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1. Auflage 2012

© 2012 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH,

Gießen

Printed in Germany

ISBN 978-3-86345-0

Verlag: DVG Service GmbH

Friedrichstraße 17

35392 Gießen

0641/24466

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www.dvg.net

75-5

Tierärztliche Hochschule Hannover

Zur Bedeutung von Peroxisomen im Metabolismus von

degenerativen und neoplastischen Lebererkrankungen beim Hund

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Julia Schüttler

geb. Borchert

Bad Kreuznach

Hannover 2012

Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup

Deutsches Primatenzentrum, Göttingen

Abteilung Infektionspathologie

1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup

Tierärztliche Hochschule Hannover

Deutsches Primatenzentrum, Göttingen

2. Gutachterin: Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein

Tierärztliche Hochschule Hannover

Institut für Pathologie

Tag der mündlichen Prüfung: 27.04.2012

Meinem Vater, meiner Mutter

und Raimund

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ...................................................................................................... 11

2 Literaturübersicht .......................................................................................... 14

2.1 Das Peroxisom.............................................................................................. 14

2.1.1 Morphologie .................................................................................................. 15

2.1.2 Funktion ........................................................................................................ 18

2.1.3 Interaktion mit Mitochondrien ........................................................................ 29

2.2 Kontrolle der Peroxisomenzahl ..................................................................... 30

2.2.1 Biogenese und Proliferation .......................................................................... 31

2.2.2 Abnahme der Peroxisomenzahl durch Autophagie ...................................... 37

2.3 Hepatopathien des Hundes .......................................................................... 39

2.3.1 Hepatozelluläre Degeneration ...................................................................... 42

2.3.2 Verhalten der Peroxisomen bei degenerativen Veränderungen der

Hepatozyten .................................................................................................. 48

2.3.3 Hepatitiden .................................................................................................... 49

2.3.4 Lebertumoren ............................................................................................... 51

3 Eigene Untersuchungen ............................................................................... 57

3.1 Material und Methoden ................................................................................. 57

3.1.1 Einleitung ...................................................................................................... 57

3.1.2 Patienten ....................................................................................................... 57

3.1.3 Lichtmikroskopische Untersuchung .............................................................. 63

3.1.4 Präparation für die Transmissionselektronenmikroskopie ............................. 63

3.1.5 Auswertung und Dokumentation ................................................................... 65

3.1.6 Statistik ......................................................................................................... 68

3.2 Ergebnisse .................................................................................................... 68

3.2.1 Zusammensetzung der Patientengruppen .................................................... 69

3.2.2 Veränderungen der labordiagnostischen Leberwerte ................................... 72

3.2.3 Lichtmikroskopische Untersuchungsergebnisse ........................................... 76

Inhaltsverzeichnis

3.2.4 Elektronenmikroskopische Untersuchungsergebnisse .................................. 95

4 Diskussion .................................................................................................. 123

4.1 Lichtmikroskopische Untersuchungen ........................................................ 123

4.2 Elektronenmikroskopische Untersuchung ................................................... 127

4.2.1 Quantitative Erfassung der Peroxisomen/Hepatozyt- Fläche ...................... 128

4.2.2 Quantitative Erfassung der Peroxisomen/Hepatozyt- Fläche/Alter ............. 133

4.2.3 Quantitative Erfassung der Peroxisomen/Hepatozyt- Fläche/Rasse........... 133

4.2.4 Morphologische Untersuchungen ............................................................... 134

4.3 Beeinflussung der Peroxisomenzahl durch Medikamente .......................... 140

5 Zusammenfassung ..................................................................................... 142

6 Summary .................................................................................................... 145

7 Literaturverzeichnis ..................................................................................... 148

8 Abbildungsverzeichnis ................................................................................ 166

9 Tabellenverzeichnis .................................................................................... 172

10 Anhang ....................................................................................................... 174

10.1 Protokolle für die Histologie ........................................................................ 174

10.1.1 Fixierlösungen............................................................................................. 174

10.1.2 Färbungen .................................................................................................. 176

10.1.3 Laborprotokolle für Einbettungen ................................................................ 181

10.2 Anhangstabellen ......................................................................................... 182

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

ALT Alaninaminotransferase

ALKP Alkalische Phosphatase

AST Aspartataminotransferase

ATG autophagy-related genes

ß-Oxidation Beta-Oxidation

bzw. beziehungsweise

ca. circa

CuZn SOD Kupfer-Zink Superoxiddismutase

d Tag

DNA Desoxyribonucleic acid

Elmi Elektronenmikroskopie

ggr. geringgradig

GLDH Glutamatdehydrogenase

GS Gallensäuren

HWZ Halbwertzeit

h Stunde

H2O2 Wasserstoffperoxid

hgr. hochgradig

IBD Inflammatory bowel disease

IL Interleukin

IFN γ Interferon gamma

Abkürzungsverzeichnis

JRT Jack Russel Terrier

KGW Körpergewicht

m/mk männlich/männlich kastriert

MDV Mitochondria derived vesicles

MAPL Mitochondria-anchored protein ligase

mgr. mittelgradig

M. Morbus

NASH non alcoholic steatohepatitis

nm Nanometer

NO Stickstoff

PD/PU Polydipsie/Polyurie

PEX Peroxin

PTS Peroxisomal targeting signal

PPO Peroxisomenproliferatoren

PPARs Peroxisome proliferator activated receptors

Px Peroxisom

rER raues (rough) Endoplasmatisches Retikulum

RHT Rauhaardackel

ROS Reactive oxygen species

sER glattes (smooth) Endoplasmatisches Retikulum

s Sekunde

SOD Superoxiddismutase

TGF β Transforming growth factor

Abkürzungsverzeichnis

TNFα Tumor necrosis factor alpha

vak. vakuolär

VLDL Very long density lipoprotein

WHWT Westhighland White Terrier

w/wk weiblich/weiblich kastriert

µm² Quadratmikrometer

1 Einleitung 11

1 Einleitung

Peroxisomen haben eine außerordentliche Bedeutung erlangt, da sie Gegenstand

zahlreicher wissenschaftlicher Untersuchungen in der Humanmedizin sind. Die

Untersuchungsergebnisse zeigen, dass die Peroxisomen an zahlreichen humanen

kongenitalen Erkrankungen beteiligt sind. „Lorenzo´s oil“ ist der Titel eines Filmes,

der sehr eindrücklich das Leben eines Jungen erzählt, der an einer unerklärlichen

Erkrankung leidet. Gleichgewichtsstörungen und letztlich schwere Hirnschädigungen

sind Folgen dieser Erkrankung, bei der es sich um die „Adrenoleukodystrophie“

handelt. Intensive wissenschaftliche Untersuchungen der letzten Jahrzehnte führten

zu der Erkenntnis, dass kleine Zellorganellen, Peroxisomen, die Ursache dieser

Erkrankung sind. Das Zellweger Syndrom und die „Refsum disease“ sind weitere

kongenitale peroxisomale Erkrankungen. Durch die Entdeckung der Peroxisomen

1954 durch RHODIN und die weiteren wissenschaftlichen Untersuchungen des

belgischen Wissenschaftlers DE DUVE (1966) erlangte diese kleine Organelle eine

immer größere Bedeutung. Ihre Beteiligung innerhalb komplexer physiologischer

Vorgänge, wie Einbindung in den Wasserstoffperoxidstoffwechsel, die ß-Oxidation

langer bis sehr langer Fettsäuren, die Synthese komplexer Substrate wie

Cholesterine, Plasmalogene und Gallensäuren, sowie die Fähigkeit sich in

Anwesenheit sogenannter Peroxisomenproliferatoren zu vermehren, machten sie zu

einem spannenden Forschungsgebiet, vor allem in der Humanmedizin. Während sich

die ersten Arbeiten mit den kongenitalen Erkrankungen der Peroxisomen befassten,

folgten durch DE CRAEMER (1995) wissenschaftliche Untersuchungen zum

Verhalten der Peroxisomen bei erworbenen Erkrankungen, wie Steatose, Hepatitis

und Zirrhose, hervorgerufen durch verschiedene Noxen wie Alkohol, Viren und

diverse Medikamente. Weitere Untersuchungen folgten zum Verhalten der

Peroxisomen bei cholestatischen Prozessen der Leber, Hepatomen und

extrahepatischen Tumoren mit oder ohne Lebermetastasen.

Die wissenschaftlichen Erkenntnisse über Peroxisomen in der Veterinärmedizin sind

bis dato sehr gering. LAGING et al. (1988) untersuchten vergleichend das Verhalten

12 1 Einleitung

der Peroxisomen in Leber und Niere von Hunden der Rasse Beagle und Dalmatiner

bei purinreicher und purinarmer Ernährung. Sie kamen zu der Erkenntnis, dass

Dalmatiner unabhängig von der Ernährung größere und zahlreichere Peroxisomen

haben als Beagle. Eine weitere Untersuchung von CENTER und Mitarbeitern (1993)

befasste sich mit dem Verhalten der hepatischen Peroxisomen in an Lipidose

erkrankten Katzen. CENTER et al. (1993) vermuteten dabei, dass eine Abnahme der

Peroxisomen mit dem Krankheitsbild der hepatischen Lipidose einhergeht. Die ersten

elektronenmikroskopischen Daten zur Morphometrie der hepatozellulären

Peroxisomen des Hundes wurden 1973 erhoben. Dies erschien notwendig, da der

Hund immer häufiger für pharmakologische und toxikologische Studien als Modell für

humane Lebererkrankungen herangezogen wurde (HESS et al. 1973).

Elektronenmikroskopische und biochemische Untersuchungen aus der

Humanmedizin zum Verhalten von Peroxisomen bei tumorösen und degenerativen

Erkrankungen der Leber (HRUBAN 1979; DE CRAEMER et al. 1993) ergaben, dass

bei degenerativen Erkrankungen, z.B. aufgrund von hepatischer Lipidose/Steatose

und entzündlichen Prozessen, im Rahmen eines erhöhten oxidativen Stresses für die

Hepatozyten, die Zahl der Peroxisomen ansteigt. Tumoröse Veränderungen der

Leber, seien sie nun primären oder sekundären Ursprunges, führten dagegen in der

Mehrzahl der Fälle zu einer Verminderung der Peroxisomen. Weiterhin haben

Untersuchungen gezeigt, dass unter dem Einfluss des Tumornekrosefaktors die

Bildung von Radikalen erheblich ansteigt. In einem solchen Fall ist die

Kapazitätsgrenze der Peroxisomen erreicht, und es kommt zu einem Abbau dieser

Organelle infolge zunehmender Zellzerstörung (YASMINEH et al. 1991). Es kann

deshalb vermutet werden, dass die Anzahl der Peroxisomen in einem Verhältnis zum

Grad der Malignität zu sehen ist. Weiterhin kann vermutet werden, dass

therapeutische Maßnahmen, welche zu einer Peroxisomenvervielfältigung führen

über eine Beeinflussung des oxidativen Stresses und Veränderungen bei der

Energiegewinnung einen Einfluss auf die Leberzelle haben könnten. Angesichts

dieser Informationen aus der Humanmedizin ist es Ziel dieser Arbeit, das Verhalten

der hepatozellulären Peroxisomen im Metabolismus von Lebererkrankungen des

Hundes elektronenmikroskopisch zu untersuchen. Dabei wurde insbesondere auf

1 Einleitung 13

quantitative und qualitative Unterschiede zwischen degenerativen und entzündlichen

Veränderungen einerseits und malignen Tumoren der Leber andererseits

eingegangen, um zu überprüfen, ob die von CRAEMER et al. (1993) bzw. HRUBAN

(1979) gewonnenen Erkenntnisse auch auf den Hund übertragbar sind.

14 2 Literaturübersicht

2 Literaturübersicht

2.1 Das Peroxisom

Peroxisomen kommen sowohl im Pflanzen- als auch im Tierreich vor. Es wurde von

ihrem Vorkommen in Amphibien, Insekten, Schnecken, Würmern und Protozoen

berichtet (MASTERS u. CRANE 1995).

Die Peroxisomen wurden erstmals 1954 durch RHODIN in Nierentubuluszellen von

Ratten entdeckt, er gab diesen Zellorganellen zunächst den Namen „Microbodies“

(RHODIN 1954). Im Jahre 1956 wurden Zellorganellen, die den bereits

beschriebenen „Microbodies“ der Niere sehr ähnlich waren, in Hepatozyten von

Rattenlebern gefunden (Abbildung 2-1) (LAZAROW u. FUJIKI 1985).

Weitere Aufklärung haben in den 60iger Jahren die biomedizinischen Experimente

von DE DUVE und BAUDHUIN (1966) erbracht, in denen Peroxisomen von

Rattenlebern isoliert und deren enzymatische Ausstattung näher differenziert wurde.

Diese biochemischen Erkenntnisse führten dazu, dass der morphologisch geprägte

Name „Microbody“ der funktionellen Bezeichnung „Peroxisom“ wich.

Die Isolierung der Peroxisomen und die anschließende zentrifugale Fraktionierung

ihrer einzelnen Komponenten, wie das peroxisomale Core oder Nukleoid, die

peroxisomale Matrix und die peroxisomale Membran, ermöglichten eine detaillierte

Aufschlüsselung der enzymatischen Ausstattung der Peroxisomen. Darüber hinaus

diente die Elektronenmikroskopie, insbesondere die zytochemische Färbung und die

immunhistochemische Elektronenmikroskopie, der Aufklärung der Funktion, der Art

und der Lokalisation der einzelnen peroxisomalen Enzyme und der Aufklärung der

verschiedenartigen morphologischen Erscheinungsbilder (MASTERS u. CRANE

1995).

Im Folgenden wird vor allem auf den Aufbau der Peroxisomen und deren

enzymatische Ausstattung im Hinblick auf die verschiedenen Funktionen

eingegangen. Außerdem wird kurz das Peroxisom im Zusammenspiel mit anderen

2 Literaturübersicht 15

Zellorganellen betrachtet. Im Anschluss werden die Mechanismen zur Regulation der

Peroxisomenzahl in der Zelle besprochen, bevor ein allgemeiner Überblick zu den

Hepatopathien des Hundes folgt.

Abbildung 2-1 Aufbau einer idealisierten tierischen Zelle (LÖFFLER et al. 2007)

2.1.1 Morphologie

Peroxisomen sind dynamische Organellen, die in Größe und Aussehen variieren

können. Darüber hinaus sind sie in der Lage, ihre räumliche Position in der Zelle

entlang des Zytoskelettes zu verändern (SCHRADER et al. 2003). Im Gegensatz zu

den Lysosomen, die sich eher perikanalikulär aufhalten, folgt die Lage der

Peroxisomen im Leberläppchen keinem festgelegten Muster (NOVIKOFF u.

16 2 Literaturübersicht

GOLDFISCHER 1969). In gesunden Hepatozyten liegen die Peroxisomen homogen

im Hepatozyten verteilt vor und das Auftreten von Peroxisomen in Gruppen ist üblich

(ROELS et al. 1983).

Peroxisomen können eine sphärische bis längliche Gestalt haben (Abbildung 2-2),

sich aber auch in Form eines tubulär-retikulären Netzwerkes darstellen, welches

häufig mit Fetttropfen assoziiert ist (SCHRADER 2001).

Abbildung 2-2 Elektronenmikroskopische Darstellung eines Peroxisoms (Pfeil) mit Marginalplatte und Nukleoid. (P596-07/K1979), Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 16.000x).

Peroxisomen besitzen im Zentrum einen dunklen homogenen Kern, der kristalline

Strukturen enthält (BERNHARD u. ROUILLER 1956) und nach BAUDHUIN et al.

(1965) als Kern mit „amorpher und fein granulärer Struktur“ beschrieben wird. Der

Kern, auch Nukleoid genannt, ist in Abhängigkeit zur Schnittebene des

elektronenmikroskopischen Präparates nicht in allen Peroxisomen der Leber

sichtbar. Ebenso abhängig von der Schnittebene ist das Erscheinungsbild des

Nukleoids: feingranulär oder polytubulär (DE DUVE u. BAUDHUIN 1966). Im

2 Literaturübersicht 17

Längsschnitt haben die Nukleoide eine längliche rechteckige Gestalt, während sie im

Querschnitt rund erscheinen. Sie liegen frei in der Matrix der Peroxisomen. Der

Umfang der Nukleoide beträgt 0,69-0,74 µm (LAGING et al. 1988). Allgemein ist das

Auftreten der Nukleoide in Leber und Nieren verbunden mit der Anwesenheit von

Uratoxidase, so dass Organismen ohne Nukleoide auch nicht über das Enzym

Uratoxidase verfügen. Es gibt aber Abweichungen davon, so dass Nieren von Ratten

und Hepatozyten des Menschen keine Uratoxidaseaktivität zeigen, jedoch über

Nukleoide verfügen und einige Nichtvertebraten, große Mengen an Uratoxidase

beherbergen, aber keine entsprechend hohe Anzahl an Nukleoiden aufweisen

(MASTERS u. CRANE 1995).

Die Membran der Peroxisomen besteht aus einer trilamellären Struktur, die eine

Dicke von 4,5 bis 8 nm aufweist (HRUBAN et al. 1966). Damit ist sie deutlich dünner

als die Membran von Lysosomen (MASTERS u. CRANE 1995).

Die Peroxisomen des Hundes sind 0,3-0,9 µm im Diameter und somit etwas kleiner

als die Peroxisomen der Ratte. Die Peroxisomen in der Leber von Dalmatinern sind

im Vergleich mit denen von Beagle deutlich größer und weisen eine höhere Dichte

auf (LAGING et al. 1988). Peroxisomen des Hundes enthalten kristalloide Nukleoide,

die aus 3-8 parallel verlaufenden Linien bestehen (SHNITKA 1966). Das Nukleoid

des Peroxisoms beim Hund ist Sitz der Urikase (BAUDHUIN et al. 1965; HAYASHI et

al. 1976; CHEVILLE 1994a). Peroxisomen in Zellen der kaninen Perianaldrüse

(KUHN 1968) sowie der Leber und der Niere (HRUBAN u. RECHCIGL 1969)

besitzen eine Marginalplatte, in Form einer elektronendichten Verdickung unter der

Membran, die durchschnittlich 0,25-0,39 µm lang ist (LAGING et al. 1988). In diesem

Teil des Peroxisoms ist die L-alpha-Hydroxysäureoxidase B lokalisiert (ZAAR 1992).

Die Peroxisomen des Hundes nehmen nur ca. 3,9 % des Zytoplasmas ein, obwohl

ca. doppelt so viele in einer Zelle vorhanden sind wie Mitochondrien, die 24 % des

zytoplasmatischen Volumens ausmachen (HESS et al. 1973).

Aufgrund ihrer charakteristischen morphologischen Eigenschaften sollen

Peroxisomen auch ohne spezielle Färbung eindeutig von den häufig räumlich

benachbarten Mitochondrien zu unterscheiden sein (BERNHARD u. ROUILLER

18 2 Literaturübersicht

1956). Eine Abgrenzung von Lysosomen ist ebenfalls möglich, da Peroxisomen

kleiner sind, ein homogeneres Erscheinungsbild besitzen, häufig zentral ein Nukleoid

aufweisen und eng mit dem Endoplasmatischen Retikulum assoziiert sind (SHNITKA

1966). Darüberhinaus sind Lysosomen in der Lage Substrate zu inkorporieren, eine

Eigenschaft, die den Peroxisomen fehlt (SHNITKA 1966).

Im Rahmen eines schnellen Zellwachstums können die Peroxisomen sehr

verschiedenartige und komplexe Formen annehmen. Dieses Phänomen kann

beispielsweise durch eine partielle Hepatektomie, Stimulation mit

Wachstumsfaktoren, Zugabe freier Fettsäuren oder freier Radikale provoziert werden

(SCHRADER et al. 1998a; SCHRADER et al. 1999).

2.1.2 Funktion

Die Peroxisomen sind in ein großes Spektrum an Aufgaben und Funktionen in der

eukaryontischen Zelle involviert (PLATTA u. ERDMANN 2007). Sie sind besonders

an Oxidations- und Detoxifikationsvorgängen beteiligt (CHEVILLE 1994e). Die

Aufgaben der Peroxisomen variieren je nach Organismus, Gewebe und der

Umgebung, in der sie sich befinden. Daher verfügen sie in den einzelnen Geweben

über unterschiedliche Enzymausstattungen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN

1992) mit über 50 verschiedenen Enzymen (DE DUVE u. BAUDHUIN 1966). Davon

sind die meisten ausschließlich in Peroxisomen lokalisiert, während einige außerdem

in Mitochondrien vorkommen (WANDERS u. WATERHAM 2006). Trotz der großen

enzymatischen Variation gilt jedoch das Auftreten von Oxidase und Katalase in den

Peroxisomen als konstant und dient somit ihrer Charakterisierung und Identifizierung

(MASTERS u. CRANE 1995).

Mehr als siebzig Prozent der peroxisomalen Enzyme befinden sich in der Matrix.

Einige wenige Enzyme sind im Nukleoid lokalisiert und der verbleibende Anteil ist in

der einfachen Membran der Peroxisomen angesiedelt (MANNAERTS u. VAN

VELDHOVEN 1992).

Das Aufgabenspektrum ist sehr komplex und umfasst den Peroxidmetabolismus, die

ß-Oxidation sowie die Biosynthese von Etherphospholipiden (Plasmalogene), welche

2 Literaturübersicht 19

besonders im Nervensystem zu finden sind. Die Synthese von Cholesterol,

Gallensäuren, Leukotrienen, Prostaglandinen und der Metabolismus von Xenobiotika

obliegt ebenfalls den Peroxisomen. Cholesterol ist ein wichtiger Bestandteil von

Membranen und dient als Komponente von Lipoproteinen. Darüber hinaus ist es an

der Synthese von Gallensäuren und Steroiden beteiligt (MASTERS u. CRANE 1995).

Da Peroxisomen auch am Abbau insbesondere von sehr langkettigen Fettsäuren

beteiligt sind, haben ihre Abwesenheit oder das Fehlen eines ihrer Enzyme, wie

Katalase oder Oxidase, metabolische Konsequenzen. Zahlreiche angeborene

Erkrankungen, darunter das Zellweger Syndrom, lassen Peroxisomen in den

Körperzellen missen und führen dadurch zu schweren körperlichen Anomalien, die

mit einem Überleben über das Säuglingsalter hinaus nicht vereinbar sind. Ein

anderes Beispiel ist der Urikasedefekt des Dalmatiners, bei dem das dunkle Zentrum

des Peroxisomes, als Sitz der Urikase definiert, beim Dalmatiner deutlich kleiner

ausgeprägt ist als bei anderen Hunderassen. Das klinische Bild ist durch deutlich

erhöhte Harnsäureaussscheidung charakterisiert mit der Gefahr der Uratsteinbildung

in den harnbildenden und –ableitenden Wegen (CHEVILLE 1994a).

Im Folgenden werden die wichtigsten Funktionen und Aufgaben der Peroxisomen

näher erläutert.

2.1.2.1 Peroxidmetabolismus

Eine der wichtigsten Funktionen der Peroxisomen ist die Neutralisierung von freien

Radikalen mit Hilfe enzymatischer Mechanismen, die im Folgenden besprochen

werden.

Oxidativer Stress ist ein Zustand der Imbalanz zwischen prooxidativ wirkenden

Komponenten (Oxidantien) und antioxidativ wirkenden Abwehrmechanismen

(Antioxidantien), der durch einen Überschuss an freien Radikalen gekennzeichnet ist

(DJORDJEVIC 2004). Der Redox Status ist dabei ein übergeordneter Begriff, der

beide Mechanismen zusammenfasst (WEBB u. TWEDT 2008).

20 2 Literaturübersicht

Freie Radikale wirken prooxidativ, da sie ein oder mehrere ungepaarte Elektronen

aufweisen (WEBB u. TWEDT 2008). Zu dieser Gruppe gehören das Superoxid-

Radikal O2-, das Hydrogen Radikal H•, das Hydroxyl Radikal OH• und das Hydrogen

Peroxid Radikal H2O2 (DJORDJEVIC 2004). Diese sind in der Lage, unterschiedliche

Biomoleküle wie Lipide, Proteine und Nukleinsäuren (DJORDJEVIC 2004)

anzugreifen und in ihrer Funktion schwer zu beeinträchtigen (LÖFFLER et al. 2007).

Die meisten freien Radikale stammen vom Sauerstoff ab, dann bezeichnet man sie

auch als reaktive Sauerstoffverbindungen (ROS=reactive oxygen species). Die

Radikalbildung ist unweigerlich an die mitochondriale Energieproduktion gekoppelt

(GEROK 1995; MANDELKER 2008; WEBB u. TWEDT 2008). Die Reduktion des

Sauerstoffes während der mitochondrialen Atmungskette erzeugt freie Radikale wie

das Superoxidradikal (MANDELKER 2008). Die zweite Gruppe der Radikale stammt

von Stickstoff ab und wird als Gruppe reaktiver Nitrogenverbindungen (RNS)

bezeichnet (MANDELKER 2008). Der gesunde Organismus wandelt ein Viertel des

eingeatmeten Sauerstoffes zu Radikalen um. Bei Krankheit werden sogar drei Viertel

des inspiratorischen Sauerstoffes in Radikale umgesetzt (DJORDJEVIC 2004).

Freie Radikale sind an der Pathogenese von zahlreichen Krankheitsprozessen

beteiligt, beeinflussen das Immunsystem negativ und beschleunigen den

Alterungsprozess der Zelle (DJORDJEVIC 2004; MANDELKER 2008; CAMOES et

al. 2009). So können zahlreiche unterschiedliche Ursachen wie Toxämien,

Infektionen, hypoxisch-ischämische Zustände, Hyperglykämien, die Verstoff-

wechslung von Xenobiotika, Hyperlipidämien, Hyperproteinämien, Neoplasien,

Entzündungen sowie Immunreaktionen und erhöhte metabolische Raten oxidativen

Stress auslösen. Vor allem bei alternden Geweben kann ein zu niedriger ATP

Gehalt, bedingt durch eine ungenügende mitochondriale Produktion, zu erhöhtem

oxidativen Stress führen (MANDELKER 2008). Außerdem entstehen freie Radikale

bei Absorption von Strahlung, dem Metabolismus von Ethanol in Hepatozyten und

Lipidperoxidation von ungesättigten Fettsäuren (DJORDJEVIC 2004). Der Vorgang

der Lipidperoxidation wird dabei selbst auch durch freie Radikale in Gang gesetzt

und dann durch sekundär gebildete Radikale aufrecht erhalten, welche das

umliegende Gewebe schädigen und so eine Kettenreaktion auslösen. Von der

2 Literaturübersicht 21

Lipidperoxidation sind besonders die sehr empfindlichen, mehrfach ungesättigten

Fettsäuren als Bestandteil von Zellmembranen und intrazellulären Organellen

betroffen (DJORDJEVIC 2004).

Die Folge der Lipidperoxidation ist eine Zunahme der Membranpermeabiltät, so dass

die Integrität von Zellorganellen wie Peroxisomen, Mitochondrien und Lysosomen

herabgesetzt wird. Darüber hinaus werden Enzyme und Rezeptoren inaktiviert.

Letztlich kann die Peroxidation zur Zerstörung aller Lipidmembranen führen

(HARMAN 1956). Mit der Zerstörung von Zellorganellen, wie z.B. den Mitochondrien,

beginnt der Alterungsprozess der Zelle, da die Energieproduktion abnimmt, vermehrt

freie Radikale anfallen und der oxidative Stress zunimmt, was wiederum zu einer

weiteren Zellschädigung führt (WALLACE 2001). Zusammenfassend kann also der

oxidative Schaden, verursacht durch freie Radikale, entweder die Ursache aber auch

die Folge mitochondrialer Dysfunktion sein (MANDELKER 2008).

Der Entstehung von Tumoren liegen Mutationen und unkontrollierte

Zellproliferationen zu Grunde. Die chronische Exposition durch oxidativen Stress

kann Mutationen der DNA zur Folge haben, die zur Expression modifizierter Gene

führen und somit das Wachstum von Tumoren unterstützen. Daher wird dem

oxidativen Stress auch eine Beteiligung an der Karzinogenese zugesprochen

(DJORDJEVIC 2004; KLAUNIG u. KAMENDULIS 2004).

Antioxidantien

Antioxidative Mechanismen wirken den freien Radikalen entgegen und können in

enzymatische und nicht enzymatische Prozesse eingeteilt werden. Im Folgenden

werden nur die enzymatischen Antioxidantien besprochen, da diese in Peroxisomen

vorkommen. Zu dieser Gruppe gehören die Katalase, als ein Bestandteil der

Peroxisomen, die Glutathionperoxidase und die Superoxiddismutase (SOD) (GEROK

1995; SCHRADER u. FAHIMI 2004). Glutathionperoxidasen sind wichtige

Bestandteile des antioxidativen Schutzsystems aller Zellen, kommen aber auch im

Extrazellularraum vor (LÖFFLER et al. 2007). Das Enzym ist in der Matrix und in den

Mitochondrien lokalisiert und kann als ein alternatives Enzym zur Katalase betrachtet

werden. Es ist in der Lage, organische Peroxide, wie Lipidperoxide (CHEVILLE

22 2 Literaturübersicht

1994b; DJORDJEVIC 2004; LÖFFLER et al. 2007) oder Wasserstoffperoxide

abzubauen, wenn die Katalaseaktivität ausgeschaltet ist, wie z.B. im Falle einer

Endotoxämie oder des Ischämie-Reperfusionssyndroms (SINGH et al. 1994).

Die Superoxiddismutase (SOD) existiert in verschiedenen Varianten mit

unterschiedlichen Metallionen im aktiven Bereich des Enzyms. CuZn SOD findet sich

im Zytoplasma, im Kern und in Peroxisomen von Säugetieren (DJORDJEVIC 2004).

Weiterhin existiert eine SOD im Serum und anderen extrazellulären Flüssigkeiten

(MARKLUND 1980). Eine erhöhte Aktivität der SOD wird über Zytokine wie IFN γ

induziert, während eine verminderte Aktivität über TNFα und TGF β eingeleitet wird

(MARKLUND 1992). Die SOD unterstützt die Beseitigung von Superoxidanion- und

Hydroxyperoxidradikalen, indem das weniger reaktionsfähige Wasserstoffperoxid

und molekularer Sauerstoff entsteht (GEROK 1995). Das Wasserstoffperoxid dient

dann wiederum der Katalase als Substrat (MASTERS u. CRANE 1995;

ANGERMULLER et al. 2009).

Peroxisomen verfügen sowohl über Oxidasen, die Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid

reduzieren können, als auch über Katalasen, die Wasserstoffperoxid zu Wasser

reduzieren (BAUDHUIN et al. 1965; DE DUVE u. BAUDHUIN 1966; SHNITKA 1966).

Die Enzyme Katalase und einige Oxidasen sind in der Matrix lokalisiert (BAUDHUIN

et al. 1965). Es existieren verschiedene Oxidasen, die ein spezielles Endprodukt und

zusätzlich Wasserstoffperoxid produzieren. Zu den peroxisomalen Oxidasen gehören

die L-α-Hydroxyacid-Oxidasen A und B. Hydroxyacid-Oxidase A ist in der Matrix und

Hydroxyacid-Oxidase B ist in der Marginalplatte lokalisiert. Beide Enzyme finden sich

insbesondere in Leber und Niere. Eine weitere Oxidase, die D-Aminoacid-Oxidase,

ist außer in den Peroxisomen auch frei im Zytosol der Zelle vorhanden (MASTERS u.

CRANE 1995).

Die Produktion und Reduktion der Wasserstoffperoxide mittels Katalase sowie die

Entgiftung anderer reaktiver Sauerstoffradikale schützt Zellen vor oxidativen

Schädigungen (TERLECKY et al. 2006). Die Katalase ist ein ubiquitäres Enzym

(SHARMA et al. 1989), das 40 % des peroxisomalen Proteins ausmacht (DE DUVE

u. BAUDHUIN 1966) und eine besonders hohe Aktivität in der Leber aufweist. Außer

2 Literaturübersicht 23

in Peroxisomen ist das Enzym auch in Mitochondrien lokalisiert, eine für die Zelle

günstige Lage, da hier viele Wasserstoffperoxid produzierende Enzyme ansässig

sind (SHARMA et al. 1989).

Die Katalase unterstützt sowohl katalytische als auch peroxidative Reaktionen.

Beide Reaktionen benötigen Wasserstoffperoxid. Im katalytischen Fall kommt ein

zweites Wasserstoffperoxid zur Reaktion dazu und es entsteht Wasser und

Sauerstoff. In der peroxidativen Reaktion reagiert Wasserstoff mit weiteren

Wasserstoffdonatoren, wie Alkoholen, Phenolen, Nitriten, Formaldehyd und primären

Aminen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992; GEROK 1995; MASTERS u.

CRANE 1995).

Katalytische Reaktion: H2O2 + H2O 2H2O + O2

Peroxidative Reaktion: H2O2 + RH2 2H2O + R

Peroxiosmen verfügen über zahlreiche weitere Enzyme. Eine umfassende Übersicht

bieten Kapitel 2 („Enzymology“) und Kapitel 3 („Intraparticulate organization of

peroxisomal proteins-methodology and topology“) des Buches „The peroxisome: a

vital organelle“ von Colin Masters und Denis Crane (MASTERS u. CRANE 1995).

Rolle der Mitochondrien bei oxidativem Stress

Mitochondrien werden ursächlich durch Hypoxie, freie Radikale und Toxinbelastung

geschädigt (VIEIRA u. KROEMER 1999).

Neben den vielseitigen, für die Zelle nützlichen Aufgaben, tragen die Mitochondrien

aber auch selbst zur Radikalbildung bei (ROTH 1997). O2- und H2O2 reagieren häufig

mit Eisen, das sich in den Mitochondrien befindet. Dadurch kann die mitochondriale

DNA geschädigt werden. Die Folge dieser Schädigung ist eine Verstärkung des

oxidativen Stresses aufgrund Expression veränderter Proteine, die verantwortlich für

die Elektronentransportkette sind. Es entsteht ein Circulus vitiosus mit verstärkter

24 2 Literaturübersicht

Radikalbildung (LEE u. WEI 1997) Unter physiologischen Bedingungen werden die

Radikale durch Antioxidantien neutralisiert (ROTH 1997). Das wichtigste Antioxidans

zum Schutz der Mitochondrien ist Glutathion (MANDELKER 2008). Bei

Krankheitszuständen, z.B. Sepsis, reichen diese Mechanismen jedoch nicht aus und

erschöpfen (ROTH 1997). Oxidativer Stress der Mitochondrien kann zu einer

Aktivierung der Mitochondrienexpression führen und damit zu Erhöhung der

Organellenanzahl (MANDELKER 2008). Neben dem Enzym Glutathion schützen

erhöhte peroxisomale Katalasekonzentrationen die Mitochondrien vor Fehl-

funktionen, während niedrige Konzentrationen zu einer mitochondrialen Dysfunktion

führen können (KOEPKE et al. 2008).

2.1.2.2 ß-Oxidation

In der Pilz- und Pflanzenzelle ist dieser biochemische Vorgang ausschließlich in den

Peroxisomen lokalisiert. In eukaryontischen Zellen findet die ß-Oxidation sowohl in

Mitochondrien als auch in Peroxisomen statt, mit dem Ziel, die Lipidhomöostase

aufrechtzuerhalten (WANDERS 2004b; POIRIER et al. 2006).

Das peroxisomale ß-Oxidationssystem dient über etwa fünf hintereinander

ablaufende ß-Oxidationszyklen der Verkürzung von sehr langen und toxischen

Fettsäuren (REDDY u. MANNAERTS 1994; MASTERS u. CRANE 1995;

HASHIMOTO 1999). Kurze Fettsäuren (<C8) sind kein geeignetes Substrat für

Peroxisomen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992). Die peroxisomale

Oxidationsrate der Fettsäuren durch die Peroxisomen nimmt bei gleichzeitig sich

verkürzender Kettenlänge ab. Ungesättigte Fettsäuren werden dahingegen

bevorzugt von den Peroxisomen oxidiert (MASTERS u. CRANE 1995).

Die daraus hervorgehenden kurz- und mittellangen Fettsäuren erreichen dann das ß-

Oxidationssystem der Mitochondrien. Diese Verstrickung der Stoffwechselwege zeigt

das enge Verhältnis von Mitochondrien und Peroxisomen (LAZAROW 1978;

HASHIMOTO 1987; MASTERS u. CRANE 1995). Der weitaus größte Anteil der

langen Fettsäuren wird in Mitochondrien der ß-Oxidation unterzogen. Die

Begründung liegt darin, dass die mitochondriale ß-Oxidation im Hinblick auf die

2 Literaturübersicht 25

Energiegewinnung um das zweifache effektiver ist als die peroxisomale ß-Oxidation

der Peroxisomen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992).

Die Enzyme zur peroxisomalen ß-Oxidation befinden sich in der Matrix. Dabei

unterliegt die peroxisomale Enzymausstattung einer Dynamik, die von dem Gewebe,

der Spezies und den Rahmenbedingungen sowie dem Einfluss von Umweltfaktoren

oder Xenobiotika abhängt (MASTERS u. CRANE 1995).

Die eigentliche ß-Oxidation gesättigter Fettsäuren verläuft in vier Schritten

(Abbildung 2-3):

1) Acyl-CoA wird mittels Acyl-CoA-Dehydrogenase zu 2-trans-Enoyl-CoA

oxidiert, dabei entsteht Wasserstoffperoxid.

2) Hydratationsschritt mittels Enoyl-CoA-Hydratase mit Zwischenprodukt L-

Hydroxyl-CoA.

3) Oxidationsschritt mittels L-3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase mit dem

Zwischenprodukt 3-Ketoacyl-CoA

4) Aus 3-Ketoacyl-CoA entsteht durch das Enzym ß-Ketoacyl-CoA-Thiolase,

mittels der thiolytischen Spaltung des Ketoacyl-CoAs, ein Acetyl-CoA und eine

um zwei C-Atome verkürzte aktivierte Fettsäure, die wieder in den ß-

Oxidationszyklus einfließen kann (LAZAROW 1978; HASHIMOTO 1987)

26 2 Literaturübersicht

Abbildung 2-3 Abbau geradzahliger Fettsäuren durch β-Oxidation (LÖFFLER et al. 2007)

Der Vorgang der ß-Oxidation beginnt mit der Aktivierung der Fettsäure. Die

peroxisomale Membran besitzt zwei Acyl-CoA-Synthetasen, die an der Aktivierung

von langen (C14-C20) und sehr langen Fettsäuren (>C20) beteiligt sind (MANNAERTS

et al. 1982; SINGH u. POULOS 1988; LAZO et al. 1990; LAGEWEG et al. 1991). Zur

Aktivierung werden ATP und Coenzyme A benötigt (MASTERS u. CRANE 1995). Da

in Peroxisomen vor allem die Oxidation sehr langer Fettsäuren stattfindet, zeigen

Patienten mit Peroxisomenmangel eine erhöhte intrazelluläre Anhäufung von sehr

langen Fettsäuren (MASTERS u. CRANE 1995).

Im Folgenden werden die wichtigsten Unterschiede zwischen peroxisomaler und

mitochondrialer ß-Oxidation in tabellarischer Form aufgezeigt:

2 Literaturübersicht 27

Tabelle 2-1 Unterschiede peroxisomaler und mitochondrialer β-Oxidation

Funktion

ß-Oxidation

(Peroxisom)

ß-Oxidation

(Mitochondrien)

Fettsäuretransport in die Organelle

(MANNAERTS et al. 1979; MASTERS u.

CRANE 1995)

membranständiges Transportsystem,

Carnithin unabhängig

Carnithin abhängig

Energieweiterverarbeitung (LAZAROW u.

DE DUVE 1976; MANNAERTS et al.

1979)

Abgabe von Wärme

Verknüpfung mit oxidativer

Phosphorylierung/Elektronentransportkette

Ablauf der ß-Oxidation (LAZAROW 1978) unvollständig,

lediglich Verkürzung von Fettsäuren

vollständig

Funktion der ß-Oxidation

(LAZAROW 1987; HAYASHI u. MIWA

1989; HAYASHI u. TAKAHATA 1991;

OSMUNDSEN et al. 1991)

Substratbereitstellung für anabole

Vorgänge (Cholesterin- u. Gallen-

säuresynthese, Phospholipide)

Eliminierung schlecht

verstoffwechselbarer Verbindungen

Bereitstellung von Energie für zelluläre

Abläufe

Enzymatische Ausstattung

(MASTERS u. CRANE 1995) 3 Enzyme

4 Enzyme

Energiestatus der Zelle

(MASTERS u. CRANE 1995) ATP unabhängig

ATP abhängig

steigt mit sinkendem ATP Gehalt

2.1.2.3 Weitere Funktionen der Peroxisomen

Synthese der Plasmalogene

Die Peroxisomen verfügen über eine enzymatische Ausstattung zur Synthese von

Plasmalogenen. Diese werden außer in den Peroxisomen auch im

Endoplasmatischen Retikulum hergestellt (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN

1992). Im menschlichen Organismus bilden die Plasmalogene 18 % der gesamten

Phospholipide (WANDERS u. WATERHAM 2006) und machen mehr als 80 % des

Phospholipidgehaltes der weißen Substanz im Gehirn aus (WANDERS 2004a).

Cholesterinsynthese

Außerdem enthalten Peroxisomen Anteile der enzymatischen Ausstattung zur

Bildung des Cholesterols (WANDERS u. WATERHAM 2006). Die Menge des in den

Peroxisomen produzierten Cholesterols ist jedoch im Vergleich zur Cholesterol-

synthese des Endoplasmatischen Retikulums sehr klein. Die physiologische Rolle

28 2 Literaturübersicht

der peroxisomalen Cholesterolsynthese ist bis jetzt unklar (MANNAERTS u. VAN

VELDHOVEN 1992).

