Biochemisches Praktikum fu r Bachelor Biowissenschaften · 3) kompetitiver ELISA: Anstelle eines...

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Biochemisches Praktikum fu r Bachelor Biowissenschaften Fassung vom Februar 2013 Universität Kaiserslautern Fachbereich Chemie Prof. Dr. W. E. Trommer

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Biochemisches Praktikum fu r

Bachelor Biowissenschaften

Fassung vom Februar 2013

Universität Kaiserslautern

Fachbereich Chemie

Prof. Dr. W. E. Trommer

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Inhalt

Zeitplan zum Biochemie-Praktikum für Bachelor-Biowissenschaften zum WS 2012/13 ................... 4

Sicherheitsinstruktionen: .............................................................................................................. 5

Anmerkungen zum Praktikum....................................................................................................... 6

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ............................................................................... 7

1. Einleitung ......................................................................................................................................... 7

2. Versuchsbeschreibung .................................................................................................................. 11

3. Versuchsdurchführung .................................................................................................................. 13

3.1 Reagenzien und Chemikalien .................................................................................................. 13

3.2 Versuchsablauf ........................................................................................................................ 14

3.3 Bestückung der Mikrotiterplatte ............................................................................................. 14

4. Auswertung ................................................................................................................................... 15

5. Literatur ......................................................................................................................................... 15

Hemmkinetik mit Lactatdehydrogenase ...................................................................................... 16

Einführung ......................................................................................................................................... 16

Proteine ......................................................................................................................................... 16

Enzyme .......................................................................................................................................... 16

Enzymkinetik nach Michaelis und Menten ................................................................................... 17

Kinetik der kompetitiven Hemmung ............................................................................................. 18

Lactatdehydrogenase .................................................................................................................... 20

Photometrie .................................................................................................................................. 21

Aufgabe ............................................................................................................................................. 21

Experimentelle Erwägungen ......................................................................................................... 22

Die Aufgabe unterteilt sich wie folgt: ............................................................................................ 23

Durchführung .................................................................................................................................... 23

Von den Assistenten werden folgende Stammlösungen bereitgestellt: ....................................... 23

Von den Studierenden werden folgende Stammlösungen hergestellt: ........................................ 23

Messung ohne Inhibitor ................................................................................................................ 23

Messung mit 0,3 ml AMP-Lösung .................................................................................................. 25

Messung mit 0,6 ml AMP-Lösung .................................................................................................. 25

Auswertung ....................................................................................................................................... 26

Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen .............................. 26

Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen ohne Inhibitor ...... 28

Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen mit 0,3 ml AMP-

Lösung ........................................................................................................................................... 30

Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen mit 0,6 ml AMP-

Lösung ........................................................................................................................................... 33

3 Die reziproke oder Lineweaver-Burk-Auftragung ......................................................................... 35

Berechnung der Inhibitorkonstante KI sowie Berechnung und Umrechnung des

Durchschnittwerts von vmax ........................................................................................................... 41

Abschließende Beurteilung ........................................................................................................... 43

4

Zeitplan zum Biochemie-Praktikum für Bachelor-Biowissenschaften zum WS 2012/13

Mo., 11.2.13

Vorbesprechung 10:00 alle Gruppen

ELISA Coaten

14:00 h: Gruppen 1A-1F

Di., 12.2.13 ELISA

9:00 h: Gruppen 1A-1F

LDH-Hemmkinetik

9:00 h: Gruppen 3A-3C

13:30 h: Gruppen 3D-3F

ELISA Coaten

15:30 h: Gruppen 2A-2F

Mi., 13.2.13

LDH-Hemmkinetik

9:00 h: Gruppen 1A-1C

13:30 h: Gruppen 1D-1F ELISA

9:00 h: Gruppen 2A-2F ELISA Coaten

15:30 h: Gruppen 3A-3F

Do., 14.2.13 ELISA

9:00 h: Gruppen 3A-3F

LDH-Hemmkinetik

9:00 h: Gruppen 2A-2C

13:30 h: Gruppen 2D-2F

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Sicherheitsinstruktionen:

Allgemeine Sicherheit:

Informieren Sie sich bei Praktikumsbeginn über die Sicherheitseinrichtungen im

Praktikumslabor: Feuerlöäscher, Feuermelder, Notduschen, Augenduschen, Not-Ausschalter

für Elektrizität, Erste-Hilfe-Kasten.

Notfall/Unfall-Pläne und Brandfall-Regeln sind neben den Türen ausgehängt.

Unfälle und Notfälle sofort bei Assistenten melden.

Fluchtwegepläne sind auf dem Gang ausgehängt.

Im Alarmfall das Gebäude auf dem kürzesten Weg verlassen, keine Aufzüge benützen, sich

auf dem großen Parkplatz hinter dem Chemie-Gebäude versammeln.

Tragen Sie im Labor immer Schutzkleidung: Labormantel (Baumwolle, kein Synthetic),

Schutzbrille, geschlossene Schuhe. Beim Arbeiten mit Gefahrstoffen Einmalhandschuhe

benützen (von uns gestellt).

Straßenkleidung etc. nicht ins Labor mitnehmen, sondern in den Spinden einschließen.

Im Labor nicht Essen und Trinken. Keine Lebensmittel in das Labor mitnehmen.

Arbeiten Sie nicht alleine im Labor und machen Sie keine Experimente, die nicht vorgesehen

sind.

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Anmerkungen zum Praktikum

Sollten Sicherheitsregeln im Labor nicht befolgt werden, können Praktikant(inn)en

vom Praktikum oder dem Versuchstag ausgeschlossen werden.

Protokolle zu den einzelnen Versuchen sind spätestens 1 Woche nach Beendigung

des Versuchs beim Versuchsassistenten / der Versuchsassistentin abzugeben.

Alle verwendeten Messwerte etc. sind im jeweiligen Protokoll anzugeben.

Rechenwege sind nachvollziehbar darzulegen.

Protokolle sind in Papierform abzugeben.

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Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

1. Einleitung 7

2. Versuchsbeschreibung 11

3. Versuchsdurchführung 13

3.1 Reagenzien und Chemikalien 13

3.2 Versuchsablauf 14

3.3 Bestückung der Mikrotiterplatte 14

4. Auswertung 15

5. Literatur 15

1. Einleitung

Die intakte Oberfläche des Körpers stellt eine wirksame Barriere gegenüber den meisten

Mikroorganismen (Viren, Bakterien, Pilzen, Parasiten) dar. Um dennoch eingedrungene Mikroben

unschädlich zu machen, verfügen Wirbeltiere über ein Abwehrsystem aus Molekülen und Zellen, das

Immunsystem.

Alle Zellen des Immunsystems stammen von pluripotenten Stammzellen ab, die sich im Laufe ihrer

Entwicklung in zwei Zellinien, die myeloische und die lymphatische, differenzieren. Die myeloische

Reihe besteht zum gößten Teil aus Phagozyten, welche in der Lage sind, Fremdorganismen zu

endocytieren und zu verdauen. Die Zellen der lymphatischen Reihe (Lymphocyten) differenzieren, je

nach Umgebung (microenvironment) in der sie heranreifen, in T- und B-Zellen. T-Zellen entwickeln

sich dabei im Thymus, während B-Zellen bei Säugetieren im Knochenmark (bone marrow) entstehen.

