Biogenese und Virusassembly des filamentösen Coliphagen M13 · Biogenese und Virusassembly des...

Biogenese und Virusassembly des filamentösen

Coliphagen M13

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades

der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

Fakultät Naturwissenschaften

Universität Hohenheim

Institut für Mikrobiologie

vorgelegt von

Martin Ploß

aus Bietigheim-Bissingen

2012

Dekan: Prof. Dr. Heinz Breer

1. berichtende Person: Prof. Dr. Andreas Kuhn

2. berichtende Person: Prof. Dr. Artur Pfitzner

Eingereicht am: 08.05.2012

Mündliche Prüfung am: 17.10.2012

Die vorliegende Arbeit wurde am 18.07.2012 von der Fakultät Naturwissenschaften

der Universität Hohenheim als „Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der

Naturwissenschaften“ angenommen.

Gewidmet

meiner geliebten Frau Stefanie

und

meinem geliebten Sohn Florian

Inhaltsverzeichnis

2

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 8

1.1 Der Bakteriophage M13 8

1.1.1 Klassifizierung des Bakteriophagen M13 8

1.1.2 Morphologie und Genom der Inoviridae 8

1.1.3 Gene, Genprodukte und ihre Funktionen 10

1.1.4 Struktur des Bakteriophagen M13 13

1.1.5 Der Zyklus des Bakteriophagen M13 14

1.2 Der gp1/11-Assembly-Komplex 21

1.3 Das Hüllprotein gp9 24

1.4 „Phage-Display“ 25

1.5 Proteintransport-Systeme 28

1.6 Aufgabenstellung der vorliegenden Arbeit 35

2 Material und Methoden 37

2.1 Material 37

2.1.1 Bakterien- und Bakteriophagenstämme 37

2.1.2 Plasmide 39

2.1.3 DNS-Standard für Agarose-Gelelektrophoresen 41

2.1.4 Enzyme 41

2.1.5 Antikörper 42

2.1.6 Proteinstandard 43

2.1.7 Aminosäuren, Zucker und Vitamine 44

2.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien 44

2.3 Oligonukleotide 48

2.3.1 Sequenzierprimer 48

2.3.2 Oligonukleotide für ortsgerichtete Mutagenesen 48

2.3.3 Oligonukleotide für die Amplifikation von Genen 49

2.3.4 Oligonukleotide für die Insertion eines antigenen Epitops 49

2.4 Geräte 50

2.5 Verwendete Kits 52

2.6 Kulturmedien 52

2.6.1 Festmedien 52

2.6.2 Flüssigmedien 53

2.7 Puffer und Lösungen 54

Inhaltsverzeichnis

3

2.7.1 Agarosegelelektrophorese 54

2.7.2 Coomassiefärbung 55

2.7.3 DNS-Puffer 55

2.7.4 DNS-Sequenziergel 55

2.7.5 Herstellung von Phagenstammlösungen 56

2.7.6 Induktion von Expressionssystemen 56

2.7.7 Kompetente E. coli-Zellen 56

2.7.8 Nanogoldmarkierung von M13-Phagen 57

2.7.9 Negativkontrastierung von biologischen Proben für die Transmissions-

elektronenmikroskopie (TEM) 57

2.7.10 Proteinstandard für die präparative Gelfiltration 57

2.7.11 Radioaktive Markierung in vivo mit anschließender Immunpräzipitation

und Protease-Mapping 58

2.7.12 Reinigung der gp1/11-Assembly-Komplexe mittels präparativer Gel-

filtration 59

2.7.13 Reinigung der gp1/11-Assembly-Komplexe mittels Metallaffinitätschro-

matographie (IMAC) 59

2.7.14 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) 61

2.7.14.1 SDS-PAGE nach Laemmli (1970) 61

2.7.14.2 SDS-Tricin-Gelelektrophorese nach Schägger & Jagow (1987) 63

2.7.15 Stammlösungen 64

2.7.16 Dot-Blot / Western-Blot 65

2.8 Methoden 65

2.8.1 Herstellung von E. coli-Vorkulturen 65

2.8.2 Herstellung transformationskompetenter E. coli-Zellen 65

2.8.3 Transformation von E. coli 66

2.8.4 Transfektion von E. coli 66

2.8.5 Isolierung von Plasmid-DNS aus E. coli 67

2.8.6 Isolierung von M13 RF-Plasmid-DNS aus E. coli 67

2.8.7 Agarose-Gelelektrophorese 68

2.8.8 Restriktionsverdau von Plasmid-DNS und DNS-Fragmenten 68

2.8.9 Ligationsansätze 69

2.8.10 Hybridisierung von Oligonukleotiden zur Ligation 69

2.8.11 Ethanol-Fällung von Plasmid-DNS 70

Inhaltsverzeichnis

4

2.8.12 DNS-Sequenzierung 70

2.8.13 PCR-Reaktionen 71

2.8.14 Ortsgerichtete Mutagenese (QuikChange® Mutagenese) 72

2.8.15 Komplementationstest 73

2.8.16 Konstruktion spezifischer M13-Phagenstämme 75

2.8.17 Plasmidkonstrukte 76

2.8.18 „One-step growth“ Experiment 78

2.8.19 M13 Adsorptionsassay 79

2.8.20 Messung des Extrusionsverlaufs von M13-Phagen auf der Zellober-

fläche von E. coli 80

2.8.21 Herstellung von M13-Phagenstammlösungen 81

2.8.22 Phagentiterbestimmung 81

2.8.23 TCA-Fällung von Proteinen 82

2.8.24 Bestimmung der Bakterienzellzahl 83

2.8.25 Präparation transfizierter E. coli DH5α-Zellen für AFM und

TEM-Messungen 83

2.8.26 Präparation und Adsorption von E. coli-Zellen für AFM-Messungen 83

2.8.27 Präparation und Adsorption von E. coli-Zellen für TEM-Messungen 84

2.8.28 „Atomic Force Microscopy“ (AFM) 84

2.8.29 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 85

2.8.30 Immunogold-Markierung von M13-Phagen 85

2.8.31 Immunogold-Markierung infizierter/uninfizierter E. coli DH5α-Zellen 86

2.8.32 Expression des gp1/11-Assembly-Komplexes 86

2.8.33 Proteinreinigung mittels Metallaffinitätschromatographie (IMAC) 87

2.8.34 Präparative Gelfiltration 88

2.8.35 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 90

2.8.36 Coomassiefärbung von SDS-Proteingelen 91

2.8.37 Western-Blot (semi-dry) und Membranbehandlung 91

2.8.38 Dot-Blot Analyse und Membranbehandlung 92

2.8.39 Pulse-labelling-Experimente, Immunpräzipitation und Protease-Mapping 93

2.8.40 In vivo Versuch zur YidC-abhängigen Membraninsertion von gp9T7 95

2.8.41 Quantifizierung radioaktiv markierter Proteine („Phosphorimaging“) 95

2.8.42 Präparation FPLC gereinigter gp1/11-Assembly-Komplexe für TEM-Auf-

nahmen 96

Inhaltsverzeichnis

5

3 Ergebnisse 97

3.1 Quantifizierung der M13-Phagenextrusion 98

3.1.1 Quantifizierung der wildtypischen M13-Phagenextrusion 98

3.1.2 Quantifizierung der M13mp19am8-Phagenextrusion während der

Komplementation durch das plasmidkodierte Haupthüllprotein gp8 101

3.1.3 M13-Adsorption an F-Pili in Abhängigkeit von der M.O.I. 104

3.2 Visualisierung M13-infizierter E. coli-Zellen 106

3.2.1 Immunogold-Markierung von M13-Phagen 107

3.2.2 TEM-Aufnahmen M13-sekretierenderE. coli DH5α-Zellen 108

3.2.3 AFM-Aufnahmen M13-sekretierender E. coli DH5α-Zellen 110

3.2.4 Veränderung der bakteriellen Zelloberfläche nach M13-Infektion 111

3.2.4.1 Extrusionsverlauf der M13-Phagen auf der Zelloberfläche von E. coli 111

3.3 Funktionelle Präsentation und Detektion von antigenen Epitopen am

N-Terminus des „Minor Coat“ Proteins gp9 116

3.3.1 Komplementationstest der gp9 Konstrukte 119

3.3.2 Expressionsnachweis der gp9 Mono-Tag Konstrukte in E. coli K38 121

3.3.3 Expressionsnachweis der gp9 Di-Tag Konstrukte in E. coli K38 122

3.3.4 Membraneinbau der Proteine gp9T7SD und gp9T7repSD in E. coli K38 124

3.3.5 Nachweis der exprimierten gp9 Konstrukte im M13-Phagen 126

3.3.5.1 Nachweis der exprimierten gp9-Konstrukte im M13-Phagen mit Hilfe

von Immun-Dot-Blots 126

3.3.5.2 Nachweis der exprimierten gp9 Doppel-Tag-Konstrukte im M13-Phagen

durch Markierung mit Protein-A konjugiertem Gold 129

3.3.6 Translokation des Konstrukts gp9T7SD in Abhängigkeit von der E. coli

Membraninsertase YidC 131

3.4 Massenbestimmung des gp1/11-Assembly-Komplexes und TEM-Auf-

nahmen der gereinigten Komplexe 135

3.4.1 Überexpression und Identifikation des M13 gp1/11-Assembly-Komplexes

in E. coli C41 135

3.4.2 Reinigung überexprimierter M13 gp1/11-Assembly-Komplexe aus E. coli

C41 mittels Metallaffinitätschromatographie (IMAC) 137

3.4.3 Massenbestimmung des gereinigten M13 gp1/11-Assembly-Komplexes

aus E. coli C41 durch präparative Gelfiltration 139

Inhaltsverzeichnis

6

3.4.4 Massenbestimmung des gereinigten M13 gp1/1-Assembly-Komplexes

aus infizierten E. coli K37 durch präparative Gelfiltration 142

3.4.5 Identifikation von Proteinbanden im IMAC-Eluat durch MALDI-TOF/MS 145

3.4.6 TEM-Aufnahmen FPLC gereinigter gp1/11-Assembly-Komplexe 147

4 Diskussion 149

4.1 Phagenextrusion aus infizierten E. coli-Zellen 149

4.2 M13-Sekretion aus infizierten E. coli-Zellen 155

4.2.1 TEM und AFM-Studien an infizierten E. coli DH5α-Zellen 155

4.2.2 Extrusionsverlauf der M13-Phagen auf der Zelloberfläche von E. coli 158

4.3 Funktionelle Präsentation antigener Epitope am N-Terminus des

„Minor Coat“ Proteins gp9 161

4.3.1 Die Translokation des Konstrukts gp9T7SD erfolgt durch die Membran-

insertase YidC 168

4.4 Massenbestimmung des gp1/11-Assembly-Komplexes 169

4.4.1 Identifikation der Proteine im IMAC-Eluat 173

4.4.2 Massenbestimmung des gereinigten gp1/11-Assembly-Komplexes aus

nicht infizierten E. coli-Zellen durch präparative Gelfiltration 175


infizierten E. coli-Zellen durch präparative Gelfiltration 177

4.4.4 TEM-Aufnahmen FPLC gereinigter gp1/11-Assembly-Komplexe 179

5 Zusammenfassung 183

6 Literaturverzeichnis 187

7 Anhang 205

Abkürzungsverzeichnis 205

MALDI-TOF/MS Analysedaten 210

Spektrum 37 kDa gp1-Proteinbande 210



Sequenzen 213

gp1 DNA-Sequenz 213

gp1 AS-Sequenz 213

gp11 DNA-Sequenz 214

gp11 AS-Sequenz 214

Inhaltsverzeichnis

7

Publikationen 215

Danksagung 216

Einleitung

8

1 Einleitung

1.1 Der Bakteriophage M13

1.1.1 Klassifizierung des Bakteriophagen M13

Der Bakteriophage M13 wurde erstmals 1963 von Peter Hans Hofschneider be-

schrieben (Hofschneider, 1963). Wegen der einzelsträngigen DNA wird M13 taxo-

nomisch der Gruppe II, den Einzelstrang-DNA-Phagen (ssDNA-Phagen; ss, „single

strand“), zugeordnet. Charakteristisch für diese Gruppe ist die genomische Repli-

kation über ein doppelsträngiges DNA-Intermediat, die sogenannte replikative Form

(RF). Generell können Phagen morphologisch in sphärische und filamentöse Phagen

unterteilt werden, die sich sowohl in Form als auch im Grad ihrer verschachtelten

Gene voneinander unterscheiden (Klaus et al., 1992).

Innerhalb der einzelsträngigen DNA-Phagen wird der filamentöse Phage M13, wie

auch die Phagen fd und f1, zur Familie der Inoviridae, der sogenannten Ff-Gruppe

(„F“ für F-Pili, „f“ für filamentös) zugeordnet.

1.1.2 Morphologie und Genom der Inoviridae

Die Phagen dieser Familie zeichnen sich durch eine einzelsträngig zirkuläre DNA

aus, welche ausschließlich durch die helikale Anordnung von Hüllproteinen vor

äußeren Einflüssen geschützt wird. Hier ergibt sich aus der Kombination von

Anordnung der Hüllproteine und DNA das filamentöse Erscheinungsbild dieser

Phagen, deren Charakteristika flexible Virionen mit einem Durchmesser von ~ 7 nm

und einer Länge von ~ 900 nm sind (Abb. 1-1).

Das M13-Genom besteht aus ~ 6400 Nukleotiden und kodiert 11 verschiedene

Genprodukte (gp), die sowohl in der Kopienzahl als auch im Molekulargewicht stark

variieren. Das Genom enthält neben einer nicht-kodierenden intergenischen Region

(IR, „intergenic region“), welche den Replikationsursprung (ORI, „origin of

replication“) für die (+) und (– )-Strang-Synthese beinhaltet, eine morphogenetisch

cis-aktive Haarnadelschlaufe („hairpin packaging signal“), welche für die Assem-

blierung des Phagen essenziell ist und der DNA innerhalb der Proteinhülle eine

Orientierung verleiht (Dotto & Zinder, 1983, Russel & Model, 1989). Innerhalb der

Gene 1 und 2 befindet sich jeweils eine translationale Initiierungsstelle, durch welche

ein weiteres „in-frame“ Phagenprotein synthetisiert wird. In beiden Fällen sind die

„in-frame“ Produkte mit dem C-terminalen Drittel des jeweils vollständigen Gen-

Einleitung

9

produkts identisch. Von den 11 phagenkodierten Proteinen bilden fünf (gp3, gp6,

gp8, gp7, gp9) die Phagenhülle um das zentral positionierte DNA-Molekül, drei (gp2,

gp5, gp10) werden für die Synthese der ssDNA und weitere drei (gp1, gp11, gp4) für

die Assemblierung des Phagen benötigt (Tabelle 1-1). Die Synthese aller Phagen-

proteine erfolgt simultan, jedoch findet hier auf der Ebene der Promotoren sowie

-abhängiger Terminationssignale eine Regulierung der jeweiligen Transkriptions-

und Translationsraten statt, um ein stöchiometrisches Gleichgewicht zwischen den

einzelnen Proteinen zu gewährleisten.

Gen Genprodukt Funktion Lokalisierung Menge Größe(AS) MG(kDa)

2 (10) gp2

Repli-

kation

Nickase(4)

Zytoplasma 1000(1)

410 46,1

gp10 Zytoplasma 500(1)

111 12,7

5 gp5 ssDNAbp Zytoplasma 100000(1)

87 9,7

3 gp3

Hüllprotein

Virion Basis 5(2)

406 42,5

6 gp6 Virion Basis 5(2)

112 12,3

7 gp7 Virion Spitze 5(2)

33 3,6

8 gp8 Filament 2700(2)

50 5,2

9 gp9 Virion Spitze 5(2)

32 3,63

1 (11) gp1

Assem-

blierung

Assembly-

Komplex iM

(3)

348 38

gp11 108 12,4

4 gp4 Pore äM 405 43,5

Abb. 1-1: AFM (Atomic Force Microscope) Auf-nahme von M13wt-Phagen. Die Länge des Mess-balkens beträgt 500 nm.

Tabelle 1-1: Übersicht über die Gene und Genprodukte F-spezifischer filamentöser Phagen sowie deren Eigenschaften. Die Gene wurden hinsichtlich der Funktion ihrer Produkte geordnet. AS = Aminosäuren, ssDNAbp = Einzelstrang-DNA bindendes Protein, iM = innere Membran, äM = äußere Membran,

(1)Anzahl pro Zelle,

(2)Anzahl pro Phage,

(3)Anzahl unbekannt,

(4)Nickase: Endonuklease mit

Topoisomeraseaktivität (Daten: Rasched & Oberer, 1986, Marvin, 1998 und Russel, 2004)

Einleitung

10

1.1.3 Gene, Genprodukte und ihre Funktionen

Gene, durch welche die Replikation des Phagen gesteuert wird

Gen 2 kodiert sowohl gp2, eine spezifische Nickase (Endonuklease mit

Topoisomeraseaktivität), welche im „rolling circle“ Replikationsmechanismus

für die Bildung eines Einzelstrangbruchs in der replikativen Form der viralen

DNA verantwortlich ist, als auch gp10, welches im Leseraster von Gen 2

liegt, wodurch 111 Aminosäuren des gp10 mit dem des C-terminalen Endes

von gp2 identisch sind (Yen & Webster, 1981, Fulford & Model 1984). In

Abwesenheit von gp10 ist die DNA-Synthese stark beeinträchtigt, wodurch

diesem „in-frame“ Produkt eine essenzielle Rolle bei der DNA-Synthese des

Phagen zufällt (Fulford & Model 1984).

Gen 5 kodiert das DNA-Bindeprotein gp5, welches in β-Konformation als

Dimer an die einzelsträngige Phagen-DNA bindet. In vitro kristallisierte

Komplexe zeigen, dass pro Helix-Windung 6 dieser Dimere (McPherson et

al., 1980) gebunden werden. Durch die Assoziation von gp5 mit der einzel-

strängigen, replizierten Phagen-DNA, welche durch elektrostatische und

Abb. 1-2: Schematische Darstellung der Phagengene und deren Genprodukte. Gen 2 kodiert

zwei Genprodukte, gp2 und gp10. Gp2 besitzt eine Endonuklease- sowie Topoisomeraseaktivität und bindet an die intergenische Region der RF-DNA. Hier erzeugt es einen Strangbruch im (+)-Strang, wodurch die Replikation der Phagen-DNA durch die wirtseigenen Proteine initiiert wird. Gp10 bewirkt im späteren Verlauf der Infektion eine Akkumulation der ssDNA. Gen 5 kodiert das ssDNA-Binde-protein, welches zusammen mit der replizierten ssDNA ein flexibles Filament ausbildet. Die Gene 7 und 9 kodieren kleine „Minor Coat“ Proteine, die an dem Ende des Phagen lokalisiert sind, welches zu Beginn der Assemblierung die Wirtszelle als Erstes verlässt. Gen 8 kodiert das Haupthüllprotein (MCP, „Major Coat“ Protein), das mit ~ 2800 Kopien am Phagen präsent ist. Die Gene 3 und 6 kodieren weitere „Minor Coat“ Proteine, die an der Basis des Phagen lokalisiert sind, durch welche die Assemblierung terminiert und zu Beginn der Infektion die Adsorption des Phagen an den F-Pilus initiiert wird. Gen 1 kodiert gp1 und gp11, die für die Assemblierung des Phagen essenziell sind und in der inneren Membran (iM) einen Assembly-Komplex ausbilden. Gen 4 kodiert gp4, welches in der äußeren Membran (äM) eine homomultimere Pore ausbildet, über die der Phage das Wirtsbakterium verlässt. Die IR-Region („intergenic region“) ist ein nicht-kodierender Bereich, der den Replikations-ursprung (ORI, „origin of replication“) für die (+) und (-)-Strang-Synthese sowie eine morphogenetisch cis-aktive Haarnadelschlaufe („hairpin packaging signal“) beinhaltet.

Einleitung

11

hydrophobe Wechselwirkungen zustande kommt, wird die Synthese des

komplementären (-)-Stranges unterbunden und ein DNA-gp5-Komplex

gebildet, der einer linksdrehenden Helix entspricht (Stassen et al., 1995,

Konings et al., 1995, Guan et al., 1995, Olah et al., 1995). Zusätzlich kommt

dem gp5 eine regulatorische Funktion während des Replikationsprozesses

zu. Hohe Konzentrationen hemmen die Konvertierung des (+)-Stranges in

die RF-Form, wodurch der Übergang von der Replikations- zur Assembly-

phase neuer Phagen-Nachkommen eingeleitet wird. Zudem reguliert gp5

durch die Expressionskontrolle von gp2 und gp10 die Replikationsphase

(Salstrom & Pratt, 1971, Model et al., 1982).

Gene für die Synthese der Hüllproteine

Die Gene 7 und 9 kodieren die „Minor Coat“ Proteine gp7 bzw. gp9, die mit

jeweils ~ 5 Kopien eine Kappenstruktur an dem Phagenende ausbilden,

welches zu Beginn der Assemblierung des Phagen zuerst das Wirts-

bakterium über den Sekretionskanal verlässt. Beide Hüllproteine sind für die

Initiation der Assemblierung essenziell, da sie mit dem „hairpin packaging

signal“ der DNA interagieren (Russel & Model, 1989, Endemann & Model,

1995). Gp7 und gp9 gehören mit 33 bzw. 32 Aminosäuren zu den kleinsten

von Ribosomen translatierten Proteinen und werden ohne N-terminale

Signalsequenz synthetisiert.

Gen 8 kodiert das Haupthüllprotein (MCP, „Major Coat“ Protein) gp8 des

Phagen. Mit ~ 2800 Kopien bildet es eine schuppenförmig helikale Umman-

telung über die gesamte Phagenlänge. Gp8 interagiert mit seiner apolaren

Domäne über hydrophobe Wechselwirkungen mit anderen gp8 sowie „Minor

Coat“ Proteinen, wodurch die Phagenhülle stabilisiert wird (Rasched &

Oberer, 1986, Marvin, 1989). Die Synthese des Haupthüllproteins erfolgt als

73 Aminosäuren langes Präprotein („procoat“) mit einer N-terminal abspalt-

baren, 23 Aminosäuren langen, Leadersequenz. Diese wird nach der Trans-

lokation des Proteins durch die Translokase YidC in der inneren Membran

von Escherichia coli durch die Leaderpeptidase abgespalten und somit zum

maturen MCP umgewandelt (Kuhn et al., 1986, Kuhn & Troschel, 1992,

Samuelson et al., 2001).

Einleitung

12

Gen 3 und 6 kodieren die „Minor Coat“ Proteine gp3 bzw. gp6, die mit

jeweils ~ 5 Kopien eine Kappenstruktur an der Phagenbasis ausbilden,

welche die Assemblierung des Phagen terminiert und anschließend zu

Beginn der Infektion die Anheftung des Phagen an den bakteriellen F-Pilus

einleitet. Im Gegensatz zu gp6 wird gp3 mit einer 18 Aminosäuren langen

Signalsequenz synthetisiert, durch welche die Translokation über das

SecYEG-Translokasesystem erfolgt (Rapoza & Webster, 1993, Thie et al.,

2008). In Abwesenheit von gp3 erfolgt eine proteolytische Prozessierung des

gp6, was ein Indiz dafür ist, dass gp3 und gp6 vor ihrer Verwendung am

Phagenpartikel in der inneren Membran assemblieren. Dies wird dadurch

unterstützt, dass beide Proteine nur als Komplex isoliert werden können

(Gailus & Rasched, 1994, Rakonjak et al., 1999).

Für die Assemblierung und die Sekretion neuer Phagenpartikel essenzielle

Gene

Gen 1 kodiert sowohl das integrale Membranprotein gp1 als auch das

integrale Membranprotein gp11, welches im Leseraster von Gen 1 liegt,

wodurch 108 Aminosäuren des gp11 mit dem C-terminalen Ende von gp1

identisch sind. Gp1 wird ohne Signalsequenz synthetisiert, jedoch weist die

Insertion des Proteins eine Abhängigkeit vom Sec-Translokasesystem auf

(Rapoza & Webster, 1993). Gp1 interagiert mit dem Thioredoxin des Wirts,

welches in E. coli von dem Gen trxA kodiert wird (Russel & Model, 1983, Lim

et al., 1985). Zudem besitzt gp1 ein Nukleotid-Bindemotiv in der zytoplas-

matischen Domäne, was nahelegt, dass die Assemblierung des Phagen

unter ATP-Umsetzung stattfindet (Russel, 1991, 1993). Gp1 und gp11 sind

essenziell für die Assemblierung neuer Phagen-Nachkommen (Silver &

Wickner, 1980, Rapoza & Webster, 1995, Marvin 1998), jedoch führt eine

Überproduktion von gp1 zu einem raschen Tod der Wirtszelle (Horabin &

Webster, 1986). Gp1 und gp11 bilden in der inneren Membran der Wirtszelle

einen Assembly-Komplex aus, welcher mit der aus gp4-Monomeren

bestehenden Pore in der äußeren Membran zu einem 2-Komponenten-

Sekretionskomplex interagiert (Rapoza & Webster, 1995, Haigh & Webster,

1999).

Einleitung

13

Gen 4 kodiert das integrale Membranprotein gp4. Dies wird mit einer 21

Aminosäuren langen Signalsequenz synthetisiert und durch das SecYEG-

Translokasesystem in das Periplasma transloziert, wo es sich anschließend

in die äußere Membran des Wirts integriert und eine Sekretionspore aus

~ 12 - 14 Homomultimeren bildet (Brissette & Russel, 1990, Russel &

Kazmierczak, 1993, Rapoza & Webster, 1993, Kazmierczak et al., 1994).

Gp4, gp1 und gp11 interagieren zu einem Sekretionskomplex, der für das

Ausschleusen neugebildeter Phagen essenziell ist (Rapoza & Webster,

1995, Haigh & Webster, 1999).

