Biochemisches Praktikum fu r Bachelor Biowissenschaften · 3) kompetitiver ELISA: Anstelle eines...
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Biochemisches Praktikum fu r
Bachelor Biowissenschaften
Fassung vom Februar 2013
Universität Kaiserslautern
Fachbereich Chemie
Prof. Dr. W. E. Trommer
2
Inhalt
Zeitplan zum Biochemie-Praktikum für Bachelor-Biowissenschaften zum WS 2012/13 ................... 4
Sicherheitsinstruktionen: .............................................................................................................. 5
Anmerkungen zum Praktikum....................................................................................................... 6
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ............................................................................... 7
1. Einleitung ......................................................................................................................................... 7
2. Versuchsbeschreibung .................................................................................................................. 11
3. Versuchsdurchführung .................................................................................................................. 13
3.1 Reagenzien und Chemikalien .................................................................................................. 13
3.2 Versuchsablauf ........................................................................................................................ 14
3.3 Bestückung der Mikrotiterplatte ............................................................................................. 14
4. Auswertung ................................................................................................................................... 15
5. Literatur ......................................................................................................................................... 15
Hemmkinetik mit Lactatdehydrogenase ...................................................................................... 16
Einführung ......................................................................................................................................... 16
Proteine ......................................................................................................................................... 16
Enzyme .......................................................................................................................................... 16
Enzymkinetik nach Michaelis und Menten ................................................................................... 17
Kinetik der kompetitiven Hemmung ............................................................................................. 18
Lactatdehydrogenase .................................................................................................................... 20
Photometrie .................................................................................................................................. 21
Aufgabe ............................................................................................................................................. 21
Experimentelle Erwägungen ......................................................................................................... 22
Die Aufgabe unterteilt sich wie folgt: ............................................................................................ 23
Durchführung .................................................................................................................................... 23
Von den Assistenten werden folgende Stammlösungen bereitgestellt: ....................................... 23
Von den Studierenden werden folgende Stammlösungen hergestellt: ........................................ 23
Messung ohne Inhibitor ................................................................................................................ 23
Messung mit 0,3 ml AMP-Lösung .................................................................................................. 25
Messung mit 0,6 ml AMP-Lösung .................................................................................................. 25
Auswertung ....................................................................................................................................... 26
Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen .............................. 26
Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen ohne Inhibitor ...... 28
Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen mit 0,3 ml AMP-
Lösung ........................................................................................................................................... 30
Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen mit 0,6 ml AMP-
Lösung ........................................................................................................................................... 33
3 Die reziproke oder Lineweaver-Burk-Auftragung ......................................................................... 35
Berechnung der Inhibitorkonstante KI sowie Berechnung und Umrechnung des
Durchschnittwerts von vmax ........................................................................................................... 41
Abschließende Beurteilung ........................................................................................................... 43
4
Zeitplan zum Biochemie-Praktikum für Bachelor-Biowissenschaften zum WS 2012/13
Mo., 11.2.13
Vorbesprechung 10:00 alle Gruppen
ELISA Coaten
14:00 h: Gruppen 1A-1F
Di., 12.2.13 ELISA
9:00 h: Gruppen 1A-1F
LDH-Hemmkinetik
9:00 h: Gruppen 3A-3C
13:30 h: Gruppen 3D-3F
ELISA Coaten
15:30 h: Gruppen 2A-2F
Mi., 13.2.13
LDH-Hemmkinetik
9:00 h: Gruppen 1A-1C
13:30 h: Gruppen 1D-1F ELISA
9:00 h: Gruppen 2A-2F ELISA Coaten
15:30 h: Gruppen 3A-3F
Do., 14.2.13 ELISA
9:00 h: Gruppen 3A-3F
LDH-Hemmkinetik
9:00 h: Gruppen 2A-2C
13:30 h: Gruppen 2D-2F
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Sicherheitsinstruktionen:
Allgemeine Sicherheit:
Informieren Sie sich bei Praktikumsbeginn über die Sicherheitseinrichtungen im
Praktikumslabor: Feuerlöäscher, Feuermelder, Notduschen, Augenduschen, Not-Ausschalter
für Elektrizität, Erste-Hilfe-Kasten.
Notfall/Unfall-Pläne und Brandfall-Regeln sind neben den Türen ausgehängt.
Unfälle und Notfälle sofort bei Assistenten melden.
Fluchtwegepläne sind auf dem Gang ausgehängt.
Im Alarmfall das Gebäude auf dem kürzesten Weg verlassen, keine Aufzüge benützen, sich
auf dem großen Parkplatz hinter dem Chemie-Gebäude versammeln.
Tragen Sie im Labor immer Schutzkleidung: Labormantel (Baumwolle, kein Synthetic),
Schutzbrille, geschlossene Schuhe. Beim Arbeiten mit Gefahrstoffen Einmalhandschuhe
benützen (von uns gestellt).
Straßenkleidung etc. nicht ins Labor mitnehmen, sondern in den Spinden einschließen.
Im Labor nicht Essen und Trinken. Keine Lebensmittel in das Labor mitnehmen.
Arbeiten Sie nicht alleine im Labor und machen Sie keine Experimente, die nicht vorgesehen
sind.
6
Anmerkungen zum Praktikum
Sollten Sicherheitsregeln im Labor nicht befolgt werden, können Praktikant(inn)en
vom Praktikum oder dem Versuchstag ausgeschlossen werden.
Protokolle zu den einzelnen Versuchen sind spätestens 1 Woche nach Beendigung
des Versuchs beim Versuchsassistenten / der Versuchsassistentin abzugeben.
Alle verwendeten Messwerte etc. sind im jeweiligen Protokoll anzugeben.
Rechenwege sind nachvollziehbar darzulegen.
Protokolle sind in Papierform abzugeben.
7
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
1. Einleitung 7
2. Versuchsbeschreibung 11
3. Versuchsdurchführung 13
3.1 Reagenzien und Chemikalien 13
3.2 Versuchsablauf 14
3.3 Bestückung der Mikrotiterplatte 14
4. Auswertung 15
5. Literatur 15
1. Einleitung
Die intakte Oberfläche des Körpers stellt eine wirksame Barriere gegenüber den meisten
Mikroorganismen (Viren, Bakterien, Pilzen, Parasiten) dar. Um dennoch eingedrungene Mikroben
unschädlich zu machen, verfügen Wirbeltiere über ein Abwehrsystem aus Molekülen und Zellen, das
Immunsystem.
Alle Zellen des Immunsystems stammen von pluripotenten Stammzellen ab, die sich im Laufe ihrer
Entwicklung in zwei Zellinien, die myeloische und die lymphatische, differenzieren. Die myeloische
Reihe besteht zum gößten Teil aus Phagozyten, welche in der Lage sind, Fremdorganismen zu
endocytieren und zu verdauen. Die Zellen der lymphatischen Reihe (Lymphocyten) differenzieren, je
nach Umgebung (microenvironment) in der sie heranreifen, in T- und B-Zellen. T-Zellen entwickeln
sich dabei im Thymus, während B-Zellen bei Säugetieren im Knochenmark (bone marrow) entstehen.