Harnsäurestoffwechsel

Das Enzym Uratoxidase oder auch Urikase ist am Purinkatabolismus beteiligt und

findet sich in den meisten Säugetierperoxisomen (USUDA et al. 1988). Dort ist es,

wie auch die Xanthinoxidase bevorzugt, im Nukleoid lokalisiert. Es gibt jedoch auch

Vertebraten, die eine nennenswerte peroxisomale Aktivität dieses Enzyms

aufweisen, ohne Nukleoide zu besitzen (MASTERS u. CRANE 1995). Die

Xanthinoxidase verstoffwechselt Xanthin zu Harnsäure, während die Uratoxidase die

Oxidation von Urat mit Hilfe von molekularem Sauerstoff zu Allantoin katalysiert

(MASTERS u. CRANE 1995). Bei einigen Neuweltaffen und dem Menschen fehlt die

Uratoxidase in hepatozellulären Peroxisomen, sodass bei diesen Spezies Harnsäure

als Endprodukt des Purinkatabolismus ausgeschieden wird (USUDA et al. 1988;

MASTERS u. CRANE 1995). Primaten verfügen dagegen über eine gewisse

Leberuratoxidaseaktivität und zeigen daher nur niedrige Harnsäurespiegel

(MASTERS u. CRANE 1995).

Die Gicht des Menschen ist eine Erkrankung in Folge des Mangels an Uratoxidase

(MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992; HAYASHI et al. 2000). Es ist das einzige

peroxisomale Enzym, das in der veterinärmedizinischen Literatur für den Hund

beschrieben ist und befindet sich in den hepatozellulären Peroxisomen im Nukleoid

(LAGING et al. 1988). Der Dalmatiner besitzt im Vergleich zum Beagle eine höhere

Anzahl und auch größere Peroxisomen. Es handelt sich hier um einen

kompensatorischen Mechanismus, um einer erhöhten Harnsäurekonzentration im

Blut vorzubeugen. Die Unfähigkeit der Hepatozyten des Dalmatiners, aus Harnsäure

mittels der in den Peroxisomen lokalisierten Urikase Allantoin zu synthetisieren, liegt

jedoch nicht an dem bei dieser Rasse vorherrschenden Urikasemangel, sondern

aufgrund eines Transportdefektes, an einer verminderten Fähigkeit der Hepatozyten,

die Harnsäure in die Hepatozyten hineinzutransportieren (GIESECKE et al. 1985;

LAGING et al. 1988).

2 Literaturübersicht 29

2.1.3 Interaktion mit Mitochondrien

Peroxisomen sind Organellen, die nicht isoliert im Zytoplasma liegen, sondern

aufgrund metabolischer Zusammenhänge mit anderen subzellulären Strukturen, wie

den Mitochondrien, dem Endoplasmatischen Retikulum, Fetttropfen und dem Zytosol

assoziiert sind (WANDERS 2004b; POIRIER et al. 2006).

Wie bereits beschrieben, ist die ß-Oxidation ein grundlegender Mechanismus, der

ebenso wie die Thermogenese sowohl in Peroxisomen als auch in Mitochondrien

stattfindet (REDDY u. MANNAERTS 1994; WANDERS 2000, 2004b). Darüber

hinaus teilen sie sich Komponenten in der Zelle, die zur Organellenteilung notwendig

sind (SCHRADER 2006; SCHRADER u. YOON 2007). Vor kurzem wurde ein

Transportmechanismus zwischen Mitochondrium und Peroxisom entdeckt

(NEUSPIEL et al. 2008), der dazu dienen könnte, Metabolite, Lipide oder Proteine

zwischen den beiden Organellen auszutauschen (KOCH et al. 2005). Dazu befindet

sich an der äußeren mitochondrialen Membran eine Ligase MAPL (mitochondria-

anchored protein ligase), welche ein „RING-Finger Motiv“ umfasst und die

Morphologie der Mitochondrien reguliert. Diese MAPL Struktur kann dann in Form

von Vesikeln (MDV=mitochondria derived vesicles) von Mitochondrien abschnüren

und später mit Peroxisomen verschmelzen. Somit teilen sich Mitochondrium und

Peroxisom nicht nur wichtige Regularien zur Teilung, sondern sind auch über

metabolische Funktionen eng miteinander verknüpft (NEUSPIEL et al. 2008). Eine

andere Funktion der MDV´s könnte der Rücktransport von zu den Mitochondrien

fehlgeleiteten peroxisomalen Membranproteinen sein, was häufig unter

experimentellen Bedingungen beobachtet wird (SACKSTEDER et al. 2000).

30 2 Literaturübersicht

2.2 Kontrolle der Peroxisomenzahl

Die Zelle hat die Fähigkeit auf metabolischen oder umgebungsbedingten Stress zu

reagieren, indem sie die Zahl der Peroxisomen erhöht, bei Bedarf jedoch auch

überschüssige oder geschädigte Organellen entfernt (YAN et al. 2005).

Peroxisomen sind Zellorganellen, die sich sowohl über Wachstum und Teilung

vermehren, als auch aufgrund ihrer engen Assoziation mit dem Endoplasmatischen

Retikulum neu gebildet werden können (GRABENBAUER et al. 2000; SCHRADER

u. FAHIMI 2006).

Die Peroxisomen sind sehr stark in Hepatozyten vertreten. In einem Hepatozyten

finden sich bis zu 1000 Peroxisomen in enger Verbindung zum Endoplasmatischen

Retikulum (CHEVILLE 1994e). Weiterhin findet man sie in großer Zahl in renalen

Tubuluszellen und in steroidsynthetisierenden Zellen (CHEVILLE 1994e).

Die Verteilung von Peroxisomen innerhalb einer Zelle bzw. im Zellverband bedarf der

Bewegung einzelner Organellen. Für diesen Zweck benötigen die Peroxisomen der

Säugetiere auf Mikrotubuli basierende Filamente (SCHRADER et al. 2003). Die

Motilität der Organelle dient dazu, eine gleichmäßige Verteilung innerhalb der Zelle

aufrechtzuerhalten, mit anderen Peroxisomen oder anderen Zellorganellen in Kontakt

zu treten oder auch Zellkompartimente zu erreichen, die aufgrund der metabolischen

Situation Peroxisomen benötigen (SCHRADER et al. 2003). Es können zwei

Bewegungsarten unterschieden werden. Die erste Variante beinhaltet eine

langsame, nicht gerichtete Bewegung, der sich ca. 95 % der Peroxisomen bedienen.

Sie benötigt keine Mikrotubuli und ist energieunabhängig. Die zweite Möglichkeit der

Bewegung ist eine energieverbrauchende, schnelle, gerichtete Motilität, die an

Mikrotubuli gekoppelt ist (WIEMER et al. 1997). Weitere Untersuchungen der

Peroxisomenmotilität an kultivierten Zellen ergaben, dass sich elongierte oder

retikulär ausgerichtete Peroxisomen langsamer und ohne Mikrotubuli bewegen,

während sphärische Peroxisomen deutlich schneller entlang des Mikrotubulisystems

ihre Lokalisation verändern können (SCHRADER 2001).

2 Literaturübersicht 31

In eukaryontischen Zellen gibt es drei verschiedene Wege, die die Anzahl der

Peroxisomen in der Zelle beeinflussen können (YAN et al. 2005).

Einer der drei Mechanismen umfasst die Peroxisomenteilung im Rahmen der

Zellteilung mit Aufteilung der Organellen auf die Tochterzellen (VEENHUIS et al.

2003). Der zweite Mechanismus beinhaltet die Autophagie von überflüssigen oder

geschädigten Peroxisomen (FARRE u. SUBRAMANI 2004; YAN et al. 2005). Der

letzte Vorgang umfasst die übermäßige starke numerische Zunahme von

Peroxisomen in kurzer Zeit unabhängig vom Zellzyklus; dieser Vorgang wird

allgemein als Peroxisomenproliferation bezeichnet (YAN et al. 2005).

2.2.1 Biogenese und Proliferation

Die Neuentstehung der Peroxisomen war und ist ein ständiger Diskussionspunkt

(PLATTA u. ERDMANN 2007) und seit ihrer Entdeckung 1954 gibt es dazu viele

Theorien (BERNHARD u. ROUILLER 1956).

Die ersten Untersuchungen, die zur Aufklärung der Biogenese von Peroxisomen in

eukaryontischen Zellen beitrugen, wurden an Hefen und Pflanzen durchgeführt und

die daraus gewonnenen Erkenntnisse auf die Säugetierzelle übertragen (GOULD u.

VALLE 2000). Dabei zeigte sich, dass die Regulation und Transkription bestimmter

Gene, sogenannter PEX-Gene, und die daraus hervorgehenden Proteine, die

sogenannten Peroxine, maßgeblich an der Entstehung von Peroxisomen beteiligt

sind.

Bis heute sind 32 PEX Gene bekannt, die an drei verschiedenen Schlüsselpositionen

der Peroxisomentwicklung involviert sind (VAN DER ZAND et al. 2006): an der

Bildung der peroxisomalen Membran, der Peroxisomenproliferation und der

Bereitstellung und Positionierung von peroxisomalen Matrixproteinen (PLATTA u.

ERDMANN 2007).

Peroxisomenteilung

Hierbei können zwei grundlegende Teilungsvorgänge unterschieden werden. Zum

einen findet während der Zellteilung eine Teilung der vorhandenen Peroxisomen

32 2 Literaturübersicht

statt, um eine gleichbleibende Anzahl an Peroxisomen in den Tochterzellen zu

gewährleisten. Es handelt sich dann um eine konstitutive Teilung.

Zum anderen kann durch extrazelluläre Stimuli eine intrazelluläre Teilung der

Peroxisomen provoziert werden, die eine starke Vermehrung (Proliferation) zur Folge

hat. Diese Peroxisomenproliferation ist charakterisiert durch eine numerische

Zunahme, erhöhte Volumendichte, zunehmende Größe und gegebenenfalls eine

vermehrte Bereitstellung von peroxisomalen Enzymen. Dadurch wird erhöhten

metabolischen Anforderungen Rechnung getragen (SCHRADER u. FAHIMI 2006).

Peroxisomen enthalten keine DNA. Die Informationen zur Herstellung von

peroxisomalen Proteinen ist in nukleären Genen verschlüsselt (LAZAROW u. FUJIKI

1985). Biochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Proteine der

Membran und der Peroxisomenmatrix an freien, im Zytosol befindlichen

Polyribosomen produziert und posttranslational in bereits bestehende Peroxisomen

transportiert werden. Hierauf begründet sich die Theorie, dass die Peroxisomen

Organellen sind, die sich wie Mitochondrien und Chloroplasten über Wachstum und

Teilung vermehren (LAZAROW u. FUJIKI 1985). Das Wachstum von Peroxisomen

wird dabei durch den Import von Membran- und Matrixproteinen gewährleistet. Bei

entsprechender Größe kommt es zur Aufteilung der Matrix und der peroxisomalen

Membran in mindestens zwei neue Peroxisomen (SCHRADER u. FAHIMI 2006).

Neuere Untersuchungen am Beispiel von Saccharomyces cerevisiae zeigen, dass

peroxisomale Bausteine aus dem Endoplasmatischen Retikulum hervorgehen,

insbesondere die peroxisomalen Membranteile, die bei der de-novo Synthese von

Peroxisomen benötigt werden (HOEPFNER et al. 2005; VAN DER ZAND et al.

2006).

Ausgehend vom Stadium des reifen Peroxisoms werden für eine Verdopplung

folgende Stadien durchlaufen (Abbildung 2-4) :

1) Verlängerung und Abschnürung

2) Teilung und Gruppenbildung

3) Trennung der Peroxisomen

2 Literaturübersicht 33

4) Wachstum der neu entstandenen Peroxisomen,

Wachstum und Reifung durch Matrixproteinimport

Verlängerung/ Abschnürung

Teilung/Gruppenbildung

Trennung

Wachstum/Reifung durch Matrixproteinimport

Reifes Peroxisom

1

2

3

4

Abbildung 2-4 Modell für die Teilung und Proliferation von Peroxisomen (modifiziert nach PLATTA u. ERDMANN 2007)

Wachstum und Reifung der Peroxisomen

Das Verfahren zur Proteinherstellung gilt sowohl für Matrixproteine als auch für

peroxisomale Membranproteine. Die im Endoplasmatischen Retikulum produzierten

peroxisomalen Membranproteine werden in das neu entstehende Peroxisom

eingebaut. Dadurch findet ein Wachstums- und Reifungsprozess statt, bis es

aufgrund der maximalen Größe erneut zu einer Teilung kommt. Damit die neu

synthetisierten Proteine die Peroxisomen erreichen, verfügen diese über

„peroxisomale targeting Signale“ (PTS). Zwei dieser Zielsignale sind bekannt unter

den Abkürzungen PTS1 und PTS2 (GOULD u. VALLE 2000; PLATTA u. ERDMANN

2007).

34 2 Literaturübersicht

Zum besseren Verständnis des peroxisomalen Wachstums kann der gesamte

Prozess in wenige wichtige Schritte unterteilt werden (Abbildung 2-5).

Der erste Schritt umfasst die Bindung eines neu synthetisierten, gefalteten Proteins

an den PTS1/Pex5-Rezeptor oder den löslichen Pex7-Rezeptor (1). Der

überwiegende Anteil der gefalteten Proteine wird über PTS1/Pex5-Rezeptor in das

peroxisomale Lumen transportiert, indem der Rezeptor zunächst das Protein zur

peroxisomalen Membran leitet (2). Anschließend erfolgt der Übertritt des Rezeptor-

Proteinkomplexes auf die luminale Seite der Peroxisomenmembran (3). Daraufhin

trennen sich Rezeptor und Protein (4). Das Protein verbleibt im Peroxisom, während

der Rezeptor in das Zytosol zurückkehrt, um für weitere peroxisomale

Matrixproteinimporte zur Verfügung zu stehen (GOULD u. VALLE 2000; PLATTA u.

ERDMANN 2007). Der Export des Rezeptors aus dem peroxisomalen Lumen zurück

ins Zytosol ist ein energieverbrauchender Prozess (OLIVEIRA et al. 2003) und auch

das Einschleusen der Proteine ist ATP abhängig. Zuerst werden die

Membranproteine synthetisiert, anschließend erfolgt die Synthese der Matrixproteine

(MASTERS u. CRANE 1995).

2 Literaturübersicht 35

Neues Protein

Neues Protein

Neues ProteinNeues

Protein

PTS1/Pex5 Rezeptor

1 2

PTS1/Pex5 Rezeptor

PTS1/Pex5 oder Lösl. Pex7 Rezeptor

3

Neues Protein

4

oder Zytosol

peroxisomaleMatrix

Löslicher Pex7

Rezeptor

PTS1/Pex5 Rezeptor

peroxisomaleMembran

Abbildung 2-5 Translokation von Proteinen zum Wachstum der Peroxisomen (modifiziert nach PLATTA u. ERDMANN 2007)

Auslösende Faktoren der Peroxisomenproliferation

Es gibt extrinsische und intrinsische Faktoren, die eine Peroxisomenproliferation

induzieren können (YAMAMOTO u. FAHIMI 1987). Eine Regeneration der Leber

nach einer partiellen Hepatektomie führt zu einer Peroxisomenproliferation in den

Hepatozyten (YAMAMOTO u. FAHIMI 1987). Auch zahlreiche Chemikalien,

Medikamente und Weichmacher, allgemein als Peroxisomenproliferatoren (PPO)

bezeichnet, können eine Vermehrung der Zellorganelle bewirken (LAZAROW u. DE

DUVE 1976; FAHIMI et al. 1982). Weichmacher, die sich z.B. in Plastikverpackungen

von Lebensmitteln befinden, haben in tierexperimentellen Studien gezeigt, dass sie

eine Peroxisomenproliferation auslösen können (MASTERS u. CRANE 1995).

Langzeitfütterungsversuche mit Ratten führten darüberhinaus zu der Entwicklung von

hepatozellulären Karzinomen (MASTERS u. CRANE 1995). Auch Medikamente, wie

Azetylsalizylsäure, anabole Steroide, Clofibrate, Trimethoprim Sulfonamide,

Spironolacton und orale Kontrazeptiva führen zu einer Erhöhung der

36 2 Literaturübersicht

Peroxisomenzahl (DE CRAEMER 1995). Die Verabreichung von

Schilddrüsenhormonen geht beispielsweise mit einer verminderten Katalaseaktivität

bei gleichzeitiger Erhöhung der Peroxisomenzahl von verminderter Größe einher

(JUST u. HARTL 1983; KERCKAERT et al. 1989). Die Stimulation von kultivierten

humanen Hepatozyten mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren oder

Sauerstoffradikalen kann ebenfalls eine Peroxisomenproliferation auslösen

(SCHRADER et al. 1998a; SCHRADER et al. 1999). Zahlreiche Untersuchungen

haben gezeigt, dass es etwa 60 Xenobiotika gibt, die zu einer

Peroxisomenproliferation führen (MOODY et al. 1991). Darüber hinaus können

fettreiche Diäten, Hungerperioden, Vitamin E Mangel, Hyperthyreoidismus und

Anpassung an Kälte zu einer Proliferation der Peroxisomen führen (MASTERS u.

CRANE 1995). Die Peroxisomenproliferation, herbeigeführt durch PPO, fällt je nach

Lokalisation im Leberläppchen sehr variabel aus. In periportalen Hepatozyten finden

sich sehr viele elongierte Peroxisomen, während im perizentralen Bereich eher

rundliche Peroxisomen vorkommen (FAHIMI et al. 1996). Elongierte Peroxisomen

sind ein Zeichen für eine peroxisomale Proliferation und geben somit einen wichtigen

Hinweis auf eine stattgefundene Teilungsaktivität der Peroxisomen (SCHRADER et

al. 1996; SCHRADER et al. 1998b; KOCH et al. 2004). Vergleicht man diese

Beobachtung mit der Proliferation von hepatischen Stammzellen von periportal nach

perizentral (ARBER et al. 1988), kann daraus gefolgert werden, dass die

Peroxisomen dieser Proliferationsrichtung folgen (SCHRADER u. FAHIMI 2006). Bei

Proliferationsvorgängen wird auch eine perinukleäre Verteilung der Peroxisomen

beobachtet (ROELS et al. 1983; DE CRAEMER et al. 1993).

Regulation der Peroxisomenproliferation

Die Regulation der Peroxisomenproliferation im Säugetierorganismus erfolgt über

nukleäre Transkriptionsfaktoren. Diese Transkriptionsfaktoren gehören zur großen

Familie der Steroid-, Thyroid- und Retinoidrezeptoren und werden als „Peroxisome

proliferator activated receptors“ (PPARs) bezeichnet (ISSEMANN u. GREEN 1990).

Es werden drei Typen unterschieden: PPAR α, PPAR β und PPAR γ

(SCHOONJANS et al. 1996).

2 Literaturübersicht 37

PPAR α ist in den Lipidstoffwechsel, die Lipoproteinsynthese und den Ablauf von

Entzündungsreaktionen involviert (FEIGE et al. 2006). PPAR α wird stark in der

Leber exprimiert (KLAUNIG et al. 2003) und wird besonders bei Nagern durch

Lipidsenker sowie mehrfach ungesättigte Fettsäuren aktiviert (BEIER et al. 1992,

1997). PPAR α fungiert als Sensor für den Lipidgehalt der Hepatozyten und reguliert

die Genexpression für die mitochondriale und peroxisomale ß-Oxidation

(HASHIMOTO et al. 2000). Ein entscheidender Punkt in der Karzinogenese ist die

Aktivierung von PPAR α (GONZALEZ et al. 1998). PPAR β bestimmt das Maß des

Fettmetabolismus in Skelettmuskeln und Fettgewebe (LUQUET et al. 2005). Die

Bedeutung von PPAR γ liegt in der Regulation der Proliferation und

Ausdifferenzierung von Fettzellen (LUQUET et al. 2005).

2.2.2 Abnahme der Peroxisomenzahl durch Autophagie

Im Folgenden wird auf die Abnahme der Peroxisomenzahl in der Zelle eingegangen,

was insbesondere über Autophagie reguliert wird.

Autophagische Prozesse sind katabole intrazelluläre Abläufe, die letztendlich in

einen lysosomalen Abbau von Zellorganellen münden. Die Autophagie nimmt eine

wichtige Stellung ein, zum Beispiel in Hepatozyten, indem die nicht mehr benötigten

Zellorganellen abgebaut werden und die Abbauprodukte der Zelle als Nährstoffe

wieder zur Verfügung stehen (CUERVO 2004a; MIZUSHIMA 2005).

Es gibt drei verschiedene Formen der Autophagie, die alle ähnliche Funktionen

erfüllen: die Makroautophagie, die Mikroautophagie und die „Chaperon-mediierte

Autophagie“ (CUERVO 2004a). Diese drei Mechanismen kommen alle in

Säugetierzellen vor (CUERVO 2004a).

Bei der Makroautophagie werden die zu entsorgenden Komponenten in eine

Doppellamelle, dem Autophagosom, verpackt, welches dann mit dem Lysosom

verschmilzt und durch Hydrolasen abgebaut wird (SAKAI et al. 2006). Die

Membranen des lysosomalen Systems sowie die lysosomalen Proteine werden im

glatten Endoplasmatischen Retikulum (sER) synthetisiert (LÖFFLER et al. 2007).

38 2 Literaturübersicht

Im Rahmen der Mikroautophagie wird das zu entsorgende Material von der

lysosomalen Membran direkt umschlossen, als sogenanntes „Microautophagic body“,

und mittels Hydrolasen abgebaut (SAKAI et al. 1998; LÖFFLER et al. 2007).

Der Prozess der „Chaperon mediierten Autophagie“ beinhaltet die Bindung eines

Rezeptors an das zu eliminierende Substrat im Zytosol. Dieser Komplex bindet nun

an einen an der lysosomalen Membran befindlichen Rezeptor. Daraufhin erfolgt der

Übertritt des Substrates in das lysosomale Lumen, in dem die Degradierung durch

Hydrolasen stattfindet (CUERVO 2004b).

Funktion

Der Vorgang der Makroautophagie ist sowohl bei pathologischen, als auch

physiologischen Abläufen, wie der Beseitigung von apoptotischen Zellen, während

der Embryogenese, der Wiederverwertung von Nährstoffen und der Beseitigung von

fehlgefalteten Proteinen, intrazellulären Bakterien und geschädigten Zellorganellen

beteiligt (CUERVO 2004a; LEVINE u. KLIONSKY 2004). Es wird angenommen, dass

es sich in erster Linie um einen protektiven Mechanismus handelt (LEMASTERS et

al. 2002; CUERVO 2004a).

Auch zur Vermeidung von Neoplasien besitzt die Autophagie eine wichtige

Schutzfunktion. Durch die Beseitigung von geschädigten Mitochondrien und der

Reduktion des oxidativen und metabolischen Stresses wird auch die DNA vor

Angriffen durch Radikale geschützt, was Mutationen verhindert und die Stabilität des

Genoms wahrt (NELSON et al. 2004; KARANTZA-WADSWORTH et al. 2007;

MATHEW et al. 2007). Eine gestört ablaufende Autophagie führt jedoch zu einer

Genamplifikation, die letztlich ein Hauptmechanismus in der Onkogenaktivierung

darstellt (LITTLE u. CHARTRAND 2004).

Regulation

Der bedeutendste Faktor, der den Prozess der Autophagie in der Leber einleitet ist

Hungern. Hierbei wird in den ersten 48h bei Ratten und Mäusen 25-45 % des

zelleigenen Proteins abgebaut (ADDIS et al. 1936). Autophagie scheint dabei einen

wichtigen Mechanismus zur alternativen Energieversorgung darzustellen, um

2 Literaturübersicht 39

während Hungerperioden durch Recyling von Zellbestandteilen einen normalen

Metabolismus zu gewährleisten (JIN u. WHITE 2007). Autophagie trägt dadurch zur

Energieversorgung von Zellen in Hungerperioden bei und ist somit an der

Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase beteiligt (NELSON et al. 2004).

Autophagie ist ein energieverbrauchender Prozess, der bei ATP Mangel zum

Erliegen kommt (MEIJER u. CODOGNO 2004). Auch Insulin übt einen

inhibitorischen Effekt aus (PFEIFER 1977), während Glukagon Autophagieprozesse

fördert (DETER et al. 1967). Die alimentäre Aufnahme von langen und sehr langen

Fettsäuren, die den Peroxisomen als Substrat dienen, führt ebenfalls zu einem

Abbruch der Pexophagie (LUIKEN et al. 1992).

2.3 Hepatopathien des Hundes

In der Humanmedizin existieren 17 erblich bedingte peroxisomale Erkrankungen, die

vor allem auf einer Biogenese- oder Funktionsstörung der Peroxisomen beruhen

(WANDERS 2004a). Für den Hund sind weder angeborene noch erworbene

peroxisomale Erkrankungen beschrieben. Um jedoch herauszufinden, ob

Peroxisomen bei bestimmten degenerativen bzw. neoplastischen Lebererkrankungen

eine Rolle spielen, wurden in der vorliegenden Arbeit Hunde mit Hepatopathien

untersucht, die im Folgenden hinsichtlich ihres makroskopischen und

mikroskopischen Erscheinungsbildes näher erläutert werden sollen.

Die Leber befindet sich zentral im kranialen Abdomen, dem Zwerchfell direkt

anliegend. Die Oberfläche ist glatt, da sie von einer serösen Kapsel überzogen ist.

Das Leberparenchym erscheint rotbraun, ist von fragiler Konsistenz und beim Hund

in zahlreiche Leberlappen unterteilt, deren Enden im gesunden Zustand scharf

konturiert sind (CULLEN 2007a).

Es können zwei Einteilungen hinsichtlich der architektonischen Bauweise der Leber

unterschieden werden: Die klassische Einteilung der Leber mit dem Leberläppchen

als kleinste anatomische Einheit. Das Leberläppchen bildet eine mehr oder weniger

sechseckige Struktur mit der in der Mitte befindlichen Zentralvene, die das Blut der

40 2 Literaturübersicht

Lebervene zuführt. An den Ecken des Sechseckes befinden sich die Portalfelder , die

auch als Glisson Trias bezeichnet bezeichnet werden. Sie schließen Gallengänge,

Zweige der Portalvene, der Leberarterie, Nervenfasern und Lymphgefäße ein,

gestützt von einem feinen retikulären Bindegewebe (Abbildung 2-6 A). Das Blut wird

aus der Leberarterie und Portalvene in die Sinusoide geleitet, wo es sich vermischt

und eng an den Hepatozyten vorbeifließt, bevor es über die Zentralvene in die V.

hepatica abgeführt wird (CULLEN 2007a).

Bei der funktionalen Einteilung der Leber nach RAPPAPORT (1980) stellt das

Portalgebiet den zentralen Punkt des sogenannten Leberazinus dar, da dort das

sauerstoffreiche Blut über die Arterie ankommt und zu den in der Peripherie

gelegenen Lebervenen abgeführt wird. Dabei nimmt der Sauerstoffgehalt von Zone 1

(periportal oder zentroazinär) über Zone 2 (mittzonal) nach Zone 3 (periazinär)

kontinuierlich ab (Abbildung 2-6 B) (CULLEN 2007a).

2 Literaturübersicht 41

Abbildung 2-6 Schematische Darstellung der funktionellen Organisation der Leber (CULLEN 2007a)

Die Hepatozyten sind in einschichtigen Zellreihen angeordnet und radiär zur

Zentralvene ausgerichtet. Die Zellreihen werden durch besondere Kapillaren, die

sogenannten Sinusoide, getrennt. Sie besitzen keine typische Basalmembran und

sind durch ein diskontinuierliches Endothel ausgekleidet. Hier befinden sich auch die

Lebermakrophagen (Kupffer-Sternzellen), die der Kontrolle des sinusoidalen Blutes

dienen (CULLEN 2007a).

42 2 Literaturübersicht

Die Hepatozyten besitzen zu der das Lumen der Sinusoide begrenzenden Seite

zahlreiche Mikrovilli, die der Oberflächenvergrößerung, der Aufnahme von

Substanzen aus dem Plasma und der Sekretion von Produkten dienen. An den

basolateralen Seiten der Hepatozyten befinden sich Gallekanälchen, die sich aus

den modifizierten Zellmembranen zweier benachbarter Hepatozyten ergeben. Der

Disse´ Raum ist eine besondere anatomische Struktur zwischen den Hepatozyten

und den Endothelzellen der Lebersinusoide. Hier findet ein Austausch von Stoffen

zwischen Plasma und den mit Mikrovilli besetzten Hepatozyten statt. Eine

Schädigung dieser Zone beeinträchtigt die Leberfunktion erheblich. In diesem Raum

befinden sich auch fettspeichernde Zellen, sogenannte Ito-Zellen, die unter anderem

der Vitamin A-Speicherung dienen. Bei Leberschädigungen sinkt ihr Vitamin A-

Gehalt und sie bilden Kollagen, das die Entstehung einer Leberfibrose fördert

(CULLEN 2007a).

2.3.1 Hepatozelluläre Degeneration

Die hepatozelluläre Degeneration, früher als Hepatose bezeichnet, umfasst nicht

primär entzündlich bedingte Veränderungen der Hepatozyten, beispielsweise durch

Sauerstoffmangel oder Stoffwechselstörungen. Die Veränderungen können folgenlos

bleiben, in ein von Entzündungsprozessen begleitetes chronisches Stadium

übergehen oder in einer chronischen Zerstörung von Lebergewebe mit vergeblichen

bindegewebigen Umbau- und Regenerationsprozessen (Zirrhose) enden (KÄUFER-

WEISS 2007).

Das Verteilungsmuster der auftretenden degenerativen Veränderungen gibt

Aufschluss über die möglichen Ursachen. So wird unterschieden, ob Leberzellen im

gesamten Parenchym (diffus), zufällig verteilt (multifokal) oder in bestimmten Zonen

(1-3) des Leberazinus geschädigt sind (ROTH u. MEYER 1995).

Hydropische Degeneration

Hepatozyten reagieren bei Störung ihrer Homöostase immer in ähnlicher Weise.

Dabei werden im allgemeinen die Elektrolytkonzentration und der Flüssigkeits-

haushalt derart gestört, dass es zu einem Wassereinstrom kommt und die Zelle

2 Literaturübersicht 43

anschwillt (CULLEN et al. 2006). Diesen Vorgang nennt man daher auch

hydropische Degeneration (CULLEN 2007b).

Mikroskopisch kann sich das zunächst in Form einer trüben Schwellung des

Hepatozyten darstellen. Dabei kommt es zu einer Schädigung der Mitochondrien

z. B. durch exogene Gifte, Hypoxie und/oder Stoffwechselentgleisungen, was zu

einer unspezifischen Leistungsschwäche der Hepatozyten führt (KÄUFER-WEISS

2007). Die ebenfalls durch Wassereinstrom vergrößerten Mitochondrien können

lichtmikroskopisch als gleichmäßig in der Leberzelle verteilte Körnchen

wahrgenommen werden (KÄUFER-WEISS 2007).

Abbildung 2-7 Hydropische Degeneration von Hepatozyten im Bereich der Zentralvene (Z=Zentralvene; Rind, Paraffinschnitt, H.E.) (CULLEN 2007a)

Bei fortschreitender hydropischer Schwellung zeigen die Zellen eine sogenannte

ballonierende Degeneration. Dabei nimmt der Einstrom von Wasser und Natrium

stetig zu. Die Konsequenz ist eine massive Schwellung der gesamten Zelle und

deren Organellen, insbesondere der Mitochondrien, der Lysosomen und des

Endoplasmatischen Retikulums (KÄUFER-WEISS 2007; STALKER u. HAYES 2007).

44 2 Literaturübersicht

Eine Zellschwellung kann reversibel sein, wenn das Ausmaß und die Dauer der

schädigenden Noxe begrenzt sind (Abbildung 2-8). Wird dabei jedoch ein kritischer

Punkt überschritten, so kommt es in der Folge zum irreversiblen Zelluntergang

(CULLEN 2007b)

Abbildung 2-8 Physiologische Zelle und Veränderungen bei reversibler und irreversibler Zellschädigung (CULLEN 2007b)

Auslöser einer hydropischen Degeneration ist im Prinzip immer eine gestörte

Zellatmung aufgrund hypoxischer Zustände, die entweder den gesamten

Organismus betreffen können oder nur lokal wirken. Eine Vergiftung oder

Blockierung mitochondrialer Enzyme führt ebenfalls zu einer gestörten Zellatmung

(KÄUFER-WEISS 2007). Daher ist die hydropische Degeneration eine relativ

unspezifische Zellveränderung, der viele Ursachen zugrunde liegen können

(CULLEN 2009). So können bei Jungtieren, die vom Wachstumsverhalten der

Wurfgeschwister abweichen, angeborene Erkrankungen, wie z. B. primäre

2 Literaturübersicht 45

Speicherkrankheiten der Leber eine ätiologische Rolle spielen (CULLEN 2009),

während bei älteren Tieren zahlreiche erworbene Erkrankungen (z. B. chronische

Vergiftungen, hohe Blutkortisolspiegel, Herzinsuffizienz, Adipositas) eine

hepatozelluläre Degeneration auslösen können. Im Rahmen einer hepatozellulären

Degeneration kommt es häufig zu Einlagerungen bestimmter Substanzen, da der

Hepatozyt nicht mehr in der Lage ist, diese angemessen zu verstoffwechseln. Dabei

handelt es sich am häufigsten um Fett oder Glykogen (STALKER u. HAYES 2007;

CULLEN 2009).

Glykogenose

Eine übermäßige hepatozelluläre Glykogeneinlagerung (Glykogenose) tritt im

Rahmen einer steroidinduzierten Hepatopathie auf und ist induziert durch endogene

oder exogene Glukokortikoide bzw. in seltenen Fällen durch Steroidhormone

(Progesteron, Aldosteron) (CULLEN et al. 2006; SEPESY et al. 2006). SEPESY et

al. (2006) gehen davon aus, dass auch eine stressinduzierte Hyperkortisolämie bei

akuten oder chronischen Erkrankungen an der Entstehung einer Glykogenose

beteiligt ist. Weiterhin beobachten sie außerdem Glykogeneinlagerungen im

Zusammenhang mit hepatischen und nicht hepatischen Neoplasien, auch wenn die

Hunde keine exogen zugeführten Glukokortikoide erhielten. Glukokortikoide führen

zu einer Anordnung der Peroxisomen um Glykogentropfen, wobei insgesamt die

Anzahl der Peroxisomen vermindert ist (PHILLIPS et al. 1987).

Im Falle einer steroidinduzierten Hepatopathie ist die Leber vergrößert und weist eine

blassbraune Farbe auf (CULLEN 2007a). Das Bild einer hepatozellulären

Glykogeneinlagerung zeigt sich als intrazytoplasmatische Vakuolisierung von

Hepatozyten mit überwiegend kleinen verwaschenen Vakuolen. Der Nukleus befindet

sich dabei zunächst noch in zentraler Position (CULLEN et al. 2006). Bei

zunehmender Glykogeneinlagerung kann es zu einer zwei bis zehnfachen

Vergrößerung der Hepatozyten mit Verdrängung des Kernes in die Peripherie

kommen. Die Veränderungen beginnen am häufigsten in der Zone 2 (intermediäre

Zone) des Azinus, können sich jedoch im weiteren Krankheitsverlauf zunehmend

ausbreiten. Im fortgeschrittenen Stadium gehören Zelluntergänge (Nekrosen), sowie

46 2 Literaturübersicht

neutrophile Entzündungszellinfiltrate als Reaktion auf den Gewebsuntergang zum

histologischen Bild. Die PAS-Färbung (periodic acid Schiff reaction) gibt Aufschluss

über den intrahepatozellulären Gehalt an Glykogen. Klinisch sind deutlich erhöhte

enzymatische Aktivitäten der ALT und der ALKP zu erwarten (STALKER u. HAYES

2007). Das Erkrankungsbild findet sich häufig bei Hunden. Auch angeborene

Glykogenspeicherkrankheiten führen zu ähnlichen Veränderungen der Hepatozyten

(STALKER u. HAYES 2007).

Lipidose

Der Lipidmetabolismus in der Leber wird sehr eng reguliert. Fettsäuren werden

oxidiert, um dem Energiebedarf zu decken; sie werden zu Triglyzeriden verestert, die

an VLDL (very long density lipoprotein) gebunden in die Fettdepots transportiert oder

in den Hepatozyten gespeichert werden (RAO u. REDDY 2004).

Bei der Anreicherung von Fetttropfen in Hepatozyten spricht man von einer

hepatischen Lipidose oder hepatozellulären Steatose, die im Extremfall zu einer

Leberverfettung führen kann (DE CRAEMER 1995; KÄUFER-WEISS 2007;

STALKER u. HAYES 2007). Dies beinhaltet eine absolute Erhöhung des

Fettgehaltes der Leberzellen (CULLEN et al. 2006; SCHRADER u. FAHIMI 2008).

Akute Lipidosen zeigen sich makroskopisch als vergrößerte blasse Lebern mit

brüchiger bis fettiger Konsistenz ohne Veränderung der Leberarchitektur.

Makroskopisch erscheinen die Ränder abgerundet (STALKER u. HAYES 2007).

Vorangeschrittene toxische Schädigungen von Hepatozyten führen zur

Verschmelzung von kleinen Lipidtropfen zu einem großen Tropfen, der den Kern aus

seiner zentralen Stellung verdrängt und zur Konturveränderung der Zelle führt. Die

Sinusoide werden komprimiert und vermindert durchblutet (STALKER u. HAYES

2007).

Eine Ansammlung von Triglyzeriden in Form von Fetttropfen kann sich histologisch

mikrovesikulär oder makrovesikulär darstellen (RAO u. REDDY 2004; STALKER u.

HAYES 2007). Die mikrovesikuläre Steatose beschreibt intrazelluläre, überwiegend

perinukleär angeordnete Lipidtropfen, die kleiner sind als der Kern, während bei einer

2 Literaturübersicht 47

makrovesikulären Steatose, die Lipidtropfen mindestens so groß wie der Kern oder

größer sind und den Nukleus nach peripher verdrängen (CULLEN et al. 2006).

Eine mikrovesikuläre Lipidose beginnt meistens zentrolobulär (Zone 3) im

Leberläppchen und kommt vor allem bei erhöhter Mobilisation von Fetten z. B. bei

Diabetes mellitus und juveniler Hypoglykämie von Toy Rassen (CULLEN et al. 2006)

und nicht selten bei toxisch bedingten Hepatopathien vor (STALKER u. HAYES

2007). Die mikrovesikuläre Lipidose tritt häufig im Zusammenhang mit Schädigungen

der Mitochondrien auf und ist hinsichtlich des Zellschadens als schwerwiegender

einzuordnen als die makrovesikuläre Lipidose (CULLEN 2009).

Bereits degenerierte Hepatozyten zeigen in besonderem Maße eine hepatische

Lipidose, da der Durchsatz von Fettsäuren und Triglyzeriden durch die Blockade an

entscheidenden Punkten im Lipidstoffwechsel und der Sekretion von VLDL

beträchtlich eingeschränkt ist. Das Fett, das als Substrat der ß-Oxidation dient,

sammelt sich somit im Hepatozyten (DE CRAEMER et al. 1995). Eine krankhafte

Verfettung der Leber kann demnach durch vielfältige alimentäre, metabolische,

toxische und hypoxische Ursachen eintreten (STALKER u. HAYES 2007). Die

hepatische Steatose kann, wie die hydropische Degeneration reversibel verlaufen.

Bei persistierender oder sehr heftiger Noxe im Zusammenhang mit ROS,

Endotoxinen, Tumornekrosefaktor alpha und unter dem Einfluss von bestimmten

Zytokinen kann sie sich zu einer Steatohepatitis ausweiten (DAY u. JAMES 1998).

Zu den verschiedenen Ursachen und Mechanismen, die eine Lipidansammlung in

Hepatozyten auslösen können, gehören:

prähepatische Ursachen: vermehrte Anfuhr und damit Aufnahme von

Fettsäuren (z. B. Mobilisation bei Laktation, Hunger, endokrine Störungen,

Trächtigkeit) (CULLEN 2007a; STALKER u. HAYES 2007)

intrahepatische Ursachen: abnorme Hepatozytenfunktion und Energie-

mangelzustände mit herabgesetztem Lipidstoffwechsel (CULLEN 2007a),

toxische und hypoxische Ursachen (CULLEN 2007a), Reduktion der Enzyme

zur ß-Oxidation in den Peroxisomen (FAN et al. 1998).

48 2 Literaturübersicht

posthepatische Ursachen: verminderte Apoproteinsynthese mit reduzierter

Bildung und Export von Lipoproteinen aus den Hepatozyten (CULLEN 2007a)

Längerfristig bestehende Lipidosen ziehen meist weitere Schädigungen nach sich.

So kommt es bei chronischen Zuständen zu Fibrose, Pigmentablagerungen und

nodulären Hyperplasien. Diese Veränderungen werden durch fortschreitende

peroxidative Schädigung und Aktivierung von Ito-Zellen hervorgerufen. Das erhöhte

Auftreten von Lipidtropfen erhöht auch den oxidativen Stress der Zelle, der zur

Verstärkung der Lipidperoxidation von Membranen beiträgt (STALKER u. HAYES

2007). In der Humanmedizin wird histologisch die Steatose auch mit Auftreten von

inflammatorischen Veränderungen, ballonierender Degeneration, Apoptose und

Entzündung beobachtet (RAO u. REDDY 2004).

