Bio4-Kurs- Vorbesprechung zum Versuch Isolierung und ... · Genetische Identifizierung von...

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Genetische Identifizierung von Stoffwechselenzymen Vorbesprechung TAG 2 Bio4-Kurs- Vorbesprechung zum Versuch Isolierung und Charakterisierung von Mutanten Versuch6Tag2.pdf

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Genetische Identifizierung von Stoffwechselenzymen

Vorbesprechung TAG 2

Bio4-Kurs- Vorbesprechung zum Versuch Isolierung

und Charakterisierung von Mutanten

Versuch6Tag2.pdf

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Die Logik der genetischen Methode:

Was braucht man um DNA zu Reparieren?

Isolierung von Mutanten, die nicht, oder schlecht reparieren

z.B. als Mutanten, die UV-sensitiv sind.

Charakterisierung der Mutanten Isolieren des betroffenen Gens mit Hilfe der Mutante z.B. durch genetische Kartierung des betroffenen Genortes z.B. durch funktionelle Komplementation (Genbank)

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Methoden, die man dazu benutzen kann: 1.  Mutagenese 2.  Mutantenisolierung 3.  Komplementationsanalysen

4.  Selektion der wt-Allele aus einer Genbank, falls funktionelle Komplementaion möglich ist, z.B. bei Mikroorganismen.

5. Sequenzieren des isolierten Plasmids (machen wir nicht)

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Beispiel:

Frage:

Wie viele Enzyme braucht die Bäckerhefe, um Tryptophan zu synthetisieren?

Experiment: Isolierung von Tryptophan bedürftigen Mutanten und ihre Analyse

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Tryptophan bedürftige Mutanten der Hefe

reiches, Vollmedium synthetisches Mangelmedium ohne Tryptophan

trp-

Mutagenese mit mutagenen Substanzen (Beispiel: Alkylierende Substanzen)

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Dies ist, je nachdem wieviele Mutanten den gesuchten Phänotyp haben, aufwändig

Ausweg: positive Selektion von Mutanten

Hypothese: 5-Fluoranthranilat resistene Mutanten

könnten Tryptophan bedürftig sei.

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How can this be?

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Chorismat

Tryptophan

Shikimat ARO1-4

PEP Erythrose-4-P

?

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Tyrosin

Phenylalanin

Anthranilat

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Chorismat

Tryptophan

Shikimat ARO1-4

PEP Erythrose-4-P

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Tyrosin

Phenylalanin

Anthranilat

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5- FAA (5-Fluoranthranilat)=

2-Amino- 5- Fluor-Benzoesäure

ein Vertreter einer Klasse von Substanzen die als Antimetaboliten bezeichnet werden.

Substanzen, die als Derivate natürlicher Metaboliten durch ihre Verwertung

den Stoffwechsel inhibieren. Ein klassisches Beispiel:

Antifolate

COOH

NH2

F wie könnte diese Substanz wirken?

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5- Fluoruracil

Es entsteht ein Suizidsubstrat (Fluordesoxyuridylat), das zur irreversiblen Hemmung der Thymidylatsynthase führt.

Ein Beispiel für die Entstehung toxischer Metabolite:

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Diese Frau hat als erste Drogen hergestellt, die als Antimetabolite (z.b.Antifolate) in den DNA Stoffwechsel eingreifen

Mit ihrem Namen sind so wichtige Dinge verbunden wie die Behandlung der Symptome übermäßigen Kalbsthymus Genusses (Allopurinol). Wer ist es und was waren ihre wichtigsten Entdeckungen?

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Induktion von Mutationen durch Alkylierung von Basen

C2H5-O-S-CH3

O

O EMS

Wie macht man das?

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FAA synthetisches Medium mit 5-Fluoroanthranilat

YEPD Vollmedium

Ausplattieren: 100 µL

(Bei mutagenisierten Zellen zusätzlich 1:3 Verdünnung) 100 µL einer 1:1000 Verdünnung

Warum bekommen verschiede Gruppen verschiedene Stämme?

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Wie kommt man von einer Sammlung Trp-bedürftiger Mutanten zur Anzahl von Enzymen (Genen) die benötigt werden, um Tryptophan zu synthetisieren?