Neben der zellvermittelten Immunreaktion spielen auch lösliche Faktoren bei der Immunantwort
eine große Rolle (humorale Immunantwort). Den Hauptträger dieser Abwehr bilden die
Immunglobuline oder Antikörper. Diese werden - nach einem Kontakt des lymphatischen Systems
mit fremden immunogenen Molekülen - von Plasmazellen, die sich aus B-Zellen entwickeln, gebildet.
Moleküle, die im Organismus die Bildung dieser Antikörper induzieren, nennt man Antigene.
Die Antikörper erkennen das infektiöse Agens spezifisch, das heißt, ein bestimmter Antikörper
erkennt nur sein zugehöriges Antigen. Die Bindung erfolgt dabei nicht an das gesamte Antigen,
sondern nur an eine bestimmte Stelle, die Antigendeterminante (Epitop).
8 Die Grundstruktur aller Antikörper besteht aus je zwei identischen leichten und schweren
Polypeptidketten, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind (Abb. 1).
Kohlenhydrat
Disulfidbrücke
schwere Kette 450 Reste
leichte Kette 212 Reste
CH3 CH2
CH1
VH
CL
VL
Türangel-(hinge) Region
Antigen-bindungs-stellen
Abb. 1: Grundstruktur eines Antikörpers (IgG)
Von der kleineren Polypeptidkette (light chain) mit einem Molekulargewicht von 25.000 Da
existieren zwei Formen, die - und die -Form. Ihre Struktur gliedert sich in zwei globuläre Regionen
(Domänen), die in sich durch je eine Disulfidbrücke stabilisiert sind. Diejenige Region, welche die
Carboxylgruppe enthält, zeigt bei einem Vergleich der Aminosäuresequenzen verschiedener
Antikörper eine hohe Übereinstimmung und wird daher als konstante Region (CL-Region, constant
light chain) bezeichnet. Das aminoterminale Ende besitzt eine große Sequenzvariabilität und wird
daher variable Region (VL-Region, variable light chain) genannt.
Die schwere Polypeptidkette (heavy chain) existiert in fünf Formen () mit einem
Molekulargewicht von 50.000-77.000 Da. Jede dieser Formen ist mit einem Leichtkettentyp frei
kombinierbar, wodurch die fünf Immunglobulinklassen (IgA, IgD, IgE, IgG bzw. IgM) entstehen.
Variationen in der Schwerkettenstruktur innerhalb einer Klasse (z. B. 1, 2, 3 u. 4) führt zur Bildung
von Subklassen (entsprechend: IgG1, IgG2, IgG3, bzw. IgG4).
Die Struktur der schweren Ketten ist denen der Leichtkette sehr ähnlich. Bedingt durch die größere
Molmasse besitzen sie jedoch neben der variablen Region (VH-Region, variable heavy chain) drei
9 konstante Domänen (CH1, CH2, CH3). Der Kohlenhydratanteil, den alle Antikörper besitzen, ist an die
CH2-Region gebunden.
Die pflanzliche Proteinase Papain spaltet Immunglobuline in der Region zwischen den CH1- und CH2-
Domänen, der sogenannten Türangelregion (hinge region), wodurch zwei identische Fab-Fragmente
und ein Fc-Fragment entstehen (Abb. 2). Ein weiteres Enzym für die Fragmentierung von Antikörpern
ist Pepsin, welches zwei größere Fragmente erzeugt, das F(ab')2-Fragment, das die über die Hinge-
Region miteinander verbundenen Fab-Regionen umfasst, und das pFc'- Fragment, welches den CH3-
Domänen des Antikörpermoleküls entspricht.
Mit diesen Fragmenten konnte gezeigt werden, dass die Antigen-Antikörper-Bindungsorte in den
variablen Bereichen (VL, VH) des Antikörpers liegen, während der Fc-Teil die Bindung des
Immunglobulins an verschiedene Zellen des Immunsystems, sowie Komplementfaktoren vermittelt.
Die hohe Beweglichkeit der Hinge-Region erlaubt eine Änderung des Abstandes der
Antigenbindungsorte, wodurch diese unabhängig voneinander verfügbar sind.
10
F(ab’)2
Peptide mit niedriger Molmasse
sekundäre Spaltung durch Papain
Papain
Pepsin
pFc’
333 234
Fab
Fc’
Fc
433 341 224
Abb. 2: Enzymatische Spaltung von Immunglobulinen
Bei der Gewinnung von Antikörpern unterscheidet man diese in zwei Gruppen:
11 1) polyklonale Antikörper: Hier handelt es sich um eine Mischung von verschiedenen, gegen
diverse Epitope gerichteten Antikörpern. Sie werden aus dem Serum von zuvor mit Antigen
immunisierten Tieren gewonnen.
2) monoklonale Antikörper: Richten sich genau gegen ein spezifisches Epitop eines Anti-
gens. Für die Gewinnung werden Plasmazellen von zuvor immunisierten Tieren durch
Fusion mit Tumorzellen immortalisiert (Hybridom-Technik). Die so erhaltenen Hybridoma-
Zellen werden mehrfach vereinzelt (kloniert), so dass sich ein Zellstamm ergibt, der auf nur
eine Plasmazelle zurückgeht. Dieser Zellstamm kann nun theoretisch eine unendlich große
Menge monoklonaler Antikörper bilden.
2. Versuchsbeschreibung
Zur Bestimmung von Antikörpertitern (AK) gegen bestimmte Antigene existiert mittlerweile eine
Vielzahl von Methoden, wobei an dieser Stelle nur der RIA (radioimmunoassay) und der ELISA
(enzyme-linked immunosorbent assay) genannt seien. Beide Assays sind sehr einfach in der
Durchführung, doch sehr sensitiv und zuverlässig, was zu deren weit verbreiteter Anwendung geführt
hat. Die Grundlage beider Methoden beruht auf der Tatsache, dass bestimmte Kunststoffoberflächen
(z. B. Polystyrol, Polypropylen, Polycarbonat, Polyvinylchlorid) geringe Mengen der meisten Proteine
fest binden können. Beim ELISA können je nach Problemstellung verschiedene Typen des Tests
durchgeführt werden:
1) „indirekter“ ELISA: Das zu testende Antigen wird an eine geeignete Plastikoberfläche adsorbiert
(Coating, I in Abb. 3). Nach Entfernen des Antigens werden noch freie Bindungsstellen mit einem
nicht reagierenden Protein (z.B. Rinderserumalbumin) blockiert (hier nicht dargestellt). Die Detektion
des Antigens erfolgt über einen für dieses Antigen spezifischen Primärantikörper (II in Abb. 3). Durch
einen Sekundärantikörper, der an den Primärantikörper bindet und mit einem Enzym markiert ist,
kann nach Zugabe des entsprechenden Substrats ein Nachweis des Antigens über die Enzymreaktion
erfolgen (III in Abb. 3).
12
I
II
III
Antigen
Abb. 3: „indirekter“ ELISA
2) Sandwich-ELISA: Im Gegensatz zum indirekten ELISA wird hier nicht das Antigen, sondern ein für
das Antigen spezifischer Antikörper an die Plastikoberfläche gebunden. Dieser ist, nachdem noch
freie Bindungstellen mit einem nicht reagierenden Protein blockiert wurden, in der Lage, sein
Antigen aus einer Probelösung zu binden. Die Detektion erfolgt wiederum über einen zweiten
Antikörper, der an ein anderes Epitop des Antigens bindet und so das Sandwich bildet (AK-Antigen-
AK-Komplex). Der Nachweis der Bindung erfolgt wie im indirekten ELISA über einen mit Enzym
markierten Sekundärantikörper, der z.B. ein farbloses Substrat zu einer farbigen Verbindung umsetzt.