Neben der zellvermittelten Immunreaktion spielen auch lösliche Faktoren bei der Immunantwort

eine große Rolle (humorale Immunantwort). Den Hauptträger dieser Abwehr bilden die

Immunglobuline oder Antikörper. Diese werden - nach einem Kontakt des lymphatischen Systems

mit fremden immunogenen Molekülen - von Plasmazellen, die sich aus B-Zellen entwickeln, gebildet.

Moleküle, die im Organismus die Bildung dieser Antikörper induzieren, nennt man Antigene.

Die Antikörper erkennen das infektiöse Agens spezifisch, das heißt, ein bestimmter Antikörper

erkennt nur sein zugehöriges Antigen. Die Bindung erfolgt dabei nicht an das gesamte Antigen,

sondern nur an eine bestimmte Stelle, die Antigendeterminante (Epitop).

8 Die Grundstruktur aller Antikörper besteht aus je zwei identischen leichten und schweren

Polypeptidketten, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind (Abb. 1).

Kohlenhydrat

Disulfidbrücke

schwere Kette 450 Reste

leichte Kette 212 Reste

CH3 CH2

CH1

VH

CL

VL

Türangel-(hinge) Region

Antigen-bindungs-stellen

Abb. 1: Grundstruktur eines Antikörpers (IgG)

Von der kleineren Polypeptidkette (light chain) mit einem Molekulargewicht von 25.000 Da

existieren zwei Formen, die - und die -Form. Ihre Struktur gliedert sich in zwei globuläre Regionen

(Domänen), die in sich durch je eine Disulfidbrücke stabilisiert sind. Diejenige Region, welche die

Carboxylgruppe enthält, zeigt bei einem Vergleich der Aminosäuresequenzen verschiedener

Antikörper eine hohe Übereinstimmung und wird daher als konstante Region (CL-Region, constant

light chain) bezeichnet. Das aminoterminale Ende besitzt eine große Sequenzvariabilität und wird

daher variable Region (VL-Region, variable light chain) genannt.

Die schwere Polypeptidkette (heavy chain) existiert in fünf Formen () mit einem

Molekulargewicht von 50.000-77.000 Da. Jede dieser Formen ist mit einem Leichtkettentyp frei

kombinierbar, wodurch die fünf Immunglobulinklassen (IgA, IgD, IgE, IgG bzw. IgM) entstehen.

Variationen in der Schwerkettenstruktur innerhalb einer Klasse (z. B. 1, 2, 3 u. 4) führt zur Bildung

von Subklassen (entsprechend: IgG1, IgG2, IgG3, bzw. IgG4).

Die Struktur der schweren Ketten ist denen der Leichtkette sehr ähnlich. Bedingt durch die größere

Molmasse besitzen sie jedoch neben der variablen Region (VH-Region, variable heavy chain) drei

9 konstante Domänen (CH1, CH2, CH3). Der Kohlenhydratanteil, den alle Antikörper besitzen, ist an die

CH2-Region gebunden.

Die pflanzliche Proteinase Papain spaltet Immunglobuline in der Region zwischen den CH1- und CH2-

Domänen, der sogenannten Türangelregion (hinge region), wodurch zwei identische Fab-Fragmente

und ein Fc-Fragment entstehen (Abb. 2). Ein weiteres Enzym für die Fragmentierung von Antikörpern

ist Pepsin, welches zwei größere Fragmente erzeugt, das F(ab')2-Fragment, das die über die Hinge-

Region miteinander verbundenen Fab-Regionen umfasst, und das pFc'- Fragment, welches den CH3-

Domänen des Antikörpermoleküls entspricht.

Mit diesen Fragmenten konnte gezeigt werden, dass die Antigen-Antikörper-Bindungsorte in den

variablen Bereichen (VL, VH) des Antikörpers liegen, während der Fc-Teil die Bindung des

Immunglobulins an verschiedene Zellen des Immunsystems, sowie Komplementfaktoren vermittelt.

Die hohe Beweglichkeit der Hinge-Region erlaubt eine Änderung des Abstandes der

Antigenbindungsorte, wodurch diese unabhängig voneinander verfügbar sind.

10

F(ab’)2

Peptide mit niedriger Molmasse

sekundäre Spaltung durch Papain

Papain

Pepsin

pFc’

333 234

Fab

Fc’

Fc

433 341 224

Abb. 2: Enzymatische Spaltung von Immunglobulinen

Bei der Gewinnung von Antikörpern unterscheidet man diese in zwei Gruppen:

11 1) polyklonale Antikörper: Hier handelt es sich um eine Mischung von verschiedenen, gegen

diverse Epitope gerichteten Antikörpern. Sie werden aus dem Serum von zuvor mit Antigen

immunisierten Tieren gewonnen.

2) monoklonale Antikörper: Richten sich genau gegen ein spezifisches Epitop eines Anti-

gens. Für die Gewinnung werden Plasmazellen von zuvor immunisierten Tieren durch

Fusion mit Tumorzellen immortalisiert (Hybridom-Technik). Die so erhaltenen Hybridoma-

Zellen werden mehrfach vereinzelt (kloniert), so dass sich ein Zellstamm ergibt, der auf nur

eine Plasmazelle zurückgeht. Dieser Zellstamm kann nun theoretisch eine unendlich große

Menge monoklonaler Antikörper bilden.

2. Versuchsbeschreibung

Zur Bestimmung von Antikörpertitern (AK) gegen bestimmte Antigene existiert mittlerweile eine

Vielzahl von Methoden, wobei an dieser Stelle nur der RIA (radioimmunoassay) und der ELISA

(enzyme-linked immunosorbent assay) genannt seien. Beide Assays sind sehr einfach in der

Durchführung, doch sehr sensitiv und zuverlässig, was zu deren weit verbreiteter Anwendung geführt

hat. Die Grundlage beider Methoden beruht auf der Tatsache, dass bestimmte Kunststoffoberflächen

(z. B. Polystyrol, Polypropylen, Polycarbonat, Polyvinylchlorid) geringe Mengen der meisten Proteine

fest binden können. Beim ELISA können je nach Problemstellung verschiedene Typen des Tests

durchgeführt werden:

1) „indirekter“ ELISA: Das zu testende Antigen wird an eine geeignete Plastikoberfläche adsorbiert

(Coating, I in Abb. 3). Nach Entfernen des Antigens werden noch freie Bindungsstellen mit einem

nicht reagierenden Protein (z.B. Rinderserumalbumin) blockiert (hier nicht dargestellt). Die Detektion

des Antigens erfolgt über einen für dieses Antigen spezifischen Primärantikörper (II in Abb. 3). Durch

einen Sekundärantikörper, der an den Primärantikörper bindet und mit einem Enzym markiert ist,

kann nach Zugabe des entsprechenden Substrats ein Nachweis des Antigens über die Enzymreaktion

erfolgen (III in Abb. 3).

