ↑ Wallen et al., 1999
Tab. 3: Veränderungen unterschiedlicher Thrombozy tenparameter unter
Stressinduktion
β-TG = β- Thromboglobulin, PF 4 = Plättchenfaktor 4, ADP =
Adenosindiphosphat, TZ = Anzahl der Thrombozyten, Aggr. = Aggregabilität,
CWCT = „Colour word conflicttest“
↔ = keine Veränderung, ↓ = Abnahme, ↑ = Zunahme
39
1.4 Überleitung zur Fragestellung der vorliegenden Arbeit
Um die in den bisherigen richtungsweisenden Studien aufgebaute These, psychischer
Stress beeinflusse das Gerinnungssystem mit der Folge einer gesteigerten
Hämostase zu untermauern, nutzten wir die Durchflusszytometrie zur Beobachtung
einer vermuteten direkten Thrombozytenaktivierung unter psychischem Stress.
Bislang liegen zu wenige gut kontrollierte Humanstudien vor, die die direkte zelluläre
Plättchenaktivierung unter Stress beschreiben.
Des Weiteren wurde in zuvor erfolgten Versuchen die Induktion standardisierter
emotionaler Belastung, z.B. durch das Prinzip der freien Rede nur selten genutzt.
An dieser Stelle knüpft die vorliegende Arbeit an, sie thematisiert folgende
Erwartungen:
Stressinduktion mittels Public Speaking führt im Vergleich zu ähnlichen Situationen
ohne Stress bei gesunden Probanden zu
1. einer Aktivierung von Thrombozyten, gemessen durch die vermehrte Exprimierung
von Oberflächenmarkern (Thrombospondin, CD 62, CD 63) sowie der gesteigerten
Ausschüttung plättchenspezifischer Proteine (PF 4, ß-TG) und einem abfallenden
Aktivierungsniveau im Verlauf,
2. einer Zunahme negativer subjektiver Befindlichkeit der Probanden, sowie deren
Abnahme nach Ende der Stressinduktion und
3. einem Anstieg des Blutdruckes, sowie dessen Abfall nach Ende der
Stressinduktion.
40
2 Material und Methoden
2.1 Studienziel
Die Untersuchungen hatten zum Ziel, gesunde Probanden kontrolliert psychischem
Stress auszusetzen, um zu definierten Zeitpunkten abgenommenes Blut auf eine
physiologische Reaktion der Thrombozyten zu überprüfen.
Das entnommene Blut dieser Patienten diente als Grundlage für eine weitere
experimentelle prospektive Arbeit, die die Auswirkungen auf das plasmatische
Gerinnungssystem (Seifert, geb. Mess, Med. Diss. in Vorbereitung) untersucht.
2.2 Probanden
15 Männer und Frauen stellten sich für die Studie freiwillig zur Verfügung (siehe auch
soziodemographische Daten unter 3.1.1).
Sie wurden über mögliche Risiken und Komplikationen der Blutentnahmen und
Blutdruck (RR)- Messungen aufgeklärt. Sie wurden über die Möglichkeit, die
Teilnahme an der Studie jederzeit abzubrechen und die Einhaltung des
Datenschutzes unsererseits informiert. Das Studiendesign sowie die angestrebten
Forschungsziele sind vor Beginn der Studie der Ethikkommission der Universität
vorgelegt und von dieser bewilligt worden (01.03.2000, AZ 00-025). Die Probanden
gaben am Tage der Untersuchung an, sich körperlich und geistig gesund zu fühlen.
2.2.1 Ausschlusskriterien
Als Ausschlusskriterium galt das Vorliegen von angeborenen oder erworbenen
Gerinnungsstörungen, Thrombozytopenie und Plättchendefekten und die Einnahme
von gerinnungsbeeinflussenden Medikamenten innerhalb der letzten 14 Tage.
Weitere Ausschlusskriterien waren Erkrankungen des Herz-, Kreislaufsystems,
bekannte psychiatrische und psychosomatische Erkrankungen, angeborene oder
erworbene Stoffwechselstörungen, chronisch entzündliche Erkrankungen, akute
Infekte, maligne Erkrankungen und schlechter Venenstatus.
41
2.3 Versuchsaufbau und Ablauf der Stressinduktion
Ziel des Versuchaufbaus war es, eine reproduzierbare mentale Stresssituation zu
schaffen, diese anhand von objektiven Messungen (Blutdruck) und subjektiver
Einschätzung des Probanden (Fragebögen zur Befindlichkeit) zu verifizieren und zu
definierten Zeitpunkten Blutproben zu gewinnen, um diese unverzüglich
aufzuarbeiten.
Alle Probanden hatten zu zwei Terminen jeweils um 8.00 Uhr zu erscheinen.
Systematisch variierend um Positionseffekte auszuschließen wurden sie dabei am
ersten Tag entweder einer standardisierten Stresssituation ausgesetzt oder
durchliefen den Versuchsablauf ohne Stressinduktion. In diesem Fall folgte der
Stressversuch am zweiten Termin.
Zwischen beiden Versuchstagen lag ein Zeitabstand von mindestens drei Wochen.
Ausgelöst wurde die Stresssituation durch die Vorbereitung und Durchführung einer
freien Rede unter Videoaufzeichnung und vor angeblichem Publikum.
Die Probanden wurden zuvor nicht über die Durchführung dieser Rede informiert. Das
Ausmaß der Stressreaktion wurde regelmäßig über Veränderungen des Blutdruck-
sowie Pulsverhaltens und durch die Probanden mit Hilfe von zu bearbeitenden
Fragebögen nach ihrer subjektiven Stresswahrnehmung aufgezeichnet.
Die Versuche wurden stets in einem ruhigen Raum nach jeweils gleichem Schema zu
immer gleichen Uhrzeiten durchgeführt. Der Proband wurde angewiesen, während
des gesamten Ablaufes zu sitzen und größere körperliche Aktivität zu vermeiden.
Dazu saß er auf einem Schreibtischstuhl, mit dem er zu Redebeginn in die Mitte des
Raumes vor eine fest installierte Kamera sowie vor eine von dieser Seite
undurchsichtige Glasscheibe geschoben wurde.
Der Versuch gliederte sich in vier aufeinander folgenden Phasen (siehe Abbildung):
Phase I: 30 Minuten Ruhe
Phase II: 30 Minuten Vorbereiten einer Rede
Phase III: freie Rede
Phase IV: 30 Minuten Ruhe
42
Die jeweiligen Aufgaben wurden dem Probanden mit Hilfe von Instruktionsbögen zu
Beginn der Versuchsphasen mitgeteilt (siehe Anlagen).
Abb. 9: Schematische Darstellung des Versuchablau fs mit Stressinduktion durch
freie Rede
BSKE = Fragebogen „Subjektive Streswahrnehmung“,
STAI = Fragebogen „State- Trait- Angstinventar“
= Blutdruck-, Herzfrequenzmessung
= Beginn der Stressinduktion
Phase I:
Die erste Phase begann immer um acht Uhr morgens, um eine tageszeitliche
Schwankung der zu messenden Werte auszuschließen und diente der Entspannung
des jeweiligen Probanden. Sie dauerte 30 Minuten.
Zunächst wurde dem sitzenden Probanden am Unterarm eine Blutdruckmanschette
eines automatischen Messgerätes der Marke Dinamap angelegt.
Anschließend verblieb er in Ruhe, füllte einen soziodemographischen und einen
Fragebogen zur Selbstbeschreibung der allgemeinen Ängstlichkeit (STAI-G Form X2,
siehe 2.4) aus.
Alle Fragebögen werden im folgenden Abschnitt näher dargestellt und sind im Anhang
aufgeführt.
Der Proband hatte nun weiterhin die Möglichkeit, sich mit Hilfe von gestellter leichter
Literatur oder durch das Hören von beruhigender Musik zu Entspannen.
08:25 BSKE
Enstspannung/ Soziodemographischer
Fragebogen, STAI
Vorbereitung Redetext
08:55
Vortrag
Entspannung
09:45 Ende
09:00 Venenpunktion
09:40 Venenpunktion,
BSKE retrospektiv, BSKE
08:00 Beginn
08:30 Venenpunktion
43
Nach 25 Minuten wurde ihm ein weiterer Fragebogen ausgehändigt
(Befindlichkeitsskalierung anhand von Kategorien und Eigenschaftswörtern, BSKE 16
E), in welchem er seinen subjektiv derzeitig empfundenen psychischen Stress
beschreiben sollte.
Danach erfolgten Blutdruck (RR)- und Pulsmessung sowie die erste Blutentnahme
(siehe 2.5.1).
Abb. 10: Entspannungsphase
Phase II:
Bis zu diesem Zeitpunkt glaubte der Proband, sich nur entspannen zu müssen.
Ihm wurde nun zu Beginn der zweiten Phase - 30 Minuten nach Versuchsbeginn - ein
populärwissenschaftlicher Text mit dem Thema Entwicklungspolitik – „Der
ungedeckte Bedarf an Familienplanung“ (Spektrum der Wissenschaft, April 2000)
ausgehändigt. Er hatte 30 Minuten Zeit, diesen zu erarbeiten und sich auf eine
zehnminütige Rede vorzubereiten, in der er den Textinhalt klar präsentieren und seine
eigene Meinung zu dem Thema wiedergeben sollte. Hilfsmittel standen ihm keine zur
Verfügung, das Erstellen von Notizen blieb ihm untersagt. Weiterhin wurde auf eine
Beurteilung der Rede seitens qualifizierter Beobachter hinter der Mattglasscheibe und
durch die spätere Begutachtung des Videomaterials in Hinblick auf die Art der
44
Präsentation, wie Rhetorik, Mimik und Gestik, sowie inhaltliche Klarheit und
Richtigkeit hingewiesen.
In zehnminütigem Abstand erfolgten nun RR- und Pulskontrollen.
Nach 25 Minuten Vorbereitungszeit wurde bereits mit dem Aufbau von Scheinwerfern
und dem Einstellen der Kamera begonnen, um die Stressinduktion zu verstärken.
Am Ende der zweiten Phase wurde der Proband von seinem Vorbereitungsplatz aus
in die Raummitte geschoben, vor einer laufenden Kamera, einem Mikrophon und im
Scheinwerferlicht vor einer einseitig durchsichtigen Spiegelwand plaziert.
Phase III:
Zu Beginn der Rede wurde sofort die zweite Blutentnahme durchgeführt, die
Venenpunktionskanüle danach entfernt. Dieser Zeitpunkt hatte sich in Vorversuchen
als Moment der maximal induzierten psychischen Erregung gezeigt. Die Probanden
wurden vor Ablauf der Redezeit nicht unterbrochen, hatten die Möglichkeit ihre Rede
vollständig vorzutragen, um die aufgebaute Anspannung zu reduzieren.
Nach Abschluss erfolgte eine weitere RR- und Pulskontrolle.
Abb. 11: Freie Rede vor laufender Kamera
45
Phase IV:
Der Proband konnte sich wie in der ersten Phase entspannen, eine RR- und
Pulskontrolle erfolgte nach weiteren 30 Minuten. Zum Abschluß sollte er retrospektiv
mit Hilfe von Fragebögen (BSKE 16 E) die Stressbelastung unmittelbar zu
Redebeginn und seine derzeitige Befindlichkeit darstellen.
Im Kontrollversuch entfielen die Redevorbereitungszeit und die Rede.
Blutdruckmonitoring, Pulsmessung, Blutentnahmen und das Bearbeiten der
Fragebögen wurden durchgeführt. In Vorversuchen hatte sich gezeigt, dass das
Blutdruckverhalten während der Entspannungsphase kaum variierte, so dass wir uns
auf drei Blutdruckmessungen beschränkten, um den Probanden in seiner
Entspannung so wenig wie möglich zu stören (siehe Abbildung 12).
Abb. 12: Schematische Darstellung des Versuchabla ufs ohne Stressinduktion
BSKE = Fragebogen „Subjektive Streswahrnehmung“,
STAI = Fragebogen „State- Trait- Angstinventar“
= Blutdruck-, Herzfrequenzmessung
08:25 BSKE
Entspannung/ Soziodemographischer
Fragebogen, STAI
Entspannung
Entspannung
09:10 BSKE
09:45 Ende
09:00 Venenpunktion
09:40 Venenpunktion,
BSKE
08:00 Beginn
08:30 Venenpunktion
46
2.4 Fragebögen
Mit Hilfe von Fragebögen sind drei Kategorien erfasst worden:
1. soziodemographische Daten,
2. die allgemeine Ängstlichkeit,
3. die jeweilige Befindlichkeit der Probanden zu unterschiedlichen
Versuchszeitpunkten.