3) kompetitiver ELISA: Anstelle eines zweiten, markierten Antikörpers wird ein markiertes
Kompetitor-Antigen verwendet. Dieses ist dem Analyten (Antigen) strukturell ähnlich und konkurriert
so mit diesem um die Bindungstellen am Antikörper. Je weniger Analyt in einer Probe enthalten ist,
desto mehr Kompetitor bindet an den Antikörper und desto intensiver ist die Farbreaktion. Die
Farbintensität verhält sich umgekehrt zur Analyt-Konzentration:
wenig Analyt = fast alle Paratope (Bindungsstelle am Antikörper) vom markierten Kompetitor besetzt
= starke Farbreaktion
viel Analyt = schwache Farbreaktion
Im Praktikumsversuch soll ein His-Tag markiertes Protein (Gelonin) aus Expressionsversuchen mittels
eines indirekten ELISAs nachgewiesen werden. Es wird deshalb ein monoklonaler Anti-His-Tag
Antikörper als Primärantikörper verwendet. Zur Nachweisreaktion wird ein an Alkalische
Phosphatase (AP) gebundener Anti-Maus-Antikörper verwendet. Das Substrat der Alkalischen
Phosphatase ist para-Nitrophenylphosphat. Durch das Enzym wird hydrolytisch die Phosphatgruppe
abgespalten und es bildet sich zunächst farbloses para-Nitrophenol. Im Alkalischen wird para-
Nitrophenol zum gelben para-Nitrophenolat-Anion, welches bei 405 nm photometrisch bestimmt
werden kann.
Reaktion:
13
3. Versuchsdurchführung
3.1 Reagenzien und Chemikalien
Testprotein (Antigen) Rekombinantes Gelonin mit His-Tag (10 µg/ml)
Gelonin aus Samen von Gelonium multiflorum (10 µg/ml)
Kontrollen
Negativkontrollen: 10 µg/ml Cytochrom c
Positivkontrolle: 10 µg/ml rekombinantes Gelonin
Primärantikörper Monoklonaler antigenspezifischer Antikörper:
Mouse-Anti-His-Antikörper
Verdünnung: 1:2000 mit PBS-Tween
Enzymkonjugat Alkalische-Phosphatase-markierte, polyklonale Antikörper gegen Maus-Immunglobuline:
Anti-mouse-lgG-Antikörper (AP)
Verdünnung: 1:1000 mit PBS-Tween
Coating-Puffer Lösung A: 100 ml 0,2 M Na2CO3 (2,12 g ad 100 ml)
Lösung B: 100 ml 0,2 M NaHCO3 (1,68 g ad 100 ml)
Gebrauchslösung : 8,5 ml Lösung A + 4 ml Lösung B
pH 10,6 (pH-Kontrolle)
ad 50 ml mit bidest. Wasser
Waschpuffer PBS-Tween Na2HPO4 0,92 g
NaH2PO4 * H2O 0,35 g
NaCl 8,18 g
pH 7,2
ad 1 l mit deionisiertem Wasser
100 ml zur Seite stellen (= PBS-Puffer)
zu den restlichen 900 ml:
14
Tween 20 0,45 ml
Blockierlösung 1% BSA in PBS
250 mg BSA in 25 ml PBS
Substratpuffer (AP) MgCl2 * 6 H2O 0,1 g
DEA (Diethanolamin) 97 ml
pH 9,8
ad 1 l bidest. Wasser
Substratlösung (AP) 15 mg p-Nitrophenylphosphat ad 15 ml Substratpuffer
3.2 Versuchsablauf
a) Das Antigen wird im Coating-Puffer auf eine Konzentration von 10 g/ml eingestellt. Je Napf
werden 100 µl dieser Lösung eingebracht. Die Bindung an die feste Phase erfolgt über Nacht bei 4
°C.
b) Die Näpfe der Platte werden durch Ausschlagen geleert. Pro Napf werden 200 µl der
Blockierlösung eingefüllt. Die Inkubation erfolgt bei Raumtemperatur für 90 min.
c) 2-maliges Waschen mit jeweils 200 µl PBS-Tween-Puffer. Ausschlagen der Näpfe.
d) Je Napf werden 100 l Primärantikörperlösung eingebracht. Die Inkubation erfolgt bei
Raumtemperatur für 1 h (siehe „Aufteilung der Mikrotiterplatte“, Abschn. 3.3)
e) 2 × Waschen. Näpfe ausschlagen.
f) Das Enzymkonjugat wird auf eine geeignete Arbeitskonzentration gebracht, d. h. ca. 1000 ×
verdünnt (10 l Enzymkonjugatlsg. + 10 ml PBS-Tween) und 100 l pro Napf eingebracht. Die
Inkubation erfolgt bei Raumtemperatur für 1 h.
g) 2 × Waschen. Näpfe ausschlagen.
h) 100 l Substratlösung zugeben. Die Entwicklung erfolgt bei Raumtemperatur. Die Platte wird nach
10 min mit Hilfe eines EIA-Readers bei 414 nm vermessen.
3.3 Bestückung der Mikrotiterplatte
a) Blank:
Für die Messung benötigt der EIA-Reader eine Spalte der Platte als Blank. In die Spalte 1 dürfen
deshalb keine Proben eingebracht werden. Stattdessen wird PBS einpipettiert. Alle anderen Schritte
wie Blockieren, Konjugatzugabe usw. erfolgen wie beschrieben.
15 b) Negativkontrolle:
Um falsche positive Ergebnisse auszuschließen, müssen in jedem ELISA Negativkontrollen
durchgeführt werden. Zu diesem Zweck wird eine Spalte der Platte nicht mit Antigen beschichtet.
Das weitere Vorgehen erfolgt wieder wie beschrieben.
Die Ursachen für falschpositive Ergebnisse können sein:
Unspezifische Adsorption des Enzymkonjugates an das Plastikmaterial,
Kreuzreaktionen des Enzymkonjugates,
c) Positivkontrolle:
Um sicherzustellen, dass der ELISA richtig durchgeführt wurde, sollte immer eine Spalte der Platte
mit einer Probe bestückt werden, von der bekannt ist, dass sie für das verwendete Antigen
spezifische Antikörper enthält. Diese Löcher müssen sich beim Entwickeln auf jeden Fall färben.
4. Auswertung
Hinweis: Bitte pro Gruppe einen USB-Stick mitbringen. Die Messdaten stehen nur in digitaler Form
zur Verfügung.
Die Auswertung erfolgt zunächst optisch, indem man die Löcher notiert, die deutlich stärker gefärbt
sind als die Negativkontrollen. Die Messwerte des EIA-Readers werden statistisch ausgewertet.
