Aus dam Roberb Koch-Institut fiir Hygiene und Infektionskrankheiten, Berlin.

Beeinflut)t die Hyaluronidase die Infektiosit~tt des Grippevirus ?

Von Georg Henneberg und Annelies Ortmann.

In Fortsetzung der Versuche, Gritoloevirus anzuziiehten (G. Henna- berg und L. Gri~tzner), erlorobten wit die M6gliehkeit, Hyaluronidase, die ups als , ,Iiinetin" (H. Gibian) yon der Firm~ Sehering A. G., Berlin W., freundlicherweise zur Verffigung gestellt wmde, als Wegbereiter fiir die Virusinfektion zu benutzen. Wenn ~uch nach G.H. Warren im Gegen- satz zu den i~lteren Ver6ffentlichungen anderer Forseher bei der exloerimen- tellen Infektion mit Poeken- und Theiler-Virus keine gesteigerte Infek- tiositi~t unter Verwendung yon gereinigter Hyaluronidase nachgewiesen werden konnte, so miissen entslorechende Beobachtungen ffir die ver- schiedenen Virusarten unter gei~nderten Bedingungen gem~cht warden, da nicht yon vornherein auf analoge Verh~ltnisse geschlossen warden kann.

Durch Duran Reynalds ist das Ph~nomen des ,,spreading factor", aus Stierhoden gewonnen, bekannt geworden (1928) (Literatur bei H. Gibian). Die yon Chain und Duthie (1939) als Ferment (Ferment- komplex) Hyaluronidase erkennte Substanz baut die Mueos~eeh~ride HyMurons~ure und Chondroitinsehwefels~ure eb. Die genannten Sehleim- stoffe sind ~ls wesentliche Bestandteile im mesodermalen Gewebe vet ~1 eten. Sie beeinflussen die Viskosit~t und Permeebiliti~t des Bindegewebes. Durch Einwirkung der yon ~ugen zugefiihrten Hyaluronidase, die auch normalerweise neben der Hyalurons~ure im Gewebe vorkommt und die mit dieser in einem bestimmten MengenverhgI~nis steh~, wird die Gewebs- festigkeit herabgesetzt nnd die Permeabilits gesteigert, so dab Stoffe in anderer Weise aufgenommen werden nnd das Gewebe durehdringen k6nnen. Da bei Infektionen Bakterien und Virusarten das Bindegewebe loassieren mtissen, k6nnten Permeabilit~tsgnderungen im Gewebe yon ausschlaggebender Bedeutung werden.

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Die Hyaluronidase wird v( r allem aus Hoden gewonnen, ist aber auch in anderen Goweben und 0rganen mehr oder weniger stark vorhanden und wird yon verschiedenen Bakterienarten (Streptokokken, Staphylo- kokken, Pneumokokken u. a.) gebfldet (H. Gibian). Die zuletzt genannte Tatsaehe kSnnte als eine Deutung der Invasionskraft yon Bakterien herangezogen werden oder aueh mSglicherweise fiir die Eignung dieser Keime als Wegbereiter yon Virusarten spreehen. Fiir die Entwiek]ung yon Infektionen (Sehnupfen, Erk~ltungskrankheiten u ~. a.) wurde die Hyaluronidasewirkung bereits mit verantwortlich gemaeht (Bergquist u. a.).

Die Hyaluronidase wirkt optimal bei p]~ 4,5. Eine groBe Anzahl yon unspezifisehen und spezifischen Hemmfaktoren, die im Serum und Gewebe vorhanden sind odor vorhanden sein kSnnen, sehal~en die Hyaluronidasewirkung Bus.