2.3.2 Verhalten der Peroxisomen bei degenerativen

Veränderungen der Hepatozyten

Die ultrastrukturellen Veränderungen bei der hydropischen Leberzelldegeneration

umfassen Plasmamembranveränderungen wie „Blebbing“, Zerreißung von Mikrovilli,

Bildung von Myelinfiguren und der Verlust von Zellkontakten. Veränderungen der

Mitochondrien in Form von Schwellung und das Auftreten von amorphen

Einlagerungen sind häufig sowie die Dilatation des Endoplasmatischen Retikulums

und die Ablösung der Ribosomen (CULLEN et al. 2006).

Beim Menschen zeigen Peroxisomen der Hepatozyten im Rahmen einer Steatose

eine variable Katalaseaktivität, werden kleiner und proliferieren, wobei sie

unterschiedliche Erscheinungsformen wie anguläre, gebogene oder irreguläre

Konturen mit Protrusionen und Membranschleifen (Gastruloid cisternae) annehmen

können. Das peroxisomale Nukleoid verschwindet dabei (DE CRAEMER et al. 1995).

Die Mitochondrien der steatotisch veränderten humanen Leber nehmen beachtlich

an Größe zu und werden als Megamitochondrien bezeichnet. Dabei zeigen sie

parakristalline Einschlüsse und parallel arrangierte Cristae (DE CRAEMER et al.

2 Literaturübersicht 49

1995). Das Endoplasmatische Retikulum einer Fettleber ist dilatiert und zeigt

Vesikelbildung (DE CRAEMER et al. 1995).

In nahezu allen geschädigten Zellen, besonders in Hepatozyten, die zu den

metabolisch aktiven Zellen zählen, kommt es im Rahmen von degenerativen

Veränderungen zu einem Anstieg der Peroxisomenzahl. Die sehr pleomorphen

Peroxisomen lagern sich dabei im Bereich der Schädigung, z.B. in der Nähe von

Mitochondrien, gruppenweise an. Insgesamt erscheint die Peroxisomenproliferation

zentrolobulär ausgeprägter als perilobulär (CHEVILLE 1994c).

2.3.3 Hepatitiden

Entzündliche Leberveränderungen können in akute und chronische sowie in

spezifische infektiös bedingte und unspezifische reaktive Formen eingeteilt werden.

Das Verteilungsmuster ist dabei abhängig von der Entzündungsursache, der

Eintrittspforte, dem Infektionserreger bzw. dessen Zelltropismus innerhalb der Leber

(CULLEN 2007a; STALKER u. HAYES 2007).

Hämatogene Infektionen verursachen z. B. ein eher zufällig verteiltes, multifokales

Verteilungsmuster, während über die Gallenwege aszendierende Infektionen vor

allem in Portalbereichen ihre Manifestation finden, wobei schwerwiegende

Infektionen das gesamte Portalfeld und über dessen Grenzen hinaus

Entzündungsprozesse mit einbeziehen können (CULLEN 2007a).

Akute Hepatitis

Die akute Hepatitis ist durch das Auftreten von Entzündungserscheinungen mit

Infiltration von neutrophilen Granulozyten, Aktivierung von Kupffer-Zellen, Nekrosen

und Apoptosevorgängen von Hepatozyten charakterisiert. Die Zellpopulationen, die

an der Entzündungsreaktion beteiligt sind, variieren stark in Abhängigkeit von der

Ursache, der Wirtsantwort und dem Stadium der Läsion. Meist dominieren

neutrophile Granulozyten bei bakteriell bedingten Infektionen und

Protozoeninfektionen. Virale Infektionen führen in erster Linie zum Auftreten von

Nekrosen, Apoptosen einzelner Zellen und häufig nur minimalen

50 2 Literaturübersicht

Entzündungszellinfiltraten, meist dominiert von Lymphozyten (CULLEN 2007a).

Kupffer-Zellen spielen außerdem eine wichtige Rolle bei akuten

Entzündungsprozessen, da sie durch ihre Phagozytosefähigkeit zur Beseitigung von

pathogenen Noxen, wie z. B. Bakterien, beitragen. Im Zuge einer Aktivierung zu

sekretorisch aktiven Histiozyten schütten sie neben Zytokinen weitere Mediatoren

aus, die an hypertrophen und proliferativen Prozessen der Hepatozyten, der Ito-

Zellen und Endothelien beteiligt sind (STALKER u. HAYES 2007). Bakterielle

Leberentzündungen können beim Hund durch Leptospiren verschiedener Serovare

(L. grippothyphosa, L. pomona, L. bratislava, L. canicola, L. icterohaemorrhagiae),

bei Jungtieren durch Clostridium piliforme oder auch nach disseminierter Ausbreitung

im Organismus durch Nocardia asteroides verursacht werden. Ursache viraler

Hepatitiden sind das canine Adenovirus 1 und das canine Herpesvirus 1 (KÄUFER-

WEISS 2007).

Chronische Hepatitis

Bei immer wiederkehrenden Noxen oder unvollständiger Ausheilung akuter

Hepatitiden kommt es zur Entwicklung einer chronischen Hepatitis. Sie ist in erster

Linie gekennzeichnet durch eine Fibrose neben Infiltrationen von mononukleären

Entzündungszellen, wie Lymphozyten, Makrophagen und Plasmazellen.

Regenerationsprozesse in Form von proliferierenden Knötchen sind ebenfalls häufig

zu finden (CULLEN 2007a). Die Diagnose sollte die Dauer und den Grad der

Erkrankung einbeziehen. Die Aktivität einer Hepatitis wird durch den Grad der

Entzündungsreaktion und das Ausmaß von Apoptose und Nekrose bestimmt

(CULLEN et al. 2006). Beim Hund finden sich variable Mengen neutrophiler

Granulozyten. Dies weist daraufhin, dass ein akuter Entzündungsreiz bestehen bleibt

bzw. wiederholt auftritt (CULLEN 2007a).

Es können verschiedene Formen von chronischen Hepatitiden unterschieden werden

(CULLEN 2007a):

granulomatöse Hepatitis (Bildung einzelner Granulome; Auftreten fokal oder

disseminiert, Entzündungsgeschehen wird dominiert durch Makrophagen und

2 Literaturübersicht 51

außerdem mehrkernigen Riesenzellen, wenigen Lymphozyten und

Plasmazellen)

chronisch-eitrige Hepatitis (Abszesse: einzeln oder multifokal auftretend, gut

bindegewebig abgegrenzt/eingekapselte Prozesse)

idiopathische chronische Hepatitis (frühere Bezeichnung: chronisch aktive

Hepatitis)

o persistierende Entzündung der Leber mit gemischtzelligen

Entzündungszellinfiltraten

o Fibrose der Portalfelder

o Noduläre Parenchymregeneration

o Portale und periportale mononukleäre Zellinfiltration

o Cholestase

Weiterhin sind zwei Subtypen der chronischen Hepatitis für Hunde beschrieben:

progressive chronische Hepatitis (rassebedingte Kupfervergiftung bei

Dalmatiner, Bedlington und West Highland White Terrier, Pudel)

familiäre chronische Hepatitis (weibliche Hunde der Rasse Dobermann,

Skye Terrier, Cocker Spaniel und Labrador Retriever)

2.3.4 Lebertumoren

Lebertumoren können primär oder sekundär auftreten. Primäre Tumore des Leber-

und des Gallengangsystems haben ihren Ursprung in epithelialen Zellen, wie den

Hepatozyten, dem Gallengangsepithel sowie dem Epithel der Gallenblase oder

entstehen aus mesenchymalem Gewebe, wie Bindegewebe oder Zellen der

Blutgefäße. Sekundäre Tumore der Leber sind sehr häufig und stellen den größten

Anteil der Lebertumore aufgrund ausgeprägter Metastasierung in dieses Organ dar.

Am häufigsten metastasieren in die Leber maligne Lymphome, darüber hinaus

Melanome und Hämangiosarkome (CULLEN 2007a).

52 2 Literaturübersicht

Virale Erreger, Chemikalien, Mykotoxine und Medikamente spielen bei der

Entstehung von Tumoren der Haussäugetiere entgegen den Erkenntnissen der

Humanmedizin eine eher untergeordnete Rolle. Tumoren der Leber und der

Gallengänge stehen, soweit bekannt, in der Veterinärmedizin nicht in direktem

Zusammenhang mit vorangegangenen Lebererkrankungen (STALKER u. HAYES

2007).

Tabelle 2-2 Übersicht der Lebertumoren (CULLEN 2007a)

Die epithelialen Tumoren der Leber gehen entweder von Hepatozyten, von

Gallengangsepithelien oder deren gemeinsamen undifferenzierten Vorläuferzellen

(oval cells) hervor. Hepatozelluläre Adenome kommen vor allem bei älteren Hunden

sowohl in gesundem Gewebe als auch in zirrhotisch umgebautem Parenchym vor

(KÄUFER-WEISS 2007). Sie unterscheiden sich makroskopisch kaum von nodulären

Hyperplasien oder von Leberzellkarzinomen und treten normalerweise als einzelne

Tumoren auf (STALKER u. HAYES 2007).

Hepatozelluläre Karzinome kommen selten aber mit einer gewissen Regelmäßigkeit

bei Hunden vor (CULLEN 2007a). Sie treten als einzelne oder multinoduläre

Umfangsvermehrungen auf (STALKER u. HAYES 2007), zeigen ein infiltratives

Wachstum und neigen nach Einbruch in das Pfortadersystem zur weiteren

Ausbreitung in der Leber (KÄUFER-WEISS 2007). Hämatogene Metastasen über die

Lebertumoren epithelial mesenchymal

Neuroendokriner

Ursprung

Sonstige

Benigne

Hepatozelluläres

Adenom

Adenom der

Gallenwege

Hämangiom

Maligne

Hepatozelluläres

Karzinom

Gallengangskarzinom

Hepatocholangio-

karzinom

Hepatoblastom

Hämangiosarkom

Hepatisches

Karzinoid

Lymphom

Myeloide Neoplasie

Mastzelltumor

2 Literaturübersicht 53

Vena hepatica finden sich meist zuerst in der Lunge (HEAD et al. 2003; STALKER u.

HAYES 2007). Histologisch werden trabekuläre, adenoide und solide Formen der

Karzinome unterschieden (STALKER u. HAYES 2007), wobei mehr als eine

histologische Variante in einem Tumor auftreten kann (HEAD et al. 2003). Mitosen

kommen häufig vor (STALKER u. HAYES 2007). Die zellulären Eigenschaften der

Hepatozyten in hepatozellulären Karzinomen variieren je nach Differenzierungsgrad.

Gut differenzierte hepatozelluläre Karzinome zeigen Leberzellen, die normalen

Hepatozyten gleichen, mit rundem zentralen Kern und eosinophilem Zytoplasma.

Das Zytoplasma kann auch blass sein, vakuolisiert und gefüllt mit Glykogen oder

Lipiden. Schlecht differenzierte Karzinome weisen dagegen Hepatozyten auf, die

sehr pleomorph sind. Diese Tumorzellen zeigen eine Anisokaryose und nur wenig

basophiles Zytoplasma. Die Nukleoli sind deutlich vergrößert. Eine Sonderform des

hepatozellulären Karzinoms stellt das Klarzellkarzinom dar, das vollständig aus

ballonierten Zellen zusammengesetzt ist (HEAD et al. 2003).

Bei den Tumoren, die vom Gallengangsepithel ausgehen, werden das Cholangiom

und das Cholangiokarzinom unterschieden. Das Cholangiom findet sich vor allem in

Lebern älterer Hunde. Cholangiome treten intrahepatisch auf, selten extrahepatisch

und erscheinen als solide oder zystische Tumore (STALKER u. HAYES 2007). Das

Wachstumsverhalten der Gallengangskarzinome ist solide oder multinodulär

(STALKER u. HAYES 2007) und besitzt häufig ein ausgeprägtes fibröses Stroma

(CULLEN 2007a). Hämatogene Metastasen sind selten, Metastasen in regionale

Lymphknoten dagegen häufig. Das Wachstumsverhalten ist sehr invasiv. Die

Abgrenzung zu anderen metastatischen Adenokarzinomen ist mitunter sehr

schwierig. (STALKER u. HAYES 2007).

Das Hepatoblastom ist ein Tumor ausgehend von pluripotenten Vorläuferzellen,

welcher sowohl bei alten als auch bei jungen Hunden vorkommt (STALKER u.

HAYES 2007).

Tumoren, die aus neuroendokrinen Zellen der Leber oder der Gallengänge

hervorgehen, nennt man hepatische Karzinoide. Diese sind gekennzeichnet durch

ein besonders aggressives Wachstumsverhalten in Form von stark infiltrativem

54 2 Literaturübersicht

Wachstum und Metastasenbildung in lokale Lymphknoten und das Peritoneum.

Typischerweise sind die Tumorzellen nesterartig arrangiert, durchzogen von

Bindegewebssepten (HEAD et al. 2003; STALKER u. HAYES 2007). Hepatische

Karzinoide müssen von metastatischen Tumoren des Nebennierenmarkes

abgegrenzt werden (HEAD et al. 2003).

Primäre mesenchymale Tumoren der Leber können von Bindegewebe der glatten

Muskulatur oder den Endothelzellen ausgehen. Sowohl gutartige Leiomyome als

auch maligne Leimyosarkome und Fibrosarkome treten auf. Hämangiome und

Hämangiosarkome finden sich ebenfalls häufig in der Leber, wobei

Hämangiosarkome dort häufiger als Metastasen vorkommen (STALKER u. HAYES

2007).

Sonstige Neoplasien

Die Leber ist aufgrund ihrer starken Vaskularisation ein bevorzugtes Organ für die

Ansiedlung metastatischer Tumoren (CHEVILLE 1994d; STALKER u. HAYES 2007).

Metastatische Neoplasien sind bei Hunden die am häufigsten vorkommenden

Lebertumoren und entstammen zumeist dem Pankreas, dem Gastrointestinaltrakt,

der Milz, der Milchleiste, den Nebennieren, Knochen und der Schilddrüse (HOSKINS

2005). Karzinome des Pankreas und Gastrointestinaltraktes metastasieren über die

Portalvene in die Leber. Einige Tumore, wie Mammakarzinome, Schildrüsen-

karzinome, Melanome und Sarkome, metastasieren über die Lunge und die

Leberarterie (STALKER u. HAYES 2007). Die periportalen und perisinusoidalen

Bereiche sind sehr empfänglich für hämatopoetische neoplastische Zellen. Aufgrund

dieser Tatsache sind Lymphome, maligne Histiozytose, myeloide und erythroide

Leukämien sowie Mastzelltumoren in der Leber nicht selten (STALKER u. HAYES

2007). Das multizentrische maligne Lymphom ist ein häufiger Tumor der Leber, auch

unter Einbeziehung von Milz (HEAD et al. 2003; STALKER u. HAYES 2007),

Lymphknoten, Thymus, Knochenmark und anderen Organen (KÄUFER-WEISS

2007; STALKER u. HAYES 2007).

2 Literaturübersicht 55

Wie bereits erwähnt sind Hämangiosarkome der Leber häufig als Metastasen

anzutreffen. Der Tumor besteht aus Endothelzellen, die unterschiedlich große

vaskuläre Spalten und Kavernen ausformen. Auch solide Formen treten auf

(STALKER u. HAYES 2007), wobei die neoplastischen Endothelzellen anhand ihrer

„schuhzweckenförmigen“ Gestalt erkannt werden können (KÄUFER-WEISS 2007).

Die bevorzugten Lokalisationen der Primärtumoren sind Milz, Knochenmark und

Leber. Die Metastasierung erfolgt in besonderem Maße in die Lunge und das rechte

Herzohr. Neben der Bösartigkeit dieser Tumore ist, im Gegensatz zu den

Hämangiomen, ihre Tendenz zur spontanen Ruptur auffällig. Häufiger als andere

Rassen erkranken der Deutsche Schäferhund und der Boxer am Hämangiosarkom

(KÄUFER-WEISS 2007).

2.3.4.1 Verhalten der Peroxisomen und Mitochondrien bei

Tumoren

Ultrastrukturelle Untersuchungen von hepatozellulären Tumoren zeigen allgemein

eine große Variabilität der Tumorzellen in der Frühphase der Karzinogenese.

Während der Entstehung eines hepatozellulären Karzinoms zeigen Tumorzellen eine

strukturelle Vereinfachung des Zytoplasmas, der Organellen (simplification).

Vereinfachungen der Organellen treten besonders beim rER und den Mitochondrien

auf. Ein Verlust von Organellen betrifft vor allem das sER, die Peroxisomen und das

Substrat Glykogen.

Bei schnell wachsenden Hepatomen konnte beispielsweise eine Abnahme der

Peroxisomenzahl und deren Enzymausstattung beobachtet werden (MOCHIZUKI et

al. 1971). Darüber hinaus findet während des Tumorwachstums ein Wechsel von

peroxidativem zu mitochondrialem Metabolismus statt, um Energie für Zellwachstum

und Mitose bereitzustellen (TOLBERT u. ESSNER 1981). Bei hepatozellulären

Karzinomen sowie bei Lebermetastasen anderer Tumore konnten Veränderungen

des peroxisomalen Erscheinungsbildes in Form von Invaginationen, Protrusionen

und Membranschleifen (Gastruloid cisternae) beobachtet werden (DE CRAEMER et

al. 1993). Diese Veränderungen sind jedoch nicht spezifisch für Tumorerkrankungen,

56 2 Literaturübersicht

da sie ebenfalls bei Hepatitis und Steatose vorkommen können (DE CRAEMER et al.

1991; DE CRAEMER et al. 1995).

Im Gegensatz zu den zahlreichen Informationen in der Humanmedizin liegen in der

Veterinärmedizin keine Erkenntnisse in Bezug auf das Verhalten der Peroxisomen

und der Mitochondrien bei tumorösen Prozessen, insbesondere des Hundes vor. Ziel

dieser Arbeit ist es, Informationen hinsichtlich des Verhaltens der caninen

Peroxisomen und auch in untergeordneter Stellung, der Mitochondrien, in tumorösen

und degenerativen Erkrankungen der Leber zu erarbeiten.

3 Eigene Untersuchungen 57

3 Eigene Untersuchungen

3.1 Material und Methoden

3.1.1 Einleitung

In der vorliegenden klinisch-prospektiven Studie erfolgte eine qualitative und

quantitative elektronenmikroskopische Untersuchung der hepatozellulären

Peroxisomen von Hunden, die an degenerativen Erkrankungen oder tumorösen

Erkrankungen der Leber litten. Als Kontrollgruppe dienten Hunde ohne

Leberveränderungen.

Alle Gruppen wurden hinsichtlich der Anzahl an Peroxisomen pro Fläche/Hepatozyt

(µm²) miteinander verglichen. Neben der Untersuchung der Peroxisomen hinsichtlich

Morphologie und Anzahl wurden außerdem die übrigen Zellorganellen der

Hepatozyten (rER, sER, Mitochondrien, Lysosomen, Glykogen) auf morphologische

Veränderungen untersucht und mit denen von lebergesunden Hunden verglichen.

Die Patienten wurden einer Anamnese, einer Allgemeinuntersuchung und einer

Ultraschalluntersuchung unterzogen. Ergänzende Untersuchungen, wie die

Bestimmung klinisch-chemischer und hämatologischer Parameter, wurden

standardmäßig eingeleitet. Vor jeder Biopsieentnahme wurden

Gerinnungsparameter, wie aktivierte partielle Thromboplastinzeit und

Prothrombinzeit bestimmt. Zur weiteren Abklärung der Hepatopathie wurde

transabdominal oder laparaskopisch eine Biopsie des pathologisch veränderten

Lebergewebes entnommen und einer histologischen Untersuchung unterzogen.

3.1.2 Patienten

Im Zeitraum Oktober 2006 - Juni 2009 wurden insgesamt 45 Patienten mit

Hepatopathien in die Studie aufgenommen. Davon konnten jedoch insgesamt 26

Patienten aufgrund unterschiedlicher Ausschlusskriterien (Tabelle 3-1) nicht

58 3 Eigene Untersuchungen

verwendet werden. Überwiegend handelte es sich dabei um die Tatsache, dass der

pathohistologische Befund am Paraffin eingebetteten Gewebe nicht in

Übereinstimmung mit der für ultrastrukturelle Untersuchungen in Epon eingebetteten

sehr kleinen Gewebeproben stand, so dass schließlich die Proben von 19 Patienten

für die vorliegende Studie zur Verfügung standen und untersucht wurden.

Auswahlkriterien/Verteilung

Patienten mit degenerativen Leberveränderungen wurden auf der Basis veränderter

klinisch-chemischer Blutparameter und der histologischen Diagnose der

Leberbiopsie in die Studie aufgenommen. Auch die Patienten mit tumorösen

Lebererkrankungen wurden anhand histologischer Befunde der Leberbiopsie und

gegebenfalls veränderter Blutwerte in die Studie integriert.

Tabelle 3-1 Anzahl der Patienten mit Hepatopathien, die nicht mit in die vorliegende Studie einbezogen werden konnten

Letztlich wurden 19 Patienten in die vorliegende Studie aufgenommen, von denen 11

in die Gruppe der degenerativen Lebererkrankungen und 8 Patienten in die Gruppe

der neoplastischen Lebererkrankungen fielen.

Ursachen

Anzahl der Patienten

keine histologischen Krankheitsanzeichen 3

Lokalisation für ultrastrukturelle Untersuchung nicht repräsentativ 23

3 Eigene Untersuchungen 59

Gruppe 1

Diese Patientengruppe umfasst 11 Hunde, die an einer degenerativen

Lebererkrankung litten. In Tabelle 3-2 findet sich eine Übersicht der Patienten.

Tabelle 3-2 Übersicht Patienten der Gruppe 1 mit degenerativen Lebererkrankungen (w=weiblich, wk=weiblich kastriert, m=männlich, M.=Morbus, WHWT=Westhighland White Terrier, JRT=Jack Russel Terrier, RHT=Rauhaarteckel)

K-Nr. Rasse Alter in Jahren

Geschlecht Gewichtsklasse Grunderkrankung Vorbehandlung

2029 Fox Terrier 12 w 10-20 kg Hämangiosarkom

(Milz), hgr.Splenitis -

1972

Welsh Terrier 10

w 0-10 kg

Hypothyreose, IBD, Futtermittelallergie,

Mammamisch-tumor, Anteile

eines Karzinoms

Kortison Trimethoprim Sulfonamide

1979

Mischling 13

wk 20-40 kg

Mitralinsuffizienz ohne

hämodynamische Bedeutung, M.

Cushing

Trilostanum

2015 Mischling 11 m 20-40 kg V. a. Pankreatitis -

2017 Cocker Spaniel

9 m 10-20 kg

Anaplastisches Sarkom (Milz) -

1963 Pudel

6

m 10-20 kg

Kryptorchide, Mitralis-

degeneration mit leichter Insuffizienz

Pimobendan

2062 RHT 12 m 0- 10 kg Hypothyreose

-

2063 RHT 12

w 0- 10 kg maligner

Granulosazelltumor (Ovar)

-

1969 WHWT 11 m 0- 10 kg V. a. Lungenfibrose Benazepril

1974 Golden R. 15 w 20-40 kg Leiomyom Benazepril

Carprofen

2025 JRT 11

w 0- 10 kg Nierentumor mit Einbruch in die V.

cava -

Gruppe 2

Die zweite Gruppe der Patienten umfasste 8 Patienten, die eine neoplastische

Veränderung in der Leber aufwiesen. Dabei handelte es sich entweder um einen

Primärtumor der Leber oder um eine sekundäre Lebermetastase. In Tabelle 3-3 ist

eine Übersicht der Patienten mit histopathologischer Tumordiagnose der

Grunderkrankung, sowie der Auflistung verabreichter Medikamente zu sehen.

60 3 Eigene Untersuchungen

Tabelle 3-3 Übersicht Patienten der Gruppe die an einem Primär- oder Sekundärtumor erkrankten (w=weiblich, m=männlich, JRT=Jack Russel Terrier, RHT=Rauhaarteckel)

K-Nr.

Rasse Alter

(Jahre) Ge-

schlecht Gewichts-

klasse

Histo-pathologische

Diagnose (Tumor)

Grunderkrankung/ Verdachtsdiagnose

Vorbehandlung

Seku

nd

ärtu

mo

r

1965 Rottweiler 11 m 20-40 kg Hämangio-

sarkom Hämangiosarkom der

Milz -

2006 Mischling 7 m 20-40 kg Hämangio-

sarkom

Hämangiosarkom der Milz

Pimobendan Benazepril

Spironolacton

2009 Hovawart 7 m 20-40 kg Hämangio-

sarkom

Gekrösetumor in Verbindung zu

Lebertumor L-Thyroxin

2030 Staffordshire

Terrier 10 w 20-40 kg anaplastisches

malignes Lymphom

multizentrisches Lymphom

2027 RHT 13 w 0- 10 kg Metastase eines Plattenepithel-

karzinoms -

Benazepril Propentophyllin

Furosemid Diazepam

Theophyllin

2021

JRT 12 m

0- 10 kg

Metastase eines

Phäochromo- blastoms

Phäochromoblastom der

Nebenniere Ramipiril

Pri

mär

-

tum

or 1968 Mischling 12 m 10-20 kg

Gallengangsadenom, hepatozelluläres

Karzinom - -

2011 Mischling 9 m

10-20 kg Klarzellkarzinom - -

Gruppe 3

Außerdem wurden als Kontrolltiere zwei Hunde der Rasse Beagle herangezogen, die

zuvor im Rahmen einer pharmakologischen Studie bereits als Kontrolltiere dienten.

Die Tiere waren 365 Tage alt und wurden mit einem Standardfutter gefüttert. Zur

Probenentnahme wurden die Tiere über eine überdosierte intravenöse Gabe von

Pentobarbital (0,5 ml/kg KGW Release®) eingeschläfert. Im Anschluss folgte die

Probenentnahme mittels Biopsie. Dabei wurden bei jedem Tier an drei zuverlässigen

Lokalisationen der Leber Bioptate entnommen, sodass insgesamt sechs Proben als

Kontrollmaterial zur Verfügung standen und elektronenmikroskopisch untersucht

werden konnten.

3 Eigene Untersuchungen 61

Tabelle 3-4 Kontrolltiere (m=männlich, d=Tage)

K-Nr.

Rasse

Alter (d)

Geschlecht

Gewicht

2103 Beagle 365 m

10-20 kg

(mittelgroße Rasse)

2104 Beagle 365 m

10-20 kg

(mittelgroße Rasse)

Laboruntersuchungen

Die im Labor der Kleintierklinik des Tierärztlichen Institutes der Georg-August-

Universität Göttingen durchgeführten Blutuntersuchungen erfolgten mit dem

Hämatologiegerät „Abbott Cell-Dyn® 3500“ (Fa. Abbott GmbH & Co. KG,

Wiesbaden). Die Messung der klinisch-chemischen Parameter erfolgte anfangs

mittels des Gerätes „RX Daytona“ (Fa. Randox Laboratories Ltd., United Kingdom),

ab März 2007 stand zur täglichen Routinediagnostik das Analysegerät „Konelab 20i“

(Fa. Thermo Fisher Scientific Inc., Dreieich) zur Verfügung. Die Untersuchung der

Gerinnungsparameter erfolgte mit dem Gerät „SCA 2000 Veterinary Coagulation

Analyzer“ (Fa. Synbiotics, San Diego, California). Die Ergebnisse der durchgeführten

Blutuntersuchungen finden sich in tabellarischer Form im Anhang (Anhangstabelle

10-1 bis Anhangstabelle 10-8).

Gewinnung der Leberprobe

Die Leberbiopsie wurde am sedierten Patienten transabdominal unter

Ultraschallkontrolle durchgeführt. In einigen Fällen machte der sonographische

Befund der Patienten eine sofortige Probelaparotomie in Allgemeinanästhesie

notwendig, sodass bei diesen Tieren unter Sichtkontrolle ein Bioptat entnommen

werden konnte. In beiden Fällen war eine 12-stündige Nahrungskarenz notwendig.

Notfallsituationen bildeten eine Ausnahme.

62 3 Eigene Untersuchungen

Alle Patienten erhielten einen intravenösen Zugang über die Vena cephalica

antebrachii oder Vena saphena lateralis mit einem sterilen Venenkatheter

„Vasocan® “ der Größe: 1,1 x 33 mm der 0,9 x 25 mm (Fa. Braun Melsungen AG,

Melsungen).

Die Sedation zur transabdominalen Biopsieentnahme wurde über die intravenöse

Gabe von Propofol (Narcofol®, Fa. Cp-pharma, Burgdorf) erreicht. Die intravenöse

Gabe erfolgte nach individueller Wirkung. Die maximale Dosis an Propofol belief sich

auf bis zu 6 mg/kg KGW.

Zur intravenösen Einleitung der Allgemeinanästhesie für die Durchführung der

Probelaparatomie wurden folgende Narkotika in Kombination angewendet:

Levomethadon (1 mg/kg KGW L-Polamivet®, Fa. Intervet, Unterschleißheim)

mit Acepromacin (0,4 mg/kg KGW Vetranquil®, Fa. Albrecht, Aulendorf)

Levomethadon (1 mg/kg KGW L-Polamivet®, Fa. Intervet, Unterschleißheim)

und Diazepam (maximal 0,5 mg/kg KGW Diazepam®, Roche Holding GmbH,

Grenzach-Whyhlen) getrennt voneinander verabreicht.

Das Inhalationsnarkosegerät „Sulla 808 V“ der Fa. Dräger, Lübeck, mit Sauerstoff-

Isofluran Gemisch, stand zur Aufrechterhaltung der Injektionsnarkose zur Verfügung.

Die Überprüfung der Vitalparameter erfolgte mit dem Pulsoximeter (Fa. Smiths

Medical PM, Inc. Veterinary Division, Norwell, USA).

Die Leberbiopsie wurde mittels einer sterilen Vet Core Biopsy needle, Surgi VetTM der

Größe: 20 mm, 14 GA, 15 cm, (Fa. Smiths Medical PM, Inc. Veterinary Division,

Norwell, USA) genommen. Die im Rahmen der Biopsie entnommenen

Gewebeproben wurden geteilt. Der Biopsieanteil für die histologische Untersuchung

wurde direkt nach der Entnahme in 10 %igem neutral gepuffertem Formaldehyd für

mindestens 24 Stunden fixiert. Der Anteil der Leberbiopsie für die TEM-

Untersuchung wurde in 2,5 %igem Glutaraldehyd fixiert und unverzüglich in 1mm x

1mm große Blöcke geschnitten.

3 Eigene Untersuchungen 63

3.1.3 Lichtmikroskopische Untersuchung

Präparation

Die Leberbioptate wurden direkt nach der Entnahme in 10 %igem neutral

gepuffertem Formaldehyd für mindestens 24 Stunden fixiert. Im Anschluss wurden

die Gewebeproben zugeschnitten und in Einbettkassetten gelegt. Die

Paraffineinbettung erfolgte automatisch durch das Gerät „Excelsior ES“ (Fa. Thermo

Scientific, Dreieich) nach einem laborüblichen Standardprotokoll (siehe Anhang). Von

den Paraffinblöcken wurden mit dem Schlittenmikrotom (Mikrotom HM 400R, Fa.

Thermo Fisher Scientific, Dreieich) 3-4 µm dicke Schnitte angefertigt. Zum

Abnehmen der Schnitte vom Paraffinblock diente ein im Eisbad angefeuchteter

Durchschlagpapierstreifen. Zum Strecken der Schnitte wurden diese in ein 40°C

warmes Wasserbad überführt. Die Paraffinschnitte wurden dann auf Objektträger

aufgezogen und bei 37°C im Wärmeschrank über Nacht getrocknet. Bis zur weiteren

Verwendung wurden sie bei Raumtemperatur aufbewahrt. Für die histologische

Untersuchung wurden die Paraffinschnitte mit der Standard-Färbung Hämatoxilin-

Eosin (H.&E.) gefärbt. Weitere Spezialfärbungen wurden durchgeführt, wie die

Berliner Blau Reaktion zum Nachweis von Eisen in Hepatozyten und die PAS

Reaktion zum Nachweis von Glykogen in Hepatozyten. Die Protokolle zu den

einzelnen Färbungen sind im Anhang aufgeführt.

Histologische Kriterien zur Diagnosestellung

Die histologische Untersuchung der Leberproben erfolgte in Zusammenarbeit mit

anerkannten Fachtierärzten für Pathologie der Tiermedizinischen Praxis für

Histopathologie Göttingen.

3.1.4 Präparation für die Transmissionselektronenmikroskopie

Für die ultrastrukturelle Untersuchung der hepatozellulären Peroxisomen wurden die

Leberproben in 2,5 %igem Glutaraldehyd fixiert und anschließend in Epon

eingebettet. Die Einbettung erfolgte in einem Epongemisch nach (LUFT 1961) (siehe

Anhang) im Lynx-Einbettautomaten (Fa. Leica, Bensheim, Deutschland). Die genaue

64 3 Eigene Untersuchungen

Anleitung zum Einbetten findet sich ebenfalls im Anhang. Die Bioptate wurden in

bereits mit vorpolymerisiertem Epon zu einem Drittel gefüllten Einbettungsformen

aus Silikongummi seitlich positioniert, so dass beim späteren Anschneiden der

Gewebeblöcke ein günstiger Anschnitt getroffen werden konnte. Die Blockformen

wurden mit Epon aufgefüllt. Es schloss sich eine 24-stündige Polymerisation des

Epoxidharzes bei 60°C im Wärmeschrank an. Die auspolymerisierten Epon-Blöcke

wurden im Anschluss mit einer Fräse (Reichert Ultratrim, Fa.Leica, Bensheim)

getrimmt. Ziel war es, die Oberfläche des Gewebeblockes so zu formen, dass das

Gewebe nur noch von einem schmalen Eponsaum umgeben war. Im weiteren

Verlauf wurden mit Hilfe des Ultramikrotoms (Reichert, Ultracut S, Fa. Leica,

Bensheim) unter Verwendung von Histo-Diamantmessern (Fa. Diatome; Bienne,

Schweiz) 0,5 µm dicke Semidünnschnitte mit einer Kantenlänge von 1-2 mm erstellt.

Die durch den Schneidevorgang anfallenden Schnitte sammelten sich auf dem

Flüssigkeitstrog und wurden auf einen Objektträger mit einem Tropfen Aqua dest.

mittels eines Glasstäbchens übertragen. Anschließend wurden die Schnitte auf einer

Wärmebank bei 60°C für mindestens eine Stunde getrocknet. Die Semidünnschnitte

wurden einer Methylenblau/Azur III Färbung nach RICHARDSON (ausführliches

Protokoll: siehe Anhang) unterzogen und mit Eukitt (Fa. Kindler, Freiburg)

eingedeckt.

Die hergestellten Semidünnschnitte dienten der lichtmikroskopischen Vororientierung

und morphologischen Beurteilung sowie der gezielten Erstellung von

Ultradünnschnitten für die elektronenmikroskopische Untersuchung.

Für die Herstellung der Ultradünnschnitte wurde der lichtmikroskopisch interessante

Bereich des Semidünnschnittes mit den relevanten und repräsentativen

pathologischen Veränderungen in einer Skizze dargestellt, sodass von dieser Region

anschließend der Ultradünnschnitt erstellt werden konnte. Für die Anfertigung der

Ultradünnschnitte wurde der Bereich des Semidünnschnittes ausgewählt, der die

histologisch diagnostizierte Lebererkrankung am besten repräsentierte und die

Hepatozyten im Anschnitt mit Nukleus auch morphologisch ein gut erhaltenes

Erscheinungsbild zeigten. Bei Patienten mit einem Lebertumor wurden die zu

untersuchenden Hepatozyten aus dem an den Tumor angrenzenden Lebergewebe

3 Eigene Untersuchungen 65

entnommen, da nur dort die Zelle in einem Zustand war, der die morphologische

Beurteilung ermöglichte. Die Auswahl der zu untersuchenden Hepatozyten erfolgte

unabhängig von ihrer periportalen, mittzonalen oder zentralen Ausrichtung im

Leberläppchen. Mit Hilfe eines Diamantmessers (Firma Diatome; Bienne, Schweiz)

wurden die 60-80 nm dünnen Schnitte in Form von Schnittketten mit einer

Kantenlänge von 0,1- 0,3 mm erstellt. Die so entstandenen Ultradünnschnitte wurden

auf Kupferobjektträgernetze, sogenannte Grids (single slot 1 x 2, Fa. Plano, Marburg)

aufgezogen. Die Kontrastierung der Schnitte wurde per Hand mit Uranylacetat und

Bleicitrat (REYNOLDS 1963; STEMPAK u. WARD 1964) durchgeführt. Die

Kontrastierungsprotokolle finden sich im Anhang.

3.1.5 Auswertung und Dokumentation

Die lichtmikroskopische Untersuchung (Mikroskop: Axioplan 2-Imaging; Fa. Zeiss,

Göttingen) erfolgte in Zusammenarbeit mit der tierärztlichen Praxis für

Histopathologie Göttingen. Die fotografische Dokumentation und Bearbeitung der

Bilder erfolgte mit der Digitalkamera Axio Cam (Fa. Carl Zeiss, Göttingen) sowie dem

Computerprogramm Axio Vision (Fa. Carl Zeiss, Göttingen).

Für die elektronenmikroskopische Untersuchung stand das ZEISS-

Elektronenmikroskop (EM 10 C, Fa. Zeiss, Oberkochen) sowie das

Bildanalyseprogramm Analysis (Soft Imaging System, Münster) zur Verfügung.

Bei insgesamt 21 Patienten wurde elektronenmikroskopisch die Anzahl der

Peroxisomen in Bezug zur Fläche (µm²) von 6 Hepatozyten bestimmt. Die Auswahl

der Hepatozyten erfolgte in erster Linie nach deren Erscheinungsbild und

Erhaltungszustand, wobei insbesondere die Morphologie der Peroxisomen gut

erhalten sein sollte.

Darüber hinaus wurden die Hepatozyten der Tiere aus Gruppe 1 so ausgewählt,

dass alle eine vergleichbare Menge von Fetttropfen enthielten. Dabei wurde die

Fläche der Fetttropfen nicht von der Gesamtfläche der Hepatozyten abgezogen (DE

CRAEMER et al. 1995).

66 3 Eigene Untersuchungen

Bei der Auswahl der Hepatozyten von Tieren der Gruppe 2 wurden nur gut erhaltene

Hepatozyten aus dem Randbereich der Neoplasie ausgewählt. Von der Auswahl von

Hepatozyten direkt aus dem Zentrum eines Tumors wurde abgesehen, da eine

angemessene Beurteilung der Organellen dieser Zellen aufgrund von nekrotischen

Veränderungen in Folge des tumorösen Geschehens nicht möglich war.

Bei 2500 facher Vergrößerung wurde der Ultradünnschnitt nach gut erhaltenen

Hepatozyten mit Nukleus durchsucht und der ausgewählte Hepatozyt fotografiert

(siehe Abbildung 3-1). Zur Identifikation und Auszählung der Peroxisomen wurde der

Hepatozyt anschließend bei 6300 facher Vergrößerung fotografiert. In dieser Ver-

größerung waren die Peroxisomen gut erkennbar. Die Einzelaufnahmen wurden

schließlich zu einem Bild zusammengefügt. Eine digitale Erfassung von sehr großen

Hepatozyten, erfolgte mit der Multiple Image Alignment (MIA)-Funktion des

Bildanalyseprogrammes. Die Fläche (µm²) eines Hepatozyten wurde ebenfalls mit

Hilfe der Bildanalysesoftware morphometrisch am Computerbildschirm bei 2500

facher Vergrößerung ermittelt. Als Bezugsgröße für die quantitative Bestimmung der

Peroxisomen diente die gesamte zytoplasmatische Fläche des jeweiligen

Hepatozyten (RYOO u. BUSCHMANN 1989).

3 Eigene Untersuchungen 67

Fläche Hepatozyt 173,17 µm²

Abbildung 3-1 Übersicht eines Hepatozyten mit Bestimmung der Fläche in µm², (K2011, Ultradünnschnitt, MIA, Transmissionselektronenmikroskopie Gerätevergr. 2500x)

Auf den ausgedruckten Übersichtsdarstellungen der Hepatozyten wurden die

einzelnen Peroxisomen/Fläche µm² des Hepatozyten ausgezählt. Die Identität der

Peroxisomen musste teilweise in höheren Vergrößerungen auf dem

Computerbildschirm überprüft werden.

Neben der quantitativen Auswertung wurde auch das morphologische

Erscheinungsbild der Peroxisomen sowie das der übrigen Zellorganellen untersucht

und qualitativ erfasst.

Die gesamte elektronenmikroskopische Auswertung erfolgte anhand eines

selbsterstellten Befundbogens (Anhangstabelle 10-9).

68 3 Eigene Untersuchungen

3.1.6 Statistik

Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm Statistica (Fa. StatSoft,

Tulsa, Oklahoma, USA).

Die statistische Auswertung der Peroxisomen/Fläche µm² sowie die Gesamt-

betrachtung der drei Gruppen hinsichtlich Alter und Rasse erfolgte unter Verwendung

eines einfaktoriellen ANOVA Testes. Ein Signifikanzwert von p <0.05 ( 5 %) wurde

der Untersuchung zu Grunde gelegt. Die vergleichende Betrachtung der Gruppen

untereinander erfolgte unter Verwendung des t-Tests. Eine Signifikanz lag vor, wenn

p <0,017 war (Bonforoni Anpassung).