Dazu werden die Negativkontrollen gemittelt und die Standardabweichung berechnet. Für jede
Probe wird ebenfalls der Mittelwert aus den Messwerten gebildet. Eine Probe ist dann positiv, wenn
dieser Mittelwert größer ist als die Summe aus dem Mittelwert der Negativkontrollen und der
zweifachen Standardabweichung.
5. Literatur
Harlow, E., Lane, D.,
Antibodies. A Laboratory Manual,
ColdSpringHarbor Laboratory, New York, 1988.
Kap. 14, Immunoassays, S. 553-612.
Goding, J. W.,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2nd ed.,
Academic Press, London, 1986.
Kap. 3.10, Screening Assays, S. 76-89.
Peters, J. H., Baumgarten, H., (Hrsg.),
Monoklonale Antikörper. Herstellung und Charakterisierung, 2. Auflage,
Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 1990.
Kap. 10, Nachweis von monoklonalen Antikörpern, S. 317-458.
16
Hemmkinetik mit Lactatdehydrogenase
Einführung
Proteine
Proteine gehören zu den wichtigsten Makromolekülen lebender Zellen. Sie sind aus 20 verschiede-
nen Aminosäuren aufgebaut, die in spezieller Reihenfolge (Sequenz, Primärstruktur) über Peptid-
bindungen miteinander verknüpft sind (Polypeptidketten). Die meisten Polypeptidketten bestehen
aus ca. 100 bis 300 Aminosäureresten, entsprechend molaren Massen von ca. 11000 bis 33000
g/mol, es gibt jedoch auch kleinere und viel größere.Die Aminosäuren besitzen Seitenketten mit
unterschiedlichen physikalischen (hydophob, hyophil) und chemischen Eigenschaften (aromatisch,
polar, sauer, basisch). Die fortlaufende Kette von Peptidbindungen und Cα-Atomen wird Rückgrat
genannt.
Die Polypeptidketten sind in der Zelle nicht beliebig ausgestreckt oder geknickt, sondern liegen in
ganz bestimmten Konformationen (Faltungen) vor, die von der Aminosäuresequenz abhängen und
durch Wechselwirkungen oder Kräfte (hydrophobe Wechselwirkungen, Van-der-Waals-Kräfte,
ionische Kräfte, Wasserstoffbrückenbindungen) oder zusätzliche kovalent-chemische Bindungen
(Disulfidbrücken) zwischen ihren Atomen und Atomgruppen stabilisiert werden (Raumstruktur,
Tertiärstruktur). Im wässrigen Milieu der Zelle ordnen sich hydrophobe Aminosäurereste im Inneren
der Struktur an, geladene und polare Gruppen stellen an der Außenseite Kontakte und Wechsel-
wirkungen mit dem Wasser her. Teilstrukturen sind oft in chrakteristischer regelmäßiger Form
ausgebildet und werden durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Atomen des Rückgrats
stabilisiert (Sekundärstrukturen wie schraubenförmige α-Helices oder aus aneinandergelagerten
Strängen gebildete β-Faltblätter). Schließlich können sich auch mehrere gefaltete Polypeptidketten
(Untereinheiten) zusammenlagern (Quartärstruktur).
Die Raumstruktur der Proteine (sog. native Struktur) ist wichtig für ihre biologische Funktion. Unter
verschiedenen Bedingungen - z. B. Hitze, extreme pH-Werte, Detergentien oder unpolare Lösungs-
mittel - kann es zur Entfaltung (Denaturierung) unter Verlust der definierten Raumstruktur und der
Funktion kommen. Die dabei entstehenden Zufallsstrukturen neigen zur Aggregation und werden in
Wasser unlöslich.
Enzyme
Die Funktion vieler Proteine ist es, chemische Reaktionen zu beschleunigen. Sie wirken damit als
Katalysatoren und werden Enzyme genannt. Ein wichtiges Funktionsprinzip bei der enzymatischen
Aktivität ist neben anderen, dass die Enzyme das reaktionsfähige Molekül (Substrat) samt eventu-
ellen Reaktionspartnern (Cosubstrate) in solcher Weise binden, dass die Reaktion erleichtert (die
Energie des Übergangszustandes herabgesetzt) wird. Dabei sind die meisten Enzyme spezifisch für
die Substrate, die sie binden, und die Reaktion, die sie an ihnen katalysieren. Bestimmte Substrate
mittlerer Molekülgröße, die nach der Reaktion in kurzen Reaktionszyklen regeneriert werden (und
damit in gewissem Sinn ebenso wenig verbraucht werden wie die Enzyme), werden als Coenzyme
bezeichnet. Das Gleichgewicht der Reaktion wird bei der Katalyse nicht verändert und es wird sowohl
die Hin- wie auch die Rückreaktion katalysiert.
Die Bindung der Substrate und Coenzyme durch das Enzym findet an spezifischen Bereichen
(Bindungsstellen oder -taschen) seiner Struktur statt. Mit diesen Bereichen überlappen sich teilweise
die sog. aktiven Zentren, an denen die eigentliche katalysierte Reaktion stattfindet. Die Reaktions-
geschwindigkeit der katalysierten Reaktion (d. i. wieviel Substrat sich pro Zeiteinheit in Produkt
17 umsetzt) kann bei gegebener Enzymkonzentration eine Obergrenze (maximale Geschwindigkeit, vmax)
nicht übersteigen (Sättigungskinetik), die erreicht wird, sobald alle Bindungsstellen des Enzyms mit
Substrat gesättigt sind.
Neben den Substraten gibt es natürlich vorkommende oder künstlich erzeugte Stoffe, die die
Enzymaktivität reversibel beeinflussen. Diese Effektoren werden in Aktivatoren, die die Aktivität
erhöhen, und Inhibitoren, welche sie erniedrigen, eingeteilt. Sie können eigene Bindungsstellen am
Enzym besetzen und ihre Wirkung durch Beeinflussung der Enzymkonformation ausüben (alloste-
rische Effektoren) oder es können mit dem Substrat aufgrund struktureller Ähnlichkeit um dieselbe
Bindungsstelle konkurrierende Hemmstoffe die Katalyse behindern (kompetitive Hemmung).
Enzymkinetik nach Michaelis und Menten
Die Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymatisch katalysierten Reaktion hängt u. a. auch von der
Substratkonzentration ab. Bei der maximalen Umsatzgeschwindigkeit (vmax) ist das Enzym vollständig
mit Substrat abgesättigt, während bei geringeren Substratkonzentrationen nicht alle Enzymmoleküle
abgesättigt sind.
KM [S]
v
vmax
vmax/2
Abb. 1
Sättigungskinetik (Reaktionsgeschwindigkeit über Substratkonzentration aufgetragen)
1923 lieferten Michaelis und Menten die mathematische Analyse dieses Verhaltens. Sie nahmen
folgenden Reaktionsverlauf an:
E + S k2
k1 ES
k4
k3 P + E
(E = Enzym, S = Substrat, ES = Enzymsubstratkomplex, P = Produkt)
[E] ist die Gesamtkonzentration an Enzym, ([E] - [ES]) die Konzentration an freiem Enzym. Die Menge
an S, die an E gebunden wird, ist, bezogen auf die Gesamtmenge an S, sehr klein und kann vernach-
lässigt werden. [S] entspricht dann zu Beginn der Messung der eingesetzten Substratkonzentration,
da noch kein P gebildet wurde. Aus demselben Grund ist bei Messung der Anfangsgeschwindigkeit
die Bildung von ES aus P + E mit der Geschwindigkeitskonstante k4 vernachlässigbar.