1.1.4 Struktur des Bakteriophagen M13

Die Hülle des Phagen besteht anteilsmäßig im Wesentlichen aus dem Haupthüll-

protein gp8, welches mit ~ 2800 Kopien eine schuppenförmig helikale Ummantelung

über die gesamte Phagenlänge ausbildet (Abb. 1-3). Charakteristisch für gp8 ist eine

apolare Domäne, welche aus 19 Aminosäuren besteht und über deren hydrophoben

Wechselwirkungen mit anderen gp8-Molekülen sowie den intrinsischen Interaktionen

mit apolaren Domänen der „Minor Coat“ Proteine die Phagenhülle stabilisiert wird

(Marvin, 1989). Neben gp8 sind noch vier weitere, sogenannte „Minor Coat“ Proteine,

die mit jeweils ~ 5 Kopien pro Partikel vorhanden sind, an der Zusammensetzung

des Phagen beteiligt (Glucksman et al. 1992, Stopar & Spruijt 2003). Hier bilden die

„Minor Coat“ Proteine gp7 und gp9 eine Kappenstruktur an der Phagenspitze, welche

zu Beginn der Phagenassemblierung zuerst das Wirtsbakterium über den Sekretions-

kanal (ein gp4-Oligomer) verlässt. Gp6 und gp3 hingegen bilden abschließend eine

Kappenstruktur am entgegengesetzten Ende des Phagen, wodurch die Phagen-

assemblierung beendet wird und der Phage eine Orientierung erhält (Simons et al.,

1980, 1981, Grant et al., 1981, Endemann & Model, 1995). Die Adsorption des

Phagen an den F-Pilus der E. coli-Zelle erfolgt durch das nach außen hin frei

zugängliche „Minor Coat“ Protein gp3, wodurch die Infektion eingeleitet wird. Die

Unterteilung des gp3 erfolgt in 3 Segmente (N1, N2 und C), die jeweils über 2 flexible

Glycin-reiche Linker miteinander verbunden sind und denen während des Infektions-

vorgangs spezifische Funktionen zugeordnet werden können (Abb. 1-4). Durch das

Segment N2 des gp3 wird die Adsorption des Phagen an den F-Pilus initiiert,

während N1 im Verlauf der Infektion an den Korezeptor TolA in der Wirtsmembran

Einleitung

14

bindet. Über das Segment C ist das gp3 in die Proteinhülle des Phagen eingebettet

(Stengele et al., 1990, Click & Webster, 1997, Rakonjac et al., 1999).

1.1.5 Der Zyklus des Bakteriophagen M13

Alle, bis zum derzeitigen Stand, charakterisierten Phagen der Ff-Gruppe verwenden

lange, dünne Strukturen auf der Oberfläche des Wirtsbakteriums, sogenannte „Pili“,

als Rezeptoren für die Initiation der Wirtsinfektion. Von den filamentösen Phagen

M13, fd und f1 wird der F-Pilus (F+, F´: „fertility“), von Ike dagegen die N- und P-Pili

als spezifische Rezeptoren präferiert (Webster, 1996). Charakteristisch für alle Infek-

tionsverläufe aus dieser Gruppe ist, dass die Wirtsorganismen im Verlauf der

Phagenvermehrung nicht durch Lyse geschädigt werden. Vielmehr sind die infizierten

Wirte weiterhin befähigt zu wachsen und sich zu teilen, obwohl ein signifikanter Effekt

bei der Zunahme der Generationszeit zu beobachten ist (Hoffmann-Berling & Mazé,

1964, Ploss & Kuhn, 2010). Durch die veränderte Generationszeit sind auch

Abb. 1-3: Schematisierte Darstellung des M13-Phagen. Die Hülle des Phagen wird hauptsächlich durch das Hüllprotein gp8 gebildet, das die DNA über die gesamte Phagenlänge schuppenförmig umgibt. Gp3 und gp6 sind an dem Ende des Phagen lokalisiert, welches zu Beginn des Infektionsprozesses an den F-Pilus der Wirtszelle adsorbiert; gp7 und gp9 befinden sich am opposi-tionären Ende (Ref. Ploss & Kuhn, 2010)

Abb. 1-4: Schematisierte Darstellung der Segmentstruktur des „Minor Coat“ Proteins gp3. Das gp3 wird in 3 Segmente unterteilt, N1, N2 und C. Die einzelnen Segmente sind über die flexiblen, Glycin-reichen Linker L1 und L2 verbunden. Durch das Segment N2 wird die Adsorption des Phagen an den F-Pilus initiiert, während N1 im Verlauf der Infektion an den Korezeptor TolA in der Wirts-membran bindet. Über das Segment C ist das gp3 in die Proteinhülle des Phagen eingebettet. AS = Aminosäure (Daten: Rakonjak et al., 1999, verändert nach Russel, 2004).

Einleitung

15

filamentöse Phagen befähigt auf Festmedien „Plaques“ auszubilden, ohne lytisch zu

sein. Hier handelt es sich um lokale Bereiche, welche sich durch das verlangsamte

Bakterienwachstum und der hieraus resultierenden geringeren Zelldichte von dem

restlichen Bakterienrasen hervorheben.

Die infizierten Zellen sekretieren bereits 10 Minuten nach erfolgreicher Infektion neue

Phagen-Nachkommen in das umgebende Medium. Die Sekretion kommt erst dann

zum Erliegen, wenn die Wirtszelle in die stationäre Phase übergeht (Klaus et al.,

1992). Allgemein kann der Zyklus des Bakteriophagen M13 in die drei Phasen

Infektion, Reproduktion und Assembly gegliedert werden. Während der Infektions-

phase erfolgt der Kontakt zwischen Phage und Wirt sowie die Einschleusung der

genetischen Information des Phagen in die Wirtszelle.

Abb. 1-5: Modell des M13-Zyklus. (I.) Die Infektion des Wirtsbakteriums wird durch die Adsorption von M13 an die Spitze des F-Pilus eingeleitet. Durch den Abbau der Pilus-Segmente an der Pilus-Basis wird der gebundene Phage in Kontakt mit der Zelloberfläche gebracht. Über die Interaktion der Phagenhüllproteine gp3 mit dem zellulären TolQRA gelangen die Hüllproteine in die innere Membran und die Phagen-DNA in das Zytoplasma. (II.) Im Verlauf der Replikation wird aus dem einzel-strängigen (+)-Strang des Phagen durch wirtseigene Enzyme eine replikative Form (RF-Form) herge-stellt, die einerseits durch phagenkodierte Proteine (gp2, gp10) vervielfältigt wird und andererseits zur Bildung neuer (+)-Einzelstränge dient. (III.) Während der Proteinsynthese werden, ausgehend von 9 Genen, 11 verschiedene Genprodukte (gp) synthetisiert, wobei hier die RF-Form als Matrize dient. Gp2, gp10 und gp5 verbleiben als lösliche Proteine im Zytoplasma. Bei den 8 verbleibenden Produkten handelt es sich um integrale Membranproteine, von denen nur gp4 in die äußere Membran inseriert, während die restlichen in die innere Membran eingebaut werden. (IV.) Zusammen mit gp5-Dimeren bildet die einzelsträngige DNA ((+)-Strang) einen Komplex. (V.) Während des Assembly werden die synthetisierten Strukturuntereinheiten mit der replizierten Phagen-DNA an der inneren Membran der Wirtszelle zu neuen Phagen-Nachkommen zusammengebaut und verlassen diese, ohne sie zu lysieren (nach Webster, 1996, abgeändert).

Einleitung

16

Die Reproduktionsphase ist geprägt durch die Vermehrung der Phagen-DNA sowie

durch die Synthese der phagenkodierten Proteine. In der Assemblyphase erfolgt

schließlich der Zusammenbau der synthetisierten Strukturuntereinheiten mit der

replizierten Phagen-DNA zu neuen Phagen-Nachkommen sowie deren Aus-

schleusung aus der Wirtszelle (Abb. 1-5).

1. Infektionsphase

Der Bakteriophage M13 infiziert Gram-negative Escherichia coli-Zellen, die als

Rezeptoren F-Pili ausbilden. Die Infektion erfolgt hier in einem zweistufigen Prozess

(Model & Russel, 1988). Während der ersten Stufe adsorbiert der Phage mit Hilfe

des N2-Segments von gp3 (Abb. 1-4) an der Spitze des F-Pilus. Durch eine Depoly-

merisierung der Pilinuntereinheiten an der Pilus-Basis in der inneren Membran

verkürzt sich der Pilus, wodurch der gebundene Phage in Kontakt mit der Zellober-

fläche gebracht wird (Frost, 1993). Daraufhin bindet das N-terminale Segment N1

des gp3 an die Untereinheit TolAIII seines Korezeptors TolA. Die Proteine TolQ, TolR

und TolA sind in der inneren Membran von E. coli lokalisiert und für die Translokation

von Gruppe A Colicinen verantwortlich (Webster, 1991). TolQ ist hier durch drei, TolR

und TolA jeweils durch eine Transmembrandomäne in der inneren Membran

verankert (Kampfenkel & Braun, 1993, Vianney et al., 1994). Über die intermole-

kularen Wechselwirkungen der drei Proteine entsteht ein Komplex, durch den die

innere Membran mit der äußeren in Kontakt steht, wodurch unter anderem die

Stabilität der äußeren Membran bedingt wird. TolA besteht aus 3 Domänen: über die

N-terminale Domäne AI ist das Protein in der inneren Membran verankert und

interagiert hierdurch mit den Proteinen TolQ und TolR. Die Domäne AII weist eine

α-helikale Struktur auf, welche das Periplasma durchspannt und die C-terminale

Domäne AIII so positioniert, dass diese mit Komponenten der äußeren Membran

interagieren kann (Abb. 1-6). AIII dient sowohl den Colicinen als auch dem Segment

N1 des gp3 als Rezeptor (Webster, 1991, Raggett et al., 1998, Karlsson et al., 2003).

In der zweiten Stufe erfolgt nach einer Konformationsänderung der α-helikalen

Struktur des TolAII-Proteins die Integration der Phagenhüllproteine in die innere

Membran, wodurch die Translokation der Phagen-DNA in die Wirtszelle zustande

kommt (Abb. 1-6) (Marvin, 1998, Karlsson et al., 2003).

Einleitung

17

2. Reproduktionsphase

Direkt nach der Translokation der einzelsträngigen Phagen-DNA (das (+)-Strang

Genom hat die Polarität einer mRNA) in das Zytoplasma bindet die wirtseigene RNA-

Polymerase am origin in der nicht-kodierenden intergenischen Region (IR) und

synthetisiert einen kurzen Primer, über dessen 3´-Ende durch die wirtseigene DNA-

Polymerase III, sowie Topoisomerase, der Einzelstrang in eine doppelsträngige Form

konvertiert wird, die sogenannte „replikative Form“ (RF) (Horiuchi, 1997). Die RF-

Form dient sowohl bei der Proteinbiosynthese der viralen Proteine als auch bei der

Synthese weiterer (+)-Stränge als Matrize. Die Replikation der RF-Form erfolgt durch

den Mechanismus des „rolling circle“. Dabei spielt die, durch das M13-Phagengenom

kodierte, Endonuklease (gp2) eine wichtige Rolle, da sie durch das Erzeugen eines

Einzelstrangbruches im (+)-Strang der RF-DNA den Replikationsprozess einleitet

und durch die Ligation der offenen Enden des (+)-Stranges nach Vollendung der

Abb. 1-6: Modell des M13-Infektionsvorgangs an einer E. coli-Zelle. (1) Die Infektion des Wirts-bakteriums wird durch die Adsorption des N2-Segments des gp3-Hüllproteins an die Spitze des F-Pilus eingeleitet. (2) Durch den Abbau der Pilinuntereinheiten an der Pilus-Basis wird der gebundene Phage in Kontakt mit der Zelloberfläche und dem Korezeptor TolA gebracht. (3) Über die Interaktion des N1-Segments mit der TolAIII-Domäne und dessen Konformationsänderung werden die Hüllpro-teine schließlich in die innere Membran integriert und die Phagen-DNA in das Zytoplasma transloziert (nach Karlsson et al., 2003)

Einleitung

18

Replikation diese rezirkularisiert. Der DNA-Replikationsprozess erfolgt parallel zur

viralen Proteinbiosynthese. Zu Beginn der frühen Replikationsphase ist die Menge

des löslichen Einzelstrang-Bindeproteins gp5 sehr gering, was dazu führt, dass die

während der Replikation neu synthetisierten (+)-Stränge sofort in die RF-Form

konvertiert werden. Während der frühen Phase steigen jedoch die Mengen an DNA

und Phagenproteinen exponentiell an. Dabei werden die Proteine gp3, gp6, gp8,

gp7, gp9, welche die Phagenhülle bilden, sowie gp1 und gp11, die für die Assem-

blierung neuer Phagenpartikel benötigt werden, in die innere Membran des Wirts

transloziert. Der Bestimmungsort für das phagenkodierte gp4 ist die äußere

Membran, in der ~ 12 - 14 gp4-Monomere eine Sekretionspore ausbilden, durch die

neue Phagen in die äußere Umgebung sekretiert werden (Russel et al., 1997).

Aufgrund erhöhter gp5-Konzentrationen kommt es in der späteren Reproduktions-

phase zu Interaktionen von gp5-Dimeren mit den synthetisierten (+)-Strängen,

wodurch die Konvertierung in die RF-Form unterdrückt wird und vermehrt ssDNA-

gp5-Komplexe gebildet werden, welche das Substrat der Assemblyphase darstellen

(Webster & Cashman, 1973). Zu diesem Zeitpunkt erfolgt gleichzeitig eine Expres-

sionskontrolle von gp2 und gp10 durch das virale gp5, indem es deren Translation

reprimiert (Yen & Webster, 1982).

3. Assemblyphase

Der Assembly-Vorgang filamentöser Phagen ist ein sekretorischer Prozess, welcher

an speziellen, membranassoziierten Bereichen stattfindet, wo innere und äußere

Membran in engem Kontakt miteinander stehen (Lopez & Webster, 1985). Diese

Assembly-Stellen werden, unabhängig von den anderen Phagenproteinen, durch die

Interaktion der periplasmatischen Domänen der drei morphogenen Proteine gp1,

gp11 und gp4 gebildet. Der Vorgang der Phagenassemblierung wird in 5 Abschnitte

eingeteilt: Preinitiation, Initiation, Elongation, Pretermination und Termination (Russel

et al., 2004).

Preinitiation: Stellt mit der Ausbildung von Assembly-Stellen, die sich aus den

morphogenen Proteinen gp1, gp11 und gp4 zusammensetzen und mit Hilfe des

Elektronenmikroskops auf den Wirtsbakterien nachgewiesen werden können, den

ersten Abschnitt in der Phagenmorphogenese dar (Lopez & Webster, 1985, Feng et

al., 1999).

Einleitung

19

Initiation: Wenn sowohl die Assembly-Stelle mit den gebundenen membran-

assoziierten „Minor Coat“ Proteinen gp7 und gp9 als auch der ssDNA-gp5-Komplex

in der Zelle vorliegen, wird durch die Bindung des Nukleoproteinkomplexes an den

Preinitiationskomplex die Assemblierung des Phagen initiiert. Hier erfolgt eine Inter-

aktion zwischen der zytoplasmatischen Domäne von gp1 mit dem „packaging signal“

des ssDNA-gp5-Komplexes, welches aus diesem herausragt (Russel & Model,

1989). Durch diesen Prozess wird bereits die Spitze des Phagen gebildet. Obwohl

die Initiation keinerlei Redoxpartner bedarf, ist das zytoplasmatische Thioredoxin

Bestandteil des Initiationskomplexes und vermutlich an der Prozessivität der Elonga-

tionsreaktionen beteiligt.

Elongation: Nachdem durch die Initiation der Assemblierung die Phagenspitze

gebildet wurde, erfolgt nun der sukzessive Austausch der gp5-Dimere am ssDNA-

gp5-Komplex gegen das Haupthüllprotein gp8. Dieser Austausch wird durch die

C-terminale Domäne des gp1 katalysiert und erfolgt vermutlich unter ATP-Hydrolyse

(Russel, 1991). Hierdurch wird die ssDNA mit einer Phagenhülle aus ~ 2800 gp8-

Molekülen umgeben, wobei die umhüllte DNA während des Elongationsprozesses

über die homomultimere gp4-Sekretionspore in die äußere Umgebung transloziert

wird (Abb. 1-7). Während der Elongation ändern die gp8-Moleküle aufgrund positiv

geladener Aminosäuren an ihrer C-terminalen Domäne im gp1/11-Assembly-

Komplex ihre Position dahingehend, dass eine Interaktion mit dem negativ gela-

denen Phosphatrückgrat der ssDNA erfolgen kann (Rapoza & Webster, 1995).

Dieser Vorgang ist persistent bis das Ende der viralen DNA erreicht wird.

Pretermination und Termination: Die Pretermination der Assemblierung wird durch

den Einbau des „Minor Coat“ Proteinkomplexes gp3/gp6 an das Ende der viralen

Einzelstrang-DNA eingeleitet. Für die Termination der Assemblierung und die Ent-

lassung des fertigen Phagen in das umgebende Medium werden 93 Aminosäuren

des C-terminalen Segments von gp3 benötigt, wobei erst ab einer Länge von 132

Aminosäuren der C-terminalen Domäne stabile Phagenpartikel entstehen (Rakonjak

et al., 1999).

Einleitung

20

Abb. 1-7: Schematisierte Darstellung der M13-Phagenassemblierung während der Elongation. Die Assemblierung des Phagen erfolgt an einer speziellen Assembly-Stelle in der inneren Membran der Wirtszelle, welche durch die Interaktionen der periplasmatischen Domänen des gp1/11-Assembly-Komplexes und der homomultimeren gp4-Pore zustande kommt. Während der Elongation werden vermutlich unter ATP-Hydrolyse die an die ssDNA gebundenen gp5-Dimere abgelöst und durch das Haupthüllprotein gp8, das innerhalb der inneren Membran mit weiteren gp8-Molekülen interagiert, ersetzt. Aufgrund positiv (+) geladener Aminosäuren an der C-terminalen Domäne der gp8-Moleküle werden vermutlich ihre Positionen im gp1/11-Assembly-Komplex dahingehend verändert, dass eine Interaktion mit dem negativ geladenen Phosphatrückgrat der ssDNA erfolgen kann. Die umhüllte DNA wird während des Elongationsprozesses über die homomultimere gp4-Sekretionspore in die äußere Umgebung sekretiert (angepasst nach Webster, 1996).

Einleitung

21

1.2 Der gp1/11-Assembly-Komplex

Die Phagenassemblierung stellt einen sekretorischen Prozess an der inneren E. coli-

Membran dar. Dabei entsteht der Phage direkt durch die Umhüllung der einzel-

strängigen Phagen-DNA mit spezifischen Phagenhüllproteinen, welche nach ihrer

Synthese in die innere Membran transloziert und über den, für die Assemblierung

essenziellen, gp1/11-Assembly-Komplex herangeführt werden (Silver & Wickner,

1980, Rapoza & Webster, 1995, Marvin 1998).

Die Synthese von gp1 und gp11 erfolgt über eine polycistronische mRNA ohne

N-terminale Signalsequenz, jedoch scheint die Translokation des 348 Aminosäuren

langen gp1 vom SecYEG-System des Wirts abhängig zu sein (LaFarina & Model,

1983, Horabin & Webster, 1986, Rapoza & Webster, 1993). In infizierten Zellen sind

gp1 und gp11 mit einer Ratio von 1:1 bis 1:2 präsent. Die Proteine werden jeweils

über eine 20 Aminosäuren lange hydrophobe Domäne in der inneren Membran

verankert und besitzen eine 75 Aminosäuren lange C-terminale Domäne, welche im

Periplasma lokalisiert ist. Die 13 Aminosäuren lange N-terminale Domäne des gp11

bzw. die 253 Aminosäuren lange N-terminale Domäne des gp1 sind zytoplasmatisch

lokalisiert, wobei die N-terminale Domäne von gp1 sowohl im Bereich der Amino-

säure 142 mit dem Genprodukt des bakteriellen trxA interagiert (Russel & Model,

1983) als auch im Bereich der Aminosäuren 8-15 das Walker Nukleotid-Bindemotiv

GXXGXGKT aufweist (Abb. 1-8) (Walker et al., 1982). Die Rolle dieses Motivs im

Assembly-Komplex ist nicht ganz geklärt, jedoch handelt es sich hier um ein beson-

deres Merkmal, welches in vielen pro- und eukaryotischen Transportsystemen vor-

handen ist und nahelegt, dass die Translokation des Phagen während der Assem-

blierung vermutlich unter ATP-Hydrolyse stattfindet (Russel, 1991, 1993) und von der

protonenmotorischen Kraft („proton motiv force“) abhängig ist (Feng et al., 1997).

Über positiv geladene Aminosäuren der N-terminalen Domänen von gp1 und gp11

erfolgt die Interaktion zwischen dem Assembly-Komplex und der einzelsträngigen

Phagen-DNA (Abb. 1-7). Während der Elongation bedingen diese Ladungen wahr-

scheinlich eine Positionsänderung der gp8-Moleküle, sodass diese an das negativ

geladene Phosphatrückgrat der ssDNA binden können (Rapoza & Webster, 1995).

Jedoch sind Einzelheiten über die weiteren Vorgänge am Assembly-Komplex weit-

gehend unbekannt.

Einleitung

22

Die Aufgabe des gp11 im Assembly-Komplex ist immer noch ungeklärt, doch zeigt

sich bei Anwesenheit dieses Proteins eine Verringerung der proteolytischen

Prozessierung des gp1, was ein Indiz dafür ist, dass gp11 sowohl für die Stabilität

des Komplexes als auch für den Schutz des gp1 vor periplasmatischen Proteasen

verantwortlich ist (Feng et al., 1999).

Der 2-Komponenten-Sekretionskomplex

Gp1 und gp11 bilden vermutlich nach Spekulation von Russel (Russel et al., 2004) in

der inneren Membran des Wirts einen multimeren Komplex aus jeweils 5 - 6 der

einzelnen Moleküle, welcher ebenfalls eine Pore darstellt, da in Abwesenheit aller

weiteren Phagenproteine eine Überproduktion an gp1 und gp11 einen Zusammen-

bruch des Membranpotentials verursacht (Horabin & Webster, 1988). Die periplas-

matisch lokalisierte C-terminale Domäne der gp1-Moleküle des Assembly-Komplexes

interagieren ab den Aminosäuren an Position 275 - 320 mit dem periplasmatischen

N-terminalen Bereich der homomultimeren gp4-Pore in der äußeren Membran zu

einem Sekretionskomplex (Abb. 1-9) (Rapoza & Webster, 1995, Feng et al., 1999,

Haigh & Webster, 1999). Dieser Komplex wird unabhängig von anderen Phagen-

proteinen ausgebildet. Die homomultimere gp4-Sekretionspore setzt sich dabei aus

Abb. 1-8: Schematisierter Aufbau der gp1- und gp11-Moleküle. Die Einteilung der gp1- und gp11-Moleküle erfolgt in drei Bereiche: (1) Die zytoplasmatisch lokalisierte N-terminale Domäne mit einem positiv geladenen amphiphilen Bereich, der mit der Phagen-DNA und den Hüllproteinen interagiert. (2) Eine hydrophobe Domäne, über die gp1 und gp11 in der inneren Membran des Wirts verankert sind und (3) die periplasmatisch lokalisierte C-terminale Domäne (nach Daten von Guy-Caffey et al., 1991 und Webster, 1996)

gp11 gp1

AS 8-15: ATP-Bindemotiv

AS 142: Interaktion mit Thioredoxin

(1) N-terminale Domäne, Zytoplasma:

gp1 AS 1-253

gp11 AS 241-253

(2) hydrophobe Domäne, innere Membran:

AS 254-273

(3) C-terminale Domäne, Periplasma:

AS 274-348

Einleitung

23

~ 12 - 14 gp4-Monomeren zusammen, welche eine fassähnliche Struktur mit einem

Durchmesser von 13,5 nm und einer Länge von 24 nm ausbildet. Der Innen-

durchmesser der Pore variiert zwischen 6 nm – 8,8 nm und ist an der Basis der

N-terminalen Domäne geschlossen, was nahelegt, dass die gp4-Sekretionspore

während der Phagenassemblierung einer Konformationsänderung unterworfen ist

(Linderoth et al., 1997, Opalka et al., 2003).

Die C-terminale Domäne des gp4 hat mit einer Anzahl von 212 Aminosäuren eine

77 %ige Sequenzübereinstimmung mit dem homologen Protein PulD aus Klebsiella,

welches zu der Kategorie der Sekretine gezählt wird (Pugsley, 1993). Bakterielle

Sekretine sind zusammen mit weiteren Proteinen in der äußeren Membran lokalisiert,

wo diese im Fall der Typ II-Sekretion die Ausschleusung hydrolytischer sowie

toxischer Proteine in das Periplasma vermitteln, die anschließend über die äußere

Membran in das umgebende Milieu transloziert werden. Im Fall der Typ III-Sekretion

vermitteln Sekretine den Transport von Kinasen und Phosphatasen über zwei

bakterielle und eine eukaryotische Membran in tierische oder pflanzliche Zellen

(Galan & Collmer, 1999). Abgesehen von den Sekretinen besitzen sowohl die Typ II-

als auch die Typ III-Sekretionssysteme, wie auch der Sekretionskomplex von M13,

innere Membran

Periplasma

Murein

äußere Membran

C-Terminus

gp1/11-Assembly-Komplex

gp4-Multimer

Abb. 1-9: Schematisierter gp1/11-gp4-Sekretionskomplex. Die C-terminale Domäne des gp1/11-Assembly-Komplexes interagiert mit der N-terminalen Domäne der 13,5 nm großen gp4-Pore zu einem Sekretionskomplex, wodurch das gp1 vor einer proteolytischen Prozessierung geschützt wird. Während der Assemblierung neuer Phagenpartikel durch den Assembly-Komplex werden die naszier-enden Phagen durch die gp4-Pore in der äußeren Membran in das umgebende Milieu abgegeben (nach Webster, 1996).

13,5 nm

N

C

N

gp11 gp1 gp4

C

C

N

Zytoplasma

Einleitung

24

eine ATP-bindende Komponente. Verglichen mit den genannten Sekretionstypen

stellt der Sekretionskomplex von M13 einen eigenen, speziell an die Phagenassem-

blierung angepassten, Sekretionstyp dar.