Auf Grund der geschilderten Eigenschaften der tty~luronidase iiber- nahmen wir dieses Ferment in unsere Versuche, um vielleicht die An- ziiehtung yon Virusarten zu erleichtern. Untersehwellige Virusmengen kSnnten noeh nach der Infektion zur Vermehrung gebracht werden, wenn es gelingt, dureh eine Hyaluronidaseinjektion vor, gleichzeitig oder nach der Infektion dem Virus den Weg in das Gewebe zu den Zellen zu bahnen. Wir untersuehten den EinfluB der Hyaluronidase auf die Infektion mit Grippevirus im Ei und bei der M~us. Vorher war der mSgliche EinfluB yon Hyaluronidase auf alas Grippevirus auszuschlieBen.

I. Wirkung der Hyaluronidase aui das Grippevirus, die Ery throeyten und das Immunse rum im Glasversuch.

Das Grippevirus veranlaBt Erythrocyten zu konglutinieren, dabei besetzen die Virusteilchen die Erythroeytenoberfl~che und kaften auf ihr durch ein Enzym ,,Mucinase". Naehdem sich allm~hlich die Virus- teilchen yon den Erythrocyten wieder gelSst haben, kSnnen diese nieht noeh einmal durch Grippevirus konglutiniert werden. Die Erythrocyten- agglutination wird bei Zusatz yon Immunserum dutch Ablenkung der Virusmucinase gehemmt.

Die Virusmucinase und die Hyaluronidase kSnnten miteinander so intefferieren, dal~ die Hyaluronidase die F~higkeit des Virus zar EIythro- eytenagglutination beeinflu6t.

Virussuspensionen mit den Konglu~inationstitern 1 : 2500 bzw. 1:10.000 aufgeschwemmt in physiologiseher NaC1-LSsung wurden mit t tyaluronidase versetzt bis zu 100 und 1000 E/ccm*. Bei Tempelaturen yon d-8 ~ d-20 ~ d-25 ~ d-37 ~ blieben die RShrchen 24 Stunden stehen. Die so vorbereiteten Virussuspensionen wurden in iiblieher Weise in den

* E ~ eine standardisierte 1YIenge Ferment, die die Viskositat der Hyaluronsgure in bestimmter Weise herabsetzt. Hauseinheit Kinetin-Schering.

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Konglutinationsversueh genommen. Dabei stellte sich heraus, dab bis zu I00E Hyaluronid~so/ccm das Virus nicht beeinflussen. Die Kon- glutinationen liefen normal und den Titern entspreehend ab. Virus- suspensionen, die mit Hyaluronidase 1000 E/ecru vorbehandelt wurden, riefen keine Konglutination der Erythroeyten mehr hervor.

Es wurde davon abgesehen, alas Virus n~ch der mSgliehen Einwirkung der Hyaluronidase dutch Zentrifugieren und Waschen yon dem Enzym zu befreien. Die d~bei normalerweise hervorgerufene Titerherabsetzung h/~tte die Deutung der Versuehsergebnisse gest6rt. Die naehgewiesene mangelnde Einwirkung yon 100 E/ecm auf das Virus geniigt ~ls Ergebnis fehlender spezifiseher Wirkung der Hyaluronidase. Die stSrende Wirkung yon 1000 E/ecru mul3 dagegen vorl~ufig als unspezifiseh angesehen werden.

In einer anderen Versuehsreihe zeigte sich, 4a]3 die Gegenwar~ der Hyaluronidase (bis zu 10 E/ecru) in Mischung mi~ einer Virussuspension und Erythroey~en die Konglutination nicht st6rt.

Um festzustellen, ob die Ityaluronidase die Erythrocyten so beein- flul3t, dal3 sio nicht mehr agglutiniert werden kSnnen, stellten wir fol- genden Versuch an:

Bei verschiedenen Temperaturen ~ 4 ~ ~- 22 ~ ~- 37 ~ wurden Erythro- eyten in 5~oiger physiol. NaC1-LSsung mit einem Zusatz his 100 E Hyaluronidase/cem suspendiert und 20 Stunden stehengelassen. Die Erythrocyten wurden anschliel3end dreimal mit physio]. N~C1-LSsung gewaschen und mit Virus versetzt. Die so vorbehandelten Erythroeyten zeigten in der Konglutination keine Beeintr~chtigung. Bei eiuem Zusa~z yon 1000 E/ecru zu der Erythrocytensuspension verf~rb~o sich diese so- fort und wurde ffir eine Konglutination unbrauchbar.