18 Ist die Bildungsgeschwindigkeit von ES,
k1 · ([E] - [ES]) · [S],
gleich seiner Zerfallsgeschwindigkeit,
k2 · [ES] + k3 · [ES],
so besteht ein Fließgleichgewicht (stationärer Zustand, steady state). Gleichsetzen der beiden Aus-
drücke und Zusammenfassen der drei Geschwindigkeitskonstanten ergibt die Michaeliskonstante
ES
SESE
1
32
M
k
kkK (1)
Wenn k2 k3, kann k3 vernachlässigt werden, und KM k2/k1 = KD ist die Dissoziationskonstante des
Gleichgewichts E + S ES.
Eine Bestimmung von KM ist dann möglich, wenn [ES] bestimmt werden kann. Dies ist auf direktem
Weg sehr schwierig, aber die Reaktionsgeschwindigkeit ist proportional [ES]:
v = k3 · [ES] (2)
Aus Gleichung (1) wird [ES] errechnet:
S
SEES
M
K
Dieser Wert wird in Gleichung (2) eingesetzt:
S
SE
M
3
K
kv
Wenn [S] so groß ist, dass die gesamte eingesetzte Enzymmenge als Enzymsubstratkomplex vorliegt
([E] = [ES]), ist die maximale Geschwindigkeit erreicht:
vmax = k3 · [E]
Daher:
vv
K
max
M
S
S
Dies ist die von Michaelis und Menten entwickelte Gleichung. Bei halbmaximaler Geschwindigkeit
wird KM = [S]. KM hat somit die Dimension einer Konzentration.
Bei Enzymreaktionen, an denen zwei oder mehr Substrate (und/oder Coenzyme) beteiligt sind, kann
für jedes ein eigener KM-Wert bestimmt werden, indem man bei dessen Messung die übrigen
Substrate (Coenzyme) in sättigenden Konzentrationen einsetzt.
Kinetik der kompetitiven Hemmung
Die kompetitive Hemmung beruht darauf, dass in einer individuellen Bindungstasche des Enzyms
entweder das Substrat oder den Hemmstoff gebunden werden kann, aber nicht beide. Bei großem
Überschuss an Substrat kann trotz der Anwesenheit von Inhibitor die Maximalgeschwindigkeit
erreicht werden, die sich daher nicht ändert. Die Substratkonzentration, bei der die halbmaximale
Geschwindigkeit errreicht wird (die scheinbare Michaelis-Konstante) wird erhöht.
19 Wir haben in der Reaktionsgleichung ein konkurrierendes Gleichgewicht (k5/k6) zu berücksichtigen:
EI + I
k6
k5 E
+ S
k2
k1 ES
k4
k3 P + E
(I = Inhibitor, EI = Enzym-Inhibitor-Komplex)
In der Michaelis-Menten-Gleichung wird KM mit einem Term multipliziert, der die Inhibitorkonzentra-
tion [I] und die Inhibitorkonstante KI enthält:
S
I1
S
M
max
IKK
vv
Abb. 2
Kinetik mit kompetitivem Inhibitor
vmax
vmax/2
KM KM(1+[I]/KI)
(scheinbare KM)
ohne Inhibitor
mit Inhibitor
mit mehr Inhibitor
20 Lactatdehydrogenase
Lactatdehydrogenase (LDH) ist ein Protein aus vier gleichen Untereinheiten (Homotetramer):
Abb. 3
Lactatdehydrogenase aus menschlichem Skelettmuskel
(Bild: Wikipedia, Strukturdaten: Protein Data Bank, Eintrag 1i10).
Es ist keine atomar aufgelöste Struktur wiedergegeben, sondern eine schematische
Repräsentation des Protein-Rückgrats durch „Bänder“ und „Schnüre“.
Ihrer Funktion nach ist LDH ein Enzym, das die Reduktion von Pyruvat zu Lactat katalysiert unter
gleichzeitiger Oxidation des Coenzyms NADH zu NAD+.
Pyruvat + NADH + H+ (LDH)
L-Lactat + NAD+
Pyruvat entsteht in der Glykolyse aus Glucose, wobei gleichzeitig NADH und ATP gebildet werden.
Die Regenerierung von NAD+ aus NADH in der LDH-Reaktion ermöglicht die Fortsetzung der Glykolyse
und somit die weitere ATP-Bildung, auch wenn keine anderen Elektronenakzeptoren (Oxidations-
mittel) wie z. B. Sauerstoff (O2) vorhanden sind (z. B. anaerobe Muskelarbeit) oder genetisch bedingt
keine Atmungskette existiert (z. B. anaerobe Bakterien).
21
Abb. 4
Strukturformeln von Pyruvat, L-Lactat, NAD+, NADH und AMP. Die Struktur von NADH ist
abgekürzt, ihren fehlenden Teil sieht man bei NAD+. Man beachte die Struktur-Überein-
stimmungen bei AMP und NAD+/NADH.
Photometrie
Wird eine Küvette, die mit einer absorbierenden Flüssigkeit oder Lösung gefüllt ist, von Licht durch-
strahlt, dann bewirkt die Absorption durch den Küvetteninhalt eine Intensitätsabnahme des Licht-
strahls. Diese ist von der Wellenlänge des Lichts, der Konzentration der absorbierenden Probe, der
Länge des Lichtweges durch die Messlösung sowie einer Stoffkonstanten (dem Extinktionskoeffizi-
enten ) abhängig. Die Wellenlängen, bei denen ein Maximum hat (die Absorptionsmaxima) sind
für absorbierende Atomgruppierungen (Chromophore) wie z. B. Nitrogruppen, Doppelbindungen,
Aromaten u. v. a. charakteristisch.
Die Konzentrationsbestimmung durch Messung der Absorption (auch Extinktion genannt) einer
monochromatischen Strahlung nach Durchgang durch die Messlösung bezeichnet man als Photo-
metrie.
Grundlage für die photometrischen Konzentrationsbestimmungen ist das Lambert-Beersche Gesetz,
nach dem sich die Konzentration einer Lichtenergie absorbierenden Verbindung in verdünnter
Lösung berechnen lässt:
cE
d
c = Konzentration [mol/l]
= molarer Extinktionskoeffizient [l mol–1 cm–1]
d = Schichtdicke der Küvette [cm]
E = Extinktion (dimensionslos)
Die Ableitung des Lambert-Beerschen Gesetzes ist den Lehrbüchern zu entnehmen.
Aufgabe Bestimmung der KM-Werte bzw. scheinbaren KM-Werte der LDH aus Schweine-Skelettmuskel für
NAD+ ohne Inhibitor und mit zwei verschiedenen Inhibitor-Konzentrationen sowie Bestimmung der
Maximalgeschwindigkeit und der Inhibitorkonstanten für AMP in diesem System.
Pyruvat
L-Lactat
NADH
H H H
NAD+
O-
AMP
22 Als Inhibitor wird AMP benutzt. Es kann auf Grund struktureller Ähnlichkeit mit NAD+ (s. Abb. 4) an
dieselbe Bindungstasche der LDH binden und hemmt daher kompetitiv.