1.3 Das Hüllprotein gp9

Gp9 wird, wie die Proteine gp7, gp3 und gp6, zu den „Minor Coat“ Proteinen gezählt,

da es mit nur ~ 5 Kopien im Phagenpartikel präsent ist (Makowski, 1992). Es bildet

zusammen mit gp7 eine Kappenstruktur an der Phagenspitze, welche zu Beginn der

Phagenassemblierung zuerst das Wirtsbakterium über den Sekretionskanal verlässt.

In Deletionsversuchen am „hairpin packaging signal“ konnte gezeigt werden, dass

Mutationen in gp7 und gp9 in der Lage sind, die Veränderungen im „hairpin

packaging signal“ zu kompensieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass beide „Minor

Coat“ Proteine essenziell für den Initiationsvorgang der Assemblierung sind (Russel

& Model, 1989, Endemann & Model, 1995). Gp9 ist mit 32 Aminosäuren das kleinste

translatierte Protein von insgesamt 5 Hüllproteinen (Russel et al., 2004) und wird, wie

gp7 und gp6, ohne N-terminale Signalsequenz synthetisiert (Peters et al., 1994).

Basierend auf der Erkenntnis, dass gp9 nach der Insertion in die innere Membran

weiterhin eine N-terminale Formylgruppe aufweist, wurde vermutet, dass die Trans-

lokation entweder sofort nach oder während der Translation erfolgt (Simons et al.,

1980).

Wie die Proteinanalyse in Abbildung 1-10 zeigt, weist gp9 eine dem Haupthüllprotein

gp8 ähnliche Struktur auf. Wie gp8 besitzt es eine hydrophobe Domäne mit einem

anschließenden hydrophilen C-terminalen Bereich mit positiv geladenen Seiten-

gruppen (Marvin, 1998). Die N-terminale Domäne dagegen, die bei gp8 in der

inneren Membran lokalisiert ist, fehlt.

Abb. 1-10: Gegenüberstellung der Aminosäuresequenzen von gp9 und gp8, sowie deren Positionierung in der inneren Membran von E. coli. Das „Minor Coat“ Protein gp9 weist eine mit dem gp8 vergleichbare Struktur auf. Gp9 besitzt wie gp8 eine hydrophobe Domäne (schwarz hinter-legt), die von einem positiv geladenen hydrophilen C-terminalen Bereich gefolgt wird. Die Ladungen der Aminosäurereste sind durch (+) und (-) gekennzeichnet (nach Marvin, 1998).

Einleitung

25

Die Orientierung des gp9 nach Translokation in die innere Membran erfolgt dabei so,

dass der N-Terminus dem Periplasma zugewendet und der C-Terminus im Zyto-

plasma ist (Simons et al., 1981, Ploss & Kuhn, 2011). Durch FTIR und CD-Unter-

suchungen konnte für das gp9 eine einfache α-helikale Struktur in künstlich herge-

stellten Vesikeln aus DOPG (1,2 Dioleyl-sn-glycerol-3-phosphoglycerol) nachge-

wiesen werden (Makowski, 1992, Houbiers et al., 1999).

1.4 „Phage-Display“

Das „Phage-Display“ wurde 1985 von Smith (Smith, 1985) eingeführt und stellt eine

biotechnologische Methode dar, bei der auf genetischer Ebene kodierende Se-

quenzen von Peptiden oder Proteinteilen wie z. B. Antikörperfragmenten bzw. kom-

pletten Proteinen, nach einer Insertion in ein Phagenhüllgen funktionell auf der Ober-

fläche von Bakteriophagen präsentiert werden. Hierdurch entspricht der Genotyp

dem vorliegenden Phänotyp. Mit Hilfe des „Phage-Display“ können unter anderem

Protein-Protein Interaktionen untersucht werden. Aufgrund der geringen Genom-

größe des wildtypischen Phagen M13 sowie dessen komplett analysierter Genom-

sequenz besteht die Möglichkeit, gezielt heterologe Hüllproteine auf der Phagen-

oberfläche zu erzeugen. Jedoch kommt es hier zu einer Limitierung, da die Insertion

sowohl von für E. coli toxischen als auch von zu langen und hydrophoben Proteinen

den Phagenzyklus beeinträchtigen können. Das „Minor Coat“ Protein gp3 weist eine

höhere Toleranz gegenüber N-terminalen Insertionen als das Haupthüllprotein gp8

auf. Während gp3 Insertionen von zusätzlichen 6 - 38 Aminosäuren in die N-termi-

nale Domäne sowohl an Position 198 als auch 249 toleriert (Scott & Smith, 1990, Kay

et al., 1993, Russel, 2004), ist die Insertion in die N-terminale Domäne von gp8 auf

8–10 Aminosäuren limitiert (Kishchenko et al., 1994, Iannolo et al., 1995). Jedoch ist

auch im Fall des gp3 die Insertion limitiert, da hier nur Peptide fusioniert werden

können, welche die Infektivität des Phagen nicht negativ beeinflussen. Weiterhin

können einzelne Aminosäuren und zusätzliche positive Ladungen der inserierten

Peptide das „Phage-Display“ dahingehend beeinträchtigen, dass hierdurch sowohl

die Translokation des Sec-abhängigen gp3, als auch die Assemblierung der Phagen-

partikel durch veränderte gp8-Moleküle gestört wird (Yamane & Mizushima, 1988,

Andersson & Heijne, 1991, Schuenemann et al., 1999, Rodi et al., 2002). Außer an

gp3 und gp8 besteht des Weiteren die Möglichkeit, ein „Phage-Display“ an den

„Minor Coat“ Proteinen gp7 und gp9 durchzuführen (Gao et al., 1999, Sweeney et al.,

http://de.wikipedia.org/wiki/Biotechnologie

http://de.wikipedia.org/wiki/Peptid

http://de.wikipedia.org/wiki/Antik%C3%B6rper

http://de.wikipedia.org/wiki/Protein

http://de.wikipedia.org/wiki/Bakteriophagen

http://de.wikipedia.org/wiki/Protein-Protein-Interaktion

Einleitung

26

2006, Løset et al., 2011). In gp9 konnten erfolgreich bis zu 34 zusätzliche Amino-

säuren in die N-terminale Domäne inseriert werden, ohne den Infektionszyklus des

Phagen zu beeinträchtigen (Ploss & Kuhn, 2011). Wie in Abbildung 1-11 dargestellt,

besteht hierdurch die Möglichkeit zur Insertion und Präsentation von Peptiden an drei

unterschiedlichen Positionen des Phagen, wodurch mono-, bi- und trifunktionale

Phagen generiert werden können (Huang et al., 2005, Guo et al., 2010).

Monovalentes-/Polyvalentes „Phage-Display“

Für die funktionelle Präsentation von Fremdpeptiden auf der Phagenoberfläche, bei

der der Phänotyp dem Genotyp entspricht, stehen zwei Methoden zur Verfügung

(Lowman, 1997). Bei einer direkten Verwendung des Phagenvektors werden die

Nukleotidsequenzen des zu präsentierenden Peptids „in-frame“ in das Gen des

entprechenden Hüllproteins inseriert. In einer anschließenden Infektion werden hier-

durch, während der Assemblierung des Phagen in E. coli, ausschließlich Phagen-

partikel erzeugt, welche nur die entsprechenden heterologen Hüllproteine präsen-

tieren, wodurch ein polyvalentes „Phage-Display“ generiert wird (Parmley & Smith,

Abb. 1-11: Schematische Darstellung der an M13 möglichen „Phage-Display“-Positionen. Durch die Insertion unterschiedlicher Peptidsequenzen in die Gene der für M13 kodierenden Hüll-proteine, besteht die Möglichkeit zur Generierung mono-, bi- und trifunktionaler Phagen.

Einleitung

27

1988). Eine alternative Methode führt über ein Phagemid-System. Hier handelt es

sich um ein Hybridvektor-System, welches sich aus einem M13-Helferphagen und

einem zusätzlichen kleinen Plasmid, dem sogenannten Phagemid, zusammensetzt

(Russel et al., 1986). Der dabei verwendete Helferphage ist jedoch dahingehend

modifiziert, dass durch Mutationen im „ori“ der intergenischen Region des Phagen die

„Verpackungseffizienz“ des Phagengenoms in neue Phagenpartikel stark beein-

trächtigt ist. Im Gegenzug besitzt das Phagemid einen wildtypischen „Ff-ori“, über

den das Defizit in der „Verpackungseffizienz“ des Phagen ausgeglichen werden

kann. Durch eine Infektion von phagemidtransformierten Zellen kommt es während

der Replikationsphase zu einer homologen Rekombination zwischen Phagemid und

Helferphagengenom. Parallel zu den wildtypischen Hüllproteinen erfolgt während der

Proteinbiosynthese auch die Herstellung des phagemidkodierten, heterologen Hüll-

proteins, welches ebenfalls für die Assemblierung neuer Phagen verwendet werden

kann. Durch die Rekombination entstehen während der Replikationsphase sowohl

wildtypische als auch rekombinante Genome mit der doppelten Genanzahl eines

Hüllproteins und wildtypischem „ori“. Da letztere eine höhere „Verpackungseffizienz“

der einzelsträngigen DNA in neue Phagenpartikel aufweisen, erfolgt während der

Assemblierung hauptsächlich die Generierung von Hybridphagen. Hierdurch entsteht

ein monovalentes „Phage-Display“, bei dem auf den Phagen sowohl wildtypische als

auch die heterologe Variante des entsprechenden Hüllproteins präsentiert wird

(Russel et al., 2004). Ein großer Vorteil dieser Methode besteht darin, dass mit Hilfe

eines kleinen Vektors mit geringem Aufwand die Präsentation heterologer Hüll-

proteine auf der Phagenoberfläche möglich ist, ohne die komplexe Struktur des

Phagengenoms beeinflussen zu müssen. Ein Nachteil dieser Methode ist, dass nur

bis zu 10 % der neugebildeten Phagen mindestens ein heterologes Hüllprotein auf-

weisen (Russel et al., 2004). Über eine dritte Methode, die Komplementation, besteht

ebenfalls die Möglichkeit zur funktionellen, polyvalenten Präsentation heterologer

Fusionsproteine. Hier entspricht jedoch der Phänotyp nicht dem Genotyp, da die

Expression des genomisch kodierten Hüllproteins zuvor über eine Punktmutation

unterbunden und anschließend durch eine induzierbare Expression, von einem

sogenannten Helferplasmid aus, für die Assemblierung des Phagen bereitgestellt

wird (Ploss & Kuhn, 2011). In Abbildung 1-12 sind die gängigen Methoden für poly-

und monovalentes „Phage-Display“ am Bakteriophagen M13 in einer Übersicht dar-

gestellt.

Einleitung

28

1.5 Proteintransport-Systeme

In allen Zellsystemen erfolgt sowohl die Synthese der organismenspezifischen als

auch, im Hinblick einer Infektion von E. coli mit Bakteriophagen, die Synthese viraler

Proteine im Zytoplasma. Im Anschluss müssen diese, um ihrer Bestimmung nach-

kommen zu können, zu individuellen Kompartimenten der Zellen transportiert

werden. Infolge dessen kann der Transport eukaryotischer Proteine zu verschie-

denen Zellorganellen erfolgen wie z. B. dem Zellkern, dem endoplasmatischen Reti-

kulum, den Peroxisomen, den Mitochondrien oder den Chloroplasten. Prokaryo-

tische, wie auch virale Proteine hingegen können aus dem Zytoplasma in die innere

Membran, ins Periplasma oder in die äußere Membran transportiert werden

(Brissette & Russel, 1990, Rapoza & Webster, 1995, Wang & Dalbey, 2011). Um

diese Translokationen zu ermöglichen, stehen in Mitochondrien, Chloroplasten und

Bakterien unterschiedliche Protein Import- und Export-Systeme zur Verfügung (Abb.

1-13).

Abb. 1-12: Allgemeines Schema von poly- und monovalenten „Phage-Display“ an M13. Hier sind jeweils am Beispiel des „Minor Coat“ Proteins gp3 die Unterschiede zwischen den einzelnen „Phage-Display“-Systemen verdeutlicht. Die Insertion der Peptidsequenzen erfolgt für das „Display“ hinter die N-terminale Signalsequenz von gp3. Im Helferphagen-System ist sowohl im Phagemid als auch in der ssDNA des Helferphagen ein „Ff-ori“ vorhanden, der jedoch im Fall des Helferphagen durch Mutationen in der Replikations- und Verpackungseffizienz der ssDNA gemindert ist. Das Komplementationssystem unterscheidet sich von den anderen zwei Systemen dahingehend, dass hier der Phänotyp nicht identisch mit dem Genotyp ist (nach Russel et al., 2004, verändert).

Einleitung

29

Abb. 1-13: Darstellung der identifi-zierten Protein Import- und Export-Systeme eu- und prokaryotischer Zellen am Beispiel des Mitochondriums, des Chloroplasten und des Bakteriums. Mitochondrium: TOM = translocase of the outer membrane, TIM = translocase of the inner membrane, SAM/TOB = sorting and assembly machinery / translocase of the outer mitochondrial membrane, MIA = mitochondrial intermembrane space import and assembly, Oxa1 = oxidase assembly. Chloroplast: TOC = translocase of the outer envelope membrane of chloroplast, TIC = translocase of the inner envelope membrane of chloroplast, TAT = twin arginine translocation, Sec = secretion, Alb3 = albino. Bakterium: BAM = β-barrel assembly machinery, Sec = secretion, Tat = twin arginine translocation (nach Wang & Dalbey, 2011)

Einleitung

30

Eukaryotische Proteintransport-Systeme

In eukaryotischen Zellen werden Proteine, deren Bestimmungsort das Mitochondrium

ist, als signalsequenztragendes Präprotein im Zytoplasma synthetisiert und an-

schließend über den TOM-Komplex („translocase of the outer membrane“) unter

ATP-Verbrauch und mit Hilfe des Membranpotentials durch die äußere Membran in

den Intermembranraum (IMS, „inter membrane space“) transloziert. Von hier aus

kann der Transport der Proteine in drei weitere Organellkompartimente erfolgen, die

mitochondriale Matrix, die äußere sowie die innere Mitochondrienmembran. Aus-

gehend vom Intermembranraum werden Proteine mit β-Faltblatt-Strukturmotiven,

deren endgültiger Bestimmungsort die äußere Mitochondrienmembran ist, über den

SAM/TOB-Komplex („sorting and assembly machinery“ / „translocase of the outer

mitochondrial membrane“) transloziert (Kozjak et al., 2003, Paschen et al., 2003).

Proteine mit konservierten Cysteinresten hingegen werden über den, in der inneren

Mitochondrienmembran lokalisierten, Mia40/Erv-Komplex („mitochondrial intermem-

brane space import and assembly“ / „essential for respiration and vegetative

growth“), unter Ausbildung essenzieller Disulfidbrücken gefaltet, wodurch das Ener-

gieniveau der zu translozierenden Proteine herabgesetzt und ihr Verbleib im Inter-

membranraum erzielt wird („folding trap“-Mechanismus, Lutz et al., 2003, Herrmann

& Köhl, 2007). Die Translokation von Proteinen, deren endgültige Lokalisation die

innere Mitochondrienmembran ist, kann auf drei Wege geschehen. Ein Weg der

Translokation erfolgt über den TIM22-Komplex („translocase of the inner

membrane“). Die hier zu translozierenden Proteine werden mit einer Signalsequenz

synthetisiert, welche nach der Translokation in den IMS mit den Chaperonen dieses

Komplexes interagieren, um anschließend über den TIM22-Komplex in die innere

Membran transloziert zu werden. Membranproteine mit einer α-helikalen Trans-

membrandomäne hingegen werden bevorzugt über den TIM23-Komplex in die innere

Membran transloziert (Glick et al.,1992). Alternativ kann die Translokation auch über

Oxa1 („oxidase assembly“), dessen Analogon im bakteriellen YidC zu finden ist,

katalysiert werden. Über diesen Weg werden die Transmembranproteine zunächst

über den TIM23-Komplex aus dem IMS in die mitochondriale Matrix importiert, um

daraufhin über Oxa1 in die innere Membran transloziert zu werden. Durch Oxa1

werden weiterhin die in der mitochondrialen Matrix translatierten Membranproteine in

die innere Mitochondrienmembran inseriert (Bonnefoy et al., 2009).

Einleitung

31

Chloroplastenspezifische Proteine werden im Zytoplasma der pflanzlichen Zelle

ebenfalls als Präproteine mit spezifischen Signalsequenzen synthetisiert. Im Unter-

schied zu den mitochondrialen Proteinen ist hier der Transport zu sechs Organell-

kompartimenten möglich. Hierzu zählen die äußere, die innere und die Thylakoid-

membran sowie der Intermembranraum, das Stroma und das Thylakoidlumen. Die

Translokation der über die äußere Membran zu importierenden Proteine wird durch

den TOC-Komplex („translocase of the outer envelope membrane of chloroplast“),

die der über die innere Membran zu importierenden Proteine durch den TIC-Komplex

(„translocase of the inner envelope membrane of chloroplast“) vermittelt. Stroma-

assoziierte Peptide verbleiben nach Abspaltung der Signalsequenz durch Stroma-

spezifische Peptidasen in diesem Kompartiment, wohingegen Thylakoidlumen-

spezifische Proteine entweder über den Sec- („secretion“) oder Tat- („twin arginine

translocation“) abhängigen Transport in das Lumen exportiert werden (Cline & Theg,

2007). Diese Proteine werden mit einer zweiteiligen N-terminalen Signalsequenz

synthetisiert, welche sich aus einem „Stroma-targeting“ und einem Thylakoidlumen-

Signal zusammensetzt, die Übereinstimmungen mit bakteriellen Signalpeptiden

zeigen. Das Tat-Signalpeptid unterscheidet sich vom Sec-Signalpeptid insofern, dass

das Tat-Signalpeptid ein sogenanntes RR-Motiv (Arginin-Arginin) vor der hydro-

phoben Transmembrandomäne aufweist (Berks, 1996). Über das Sec-Translokase-

system können ungefaltete Proteine entweder in die Thylakoidmembran transloziert

oder in das Thylakoidlumen exportiert werden, wohingegen über das Tat-Translo-

kasesystem der Export gefalteter Proteine in das Lumen erfolgt (Mould et al.,1997).

Chloroplastenkodierte Proteine wie z. B. die Chlorophyll a- und b-Bindeproteine

besitzen ein stark konserviertes, aus 18 Aminosäuren bestehendes Motiv (L18-Motiv,

VDPLYPGGSFDPLGLADD), wodurch diese mittels des chloroplasteneigenen

cpSRP-Systems („chloroplast signal recognition particle“) cotranslational über cpFtsY

(„chloroplast filamentous temperature-sensitive Y“) an die Thylakoidmembran geleitet

und nach GTP-Hydrolyse über das Alb3-System inseriert werden (Tu et al., 1999,

2000, Henry et al., 2007).

Einleitung

32

Prokaryotische Proteintransport-Systeme

Ähnlich den Sec- und Tat-Translokasesystemen der Chloroplasten, sind die

bakteriellen Analoga gleichfalls für die Proteintranslokation über die innere Bakterien-

membran in das Periplasma verantwortlich. Wie bei den Mitochondrien- und Chloro-

plastenproteinen werden sowohl bakterielle als auch virale M13-Proteine wie gp3,

gp8 und gp4, welche zu anderen Zellkompartimenten delegiert werden müssen,

ebenfalls als signalsequenztragende Präproteine synthetisiert. Für die Sekretion von

ungefalteten Proteinen in das Periplasma ist die SecYEG-Translokase das bevor-

zugte System, während nur eine sehr geringe Anzahl an gefalteten und mit Metall-

Kofaktoren assoziierten Proteinen über das Tat-Translokasesystem in das Peri-

plasma von E. coli exportiert wird. Nach der Translokation werden Proteine mit

β-Faltblatt-Strukturmotiven, deren endgültiger Bestimmungsort die äußere Membran

ist, durch den BAM-Komplex („β-barrel assembly machinery“), der zu dem

SAM/TOB-Komplex der Mitochondrien analog ist, transloziert (Knowles et al., 2009).

Der Export bakterieller Lipoproteine in die äußere Membran hingegen wird über das

bakterienspezifische Lol-System, in dem die Proteinkomponenten LolABCDE invol-

viert sind, vermittelt (Tokuda & Matsuyama, 2004). Die Insertion membranasso-

ziierter Proteine kann in E. coli entweder Sec-abhängig kotranslational über den

SRP-Sec-Weg („signal recognition protein“) oder Sec-unabhängig über den YidC-

Weg erfolgen (Ulbrandt et al., 1997).

Translokationssysteme in Escherichia coli

Die Delegation der bakteriellen Proteine und die Bestimmung des in Folge dafür

benötigten Transportwegs erfolgt während der Proteinsynthese am Ribosom. Einer

der wichtigsten Translokationswege wird von den Proteinen SecA und SecB ver-

mittelt und als Sec-abhängige Translokation bzw. Sekretion bezeichnet (Abb. 1-14

b)). Während der Proteinsynthese erfolgt die Bindung eines ribosomenassoziierten

„Trigger Factor“ (TF) an eine N-terminale Sec-Signalsequenz der naszierenden

Peptidkette. Nach Vollendung der Synthese wird das ungefaltete Präprotein post-

translational von SecB gebunden und über elektrostatische Wechselwirkungen mit

dem membranassoziierten SecA an die innere Membran geführt (Wickner & Leonard,

1996). Durch die Interaktion der Präprotein-Signalsequenz mit SecA wird das SecB-

assoziierte Präprotein auf SecY übertragen und anschließend unter ATP-Hydrolyse

und mit Hilfe der protonenmotorischen Kraft (PMF, „proton motive force“) durch die

Einleitung

33

SecY-Pore in das Periplasma sekretiert. Während dieses Sekretionsvorgangs wird

die N-terminale Signalsequenz durch die membrangebundene Leaderpeptidase

prozessiert (Watanabe et al., 1988). Über diesen Weg werden Außenmembran-

proteine wie OmpA („outer membrane protein“), die alkalische Phosphatase PhoA,

das periplasmatische Maltose Bindeprotein MBP und das M13-kodierte gp4, welches

in der äußeren Membran eine homomultimere Pore bildet, sekretiert (Lecker et al.,

1990, Bassford, 1990, Brissette & Russel, 1990).

Eine weitere Sec-abhängige Translokation stellt der SRP-Sec-Weg dar, über den

Membranproteine, deren endgültiger Bestimmungsort die innere Membran ist, trans-

loziert werden (Abb.1-14 A)). Weist die während der Proteinsynthese aus dem Ribo-

som heraustretende Peptidkette eine Signalsequenz mit hydrophobem (von Heijne,

1985) und helikalem Charakter (Bruch et al., 1989) auf, so bindet das ribosomen-

assoziierte SRP den Ribonukleoproteinkomplex. Durch die Bindung des SRPs ent-

steht ein RNC/SRP-Komplex („ribosome nascent chain“), der anschließend mit dem

membranassoziierten SRP-Rezeptor FtsY („filamentous temperature-sensitive Y“) an

der inneren Membran interagiert. Unter GTP-Hydrolyse dissoziiert der FtsY/SRP-

Komplex, wodurch die Peptidkette an die Translokase SecYEG übertragen wird.

Anschließend erfolgt die Membraninsertion des Proteins unter Mitwirkung von YidC,

das für die richtige Faltung des Proteins verantwortlich ist. Als Sec-abhängige Subs-

trate wurden die ATP-Synthase Untereinheit a (FOa) (Yi et al., 2003, 2004), die

Zytochrom-bo3-Oxidase-Untereinheit CyoA (Celebi et al., 2006, Bloois et al., 2006,

Plessis et al., 2006,), die NADH Dehydrogenase I Untereinheit (Price & Driessen,

2010), als auch das „Minor Coat“ Protein gp3 des Bakteriophagen M13 charak-

terisiert (Rapoza & Webster, 1993, Thie et al., 2008).

Die Insertion integraler Membranproteine kann jedoch auch Sec-unabhängig über

den YidC-Weg erfolgen (Abb. 1-14 C)). Dieses System wird aber nur von wenigen

Proteinen wie z. B. dem Hüllprotein gp8 des Phagen M13, dem Hüllprotein des

Phagen Pf3, der c-Untereinheit der F1FO-ATP-Synthase und dem mechanosensitiven

Kanalprotein MscL genutzt (Samuelson et al., 2000, Chen et al., 2002, Van der Laan

et al., 2004, Facey et al., 2007,). Während SRP am kotranslationalen Targeting von

MscL und der c-Untereinheit der F1FO-ATP-Synthase beteiligt ist, erfolgt der Trans-

port des Hüllproteins von Pf3 als auch der des Präproteins gp8 des Phagen M13

unter Ausschluss weiterer Proteine (van Bloois et al., 2004, Facey et al., 2007). Nach

der Bindung des Substrates an die Insertase YidC und der darauf folgenden Faltung

Einleitung

34

des zu inserierenden Proteins wird dieses in die innere Membran abgegeben und,

wie im Fall des gp8-Präproteins, anschließend die N-terminale Leader-Signalse-

quenz durch die Leaderpeptidase abgespalten (Chang et al., 1978).

SecYEG

YidC

SRP

FtsY

YidC

GTP

Lep

3.

Transfer an YidC

1. SRP-vermitteltes Targeting an

FtsY

Ribosom

mRNA

2. Translokation durch SecY

4. Membraninsertion

ATP +

PMF

Lep

Ribosom

mRNA

SecA SecA

SecYEG

SecB

SecB

TF

naszierendes Polypeptid 1.

Translation

2. SecB-vermitteltes post-translationales

Targeting

3. Sekretion durch

SecY

4. Abspaltung des

Signalpeptids

Ribosom

mRNA

Sec-Signalpeptid TF

1.