12

I

II

III

Antigen

Abb. 3: „indirekter“ ELISA

2) Sandwich-ELISA: Im Gegensatz zum indirekten ELISA wird hier nicht das Antigen, sondern ein für

das Antigen spezifischer Antikörper an die Plastikoberfläche gebunden. Dieser ist, nachdem noch

freie Bindungstellen mit einem nicht reagierenden Protein blockiert wurden, in der Lage, sein

Antigen aus einer Probelösung zu binden. Die Detektion erfolgt wiederum über einen zweiten

Antikörper, der an ein anderes Epitop des Antigens bindet und so das Sandwich bildet (AK-Antigen-

AK-Komplex). Der Nachweis der Bindung erfolgt wie im indirekten ELISA über einen mit Enzym

markierten Sekundärantikörper, der z.B. ein farbloses Substrat zu einer farbigen Verbindung umsetzt.

3) kompetitiver ELISA: Anstelle eines zweiten, markierten Antikörpers wird ein markiertes

Kompetitor-Antigen verwendet. Dieses ist dem Analyten (Antigen) strukturell ähnlich und konkurriert

so mit diesem um die Bindungstellen am Antikörper. Je weniger Analyt in einer Probe enthalten ist,

desto mehr Kompetitor bindet an den Antikörper und desto intensiver ist die Farbreaktion. Die

Farbintensität verhält sich umgekehrt zur Analyt-Konzentration:

wenig Analyt = fast alle Paratope (Bindungsstelle am Antikörper) vom markierten Kompetitor besetzt

= starke Farbreaktion

viel Analyt = schwache Farbreaktion

Im Praktikumsversuch soll ein His-Tag markiertes Protein (Gelonin) aus Expressionsversuchen mittels

eines indirekten ELISAs nachgewiesen werden. Es wird deshalb ein monoklonaler Anti-His-Tag

Antikörper als Primärantikörper verwendet. Zur Nachweisreaktion wird ein an Alkalische

Phosphatase (AP) gebundener Anti-Maus-Antikörper verwendet. Das Substrat der Alkalischen

Phosphatase ist para-Nitrophenylphosphat. Durch das Enzym wird hydrolytisch die Phosphatgruppe

abgespalten und es bildet sich zunächst farbloses para-Nitrophenol. Im Alkalischen wird para-

Nitrophenol zum gelben para-Nitrophenolat-Anion, welches bei 405 nm photometrisch bestimmt

werden kann.

Reaktion:

13

3. Versuchsdurchführung

3.1 Reagenzien und Chemikalien

Testprotein (Antigen) Rekombinantes Gelonin mit His-Tag (10 µg/ml)

Gelonin aus Samen von Gelonium multiflorum (10 µg/ml)

Kontrollen

Negativkontrollen: 10 µg/ml Cytochrom c

Positivkontrolle: 10 µg/ml rekombinantes Gelonin

Primärantikörper Monoklonaler antigenspezifischer Antikörper:

Mouse-Anti-His-Antikörper

Verdünnung: 1:2000 mit PBS-Tween

Enzymkonjugat Alkalische-Phosphatase-markierte, polyklonale Antikörper gegen Maus-Immunglobuline:

Anti-mouse-lgG-Antikörper (AP)

Verdünnung: 1:1000 mit PBS-Tween

Coating-Puffer Lösung A: 100 ml 0,2 M Na2CO3 (2,12 g ad 100 ml)

Lösung B: 100 ml 0,2 M NaHCO3 (1,68 g ad 100 ml)

Gebrauchslösung : 8,5 ml Lösung A + 4 ml Lösung B

pH 10,6 (pH-Kontrolle)

ad 50 ml mit bidest. Wasser

Waschpuffer PBS-Tween Na2HPO4 0,92 g

NaH2PO4 * H2O 0,35 g

NaCl 8,18 g

pH 7,2

ad 1 l mit deionisiertem Wasser

100 ml zur Seite stellen (= PBS-Puffer)

zu den restlichen 900 ml:

14

Tween 20 0,45 ml

Blockierlösung 1% BSA in PBS

250 mg BSA in 25 ml PBS

Substratpuffer (AP) MgCl2 * 6 H2O 0,1 g

DEA (Diethanolamin) 97 ml

pH 9,8

ad 1 l bidest. Wasser

Substratlösung (AP) 15 mg p-Nitrophenylphosphat ad 15 ml Substratpuffer

3.2 Versuchsablauf

a) Das Antigen wird im Coating-Puffer auf eine Konzentration von 10 g/ml eingestellt. Je Napf

werden 100 µl dieser Lösung eingebracht. Die Bindung an die feste Phase erfolgt über Nacht bei 4

°C.

b) Die Näpfe der Platte werden durch Ausschlagen geleert. Pro Napf werden 200 µl der

Blockierlösung eingefüllt. Die Inkubation erfolgt bei Raumtemperatur für 90 min.

c) 2-maliges Waschen mit jeweils 200 µl PBS-Tween-Puffer. Ausschlagen der Näpfe.

d) Je Napf werden 100 l Primärantikörperlösung eingebracht. Die Inkubation erfolgt bei

Raumtemperatur für 1 h (siehe „Aufteilung der Mikrotiterplatte“, Abschn. 3.3)

e) 2 × Waschen. Näpfe ausschlagen.

f) Das Enzymkonjugat wird auf eine geeignete Arbeitskonzentration gebracht, d. h. ca. 1000 ×

verdünnt (10 l Enzymkonjugatlsg. + 10 ml PBS-Tween) und 100 l pro Napf eingebracht. Die

Inkubation erfolgt bei Raumtemperatur für 1 h.

g) 2 × Waschen. Näpfe ausschlagen.

h) 100 l Substratlösung zugeben. Die Entwicklung erfolgt bei Raumtemperatur. Die Platte wird nach

10 min mit Hilfe eines EIA-Readers bei 414 nm vermessen.

3.3 Bestückung der Mikrotiterplatte

a) Blank:

Für die Messung benötigt der EIA-Reader eine Spalte der Platte als Blank. In die Spalte 1 dürfen

deshalb keine Proben eingebracht werden. Stattdessen wird PBS einpipettiert. Alle anderen Schritte

wie Blockieren, Konjugatzugabe usw. erfolgen wie beschrieben.

15 b) Negativkontrolle:

Um falsche positive Ergebnisse auszuschließen, müssen in jedem ELISA Negativkontrollen

durchgeführt werden. Zu diesem Zweck wird eine Spalte der Platte nicht mit Antigen beschichtet.

Das weitere Vorgehen erfolgt wieder wie beschrieben.

Die Ursachen für falschpositive Ergebnisse können sein:

Unspezifische Adsorption des Enzymkonjugates an das Plastikmaterial,

Kreuzreaktionen des Enzymkonjugates,

c) Positivkontrolle:

Um sicherzustellen, dass der ELISA richtig durchgeführt wurde, sollte immer eine Spalte der Platte

mit einer Probe bestückt werden, von der bekannt ist, dass sie für das verwendete Antigen

spezifische Antikörper enthält. Diese Löcher müssen sich beim Entwickeln auf jeden Fall färben.

4. Auswertung

Hinweis: Bitte pro Gruppe einen USB-Stick mitbringen. Die Messdaten stehen nur in digitaler Form

zur Verfügung.

Die Auswertung erfolgt zunächst optisch, indem man die Löcher notiert, die deutlich stärker gefärbt

sind als die Negativkontrollen. Die Messwerte des EIA-Readers werden statistisch ausgewertet.