Weiterhin konnten wit beohaehten, da{~ dureh die Hyaluronidase die Hemmkraft des Serums gegenfiber der ttaemagglutination nicht he- einflui3t wird: Grippe-Immtmser~ 1 : 2 bis 1 : 480 mit physiol. NaC1-L6sung verdfinnt, erhielten Zus~tze von 1,5--20E. Hyaluronidase/ccm. Mit diesen Sera wurde ein Hemmversueh nach Hirst angesetzt bei einer Temperatur yon ~-20 ~ und einem pE-Wert 7,0. Die Hyaluronidase hatte die ttemmkraft der Ser~ nicht beeinflul3t. /)as ffir die ~erment- wirkung optimale Milieu yon p~ 4,5 konnte in dieser Versuchsanordnung nieht gewi~hlt werden.

Wie oben beschrieben, wirkt die Hy~luronid~se his zu 100 E/ccm nicht auf die ,,Mucinase" des Grippevirus im Glasversueh, auch beein- flul3t die Hy~luronidase die Erythrocytenoberfl~che mindestens nicht in der Weise, d~13 dadurch die Agglutinierbarkeit duroh das Virus gest6rt wird.

Urn die Spezifit/it des sich ~n der Erythrocytenoberfl~che ~bspielenden Vorganges zu demonstrieren und die Verschiedenartigkeit tier Mucinase und der Hyaluronidase herauszusteilen, wiederholten und best~tigten

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wir entsprechende Versuche mit dem Filtrat yon Choleravibrionen- kulturen, welches mit der Mueinase des Grippevirus interferiert (Literatur siehe bei Biding).

Choleravibrionen wuchsen in Peptonwasser bei 37 ~ 1, 2, 4 und 8 Tage lang. Die Kulturen wurden nach den betreffenden Bebrfitungszeiten dureh Membr~nfilter Nr. 10 steril filtriert.

In diesen verschiedenen Choler~filtraten wurden Erythrocyten in der Verdfinnung 1 : 2 suspendiert und 24 Stunden bei ~-4 ~ Zimmertem- peratur (-~18 ~ und ~-37 ~ stehengelassen, die Filtrate abgegossen und die Erythroey~en mit physiol. NaC1-LSsung dreimal gewasehen und im Konglutinationsversueh mit Virus ~ngesetzt. Die Filtrate besal~en in versehiedener St~rke die Eigenschaft, Erythrocyten inagglutinabel zu maehen. Am siehersten wirkten in dieser Hinsieht Filtrate eint~giger, meist auch noeh zweit~giger Kulturen. Die Filtrate vier~giger und ~lterer Kulturen beeinfluBten die Erythrocyten nieht in der besehriebenen Weise. Abet aueh die 24-Stunden-Filtrate differierten sehr wesentlich in ihrer F~higkeit, die Erythroey~en inagglutin~bel zu maehen. Bei eiuigen Ans~tzen yon Cholerakulturen wurde dieses Ergebnis bei ~-4 ~ bereits naeh Verlauf einer Stunde erreieht, bei anderen in der Zeit zwisehen 6 und 24 Stunden. Einige Ans~tze der 24-Stunden-Cholerakulturen wirkten ~uch nach 24 Stunden nieht.

Es ist auffaUend, dal~ sieh die mit Cholerafiltrat vorbehandelten Erythrocyten den Grippevirus St~mmen PR 8 und FM 1 gegeniiber anders verhielten als dem im Versuehe verwandten Stature Lee gegen- fiber, indem dieser Virusstamm in einigen F~Lllen die vorbehandelten Erythroeyten konglutinierte.

Das Cholerakulturfiltrat ha~e keine Wirkung auf die Viskosit~t der ttyalurons~ure.

