Beeinflussung der Ergebnisse der biologischen Dosimetrie ... fileBMU – 2005-670 „Beeinflussung...

BMU – 2005-670

„Beeinflussung der Ergebnisse der biologischen

Dosimetrie durch Zellzyklusverzögerungen bei höheren

Dosen“

Universität Bremen,

Leobner Straße

28359 Bremen

Prof. Dr. med. W. Hoffmann, Dr. rer. nat. A. Heimers,

Dr. H.J. Brede, Dr. U. Giesen

IMPRESSUM

Dieser Band enthält einen Abschlussbericht über ein vom Bundesministerium für

Umwelt, Naturschutz und Reaktorsicherheit (BMU) gefördertes Vorhaben.

Verantwortlich für den Inhalt sind allein die Autoren. Das BMU übernimmt keine

Gewähr für die Richtigkeit, die Genauigkeit und Vollständigkeit der Angaben sowie

die Beachtung privater Rechte Dritter. Der Eigentümer behält sich alle Rechte an der

weiteren Nutzung oder Vervielfältigung des Berichts vor.

Der Bericht gibt die Auffassung und Meinung des Auftragnehmers wieder und muss

nicht mit der des BMU übereinstimmen.

Herausgeber:

Bundesministerium für Umwelt, Naturschutz und Reaktorsicherheit

Referat RS I 2

Postfach 12 06 29

53048 Bonn

ISSN 1612-6386

Erscheinungsjahr: 2005

Heimers/Hoffmann. Abschlußbericht BfS-StSch 4321 1

Der Bericht gibt die Auffassung und Meinung des Auftragnehmers wieder und muss nicht mit der Meinung des Auftraggebers (Bundesminister für Umwelt, Naturschutz und Reaktorsicherheit) übereinstimmen Schlussbericht zu § 12 Abs. 3 StSch 4321 Beeinflussung der Ergebnisse der Biologischen Dosimetrie durch Zellzyklus-verzögerung bei höheren Dosen Auftragnehmer: Zentrum für Umweltforschung und Umwelttechnologie (UFT), Universität Bremen Laufzeit des Vorhabens: 01.09.2002 – 31.08.2004 Projektleiter: Prof. Dr. med. W. Hoffmann, MPH Stellv. Projektleitung und Projektkoordination: Dr. rer. nat. A. Heimers Neutronenbestrahlung in der PTB: Dr. H. J. Brede und Dr. U. Giesen Zusammenfassung Mit Hilfe strahlentypischer Chromosomenaberrationen [dizentrische (dic) und Ringchromosomen (cRing)] wurde in peripheren menschlichen Lymphozyten untersucht, ob nach Exposition mit unterschiedlichen Dosen locker und dicht ionisierender Strahlung und Kulturzeiten von 48h, 56h und 72h die Dosis einen Einfluss auf die Proliferationsgeschwindigkeit und damit auf die ermittelte Aberrationsfrequenz hat. Mit unterschiedlichen Mischungsverhältnissen (25, 50 und 75%) von bestrahltem und unbestrahltem Blut wurde weiterhin ermittelt, wie locker und dicht ionisierende Strahlung bei unterschiedlich hohen Dosen im höheren Dosisbereich den Zellzyklus in simulierten Teilkörperbestrahlungen beeinflusst. Für die Expositionen mit locker ionisierender Strahlung (Röntgenstrahlen, 200 kV) wurden Blutproben von 5 männlichen Probanden mit folgenden Dosen bestrahlt: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 und 5,0 Gy, die Ex-positionen mit dicht ionisierender Strahlung (Neutronen mit mittlerer Energie <En> = 2,1 MeV) und den Dosen: 0,1; 0,3; 0,5; 0,7 und 1,0 Gy fanden in Kooperation mit der PTB in Braunschweig statt. Für die simulierten Teilkörperexpositionen wurde das Blut von zwei Probanden mit den genannten Dosen bestrahlt und unterschiedliche Mischungsverhältnisse (25%, 50%, 75%) von bestrahltem und unbe-strahltem Blut hergestellt. Es erfolgten Anstiege in der Häufigkeit strahlentypischer Chromosomenaberrationen mit Dauer der Kulturzeit, wobei nach Röntgenexposition in der Gesamtgruppe signifikante Unterschiede zwischen 48 und 72h Kulturzeit für die Dosen 2,0 (p<0,01), 3,0 (p<0,05) und 4,0 (p<0,01) Gy auftraten, für 2,0 Gy auch zwischen 56h und 72h (p<0,01). Für die Neutronenexposition gab es signifikante Unterschiede zwischen 48h und 72h nach 0,1 (p<0,05), 0,7 (p<0,01) und 1,0 Gy (p<0,01). Ebenfalls waren signifikante Unterschiede für 0,7 (p<0,05) und 1,0 Gy (p<0,01) auch zwischen 56 und 72h zu beob-achten. Die Anzahl stark geschädigter Zellen stieg mit Dosis und Dauer der Kulturzeit nach Anwen-dung beider Strahlenarten an, nach Röntgenexposition zeigte sich in allen Fällen eine Poisson Ver-teilung von dic und cRing, nach Neutronen eine Überdispersion. Neutronen verursachten eine stär-kere Zellzyklusverzögerung als Röntgenstrahlen und insbesondere stark geschädigte Zellen benötig-ten bis zu 72h Kulturdauer, um in der ersten Metaphase sichtbar zu werden. Die beobachtete Zellzy-klusverzögerung ist abhängig vom LET und der Dosis der Strahlung, sowie von der Art und der Anzahl strahlentypischer Aberrationen pro Zelle. Nach simulierten Teilkörperbestrahlungen resultierten ab 3,0 Gy Röntgenbestrahlung bei allen drei Mi-schungsverhältnissen signifikante Unterschiede zwischen 48 und 72h, sowie zwischen 56 und 72h. Signifikante Unterschiede gab es ebenfalls nach Neutronenexposition zwischen den angewendeten Kulturzeiten, diese erfolgten hier aber unsystematisch. Die Verteilung der dic und cRing zeigte für beide Strahlenarten eine Überdispersion. Es kam in Abhängigkeit vom bestrahlten Volumen und der angewendeten Dosis zu teilweise drastischen Zellzyklusverzögerungen der bestrahlten Zellen: je klei-ner das bestrahlte Volumen und je höher die Dosis, desto größer war der Selektionsvorteil der unbe-


strahlten Zellen. Eine Teilkörperexposition mit Röntgenstrahlen konnte aufgrund der Überdispersion deutlich von einer Ganzkörperexposition unterschieden werden. Nach Neutronenexposition erfolgte dagegen in beiden Fällen eine Überdispersion, so dass sich ein Unterschied zwischen Ganz- und Teilkörperbestrahlung anhand der quantitativen zytogenetische Analyse nicht nachweisen ließ. Neben dem Transfer der wissenschaftlichen Erkenntnisse und technischen Innovationen im For-schungskontext wird empfohlen, die Ergebnisse dieses Projektes in allgemeine Empfehlungen zum Vorgehen bei der retrospektiven Dosisermittlung durch die Biologische Dosimetrie einfließen zu las-sen. Voraussetzung wäre ein Erfahrungsaustausch mit den bestehenden bzw. geplanten nationalen und internationalen Netzwerken für zytogenetische Methoden in der Strahlenbiologie und Strahlenme-dizin und die Einleitung eines Konsensusprozesses mit den dort beteiligten Experten und Institutionen. I. Darstellung zu 1. Aufgabenstellung Gegenstand des Forschungsprojektes war die systematische Untersuchung be-stimmter Einflussfaktoren auf die Validität und Zuverlässigkeit der Dosisabschätzung einer Strahlenexposition mittels quantitativer Analyse strahlentypischer Chromoso-menaberrationen im Individualfall. Die Anzahl aberranter Zellen, die nach einer be-stimmten Kulturzeit beobachtet werden, in der Regel nach 48h, ist abhängig von der Kinetik der exponierten Zellpopulation. Dies bedeutet insbesondere, dass der Zell-zyklus aberranter Zellen verzögert sein kann, so dass ihre Zellteilung u. U. nach 48h Kulturzeit noch nicht vollendet ist und sie damit in der Analyse nicht erfasst werden. Dadurch kann es zu einer Unterschätzung der äquivalenten Ganzkörperdosis kom-men. Solche Zellzyklusverzögerungen (mitotic delay) treten insbesondere nach ho-hen Dosen auf (Lloyd et al 1977), sie sind aber auch abhängig von der Strahlenqua-lität (Ritter et al 1996). Diese Beobachtung ist bedeutsam für die Bestimmung der Relativen Biologischen Wirksamkeit (RBW) dicht ionisierender Strahlung. Diese würde für Strahlungsarten mit höherem LET systematisch unterschätzt, wenn nach einer Standardkulturzeit von 48h stark geschädigte Zellen die Mitose möglicherweise noch nicht erreicht oder bereits abgeschlossen haben. In diesem Projekt wurde un-tersucht, ob nach Exposition mit unterschiedlichen Dosen locker (200 kV Röntgen-strahlung) und dicht ionisierender Strahlung (Neutronen mit mittlerer Energie <En> = 2,1 MeV) und Kulturzeiten von 48h, 56h und 72h die Dosis einen Einfluss auf die Proliferationsgeschwindigkeit und damit auf die ermittelte Aberrationsfrequenz hat. Durch das gleichzeitige Vorhandensein von bestrahlten und unbestrahlten Lympho-zytenpopulationen ist die Interpretation von Aberrationsfrequenzen im Vergleich zu einer Ganzkörperbestrahlung nach einer Teilkörperbestrahlung, wie sie bei Strahlen-unfällen recht häufig vorkommt, komplizierter. Es konnte gezeigt werden, dass be-strahlte Zellen einen Selektionsnachteil gegenüber unbestrahlten Zellen haben, d.h. sie teilen sich verzögert oder überleben die Mitose nicht (Lloyd et al 1973). Dieser beschriebene Effekt ist dosisabhängig. Demnach müssten nach akuter Teilkörperbe-strahlung Lymphozytenkulturen nur ein unvollständiges Muster in der Anzahl ge-schädigter wie auch ungeschädigter Zellen ergeben. Mit unterschiedlichen Mi-schungsverhältnissen von bestrahltem und unbestrahltem Blut wurde untersucht, wie locker und dicht ionisierende Strahlung bei unterschiedlich hohen Dosen den Zell-zyklus in simulierten Teilkörperbestrahlungen beeinflusst.