2.4.1 Soziodemographischer Fragebogen
Mit Hilfe dieses Fragebogens wurden soziologische Daten erfasst. Besonders wichtig
waren Kenntnisse über Schulabschlüsse und die derzeitige berufliche Tätigkeit.
Genutzt wurde ein im klinischen Alltag üblicher Bogen aus der Klinik für
Psychosomatik und Psychotherapie (siehe Anlage).
2.4.2 Befindlichkeitsskalierung anhand von Kategori en und Eigenschaftswörtern (BSKE)
Die BSKE wurde 1999 von Prof. Dr. W. Janke an der Universität Würzburg entwickelt
und uns freundlicherweise zur Nutzung zur Verfügung gestellt (Janke et al., 1999).
Es sind verschiedene Formen der Fragebögen mit unterschiedlichen Schwerpunkten
erhältlich.
Die von uns genutzte Form BSKE 16E (siehe Anhang) diente der mehrdimensionalen
Beschreibung des momentanen Befindens, bzw. retrospektiv des Befindens zu
Beginn der Rede.
Es werden 16 Emotionszustände, wie zum Beispiel das Gefühl der Besorgtheit oder
das Gefühl des Ärgers, vorgegeben. Anhand einer Skalierung hat der Proband die
Möglichkeit die Stärke des erlebten Emotionszustandes auszuwählen.
Die Auswertung und Interpretation erfolgte entsprechend den in beigefügten Tabellen
ersichtlichen Item-, Subtest- und Bereichsebenen. Negativ gepolte Items wurden
invertiert.
47
2.4.3 State-Trait-Angstinventar (STAI)
Beim STAI handelt es sich um die deutsche Adaptation des von Spielberger et al.
1970 entwickelten „State Trait Anxiety Inventory“ (Spielberger und Vagg, 1984),
welches im klinischen Bereich und in der experimentellen Angst- und Stressforschung
eingesetzt wird. Die zwei Skalen des STAI dienen der Messung von Angst als
Zustand (State-Angst, augenblickliche Gefühlslage, STAI-G Form X1) und als
Eigenschaft (Trait-Angst = Ängstlichkeit, allgemeine Gefühlslage, STAI-G Form
X2).
Die Trait- Angstskala stützt sich auf zwanzig Feststellungen, mit denen der Proband
beschreiben soll, wie er sich im Allgemeinen fühlt. Dreizehn Feststellungen sind in
Richtung Angst, sieben in Richtung Angstfreiheit formuliert.
Die State- Angstskala wurde nicht genutzt.
Das Trait- Modell beschreibt Ängstlichkeit als überdauerndes Merkmal. Diese
Ängstlichkeit bezieht sich auf relativ stabile interindividuelle Differenzen in der
Neigung, Situationen als bedrohlich zu bewerten und mit einem Anstieg der
Zustandsangst zu reagieren. Dieses Persönlichkeitsmerkmal liegt individuell
unbeeindruckt von der Zeit und Situation in unterschiedlicher Ausprägung vor.
Hochängstliche tendieren dazu, mehr Situationen als bedrohlich einzustufen und auf
solche Situationen mit einem höheren Zustandsangstanstieg zu reagieren als
Niedrigängstliche
Die Auswertung und Interpretation erfolgte durch die Bildung eines Summenwertes,
der das Ausmaß der Angst repräsentieren sollte. Dazu musste zunächst eine
Inversion der Feststellungen in Richtung Angstfreiheit vorgenommen werden.
2.5 Messung des Blutdrucks
Der Blutdruck (RR) wurde stets zu den definierten Messzeitpunkten (siehe 2.3) am
sitzenden Probanden am Unterarm mit einer Blutdruckmanschette eines
automatischen Messgerätes der Marke Dinamap gemessen. Dabei wurde
insbesondere der Mittlere arterielle Druck (MAD) bestimmt. Dieser liegt zwischen dem
systolischen und dem diastolischen Blutdruck. Er kann genau berechnet werden,
indem die Fläche unter der arteriellen Druckkurve gemittelt wird. Dies wird z.B.
48
während des Monitorings auf einer Intensivstation oder im OP berechnet und
angezeigt. Liegen nur der systolische und der diastolische Wert vor, dann kann der
MAD nach folgender Formel für periphere Gefäße grob geschätzt werden:
Formel 1 Errechnung des MAD
Zu sieben Messzeitpunkten (siehe 2.3) wurden im Stressversuch systolischer und
diastolischer Blutdruck sowie die Herzfrequenz gemessen. Diese Messungen wurden
so häufig durchgeführt, um über den ganzen Versuchsablauf die Kreislaufsituation
des Probanden zu beobachten. Im Kontrollversuch beschränkten wir uns aufgrund
einer stabilen Kreislaufsituation auf die Messung an drei definierten Messzeitpunkten.
Der Mittlere arterielle Druck spiegelte die Blutdrucksituation (Systole und Diastole) für
unsere Zwecke als alleiniger Wert suffizient wieder.
2.6 Gewinnung der Blutproben
Die Gewinnung des Blutes sowie dessen Aufarbeitung bedurften maximaler Übung
und Vorbereitung. Ziel war es, die Situation der Thrombozyten in vivo darzustellen.
Eine Thrombozytenaktivierung durch die Blutentnahme oder die spätere
Weiterverarbeitung des Blutes war deshalb unbedingt zu vermeiden.
2.6.1 Blutentnahme
An den drei definierten Zeitpunkten wurde das Blut grundsätzlich am sitzenden
Probanden entnommen, um eine eventuelle Thrombozytenaktivierung durch
hämodynamischen Stress während Belastung auszuschließen oder zu minimieren.
Für jede Punktion wurde eine neue Vene des Unterarmes gewählt, an dem zuvor
keine Blutdruckmessung durchgeführt worden war.
Um eine Stase und damit die oben genannte Aktivierung der Thrombozyten zu
vermeiden, wurde wenn möglich nicht, ansonsten nur gering und für kurze Zeit
gestaut (bei max. 40 mmHg). Wenn vorhanden wurde die Stauung vor der Entnahme
49
gelöst. Gängige Venenstimulationen durch Faustschluss, Beklopfen der Vene etc.
wurden unterlassen (Valet et al., 1993).
Genutzt wurde das Venenpunktionsbesteck „Venofix“ der Firma Braun (Luer Lock, 21
G, 0,8 x 20 mm). Dieses entspricht der Forderung nach einem großen
Innendurchmesser (0,8 – 1mm) bei kurzer Nadellänge (Valet et al., 1993) und ist
gleichzeitig einfach zu handhaben und unkompliziert zu beschaffen und es entspricht
einer in der Thrombozytendiagnostik üblichen Nadelgröße (Winther et al, 1992;
McNicol, 1996).
Entnommen wurden 1 x 9 ml Blut in Entnahmeröhrchen „Monovette“ der Firma
Sarstedt, gefüllt mit 1 ml 3,8%iger Natriumcitratlösung, sowie 2 x 2,9 ml in Röhrchen
mit 0,1 ml CTAD- Antikoagulans zur Thrombozytenstabilisierung (10% [Vol], CTAD:
Citrat, Theophyllin, Adenosin, Dipyridamol).
Dabei wurde auf eine Entnahme unter nur geringem Sog geachtet und die Proben nur
unter leichtem Schwenken vermischt.
Nach Entfernung der Nadel wurde sofort für mehrere Minuten ein kräftiger Druck auf
die Einstichstelle ausgeübt, um eine schnelle Blutstillung herbeizuführen.
2.6.2 Weiterverarbeitung des CTAD- Blutes
Die Weiterverarbeitung der Blutproben begann direkt nach den Blutentnahmen, indem
die Thrombozyten für die durchflusszytometrische Messung aus dem ersten CTAD-
Röhrchen in 2 ml Formaldehyd in ihrem Ist- Zustand fixiert wurden. Für die ELISA-
Bestimmung wurde das Blut des zweiten CTAD- Röhrchens sofort nach der Abnahme
in Eis gekühlt und innerhalb der nächsten Stunde weiterbehandelt und entsprechend
den Firmenangaben eingefroren.
2.7 Durchflusszytometrische Bestimmung thrombozytär er Membranglykoproteine
2.7.1 Prinzip der Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie ist eine Methode zur quantitativen und qualitativen
Bestimmung von Zellen in Suspensionen. Ursprünglich entwickelt als Alternative zur
50
mikroskopischen Analyse von einzelnen Zellen, hat sie in den letzten Jahren in der
klinischen Diagnostik und Forschung immer mehr an Bedeutung gewonnen.
Ein Durchflusszytometer wie das FACSScan (Fluorescense- Activated Cell Sorting)
identifiziert Zellen, die einzeln mit hoher Geschwindigkeit durch einen fokussierten
Laserstrahl fließen (siehe Abbildung 11).
Das dabei entstehende Streulicht und evtl. vorhandene Fluoreszens werden
gemessen. Unterschiedliche Zellarten, aber auch Oberflächenstrukturen oder DNA-
Gehalt können so identifiziert und differenziert werden. Auch in größeren
Populationen sind wenige auffällige Anteile messbar (Lovett et al., 1984).
Der Vorteil der Durchflusszytometrie liegt in ihrer Schnelligkeit, Selektivität und
Sensitivität. Gegenüber anderen immunologischen Methoden sind Aussagen über
einzelne Partikel möglich und Messung und Auswertung lassen sich zudem auf
Partikel beschränken, die bestimmte vorgewählte Kriterien erfüllen (Größe,
Lichtstreuung, Fluoreszensaktivität) (Marti et al., 2001).
Für unsere Versuche stand ein FACSScan der Firma Becton Dickinson im
Hämatologie Labor der Universitätsklinik Lübeck zur Verfügung.
Um Einzelmessungen von Partikeln geringer Größe zu ermöglichen, wird die
Suspension durch eine Düse mit geringem Durchmesser geleitet. Deren Öffnung wird
funktionell dadurch weiter verkleinert, dass die Zellen von einem laminar fließenden
Hüllstrom aus einer systemeigenen Flüssigkeit, der „Sheath Fluid“
(phosphatgepufferte Kochsalzlösung) umgeben und darin zentriert werden. Dadurch
wird die engste Stelle der Düse, an der die Messung vorgenommen wird, nur von
jeweils einem Messobjekt passiert.
Die Durchflussrate beträgt 12 ml/min, hat damit eine Strömungsgeschwindigkeit von
6m/sec in der Durchflussdüse. An diesem Punkt werden die Zellen mit
monochromatischem Licht aus einem luftgekühlten Argon- Laser mit einem
Emissionspektrum von 488 nm bestrahlt.
Bei der entstehenden Lichtstreuung wird zwischen der Seitwärtsstreuung („side angle
light scatter“, SSc) in einem Winkel von 90° zur Fl ießrichtung und der
Vorwärtssteuung („forward angle light scatter“, FSc) in einem Winkel von nur 0,5° in
Flussrichtung unterschieden (Marti et al., 2001).
51
Abb. 13: Schematischer Aufbau eines Durchflusszyt ometers.
Die Probe wird angesaugt und in einen zusätzlichen Hüllstrom eingebettet. Dieser sorgt
dafür, dass die Zellen möglichst einzeln an einem orthogonal eintreffenden Laserstrahl
vorbeigeführt werden. Beim Passieren des Laserstrahls entstehen zellcharakteristische
Lichtstreuphänomene, die als Vorwärts- und Seitwärtsstreuung registriert werden. Die
Anregung mit UV- Licht erlaubt zusätzlich die Registrierung von Fluoreszenzen
fluorochrommarkierter Antikörper auf der Zelloberfläche.
Die Seitwärtsstreuung wird durch die Oberflächenbeschaffenheit, Form und die
Inhaltsstoffe der Zelle beeinflusst. Je unregelmäßiger die Oberfläche, desto mehr
Licht wird zur Seite gestreut. Die Vorwärtsstreuung dient als Volumensignal.
Um aktivitätsabhängige Veränderungen, bzw. zellspezifische Oberflächenstrukturen
unterscheiden zu können, ist eine Markierung mit antikörpergebundenen
Fluoreszensfarbstoffen möglich. Um ein spezifisches Epitop exakt zu erfassen und
Detektor
Detektor
PE (475 nm)
Detektor
Laser
Detektor
FITC (510-560 nm)
Fluoreszenz
Seitwärtsstreuung (Granulation)
Vorwärtsstreuung (Zellgröße)
52
eine unspezifische Bindung zu vermeiden, wurden monoklonale Antikörper
verwendet.