Translation

naszierendes Polypeptid

YidC

Lep

FtsY

SRP

2a. post-

translationales Targeting

3. Translokation durch YidC + PMF

4. Membraninsertion

5. Abspaltung des Signalpeptids

Tat

C Tat

B

Tat A

Tat

C Tat A Oligo-mere

Tat

B

Lep

Tat

C Tat

B

Tat A Oligo-mere

Insertion Sekretion Insertion durch YidC

Sec-abhängiger Proteintransport Sec-unabhängiger

Proteintransport

naszierendes Polypeptid

Ribosom

mRNA

Tat-Signalpeptid TF

1. Translation

KF

KF 2. Nach Faltung und Targeting des Proteins

durch Kofaktoren (KF)

3. Bindung des Signalpeptids

an TatC

4. Oligomerisation der TatA-Untereinheiten

PMF

6. Abspaltung des

Signalpeptids

5. Translokation durch TatA + PMF

Insertion/Sekretion durch Tat

Abb. 1-14: Proteintransportmechanismen in Escherichia coli. A) (1.) Über das ribosomenassoziierte SRP wird die naszierende Peptidkette kotranslational an FtsY gebunden. Unter GTP-Hydrolyse dissoziiert der FtsY/SRP-Komplex. (2.) Die naszierende Kette wird an die Translokase SecY über-tragen und transloziert. (3.) Transfer des Proteins von SecYEG auf YidC (4.) mit darauf folgender Faltung und Membraninsertion. B) Post-translationale Proteinsekretion. (1.) Nach Translation (2.) bindet zytoplasmatisches SecB an die mature Sequenz der Peptidkette und leitet diese zu SecA. Von dort aus wird das Peptid auf SecY übertragen und anschließend durch (3.) ATP-Hydrolyse und mit Hilfe der protonenmotorischen Kraft über die SecYEG-Pore in das Periplasma sekretiert, (4.) wobei die Sec-Signalsequenz

durch die Leaderpeptidase (Lep) prozessiert wird. C) (1.) Naszierende Peptidkette mit gebundenem „Trigger Factor“ (TF) während der Protein-synthese. (2a.) Post-translationales Targeting an YidC (M13 procoat, Pf3 coat). (2b.) Kotranslationales Targeting der Peptidkette via SRP und FtsY an YidC (z.B. MscL). (3.) Translokation und (4.) Insertion des Proteins in

A) B) C)

D)

Peri-

plasma

Zyto-

plasma

Zyto-

plasma

Peri-plasma

die innere Membran durch YidC und PMF („proton motive force“) sowie (5.) eventuelle Abspaltung des Signalpeptids durch Lep. D) (1.) Nach Translation des Proteins (2.) erfolgt die Faltung und Bindung spezifischer Kofaktoren (KF) (3.) mit anschließendem Targeting an TatC. (4.) Oligo-merisierung von TatA und Ausbildung eines Transportkanals (5.) durch den das Protein mit Hilfe der PMF transloziert und (6.) anschließend durch Lep prozessiert wird.

2b. kotranslationales

Targeting via SRP

Einleitung

35

Ein weiterer, Sec-unabhängiger, Proteintransportweg stellt das, zu den Chloroplasten

homologe, Tat-System dar (Robinson et al, 2001) (Abb. 1-14 D)). Über dieses

System werden bereits gefaltete Präproteine, welche ein N-terminales Doppel-

Arginin Motiv aufweisen, entweder in die innere Membran inseriert oder ins Peri-

plasma transloziert (Berks et al., 2000). Das Tat-System besteht aus einem TatABC-

Komplex, in dem wahrscheinlich multimere TatA-Proteine einen Transportkanal in

der Zytoplasmamembran ausbilden (Line & Mori, 2001). Durch die Bindung des

Substrates an die Untereinheit TatC des Rezeptorelements TatBC, wird die Poly-

merisation der TatA-Untereinheiten zu einem Transportkanal initiiert, woraufhin das

zu transportierende Protein auf TatA übertragen und mit Hilfe der protonen-

motorischen Kraft (PMF, „proton motive force“) entweder in die Membran inseriert

oder in das Periplasma transloziert wird (Yahr & Wickner, 2001, Alami et al.,2003,

Cline & Theg, 2007, Tarry et al., 2009). Nach dem Proteintransport erfolgt abschlie-

ßend die Prozessierung der Peptide, in welcher das N-terminale Tat-Signalpeptid

durch die, in der Zytoplasmamembran lokalisierte, Leaderpeptidase entfernt wird. Zu

den Tat-Substraten zählen vornehmlich Proteine mit Redoxeigenschaften wie z. B.

die Trimethylamin-N-Oxid-Reduktase (TorA) (Sargent et al., 1998), die -Untereinheit

der Formiatdehydrogenase N (FdnG) (Wexler et al., 1998) und die kleine Unter-

einheit Hya der Hydrogenase 1 (Mori & Cline, 1998). Weitere Tat-Substrate sind

unter anderem die -Lactamase (Nivière at al., 1992), die P2-Domäne der Leader

Peptidase (Cristobal et al., 1999) und die Nitratreduktase (Weiner et al., 1998).

1.6 Aufgabenstellung der vorliegenden Arbeit

In dieser Arbeit soll durch die Untersuchung vier essenzieller Bereiche des M13-

Phagenzyklus, welche die Abschnitte Infektion, Proteininsertion, Assembly sowie die

Phagensekretion betreffen, neue Erkenntnisse über die Biogenese und die Assem-

blierung des filamentösen Coliphagen M13 erhalten werden. Mit Hilfe einer Quantifi-

zierung der M13-Phagenextrusion sollen anhand detaillierter „one-step growth“

Experimente neue Einblicke sowohl in die wildtypisch verlaufende Infektion als auch

in dem Verlauf einer induzierten Sekretion erhalten werden. Über die Quantifi-

zierungen können anschließend Rückschlüsse auf die Dynamik der Phagen-Wirts-

bindung, die Anzahl der sekretierten Phagen-Nachkommenschaften pro Zelle und

den Infektionsverlauf in infizierten Zellen gezogen werden. Diese Erkenntnisse sollen

im Verlauf dieser Arbeit dazu verwendet werden, die Sekretion neu gebildeter

Einleitung

36

Phagenpartikel auf der Bakterienoberfläche, sowohl mit elektronenmikroskopischen

(TEM, „transmission electron microscope“) als auch mit rasterkraftmikroskopischen

(RKM = AFM, „Atomic Force Microscope“) Methoden, näher untersuchen zu können.

Auch sind noch nicht für alle Phagenhüllproteine, die während des Assemblierungs-

vorgangs für die Sekretion neuer Phagen in der inneren Wirtsmembran zur Ver-

fügung stehen, deren wirtsspezifisch verwendeten Proteintransportsysteme identi-

fiziert. Mit Hilfe der funktionellen Präsentation von Fremdpeptiden am „Minor Coat“

Protein gp9 soll durch die Detektion antigener Epitope Aufklärung über dessen

Insertion in die innere Wirtsmembran erhalten werden.

Über den phagenkodierten gp1/11-Assembly-Komplex konnten hinsichtlich seiner

Bedeutung für den M13-Phagenzyklus sowie dessen Interaktion mit phagen-

kodierten als auch wirtsspezifischen Proteinen in der Vergangenheit fundamentale

Erkenntnisse erhalten werden. Trotz der eingehenden Untersuchungen um die

Bedeutung des Komplexes für die Assemblierung, ist es noch nicht gelungen,

dessen Größe und Molekulargewicht zu erörtern bzw. diesen zu visualisieren. Eine

Überexpression der Phagenproteine gp1/11 in E. coli-Zellen sollte es ermöglichen,

die Masse des Komplexes zu ermitteln und erste strukturelle Charakterisierungen

des gereinigten gp1/11-Assembly-Komplexes durchzuführen.

Material und Methoden

37

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Bakterien- und Bakteriophagenstämme

Bakterienstämme

Escherichia coli C41 (DE3) (Miroux & Walker, 1996)

F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB

-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])

Dieser Stamm stellt eine Spontanmutation des E. coli-Stammes BL21(DE3) dar. Er

wird zur Überexpression rekombinanter Proteine in Expressionsvektoren mit T7

Promotoren verwendet (Sambrook et al., 1989).

Escherichia coli DH5α (Hanahan, 1985)

F- gyrA96 (Nalr) recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17 (rk-, mk

+) glnV44 deoR ∆(lacZYA-

argF) U169 [Φ80d ∆(lacZ) M15]

Dieser Bakterienstamm bildet weder F-Pili noch Fimbrien aus und eignet sich

aufgrund dieser Eigenschaften für die Messungen der M13-Phagensekretion mit dem

AFM und TEM. Zur Infektion muss der Bakterienstamm mit dem RF-Plasmid des

M13-Phagen transfiziert werden.

Escherichia coli JS7131 (Samuelson et al., 2000)

MC1060 ΔyidC attB::R6Kori ParaBADyidC+ (Specr)

Bei diesem Bakterienstamm handelt es sich um einen YidC-Depletionsstamm. Die

genomische YidC-Expression wird durch einen araBAD Promotor kontrolliert wo-

durch die Expression in diesen Zellen durch Arabinose (Expression) bzw. Glukose

(keine Expression) reguliert werden kann.

Escherichia coli K37 (Hines & Ray, 1980)

HfrC supD32 relA1 pit-10 spoT1 tonA22 ompF627 phoA4 T2R λ-

Dieser Bakterienstamm ist ein Wirt des Bakteriophagen M13. Als Suppressor-Stamm

kann dieser sowohl für M13wt als auch für Phagen mit Ambermutation zur Eta-

blierung von Phagenstammlösungen verwendet werden. Er kann ebenfalls zum Aus-

plattieren bei Spot- und Plaque-Tests eingesetzt werden.

Escherichia coli K38 (Garen et al., 1965, Lyons & Zinder, 1972)

HfrC T2R relA1 pit-10 spoT1 tonA22 ompF627 phoA4 λ-


38

Dieser Bakterienstamm ist ein Wirt des Bakteriophagen M13wt. Als Nicht-Sup-

pressor-Stamm führen Ambermutation in Genen zur Termination der Translation. Er

wird sowohl zur Identifikation von M13-Ambermutanten als auch in Komplemen-

tationstests, in denen die Translation genomischer Gene des M13-Phagen zuvor

durch Insertion von Ambermutantionen unterbunden und nur anhand hilfsplasmid-

kodierter Gene kompensiert werden kann, verwendet.

Escherichia coli MC4100 (Casadaban, 1976)

F- [araD139]B/r Δ(argF-lac)169* lambda- e14- flhD5301 Δ(fruK-yeiR)725 (fruA25)‡

relA1 rpsL150(strR) rbsR22 Δ(fimB-fimE)632(::IS1) deoC1

Aufgrund des fehlenden F-Plasmids ist dieser Stamm kein natürlicher Wirt des

Bakteriophagen M13. Der Stamm wurde für die Quantifizierung der unspezifischen

Adsorption von M13-Phagen an Bakterien verwendet.

Escherichia coli XL1-blue (Bullock et al., 1987)

supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA46 thi, relA1 lac- F´[proAB+ laclq lacZ∆M15

Tn10(tetr)]

Dieser Bakterienstamm wird allgemein wegen seines Rekombinationsdefizits zur

Transformation und Isolierung von Vektoren verwendet. Durch den ΔlacZ-Genotypen

ist eine Blau-Weiß-Selektion mit X-Gal (Sambrook et al., 1989) möglich. Der Bakte-

rienstamm wird wegen der F-Pili wie E. coli K37 als Suppressor-Stamm zur Eta-

blierung von Phagenstammlösungen und zum Ausplattieren bei Spot- und Plaque-

Tests eingesetzt.

Bakteriophagenstämme:

M13mp19

Entspricht dem M13wt, in dessen Genom zusätzlich ein lacZ-Gen inseriert wurde,

welches für das N-terminale α-Fragment der β-Galactosidase kodiert und zwischen

den Kodons 6-7 eine „Multiple Cloning Site“ aufweist. Dadurch ist eine Blau-Weiß-

Selektion möglich.

M13amp

Ursprünglicher Phagenstamm ist M13mp19. In dessen „Multiple Cloning Site“ wurde

das β-Lactamase-Gen aus pGZamp inseriert, wodurch nach IPTG-Induktion die

infizierten E. coli-Zellen eine Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin erhalten.


39

M13am9-M7

Ursprünglicher Phagenstamm ist M13mp19. In das Gen 9 wurde an der Position +7

durch eine ortsgerichtete Mutagenese eine Ambermutation inseriert.

M13mp19-am8-M2

Ursprünglicher Phagenstamm ist M13mp19. Zusätzlich wurde in das Gen 8 eine

Ambermutation an der Position +2 inseriert.

2.1.2 Plasmide

pETg1/11

Der Ursprungsvektor ist das Plasmid pET-16b (Novagen), welcher eine durch den

T7-Promotor kontrollierte „Multiple Cloning Site“ besitzt. Der „Multiple Cloning Site“ ist

eine kodierende Sequenz für einen 10x Histidin-Tag vorangestellt, so dass durch die

Klonierung von Genen in diesen Bereich nach Expression Fusionsproteine mit

N-terminalen 10x Histidin-Tag entstehen. Zur Reinigung und Charakterisierung des

gp1/11-Assembly-Komplexes wurde das Gen 1 mittels PCR-Methode amplifiziert und

anschließend zwischen die Schnittstellen XhoI und Bpu1102I inseriert.

pGEMT-easy (Promega)

Das offene Plasmid mit T-Überhängen an den 3´-Enden der Plasmid-DNS diente zur

Insertion des mittels PCR-Amplifikation erhaltenen Fragments der Gene 7 und 9.

pGEMg7/9

Vektor mit T7-Promotor. Die Gene 7 und 9 des Bakteriophagen M13 wurden über

A-Überhänge in die „Multiple Cloning Site“ ligiert.

pGZamp

Der Ursprungsvektor ist das Plasmid pGZ119EH (Lessl et al., 1992), in welches das

β-Lactamase-Gen aus pUC18 in die SmaI-Schnittstelle inseriert wurde.

pMSg1/11

Der Ursprungsvektor ist das Plasmid pMS119EH (Strack et al., 1992), welches eine

durch den Tac-Promotor kontrollierte „Multiple Cloning Site“ besitzt. Zur Expression

des gp1/11-Assembly-Komplexes mit 10x N-terminalem Histidin-Tag in E. coli-

Stämmen, welche keine T7-Polymerase exprimieren, wurde das Gen aus pETg1/11

zwischen die Schnittstellen XbaI und HindIII inseriert.


40

pGZg804

Der Ursprungsvektor ist das Plasmid pGZ119HE (Lessl et al.,1992), in welches das

M13-Gen 8 aus pJF804 (Fürste et al., 1986) zwischen die Schnittstellen SalI und

EcoRI inseriert wurde.

pMSg7/9

Der Ursprungsvektor ist das Plasmid pMS119EH (Strack et al., 1992), welches eine

durch den Tac-Promotor kontrollierte „Multiple Cloning Site“ besitzt. Die M13-Gene 7

und 9 wurden zur genetischen Manipulation sowie für Expressions- und Komplemen-

tationsstudien aus dem Vektor pGEMg7/9 zwischen die Schnittstellen PaeI und SacI

inseriert.

pMSg9MunI

Entspricht pMSg7/9, jedoch wurde in Gen 9 eine MunI-Schnittstelle an Position +3

inseriert.

pMSg9T7

Entspricht pMSg7/9, jedoch wurde in Gen 9 an Position +3 die kodierende Sequenz

des T7-Tags inseriert.

pMSg9T7rep

Entspricht pMSg9T7, jedoch wurde in Gen 9 an Position +22 die kodierende Start-

sequenz +1 und +2 von gp9 an das Ende des kodierenden T7-Tags eingefügt, um

die wildtypische Aminosäuresequenz wiederherzustellen.

pMSg9HA

Entspricht pMSg7/9, jedoch wurde in Gen 9 an Position +3 die kodierende Sequenz

des HA-Tags inseriert.

pMSg9HArep

Entspricht pMSg9HA, jedoch wurde in Gen 9 an Position +20 die kodierende Start-

sequenz +1 und +2 von gp9 an das Ende des kodierenden HA-Tags eingefügt, um

die wildtypische Aminosäuresequenz wiederherzustellen.

pMSg9T7SD

Entspricht pMSg9T7, jedoch mit der zusätzlichen, 8 bp vor dem Startcodon von Gen

9 eingefügten, E. coli Shine-Dalgarno-Sequenz AGGAGG.


41

pMSg9DT7SD

Entspricht pMSg9T7SD, jedoch mit einem zusätzlichen T7-Tag an Position +20.

pMSg9T7repSD

Entspricht pMSg9T7rep, jedoch mit der zusätzlichen, 8 bp vor dem Startcodon von

Gen 9 eingefügten, E. coli Shine-Dalgarno-Sequenz AGGAGG.

pMSg9DT7repSD

Entspricht pMSg9T7repSD, jedoch mit einem zusätzlichen T7-Tag an Position +20.

pMSg9HASD

Entspricht pMSg9HA, jedoch mit der zusätzlichen, 8 bp vor dem Startcodon von Gen

9 eingefügten, E. coli Shine-Dalgarno-Sequenz AGGAGG.

pMSg9DHASD

Entspricht pMSg9HASD, jedoch mit einem zusätzlichen HA-Tag an Position +18.

pMSg9HArepSD

Entspricht pMSg9HArep, jedoch mit der zusätzlichen, 8 bp vor dem Startcodon von

Gen 9 eingefügten, E. coli Shine-Dalgarno-Sequenz AGGAGG.

pMSg9DHArepSD

Entspricht pMSg9HArepSD, jedoch mit einem zusätzlichen HA-Tag an Position +18.

pUC18 (Fermentas)

Aus diesem Plasmid entstammt das β-Lactamase-Gen, welches im Vektor pGZamp

unter der Kontrolle des induzierbaren Tac-Promotors steht.

2.1.3 DNS-Standard für Agarose-Gelelektrophoresen

DNA Ladder, 1 kb (N3232S), 100 bp (N3231S ) von New England Biolabs GmbH,

Frankfurt, D

2.1.4 Enzyme

DNase II, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, D

Lysozym, Serva, Hamburg, D

Proteinase K, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, D


42

Restriktionsendonukleasen

Alle in dieser Arbeit eingesetzten Restriktionsendonukleasen wurden von der Firma

Fermentas Life Sciences GmbH (St. Leon-Rot, D) bezogen.

DNS-Ligase

Die in dieser Arbeit für Ligationsreaktionen verwendete T4 DNA-Ligase wurde von

Fermentas Life Sciences GmbH (St. Leon-Rot, D) bezogen.

DNS modifizierende Enzyme

Die folgenden Enzyme der Firma Fermentas Life Sciences GmbH (St. Leon-Rot, D)

wurden zur Modifikation von Plasmiden und DNS-Fragmenten verwendet:

Klenow-Fragment (DNA-Polymerase I)

T4 DNA-Polymerase

Shrimp Alkaline Phosphatase

T4 Polynukleotidkinase

DNS-Polymerasen

Für QuikChange® Mutagenesen und PCR-Amplifikationen verwendete Enzyme:

PfuUltraII™ Fusion HS, Stratagene, La Jolla, USA

GoTaq® Flexi DNA-Polymerase, Promega Corp., Madison,

WI, USA

2.1.5 Antikörper

Primäre Antikörper:

Anti-M13 Coat (AII), Western/Dot-Blot 1:10000 in 1x TBS, Immunpräzipitation

8 µl Serum, Kaninchenserum, Institutsbestand

Anti-M13 pI/XI (C-terminaler Antikörper), Western-Blot 1:10000 in 1x TBS, Kanin-

chenserum. Der polyklonale Antikörper wurde mit Hilfe des synthetischen Peptids

CVSIKKGNSNEIVK hergestellt, GenScript corp., Scotch Plains, NJ, USA

Anti-T7-Tag, Western-Blot 1:5000 in 1x TBS, Immunpräzipitation 3 µl Serum,

monoklonaler Antikörper, Novagen, USA

Anti-HA-Tag, Western-Blot 1:1000 in 1x TBS, Immunpräzipitation 5 µl Serum,

monoklonaler Antikörper, Roche Pharma AG, Grenzach-Wyhlen, D

Anti-YidC, Western-Blot 1:10000 in 1x TBS, C-terminaler Antikörper, Kanin-

chenserum, Institutsbestand


43

Anti-GroEL, Western-Blot 1:10000 in 1x TBS, Immunpräzipitation 1 µl Serum,

Kaninchenserum, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, D

Anti-OmpA, Western-Blot 1:10000 in 1x TBS, Immunpräzipitation 1 µl Serum,

Kaninchenserum, Institutsbestand

Sekundäre Antikörper:

Serum gegen primäre Antikörper aus Kaninchen, monoklonaler anti-Rabbit IgG

aus Ziege mit konjugierter Peroxidase, Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, D

Serum gegen primäre Antikörper aus Mäusen, monoklonaler anti-mouse IgG aus

Schaf mit konjugierter Meerrettichperoxidase, Amersham, GE Healthcare,

Buckinghamshire, UK

Detektion und Visualisierung gebundener Erstantikörper an M13-Phagen mit Hilfe

von Protein-A konjugiertem Gold mit 20 nm Durchmesser, P6855, Sigma-Aldrich

Chemie GmbH, Steinheim, D

Protein-A Zysorbin™ Immunoadsorbent für die Isolierung von Proteinen mit

primär gebundenen Antikörpern während der Immunpräzipitation, ZYTOMED

GmbH, Berlin, D

2.1.6 Proteinstandard

PageRuler™ Prestained Protein Ladder PR0671, Fermentas Life Sciences GmbH,

St. Leon-Rot, D

PageRuler™ Prestained

170 kDa

130 kDa

100 kDa

70 kDa

55 kDa

40 kDa

35 kDa

25 kDa

15 kDa

10 kDa

Tabelle 2-1: Größenverteilung der Proteine im Proteinstandardgemisch nach gelelektrophoretischer

Auftrennung.


44

2.1.7 Aminosäuren, Zucker und Vitamine

Aminosäuren:

[35S]-L-Methionin, MP Biomedicals, Irvine, USA

Alle anderen in dieser Arbeit verwendeten Aminosäuren stammen von BIOMOL

Feinchemikalien GmbH, Hamburg, D.

Zucker:

Arabinose, USB, Cleveland, USA

Glukose, USB, Cleveland, USA

Vitamine:

Vitamin B1, Merck, Darmstadt, D

2.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien

A

Aceton Carl Roth KG, Karlsruhe, D

Acrylamid Carl Roth KG, Karlsruhe, D

AFM Messspitzen NPS-20 Brucker AXS, Palaiseau, F

Agar GERBU Biotechnik GmbH, Gaiberg, D

Agarose Ultrapure USB Corporation, Cleveland, USA

Alamethicin (aus Trichoderma viride) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, D

Ampicillin USB Corporation, Cleveland, USA

Ammoniumchlorid, NH4Cl Merck, Darmstadt, D

Ammoniumperoxodisulfat (APS) Merck, Darmstadt, D

B

Bisacrylamid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, D

Borsäure Merck, Darmstadt, D

Bromphenolblau Bio Rad Laboratories, CA, USA

C

Carbonylcyanid-m-Chlorophenyl- Merck, Darmstadt, D

hydrazon (CCCP)

Caesiumchlorid, CsCl USB, Cleveland, OH, USA

Calciumchlorid, CaCl2 Dihydrat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, D

Chloramphenicol Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, D


45

Coomassie Brilliant Blue R250 Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, D

D

2’-Desoxy-Nukleosid-5’-Triphosphat USB, Cleveland, OH, USA

(dNTP)

Di-2’-Desoxy-Nukleosid-5’-Triphos- USB, Cleveland, OH, USA

phat (ddNTP)

Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt, D

Dinatriumhydrogenphosphat, J. T. Baker, Deventer, Nl

Na2HPO4

1,4-Dithiotreitol, DTT GERBU Biotechnik GmbH, Gaiberg, D

Dodecylphosphocholin Anatrace Inc., Maumee, OH, USA

(Fos-cholin12 )

E

ECL Immobilon Western Detection Millipore GmbH, Schwalbach/Taunus, D

Reagens

Eisessig Merck, Darmstadt, D

Eisen(III)-citrat tribasisch Hydrat Merck, Darmstadt, D

Entwickler Eukobrom TETENAL AG & Co. KG,

Norderstedt, D

Ethanol Merck, Darmstadt, D

Ethidiumbromid Merck, Darmstadt, D

Essigsäure (100 %) Merck, Darmstadt, D

Ethylendiamintetraessigsäure USB Corporation, Cleveland, OH, USA

(EDTA)

F

Film (Valmex Blue sensitive X-Ray Valmex photographische Produkte,

VA711B) Augsburg, D

Filterpapier (1 mm, 3 mm) Whatman GB 004 Gel Blotting paper GmbH,

Schleicher & Schuell, Dassel D

Fixierer Superfix Plus, Eukobrom TETENAL AG &

Co. KG, Norderstedt, D

G

Gelfiltrationssäule (XK 16/40) Amersham, GE Healthcare,

Buckinghamshire, UK


46

Glaswaren Schott AG, Jena, D

Glycerin Fluka Chemie GmbH, Buchs, CH

Glycin USB, United States Biochemical Corporation,

Cleveland, OH, USA

H

Harnstoff, Urea Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, D

HClkonz Merck, Darmstadt, D

Hefeextrakt Oxoid LTD., Basingstone, Hampshire, UK

I

Imidazol Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, D

Isopropanol Fluka Chemie GmbH, Buchs, CH

Isopropyl-β-D-galactopyranosid Gerbu Biotechnik GmbH, Gaiberg, D

(IPTG)

K

Kaliumchlorid, KCl Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, D

Kaliumdihydrogenphosphat, KH2PO4 Fluka Chemie GmbH, Buchs, CH

Kaliumhydroxid, KOH Merck, Darmstadt, D

Kupfernetzchen (Athene 200) Plano, Wetzlar, D

L

Long RangerTM Gel Lösung FMC BioProducts, Rockland, ME, USA

M

Magermilchpulver Heirler Cenovis GmbH, Radolfzell, D

Magnesiumchlorid, MgCl2 6 H2O Merck, Darmstadt, D

Magnesiumsulfat, MgSO4 Merck, Darmstadt, D

Mangan(II)-chlorid, MnCl2 4 H2O Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, D

Membran für Western-Blot Hybond Nitrocellulose Membrane, Amersham

ECL Bioscience, Buckinghamshire, UK

Minisäule BD PlastipakTM, 5 ml-Spritze, Becton

Dickinson, Heidelberg, D

Monomerlösung Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe, D

(30% Acrylamid, 0,8% Bisacrylamid)

Muscovite Mica V-1 Quality Electron Microscopy Sciences, München, D


47

N

Natriumchlorid, NaCl USB Corporation, Cleveland, OH, USA

Natriumdodecylsulfat (SDS) Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, D

Natriumhydroxid, NaOH Merck, Darmstadt, D

Ni-NTA-Agarose, Ni-NTA-Superflow, Qiagen, Hilden, D

Bindungskapazität 50 mg/ml

Nitrocellulose Transfere Membrane Whatman GmbH, Dassel, D

PROTRAN®

Nukleotidmix, 4dNTP Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, D

P

Phenylmethansulfonsäurefluorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

(PMSF) Steinheim, D

Polyethylenglycol, PEG 6000 Applichem GmbH, Darmstadt, D

Ponceau S Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, D

Primer Biomers, Ulm, D

R

Rubidiumchlorid, RbCl Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, D

Reaktionsgefäße (1,5 ml, 2 ml) Sarstedt, Nümbrecht, D

S

Schwefelsäure, H2SO4 Merck, Darmstadt, D

Sephadex G10 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, D

Superdex 200TM Amicon, Schorndorf, D

Spritzen BD PlastipakTM, 50 ml, Becton Dickinson,

Heidelberg, D

Spritzenfilter, ø 25 mm, 0,22 µm Fisherbrand, Syringe Filter, Fisher Scientific

GmbH, Schwerte, D

T

Tetramethylethylendiamin (TEMED) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, D

Thermo SequenaseTM Cycle USB, Cleveland, OH, USA

Sequencing Kit

Trichloressigsäure, TCA Merck, Darmstadt, D

Tricin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, D

Tris (hydroxymethyl)-aminomethan USB, Cleveland, OH, USA

TritonX-100 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, D


48

Trypton BitTekTM Oxoid LTD., Basingstone, Hampshire, UK

2.3 Oligonukleotide

Der Bezug sowohl von fluoreszenzmarkierten Sequenzierprimern als auch von

Primern für die Durchführung ortsgerichteter Mutagenesen in Gen 8 und 9 des

Phagen M13 erfolgte über die Firma Eurofins MWG Operon (Ebersberg, D). Primer

für die Amplifizierung und Durchführung ortsgerichteter Mutagenesen in Gen 1 des

Phagen M13 erfolgte über die Firma Biomers.net GmbH (Ulm, D).