Zu den Untersuchungskriterien gehörten: Peroxisomen (Px) klein, Peroxisomen (Px)

groß, Erhaltungszustand, Verteilung der Peroxisomen (Px) in der Zelle, Protrusion,

Marginalplatte, Nukleoid, Mitochondrien, Schwellung der Mitochondrien,

parakristalline Einschlüsse der Mitochondrien, Riesenmitochondrien, Lipidtropfen,

Myelinfiguren, Glykogen. Die Auswertung der Untersuchungskriterien erfolgte bei

globaler Betrachtung mit dem Kruskal- Wallis Test (p <0,05). Bei Betrachtung der

Einzelgruppen untereinander wurde der Mann-Withney U Test verwendet (p <0,017).

3.2 Ergebnisse

Ziel der vorliegenden Arbeit ist die elektronenmikroskopische, quantitative und

qualitative Untersuchung hepatozellulärer Peroxisomen von Hunden, die entweder

neoplastische oder degenerative Leberveränderungen aufweisen, im Vergleich zu

einer gesunden Kontrollgruppe.

Zunächst werden die Patientengruppen, die in die vorliegende Untersuchung

einbezogen wurden, hinsichtlich der Alters-, Rasse- und Gewichtsklassenverteilung

beschrieben.

Im Anschluss werden die wichtigsten klinisch-chemischen Laborergebnisse

vorgestellt. Schließlich erfolgt eine vergleichende Darstellung der licht- und

elektronenmikroskopischen Untersuchungsergebnisse der einzelnen Gruppen sowie

3 Eigene Untersuchungen 69

in Abhängigkeit vom Alter und den Gewichtsklassen der Hunde mit entsprechenden

statistischen Auswertverfahren.

3.2.1 Zusammensetzung der Patientengruppen

Rasseverteilung

Die Gruppe der Hunde mit degenerativen Leberveränderungen (Gruppe 1) besteht,

wie in Tabelle 3-5 ersichtlich, aus zwei Mischlingen, zwei Rauhaarteckeln, und je

einem Fox Terrier, Welsh Terrier, Cocker Spaniel, Pudel, Westhighland White

Terrier, Golden Retriever und Jack Russel Terrier.

Die Gruppe der Hunde mit neoplastischen Leberveränderungen (Gruppe 2) setzt sich

aus drei Mischlingen und jeweils einem Hund der Rasse Rottweiler, Hovawart,

Staffordshire Terrier, Rauhaarteckel und Jack Russel Terrier zusammen.

Die Gruppe der gesunden Kontrolltiere (Gruppe 3) besteht aus zwei Beagle mit

einem Alter von 365 Tagen.

70 3 Eigene Untersuchungen

Tabelle 3-5 Rasseverteilung der Gruppen 1-3

Altersverteilung

Gruppe 1 besteht aus vier Patienten im Alter zwischen sechs und zehn Jahren

(36 %) und sieben Patienten im Alter von elf bis 15 Jahren (64 %). Keiner der Hunde

aus Gruppe 1 war jünger als sechs Jahre.

Gruppe 2 bestand zur Hälfte aus Hunden zwischen sechs und zehn Jahren und zur

anderen Hälfte aus Hunden im Alter von elf bis 15 Jahren.

Zwei gesunde Kontrolltiere im Alter von 365 Tagen bildeten die Gruppe 3.

Eine vergleichende Darstellung der Altersverteilung findet sich in Tabelle 3-6.

Rasse

Anteil an Gesamtpatientenzahl

Absolute Häufigkeit (n)

Gruppe 1

(Degeneration)

Gruppe 2

(Tumor)

Gruppe 3

(Kontrolle)

Mischling 5 (23 %) 2 3 -

Rauhaarteckel 3 (14 %) 2 1 -

Jack Russel Terrier 2 ( 9 %) 1 1 -

Fox Terrier 1 ( 5 %) 1 - -

Welsh Terrier 1 ( 5 %) 1 - -

Cocker Spaniel 1 ( 5 %) 1 - -

Pudel 1 ( 5 %) 1 - -

Westhighland White Terrier

1 (5 %) 1 - -

Golden Retriever 1 (5 %) 1 - -

Rottweiler 1 (5 %) - 1 -

Hovawart 1 (5 %) - 1 -

Staffordshire Terrier 1 (5 %) - 1 -

Beagle 2 (9 %) - - 2

3 Eigene Untersuchungen 71

Tabelle 3-6 Altersverteilung: absolute und relative Häufigkeit der Patienten der Gruppen 1-3

Gewichtsverteilung

Die Hunde der Gruppe 1 verteilen sich anhand ihres Körpergewichtes in folgende

Gewichtsklassen. Fünf Hunde kleiner Rassen mit einem Körpergewicht (KGW) bis zu

10 kg, drei Hunde mittelgroßer Rasse mit einem KGW von 10-20 kg sowie drei

Hunden großer Rassen mit einem KGW von 20-40 kg.

Tabelle 3-7 Gewichtsverteilung der Patienten der Gruppen 1-3

Gewichtsklasse Anteil an

Gesamtpatientenzahl

Absolute Häufigkeit (n)

Gruppe 1

(Degeneration)

Gruppe 2

(Tumor)

Gruppe 3

(Kontrolle)

kleine Rasse: 0-10 kg 7 (33 %) 5 2 0

mittelgroße Rasse: 10-20 kg 7 (33 %) 3 2 2

große Rasse:

20-40 kg 7 (33 %) 3 4 0

Die Gruppe 2 besteht aus jeweils zwei Hunden (25 %), die kleinen bzw. mittelgroßen

Rassen angehören. Vier Hunde (50 %) gehören großen Rassen an.

Zwei Hunde mittelgroßer Rasse (Beagle) bilden die Gruppe 3 (Kontrolle).

Geschlechtsverteilung

Sechs (54,5 %) von elf Patienten der Gruppe 1 sind weiblichen Geschlechts. Eine

dieser Hündinnen (K 1979) ist kastriert. Diese Hündin wird aufgrund der geringen

Anzahl bei der statistischen Auswertung den weiblichen Tieren zugeordnet. Die

übrigen 5 (45,5 %) Hunde sind männlichen Geschlechts und nicht kastriert.

Altersgruppe

Anteil an Gesamtpatientenzahl

Absolute Häufigkeit (n)

Gruppe 1

(Degeneration)

Gruppe 2

(Tumor)

Gruppe 3

(Kontrolle)

1-5 Jahre 2 (10 %) 0 0 2

6-10 Jahre 8 (38 %) 4 4 -

11-15 Jahre 11 (52 %) 7 4 -

72 3 Eigene Untersuchungen

Tabelle 3-8 Geschlechtsverteilung der Hunde der Gruppen 1-3

Geschlecht Anteil an Gesamtpatientenzahl

Absolute Häufigkeit (n)

Gruppe 1

(Degeneration)

Absolute Häufigkeit (n)

Gruppe 2

(Tumor)

Absolute Häufigkeit (n)

Gruppe 3

(Kontrolle)

weiblich total 8 (38 %) 6 2 0

weiblich intakt 7 (33 %) 5 2 0

weiblich kastriert 1 (5 %) 1 0 0

männlich total 13 (62 %) 5 6 2

männlich intakt 13 (62 %) 5 6 2

männlich kastriert 0 0 0 0

Von den acht Patienten der Gruppe 2, sind zwei (25 %) weiblichen und sechs (75 %)

männlichen Geschlechts, wobei keiner der Hunde kastriert ist.

Gruppe 3 besteht aus zwei männlichen Tieren, die ebenfalls nicht kastriert sind.

3.2.2 Veränderungen der labordiagnostischen Leberwerte

Es folgt ein Überblick über einige wichtige labordiagnostische Leberwerte (ALT,

GLDH, ALKP, Gallensäure), die in der vorliegenden Arbeit bei den Hunden aller

Gruppen untersucht wurden. Die Einteilung der Laborwertveränderungen erfolgt

nach CENTER (2007) in folgende Grade: geringgradig (<5fache Erhöhung des

Referenzwertes), mittelgradig (5-10fache Erhöhung des Referenzwertes), hochgradig

(>10fache Erhöhung des Referenzwertes) sowie die Kategorie „nicht gemessen“ und

„normal“ (Werte im Referenzbereich). Die Laboruntersuchungen wurden für die

Gruppen 1 (Degeneration) und Gruppe 2 (Tumor) durchgeführt. Labordiagnostische

Untersuchungsergebnisse der Kontrolltiere lagen nicht vor.

3 Eigene Untersuchungen 73

Das Enzym Alaninaminotransferase (ALT) ist ein zytoplasmatisches Enzym mit

einer HWZ von 2-3 Tagen beim Hund. ALT-Erhöhungen finden sich bei

hepatozellulären Schädigungen jeglicher Art und sind beim Hund leberspezifisch

(STOCKHAM u. SCOTT 2008). Die größten Anstiege der ALT sind im

Zusammenhang mit hepatozellulären Nekrosen und entzündlichen Prozessen zu

verzeichnen (CENTER 2007).

Abbildung 3-2 ALT Laborwertveränderungen der Gruppe 1 und 2 (Gradeinteilung nach CENTER 2007)

In Gruppe 1 zeigen jeweils 36,4 % der Patienten normale ALT Werte bzw.

geringgradig erhöhte ALT Werte (Abbildung 3-2). Mittelgradige ALT Erhöhungen

finden sich zu 27,2 % der Patienten. Hochgradige Veränderungen der ALT zeigt

keiner der Gruppe 1.

Die Gruppe 2 weist jeweils 12,5 % normale bzw. geringgradig erhöhte ALT Werte

auf, während 37,5 % mittelgradige und 25 % hochgradige Veränderungen der ALT

zeigen. Für 12,5 % der Gruppe 2 liegen keine Messwerte vor.

Die Glutamatdehydrogenase (GLDH) ist ein mitochondriales Enzym und gibt

Hinweise auf Leberzellschädigungen, die fokal oder diffus sein können sowie

reversibel wie irreversibel verlaufen. Die GLDH ist weitaus sensitiver für

74 3 Eigene Untersuchungen

hepatozelluläre Schädigungen beim Hund als die ALT (STOCKHAM u. SCOTT

2008).

Abbildung 3-3 GLDH Laborwertveränderungen der Gruppe 1 und 2 (Gradeinteilung nach CENTER 2007)

Bei Gruppe 1 ist die GLDH insgesamt etwas seltener und nicht so stark erhöht wie

bei Gruppe 2. Hier zeigen 36,4 % der Patienten keine Abweichungen vom

Normalwert, 27,2 % geringgradige Erhöhungen und jeweils 18,2 % mittelgradige

bzw. hochgradige Zunahmen der GLDH. In Gruppe 2 ist bei 37,5 % der Patienten

eine hochgradige Zunahme der GLDH zu verzeichnen, während jeweils 25 %

mittelgradige bzw. gar keine Abweichungen vom Normalwert aufweisen. Für 37,5 %

der Gruppe 2 liegen keine Messwerte vor.

Die Alkalische Phosphatase (ALKP) gehört zur Familie der Phosphatasen. In

nahezu allen Geweben lassen sich Enzymaktivitäten nachweisen. Die ALKP ist nur

bedingt als ein leberspezifisches Enzym zu betrachten (KRAFT u. DÜRR 2005).

3 Eigene Untersuchungen 75

Abbildung 3-4 ALKP Laborwertveränderungen der Gruppe 1 und 2 (Gradeinteilung nach CENTER 2007)

Die Patienten der Gruppe 1 zeigen zu 27,2 % keine Veränderungen der ALKP und

bei jeweils 36,4 % sind geringgradige bzw. mittelgradige Anstiege dieses Enzyms

vorhanden.

In Gruppe 2 zeigen jeweils zwei Patienten (25 %) hochgradige, geringgradige bzw.

keine Erhöhungen der ALKP. Für weitere 25 % liegen keine Messwerte vor.

Die Gallensäuren (GS) sind bedeutend für die Verdauung und Resorption von

Lipiden im Intestinum (KRAFT u. DÜRR 2005). Erhöhungen der Gallensäurewerte

finden sich bei diffusen hepatozellulären Erkrankungen, cholestatischen Prozessen

in der Leber sowie angeborenen und erworbenen portosystemischen Shunts

(STOCKHAM u. SCOTT 2008).

76 3 Eigene Untersuchungen

Abbildung 3-5 Gallensäure Laborwertveränderungen der Gruppe 1 und 2 (Gradeinteilung nach CENTER 2007)

Die Gallensäurewerte der Gruppen 1 und 2 sind überwiegend „normal“. Bei 18,2 %

der Tiere liegen geringgradige Zunahmen vor (Abbildung 3-5). Bei der Hälfte der

Gruppe 2 (50 %) wurden keine Messungen durchgeführt. Bei den übrigen Patienten

zeigen 25 % keine Erhöhungen und jeweils 12,5 % geringgradige bzw. hochgradige

Erhöhungen der Gallensäurewerte. Ausführliche Informationen zu den übrigen

gemessenen klinisch-chemischen, wie auch hämatologischen labordiagnostischen

Parametern der Gruppe 1 und 2 sind im Anhang (Anhangstabelle 10-1 bis

Anhangstabelle 10-8) zu finden.

3.2.3 Lichtmikroskopische Untersuchungsergebnisse

Die Leberbioptate aller in die Untersuchung mit einbezogenen Patienten wurden

einer umfangreichen histopathologischen Untersuchung unterzogen. Bei der Gruppe

1 wurden die degenerativen Veränderungen qualitativ hinsichtlich ihres Charakters

beschrieben sowie semiquantitativ hinsichtlich ihres Ausprägungsgrades in gering-,

mittel- oder hochgradige Veränderungen eingeteilt. Dabei wurden insbesondere auf

die Art der hepatozellulären Degeneration (vakuolig, hydropisch, ballonier-

3 Eigene Untersuchungen 77

end/Pflanzenzelltyp), den Charakter des begleitenden Entzündungszellinfiltrates, den

Lipidgehalt der Hepatozyten, Anzahl und Morphologie der Itozellen, intrazellulär und

extrazelluläres Vorkommen von Pigmenten sowie entsprechende Begleit-

erscheinungen, wie Cholestase, stauungsbedingte Hyperämien oder Proliferation

des Gallengangsepithels geachtet. Eine Zusammenfassung der histopathologischen

Befunde von Gruppe 1 ist in Tabelle 3-9 dargestellt.

In Gruppe 1 zeigten 5 Hunde (45,5 %) insgesamt geringgradige degenerative

Leberveränderungen, während 4 Hunde (36,3 %) mittelgradige Degenerationen

aufwiesen. 2 Tiere (18,2 %) zeigten eine hochgradige Degeneration der Hepatozyten

(Abbildung 3-6). Über 50 % der degenerativen Veränderungen wurden von

Entzündungszellinfiltraten begleitet, die häufig von neutrophilen Granulozyten

dominiert wurden, aber auch gemischtzellige Infiltrate, die fokal, multifokal

herdförmig, zentrolobulär und perivaskulär auftraten. Sie kamen in minimaler,

geringgradiger und mittelgradiger Ausprägung vor. In 27 % der Fälle traten

Lipidansammlungen mit minimaler bis mittelgradiger Ausprägung auf.

Bei Gruppe 2 wurde ebenfalls das nicht-neoplastisch veränderte Leberparenchym

hinsichtlich degenerativer Veränderungen untersucht und beurteilt. Vier (50 %)

Hunde zeigten eine geringgradige Degeneration, eine mittelgradige Degeneration

konnte bei drei Hunden (37,5 %) diagnostiziert werden, während ein Patient (12,5 %)

eine hochgradige Degeneration zeigte. Außerdem wurde der vorhandene Tumor

charakterisiert und entweder als primärer Lebertumor oder als Metastase anderen

Ursprungs eingeteilt.

Eine Zusammenfassung der histopathologischen Befunde von Gruppe 2 ist in

Tabelle 3-10 und Tabelle 3-11 dargestellt.

Bei Gruppe 3 standen zwei Patienten als Kontrolltiere zur Verfügung. Das

Lebergewebe dieser Tiere wurde ebenfalls hinsichtlich degenerativer Veränderungen

untersucht und beurteilt. Beide Patienten wiesen minimale degenerative

Veränderungen auf.

78 3 Eigene Untersuchungen

In Abbildung 3-6 findet sich eine Übersicht der Gruppen hinsichtlich der Aufteilung

der Patienten in Schweregrade der Degeneration.

Abbildung 3-6 Verteilung des Schweregrades der Degeneration in den Gruppen 1-3

Im Folgenden werden exemplarisch einige repräsentative Fälle aus Gruppe 1

anhand ihres charakteristischen histopathologischen Erscheinungsbildes näher

beschrieben.

3 Eigene Untersuchungen 79

Histologische Befunde

Tabelle 3-9 Zusammenfassung der histopathologischen Untersuchungsbefunde von Gruppe 1 (+) minimal, + geringgradig, ++ mittelgradig, +++ hochgradig, *=Makrophagen assoziiert

P-

Nr.

De

ge

ne

ration

de

r

Hep

ato

zyte

n

En

tzü

nd

ung

s-

ze

llen

Lip

ide

in

Hep

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n

Ito

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Pig

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Hep

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zyte

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Cho

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Sta

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Ga

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ga

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tio

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an

g/N

ekro

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ilun

gsm

uste

r

Gru

nd

erk

ran

ku

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va

ku

olig

hyd

rop

isch

ba

llon

iere

nd

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mis

ch

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llig

ne

utr

op

hile

Gra

nu

lozyte

n

Ge

mis

ch

t-

tro

pfig

Hyp

erp

lasie

Ve

rfe

ttun

g

Häm

osid

erin

75/

08

+ (+) +

multifokal/

herd

förm

ig V. a. Hämangio-

sarkom (Milz),

Splenitis

513/

06

+ ++ ++ ++

diffu

s

IBD,

Futtermittelaller

gie

596/

07

+ (+) (+) +++ diffu

s

---

45/

09

+ + ++* ++

diffu

s

---

925/

07

+ (+)

---

Anaplastisches

Sarkom (Milz)

430/

06

++ (+) (+)

diffu

s

---

363/

08

++ + + ++ ++ ++

diffu

s,

multifokal,

herd

förm

ig

---

80 3 Eigene Untersuchungen

Fortsetzung von Tabelle 3-9

P-

Nr.

Deg

en

era

tion

de

r

Hep

ato

zyte

n

En

tzü

nd

ung

s-

ze

llen

Lip

ide

in

Hep

ato

zyte

n

Ito

zelle

n

Pig

men

te in

Hep

ato

zyte

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Cho

lesta

se

Sta

uu

ng

shyp

erä

mie

Ga

llen

ga

ngsp

rolif

era

tio

n

Ze

llun

terg

an

g/N

ekro

se

Ve

rte

ilun

gsm

uste

r

Gru

nd

erk

ran

ku

ng

va

ku

olig

hyd

rop

isch

ba

llon

iere

nd

ge

mis

ch

tze

llig

ne

utr

op

hile

Gra

nu

lozyte

n

Ge

mis

ch

tt-

rop

fig

Hyp

erp

lasie

Ve

rfe

ttun

g

Häm

osid

erin

371/

08

++ ++ (+) + + ++

diffu

s maligner

Granulosa-zelltumor

476/

06

++/++

+ + (+) +/++

---

Kortison-dauer-

medikation (Hautpatient)

539/

07

++/++

+ ++ ++ + +

diffu

s Leiomyom

(kaudal der Blase)

31/

08

+++ ++ ++ m

ultifokal,

zentr

o-lobulä

r Niere: ana-plastischer

Tumor

Geringgradige hepatozelluläre Degeneration

Geringgradige Degenerationen der Hepatozyten waren histologisch durch vakuolige,

hydropische oder auch hydropisch-vakuolige Schwellungen der Hepatozyten

charakterisiert. Die Verteilungsmuster der histologischen Veränderungen reichten

von multifokal herdförmig und herdförmig bis diffus. Die entzündlichen

Begleiterscheinungen waren gemischtzelligen Charakters, rein granulozytärer Natur

oder eine Kombination beider Merkmale. Ein Patient zeigte eine gemischttropfige

Verfettung der Hepatozyten, weitere Patienten zeigten hochgradige Verfettungen

oder auch nur vereinzelt Einlagerungen von Fett in Hepatozyten. Itozellhyperplasien

traten in geringgradigem bis mittelgradigem Umfang auf. Eine Hämosiderose

3 Eigene Untersuchungen 81

assoziiert mit Makrophagen oder Hepatozyten trat bei nahezu allen Patienten auf.

Eine repräsentative Darstellung einer geringgradigen Degeneration findet sich in

Abbildung 3-7.

Abbildung 3-7 Geringgradige Leberzelldegeneration mit ggr. Itozellhyperplasie (Pfeil) und minimalen gemischtzelligen perivaskulären Entzündungszellinfiltraten (Pfeilkopf),

(P75/08, Paraffinschnitt, H.E.).

Mittelgradige hepatozelluläre Degeneration

Die Veränderungen der Hepatozyten in der als mittelgradig eingestuften

Degeneration reichten von rein hydropischen, rein vakuoligen bis zu Mischformen

von vakuolären-hydropischen Veränderungen der Leberzellen. Das

Verteilungsmuster gestaltete sich diffus und multifokal herdförmig in den

untersuchten Lebergeweben. Entzündliche Infiltrate traten in Form von multifokal

geringgradig perivaskulär befindlichen neutrophilen Granulozyten sowie

gemischtzelligen perivaskulären Entzündungszellinfiltraten unter Beteiligung von

neutrophilen Granulozyten auf. Der überwiegende Anteil der Patienten zeigte eine

Hämosiderose und ein Patient zeigte eine Cholestase. Eine repräsentative

Darstellung einer mittelgradigen Degeneration findet sich in Abbildung 3-8.

82 3 Eigene Untersuchungen

Abbildung 3-8 Mittelgradige hydropische Degeneration der Hepatozyten (Pfeilkopf) (P430/06, Paraffinschnitt, H.E.).

Hochgradige hepatozelluläre Degeneration

Die Gruppe der hochgradigen Degenerationen zeigte zwei Patienten mit je einer

vakuolären Degeneration und einer Degeneration vom Pflanzenzelltyp (ballonierende

Degeneration).

Die vakuolige Degeneration trat diffus im Lebergewebe auf und ging mit einer

mittelgradigen gemischttropfigen Verfettung der Hepatozyten einher. Eine

geringgradige Gallengangsproliferation trat auf. Hämosiderinablagerungen in Form

von gelblich-bräunlichen Ablagerungen fanden sich in den Gefäßwänden und in den

Hepatozyten. Eine repräsentative Darstellung der hochgradigen Degeneration findet

sich in Abbildung 3-9.

3 Eigene Untersuchungen 83

Abbildung 3-9 Hochgradige Degeneration der Hepatozyten. Inset zeigt eine ausgeprägte gemischttropfige Verfettung (539/07, Paraffinschnitt, H.E.).

Leberzelldegeneration vom Pflanzenzelltyp (ballonierende Degeneration)

Die Veränderungen der Hepatozyten in Form von hochgradigen

Leberzelldegenerationen vom Pflanzenzelltyp (ballonierend) fanden sich multifokal

zentrolobulär. Vor allem periportal traten multifokal mittelgradige gemischtzellige

Entzündungszellinfiltrate mit hoher Beteiligung von neutrophilen Granulozyten auf.

Eine repräsentative Darstellung einer ballonierenden Degeneration der Hepatozyten

findet sich in Abbildung 3-10.

84 3 Eigene Untersuchungen

Abbildung 3-10 Hochgradige zentrolobuläre Leberzelldegeneration vom Pflanzenzelltyp (P31/08, Paraffinschnitt, H.E.).

Sekundäre Begleiterscheinungen

Die meisten Pigmente, die im Rahmen der degenerativen Veränderungen in Gruppe

1 gefunden werden konnten, waren intrazellulär in Hepatozyten, gelblich-braun und

fein granulär. Eine positive Berliner Blau Färbung sprach für das Vorliegen von

Hämosiderin (Abbildung 3-11).

Einige Patienten zeigten eine Cholestase (Abbildung 3-12). Zahlreiche Patienten

zeigen Itozellhyperplasien (Abbildung 3-13).

Zwei Patienten zeigten Stauungshyperämien. Nekroseherde/Zelluntergänge fanden

sich nur in wenigen Fällen.

3 Eigene Untersuchungen 85

Abbildung 3-11 Geringgradige hydropische Leberzelldegeneration mit Hämosiderinspeicherung in Kupffer Sternzellen (schwarze Pfeile) (P596/07, Paraffinschnitt, Berliner Blau Färbung).

Abbildung 3-12 Geringgradige hydropische bis vakuoläre hepatozelluläre Degeneration mit Cholestase (schwarze Pfeile), (P45/09, Paraffinschnitt, H.E.).

86 3 Eigene Untersuchungen

Gruppe 2

Zwei Patienten der Gruppe 2 hatten primäre Lebertumoren, die hepatozellulären

Ursprungs waren (Tabelle 3-10). Die übrigen Tiere der Gruppe 2 wiesen Metastasen

in der Leber auf, die von Primärtumoren anderen Ursprungs entstammten. So hatten

drei Hunde ein metastatisches Hämangiosarkom. Zwei dieser Patienten zeigten

einen Primärtumor in der Milz. Der Sitz des Primärtumors des dritten Patienten war

unklar (multizentrisches Auftreten Darm/Mesenterium). Jeweils ein Hund wies eine

Lebermetastase eines Plattenepithelkarzinoms bzw. eines Phäochromoblastoms auf

und ein weiterer Hund wies hepatische Anteile eines multizentrischen Lymphoms

auf.

Tabelle 3-10 Tumorverteilung in Gruppe 2

Entstehung des Tumors

Tumorart

Anzahl

primär (n=2) Klarzellkarzinom 1

hepatozelluläres Karzinom 1

sekundär (n=6)

Hämangiosarkom 3

multizentrisches Lymphom 1

Plattenepithelkarzinom 1

Phäochromoblastom 1

Für die Untersuchung hepatozellulärer Veränderungen in der Gruppe 2 wurden nicht

neoplastisch veränderte Hepatozyten im Randbereich der Tumoren ausgewählt und

hinsichtlich Degeneration, Auftreten von Entzündungszellen, Lipidgehalt, Itozellen,

Pigmentgehalt sowie sekundären Begleiterscheinungen, wie Cholestase, Hyperämie

und Gallengangsproliferationen histologisch untersucht. Die Ergebnisse sind in

Tabelle 3-11 zusammengefasst.

3 Eigene Untersuchungen 87

Tabelle 3-11 Histopathologische Untersuchungsbefunde der Gruppe 2 (+) minimal, + geringgradig, ++ mittelgradig, +++ hochgradig

P-

Nr.

Deg

en

era

tion

En

tzü

nd

ung

s-

ze

llen

Lip

ide

in

Hep

ato

zyte

n

Ito

zelle

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Pig

men

t in

Hep

ato

zyte

n

Cho

lesta

se

Sta

uu

ng

shyp

erä

mie

Ga

llen

ga

ngsp

rolif

era

tio

n

Ze

llun

terg

an

g/N

ekro

se

Ve

rte

ilun

gsm

uste

r

vakuolig

hydro

pis

ch

ballo

nie

rend

gem

ischtz

elli

g

mononukle

är

neutr

ophile

Gra

nulo

zyte

n

kle

invakuolig

gro

ßvakuolig

gem

ischttro

pfig

Hyperp

lasie

Verf

ettung

Häm

osid

erin

Bili

rubin

444/

06

+ + + ++

+

mulif

okal

771/

07

+ + + + ++ +

+

multifokal

803/

07

+++ +++ ++ ++ ++

467/

06

+ + ++ +/

++

++ 77/

08

++ + +

zentr

o-

lobulä

r

67/

08

+ ++ ++ ++ + + (+)

multifokal

853/

07

++ (+) +

periport

al

992/

08

++ + ++ ++

+

diffu

s

88 3 Eigene Untersuchungen

Vier Hunde (50 %) zeigten eine geringgradige Degeneration, eine mittelgradige

Degeneration konnte bei 3 Hunden (37,5 %) diagnostiziert werden, während ein

Patient (12,5 %) eine hochgradige Degeneration in der Umgebung der Neoplasie

zeigte (Abbildung 3-6).

Im Folgenden werden exemplarisch einige repräsentative Fälle aus Gruppe 2

anhand des histopathologischen Erscheinungsbildes der nicht neoplastischen

hepatozellulären Veränderungen/Degeneration näher beschrieben.

Geringgradige hepatozelluläre Degeneration im tumorangrenzenden

Lebergewebe

Geringgradige Degenerationen (Abbildung 3-13) des an den Tumor angrenzenden

Lebergewebes zeigten sich in vakuolären, hydropischen Veränderungen oder einer

Kombination beider Charakteristika sowie als ballonierende Degeneration. Es lag ein

multifokal bis diffuses Verteilungsmuster der degenerativen Veränderungen vor. Es

traten gemischtzellige und neutrophile entzündliche Infiltrate auf. Die Patienten

zeigten eine geringgradige bis mittelgradige Itozellhyperplasie und geringgradige bis

mittelgradige Hämosiderinansammlungen. Zwei Hunde zeigten eine mittelgradige

Cholestase. Teils fanden sich gering- bis mittelgradige Gallengangsproliferationen,

geringgradige Stauungshyperämien sowie minimale bis mittelgradige Nekrosen. Eine

repräsentative Darstellung einer geringgradigen vakuolären Degeneration in der

Nähe eines Tumorareals findet sich in Abbildung 3-13.

3 Eigene Untersuchungen 89

a

a a

a

B

A

A

Abbildung 3-13 Itozellhyperplasie mit Verfettung (a), geringgradige vakuoläre Leberzelldegeneration (A), Inset (B): Metastase eines Plattenepithelkarzinoms in der Leber, (P67/08, Paraffinschnitt, H.E.).

Mittelgradige hepatozelluläre Degeneration im tumorangrenzenden

Lebergewebe

Mittelgradige Leberzelldegenerationen (Abbildung 3-14) der an den Tumor

angrenzenden Leberzellen hatten einen hydropischen oder vakuolären Charakter.

Das Verteilungsmuster der degenerativen Veränderungen der Hepatozyten zeigte

sich diffus, periportal oder zentrolobulär. Die Veränderungen wurden von minimalen

bis geringgradigen gemischtzelligen und mononukleären oder neutrophilen

Entzündungsinfiltraten begleitet. Zwei der Patienten zeigten eine gering- bis

mittelgradige Itozellhyperplasie. Geringgradige Ansammlungen von Hämosiderin in

den Hepatozyten sowie Anzeichen einer Cholestase fanden sich bei je einem

Patient. In geringgradigem Umfang fanden sich bei einem Patienten Nekrosen. Eine

repräsentative Darstellung einer mittelgradigen hydropischen Degeneration im

tumorfreien Lebergewebe findet sich in Abbildung 3-14.

90 3 Eigene Untersuchungen

A

B C

D

Abbildung 3-14 Mittelgradige hydropische Leberzelldegeneration (A), intrazelluläre Pigmentablagerung (dünne Pfeile), minimale Infiltrate neutrophiler Granulozyten (dicke Pfeile); Inset (B): Metastase eines Phäochromoblastoms (C) in der Leber, tumorfreies Lebergewebe (D), (P992/08, Paraffinschnitt, H.E.).

Hochgradige hepatozelluläre Degeneration im tumorangrenzenden

Lebergewebe

Die hochgradige Degeneration (Abbildung 3-15) wurde als hydropisch bis

ballonierend charakterisiert. In mittelgradigem Umfang fand sich eine Cholestase und

Stauungshyperämie im Gewebe und in mittelgradigem Umfang traten

Gallengansproliferationen auf. Eine repräsentative Darstellung einer hochgradigen

hydropischen Degeneration im Zusammenhang mit einem Tumor findet sich in

Abbildung 3-15.

3 Eigene Untersuchungen 91

B

A

Abbildung 3-15 Hochgradige hydropische bis ballonierende Degeneration der Hepatozyten (A) im an den Tumor (Hämangiosarkom) angrenzenden Lebergewebe (großes Bild); Inset: Hämangiosarkom, (P803/07, Paraffinschnitt, H.E.).

Sonstige Veränderungen

Hyperplasien der Itozellen traten in geringgradigem bis mittelgradigem Umfang auf

(Abbildung 3-13).

Hämosiderose

Hämosiderin trat in geringgradigem bis mittelgradigem Umfang in den Makrophagen

und Hepatozyten auf (Abbildung 3-16).

Gallengangsproliferation und Stauungshyperämie

Gallengangsproliferationen fanden sich in gering- bis mittelgradigem Umfang.

Stauungshyperämien fanden sich in geringgradigem und mittelgradigem Umfang

(Abbildung 3-17).

92 3 Eigene Untersuchungen

Abbildung 3-16 Geringgradige hepatozelluläre Degeneration bei hepatozellulärem Karzinom, Hämosiderinablagerung in Kupffer Sternzellen (schwarze Pfeile) und intrahepatozellulär (rote Pfeile) (P467/06-1, Paraffinschnitt, Berliner Blau Färbung).

3 Eigene Untersuchungen 93

A

Abbildung 3-17 Ausgeprägte Gallengangsproliferation (dünne Pfeile), Stauungshyperämie (A) und hochgradige hydropische Leberzelldegeneration (Paraffinschnitt, H.E.) bei einem Tier (P803/07) mit einem Hämangiosarkom.

Gruppe 3

Für die vorliegende Arbeit wurden zwei Kontrolltiere herangezogen, die klinisch keine

Hinweise hinsichtlich einer Lebererkrankung aufwiesen. Bei der histologischen

Untersuchung der Lebern zeigten sich jedoch bei beiden Hunden geringgradige

hepatozelluläre Veränderungen, die mit minimaler hydropischer Schwellung

einhergingen (Abbildung 3-18).

94 3 Eigene Untersuchungen

Abbildung 3-18 Geringgradige hydropische Degeneration, (P2103/3, Paraffinschnitt, H.E.).

3 Eigene Untersuchungen 95

3.2.4 Elektronenmikroskopische Untersuchungsergebnisse

Neben der histologischen Untersuchung von Leberbiopsien wurden die

hepatozellulären Veränderungen der Tiere aus den drei Untersuchungsgruppen

ultrastrukturell analysiert und im Hinblick auf morphologische und quantitative

Veränderungen der Peroxisomen miteinander verglichen. Für die ultrastrukturelle

Untersuchung mittels Elektronenmikroskopie wurden zunächst Semidünnschnitte

hergestellt und auf repräsentative Veränderungen der Leberzellen für die spätere

Anfertigung von Ultradünnschnitten abgesucht. Dabei zeigte sich, dass im

Semidünnschnitt die degenerativen Veränderungen teilweise deutlicher zum

Vorschein kamen als in den zuvor untersuchten, mit H.E.-gefärbten histologischen

Schnitten, so dass im Folgenden ergänzend einige repräsentative Semidünnschnitte

mit charakteristischen hepatozellulären degenerativen Veränderungen dargestellt

wurden.

3.2.4.1 Semidünnschnitte

Geringgradige Degeneration

Abbildung 3-19 zeigt, die schon im H.E. Schnitt deutlich erkennbare diffuse

hydropische Schwellung der Hepatozyten. Sehr eindrücklich stellt sich im

Semidünnschnitt die zusätzliche multifokale gemischttropfige Verfettung dar.

Während es sich bei den weißen Punkten in anderen Schnitten um geschwollene

Mitochondrien handelt (Abbildung 3-22), sind es hier eindeutig Fetttropfen. Der

Semidünnschnitt lässt deutlich die Zellgrenzen im Gegensatz zum H.E. Schnitt

erkennen.

96 3 Eigene Untersuchungen

Abbildung 3-19 Gegenüberstellung von Semidünnschnitt und Paraffinschnitt bei einem Fall (K1972) mit geringgradiger hydropischer Leberzelldegeneration mit assoziierter gemischttropfiger Verfettung (Semidünnschnitt, Methylenblau; Paraffinschnitt, H.E.).

Der Patient K1968/1 (Abbildung 3-20) erkrankte an einem hepatozellulären Karzinom

mit adenomatöser Gallengangsproliferation. In Abbildung 3-20 ist eine geringgradige

hydropische Degeneration im an den Tumor angrenzenden Gewebe dargestellt. Der

Semidünnschnitt zeigt sehr deutlich die sich verändernde Anordnung der

Leberzellen, die auch schon im H.E. Schnitt (Inset) nicht mehr gegeben ist. Die

Hepatozyten weisen eine inhomogene Anfärbung des Zytoplasmas auf.

3 Eigene Untersuchungen 97

Abbildung 3-20 Geringgradige hepatozelluläre Degeneration (K1968/1). Der Semidünnschnitt zeigt inhomogene zytoplasmatische Färbungen mit eingelagerten grünlichen Fettvakuolen in den Hepatozyten. Daneben sieht man einen Fetttropfen (Pfeil), der im H.E. Schnitt (Inset) als leere Vakuole erkennbar ist. Im H.E. Schnitt sind zusätzlich Herde mit Hämosiderinablagerungen (Kreis). (Semidünnschnitt, Methylenblau; Paraffinschnitt, H.E. Färbung).

Mittelgradige hepatozelluläre Degeneration

Im Semidünnschnitt sind im Vergleich zum Paraffinschnitt verschiedene Einzelheiten

der jeweiligen hepatozellulären Degeneration besonders sichtbar. Während der

Paraffinschnitt eher nur diffuse Veränderungen einer Degeneration mit mittelgradiger

Ausprägung aufweist, zeigen die Semidünnschnitte deutlich abgegrenzte

Hepatozyten, bei denen die Zellkerne überwiegend noch gut erhalten sind. Im

Zytoplasma sind eindeutige Charakteristika der Degeneration sichtbar, z. B.

ausgeprägte Glykogenfelder, die den Hepatozyten im Paraffinschnitt hydropisch

geschwollen erscheinen lassen (Abbildung 3-21).

98 3 Eigene Untersuchungen

Abbildung 3-21 Mittelgradige hepatozelluläre Degeneration bei einem Hund mit Klarzellkarzinom (K2011/20). Die im Inset sichtbare mittelgradige hydropische Schwellung der Hepatozyten ist im Semidünnschnitt auf eine massive Glykogenablagerung mit einzelnen feinen Fettvakuolen zurückzuführen. (Semidünnschnitt, Methylenblau; Paraffinschnitt, H.E. Färbung).

Hochgradige hepatozelluläre Degeneration vom Pflanzenzelltyp

Auch bei den Fällen mit hochgradigen hepatozellulären Degenerationen lassen sich

in Semidünnschnitten von Biopsien der Tiere mit und ohne tumoröse Veränderungen

deutlich mehr Einzelheiten als im H.E. gefärbten Paraffinschnitt erkennen (Abbildung

3-22). Da sich die individuellen Zellen deutlich darstellen, ist die ausgeprägte

Schwellung sichtbar. Die Zellkerne werden an die Peripherie des Zytoplasmas

gedrängt, oft fehlen Anschnitte der Kerne in der Schnittebene oder es fallen

Kernuntergangsformen auf. Durch die unterschiedliche Schwellung der Zellen wird

die Balkenstruktur der Lobuli sehr unregelmäßig und teilweise aufgelöst. Bei

Schwellung der Zellen mit Akzentuierung der Zellwände wird bei einigen Fällen die

charakteristische pflanzenzellähnliche Erscheinung der Hepatozyten deutlich, die die

Degeneration vom Pflanzenzelltyp lichtmikroskopisch charakterisiert.

3 Eigene Untersuchungen 99

Im Vergleich mit Kontrolltieren (Abbildung 3-23) färbt sich das Zytoplasma der

Hepatozyten unterschiedlich und inhomogen an. Im Zytoplasma finden sich je nach

Art der Degeneration Einschlüsse, die von Fetttropfen über Pigmentablagerungen

und ausgeprägten Vakuolisierungen reichen. Grundsätzlich zeigen die mehr oder

weniger gut erhaltenen Hepatozyten eine Vielzahl kleiner Vakuolen, bei denen es

sich um geschwollene Mitochondrien handelt.

Bei den Tieren mit diffusen hepatozellulären Degenerationen zeigen sich auf

lichtmikroskopischer Ebene am Semidünnschnitt keine Unterschiede zu den Tieren

mit Tumorerkrankungen, bei denen degenerative Hepatozytenareale in Tumornähe

ausgewählt wurden.

F

F

F

F

G

G

Abbildung 3-22 Ausgeprägte hepatozelluläre Degenerationserscheinungen bei einem Tier (K2025/3) aus der Gruppe 1. Neben Fetttropfen (F) zeigen sich Degenerationserscheinungen durch starke deutliche Schwellung der Hepatozyten (Pfeilspitzen). Andere Hepatozyten zeigen intrazytoplasmatische Pigmentablagerungen (dünne Pfeile) oder sind durch unregelmäßige Glykogenablagerungen (G) charakterisiert. In fast allen Zellen sind kleine Vakuolen zu erkennen, bei denen es sich um geschwollene Mitochondrien handelt (Semidünnschnitt, Methylenblau).

100 3 Eigene Untersuchungen

Kontrolltiere

Wie bei der lichtmikroskopischen Auswertung an H.E. gefärbten Paraffinschnitten

zeigen auch die Semidünnschnitte der beiden Kontrolltiere an einzelnen Hepatozyten

vereinzelte Anzeichen einer hepatozellulären Degeneration. Diese äußern sich in

Form von leichten Vakuolisierungen im Zytoplasma oder hydropischen Schwellungen

einzelner Hepatozyten. Überwiegend zeigt die Leber der Kontrolltiere einen

regulären Aufbau der Leberbälkchen mit Hepatozyten, die ein homogen angefärbtes

Zytoplasma aufweisen (Abbildung 3-23).

Abbildung 3-23 Kontrolltier (K2103) mit einzelnen Vakuolen in den ansonsten regelmäßig angeordneten Hepatozyten, die ein homogen gefärbtes Zytoplasma aufweisen (Semidünnschnitt, Methylenblau).