II. Beeinflul~t die Hyaluronidase das Angehen der Virusinfektion im Hiihnerei ?

Um den Naehweis zu fiihren, ob die Hyaluronidase naeh Injektion in die A]lantoisfliissigkeit eines bebriiteten Hiihnereies das Gewebsgeftige der Membranen, Gef~t~w~nde u .a . aufloekert und damit das Angehen einer Grippevirusinfektion beeinfluBt, wurden die Versuehe naeh folgenden Gesiehtspunkten unternommen :

Dureh die Wirkung der tiyaluronidase kSnnte die fiir eine angehende Infektion nStige Virusmenge (-----kritisehe Keimzahl) kleiner sein als in der Kontrolle; die zwisehen der Infektion ulld nachweisbaren Vermehrung liegende Latenzzeit kSnnte durch ttyaluronidaseeinflul~ verkiirzt, die St~rke der Virusvermehrung gesteigert sein.

Erfahrungsgem~Ll~ liegt die geringste wirkungsvolle Infek~ionsdosis ffir das bebriitete Ei weir fiber dem Endtiter ffir die Erythrocytenkon-

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glutination der betreffenden Grippevirussuspension. So genfigen noeh zur Infektion des Eies 0,1 corn einer 24-, 36faehen Verdfinnung des Konglutinationsendtiters. Die HShe der noeh infekti6sen HSehstver- dfinnung bezogen auf den Konglutinationsendtiter sehwankt zwisehen 16--60faeh und mehr. In den Versuehen wurden versehiedene Verdfin- nungen (fiber den Konglutinationstiter der Virussuspension hinaus), z. B. 4-, 6-, 8-, 10-, 16-, 20-, 24-, 28-, 32-, 36-, 40-, 50- und 60f~eh verwendet.

Es gelang nieht, dureh einen Hyaluronidasezusatz yon 1 bzw. 100 E/Ei vor, gleiehzeitig mit und naeh der Virusinfektion mit hSheren Verdfin- nungen als in den Kontrollen ein siehereres Wa.chstum des Virus zu erreiehen.

Die ttyaluronidasegabe 1 bzw. 4 Stunden vor der Virusinfektion oder simultan mit ihr sollte mSglicherweise das Gewebe leiehter durehdringlieh machen. Damit abet die vermutete Wirkung der Hyaluronidase erst naeh der Latenzzeit, die der naehweisbaren Vermehrung vorausgeht, ein- tr i t t , wurde das Enzym auch 7 Stunden und mehr p. inf. in die Eier eingebraeht. Die Latenzzeit, die bis zu 18 Stunden dauern ka.nn, wurde dutch Einflug der Hyaluronidase (10 E/Ei) nieht verkfirzt, aueh wenn das Enzym 1~ bzw. 18 Stunden p. inf. verabreicht wurde. Diese Fest- stellungen gesehahen mit tIilfe der Erythroeytenkonglutination.

Ein Einflug der gyaluronidase 1--10 E/El auf die Vermehrungs- intensit~t des Grippevirus, gemessen an dem Konglutinationstiter der geernteten Allantoisfliissigkeit, wurde ebenfalls nieht beobachtet.

In den genannten Versuehsreihen war bei Zus~tzen yon 1--10 E HyMuronidase/Ei keine ungfinstige Beeinflussung des Viruswaehstums festzustellen. Naeh einer Zugabe yon 100 E/Ei gelang es nieht, in der Allantois Virus naehzuweisen. Aueh ffir diese F~lle (siehe oben) mug eine unspezifisehe Wirkung der grogen Hyaluroindasemenge angenommen werden.

Die genannten Versuche wurden mit relativ groBem Hyaluronidase- iibersehuB durchgeffihrt. Dies gesehah, um einen erwarteten Ver]ust an Hyaluronidasewirksamkeit in dem ~ilieu des bebriiteten Hfihnereies (pH-Wert, Temperatur, Inhibitoren .~) zu kompensieren.