2.3.1 Sequenzierprimer Annealing Temperatur

Procoat Start: 5´-ATTACGTATTTTACCCG-3´ 47°C

Procoat Back: 5´-GGAGCCTTTATTTGTATCGGT-3´ 59°C

Tac Forward: 5´-GACAATTAATCATCGGCTCG 56°C

Tac Back: 5´-GGCTGAAAATCTTCTCTCATCCG-3´ 59°C

T7 Forward: 5´-TAATACGACTCACTATAGGG-3´ 55°C

T7 Back: 5´-CGCTGAGATAGGTGCCTCAC-3´ 53°C

Universal reverse: 5´-TTGTGAGCGGATAACAATTTC-3´ 52°C

2.3.2 Oligonukleotide für ortsgerichtete Mutagenesen

Insertion einer Ambermutation in Gen 8 an Position +3:

(A): 5´-CCTCATGAAATAGTACTTAGTCCTCAAAGC-3´ Tm 68°C

(B): 5´-GCTTTGAGGACTAAGTACTATTTCATGAGG-3´

Insertion einer Ambermutation in Gen 9 an Position +7:

(A): 5´-GTTTTAGTGTATTAGTTCGCCTCTTTCG-3´ Tm 66°C

(B): 5´-CGAAAGAGGCGAACTAATACACTAAAAC-3´

Insertion einer MunI-Schnittstelle in Gen 9 an Position +2:

(A): 5´-GGGTCAAAGATGAGTCAATTGGTTTTAGTGTATTC-´3 Tm 70°C

(B): 5´-GAATACACTAAAACCAATTGACTCATCTTTGACCC-´3

Insertion der Shine-Dalgarno-Sequenz AGGAGG vor das Startcodon

von Gen 9 an Position -8:

(A): 5´-GCTTGGTATAATCGCAGGAGGTCAAAGATGAGTC-3´ Tm 74°C

(B): 5´-GACTCATCTTTGACCTCCTGCGATTATACCAAGC-3´


49

Reparatur der Startsequenzen in Gen 9 durch Insertion des Bereichs +1 und +2 von

gp9 an Position +20 (gp9HArep) bzw +22 (gp9T7rep):

gp9HA

(A): 5´-GATTATGCACAATTGATGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTTG-3´ Tm 70°C

(B): 5´-CAAAAGAATACACTAAAACACTCATCAATTGTGCATAATC-3´

gp9T7

(A): 5´-GGTTCAGCGCAATTGATGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTTG-3´ Tm 74°C

(B): 5´-CAAAAGAATACACTAAAACACTCATCAATTGCGCTGAACC-3´

2.3.3 Oligonukleotide für die Amplifikation von Genen

Gen 7/9:

(A): 5´-TGTACACCGTTCATCTGTCC-3´ Tm 60°C

(B): 5´-TCATGAGGAAGTTTCCATTAAACG-3´ Tm 59°C

Gen 1:

(A): 5´-CCGCCTCGAGATGGCTGTTTATTTTGTAACTGGC-3´ Tm 68°C

(B): 5´-CCGCTCAGCTTAATTACATTTAACAATTTCATTTGAATTACC-3´ Tm 66°C

2.3.4 Oligonukleotide für die Insertion eines antigenen Epitops

T7-Tag:

(A): 5´-AATTAATGGCGTCCATGACCGGTGGTCAACAGATGGGTTCAGGTTCA

GCGC-3´ Tm 85°C

(B): 5´-AATTGCGCTGAACCTGAACCCATCTGTTGACCACCGGTCATGGACGC

CATT-3´ Tm 85°C

HA-Tag:

(A): 5´-AATTAGCGTCAGGTTCATATCCGTATGACGTTCCGGATTATGCAC-3´

Tm 79°C

(B): 5´-AATTGTGCATAATCCGGAACGTCATACGGATATGAACCTGACGCT-3´

Tm 79°C


50

2.4 Geräte

AFM („Atomic Force Microscope“)

Nanoscope IIIa, Digital Instruments, USA

Agarose-Gelelektrophoresekammer

Easy Electrophoresis Systems, Model #B1A, Owl Scientific Inc., USA

Äkta

Basic Chromatographie System pH/C-900, UV-900, P-900, Amersham Biosciences,

Freiburg, D

Autoklaven

H+P Varioklav® 75S, H+P Labortechnik GmbH, Oberschleißheim, D

H+P Varioklav® 135S, H+P Labortechnik GmbH, Oberschleißheim, D

Bildaufnahmesysteme (Aufnahme von Gelen und LB-Medienplatten)

Digitales Bildaufnahmesystem, Darkroom Evo III mit Software Diana/95 Camera

Control v. 1.6, Raytest Isotopenmessgeräte, Straubengardt, D

Bio-IMAGING Analyser BAS-1500 und Geldokumentationssystem mit Software

AIDA, Raytest Isotopenmessgeräte, Straubengardt, D

Scanner UMAX PowerLook III mit Software Adobe Photoshop 5.0, Amersham,

GE Healthcare, Buckinghamshire, UK

Blotkammer (Western-Blot)

semi-dry Blotkammer, Owl Separation Systems, Schleicher & Schuell, Dassel, D

Brutschränke

Heraeus B6030, Heraeus Sepatech GmbH, Osterode, D

Heraeus T6200, Heraeus Sepatech GmbH, Osterode, D

DNS-Sequenzierer

DNA-Sequencer LI-COR® Modell 4200, Software e-Seq v3.0, LI-COR® Inc., Lincoln,

USA

Drehrad

Gerlinde Kisker, Produkte für die Biotechnologie, Mühlhausen, D

Eismaschine

Scotsman® AF20, Scotsman Ice Systems, Vernon Hills, Illinois, USA

Geltrockner

BioRad Gel Dryer Model 583, Bio Rad Laboratories, Hercules, CA, USA


51

Heizblock

Unitek HB-130, Miyachi Unitek, Monrovia, CA, USA

Magnetrührer

Magnetrührer MR 2000, Heidolph Elektro GmbH & Co. KG, Kelheim, D

Mikroskop

Standard 18, Carl Zeiss, Oberkochen, D

Netzgeräte

Power Pac 300, BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA

Power Pac 3000, BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA

pH-Messgerät

Metrohm 620 pH-Meter, Metrohm, Herisau, CH

Photometer

Cell Density Meter CO 8000, WPA Biowave, Cambridge, UK

Lambda 15 UV/VIS Spectrophotometer, Perkin-Elmer Inc., Waltham, MA, USA

SDS-PAGE

Hoefer Electrophoresis Unit SE600 Series, Amersham Biosciences, Freiburg, D

Sterilisation

gebrauchsfertige Filtereinheit, Filtration Life Science Diagnostic Components,

Schleicher & Schuell, Dassel, D

Sterilbank

BDK Luft- und Reinraumtechnik GmbH, Sonnenbühl-Genkingen, D

Thermoblock/Mixer

Thermoblock, Unitek HB-130, Biozym, Hermeln, D

Thermomixer 5436, Eppendorf AG, Hamburg, D

Thermocycler

T3 Thermocycler und TGradient, Biometra GmbH, Goettingen, D

Tischschüttler

Vortex genie 2, Scientific Industries, bender & Hobein AG, Zürich, CH

Transmissionselektronenmikroskop (TEM)

LEO 912AB mit Omega Filter für EFTEM, 80kV, Punkt zu Punkt Auflösung 0,37 nm,

Carl Zeiss NTS GmbH, Oberkochen, D


52

Vakuumkonzentration

SpeedVac Concentrator, Savant Instruments Inc. Model RH40-11 mit Refrigerated

Condensation Trap (Kühlfalle) und High Vacuum Pump, Bachofer Laboratoriums-

geräte, Reutlingen, D

Waagen

Sartorius 1264MP, Sartorius Werke GmbH, Göttingen, D

Sartorius Competence CP 224 S, Sartorius Werke GmbH, Göttingen, D

Wasseraufbereitungsanlage (zur Erzeugung von H2Obidest)

Milli-Q® Water Purification System, Q-Garde® 2, Millipore GmbH, Eschborn, D

Wasserbad

Wasserbadschüttler HT, Infors AG, Bottmingen, CH

Zellaufschlusssystem

French Pressure Cell Press, American Instrument Company, MA, USA

Zentrifugen

Tischzentrifuge Z 200 M/H, HERMLE Labortechnik GmbH, Wehingen, D

Tischkühlzentrifuge Z 233 MK, HERMLE Labortechnik GmbH, Wehingen, D

Kühlzentrifuge Model J2-21, Zentrifuge mit den Rotoren JA14, JA20, Beckman

Instruments GmbH, USA

Kühlzentrifuge Model Avanti J25, Zentrifuge mit den Rotoren JLA25.50,

JLA10.500, JLA16.250, Beckman Coulter, Inc. Fullerton, CA, USA

Ultrazentrifuge Optima LE-80K, Zentrifuge mit den Rotoren 50Ti, 60Ti, SW28,

Beckman Instruments GmbH, Fullerton, CA, USA

2.5 Verwendete Kits

ZippyTM Plasmid Miniprep Kit, Zymo Research, Irvine, CA, USA

ZymocleanTM, Gel DNS Recovery Kit, Zymo Research, Irvine, CA, USA

GFXTM PCR DNS and Gel Band purification Kit, Amersham Inc., Cleveland, OH,

USA

ECL PlusWestern Blotting Reagent Pack, Amersham Inc., Cleveland, OH, USA

2.6 Kulturmedien

2.6.1 Festmedien

LB-Agarplatten:

LB-Medium, 1,5 % (w/v) Agar, pH 7,5 (NaOH), autoklaviert


53

LB-Agarplatten mit Ampicillin:

LB-Medium, 1,5 % (w/v) Agar, pH 7,5 (NaOH), autoklaviert, Ampicillin (100 µg/ml)

sterilfiltriert

LB-Topagar:

LB-Medium, 0,7 % (w/v) Agar, pH 7,5 (NaOH), autoklaviert

2.6.2 Flüssigmedien

M9 Minimalmedium (10 x):

300 mM Na2HPO4 x 2 H2O, 220 mM KH2PO4, 180 mM NH4Cl, 80 mM NaCl

„Pulse“-Medium:

10 % (v/v) M9 Minimalmedium (10 x), 0,1 % (v/v) 1 M MgSO4, 0,1 % (v/v) 1 M CaCl2,

0,5 % (v/v) Vitamin B1-Lösung (1 mg/ml), 0,5 % (v/v) Eisencitrat (0,1 %), 0,5 % (v/v)

Glukoselösung (40 %), Aminosäuremix ohne L-Methionin 10 % (v/v).

Für Pulsversuche mit araBAD Promotor wird zur Induktion plasmidkodierter Proteine

die Glukoselösung durch eine Arabinoselösung ersetzt.

Aminosäuremix ohne L-Methionin:

Für die Herstellung werden alle Aminosäuren aus Tabelle 2-2 getrennt eingewogen

und, mit Ausnahme der Asparaginsäure und Tyrosin, in ddH2O gelöst.

Tabelle 2-2: Molarität der einzelnen Aminosäurelösungen für den Aminosäuremix ohne

L-Metionin. *Lösen in 1,5 ml 0,5 N HCl, **Lösen in 10 ml 0,1 N NaOH

Aminosäure Molarität [mM] Alanin 100 Arginin 50

Asparagin 100 Asparaginsäure 100*

Cystein 100 Glutamin 100

Glutaminsäure 50 Glycin 100 Histidin 100

Isoleucin 100 Leucin 100 Lysin 100

Phenylalanin 100 Prolin 100 Serin 100

Threonin 100 Tryptophan 50

Tyrosin 5**

Valin 100


54

Hiervon werden 2 ml Tyrosinlösung, 200 µl Argininlösung, 200 µl Glutaminsäure-

lösung, 200 µl Tryptophanlösung und jeweils 100 µl der verbleibenden Aminosäure-

lösungen mit 6 ml ddH2O gemischt und mit 10 µl HClkonz neutralisiert.

LB-Medium:

1 % (w/v) Trypton, 0,5 % (w/v) NaCl, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, pH 7,5 (NaOH),

autoklaviert

LB-Medium mit Ampicillin:

1 % (w/v) Trypton, 0,5 % (w/v) NaCl, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, pH 7,5 (NaOH),

autoklaviert, Ampicillin (100 µg/ml) sterilfiltriert

2.7 Puffer und Lösungen

2.7.1 Agarosegelelektrophorese

10x TBE-Puffer (pH 8,3):

Substanz Menge

Tris 2,2 M

Borsäure 1,8 M

EDTA pH 8,0 50 mM

4x DNS-Probenpuffer:

Substanz Menge

Glycerol 50 % (w/v)

Bromphenolblau 0,4 % (w/v)

EDTA 1 mM

10x Ethidiumbromidlösung:

Substanz Menge

Ethidiumbromid 10 mg/ml


55

2.7.2 Coomassiefärbung

Färbelösung:

Substanz Menge Coomassie Brilliant blue

R250 0,1 % (w/v)

Ethanol 40 % (v/v)

Essigsäure 100 % 10 % (v/v)

Entfärbelösung:

Substanz Menge


2.7.3 DNS-Puffer

10x TE-Puffer (pH 8 mit HCl):

Substanz Menge

Tris 0,1 M

EDTA 10 mM

2.7.4 DNS-Sequenziergel

Stammlösungen:

10x TBE (pH 8,3)

Substanz Menge

Tris 2,2 M

Borsäure 1,8 M

EDTA 50 mM

sterilfiltrieren

Sequenziergel

Substanz Menge

Harnstoff 42 % (w/v)

Acrylamidlösung LongRanger

TM

12 % (v/v)

10 x TBE 12 % (v/v)

10 % (w/v) APS 0,005 % (v/v)

TEMED 0,0005 % (v/v)


56

2.7.5 Herstellung von Phagenstammlösungen

Präzipitationspuffer:

Substanz Menge

PEG 6000 20 % (w/v)

NaCl 2,5 M

sterilfiltrieren

2.7.6 Induktion von Expressionssystemen

1 M IPTG:

Substanz Menge

IPTG 23,8 % (w/v)

sterilfiltrieren

Arabinose:

Substanz Menge

Arabinose 25 % (w/v)

sterilfiltrieren

2.7.7 Kompetente E. coli-Zellen

TFB1-Puffer (pH 5,8 mit Essigsäure):

Substanz Menge

RbCl 100 mM

MnCl2 50 mM

Kaliumacetat 30 mM

CaCl2 10 mM

Glycerin 15 % (w/v)

sterilfiltrieren

TFB2-Puffer (pH 7,0 mit KOH):

Substanz Menge

MOPS 10 mM

RbCl 10 mM

CaCl2 75 mM

Glycerin 15 % (w/v)

sterilfiltrieren


57

2.7.8 Nanogoldmarkierung von M13-Phagen

10x TBS-Puffer (pH 7,4):

Substanz Menge

Tris 200 mM

NaCl 1,5 M

KCl 27 mM

autoklavieren

Block-Lösung:

Substanz Menge

10x TBS 10 % (v/v)

BSA 0,1 % (w/v)

Staph-A Nanogold-Lösung:

Substanz Menge

10x TBS 10 % (v/v)

BSA 0,1 % (w/v)

Staph-A Nanogoldlösung 0,05 % (v/v)

2.7.9 Negativkontrastierung von biologischen Proben für die Transmissions-

elektronenmikroskopie (TEM)

Substanz Menge

Phosphorwolframsäure 5 % (w/v)

Ethanol 50 % (w/v)

Der pH-Wert der Lösung wird mit Natronlauge auf pH 7 eingestellt.

2.7.10 Proteinstandard für die präparative Gelfiltration

Substanz Menge

Apoferritin 25 mg/ml

β-Amylase 5 mg/ml

BSA 5 mg/ml

Carboanhydrase 3 mg/ml

Tris/HCl pH 7,5 20 mM

NaCl 50 mM

Fos-cholin 12 0,8 % (v/v)


58

2.7.11 Radioaktive Markierung in vivo mit anschließender Immunpräzipitation

und Protease-Mapping

Stammlösungen:

Substanz Menge

EDTA pH 8 100 mM

IPTG 1 M

[35

S]-L-Methionin 10 µCi/µl

Proteinase K 20 mg/ml

Protein-A

Lysozym 0,5 mg/ml

Fixierlösung für radioaktive SDS-Gele:

Substanz Menge

Ethanol 40 % (v/v)


Probenaufbereitung:

Substanz Menge

Aceton

TCA 100 % (w/v)

Pufferlösungen:

TEN-Puffer

Substanz Menge

Tris/HCl pH 8 10 mM

NaCl 150 mM

EDTA 1 mM

TENTX-Puffer

Substanz Menge

Tris/HCl pH 8 10 mM

NaCl 150 mM

EDTA 1 mM

Triton X-100 2 % (v/v)


59

Spheroplastenpuffer

Substanz Menge

Saccharose 40 % (w/v)

Tris/HCl pH 8 33 mM

2.7.12 Reinigung der gp1/11-Assembly-Komplexe mittels präparativer Gelfil-

tration

Puffer für Säule XK 16/40

Substanz Menge


NaCl 50 mM


2.7.13 Reinigung der gp1/11-Assembly-Komplexe mittels Metallaffinitätschro-

matographie (IMAC)

Aufbewahrungspuffer für E. coli-Zellen:

Substanz Menge


Saccharose 25 % (w/v)

Zellen können über mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden.

Stammlösungen für den Zellaufschluß im „French-Press“ Verfahren:

Substanz Menge

DNase II 25 mg/ml

PMSF in DMSO 100 mM

MgCl2 1 M

CaCl2 20 mg/ml

Stammlösungen für die Metallaffinitätschromatographie (IMAC):

Substanz Menge

Imidazol/HCl pH 7 1 M

NaCl 5 M

Tris/HCl pH 7,5 1 M

Fos-cholin 12 10 %


60

Puffer für die Metallaffinitätschromatographie (IMAC):

Equilibrierungspuffer für Ni-NTA-Säulenmatrix

Substanz Menge

Imidazol 10 mM


NaCl 300 mM

Solubilisierungspuffer

Substanz Menge

Imidazol 10 mM


NaCl 300 mM

Fos-cholin 12 2 % (v/v)

Säulenwaschpuffer 1

Substanz Menge

Imidazol 15 mM


NaCl 300 mM


Säulenwaschpuffer 2

Substanz Menge

Imidazol 40 mM


NaCl 300 mM


Elutionspuffer

Substanz Menge

Imidazol 300 mM


NaCl 300 mM



61

2.7.14 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

Probenaufbereitung/Stammlösungen:

Substanz Menge

Aceton

APS 10 % (w/v)

SDS 25 % (w/v)

TEMED

TCA 100 % (w/v)

SDS-Probenpuffer:

Lösung 1

Substanz Menge


EDTA/HCl pH 7,0 20 mM

Lösung 2

Substanz Menge

Tris/HCl pH 7,0 83,3 mM

Glycerin 29,2 % (v/v)

SDS 8,8 % (w/v)

Bromphenolblau 0,14 % (w/v)

1 M DDT

Die Lösungen werden im folgenden Verhältnis vor der Verwendung miteinander

gemischt: Lösung 1 : Lösung 2 : 1 M DTT

5 : 4 : 1 ( v/v)

2.7.14.1 SDS-PAGE nach Laemmli (1970)

10x SDS-Laufpuffer:

Substanz Menge

Tris 3 % (w/v)

Glycin 14,4 % (w/v)

SDS 1 % (w/v)


62

SDS-Gele ohne Harnstoff

Monomerlösung:

Substanz Menge

Acrylamid 30 % (w/v)

Bisacrylamid 0,8 % (w/v)

Zusammensetzung von Sammel- und Trenngel (18 x 14 cm):

Sammelgel (3 %)

Substanz Menge

1 M Tris/HCl pH 6,8 1,75 ml

Monomerlösung 1,33 ml

ddH2O 7,3 ml

25 % (w/v) SDS 40 µl

10 % (w/v) APS 50 µl

TEMED 5 µl

Trenngel (12 %)

Substanz Menge



ddH2O 6,0 ml

25 % (w/v) SDS 60 µl

10 % (w/v) APS 75 µl

TEMED 5 µl

SDS-Gele mit Harnstoff

Lösungen:

Substanz Menge


Bisacrylamid 2 % (w/v)

Zusammensetzung von Sammel- und Trenngel (18 x 14 cm):

Sammelgel (3 %)

Substanz Menge

Harnstoff 3,6 g


45 % (w/v) Acrylamid 1,1 ml


63

2 % (w/v) Bisacrylamid 0,65 ml

ddH2O 4,85 ml

25 % (w/v) SDS 40 µl

10 % (w/v) APS 100 µl

TEMED 8 µl

Trenngel (22 %)

Substanz Menge

Harnstoff 7,2 g

3,3 M Tris/HCl pH 8,7 2,5 ml

45 % (w/v) Acrylamid 9,8 ml

2 % (w/v) Bisacrylamid 0,8 ml

25 % (w/v) SDS 100 µl

10 % (w/v) APS 70 µl

TEMED 10 µl

2.7.14.2 SDS-Tricin-Gelelektrophorese nach Schägger & Jagow (1987)

10x Kathodenpuffer (- Pol) (pH 8,25 mit HCl):

Substanz Menge

Tris 1 M

Tricin 1 M

SDS 1 % (w/v)

10x Anodenpuffer (+ Pol) (pH 8,9 mit HCl):

Substanz Menge

Tris 2 M

Monomerlösung:

Substanz Menge


Bisacrylamid 1,5 % (w/v)

Gel-Pufferlösung:

Substanz Menge

Tris/HCl pH 8,9 3 M

SDS 0,3 % (w/v)


64

Zusammensetzung von Sammel-, Spacer- und Trenngel (18 x 14 cm):

Sammelgel (4 %)

Substanz Menge

Monomerlösung 480 µl

Gel-Pufferlösung 1,49 ml

ddH2O 4,03 ml

10 % (w/v) APS 30 µl

TEMED 3 µl

„Spacer“-Gel (10 %)

Substanz Menge


Gel-Pufferlösung 1 ml

ddH2O 1,39 ml

10 % (w/v) APS 10 µl

TEMED 2 µl

Trenngel (16,5 %)

Substanz Menge


Gel-Pufferlösung 2,66 ml

Glycerol 1,06 g

ddH2O 1,62 ml

10 % (w/v) APS 30 µl

TEMED 3 µl

2.7.15 Stammlösungen

Substanz Menge

Ampicillin 20 mg/ml

Chloramphenicol 25 mg/ml

Glukose 40 % (w/v)

NaCl 5 M


65

2.7.16 Dot-Blot / Western-Blot

10x TBS-Puffer (pH 7,4):

Substanz Menge

Tris 200 mM

NaCl 1,5 M

KCl 27 mM

10x Transferpuffer:

Substanz Menge

Tris 500 mM

Glycin 3 M

Ponceau S-Lösung:

Substanz Menge

Ponceau S-Farbstoff 0,2 % (w/v)

Essigsäure 5 % (v/v)

Block-Lösung:

Substanz Menge

10x TBS 10 % (v/v)

Milchpulver 5 % (v/v)

„Stripping“-Puffer (pH 2,3) zur Entfernung gebundener Antikörper:

Substanz Menge

Glycin 200 mM

NaCl 500 mM

2.8 Methoden

2.8.1 Herstellung von E. coli-Vorkulturen

2 ml LB-Medium wurde mit einer E. coli-Einzelkolonie beimpft und über Nacht bei

37°C geschüttelt. Bei Transformanten erfolgte der Zusatz des entsprechenden Anti-

biotikums zum Medium.