2. Voraussetzungen, unter denen das FE-Vorhaben durchgeführt wurde Fünf freiwillige Blutspender, die bereit waren, größere Mengen an Blut zu spenden und folgende Kriterien erfüllten: - Nichtraucher - keine übermäßige medizinisch-diagnostische Strahlenbelastung - keine vorhergehende Chemo- oder Strahlentherapie - keine Beschäftigung in Berufen und/oder exponierten Zonen, die das Tragen von

Strahlenplaketten, –ringen oder TLDs vorschreibt. Kooperation mit der Physikalisch-Technischen Bundesanstalt (PTB), Braunschweig, um die Neutronenbestrahlungen durchzuführen. 3. Planung und Ablauf des Vorhabens Auswahl von fünf gesunden männlichen Probanden (Alter 42-52 Jahre) anhand la-boreigener Fragebögen, welche die o. g. Kriterien erfüllten. Kontaktaufnahme zur PTB und dort Präsentation des Forschungsvorhabens; Aus-wahl des Neutronenfeldes, um die gewünschten Dosen applizieren zu können. Bestrahlung von biologischen Proben im intensiven Neutronenfeld der PTB mit einer mittleren Energie En = 2,1 MeV. Die Bestrahlungen erfolgten in einem intensiven, kollimierten Neutronenfeld (Dietze et al 1984, Brede 2004) an der Ionenbeschleunigeranlage der PTB (Brede et al 1980). Als Neutronenquelle wurde die (9Be + d) - Reaktion mit einer Deuteronenein-schussenergie von Ed = 3,4 MeV benutzt. Das Target besteht aus einer 4 mm dicken Be-Scheibe und ist wassergekühlt. Der Deuteronen-Teilchenstrahl wird vollständig im Be-Material gestoppt, so dass ein breites Neutronenspektrum mit einer mittleren Energie von <En> = 2,1 MeV erzeugt wird. Für die spektrale Verteilung der Neutronenenergien wurden die experimentellen Daten von Meadows (Meadows 1993) übernommen. Das mittlere LET in Wasser beträgt ca. 40 keV/µm. Die Proben wurden in "Frei Luft"-Geometrie in einem Abstand von 585 mm vom Neutronentarget unter 0oGrad zur Deuteronenstrahlrichtung in einem streuarmen Halter befestigt. Das Neutronenfeld wurde durch einen Kollimator mit einer Öffnung von 75 mm x 75 mm definiert. Der Abstand der Proben zum Kollimator betrug 180°mm. Die Wasserenergiedosis wurde mit einer Ionisationskammer aus gewebeäquivalen-tem Material (A150-Plastik) - gefüllt mit gewebeäquivalentem Gas (TE) - bestimmt (Type T2 der Firma EXARADIN, Volumen = 0,5 cm3, Wandstärke =1 mm, Aufbau-kappe = 1 mm)(EXRADIN, [email protected], 7601 Murphy Drive, Middleton, Wi 53562-2532, USA) Ein Absolutvergleich dieser TE-Kammer mit einem Wasserkalorimeter im Neutronenfeld der mittleren Neutronenenergie En = 5,3 MeV (Ed = 13,3 MeV) am gleichen Messplatz zeigte eine Übereinstimmung der Dosiswerte innerhalb der relativen Standardunsicherheiten von 1,5 % bzw. 1,8 % (Brede 2004). Für die hier beschriebenen Messungen wurde deshalb die TE-Ionisationskammer


relativ zum Kalorimeter kalibriert. Diese Kalibrierung kann übernommen werden, da der Unterschied in der relativen Neutronenempfindlichkeit der TE-Kammer für das Neutronenfeld mit einer mittleren Energie von En = 5.3 MeV (Ed = 13,3 MeV) von 0,939 ± 5 % (Brede 2004) und für das Neutronenfeld mit einer mittleren Energie von 2,1 MeV (Ed = 3,4 MeV) von 0,96 ± 10 % (Watermann et al 1979) innerhalb der Un-sicherheiten übereinstimmen. Die Verhältnisse R der Kermafaktoren von Wasser zu A150-Plastik für die Neutronenspektren bei Ed = 13.3 MeV (R = 1,058 [Brede 2004]) und Ed = 3.4 MeV (R = 1,067 [Caswell et al 1980]) stimmen innerhalb von 1 % über-ein. Der Dosisanteil durch Photonen wurde bei dieser Deuteriumenergie nicht separat bestimmt. Im Neutronenfeld bei einer Energie von Ed = 13,3 MeV wurde eine relative Photonendosis von 2,1 % zur Gesamtdosis gemessen. Aufgrund der starken Ab-nahme der Photonenausbeute mit fallender Deuteroneneinschussenergie wird der Photonendosisanteil an der Gesamtdosis bei Ed = 3,4 MeV kleiner als 2 % sein. Bei einem Deuterium-Ionenstrom auf dem Be-Target von 80 µA wurde eine Dosisrate von ca. 1,8 Gy/h erreicht. Unter den obigen Voraussetzungen und Annahmen beträgt die relative Standardunsicherheit für die angegebenen Dosiswerte 5 %. Prüfung des Vorhabens unter ethischen Gesichtspunkten: von der Ethikkommission der Ärztekammer Bremen wurden keine berufsrechtlichen oder berufsethischen Ein-wände gegen das Vorhaben erhoben (Bescheid vom 23.11.2002). Einteilung des Vorhabens in verschiedene Arbeitspakete (AP): AP 1 Zellzyklusverzögerung nach Exposition mit locker ionisierender Strahlung • Kalibrierung der 200 kV RT 200 Müller Röntgenanlage im UFT Bremen mit PTW DL4 Dosimentor

im Wasserphantom bei konstanter Temperatur (37°C) • am Abend vor der Bestrahlung Einbestellung der Probanden und Blutabnahme durch qualifizierte

Krankenschwester mittels Venenpunktion (S-Monovetten mit Lithium-Heparin und Multifly-Set, Sarstedt), Lagerung der Blutproben bei 37°C

• Bestrahlung der Blutproben mit 200 kV Röntgenstrahlung (15 mA, 1mm Cu; Dosisrate: 0,52 Gy/min) und folgenden Dosen: 1, 2, 3, 4, 5 Gy bei 37°C

• 15.10.2002: Probanden A,B,E • 27.11.2002: Probanden C, D • 4 Stunden Aufbewahrung der Blutproben bei 37°C im Brutschrank, um vergleichbare Bedingun-

gen zu den Neutronenexponierten Proben herzustellen • Kulturansatz

Drei unterschiedliche Kulturzeiten für jeden Dosispunkt: 48h, 56h, 72h • Aufbereitung, Fluoreszenz-plus-Giemsas (FPG) -Färbung nach den drei verschiedenen Kulturzei-

ten • Auswertung aller strukturellen Chromosomenaberrationen in insgesamt 33.000 Zellen aus ersten

Mitosen nach vorheriger Lokalisation durch den Metaphasenfinder (MetaSystems, Altlussheim) • Auswertung von jeweils 1000 Zellen/Proband aus parallel angesetzten Kulturen unbestrahlter

Blutproben zur Ermittlung des Kontrollwertes struktureller Chromosomenaberrationen nach den drei verschiedenen Kulturzeiten

• Ermittlung des Replikationsindex • Erstellung des ersten Zwischenberichtes


AP2 Zellzyklusverzögerung nach Exposition mit dicht ionisierender Strahlung • Blutabnahme am Abend vor der Bestrahlung, Lagerung und Transport nach Braunschweig am

folgenden Morgen bei 37°C • Bestrahlung der Blutproben von fünf Probanden mit Neutronen und folgenden Dosen: 0,1; 0,3;

0,5; 0,7; 1,0 Gy bei Raumtemperatur • 18.02.2003: Probanden B, D, E (mittlere Dosisrate 0,4 mGy/s) (Tab.1) • 01.04.2003: Probanden A, C (mittlere Dosisrate 0,5 mGy/s) (Tab.1) • Transport der Blutproben zurück nach Bremen bei 37°C innerhalb von vier Stunden • Kulturansatz

Drei unterschiedliche Kulturzeiten für jeden Dosispunkt: 48h, 56h, 72h • Aufbereitung, FPG-Färbung nach den drei verschiedenen Kulturzeiten • Auswertung aller struktureller Chromosomenaberrationen in 36.000 Zellen aus ersten Mitosen

nach vorheriger Lokalisation durch den Metaphasenfinder (MetaSystems, Altlussheim) • Ermittlung des Replikationsindex • Erstellung des zweiten Zwischenberichtes AP3 Simulation von Teilkörperbestrahlungen mit locker ionisierender Strahlung • Blutabnahme am Abend vor der Bestrahlung, Lagerung bei 37°C, es wurden die Probanden B und

D gewählt, da sie den größten Satz verwertbarer Metaphasen brachten • Bestrahlung der Blutproben mit 200 kV Röntgenstrahlung (15 mA, Dosisrate: 0,52 Gy/min) und

folgenden Dosen: 1, 2, 3, 4, 5 Gy bei 37°C • 20.05.2003: 1,0; 2,0 und 3,0 Gy • 19.08.2003: 1,0; 4,0 und 5,0 Gy • 28.10.2003: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 und 5,0 Gy • 02.12.2003: 2,0 und 3,0 Gy • 4 Stunden Aufbewahrung der Blutproben bei 37°C im Brutschrank, um vergleichbare Bedingun-

gen zu den Neutronenexponierten Proben herzustellen • Herstellen folgender Mischungsverhältnisse von bestrahltem und unbestrahltem Blut: 25%, 50%,

75% • Kulturansatz

Drei unterschiedliche Kulturzeiten für jedes Mischungsverhältnis und jeden Dosispunkt: 48h, 56h, 72h

• Aufbereitung, FPG-Färbung nach den drei verschiedenen Kulturzeiten • Auswertung aller struktureller Chromosomenaberrationen in 51.600 Zellen aus ersten Mitosen

nach vorheriger Lokalisation durch den Metaphasenfinder (MetaSystems, Altlussheim) • Ermittlung des Replikationsindex • Erstellung des dritten Zwischenberichtes AP4 Simulation von Teilkörperbestrahlungen mit dicht ionisierender Strahlung • Blutabnahme am Abend vor der Bestrahlung, Lagerung und Transport nach Braunschweig am

folgenden Morgen bei 37°C • Bestrahlung der Blutproben mit Neutronen und folgenden Dosen: 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0 Gy bei

Raumtemperatur • Transport der Blutproben zurück nach Bremen bei 37°C innerhalb von vier Stunden • 08.12.2003: 0,1; 0,3 und 0,5 Gy (mittlere Dosisrate 0,5 mGy/s) (Tab.1) • 09.03.2004: 0,1; 0,7 und 1,0 Gy (mittlere Dosisrate 0,5 mGy/s) (Tab.1) • 21.04.2004: 0,7 und 1,0 Gy (mittlere Dosisrate 0,3 mGy/s) (Tab.1) • Herstellen folgender Mischungsverhältnisse von bestrahltem und unbestrahltem Blut: 25%, 50%,

75% • Kulturansatz

Drei unterschiedliche Kulturzeiten für jedes Mischungsverhältnis und jeden Dosispunkt: 48h, 56h, 72h

• Aufbereitung, FPG-Färbung nach den drei verschiedenen Kulturzeiten • Auswertung aller struktureller Chromosomenaberrationen in 52.200 Zellen aus ersten Mitosen

nach vorheriger Lokalisation durch den Metaphasenfinder (MetaSystems, Altlussheim)