Die Allantoisfliissigkeit hatte einen f fir die Hyaluronidasewirkung ungfinstigen (optimal 4,5 p~) Sgurewert yon etwa pg 7,9--8,5. In vitro hielten sieh in dieser Allantoisflfissigkeit 1 E bzw. 10 E 24 Stunden bei 37 ~ Wenn 10 E in das Ei injizierL waren, zeigte die Allantoisflfissigkeit noeh nach 30 Stunden eine ttyaluronidasewirkung. Dieselbe dem Ei ent- nommene Allantoisfltissigkeit hatte noch naeh weiteren 18 Stunden (d- 4 o Aufbewahrungstemperatur) eine Fermentwirksamkeit. Sehwan- kungen in der Haltbarkeit der Hyaluronidase im Ei bzw. in der A]lantois- flfissigkeit wurden beobaehtet. Die Allantoisflfissigkeit enthielt aber keinen naeh kurzer Zeit durch Titration feststellbaren Inhibitor des l~erments.

Beeinflui]t die Hyaluronidase die Infektiosit~t des Grippevirus? 261

Die Ermittlungen der Hyaluronidasewirkung wurden in Form des Hauttestes am Albinokaninchen durchgefiihrt. Als /(ontrolle gMten HyMuronidaselSsung und hyaluronidasefreie Allantoisfliissigkeit.

III . BeeinfluBt die Hyaluronidase die Grippevirusinfektion der Maus?

Normalerweise werden M/~use bei der Passagefibertragung mit 0,15 ccm einer Virusallantoisfliissigkeit 1 :10 bis 1 :100 oder mit einer M~use- lungensuspension 1 : 10 infiziert. Die Passagetiere sterben j e nach Virulenz des Stammes und nach Gewicht der Maus am 4. bis 6. Tag. Bei den mit Allantoisfliissigkeit infizierten Tieren trier eine Verz6gerung bis zum 8. Tag auf. Die nach 48 Stunden gewonnenen, meist bakteriell sterflen Lungen, mit grSBtm6glichster Virusmenge dienen a]s ImpfmateriM fiir weitere Passagen (Herzberg). Diese Lungen sind makroskopisch nur in seltenen Fi~llen ver~nclert im Gegensatz zu jenen der schwerkranken oder gestorbenen Tiere. Es konnte erwartet werden, dab im M/~use- versuch ira Gegensatz zum Versuch im bebriiteten Ei die Hyaluronidase bei intranasMer Verabreichung die Ausbreitung der Virusinfektion durch Gewebslockerung und Permeabiliti~tssteigerung unterstfitzt und demnach die Viruserkrankung schneller un4 umfassender abl~uft.

Ein Zusatz yon Hya]uronidase 1, 10 oder 100 E/)/[aus zur infizierenden Virussuspension (Allantoisfliissigkeit, konzentriert) un4 die Verimpfung dieser )/[ischung in~ranasM brachte keine verwertbare Verktirzung der Zeit bis zum Tode der Tiere oder keine Steigerung der makroskopisch feststellbaren Lungenerscheinungen.

In 8 VeIsuchsreihen mi~ insgesamt 167 M~usen, zuzfiglich der Kontroll- tiere, wurden 1 oder 10 E/Maus (meist 10 E) Hyaluronidase 6, 10, 17 oder 24 Stunden nach der Virusinfektion inr verabreicht. Es gelang nicht, eine rege]m~Bige und gleichartige Beeinflussung der Virus- infektion betreffs der Termine des I~rankwerdens, des Zeitpunktes des Todes und der St/~rke der Lungenbefunde hervorzurufen.

1 oder 4 Stunden vor der Virusinfektion wurden den M~usen 1 oder 10 E HyMuronidase intranasal verabreicht. Die Virusinfektionen dieser Tiere liefen nicht anders ab als die der I~ontrollen, und auch die Lungen- befunde unterschieden sich nicht voneinander.