2.8.2 Herstellung transformationskompetenter E. coli-Zellen

Zum Beimpfen einer 50 ml LB-Kultur im Verhältnis 1:100 wurde eine frische Über-

nachtvorkultur des gewünschten E. coli-Stamms verwendet. Die Inkubation der


66

Zellkultur erfolgte anschließend unter Schütteln bei 37°C bis zu einer optischen

Dichte (OD600) von 0,5. Daraufhin wurde die Kultur auf Eis gestellt, in ein steriles

Zentrifugengefäß überführt und zentrifugiert (5000 g, 10 min, 4°C). Der Überstand

wurde verworfen, das Zellpellet in 30 ml TFB1-Puffer (4°C) aufgenommen und

60 Minuten auf Eis gestellt. Es erfolgte eine erneute Zentrifugation, nach welcher der

Überstand abermals verworfen und das Pellet nun in 2 ml TFB2-Puffer aufge-

nommen wurde. Die Aliquotierung der Zellen erfolgte zu 50 µl in auf Eis vorgekühlte

1,5 ml Plastikreaktionsgefäße, welche direkt in flüssigem Stickstoff eingefroren und

bei -80°C gelagert wurden.

2.8.3 Transformation von E. coli

50 µl transformationskompetenter Bakterienzellen wurden auf Eis aufgetaut und

anschließend mit 1-2 µl Plasmid-DNS versetzt. Hierauf folgte eine 30-minütige

Inkubation der Zellen auf Eis mit einem anschließenden Hitzeschock (42°C, 90 s)

und Reinkubation der Zellen auf Eis (2 min). Die transformierten Zellen wurden

anschließend auf LB-Agarplatten mit entsprechendem Antibiotikum ausgebracht und

über Nacht bei 37°C inkubiert.

2.8.4 Transfektion von E. coli

50 µl transformationskompetenter Bakterienzellen wurden auf Eis aufgetaut und

anschließend mit 1-2 µl RF-Plasmid-DNS versetzt. Hierauf folgte eine 30-minütige

Inkubation der Zellen auf Eis mit einem anschließenden Hitzeschock (42°C, 90 s)

und Reinkubation der Zellen auf Eis (2 min). Im Fall des M13-Phagenstamms mit

β-Lactamase-Gen wurden die transfizierten Zellen auf LB-Agarplatten mit Ampicillin

(100 µg/ml) und IPTG (1 mM) ausgebracht und bei 37°C über Nacht inkubiert. Für

Phagenstämme ohne β-Lactamase-Gen wurden die transfizierten Zellen nach dem

Hitzeschock max. 30 Minuten bei 37°C inkubiert und mit diesen dann eine

Verdünnungsreihe bis 1:100000 angefertigt. Von den Verdünnungsstufen wurden je

100 µl in, mit Plattierbakterien versetzten, Top-Agar (350 µl E. coli F+, 46°C) auf LB-

Agarplatten ausgebracht und nach Verfestigung des Top-Agars über Nacht bei 37°C

inkubiert.


67

2.8.5 Isolierung von Plasmid-DNS aus E. coli

Minipräparation

a) Anzucht einer E. coli-Flüssigkultur

Für die Minipräparation wurden die Plasmide von Interesse zuvor in E. coli-Zellen

transformiert (Kap. 2.8.3). Mit einer Einzelkolonie erfolgte dann die Beimpfung von

2 ml LB-Medium, zu dem entsprechend benötigtes Antibiotikum zugesetzt wurde. Die

Flüssigkultur wurde anschließend über Nacht bei 37°C inkubiert.

b) Isolierung von Plasmid-DNS

Die Plasmidisolierung wurde nach dem Protokoll des ZippyTM Plasmid Miniprep Kits

von Zymo Research durchgeführt.

2.8.6 Isolierung von M13 RF-Plasmid-DNS aus E. coli

a1) Minipräparation nach Infektion

Für die Minipräparation wurde eine, bei 37°C gewachsene, E. coli K37-Kultur (2 ml)

bei einer optischen Dichte (OD600) von 0,2 mit dem M13-Phagenstamm von Interesse

mit einer M.O.I. („Multiplicity of infection“) von 10 infiziert. Anschließend wurde die

Kultur bei 37°C über Nacht inkubiert.

a2) Minipräparation nach Transfektion

Für die Minipräparation wurde das RF-Plasmid des Phagenstamms von Interesse in

kompetente E. coli-Zellen transformiert (Kap. 2.8.4) und diese anschließend in Top-

Agar auf LB-Kulturplatten ausplattiert. Von den gebildeten Plaques auf dem Bakte-

rienrasen wurde eine Einzelplaque mit Hilfe einer Pasteurpipette isoliert und in 500 µl

sterilem ddH2O aufgenommen und anschließend für mindestens 30 Minuten bei RT

inkubiert. 250 µl dieser Phagenlösung wurde dann für die Infektion einer bei 37°C

gewachsene E. coli K37-Kultur (2 ml, siehe a1)) verwendet.

Alternativ kann die isolierte Einzelplaque direkt in 2 ml LB-Medium aufgenommen

und anschließend über Nacht bei 37°C inkubiert werden.

b) Isolierung von M13 RF-Plasmid-DNS

Die Plasmidisolierung wurde nach dem Protokoll des ZippyTM Plasmid Miniprep Kits

von Zymo Research durchgeführt.


68

2.8.7 Agarose-Gelelektrophorese

Zu 40 ml 1x TBE-Puffer wurden, entsprechend der zu trennenden DNS-Fragmente

(Tabelle 2-3), die Mengen (w/v) Agarose zugegeben und aufgekocht. Nach dem

Abkühlen auf circa 50°C wurden 20 µg Ethidiumbromid zu der flüssigen Agarose-

schmelze zugesetzt und anschließend in die Agarose-Gelelektrophorese-Vorrichtung

„Easy Electrophoresis Systems“ gegossen. Als Laufpuffer diente 1x TBE. Zu 10 µl

DNS-Probe wurden 5 µl 4x DNS-Probenpuffer zugegeben und diese wurden dann

bei einer konstanten Spannung von 90 V aufgetrennt. Die Abschätzung der DNS-

Fragmentgrößen erfolgte anhand aufgetragener DNS-Standards (1 kb DNA Ladder,

100 bp DNA Ladder, New England BioLabs Inc.)

Fragmentlänge Agarosekonzentration

(w/v)

1 bis 30 kb 0,5 %

0,8 bis 12 kb 0,7 %

0,5 bis 7 kb 1,0 %

0,4 bis 6 kb 1,2 %

0,2 bis 3 kb 1,5 %

0,1 bis 2 kb 2,0 %

2.8.8 Restriktionsverdau von Plasmid-DNS und DNS-Fragmenten

Zur Herstellung der in dieser Arbeit vorgestellten Plasmidkonstrukte wurden folgende

Verdaustrategien angewendet:

a) Einfachverdau (10 µl Gesamtvolumen)

1 µl 10x Enzymreaktionspuffer

1 µl Restriktionsenzym

350 – 400 ng Plasmid-DNS

mit x µl ddH2O steril auf 10 µl ergänzen

Der Ansatz wurde abhängig vom verwendeten Enzym 2 h bei 37°C oder 30°C

inkubiert. Zur Entfernung des Restriktionsenzyms wurde die verdaute DNS über das

ZymocleanTM, Gel DNA Recovery Kit von Zymo Research gereinigt.

Tabelle 2-3: Agarosekonzentrationen und die jeweiligen Fragmentlängen-Trennbereiche


69

b) Doppelverdau in geeignetem Enzymreaktionspuffer (15 µl Gesamtvolumen)

1,5 µl 10x Enzymreaktionspuffer

1 µl Restriktionsenzym A

1 µl Restriktionsenzym B

350 – 400 ng Plasmid-DNS


Der Ansatz wurde abhängig von den verwendeten Enzymen 2 h bei 37°C oder 30°C

inkubiert. Zur Entfernung der Restriktionsenzyme und zur Isolierung des DNS-

Fragments von Interesse wurde die verdaute DNS über eine Agarosegelelektro-

phorese aufgetrennt, das DNS-Fragment isoliert und mit Hilfe des ZymocleanTM Gel

DNA Recovery Kit von Zymo Research nach Vorschrift gereinigt.

C) Doppelverdau ohne geeigneten Enzymreaktionspuffer

Bei Doppelverdauen mit Restriktionsenzymen, welche keinen geeigneten gemein-

samen Reaktionspuffer besaßen, wurden nacheinander Einfachverdaue wie unter a)

beschrieben durchgeführt.

2.8.9 Ligationsansätze

Ligationen wurden mit T4 DNA-Ligase in einem Endvolumen von 10 µl entsprechend

der Konzentrationen und Bedingungen laut Herstellerangaben (MBI-Fermentas)

durchgeführt.

2.8.10 Hybridisierung von Oligonukleotiden zur Ligation

Phosphorylierung der Oligonukleotide

Für je ein Oligonukleotid wurde ein Ansatz hergestellt:

1 µg Oligonukleotid

3 µl 5x T4 Polynukleotidkinasepuffer

1 µl 10 mM ATP

2 µl T4 Polynukleotidkinase


Die Ansätze wurden für 1 h bei 37°C und anschießend für 20 Minuten bei 65°C

inkubiert.


70

Hybridisierung der Oligonukleotide

Zur Generierung von hybridisierten Oligonukleotiden wurden jeweils die 15 µl

Ansätze der phosphorylierten Einzeloligonukleotide vereinigt.

15 µl Oligonukleotid A

15 µl Oligonukleotid B

4 µl 10x Annealing Puffer (200 mM Tris/HCl (pH 7,4), 20 mM MgCl2,

500 mM NaCl)

6 µl ddH2O

Der Ansatz wurde für 10 Minuten auf 95°C erhitzt, langsam auf 50°C abgekühlt,

0,1 µg – 0,5 µg MunI linearisierter pMSg9MunI Vektor hinzugefügt und anschließend

weiter langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Der Ansatz wurde daraufhin mit

Ethanol gefällt (Kap. 2.8.11), eine Ligation (Kap. 2.8.9) durchgeführt und in E. coli-

Zellen transformiert (Kap. 2.8.3).

2.8.11 Ethanol-Fällung von Plasmid-DNS

Zur Fällung wurde 1/10 des Ausgangsvolumens an Natriumacetat (3 M, pH 5,5)

sowie das 2,5-fache Volumen an Ethanol (100 %) zur DNS-Probe zugegeben und

gemixt. Der Ansatz wurde dann 1 h bei -80°C inkubiert und anschließend 20 Minuten

bei 4°C mit 16 000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen und

verworfen. Als Waschschritt erfolgte die Zugabe von 1 ml eiskaltem, 80 %igem

Ethanol zu der pelletierten DNS. Die Probe wurde dann 5 Minuten bei 4°C mit 16 000

g zentrifugiert, der Überstand abgenommen und verworfen. Zur Entfernung des Rest-

ethanols aus der DNS wurde die Probe im Speed Vac Concentrator getrocknet und

anschließend in 10 µl 1x TE-Puffer aufgenommen.

2.8.12 DNS-Sequenzierung

Die in dieser Arbeit durchgeführten Sequenzierungen wurden nach der Methode von

Sanger (Sanger et al., 1977) unter Verwendung des Thermo SequenaseTM Cycle

Sequencing Kits (USB, Cleveland, OH, USA) und fluoreszenzmarkierter Primer

(Kapitel 2.3) nach folgendem Programm im Thermocycler durchgeführt:


71

Anzahl der Zyklen Temperatur Zeit

Vorheizen 1 95°C 2 min

Denaturierung

30

95°C 30 s

Annealing Primer TM – 10°C 30 s

Elongation 72°C 15 s / 1 kb

Final Elongation 1 72°C 3 min

Ende 4°C ∞

Sequenziergel

Der Zusammenbau der Gelapparatur erfolgte nach Vorschrift des Herstellers. Für ein

Sequenziergel wurden die Substanzen aus Kapitel 2.7.4 in 10 ml ddH2O gelöst, an-

schließend zu 50 ml mit ddH2O ergänzt und entgast. Aus dieser 50 ml Lösung

wurden sodann 3 ml entnommen, mit 4 µl TEMED und 32 µl 10 %iger APS-Lösung

versetzt und zum Abdichten der Unterseite der Gelapparatur verwendet. Nach

dessen Polymerisation wurde nach Zugabe von 25 µl TEMED und 250 µl 10 %iger

APS-Lösung zu der Restmenge mit diesem das Sequenziergel gegossen und ein

Vorkamm an der Oberseite der Gelapparatur eingesteckt. Nach vollständiger Poly-

merisation des Gelmaterials (1 h) wurde der Vorkamm gegen einen Haifischzahn-

kamm ausgetauscht und die Gelapparatur in das Sequenziergerät installiert.

2.8.13 PCR-Reaktionen

Die Amplifikation von Genfragmenten durch PCR („polymerase chain reaktion“) zur

anschließenden Klonierung in Plasmidvektoren erfolgte mit Hilfe der GoTaq® Flexi

DNA-Polymerase von Promega und speziellen Oligonukleotiden (Kap. 2.3) nach

folgendem Protokoll:

a) PCR-Mix (50 µl)

10 µl 5x Green GoTaq Flexi-Buffer

1 µl dNTP-Mix (10 mM each)

100 – 150 ng Templat DNS

4 µl MgCl2 25 mM

3 µl Primer A (10 pM/µl)

3 µl Primer B (10 pM/µl)

x µl dd H2O steril auf 49,5 µl ergänzen

0,5 µl GoTaq® Flexi DNA-Polymerase


72

b) PCR-Reaktionsprotokoll:


Initiale Denaturierung 1 95°C 2 min

Denaturierung

30

95°C 30 s


Elongation 72°C 1 min / 1 kb


Ende 4°C ∞

Nach der PCR wurde der Mix über eine Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und

das Amplifikat mit Hilfe des ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit von Zymo Research

gereinigt.

2.8.14 Ortsgerichtete Mutagenese (QuikChange® Mutagenese)

Die ortsspezifische Manipulation von Gensequenzen zur Herstellung der gp9 Kon-

strukte in Kapitel 2.8.17 sowie der M13-Phagen mit Ambermutationen in den Genen

8 und 9 in Kapitel 2.8.16 erfolgte mit Hilfe spezifischer Oligonukleotide (Kap. 2.3) und

der Polymerase PfuUltraII™ Fusion HS von Stratagene nach folgendem Protokoll:

a) QuikChange®-Ansatz (50 µl)

5 µl 10x PfuUltraII™ Fusion HS Reaction-Buffer

1 µl dNTP-Mix (10 mM each)

30 ng Templat DNS

2 µl Primer A (100 ng/µl)

2 µl Primer B (100 ng/µl)

x µl dd H2O steril auf 49 µl ergänzen

1 µl PfuUltraII™ Fusion HS DNA-Polymerase

b) PCR-Reaktionsprotokoll:


Initiale Denaturierung 1 95°C 2 min

Denaturierung 19

95°C 20 s



73

Elongation 72°C 15 s / 1 kb


Ende 4°C ∞

Nach Ablauf der Reaktion wurden 2 µl des Restriktionsenzyms DpnI (5 u/µl) zu dem

Reaktionsansatz hinzugegeben und für 2 h bei 37°C inkubiert. Danach wurde die

Plasmid-DNS durch eine Ethanol-Fällung (Kap. 2.8.11) gereinigt und in E. coli XL1-

blue transformiert (Kap. 2.8.3).

2.8.15 Komplementationstest

Mit Hilfe des Komplementationstest wurde ein induziertes „one-step growth“

Experiment zur Quantifizierung der M13-Phagenextrusion durchgeführt und die

Funktionalität der hergestellten gp9-Konstrukte überprüft.

Das Prinzip des Komplementationstest besteht in einer Überprüfung der Funk-

tionalität eines auf genetischer Ebene modifizierten Genes und die hieraus resul-

tierende Beeinflussung des Phagenzyklus. Hierzu werden einmal Bakterienstämme

benötigt, welche als Nicht-Suppressoren bezeichnet werden und nicht in der Lage

sind eine spezielle „nonsense“ Mutation, die Ambermutation, während der Trans-

lation selbst wiederherzustellen. Als weiteres wird ein M13-Phagenstamm benötigt,

welcher in dem Gen des Genprodukts, welches untersucht werden soll, eine Amber-

mutation besitzt und daher nicht in der Lage ist, dieses Genprodukt zu bilden. Durch

diese Konstellation kommt es bei einer Infektion von E. coli Nicht-Suppressor-

stämmen wie z.B. E. coli K38 zu keiner Vermehrung des Phagen. Besitzt jedoch die

Zelle durch eine vorausgegangene Transformation ein Plasmid, welches für das

mutationsfreie Genprodukt kodiert, kann dieses exprimiert, für die Phagenassem-

blierung verwendet und somit die Funktionalität des plasmidkodierten Genprodukts

untersucht und hierdurch ebenfalls der Assembly-Vorgang kontrolliert werden.

a) Induziertes „one-step growth“ Experiment

Phagenstamm M13mp19am8-M2: Damit die Phagensekretion aus E. coli induzierbar

und somit kontrollierbar war, wurde die genetische Erbsubstanz des wildtypischen

M13mp19-Phagen durch eine Ambermutation im Gen 8 verändert, wodurch kein

funktionsfähiges Haupthüllprotein gebildet wird.


74

Nicht-Suppressorstamm E. coli K38: In diesen Bakterienstamm wurden zur Induzier-

barkeit der Assemblierung von M13mp19am8-M2 das Plasmid pGZg8wt (Kap. 2.1.2)

transformiert (Kap. 2.8.3) und eine Vorkultur (Kap. 2.8.1) hergestellt.

Die Durchführung entspricht der des Kapitels 2.8.18.

b) Komplementationstest der gp9-Konstrukte

Phagenstamm M13am9-M7: Um die Funktionalität der plasmidkodierten Konstrukte

untersuchen zu können, wurden die Komplementationsexperimente mit diesem

Phagenstamm durchgeführt, dessen genetische Erbsubstanz durch Insertion einer

Ambermutation im Gen 9 verändert wurde und der somit kein funktionsfähiges gp9

mehr bildet.

Suppressorstamm E. coli K37: In diesem Bakterienstamm werden die Genprodukte

von Genen mit Ambermutation in nahezu wildtypischer Expressionsrate hergestellt.

Dieser Bakterienstamm stellte somit den Referenzwert für die wildtypische Ver-

mehrung des Phagenstamms M13am9-M7 dar.

Nicht-Suppressorstamm E. coli K38: In diesen Bakterienstamm wurden zur Funktio-

nalitätsüberprüfung die plasmidkodierten gp9-pMS-Konstrukte aus Kapitel 2.1.2

transformiert (Kap. 2.8.3). Weiterhin diente der nicht transformierte Stamm als

Kontrolle, um die Anzahl der M13-Revertanten bestimmen zu können.

Für Komplementationsexperimente wurde von der M13am9-M7 Phagenstamm-

lösung (Phagentiter 1 x 109 pfu/ml) eine Verdünnungsreihe so hergestellt, dass in

den einzelnen Verdünnungsstufen Phagentiter von 106 pfu/ml bis 101 pfu/ml

vorlagen. Damit die Komplementationsexperimente als Spot-Test (Kap. 2.8.22 a))

durchführbar waren wurden von allen transformierten pMSgp9-Konstrukten in E. coli

K38 je 2 ml LBamp Vorkulturen (Kap. 2.8.1) hergestellt und diese anschließend bei

37°C bis zu einer Zelldichte von 4 x 108 Bakterien/ml kultiviert. Wie in Kapitel 2.8.22

a) beschrieben, wurden dann für jedes Konstrukt Spot-Tests durchgeführt, bei denen

jeweils abwechselnd die einzelnen plasmidtragenden E. coli K38-Kulturen als

Plattierbakterien verwendet wurden. Zur Kontrolle wurde eine E. coli K37-Kultur ohne

Plasmid und eine E. coli K38-Kultur ohne Plasmid zum Ausplattieren verwendet. Zu

allen Komplementationsexperimenten wurde IPTG (1 mM Endkonzentration) zur

Induktion der plasmidkodierten gp9-Konstrukte zum Top-Agar hinzugegeben. Nach

Verfestigung des Top-Agars wurden jeweils 10 µl der zuvor hergestellten Verdün-


75

nungsstufen von M13am9-M7, 106 pfu/ml bis 101 pfu/ml auf die Oberseite der

einzelnen LB-Platten aufgebracht und bei RT getrocknet. Die LB-Platten wurden

dann über Nacht bei 37°C inkubiert und daraufhin die Plaque-Bildung am Folgetag

analysiert.

2.8.16 Konstruktion spezifischer M13-Phagenstämme

M13amp

Dieser Phagenstamm wurde zur Selektion infizierter Bakterienzellen generiert.

Hierfür wurde das β-Lactamase-Gen durch Restriktionsverdau (Kap. 2.8.8) mit dem

Enzym PagI aus dem Plasmid pUC18 isoliert und das ~1 kb große Fragment nach

enzymatischer Modifikation seiner 5´- und 3´-Überhänge mit Hilfe des Klenow-

Fragments (nach Anleitung MBI-Fermentas) in die SmaI-Position des Vektors

pGZ119EH ligiert, wodurch der Vektor pGZamp hervorging. Anschließend erfolgte

die Subklonierung des β-Lactamase-Gens aus dem Vektor pGZamp über die Restrik-

tionsschnittstellen EcoRI und PstI (Kap. 2.8.8) in die „Multiple Cloning Site“ des

Phagenstamms M13mp19. Die generierten Konstrukte wurden durch DNA-Sequen-

zierung mit Hilfe des „Universal reverse“-Primers (Kap. 2.3.1) überprüft.

M13am9-M7

Dieser Phagenstamm wurde zur Überprüfung der Funktionsfähigkeit der in dieser

Arbeit hergestellten gp9-Konstrukte generiert. Über eine ortsgerichtete Mutagenese

(Kap. 2.8.14) wurde mit Hilfe eines modifizierten Primerpaares (Kap. 2.3.2) in Gen 9

des Phagenstamms M13mp19 eine Ambermutation (TAG) an Aminosäureposition +7

inseriert und mit Hilfe des „Procoat back“-Primers (Kap. 2.3.1) durch DNA-Sequen-

zierung überprüft.

M13mp19-am8-M2

Dieser Phagenstamm wurde zur Realisierung eines induzierbaren Phagensekretions-

systems generiert. Über eine ortsgerichtete Mutagenese (Kap. 2.8.14) wurde mit

Hilfe eines modifizierten Primerpaares (Kap. 2.3.2) in Gen 8 des Phagenstamms

M13mp19 eine Ambermutation (TAG) an Aminosäureposition +2 inseriert und mit

Hilfe des „Procoat Start“-Primers (Kap. 2.3.1) durch DNA-Sequenzierung überprüft.


76

2.8.17 Plasmidkonstrukte

Gen 9-Konstrukte

pGEMg7/9

Die Gene 7 und 9 wurden durch PCR unter Verwendung des M13mp19 RF-Plasmids

als „Template“ mit Hilfe des Primerpaares aus Kapitel 2.3.3 amplifiziert und über

A-Überhänge in den Vektor pGEMT-easy (Promega) ligiert (Kap. 2.8.9) und mit Hilfe

des „T7 Forward“-Primers (Kap. 2.3.1) durch DNA-Sequenzierung überprüft.

pMSg7/9

Sowohl zur weiteren genetischen Modifikation als auch für Expressions- und Komple-

mentationsstudien wurden die Gene 7 und 9 des M13-Phagen aus dem Vektor

pGEMg7/9 über die Restriktionsschnittstellen PaeI und SacI (Kap. 2.8.8) in den

Vektor pMS119HE ligiert (Kap. 2.8.9). Das generierte gp9-Konstrukt wurde mit Hilfe

des „Tac Forward“-Primers (Kap. 2.3.1) durch DNA-Sequenzierung überprüft.

pMSg9MunI

Über eine ortsgerichtete Mutagenese (Kap. 2.8.14) erfolgte mit Hilfe eines modi-

fizierten Primerpaares (Kap. 2.3.2) die Insertion einer MunI-Schnittstelle (CAATTG)

an die Aminosäureposition +2 des Gens 9 im Vektor pMSg7/9. Das generierte gp9-

Konstrukt wurde mit Hilfe des „Tac Forward“-Primers (Kap. 2.3.1) durch DNA-

Sequenzierung überprüft.

pMSg9T7 und pMSg9HA

Die Insertion der antigenen T7- und HA-Epitope in den N-terminalen Bereich des

Gens 9 erfolgte durch die Ligation (Kap. 2.8.9) der zuvor hybridisierten Oligo-

nukleotide (Kap. 2.8.10) aus Kapitel 2.3.4 in die MunI-Schnittstelle des Vektors

pMSg9MunI. Die generierte gp9-Konstrukte wurde mit Hilfe des „Tac Forward“-

Primers (Kap. 2.3.1) durch DNA-Sequenzierung überprüft.

pMSg9T7rep und pMSg9HArep

Zur Wiederherstellung der wildtypischen Aminosäuresequenz nach den Sequenzen

der zuvor eingefügten antigenen Epitope wurde in Gen 9 des pMSg9T7- bzw.

pMSg9HA-Vektors an Position +20 (HA) bzw. +22 (T7) die Startsequenz ATGAGT

des wildtypischen gp9 über eine ortsgerichtete Mutagenese (Kap. 2.8.14) mit Hilfe

modifizierter Primerpaare (Kap. 2.3.2) eingefügt. Die generierten gp9-Konstrukte


77

wurden mit Hilfe des „Tac Forward“-Primers (Kap. 2.3.1) durch DNA-Sequenzierung

überprüft.

pMSg9T7SD, pMSg9HASD, pMSg9T7repSD und pMSg9HArepSD

Damit bei der Expression der gp9-pMS-Konstrukte in den E. coli-Zellen höhere

Proteinmengen erhalten werden konnten, wurden in die Konstrukte über eine orts-

gerichtete Mutagenese (Kap. 2.8.14) mit Hilfe modifizierter Primerpaare (Kap. 2.3.2)

8 bp vor dem Startcodon von Gen 9 die Shine-Dalgarno-Sequenz AGGAGG von

E. coli inseriert. Die generierten gp9-Konstrukte wurden anschließend mit Hilfe des

„Tac Forward“-Primers (Kap. 2.3.1) durch DNA-Sequenzierung überprüft.

pMSg9DT7SD, pMSg9DHASD, pMSg9DT7repSD und pMSg9DHArepSD

Durch eine weitere Insertion der zuvor hybridisierten Oligonukleotide (Kap. 2.8.10)

aus Kapitel 2.3.4 in die MunI-Schnittstelle (Kap. 2.8.8) der Vektoren pMSg9T7SD,

pMSg9HASD, pMSg9T7repSD und pMSg9HArepSD konnten durch die anschlie-

ßende Ligation (Kap. 2.8.9) jeweils ein weiteres antigenes T7- bzw. HA-Epitop in den

N-terminalen Bereich des Gens 9 eingefügt werden. Die generierten gp9-Konstrukte

wurden mit Hilfe des „Tac Forward“-Primers (Kap. 2.3.1) durch DNA-Sequenzierung

überprüft.