Fluoreszenzlicht kann in verschiedenen Wellenlängenbereichen registriert werden,
wodurch eine Unterscheidung zwischen markierten und nicht markierten Zellen
möglich ist.
Als Farbstoffe wurden Phycoerythrin (PE) und Fluorescein- Isocyanat (FITC)
verwendet. Sie unterscheiden sich in den Absorptions- und Emissionsmaxima. Das
Fluoreszenzmaximum von PE liegt mit 575 nm im orangen Bereich, FITC absorbiert
hingegen in einem Wellenbereich von 460-519 nm und fluoresziert zwischen 510 und
560 nm im grünen Bereich. Die verwendeten Antikörper sind in 2.6.1. beschrieben
2.7.2 Präparation der Thrombozyten
2.7.2.1 Thrombozytenseparation
Zwei Milliliter des CTAD- Blutes dienten zur Erstellung einer
Thrombozytensuspension. Ziel dabei war es, möglichst die gesamte
Plättchenpopulation zu isolieren und zu fixieren, um einer Verfälschung durch in- vitro-
Lagerung vorzubeugen.
Eine im Ansatz von Tschöpe et al. (1988) entwickelte und von Valet et al. im III.
Düsseldorfer Protokoll zur Bestimmung von Aktivierungsmarkern auf Thrombozyten
(Valet et al., 1993; Ault und Mitchell, 1994; Zeller, 1999) beschriebene Methode diente
als Vorlage, wurde aber in der Durchführung verändert.
So wurden in Vorversuchen unter anderem Zentrifugationszyklen in Zeitdauer und
Intensität variiert, bis wir eine optimal konzentrierte Plättchensuspension gewinnen
konnten.
Die Probengewinnung war zeit- und arbeitsaufwendig, insbesondere da alle drei
Blutproben sofort nach ihrer Fixierung parallel weiterverarbeitet werden mussten.
53
Für die Präparation wurden folgende Materialien verwendet:
1. Phospat gepufferte Kochsalzlösung (PBS- Puffer ): 1,084 g KH2PO4 [Merck 4873 oder 12034], 4,51 g Na2HPO4 [Merck 6580],
4,51 g NaCl [Merck 6404] in 1 Liter Aqua dest.
2. 1%ige Paraformaldehydlösung: PFA reinst [Merck 4005, 011k13276505] in PBS, pH 7,2,
3. 3,8%ige Natriumcitratlösung = Waschlösung: tri-Natriumcitryt-Dihydrat [Merck 6448 oder 6447] in PBS.
4. Formaldehydlösung (37%, säurefrei),
Best.-Nr. 3999, Merck, Darmstadt, Deutschland
5. Rabbit-Serum, Best.-Nr. R-4504, Sigma, Steinheim, Deutschland
6. FACSFlow, Sheath-Fluid, Best.-Nr. 952003, Becton Dickinson,
Heidelberg, Deutschland
7. CaliBRITE, Beads zur Einstellung der Fluoreszenzkompensation,
Sensitivität und Justierung, Best.-Nr. 95-0002, Becton Dickinson
8. Waschlösung: 3,8% NaCitrat (tri- Natrium-Dihydrat), Best.-Nr. 6448, Merck
Die Lösungen 1-3 wurden selbst angesetzt.
Direkt nach der Blutentnahme wurden 2 ml aus dem CTAD-Röhrchen in 2 ml
Paraformaldehydlösung pipettiert und durch leichtes Schwenken vermischt.
Nach exakt 15 Minuten Einwirkzeit bei Raumtemperatur folgten Schritte zur
Separation der fixierten Plättchen aus dem Blut.
Dazu wurde die Lösung 5 min bei 800 Umdrehungen (116 g) zentrifugiert.
Zentrifugationen wurden grundsätzlich in einer Megafug 1.0 ohne Einsatz der Bremse
durchgeführt. Der dabei entstehende plättchenreiche Überstand wurde mit
großzügigem Abstand zu den abzentrifugierten roten und weißen Blutkörperchen mit
einer Pasteurpipette abpipettiert und ein zweites Mal für 5 min bei 2000 Umdrehungen
(700g) zentrifugiert. Dadurch konzentrierten sich die Blutplättchen auf dem Boden des
Reagenzglases und bildeten ein sogenanntes Pellet.
Der Überstand konnte vollständig abpipettiert und verworfen werden. Das Pellet
wurde vorsichtig mit 200 µl Kaninchenserum (Sigma, Lot 107H8409) und 1,8 ml
Waschlösung aufgemischt. Die im Kaninchenserum vorhandenen Immunglobuline
dienten der Blockade der thrombozythären Fc- Rezeptoren. Nach einer weiteren
Zentrifugation für 5 Minuten bei 2000 Umdrehungen (700 g), wurde das erneut
54
entstehende Pellet in 1 ml Waschlösung resuspensiert. Die nun entstandene
Suspension konnte zur Markierung mit Antikörpern genutzt werden. Um eine
standardisierte Konzentration zur Messung am Durchflusszytometer zu erhalten,
wurde die Thrombozytenkonzentration mit Hilfe eines Sysmex (KX-21, in
Vorverdünnung) gemessen und durch Zugabe von PBS- Lösung auf eine
Konzentration von 50.000 Thrombozyten pro Mikroliter eingestellt. Die Messung am
Sysmex diente gleichzeitig als Qualitätskontrolle, da sie eventuelle Verunreinigungen
mit Erythrozyten und Leukozyten anzeigt.
2.7.2.2 Markierung mit Antikörpern
Im Anschluss an die Separation erfolgte eine sofortige Markierung der Plättchen mit
Antikörpern.
Dazu wurden in sieben Reagenzröhrchen je 100 µl Plättchensuspension mit je 20 µl
von einer oder zwei Antikörperlösungen gemischt (siehe Tabelle 4) und anschließend
eine Stunde bei Zimmertemperatur im Dunkeln inkubiert.
Probenansatz Nr. Antikörper
1 ohne Antikörper
2 Maus IgG1-FITC + IgG1-PE
3 CD 41 PE
4 CD 41 FITC
5 Thrombospondin PE + CD 41 FITC
6 CD 62P FITC + CD 41 PE
7 CD 63 FITC + CD 41 PE
Tab. 4: Verwendete Antikörper,
numerische Zuordung der verwendeten Probenansätze
Die Antikörperlösungen stammten von der Firma Immunotech (Beckman Coulter
GmbH Diagnostics, 47807 Krefeld).
55
Probenansatz Nummer 1 diente einer ersten unspezifischen Messung von Zellen.
Probenansatz Nummer 2 diente einem Nachweis humaner Zellen. Die monoklonalen
IgG1-Antikörper der Maus binden unspezifisch an menschliche
Zelloberflächenantigene im peripheren Blut und an Geweben.
Ansatz Nummer 3 bis 7:
CD 41a als GP IIb/IIIa- Komplex der Thrombozyten ist sowohl auf aktivierten als auch
auf ruhenden Plättchen ausgebildet (McGregor et al., 1983 , Phillips et al., 1988; siehe
auch 1.2.2.4).
Dementsprechend wurde durch einen Nachweis dieser Rezeptorantigene in den
Ansätzen 3, 4, 5, 6, und 7 ein Vorliegen von Thrombozyten bewiesen.
Probenansatz Nummer 5, 6 und 7:
Die Antikörper spezifisch für Thrombospondin- 1, CD 62P und CD 63 binden an
aktivierte Thrombozyten, dienten als Marker der Gerinnungsaktivität (Legrand, 1988,
Johnston et al., 1987, de Bruijne-Admiraal et al., 1992, Nieuwenhuis et al., 1987, Ault,
2001; siehe 1.2.2.4).
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die markierten Suspensionen ein letztes Mal
gewaschen, um überschüssige Antikörperlösung zu entfernen. Dazu wurden in jedes
Röhrchen 1 ml Waschlösung gegeben, diese 5 min bei 2000 Umdrehungen (700 g)
zentrifugiert und genau 1 ml Überstand vorsichtig abpipettiert. Anschließend wurden
sie mit je 1 ml PBS- Lösung wieder aufgefüllt und konnten nun im
Durchflusszytometer gemessen werden. Die Verdünnung mit PBS- Lösung beugte der
Entwicklung von Thrombozytenaggregaten vor.
2.7.2.3 Messung am Durchflusszytometer und Analyse der Messwerte
Fluoreszenzfarbstoffe die an das Fc-Fragment von Immunglobulinen gekoppelt
werden und sich gegen spezifische antigene Epitope der Zelle richten, sind für die
durchflusszytometrische Zelldiagnostik geeignet. Je nach Konzeption des
Durchflusszytometers können bis zu fünf Eigenschaften (zwei Lichtstreuungen und
drei Fluoreszenzen) einer einzelnen Zelle gemessen werden. Durch die so genannte
5-Parameter LIST-MODE Datenaufnahme werden alle Eigenschaften einer Zelle
gespeichert. Jeweils zwei Eigenschaften einer Zelle können dann später miteinander
in Verbindung gesetzt werden. Durch das Definieren von Auswertefenstern („Gating“)
56
werden nur solche Zellen zur Darstellung zugelassen, die definierte Eigenschaften
aufweisen.
Die von den unterschiedlichen Detektoren aufgefangenen Signale werden verstärkt,
gemessen, digitalisiert, über eine Schnittstelle an einen Computer (Power Macintosh
7600) weitergeleitet und abgespeichert. Mit Hilfe einer von Becton Dickinson
bereitgestellten Software (Cell Quest, V 3.1f, 1997) können diese ausgewertet
werden.
Bei der Thrombozytenfluoreszenzfärbung werden monoklonale Antikörper verwendet,
die gegen definierte Epitope der Oberflächenmembran der Thrombozyten gerichtet
sind.
Zur Kontrolle des Anteils des unspezifisch gebundenen Fluoreszenzfarbstoffes wurde
eine Probe zusätzlich mit einem unspezifischen Antikörper (hier Mouse- IgG1 FITC
und PE) gefärbt.
Zur eindeutigen Unterscheidung der Thrombozyten von anderen Blutzellen, bzw.
Zelltrümmern diente die Markierung mit CD 41 Antikörpern (siehe 2.6.1.) und die
typischen Streulichtwerte (SSc, FSc) der Plättchen. Um die Analyse auf den Bereich
dieser Werte einzugrenzen, wurde ein bei jeder Messung individuelles Gate gesetzt,
eine definierte Region, in der jeder Parameter obere und untere Grenzwerte erhält.
Abb. 14: Setzen des Gates um eine Thrompozytenpop ulation,
x-Achse: FSC (Vorwärtsstreulicht), y-Achse: SSC (Se itwärtsstreulicht).
„Dot-Plot Darstellung“, Thrombozyten zeigen auf Grund ihrer Morphologie eine charakteristische Lichtstreuung
57
Abb. 15: Dot-Plot Darstellung einer Thrombozytenp opulation mit Nachweis einer
Expression von CD 41.
Der Antikörper CD41 erkennt die αIIb-Kette des thrombozytären Glykoproteins IIb-IIIa (Fibrinogenrezeptor).
Zusätzlich wurde ein Schwellenwert für die Vorwärtsstreuung festgelegt, um die
aufgenommene Menge an Störsignalen durch Zelltrümmer zu reduzieren.
Die gleichzeitige Messung zweier Farbstoffe brachte das Problem mit sich, dass sich
die Wellenlängenbereiche überlappen können. Ein Teil der FITC- Fluoreszenz ist so
langwellig, dass sie durch den Photodetektor für PE ebenfalls registriert wird.
Um die PE- Fluoreszenz mit einer ausreichenden Sensitivität messen zu können,
musste eine geringe durch FITC verursachte Stimulation in Kauf genommen werden.
Damit diese doppelte Registrierung aber möglichst gering ausfiel, bestand die
Möglichkeit der Kompensation. Dabei wurde von beiden betroffenen Photodetektoren
ein gewisser Prozentsatz der gemessenen Signale subtrahiert (Ault, 2001).
Diese Kompensation wurde am Gerät voreingestellt, bzw. individuell mit Hilfe der
Software nachreguliert.