• Ermittlung des Replikationsindex • Erstellung des vierten Zwischenberichtes AP5 Zusammenstellung der Ergebnisse, statistische Auswertung, Erstellen des Ab-schlussberichtes 4. Wissenschaftlicher und technischer Stand, an den angeknüpft wurde, insbe-sondere - Angabe bekannter Konstruktionen, Verfahren und Schutzrechte, die für die Durchführung des FE-Vorhabens benutzt wurden, Methodenbeschreibung zur Chromosomenaberrationsanalyse 0,50 ml einer peripheren venösen Blutprobe werden pro Kulturflasche (50 cm³, Nunclon TM, Nunc) mit je 5,60 ml RPMI 1640 Medium (Biochrom), 1,0 ml fetalem Kälberserum (Biochrom), 500 I.E. Heparin-Natrium (Ratiopharm), 0,500 mg Streptomycin, 500 I.E. Penicillin (Roche), 0,027 mg Bromodeoxyuri-din (BrdU, Sigma-Aldrich) und 0,036 mg Phytohaemagglutinin (Biochrom) versetzt. Drei Stunden vor Ablauf der Kurzzeitkulturen (48 h, 56h, 72h) werden die T-Lymphozyten mit Colcemid (0,340 µg/ ml, Boehringer) in der Metaphase arretiert. Nach hypotoner Behandlung (0,075 M KCl-Lösung) werden die Lymphozyten isoliert und mit Methanol:Eisessig (3:1) fixiert, danach wird die Zellsuspension auf Objektträger aufgetropft. Die Präparate werden luftgetrocknet und nach Vorbehandlung mit Bisbenzi-mid (Sigma-Aldrich), UV-Licht (360 nm) und heißer SSC-Lösung mit Giemsalösung (Merck, 5%ig in Sörensen-Puffer) gefärbt (Fluoreszenz plus Giemsa (FPG)-Technik nach Perry und Wolff 1974. Die Aberrationsanalyse wird lichtmikroskopisch bei 1000facher Vergrößerung durchgeführt. Alle struktu-rellen Chromosomen- (dizentrische Chromosomen (dic), zentrische Ringchromosomen (cRing), poly-zentrische Chromosomen, azentrische Fragmente (ace) incl. Minutes und azentrischen Ringen, Chromosomengaps) und Chromatidaberrationen (Chromatidaustausche wie triradiale und quadriradi-ale Formationen, Chromatidenbrüche, Chromatidengaps) werden protokolliert. Polyzentrische Chro-mosomen mit n Zentromeren werden als n-1 dizentrische gewertet. Die Identifizierung und Beschrei-bung basiert auf den Kriterien des International System for human Cytogenetic Nomenclature (ISCN 1995). Die Analyse erfolgt mit Hilfe eines computergesteuerten Bildverarbeitenden Systems (Meta-phasenfinder der Firma metaSystems, Altlussheim). Die Auswertedaten werden über die Software dieses Systems verwaltet.

Für die Auswertung werden nur Metaphasen aus der ersten Teilung analysiert, weil instabile Aberrati-onen (z.B. dizentrische Chromosomen) als Konsequenz weiterer Teilungen verloren gehen.

Eine Unterscheidung zwischen ersten und späteren Mitosen wird durch die angewendete differentielle FPG-Färbetechnik gewährleistet. Die Analyse bezieht außerdem nur Metaphasen ein, die festgelegten Qualitätskriterien entsprechen (Hoffmann et al 1991), z. B. werden dic und cRing nur mit assoziiertem azentrischen Fragment ausgewertet. Als statistische Auswertemethoden kommen folgende Tests zur Anwendung: Prüfung auf Poisson-Verteilung, bei Abweichung Dispersionsindex und u-Test (Radakrishna und Chakravarti 1956; Savage 1970; Edwards et al 1979); Fisher's-Exact-Signifikanztest für Mutationsfrequenzen; Angabe der 95% Konfidenzintervalle (Clopper und Pearson 1934) auf der Basis der Poisson-Verteilung; Angabe vom Standardfehler des Mittelwertes (SEM: standard error of the mean) nach Überdispersion; Dosis Wir-kungs- Kurven wurden mit Hilfe der iteratively reweighted least squares Analyse gefittet. - Angabe der verwendeten Fachliteratur sowie der benutzten Informations- und Dokumentationsdienste Anderson R.M., Marsden S.J., Wright E.G., Kadhim M.A., Goodhead D.T., Griffin C.S., Complex chromosome aberrations in peripheral blood lymphocytes as a potential biomarker of exposure to high-LET α-particles. Int. J. Radiat. Biol. 76, 2000, 31-42.


Barquinero J.F., Barrios L., Caballin M.R., Miros R., Ribas M., Egozcue J., Biological dosimetry in simulated in vitro partial irradiations. Int. J. Radiat. Biol. 71, 1997, 435-440. Beek B. and Obe G., The human leucocyte test system:X. Higher sensitivity to X-irradiation in the G0 stage of the cell cycle of early as compared to late replicating cells. Human genetics 35, 1976, 57-70. Bender M. A. and Brewen J.G., Factors influencing chromosome aberration yields in the human pe-ripheral leukocyte system. Mut. Res. 8, 1969, 383-399. Boei J.J.W.A., Vermeulen S., Natarajan A.T., Detection of chromosomal aberrations by fluorescence in situ hybridization in the first three postirradiation divisions of human lymphocytes. Mut. Res. 349, 1996, 127-135. Brede, H.J.; Cosack, M.; Dietze, G.; Gumpert, H.; Guldbakke, S.; Jahr, R.; Kutscha, M.; Schlegel- Bickmann, D.;Schölermann, H.: The Braunschweig Accelerator Facility for Fast Neutrons Research. I.Building Design and Accelerators. Nucl. Instr. and Meth. 169, 1980, 349-358. Brede H.J.: Darstellung der Wasserenergiedosis im kollimierten, gemischten Neutronen-Photonfeld der PTB PTB-Bericht: PTB-N-45, ISBN 3-86509-170-9, 2004. Buul v. P.P.W. and Natarajan A.T., Chromosomal radiosensitivity of human leucocytes in relation to sampling time. Mut. Res. 70, 1980, 61-69. Caswell R.S.; Coyne J.J., Randolph M.L.: Kerma Factors for Neutron Energies below 30 MeV. Rad.. Res. 83, 1980, 217 – 254. Clopper C.J., Pearson E., The use of confidence or fiducial limits illustrated in the case of binomial. Biometrica 26, 1934, 404-413. Dietze G, Brede H.J.,. Schlegel-Bickmann D.: Dosimetry for neutron therapy at the Physikalisch-Tech-nische Bundesanstalt (PTB). in: Advances in Dosimetry for fast Neutrons and Heavy Charged Parti-cles for Therapy Applications 1984, 203-215, IAEA-Report-AG-371/14. Duran A., Barquinero J.F., Caballin M.R., Ribas M., Puig P., Egozcue J., Barrios L., Suitability of FISH painting techniques for the detection of partial-body irradiations for biological dosimetry. Rad. Res. 157, 2002, 461-468. Durante M., Yamada S., Ando K., Furusawa Y., Kawata T., Majima H., Nakano T., Tsujii H., Meas-urements of the equivalent whole-body dose during radiation therapy by cytogenetic methods. Phys. Med. Biol. 44, 1999, 1289-1298. Edwards A.A., Lloyd D.C., Purrott R.J., Radiation induced chromosome aberrations and the Poisson distribution. Rad. Environm. Biophys. 16, 1979, 89-100. Fabry L., Leonard A., Decat G., Deknudt Gh., Jacqut P., Leonard E.D., Chromosome aberrations in mixed cultures of in vitro irradiated and unirradiated human lymphocytes. Strahlenth. Onkol. 164, 1988, 108-110.


George K., Wu H., Willingham V., Furusawa Y., Kawata T., Cucinotta F.A., High- and low-LET induced chromosome damage in human lymphocytes: a time-course of aberrations in metaphase and inter-phase. Int. J. Radiat. Biol. 77, 2001, 175-183. Guerrero-Carbajal Y.C., Moquet J.E., Edwards A.A., Lloyd D.C., The persistence of FISH transloca-tions for retrospective biological dosimetry after simulated whole or partial body irradiation. Rad. Prot. Dos. 76, 1998, 159-168. Hoffmann G.R., Sayer A.M., Littlefield L.G., Higher frequency of chromosome aberrations in late-aris-ing first-division metaphases than in early-arising metaphases after exposure of human lymphocytes to X-rays in G0. Int. J. Radiat. Biol. 78, 2002, 765-772. Hoffmann W., Dannheim T., Grell-Büchtmann I., Heimers A., Nahrmann A., Schröder H., Schmitz-Feuerhake I., Tomalik P., Quantitative Chromosomenaberrationsanalyse zur retrospektiven Dosiser-mittlung nach Exposition mit ionisierender Strahlung: Biologische Dosimetrie. BIOfoum 14, 1991, 381-385. ISCN. An International System for Human Cytogenetic Nomenclature. F. Mitelmann. S. Karger (Eds.), Basel, 1995. Leonard A., Decat G., Relation between cellcycle and yield of aberrations observed in irradiated hu-man lymphocytes. Can. J. Genet. Cytol. 21, 1979, 473-478. Lloyd D.C., Purrott R.J., Dolphin G.W., Chromosome aberration dosimetry using human lymphocytes in simulated partial body irradiation. Phys. Med. Biol. 18, 1973, 421-31. LLoyd D.C., Dolphin G.W., Purrott R.J., Tipper P.A., The effect of X-ray induced mitotic delay on chromosome aberration yields in human lymphocytes. Mut. Res. 42, 1977, 401-12. Loucas B.D. and Geard C.R., Kinetics of chromosome rejoining in normal human fibroblasts after ex-posure to low- and high-LET radiations. Rad. Res. 138, 1994, 352-360. Meadows J.W.:The 9Be(d,n) thick-target neutron spectra for deuteron energies between 2.6 and 7.0 MeV. Nucl. Instr. and Meth. A324, 1993, 239 - 246. Nasanova E., Ritter S., Gudowska-Nowak E., Kraft G., High-LET-induced chromosomal damage: time-dependent expression. Physica Medica 12, Suppl. 1, 2001, 198-201. Nasonova E. and Ritter S., Cytogenetic effects of densely ionising radiation in human lymphocytes: impact of cell cycle delays. Cytogenet. Gen. Res. 104, 2004, 216-220 Peak M.J., Wang L., Hill C.K., Peak J.G., Comparison of repair of DNA double strand breaks caused by neutron or gamma radiation in cultured human cells. Int. J. Rad. Biol. 60, 1991, 891-898. Perry P. and Wolff S., New Giemsa method for the differential staining of sister chromatids. Nature, 251, 1974, 156-158.