Experimentelle Erwägungen
Aus praktischen Gründen untersuchen wir die Rückreaktion der physiologischen LDH-
Reaktion:
L-Lactat + NAD+ (LDH)
Pyruvat + NADH + H+
Während der Reaktion nimmt die Konzentration von NADH und Pyruvat zu. Während Pyruvat
(und Lactat) wegen mangelnder Absorption im sichtbaren oder nahen UV-Licht photomet-
risch schlecht zu bestimmen sind, kann NADH bei einer Wellenlänge von 340 nm verfolgt
werden, wo eine seiner Absorptionsbanden ein Maximum besitzt, ohne dass NAD+ dort
absorbiert. (Manchmal wird NADH gerätebedingt auch bei 366 nm gemessen. Dies entspricht
jedoch nicht seinem Absorptionsmaximum und ist daher weniger günstig.)
Abb. 5
Absorptionsspektren von NAD+ und NADH
Der molare Extinktionskoeffizient bei 340 nm ε340 von NADH beträgt 6300 l mol–1 cm–1. Die
Schichtdicke unserer Küvetten beträgt 1 cm.
Das bedeutet z. B., dass eine 10-4-molare Lösung (Lösung von 0,1 mmol/l) von NADH in
unserer Küvette bei 340 nm eine Extinktion von 0,63 aufweisen würde.
Da Reaktionsgeschwindigkeiten grundsätzlich temperaturabhängig sind, müssen die Proben
thermostatisiert werden.
Um die Gültigkeit der Michaelis-Menten-Gleichung sicherzustellen, muss die
Anfangsgeschwindigkeit bestimmt werden.
Daher wird das Enzym zuletzt zugegeben, möglichst schnell gemischt und sofort gemessen.
ε [1
03 l
mo
l-1 c
m-1
]
23 Die Aufgabe unterteilt sich wie folgt:
1. Messung der Reaktionsgeschwindigkeit bei 5 verschiedenen NAD+-Konzentrationen. Die
Konzentration von Lactat wird dabei in gleichbleibender, sättigender Höhe eingesetzt. AMP
wird zunächst nicht zugegeben.
2. Zweimalige Wiederholung der Messreihe bei zwei verschiedenen AMP-Konzentrationen.
3. Auswertung
Durchführung
Von den Assistenten werden folgende Stammlösungen bereitgestellt:
Lösung Konzentration, pH Vorbereitungshinweise für Assistenten
Glycinpuffer 0,1 M, pH 9,5
Phosphatpuffer 67 mM NaH2PO4, pH 7,2
LDH aus Schweine-Skelettmuskel
ca. 0,125 mg/ml in Phosphatpuffer pH 7,2, genaue Konz. wird bekannt gegeben
100 µl Ammoniumsulfatsuspension (10 mg/ml) 10 min zentrifugieren bei 13000 rpm (Eppendorf-Zentrifuge). Pellet aufnehmen in 200 µl Phosphatpuffer. Photometr. Konz.-Best.: A280 = 1,34 entspricht 1 mg/ml (für diese Messung 1:10 verdünnen). Für Versuch 1:40 verdünnen.
Tabelle 1
Von den Studierenden werden folgende Stammlösungen hergestellt:
Lösung Konzentration Hinweise
NAD+ 10 mM in Wasser (sprich: “10 millimolar”, Bedeutung: 10 mmol/l)
molare Masse MW = 663,4 genaue Einwaage wird bekannt gegeben
AMP 10 mM in Glycinpuffer pH 9,5 MW = 347,22 genaue Einwaage wird bekannt gegeben
L-Lactat 0,7 M in Glycinpuffer pH 9,5 Lithium-Lactat, MW = 96,01 genaue Einwaage wird bekannt gegeben
Tabelle 2
Alle Stammlösungen werden mit Eiswasser gekühlt.
Messung ohne Inhibitor
In 15-ml-Falcon-Röhrchen werden die in der folgenden Tabelle 3 aufgeführten Mengen
zusammenpipettiert und gemischt (Raumtemperatur).
Pipettierschema
Angaben in ml
Probe 1 2 3 4 5
Glycin-Puffer 4,655 4,640 4,610 4,55 4,40
Lactat 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
AMP 0 0 0 0 0
NAD+ 0,045 0,06 0,09 0,15 0,3
Summe 5 5 5 5 5
Tabelle 3
24 Messung der Proben
Aus jedem Röhrchen werden 0,5 ml entnommen und in nummerierte Plastikküvetten bis zur
Messung (mind. 5 min) im Thermoblock auf 25 ° temperiert.
Danach werden für Küvette 1 folgende Operationen durchgeführt, wobei die Messwerte in die
unten stehende Tabelle 4 eingetragen werden:
Küvette in den Strahlengang des Photometers stellen (Markierungspfeil nach vorne zeigend).
Photometer mit geschlossenem Deckel bei 340 nm auf 0 abgleichen (“blanken”).
Dann muss es schnell gehen:
Stoppuhr starten, möglichst gleichzeitig 10 µl der Enzymstammlösung in die Küvette
pipettieren, schnell aber gründlich mit der Pipette umrühren, Deckel des Photometers
schließen und nach 6 s E340 ablesen und notieren (Tabelle 4).
Danach weitere 90 s lang alle 9 s E340 und Zeit ablesen und notieren.
Auf dieselbe Weise werden die Proben 2 – 5 gemessen und die Werte in die unten stehende
Tabelle 4 eingetragen.
Messdaten ohne Inhibitor
Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5
Zeit [s] E340 Zeit [s] E340 Zeit [s] E340 Zeit [s] E340 Zeit [s] E340
6 6 6 6 6
15 15 15 15 15
24 24 24 24 24
33 33 33 33 33
42 42 42 42 42
51 51 51 51 51
60 60 60 60 60
69 69 69 69 69
78 78 78 78 78
87 87 87 87 87
96 96 96 96 96
Tabelle 4
25 Messung mit 0,3 ml AMP-Lösung
In 15-ml-Falcon-Röhrchen werden die in der folgenden Tabelle 5 aufgeführten Mengen
zusammenpipettiert und gemischt (Raumtemperatur).
Pipettierschema
Angaben in ml
Probe 1 2 3 4 5
Glycin-Puffer 4,355 4,34 4,31 4,25 4,1
Lactat 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
AMP 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
NAD+ 0,045 0,06 0,09 0,15 0,3
Summe 5 5 5 5 5
Tabelle 5
Messung der Proben
Die Proben 1 – 5 werden wie oben beschrieben gemessen und die Werte in die unten stehende
Tabelle 6 eingetragen.
Messdaten mit 0,3 ml AMP-Lösung
Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5
Zeit [s] E340 Zeit [s] E340 Zeit [s] E340 Zeit [s] E340 Zeit [s] E340
6 6 6 6 6
15 15 15 15 15
24 24 24 24 24
33 33 33 33 33
42 42 42 42 42
51 51 51 51 51
60 60 60 60 60
69 69 69 69 69
78 78 78 78 78
87 87 87 87 87
96 96 96 96 96
Tabelle 6
Messung mit 0,6 ml AMP-Lösung
In 15-ml-Falcon-Röhrchen werden die in der folgenden Tabelle 8 aufgeführten Mengen
zusammenpipettiert und gemischt (Raumtemperatur).