Die beste grafische Darstellung ergab sich durch logarithmische Signalverstärkungen.
Gemessen wurden jeweils 10.000 Zellen, ca. 1000 Zellen pro Sekunde. Dazu musste
ggf. mit PBS nach verdünnt werden. Dieser relativ langsame Messmodus wurde
ausgewählt, um eine exakte Bestimmung der Fluoreszenz zu gewährleisten.
58
Die vorgegebene Geräteeinstellung lautete: FL1 = 680 log, FL2 = 565 log, wobei FL
für die Fluoreszenzkanäle steht. Die Grundeinstellungen für FSC betrug E00 log, für
SSC 375 log. Die Kompensation war auf FL-0,2% FL2 festgelegt.
Der FACSScan wurde einmal wöchentlich mit Mikrosphären von bekannter Größe und
Fluoreszenz kalibriert (CaliBrite Beads, Becton Dickinson Immunocytometry
systems).
Das Programm Cell Quest, V 3.1f (Becton- Dickinson) ermöglichte eine grafische
Darstellung der Messergebnisse in so genannten Dot Plots, den korrelierten
Zweiparameter- Punkthistogrammen. Dabei wurde die Fluoreszenz 1 gegen die x-
Achse und die Fluoreszenz 2 gegen die y-Achse aufgetragen. Die Signalauflösung
wurde logarithmisch verstärkt.
Erstellt wurden Einzelparameterhistogramme, welche die Zellzahl (counts) auf der y-
Achse gegen die Fluoreszenz oder Streulichtwerte illustrieren.
Abb. 16: Beispiel für ein Histogramm
x-Achse: Maß der Fluoreszenz pro Artikel, y-Achse: Ereignisse (Counts), R3: aktivierte Thrombozyten, CD41- FITC-positiv
Aufgetragen ist die Zellzahl gegen die FITC- Fluoreszenz
59
Die Zahl der im Gate gemessenen Thrombozyten wurde in Beziehung gesetzt mit den
antikörperpositiven Signalen. So errechneten sich Prozentwerte von rezeptorpositiven
Plättchen.
Es wurden die negativ markierten Zellen „ausgegatet“ und alle Zellen mit einer
Fluoreszenz, die darüber hinausging, als positiv bewertet.
Abb. 17: Ansatz mit Thrombospondin als Marker.
x-Achse: Maß der Fluoreszenz pro Artikel, y-Achse: Ereignisse (Counts), R2: Thrombospondin-positive Thrombozyten
2.8 Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)
2.8.1 Prinzip des ELISA
Ein Enzym- Immunassay (EIA) ist eine empfindliche und spezifische immunologische
Methode zur Bestimmung antigener Substanzen (Proteine, Hormone, Pharmaka u.a.)
in Flüssigkeiten, z.B. im Plasma. Es werden enzymmarkierte spezifische Antikörper
oder Antigene vom gleichen Typ wie das zu bestimmende Antigen verwendet. Ein EIA
kann unter anderem als ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) durchgeführt
werden.
Ein ELISA ist ein heterogener EIA, bei dem die gegen das zu bestimmende Antigen
gerichteten Antikörper an eine Trägersubstanz gebunden vorliegen. An die nach
60
Inkubation mit der Probe gebildeten Immunkomplexe lagern sich in einem
nachfolgenden Schritt zugefügte, mit einem Enzym markierte Antikörper an
(Sandwichmethode). Durch Zugabe eines chromogenen Substrats zum
Reaktionsansatz wird eine enzymatische Farbreaktion ausgelöst, die photometrisch
gemessen werden kann. Die Antigenkonzentration in der Probe wird durch Vergleich
mit Standardreihen bekannter Antigenkonzentration ermittelt. Dabei ist die
Antigenkonzentration proportional zur Enzymaktivität (Lane et al., 1986).
2.8.2 Durchführung des ELISA
Zwei Milliliter des CTAD- Blutes wurden zur Messung der Thrombozyten- Release-
Faktoren Plättchenfaktor 4 und β- Thromboglobulin genutzt. Diese erfolgte mittels
Enzymimmunoassay (ELISA).
Diese Tests werden mit Hilfe peroxydasemarkierter Antikörper durchgeführt: Das zu
bestimmende Antigen bindet an Antikörper, mit denen das Reagenzgefäß beschichtet
ist. In einer zweiten Reaktion kommt es durch Ankoppeln von Peroxydase an den
Antigen- Antikörper- Komplex zu einer Farbstoffreaktion, die photometrisch gemessen
wird (Lane et al., 1986).
Plättchenfaktor 4 wurde mit dem vorgefertigten ELISA-Set Asserchrom® PF 4 der
Firma Stago Diagnostica, Roche nach dem Sandwich-Prinzip quantitativ bestimmt.
Nach dem gleichen Prinzip wurde β-Thromboglobulin mit Asserchrom® β-TG
bestimmt.
Nach der Testdurchführung wurden die Extinktionen der peroxydasemarkierten
Antikörper bei 492 nm gemessen und auf doppelt logarithmischen Papier gegen
Plättchenfaktor 4 in IU/ ml aufgetragen.
2.9 Weiterverarbeitung des restlichen Blutes
Das Citratblut diente der Bestimmung eines kleinen Blutbildes und von
Globalparametern der Blutgerinnung (Quick, INR, Fibrinogen, PTT, Thrombinzeit,
Antithrombin III).
Außerdem wurde es von einer Kommilitonin zur Bestimmung plasmatischer
Gerinnungsfaktoren (D-Dimere, t-PA, t-PA-PAI-1, PAP, F1, F2, TAT) im Elisa genutzt.
61
Das kleine Blutbild wurde an einem Sysmex KX-21 des Hämatologielabors gemessen.
Leukozyten, Erythrozyten und Thrombozyten wurden dabei nach dem
Widerstandsprinzip bestimmt, das Hämoglobin nach der cyanidfreien Methode und
der Hämatokrit mit Hilfe der kumulativen Impulshöhensummierung.
Die Globaltests wurden mit Hilfe eines Behring Coagulation Sytems (BCS) des
Gerinnungslabors durchgeführt. Dazu musste das Citratblut zuvor zehn Minuten bei
3500 Umdrehungen zentrifugiert werden.
Das BCS ist ein Gerinnungssystem zur Abarbeitung koagulometrischer, chromogener
und immunchemischer Tests.
Quick, Fibrinogen, PTT und Thrombinzeit wurden koagulometrisch bestimmt.
Gemessen wurde beispielsweise die Zeit nach dem Mischen eines Testansatzes bis
zur Gerinnselbildung anhand einer reduzierten Transmission aufgrund der
Trübungszunahme bei Fibrinbildung.
Antithrombin III wurde enzymatisch mit Hilfe von chromogenen Substraten bestimmt.
Dazu wurde die Bildung eines Farbstoffes als Extinktionsänderung gemessen.
2.10 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Statistikprogrammes SPSS in
Zusammenarbeit mit dem Institut für Biometrie und Statistik der Universität Lübeck.
Bestimmt wurden dabei relative und absolute Häufigkeiten, deskriptive Statistiken,
Mittelwerte, sowie Statistiken und T- Tests bei gepaarten Stichproben.
Varianzanalysen mit Messwiederholung wurden für den Vergleich der
Kontrollmessung mit den Messungen unter Stressinduktion über die jeweiligen
Messzeitpunkte und zu Lasten der Gruppenzugehörigkeit durchgeführt. Zusätzlich
erfolgte die Berechnung eines möglichen Interaktionseffektes zwischen den
Haupteffekten Messzeitpunkt und Gruppenzugehörigkeit. Bei Vorliegen signifikanter
varianzanalytischer Haupt- oder Interaktionseffekte wurden post-hoc-Tests berechnet,
um Einzelvergleiche auf Signifikanz zu prüfen.
Das Signifikanzniveau liegt bei ≤ 0,05. Da es sich um eine explorative Studie mit
kleinem Stichprobenumfang handelt, wurde auf eine Alphafehleradjustierung
verzichtet.
62
3 Ergebnisse
3.1 Auswertung der Fragebögen
Zunächst werden die Ergebnisse der Fragebögen dargestellt.
Diese geben Auskunft über die soziale Struktur des Probandenkollektivs, die
allgemeine Ängstlichkeit, sowie der Befindlichkeit zu den jeweiligen
Messzeitpunkten während der Versuche. Kontroll- und
Stressinduktionsbedingungen werden dabei verglichen.
3.1.1 Soziodemographische Auswertung
Von den insgesamt 15 untersuchten Probanden waren 8 Männer, 7 Frauen im
Durchschnittsalter von 25,33 Jahren (jüngster Proband: 23 Jahre, ältester Proband:
29 Jahre) und deutscher Nationalität. Sie rekrutierten sich aus der Studentenschaft der Universität sowie der
Fachhochschule Lübeck. Elf der Probanden befanden sich noch im Studium, vier
hatten dieses an einer Universität/Fachhochschule bereits abgeschlossen. Alle hatten
die Schule mit dem Abitur, bzw. Fachabitur abgeschlossen.
51% führten ihren eigenen Haushalt und 43% lebten in einer Wohngemeinschaft, alle
Probanden waren zum Zeitpunkt der Untersuchungen ledig.
3.1.2 State-Trait-Angstinventar (STAI)
Das STAI (siehe auch 2.4.3) wurde nicht bezüglich der Zustandsangst (State),
sondern bezüglich der „Trait Angst“, also der überdauernden Ängstlichkeit jeweils
zu Beginn des Versuchstages mit Stressinduktion bestimmt (m = 36,533; sd =
6,707) und zu Beginn des Versuchs unter Entspannungs-, d.h.
Kontrollbedingungen (m = 36,533; sd = 7,405) nach Abstand von mindestens drei
Wochen.
Der T-Test für unabhängige Stichproben ergab, dass sich zwischen den beiden
Versuchstagen keine signifikanten Unterschiede in der Beschreibung der
63
Ängstlichkeit der Probanden zeigten (T = .000; p= 1.000), es ergaben sich so die
jeweils gleichen Ausgangsvoraussetzungen.
3.1.3 Befindlichkeitsskalierung anhand von Kategori en und
Eigenschaftswörtern (BSKE)
Der BSKE wurde in jedem Versuchsaufbau dreimalig eingesetzt:
In der ersten Phase zum Erfassen der jeweiligen subjektiven Stresswahrnehmung zu
Versuchsbeginn, retrospektiv nach beendeter Rede, um die subjektive
Stresswahrnehmung zu Redebeginn zu erfassen, und in der abschließenden
Entspannungsphase.
Im Versuchsablauf ohne Stressinduktion wurde der BSKE ebenfalls zu den gleichen
Zeitpunkten ausgefüllt.
Wertet man die Items mit negativer Stimmung (Items 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 12, 14, 16)
des BSKE aus (Summenwert geteilt durch Anzahl der Items), so zeigt sich, dass
jeweils zu Versuchsbeginn ein ähnliches Anspannungsniveau vorlag:
Stresstest (m= 1,05; sd= 0,57), Kontrolltest (m= 1,10; sd= 0,4).
Der sich anschließende zeitliche Verlauf über die zwei weiteren Messzeitpunkte
hinweg zeigte einen deutlichen Anstieg von der Ruhebedingung zur
Stresssituation (m= 1,76; sd= 0,93) und einen in der abschließenden
Entspannungsphase nachfolgenden Abfall zur erneuten Ruhe (m= 0,85; sd= 0,49).
Während des Versuchsablaufs ohne Stressinduktion wurde der Anstieg wie zu
erwarten nicht festgestellt, die Probanden fühlten sich auf etwa gleich bleibendem
Niveau über den gesamten Versuchsablauf entspannt (im Verlauf m= 1,05; sd=
0,43 und zum Versuchende= 0,96; sd= 0,44).
Dementsprechend zeigt die Varianzanalyse mit Messwiederholung einen
signifikanten Haupteffekt zu Lasten des Messzeitpunktes (F= 11,788; p= 0,001),
nicht jedoch zu Lasten der Gruppenzugehörigkeit (F= 1,5032; p=0,24).
Es zeigt sich ein signifikanter Interaktionseffekt zwischen den Haupteffekten
Messzeitpunkt und Gruppenzugehörigkeit (F= 9,48; p= 0,003). Im post-hoc Test
zeigt sich ein signifikanter Anstieg der negativen Stimmung in der
Stressbedingung vom ersten zum zweiten Messzeitpunkt (T= -3,454; p = 0,004)
64
sowie ein signifikanter Abfall der negativen Stimmung vom zweiten zum dritten
Messzeitpunkt (T = 4,752; p = 0,000). In der Kontrollbedingung finden sich keine
signifikanten Veränderungen.