Poncelet E., Leonard A., Leonard E.D., Dutrillaux B., Biological dosimetry: radiation-induced mitotic delay can lead to an underestimate of the part of the body exposed after non-uniform irradiation. Strahlenth. Onkol. 164, 1988, 542-543. Radakrishna R.C., Chakravarti J., Some small sample tests of significance for a Poisson distribution. Biometrics 12, 1956, 264-282. Ritter S., Nasonova E., Scholz M., Kraft-Weyrather W., Kraft G., Comparison of chromosomal damage induced by X-rays and Ar ions with an LET of 1840 keV/µm in G1 V79 cells. Int. J. Rad. Biol. 69, 1996, 155-166. Ritter S., Nasonova E., Furusawa Y., Ando K., Relationship between aberration yield and mitotic delay in human lymphocytes exposed to 200 MeV/u Fe-ions or X-rays. J. Rad. Res. 43, Suppl., 2002, S175-S179. Savage J.R.K., Sites of radiation induced chromosome exchanges. Curr. Top. Radiat. Res. 6, 1970, 89-100. Scott D. and Lyons C.Y., Homogenous sensitivity of human peripheral blood lymphocytes to radiation-induced chromosome damage. Nature 278, 1979, 756-758. Sharpe H.B.A:, Pitfalls in the use of chromosome aberration analysis for biological radiation dosimetry. Brit. J. Radiol. 42, 1969, 943-944. Sreedevi B., Rao B.S., Nagara H., Pal N.K., Chromosome aberration analysis in radiotherapy patients and simulated partial body exposures: biological dosimetry for non-uniform exposures. Rad. Prot. Dos. 94, 2001, 317-322. Waterman F.M., Kuchnir F.T., Skaggs L.S., Kouzes R.T., Moore W.H.: Energy Dependence of the Neutron Sensitiviy of C-Co2, Mg-Ar and TE-TE IonisationChambers. Phys. Med. Biol. 24, 1979, 721 - 733. 5. Zusammenarbeit mit anderen Stellen Physikalisch-Technische Bundesanstalt (PTB), Braunschweig Fachbereich 6.4, Ionenbeschleuniger und Referenzstrahlungsfelder


II. Eingehende Darstellung 1. Darstellung des erzielten Ergebnisses Alle Tabellen und Abbildungen befinden sich im Anhang. Arbeitspaket 1: Zellzyklusverzögerung nach Exposition mit locker ionisieren-der Strahlung Es erfolgte ein dosisabhängiger Anstieg der Frequenz dizentrischer Chromosomen (dic), wie auch von zentrischen Ringchromosomen (cRing), multizentrischen Chro-mosomen (tri- und tetrazentrisch) und azentrischen Fragmenten (excess ace). Ebenfalls erfolgte ein Anstieg in der Frequenz von dic und cRing mit Dauer der Kul-turzeit, der aber nur in Einzelfällen signifikant war (Tab.2; Abb.1). Nach 2,0, 3,0 und 4,0 Gy zeigte sich in der Gesamtgruppe ein sign. Unterschied (2,0: p<0,01; 3,0: p<0,05; 4,0: p<0,01; Fisher`s Exact Test) in der Frequenz von dic und cRing zwischen Kulturzeiten von 48 und 72h, nach 2,0 Gy auch zwischen 56h und 72h (p<0,01). Die Verteilung der dizentrischen Chromosomen entspricht bis auf eine Aus-nahme (3,0 Gy, 48h: u = 2,11) einer Poisson-Verteilung, wobei sich eine Tendenz zur Unterdispersion zeigt, die aber nicht sign. ist (Tab.3-8). Tab.9 zeigt die Anzahl aller beobachteten Aberrationen in Abhängigkeit von Kulturzeit und Dosis. Abb.2 zeigt die Dosis-Wirkungsbeziehungen für dic und cRing nach den unterschied-lichen Kulturzeiten von 48, 56 und 72h unter Berücksichtigung des laboreigenen Kontrollwertes von 0,0005 ±0,0001. Die Koeffizienten der linear-quadratischen Funk-tionen (y = c + αD + βD2) sind folgende: 48h: 0,0005 (± 0,0001) + 0,0652 (± 0,0064) D + 0,0742 (± 0,0023) D2 56h: 0,0005 (± 0,0001) + 0,0692 (± 0,0065) D + 0,0770 (± 0,0024) D2 72h: 0,0005 (± 0,0001) + 0,0683 (± 0,0068) D + 0,0829 (± 0,0025) D2

Die Schwankungsbereiche in den Klammern geben jeweils den Standardfehler der Parameterschätzungen an. Der Replikationsindex (RI) bestätigt den Einfluss hoher Dosen auf die Mitosefähig-keit, je höher die Dosis, desto mehr nähert sich der RI bei allen Kulturzeiten dem Wert 1 an (Tab.10). Bei einer Betrachtung der Metaphasen in ersten, zweiten und weiteren Teilungen (Tab.11) zeigt sich, dass nach 48h mehr als 98% (98,5 – 100%) der Lymphozyten in Metaphase sich in der ersten Teilungsphase nach Bestrahlung befinden. Nach 56h befindet sich der Hauptteil (79 – 99%) der Metaphasen noch in der ersten Teilungsphase, und erst nach 72h übersteigt der Anteil der zweiten Meta-phasen (>50%) nach 1,0; 2,0 und 4,0 Gy den Anteil der ersten Metaphasen. Nach 3,0 Gy liegt der Anteil zweiter Metaphasen knapp unter 50% (49,6%) und nach 5,0 Gy bei 42,9%. In der vorliegenden Studie zeigt sich, dass Zellen mit zwei und mehr Austauschaber-rationen (dic und cRing) häufiger nach 56h und 72h Kulturdauer auftreten als nach 48h. Signifikante Unterschiede sind nach 2,0 und 4,0Gy zu beobachten: nach 2,0 Gy unterscheidet sich der Anteil von Zellen mit 2 dic und mehr (Cd2+) zwischen 56 und 72h signifikant (p< 0,05); ebenfalls unterscheidet sich der Anteil der Zellen mit Aus-tauschaberrationen (Cd) signifikant zwischen 48 und 72h (p< 0,05), wie auch zwi-


schen 56 und 72h (p< 0,05). Auch die Zellen, die nur eine Austauschaberration tra-gen, steigen nach 72h im Vergleich zu 48h signifikant (p< 0,05) an. Nach 4,0 Gy zeigt sich ein signifikanter Unterschied (p= 0,05) bei den Cd2+ Zellen im Vergleich zwi-schen 48 und 72h. Trizentrische Chromosomen (tric: Chromosomen mit drei Zentromeren: jeweils ein Bruch in drei Chromosomen) treten nach allen Dosen und Kulturzeiten auf, tetrazen-trische (tetra: Chromosomen mit vier Zentromeren: jeweils ein Bruch in vier Chromo-somen) dagegen nur nach Dosen von 4,0 und 5,0 Gy, aber auch bei allen Kulturzei-ten, die höchste Anzahl tritt nach 5,0 Gy auf. Unter Berücksichtigung aller angewen-deten Dosen sowie einer Anzahl von 33.000 ausgewerteten Metaphasen sind nach einer Kulturzeit von 48h insgesamt 1628 Zellen (4,9%) mit zwei oder mehr Aus-tauschaberrationen zu finden, nach 56h 1665 Zellen (5,0%) und nach 72h 1821 Zel-len (5,5%). Signifikante Unterschiede bestehen zwischen 48h und 72h (p< 0,01), sowie zwischen 56 und 72h (p< 0,05). Bei einer weiteren Eingrenzung der multiaber-ranten Zellen auf Metaphasen mit drei und mehr Austauschaberrationen (Cd3+) zeigt sich nur noch ein signifikanter Unterschied (p< 0,05) zwischen einer Kulturzeit von 48h im Vergleich zu 72h. Überzählige azentrische Fragmente (excess ace), d.h. solche, die nicht mit einem dizentrischen Chromosom oder einem zentrischen Ringchromosom assoziiert sind, steigen nach Dosen von ≥ 3,0 Gy signifikant an: nach 3,0 Gy zwischen 48 und 72h (p<0,01), wie auch zwischen 56 und 72h (p<0,01); nach 4,0 Gy zwischen 48 und 56h (p<0,01) und 48 und 72h (p<0,01); nach 5,0 Gy zwischen 48 und 56h (p<0,01), zwi-schen 48 und 72h (p< 0,01) und nach 56 und 72h (p< 0,05). AP2: Zellzyklusverzögerung nach Exposition mit dicht ionisierender Strahlung Im folgenden Text, sowie in den Tabellen und Abbildungen werden aus Gründen der Vereinfachung die Solldosen benannt, die real applizierten Neutronendosen finden sich in Tab. 1. Für die Berechnung der Dosis-Wirkungskurve wurden die real appli-zierten Dosen aus den zwei unterschiedlichen Bestrahlungsterminen sowie die ent-sprechenden Aberrationsfrequenzen pro Dosispunkt gemittelt, da sich die Vertrau-ensbereiche der Aberrationsfrequenzen überlappen. Es erfolgte ein dosisabhängiger Anstieg in der Frequenz von dic, cRing, multizentri-schen Chromosomen und excess ace, für dic (Tab.12, Abb.3) und excess ace auch ein Anstieg mit Dauer der Kulturzeit: nach 0,1 Gy zeigt sich in der Gesamtgruppe ein sign. Unterschied (p<0,05; Fisher`s-Exact Test) in der Frequenz von dic und cRing zwischen Kulturzeiten von 48 und 72h, nach 0,7 und 1,0 Gy wurden sign. Unter-schiede (Fisher`s-Exact Test) sowohl zwischen 48 und 72 h (p<0,01) als auch zwischen 56 und 72h (0,7 Gy: p<0,05; 1,0 Gy: p<0,01) beobachtet. In den Gesamt-gruppen weicht die Verteilung der dic und cRing von einer Poisson-Verteilung ab, sie zeigt eine sign. Überdispersion (u-Test, u>1,96) (Tab.13-17). In Einzelfällen zeigten sich nach allen Dosen aber auch Poisson-Verteilungen. Tab.18 zeigt die Anzahl aller beobachteten Aberrationen in Abhängigkeit von Kulturzeit und Dosis. Abb.4 zeigt die Dosis-Wirkungsbeziehungen für dic und cRing nach den unterschied-lichen Kulturzeiten von 48, 56 und 72h unter Berücksichtigung des laboreigenen Kontrollwertes. Die Koeffizienten der linear-quadratischen Funktionen (y = c + αD + βD2) sind folgende:


48h: 0,0005 (± 0,0001) + 0,5214 (± 0,0254) D + 0,0843 (± 0,0396) D2 56h: 0,0005 (± 0,0001) + 0,5575 (± 0,0261) D + 0,1013 (± 0,0407) D2 72h: 0,0005 (± 0,0001) + 0,5440 (± 0,0267) D + 0,2812 (± 0,0427) D2