Gen 1-Konstrukte

pETg1/11

Zur Reinigung und Charakterisierung des gp1/11-Assembly-Komplexes wurde das

Gen 1 durch PCR unter Verwendung des M13mp19 RF-Plasmids als Templat mit

Hilfe des Primerpaares aus Kapitel 2.3.3 amplifiziert, anschließend in die Schnitt-

stellen XhoI und Bpu1102I des Vektors pET-16b (Novagen) inseriert (Kap. 2.8.8) und

das Konstrukt mit Hilfe des „T7 Forward“-Primers (Kap. 2.3.1) durch DNA-Sequen-

zierung überprüft.

pMSg1/11

Zur Expression des gp1/11-Assembly-Komplexes mit 10x N-terminalem Histidin-Tag

in E. coli-Stämmen, welche keine T7-Polymerase exprimieren, wurde das Gen 1 aus

pETg1/11 über die Restriktionsschnittstellen XbaI und HindIII (Kap. 2.8.8) in den

Vektor pMS119EH subkloniert. Hierbei wurde darauf geachtet, dass die Ribosomen-

bindestelle aus pET-16b Bestandteil des zu klonierenden Fragments war.


78

2.8.18 „One-step growth“ Experiment

Die Quantifizierung der Phagensekretion aus E. coli stellt eine zeitliche Veränderung

der Phagenmenge im umgebenden Medium nach erfolgter Infektion einer Bakterien-

kultur dar. Da die Phagenproteinbiosynthese unmittelbar von der Stoffwechsel-

leistung des Wirtes abhängig ist, kann diese unter anderem durch die Variation der

Kulturmedientemperatur gesteuert werden.

Phagenstamm M13mp19: Zur Quantifizierung der wildtypischen Phagensekretion

aus E. coli K38 wurde dieser, dem M13 Wildtyp entsprechende, Phagenstamm

verwendet.

Bakterienstamm E. coli K38: In diesem Stamm kann sich M13mp19 wildtypisch

vermehren.

Zur Durchführung des „one-step growth“ Experiments wurde ein steriler Erlenmeyer-

kolben mit 50 ml LB-Flüssigmedium 1/100 mit einer E. coli K38-Vorkultur (Kap 2.8.1)

bzw. im Fall des induzierbaren Experiments (Kap. 2.8.15 a)) mit einer mit pGZg8wt

transformierten E. coli K38 Vorkultur beimpft. Die Zellen wurden bei 37°C bis zu einer

Zelldichte von circa 2 x 108 Bakterien/ml kultiviert und anschließend im Eiswasserbad

abgekühlt. Daraufhin folgte eine 5-minütige Infektion der Zellkultur mit M13mp19

(M.O.I 100) bzw. mit M13mp19am8 (M.O.I. 10) im Eiswasserbad. Zur Abtrennung

des phagenhaltigen Kulturmediums wurde die Zellkultur zentrifugiert (7500 g, 4°C,

5 min), der Überstand verworfen und die Zellen in 5 ml frischem LB-Flüssigmedium

(4°C) aufgenommen und in einen neuen, mit 50 ml LB-Flüssigmedium vorge-

wärmten, Erlenmeyerkolben (37°C) überführt. Anschließend erfolgte eine erneute

Inkubation der Zellen bei 37°C. Dies stellt den Zeitpunkt t = 0 min dar. Im Fall des

induzierten „one-step growth“ Experiments erfolgte an dieser Stelle die Zugabe von

IPTG (1 mM Endkonzentration). Zu definierten Zeiten (Kap. 3.1.1 bzw. 3.1.2) wurden

Proben zu 500 µl aus der infizierten Kultur entnommen und in ein steriles 1,5 ml

Reaktionsgefäß überführt und zentrifugiert (16 000 g, 4°C, 2 min). Der Überstand

wurde in ein neues steriles 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und auf Eis gelagert. Zur

Bestimmung der Veränderung des Phagentiters im Kulturmedium wurden anschlie-

ßend von den Überständen Verdünnungsreihen bis zu einer Verdünnungsstufe von

1/108 angefertigt und mit diesen ein Spot-Test (Kap. 2.8.22 a)) und daraufhin, zur


79

eindeutigen Ermittlung der Phagentiter, ein Plaque-Test (Kap. 2.8.22 b)) durchge-

führt. Die Tests wurden 3-mal wiederholt.

Im Fall des induzierten „one-step growth“ Experiments aus Kapitel 2.8.15 a) wurde

als Kontrolle die Veränderung des Phagentiters in einer zweiten infizierten, jedoch

nicht induzierten, Zellkultur ermittelt.

Die Veränderung des Bakterientiters während des wildtypisch verlaufenden „one-step

growth“ Experiments wurde durch die Entnahme von 100 µl Proben zu definierten

Zeiten (Kap. 3.1.1) mittels Lichtmikroskopie bestimmt (Kap. 2.8.23).

2.8.19 M13 Adsorptionsassay

Phagenstamm M13mp19: Zur Quantifizierung der wildtypischen Phagenadsorption

an E. coli K38 wurde dieser, dem M13 Wildtyp entsprechende, Phagenstamm ver-

wendet.

Bakterienstamm E. coli K38: Dieser Stamm besitzt für den erfolgreichen Infektions-

vorgang von M13 F-Pili.

Bakterienstamm E. coli MC4100: Dieser Stamm besitzt keine F-Pili für die Adsorption

von M13-Phagen auf der Bakterienoberfläche und stellt somit die Kontrolle dar.

Zur Durchführung des Adsorptionsassays wurde ein steriler Erlenmeyerkolben mit

50 ml LB-Flüssigmedium 1/100 mit einer E. coli K38-Vorkultur (Kap 2.8.1) bzw. ein

zweiter mit einer E. coli MC4100-Vorkultur beimpft. Die Zellen wurden bei 37°C bis

zu einer Zelldichte von circa 2 x 108 Bakterien/ml kultiviert und anschließend im Eis-

wasserbad abgekühlt. Daraufhin folgte eine 5-minütige Infektion der Zellkulturen mit

M13mp19 auf Eis. Damit die Anzahl der gebundenen Phagen anhand der Abnahme

des eingesetzten Phagentiters bestimmt werden konnte, wurde einmal eine Probe zu

500 µl kurz nach der Zugabe der entsprechenden Phagenmenge und ein weiteres

Mal nach Beendigung der 5-minütigen Infektion entnommen und in ein steriles 1,5 ml

Reaktionsgefäß überführt und zentrifugiert (16 000 g, 4°C, 2 min). Der Überstand

wurde in ein neues steriles 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und auf Eis gelagert. Zur

Bestimmung der Veränderung des Phagentiters im Kulturmedium wurden anschlie-

ßend von den Überständen Verdünnungsreihen bis zu einer Verdünnungsstufe von

1/109 angefertigt und mit diesen ein Spot-Test (Kap. 2.8.22 a)) und daraufhin, zur


80

eindeutigen Ermittlung der Phagentiter, ein Plaque-Test (Kap. 2.8.22 b)) durchge-

führt. Sowohl der Spot- als auch der Plaque-Test wurden 3-mal wiederholt.

Im Fall der Kontrolle E. coli K38 wurde dieser Adsorptionsassay mit den M.O.I.-

Werten 5, 10, 20, 52 und 90 durchgeführt.

Im Fall der Negativkontrolle E. coli MC4100 wurde für die Ermittlung der unspezi-

fischen Adsorption von M13-Phagen an Glasgeräte und Bakterien dieser Adsorp-

tionsassay mit den M.O.I.-Werten 10, 50 und 100 durchgeführt.

2.8.20 Messung des Extrusionsverlaufs von M13-Phagen auf der Zellober-

fläche von E. coli

Phagenstamm M13mp19: Zur Quantifizierung der wildtypischen Phagensekretion

aus E. coli XL1-blue wurde dieser, dem M13 Wildtyp entsprechende, Phagenstamm

verwendet.

Bakterienstamm E. coli XL1-blue: In diesem Stamm kann sich M13mp19 wildtypisch

vermehren.

Um den zeitlichen Verlauf des Sekretionsvorgangs auf der Zelloberfläche mit Hilfe

des AFM („Atomic Force Microscope“) messen zu können, wurde ein steriler

Erlenmeyerkolben mit 50 ml LB-Flüssigmedium 1/100 mit einer E. coli XL1-blue-

Vorkultur (Kap 2.8.1) beimpft. Die Zellen wurden bei 37°C bis zu einer Zelldichte von

circa 2 x 108 Bakterien/ml kultiviert und anschließend im Eiswasserbad abgekühlt.

Daraufhin folgte die Infektion (M.O.I. 20) der Zellkultur für 5 Minuten mit M13mp19.

Anschließend wurde die Batch-Kultur sofort wieder bei 37°C geschüttelt. Für die

Messungen der einzelnen Sekretionsstadien am AFM wurden aus der Batch-Kultur

Probenmengen von 500 µl entnommen und in sterile 1,5 ml Reaktionsgefäße über-

führt, die sowohl Alamethicin (5 µM Endkonzentration) als auch CCCP (50 µM End-

konzentration) enthielten und auf Eis gelagert. Die Probenentnahmen erfolgten kurz

vor Infektion sowie direkt nach erneutem Schütteln bei 37°C zu den Zeitpunkten

t = 0, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 und 16 Minuten. Die Proben wurden daraufhin, wie

in Kapitel 2.8.26 beschrieben, für die Messungen am AFM vorbereitet und gemessen

(Kap. 2.8.28). Die Messungen wurden 3-mal wiederholt.


81

2.8.21 Herstellung von M13-Phagenstammlösungen

a) Phagenvermehrung

Für die Phagenvermehrung wurden 100 ml LB-Medium mit einer frischen Vorkultur

von E. coli K37 im Verhältnis 1/100 beimpft. Die Kultur wurde anschließend bis zu

einer optischen Dichte (OD600) von 0,2 bei 37°C geschüttelt. Daraufhin erfolgte die

Infektion der Bakterienkultur für 5 Minuten mit einer M.O.I. von 5 bei Raumtemperatur

ohne Schütteln. Anschließend wurde die Kultur über Nacht bei 37°C geschüttelt.

b) Präzipitation der Phagen

Die infizierte Übernachtkultur wurde in ein steriles Zentrifugengefäß überführt und

zentrifugiert (8000 g, 15 min). Anschließend erfolgte die vorsichtige Überführung des

phagenhaltigen Überstands in ein neues steriles Gefäß. Zum Überstand wurde 1/6

des Ausgangsvolumens an Präzipitationspuffer (Kap. 2.7.5) hinzugegeben und für

4 h bei 6°C gemischt. Anschließend wurde die Suspension erneut bei 8000 g für

15 Minuten zentrifugiert. Das pelletierte Phagenpräzipitat wurde vorsichtig vom Über-

stand abgetrennt und das trübe Phagenpellet in 1 ml 1x TE-Puffer aufgenommen.

Zur Entfernung von kopräzipitierten Bakterienzellen wurde das eluierte Phagenpellet

in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt und für 2 Minuten bei 16 000 g zentrifugiert. Der

Überstand wurde dann vorsichtig in ein neues steriles 1,5 ml Reaktionsgefäß über-

führt und der Phagentiter bestimmt.

2.8.22 Phagentiterbestimmung

a) Spot-Test

Dieses Verfahren stellt eine schnelle Methode zur Ermittlung der Phagenkon-

zentration in einer Phagenlösung dar. Es handelt sich hierbei jedoch nicht um eine

genaue Methode, sie dient vielmehr zur Ermittlung einer sinnvollen Verdünnungs-

stufe aus einer Phagenlösung anhand derer dann eine genaue Phagentiterbe-

stimmung mit Hilfe des Plaque-Test Verfahrens durchgeführt werden kann. Als Basis

für den Test wird der zellfreie Überstand einer E. coli-Flüssigkultur verwendet. Hierfür

wird eine Probe von 500 µl aus der Kultur entnommen und zentrifugiert (16 000 g,

3 min). Der Überstand wird in ein neues steriles 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und

hieraus eine Verdünnungsreihe bis 1/1010 hergestellt.

Für den Spot-Test wurden 3 ml geschmolzener Top-Agar in ein steriles Reagenzglas

gegeben und dieses in einem Thermoblock auf 47°C temperiert. Anschließend

wurden zum geschmolzenen Top-Agar 350 µl Plattierbakterien (E. coli, F+, z.B. K37


82

oder XL1-blue) zugegeben und gemischt. Die Suspension wurde auf eine LB-Agar-

platte ausgebracht, woraufhin sie sich nach 5 Minuten verfestigte. Auf den Top-Agar

wurden dann jeweils 10 µl der einzelnen Phagenverdünnungen pipettiert. Man lässt

die Tropfen in den Agar einwirken bis keine Flüssigkeit auf der Oberfläche mehr zu

sehen ist. Danach wurde die LB-Agarplatte bei 37°C über Nacht im Brutschrank

inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte die Auswertung der gebildeten Plaques.

b) Plaque-Test

Durch diese Methode erfolgt eine genaue Bestimmung der Phagenpartikelanzahl pro

Volumeneinheit in einer Flüssigkeit.

Für den Plaque-Test wurden 3 ml geschmolzener Top-Agar in ein steriles Reagenz-

glas gegeben und dieses in einem Thermoblock auf 47 °C temperiert. Anschließend

wurden zum geschmolzenen Top-Agar 350 µl der Plattierbakterien (E. coli, F+, z.B.

K37 oder XL1-blue) und 100 µl einer angemessenen Phagenverdünnung aus a)

zugegeben und gemischt. Die Suspension wurde dann auf eine LB-Agarplatte

ausgebracht, woraufhin sie sich nach 5 Minuten verfestigte. Danach wurde die LB-

Agarplatte bei 37°C über Nacht im Brutschrank inkubiert. Am nächsten Tag erfolgten

die Auswertung der gebildeten Plaques und die Bestimmung des Phagentiters in der

vorliegenden Phagenstammlösung.

Der Phagentiter in „plaque forming units“ (pfu) pro Milliliter lässt sich wie folgt

errechnen:

2.8.23 TCA-Fällung von Proteinen

Zur Konzentrierung und Aufbereitung von Proteinen für SDS-Polyacrylamid-

Gelelektrophoresen sowie für SDS-Tricin-Gelelektrophoresen wurden diese zuvor mit

Hilfe von Trichloressigsäure (TCA) gefällt. Hierfür wurden die Proben mit TCA

versetzt (12 % Endkonzentration), kurz gemischt, 60 Minuten auf Eis inkubiert und

anschließend zentrifugiert (10 min, 4°C und 16 000 g). Der Überstand wurde vor-

sichtig abgenommen und das Pellet zweimal mit 1 ml eiskaltem Aceton gewaschen

und zentrifugiert (10 min, 4°C und 16 000 g). Abschließend wurde das Pellet bei

50°C getrocknet, in Probenpuffer aufgenommen und kurz vor der Verwendung für die

SDS-Gelelektrophorese 5 Minuten bei 95°C mit Hilfe eines Thermoblocks gekocht.


83

2.8.24 Bestimmung der Bakterienzellzahl

Die Bestimmung der Bakterienzellzahl von E. coli-Flüssigkulturen erfolgte mit Hilfe

der Thoma-Zählkammer am Lichtmikroskop. Hierfür wurde aus der Kultur steril eine

Probe von 200 µl entnommen und diese nach Bedarf verdünnt bis bei einer 400-

fachen Vergrößerung am Mikroskop die Bakterienzellen mit der Thoma-Zählkammer

auszählbar waren. Zur Bestimmung der Bakterienzellzahl wurden die Werte aus vier

ausgezählten Kleinquadraten gemittelt und wie folgt die Zellzahl pro Milliliter

errechnet:

2.8.25 Präparation transfizierter E. coli DH5α-Zellen für AFM und TEM-

Messungen

Kompetente E. coli DH5α-Zellen (Kapitel 2.8.2) wurden, wie in Kapitel 2.8.4

beschrieben, mit dem RF-Plasmid des Phagenstamms M13amp (Kapitel 2.1.1) trans-

fiziert und auf eine LB-Agarplatte mit Ampicillin (Kap. 2.6.1) und IPTG (1 mM End-

konzentration) ausplattiert. Die LB-Agarplatte wurde über Nacht bei 37°C inkubiert

und am Folgetag mit einer Einzelkolonie eine Vorkultur hergestellt (Kap. 2.8.1). Vor

der Messung der transfizierten E. coli-Zellkultur wurde der Überstand mit Hilfe des

Spot-Tests (Kap. 2.8.22 a)) auf die Präsenz von M13-Phagen hin untersucht und

dann wie in den Kapiteln 2.8.26 und 2.8.27 für die Untersuchungen aufbereitet.

Als Kontrollen wurden nicht infizierte E. coli DH5α-Zellen verwendet.

2.8.26 Präparation und Adsorption von E. coli-Zellen für AFM-Messungen

Für die Messungen von Bakterien am AFM wurde als Ausgangsmaterial eine

Bakterienflüssigkultur in LB-Medium verwendet (Kapitel 2.8.1). Die Zellen wurden bei

Abb. 2-1: Schematischer Aufbau des Zählfeldes bei einer Thoma-Zählkammer. Kleinquadrate sind in grau hervorgehoben.


84

37°C bis zu einer Zelldichte von 2 x 108 Bakterien/ml kultiviert. Aus dieser Kultur

erfolgte dann die Entnahme von 500 µl, die sodann in ein steriles 1,5 ml Reaktions-

gefäß überführt und vorsichtig zentrifugiert (7500 g, 3 min) wurden. Der Überstand

wurde verworfen. Daraufhin folgten drei Waschschritte in denen das Zellpellet

vorsichtig in sterilem ddH2O aufgenommen und abermals zentrifugiert wurde (7500 g,

3 min). Abschließend wurden die Zellen in 500 µl sterilem ddH2O aufgenommen.

Von den 500 µl der Zellsuspension wurden anschließend 10 µl auf die neu abge-

zogene Glimmeroberfläche (Muscovite Mica, V-1 Quality), welche zuvor mit 2-Kom-

ponentenklebstoff auf die Oberfläche eines AFM-Probenträgers befestigt wurde,

aufgebracht und adsorbiert (4°C, 15 min). Danach wurde die Restflüssigkeit mit einer

Pipette abgenommen, die AFM-Probenoberfläche 2-mal mit 15 µl ddH2O gewaschen

und 5 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet.

2.8.27 Präparation und Adsorption von E. coli-Zellen für TEM-Messungen

Die Präparation der Proben erfolgte wie unter Kapitel 2.8.26 beschrieben.

Von der gereinigten Zellsuspension wurden 10 µl auf ein zuvor plasmagereinigtes

(Benada & Pokorný, 1990) Kupfernetzchen (Athene 200) aufgebracht und für

5 Minuten bei Raumtemperatur adsorbiert. Die Flüssigkeit wurde anschließend mit

Hilfe eines Filterpapiers von der Oberfläche abgesaugt. Die Oberfläche wurde dann

durch 2-maliges eintauchen des Netzchens in 2 Tropfen ddH2O á 50 µl gewaschen,

die Restflüssigkeit mit Hilfe eines Filterpapiers von der Oberfläche des Netzchens

entfernt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet. Zur Negativkontras-

tierung der Proben wurden dann 5 µl einer 5 %igen Phosphorwolframsäure (pH 7)

auf die Netzchenoberfläche aufgebracht, nach 30 s mit Hilfe eines Filterpapiers von

der Oberfläche entfernt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet.

2.8.28 „Atomic Force Microscopy“ (AFM)

Alle Messungen wurden mit dem kommerziell erhältlichen Nanoscope IIIa von Digital

Instruments aufgenommen. Das Gerät war mit einem J-Scanner mit 150 µm Scan-

Weite ausgestattet. Die Messung der leicht feuchten biologischen Proben erfolgte im

Kontakt-Modus mit Hilfe einer goldbedampften Siliziumnitritmesssonde („Cantilever“),

die eine Federkonstante von k = 0,06 N/m (NP-S) besaß. Die Geschwindigkeit, mit

welcher die Probenoberfläche gerastert wurde, betrug 3,52 Hz und der Rasterwinkel

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pokorn%C3%BD%20V%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract


85

90° zur Achse der Messsonde. Die Auflagekraft der Messsonde während der

Probenmessungen betrug weniger als 1 nN. Alle AFM-Messdaten, welche als soge-

nannte „Deflection“-Bilder in dieser Arbeit gezeigt sind, wurden mit dem frei erhält-

lichen Programm WSxM v.4.0 Develop 12.4 der Firma Nanotec Electronica ver-

arbeitet.

2.8.29 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

Alle Messungen der hier gezeigten TEM-Aufnahmen erfolgten mit einem LEO 912AB

der Firma Zeiss GmbH mit Omega Filter für EFTEM und einer Punkt zu Punkt

Auflösung von 0,37 nm. Die Messungen wurden mit einer Beschleunigungs-

spannung von 80 kV betrieben; als Kathode wurde eine Lanthanhexaborid (LaB6) –

Kristallelektrode mit pyramidenförmiger Spitze als Elektronenquelle verwendet. Die

Bildaufnahme erfolgte durch eine 2k x 2k CCD-Kamera der Firma Olympus und die

Bildverarbeitung durch das Programm iTEM der Firma Olympus Soft Imaging

Solutions.

2.8.30 Immunogold-Markierung von M13-Phagen

Für die Markierung wurde die M13-Phagenstammlösung (Kap. 2.8.21) zu einer

Endkonzentration von 5 x 109 pfu/ml entsprechend mit Wasser verdünnt. Aus dieser

Verdünnung wurden 10 µl auf einem zuvor plasmagereinigten (Benada & Pokorný,

1990) Kupfernetzchen (Athene 200) aufgebracht und für 1 Minute bei Raum-

temperatur adsorbiert. Die Flüssigkeit wurde anschließend mit Hilfe eines Filter-

papiers von der Oberfläche abgesaugt. Die Oberfläche wurde dann durch 2-maliges

Eintauchen des Netzchens in 2 Tropfen ddH2O á 50 µl gewaschen, die Rest-

flüssigkeit mit Hilfe eines Filterpapiers von der Oberfläche des Netzchens entfernt

und für 5 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet. Zur Vermeidung unspezifischer

Bindungen des Erstantikörpers an das Trägermaterial des Kupfernetzchens sowie

den Phagen wurde die Probe mit 50 µl 1x TBS/0,1 % BSA (Kap. 2.7.8) für 10

Minuten inkubiert. Der überschüssige Puffer wurde anschließend mit Hilfe eines

Filterpapiers von der Oberfläche entfernt, direkt durch 20 µl Erstantikörperlösung

(1:5000 in 1x TBS) ersetzt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Anschließend erfolgte die Entfernung der Antikörperlösung wieder mit Filterpapier

und die Probe wurde mit 50 µl 1x TBS für 3 Minuten inkubiert. Nach Entfernen des

Puffers mit Filterpapier wurden 20 µl einer 1:20 Verdünnung in 1x TBS des Protein-A

konjugierten Goldes (Protein-A – 20 nm kolloidales Gold, Sigma Aldrich) auf die



86

Netzchenoberfläche aufgebracht und für weitere 30 Minuten inkubiert. Abschließend

wurde die Probe 1-mal mit 50 µl 1x TBS/0,1% BSA für 3 Minuten und 2-mal mit 50 µl

ddH2O für 2 s gewaschen. Überschüssiges Wasser wurde mit Hilfe von Filterpapier

entfernt und das Netzchen bei Raumtemperatur getrocknet.

Für die Messungen am TEM wurde die Probe, wie in Kapitel 2.8.27 beschrieben,

negativ kontrastiert.

Als Kontrolle wurde eine Probe nicht mit Primärantikörpern vorbehandelt.

2.8.31 Immunogold-Markierung infizierter/uninfizierter E. coli DH5α-Zellen

Für die Markierung wurden transfizierte E. coli DH5α-Zellen wie in Kapitel 2.8.25

hergestellt und wie in Kapitel 2.8.25 präpariert. Im Unterschied dazu wurden die

transfizierten Zellen nach dem letzten Waschschritt in 500 µl 1x TBS/0,1 % BSA

(Kap. 2.7.8) aufgenommen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Anschließend wurden die Zellen zentrifugiert (7500 g, 3 min) und in 50 µl Primär-

antikörperlösung (1:5000 in 1x TBS) aufgenommen und 30 Minuten auf einem

Drehrad bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden daraufhin 2-mal mit 500 µl

1x TBS gewaschen und zentrifugiert (7500 g, 3 min). Nach dem letzten Waschschritt

erfolgte dann die Aufnahme der Zellen in 50 µl Protein-A konjugierter Goldlösung,

welche zuvor 1:20 in 1x TBS verdünnt wurde. Die Probe wurde für weitere 30

Minuten bei Raumtemperatur auf einem Drehrad inkubiert. Abschließend wurden die

Zellen 2-mal mit 500 µl ddH2O gewaschen und zentrifugiert (7500 g, 3 min) und dann

in 100 µl ddH2O aufgenommen.

Für die Messungen am TEM wurde die Probe, wie in Kapitel 2.8.27 beschrieben,

präpariert.

Als Kontrolle wurde eine Probe nicht infizierter E. coli DH5α dieser Prozedur unter-

zogen.