Dazu werden die Negativkontrollen gemittelt und die Standardabweichung berechnet. Für jede

Probe wird ebenfalls der Mittelwert aus den Messwerten gebildet. Eine Probe ist dann positiv, wenn

dieser Mittelwert größer ist als die Summe aus dem Mittelwert der Negativkontrollen und der

zweifachen Standardabweichung.

5. Literatur

Harlow, E., Lane, D.,

Antibodies. A Laboratory Manual,

ColdSpringHarbor Laboratory, New York, 1988.

Kap. 14, Immunoassays, S. 553-612.

Goding, J. W.,

Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2nd ed.,

Academic Press, London, 1986.

Kap. 3.10, Screening Assays, S. 76-89.

Peters, J. H., Baumgarten, H., (Hrsg.),

Monoklonale Antikörper. Herstellung und Charakterisierung, 2. Auflage,

Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 1990.

Kap. 10, Nachweis von monoklonalen Antikörpern, S. 317-458.

16

Hemmkinetik mit Lactatdehydrogenase

Einführung

Proteine

Proteine gehören zu den wichtigsten Makromolekülen lebender Zellen. Sie sind aus 20 verschiede-

nen Aminosäuren aufgebaut, die in spezieller Reihenfolge (Sequenz, Primärstruktur) über Peptid-

bindungen miteinander verknüpft sind (Polypeptidketten). Die meisten Polypeptidketten bestehen

aus ca. 100 bis 300 Aminosäureresten, entsprechend molaren Massen von ca. 11000 bis 33000

g/mol, es gibt jedoch auch kleinere und viel größere.Die Aminosäuren besitzen Seitenketten mit

unterschiedlichen physikalischen (hydophob, hyophil) und chemischen Eigenschaften (aromatisch,

polar, sauer, basisch). Die fortlaufende Kette von Peptidbindungen und Cα-Atomen wird Rückgrat

genannt.

Die Polypeptidketten sind in der Zelle nicht beliebig ausgestreckt oder geknickt, sondern liegen in

ganz bestimmten Konformationen (Faltungen) vor, die von der Aminosäuresequenz abhängen und

durch Wechselwirkungen oder Kräfte (hydrophobe Wechselwirkungen, Van-der-Waals-Kräfte,

ionische Kräfte, Wasserstoffbrückenbindungen) oder zusätzliche kovalent-chemische Bindungen

(Disulfidbrücken) zwischen ihren Atomen und Atomgruppen stabilisiert werden (Raumstruktur,

Tertiärstruktur). Im wässrigen Milieu der Zelle ordnen sich hydrophobe Aminosäurereste im Inneren

der Struktur an, geladene und polare Gruppen stellen an der Außenseite Kontakte und Wechsel-

wirkungen mit dem Wasser her. Teilstrukturen sind oft in chrakteristischer regelmäßiger Form

ausgebildet und werden durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Atomen des Rückgrats

stabilisiert (Sekundärstrukturen wie schraubenförmige α-Helices oder aus aneinandergelagerten

Strängen gebildete β-Faltblätter). Schließlich können sich auch mehrere gefaltete Polypeptidketten

(Untereinheiten) zusammenlagern (Quartärstruktur).

Die Raumstruktur der Proteine (sog. native Struktur) ist wichtig für ihre biologische Funktion. Unter

verschiedenen Bedingungen - z. B. Hitze, extreme pH-Werte, Detergentien oder unpolare Lösungs-

mittel - kann es zur Entfaltung (Denaturierung) unter Verlust der definierten Raumstruktur und der

Funktion kommen. Die dabei entstehenden Zufallsstrukturen neigen zur Aggregation und werden in

Wasser unlöslich.

Enzyme

Die Funktion vieler Proteine ist es, chemische Reaktionen zu beschleunigen. Sie wirken damit als

Katalysatoren und werden Enzyme genannt. Ein wichtiges Funktionsprinzip bei der enzymatischen

Aktivität ist neben anderen, dass die Enzyme das reaktionsfähige Molekül (Substrat) samt eventu-

ellen Reaktionspartnern (Cosubstrate) in solcher Weise binden, dass die Reaktion erleichtert (die

Energie des Übergangszustandes herabgesetzt) wird. Dabei sind die meisten Enzyme spezifisch für

die Substrate, die sie binden, und die Reaktion, die sie an ihnen katalysieren. Bestimmte Substrate

mittlerer Molekülgröße, die nach der Reaktion in kurzen Reaktionszyklen regeneriert werden (und

damit in gewissem Sinn ebenso wenig verbraucht werden wie die Enzyme), werden als Coenzyme

bezeichnet. Das Gleichgewicht der Reaktion wird bei der Katalyse nicht verändert und es wird sowohl

die Hin- wie auch die Rückreaktion katalysiert.

Die Bindung der Substrate und Coenzyme durch das Enzym findet an spezifischen Bereichen

(Bindungsstellen oder -taschen) seiner Struktur statt. Mit diesen Bereichen überlappen sich teilweise

die sog. aktiven Zentren, an denen die eigentliche katalysierte Reaktion stattfindet. Die Reaktions-

geschwindigkeit der katalysierten Reaktion (d. i. wieviel Substrat sich pro Zeiteinheit in Produkt

17 umsetzt) kann bei gegebener Enzymkonzentration eine Obergrenze (maximale Geschwindigkeit, vmax)

nicht übersteigen (Sättigungskinetik), die erreicht wird, sobald alle Bindungsstellen des Enzyms mit

Substrat gesättigt sind.

Neben den Substraten gibt es natürlich vorkommende oder künstlich erzeugte Stoffe, die die

Enzymaktivität reversibel beeinflussen. Diese Effektoren werden in Aktivatoren, die die Aktivität

erhöhen, und Inhibitoren, welche sie erniedrigen, eingeteilt. Sie können eigene Bindungsstellen am

Enzym besetzen und ihre Wirkung durch Beeinflussung der Enzymkonformation ausüben (alloste-

rische Effektoren) oder es können mit dem Substrat aufgrund struktureller Ähnlichkeit um dieselbe

Bindungsstelle konkurrierende Hemmstoffe die Katalyse behindern (kompetitive Hemmung).

Enzymkinetik nach Michaelis und Menten

Die Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymatisch katalysierten Reaktion hängt u. a. auch von der

Substratkonzentration ab. Bei der maximalen Umsatzgeschwindigkeit (vmax) ist das Enzym vollständig

mit Substrat abgesättigt, während bei geringeren Substratkonzentrationen nicht alle Enzymmoleküle

abgesättigt sind.

KM [S]

v

vmax

vmax/2

Abb. 1

Sättigungskinetik (Reaktionsgeschwindigkeit über Substratkonzentration aufgetragen)

1923 lieferten Michaelis und Menten die mathematische Analyse dieses Verhaltens. Sie nahmen

folgenden Reaktionsverlauf an:

E + S k2

k1 ES

k4

k3 P + E

(E = Enzym, S = Substrat, ES = Enzymsubstratkomplex, P = Produkt)

[E] ist die Gesamtkonzentration an Enzym, ([E] - [ES]) die Konzentration an freiem Enzym. Die Menge

an S, die an E gebunden wird, ist, bezogen auf die Gesamtmenge an S, sehr klein und kann vernach-

lässigt werden. [S] entspricht dann zu Beginn der Messung der eingesetzten Substratkonzentration,

da noch kein P gebildet wurde. Aus demselben Grund ist bei Messung der Anfangsgeschwindigkeit

die Bildung von ES aus P + E mit der Geschwindigkeitskonstante k4 vernachlässigbar.