Die Schwankungsbereiche in den Klammern geben jeweils den Standardfehler der Parameterschätzungen an. Der Replikationsindex (RI) vermindert sich mit der Höhe der Dosis und nähert sich dem Wert 1 an (Tab.19). Bei einer Betrachtung der Metaphasen in ersten, zweiten und weiteren Teilungen (Tab.20) zeigt sich, dass sich nach 48h mehr als 98% (98,5 – 100%) der Metaphasen in der ersten Teilungsphase befinden. Nach 56h befindet sich der Hauptteil (66,1 – 86,9%) der Metaphasen noch in der ersten Teilungsphase. Nach 72h befindet sich noch immer ein großer Teil der Metaphasen in der ersten Tei-lungsphase (47,6 – 65,7%; 34,3% nach 0,1 Gy), der Anteil der Zellen in der zweiten Teilungsphase liegt zwischen 26,7% und 42,3% (51,7% nach 0,1 Gy) und der Anteil der Zellen aus dritten und höheren Teilungsphasen liegt zwischen 6,0% und 14,1%. Nach Analyse der stark geschädigten Zellen zeigt sich, dass ihre Anzahl mit Dosis und Dauer der Kulturzeit ansteigt, nach 0,1 Gy, 0,3 Gy und 0,5 Gy sind die Unter-schiede aber nicht signifikant. Nach 0,7 und 1,0 Gy steigt die Anzahl der Cd Zellen und die der Cd2+ Zellen zwischen 48 und 72h Kulturdauer statistisch signifikant (p< 0,01) an, nach 1,0 Gy ist der Unterschied in der Anzahl der Cd2+ Zellen ebenfalls sig-nifikant (p< 0,01) erhöht. Dagegen bleibt die Anzahl der Zellen mit nur einer Aus-tauschaberration auch nach verlängerter Kulturdauer nahezu gleich. Zellen mit trizentrischen Chromosomen treten wie nach Röntgenbestrahlung bei allen Kulturzeiten und nach allen angewendeten Dosen auf. Tetrazentrische Chromoso-men werden dagegen nur nach 0,5, 0,7 und 1,0 Gy und nur nach 56 und 72h beob-achtet. Unter Berücksichtigung aller Dosen und einer Anzahl von 36.000 ausgewer-teten Metaphasen treten nach 48h Kulturdauer insgesamt 443 Zellen (1,2%) mit zwei oder mehr Austauschaberrationen (dic + cRing) auf, nach 56h finden sich 471 Zellen (1,3%), nach 72h 603 Zellen (1,7%). Ein signifikanter Unterschied besteht zwischen 48h und 72h (p< 0,01), sowie zwischen 56 und 72h (p< 0,01). Bei weiterer Eingren-zung auf Zellen mit drei Austauschaberrationen (dic + cRing) bleiben im Vergleich zur Röntgenstrahlung die signifikanten Unterschiede zwischen 48 und 72h (p< 0,01) und 56 und 72h (p<0,05) bestehen. Eine Verlängerung der Kulturdauer um acht Stunden erhöhte somit nicht die Anzahl der Zellen mit multiplen Aberrationen. Tat-sächlich treten die durch die Neutronenbestrahlung am stärksten geschädigten Zel-len erst nach 72h auf. Überzählige azentrische Fragmente (excess ace) steigen ab 0,5 Gy signifikant an: nach 0,5 Gy zwischen 48 und 56h (p<0,05) wie auch nach 48 und 72h (p< 0,01); nach 0,7 Gy zwischen 48 und 72h (P< 0,01); nach 1,0 Gy zwischen 48 und 56h (p<0,01) wie auch zwischen 48 und 72h (p< 0,01). Diskussion der Ergebnisse von AP1 und AP2 In verschiedenen Studien wird postuliert, dass locker ionisierende Strahlung wie Gamma- und Röntgenstrahlung, sowie Partikel bis zu einem LET von 30 keV/µm nur einen geringen Effekt auf den Zellzyklus haben (Nasonova und Ritter 2004), und dass bestrahlte Zellen entweder eine stabile Aberrationsfrequenz (Leonard und Decat 1979; Scott und Lyons 1979; v. Buul und Natarajan 1980; Ritter et al 2002)


aufzeigen oder nur einen leichten Anstieg mit verlängerter Dauer der Kulturzeit (Lloyd et al 1977; Ritter et al 1996; Anderson et al 2000; Nasanowa et al. 2000). Dicht ioni-sierende Strahlung (LET ≥ 100 keV/µm) dagegen zeigte drastische Zellzyklusstörun-gen und einen stärkeren Aberrationsanstieg mit einer Verlängerung der Kulturzeit (Anderson et al 2000, George et al 2001, Ritter et al 2002). Diese Unterschiede zwi-schen locker und dicht ionisierender Strahlung beruhen auf der Anordnung ihrer räumlichen Energiedeposition: Kennzeichen von locker ionisierender Strahlung ist ihre homogene Energieverteilung mit nur geringen Unterschieden in der Anzahl der Schäden pro Zelle, während nach dem Einwirken dicht ionisierender Strahlung eine inhomogene Energieverteilung vorliegt, mit dem Auftreten von ungeschädigten, ge-ring geschädigten und schwer geschädigten Zellpopulationen, wobei schwer ge-schädigte Zellen erst spät die Mitose erreichen. Eine Reihe von Studien wirft Zweifel an der Behauptung auf, dass Lymphozyten, unabhängig vom Zeitpunkt der Kultur-dauer, konsistente Aberrationsfrequenzen in ersten Metaphasen zeigen. Als mögli-che Erklärung werden zwei Subpopulationen von Lymphozyten diskutiert, die sich in Strahlensensitivität und Progressionsrate von der Stimulation bis zur Teilung unter-scheiden (Bender und Brewen 1969). Beek und Obe (1976) beschreiben höhere Aberrationsfrequenzen in frühen ersten Metaphasen im Gegensatz zu späten. Hoff-mann et al (2002) beobachten ansteigende Frequenzen von Chromosomenaberrati-onen in ersten Teilungsphasen von 48h über 70h bis hin zu 94h, wie auch Boei et al (1996) nach konventioneller Färbung und nach Anwendung der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechnik (FISH). Aber auch konsistente Aberrationsfrequenzen nach unterschiedlichen Kulturzeiten werden nach FISH beobachtet (Guerrero-Carbajal et al 1998). In der vorliegenden Studie ergeben sich nach Exposition der Lymphozyten mit Rönt-genstrahlen und Dosen von 2,0; 3,0 und 4,0 Gy sign. Unterschiede in der dic Fre-quenz zwischen Kulturzeiten von 48 und 72h. Nach Neutroneneinwirkung zeigt sich ebenfalls dieser Unterschied bei 0,1 Gy und bei den beiden höchsten angewendeten Dosen von 0,7 und 1,0 Gy, zusätzlich bei den zwei letztgenannten Dosen auch zwischen 56 und 72h. Der Hauptanstieg der Aberrationen findet nach Röntgenstrahleneinwirkung demnach zwischen 48 und 72h statt, während nach Neutronenexposition der Hauptanstieg erst nach 56h stattfindet. Neutronen verursachen demnach im Bereich der genannten Dosen eine stärkere Mitose-verzögerung als Röntgenstrahlen, und auch nach 56h ist das Ende dieser Verzöge-rung noch nicht erreicht. Diese stärkere Verzögerung durch Neutronen lässt sich auch aus den Daten der Verteilung der Metaphasen in den einzelnen Teilungspha-sen interpretieren. Nach Exposition zu Röntgenstrahlen übersteigt der Anteil zweiter Metaphasen den Anteil erster Metaphasen in 72h Kulturen, während nach Neutro-nenexposition der höchste Anteil von Lymphozyten in Metaphase sich auch nach 72h noch in der ersten Teilungsphase befindet. Wenn stark geschädigte Zellen für die Zellzyklusverzögerung verantwortlich sind, wie Lloyd et al. vermutet haben (Lloyd et al 1977), dann wäre eine größere Anzahl von Zellen mit multiplen Aberrationen unter den späten ersten Metaphasen nach 56h oder 72h als nach 48h-Kulturen zu erwarten. Die FISH-Daten von Hoffmann et al (2002) nach hohen Dosen von Röntgenstrahlen zeigen einen Trend in diese Rich-tung an, er ist dort aber statistisch nicht eindeutig belegbar. In der vorliegenden Stu-die steigt nach Röntgenstrahleneinwirkung die Anzahl stark geschädigter Zellen mit Dosis und Dauer der Kulturzeit an, erreicht aber nur in wenigen Fällen die statistische Signifikanz: nach 2,0 Gy erhöht sich die Anzahl von Cd2+ Zellen zwischen 56 und


72h, sowie die Anzahl von Cd Zellen zwischen 48 und 72h, wie auch zwischen 56 und 72h. Nach 4,0 Gy zeigt sich ein sign. Unterschied zwischen 48 und 72h in der Anzahl von Cd2+ Zellen. Dass nach 5,0 Gy kein sign. Unterschied auftritt, kann an der hohen Dosis liegen, mit der in diesem Fall alle hoch aberranten Zellen in der Mitose verzögert werden. Mit dem Anstieg der stark geschädigten Zellen bei verlängerter Kulturdauer steigt auch die Anzahl der Zellen mit nur einem dizentrischen Chromo-som, d. h. schwer geschädigte Zellen treten zwar später auf, verändern aber nicht das Verhältnis zu den weniger geschädigten Zellen. Hier zeigt sich die homogene Verteilung locker ionisierender Strahlung: es liegt eine Poisson-Verteilung der di-zentrischen und zentrischen Ringchromosomen vor. Nach Neutronenexposition nimmt die Anzahl stark geschädigter Zellen dagegen systematisch zu, sie steigt mit Dosis und Dauer der Kulturzeit an und signifikante Unterschiede werden bei den beiden höchsten Dosen von 0,7 und 1,0 Gy erreicht (Cd2+ Zellen zwischen 48 und 72h nach beiden Dosen; Cd Zellen zwischen 48 und 72h nach 0,7 Gy). Die Anzahl der Zellen mit nur einem dic bleibt auch nach verlän-gerter Kulturzeit hingegen relativ konstant, wie auch die Anzahl der ungeschädigten Zellen. Dieser Befund ist verantwortlich für die beobachtete Überdispersion, welche besagt, dass die Klassen mit mehreren Aberrationen und die ohne Aberrationen überrepräsentiert sind, die Klasse mit nur einer Aberration dagegen unterbesetzt ist. Nach einer Kulturzeit von 72h zeigen sich somit mehr Zellen mit multiplen Aberratio-nen als nach den kürzeren Kulturzeiten, d. h. die angewendete Neutronenstrahlung führt nach 0,7 und 1,0 Gy zu einer erheblichen Zellzyklusverzögerung aufgrund der stark geschädigten Zellen. Tetrazentrische Chromosomen treten nur nach 0,5; 0,7 und 1,0 Gy Neutronenbe-strahlung auf und nur nach 56 und 72h, während sie nach Röntgenbestrahlung auch nur nach den höchsten Dosen auftreten, aber hier nach allen Kulturzeiten. Diese Be-obachtung ist ein erwartetes Indiz für die Energieverteilung locker ionisierender Strahlung auf Zellen, die eine gleichmäßige Aberrationsverteilung innerhalb der ex-ponierten Zellpopulation zur Folge hat (Ritter et al 2002). Unter Berücksichtigung aller Dosen und aller Kulturzeiten verursacht die Neutronen-exposition signifikante Unterschiede in der Anzahl von Cd2+ Zellen sowie von Cd3+ Zellen zwischen 48 und 72h Kulturdauert, wie auch zwischen 56 und 72h. Auch nach Röntgenstrahlen unterscheiden sich Cd2+ Zellen signifikant zwischen 48 und 72h, sowie zwischen 56 und 72h, Cd3+ Zellen dagegen nur zwischen 48 und 72h. Diese Beobachtungen zeigen, dass Neutronen eine stärkere Zellzyklusverzögerung verur-sachen als Röntgenstrahlung, und dass insbesondere stark geschädigte Zellen nach Neutronenexposition bis zu 72h benötigen, um in der ersten Metaphase sichtbar zu werden. Da der durch Hoch-LET induzierte initiale molekulare Schaden qualitativ verschieden ist von den Schäden, die nach Nieder-LET Strahlen auftreten, und auch schwieriger und langsamer zu reparieren ist (Peak et al.; 1991 Loucas und Geard 1994; Ritter et al 1996), hängt die Dauer der Verzögerung hier vom LET der Neutro-nen wie auch von der Art und der Anzahl der strahleninduzierten Austauschaberrati-onen pro Zelle und von der Dosis ab. Das Verbleiben von schwer geschädigten Zel-len in der G2-Phase wird als Hauptgrund für einen verzögerten Mitoseeintritt gese-hen, diese Vermutung konnte mit der Methode der chemisch induzierten „Premature Chromosome Condensation“ (PCC) bestätigt werden (Durante et al 1999, Ritter 2002). Der Einfluss von Zelltod auf die Aberrationsfrequenz kann aber nicht ausge-schlossen werden (Lloyd et al 1977). So kann der Befund aus der vorliegenden Stu-