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
2,00
1 2 3
Messzeitpunkte
Mitt
elw
ert N
egat
ive
Item
s B
SK
E
Stressversuch
Kontrollversuch
Abb. 18: Mittelwerte der „Subjektiven Stresswahrn ehmung“ im BSKE in Abhängigkeit
von der experimentellen Bedingung und dem Zeitverl auf
Wertet man als einziges Item exemplarisch das „Gefühl der Ängstlichkeit“ (Item 3 des
BSKE), so zeigt sich ein ähnliches Ergebnis:
Kaum gefühlte Ängstlichkeit jeweils zu Versuchsbeginn (Stresstest m= 0,27; sd= 0,6,
Kontrolltest m= 0,3; sd= 0,62), deutlicher Anstieg in der Phase der Stressinduktion
(m= 1,53; sd= 1,52) mit nachfolgendem Abfall leicht unter das Anfangsniveau (m=
0,2; sd= 0,41).
Ohne Stressinduktion zeigte sich nur ein dezenter Anstieg (m= 0,47; sd= 0,64) mit
ebenfalls Abfall leicht unter das Anfangsniveau (m= 0,27; sd= 0,46).
In der Varianzanalyse mit Messwiederholung stellt sich so ein signifikanter
Haupteffekt zu Lasten des Messzeitpunktes (F= 6,74; p= 0,01), nicht jedoch zu Lasten
der Gruppenzugehörigkeit (F= 3,59; p=0,08) dar.
Es zeigt sich ein signifikanter Interaktionseffekt zwischen den Haupteffekten
Messzeitpunkt und Gruppenzugehörigkeit (F= 4,627; p=0,03). Im post-hoc Test zeigt
sich ein signifikanter Anstieg der Ängstlichkeit in der Stressbedingung vom ersten zum
65
zweiten Messzeitpunkt (T = -3,020; p = 0,009) sowie ein signifikanter Abfall der
negativen Stimmung vom zweiten zum dritten Messzeitpunkt (T = 3,696; p = 0,002). In
der Kontrollbedingung finden sich keine signifikanten Veränderungen.
3.2 Auswertung des gemessenen Blutdrucks
Exemplarisch sollen hier zunächst die wichtigsten Messergebnisse anhand des
mittleren arteriellen Drucks (MAD) dargestellt werden:
Der erste Messzeitpunkt lag am Ende der Vorbereitungs-, also Entspannungszeit, zu
dem sich der Proband an die Versuchssituation gewöhnt haben sollte. Der fünfte
Messzeitpunkt lag in der direkten Phase der Stressinduktion direkt 30 Sekunden nach
Redebeginn, die abschließende siebte Messung fand am Ende des Versuches nach
30 Minuten Erholung statt.
Diese drei Messzeitpunkte gleichen den drei im Kontrollversuch durchgeführten
Blutdruckmessungen und stellen exemplarisch das Blutdruckverhalten gut dar:
Der erste gemessene MAD lag im Stressversuch nur leicht differierend bei einem
Mittelwert von 86,93 mmHg (sd= 10,35) und im Kontrollversuch bei m= 91,80 mmHg
(sd= 13,44).
Der fünfte Messzeitpunkt erreichte im Stressversuch m= 107,87 mmHg (sd= 10,38)
und in der Kontrolle m= 88,93 mmHg (sd= 6,23).
Zum Versuchsende lagen die Werte wieder etwa im Ausgangsbereich, nach dem
Stressversuch im Mittel bei 90,93 mmHg (sd= 7,36), in der Kontrolle bei 86,80 mmHg
(sd= 6,89).
66
70,00
80,00
90,00
100,00
110,00
120,00
1 5 7
Messzeitpunkte
Mitt
elw
ert M
AD
(m
mH
g)
Stressversuch
Kontrollversuch
Abb. 19: Mittelwerte des Mittleren Arteriellen Bl utdrucks (MAD) in Abhängigkeit
von der experimentellen Bedingung und dem Zeitverl auf
Die Varianzanalyse zeigt einen signifikanter Haupteffekt zu Lasten des
Messzeitpunktes (F= 27,874; p< 0,001), sowie einen signifikanten Interaktionseffekt
zwischen den Haupteffekten Messzeitpunkt und der Gruppenzugehörigkeit (F=
23,457; p< 0,001).
Die Berechnung zu Lasten der Gruppenzugehörigkeit (F= 9,849; p= 0,007) zeigt
ebenfalls einen signifikanten Unterschied. Im post-hoc Test zeigt sich ein signifikanter
Blutdruckanstieg in der Stressbedingung vom ersten zum zweiten Messzeitpunkt (T =
-8,353; p =0,000) sowie ein signifikanter Blutdruckabfall vom zweiten zum dritten
Messzeitpunkt (T = 6,575; p = 0,000). In der Kontrollbedingung finden sich keine
signifikanten Veränderungen.
Aus Gründen der Vollständigkeit werden in nachfolgender Tabelle 5 die Mittelwerte
des MAD aller Messzeitpunkte dargestellt:
67
Mit Stressinduktion
Ohne Stressinduktion
Mittelwert sd Mittelwert sd
Messzeitpunkt 1 86,9 10,35 91,8 13,44
Messzeitpunkt 2 89,9 9,2
Messzeitpunkt 3 89,3 11,11
Messzeitpunkt 4 96,7 8,76
Messzeitpunkt 5 107,9 10,38 88,9 6,24
Messzeitpunkt 6 96,3 9,88
Messzeitpunkt 7 90,9 7,36 86,8 6,9
Tab. 5: Mittlerer arterieller Druck
Mittelwerte und Standardabweichungen (sd) des MAD (in mmHg) beider Versuchsgruppen. N = 15.
3.3 Auswertung der gemessenen Thrombozytenmembranproteine
Mittels der Durchflusszytometrie wurden Oberflächenmarker bestimmt, die einen
Rückschluss auf die thrombozytäre Aktivität geben sollen.
Thrombospondin, CD 63 und CD 62 wurden durch gegen sie gerichtete monoklonale
Antikörper identifiziert.
3.3.1 Auswertung des Thrombozytenmarkers Thrombospo ndin
Das Vorliegen des Thrombozytenoberflächenmarkers Thrombospondin wurde
quantitativ an den drei einheitlichen Messzeitpunkten erfasst und ausgewertet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt:
Mit Stressinduktion
Ohne Stressinduktion
Mittelwert sd Mittelwert sd
Messzeitpunkt 1 29,36 5,5 23,78 12,26
Messzeitpunkt 2 36,33 8,75 28,56 14,14
Messzeitpunkt 3 26,23 7,58 24,90 12,93
68
20.00
23.00
26.00
29.00
32.00
35.00
38.00
1 2 3
Messzeitpunkte
Mitt
elw
ert T
hrom
bosp
ondi
n po
s.
(%)
Stressversuch
Kontrollversuch
Tab. 6: Oberflächenmarker Thrombospondin
Mittelwerte und Standardabweichungen (sd) des Akti vierungsgrades von Thrombospondin (in Prozent) beider Versuchsgruppen. N = 15.
Abb. 20: Mittelwerte der Thrombospondin positiven Plättchen in Abhängigkeit
von der experimentellen Bedingung und dem Zeitverl auf
In der Varianzanalyse findet sich kein signifikanter Haupteffekt zu Lasten der
Gruppenzugehörigkeit (F= 1,88; p= 0,19). Ein signifikanter Effekt zu Lasten des
Messzeitpunktes (F= 9,18; p= 0,003) liegt vor.
Der Interaktionseffekt zwischen Messzeitpunkt und Gruppenzugehörigkeit ist nicht
signifikant (F= 1,94; p= 0,182). Im post-hoc Test zeigt sich eine signifikante Zunahme
von Thrombospondin in der Stressbedingung vom ersten zum zweiten Messzeitpunkt
(T= -2,882; p = 0,012) sowie eine signifikante Abnahme von Thrombospondin vom
zweiten zum dritten Messzeitpunkt (T= 3,691; p= 0,002). Auch in der
Kontrollbedingung findet sich ein signifikanter Thombospondinanstieg vom ersten zum
zweiten Messzeitpunkt (T= -3,290; p= 0,005) sowie ein signifikanter Rückgang vom
zweiten zum dritten Messzeitpunkt (T= 2,379; = 0,032).
69
3.3.2 Auswertung des Thrombozytenmarkers Glykoprote in 53 (CD 63)
Das Vorliegen des Oberflächenmarkers CD 63 wurde quantitativ an den drei
einheitlichen Messzeitpunkten in beiden Versuchen erfasst und ausgewertet.
Die Mittelwerte und Standardabweichungen sind in der nachfolgenden Tabelle 7
dargestellt:
Mit Stressinduktion
Ohne Stressinduktion
Mittelwert sd Mittelwert sd
Messzeitpunkt 1 70,82 11,3 57,15 15,43
Messzeitpunkt 2 72,16 8,67 59,88 15,56
Messzeitpunkt 3 61,39 15,98 56,85 16,06
Tab. 7: Oberflächenmarker CD 63
Mittelwerte und Standardabweichungen (sd) des Akti vierungsgrades von CD 63 (in Prozent) beider Versuchsgruppen. N = 15.
In der Varianzanalyse findet sich ein signifikanter Haupteffekt zu Lasten der
Gruppenzugehörigkeit (F= 4,9; p= 0,043), jedoch nicht zu Lasten des
Messzeitpunktes (F= 3,3; p= 0,069).
Der Interaktionseffekt zwischen Messzeitpunkt und Gruppenzugehörigkeit ist nicht
signifikant (F= 2,11; p= 0,161). Im post-hoc Test zeigt sich lediglich eine
signifikante Abnahme von CD 63 vom zweiten zum dritten Messzeitpunkt in der
Stressbedingung (T= 2,452; p= 0,028). Alle weiteren Einzelvergleiche ergeben
keine statistische Signifikanz.
3.3.3 Auswertung des Thrombozytenmarkers P-Selectin (CD 62)
Das Vorliegen des Oberflächenmarkers CD 62 ist quantitativ an den drei einheitlichen
Messzeitpunkten erfasst und ausgewertet worden.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 8 dargestellt:
70
Mit Stressinduktion
Ohne Stressinduktion
Mittelwert sd Mittelwert sd
Messzeitpunkt 1 34,82 22,16 21,22 13,33
Messzeitpunkt 2 30,6 16,97 23,16 13,80
Messzeitpunkt 3 23,74 12,65 20,88 14,41
Tab. 8: Oberflächenmarker CD 62
Mittelwerte und Standardabweichungen (sd) des Akti vierungsgrades von CD 62 (in Prozent) beider Versuchsgruppen. N = 15.
In der Varianzanalyse findet sich weder ein signifikanter Haupteffekt zu Lasten der
Gruppenzugehörigkeit (F= 3,39; p= 0,087), noch zu Lasten des Messzeitpunktes
(F= 2,55; p= 0,116).
Der Interaktionseffekt zwischen Messzeitpunkt und ist nicht signifikant (F= 1,763; sd=
0,21).
3.4 Auswertung der Granulainhaltstoffe
Als weitere Thrombozyten- Aktivierungsmarker wurden Plättchenfaktor 4 und
ß- Thromboglobulin aus dem abgenommenen Blut mittels ELISA bestimmt.
3.4.1 Auswertung der Messung von Plättchenfaktor 4
Plättchenfaktor 4 ist quantitativ an den drei einheitlichen Messzeitpunkten erfasst und
ausgewertet worden.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 9 dargestellt:
Mit Stressinduktion
Ohne Stressinduktion
Mittelwert sd Mittelwert sd
Messzeitpunkt 1 16,78 11,62 27,03 15,68
Messzeitpunkt 2 18,22 12,10 18,90 16,50
Messzeitpunkt 3 22,8 29,9 14,04 6,94
71
Tab. 9: Aktivitätsmarker Plättchenfaktor 4
Mittelwerte und Standardabweichungen (sd) von PF 4 beider Versuchsgruppen. N = 15.
In der Varianzanalyse findet sich weder ein signifikanter Haupteffekt zu Lasten der
Gruppenzugehörigkeit (F= 0,033; p= 0,858), noch zu Lasten des Messzeitpunktes
(F= 1,40; p= 0,281).