Komplementationsanalyse

MATa MATα

Diploide Zelle MATa/α

Trp--MutanteA

Phänotyp der diploden Zelle

TRP+ Trp-

Trp--MutanteB

A und B haben Mutationen in unterschiedlichen Genen

das selbe Gen ist in A und B betroffen

Komplementationsgruppe

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MATa-STAMM MATα-STAMM

ungerade Gruppenummer gerade Gruppenummer

keine Mutagenese:

Mutagenese:

4836

4837

4865

4866

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Fahrplan

Tag 2 Tag 4

Tag 5 Tag 6

Tag 7/8: Auswertung der Komplementationsanalyse

haploide Mutanten auf 5 FAA Platten selektionieren

Mutantenkolonien auf YEPD und -Trp Platten vereinzeln.

-Trp Mutanten mit -Trp Mutanten des kompatiblen Kreuzungstyps

MATa bzw. MATα auf Vollmediumplatten kreuzen.

Selektion der diploiden Kreuzungsprodukte durch Replikaplattieren auf verschiedenen Selektionsmedien.

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YEPD -Tryptophan

1 1

von aussen nach innen ausstreichen

Testen der Mutanten

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A A*

B C

?

B* wt trp1 trp3 trp4 trp5

A

B C

MATa

MATα

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A* B* wt trp1 trp3 trp4 trp5

A

B C

MATa

MATα

STEMPEL

Kreuzungs-Platte kopfüber

Samt

2. Platte:-Uracil-Histidin

3.Platte:-Uracil-Histidin-Tryptophan sanfter Druck

Die Kreuzung kompatibler Hefemutanten

Vollmedium (YEPD)

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Wie kommt man nun von der Identifizierung der Gene (Komplementationsgruppen) zu ihrer Isolierung?

TRP1

Plasmid

Transformation

trp1-Mutante Plasmid-Komplementation

Wie man mit Plasmiden arbeitet und wie man ein Plasmid mit dem TRP1 Gen isolieren kann: nächste Woche

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A

B C D E�F

G

synthetisches Medium ohne Trp

"Kreuzung"

Es gibt mindestens 3 Komplementationsgruppen (Gene)

TRP1: Mutanten A, C, E TRP2: Mutanten G, B, D TRP3: Mutante F

MATa

MATα

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FAA YEPD

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http://www.achievement.org/autodoc/page/eli0int-4

When did it occur to you that you could design drugs, rather than follow the traditional trial and error approach? I don't think I can take credit for that. It started out in almost a naive way. I was only following what Dr. Hitchings had decided was the way to go. He didn't know any

more than I did whether it was going to succeed at the time. We knew something about the nucleic acids which make up the nucleus of the cell. We knew it was very important for cells to

have this in order to divide. We didn't know much about the structure -- it was prior to the Watson hypothesis of the double helix -- but we did know that there were four bases that were essential

for nucleic acid. So the thought was, "What would happen if we made artificial bases? Things that look very close to the regular ones, but couldn't really be utilized by the cells." That was the

approach. We didn't understand all the pathways, how these compounds could be used, or what would happen if they got into the nucleic acid. So, the idea was not that we knew exactly what to make, only that we would make things so close to the original that it would fool some enzymes,

some cells into taking them up. We used to call it a rubber donut. It looked like the real thing, but it wouldn't work, and that's what we found.

Gertrud Elion

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TRP1 Phosphoribosylanthranilate isomerase 220 Aminosäuren TRP2 Anthranilate synthase, catalyzes the initial step of tryptophan biosynthesis, forms multifunctional hetero-oligomeric anthranilate synthase:indole-3-glycerol phosphate synthase enzyme complex with Trp3p 507 Amnosäuren TRP3 Bifunctional enzyme exhibiting both indole-3-glycerol-phosphate synthase and anthranilate synthase activities, forms multifunctional hetero-oligomeric anthranilate synthase:indole-3-glycerol phosphate synthase enzyme complex with Trp2 484 Aminosäuren TRP4 Anthranilate phosphoribosyl transferase of the tryptophan biosynthetic pathway, catalyzes the phosphoribosylation of anthranilate, subject to the general control system of amino acid biosynthesis 380 Aminosäuren TRP5 Tryptophan synthase involved in tryptophan biosynthesis, regulated by the general control system of amino acid biosynthesis 707 Aminosäuren

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