3 Eigene Untersuchungen 101

3.2.4.2 Ultradünnschnitte

3.2.4.2.1 Quantitative Unterschiede der Peroxisomenzahl

Nachdem anhand der Semidünnschnitte repräsentative Ultradünnschnitte aus den

Leberproben angefertigt wurden, konnten diese im Hinblick auf morphologische

sowie quantitative Unterschiede der Peroxisomen zwischen den Gruppen

ultrastrukturell untersucht werden.

Für die quantitative Untersuchung der hepatozellulären Peroxisomen und deren

Vergleich zwischen den Untersuchungsgruppen sowie in Abhängigkeit von Alter und

Rasse/Gewichtsklasse der untersuchten Tiere wurden die Peroxisomen in jeweils

sechs Hepatozyten pro Patient ausgezählt und auf die Gesamtfläche der

Hepatozyten (µm²) bezogen.

3.2.4.2.2 Morphologische Unterschiede der Peroxisomen

Für die morphologische Untersuchung wurden die hepatozellulären Peroxisomen

hinsichtlich ihrer Größe, ihrer Verteilung innerhalb der Zelle sowie ihrer Form

(Protrusion, Marginalplatte, Nukleoid) beurteilt. Darüber hinaus wurden die

hepatozellulären Mitochondrien beschrieben und die Anwesenheit von Lipidtropfen,

Myelinfiguren und der Glykogengehalt semiquantitativ erfasst.

Die Ergebnisse der morphologischen Untersuchungen der hepatozellulären

Peroxisomen und Mitochondrien sowie der semiquantitativen Auswertung von

hepatozellulären Lipidtropfen, Myelinfiguren und Glykogengehalt sind für Gruppe

1(Tiere ohne Tumor) in Tabelle 3-12, für Gruppe 2 (Tiere mit Tumor) in Tabelle 3-13

und für Gruppe 3 (Kontrolltiere) in Tabelle 3-14 zusammengefasst.

102 3 Eigene Untersuchungen

Gruppe 1

Tabelle 3-12 Semiquantitative Beurteilung der Morphologie der Peroxisomen und der Hepatozyten bei Tieren ohne Lebertumoren (+) vereinzelt (<10 %), + geringgradig (10-30 %), ++ mittelgradig (30-50 %), +++ hochgradig (50-100 %), x vorhanden, - nicht vorhanden, n.b. nicht beurteilbar

Merkmal P75/

08

K 2029

P513/

06

K 1972

P596/

07

K 1979

P45/

09

K 2015

P925/

07

K 2017

P430/

06

K 1963

P363/

08

K 2062

P371/

08

K 2063

P476/

06

K 1969

P539/

07

K 1974

P31/

08

K 2025

Px klein

Durchmesser:

ca.555nm

+ + ++ ++ ++ + (+) + (+) ++ ++

Px groß

Durchmesser:

ca. 918 nm

+ + + + + + + - ++ (+) (+)

Verteilung in der

Zelle

Nähe

Fett-

tropfen

Cluster Pan-

zytär

Pan-

zytär

Cluster Pan-

zytär

Cluster

Pan-

zytär

Pan-

zytär

Cluster

Pan-

zytär

Peri-

nukleär

Pan-

zytär

Protrusion x x x - - x x - - - -

Marginalplatte x x x - x x x x x x x

Nukleoid x x x x - x x x x - -

Mitochondrien

Schwellung x - x - x - x x - x x

Lyse - - x - x - - x - x x

Parakristalline

Einschlüsse - - x - x x - - x - -

Riesen-

mitochondrien x x x x x x x x x x -

Lipidtropfen ++ + (+) ++ (+) + - - + ++ -

Myelinfiguren + - ++ ++ + + + ++ (+) + +

Glykogen - +++ +++ +++ ++ +++ + +++ +++ +++ ++

3 Eigene Untersuchungen 103

Gruppe 2

Tabelle 3-13 Semiquantitative Beurteilung der Morphologie der Peroxisomen und der Hepatozyten bei Lebertumoren (+) vereinzelt (<10 %), + geringgradig (10-30 %), ++ mittelgradig (30-50 %), +++ hochgradig (50-100 %), x vorhanden, - nicht vorhanden, n.b. nicht beurteilbar

Merkmal

P 444/06

K 1965

P 771/07

K 2006

P 803/07

K 2009

P 467/06

K 1968

P 77/08

K 2030

P 67/08

K 2027

P 853/07

K 2011

P992/08

K 2021

Px klein

Durchmesser:

ca. 555nm

+ + + + + + + +

Px groß

Durchmesser:

ca. 918 nm

+ + + + + + + -

Verteilung in

der Zelle

panzytär panzytär panzytär panzytär panzytär

Cluster

panzytär panzytär panzytär

Cluster

Protrusion x - x x x x - x

Marginalplatte x - x x x x - x

Nukleoid x - x - x x - x

Mitochondrien

Schwellung x x x - x x - x

Lyse x x x - x x - x

Parakristalline

Einschlüsse

- - x - - - x x

Riesenmitochondrien - - x x - x x -

Lipidtropfen - - ++ + - + - -

Myelinfiguren +++ +++ ++ (+) (+) ++ - ++

Glykogen ++ + +++ ++ ++ + +++ ++

104 3 Eigene Untersuchungen

Gruppe 3

Tabelle 3-14 Semiquantitative Beurteilung der Morphologie der Peroxisomen und der Hepatozyten bei Kontrolltieren (+) vereinzelt (<10 %), + geringgradig (10-30 %), ++ mittelgradig (30-50 %), +++ hochgradig (50-100 %), x vorhanden, - nicht vorhanden, n.b. nicht beurteilbar

Merkmal K 2104-7 K 2104-8 K 2104-9 K 2103-3 K 2103-12 K 2103-15

Px klein

Durchmesser:

ca. 555nm

+ + + ++ + ++

Px groß

Durchmesser:

ca. 918 nm

+++ +++ +++ + +++ ++

Verteilung in der Zelle

panzytär

Cluster

panzytär

Cluster

panzytär

Cluster

perinukleär

Cluster

perinukleär

Cluster

panzytär

Cluster

Protrusion - x x x x -

Marginalplatte x - x - x -

Nukleoid x x x x - x

Mitochondrien

Schwellung x x x x x x

Lyse - x - x x -

Parakristalline

Einschlüsse

- - x - - -

Riesenmitochondrien x x - x x x

Lipidtropfen (+) + + (+) (+) +

Myelinfiguren + + (+) + ++ +

Glykogen +++ +++ +++ +++ +++ +++

3 Eigene Untersuchungen 105

Unterschiede in der Peroxisomengröße

Bei der ultrastrukturellen Untersuchung der Hepatozyten wurde das Vorkommen von

Peroxisomen unterschiedlicher Größe semiquantitativ erfasst, wobei in der

Auswertung die Anzahl der Peroxisomen mit keine (0%), vereinzelt (<10 %),

geringgradig (10-30 %), mittelgradig (30-50 %) und hochgradig (50-100 %) erfasst

wurde. Zusätzlich wurde dabei zwischen kleinen (Durchmesser ca. 555 nm) und

großen (Durchmesser ca. 918 nm) Peroxisomen unterschieden.

Es zeigte sich, dass in Gruppe 1 45,4 % der Patienten eine mittelgradige Anzahl

kleiner Peroxisomen aufwies, während bei 36,5 % der Patienten geringgradig kleine

und bei 18,1 % nur vereinzelt kleine Peroxisomen gefunden wurden. Das

Vorkommen großer Peroxisomen war dagegen in Gruppe 1 anders verteilt. So

enthielten die Hepatozyten von 63,6 % der Patienten große Peroxisomen in geringer

Anzahl, während zwei Patienten (18,2 %) nur vereinzelt Peroxisomen aufwiesen. Bei

einem Patienten dieser Gruppe konnten keine Peroxisomen festgestellt werden,

während ein Tier große Peroxisomen in mittelgradiger Anzahl besaß.

In Gruppe 2 zeigten sich in den Hepatozyten aller Patienten nahezu gleichermaßen

kleine sowie große Peroxisomen in geringgradigem Ausmaß, wobei ein Patient gar

keine großen Peroxisomen aufwies.

Die Kontrollgruppe (Gruppe 3) zeichnete sich dadurch aus, dass die meisten der

untersuchten Hepatozyten (66,6 %) hochgradig große Peroxisomen enthielten und

nur in einem Schnittpräparat jeweils eine gering- bis mittelgradige Anzahl großer

Peroxisomen gefunden wurde. Kleine Peroxisomen waren in 66,7 % der Fälle in

geringgradiger Anzahl feststellbar.

Eine Übersicht über die Verteilung großer und kleiner Peroxisomen in den drei

Untersuchungsgruppen ist in Abbildung 3-24 und Abbildung 3-25 dargestellt.

Die vergleichende statistische Auswertung aller Gruppen hinsichtlich des Auftretens

von kleinen Peroxisomen in den Hepatozyten ergab keinen signifikanten Unterschied

(Kruskal Wallis Test), während bei den großen Peroxisomen ein signifikanter

106 3 Eigene Untersuchungen

Unterschied festzustellen war (Kruskal Wallis Test p-Wert 0,0288; signifikant ab

p <0,05).

Ein paarweiser Gruppenvergleich ist aufgrund einer zu kleinen Gruppengröße aller

Untersuchungsgruppen nicht durchgeführt worden.

Abbildung 3-24 Verteilung kleiner Peroxisomen in den Gruppen 1-3

Abbildung 3-25 Verteilung großer Peroxisomen in den Gruppen 1-3

3 Eigene Untersuchungen 107

Verteilung der Peroxisomen in der Zelle

Bei der Untersuchung des Verteilungsmusters der Peroxisomen innerhalb der

Hepatozyten wurde zwischen einem panzytären Auftreten, Gruppenbildung (Cluster)

(Abbildung 3-27), Anhäufungen im Bereich des Kernes (perinukleär) (Abbildung

3-28) und sonstigen Verteilungsmustern unterschieden. Wie in Abbildung 3-26

ersichtlich, waren die Peroxisomen in Gruppe 1 und 2 am häufigsten panzytär

verteilt, gefolgt von Clusterbildung. In der Kontrollgruppe hingegen waren die

Peroxisomen am häufigsten in Clustern angeordnet und weniger häufig panzytär

bzw. perinukleär. In Gruppe 1 konnte außerdem bei einem Patienten eine deutlich

mit Fetttropfen und degenerierten Mitochondrien (Abbildung 3-29) assoziierte

Lokalisation der Peroxisomen beobachtet werden. Hinsichtlich der statistischen

Auswertung der Verteilung der Peroxisomen in den vier Merkmalen (Nähe

Fettropfen, Cluster, panzytär, perinukleär) ergab sich lediglich in einem Merkmal

(Cluster) ein signifikantes Ergebnis. Gruppe 1 zeigte das Auftreten der Peroxisomen

in Form eines Clusters zu 36,4 %, während Gruppe 2 das Merkmal zu 25 % aufwies

und Gruppe 3 zu 100 %. Der Unterschied erwies sich zwischen allen drei Gruppen

im Merkmal (Cluster) als signifikant p 0,01233 (p Wert signifikant ab p <0,05).

Abbildung 3-26 Peroxisomales Verteilungsmuster der Gruppen 1-3

108 3 Eigene Untersuchungen

M

Abbildung 3-27 Verteilungsmuster der Peroxisomen (Pfeile) als Cluster. Mitochondrium (M) (K2103/15, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 16.000x).

N MM

MM

M

Abbildung 3-28 Perinukleäres Verteilungsmuster der Peroxisomen (Pfeile). Nukleus (N), Mitochondrium (M) (K2103/12, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 6300x).

3 Eigene Untersuchungen 109

Px

Px

Px

Px F

FF

F

M

Abbildung 3-29 Verteilung der Peroxisomen (Px) im Bereich von Fetttropfen (F) und Mitochondrium (M). (K2029, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 16.000x).

Morphologische Veränderungen der Peroxisomen

Die hepatozellulären Peroxisomen wurden darüber hinaus hinsichtlich ihrer

morphologischen Eigenschaften in den verschiedenen Untersuchungsgruppen

beurteilt (Abbildung 3-30). Dabei zeigte sich, dass in Gruppe 1 Marginalplatten

(Abbildung 3-32) am häufigsten mit 90,1 % zu finden waren, gefolgt vom Auftreten

eines Nukleoids (72,3 %) (Abbildung 3-33). In weniger als 50 % der Fälle wiesen die

Peroxisomen in Gruppe 1 Protrusionen (Abbildung 3-31) auf. In Gruppe 2 dagegen

wurden Protrusionen (75 %) ebenso häufig wie Marginalplatten (75 %) festgestellt.

Das Auftreten eines Nukleoids war geringfügig (62,5 %). In der Kontrollgruppe waren

Nukleoide dagegen am häufigsten nachweisbar (83,3 %), gefolgt von Protrusionen

(66,7 %) und dem Vorhandensein einer Marginalplatte (50 %). Bei der statistischen

Auswertung mit Hilfe des Pearson Chi-Quadrat Testes konnten in keinem Fall

signifikante Unterschiede zwischen den Untersuchungsgruppen ermittelt werden

(Protrusion p-Wert 0,40036; Marginalplatte p-Wert 0,16792; Nukleoid p-Wert 0,68960

signifikant ab p<0,05000).

110 3 Eigene Untersuchungen

Abbildung 3-30 Morphologische Veränderungen der Peroxisomen der Gruppen 1-3

PxM

N

Abbildung 3-31 Protrusion (roter Pfeil) eines Peroxisoms (Px). Mitochondrium (M), Nukleus (N) (K1965, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 12.000x).

3 Eigene Untersuchungen 111

M

Px

Px

Px

Px

Abbildung 3-32 Marginalplatten (rote Pfeile) der Peroxisomen (Px). Mitochondrium (M), das geschwollen ist. (K2029, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 16.000x).

Px

Nk

Abbildung 3-33 Peroxisom (Px) mit Nukleoid (Nk) und Marginalplatte (Pfeil). (K1969, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 25.000x).

112 3 Eigene Untersuchungen

Mitochondriale Eigenschaften

Neben den Peroxisomen wurden außerdem die hepatozellulären Mitochondrien

hinsichtlich Schwellungen, lytischen Prozessen und parakristallinen Einschlüssen

sowie der Anwesenheit von Riesenmitochondrien ultrastrukturell untersucht

(Abbildung 3-34).

Dabei zeigten sich in Gruppe 1 am häufigsten Riesenmitochondrien (90,1 %)

(Abbildung 3-35) gefolgt von Schwellungen (63,6 %) (Abbildung 3-37), Lysen (45,5

%) (Abbildung 3-36) und Einschlüssen (36,4 %) (Abbildung 3-35). In Gruppe 2 waren

die am häufigsten beobachteten mitochondrialen Veränderungen in Form von

Schwellung (75 %) und Lyse (75 %) zu finden. Riesenmitochondrien und

parakristalline Einschlüsse kamen dagegen nur bei der Hälfte bzw. etwas mehr als

einem Drittel der untersuchten Patienten von Gruppe 2 vor. In der Kontrollgruppe

zeigten sämtliche Lokalisationen eine ausgeprägte Schwellung der Mitochondrien

und sehr häufig waren Riesenmitochondrien anzutreffen (83,3 %). Die Hälfte der

untersuchten Lokalisationen wiesen lytisch veränderte Mitochondrien auf und nur zu

16,7 % konnten parakristalline Einschlüsse gefunden werden. Die statistische

Auswertung mit dem Pearson Chi square-Test hinsichtlich der mitochondrialen

Eigenschaften Schwellung, Lyse, parakristallinen Einschlüssen und

Riesenmitochondrien ergab keinen signifikanten Unterschied (Schwellung p-Wert

2,4403; Lyse p-Wert 0,41558; Einschlüsse p-Wert 0,65189; Riesenmitochondrien p-

Wert 0,10634; signifikanter p-Wert <0,0500).

3 Eigene Untersuchungen 113

Abbildung 3-34 Eigenschaften der Mitochondrien der Gruppen 1-3

RM

M

Abbildung 3-35 Riesenmitochondrium (RM) mit parakristallinen Einschlüssen (Pfeile) in Nachbarschaft zu einem normal großen Mitochondrium (M) verdeutlicht den Größenunterschied. (K1979, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 16.000x).

114 3 Eigene Untersuchungen

M

Abbildung 3-36 Lyse eines Mitochondriums (M). (K2015, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronen-mikroskopie, Gerätevergr. 12.500x).

M

Abbildung 3-37 Schwellung eines Mitochondriums (M). (K2015, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 12.500x).

3 Eigene Untersuchungen 115

Lipidgehalt, Myelinfiguren und Glykogengehalt

Auch elektronenmikroskopisch konnten intrahepatozelluläre Lipidtropfen in allen

Untersuchungsgruppen nachgewiesen werden (Abbildung 3-39). Entsprechend

wurden ausgewählte Hepatozyten aus den drei Untersuchungsgruppen auf ihren

Lipid- und Glykogengehalt sowie auf das Vorkommen von Myelinfiguren untersucht

und semiquantitativ ausgewertet (Abbildung 3-38). Dabei zeigte sich, dass in Gruppe

1 tendenziell die meisten Lipidtropfen mit mittelgradigen Mengen bei fast 30 % der

untersuchten Hepatozyten nachgewiesen werden konnten. In Gruppe 2 zeigten

dagegen nur 12,5 % einen mittelgradigen Lipidgehalt und die Mehrheit der Patienten

wiesen überhaupt keine Lipidtropfen auf (62,5 %). In der Kontrollgruppe waren

minimale bis geringgradige Lipidgehalte gleichermaßen in den untersuchten

Schnittebenen verteilt. Zur statistischen Auswertung wurde der Kruskal-Wallis Test

herangezogen. Dabei wurden die drei Untersuchungsgruppen hinsichtlich des

Merkmals Lipidtropfen global betrachtet. Hierbei ergab sich ein signifikanter p-Wert

0,0107 (p-Wert signifikant <0,05000). Im Paarvergleich, der mittels des Mann-

Whitney U-Testes durchgeführt wurde, fand sich zwischen Gruppe 2 und 3 ein

signifikanter Unterschied p-Wert 0,008132 (p-Wert signifikant <0,017).

Abbildung 3-38 Häufigkeit des Vorkommens von Lipidtropfen in den Hepatozyten der Untersuchungsgruppen 1-3

116 3 Eigene Untersuchungen

Hepatozyt

F

F

FF

F

FF

Abbildung 3-39 Gemischttropfige Verfettung (F) eines Hepatozyten. (K1972, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. links 2500x und rechts 3150x).

Myelinfiguren als Einschlüsse in Mitochondrien oder Autophagosomen

repräsentieren möglicherweise pathologische Konformationen von Membran-

proteinen und Lipoproteinschichten und wurden vor allem in Gruppe 2 in gehäufter

Form beobachtet. Hier zeigten 37,5 % der Hepatozyten mittelgradige und 25 %

hochgradige Anhäufungen von Myelinfiguren (Abbildung 3-40 und Abbildung 3-41),

während sie bei 25 % der Hepatozyten nur in minimaler Ausprägung gefunden

wurden. In 12,5 % der Gruppe 2 konnten keine Myelinfiguren nachgewiesen werden.

In Gruppe 1 waren vor allem geringgradige Mengen von Myelinfiguren erkennbar

(54,5 %) und bei 27,3 % traten sie in mittelgradiger Ausprägung auf. Der Rest zeigte

entweder keine (9,1 %) oder nur minimale (9,1 %) Anzeichen von Myelinfiguren. Bei

keinem Patienten der Gruppe 1 wurden hochgradige Anhäufungen von Myelinfiguren

festgestellt. In der Kontrollgruppe wurden zu gleichen Teilen minimale bis

geringgradige Mengen von Myelinfiguren nachgewiesen. Die statistische Auswertung

mit Hilfe des Kruskal-Wallis-Tests ergab keinen signifikanten Unterschied p-Wert

3 Eigene Untersuchungen 117

0,2402 (p-Wert signifikant ab p <0,05000). Ein Paarvergleich wurde nicht

durchgeführt.

Abbildung 3-40 Häufigkeit des Auftretens von Myelinfiguren

M

MF

Abbildung 3-41 Myelinfigur (MF) in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem Mitochondrium (M). (K2015, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 16.000x).

118 3 Eigene Untersuchungen

In Gruppe 1 und 3 war der Glykogengehalt der untersuchten Leberzellen am

höchsten (Abbildung 3-42). Das Glykogen stellt sich dabei elektronenmikroskopisch

als Ansammlung feingranulären Materials dar (Abbildung 3-43). Die Kontrollgruppe

zeigte dabei einen hochgradigen Glykogengehalt in 100 % der untersuchten Zellen.

In Gruppe 1 wurden bei 63,6 % hochgradige Mengen und bei 18,2 % mittelgradige

Mengen an Glykogen festgestellt. Der Rest zeigte entweder nur wenig oder gar kein

Glykogen. In Gruppe 2 zeigte die Hälfte der untersuchten Patienten mittelgradige

Glykogenmengen, während jeweils ein Viertel entweder geringgradige oder

hochgradige Glykogengehalte aufwies. Die statistische Auswertung mittels des

Kruskall-Wallis-Test ergab eine Signifikanz. Der p-Wert lag bei 0,0217 (p-Wert

signifikant ab <0,05000). Der Paarvergleich der Gruppen untereinander mittels des

Mann-Whitney U-Testes ergab keine signifikanten Werte (p-Wert signifikant ab p

<0,017).

Abbildung 3-42 Glykogengehalt der Hepatozyten der Untersuchungsgruppen 1-3

3 Eigene Untersuchungen 119

PxNk

Abbildung 3-43 Ausgeprägte Glykogenansammlungen (rote Pfeile) neben einem Peroxisom (Px) mit Nukleoid (N) und sichtbarer Marginalplatte (schwarzer Pfeil). (K1972, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr.16.000x).

3.2.4.2.4 Quantitative Unterschiede

Um herauszufinden, ob sich die Anzahl der Peroxisomen in Abhängigkeit von

unterschiedlichen Krankheitsprozessen in der Leber sowie je nach Alter bzw.

Rasse/Gewichtsklasse der untersuchten Hunde unterscheidet, wurden die

Peroxisomen in sechs repräsentativen Hepatozyten pro Patient bzw. 18 Hepatozyten

pro Kontrolltier (jeweils 6 Hepatozyten aus 3 verschiedenen Lokalisationen)

ausgezählt. Dabei wurde die ausgezählte Peroxisomenmenge auf die Fläche des

untersuchten Hepatozyten bezogen und aus allen untersuchten Hepatozyten der

Mittelwert gebildet. Die Tabellen mit den ausgezählten Peroxisomen pro µm²

Hepatozyt sowie deren Mittelwerte sind im Anhang (Anhangstabelle 10-11)

aufgeführt. Im Anhang (Anhangstabelle 10-12) findet sich eine Gesamtübersicht der

zur statistischen Untersuchung verwendeten Daten.

120 3 Eigene Untersuchungen

Unterschiede zwischen den Gruppen

Die durchschnittliche Peroxisomenzahl/µm² Hepatozyt betrug für die Gruppe 1 0,13

und lag damit etwas höher als in den Gruppen 2 und 3 mit jeweils 0,1

Peroxisomen/µm² Hepatozyt (Abbildung 3-44). Beim Vergleich der untersuchten

Patientengruppen untereinander sowie mit den Kontrolltieren konnten keine

signifikanten Unterschiede zwischen den Hunden der Gruppe 1, Gruppe 2 und den

Kontrolltieren (Gruppe 3) gefunden werden (einfaktorielle ANOVA, p-Wert 0,17515).

Abbildung 3-44 Darstellung der Mittelwerte der Peroxisomenzahl/Hepatozytenfläche (µm²) in den drei Untersuchungsgruppen

Altersabhängige Unterschiede

Da sich zwischen den Untersuchungsgruppen keine statistisch signifikanten

Unterschiede der Peroxisomenzahl/µm² Hepatozyt ergaben und die Patientenzahl

pro Untersuchungsgruppe für eine Einteilung in unterschiedliche Altersstufen

innerhalb der Gruppe zu niedrig war, wurden sämtliche untersuchten Tiere aus allen

Gruppen zusammengefasst und in drei Altersklassen (1-5 Jahre, 6-10 Jahre, 11-15

Jahre) eingeteilt, um mögliche altersabhängige Unterschiede der

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3

n/µm²

Durchschnittliche Px Zahl pro µm² Hepatozyt (Mittelwerte mit Standardabweichung)

3 Eigene Untersuchungen 121

Peroxisomenanzahl/µm² Hepatozyt zu ermitteln (Anhangstabelle 10-12). Dabei

zeigte sich, dass Tiere im Alter von 11-15 Jahren durchschnittlich etwas mehr

Peroxisomen/µm² Hepatozyt (0,12) aufwiesen, als jüngere Tiere (jeweils ca. 0,1

Peroxisom/µm² Hepatozyt). Die statistische Analyse mittels eines einfaktoriellen

ANOVA Testes ergab jedoch keine signifikanten Unterschiede (p-Wert 0,38906)

zwischen den verschiedenen Altersklassen (Abbildung 3-45).

1-5 Jahre 6-10 Jahre 11-15 Jahre

Altersgruppen

0,06

0,07

0,08

0,09

0,10

0,11

0,12

0,13

0,14

0,15

0,16

Mitte

lwert

e d

er

Pero

xis

om

en/ F

läche µ

Abbildung 3-45 Mittelwerte der Peroxisomen/Hepatozytenfläche(µm²) in Bezug zu den Altersgruppen

Gewichts- bzw. rasseabhängige Unterschiede

Neben altersabhängigen Unterschieden wurden außerdem quantitative Unterschiede

der hepatozellulären Peroxisomen in Abhängigkeit der Rasse bzw. des Gewichtes

der untersuchten Hunde ausgewertet. Hierzu wurden ebenfalls sämtliche Tiere aus

allen Gruppen zusammengefasst und in drei Gewichtsklassen (0-10 kg, 10-20 kg,

20-40 kg) eingeteilt (Anhangstabelle 10-12). Beim Vergleich der durschnittlichen

Peroxisomenanzahl/µm² Hepatozyt fiel auf, dass die Hunde kleiner Rassen bzw. der

122 3 Eigene Untersuchungen

Gewichtsklasse1 (0-10 kg) im Mittel deutlich mehr Peroxisomen aufwiesen als Hunde

mittlerer (10-20 kg) bzw. großer Rassen (20-40 kg) Gewichtsklassen. Die statistische

Auswertung mittels des einfaktoriellen ANOVA Tests der verschiedenen

Gewichtsklassen in Bezug auf die Mittelwerte der Peroxisomenanzahl/µm² Hepatozyt

ergab einen signifikanten Unterschied (p-Wert 0,04023). Der Paarvergleich ergab

unter Verwendung des t-Testes nach Bonforoni-Anpassung (p-Wert signifikant ab

<0,017) einen signifikanten Unterschied (p-Wert 0,016221) zwischen den Gruppen 1

(0-10 kg) und Gruppe 3 (20-40 kg).

0-10kg 10-20kg 20-40kg

Gewichtsklassen

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,10

0,11

0,12

0,13

0,14

0,15

0,16

0,17

0,18

Mitte

lwert

e d

er

Pero

xis

om

en/ µ

Flä

che

Abbildung 3-46 Mittelwerte der Peroxisomen/Hepatozytenfläche (µm²) in Bezug zu den Gewichtsklassen

4 Diskussion 123

4 Diskussion

Ziel der vorliegenden Arbeit war die vergleichende lichtmikroskopische und

elektronenmikroskopische Untersuchung von caninen Hepatozyten im Hinblick auf

morphologische und quantitative Unterschiede der Peroxisomen bei Tieren mit

primären degenerativen Lebererkrankungen sowie bei Tieren mit neoplastischen

Veränderungen in der Leber. Zur Diagnostik der Lebererkrankung wurden neben der

pathohistologischen Untersuchung der Leberbiopsien auch leberspezifische klinisch-

chemische Blutparameter untersucht, die in der Diagnostik von Lebererkrankungen

von Bedeutung sind.

4.1 Lichtmikroskopische Untersuchungen

Die geringgradige hepatozelluläre Leberzelldegeneration war die am häufigsten

histologisch gestellte Diagnose, gefolgt von der mittelgradigen hepatozellulären

Degeneration. Die Patienten der Gruppe 1 waren an extrahepatischen Tumoren,

Pankreatitis, IBD, Insuffizienz der Mitralklappe, Hypothyreose und Lungenfibrose

erkrankt. Die Patienten der Gruppe 2 zeigten als Grunderkrankung entweder einen

Primärtumor der Leber oder eine sekundäre Tumorerkrankung infolge einer

Metastasierung in die Leber. Der Charakter der Leberzelldegenerationen reichte in

Gruppe 1 von rein vakuolär (n=2), ballonierend (n=2), vakuolär-hydropisch (n=2) bis

zu rein hydropischer Degeneration (n=5), während Gruppe 2 einen Patienten mit

vakuolär-hydropischer Degeneration, drei Patienten mit rein vakuolärer Degeneration

und vier mit hydropischer Degeneration einschloss. Sicherlich können die einzelnen

Degenerationstypen (vakuolär, hydropisch, ballonierend, Mischformen) aufgrund des

unterschiedlichen Schweregrades nicht gleichgesetzt werden, jedoch lässt sich

feststellen, dass die Untersuchungsergebnisse Parallelen mit den Untersuchungs-

ergebnissen einer Studie von SEPESY et al. (2006) aufweisen, in denen 336

Patienten mit einer vakuolären Degeneration hinsichtlich der Grunderkrankung

untersucht wurden. Sie konnten beweisen, dass die vakuoläre Degeneration von

124 4 Diskussion

Hepatozyten, wie früher angenommen, nicht ausschließlich die Folge übermäßiger

endogener oder exogener Glukokortikoidwirkung ist, sondern zahlreiche

internistische Erkrankungen ursächlich dafür sein können (DE NICOLA et al. 2005;

SEPESY et al. 2006). Das Untersuchungsergebnis wird unterstützt durch die

Tatsache, dass lediglich aus Gruppe 1 je ein Patient (K1972) unter exogenem bzw.

endogenem Glukokortikoideinfluss (Morbus Cushing) (K1979) stand. Sekundär

bedingte Leberveränderungen mit abnormalen Leberenzymaktivitäten sind weitaus

häufiger als primäre Ursachen (DE NICOLA et al. 2005). Darüber hinaus ist der

Anstieg der Leberenzymaktivitäten nicht gleichzusetzen mit dem Schweregrad der

hepatischen Störung. Lediglich 10 % der vorgestellten Patienten mit erhöhten

Leberenzymaktivitäten haben tatsächlich eine primäre Lebererkrankung (DE NICOLA

et al. 2005). Das Leberenzym Alaninaminotransferase (ALT) steigt besonders bei

hepatozellulärer Nekrose, Entzündung (CENTER 2007) und hepatozellulärer

Degeneration (DIAL 1995) an. 37,5 % der Patienten von Gruppe 2 zeigten 5-10fache

ALT Wert Erhöhungen, während sogar 25 % über 10fache Erhöhungen aufwiesen.

Auffallend dabei ist, dass sich die histologischen Veränderungen nicht immer in der

Höhe der ALT Werte widerspiegeln. In Gruppe 1 zeigte Patient K2025 eine

hochgradige Degeneration der Hepatozyten bei gleichzeitig physiologischem ALT

Wert. In Gruppe 2 wies Patient K 2027 histologisch eine geringgradige vakuoläre

Degeneration der Hepatozyten auf, während die ALT um das >10fache erhöht war.

Die geringgradige Degeneration war somit nicht die Grundursache dieser

labordiagnostischen Veränderung, sondern eine Metastase eines

Plattenepithelkarzinoms, das vermutlich zu Nekrose von Leberzellen mit begleitender

Entzündung führte. Erstaunlicherweise zeigte Patient K2030 keine ALT Erhöhung,

ließ jedoch histologisch eine mittelgradige vakuoläre Degeneration in

Zusammenhang mit einem anaplastischen malignen Lymphom in der Leber

erkennen. Diese Beobachtungen decken sich mit der Studie von CENTER et al.

(2007), die ebenfalls feststellten, dass Tiere mit schweren pathologischen

Veränderungen normale ALT Werte aufweisen können. Die Arbeitsgruppe merkt an,

dass normale ALT Werte auch ein Hinweis sein können, dass kaum noch

lebensfähige Hepatozyten vorhanden sind oder aber die ALT schon wieder im

4 Diskussion 125

Absinken begriffen ist (CENTER 2007). Leider können über den Verlauf der

Laborwerte in dieser Studie keine Aussagen getroffen werden, da keine

Untersuchungen der Laborwerte in zeitlichem Verlauf vorgenommen wurden.

Ähnliche Veränderungen finden sich bei dem Enzym Glutamatdehydrogenase

(GLDH), welches ein mitochondriales Enzym darstellt (STOCKHAM u. SCOTT 2008).

Der überwiegende Anteil der Patienten der Gruppe 1 zeigte Werte im

Referenzbereich oder Werte, die unter einer fünffachen Erhöhung lagen. Patient

K2025 wies trotz hochgradiger hepatozellulärer Degeneration einen normalen GLDH

Wert auf. Gruppe 2 hingegen zeigte überwiegend Patienten (37,5 %) mit über

10facher GLDH Erhöhung und 25 % mit fünf bis zehnfacher GLDH Erhöhung. Durch

das Vorhandensein eines Tumors in der Leber als primäre Ursache kam es hier im

Gegensatz zur Gruppe 1 zu stärkeren Schädigungen des Lebergewebes, was sich in

erhöhten enzymatischen Aktivitäten niederschlug. Elektronenmikroskopisch fanden

sich ebenfalls in Gruppe 2 stärkere degenerative Veränderungen der Mitochondrien

in Form von Schwellung und lytischen Veränderungen als in Gruppe 1. Die GLDH

Erhöhungen deuten daraufhin, dass die Mitochondrien in besonderem Maße in ihrer

Funktion beeinträchtigt sind (KÄUFER-WEISS 2007), da das Enzym ansonsten nicht

in dem Ausmaß im Serum messbar wäre. Die Mitochondrien können eine

Schädigung durch Hypoxie, freie Radikale und Toxinbelastung erfahren (VIEIRA u.

KROEMER 1999). Neben den vielseitigen Aufgaben, tragen die Mitochondrien aber

auch selbst zur Radikalbildung bei (ROTH 1997). O2- und H2O2 reagieren häufig mit

Eisen, das sich in den Mitochondrien befindet. Dadurch kann die mitochondriale DNA

geschädigt werden. Die Folge dieser Schädigung ist eine Verstärkung des oxidativen

Stresses aufgrund der Expression veränderter Proteine, die für die Elektronen-

transportkette verantwortlich sind. Es entsteht ein Circulus vitiosus mit verstärkter

Radikalbildung (LEE u. WEI 1997).

Die höchsten ALKP (Alkalische Phosphatase) Erhöhungen fanden sich in der Gruppe

1 zu 35,4 % mit geringgradigen bis mittelgradigen Erhöhungen. Allein 25 % der

Patienten von Gruppe 2 zeigten hochgradige ALKP Wert Erhöhungen. Die höchsten,

also bis zu 100facher ALKP Erhöhung finden sich bei diffusen oder fokalen

cholestatischen Veränderungen, beim hepatozellulären Karzinom, Gallengangs-

126 4 Diskussion

karzinom und Patienten mit einer Glukokortikoidbehandlung oder endogener

Exposition (CENTER 2007). Erstaunlicherweise zeigten in dieser Studie gerade die

Patienten der Gruppe 2 eine normale (K2011) bzw. eine bis zu fünffache (K2009)

Erhöhung des Referenzwertes, die histologisch eine mittelgradige Cholestase

aufwiesen. Eine mögliche Erklärung könnte sein, dass es sich bei dem Pigment doch

um Lipofuscin oder Hämosiderin handelte, da es schwierig ist, dies ohne

Spezialfärbungen nachzuweisen. Patient K2009 erkrankte an einem

Hämangiosarkom der Leber und Patient K2011 an einem Klarzellkarzinom. Der

Patient K1968 zeigte wider Erwarten lediglich eine bis zu fünffache

Referenzwerterhöhung, wobei gerade bei Karzinomen deutlich höhere Werte zu

finden sein können (CENTER 2007).

Die Gruppe 1 zeigte bei drei Patienten histologisch mittelgradige Cholestasen, auch

hier waren die ALKP Werte wider Erwarten normal (K2063) oder nur bis zum

fünffachen Wert erhöht (K2062 und K2015). Lediglich die Patienten, die unter

endogenem (K1979) und exogenem (K1972) Kortisoneinfluss standen, zeigten eine

um das fünf- bis zehnfache Erhöhung des Referenzwertes. Wobei hier natürlich

durchaus höhere ALKP Werte (bis zum 100fachen des Referenzwertes (CENTER

2007) erwartet werden können. Patient K1979 wurde schon mit Trilostan behandelt,

sodass deshalb der ALKP Wert niedriger ausfiel und Patient K1972 erhielt sechs

Monate vor der Biopsieentnahme die letzten Kortisongaben; aufgrund zu starker

Nebenwirkungen wurde die Gabe abgebrochen. Der dennoch relativ hohe ALKP

Wert kann, trotz fehlender Kortisongabe, dadurch erklärt werden, dass dieser Hund

chronisch an einer „Inflammatory bowel disease“ (IBD) und Futtermittelallergie

erkrankt war. Bei derartigen Patienten können erhöhte ALKP Werte durch

endogenen chronischen Stress erzeugt werden (CENTER 2007). Die Gallensäuren

wurden routinemäßig bestimmt. Sie zeigten überwiegend keine Auffälligkeiten,

sodass sie hier nicht weiter diskutiert werden.

Auffallend in dieser Arbeit war das übermäßige Vorkommen von sekundären

Lebertumoren (n=6) im Gegensatz zu primären Lebertumoren (n=2). Die primären

Tumoren zeigten begleitend je eine mittelgradige und eine geringgradige

Leberzelldegeneration, während in der Gruppe der sekundär bedingten Tumoren drei

4 Diskussion 127

Patienten begleitend eine geringgradige, zwei eine mittelgradige zeigten und ein

Patient eine hochgradige Degeneration aufwies. Eine mögliche Erklärung für den

unterschiedlichen Ausprägungsgrad ist sicher die Dauer der Erkrankung, jedoch

auch die Lokalisation der Biopsieentnahme des annähernd gesunden Gewebes der

Leber. Der Umstand, dass in dieser Arbeit mehr Patienten mit einem sekundär

bedingten Tumor untersucht wurden ist darin begründet, dass die Leber neben der

Lunge ein Organ ist, in dem sich bevorzugt Metastasen ansiedeln (CULLEN 2009),

da sie ein sehr stark vaskularisiertes Organ ist (CHEVILLE 1994d; STALKER u.

HAYES 2007). Metastatische Neoplasien sind bei Hunden die am häufigsten

vorkommenden Lebertumoren und entstammen zumeist dem Pankreas, dem

Gastrointestinaltrakt, der Milz, der Milchleiste, den Nebennieren, den Knochen und

der Schilddrüse (HOSKINS 2005).

Letztlich müssen noch die minimalen Veränderungen der klinisch gesunden

Kontrolltiere besprochen werden. Histologisch fanden sich in den histologischen

Proben minimale degenerative Veränderungen. So können die minimalen

geringgradigen Degenerationen der Hepatozyten als Reaktion auf die Hypoxie

betrachtet werden (KÄUFER-WEISS 2007), die im Rahmen einer Allgemein-

anästhesie, wie bei den Kontrolltieren vorliegend eintreten können.

4.2 Elektronenmikroskopische Untersuchung

Für die vorliegende elektronenmikroskopische Untersuchung standen 19

Leberbiopsien von Patienten der Kleintierklinik des Tierärztlichen Institutes der

Georg-August-Universität Göttingen zur Verfügung. Gruppe 1 mit degenerativen

Lebererkrankungen umfasste elf Patienten. Die Gruppe 2 umfasste acht Patienten

mit einem Primär- oder Sekundärtumor der Leber. Als Kontrollgruppe dienten jeweils

3 Leberbiopsien unterschiedlicher Lokalisation von zwei Hunden der Rasse Beagle,

die als klinisch gesund eingestuft wurden. Sämtliche Leberproben wurden an

repräsentativen Lokalisationen hinsichtlich morphologischer Veränderungen der

hepatozellulären Peroxisomen sowie auf deren quantitative Unterschiede untersucht

und zwischen den Gruppen verglichen.

128 4 Diskussion

4.2.1 Quantitative Erfassung der Peroxisomen/Hepatozyt- Fläche

Aufgrund der physiologischen Eigenschaften der Peroxisomen kann angenommen

werden, dass bei primären degenerativen Lebererkrankungen (Gruppe 1) die Anzahl

der Peroxisomen zunimmt. Bei Untersuchungen aus der Humanmedizin an

degenerativ veränderten Hepatozyten, begleitet von steatotischen Veränderungen,

konnte eine Proliferation mit Verringerung der peroxisomalen Größe festgestellt

werden (DE CRAEMER et al. 1995). Auch ein an Lipodystrophie erkrankter Junge

zeigte bei milder Lipidakkumulation eine Steigerung der Peroxisomenanzahl pro

Hepatozyt (DE CRAEMER et al. 1992). Degenerative Veränderungen der

Hepatozyten haben vielfältige Ursachen wie z.B. die Einwirkung verschiedenster

Xenobiotika und Umweltgifte, aber auch hypoxische Zustände mit der Bildung von

freien Radikalen als Folge des oxidativen Stresses. Bei all diesen pathologischen

Veränderungen hat das Peroxisom die Hauptaufgabe die schädlichen Substrate

durch den Peroxidmetabolismus und der damit verbundenen Aktivität der Katalase

zu neutralisieren und weiteren Zellschaden zu verhindern (MANNAERTS u. VAN

VELDHOVEN 1992; SCHRADER u. FAHIMI 2004). In der vorliegenden Arbeit konnte

jedoch keine signifikante Zunahme der Peroxisomenzahl im Vergleich zu den

gesunden Kontrolltieren (Gruppe 3) gefunden werden. Zwischen Gruppe 1 (primäre

hepatozelluläre Degeneration) und Gruppe 2 (Tiere mit Tumoren) waren ebenso

keine signifikanten Unterschiede feststellbar.