Der Interaktionseffekt zwischen Messzeitpunkt und Gruppenzugehörigkeit ist nicht
signifikant (F= 1,84; sd= 0,19).
3.4.2 Auswertung der Messung von β-Thromboglobulin
β- Thromboglobulin ist quantitativ an den drei einheitlichen Messzeitpunkten erfasst
und ausgewertet worden.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 10 dargestellt:
Mit Stressinduktion
Ohne Stressinduktion
Mittelwert sd Mittelwert sd
Messzeitpunkt 1 62,82 31,15 71,05 34,26
Messzeitpunkt 2 67,13 33,61 50,01 33,35
Messzeitpunkt 3 61,90 65,04 40,72 19,39
Tab. 10: Aktivitätsmarker β- Thromboglobulin
Mittelwerte und Standardabweichungen (sd) von β- TG beider Versuchsgruppen. N = 15.
In der Varianzanalyse findet sich weder ein signifikanter Haupteffekt zu Lasten der
Gruppenzugehörigkeit (F= 1,32; p= 0,27), noch zu Lasten des Messzeitpunktes
(F= 2,08; p= 0,165).
Der Interaktionseffekt zwischen Messzeitpunkt und Gruppenzugehörigkeit ist nicht
signifikant (F= 1,34; sd= 0,30).
72
3.5 Auswertung der Plättchenzahl
An den drei Messzeitpunkten wurde die Plättchenzahl bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 11 dargestellt:
Mit Stressinduktion
Ohne Stressinduktion
Mittelwert sd Mittelwert sd
Messzeitpunkt 1 198,8 69,16 210,47 51,09
Messzeitpunkt 2 208,67 61,8 211,53 53,98
Messzeitpunkt 3 212,33 60,1 223,1 60,46
Tab. 11: Anzahl der Thrombozyten
Mittelwerte und Standardabweichungen (sd) der Plätt chenzahl (10 9/l) beider Versuchsgruppen. N = 15.
In der Varianzanalyse findet sich weder ein signifikanter Haupteffekt zu Lasten der
Gruppenzugehörigkeit (F= 1,83; p= 0,198), noch zu Lasten des Messzeitpunktes
(F= 2,71; p= 0,104).
Der Interaktionseffekt zwischen Gruppe und Messzeitpunkt ist nicht signifikant (F=
2,63; sd= 0,11).
73
4 Diskussion
Ziel dieser Studie war es, Auswirkungen von psychischem Stress auf die
Blutgerinnung zu untersuchen. Dazu wurde die Aktivität von Blutplättchen,
gemessen an exprimierten Membranproteinen und abgegebenen
Granulainhaltsstoffen unter der Stressinduktion durch freie Rede betrachtet.
Multiple Studien haben sich bisher mit der Auswirkung von physischem und
psychischem Stress auf die Blutgerinnung beschäftigt (siehe 1.3), wobei die
Ergebnisse differieren (Känel et al., 2001). Der Einfluss von Thrombozyten auf
kardiovasculäre Erkrankungen (Grau et al., 1998, Zeller et al., 1999, Maree und
Fitzgerald, 2004) und der Einfluss psychischer Faktoren (Kawachi et al., 1994)
wurden mehrfach beschrieben und Zusammenhänge sollten hier genauer
untersucht werden.
Wie zu erwarten und im Ergebnisteil dargestellt (siehe Kapitel 3), kam es unter dem
Einfluss von Public Speaking zu einem deutlichen Anstieg des Blutdruckes sowie
einer signifikanten Abnahme der positiven Befindlichkeit.
Somit konnte der Einfluss von freier Rede als Laborstressor bestätigt werden (vgl.
Kapitel 1.13). Die Ergebnisse der vorliegenden Studie reihen sich damit nahtlos in die
Befundlage aus der Literatur ein. Auch das Ausmaß der Veränderungen zeigt eine
Übereinstimmung mit anderen Befunden (z.B. Kirschbaum et al., 1993). Die
Voraussetzungen, den Einfluss psychischer Belastung auf das Aggregationsverhalten
von Thrombozyten zu untersuchen, sind damit also gegeben.
4.1 Betrachtung der Methodik
Die Methode der öffentlichen Rede hat sich in der Stressforschung schon vielfach
bewährt, die Durchflusszytometrie und das Prinzip des ELISA sind in der
Hämostaseologie ebenfalls häufig genutzte Verfahren.
Eine Schwierigkeit war es, diese Methoden in Verbindung zu setzen und ein
Studiendesign zu entwickeln, welches objektivierbare Ergebnisse liefert, die in
Beziehung gesetzt werden können.
74
Das Design wurde so gewählt und in zahlreichen Vorversuchen angepasst, dass
möglichst:
1. Ein Maximum an zumutbarem reproduzierbaren Stress induziert wird.
Dabei sollte die Abbrechquote der freiwillig teilnehmenden Probanden möglichst
gering ausfallen und sie sollten entspannt und unvoreingenommen am Tag des
Stress- und des Kontrollversuches erscheinen.
2. Zu den Zeitpunkten der stärksten Stressinduktion sowie in maximaler Entspannung
Blutentnahmen erfolgen, die so schnell wie möglich weiterverarbeitet und untersucht
werden.
Der günstigste Zeitpunkt wurde anhand von Befindlichkeitsbeschreibungen und
Auswertungen von Blutdruck- und Pulsverhalten in mehreren Vorversuchen
analysiert.
3. Weder durch den Versuchsaufbau, die Blutentnahmen, noch während der
Aufbereitung des Blutes eine zusätzliche Aktivierung der Blutgerinnung oder gar
Schädigung der Plättchen erfolgt.
Im ursprünglichen Versuchsaufbau wurde der Proband aufgefordert, sich zu Beginn
der Rede vor die laufende Kamera zu stellen. Diese Variante wurde wieder verworfen,
als sich zeigte, dass anscheinend schon durch die Orthostase bei dem Aufstehen
sowie durch körperliche Aktivität eine Zunahme des Aktivitätsniveaus der
Thrombozyten erfolgte. Diese Beobachtung deckt sich mit diversen Studien (Ohri et
al., 1983; Hendra et al.,1988; Naesh et al., 1990; Piret et al., 1990). Die körperliche
Aktivität der Probanden wurde im endgültigen Versuchsablauf auf ein zumutbares
Minimum reduziert.
Es zeigte sich, dass eine sofortige Weiterverarbeitung des Blutes zur
Thrombozytenaufbereitung und Fixierung notwendig war, um eine ungewollte
zusätzliche Aktivierung der Plättchen zu verhindern, bzw. zu reduzieren. Jeder
Kontakt mit Oberflächen in vitro kann eine Aktivierung der Plättchen bewirken.
Deshalb wurden diese in ihrem Ist- Zustand direkt nach der Blutentnahme in
Paraformaldehydlösung fixiert. Eine durch die Fixation bedingte Aktivierung konnte in
unseren Vorversuchen (im Gegensatz zu den Ergebnissen von Cahill et al., 1993)
nicht beobachtet werden.
In der Literatur wird eine Aktivierung der Plättchen durch die Zentrifugation
beschrieben (Goodall, 1991), weshalb einige Autoren ihre durchflusszytometrischen
Analysen aus Vollblut durchführen (Michelson, 1996). Durch Reduktion der
75
Zentrifugalgeschwindigkeit auf 2000 Umdrehungen und Verzicht auf das Nutzen der
Zentrifugenbremse ließ sich jedoch eine übermäßige weitere Plättchenaktivierung
verhindern.
Die Analyse der Messergebnisse zeigte sich insofern als schwierig, da subjektiv
gefühlte und objektiv labortechnisch gemessene Parameter in Beziehung gesetzt
werden sollten.
4.2 Ergebnisdiskussion
4.2.1 Probandenkollektiv
Um pathologische oder iatrogene Störfaktoren (z.B. Vorerkrankungen,
Medikamenteneinnahme) möglichst auszugrenzen, wurde ein junges, anamnestisch
gesundes Probandenkollektiv gewählt. Die Studienpopulation bestand ausschließlich
aus Studierenden oder Studierten im dritten Lebensjahrzehnt, um zu verhindern, dass
wie in der Literatur beschrieben sozioökonomische Einflüsse wie niedriger
sozioökonomischer Status oder ein niedriger Bildungsgrad als Stressoren
Einwirkungen auf die Blutgerinnung nehmen können (Folsom et al., 1993, Wamala et
al., 1999, v. Känel et al., 2001).
Weiterhin wurde darauf geachtet, ca. 50 % Männer und 50 % Frauen zu rekrutieren.
Durch die Bearbeitung des State- Trait- Angstinventars (STAI) wurde die Ängstlichkeit
der Probanden kontrolliert, die Werte entsprachen der Normpopulation.
4.2.2 Stressinduktion durch Public Speaking
Betrachtet man die gemessenen Blutdrücke (siehe 3.2), so fällt auf, dass mit dem
Beginn der Rede ein signifikant deutlicher Anstieg zu verzeichnen ist. Schon zu Ende
der Redezeit fällt dieser rasch wieder ab und normalisiert sich zu Ende des
Versuchsablaufs.
Die Ergebnisse der Befindlichkeitsskalierung (BSKE) zeigen, dass unter dem Einfluss
des Public Speaking ein verstärktes Gefühl der Ängstlichkeit aufgetreten ist. Alle
Probanden beschrieben zu diesem Zeitpunkt eine negative Befindlichkeit.
76
Demgegenüber stehen die Kontrollversuche ohne subjektive Stresswahrnehmung
(siehe 3.1.3).
Die Probanden, die am ersten Versuchstag die Stressinduktion erlebten und am
zweiten Termin, wie angekündigt, lediglich entspannten, zeigten zu Beginn des
Kontrollversuchs keine gesteigerte Ängstlichkeit, z.B. in Form einer ängstlichen
Erwartungshaltung.
Wertet man den gesteigerten Blutdruck als Zeichen einer verstärkten
Adrenalinausschüttung zu Redebeginn und betrachtet zeitgleich die subjektive
Stresswahrnehmung der Probanden, so kann wie beabsichtigt von einer bei allen
Probanden erfolgreichen Stressinduktion mit nachfolgender Entspannung
ausgegangen werden.
Alle Probanden schilderten die zu Beginn der freien Rede aufgetretene Angst vor der
Bewertung durch ein vermeintliches Publikum, die sich schon während der
Redevorbereitung entwickelt hätte. Dieser Zeitpunkt würde nach dem Modell des GAS
nach Selye der Alarmreaktion mit folgender Schockphase entsprechen. Die sinkende
Stressresistenz mit zugleich sympathischer Erregung spiegelt sich in der
Blutdrucksteigerung als Zeichen einer vermehrten Ausschüttung von Katecholaminen
wider.
Wie ausgeprägt sich bei unseren Probanden eine solche Gegenschockphase
entwickelte, hätte durch eine erneute Stressinduktion beobachtet werden können. In
diesem Falle wäre – nach Selye - die Stressreaktion, gemessen an RR- Anstieg und
vor allem subjektiver Stresswahrnehmung nicht so deutlich ausgefallen. Der Proband
hätte dem Ausgangsstressor, z.B. einer erneuten freien Rede Widerstand leisten
können.
Es ist jedoch anzunehmen, dass dieser Widerstand sehr unterschiedlich ausgefallen
wäre, da die subjektive Bewertung der Bedrohlichkeit der Situation zu berücksichtigen
ist. Auch wenn es sich bei unseren Probanden um Studierende handelte, so gaben
einige in späteren Gesprächen eine erhebliche Angst vor öffentlichen Reden an. Dies
entspricht der Aussage des Interaktionsmodells nach Lazarus.
Die Intensität einer Stessreaktion lässt sich also vor Versuchsbeginn nicht genau
voraussagen, beide Stressmodelle müssen in vorbereitende Überlegungen
einbezogen werden.
77
Betrachtet man die Zeit der Redevorbereitung, so hatten die Probanden die
Möglichkeit, sich mit ihren Gedanken und Gefühlen auseinanderzusetzen. Individuell
unterschiedlich kann dies zu einer subjektiven Stresssteigerung geführt haben, evtl.
jedoch auch durch zu einer schon zu Redebeginn einsetzenden Gegenschockphase.
Die Versuchsergebnisse spiegeln eine Stressreaktion bei allen Probanden wider,
jedoch wäre eine Veränderung des Versuchdesigns mit unterschiedlichen
Vorbereitungszeiten in zukünftigen Studien möglich, um individuell unterschiedliche
Reaktionen und auch eine evtl. Anpassung des Gerinnungssystems zu untersuchen.