18 Ist die Bildungsgeschwindigkeit von ES,

k1 · ([E] - [ES]) · [S],

gleich seiner Zerfallsgeschwindigkeit,

k2 · [ES] + k3 · [ES],

so besteht ein Fließgleichgewicht (stationärer Zustand, steady state). Gleichsetzen der beiden Aus-

drücke und Zusammenfassen der drei Geschwindigkeitskonstanten ergibt die Michaeliskonstante

ES

SESE

1

32

M

k

kkK (1)

Wenn k2 k3, kann k3 vernachlässigt werden, und KM k2/k1 = KD ist die Dissoziationskonstante des

Gleichgewichts E + S ES.

Eine Bestimmung von KM ist dann möglich, wenn [ES] bestimmt werden kann. Dies ist auf direktem

Weg sehr schwierig, aber die Reaktionsgeschwindigkeit ist proportional [ES]:

v = k3 · [ES] (2)

Aus Gleichung (1) wird [ES] errechnet:

S

SEES

M

K

Dieser Wert wird in Gleichung (2) eingesetzt:

S

SE

M

3

K

kv

Wenn [S] so groß ist, dass die gesamte eingesetzte Enzymmenge als Enzymsubstratkomplex vorliegt

([E] = [ES]), ist die maximale Geschwindigkeit erreicht:

vmax = k3 · [E]

Daher:

vv

K

max

M

S

S

Dies ist die von Michaelis und Menten entwickelte Gleichung. Bei halbmaximaler Geschwindigkeit

wird KM = [S]. KM hat somit die Dimension einer Konzentration.

Bei Enzymreaktionen, an denen zwei oder mehr Substrate (und/oder Coenzyme) beteiligt sind, kann

für jedes ein eigener KM-Wert bestimmt werden, indem man bei dessen Messung die übrigen

Substrate (Coenzyme) in sättigenden Konzentrationen einsetzt.

Kinetik der kompetitiven Hemmung

Die kompetitive Hemmung beruht darauf, dass in einer individuellen Bindungstasche des Enzyms

entweder das Substrat oder den Hemmstoff gebunden werden kann, aber nicht beide. Bei großem

Überschuss an Substrat kann trotz der Anwesenheit von Inhibitor die Maximalgeschwindigkeit

erreicht werden, die sich daher nicht ändert. Die Substratkonzentration, bei der die halbmaximale

Geschwindigkeit errreicht wird (die scheinbare Michaelis-Konstante) wird erhöht.

19 Wir haben in der Reaktionsgleichung ein konkurrierendes Gleichgewicht (k5/k6) zu berücksichtigen:

EI + I

k6

k5 E

+ S

k2

k1 ES

k4

k3 P + E

(I = Inhibitor, EI = Enzym-Inhibitor-Komplex)

In der Michaelis-Menten-Gleichung wird KM mit einem Term multipliziert, der die Inhibitorkonzentra-

tion [I] und die Inhibitorkonstante KI enthält:

S

I1

S

M

max

IKK

vv

Abb. 2

Kinetik mit kompetitivem Inhibitor

vmax

vmax/2

KM KM(1+[I]/KI)

(scheinbare KM)

ohne Inhibitor

mit Inhibitor

mit mehr Inhibitor

20 Lactatdehydrogenase

Lactatdehydrogenase (LDH) ist ein Protein aus vier gleichen Untereinheiten (Homotetramer):

Abb. 3

Lactatdehydrogenase aus menschlichem Skelettmuskel

(Bild: Wikipedia, Strukturdaten: Protein Data Bank, Eintrag 1i10).

Es ist keine atomar aufgelöste Struktur wiedergegeben, sondern eine schematische

Repräsentation des Protein-Rückgrats durch „Bänder“ und „Schnüre“.

Ihrer Funktion nach ist LDH ein Enzym, das die Reduktion von Pyruvat zu Lactat katalysiert unter

gleichzeitiger Oxidation des Coenzyms NADH zu NAD+.

Pyruvat + NADH + H+ (LDH)

L-Lactat + NAD+

Pyruvat entsteht in der Glykolyse aus Glucose, wobei gleichzeitig NADH und ATP gebildet werden.

Die Regenerierung von NAD+ aus NADH in der LDH-Reaktion ermöglicht die Fortsetzung der Glykolyse

und somit die weitere ATP-Bildung, auch wenn keine anderen Elektronenakzeptoren (Oxidations-

mittel) wie z. B. Sauerstoff (O2) vorhanden sind (z. B. anaerobe Muskelarbeit) oder genetisch bedingt

keine Atmungskette existiert (z. B. anaerobe Bakterien).

21

Abb. 4

Strukturformeln von Pyruvat, L-Lactat, NAD+, NADH und AMP. Die Struktur von NADH ist

abgekürzt, ihren fehlenden Teil sieht man bei NAD+. Man beachte die Struktur-Überein-

stimmungen bei AMP und NAD+/NADH.

Photometrie

Wird eine Küvette, die mit einer absorbierenden Flüssigkeit oder Lösung gefüllt ist, von Licht durch-

strahlt, dann bewirkt die Absorption durch den Küvetteninhalt eine Intensitätsabnahme des Licht-

strahls. Diese ist von der Wellenlänge des Lichts, der Konzentration der absorbierenden Probe, der

Länge des Lichtweges durch die Messlösung sowie einer Stoffkonstanten (dem Extinktionskoeffizi-

enten ) abhängig. Die Wellenlängen, bei denen ein Maximum hat (die Absorptionsmaxima) sind

für absorbierende Atomgruppierungen (Chromophore) wie z. B. Nitrogruppen, Doppelbindungen,

Aromaten u. v. a. charakteristisch.

Die Konzentrationsbestimmung durch Messung der Absorption (auch Extinktion genannt) einer

monochromatischen Strahlung nach Durchgang durch die Messlösung bezeichnet man als Photo-

metrie.

Grundlage für die photometrischen Konzentrationsbestimmungen ist das Lambert-Beersche Gesetz,

nach dem sich die Konzentration einer Lichtenergie absorbierenden Verbindung in verdünnter

Lösung berechnen lässt:

cE

d

c = Konzentration [mol/l]

= molarer Extinktionskoeffizient [l mol–1 cm–1]

d = Schichtdicke der Küvette [cm]

E = Extinktion (dimensionslos)

Die Ableitung des Lambert-Beerschen Gesetzes ist den Lehrbüchern zu entnehmen.

Aufgabe Bestimmung der KM-Werte bzw. scheinbaren KM-Werte der LDH aus Schweine-Skelettmuskel für

NAD+ ohne Inhibitor und mit zwei verschiedenen Inhibitor-Konzentrationen sowie Bestimmung der

Maximalgeschwindigkeit und der Inhibitorkonstanten für AMP in diesem System.