Es fiel bei allen genannten Versuchsanordnungen auf, dab bereits nach 48 Stunden - - besonders aber sparer - - die Lungenabstriche (Auf: tupfen der Lungenschnittstellen) bakteriel]e sekund~re Infektionen mit Kokken, Gram-negativen St~bchen (z. B. Influenzabazillen) in einom Umfange zeigten, wie es sonst besonders ftir Lungen, die nach 48 Stunden gewonnen sind, ungewShnlich ist. Aus diesem Grunde wurde bei dem Ansetzen der Kontrollen darauf geachtet, dub die narkotisierten Tiere start der Hyaluronidaseinspiration physiol. NaCI-L5sung erhielten, um die einfache Schwemmwirkung der inspirierten Fliissigkeiten fiir ~' das

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Aufkommen sekundiirer Infektionen festzustellen. Die Versuehe zeigten, dal3 diese einfaehe Sehwemmwirkung die sekundiire Infektion nieht erklart, da letztere vor allem bei der Inspiration yon Hyaluronidase auf- traten. ])as Ferment seheint eine Infektion nicht mit dem Grippe~drus, aber mit den genannten Keimen zu unterstfitzen.

Die sekund~ren Infektionen sollten in einer Versuehsanordnung wihrend des Ablaufs der ersten 4 Tage durch 2real t~gliche Gaben von Penicillin (100 E/Tier subeutan) verhindert werden. Dies gelang nicht bei den nach 48 Stunden getSteten mit Hyaluronidase behandelten Tieren im Vergleich zu den steril bleibenden Kontrollen (virusinfiziert ohne Hyaluronidase), w~s auBerdem bei der Art der gefundenen Keime, die als penieillinresistent zu ge]ten haben, begreiflich ist.

Nur wenn grofte Infektionsdosen bei der intraperitonealen Injektion verwandt werden, gelingt es, virusbedingte Lungenprozesse hervorzu- rufen. Die I)urchtrgnkung der Lunge mit Hyaluronidase kSnnte bei einer Infektion dureh intraperitoneale Inj ektion des Virus die Entwicklung einer spezifisehen Pneumonie unterstiitzen. Eine so geaitete Beeinflussung gelang nieht bei einer Inspiration yon 10 E Hyaluronidase 6 Stunden naeh der intraperitonealen Injektion von 0,2 ecru einer hochvirulenten Virus enthaltenden Lungengewebssuspension 1 : 5 bzw. 1 : ]0 verdiinnt.

Unsere Versuche mit Eiern und Miusen ftihrten nicht zu den er- w~rteten Erfolgen. Die Vermehrung des Grippevirus im Ei wird im Tempo und in der Intensi~iit durch das Virus selbst bestimmt. Das embryonale Gewebe konnte durch die t tyaluronidasewirkung nieht so beeinfluBt werden, dab die Infektion schneller und sti~rker anging als normalerweise. GroBe Mengen yon Hyaluronidase nehmen dem Virus die Infektiosit~t und die F~thigkeit, Erythroeyten zu konglutinieren. Eine Steigerung der Infektiositiit des Virus bei intranasaler Infektion der Maus kam unter der Fermentwirkung nieht zustande.

Schrifttum.

i Biding, R. u. Heinlein, H . ,,Die Grippe." Joh. Amb. Barth, Leipzig 1949.-- ~ Gibian, H. Ailgew. Chemie, Bd. 63, S. 105--I17, 1951. - - 3 Henne- berg, O. u. Griitzner, L. Zbl. Bakter. I Orig. 154, 94--98 (1949).- 4 Herz- berg, K . Z. Immun. forsehung 106, 3 (1949).--~ Warren, G. H. Ann. New York Aead. of Sei. 52, i157 (1950).

tterausgeber, Eigentfimer und Verleger: Springer-Verlag, Wien I, ~51kerbastei 5. Ffir den Inhalt verantwortlich: Prof. Dr. Curt ttallauer, Bern, Friedbiihlstr. 51. - - Druck: Manzsche Bachdruekerei,

Wien IX, Lustkandlgasse 52.