Die vorhandene veterinärmedizinische Literatur zu dieser Fragestellung ist sehr

gering. Eine mögliche Erklärung findet sich bei CENTER et al.(1993). Die

Arbeitsgruppe untersuchte Katzen, die an einer Lipidose erkrankt waren. Die Anzahl

der hepatozellulären Peroxisomen der an der Lipidose erkrankten Katzen war wider

Erwarten deutlich verringert, sodass CENTER et al. (1993) vermuteten, dass die

Hepatozyten nicht in der Lage waren neue Peroxisomen zu produzieren und die

Funktion der Organelle aufrechtzuerhalten. Es bestand die Annahme, dass ein

Feedbackmechanismus existiert, der die Biogenese neuer Peroxisomen unterbindet.

Weiterhin bestand die Vermutung, dass die Verminderung der Peroxisomen dem

Krankheitsbild der hepatischen Lipidose zu zuordnen war oder aber die Peroxisomen

4 Diskussion 129

aufgrund peroxisomaler Dysfunktion der Grund der hepatischen Lipidose sein

konnten.

Eine weitere mögliche Erklärung für die ausgebliebene Erhöhung der Peroxisomen in

Gruppe 1 könnte in der Qualität bzw. der Kettenlänge der Fette liegen, die in den

Hepatozyten akkumulieren. Im Rahmen der ß-Oxidation können durch Peroxisomen

lediglich sehr lange oder auch toxische Fettsäuren abgebaut werden (REDDY u.

MANNAERTS 1994; MASTERS u. CRANE 1995). Die Untersuchung der Qualität der

Fette in den Hepatozyten war jedoch nicht Gegenstand dieser Dissertation, wäre

jedoch sicherlich interessant für weiterführende Untersuchungen.

Die ausgebliebene Proliferation von Peroxisomen der Gruppe 1 könnte darüber

hinaus mit dem Prozess der Autophagie in Zusammenhang stehen. Autophagische

Prozesse sind katabole intrazelluläre Abläufe, die letztendlich in einen lysosomalen

Abbau von Zellorganellen münden. Die Autophagie nimmt eine wichtige Stellung ein,

zum Beispiel in Hepatozyten, indem sie die Zelle durch den Abbau von

intrazellulären Materialien mit Nährstoffen versorgt, aber auch nicht mehr benötigte

Zellorganellen abbaut (CUERVO 2004a; MIZUSHIMA 2005). Möglicherweise

unterliegen einige der Peroxisomen aufgrund einer starken Beanspruchung der Zelle

bereits der Autophagie, sodass sie der quantitativen Erfassung nicht mehr zur

Verfügung standen.

Bei der Diskussion um die ausgebliebene Peroxisomenproliferation sollte auch die

Methodik dieser Dissertation beleuchtet werden. Zum einen erfolgte die Auswahl der

Hepatozyten in Anlehnung an eine humanmedizinische Untersuchung, unabhängig

von der periportalen, mittzonalen oder zentralen Ausrichtung, da in dieser

Untersuchung mittels Katalaseanfärbung der Peroxisomen gezeigt werden konnte,

dass es keine bevorzuge periportale oder zentrolobuläre Anhäufung von

Peroxisomen gibt (ROELS et al. 1983). Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass der

Hund gänzlich anders veranlagt ist und bei dieser Spezies durchaus eine regionale

hepatozelluläre Häufung von Peroxisomen besteht. Darüber hinaus könnten z. B.

Proliferationsvorgänge der Peroxisomen vor allem zentrolobulär stattgefunden

haben. Andererseits wurden, um ein vergleichbares Verhältnis von Fläche und

130 4 Diskussion

Anzahl der Peroxisomen zu gewährleisten, bei allen Patienten der Gruppe 1-3

ähnliche Hepatozyten ausgewählt. Diese Auswahl sollte eine Konstanz und

Homogenität der untersuchten Hepatozyten ermöglichen.

Fetttropfen innerhalb des Hepatozyten wurden nicht von der Gesamtfläche

abgezogen, da dies laut DE CRAEMER et al. (1995) nicht notwendig sei, weil sich

dabei keine Unterschiede bei der Zählung von Zellorganellen ergeben.

Fünf Patienten der Gruppe 1 erkrankten an einer geringgradigen Degeneration der

Hepatozyten, vier Patienten an einer mittelgradigen Degeneration und zwei an einer

hochgradigen Degeneration. In der Gruppe 2 zeigten vier Patienten eine

geringgradige und drei Patienten eine mittelgradige Degeneration der Hepatozyten,

während ein Patient eine hochgradige Degeneration aufwies. Die Kontrolltiere

(Gruppe 3) zeigten minimale degenerative Veränderungen. Die Patienten mit

hochgradigen degenerativen Veränderungen zeigten keine höheren durch-

schnittlichen Peroxisomenzahlen je µm² Hepatozytenfläche als Fälle mit gering- oder

mittelgradigen Degenerationen, was eigentlich die Erwartung gewesen wäre. Die

breite Variation des Schweregrades der degenerativen Veränderungen könnte eine

weitere Erklärung dafür sein, dass die durchschnittliche Peroxisomenzahl in beiden

Gruppen nicht zugenommen hat. Es wäre möglich, dass bei gering- bis

mittelgradigen Degenerationsvorgängen der Impuls zur Biogenese von Peroxisomen

zu gering ist oder die Anzahl der vorhandenen Peroxisomen mit der darin

befindlichen Katalase und der Kapazität zur ß-Oxidation ausreicht, um den zellulären

Schädigungen entgegenzuwirken. Darüber hinaus müssten in einer Folgestudie

deutlich mehr Patienten integriert werden, die an einer hochgradigen

hepatozellulären Degeneration leiden, um statistisch die Aussagen besser absichern

zu können.

Im Rahmen der Diskussion der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit müssen auch

speziesspezifische Unterschiede berücksichtigt werden. Die Gabe von als

Peroxisomenproliferatoren wirkenden hypolipidämisch wirksamen Medikamenten

führt beim Hund und Primaten, eingeschlossen der Mensch zu keiner

Peroxisomenproliferation im Gegensatz zu Ratten (DE LA IGLESIA et al. 1981). Die

4 Diskussion 131

unterschiedliche Reaktion der Säugetiere auf die einzelnen Peroxisomen-

proliferatoren korreliert mit der Expression des PPAR α (KLAUNIG et al. 2003;

PETERS et al. 2005). Die schwache Antwort auf Peroxisomenproliferatoren zur

Indukution des PPAR α Rezeptors bei Nicht-Nagern, wie dem Hund, liegt in einer

unterschiedlichen Aktivierung der PPAR α Transkription begründet (BOSGRA et al.

2005). Die Gabe von PPAR α Agonisten verursacht bei der Ratte eine erhöhte

Aktivität der Enzyme zur ß-Oxidation der Mitochondrien und der Peroxisomen,

während beim Hund nur die mitochondriale ß-Oxidationsaktivität gesteigert wird.

Daher führen beim Hund vermehrt anfallende Fettsäuren bedingt durch Behandlung

mit PPAR α Agonisten zu einer erhöhten Aktivität der Mitochondrien, da eine

peroxisomale Proliferation ausbleibt. Es kommt zu einer Mehrbelastung der

Mitochondrien (GUO et al. 2007). Demnach könnte es sein, dass der Hund auf

Einlagerung von Fetttropfen, wie wir sie besonders bei den Patienten K1972/P513/06

(ggr. Leberzelldegeneration) und K1974/P539/07 (hgr. Leberzelldegeneration) mit

mittelgradigen gemischttropfigen hepatozellulären Verfettungen sehen, gar nicht mit

einer Peroxisomenproliferation reagieren kann.

Humanmedizinische Untersuchungen hinsichtlich der Anzahl der Peroxisomen in

Hepatozyten bei tumorösen Erkrankungen der Leber fallen nicht einheitlich aus. Die

konträren Ergebnisse liegen in der Wahl der zu untersuchenden Zelltypen. Werden

die Peroxisomen in stark veränderten Tumorzellen untersucht, sind aufgrund der

Entdifferenzierung der Zellen infolge neoplastischer Veränderungen auch weniger

Organellen, insbesondere Peroxisomen, vorhanden. Sind gesunde oder

degenerierte, dem Tumor benachbarte Hepatozyten Gegenstand der Untersuchung,

so ist davon auszugehen, dass die Organellen wesentlich besser erhalten sind und

gegebenfalls zunehmen. In dieser Studie wurden ausschließlich gut erhaltene

Hepatozyten untersucht. Die Auswahl von annähernd gesund erscheinenden

Hepatozyten für die elektronenmikroskopische Untersuchung, anstatt der tumorös

veränderten Zellen, stellt eine mögliche Erklärung dar, warum die Zahl der

Peroxisomen nicht signifikant verändert ist.

Aufgrund ihrer Untersuchungen kamen BERNHARD u. ROUILLER (1956) zu der

Erkenntnis, dass eine Färbung der Peroxisomen zur eindeutigen Identifikation nicht

132 4 Diskussion

notwendig sei. Daher erfolgte in dieser Arbeit ebenfalls keine Anfärbung. DE

CRAEMER (1995) vertritt ebenfalls die Ansicht, dass sich die Peroxisomen mittels

Elektronenmikroskopie eindeutig in ihrer Morphologie zuverlässig von anderen

Zellorganellen unterscheiden lassen, obwohl die Gefahr bestand, die Zahl der

Peroxisomen zu überschätzen oder zu unterschätzen. Da jedoch in der vorliegenden

Arbeit einige Leberproben nicht die optimale erwünschte Qualität für eine

elektronenmikroskopische Untersuchung aufwiesen, kann nicht ausgeschlossen

werden, dass einige Peroxisomen nicht als solche erkannt wurden. Aufgrund dieser

Erfahrungen ist entgegen der Ansicht von DE CRAEMER (1995) bzw. BERNHARD

u. ROUILLER (1956) eine Katalasefärbung zur Identifikation von Peroxisomen

gerade in stark beeinträchtigten bzw. nicht gut erhaltenen Gewebeproben

ausdrücklich empfehlenswert.

In den Leberbiopsien der Kontrollpatienten fielen histologisch minimale Anzeichen

einer hydropischen Schwellung der Hepatozyten auf. Die Patienten waren 365 Tage

alt, lebten in stabilen Kleingruppen und bekamen ein standardisiertes

Feuchtfuttermittel. Die Hunde zeigten bei der klinischen Allgemeinuntersuchung

keine Auffälligkeiten, wurden aber vor der Biopsieentnahme narkotisiert. Die Narkose

mit begleitender Hypoperfusion des Organismus und der damit verbundenen

Hypoxie, insbesondere im Lebergewebe, könnte ein Grund für die minimalen

hepatozellulären Degenerationserscheinungen sein. Klinisch chemische

Untersuchungsergebnisse der Leberenzyme lagen für diese Tiere leider nicht vor.

Die Tatsache, dass vergleichsweise junge Hunde bereits derartige Veränderungen

zeigen, lässt die Frage aufkommen, ob es überhaupt möglich ist, vollständig gesunde

Hepatozyten für eine derartige Untersuchung unter Narkose zu gewinnen. Allgemein

bleibt festzustellen, dass die Leber auf alle systemischen Einflüsse des Körpers

reagiert, also auch auf nicht hepatische Störungen, die in der Folge die Funktion der

Hepatozyten beeinflussen (CENTER 2007).

4 Diskussion 133

4.2.2 Quantitative Erfassung der Peroxisomen/Hepatozyt-

Fläche/Alter

Da sich zwischen den Untersuchungsgruppen keine statistisch signifikanten

Unterschiede der Peroxisomenzahl/µm² Hepatozyt ergaben und die Patientenzahl

pro Untersuchungsgruppe für eine Einteilung in unterschiedliche Altersstufen

innerhalb der Gruppe zu niedrig war, wurden sämtliche untersuchten Tiere aus allen

Gruppen zusammengefasst und in drei Altersklassen (1-5 Jahre, 6-10 Jahre, 11-15

Jahre) eingeteilt, um mögliche altersabhängige Unterschiede der

Peroxisomenanzahl/µm² Hepatozyt zu ermitteln (Anhangstabelle 10-12). Die

statistische Analyse ergab jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den

verschiedenen Altersklassen. Es zeigte sich das Tiere im Alter von 11-15 Jahre

durchschnittlich etwas mehr Peroxisomen/µm² Hepatozyt (0,12) aufwiesen als

jüngere Tiere (0,10 Peroxisomen/µm² Hepatozyt). Die Tendenz der Peroxisomen,

verstärkt in alternden Zellen aufzutreten, deckt sich mit einer humanmedizinischen

Untersuchung. Es wurde festgestellt, dass alternde Fibroblasten, deren

peroxisomaler Enzymgehalt z. B. Katalase absinkt, diesem Zustand mit einer

Peroxisomenproliferation begegnen (LEGAKIS et al. 2002). Es handelte sich bei

dieser Untersuchung zwar um Fibroblasten, jedoch ist nicht auszuschließen, dass

dieses Phänomen auch für canine Hepatozyten zutrifft. Für weiterführende

Untersuchungen sollten in den Gruppen 1-3 deutlich größere Patientenzahlen in den

Altersgruppen gewählt werden, um statistisch aussagekräftigere Untersuchungen

machen zu können.

4.2.3 Quantitative Erfassung der Peroxisomen/Hepatozyt-

Fläche/Rasse

Die Hepatozyten der kleinen Rassen (0-10 kg) zeigen signifikant mehr

Peroxisomen/µm² Hepatozytenfläche als die Tiere, die den Gewichtsklassen 10-20

kg und 20-40 kg angehörten. Für dieses Phänomen liegen in der Literatur keine

Hinweise vor. Wird in die Betrachtung der Gewichtsklasse (0-10 kg) das Alter

einbezogen, gehören zwei Patienten der Altersgruppe 6-10 Jahre an und fünf

134 4 Diskussion

Patienten fallen in die Gruppe 11-15 Jahre. Sowohl die Gewichtsklasse 10-20 kg als

auch die Gewichtsklasse 20-40 kg weisen je drei Patienten mit einem Alter von 6-10

Jahren auf. Zwei Patienten der Gewichtsklasse 10-20 kg sowie vier Patienten der

Gewichtsklasse 20-40 kg haben ein Alter von 11-15 Jahren erreicht.

So hatte die vermehrte Anzahl der Peroxisomen in den Hepatozyten wahrscheinlich

weniger mit der Rasse als mit dem Alter zu tun. Aus Untersuchungen in der

Humanmedizin ist bekannt, dass auch Fibroblasten mit zunehmendem Alter mit einer

Peroxisomenproliferation reagierten (LEGAKIS et al. 2002).

4.2.4 Morphologische Untersuchungen

Bei der morphologischen Untersuchung wurden die Peroxisomen anhand ihrer

Größe (klein/groß), ihres Verteilungsmusters innerhalb der Zelle sowie ihrer

morphologischen Veränderungen (Protrusion, Marginalplatte, Nukleoid) beurteilt.

Peroxisomengröße

In Gruppe 1 und 2 konnte aufgrund der vorhandenen degenerativen sowie der

Lokalisation der Hepatozyten in unmittelbarer Nachbarschaft zu neoplastischen

Prozessen, dem teilweise Vorhandensein von Fetttropfen und dem aus den

degenerativen Veränderungen für die Zelle resultierenden oxidativen Stress, erwartet

werden, dass dies eine Proliferation von Peroxisomen bei gleichzeitiger

Verkleinerung der Peroxisomengröße zur Folge hatte.

Im Rahmen von Proliferationsvorgängen verringern Peroxisomen ihre Größe,

während ihre Gesamtzahl zunimmt (DE CRAEMER 1995).

In der vorliegenden Untersuchung konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede

in den einzelnen Gruppen 1-3 im Hinblick auf das Vorkommen kleiner Peroxisomen

festgestellt werden. Da es sich hierbei um eine semiquantitative Auswertung

handelte, konnte im vorliegenden Fall keine Aussage über absolute Zahlen getroffen

werden, aber es liegt die Vermutung nahe, dass in den untersuchten Zellen keine

Proliferation stattgefunden hatte. Diese Feststellung wurde unterstützt durch die

Tatsache, dass bei Betrachtung der Gruppen 1-3 ein signifikanter Unterschied

4 Diskussion 135

bestand, was das Auftreten von großen Peroxisomen betraf. Große Peroxisomen

fanden sich in Zellen, in denen keine Peroxisomenproliferation stattgefunden hatte.

Verteilungsmuster in der Zelle

Hinsichtlich der statistischen Auswertung der Verteilung der Peroxisomen in vier

Merkmalen (Nähe Fettropfen, Cluster, panzytär, perinukleär) ergab sich lediglich in

einem Merkmal (Cluster) ein signifikantes Ergebnis. Gruppe 1 zeigte das Auftreten

der Peroxisomen in Form eines Clusters zu 36,4 %, während Gruppe 2 das Merkmal

zu 25 % aufwies und Gruppe 3 zu 100 %. Der Unterschied erwies sich zwischen

allen drei Gruppen als signifikant p 0,01233 (p-Wert signifikant ab p <0,05).

Keine der Gruppen 1-3 zeigte ein perinukleäres Auftreten von Peroxisomen, sodass

auch diese Untersuchung die Annahme unterstützt, dass keine

Proliferationsvorgänge in den untersuchten Hepatozyten stattgefunden hatten.

Unsere Untersuchungen werden von ROELS et al. (1983) und DE CRAEMER et al.

(1991) bestätigt, die ebenfalls bei Proliferationsvorgängen und in pathologisch

veränderten Lebern eine perinukeäre Verteilung der Peroxisomen fanden. In der

Kontrollgruppe der vorliegenden Studie lagen die Peroxisomen zu 100 % als Cluster

vor, was durch die Untersuchung von ROELS et al. (1983) bestätigt wird, der

ebenfalls bei gesunden Lebern eine homogene Verteilung der Peroxisomen

beobachtet oder die Ansammlung in Form von Gruppen (Cluster). Die degenerativ

veränderten Hepatozyten (Untersuchungsgruppe 1 und 2) zeigten deutlich weniger

Peroxisomen in Form von Clustern. Die Beobachtung, dass Peroxisomen sich

insbesondere in der Nähe von Fetttropfen positionierten (SCHRADER 2001) ließ sich

in der vorliegenden Studie nicht bestätigen, was sicherlich daran lag, das nur zwei

Patienten K1972/P513/06 (ggr. Leberzelldegeneration) und K1974/P539/07 (hgr.

Leberzelldegeneration) hepatozelluläre Verfettungen im Untersuchungsgut

aufwiesen.

Morphologische Veränderungen (Protrusion, Marginalplatte, Nukleoid)

Bei der statistischen Auswertung mit Hilfe des Pearson Chi-Quadrat Testes konnten

in keinem Fall signifikante Unterschiede zwischen den Untersuchungsgruppen

136 4 Diskussion

ermittelt werden (Protrusion p-Wert 0,40036; Marginalplatte p-Wert 0,16792;

Nukleoid p-Wert 0,68960 signifikant ab p<0,05000).

Protrusion:

Das Auftreten von Protrusionen findet man insbesondere bei degenerativen

Veränderungen der Hepatozyten in Zusammenhang mit Steatose, Hepatitiden und

auch Tumorerkrankungen (DE CRAEMER 1995). Die Formveränderungen findet

man ebenfalls bei Proliferationsvorgängen der Peroxisomen. Sie führen zusätzlich zu

einer Oberflächenvergrößerung, die einen erhöhten peroxisomalen Metabolismus

ermöglichen (ROELS et al. 1991). Auffallend ist, dass die Kontrolltiere annähernd so

viele Peroxisomen aufweisen wie die Gruppen 1-2. Eine mögliche Erklärung stellt

neben der Lokalisation der Entnahme der Leberprobe auch der Zeitpunkt im

Krankheitsverlauf dar, sodass zu Beginn einer degenerativen Veränderung der

Impuls zur Peroxisomenproliferation und damit einhergehender Formveränderung

stärker ausfällt als im späteren Verlauf und mit zunehmender Dauer der Erkrankung

abnimmt, gänzlich schwindet oder auf einem Niveau bleibt. Leider liegen über die

Dauer der einzelnen Erkrankungen der Patienten keine Daten vor.

Marginalplatte und Nukleoid:

Die Marginalplatte als elektronendichte Verdickung unter der Peroxisomenmembran

und das Nukleoid als elektronendichter Kern zentral im Peroxisom zeigten sich bei

allen drei Untersuchungsgruppen in nahezu ähnlichem Umfang. Eine Untersuchung

an Katzen, die entweder an einer Lipidose erkrankt waren oder an einer

Gallengangsobstruktion, zeigte, dass bei der erstgenannten Gruppe weder

Marginalplatten noch Nukleoide und bei den Patienten, die an einer

Gallengangsobstruktion litten, beide morphologischen Merkmale vorhanden waren

(CENTER et al. 1993). Die Arbeitsgruppe vermutete, dass das komplette

Verschwinden der morphologischen Merkmale direkt mit dem Krankheitsbild der

Lipidose verbunden ist (CENTER et al. 1993). Bei der quantitativen Erfassung sollte

ebenso berücksichtigt werden, dass das Vorhandensein des Nukleoids abhängig von

der Schnittebene des Präparates ist (DE DUVE u. BAUDHUIN 1966).

4 Diskussion 137

Degenerative Veränderungen, wie sie bei Gruppe 1 und 2 in unterschiedlichem

Schweregrad auftraten, scheinen demnach nicht mit Veränderungen der

Marginalplatte oder dem Nukleoid einherzugehen.

Mitochondriale Eigenschaften

Die Mitochondrien wurden hinsichtlich des Auftretens von Schwellungen, lytischen

Erscheinungen, parakristallinen Einschlüssen und dem Auftreten von

Riesenmitochondrien untersucht. Es bestand kein signifikanter Unterschied in den

vier untersuchten Merkmalen zwischen den Gruppen 1-3. Eine Schwellung zeigten

nahezu 100 % der Gruppe 3 und in etwa gleichen Anteilen Gruppe 1 und 2 (60-70

%). Hinsichtlich der lytischen Veränderungen zeigten beinahe 80 % der Gruppe 2

dieses Merkmal, während dies bei ungefähr 50 % der Gruppe 1 und 3 zutraf.

Parakristalline Einschlüsse fanden sich bei knapp 40 % der Gruppe 1 und 2 sowie

bei knapp 20 % der Gruppe 3. Die Riesenmitochondrien traten zu 80-90 % in Gruppe

1 und 3 auf, während Gruppe 2 zu etwa 50 % das Merkmal aufwies.

Zu den mitochondrialen Veränderungen bei beeinträchtigter Zellhomöostase gehören

Schwellung und Lyse der Mitochondrien, parakristalline Einschlüsse und die Bildung

von Riesenmitochondrien (CHEVILLE 1994c). Mitochondriale Veränderungen

werden dann als bedeutsam betrachtet, wenn sie weitläufig, diffus und immer

wiederkehrend auftreten (CENTER et al. 1993). Allerdings muss einschränkend

gesagt werden, dass mitochondriale Veränderungen in einer Vielzahl von

humanmedizinischen Lebererkrankungen auftreten und diese als unspezifisch

betrachtet werden (PHILLIPS et al. 1987). Veränderungen in Form von

Schwellungen der Mitochondrien fanden sich ebenfalls in tumorös als auch an den

Tumor angrenzenden Lebergeweben (GHADIALLY u. PARRY 1966). Insbesondere

die Gruppen 1 und 2 zeigten überwiegend histologisch geringgradige und

mittelgradige sowie wenige hochgradige Degenerationen der Hepatozyten.

Die Interpretation der elektronenmikroskopischen Bilder muss immer unter dem

Gesichtspunkt der Fixationsmethode betrachtet werden, denn Glutaraldehyd hat

einen negativen Einfluss auf Membranen, insbesondere auf die sehr empfindlichen

138 4 Diskussion

mitochondrialen Membranen, sodass es leicht zu Artefakten kommen kann

(CHEVILLE 1994c).

Die mitochondrialen Größenveränderungen lassen sich nicht in den Hämalaun-Eosin

gefärbten Paraffinschnitten erkennen. Dagegen werden sie in den

Semidünnschnitten, in Form von intrahepatozellulären kleinen weißen Punkten auf

„blauem Hintergrund“ deutlich. CENTER et al. (1993) beobachteten in ihrer

Untersuchung bei den an Lipidose erkrankten Katzen ebenfalls eine starke

Größenzunahme der Mitochondrien, die sie als Kompensationsmechanismus für eine

verminderte Anzahl an Mitochondrien betrachten.

Lipidtropfen, Glykogengehalt und Myelinfiguren in den Hepatozyten

In Gruppe 1 konnten tendenziell die meisten Lipidtropfen nachgewiesen werden. 30

% der untersuchten Hepatozyten zeigten entsprechende Lipidgehalte. In Gruppe 2

zeigte die Mehrheit der Patienten überhaupt keine Lipidtropfen (62,5 %). Die

Kontrollgruppe zeigte minimale Anzeichen einzelner kleiner Lipidtropfen.

Hepatozelluläre Degenerationen sind nicht entzündliche Veränderungen der

Hepatozyten, bedingt durch eine Hypoxie oder allgemeine Stoffwechselstörungen

(KÄUFER-WEISS 2007). Neben der Einlagerung von Wasser (KÄUFER-WEISS

2007) kann es auch zur Anreicherung von Lipiden oder Glykogen kommen

(STALKER u. HAYES 2007; CULLEN 2009). Die Kontrollgruppe zeigte deutlich mehr

Lipidtropfen als die Gruppe 2. Ein mögliche Erklärung liegt in einer prähepatischen

Ursache wie z.B. Hungern (STALKER u. HAYES 2007). Die Tiere insbesondere der

Gruppe 3 wurden vor der Narkose 24h nüchtern belassen. Bei Gruppe 2 konnten die

Tiere nicht in allen Fällen nüchtern gelassen werden, da es sich um Notfälle

handelte, die der direkten Behandlung (Operation) bedurften. Eine weitere mögliche

Erklärung wäre eine Reduktion von Enzymen zur ß-Oxidation in den Peroxisomen

der Kontrollgruppe. Um dies beweisen zu können, müsste man in einer

Folgeuntersuchung die peroxisomalen Enzyme quantitativ bestimmen.

Die Gruppen 1 und 3 zeigten die größten Mengen an Glykogeneinlagerungen in den

untersuchten Hepatozyten. Mögliche Erklärungen finden sich in Gruppe 1 im Hinblick

4 Diskussion 139

auf Grunderkrankungen der untersuchten Patienten. So litt Patient K1972 an einer

Futtermittelunverträglichkeit/Allergie und bekam regelmäßig Glukokortikoide iatrogen

verabreicht. Der Patient mit K1979 war an einem Morbus Cushing erkrankt, sodass

er unter endogenem Glukokortikoideinfluss stand. Beide Patienten zeigten bei der

Bestimmung der klinisch-chemischen Blutparameter hochgradige ALT und ALKP

Erhöhungen (Anhangstabelle 10-1). Die Ursache der starken Glykogeneinlagerung

bei den Kontrolltieren könnte darin begründet liegen, dass es sich um gesunde Tiere

handelte, die keine Anorexie im Vorfeld aufwiesen, während die anderen Patienten

teilweise Anzeichen einer Anorexie als klinisches Begleitsymptom ihrer Erkrankung

zeigten. Die Hepatozyten der Gruppe 2, die an den Tumor angrenzend lagen,

zeigten überwiegend eine gering- bis mittelgradige Einlagerung von Glykogen.

Myelinfiguren als Einschlüsse in Mitochondrien oder Autophagosomen

repräsentieren möglicherweise pathologische Konformationen von Membran-

proteinen und Lipoproteinschichten (CASTEJON u. CASTEJON 2008). Die

statistische Auswertung aller drei Untersuchungsgruppen ergab kein signifikantes

Ergebnis. Die Gruppe 2 zeigte in der elektronenmikroskopischen Untersuchung zu

37,5 % in mittelgradiger und zu 25 % Myelinfiguren in hochgradiger Ausprägung.

Myelinfiguren entstehen durch die Degeneration des Endoplasmatischen Retikulums,

aber auch durch andere Organellen. Die Membranen kollabieren, aggregieren und

formieren sich neu zu „Myelinfiguren“. Diese finden sich frei im Zytosol (CHEVILLE

1994c, b). Die untersuchten Hepatozyten der Gruppe 2 zeigten besonders auffällig

degenerative Veränderungen der Mitochondrien. Damit geht das starke Auftreten der

Myelinfiguren einher, so dass davon auszugehen ist, dass die Hepatozyten der

Gruppe 2 in dem Tumor angrenzenden Gebiet deutlich stärker degeneriert und in

ihrer Funktion beeinträchtigt sind als die Hepatozyten der Gruppe 1 und 3.

Insgesamt lässt sich festhalten, dass die ultrastrukturellen Veränderungen im Bereich

der Peroxisomen und angrenzender Strukturen bei Tumorpatienten stärker zu Tage

treten als bei den Tieren mit reiner Leberdegeneration und den Kontrolltieren.

140 4 Diskussion

4.3 Beeinflussung der Peroxisomenzahl durch Medikamente

Alle in der vorliegenden Arbeit untersuchten Patienten wurden zur Entnahme einer

Leberbiopsie in Allgemeinnarkose versetzt. In den meisten Fällen handelte es sich

um eine Kombination aus Levomethadon (L-Polamivet®, Fa. Intervet,

Unterschleißheim) und Acepromacin (Vetranquil®, Fa. Albrecht, Aulendorf). In einigen

Fällen wurde die Kombination aus Levomethadon (L-Polamivet®, Fa. Intervet,

Unterschleißheim) und Diazepam (Diazepam®, Roche Holding GmbH, Grenzach-

Whyhlen) verwendet, die getrennt voneinander appliziert wurden. Eine dritte Variante

der Allgemeinnarkose bestand aus der Kombination von Levomethadon (L-

Polamivet®, Fa. Intervet, Unterschleißheim) und Xylazin (Xylazin®, Fa. Cp Pharma,

Burgdorf). Eine letzte Variante bestand aus Propofol und Xylazin (Xylazin®, Fa. Cp

Pharma, Burgdorf).

Zwar liegen keine detaillierten Informationen zur Wirkung dieser Medikamente

explizit auf hepatozelluläre Peroxisomen vor, aber allgemein kann angenommen

werden, dass eine Narkose zu einer Hypoperfusion und damit zu einer Hypoxie der

Zellen führt, die wiederum in der Zelle einen erhöhten oxidativen Stress nach sich

zieht. Dies könnte eine Peroxisomenproliferation induzieren.

In der Gruppe 2 wurde dem Tier K1972 mit geringgradiger Leberzelldegeneration

wiederholt Kortison und dauerhaft Sulfonamide verabreicht. Glukokortikoide führen

zu einer Verminderung der Peroxisomen (PHILLIPS et al. 1987). Dies gilt es bei der

Zählung der Peroxisomen zu berücksichtigen, wenngleich es sich hier nur um einen

Patienten handelte, so dass dies sicher nicht den Ausschlag für das Gesamtergebnis

ergab. Dem Hund K1974 mit einer hochgradigen Degeneration der Hepatozyten

wurde Carprofen verabreicht, ein nicht steroidales Antiphlogistikum. Aufgrund der

Tatsache, dass Acetylsalicylsäure der gleichen Gruppe angehört und dies zu einer

Erhöhung der Peroxisomenzahl beim Menschen führt, kann eine solche Wirkung

theoretisch auch für den Hund von Bedeutung sein. Es fehlen jedoch

wissenschaftliche Untersuchungen dazu.

4 Diskussion 141

Bei Patient K1979 mit einer geringgradig eingestuften Degeneration wurde Trilostan,

ein Wirkstoff zur Behandlung des Morbus Cushing verabreicht. Es konnte keine

Literatur gefunden werden, welche Auswirkungen Trilostan auf die Peroxisomenzahl

von Hepatozyten hat. Es sollte jedoch bedacht werden, dass körpereigene

Glukokortikoide, wie auch exogen zugeführte Glukokortikoide, ebenfalls zu einer

Verminderung der Peroxisomen führen können. Der Patient K2006 wurde mit

Spironolacton behandelt. Aus wissenschaftlichen Untersuchungen der

Humanmedizin ist bekannt, dass dies zu einer Erhöhung der Peroxisomenzahl führt.

Aufgrund einer Hypothyreose des Patienten K 2009 wurden diesem L-Thyroxin

verabreicht. Dieser Wirkstoff führt in den Peroxisomen zu einer erhöhten

peroxisomalen ß-Oxidationskapazität bei gleichzeitiger Erhöhung der

Peroxisomenzahl mit verminderter Größe (JUST u. HARTL 1983; KERCKAERT et al.

1989).

Zusammenfassend ergeben die Untersuchungen dieser Studie keine signifikanten

Unterschiede in der Anzahl der Peroxisomen in degenerativen Veränderungen der

Leber sowie in dem Tumor angrenzenden degenerativ veränderten Gewebe. Der

Hund reagiert entgegen den Untersuchungen in der Humanmedizin nicht mit einer

Peroxisomenproliferation bei degenerativen Veränderungen oder bei oxidativem

Stress in der Leberzelle. Es konnten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der

Peroxisomengröße und des Verteilungsmusters der Peroxisomen in der Zelle

zwischen den drei Untersuchungsgruppen ermittelt werden. Dies spricht zusätzlich

für eine nicht stattgefundene Peroxisomenproliferation. Signifikant war die Anzahl der

Peroxisomen in den unterschiedlichen Altersklassen. So zeigten ältere Hunde

deutlich mehr Peroxisomen als jüngere Tiere. In einer folgenden Studie sollten neben

der quantitativen Zählung auch die peroxisomalen Enzyme bestimmt werden.

Vielleicht ist die Menge an Katalase in den Peroxisomen ausreichend, um dem

oxidativen Stress entgegenzuwirken bzw. sind die Enzyme der ß- Oxidation

ausreichend zum Abbau von angereicherten Fettsäuren. Zusätzlich sollten auch die

Mitochondrien quantitativ bestimmt werden, denn sie sind ebenfalls an der

Homöostase der Zelle und der Bekämpfung von freien Radikalen beteiligt.

142 5 Zusammenfassung

5 Zusammenfassung

Julia Schüttler (2012)

Zur Bedeutung von Peroxisomen im Metabolismus von degenerativen und

neoplastischen Lebererkrankungen beim Hund

Peroxisomen sind Zellorganellen, die besonders in Leberzellen über ihre

enzymatische Ausstattung in eine Vielzahl physiologischer Stoffwechselwege

eingebunden sind. Vor diesem Hintergrund wurden bei einem Patientenkollektiv der

Kleintierklinik des Tierärztlichen Instituts (Georg-August-Universität Göttingen), die

Auswirkungen von Lebererkrankungen auf die Integrität der hepatozellulären

Peroxisomen bei Hunden untersucht.

Für die Untersuchungen standen 19 Hunde mit Hepatopathien und zwei gesunde

Kontrolltiere zur Verfügung. Aufgrund der histologischen Bewertung erfolgte eine

Zuordnung der Tiere in eine Gruppe mit primären Leberdegenerationen (n=11) und in

eine Gruppe mit neoplastischen Veränderungen (n=8). Neben labordiagnostischen

und umfangreichen lichtmikroskopischen Auswertungen wurden umfangreiche

ultrastrukturelle Untersuchungen an Hepatozyten durchgeführt, um quantitative und

qualitative Veränderungen an den hepatozellulären Peroxisomen festzustellen. Die

dabei ermittelten Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen.

1. Bei den labordiagnostischen Werten (ALT, GLDH, ALKP, Gallensäuren)

zeigen sich im Vergleich besonders in der Gruppe der Tumorpatienten

erhöhte Leberwerte.

2. Die histologischen Leberveränderungen wurden in die drei Gruppen gering-,

mittel- und hochgradige Leberdegenerationen eingeteilt, wobei die de-

generativen Veränderungen durch vakuolisierende, hydropische und

ballonierende Muster mit und ohne Verfettung der Hepatozyten charakterisiert

waren und von verschiedenen reaktiven Prozessen begleitet wurden. Diese

Veränderungen lagen sowohl in der Gruppe der primär degenerativ

5 Zusammenfassung 143

veränderten Hepatozyten vor als auch in der Tiergruppe, die neben

degenerierten Leberzellen Tumorveränderungen aufwiesen.

3. Zu den Tumoren gehörten ein Klarzellkarzinom, ein hepatozelluläres

Karzinom, drei Fälle mit Metastasen eines Hämangiosarkoms, je eine

Metastase eines Plattenepithelkarzinoms, eines Phäochromoblastoms sowie

ein multizentrisches Lymphom. In der Umgebung der neoplastischen

Strukturen zeigten die Hepatozyten graduell unterschiedliche degenerative

Prozesse.

4. Ultrastrukturell sind die Peroxisomen des Hundes durch eine Marginalplatte

und ein zentrales Nukleoid gezeichnet. Weiterhin finden sich vereinzelt

Protrusionen. Die Peroxisomen liegen diffus einzeln im Zytoplasma (panzytär)

und im perinukleären Bereich. Fokal finden sich intrazytoplasmatische Cluster.

5. Beim Gruppenvergleich zeigt sich, dass große Peroxisomen (Durchmesser

>918 nm) besonders bei den Kontrolltieren vorhanden sind, bei denen die

Peroxisomen regelmäßig als Cluster festzustellen sind. Bei den übrigen

Merkmalen treten keine signifikanten Unterschiede auf. Auch hinsichtlich der

Peroxisomenzahl pro µm2 Hepatozytenfläche liegen keine signifikanten

Unterschiede zwischen den Gruppen vor.

6. In allen drei Gruppen können unterschiedliche Veränderungen an den

Mitochondrien der Hepatozyten festgestellt werden, die von lytischen

Prozessen über Schwellungen von Mitochondrien bis zur Bildung von so-

genannten Riesenmitochondrien mit und ohne parakristalline Einschlüsse

reichen, ohne dass statistisch signifikante Unterschiede vorliegen. Dies trifft im

Wesentlichen auch für Veränderungen wie Lipidtropfen, Myelinfiguren und

Glykogengehalte der Hepatozyten zu.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass auch bei Hunden die Peroxisomen ein

wesentlicher struktureller Bestandteil der Hepatozyten sind. Bei degenerativen

Prozessen an Hepatozyten zeigen sich unabhängig von der zugrunde liegenden

144 5 Zusammenfassung

Kausalität Veränderungen, die Ausdruck eines entsprechenden Zellmetabolismus

sein dürften. Bei der Heterogenität der dystrophischen Prozesse und der

unterschiedlichen Ausgangssituation (primäre Degeneration, Degenerationen im

Rahmen einer Neoplasie) sowie den vielseitigen Wechselwirkungen mit reaktiven

Vorgängen wie entzündlichen Zellinfiltrationen ist die Untersuchung von Biopsien mit

Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie ein weniger geeignetes Verfahren, um

anhand punktueller Ergebnisse generelle Aussagen zum Ausmaß der

Leberschädigung zu ermöglichen. Dennoch zeigen die Ergebnisse, dass die

Peroxisomen neben anderen Zellorganellen Rückschlüsse auf das Ausmaß von

hepatozellulären Zellschädigungen bei Hepatopathien des Hundes zulassen.

Möglicherweise lassen sich an den Peroxisomen durch eine stringente Selektion der

Patienten anhand festgelegter klinischer Befunde, labordiagnostischer Parameter

und histologischer Eingrenzung auf ein einheitliches Veränderungsmuster

krankheitstypische ultrastrukturelle Veränderungen nachweisen.

6 Summary 145

6 Summary

Julia Schüttler (2012)

The role of peroxisomes in the metabolism in degenerative and neoplastic

diseases of the canine liver

Peroxisomes are characterized by their content of enzymes. Especially in

hepatocytes the peroxisomes are involved in a variety of metabolic functions. The

purpose of this study was to investigate the effect of liver diseases on the integrity of

canine hepatocellular peroxisomes. The study was performed with patients from the

clinic of small animals (Veterinary institute, Georg-August-university; Göttingen).

The population of dogs included in the study consisted of 19 dogs with hepatopathies

and two healthy dogs as control animals. Dogs were grouped on the basis of results

of histologic examination of biopsy specimens. Disease groups included patients with

primary hepatocellular degeneration (n=11) and patients with neoplastic diseases

(n=8). To determine quantitative and qualitative changes of hepatocellular

peroxisomes, hematologic and biochemical blood profiles, extensive light microscopy

examinations and detailed transmission electron microscopy studies were performed.

The results can be summarized as follows.

1. In comparison to the group of patients with primary degenerative liver disease

the group of patients with neoplastic disease showed elevated serum

concentrations of ALT, GLDH, ALKP and bile acids.

2. The results of histologic examinations of liver tissue were divided into mild,

moderate and severe degenerative hepatocellular changes. Degenerative

alterations of hepatocytes were characterized as vacuolar, hydropic or

ballooning with or without steatosis of hepatocytes. Degenerative hepato-

cellular changes were associated with variable reactive processes. These

pathohistological changes were associated with patients showing primary

degenerative disease as well as with patients suffering from degenerative

hepatocellular disease and neoplasia of liver tissue.