26 Pipettierschema
Angaben in ml
Probe 1 2 3 4 5
Glycin-Puffer 4,055 4,04 4,01 3,95 3,8
Lactat 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
AMP 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
NAD+ 0,045 0,06 0,09 0,15 0,3
Summe 5 5 5 5 5
Tabelle 7
Messung der Proben
Die Proben 1 – 5 werden wie oben beschrieben gemessen und die Werte in die unten stehende
Tabelle 8 eingetragen.
Messdaten mit 0,6 ml AMP-Lösung
Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5
Zeit [s] E340 Zeit [s] E340 Zeit [s] E340 Zeit [s] E340 Zeit [s] E340
6 6 6 6 6
15 15 15 15 15
24 24 24 24 24
33 33 33 33 33
42 42 42 42 42
51 51 51 51 51
60 60 60 60 60
69 69 69 69 69
78 78 78 78 78
87 87 87 87 87
96 96 96 96 96
Tabelle 8
Auswertung
Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen
Aus jeder Zeitreihe einer Probe muss die Anfangsgeschwindigkeit bestimmt werden. Dazu wird wie
folgt vorgegangen:
(1) Ein Diagramm (Abszisse = Zeit-Achse (t), Ordinate = Extinktions-Achse (E340)) wird vorbereitet.
Skalieren Sie Extinktionsachse so, dass alle Messpunkt Platz finden.
(2) Die Messpunkte werden in das Diagramm eingetragen.
27 (3) Die Messpunkte im Diagramm werden von Hand mit einer glatten Kurve gefittet
(angenähert).
Die Kurve muss nicht alle Messpunkte exakt berühren, da sie eine Ausgleichskurve darstellen
soll und die Messpunkte streuen können.
(4) Die glatte Kurve wird über den Beginn der Messung hinaus nach links bis zum Schnittpunkt
mit der Abszisse (Zeit-Achse) extrapoliert (weitergeführt).
Dabei soll der bisherige Krümmungsverlauf der Kurve so gut wie möglich weitergeführt
werden.
Auf Grund von Unwägbarkeiten beim Mischvorgang wird die Extrapolation im Allgemeinen
die Abszisse nicht bei t=0 schneiden.
(5) Am Schnittpunkt mit der Abszisse wird mit dem Lineal eine Tangente an die extrapolierte
Kurve gelegt.
(6) Mit Hilfe eines Steigungsdreiecks an der Tangente wird die Tangentensteigung und somit die
Anfangssteigung der Kurve ermittelt. Diese entspricht der Anfangsgeschwindigkeit der
Enzymreaktion.
Beispiel:
Abb. 6
Beispiel für die graphische Auswertung einer Extinktions/Zeit-Kurve.
ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: 0,62 / 1 min = 0,62/min
E340
t [s]
96 87 78 69 60 51 42 33 244
15 6 -3
ΔE =
0,6
2
0,8
×
0,6
0,4
0,2
×
× ×
× ×
×
× × × ×
Δt = 1 min
28 Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen ohne
Inhibitor
Ohne Inhibitor, Probe 1
ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________
Ohne Inhibitor, Probe 2
ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________
E340
t [s]
96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3
E340
t [s]
96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3
29 Ohne Inhibitor, Probe 3
ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________
Ohne Inhibitor, Probe 4
ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________
E340
t [s]
96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3
E340
t [s]
96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3
30 Ohne Inhibitor, Probe 5
ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________
Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen mit 0,3 ml
AMP-Lösung
Mit 0,3 ml AMP-Lösung, Probe 1
ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________
E340
t [s]
96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3
E340
t [s]
96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3
31 Mit 0,3 ml AMP-Lösung, Probe 2
ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________
Mit 0,3 ml AMP-Lösung, Probe 3
ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________
E340
t [s]
96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3
E340
t [s]
96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3
32 Mit 0,3 ml AMP-Lösung, Probe 4
ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________
Mit 0,3 ml AMP-Lösung, Probe 5
ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________
E340
t [s]
96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3
E340
t [s]
96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3
33 Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen mit 0,6 ml
AMP-Lösung
Mit 0,6 ml AMP-Lösung, Probe 1
ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________
Mit 0,6 ml AMP-Lösung, Probe 2
ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________
E340
t [s]
96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3
E340
t [s]
96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3
34 Mit 0,6 ml AMP-Lösung, Probe 3
ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________
Mit 0,6 ml AMP-Lösung, Probe 4
ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________
E340
t [s]
96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3
E340
t [s]
96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3
35 Mit 0,6 ml AMP-Lösung, Probe 5
ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: _____________________________________________________
Die reziproke oder Lineweaver-Burk-Auftragung
Die Auftragung der Anfangsgeschwindigkeit v über der anfänglichen Substratkonzentration [S] wie in
Abb. 1 hat die Schwierigkeit, dass sehr hohe NAD+-Konzentrationen angewandt werden müssten, um
den Maximalwert vmax zu erhalten.
Das Verfahren von Lineweaver und Burk umgeht diese Schwierigkeit. Die Michaelis-Menten-
Gleichung wird folgendermaßen umgeformt:
1 1 1
v
K
v
K
v v
M
max
M
max max
S
S S
Diese Gleichung hat die allgemeine Form y = ax + b (mit y = 1/v und x = 1/[S]) und stellt die Gleichung
einer Geraden dar. Es resultiert daher eine Gerade, wenn die experimentell gewonnenen Daten in
Form von 1/v gegen 1/[S] aufgetragen werden. Die Steigung a der Geraden entspricht KM/vmax, der
Ordinatenabschnitt 1/vmax und der Abszissenabschnitt –1/KM (Abb. 3).
E340
t [s]
96 87 78 69 60 51 42 33 24 15 6 -3
36
2/vmax
1/[S] –1/KM
a=KM/vmax
1/KM
1/v
1/vmax
x
Abb. 7
Reziproke oder Lineweaver-Burk-Auftragung
Die ermittelten Tangentensteigungen (ΔE/Δt) sind nach dem Lambert-Beerschen Gesetz
proportional zur jeweiligen zeitlichen Zunahme der NADH-Konzentration (Δc/Δt) und somit zur
Geschwindigkeit v der enzymatischen Reaktion.
Proportionalitätsfaktor ist 1/ε340, wobei ε340 = 6300 l · mol-1 · cm-1. Zusätzlich muss die Schichtdicke d
der Probe im Strahlengang berücksichtigt werden (1 cm):
[
]
[
]
oder mit anderen Einheiten:
[
]
Die Extinktion E und die Extinktionsänderung ΔE sind dimensionslos.
Statt 1/[S] wird 1/[NAD+], die reziproke NAD+-Konzentration zu Beginn der jeweiligen Reaktion in der
Küvette, auf der Abszisse aufgetragen.