4.2.3 Einfluß von Public Speaking auf Thrombozyten
4.2.3.1 Thrombospondin, Glykoprotein 53 (CD 63), P- Selectin (CD 62)
Im Ruhezustand liegt der Hauptanteil dieser Proteine in den Plättchen gespeichert
vor, durch Thrombozytenaktivierung werden sie sezerniert und an der
Plättchenmembran exprimiert (siehe 1.2.2.4). Ein vermehrter durchflusszytometrischer
Nachweis spricht demnach für eine Aktivierung der Plättchen.
So fiel unter Stressbedingungen zum zweiten Messpunkt ein signifikanter Anstieg des
Thrombospondins und anschließend in der Ruhephase ein Abfall leicht unter die
Ausgangswerte auf, während im Kontrollversuch zum zweiten Messzeitpunkt ein
geringerer, jedoch ebenfalls signifikanter Anstieg und Abfall erfolgte.
Diese Tendenzen zeigten sich bei den Messungen von CD 63 und CD 62 nicht.
CD 63 zeigte unter Stressinduktion nur einen leichten, im Vergleich mit der
Kontrollgruppe nicht signifikanten Anstieg. Die gemessenen Werte zu Versuchsende
lagen auch hier leicht unter den Ausgangswerten. Dennoch fiel ein signifikanter
Haupteffekt zu Lasten der Gruppenzugehörigkeit auf, jedoch nicht zu Lasten des
Messzeitpunktes.
CD 62 zeigte unter Stressinduktion sogar einen leichten Abfall.
Die Vermutung, dass mentaler Stress in dem hier gewählten Versuchsaufbau zu
einem Anstieg des Thrombospondins führt, kann mit dieser Arbeit bekräftigt werden.
Es zeigt sich, dass ein kurzer Stressmoment ausreicht, eine zunehmende
Thrombozytenaktivierung - gemessen am Thrombospondin - auszulösen, der durch
78
Entspannung jedoch auch schnell wieder entgegengewirkt werden kann. Mittels
Messungen von CD 62 und CD 63 lässt sich diese Tendenz nicht nachweisen.
Bei Bestimmungen dieser drei Parameter fällt zudem eine erhöhte Exprimierung der
Ausgangswerte der Stressversuche im Vergleich mit den Kontrollwerten auf.
Betrachtet man CD 62 zeigen sich eine über den gesamten Stressversuch im
Vergleich mit der Kontrollgruppe höhere Werte, dies spiegelt sich im signifikanten
Haupteffekt zu Lasten der Gruppenzugehörigkeit wider. Möglicherweise kann dies mit
dem Stressor einer unbewussten Erwartungshaltung der Probanden erklärt werden.
Am ersten Versuchstag kann diese trotz Vorabinformationen durch die Ungewissheit
des anstehenden Versuches entstanden sein (vergleiche Jern et al, 1991). Die
Probanden, die im ersten Versuch keine Stressinduktion durchliefen, erwarteten am
folgenden Versuchstag trotz des Hinweises, wieder nur entspannen zu müssen
eventuell einen veränderten Versuchsablauf. Möglicherweise lässt sich mit dieser
gesteigerten Anspannung auch der kurze Anstieg des Thrombospondins unter
Kontrollbedingungen erklären. In nachfolgenden Arbeiten sollten gezielte
Untersuchungen des Thrombospondins in größeren Probandenkollektiven erfolgen.
Mit Hilfe des BSKE ließ sich jedoch zu Beginn der Kontroll- und Stressversuche keine
gesteigerte Ängstlichkeit feststellen. Da diese jedoch nur die subjektive
Wahrnehmung der Probanden wieder spiegeln, können sie eine unbewusste
Erwartungshaltung nicht immer erfassen.
Dass generell auch unter Ruhebedingungen Thrombozytenaktivitätsparamter
nachweisbar sind, überrascht nicht. Die körperliche Aktivität vor Versuchsbeginn, die
Blutentnahme an sich oder die Plättchenaufbereitung können zum Beispiel zu einem
leichten Aktivitätsanstieg führen.
Auch die häufig auftretende ängstliche Erwartungshaltung vor Blutentnahmen kann
diese beeinflusst haben (Ogston et al., 1962).
4.2.3.2 Plättchenfaktor 4 und β-Thromboglobulin
Plasmakonzentrationen von Granulainhaltsstoffen der Thrombozyten lassen auf deren
Aktivitätsgrad schließen. Der Spiegel von Plättchenfaktor 4 im Plasma kann nach
Aktivierung bis um das fünfzigfache ansteigen (Walz, 1984).
Plättchenfaktor 4 und ß- Thromboglobulin lassen sich schnell im ELISA identifizieren
und dienen als Indikator des Ausmaßes der Plättchenaggregation.
79
Die Vermutung, dass mentaler Stress in dem hier gewählten Versuchsaufbau zu
einem Anstieg der Granulainhaltsstoffe führt, kann mit dieser Arbeit nicht bestätigt
werden. Bei der Messung von Plättchenfaktor 4 zeigte sich zwar ein leichter Anstieg
vom ersten bis zum dritten Messzeitpunkt, in der Kontrollgruppe jedoch fiel
ausgehend von einem sehr hohen Anfangswert (höher als die höchste gemessenen
PF 4- Konzentration im Stressversuch) die Konzentration über die drei
Messzeitpunkte ab.
Dies zeigte sich auch in den Messungen des ß- Thromboglobulin im Kontrollversuch:
Ausgehend von einem höher als im Stressversuch gelegenen Wert fielen diese über
die Messungen ab. Dies könnte mit einer zunehmenden Entspannung der Probanden
zusammenhängen, allerdings liegt eine recht hohe Standardabweichung vor, d.h. die
einzelnen Probanden differierten deutlich in den Messergebnissen. Unter
Stressinduktion veränderte sich der ß- Thromboglobulin– Spiegel nur wenig, wobei
sich jedoch ein leichter Anstieg bei Stressinduktion messen ließ.
Ob sich die Tendenz des leichten Anstiegs der Konzentration der Granulainhaltsstoffe
unter psychischem Stress und der Abfall der Konzentration unter zunehmender
Entspannung sich bestätigt, sollte mit großen Probandenkollektiven untersucht
werden.
4.2.3.3 Plättchenzahl
Eine signifikante gruppenspezifische Veränderung der Thrombozytenzahl in Form
eines deutlichen Ansteigs oder Abfalls unter Stressinduktion ließ sich mit dieser Arbeit
nicht feststellen. Sowohl unter Stressinduktion, als auch unter Ruhebedingungen
kommt es zu einem leichten Anstieg der Plättchenzahl, unter Ruhebedingungen
jedoch mit einem etwas höheren Ausgangsniveau.
Diesbezüglich zeigt sich auch die Studienlage indifferent. In mehreren Studien wurde
ein Anstieg der Plättchenzahl unter Stress festgestellt (Haft und Arkel 1976, Arkel et
al. 1977, Goodall et al., 1999), in weiteren jedoch blieb die Zahl unverändert (Levine
et al., 1985) oder es wurde ein Abfall registriert (Mest et al., 1982).
Die Plättchenkonzentration im zirkulierenden Blut liegt in einem breiten Normbereich
zwischen 150 und 350 x 109 /l und unterliegt starken individuellen Schwankungen und
multifaktoriellen Einflüssen. Möglicherweise wurde während der Dauer unseres
Versuches ein eventueller Anstieg durch Rekrutierung der Plättchen z.B. aus der Milz
80
noch nicht erfasst. In zukünftigen Studien wäre ein späterer weiterer Messzeitpunkt
wünschenswert, um eine mögliche Veränderung der Plättchenzahl zu beobachten.
4.3 Abschließende zusammenfassende Betrachtung
Die Auswertung der im Rahmen dieser Studie erhobenen Ergebnisse lässt folgende
Schlüsse zu:
1. Durch freie Rede induzierter Stress führt zu einem Blutdruckanstieg, sowie
2. einer signifikanten Abnahme der positiven Befindlichkeit .
3. Die Annahme einer dadurch induzierten vermehrten Exprimierung von
Thrombospondin als Zeichen einer Thrombozytenaktivierung wird bekräftigt.
Nicht bestätigt werden konnte diese These anhand der
Thrombozytenoberflächenmarker CD 62 und CD 63.
Die Ergebnisse gemessen an PF- 4 und ß- TG zeigen nur die Tendenz einer
aktivierenden Beeinflussung durch Stressinduktion.
Die Thrombozytenzahl wird nicht signifikant beeinflust.
Warum es unter Kontrollbedingungen ebenfalls zu einem leichten Anstieg der
Thrombospondinexprimierung gekommen ist, lässt sich letztendlich nicht sicher
klären.
In wie weit grundsätzlich diese Ergebnisse zur Aggregation valide sind, sollte in
zukünftigen Studien mit größeren Probandenkollektiven erforscht werden. Möglich
wäre auch die Untersuchung an einem Patientenkollektiv mit kardiovasculären
Vorerkrankungen. Bei diesen könnte eine verstärkte Reaktion auf Stress respektive
einer adrenergen Stimulation vorliegen (Lande et al., 1988).
Zu erwägen wäre eine zusätzliche durchflusszytometrische Untersuchung aus Vollblut
(Michelson, 1996), um eine eventuelle Aktivierung während der Zentrifugation
auszuschließen.
81
5 Zusammenfassung
Das Gerinnungssystem des Menschen spielt zusammen mit Stress eine wesentliche
Rolle bei der Entstehung und Aufrechterhaltung von Herz- Kreislauferkrankungen, die
heutzutage zu den häufigsten Todesursachen der Industrienationen zählen.
Der Einfluss von Stress auf Veränderungen der Blutgerinnung ist bisher schon
vielfach untersucht worden. Bislang sind die pathophysiologischen Mechanismen
noch nicht vollständig geklärt.
Die gegenwärtige Studie wurde durchgeführt, um die Auswirkungen von Stress auf die
zelluläre Aktivität der Thrombozyten zu untersuchen.
Es wurden 15 gesunde männliche und weibliche Probanden unter freier Rede und
unter Kontrollbedingungen (kein Stress) beobachtet. Dabei wurden Thrombozyten auf
ihre Anzahl, exprimierte Marker und Granulainhaltsstoffe als Zeichen ihrer zellulären
Aktivität zu unterschiedlichen Zeitpunkten untersucht. Dazu wurden die Methoden der
Durchflusszytometrie und des ELISA genutzt.
Die emotionale Befindlichkeit der Probanden wurde mittels Fragebogen und die
Kreislaufreaktion anhand des aufgezeichneten Blutdrucks ermittelt.
Die Ergebnisse demonstrierten, dass sich durch die Freie Rede Stress induzieren
lässt.
Zudem konnte eine Aktivitätssteigerung der Thrombozyten unter dem Einfluss von
Stress anhand des Oberflächenmarkers Thrombospondin beobachtet werden.
Nicht bestätigt werden konnte diese These anhand der
Thrombozytenoberflächenmarker CD 62 und CD 63, während die Ergebnisse der
Messung der thrombozytären Granulainhaltsstoffen PF- 4 und ß- TG lediglich die
Tendenz einer Aktivierung zeigten.
Diese Ergebnisse wurden in Bezug auf das Regelungsmuster der Thrombozyten und
die methodischen Beschränkungen diskutiert.
In wie weit grundsätzlich diese Ergebnisse zur Aggregation valide sind, sollte in
zukünftigen Studien mit größeren Probandenkollektiven erforscht werden.
Ebenfalls wäre eine Untersuchung an einem Patientenkollektiv mit kardiovasculären
Vorerkrankungen oder gesteigerten Risikofaktoren möglich.