Pyruvat

L-Lactat

NADH

H H H

NAD+

O-

AMP

22 Als Inhibitor wird AMP benutzt. Es kann auf Grund struktureller Ähnlichkeit mit NAD+ (s. Abb. 4) an

dieselbe Bindungstasche der LDH binden und hemmt daher kompetitiv.

Experimentelle Erwägungen

Aus praktischen Gründen untersuchen wir die Rückreaktion der physiologischen LDH-

Reaktion:

L-Lactat + NAD+ (LDH)

Pyruvat + NADH + H+

Während der Reaktion nimmt die Konzentration von NADH und Pyruvat zu. Während Pyruvat

(und Lactat) wegen mangelnder Absorption im sichtbaren oder nahen UV-Licht photomet-

risch schlecht zu bestimmen sind, kann NADH bei einer Wellenlänge von 340 nm verfolgt

werden, wo eine seiner Absorptionsbanden ein Maximum besitzt, ohne dass NAD+ dort

absorbiert. (Manchmal wird NADH gerätebedingt auch bei 366 nm gemessen. Dies entspricht

jedoch nicht seinem Absorptionsmaximum und ist daher weniger günstig.)

Abb. 5

Absorptionsspektren von NAD+ und NADH

Der molare Extinktionskoeffizient bei 340 nm ε340 von NADH beträgt 6300 l mol–1 cm–1. Die

Schichtdicke unserer Küvetten beträgt 1 cm.

Das bedeutet z. B., dass eine 10-4-molare Lösung (Lösung von 0,1 mmol/l) von NADH in

unserer Küvette bei 340 nm eine Extinktion von 0,63 aufweisen würde.

Da Reaktionsgeschwindigkeiten grundsätzlich temperaturabhängig sind, müssen die Proben

thermostatisiert werden.

Um die Gültigkeit der Michaelis-Menten-Gleichung sicherzustellen, muss die

Anfangsgeschwindigkeit bestimmt werden.

Daher wird das Enzym zuletzt zugegeben, möglichst schnell gemischt und sofort gemessen.

ε [1

03 l

mo

l-1 c

m-1

]

23 Die Aufgabe unterteilt sich wie folgt:

1. Messung der Reaktionsgeschwindigkeit bei 5 verschiedenen NAD+-Konzentrationen. Die

Konzentration von Lactat wird dabei in gleichbleibender, sättigender Höhe eingesetzt. AMP

wird zunächst nicht zugegeben.

2. Zweimalige Wiederholung der Messreihe bei zwei verschiedenen AMP-Konzentrationen.

3. Auswertung

Durchführung

Von den Assistenten werden folgende Stammlösungen bereitgestellt:

Lösung Konzentration, pH Vorbereitungshinweise für Assistenten

Glycinpuffer 0,1 M, pH 9,5

Phosphatpuffer 67 mM NaH2PO4, pH 7,2

LDH aus Schweine-Skelettmuskel

ca. 0,125 mg/ml in Phosphatpuffer pH 7,2, genaue Konz. wird bekannt gegeben

100 µl Ammoniumsulfatsuspension (10 mg/ml) 10 min zentrifugieren bei 13000 rpm (Eppendorf-Zentrifuge). Pellet aufnehmen in 200 µl Phosphatpuffer. Photometr. Konz.-Best.: A280 = 1,34 entspricht 1 mg/ml (für diese Messung 1:10 verdünnen). Für Versuch 1:40 verdünnen.

Tabelle 1

Von den Studierenden werden folgende Stammlösungen hergestellt:

Lösung Konzentration Hinweise

NAD+ 10 mM in Wasser (sprich: “10 millimolar”, Bedeutung: 10 mmol/l)

molare Masse MW = 663,4 genaue Einwaage wird bekannt gegeben

AMP 10 mM in Glycinpuffer pH 9,5 MW = 347,22 genaue Einwaage wird bekannt gegeben

L-Lactat 0,7 M in Glycinpuffer pH 9,5 Lithium-Lactat, MW = 96,01 genaue Einwaage wird bekannt gegeben

Tabelle 2

Alle Stammlösungen werden mit Eiswasser gekühlt.

Messung ohne Inhibitor

In 15-ml-Falcon-Röhrchen werden die in der folgenden Tabelle 3 aufgeführten Mengen

zusammenpipettiert und gemischt (Raumtemperatur).

Pipettierschema

Angaben in ml

Probe 1 2 3 4 5

Glycin-Puffer 4,655 4,640 4,610 4,55 4,40

Lactat 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

AMP 0 0 0 0 0

NAD+ 0,045 0,06 0,09 0,15 0,3

Summe 5 5 5 5 5

Tabelle 3

24 Messung der Proben

Aus jedem Röhrchen werden 0,5 ml entnommen und in nummerierte Plastikküvetten bis zur

Messung (mind. 5 min) im Thermoblock auf 25 ° temperiert.

Danach werden für Küvette 1 folgende Operationen durchgeführt, wobei die Messwerte in die

unten stehende Tabelle 4 eingetragen werden:

Küvette in den Strahlengang des Photometers stellen (Markierungspfeil nach vorne zeigend).

Photometer mit geschlossenem Deckel bei 340 nm auf 0 abgleichen (“blanken”).

Dann muss es schnell gehen:

Stoppuhr starten, möglichst gleichzeitig 10 µl der Enzymstammlösung in die Küvette

pipettieren, schnell aber gründlich mit der Pipette umrühren, Deckel des Photometers

schließen und nach 6 s E340 ablesen und notieren (Tabelle 4).

Danach weitere 90 s lang alle 9 s E340 und Zeit ablesen und notieren.

Auf dieselbe Weise werden die Proben 2 – 5 gemessen und die Werte in die unten stehende

Tabelle 4 eingetragen.

Messdaten ohne Inhibitor

Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5

Zeit [s] E340 Zeit [s] E340 Zeit [s] E340 Zeit [s] E340 Zeit [s] E340

6 6 6 6 6

15 15 15 15 15

24 24 24 24 24

33 33 33 33 33

42 42 42 42 42

51 51 51 51 51

60 60 60 60 60

69 69 69 69 69

78 78 78 78 78

87 87 87 87 87

96 96 96 96 96

Tabelle 4

25 Messung mit 0,3 ml AMP-Lösung

In 15-ml-Falcon-Röhrchen werden die in der folgenden Tabelle 5 aufgeführten Mengen

zusammenpipettiert und gemischt (Raumtemperatur).

Pipettierschema

Angaben in ml

Probe 1 2 3 4 5

Glycin-Puffer 4,355 4,34 4,31 4,25 4,1

Lactat 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

AMP 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

NAD+ 0,045 0,06 0,09 0,15 0,3

Summe 5 5 5 5 5

Tabelle 5

Messung der Proben

Die Proben 1 – 5 werden wie oben beschrieben gemessen und die Werte in die unten stehende

Tabelle 6 eingetragen.

Messdaten mit 0,3 ml AMP-Lösung

Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5

Zeit [s] E340 Zeit [s] E340 Zeit [s] E340 Zeit [s] E340 Zeit [s] E340

6 6 6 6 6

15 15 15 15 15

24 24 24 24 24

33 33 33 33 33

42 42 42 42 42

51 51 51 51 51

60 60 60 60 60

69 69 69 69 69

78 78 78 78 78

87 87 87 87 87

96 96 96 96 96

Tabelle 6

Messung mit 0,6 ml AMP-Lösung

In 15-ml-Falcon-Röhrchen werden die in der folgenden Tabelle 8 aufgeführten Mengen

zusammenpipettiert und gemischt (Raumtemperatur).