Verdünnungsberechnung
NAD+ wurde zunächst von der Stammlösung in das Falcon-Röhrchen pipettiert und dadurch
verdünnt. Das Volumen im Falcon-Röhrchen ist 5 ml. Die NAD+-Konzentration im Falcon-
Röhrchen berechnet sich also wie folgt:
[NAD+]Falcon = [NAD+]Stammlösung × NAD+-Volumenpipettiert / 5 ml
Die Stammlösung ist 10 mM oder 10 µmol/ml, also wird:
[NAD+]Falcon = 10 µmol/ml × NAD+-Volumenpipettiert / 5 ml
Nachdem 0,5 ml Lösung aus dem Falcon-Röhrchen in die Küvette pipettiert wurden,
wurden 0,01 ml Enzymlösung dazugegeben und dadurch das NAD+ nochmals verdünnt (von
0,5 ml auf 0,51 ml). Man rechnet:
[NAD+]Küvette = [NAD+]Falcon × 0,5/0,51
= 10 µmol/ml × NAD+-Volumenpipettiert / 5 ml × 0,5/0,51
37
Maßgeblich ist die Konzentration in der Küvette.
Genau dieselben Überlegungen gelten für den Inhibitor AMP. Berechnen Sie:
AMP-Volumen pipettiert [ml]
[AMP] in Küvette [µmol/ml]
0,3
0,6
Tabelle 9
38 Umrechnung der Messwerte
Tragen Sie Ihre Messergebnisse in die folgende Tabelle 10 ein oder erstellen Sie eine gleichwertige
Excel-Tabelle und legen Sie diese mit dem Protokoll vor.
Ohne Inhibitor
NAD+-Vol. pipettiert
[ml]
[NAD+] in Küvette
[µmol/ml]
1/[NAD+] in Küvette
[ml/µmol]
Steigung ΔE/Δt
[1/min]
v
[
]
1/v
[
]
Probe 1 0,045
Probe 2 0,06
Probe 3 0,09
Probe 4 0,15
Probe 5 0,3
Mit 0,3 ml AMP
NAD+-Vol. pipettiert
[ml]
[NAD+] in Küvette
[µmol/ml]
1/[NAD+] in Küvette
[ml/µmol]
Steigung ΔE/Δt
[1/min]
v
[
]
1/v
[
]
Probe 1 0,045
Probe 2 0,06
Probe 3 0,09
Probe 4 0,15
Probe 5 0,3
Mit 0,6 ml AMP
NAD+-Vol. pipettiert
[ml]
[NAD+] in Küvette
[µmol/ml]
1/[NAD+] in Küvette
[ml/µmol]
Steigung ΔE/Δt
[1/min]
v
[
]
1/v
[
]
Probe 1 0,045
Probe 2 0,06
Probe 3 0,09
Probe 4 0,15
Probe 5 0,3
Tabelle 10
39 Graphische Bestimmung oder Berechnung der (scheinbaren) KM-Werte und der
Maximalgeschwindigkeit
Zeichnen Sie für jede Inhibitorkonzentration ein Diagramm mit den reziproken
Geschwindigkeiten über den reziproken NAD+-Konzentrationen (bezogen auf Küvette).
Zeichnen Sie mit dem Lineal eine Ausgleichsgerade ein und entnehmen Sie 1/KM (aus dem
Abszissenabschnitt) und somit KM nach dem Vorbild von Abb. 7. Entnehmen Sie auch 1/v (aus
dem Ordinatenabschnitt) und somit v.
oder
erstellen Sie die Diagramme und berechnen Sie die Ausgleichsgeraden sowie die KM- und
v-Werte mit einem Computer. Legen Sie die Computerdiagramme dem Assistenten mit
diesem Protokoll vor.
Für die Messungen in Abwesenheit von AMP erhalten wir den -Wert für NAD+.
In Anwesenheit von AMP erhalten wir scheinbare -Werte .
Die Einheit der - und -Werte ist µmol/ml oder mM.
Ohne AMP
Ergebnis ohne Inhibitor:
(1/mM)
(mM)
(min/mM)
(mM/min)
Tabelle 11
1/v [min · ml / µmol]
1/[NAD+] [ml/µmol]
40 Mit 0,3 ml AMP-Lösung
Ergebnis mit 0,3 ml AMP:
(1/mM)
(mM)
(min/mM)
(mM/min)
Tabelle 12
1/v [min · ml / µmol]
1/[NAD+] [ml/µmol]
41 Mit 0,6 ml AMP-Lösung
Ergebnis mit 0,6 ml AMP:
(1/mM)
(mM)
(min/mM)
(mM/min)
Tabelle 13
Berechnung der Inhibitorkonstante KI sowie Berechnung und Umrechnung des
Durchschnittwerts von vmax
Für die Messungen in Abwesenheit von AMP erhalten wir den -Wert für NAD+.
In Anwesenheit von AMP erhalten wir scheinbare -Werte , für die gilt:
(
)
Da KM und [I] bekannt sind, kann KI, die Inhibitorkonstante von AMP für NAD+ bei LDH, berechnet
werden:
1/v [min · ml / µmol]
1/[NAD+] [ml/µmol]
42 Auch KI hat die Einheit µmol/ml oder mM.
Berechnen Sie die Inhibitorkonstante KI, indem Sie für [I] die AMP-Konzentrationen aus Tabelle 9 und
für KM den Wert aus der Messung ohne Inhibitor (Tabelle 11) einsetzen:
[
]
(aus Tabelle 9)
[
]
(aus Messung) [
]
Durchschnitt
[
]
mit 0,3 ml AMP-Lösung
mit 0,6 ml AMP-Lösung
Tabelle 14
Die oben erhaltene Maximalgeschwindigkeit vmax wird in der Enzymkinetik als volumenbezogene
Aktivität bezeichnet und die oben dafür verwendeten Einheiten (
) werden traditionell als
U/ml bezeichnet (U: von „unit“).
Bei kompetitiver Inhibition ändert sich vmax nicht. Wir sollten also bei allen Inhibitorkonzentrationen
ähnliche vmax-Werte erhalten haben und bilden daraus den Durchschnitt:
[
]
(aus Messung)
Durchschnitt
[
]
ohne Inhibitor
mit 0,3 ml AMP-Lösung
mit 0,6 ml AMP-Lösung
Tabelle 15
Um die spezifische Aktivität des Enzyms (in U/mg oder
) zu erhalten, muss die
volumenbezogene Aktivität (Durchschnitt aus Tabelle 15) durch die Enzymkonzentration in der
Küvette dividiert werden. Die Enzymkonzentration in der Küvette ist die bekannt gegebene
Konzentration der Enzymstammlösung (in
) multipliziert mit
. Letzteres ist der Faktor der
Verdünnung, die dem Enzym widerfährt, weil 0,01 ml Enzymstammlösung zu 0,5 ml Küvetteninhalt
gegeben werden.
Berechnen Sie die Enzymkonzentration in der Küvette:
Konzentration der Enzymstammlösung [
] Konzentration in Küvette [
]
43 Berechnen Sie die Aktivitätsmenge in der Küvette und die spezifische Aktivität des Enzyms:
volumenbez. Aktivität [U/ml]
(vmax aus Tabelle 15)
spezifische Aktivität [U/mg]
Abschließende Beurteilung
Entsprachen alle Messergebnisse Ihren Erwartungen?
o Ja
o Nein
Falls nicht, welche Ergebnisse waren unerwartet und welche Gründe könnten dafür vorliegen?
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________