die, dass nach 5,0 Gy Röntgenbestrahlung kein sign. Unterschied in der Frequenz stark geschädigter Zellen nach den einzelnen Kulturzeiten auftrat, auch als Zelltod nach der höchsten angewendeten Röntgendosis interpretiert werden. In den PCC Untersuchungen war 4,0 Gy Röntgenstrahlung die höchste Dosis, die appliziert wurde. Der durch Hoch-LET Strahlung wie Neutronen oder Partikel induzierte qualitative Schaden in der Zelle beeinflusst somit das zeitliche Verhalten dieser Zelle im Zell-zyklus und damit die Bestimmung der Relativen Biologischen Wirksamkeit (RBW) für diese zytogenetischen Endpunkte. Es könnte zu einer Unterschätzung des strahlen-induzierten Schadens kommen, wenn nach Standardprotokoll Metaphasen in der Regel nach 48h Kulturdauer ausgewertet werden (George et al 2001, Nasonova und Ritter 2004). Ritter et al (1996) plädieren für unterschiedliche Kulturzeiten nach Ex-position von Hoch-LET Strahlen, um das gesamte Schadensspektrum zu erfassen. Die Daten der vorliegenden Studie zeigen eine deutliche Mitoseverzögerung nach Exposition mit hohen Dosen Röntgenstrahlung und Neutronen, wobei sich die Qua-lität dieser Verzögerung zwischen den beiden Strahlenarten unterscheidet: nach Röntgenexposition steigt die Anzahl unterschiedlich aberranter Zellen mit Dauer der Kulturzeit an, wohingegen nach Neutronenexposition die beobachtete Mitoseverzögerung von Art und Anzahl der Aberrationen pro Zelle abhängig ist. Diese Beobachtung geht einher mit dem unterschiedlichen LET (hier: Röntgenstrah-len: 1,7 keV/µm; Neutronen: mittleres LET ca. 40 keV/µm) der verwendeten Strah-lenarten, sowie der Höhe der Dosis. Selbst im gewählten Dosisspektrum <= 1,0 Gy induzieren Neutronen eine verzögerte Mitose, wenn die Ergebnisse mit der appli-zierten Röntgenstrahlung verglichen werden. Im vorliegenden Experiment übersteigt die niedrigste Röntgendosis die kleinste Neutronendosis um den Faktor 10. Verlän-gerte Kulturzeiten nach Partikelbestrahlung mit einem LET bis zu 30 keV/µm zeigten nur einen minimalen Effekt auf die Aberrationsrate (Nasonova und Ritter 2004), Neut-ronen mit einem mittleren LET von ca. 40 keV/µm (wie hier verwendet) hingegen be-einflussen signifikant den Zellzyklus geschädigter Lymphozyten. Überzählige azentrische Fragmente steigen nach Röntgen- und Neutronenexposition nach den drei jeweils höchsten Dosen zwischen den einzelnen Kulturzeiten signifi-kant an. Es gibt keinen Hinweis darauf, dass Neutronen im Vergleich zur Röntgen-strahlung signifikant mehr azentrische Fragmente induzieren, zumindest nicht in dem gewählten Dosisbereich. Dosis-Wirkungskurven bilden die Grundlage für Dosisabschätzungen nach einer er-littenen Strahlendosis. Die hier erhobenen Daten bestätigen für beide Strahlenarten ein linear-quadratisches Dosismodell. Abhängig von den Koeffizienten der jeweiligen Dosis-Wirkungskurve, die auf der Dauer der unterschiedlichen Kulturzeiten basiert, ergibt eine bestimmte dic Frequenz nach Röntgenexposition drei Dosen, deren Kon-fidenzintervalle sich aber überlappen. Daraus kann gefolgert werden, dass eine Do-sis-Wirkungskurve, etabliert nach 48h Kulturdauer, auch im hohen Dosisbereich noch verlässliche Dosisabschätzungen erlaubt. Auch nach Neutronenexposition überlap-pen sich die Konfidenzintervalle der berechneten Dosen, so dass auch hier eine Empfehlung für die 48h Kulturdauer ausgesprochen werden kann. Dosen werden dagegen überschätzt, wenn Aberrationsfrequenzen mit Dosis-Wirkungskurven vergli-chen werden, die nach Standardkulturzeiten erzeugt wurden. Dosisabschätzungen


sollten somit generell nur mit Dosis-Wirkungskurven durchgeführt werden, die unter gleichen Bedingungen erhoben wurden. AP3: Simulation von Teilkörperbestrahlungen mit locker ionisierender Strah-lung Im Folgenden werden die Gesamtergebnisse beider Probanden beschrieben. Es erfolgte ein dosisabhängiger Anstieg der Frequenzen von dic und cRing (Tab. 21-25; Abb. 5-7) bis auf eine Ausnahme: beim Mischungsverhältnis 25% und einer Kul-turzeit von 48h erfolgte der dosisabhängige Anstieg bis 4,0 Gy, bei 5,0 Gy lag die Frequenz unter der von 4,0 Gy. Größtenteils erfolgte ein Anstieg der dic Frequenzen mit Dauer der Kulturzeit, in den übrigen wenigen Fällen kam es zu Schwankungen, so zeigten sich beispielsweise Abfälle nach 56 und 72h im Vergleich zu 48h oder 56h. Im Einzelnen: - 1,0 Gy Röntgenbestrahlung: 50%: sign. Unterschied zwischen 48 und 56h (p< 0,05) - 2,0 Gy Röntgenbestrahlung: 50%: sign. Unterschied zwischen 48 und 56h (p<0,01) und 48 und 72h (p=0,05) 75%: sign. Unterschied zwischen 48 und 56h (p<0,05) und 48 und 72h (p<0,01) - 3,0 Gy Röntgenbestrahlung: 25%: sign Unterschied zwischen 48 und 72h (p<0,01) und 56 und 72h (p<0,01) 50%: sign. Unterschied zwischen 48 und 72h (p<0,01) und 56 und 72h (p<0,01) 75%: sign. Unterschied zwischen 48 und 72h (p<0,01) und 56 und 72h (p<0,05) 4,0 Gy Röntgenbestrahlung: 25%: sign. Unterschied zwischen 48 und 72h (p<0,01) und 56 und 72h (p<0,01) 50%: sign. Unterschied zwischen 48 und 72h (p<0,01) und 56 und 72h (p<0,01), sowie zwischen 48 und 56h (p<0,05) 75%: sign. Unterschied zwischen 48 und 72h (p<0,01) und 56 und 72h (p<0,01) 5,0 Gy Röntgenbestrahlung: 25%: sign. Unterschied zwischen 48 und 72h (p<0,01) und 56 und 72h (p<0,01), sowie zwischen 48 und 56h (p<0,01) 50%: sign. Unterschied zwischen 48 und 72h (p<0,01) und 56 und 72h (p<0,01) 75%: sign. Unterschied zwischen 48 und 72h (p<0,01) und 56 und 72h (p<0,01), sowie zwischen 48 und 56h (p<0,05) Die Tabellen 26-30 zeigen alle ausgewerteten Chromosomenaberrationen pro Zeit-einheit und Mischungsverhältnis. Verteilung der dizentrischen Chromosomen: In den Gesamtergebnissen der beiden Probanden weicht die Verteilung der dic und cRing von einer Poisson-Verteilung ab, sie zeigt eine sign. Überdispersion an (u-Test u>1,96; Tab. 31-35). Lediglich in vier Einzelfällen (3mal nach 1,0 Gy, 1mal nach 2,0 Gy) ist die Überdispersion nicht sign., in einem Fall (nach 1,0 Gy) liegt eine Poisson-Verteilung vor. Replikationsindex (RI) Der RI (Tab. 36-40) steigt mit Dauer der Kulturzeit, d.h. je länger die Kulturzeit, desto mehr 2., 3. oder höhere Zellteilungen haben stattgefunden. Je höher die Dosis, desto mehr Metaphasen befinden sich nach 48h in der ersten Teilungsphase (80 % nach 1,0 Gy bis zu 99,3% nach 5,0 Gy). Nach 56h ist der Hauptanteil der Metaphasen der