26 Pipettierschema

Angaben in ml

Probe 1 2 3 4 5

Glycin-Puffer 4,055 4,04 4,01 3,95 3,8

Lactat 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

AMP 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6

NAD+ 0,045 0,06 0,09 0,15 0,3

Summe 5 5 5 5 5

Tabelle 7

Messung der Proben

Die Proben 1 – 5 werden wie oben beschrieben gemessen und die Werte in die unten stehende

Tabelle 8 eingetragen.

Messdaten mit 0,6 ml AMP-Lösung

Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5

Zeit [s] E340 Zeit [s] E340 Zeit [s] E340 Zeit [s] E340 Zeit [s] E340

6 6 6 6 6

15 15 15 15 15

24 24 24 24 24

33 33 33 33 33

42 42 42 42 42

51 51 51 51 51

60 60 60 60 60

69 69 69 69 69

78 78 78 78 78

87 87 87 87 87

96 96 96 96 96

Tabelle 8

Auswertung

Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen

Aus jeder Zeitreihe einer Probe muss die Anfangsgeschwindigkeit bestimmt werden. Dazu wird wie

folgt vorgegangen:

(1) Ein Diagramm (Abszisse = Zeit-Achse (t), Ordinate = Extinktions-Achse (E340)) wird vorbereitet.

Skalieren Sie Extinktionsachse so, dass alle Messpunkt Platz finden.

(2) Die Messpunkte werden in das Diagramm eingetragen.

27 (3) Die Messpunkte im Diagramm werden von Hand mit einer glatten Kurve gefittet

(angenähert).

Die Kurve muss nicht alle Messpunkte exakt berühren, da sie eine Ausgleichskurve darstellen

soll und die Messpunkte streuen können.

(4) Die glatte Kurve wird über den Beginn der Messung hinaus nach links bis zum Schnittpunkt

mit der Abszisse (Zeit-Achse) extrapoliert (weitergeführt).

Dabei soll der bisherige Krümmungsverlauf der Kurve so gut wie möglich weitergeführt

werden.

Auf Grund von Unwägbarkeiten beim Mischvorgang wird die Extrapolation im Allgemeinen

die Abszisse nicht bei t=0 schneiden.

(5) Am Schnittpunkt mit der Abszisse wird mit dem Lineal eine Tangente an die extrapolierte

Kurve gelegt.

(6) Mit Hilfe eines Steigungsdreiecks an der Tangente wird die Tangentensteigung und somit die

Anfangssteigung der Kurve ermittelt. Diese entspricht der Anfangsgeschwindigkeit der

Enzymreaktion.

Beispiel:

Abb. 6

Beispiel für die graphische Auswertung einer Extinktions/Zeit-Kurve.

ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: 0,62 / 1 min = 0,62/min

E340

t [s]

96 87 78 69 60 51 42 33 244

15 6 -3

ΔE =

0,6

2

0,8

×

0,6

0,4

0,2

×

× ×

× ×

×

× × × ×

Δt = 1 min

28 Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen ohne

Inhibitor

Ohne Inhibitor, Probe 1

ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________

Ohne Inhibitor, Probe 2

ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________

E340

t [s]

96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3

E340

t [s]

96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3

29 Ohne Inhibitor, Probe 3

ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________

Ohne Inhibitor, Probe 4

ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________

E340

t [s]

96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3

E340

t [s]

96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3

30 Ohne Inhibitor, Probe 5

ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________

Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen mit 0,3 ml

AMP-Lösung

Mit 0,3 ml AMP-Lösung, Probe 1

ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________

E340

t [s]

96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3

E340

t [s]

96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3

31 Mit 0,3 ml AMP-Lösung, Probe 2

ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________

Mit 0,3 ml AMP-Lösung, Probe 3

ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________

E340

t [s]

96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3

E340

t [s]

96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3

32 Mit 0,3 ml AMP-Lösung, Probe 4

ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________

Mit 0,3 ml AMP-Lösung, Probe 5

ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________

E340

t [s]

96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3

E340

t [s]

96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3

33 Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen mit 0,6 ml

AMP-Lösung

Mit 0,6 ml AMP-Lösung, Probe 1

ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________

Mit 0,6 ml AMP-Lösung, Probe 2

ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________

E340

t [s]

96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3

E340

t [s]

96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3

34 Mit 0,6 ml AMP-Lösung, Probe 3

ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________

Mit 0,6 ml AMP-Lösung, Probe 4

ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________

E340

t [s]

96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3

E340

t [s]

96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3

35 Mit 0,6 ml AMP-Lösung, Probe 5

ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________

Die reziproke oder Lineweaver-Burk-Auftragung

Die Auftragung der Anfangsgeschwindigkeit v über der anfänglichen Substratkonzentration [S] wie in

Abb. 1 hat die Schwierigkeit, dass sehr hohe NAD+-Konzentrationen angewandt werden müssten, um

den Maximalwert vmax zu erhalten.

Das Verfahren von Lineweaver und Burk umgeht diese Schwierigkeit. Die Michaelis-Menten-

Gleichung wird folgendermaßen umgeformt:

1 1 1

v

K

v

K

v v

M

max

M

max max

S

S S

Diese Gleichung hat die allgemeine Form y = ax + b (mit y = 1/v und x = 1/[S]) und stellt die Gleichung

einer Geraden dar. Es resultiert daher eine Gerade, wenn die experimentell gewonnenen Daten in

Form von 1/v gegen 1/[S] aufgetragen werden. Die Steigung a der Geraden entspricht KM/vmax, der

Ordinatenabschnitt 1/vmax und der Abszissenabschnitt –1/KM (Abb. 3).

E340

t [s]

96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3

36

2/vmax

1/[S] –1/KM

a=KM/vmax

1/KM

1/v

1/vmax

x

Abb. 7

Reziproke oder Lineweaver-Burk-Auftragung

Die ermittelten Tangentensteigungen (ΔE/Δt) sind nach dem Lambert-Beerschen Gesetz

proportional zur jeweiligen zeitlichen Zunahme der NADH-Konzentration (Δc/Δt) und somit zur

Geschwindigkeit v der enzymatischen Reaktion.

Proportionalitätsfaktor ist 1/ε340, wobei ε340 = 6300 l · mol-1 · cm-1. Zusätzlich muss die Schichtdicke d

der Probe im Strahlengang berücksichtigt werden (1 cm):

[

]

[

]

oder mit anderen Einheiten:

[

]

Die Extinktion E und die Extinktionsänderung ΔE sind dimensionslos.

Statt 1/[S] wird 1/[NAD+], die reziproke NAD+-Konzentration zu Beginn der jeweiligen Reaktion in der

Küvette, auf der Abszisse aufgetragen.