82
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Beutler E, Lichtman MA, Coller BS, Kipps TJ, eds. Williams Hematology,
5th ed. New York, NY: McGraw-Hill, 1161-1201 (1995)
151. Wilker FW: Aktivations- und Bewustseinszustände. In: F-W Wilker, C
Bischoff, P Novak (Hrsg.). Medizinische Psychologie und Medizinische
Soziologie, 32-46. München: Urban & Schwarzenberg Verlag (1994)
152. Winther K, Hillegas W, Torfler GH, Jimenez A, Brezinski DA, Schafer AI,
Loscalzo J, Wliiams GH, Muller JE: Effects on platelet aggregation and
fibrinolytic activity during upright posture and exercise in healthy men. Am J
Cardiol 70, 1051-1055 (1992)
153. Zeller JA, Tschoepe D, Kessler C: Circulating platelets show increased
activation in patients wit acute cerebral ischemia. Thromb Haemost 81,
373-377 (1999)
154. Zucker S, Mileke CH, Durocher JR, Crosby WH: Oozing and bruizing due
to abnormal platelet function (thrombocytopathia). A family study of the
syndrome. Annals of Internal Medicine, 76, 727-731 (1972)
95
7 Anhang
7.1 Instruktionsbögen
7.1.1 Instruktionsbogen 1
Während der nächsten 30 min sollten Sie versuchen, sich im Sitzen möglichst zu
entspannen. Bitte stehen Sie nach Versuchsbeginn nicht mehr auf.
In dieser Zeit werden wir Ihnen drei Fragebögen aushändigen, die Sie bitte
ausfüllen.
Nach 30 min werden wir einige Vitalparameter, wie z.B. Blutdruck und Puls,
ableiten.
Danach entnehmen wir Ihnen 19,0 ml Blut.
Mehr kommt in dieser Zeit nicht auf Sie zu.
7.1.2 Instruktionsbogen 2
Ihre Aufgabe besteht darin, eine 10-minütige Rede zu halten,
welche auf Video aufgezeichnet wird.
Beurteilt werden die Art der Präsentation, wie Rhetorik, Mimik und Gestik,
inhaltliche Klarheit und Richtigkeit.
Dazu wird Ihnen gleich ein Text ausgehändigt, den Sie bitte während der nächsten
30 min durcharbeiten.
Sie sollten danach in der Lage sein, den Inhalt frei zu präsentieren und Ihre eigene
Meinung zu diesem Thema zu vertreten.
Die Redezeit sollte nicht über- oder unterschritten werden.
Bei der Redevorbereitung stehen Ihnen keinerlei Hilfsmittel zur Verfügung.
Es ist auch nicht erlaubt, sich Notizen anzufertigen.
Die Beurteilung Ihrer Rede erfolgt durch qualifizierte Beobachter, sowie durch
nachträgliche Begutachtung des Vidoematerials.
Vitalparameter werden während der 30-minütigen Vorbereitungszeit gemessen.
Unmittelbar zu Redebeginn erfolgt eine zweite Blutentnahme.
96
7.1.3 Instruktionsbogen 3 Während der nächsten 30 min sollten Sie versuchen, sich im Sitzen möglichst
wieder zu entspannen.
Zu Ende dieser Zeit werden wir Ihnen erneut zwei Fragebogen austeilen, die Sie bitte
ausfüllen.
Versuchen Sie bei Angaben auf dem ersten Fragebogen retrospektiv einzuschätzen,
wie Sie sich unmittelbar vor Redebeginn gefühlt haben.
Auf dem zweiten Fragebogen schätzen Sie bitte Ihr derzeitiges Befinden ein.
Im Anschluss entnehmen wir ein letztes Mal 19,0 ml Blut.
Dann haben Sie es geschafft.
Vielen herzlichen Dank für Ihre Mitarbeit!
97
7.2 Fragebögen
7.2.1 Soziodemographische Daten
98
99
7.2.2 State-Trait-Angstinventar (STAI)
100
101
7.2.3 Befindlichkeitsskalierung anhand von Kategori en und Eigenschaftswörtern (BSKE)
102
103
7.3 Versuchsprotokoll
104
105
7.4 Arbeitsanleitung Präparation der Thromboyzyten vor Antikörpermarkierung
1. direkt nach Blutentnahme 2 ml Blut (CTAD) in 2 ml Paraformaldehydlösung
durch Schwenken mischen
2. 15 min Raumtemperatur
3. Zentrifugation:
5 min bei 800 Umdrehungen (116 g) ohne Bremse (Megafug 1.0)
4. plättchenreichen Überstand mit Pasteurpipette abheben
5. Zentrifugation des Überstandes:
6. 5 min bei 2000 Umdrehungen (700 g) ohne Bremse
7. plättchenfreien Überstand abpipettieren
8. plättchenreiches Pellet mit 1,8 ml Waschlösung und 200 µl Rabbit- Serum
aufmischen
9. Zentrifugation:
5 min bei 2000 Umdrehungen (700 g) ohne Bremse
10. Resuspension des Pellets in 1 ml Waschlösung
11. Plättchenkonzentration messen im Sysmex, dazu 20 µl Plättchenkonzentrat
auf 10 ml Verdünnung
12. Einstellen auf 50.000 Thrombozyten/µl durch Verdünnen mit PBS
13. Je 20 µl Antikörperlösung zu 100 µl Plättchensuspension pipettieren und
durch Schwenken mischen,
1 h bei Zimmertemperatur im Dunkeln inkubieren
14. Zugabe von 1 ml Waschlösung
15. Zentrifugation:
5 min bei 2000 Umdrehungen (700 g) ohne Bremse
16. 1 ml Überstand abpipettieren, mit 1 ml PBS auffüllen
106
8 DANKSAGUNG
Mein Dank gilt Herrn Herrn Priv.- Doz. Dr. phil. D.Benninghoven für die Überlassung
des Themas und Herrn Priv.- Doz. Dr. med. G. Jantschek für die Möglichkeit, diese
Arbeit in seiner Klinik durchführen zu können.
Großer Dank gilt Herrn Priv.- Doz. Dr. med. H.-J. Siemens, der sich viel Zeit und
Mühe gemacht hat, besonders den experimentellen Laborabschnitt zu unterstützen
und umzusetzen.
Meinem direkten Betreuer Herrn Dr. med. S. Kunzendorf möchte ich ebenso
besonders danken, da er sich in allen Abschnitten für ein Weiterkommen der Arbeit
eingesetzt hat und stets ein offenes Ohr für Fragen hatte.
Dank gilt auch Frau Anne Seifert für die tatkräftige gemeinsame Erarbeitung der
Arbeitsabläufe, die Arbeit mit den Probanden sowie für ihre helfende Hand im Labor.
Danke ebenfalls an Frau Michaela Rohlfing für die konstruktiv kritische Lektüre der
Arbeit sowie Frau Heike Hufnagel und Herrn Dr. Henrik Seintsch für die Hilfe bei der
optischen Gestaltung und Frau Maria Noftz als Fotomodell.
Herrn Prof. Dr. med. T. Wagner danke ich für die Möglichkeit der Nutzung des
hämatologischen Labors der Medizinischen Klinik I. Seinen Mitarbeitern und
Mitarbeiterinnen gilt mein Dank für die unterstützende Hilfe bei Fragen technischer
und inhaltlicher Natur und das freundlich aufnehmende Arbeitsklima.
Ein besonderer Dank gilt allen Probanden, die sich im Rahmen dieser Arbeit haben
unentgeltlich untersuchen und unter Stress setzen lassen.
Mein ganz besonderer Dank gilt auch meinen Eltern, die mir durch ihre Unterstützung
das Studium der Humanmedizin und die Anfertigung dieser Promotionsarbeit erst
ermöglicht haben und meiner Freundin Ilona Zimmermann, die mich stets motiviert
und bestärkt hat.
107
9 ERKLÄRUNG
Die vorliegende Arbeit wurde in der Klinik für Psychosomatik und Psychotherapie des
Universitätsklinikums Schleswig-Holstein, Campus Lübeck unter Aufsicht von Herrn
Priv.-Doz. Dr. phil. Benninghoven durchgeführt.
Die Studie wurde unter dem Titel: „Stress und Hyperkoagulabilität“ der
Ethikkommission vorgelegt und in ihrer Sitzung am 01.03.2000 unter dem
Aktenzeichen 00-025. genehmigt.
Ich habe die vorliegende Dissertation selbstständig und ohne fremde Hilfe angefertigt
und keine anderen als die in der Arbeit genannten personellen, technischen und
sachlichen Hilfen oder Hilfsmittel verwendet. Wörtlich oder inhaltlich entnommene
Zitate aus den benutzten Werken sind als solche kenntlich gemacht.
Ich versichere nicht vorher oder gleichzeitig andernorts einen Zulassungsantrag
gestellt zu haben und habe mich zuvor keinem anderen Promotionsverfahren
unterzogen. Die Arbeit wurde keiner anderen Promotionsbehörde im In- oder Ausland
vorgelegt.
108
10 Lebenslauf
Angaben zur Person
Name Trygve Gräntzdörffer
Geburt 01.04.1976 geboren in Lüneburg
Staatsangehörigkeit deutsch
Familienstand ledig
Eltern Ingrid Gräntzdörffer, geb. Söhl (Lehrerin)
Eike Gräntzdörffer (Lehrer)
Bruder Eike A. Gräntzdörffer (Physiotherapeut)
Berufliche Tätigkeit
12.03 - 06.04 Arzt im Praktikum am Bundeswehrkrankenhaus
Bad Zwischenahn, Abteilung Chirurgie
06.04 -10.04 Arzt im Praktikum am Bundeswehrkrankenhaus
Bad Zwischenahn, Abteilung Innere Medizin
Seit 01.10.04 Vollapprobation
10.04 - 06.05 Assistenzarzt am Bundeswehrkrankenhaus
Bad Zwischenahn, Abteilung Innere Medizin
06.05 - 02.06 Assistenzarzt am Bundeswehrkrankenhaus
Bad Zwischenahn, Abteilung Anästhesie und Intensivmedizin
02.06 – 02.09 Truppenarzt im Sanitätszentrum der Bundeswehr in Rotenburg
(Wümme)
seit 03.09 Assistenzarzt am Bundeswehrkrankenhaus Westerstede,
Abteilung Innere Medizin
In der Weiterbildung zum Facharzt für Allgemeinmedizin/Innere
Medizin.
Zusatzbezeichnungen:
Arzt für Notfallmedizin, Arzt für Sportmedizin
Weiterbildungen in den Bereichen:
Psychosomatische Grundversorgung, Hygiene, Akupunktur,
Manuelle Medizin.
109
Studium
10.1997-12.2003 Studium der Humanmedizin an der Medizinischen Universität zu
Lübeck
08.1999 Physikum
08.2000 1.Staatsexamen
09.2002 2.Staatsexamen
12.2003 3.Staatsexamen
Praktisches Jahr
10.2002 - 01.2003 Innere Medizin, Asklepios- Klinik Bad Oldesloe
02.2003 - 05.2003 Chirurgie, Asklepios- Klinik Bad Oldesloe
06.2003 - 09.2003 Neurologie, Klinik für Neurologie, Universitätsklinikum
Schleswig-Holstein, Campus Lübeck
Dissertation
Experimentelle Studie zur Thrombozytenaktivierung durch psychisch induzierten
Stress, Med. Klinik II/ Klinik für Psychosomatik und Psychotherapie,
Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Lübeck
Doktorvater: PD Dr. phil. Benninghoven
Zeitraum der experimentellen Datengewinnung: 2000-2001
Publikationen
1) Ausgezeichnet mit dem Posterpreis bei der Jahrestagung 2002 des Deutschen
Kollegiums für Psychosomatische Medizin:
Kunzendorf S, Benninghoven D, Siemens HJ, Meß A, Gräntzdörffer T, Specht T &
Jantschek G: Blutgerinnungsaktivierung bei psychisch induziertem Streß (Abstract).
Psychotherapie, Psychosomatik und Medizinische Psychologie, 52(2), 101 (2002).
2) Kunzendorf S, Benninghoven D, Siemens HJ, Meß A, Gräntzdörffer T, Specht T &
Jantschek G: Hyperkoagulabilität bei psychisch induziertem Stress (Abstract).
Psychotherapie, Psychosomatik und Medizinische Psychologie, 51(2), 107 (2001).
110
3) Siemens HJ, Meß A, Gräntzdörffer T, Brückner S, Jurat A, Kunzendorf S,
Benninghofen D, Jahn J, Jantschek G: Activation of platelets and the plasmatic
coagulation system by mental stress – first results. Supplement to the journal
Thrombosis and Haemostasis, Juli 2001 (ISSN 0340-6245).
Schulausbildung
1982 - 1986 Grundschule Bardowick
1986 - 1988 Orientierungsstufe Bardowick
1988 - 1995 Gymnasium Herderschule Lüneburg,
Abitur Juni 1995
Wehrdienst
1995 – 1996 Wehrdienst im Sanitätsdienst der Bundeswehr