ersten Teilungsphase (54 – 83,8%) arretiert. Nach 72h zeigt sich kein eindeutiges Bild: zweite und dritte Metaphasen nehmen von 1,0 bis 3,0 Gy kontinuierlich ab, steigen nach 4,0 oder 5,0 Gy aber wieder an (Tab. 41-45). Dieses inkonsistente Bild könnte am ehesten eine Folge der unterschiedlichen Bestrahlungstermine sein, bei denen das Proliferationsverhalten der Zellen beider Probanden stark variierte. AP4: Simulation von Teilkörperbestrahlungen mit dicht ionisierender Strahlung Im Folgenden werden die Gesamtergebnisse beider Probanden beschrieben. Es erfolgte ein dosisabhängiger Anstieg der Frequenzen von dic und cRing (Tab. 46-50; Abb. 8-10) in Abhängigkeit vom Mischungsverhältnis, je höher der Anteil be-strahlter Zellen, desto höher die Aberrationsrate (eine Ausnahme: 0,1 Gy, 48 h, Mi-schungsverhältnis 50%: die Frequenz liegt bei 50% bestrahlten Zellen niedriger als bei 25%, der Unterschied ist aber nicht signifikant). Ein Anstieg der dic und cRing Frequenzen mit Dauer der Kulturzeit konnte in der Mehrzahl der Fälle beobachtet werden, in zwei Fällen lag die Frequenz nach 72h niedriger als nach 56h, in einem Fall nach 72h niedriger als nach 48h und einmal nach 56h niedriger als nach 48h. Im Einzelnen: - 0,1 Gy Neutronen 25%: sign. Unterschied zwischen 48 und 56h (p< 0,05) und 72 und 56h (p< 0,05), aber: Frequenz nach 56h höher als nach 72h 50%: sign. Unterschied zwischen 48 und 56h (p< 0,01) und 48 und 72h (p< 0,01) 75%: sign. Unterschied zwischen 56 und 72h (p<0,01) - 0,3 Gy Neutronen 25%: sign. Unterschied zwischen 48 und 72h (p< 0,01) 50%: sign. Unterschied zwischen 48 und 72h (p< 0,01) und 56 und 72h (p< 0,05) 75%: sign. Unterschied zwischen 48 und 72h (p< 0,05) - 0,5 Gy Neutronen 25%: sign. Unterschied zwischen 72 und 56h (p< 0,05), aber: Frequenz nach 56h höher als nach 72h 50%: sign. Unterschied zwischen 48 und 72h (p= 0,01) 75%: sign. Unterschied zwischen 48 und 72h (p< 0,01) - 0,7 Gy Neutronen 25%: sign. Unterschied zwischen 48 und 56h (p<0,01) 50%: sign. Unterschied zwischen 48 und 56h (p< 0,01) und 48 und 72h (p< 0,01) 75%: sign. Unterschied zwischen 48 und 72h (p< 0,01) - 1,0 Gy Neutronen 25%: keine sign. Unterschiede zwischen den einzelnen Kulturzeiten 50%: sign. Unterschied zwischen 48 und 56h (p< 0,05) und 48 und 72h (p< 0,05) 75%: sign. Unterschied zwischen 48 und 72h (p< 0,01) Die Tabellen 51-55 zeigen alle beobachteten Chromosomenaberrationen pro Zeit-einheit und Mischungsverhältnis. Verteilung der dizentrischen Chromosomen: In den Gesamtergebnissen der beiden Probanden weicht die Verteilung der dic und cRing von einer Poisson-Verteilung ab, sie zeigt eine signifikante Überdispersion an (u-Test u>1,96) (Tab. 56-60). Lediglich in einem Einzelfall ist die Überdispersion nicht signifikant (1,0 Gy, 75%), zweimal liegt eine nicht signifikante Unterdispersion vor (0,1 Gy, 50% und 0,3 Gy, 25%).


Replikationsindex (RI): Der RI (Tab. 61-65) steigt mit Dauer der Kulturzeit, d.h. je länger die Kulturzeit, desto mehr 2., 3. oder mehr Zellteilungen haben stattgefunden. Nach Dosen von 0,1, 0,3 und 0,5 Gy sind die RIs der einzelnen Mischungsverhältnisse vergleichbar. Nach Do-sen von 0,7 und 1,0 Gy fällt der RI in Abhängigkeit vom Mischungsverhältnis: je mehr bestrahlte Zellen, desto niedriger ist der RI. Nach 48h Kulturzeit befindet sich der Hauptanteil der Metaphasen in der ersten Tei-lungsphase (87,0 – 97,5%), wie auch nach 56h (54,5 – 74,8%). Nach 72h und Dosen von 0,1, 0,3 und 0,5 Gy befindet sich der Hauptanteil der Metaphasen immer noch in der ersten Teilungsphase (44,5 – 53,3%), nach Dosen von 0,7 und 1,0 Gy überwie-gen die Metaphasen aus der zweiten Teilungsphase (37,7 – 55,8%) (Tab. 66-70). Die letztgenannten Dosen wurden aber an einem anderen Termin appliziert, so dass hier am ehesten von einem unterschiedlichen Replikationsverhalten auszugehen ist. Diskussion der Ergebnisse von AP3 und AP4 Die Interpretation von Chromosomenschäden nach einer Teilkörperbestrahlung ist ungleich komplizierter als nach einer Ganzkörperbestrahlung, da aufgrund der Blut-zirkulation im Körper im peripheren Blut eine Population von bestrahlten und unbe-strahlten Lymphozyten vorliegt. Sharpe hat in Mischkulturen von bestrahlten und unbestrahlten Lymphozyten bereits 1969 gezeigt, dass ionisierende Strahlung zu einem selektiven Verlust von Lymphozyten führt, den die Autorin auf Interphasetod oder einen verzögerten Mitoseeintritt zurückführte (Sharpe 1969). Lloyd et al (1973) wiesen nach, dass bestrahlte Zellen im Vergleich zu unbestrahlten Zellen in Kultur weniger gut transformieren oder überleben, und dass sich dieser Effekt besonders deutlich nach hohen Dosen zeigt. Bei einer gleichmäßigen Überlebensrate von glei-chen Teilen bestrahlter und unbestrahlter Zellen wäre das Verhältnis der dic-Fre-quenzen von gemischter Probe zu rein bestrahlter Probe 50%. Tatsächlich beträgt das Verhältnis 45% bei 0,5 Gy und fällt bis auf 5% bei 7,0 Gy (Lloyd et al 1973) nach 48h Kulturzeit. Auf die vorliegende Studie übertragen, würden bei den unterschiedli-chen Mischungen Verhältnisse von 25%, 50% und 75% erwartet. Nach Röntgenex-position wird der Erwartungswert von 25% nach einer applizierten Dosis von 1,0 Gy und 72h Kulturdauer einmalig erreicht, er fällt bei allen anderen applizierten Dosen und Kulturzeiten ab bis 6,4 % (5,0 Gy; 48h). 50% wird einmal erreicht (4,0 Gy 72h), einmal überschritten (52,6%; 1,0 Gy; 56h), und fällt ab bis auf 27,0% (5,0 Gy; 48h). 75% werden bis auf 5,0 Gy nach allen Dosen und 72h Kulturzeit überschritten, nach 2,0 Gy auch nach 56h Kulturzeit. Der Wert fällt bis auf 39% nach 5,0 Gy und 48h Kulturdauer. Die realen Verhältnisse werden bei 1,0 und 2,0 Gy nach 56h Kultur-dauer am ehesten erreicht, bei 3,0; 4,0 und 5,0 Gy nach 72h Kulturdauer. Nach Neutronenexposition fallen die Erwartungswerte ab 0,5 Gy (bei 25% Erwar-tungswert bis auf 14,6% nach 0,7 Gy und 48h; bei 50% bis auf 26,2% nach 0,1 Gy und 48h; bei 75% bis auf 52,3% nach 0,1 Gy und 56h), nach 0,1 und 0,3 Gy liegen die beobachteten Werte z. T. über den Erwartungswerten, allerdings erst nach 56 oder 72h Kulturdauer (bei 25% bis zu 40,3% nach 0,1 Gy und 56h; .bei 50% bis zu 67,9% nach 0,3 Gy und 72h; bei 75% bis zu 89,7% nach 0,1 Gy und 72h). Annä-hernd reale Verhältnisse werden bei allen Dosen nach 56 oder 72h erreicht. Diese Werte zeigen, dass nach Teilkörperbestrahlungen mit hohen Dosen locker (hier ab 2,0 Gy) und dicht ionisierender (hier ab 0,5 Gy) Strahlung es in Abhängigkeit von dem bestrahlten Volumen und der Dosis zu teilweise drastischen Zellzyklusverzöge-


rungen der bestrahlten Zellen kommt: je kleiner das bestrahlte Volumen, desto höher der Selektionsvorteil der unbestrahlten Zellen. In diesem Experiment waren signifikante Anstiege von dic und cRing mit Dauer der Kulturzeit zu beobachten: nach Röntgenexposition ab 3,0 Gy bei allen Mischungs-verhältnissen und Kulturzeiten, insbesondere zwischen 48 und 72h Kulturzeit, sowie zwischen 56 und 72h. Nach 1,0 und 2,0 Gy sind einzelne sign. Unterschiede vor al-lem zwischen 48 und 56h und 48 und 72h zu beobachten. Hieraus lässt sich schlie-ßen, dass nach 1,0 und 2,0 Gy die Mitoseverzögerung bereits nach 56h abgeschlos-sen ist, während nach 3,0; 4,0 und 5,0 Gy die Verzögerung darüber hinaus anhält. Diese Schlussfolgerung deckt sich mit der oben beschriebenen Beobachtung, dass eine Übereinstimmung der beobachteten Aberrationsraten mit den realen Mi-schungsverhältnissen bei 1,0 und 2,0 Gy nach 56h erreicht wird und bei den drei hö-heren Dosen nach 72h. Nach Neutronenexposition lassen sich signifikante Unter-schiede zwischen den Kulturzeiten bei allen Mischungsverhältnissen und nach allen Dosen beobachten, sie erfolgen aber unsystematisch. Auffallend ist, dass nach Röntgenexposition beim Mischungsverhältnis 25% und einer Kulturzeit von 48h der dosisabhängige Anstieg von dic und cRing bis 4,0 Gy erfolgt, bei 5,0 Gy liegt die dic-Frequenz unter der von 4,0 Gy. Nach Exposition mit der höchsten Neutronendosis und einem Mischungsverhältnis von 25% lassen sich keine signifikanten Unter-schiede in der dic-Frequenz nach den unterschiedlichen Kulturzeiten feststellen, die Anzahl der dic steigt nur gering an. Nach den höchsten Dosen der hier angewende-ten locker (5,0 Gy) und dicht (1,0 Gy) ionisierenden Strahlung und einem Mischungs-verhältnis mit einer 25%igen Fraktion bestrahlter Zellen kommt es zu den größten Störungen im Zellzyklus. Hier zeigt sich deutlich der Selektionsvorteil unbestrahlter Zellen, wie auch der Einfluss der höchsten applizierten Dosen auf den verzögerten Mitoseeintritt von geschädigten Lymphozyten. Bei Analyse der stark geschädigten Zellen ergibt sich, dass bei Dosen von 3,0 – 5,0 Gy Röntgenstrahlung sich die Frequenzen von Cd Zellen, Cd2+ Zellen und Cd3+ Zellen nach Kulturzeiten von 48h und 72h, häufig auch von 56h und 72h signifikant unter-scheiden. Im Gegensatz dazu stehen die Daten aus den Neutronenexpositionen: nur in Ausnahmefällen zeigen sich, unsystematisch, signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Kulturzeiten. Diese Unsystematik nach Neutronenbestrahlung lässt sich durch die inhomogene Energieverteilung erklären, welche das Aberrationsspekt-rum stark beeinflusst: vereinzelte hoch aberrante Zellen treten ungleichmäßig in allen Mischungsfraktionen auf. Wenn diese Zellen auch in den 48h-Kulturen vorhanden wären, könnten diese aufgrund der Mitoseverzögerung gegebenenfalls nicht expri-miert werden. Die Verteilung der dic und cRing zeigt nach simulierten Teilkörperexpositionen von Röntgenstrahlen und Neutronen in den Gesamtergebnissen erwartungsgemäß eine sign. Überdispersion: u>1,96. Bei großen Anteilen unbestrahlten Bluts und hohen Dosen steigt der Wert u als statistischer Messpapameter für eine Überdispersion systematisch an (Fabry et al 1988; Poncelet et al 1988; Sreedevi et al 2001). Ver-mutet wird ein selektiver Verlust geschädigter Zellen durch Interphasetod oder ver-zögerten Mitoseeintritt. In der vorliegenden Studie steigt nach Röntgenbestrahlung der u-Wert ebenfalls kontinuierlich an. Dabei ergeben sich die höchsten Werte bei Mischkulturen mit der geringsten bestrahlten Fraktion (25%) und den höchsten an-gewendeten Dosen. Dieser Befund ist durch die „Verdünnung“ der hoch exponierten und dementsprechend viele Aberrationen tragenden Subfraktion innerhalb der