Verdünnungsberechnung

NAD+ wurde zunächst von der Stammlösung in das Falcon-Röhrchen pipettiert und dadurch

verdünnt. Das Volumen im Falcon-Röhrchen ist 5 ml. Die NAD+-Konzentration im Falcon-

Röhrchen berechnet sich also wie folgt:

[NAD+]Falcon = [NAD+]Stammlösung × NAD+-Volumenpipettiert / 5 ml

Die Stammlösung ist 10 mM oder 10 µmol/ml, also wird:

[NAD+]Falcon = 10 µmol/ml × NAD+-Volumenpipettiert / 5 ml

Nachdem 0,5 ml Lösung aus dem Falcon-Röhrchen in die Küvette pipettiert wurden,

wurden 0,01 ml Enzymlösung dazugegeben und dadurch das NAD+ nochmals verdünnt (von

0,5 ml auf 0,51 ml). Man rechnet:

[NAD+]Küvette = [NAD+]Falcon × 0,5/0,51

= 10 µmol/ml × NAD+-Volumenpipettiert / 5 ml × 0,5/0,51

37

Maßgeblich ist die Konzentration in der Küvette.

Genau dieselben Überlegungen gelten für den Inhibitor AMP. Berechnen Sie:

AMP-Volumen pipettiert [ml]

[AMP] in Küvette [µmol/ml]

0,3

0,6

Tabelle 9

38 Umrechnung der Messwerte

Tragen Sie Ihre Messergebnisse in die folgende Tabelle 10 ein oder erstellen Sie eine gleichwertige

Excel-Tabelle und legen Sie diese mit dem Protokoll vor.

Ohne Inhibitor

NAD+-Vol. pipettiert

[ml]

[NAD+] in Küvette

[µmol/ml]

1/[NAD+] in Küvette

[ml/µmol]

Steigung ΔE/Δt

[1/min]

v

[

]

1/v

[

]

Probe 1 0,045

Probe 2 0,06

Probe 3 0,09

Probe 4 0,15

Probe 5 0,3

Mit 0,3 ml AMP

NAD+-Vol. pipettiert

[ml]

[NAD+] in Küvette

[µmol/ml]

1/[NAD+] in Küvette

[ml/µmol]

Steigung ΔE/Δt

[1/min]

v

[

]

1/v

[

]

Probe 1 0,045

Probe 2 0,06

Probe 3 0,09

Probe 4 0,15

Probe 5 0,3

Mit 0,6 ml AMP

NAD+-Vol. pipettiert

[ml]

[NAD+] in Küvette

[µmol/ml]

1/[NAD+] in Küvette

[ml/µmol]

Steigung ΔE/Δt

[1/min]

v

[

]

1/v

[

]

Probe 1 0,045

Probe 2 0,06

Probe 3 0,09

Probe 4 0,15

Probe 5 0,3

Tabelle 10

39 Graphische Bestimmung oder Berechnung der (scheinbaren) KM-Werte und der

Maximalgeschwindigkeit

Zeichnen Sie für jede Inhibitorkonzentration ein Diagramm mit den reziproken

Geschwindigkeiten über den reziproken NAD+-Konzentrationen (bezogen auf Küvette).

Zeichnen Sie mit dem Lineal eine Ausgleichsgerade ein und entnehmen Sie 1/KM (aus dem

Abszissenabschnitt) und somit KM nach dem Vorbild von Abb. 7. Entnehmen Sie auch 1/v (aus

dem Ordinatenabschnitt) und somit v.

oder

erstellen Sie die Diagramme und berechnen Sie die Ausgleichsgeraden sowie die KM- und

v-Werte mit einem Computer. Legen Sie die Computerdiagramme dem Assistenten mit

diesem Protokoll vor.

Für die Messungen in Abwesenheit von AMP erhalten wir den -Wert für NAD+.

In Anwesenheit von AMP erhalten wir scheinbare -Werte .

Die Einheit der - und -Werte ist µmol/ml oder mM.

Ohne AMP

Ergebnis ohne Inhibitor:

(1/mM)

(mM)

(min/mM)

(mM/min)

Tabelle 11

1/v [min · ml / µmol]

1/[NAD+] [ml/µmol]

40 Mit 0,3 ml AMP-Lösung

Ergebnis mit 0,3 ml AMP:

(1/mM)

(mM)

(min/mM)

(mM/min)

Tabelle 12

1/v [min · ml / µmol]

1/[NAD+] [ml/µmol]

41 Mit 0,6 ml AMP-Lösung

Ergebnis mit 0,6 ml AMP:

(1/mM)

(mM)

(min/mM)

(mM/min)

Tabelle 13

Berechnung der Inhibitorkonstante KI sowie Berechnung und Umrechnung des

Durchschnittwerts von vmax

Für die Messungen in Abwesenheit von AMP erhalten wir den -Wert für NAD+.

In Anwesenheit von AMP erhalten wir scheinbare -Werte , für die gilt:

(

)

Da KM und [I] bekannt sind, kann KI, die Inhibitorkonstante von AMP für NAD+ bei LDH, berechnet

werden:

1/v [min · ml / µmol]

1/[NAD+] [ml/µmol]

42 Auch KI hat die Einheit µmol/ml oder mM.

Berechnen Sie die Inhibitorkonstante KI, indem Sie für [I] die AMP-Konzentrationen aus Tabelle 9 und

für KM den Wert aus der Messung ohne Inhibitor (Tabelle 11) einsetzen:

[

]

(aus Tabelle 9)

[

]

(aus Messung) [

]

Durchschnitt

[

]

mit 0,3 ml AMP-Lösung

mit 0,6 ml AMP-Lösung

Tabelle 14

Die oben erhaltene Maximalgeschwindigkeit vmax wird in der Enzymkinetik als volumenbezogene

Aktivität bezeichnet und die oben dafür verwendeten Einheiten (

) werden traditionell als

U/ml bezeichnet (U: von „unit“).

Bei kompetitiver Inhibition ändert sich vmax nicht. Wir sollten also bei allen Inhibitorkonzentrationen

ähnliche vmax-Werte erhalten haben und bilden daraus den Durchschnitt:

[

]

(aus Messung)

Durchschnitt

[

]

ohne Inhibitor

mit 0,3 ml AMP-Lösung

mit 0,6 ml AMP-Lösung

Tabelle 15

Um die spezifische Aktivität des Enzyms (in U/mg oder

) zu erhalten, muss die

volumenbezogene Aktivität (Durchschnitt aus Tabelle 15) durch die Enzymkonzentration in der

Küvette dividiert werden. Die Enzymkonzentration in der Küvette ist die bekannt gegebene

Konzentration der Enzymstammlösung (in

) multipliziert mit

. Letzteres ist der Faktor der

Verdünnung, die dem Enzym widerfährt, weil 0,01 ml Enzymstammlösung zu 0,5 ml Küvetteninhalt

gegeben werden.

Berechnen Sie die Enzymkonzentration in der Küvette:

Konzentration der Enzymstammlösung [

] Konzentration in Küvette [

]

43 Berechnen Sie die Aktivitätsmenge in der Küvette und die spezifische Aktivität des Enzyms:

volumenbez. Aktivität [U/ml]

(vmax aus Tabelle 15)

spezifische Aktivität [U/mg]

Abschließende Beurteilung

Entsprachen alle Messergebnisse Ihren Erwartungen?

o Ja

o Nein

Falls nicht, welche Ergebnisse waren unerwartet und welche Gründe könnten dafür vorliegen?

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