146 5 Summary

3. The group of patients with neoplastic liver disease included one clear cell

carcinoma, a hepatocellular carcinoma, three cases with liver metastasis of a

hemangiosarcoma, metastasis of a squamous cell carcinoma and a

metastasis of a pheochromoblastoma as well as one multicentric lymphoma.

Hepatocytes next to neoplastic structures showed gradually different

degenerative processes.

4. Ultrastructurally canine hepatocellular peroxisomes contained a marginal plate

and a central nucleoid. Protrusions of peroxisomes appeared also. The

peroxisomal distribution pattern in the hepatocytes was arranged diffuse

solitary (pancytoplasmic) and perinuclear. Focal intracytoplasmatic clusters of

peroxisomes existed.

5. Comparing the groups, big peroxisomes (diameter >918nm) were especially

observed in patients of the control group. The peroxisomes were arranged

regulary in clusters. Comparison of the other characteristics revealed no

significant differences. Regarding the feature “peroxisomal number per

hepatocellular surface (µm²)” we determined no significant results among the

groups.

6. Hepatocellular mitochondria of all three groups showed alterations. Lytic

processes, swelling of mitochondria and giant mitochondria with and without

paracrystal inclusions were observed. However there was no significant

difference between the three groups. The mitochondrial aberrations, the

occurrence of lipid droplets, myelin figures and glycogen content of

hepatocytes did not differ significantly.

Results suggest that peroxisomes are common organelles in canine hepatocytes.

Alterations associated with degenerative processes occur apart from the underlying

cause and accordingly reflect cell metabolism. The examination of biopsy specimens

with transmission electron microscopy is not a very suitable method to obtain general

information about hepatocellular damage based on punctual results. An explanation

might be the variability of dystrophic processes, the quite different start points of

disease (primary degeneration, degeneration combined with neoplasia) and the

pathophysiological interactions for example characterized by inflammatory cell

6 Summary 147

infiltrates. The results in the present study reveal that peroxisomes beyond other cell

organelles are a suitable indicator for hepatocellular damage. If patients are selected

stringently based on defined clinical results, laboratory parameters and defined

histologic diagnosis referring to a uniform pattern of changes the investigator might

be able to determine disease related typical ultrastructural changes in peroxisomes.

148 7 Literaturverzeichnis

7 Literaturverzeichnis

ADDIS, T., L. POO u. W. LEW (1936): The quantities of protein lost by the various organs and tissues of the body during a fast. J Biol Chem 115, 111-118 ANGERMULLER, S., M. ISLINGER u. A. VOLKL (2009): Peroxisomes and reactive oxygen species, a lasting challenge. Histochem Cell Biol 131, 459-463 ARBER, N., G. ZAJICEK u. I. ARIEL (1988): The streaming liver. II. Hepatocyte life history. Liver 8, 80-87 BAUDHUIN, P., H. BEAUFAY u. C. DE DUVE (1965): Combined biochemical and morphological study of particulate fractions from rat liver. Analysis of preparations enriched in lysosomes or in particles containing urate oxidase, D-amino acid oxidase, and catalase. J Cell Biol 26, 219-243 BEIER, K., A. VOLKL u. H. D. FAHIMI (1992): Suppression of peroxisomal lipid beta-oxidation enzymes of TNF-alpha. FEBS Lett 310, 273-276 BEIER, K., A. VOLKL u. H. D. FAHIMI (1997): TNF-alpha downregulates the peroxisome proliferator activated receptor-alpha and the mRNAs encoding peroxisomal proteins in rat liver. FEBS Lett 412, 385-387 BERNHARD, W. u. C. ROUILLER (1956): Microbodies and the problem of mitochondrial regeneration in liver cells. J Biophys Biochem Cytol 2, 355-360 BOSGRA, S., W. MENNES u. W. SEINEN (2005): Proceedings in uncovering the mechanism behind peroxisome proliferator-induced hepatocarcinogenesis. Toxicology 206, 309-323 CAMOES, F., N. A. BONEKAMP, H. K. DELILLE u. M. SCHRADER (2009): Organelle dynamics and dysfunction: A closer link between peroxisomes and mitochondria. J Inherit Metab Dis 32, 163-180

7 Literaturverzeichnis 149

CASTEJON, O. J. u. H. D. CASTEJON (2008): Electron Microscopy of myelin figures in normal and pathological tissue. Acta Microscopia 17, 13-19 CENTER, S. A. (2007): Interpretation of liver enzymes. Vet Clin North Am Small Anim Pract 37, 297-333, vii CENTER, S. A., L. GUIDA, M. J. ZANELLI, E. DOUGHERTY, J. CUMMINGS u. J. KING (1993): Ultrastructural hepatocellular features associated with severe hepatic lipidosis in cats. Am J Vet Res 54, 724-731 CHEVILLE, N. F. (1994a): Blockade of Metabolic Pathways. In: N. F. CHEVILLE (Hrsg.): Ultrastructural Pathology- An Introduction to Interpretation 1stedition, Iowa State University Press, Ames, Iowa, Ames, S. 126-191 CHEVILLE, N. F. (1994b): Consequences of Acute cell injury: Necrosis, Recovery and Hypertrophy. In: N. F. CHEVILLE (Hrsg.): Ultrastructural Pathology- An Introduction to Interpretation 1st edition, Iowa State University Press, Ames, Iowa, Ames, S. 80-123 CHEVILLE, N. F. (1994c): Interpretation of Acute cell injury: Degeneration. In: N. F. CHEVILLE (Hrsg.): Ultrastructural Pathology- An Introduction to Interpretation 1st edition, Iowa State University Press, Ames, Iowa, Ames, S. 51-79 CHEVILLE, N. F. (1994d): Neoplasia. In: N. F. CHEVILLE (Hrsg.): Ultrastructural Pathology- An Introduction to Interpretation 1st edition, Iowa State University Press, Ames, Iowa, Ames, S. 229-273 CHEVILLE, N. F. (1994e): Normal Cell Structure: An Overview. In: N. F. CHEVILLE (Hrsg.): Ultrastructural Pathology- An Introduction to Interpretation 1st edition, Iowa State University Press, Ames, Iowa, Ames, S. 2-50 CUERVO, A. M. (2004a): Autophagy: in sickness and in health. Trends Cell Biol 14, 70-77

150 7 Literaturverzeichnis

CUERVO, A. M. (2004b): Autophagy: many paths to the same end. Mol Cell Biochem 263, 55-72 CULLEN, J. M. (2007a): Leber, Gallensystem und exokrines Pankreas. In: M. D. MC GAVIN und J. F. ZACHARY (Hrsg.): Pathologie der Haustiere Elsevier GmbH München, Urban & Fischer Verlag, München, S. 367-425 CULLEN, J. M. (2007b): Schädigung von Zellen und Geweben. In: R. K. MYERS, MC GAVIN, M.D. (Hrsg.): Pathologie der Haustiere Elsevier GmbH München, Urban & Fischer Verlag München, S. CULLEN, J. M. (2009): Summary of the World Small Animal Veterinary Association standardization committee guide to classification of liver disease in dogs and cats. Vet Clin North Am Small Anim Pract 39, 395-418 CULLEN, J. M., T. VAN DEN INGH, T. VAN WINKLE, J. CHARLES u. V. J. DESMET (2006): Morphological classification of parenchymal disorders of the canine and feline liver. In: J. ROTHUIZEN, S. E. BUNCH, J. A. CHARLES, J. M. CULLEN, V. J. DESMET, V. SZATMARI, D. TWEDT, T. VAN DEN INGH, T. VAN WINKLE und R. WASHABAN (Hrsg.): WSAVA Standards for clinical and histological Diagnosis of Canine and Feline Liver Diseases Saunders Elsevier, Philadelphia, S. 77-83 DAY, C. P. u. O. F. JAMES (1998): Steatohepatitis: a tale of two "hits"? Gastroenterology 114, 842-845 DE CRAEMER, D. (1995): Secondary alterations of human hepatocellular peroxisomes. J Inherit Metab Dis 18 Suppl 1, 181-213 DE CRAEMER, D., I. KERCKAERT u. F. ROELS (1991): Hepatocellular peroxisomes in human alcoholic and drug-induced hepatitis: a quantitative study. Hepatology 14, 811-817 DE CRAEMER, D., M. PAUWELS, M. HAUTEKEETE u. F. ROELS (1993): Alterations of hepatocellular peroxisomes in patients with cancer. Catalase cytochemistry and morphometry. Cancer 71, 3851-3858

7 Literaturverzeichnis 151

DE CRAEMER, D., M. PAUWELS u. C. VAN DEN BRANDEN (1995): Alterations of peroxisomes in steatosis of the human liver: a quantitative study. Hepatology 22, 744-752 DE CRAEMER, D., L. VAN MALDERGEM u. F. ROELS (1992): Hepatic ultrastructure in congenital total lipodystrophy with special reference to peroxisomes. Ultrastruct Pathol 16, 307-316 DE DUVE, C. u. P. BAUDHUIN (1966): Peroxisomes (microbodies and related particles). Physiol Rev 46, 323-357 DE LA IGLESIA, F. A., S. M. PINN, J. LUCAS u. E. J. MC GUIRE (1981): Quantitative stereology of peroxisomes in hepatocytes from hyperlipoproteinemic patients receiving Gemfibrozil. Micron 12, 97-98 DE NICOLA, D., S. CENTER, R. HAWTHORNE, B. POTEET, J. M. STEINER, D. TWEDT u. D. A. WILLIAMS (2005): Diagnosing Liver Disease: A roundtable discussion. IDEXXLaboratories, (http://www.idexx.co.uk/animalhealth/analysers/snapreader/lr0905final.pdf) DETER, R. L., P. BAUDHUIN u. C. DE DUVE (1967): Participation of lysosomes in cellular autophagy induced in rat liver by glucagon. J Cell Biol 35, C11-16 DIAL, S. M. (1995): Clinicopathologic evaluation of the liver. Vet Clin North Am Small Anim Pract 25, 257-273 DJORDJEVIC, V. B. (2004): Free radicals in cell biology. Int Rev Cytol 237, 57-89 FAHIMI, H. D., K. BEIER, M. LINDAUER, A. SCHAD, J. ZHAN, J. PILL, W. REBEL, A. VOLKL u. E. BAUMGART (1996): Zonal heterogeneity of peroxisome proliferation in rat liver. Ann N Y Acad Sci 804, 341-361 FAHIMI, H. D., A. REINICKE, M. SUJATTA, S. YOKOTA, M. OZEL, F. HARTIG u. K. STEGMEIER (1982): The short- and long-term effects of bezafibrate in the rat. Ann N Y Acad Sci 386, 111-135

152 7 Literaturverzeichnis

FAN, C. Y., J. PAN, N. USUDA, A. V. YELDANDI, M. S. RAO u. J. K. REDDY (1998): Steatohepatitis, spontaneous peroxisome proliferation and liver tumors in mice lacking peroxisomal fatty acyl-CoA oxidase. Implications for peroxisome proliferator-activated receptor alpha natural ligand metabolism. J Biol Chem 273, 15639-15645 FARRE, J. C. u. S. SUBRAMANI (2004): Peroxisome turnover by micropexophagy: an autophagy-related process. Trends Cell Biol 14, 515-523 FEIGE, J. N., L. GELMAN, L. MICHALIK, B. DESVERGNE u. W. WAHLI (2006): From molecular action to physiological outputs: peroxisome proliferator-activated receptors are nuclear receptors at the crossroads of key cellular functions. Prog Lipid Res 45, 120-159 GEROK, W., BLUM H.E. (1995): Hepatologie. Urban & Schwarzenberg, München, Wien GHADIALLY, F. N. u. E. W. PARRY (1966): Ultrastructure of a human hepatocellular carcinoma and surrounding non-neoplastic liver. Cancer 19, 1989-2004 GIESECKE, D., W. KRAFT u. W. TIEMEYER (1985): [Why Dalmatians excrete uric acid. Causes and consequences of a classical metabolic disorder]. Tierarztl Prax 13, 331-341 GONZALEZ, F. J., J. M. PETERS u. R. C. CATTLEY (1998): Mechanism of action of the nongenotoxic peroxisome proliferators: role of the peroxisome proliferator-activator receptor alpha. J Natl Cancer Inst 90, 1702-1709 GOULD, S. J. u. D. VALLE (2000): Peroxisome biogenesis disorders: genetics and cell biology. Trends Genet 16, 340-345 GRABENBAUER, M., K. SATZLER, E. BAUMGART u. H. D. FAHIMI (2000): Three-dimensional ultrastructural analysis of peroxisomes in HepG2 cells. Absence of peroxisomal reticulum but evidence of close spatial association with the endoplasmic reticulum. Cell Biochem Biophys 32, 37-49

7 Literaturverzeichnis 153

GUO, Y., R. A. JOLLY, B. W. HALSTEAD, T. K. BAKER, J. P. STUTZ, M. HUFFMAN, J. N. CALLEY, A. WEST, H. GAO, G. H. SEARFOSS, S. LI, A. R. IRIZARRY, H. R. QIAN, J. L. STEVENS u. T. P. RYAN (2007): Underlying mechanisms of pharmacology and toxicity of a novel PPAR agonist revealed using rodent and canine hepatocytes. Toxicol Sci 96, 294-309 HARMAN, D. (1956): Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. J Gerontol 11, 298-300 HASHIMOTO, T. (1987): Comparison of enzymes of lipid ß-oxidation in peroxisomes and mitochondria. In: H. D. FAHIMI und H. SIES (Hrsg.): Peroxisomes in Biology and Medicine Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, S. 97-104 HASHIMOTO, T. (1999): Peroxisomal beta-oxidation enzymes. Neurochem Res 24, 551-563 HASHIMOTO, T., W. S. COOK, C. QI, A. V. YELDANDI, J. K. REDDY u. M. S. RAO (2000): Defect in peroxisome proliferator-activated receptor alpha-inducible fatty acid oxidation determines the severity of hepatic steatosis in response to fasting. J Biol Chem 275, 28918-28928 HAYASHI, H. u. A. MIWA (1989): The role of peroxisomal fatty acyl-CoA beta-oxidation in bile acid biosynthesis. Arch Biochem Biophys 274, 582-589 HAYASHI, H. u. S. TAKAHATA (1991): Role of peroxisomal fatty acyl-CoA beta-oxidation in phospholipid biosynthesis. Arch Biochem Biophys 284, 326-331 HAYASHI, H., K. TAYA, T. SUGA u. S. NIINOBE (1976): Studies on peroxisomes. VI. Relationship between the peroxisomal core and urate oxidase. J Biochem 79, 1029-1034 HAYASHI, S., S. FUJIWARA u. T. NOGUCHI (2000): Evolution of urate-degrading enzymes in animal peroxisomes. Cell Biochem Biophys 32 Spring, 123-129

154 7 Literaturverzeichnis

HEAD, K. W., J. M. CULLEN, R. R. DUBILZIEG, R. W. ELSE, W. MISDORP, A. K. PATNAIK, S. TATEYAMA u. I. GAAG (2003): Histological Classification of Tumors of the Alimentary System of Domestic Animals. In: F. Y. SCHULMAN (Hrsg.): World Health Organization International Histological Classification of Tumors of Domestic animals 2.Auflage, Armed Forces Institute of Pathology, Washington, DC, Washington, S. 122-124 HESS, F. A., E. R. WEIBEL u. R. PREISIG (1973): Morphometry of dog liver: normal base-line data. Virchows Arch B Cell Pathol 12, 303-317 HOEPFNER, D., D. SCHILDKNEGT, I. BRAAKMAN, P. PHILIPPSEN u. H. F. TABAK (2005): Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell 122, 85-95 HOSKINS, J. D. (2005): Liver disease in the geriatric patient. Vet Clin North Am Small Anim Pract 35, 617-634 HRUBAN, Z. (1979): Ultrastructure of hepatocellular tumors. J Toxicol Environ Health 5, 403-433 HRUBAN, Z. u. M. RECHCIGL, JR. (1969): Microbodies and related particles. Morphology, biochemistry, and physiology. Int Rev Cytol Suppl 1:1-296 HRUBAN, Z., H. SWIFT u. A. SLESERS (1966): Ultrastructural alterations of hepatic microbodies. Lab Invest 15, 1884-1901 ISSEMANN, I. u. S. GREEN (1990): Activation of a member of the steroid hormone receptor superfamily by peroxisome proliferators. Nature 347, 645-650 JIN, S. u. E. WHITE (2007): Role of autophagy in cancer: management of metabolic stress. Autophagy 3, 28-31 JUST, W. W. u. F. U. HARTL (1983): Rat liver peroxisomes, II. Stimulation of peroxisomal fatty-acid beta-oxidation by thyroid hormones. Hoppe Seylers Z Physiol Chem 364, 1541-1547

7 Literaturverzeichnis 155

KARANTZA-WADSWORTH, V., S. PATEL, O. KRAVCHUK, G. CHEN, R. MATHEW, S. JIN u. E. WHITE (2007): Autophagy mitigates metabolic stress and genome damage in mammary tumorigenesis. Genes Dev 21, 1621-1635 KÄUFER-WEISS, I. (2007): Leber und Gallenwege. In: E. DAHME, WEISS, E. (Hrsg.): Grundriss der speziellen pathologischen Anatomie der Haustiere Verlag Enke, Stuttgart, S. 148-166 KERCKAERT, I., A. CLAEYS, W. JUST, A. CORNELIS u. F. ROELS (1989): Automated image analysis of rat liver peroxisomes after treatment with thyroid hormones: changes in number, size and catalase reaction. Micron Microsc Acta 20, 9-18 KLAUNIG, J. E., M. A. BABICH, K. P. BAETCKE, J. C. COOK, J. C. CORTON, R. M. DAVID, J. G. DELUCA, D. Y. LAI, R. H. MCKEE, J. M. PETERS, R. A. ROBERTS u. P. A. FENNER-CRISP (2003): PPARalpha agonist-induced rodent tumors: modes of action and human relevance. Crit Rev Toxicol 33, 655-780 KLAUNIG, J. E. u. L. M. KAMENDULIS (2004): The role of oxidative stress in carcinogenesis. Annu Rev Pharmacol Toxicol 44, 239-267 KOCH, A., G. SCHNEIDER, G. H. LUERS u. M. SCHRADER (2004): Peroxisome elongation and constriction but not fission can occur independently of dynamin-like protein 1. J Cell Sci 117, 3995-4006 KOCH, A., Y. YOON, N. A. BONEKAMP, M. A. MCNIVEN u. M. SCHRADER (2005): A role for Fis1 in both mitochondrial and peroxisomal fission in mammalian cells. Mol Biol Cell 16, 5077-5086 KOEPKE, J. I., C. S. WOOD, L. J. TERLECKY, P. A. WALTON u. S. R. TERLECKY (2008): Progeric effects of catalase inactivation in human cells. Toxicol Appl Pharmacol 232, 99-108 KRAFT, W. u. U. M. DÜRR (2005): 13 Leber In: W. KRAFT und U. M. DÜRR (Hrsg.): Klinische Labordiagnostik in der Tiermedizin 6.Auflage, Schattauer Verlag, Stuttgart, S. 145-167

156 7 Literaturverzeichnis

KUHN, C. (1968): Particles resembling microbodies in normal and neoplastic perianal glands of dogs. Z Zellforsch Mikrosk Anat 90, 554-562 LAGEWEG, W., J. M. TAGER u. R. J. WANDERS (1991): Topography of very-long-chain-fatty-acid-activating activity in peroxisomes from rat liver. Biochem J 276, 53-56 LAGING, C., A. POSPISCHIL u. D. GIESECKE (1988): [Peroxisomes in the liver and kidney of dogs on a purine-rich and purine-deficient diet. An ultrastructural-morphometric study]. Zentralbl Veterinarmed A 35, 285-290 LAZAROW, P. B. (1978): Rat liver peroxisomes catalyze the beta oxidation of fatty acids. J Biol Chem 253, 1522-1528 LAZAROW, P. B. (1987): The role of peroxisomes in mammalian cellular metabolism. J Inherit Metab Dis 10 Suppl 1, 11-22 LAZAROW, P. B. u. C. DE DUVE (1976): A fatty acyl-CoA oxidizing system in rat liver peroxisomes; enhancement by clofibrate, a hypolipidemic drug. Proc Natl Acad Sci USA 73, 2043-2046 LAZAROW, P. B. u. Y. FUJIKI (1985): Biogenesis of peroxisomes. Annu Rev Cell Biol 1, 489-530 LAZO, O., M. CONTRERAS u. I. SINGH (1990): Topographical localization of peroxisomal acyl-CoA ligases: differential localization of palmitoyl-CoA and lignoceroyl-CoA ligases. Biochemistry 29, 3981-3986 LEE, H. C. u. Y. H. WEI (1997): Mutation and oxidative damage of mitochondrial DNA and defective turnover of mitochondria in human aging. J Formos Med Assoc 96, 770-778 LEGAKIS, J. E., J. I. KOEPKE, C. JEDESZKO, F. BARLASKAR, L. J. TERLECKY, H. J. EDWARDS, P. A. WALTON u. S. R. TERLECKY (2002): Peroxisome senescence in human fibroblasts. Mol Biol Cell 13, 4243-4255

7 Literaturverzeichnis 157

LEMASTERS, J. J., T. QIAN, L. HE, J. S. KIM, S. P. ELMORE, W. E. CASCIO u. D. A. BRENNER (2002): Role of mitochondrial inner membrane permeabilization in necrotic cell death, apoptosis, and autophagy. Antioxid Redox Signal 4, 769-781 LEVINE, B. u. D. J. KLIONSKY (2004): Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev Cell 6, 463-477 LITTLE, K. C. u. P. CHARTRAND (2004): Genomic DNA is captured and amplified during double-strand break (DSB) repair in human cells. Oncogene 23, 4166-4172 LÖFFLER, G., P. E. PETRIDES u. P. C. HEINRICH (2007): Biochemie und Pathobiochemie. Springer Medizin Verlag, Heidelberg LUFT, J. H. (1961): Improvements in epoxy resin embedding methods. J Biophys Biochem Cytol 9, 409-414 LUIKEN, J. J., M. VAN DEN BERG, J. C. HEIKOOP u. A. J. MEIJER (1992): Autophagic degradation of peroxisomes in isolated rat hepatocytes. FEBS Lett 304, 93-97 LUQUET, S., C. GAUDEL, D. HOLST, J. LOPEZ-SORIANO, C. JEHL-PIETRI, A. FREDENRICH u. P. A. GRIMALDI (2005): Roles of PPAR delta in lipid absorption and metabolism: a new target for the treatment of type 2 diabetes. Biochim Biophys Acta 1740, 313-317 MANDELKER, L. (2008): Introduction to oxidative stress and mitochondrial dysfunction. Vet Clin North Am Small Anim Pract 38, 1-30 MANNAERTS, G. P., L. J. DEBEER, J. THOMAS u. P. J. DE SCHEPPER (1979): Mitochondrial and peroxisomal fatty acid oxidation in liver homogenates and isolated hepatocytes from control and clofibrate-treated rats. J Biol Chem 254, 4585-4595

158 7 Literaturverzeichnis

MANNAERTS, G. P., P. VAN VELDHOVEN, A. VAN BROEKHOVEN, G. VANDEBROEK u. L. J. DEBEER (1982): Evidence that peroxisomal acyl-CoA synthetase is located at the cytoplasmic side of the peroxisomal membrane. Biochem J 204, 17-23 MANNAERTS, G. P. u. P. P. VAN VELDHOVEN (1992): Role of peroxisomes in mammalian metabolism. Cell Biochem Funct 10, 141-151 MARKLUND, S. (1980): Distribution of CuZn superoxide dismutase and Mn superoxide dismutase in human tissues and extracellular fluids. Acta Physiol Scand Suppl 492, 19-23 MARKLUND, S. L. (1992): Regulation by cytokines of extracellular superoxide dismutase and other superoxide dismutase isoenzymes in fibroblasts. J Biol Chem 267, 6696-6701 MASTERS, C. J. u. D. CRANE (1995): The peroxisome: a vital organelle. Cambridge University Press, Cambridge MATHEW, R., V. KARANTZA-WADSWORTH u. E. WHITE (2007): Role of autophagy in cancer. Nat Rev Cancer 7, 961-967 MEIJER, A. J. u. P. CODOGNO (2004): Regulation and role of autophagy in mammalian cells. Int J Biochem Cell Biol 36, 2445-2462 MIZUSHIMA, N. (2005): The pleiotropic role of autophagy: from protein metabolism to bactericide. Cell Death Differ 12 Suppl 2, 1535-1541 MOCHIZUKI, Y., Z. HRUBAN, H. P. MORRIS, A. SLESERS u. E. L. VIGIL (1971): Microbodies of Morris hepatomas. Cancer Res 31, 763-773 MOODY, D. E., J. K. REDDY, B. G. LAKE, J. A. POPP u. D. H. REESE (1991): Peroxisome proliferation and nongenotoxic carcinogenesis: commentary on a symposium. Fundam Appl Toxicol 16, 233-248

7 Literaturverzeichnis 159

NELSON, D. A., T. T. TAN, A. B. RABSON, D. ANDERSON, K. DEGENHARDT u. E. WHITE (2004): Hypoxia and defective apoptosis drive genomic instability and tumorigenesis. Genes Dev 18, 2095-2107 NEUSPIEL, M., A. C. SCHAUSS, E. BRASCHI, R. ZUNINO, P. RIPPSTEIN, R. A. RACHUBINSKI, M. A. ANDRADE-NAVARRO u. H. M. MCBRIDE (2008): Cargo-selected transport from the mitochondria to peroxisomes is mediated by vesicular carriers. Curr Biol 18, 102-108 NOVIKOFF, A. B. u. S. GOLDFISCHER (1969): Visualization of peroxisomes (microbodies) and mitochondria with diaminobenzidine. J Histochem Cytochem 17, 675-680 OLIVEIRA, M. E., A. M. GOUVEIA, R. A. PINTO, C. SA-MIRANDA u. J. E. AZEVEDO (2003): The energetics of Pex5p-mediated peroxisomal protein import. J Biol Chem 278, 39483-39488 OSMUNDSEN, H., J. BREMER u. J. I. PEDERSEN (1991): Metabolic aspects of peroxisomal beta-oxidation. Biochim Biophys Acta 1085, 141-158 PETERS, J. M., C. CHEUNG u. F. J. GONZALEZ (2005): Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha and liver cancer: where do we stand? J Mol Med 83, 774-785 PFEIFER, U. (1977): Inhibition by insulin of the physiological autophagic breakdown of cell organelles. Acta Biol Med Ger 36, 1691-1694 PHILLIPS, M. J., S. POUCELL, P. VALENCIA u. J. PATTERSON (1987): The liver. An atlas and text of ultrastructural pathology. Raven Press, New York PLATTA, H. W. u. R. ERDMANN (2007): The peroxisomal protein import machinery. FEBS Lett 581, 2811-2819 POIRIER, Y., V. D. ANTONENKOV, T. GLUMOFF u. J. K. HILTUNEN (2006): Peroxisomal beta-oxidation--a metabolic pathway with multiple functions. Biochim Biophys Acta 1763, 1413-1426

160 7 Literaturverzeichnis

RAO, M. S. u. J. K. REDDY (2004): PPARalpha in the pathogenesis of fatty liver disease. Hepatology 40, 783-786 RAPPAPORT, A. M. (1980): Hepatic blood flow: morphologic aspects and physiologic regulation. Int Rev Physiol 21, 1-63 REDDY, J. K. u. G. P. MANNAERTS (1994): Peroxisomal lipid metabolism. Annu Rev Nutr 14, 343-370 REYNOLDS, E. S. (1963): The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J Cell Biol 17, 208-212 RHODIN, J. (1954): Correlation of ultrastructural organization and function in normal and experimentally changed proximal convoluted tubule cells of the mouse kidney. Thesis.Stockholm: Aktiebolaget Godvil, Karolinska Institute. ROELS, F., M. ESPEEL u. D. DE CRAEMER (1991): Liver pathology and immunocytochemistry in congenital peroxisomal diseases: a review. J Inherit Metab Dis 14, 853-875 ROELS, F., M. PAUWELS, A. CORNELIS, I. KERCKAERT, P. VAN DER SPEK, G. GOOVAERTS, J. VERSIECK u. S. GOLDFISCHER (1983): Peroxisomes (microbodies) in human liver: cytochemical and quantitative studies of 85 biopsies. J Histochem Cytochem 31, 235-237 ROTH, E. (1997): Oxygen free radicals and their clinical implications. Acta Chir Hung 36, 302-305 ROTH, L. u. D. J. MEYER (1995): Interpretation of liver biopsies. Vet Clin North Am Small Anim Pract 25, 293-303 RYOO, J. W. u. R. J. BUSCHMANN (1989): Morphometry of liver parenchyma in needle biopsy specimens from patients with alcoholic liver disease: preliminary variables for the diagnosis and prognosis of cirrhosis. Mod Pathol 2, 382-389

7 Literaturverzeichnis 161

SACKSTEDER, K. A., J. M. JONES, S. T. SOUTH, X. LI, Y. LIU u. S. J. GOULD (2000): PEX19 binds multiple peroxisomal membrane proteins, is predominantly cytoplasmic, and is required for peroxisome membrane synthesis. J Cell Biol 148, 931-944 SAKAI, Y., A. KOLLER, L. K. RANGELL, G. A. KELLER u. S. SUBRAMANI (1998): Peroxisome degradation by microautophagy in Pichia pastoris: identification of specific steps and morphological intermediates. J Cell Biol 141, 625-636 SAKAI, Y., M. OKU, I. J. VAN DER KLEI u. J. A. KIEL (2006): Pexophagy: autophagic degradation of peroxisomes. Biochim Biophys Acta 1763, 1767-1775 SCHOONJANS, K., B. STAELS u. J. AUWERX (1996): Role of the peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) in mediating the effects of fibrates and fatty acids on gene expression. J Lipid Res 37, 907-925 SCHRADER, M. (2001): Tubulo-reticular clusters of peroxisomes in living COS-7 cells: dynamic behavior and association with lipid droplets. J Histochem Cytochem 49, 1421-1429 SCHRADER, M. (2006): Shared components of mitochondrial and peroxisomal division. Biochim Biophys Acta 1763, 531-541 SCHRADER, M., J. K. BURKHARDT, E. BAUMGART, G. LUERS, H. SPRING, A. VOLKL u. H. D. FAHIMI (1996): Interaction of microtubules with peroxisomes. Tubular and spherical peroxisomes in HepG2 cells and their alterations induced by microtubule-active drugs. Eur J Cell Biol 69, 24-35 SCHRADER, M. u. H. D. FAHIMI (2004): Mammalian peroxisomes and reactive oxygen species. Histochem Cell Biol 122, 383-393 SCHRADER, M. u. H. D. FAHIMI (2006): Growth and division of peroxisomes. Int Rev Cytol 255, 237-290 SCHRADER, M. u. H. D. FAHIMI (2008): The peroxisome: still a mysterious organelle. Histochem Cell Biol 129, 421-440

162 7 Literaturverzeichnis

SCHRADER, M., K. KRIEGLSTEIN u. H. D. FAHIMI (1998a): Tubular peroxisomes in HepG2 cells: selective induction by growth factors and arachidonic acid. Eur J Cell Biol 75, 87-96 SCHRADER, M., B. E. REUBER, J. C. MORRELL, G. JIMENEZ-SANCHEZ, C. OBIE, T. A. STROH, D. VALLE, T. A. SCHROER u. S. J. GOULD (1998b): Expression of PEX11beta mediates peroxisome proliferation in the absence of extracellular stimuli. J Biol Chem 273, 29607-29614 SCHRADER, M., M. THIEMANN u. H. D. FAHIMI (2003): Peroxisomal motility and interaction with microtubules. Microsc Res Tech 61, 171-178 SCHRADER, M., R. WODOPIA u. H. D. FAHIMI (1999): Induction of tubular peroxisomes by UV irradiation and reactive oxygen species in HepG2 cells. J Histochem Cytochem 47, 1141-1148 SCHRADER, M. u. Y. YOON (2007): Mitochondria and peroxisomes: are the 'big brother' and the 'little sister' closer than assumed? Bioessays 29, 1105-1114 SEPESY, L. M., S. A. CENTER, J. F. RANDOLPH, K. L. WARNER u. H. N. ERB (2006): Vacuolar hepatopathy in dogs: 336 cases (1993-2005). J Am Vet Med Assoc 229, 246-252 SHARMA, K. D., L. A. ANDERSSON, T. M. LOEHR, J. TERNER u. H. M. GOFF (1989): Comparative spectral analysis of mammalian, fungal, and bacterial catalases. Resonance Raman evidence for iron-tyrosinate coordination. J Biol Chem 264, 12772-12779 SHNITKA, T. K. (1966): Comparative ultrastructure of hepatic microbodies in some mammals and birds in relation to species differences in uricase activity. J Ultrastruct Res 16, 598-625 SINGH, A. K., G. S. DHAUNSI, M. P. GUPTA, J. K. ORAK, K. ASAYAMA u. I. SINGH (1994): Demonstration of glutathione peroxidase in rat liver peroxisomes and its intraorganellar distribution. Arch Biochem Biophys 315, 331-338

7 Literaturverzeichnis 163

SINGH, H. u. A. POULOS (1988): Distinct long chain and very long chain fatty acyl CoA synthetases in rat liver peroxisomes and microsomes. Arch Biochem Biophys 266, 486-495 STALKER, M. u. M. HAYES (2007): Liver and Biliary System. In: M. G. MAXIE (Hrsg.): Jubb, Kennedy and Palmer´s Pathology of Domestic animals Elsevier Saunders Philadelphia PA, Philadelphia, S. 297-387 STEMPAK, J. G. u. R. T. WARD (1964): An Improved Staining Method for Electron Microscopy. J Cell Biol 22, 697-701 STOCKHAM, S. L. u. M. A. SCOTT (2008): Enzymes Liver function. In: S. L. STOCKHAM und M. A. SCOTT (Hrsg.): Fundamentals of Veterinary Clinical Pathology 2nd edition, Blackwell Publishing Professional Iowa, S. 639-706 TERLECKY, S. R., J. I. KOEPKE u. P. A. WALTON (2006): Peroxisomes and aging. Biochim Biophys Acta 1763, 1749-1754 TOLBERT, N. E. u. E. ESSNER (1981): Microbodies: peroxisomes and glyoxysomes. J Cell Biol 91, 271s-283s USUDA, N., M. K. REDDY, T. HASHIMOTO, M. S. RAO u. J. K. REDDY (1988): Tissue specificity and species differences in the distribution of urate oxidase in peroxisomes. Lab Invest 58, 100-111 VAN DER ZAND, A., I. BRAAKMAN, H. J. GEUZE u. H. F. TABAK (2006): The return of the peroxisome. J Cell Sci 119, 989-994 VEENHUIS, M., J. A. KIEL u. I. J. VAN DER KLEI (2003): Peroxisome assembly in yeast. Microsc Res Tech 61, 139-150

164 7 Literaturverzeichnis

VIEIRA, H. L. u. G. KROEMER (1999): Pathophysiology of mitochondrial cell death control. Cell Mol Life Sci 56, 971-976 WALLACE, D. C. (2001): A mitochondrial paradigm for degenerative diseases and ageing. Novartis Found Symp 235, 247-263; discussion 263-246 WANDERS, R. J. (2000): Peroxisomes, lipid metabolism, and human disease. Cell Biochem Biophys 32, 89-106 WANDERS, R. J. (2004a): Metabolic and molecular basis of peroxisomal disorders: a review. Am J Med Genet A 126A, 355-375 WANDERS, R. J. (2004b): Peroxisomes, lipid metabolism, and peroxisomal disorders. Mol Genet Metab 83, 16-27 WANDERS, R. J. u. H. R. WATERHAM (2006): Biochemistry of mammalian peroxisomes revisited. Annu Rev Biochem 75, 295-332 WEBB, C. u. D. TWEDT (2008): Oxidative stress and liver disease. Vet Clin North Am Small Anim Pract 38, 125-135, v WIEMER, E. A., T. WENZEL, T. J. DEERINCK, M. H. ELLISMAN u. S. SUBRAMANI (1997): Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J Cell Biol 136, 71-80 YAMAMOTO, K. u. H. D. FAHIMI (1987): Three-dimensional reconstruction of a peroxisomal reticulum in regenerating rat liver: evidence of interconnections between heterogeneous segments. J Cell Biol 105, 713-722 YAN, M., N. RAYAPURAM u. S. SUBRAMANI (2005): The control of peroxisome number and size during division and proliferation. Curr Opin Cell Biol 17, 376-383 YASMINEH, W. G., J. L. PARKIN, J. I. CASPERS u. A. THEOLOGIDES (1991): Tumor necrosis factor/cachectin decreases catalase activity of rat liver. Cancer Res 51, 3990-3995

7 Literaturverzeichnis 165

ZAAR, K. (1992): Structure and function of peroxisomes in the mammalian kidney. Eur J Cell Biol 59, 233-254

166 8 Abbildungsverzeichnis

8 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 2-1 Aufbau einer idealisierten tierischen Zelle (LÖFFLER et al. 2007) 15

Abbildung 2-2 Elektronenmikroskopische Darstellung eines Peroxisoms (Pfeil)

mit Marginalplatte und Nukleoid. (P596-07/K1979),

Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie,

Gerätevergr. 16.000x). 16

Abbildung 2-3 Abbau geradzahliger Fettsäuren durch β-Oxidation (LÖFFLER et

al. 2007) 26

Abbildung 2-4 Modell für die Teilung und Proliferation von Peroxisomen

(modifiziert nach PLATTA u. ERDMANN 2007) 33

Abbildung 2-5 Translokation von Proteinen zum Wachstum der Peroxisomen

(modifiziert nach PLATTA u. ERDMANN 2007) 35

Abbildung 2-6 Schematische Darstellung der funktionellen Organisation der

Leber (CULLEN 2007a) 41

Abbildung 2-7 Hydropische Degeneration von Hepatozyten im Bereich der

Zentralvene (Z=Zentralvene; Rind, Paraffinschnitt, H.E.)

(CULLEN 2007a) 43

Abbildung 2-8 Physiologische Zelle und Veränderungen bei reversibler und

irreversibler Zellschädigung (CULLEN 2007b) 44

Abbildung 3-1 Übersicht eines Hepatozyten mit Bestimmung der Fläche in µm²,

(K2011, Ultradünnschnitt, MIA, Transmissionselektronen-

mikroskopie Gerätevergr. 2500x) 67

Abbildung 3-2 ALT Laborwertveränderungen der Gruppe 1 und 2

(Gradeinteilung nach CENTER 2007) 73

Abbildung 3-3 GLDH Laborwertveränderungen der Gruppe 1 und 2

(Gradeinteilung nach CENTER 2007) 74

8 Abbildungsverzeichnis 167

Abbildung 3-4 ALKP Laborwertveränderungen der Gruppe 1 und 2

(Gradeinteilung nach CENTER 2007) 75

Abbildung 3-5 Gallensäure Laborwertveränderungen der Gruppe 1 und 2

(Gradeinteilung nach CENTER 2007) 76

Abbildung 3-6 Verteilung des Schweregrades der Degeneration in den Gruppen

1-3 78

Abbildung 3-7 Geringgradige Leberzelldegeneration mit ggr. Itozellhyperplasie

(Pfeil) und minimalen gemischtzelligen perivaskulären

Entzündungszellinfiltraten (Pfeilkopf), 81

Abbildung 3-8 Mittelgradige hydropische Degeneration der Hepatozyten

(Pfeilkopf) (P430/06, Paraffinschnitt, H.E.). 82

Abbildung 3-9 Hochgradige Degeneration der Hepatozyten. Inset zeigt eine

ausgeprägte gemischttropfige Verfettung (539/07, Paraffinschnitt,

H.E.). 83

Abbildung 3-10 Hochgradige zentrolobuläre Leberzelldegeneration vom

Pflanzenzelltyp (P31/08, Paraffinschnitt, H.E.). 84

Abbildung 3-11 Geringgradige hydropische Leberzelldegeneration mit

Hämosiderinspeicherung in Kupffer Sternzellen (schwarze Pfeile)

(P596/07, Paraffinschnitt, Berliner Blau Färbung). 85

Abbildung 3-12 Geringgradige hydropische bis vakuoläre hepatozelluläre

Degeneration mit Cholestase (schwarze Pfeile), (P45/09,

Paraffinschnitt, H.E.). 85

Abbildung 3-13 Itozellhyperplasie mit Verfettung (a), geringgradige vakuoläre

Leberzelldegeneration (A), Inset (B): Metastase eines

Plattenepithelkarzinoms in der Leber, (P67/08, Paraffinschnitt,

H.E.). 89

Abbildung 3-14 Mittelgradige hydropische Leberzelldegeneration (A),

intrazelluläre Pigmentablagerung (dünne Pfeile), minimale

168 8 Abbildungsverzeichnis

Infiltrate neutrophiler Granulozyten (dicke Pfeile); Inset (B):

Metastase eines Phäochromoblastoms (C) in der Leber,

tumorfreies Lebergewebe (D), (P992/08, Paraffinschnitt, H.E.). 90

Abbildung 3-15 Hochgradige hydropische bis ballonierende Degeneration der

Hepatozyten (A) im an den Tumor (Hämangiosarkom)

angrenzenden Lebergewebe (großes Bild); Inset: Hämangio-

sarkom, (P803/07, Paraffinschnitt, H.E.). 91

Abbildung 3-16 Geringgradige hepatozelluläre Degeneration bei

hepatozellulärem Karzinom, Hämosiderinablagerung in Kupffer

Sternzellen (schwarze Pfeile) und intrahepatozellulär (rote Pfeile)

(P467/06-1, Paraffinschnitt, Berliner Blau Färbung). 92

Abbildung 3-17 Ausgeprägte Gallengangsproliferation (dünne Pfeile),

Stauungshyperämie (A) und hochgradige hydropische

Leberzelldegeneration (Paraffinschnitt, H.E.) bei einem Tier

(P803/07) mit einem Hämangiosarkom. 93

Abbildung 3-18 Geringgradige hydropische Degeneration, (P2103/3, Paraffin-

schnitt, H.E.). 94

Abbildung 3-19 Gegenüberstellung von Semidünnschnitt und Paraffinschnitt bei

einem Fall (K1972) mit geringgradiger hydropischer Leberzell-

degeneration mit assoziierter gemischttropfiger Verfettung

(Semidünnschnitt, Methylenblau; Paraffinschnitt, H.E.). 96

Abbildung 3-20 Geringgradige hepatozelluläre Degeneration (K1968/1). Der

Semidünnschnitt zeigt inhomogene zytoplasmatische Färbungen

mit eingelagerten grünlichen Fettvakuolen in den Hepatozyten.