Mischprobe erklärbar und entspricht somit genau der Erwartung. Mit Hilfe der FISH-Analyse konnte eine Überdispersion nur nach hohen Dosen Röntgenstrahlung und kleinen Anteilen bestrahlter Zellen erkannt werden (Duran et al 2002). Es hätten we-sentlich mehr Zellen ausgewertet werden müssen als bei Anwendung der konventio-nellen Methode. Die Analyse von dic und cRing bei gleichzeitiger FPG-Färbung ist somit am besten geeignet, um Teilkörper Expositionen nach Einwirkung von Rönt-genstrahlen zu erkennen. Nach Neutronenexposition zeigt sich dagegen kein eindeutiges Bild. Die höchsten u-Werte werden zwar auch bei kleinster bestrahlter Blutfraktion und den höchsten Dosen beobachtet, es erfolgt aber kein systematischer Anstieg. Hohe u-Werte kön-nen auch bei größer bestrahlten Fraktionen und bei niedrigeren Dosen berechnet werden. Im Gegensatz zur Ganzkörpersimulation mit einer Poisson-verteilten dic Frequenz können Teilkörperexpositionen mit Röntgenstrahlen hier deutlich erkannt werden. Weniger eindeutig wird es dagegen nach einer Teilkörperexposition mit Neutronen, denn Neutronen verursachen auch nach Ganzkörperexposition zum überwiegenden Teil bereits eine Überdispersion aufgrund der inhomogenen Energie- und daraus re-sultierenden dic Verteilung. Danksagung Die Autoren bedanken sich bei Frau H. Schröder für die Blutabnahmen und für wert-volle Diskussionsbeiträge; bei BTA L. Röhrs für die unverzichtbare Hilfe im Labor und am Mikroskop; bei Frau E. Eggestein und den Operateuren der PTB H. Eggestein, O. Döhr, T. Heldt, M. Hoffmann für die Neutronenbestrahlungen.


2. Darstellung des voraussichtlichen Nutzens, insbesondere der Verwertbarkeit des Ergebnisses Bereitstellung von Dosiswirkungsbeziehungen nach hohen Dosen locker und dicht ionisierender Strahlung und Vergleichswerten für ein Netzwerk Biologische Dosi-metrie; Genauere Kenntnis der Lymphozytenkinetik nach Einwirken von hohen Dosen locker und dicht ionisierender Strahlung und nach Anwendung unterschiedlicher Kulturzei-ten; Genauere Kenntnis der Lymphozytenkinetik bei simulierter Teilkörperbestrahlung nach Einwirkung von hohen Dosen locker und dicht ionisierender Strahlung und nach Anwendung unterschiedlicher Kulturzeiten. Die in diesem Projekt gewonnenen systematischen Parameter erlauben eine präzi-sere Planung der experimentellen Randbedingungen (insbesondere der Kulturzeit) von retrospektiven Dosisermittlungen in Abhängigkeit von den Bestrahlungsbedin-gungen (Strahlenart, Expositionsdosis, Anteil des exponierten Körpervolumens). Die Validität und die Präzision der quantitativen zytogenetischen Analyse als Biologische Dosimetrie wird dadurch erhöht und die Interpretation stattgehabter Bestrahlungser-eignisse und ihrer radiologischen Folgen entsprechend verbessert. Es ist zu überlegen, ob nach Teilkörperexposition Chromosomenaberrationsanalysen zusätzlich auch nach verlängerten Kulturzeiten erfolgen sollten, insbesondere nach hohen Dosen und kleinen bestrahlten Fraktionen. Hier könnte eine gemeinsame Konvention für ein Standardprotokoll getroffen werden. 3. Darstellung des während der Durchführung des FE-Vorhabens dem AN be-kannt gewordenen Fortschritts auf dem Gebiet des Vorhabens bei anderen Stellen Studien zur Mitoseverzögerung finden an der GSI (Gesellschaft für Schwerionenfor-schung) in Darmstadt statt. Nach Experimenten mit V79 Chinesischen Hamsterzellen wird dort inzwischen der Einfluss von niederenergetischen Schwerionen mit hohem LET auf das Mitoseverhalten von Lymphozyten untersucht. Es zeigte sich, dass die Aberrationsfrequenzen in Metaphasen aus ersten Teilungen mit verlängerter Kultur-zeit drastisch ansteigen, und dass dieser Effekt abhängig ist vom LET der einge-setzten Schwerionen (Nasonova und Ritter 2004). 4. Darstellung der geplanten Veröffentlichungen des FE-Ergebnisses nach §20 - In internationaler Fachzeitschrift, z.B., International Journal of Radiation Biology - Im Jahresbericht des BfS - Im Jahresbericht der PTB - Präsentation auf nationaler/internationaler Tagung, z.B. Jahrestagung der Gesell-

schaft für Strahlenbiologie


III. Anlage: Erfolgskontrollbericht 1. Beitrag des Ergebnisses zu den förderpolitischen Zielen Diese Studie ist ein Beitrag zur Grundlagenforschung der angewendeten Biologi-schen Dosimetrie. Die Ergebnisse sollten in Empfehlungen zur praktischen Durchfüh-rung der Biologischen Dosimetrie umgesetzt werden, insbesondere im Rahmen der retrospektiven Dosisbestimmung bei potentiell strahlengeschädigten Personen mit Teilkörperexposition. Hier ist vor allem ein Netzwerk Biologische Dosimetrie gefor-dert, aber auch die regionalen Strahlenschutzzentren, und Labore, die individuelle Begutachtungen von exponierten Personen vornehmen. 2. Das wissenschaftlich-technische Ergebnis des FE-Vorhabens, die erreichten Nebenergebnisse und die gesammelten wesentlichen Erfahrungen Das vorgegebene Programm konnte bewältigt werden. Von den in mehreren Berei-chen erzielten Ergebnissen sind insbesondere die Neutronendaten aus den Teilkör-per Experimenten von Bedeutung, da bislang derartige Untersuchungen unserer Kenntnis nach international noch nicht durchgeführt wurden. Nebenergebnisse, wie die Ermittlung des RI, konnten zur Interpretation der Daten mit herangezogen wer-den. Wesentliche Erfahrung im praktischen Bereich: hohe Dosen ionisierender Strahlung und Kulturzeiten von 48h erfordern aufgrund der Mitoseverzögerung eine hohe An-zahl von Zellkulturen, um für die Auswertung eine nach statistischen Gesichtspunk-ten ausreichende Metaphasenzahl zu erreichen. 3. Erfindungen, Schutzrechtsanmeldungen entfällt 4. Wirtschaftliche Erfolgsaussichten entfällt 5. Wissenschaftliche und/oder technische Erfolgsaussichten Umsetzung in Empfehlungen zur praktischen Durchführung der Biologischen Dosi-metrie, z. B. im Rahmen der retrospektiven Dosisbestimmung bei vermuteter Über-exposition im beruflichen, medizinisch-diagnostischen oder medizinisch-therapeuti-schen Bereich. Adressaten wären z. B. die regionalen Strahlenschutzzentren, aber auch Labore, die individuelle Begutachtungen von exponierten Personen vornehmen. 6. Wissenschaftliche Anschlussfähigkeit für eine mögliche notwendige nächste Phase bzw. die nächsten innovatorischen Schritte Ergänzung der Röntgen-Dosiswirkungskurven um Dosen < 1,0 Gy, um den RBW der angewendeten Neutronenstrahlung zu ermitteln und um zu klären, ob es zu einer Un-terschätzung der RBW kommt, wenn nach Standardprotokoll Metaphasen nach 48h Kulturdauer ausgewertet werden.


Weiterführung der Teilkörperversuche mit Neutronen mit höherem LET und zusätz-lich niedrigeren Dosen. Hier könnten Aussagen getroffen werden, inwieweit die Mito-severzögerung abhängig ist von der Höhe der Dosis oder eher vom LET. 7. Arbeiten, die zu keiner Lösung geführt haben hat es nicht gegeben 8. Präsentationsmöglichkeiten für mögliche Nutzer, z. B. Anwenderkonferenze Neben dem Transfer der wissenschaftlichen Erkenntnisse und technischen Innovati-onen im Forschungskontext wird empfohlen, die Ergebnisse dieses Projektes in all-gemeine Empfehlungen zum Vorgehen bei der retrospektiven Dosisermittlung durch die Biologische Dosimetrie einfließen zu lassen. Voraussetzung wäre ein Erfah-rungsaustausch mit den bestehenden bzw. geplanten nationalen und internationalen Netzwerken für zytogenetische Methoden in der Strahlenbiologie und Strahlenmedi-zin und die Einleitung eines Konsensusprozesses mit den dort beteiligten Experten und Institutionen, (z. B. GSI in Darmstadt oder NET-EULEP = europäisches radio-biologisches Netzwerk). 9. die Einhaltung der Kosten- und Zeitplanung Kosten- und Zeitplan konnten im Wesentlichen eingehalten werden. Ein Teil des Ar-beitspaketes 1 konnte nicht im vorgegebenen Zeitrahmen abgeschlossen werden. Nach Rücksprachen mit den Auftraggebern wurde dieses im Zeitbudget des Arbeits-paketes 3 zusätzlich bearbeitet. Die Abgabe des Abschlußberichtes verzögerte sich um einige Wochen u. a. aufgrund einer unvorhergesehenen langfristigen Erkrankung einer Mitarbeiterin.

Beeinflussung der Ergebnisse der biologischen Dosimetrie ... fileBMU – 2005-670 „Beeinflussung...

Documents

Transcript of Beeinflussung der Ergebnisse der biologischen Dosimetrie ... fileBMU – 2005-670 „Beeinflussung...