Daneben sieht man einen Fetttropfen (Pfeil), der im H.E. Schnitt

(Inset) als leere Vakuole erkennbar ist. Im H.E. Schnitt sind

zusätzlich Herde mit Hämosiderinablagerungen (Kreis).

(Semidünnschnitt, Methylenblau; Paraffinschnitt, H.E. Färbung). 97

8 Abbildungsverzeichnis 169

Abbildung 3-21 Mittelgradige hepatozelluläre Degeneration bei einem Hund mit

Klarzellkarzinom (K2011/20). Die im Inset sichtbare mittelgradige

hydropische Schwellung der Hepatozyten ist im Semidünnschnitt

auf eine massive Glykogenablagerung mit einzelnen feinen

Fettvakuolen zurückzuführen. (Semidünnschnitt, Methylenblau;

Paraffinschnitt, H.E. Färbung). 98

Abbildung 3-22 Ausgeprägte hepatozelluläre Degenerationserscheinungen bei

einem Tier (K2025/3) aus der Gruppe 1. Neben Fetttropfen (F)

zeigen sich Degenerationserscheinungen durch starke deutliche

Schwellung der Hepatozyten (Pfeilspitzen). Andere Hepatozyten

zeigen intrazytoplasmatische Pigmentablagerungen (dünne

Pfeile) oder sind durch unregelmäßige Glykogenablagerungen

(G) charakterisiert. In fast allen Zellen sind kleine Vakuolen zu

erkennen, bei denen es sich um geschwollene Mitochondrien

handelt (Semidünnschnitt, Methylenblau). 99

Abbildung 3-23 Kontrolltier (K2103) mit einzelnen Vakuolen in den ansonsten

regelmäßig angeordneten Hepatozyten, die ein homogen

gefärbtes Zytoplasma aufweisen (Semidünnschnitt,

Methylenblau). 100

Abbildung 3-24 Verteilung kleiner Peroxisomen in den Gruppen 1-3 106

Abbildung 3-25 Verteilung großer Peroxisomen in den Gruppen 1-3 106

Abbildung 3-26 Peroxisomales Verteilungsmuster der Gruppen 1-3 107

Abbildung 3-27 Verteilungsmuster der Peroxisomen (Pfeile) als Cluster.

Mitochondrium (M) (K2103/15, Ultradünnschnitt, Transmissions-

elektronenmikroskopie, Gerätevergr. 16.000x). 108

Abbildung 3-28 Perinukleäres Verteilungsmuster der Peroxisomen (Pfeile).

Nukleus (N), Mitochondrium (M) (K2103/12, Ultradünnschnitt,

Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 6300x). 108

170 8 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 3-29 Verteilung der Peroxisomen (Px) im Bereich von Fetttropfen (F)

und Mitochondrium (M). (K2029, Ultradünnschnitt,

Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 16.000x). 109

Abbildung 3-30 Morphologische Veränderungen der Peroxisomen der Gruppen

1-3 110

Abbildung 3-31 Protrusion (roter Pfeil) eines Peroxisoms (Px). Mitochondrium

(M), Nukleus (N) (K1965, Ultradünnschnitt, Transmissions-

elektronenmikroskopie, Gerätevergr. 12.000x). 110

Abbildung 3-32 Marginalplatten (rote Pfeile) der Peroxisomen (Px).

Mitochondrium (M), das geschwollen ist. (K2029,

Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie,

Gerätevergr. 16.000x). 111

Abbildung 3-33 Peroxisom (Px) mit Nukleoid (Nk) und Marginalplatte (Pfeil).

(K1969, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie,

Gerätevergr. 25.000x). 111

Abbildung 3-34 Eigenschaften der Mitochondrien der Gruppen 1-3 113

Abbildung 3-35 Riesenmitochondrium (RM) mit parakristallinen Einschlüssen

(Pfeile) in Nachbarschaft zu einem normal großen Mitochondrium

(M) verdeutlicht den Größenunterschied. (K1979,

Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie,

Gerätevergr. 16.000x). 113

Abbildung 3-36 Lyse eines Mitochondriums (M). (K2015, Ultradünnschnitt,

Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 12.500x). 114

Abbildung 3-37 Schwellung eines Mitochondriums (M). (K2015, Ultradünnschnitt,

Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 12.500x). 114

Abbildung 3-38 Häufigkeit des Vorkommens von Lipidtropfen in den Hepatozyten

der Untersuchungsgruppen 1-3 115

8 Abbildungsverzeichnis 171

Abbildung 3-39 Gemischttropfige Verfettung (F) eines Hepatozyten. (K1972,

Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Geräte-

vergr. links 2500x und rechts 3150x). 116

Abbildung 3-40 Häufigkeit des Auftretens von Myelinfiguren 117

Abbildung 3-41 Myelinfigur (MF) in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem

Mitochondrium (M). (K2015, Ultradünnschnitt, Transmissions-

elektronenmikroskopie, Gerätevergr. 16.000x). 117

Abbildung 3-42 Glykogengehalt der Hepatozyten der Untersuchungsgruppen 1-3 118

Abbildung 3-43 Ausgeprägte Glykogenansammlungen (rote Pfeile) neben einem

Peroxisom (Px) mit Nukleoid (N) und sichtbarer Marginalplatte

(schwarzer Pfeil). (K1972, Ultradünnschnitt, Transmissions-

elektronenmikroskopie, Gerätevergr. 16.000x). 119

Abbildung 3-44 Darstellung der Mittelwerte der Peroxisomenzahl/

Hepatozytenfläche (µm²) in den drei Untersuchungsgruppen 120

Abbildung 3-45 Mittelwerte der Peroxisomen/Hepatozytenfläche( µm²) in Bezug

zu den Altersgruppen 121

Abbildung 3-46 Mittelwerte der Peroxisomen/Hepatozytenfläche (µm²) in Bezug

zu den Gewichtsklassen 122

172 9 Tabellenverzeichnis

9 Tabellenverzeichnis

Tabelle 2-1 Unterschiede peroxisomaler und mitochondrialer β-Oxidation 27

Tabelle 2-2 Übersicht der Lebertumoren (CULLEN 2007a) 52

Tabelle 3-1 Anzahl der Patienten mit Hepatopathien, die nicht mit in die

vorliegende Studie einbezogen werden konnten 58

Tabelle 3-2 Übersicht Patienten der Gruppe 1 mit degenerativen

Lebererkrankungen (w=weiblich, wk=weiblich kastriert,

m=männlich, M.=Morbus, WHWT=Westhighland White Terrier,

JRT=Jack Russel Terrier, RHT=Rauhaarteckel) 59

Tabelle 3-3 Übersicht Patienten der Gruppe die an einem Primär- oder

Sekundärtumor erkrankten (w=weiblich, m=männlich,

JRT=Jack Russel Terrier, RHT=Rauhaarteckel) 60

Tabelle 3-4 Kontrolltiere (m=männlich, d=Tage) 61

Tabelle 3-5 Rasseverteilung der Gruppen 1-3 70

Tabelle 3-6 Altersverteilung: absolute und relative Häufigkeit der Patienten

der Gruppen 1-3 71

Tabelle 3-7 Gewichtsverteilung der Patienten der Gruppen 1-3 71

Tabelle 3-8 Geschlechtsverteilung der Hunde der Gruppen 1-3 72

Tabelle 3-9 Zusammenfassung der histopathologischen Untersuchungs-

befunde von Gruppe 1 79

Tabelle 3-10 Tumorverteilung in Gruppe 2 86

1 173

Tabelle 3-11 Histopathologische Untersuchungsbefunde der Gruppe 2 (+)

minimal, + geringgradig, 87

Tabelle 3-12 Semiquantitative Beurteilung der Morphologie der

Peroxisomen und der Hepatozyten bei Tieren ohne

Lebertumoren 102

Tabelle 3-13 Semiquantitative Beurteilung der Morphologie der

Peroxisomen und der Hepatozyten bei Lebertumoren 103

Tabelle 3-14 Semiquantitative Beurteilung der Morphologie der

Peroxisomen und der Hepatozyten bei Kontrolltieren 104

174 10 Anhang

10 Anhang

10.1 Protokolle für die Histologie

10.1.1 Fixierlösungen

10 %iges neutral gepuffertes Formalin

35 %ige Formaldehydlösung 285 ml

Aqua dest. 215 ml

Stammlösung A Phosphatpuffer (s.u.) 100 ml

Stammlösung B Phosphatpuffer (s.u.) 400 ml

2,5 %ige gepufferte Glutaraldehydlösung

25 %ige Glutaraldehydlösung 100 ml

Aqua dest. 400 ml

Lösung A Phosphatpuffer (s.u.) 100 ml

Lösung B Phosphatpuffer (s.u.) 400 ml

10.1.1.1 Phosphatpuffer

Stammlösung A (0,2 M)

Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (Fa. Merck, Darmstadt, Nr.6346)

27,6g

Aqua bidest. ad 1000 ml

Stammlösung B (0,2 M)

Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 6580)

35,6 g

Aqua bidest. ad 1000 ml

10 Anhang 175

Gebrauchslösung (0,1M, pH 7,4-7,6)

Stammlösung A 10 ml

Stammlösung B 40 ml

Aqua bidest. 50 ml

10.1.1.2 Epongemisch nach LUFT (1961)

Mischung A:

Glycidether 100

(Fa. Serva, Heidelberg, BRD, Nr.21045) 71,3 g

DDSA (2-Dodecenylsuccinic acid anhydrid)

(Fa. Serva, Heidelberg, BRD, Nr.20755) 115,0g

auf einem Magnetrührer 1 h rühren

Mischung B:

Glycidether 100

(Fa. Serva, Heidelberg, BRD, Nr.21045) 100,0 g

MNA (Methylnadic anhydride)

(Fa. Serva, Heidelberg, BRD, Nr.29452) 89,0 g

auf einem Magnetrührer 1 h rühren

Mischung A und B im Verhältnis 1:1 mischen und 30 min rühren

1,8 % Beschleuniger 2,4,6-Tris-dimethylaminomethylphenol

(Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 36975)

tropfenweise dazugeben und 15 min rühren

176 10 Anhang

10.1.2 Färbungen

10.1.2.1 Hämalaun & Eosin Färbung

Entparaffinisierung und Rehydratisierung:

Xylol: 5 min

Xylol: 2 min

Xylol: 2 min

100 %iger Alkohol: 2 min

96 %iger Alkohol: 2 min

80 %iger Alkohol: 1 min

70 %iger Alkohol: 1 min

Aqua dest. 1 min

Zur Kernfärbung: Hämalaun nach Mayer (Fa. Merck, Darmstadt) für 3 min

Zum Bläuen 10 min fließend wässern

Zur Gegenfärbung: wässriges Eosin (Fa. Thermo Fisher Scientific, Dreieich)

für 5 min

Fließend wässern für 5 s

Entwässerung in der aufsteigenden Alkoholreihe:

70 %iger Alkohol: 1 min

80 %iger Alkohol: 1 min

96 %iger Alkohol: 1 min

100 %iger Alkohol: 1 min

100 %iger Alkohol: 2 min

Xylol: 1 min

Xylol: 3 min

Xylol: 3 min

Eindecken mit Eukitt (Fa. Kindler, Freiburg)

10 Anhang 177

10.1.2.2 Berliner Blau Reaktion (Eisennachweis nach Perls)

Entparaffinisierung und Rehydratisierung:

Xylol: 5 min

Xylol: 2 min

Xylol: 2 min

100 %iger Alkohol: 2 min

96 %iger Alkohol: 2 min

80 %iger Alkohol: 1 min

70 %iger Alkohol: 1 min

Aqua dest.: 1 min

Kaliumferrozyanid 10 %ig: 5 min

1:1 HCl 20 %ig und Kaliumferrozyanid 20 %ig: 30 min

3 x in Aqua dest. spülen

Kernechtrot (Darstellung der Kerne): 5 min

3 x in Aqua dest. spülen

Entwässerung in der aufsteigenden Alkoholreihe:

70 %iger Alkohol: 1 min

80 %iger Alkohol: 1 min

96 %iger Alkohol: 1 min

100 %iger Alkohol: 1 min

100 %iger Alkohol: 2 min

Xylol: 1 min

Xylol: 3 min

Xylol: 3 min

Eindecken mit Eukitt (Fa. Kindler, Freiburg)

178 10 Anhang

10.1.2.3 Periodic-Acid-Schiff-Reaktion (PAS)

Entparaffinisierung und Rehydratisierung:

Xylol: 5 min

Xylol: 2 min

Xylol: 2 min

100 %iger Alkohol: 2 min

96 %iger Alkohol: 2 min

80 %iger Alkohol: 1 min

70 %iger Alkohol: 1 min

Aqua dest.: 1 min

0,5 % Perjodsäure 10 min

Aqua dest. fließend 10 min

Schiff´s Reagenz (Fa. Merck, Darmstadt): 15 min

Leitungswasser fließend: 10 min

Gegenfärbung mit Hämalaun nach Mayer: 30 s

Bläuen in Leitungswasser: 10 min

Entwässerung in der aufsteigenden Alkoholreihe:

70 %iger Alkohol: 1 min

80 %iger Alkohol: 1 min

96 %iger Alkohol: 1 min

100 %iger Alkohol: 1 min

100 %iger Alkohol: 2 min

Xylol: 1 min

Xylol: 3 min

Xylol: 3 min

Eindecken mit Eukitt (Fa. Kindler, Freiburg)

10 Anhang 179

10.1.2.4 Methylenblaufärbung nach RICHARDSON (1960)

Lösung A:

Azur II für die Lichtmikroskopie (Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 9211)

1,0 g

Aqua dest. ad 100 ml

Lösung B:

di-Natriumtetraborat p.a. (Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 6306)

1,0 g

Aqua dest. ad 100 ml

Methylenblau für die Lichtmikroskopie (Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 15943)

1,0 g darin lösen

Lösungen A und B im Verhältnis 1:1 mischen und filtrieren

Schnitte auf der Wärmebank (60°C) 1 min mit dieser Mischung färben

180 10 Anhang

10.1.2.5 Doppelkontrastierung mit Uranylacetat und Bleicitrat nach

Reynolds

1 Tropfen des 5 %igen Uranylacetates in eine mit Paraplast gefüllte Petri-

schale pipettieren

Kupferobjektträgernetz für 30 min. in diesen Tropfen legen

Kupferobjektträgernetz gründlich in Aqua dest. abspülen

von der gebrauchsfertigen, zentrifugierten Lösung 1 Tropfen in eine mit

Paraplast ausgegossene Petrischale

Kupferobjektträgernetz für 7 Minuten in diesen Tropfen legen

Petrischale verschließen

nach dem Kontrastieren gründlich mit Aqua bidest. spülen

Grids trocknen lassen

Ansetzen des Bleicitrates :

Bleinitrat (Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 7398)

1,33 g

Natriumcitrat (Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 6448)

1,67 g

Aqua dest. ad 30 ml

Reagenzien stark schütteln

nach 30 min erfolgt Umwandlung von Bleinitrat zu Bleicitrat

8 ml 1N NaOH (carbonatfrei) zusetzen

auf 50 ml Aqua dest. auffüllen und schwenken

Nach Auflösen des Bleicitrates ist die Lösung fertig (pH 12)

Uranylacetatlösung

5 %ige wässrige Uranylacetat-Lösung (Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 8473

lichtgeschützt aufbewahren!)- vorher zentrifugieren

10 Anhang 181

10.1.3 Laborprotokolle für Einbettungen

Paraffineinbettung- Excelsior ES Protokoll

Wasser (entmineralisiert) für 2 h bei Zimmertemperatur

aufsteigende Alkoholreihe (50 %ig-70 %ig-80 %ig-96 %ig-100 %ig-100 %ig)

für jeweils 45 min bei 35°C und Vakuum

2x Isopropanol für je1 h bei Zimmertemperatur und Vakuum

3x Paraffin für jeweils 1,0 h bei 60°C und Vakuum

Eponeinbettung nach Luft (1961)

1. Spülen in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) 1,4 h/4°C

(3x wechseln)

2. Nachfixieren in 1 %iger Osmiumtetroxidlösung

0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4-7,6) 2,0 h/4°C

3. Spülen in 0,1 M Phophatpuffer (pH 7,4) 1,5 h/4°C

(3x wechseln)

4. Dehydrieren in einer aufsteigenden Ethanolreihe

30 %iger Alkohol 30 min/4°C

50 %iger Alkohol 30 min/4°C

70 %iger Alkohol 30 min/4°C

96 %iger Alkohol 30 min/4°C

100 %iger Alkohol 30 min/4°C

100 %iger Alkohol 30 min/4°C

Isopropanol 30 min/4°C

5. Infiltration mit Propylenoxid 30 min/4°C

(2x wechseln)

6. Infiltration mit Propylenoxid-Epon 2:1 1,0 h/10°C

7. Infiltration mit Propylenoxid-Epon 1:1 2,0 h/10°C

8. Infiltration mit Propylenoxid-Epon 1:2 4,0 h/10°C

9. Infiltration mit reinem Epon über Nacht/20°C

10. Infiltration mit reinem Epon 3,0h/20°C

182 10 Anhang

10.2 Anhangstabellen

Anhangstabelle 10-1 Klinische Chemie der Patienten mit einer hepatozelulären Degeneration (Gruppe 1) mit klinikeigenen Referenzwerten

Parameter Ref.wert

K-Nummer

2029 1972 1979 2015 2017 1963 2062 2063 1969 1974 2025

Glukose (mg/dl) 70-120 81 95 135

sie

he A

nhangsta

belle

10-4

86 94 107 112 124 96

sie

he A

nhangsta

belle

10-6

Fructosamin(µmol/l) 0-370 283 187 108 60 90 199 323 88 42

Gallensäure(µmol/l) 0-20 3 17 22 6 12 53 2 13 3

GLDH (U/l) 0-6 39 28 >73 4 >73 38 21 6 2

ALT (U/l) 0-55 260 237 363 36 417 307 79 88 30

AST (U/l) 0-30 398 47 42 47 72 73 37 21 19

T-Bil (mg/dl) 0-0,4 0,15 0,2 * 0,1 0,4 0,2 0,2 0,3 0,2

AP (U/l) 0-150 380 >800 >800 102 270 385 93 743 800

Ges.-Eiweiß (g/dl) 5,4-7,5 6,2 8,0 8,0 5,9 8,1 6,0 5,8 6,6 5,5

Albumin (g/dl) 2,5-4,4 2,7 3,4 4,3 2,8 4,0 2,6 3,1 3,2 2,4

Globulin (g/dl) 2,51-4,51

3,4 4,6 3,7 3,1 4,1 3,4 2,6 3,4 3,1

Kreatinin (mg/dl) 0,4-1,4 1,2 0,84 0,94 0,8 0,6 0,9 0,8 0,8 0,9

Harnstoff (mg/dl) 20-50 70 20 29 28 23 35 25 17 25

Calcium (mmol/l) 2,3-3,0 2,8 2,7 2,9 2,2 2,5 3,0 2,7 2,7 2,2

Phosphor (mmol/l) 0,7-1,6 1,7 1,0 1,3 1,5 1,7 0,9 1,2 1,1 1,2

α- Amylase (U/l) 0-1650 1285 355 661 1200 571 532 577 435 430

Cholesterin (mg/dl) 120-390 258 590 253 152 281 245 308 288 371

Lipase (U/l) 0-300 161 26 57 109 14 77 71 22 19

Kreatininkinase (U/l) 0-90 641 93 96 139 172 104 179 100 61

Natrium (mmol/l) 140-155 145 * * * * 148 144 * *

Kalium (mmol/l) 3,5-5,1 4,9 * * * * 5,2 4,4 * *

CRP (mg/l) 0-15 7 * * * * 3 4 * *

PT (sec.) 12-17 14 12 16 * 12 12 * * 14

PTT (sec.) 71-102 80 70 97 * 70 ** * * 83

* nicht gemessen ** nicht messbar (out of range)

10.2 Anhangstabellen 183

Anhangstabelle 10-2 Klinische Chemie der Patienten mit einem primären oder sekundären Tumor der Leber (Gruppe 2) mit klinikeigenen Referenzwerten

Parameter Ref.wert

K-Nummer

1965 2006 2009 1968 2030 2027 2011 2021

Glukose (mg/dl) 70-120 v * 84 117 91 95

sie

he A

nhangsta

belle

10-4

I

Fructosamin(µmol/l) 0-370 e * 156 52 347 315 D

Gallensäure(µmol/l) 0-20 t * 9 26 7 986 E

GLDH (U/l) 0-6 t * 69 73 5 sie

he

Anhangsta

belle

10-4

X

ALT (U/l) 0-55 e * 317 399 56 X

AST (U/l) 0-30 s * 169 71 80

T-Bil (mg/dl) 0-0,4 t * 0,2 0,4 0,3

AP (U/l) 0-150 * 261 236 33

Ges.-Eiweiß (g/dl) 5,4-7,5 * 6,8 6,0 7,0 6,3

Albumin (g/dl) 2,5-4,4 * 3,5 2,5 2,9 3,4

Globulin (g/dl) 2,51-4,51

* 3,3 3,5 2,9

Kreatinin (mg/dl) 0,4-1,4 * 1,4 1,0 1,2 1,2

Harnstoff (mg/dl) 20-50 * 84 31 28 33

Calcium (mmol/l) 2,3-3,0 * 2,4 2,4 3,6 2,8

Phosphor (mmol/l) 0,7-1,6 * 1,0 1,5 1,0 1,2

α- Amylase (U/l) 0-1650 * 367 735 805 708

Cholesterin (mg/dl) 120-390 * 285 250 246 769

Lipase (U/l) 0-300 * 22 36 60 294

Kreatininkinase (U/l) 0-90 * 73 315 65 328

Natrium * * * 148 144

Kalium * * * 4,17 3,8

CRP * * * 11 10

PT (sec.) 12-17 * 14 * * 43 12 *

PTT (sec.) 71-102 * 74 * * 114 87 *

* nicht gemessen ** nicht messbar (out of range)

184 10 Anhang

Anhangstabelle 10-3 Differentialblutbilder der Patienten Gruppe 1 und Gruppe 2

K-Nr.

Leuk.

(K/µl)

Erythr.

(M/µl)

Neutr.

(%)

Lymph.

. (%)

Mono.

(%)

Eos.

(%)

Baso.

(%)

Hb

(g/dl)

HKT

(%)

MCV

(fL)

MCH

(pg)

MCHC

(g/dl)

PLT

(K/µl)

Gru

pp

e 1

2029 24 6,8 87 5 7 0 1 15 43 64 22 35 365

1972 8,0 8,3 74 15 5 5 1 18 62 75 22 30 556

1979 12 9,3 74 18 7 1 1 20 60 64 21 33 436

2015 siehe Anhangstabelle 10-5

2017 26 4,7 91 6 3 0 0 11 33 69 24 34 136

1963 12 7,5 81 13 5 0 1 18 54 72 24 34 16

2062 16 5,4 94 5 1 0 0 12 34 64 22 34 391

2063 14 7,0 76 10 12 0 2 16 47 67 23 34 1079

1969 8 7,0 71 19 8 1 1 18 54 74 24 32 536

1974 10 7,5 78 6 15 0 1 17 51 68 22 32 796

2025 107 2,7 98 1 1 0 0 6 19 72 23 32 553

Gru

pp

e 2

1965 siehe Anhangstabelle 10-8

2006 * * * * * * * * * * * * *

2009 6 6,4 51 47 0 1 1 14 42 65 22 34 128

1968 29 6,1 74 6 15 0 4 14 38 63 22 35 549

2030 5 7,0 71 12 14 2 1 15 44 65 22 34 330

2027 14 8,0 92 7 1 0 0 19 58 70 22 32 270

2011 siehe Anhangstabelle 10-5

2021 15 6,0 89 6 1 4 0 13 41 68 22 32 381

Ref.-Wert 6-12

5,5-

8,5

55-

75 13-33 0-5 0-4 0-1

15-

19

44-

52

60-

77

17-

23 31-34 200-400

* nicht gemessen ** nicht messbar (out of range)

10.2 Anhangstabellen 185

Anhangstabelle 10-4 Klinische Chemie Patienden der Gruppen 1 und 2 (Laboklin)

* nicht gemessen ** nicht messbar (out of range)

Parameter Ref.Wert

Gruppe 1 Gruppe 2

2015 2027 2011

Fructosamin (µmol/l) 0-374 218 * 329

GLDH (U/l) 0-6 9 263 53

GGT (U/l) 0-5 9 * 5,8

ALT (U/l) 0-55 54 1268 1071

AST (U/l) 0-25 8 182 32

T-Bil (µmol/l) 0-3,4 1,5 39 1,2

AP (U/l) 0-108 115 4787 109

Ges.-Eiweiß (g/l) 54-75 63 * 73

Albumin (g/l) 25-44 39 * 40

Globulin (g/l) 25-45 24 * 33

Kreatinin (µmol/l) 35-106 52 * 71

Harnstoff (mmol/l) 3,3-8,3 3,8 * 3,9

Calcium (mmol/l) 2,3-3,0 2,7 * 2,7

Phosphor (mmol/l) 0,7-1,6 1,4 * 1,7

α- Amylase (U/l) 0-1650 1016 * 965

Cholesterin (mmol/l) 3,1-10,1 5,2 * 7,3

Lipase (U/l) 0-300 593 * 45

Kreatininkinase (U/l) 0-90 68 * 34

Natrium (mmol/l) 140-155 147 * 146

Kalium (mmol/l) 3,5-5,1 4,4 * 4,5

CRP (mg/l) 0-15 * * *

PT (sec.) 12-17 13 43 12

PTT (sec.) 71-102 69 114 87

186 10 Anhang

Anhangstabelle 10-5 Differentialblutbilder der Patienten Gruppe 1 und Gruppe 2 (Laboklin)

K-Nr.

Leuko.

(G/l)

Erythr.

(T/l)

Neutr.

(%)

Lymph

. (%)

Mono.

(%)

Eos.

(%)

Baso.

(%)

Hb

(g/l)

HKT

(l/l)

PLT

(G/l)

Gru

pp

e 1

2015 7,4 8,0 71 18 7 4 0 186 0,57 440

Gru

pp

e 2

2011 9,7 7,5 69 25 6 0 0 190 0,48 315

Ref.-Wert 6-12 5,5-8,5 55-75 13-30 0-4 0-6 0-1

150-

190

0,44-

0,52

150-

500

Anhangstabelle 10-6 Klinische Chemie (Synlab) Gruppe 1

Parameter Ref.Wert

Gruppe 1

2025

GLDH (U/l) 0-9,6 4,9

ALT (U/l) 0-80 17

AST (U/l) 0-76 35

T-Bil (µmol/l) 0-8,55 3,42

AP (U/l) <141 20

Ges.-Eiweiß (g/l) 55-75 54

Albumin (g/l) 28-46 24,0

Kreatinin (µmol/l) <141 99,9

Harnstoff (mmol/l) 3,3-8,3 12,8

Calcium (mmol/l) 2,0-3,0 2,2

Phosphor (mmol/l) 0,68-1,74 1,14

Cholesterin (mmol/l) 3,49-6,99 3,44

Natrium (mmol/l) 140-155 153

Kalium (mmol/l) 3,5-5,1 3,9

Glukose (mmol/l) 3,05-5,55 5,27

Eisen (µmol/l) 11,3-34,0 20,4

10.2 Anhangstabellen 187

Anhangstabelle 10-7 Klinische Chemie Vettest Gruppe 2

Anhangstabelle 10-8 Hämatologie (Gruppe 2) Vet Abc

K-Nr.

WBC

(10³/µl)

Erythr.

(10 6 /µl)

Neutr.

(%)

Lymph.

(%)

Mono.

(%)

Hb

(gdl)

HKT

(%)

PLT

(10³/ µl)

Gru

pp

e 2

1965 13,3 3,2 88 7 5 7,04 21 49

Ref.-

Wert 6-12 5,5-8,5 0-100 0-100 0-100 15-20

44,0-

57,0 150-500

Parameter Ref.Wert

Gruppe 2

1965 2021

ALT (U/l) 10-100 59 776

AST (U/l) 0-50 55 *

AP (U/l) 23-212 - 2000

Urea (mmol/l) 2,5-9,6 17,1 -

Kreatinin (µmol/l) 44-159 241 -

Kreatinin (mg/dl) 0,5-1,8 - 0,6

Glukose (mmol/l) 3,89-7,94 6,59 -

Glukose (mg/dl) 70-143 - 74

T-Bil (µmol/l) 0-15 2 -

- T-Bil (mg/dl) 0,0-0,9 - 5,0

BUN (mg/dl) 7-27 - 13

Albumin ( g/dl) 2,2-3,9 - 2,8

Total Protein (g/dl) 5,2-8,2 - 6,3

Globulin ( g/dl) 2,5-4,5 - 3,4

Amylase ( U/l) 500-1000 - 827

Cholesterin (mg/dl) 110-320 - 261

Calcium (mg/dl) 7,9-12,0 - 10,5

Phosphor (mg/dl) 2,5-6,8 - 2,6

188 10 Anhang

Anhangstabelle 10-9 Auswertungsbogen der elektronenmikroskopischen Untersuchung

Elmi

K-Nummer

Schnittqualität

Fotos

Morphologie Peroxisomen

PX Zahl

PX Größe

Verteilung innerhalb der Zelle

Invagination

Protrusion

Nukleoid in PX

Marginalplatte

Besonderheiten

Mitochondrien

Endoplasmat. Retikulum

Glykogen

Nukleus

Lysosomen

Cytoplasma

Endothel

Mikrovilli

Anzahl Px pro Hepatozyt

Anzahl Px und Fläche des

Hepatozyten

Hep A Px

Fläche µm² Hep B Px

Fläche µm²

Hep C Px

Fläche µm² Hep D Px

Fläche µm²

Hep E Px

Fläche µm² Hep F Px

Fläche µm²

Px/Fläche (Zytosol)

10.2

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189

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190 10 Anhang

Anhangstabelle 10-11 Ergebnisse der Peroxisomenzählung pro Hepatozyt mit Mittelwert

Tier K Nummer Gruppe Hep1 Px/µm²Hep2 Px/µm²Hep3 Px/µm²Hep4 Px/µm²Hep5 Px/µm²Hep6 Px/µm²Mittelwerte

1 2029 kein Tumor 0,08 0,05 0,08 0,09 0,07 0,12 0,08

2 1972 kein Tumor 0,16 0,14 0,17 0,19 0,10 0,14 0,15

3 1979 kein Tumor 0,09 0,18 0,15 0,17 0,19 0,14 0,15

4 2015 kein Tumor 0,07 0,12 0,11 0,07 0,08 0,16 0,10

5 2017 kein Tumor 0,11 0,13 0,14 0,15 0,13 0,14 0,13

6 1963 kein Tumor 0,18 0,16 0,17 0,17 0,13 0,12 0,16

7 2062 kein Tumor 0,12 0,15 0,15 0,09 0,11 0,10 0,12

8 2063 kein Tumor 0,13 0,24 0,15 0,16 0,15 0,11 0,16

9 1969 kein Tumor 0,11 0,19 0,19 0,12 0,12 0,14 0,15

10 1974 kein Tumor 0,05 0,07 0,07 0,09 0,11 0,09 0,08

11 2025 kein Tumor 0,09 0,08 0,08 0,09 0,11 0,12 0,10

12 1965 Tumor 0,07 0,06 0,10 0,09 0,07 0,10 0,08

13 2006 Tumor 0,07 0,07 0,04 0,04 0,04 0,08 0,06

14 2009 Tumor 0,09 0,08 0,11 0,06 0,09 0,10 0,09

15 1968 Tumor 0,11 0,08 0,18 0,09 0,08 0,10 0,11

16 2030 Tumor 0,08 0,05 0,07 0,08 0,09 0,09 0,08

17 2027 Tumor 0,17 0,13 0,11 0,10 0,08 0,10 0,11

18 2011 Tumor 0,05 0,02 0,06 0,02 0,06 0,05 0,04

19 2021 Tumor 0,17 0,16 0,15 0,21 0,27 0,18 0,19

20 2104-7 Kontrolle 0,04 0,12 0,06 0,04 0,06 0,05 0,06

21 2104-8 Kontrolle 0,08 0,10 0,09 0,06 0,06 0,08 0,08

22 2104-9 Kontrolle 0,10 0,13 0,09 0,09 0,12 0,13 0,11

23 2103-3 Kontrolle 0,11 0,11 0,12 0,11 0,16 0,14 0,12

24 2103-12 Kontrolle 0,11 0,22 0,11 0,20 0,19 0,07 0,15

25 2103-15 Kontrolle 0,08 0,07 0,05 0,10 0,06 0,04 0,07

10.2 Anhangstabellen 191

Anhangstabelle 10-12 Stammdaten der statistischen Untersuchung (Mittelwert der Peroxisomen/µm², Alter, Gewichtsklasse)

K Nummer Gruppe Hep1 Px/µm²Hep2 Px/µm²Hep3 Px/µm²Hep4 Px/µm²Hep5 Px/µm²Hep6 Px/µm²Mittelwerte Alter in Jahren Gewichtsklasse

2029 kein Tumor 0,08 0,05 0,08 0,09 0,07 0,12 0,08 11-15 10-20 kg

1972 kein Tumor 0,16 0,14 0,17 0,19 0,10 0,14 0,15 6-10 0-10 kg

1979 kein Tumor 0,09 0,18 0,15 0,17 0,19 0,14 0,15 11-15 20-40 kg

2015 kein Tumor 0,07 0,12 0,11 0,07 0,08 0,16 0,10 11-15 20-40 kg

2017 kein Tumor 0,11 0,13 0,14 0,15 0,13 0,14 0,13 6-10 10-20 kg

1963 kein Tumor 0,18 0,16 0,17 0,17 0,13 0,12 0,16 6-10 10-20 kg

2062 kein Tumor 0,12 0,15 0,15 0,09 0,11 0,10 0,12 11-15 0-10 kg

2063 kein Tumor 0,13 0,24 0,15 0,16 0,15 0,11 0,16 11-15 0-10 kg

1969 kein Tumor 0,11 0,19 0,19 0,12 0,12 0,14 0,15 11-15 0-10 kg

1974 kein Tumor 0,05 0,07 0,07 0,09 0,11 0,09 0,08 11-15 20-40 kg

2025 kein Tumor 0,09 0,08 0,08 0,09 0,11 0,12 0,10 6-10 0-10 kg

1965 Tumor 0,07 0,06 0,10 0,09 0,07 0,10 0,08 11-15 20-40 kg

2006 Tumor 0,07 0,07 0,04 0,04 0,04 0,08 0,06 6-10 20-40 kg

2009 Tumor 0,09 0,08 0,11 0,06 0,09 0,10 0,09 6-10 20-40 kg

1968 Tumor 0,11 0,08 0,18 0,09 0,08 0,10 0,11 11-15 10-20 kg

2030 Tumor 0,08 0,05 0,07 0,08 0,09 0,09 0,08 6-10 20-40 kg

2027 Tumor 0,17 0,13 0,11 0,10 0,08 0,10 0,11 11-15 0-10 kg

2011 Tumor 0,05 0,02 0,06 0,02 0,06 0,05 0,04 6-10 10-20 kg

2021 Tumor 0,17 0,16 0,15 0,21 0,27 0,18 0,19 11-15 0-10 kg

2104-7 Kontrolle 0,04 0,12 0,06 0,04 0,06 0,05 0,06 1-5 10-20 kg

2104-8 Kontrolle 0,08 0,10 0,09 0,06 0,06 0,08 0,08 1-5 10-20 kg

2104-9 Kontrolle 0,10 0,13 0,09 0,09 0,12 0,13 0,11 1-5 10-20 kg

2103-3 Kontrolle 0,11 0,11 0,12 0,11 0,16 0,14 0,12 1-5 10-20 kg

2103-12 Kontrolle 0,11 0,22 0,11 0,20 0,19 0,07 0,15 1-5 10-20 kg

2103-15 Kontrolle 0,08 0,07 0,05 0,10 0,06 0,04 0,07 1-5 10-20 kg

192 Danksagung

Danksagung

An erster Stelle danke ich meinem Doktorvater, Herrn Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup, für

die Überlassung des Dissertationsthemas, die uneingeschränkte Unterstützung des

Vorhabens, in Form von Diskussionen, fachlichem Rat und freundlichen Zuspruch.

Ich danke für die Begeisterung für die Pathologie, insbesondere für die

Elektronenmikroskopie, die ich, als Klinikerin, stets durch ihn erfahren habe.

Ich bedanke mich sehr herzlich bei Herrn Prof. Dr. Stephan Neumann für die

Hilfestellung bei der Umsetzung dieser Dissertation, sowohl in fachlichen Fragen und

wissenschaftlichen Diskussionen als auch für die freundschaftliche Unterstützung.

Danke an Frau Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein für die Bereitschaft, das

Zweitgutachten zu erstellen.

Darüberhinaus danke ich den Mitarbeitern der Abteilung Medizinische Statistik der

Universität Göttingen, insbesondere Frau Dr. Katharina Lange, Herrn Simon

Schneider und Herrn Thomas Asendorf, für die statistische Auswertung meiner

Daten.

Ich danke allen Mitarbeitern der Kleintierklinik des Tierärztlichen Institutes bei der

Durchführung und Umsetzung dieses Vorhabens. Insbesondere danke ich Uta,

Wendy und Sonja für Ihren Zuspruch, ihre Hilfsbereitschaft und Freundschaft. Ganz

besonders möchte ich Almuth für ihre Ideen und die Unterstützung im Hinblick auf

die Dissertation danken, insbesondere für die Freundschaft, die Diskussionen und

wertvollen Gespräche in allen Lebenslagen über all die Jahre. Danke.

Danksagung 193

Die Abteilung Infektionspathologie des Deutschen Primatenzentrums mit all ihren

Mitarbeitern hat mich immer herzlich aufgenommen - ich danke Euch. Ich danke Dr.

Martina Zöller für die wertvollen Hinweise zur Lichtmikroskopie und der

fotografischen Erfasssung der histologischen Befunde. Frau PD Dr. Martina

Schlumbohm für Ratschläge und Ideen hinsichtlich der Statistik dieser Arbeit und

Frau Stephanie Heiduck für die Hilfe bei der Beschaffung sehr ausgefallener

Literaturquellen. Besonders möchte ich Frau Nadine Schminke meinen Dank

aussprechen, die mit fachkundigem Rat und großem Engagement an der Umsetzung

dieses Projektes beteiligt war. Ebenso geht ein großes Dankeschön an Frau Kaiser-

Jarry für ihre Hilfe bei der Umsetzung der Arbeit. Ich werde sie in wertvoller

Erinnerung behalten. Ebenfalls danke ich sehr herzlich Anne Gereke für die

abschließende sorgfältige Durchsicht der Dissertation.

Ganz besonders danke ich Frau Dr. Eva Gruber-Dujardin für die überaus

sorgfältigen, wertvollen und kritischen Korrekturen meiner Dissertation. Ich danke für

die zahlreichen Ratschläge und fachlichen Diskussionen, die von unschätzbarem

Wert für das Gelingen dieser Arbeit waren. Danke, Eva.

Ich empfinde große Dankbarkeit gegenüber meiner Familie. Dieses Projekt nahm viel

Zeit in Anspruch, die ich nicht mit der Familie verbringen konnte. Ich danke Euch für

euren Rückhalt, das stetige Verständnis und die Liebe.

Mein größter Dank geht an meine Eltern Karl-Heinz und Reinhild, die mir über all die

Jahre, die Zeit des Veterinärstudiums inbegriffen, Rückhalt, Hilfe zu jeder Zeit, ein

geborgenes Zuhause, ein offenes Ohr und letztlich auch finanzielle Unterstützung

gegeben haben. Danke.

194 Danksagung

Zum Abschluss möchte ich Raimund für sein unendliches Vertrauen, seine

Zuversicht und seine unermessliche Geduld danken. Ich bin sehr glücklich, dass Du

mich in dieser Zeit begleitet hast.

Göttingen, den 27.Februar 2012

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel „Zur Bedeutung von

Peroxisomen im Metabolismus von degenerativen und neoplastischen

Lebererkrankungen beim Hund“ selbstständig verfasst habe. Bei der Anfertigung

wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:

Abteilung Medizinische Statistik der Universität Göttingen

Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten

(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat

von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die

im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.

Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt:

Deutsches Primatenzentrum, Abt. Infektionspathologie; Göttingen

Kleintierklinik, Tierärztliches Institut, Georg-August-Universität; Göttingen

Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen

ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.

Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig

und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.

Julia Schüttler