2.8.32 Expression des gp1/11-Assembly-Komplexes

Expression in E. coli C41

Für die Expression und Reinigung der gp1/11-Assembly-Komplexe wurde das

Plasmid pETg1/11 (Kap. 2.8.17), wie in Kapitel 2.8.3 beschrieben, in E. coli C41

transformiert und eine Vorkultur hergestellt (Kap. 2.8.1.). Die Vorkultur wurde

anschließend dazu verwendet, um Hauptkulturen (2 ml, 2 L, 4 L) im Verhältnis 1:100

beimpfen zu können. Die Hauptkulturen wurden bei 37°C bis zu einer optischen

Dichte (OD600) von 0,5 kultiviert. Die Expression des plasmidkodierten gp1/11 wurde


87

dann durch die Zugabe von IPTG (1 mM Endkonzentration) induziert. Nach

2,5 h wurden die Großkulturen zentrifugiert (7500 g, 4°C, 10 min) und in 2 ml pro

Gramm Zellpellet Tris/Sucrose Puffer (2.7.13) aufgenommen. Die 2 ml Kleinkulturen

wurden 3 Minuten bei 16 000 g zentrifugiert und TCA gefällt (Kap. 2.8.23).

Expression in E. coli K37

Für die Expression und Reinigung der gp1/11-Assembly-Komplexe wurde das

Plasmid pMSg1/11 (Kap. 2.8.17), wie in Kapitel 2.8.3 beschrieben, in E. coli K37

transformiert und eine Vorkultur hergestellt (Kap. 2.8.1). Die Vorkultur wurde

anschließend dazu verwendet, um die Hauptkultur (4 L) im Verhältnis 1:100 beimpfen

zu können. Die Hauptkultur wurde bei 37°C bis zu einer optischen Dichte (OD600) von

0,5 kultiviert. Die Expression des plasmidkodierten gp1/11 wurde dann durch die

Zugabe von IPTG (1 mM Endkonzentration) induziert und die Zellkultur mit einer

M.O.I. von 5 mit M13mp19-Phagen infiziert. Nach 2,5 h wurden die Großkulturen

zentrifugiert (7500 g, 4°C, 10 min) und in 2 ml pro Gramm Zellpellet Tris/Sucrose

Puffer (Kap. 2.7.13) aufgenommen.

2.8.33 Proteinreinigung mittels Metallaffinitätschromatographie (IMAC)

Die Reinigung des gp1/11-Assembly-Komplexes mittels IMAC erfolgte aus nicht

infizierten E. coli C41 und infizierten E. coli K37 (Kap. 2.8.32). Um die in der inneren

Membran von E. coli lokalisierten gp1/11-Assembly-Komplexe reinigen zu können,

wurden die in Tris/Sucrose Puffer (Kap. 2.7.13) aufgenommen Zellen mit PMSF

(2,5 mM Endkonzentration), MgCl2 (15 mM Endkonzentration) und DNAse II (8 µg

Endkonzentration) versetzt und im „French Press“-Verfahren (Milner et al., 1950) bei

8000 Psi aufgeschlossen. Die Suspension wurde bei 4000 g für 10 Minuten bei 4°C

zentrifugiert und das Pellet verworfen. Zur Pelletierung der inneren Zellmembranen

im resultierenden Überstand erfolgte eine Zentrifugation bei 177 614 g für 60 Minuten

bei 4°C, der Überstand wurde anschließend verworfen, das Pellet in 20 ml eiskaltem

Solubilisierungspuffer (Kap. 2.7.13) aufgenommen und mittels Dounce Homogeni-

sators homogenisiert. Die Solubilisierung der Membranen erfolgte für 2 h unter

Rühren bei 4°C. Zur Abtrennung nicht solubilisierbarer Bestandteile wurde die

Suspension nochmals bei 177 614 g für 60 Minuten bei 4°C zentrifugiert und der

Überstand in ein steriles 50 ml Reaktionsgefäß überführt. Zu dieser Lösung wurde

1 ml Ni-NTA-Agarose zugegeben, welche zuvor 3-mal mit 15 ml ddH2O gewaschen

und anschließend 15 Minuten mit 10 ml Äquilibrierungspuffer (Kap 2.7.13) inkubiert


88

wurde. Nach Zugabe der Ni-NTA-Agarose zur solubilisierten Fraktion folgte eine

Inkubationsphase für 2 h unter Rotation bei 4°C. Die darauf folgenden Prozeduren

wurden bei 4°C durchgeführt. Nach der Inkubationsphase wurde die Suspension in

eine Minisäule (BD PlastipakTM, 5 ml, Becton Dickinson) überführt und die Ni-NTA-

Agarose im „Gravity flow“-Verfahren einmal mit 10 ml Säulenwaschpuffer 1 (Kap.

2.7.13) und ein weiteres Mal mit 10 ml Säulenwaschpuffer 2 (Kap. 2.7.13) gereinigt.

Abschließend wurde die Ni-NTA-Agarose zur Entfernung der gebundenen Proteine

mit 1,5 ml Elutionspuffer (Kap. 2.7.13) für 1 h bei 4°C inkubiert und dann die

Elutionsfraktion bei 1500 g (2 min) in ein steriles 15 ml Reaktionsgefäß überführt. Zur

Aufbewahrung der eluierten Proteine wurden diese in flüssigem Stickstoff tiefgefroren

und bei -80°C gelagert.

2.8.34 Präparative Gelfiltration

Kalibrierung des Trennsystems

Durch die präparative Gelfiltration werden Proteine aufgrund ihrer hydrodynamischen

Eigenschaften über eine Säulenmatrix getrennt. Für die Auftrennung des Protein-

gemisches in der Elutionsfraktion aus der Metallaffinitätschromatographie in Kapitel

2.8.33 wurde als Säulenmatrix SuperdexTM 200 mit einem Trennbereich von 10 – 600

kDa in einer XK 16/40 Säule (Amersham, GE Healthcare) gewählt. Um das Trenn-

verhalten der Säule zu bestimmen und den daraus erhaltenen Fraktionsvolumina

entsprechende Molekulargewichte zuordnen zu können, wurde eine Kalibrierung der

Säule mit Hilfe von 2 ml des Proteinstandards aus Kapitel 2.7.10 durchgeführt,

welcher Proteine mit bekannten molekularen Massen enthielt. Die Kalibrierung

erfolgte mit Hilfe des Äkta Basic Chromatographie Systems (Amersham Biosciences)

mit einer konstanten Flussrate von 0,5 ml/min. Die eluierten Proteine wurden in

Fraktionen zu je 2 ml gesammelt. Die molekularen Massen der eluierten Standard-

proteine wurden logarithmisch gegen das Elutionsvolumen (Ve) aufgetragen (Tabelle

2-4) und hieraus eine Standardkurve für die XK 16/40-Säule mit SuperdexTM 200

Säulenmatrix ermittelt (Abb. 2-2). Durch den Vergleich dieser Werte mit dem

Elutionsverhalten der Proteine aus der Elutionsfraktion der Metallaffinitätschromato-

graphie (Kap. 2.8.33) wurden deren Massen ermittelt.


89

Tabelle 2-4: Proteine des Standardgemisches mit den zugehörigen Massen in kDa und

Elutionsvolumina (Ve) zur Kalibrierung des Trennverhaltens der XK 16/40 Säule mit SuperdexTM

200 Säulenmatrix.

Protein Ve Masse

Apoferritin 20,4 ml 440 kDa

beta-Amylase 24,2 ml 200 kDa

BSA Dimer 27,7 ml 132 kDa

BSA Monomer 31,5 ml 66,5 kDa

Carboanhydrase 38,9 ml 30 kDa

Abb. 2-2: Ermittelte Standardkurve der durch Gelfiltration getrennten Standardproteine. Die

molekularen Massen der eluierten Standardproteine wurden logarithmisch gegen das Elutions-

volumen (Ve) aufgetragen.

Gelfiltration der Elutionsfraktionen aus der Metallaffinitätschromatographie

Die Auftrennung des Elutionsgemisches aus Kapitel 2.8.33 erfolgte durch das Äkta

Basic Chromatographie System (Amersham Biosciences) mit einer XK 16/40-Säule

und SuperdexTM 200 als Säulenmatrix. Für die Prozedur wurde der Puffer aus Kapitel

2.7.12 verwendet. Die Gelfiltration wurde mit einer konstanten Durchflussrate von

0,5 ml/min durchgeführt und die eluierten Fraktionen zu je 2 ml gesammelt. Zur

Identifikation der Proteine in den jeweiligen Elutionsfraktionen wurden aus diesen

150 µl Proben entnommen und mit TCA gefällt (Kap. 2.8.23). Anschließend erfolgte

die Auftrennung der Proben über ein 12 %iges SDS-Gel (Kap. 2.8.35). Das Protein-

bandenmuster wurde, wie in Kapitel 2.8.36 beschrieben, mit Coomassie sichtbar

20 40 60 80 10010

100

1000

BSA Monomer 66,5 kDa

BSA Dimer 132 kDa

Carboanhydrase 30 kDa

Apoferritin 440 kDa

beta-Amylase 200 kDa

Masse [

kD

a]

Ve [ml]


90

gemacht. Die Zuordnung der in den Elutionsfraktionen vorherrschenden Massen

erfolgte anhand der für die Säule XK 16/40 ermittelten Standardkurve und der

Elutionsvolumina (Ve) der einzelnen Fraktionen.

2.8.35 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Zur Auftrennung des kleinen Hüllproteins gp9 des Bakteriophagen M13 wurden

sowohl SDS-Polyacrylamid-Gele mit Harnstoff (22 %) nach Laemmli (1970) als auch

SDS-Tricin-Gele (16,5 %) nach Schägger und Jagow (1987) verwendet. Die Auf-

trennung der gp1/11-Assembly-Komplexe erfolgte durch 12 % SDS- Polyacrylamid-

Gele ohne Harnstoffanteile.

Probenvorbereitung

Nach TCA-Fällung der Proben (Kap. 2.8.23) wurden diese in SDS-Probenpuffer

(Kap. 2.7.14) aufgenommen, 5 Minuten bei 95°C inkubiert und anschließend in die

vorgesehenen Probentaschen der SDS-Gele pipettiert.

SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese ohne Harnstoff (12 %)

Für das Trenngel wurden die Substanzen aus Kapitel 2.7.14.1 gelöst, entgast und

mit SDS, APS und TEMED versetzt, zwischen zwei Gelplatten gegossen und mit

Isopropanol überschichtet. Nach der Polymerisation des Trenngels wurde das

Isopropanol mit dH2O entfernt, die Lösung für das Sammelgel aus Kapitel 2.7.14.1

gelöst, auf das Trenngel gegossen und der Kamm für die Probentaschen

eingesteckt. Nach 15-minütiger Polymerisation wurde der Kamm entfernt, die

Taschen mit dH2O gespült und das Gel in die dafür vorgesehene Apparatur installiert

(Laufzeit bei 25 mA ~ 3-4 h).

SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit Harnstoff (22 %)

Für das Trenngel wurden die Substanzen aus Kapitel 2.7.14.1 gelöst, entgast und

mit SDS, APS und TEMED versetzt, zwischen zwei Gelplatten gegossen und mit

Isopropanol überschichtet. Nach der Polymerisation des Trenngels wurde das

Isopropanol mit dH2O entfernt, die Lösung für das Sammelgel aus Kapitel 2.7.14.1

gelöst, auf das Trenngel gegossen und der Kamm für die Probentaschen

eingesteckt. Nach 15-minütiger Polymerisation wurde der Kamm entfernt, die


(Laufzeit bei 25 mA ~ 5,5-6,5 h).


91

SDS Tricin-Gelelektrophorese (16,5 %)

Für das Trenngel wurden die Substanzen aus Kapitel 2.7.14.2 gelöst, mit APS und

TEMED versetzt, zwischen zwei Gelplatten gegossen und mit Isopropanol über-

schichtet. Nach der Polymerisation des Trenngels wurde das Isopropanol mit dH2O

entfernt, die Lösung für das Spacer-Gel aus Kapitel 2.7.14.2 gelöst, auf das Trenngel

gegossen und mit Isopropanol überschichtet. Nach der Polymerisation des Spacer-

Gels wurde das Isopropanol mit dH2O entfernt, die Lösung für das Sammelgel aus

Kapitel 2.7.14.2 gelöst, auf das Spacer-Gel gegossen und der Kamm für die Proben-

taschen eingesteckt. Nach der Polymerisation wurde der Kamm entfernt, die


(Laufzeit bei 25 mA ~ 6,5-7,5 h).

2.8.36 Coomassiefärbung von SDS-Proteingelen

Die Visualisierung der durch SDS-PAGE aufgetrennten Proteinbandenmuster

erfolgte mit Hilfe der Färbe- und Entfärbelösung aus Kapitel 2.7.2. Nach Beendigung

der SDS-PAGE wurde das Gel aus der Apparatur entfernt, in eine Schale mit Färbe-

lösung gelegt und 2 x 3 Minuten in der Mikrowelle bei 600 Watt gefärbt. Zur

Entfärbung wurde das Gel 3 x 5 Minuten in der Mikrowelle bei 600 W in Entfärbe-

lösung erhitzt.

2.8.37 Western-Blot (semi-dry) und Membranbehandlung

Durch SDS-PAGE aufgetrennte Proteine können mit dem Western-Blot Verfahren

durch elektrischen Strom auf eine proteinbindende Membran übertragen und

anschließend mit geeigneten Antikörpern nachgewiesen werden. Für die Durch-

führung eines semi-dry Western-Blots wurden auf die Kathodenseite zuerst zwei mit

1x Transferpuffer getränkte Filterpapiere gelegt. Auf die Filter wurden blasenfrei das

SDS-Gel, die Nitrocellulose Transfermembran und noch 2 mit Transferpuffer

getränkte Filterpapiere gelegt. Auf diese Schichtung wurde der Deckel mit der Anode

aufgesetzt, verschraubt und die Elektroden angeschlossen. Die Stromdichte beim

semi-dry Western-Blot betrug 1,0-1,5 mA pro cm2 Gelfläche. Bei einem Minigel

entspricht das einer Stromstärke von 50 mA, bei einem Maxigel (10 cm x 18 cm)

einer Stromstärke von 250 mA. Der Blot war nach 75 Minuten beendet.


92

Immundetektion der Proteine und ECL

Proteine, welche durch das Western-Blot Verfahren auf eine proteinbindende

Membran übertragen wurden, können durch spezifische Antikörper detektiert und

anschließend durch ECL (Enhanced Chemoluminescence) nachgewiesen werden.

Nach dem Transfer wurde die Nitrocellulose Membran für 2 Minuten in eine 0,2 %ige

Ponceau-S-Lösung gegeben, um die Proteine zu fixieren. Die Membran wurde unter

fließendem Wasser entfärbt und über Nacht in 1x TBS/5 % Magermilchpulver bei 4°C

geschüttelt. Am Folgetag wurde die Membran 3-mal 5 Minuten mit 1x TBS ge-

waschen. Danach erfolgte die Zugabe des 1. Antikörpers (Kap. 2.1.5) auf die

Membran und die Inkubation (2 h) bei 4°C unter Schütteln. Die Membran wurde dann

2-mal 5 Minuten mit 1x TBS gewaschen und anschließend mit dem 2. Antikörper

(Kap. 2.1.5) inkubiert (90 min) und 3-mal 5 Minuten mit 1x TBS gewaschen.

Das Proteinbandenmuster wurde dann mit dem ECL Immobilon Western Detection

Reagents (Millipore) nach Anleitung auf einen Röntgenfilm übertragen.

2.8.38 Dot-Blot Analyse und Membranbehandlung

Die Detektion der plasmidkodierten gp9-Konstrukte am Phagen erfolgte mit Hilfe von

Dot-Blot Analysen. Hierfür wurden zuvor die plasmidkodierten gp9-Konstrukte in

E. coli K38-Zellen transformiert (Kap. 2.8.3). Von den Konstrukten wurde je eine

Einzelkolonie für die Herstellung von Vorkulturen verwendet (Kap. 2.8.1). Die

Vorkulturen dienten anschließend zur Beimpfung von 50 ml LB-Batchkulturen

(1:100). Nach Beimpfung der Batch-Kulturen erfolgte die Zugabe von IPTG (1 mM

Endkonzentration) und die Inkubation für 15 Minuten bei 37°C unter Schütteln.

Hierauf wurden die Batch-Kulturen jeweils mit dem Phagenstamm M13am9-M7 bei

Raumtemperatur für 5 Minuten ohne Schütteln infiziert (M.O.I. 5). Anschließend

erfolgte die Kultivierung der infizierten Kulturen über Nacht bei 37°C unter Schütteln.

Am Folgetag wurden aus den 50 ml Batch-Kulturen, wie in Kapitel 2.8.21 b)

beschrieben, Phagenstammlösungen hergestellt und anschließend deren Phagen-

titer bestimmt (Kap. 2.8.22).

Als Kontrollen bei den Dot-Blot Analysen dienten die induzierten, jedoch nicht infi-

zierten, Übernacht-Batch-Kultur Varianten der hier transformierten Zellen. Diese

Kulturen wurden ebenfalls, wie in Kapitel 2.8.21 b) und 2.8.22 beschrieben, präzi-

pitiert und anschließend deren Phagentiter bestimmt.


93

Von den hergestellten Phagenstammlösungen wurden Verdünnungsreihen so ange-

fertigt, dass in diesen nahezu gleiche Mengen an Phagen pro 400 µl vorlagen

(106 pfu bis 108 pfu). Die Kontrollen wurden entsprechend den Verdünnungsstufen

der Phagenstammlösungen verdünnt (10-1 bis 10-3).

In die Dot-Blot Apparatur (MiniFold®) wurden zwei Filterpapiere (1 mm, Whatmann)

und auf diese eine Nitrocellulose Transfermembran (PROTRAN®), die zuvor

zusammen 5 Minuten in 1x Transferpuffer (Kap. 2.7.16) inkubiert wurden, aufgelegt

und eingespannt. Die Apparatur wurde mit einer Vakuumpumpe verbunden und unter

Vakuum gesetzt, woraufhin aus den zuvor hergestellten Verdünnungsstufen jeweils

400 µl der Phagenlösungen mit Hilfe der Dot-Blot Apparatur auf die Nitrocellulose

Transfermembran aufgebracht wurden.

Immundetektion der gp9-Konstrukte und ECL

Nach dem Transfer der Phagen wurde die Membran für 2 Minuten in eine 0,2 %ige

Ponceau-S-Lösung gegeben, um die Phagen zu fixieren. Die Membran wurde unter

fließendem Wasser entfärbt und über Nacht in 1x TBS/5 % Magermilchpulver bei

4°C geschüttelt. Am Folgetag wurde die Membran 3-mal 5 Minuten mit 1x TBS

gewaschen. Danach erfolgte die Zugabe des 1. Antikörpers (Kap. 2.1.5) auf die

Membran und die Inkubation (2 h) bei 4°C unter Schütteln. Die Membran wurde dann

2-mal 5 Minuten mit 1x TBS gewaschen und anschließend mit dem 2. Antikörper

(Kap. 2.1.5) inkubiert (90 min) und 3-mal 5 Minuten mit 1x TBS gewaschen.

Die Signale wurden dann mit dem ECL Immobilon Western Detection Reagents

(Millipore) nach Anleitung auf einen Röntgenfilm übertragen.

2.8.39 Pulse-labelling-Experimente, Immunpräzipitation und Protease-Mapping

„Pulse-labelling“-Experimente

Für „Pulse-labelling“-Experimente wurden die entsprechenden Plasmide mit den zu

untersuchenden gp9-Konstrukten in E. coli K38 transformiert (Kap. 2.8.3) und

daraufhin Vorkulturen hergestellt (Kap. 2.8.1). Mit den Vorkulturen wurden jeweils

2 ml „Pulse“-Medium (Kap. 2.6.2) 1:10 beimpft und bei 37°C geschüttelt. Ab einer

Zellzahl von 2 x 108 Zellen/ml wurden die Zellen zentrifugiert (16 000 g, 2 min), in

500 µl neuem „Pulse“-Medium aufgenommen und mit IPTG (1 mM Endkonzentration)

induziert. Nach 10 Minuten wurden die gebildeten Proteine durch Zugabe von 20 µCi

[35S]-Methionin radioaktiv markiert und nach weiteren 10 Minuten die Proben mit TCA

präzipitiert, anschließend mit Aceton gereinigt und abschließend getrocknet (Kap.


94

2.8.23). Die resultierenden Präzipitate wurden in 50 µl Tris/SDS-Puffer (10 mM

Tris/HCl pH 8.0, 2 % SDS) aufgenommen, 5 Minuten bei 95°C im Thermoblock

erhitzt und immunpräzipitiert.

Immunpräzipitation

Für eine Immunpräzipitation wurden zu den Proben 1 ml TENTX–Puffer (Kap. 2.7.11)

und 15 µl Protein-A Substrat (ZysorbinTM) zugegeben, für 30 Minuten bei 4°C auf

einem Drehrad inkubiert und anschließend bei 16 000 g für 15 Minuten zentrifugiert.

Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt, mit 1-8 µl Primär-

antikörper versetzt (Kap. 2.1.5) und über Nacht bei 4°C auf dem Drehrad inkubiert.

Dann erfolgte die Zugabe von 20 µl der Protein-A Suspension zu den Proben sowie

eine weitere Inkubation für eine Stunde auf dem Drehrad mit anschließender

Zentrifugation (14 000 g, 4°C, 30 sec) der Proben. Das Pellet wurde zweimal mit

1 ml TENTX und einmal mit 1 ml TEN-Puffer (Kap. 2.7.11) gewaschen, in 20 µl SDS-

Probenpuffer (Kap. 2.7.14) aufgenommen, 5 Minuten bei 95°C inkubiert und

gelelektrophoretisch (22 % SDS-Gel mit Harnstoff Kap. 2.7.14.1; 16,5 % SDS-Tricin

Gel Kap. 2.7.14.2) analysiert. Nach der gelelektrophoretischen Auftrennung (Kap.

2.8.35) wurden die Proteine durch eine 10-minütige Inkubation des Gels in

Fixierlösung (Kap. 2.7.11) fixiert und anschließend mit Hilfe einer Geltrocknungs-

apparatur (80°C, 4 h) auf 1 mm Filterpapier (Whatman®) aufgebracht.

Protease-Mapping

Für das Protease-Mapping der zu analysierenden gp9-Konstrukte wurden die Zellen

wie im vorherigen Abschnitt kultiviert und die nach Induktion gebildeten Proteine für

10 Minuten mit [35S]-Methionin radioaktiv markiert. Nach dem 10-minütigen „Pulse-

labelling“ wurden die Proben zentrifugiert (12 000 g, 4°C, 3 min), der radioaktive

Überstand verworfen, die Zellen in 500 µl eiskaltem Spheroplastenpuffer (Kap.

2.7.11) resuspendiert, 5 µl EDTA (0,1 M Stammlösung), 5 µl Lysozym (0,5 mg/ml

Stammlösung) zugegeben und für 15 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellsuspensionen

wurden anschließend in je 3 Ansätze (1x 100 µl, 2 x 200 µl) aliquotiert. Ein 200 µl

Aliquot wurde unmittelbar mit TCA präzipitiert (Kap. 2.8.23), zu dem zweiten 200 µl

Aliquot wurden 7,5 µl Proteinase K (20 mg/ml Stammlösung), zu dem dritten Aliquot

mit 100 µl sowohl 7,5 µl Proteinase K als auch 30 µl Triton X-100 (10 % Stamm-

lösung) zugegeben und für 1 h auf Eis inkubiert. Nach der Inkubation wurde der

Proteaseverdau durch die Präzipitation der Proben mit TCA (Kap. 2.8.23) gestoppt.


95

Die Proben wurden anschließend, wie im obigen Abschnitt beschrieben, immun-

präzipitiert unter der Verwendung von anti-OmpA, anti-GroEL, anti-HA, anti-T7 und

anti-M13 Coat Seren.

2.8.40 In vivo Versuch zur YidC-abhängigen Membraninsertion von gp9T7

Zur Untersuchung der YidC-abhängigen Membraninsertion des gp9T7-Konstruktes

wurde das Plasmid pMSgp9T7SD (Kap. 2.1.2) in E. coli JS7131 (Kap. 2.1.1)

transformiert (Kap. 2.8.3) und eine Vorkultur hergestellt (Kap. 2.8.1). Die Vorkultur

diente zur Beimpfung (1:100) von zwei 2 ml LB-Medien mit Arabinose (0,2 %

Endkonzentration). Die Kulturen wurden bei 37°C bis zu einer Zellzahl von 1x 108

Zellen/ml geschüttelt, dann dreimal mit 1x M9-Minimalmedium gewaschen und

zentrifugiert (12 000 g, 3 min). Daraufhin wurden die Zellen einmal in 2 ml „Pulse“-

Medium (Kap. 2.6.2) mit Arabinose (0,2 % Endkonzentration) sowie ein weiteres Mal

in 2 ml „Pulse“-Medium mit Glukose (0,2 % Endkonzentration) aufgenommen und für

weitere 2 h bei 37°C geschüttelt.

Zum Nachweis der YidC Depletion wurden sowohl aus der Arabinose- als auch aus

der Glukose-Kultur Proben von 100 µl entnommen, TCA präzipitiert (Kap. 2.8.23) und

über eine 12 %ige SDS-PAGE (Kap. 2.8.35) mit anschließendem Western-Blot (Kap.

2.8.37) unter Verwendung eines anti-YidC Serums (Kap. 2.1.5) analysiert.

Zur Analyse der YidC-abhängigen Membraninsertion von gp9T7 wurden die Kulturen,

wie in Kapitel 2.8.39 für das „Pulse-labelling“ beschrieben, induziert, radioaktiv

behandelt und anschließend ein Protease-Mapping durchgeführt. Daraufhin folgte die

Immunpräzipitation der Proben unter der Verwendung der anti-OmpA, anti-GroEL

und anti-T7 Seren. Die Proben wurden anschließend gelelektrophoretisch über ein

16,5 % SDS-Tricin-Gel (Kap. 2.7.14.2) analysiert. Nach der gelelektrophoretischen

Auftrennung (Kap. 2.8.35) wurden die Proteine durch eine 10-minütige Inkubation

des Gels in Fixierlösung (Kap. 2.7.11) fixiert und anschließend mit Hilfe einer

Geltrocknungsapparatur (80°C, 4 h) auf 1 mm Filterpapier (Whatman®) aufgebracht.

2.8.41 Quantifizierung radioaktiv markierter Proteine („Phosphorimaging“)

Die Quantifizierung des Bandenmusters der radioaktiv markierten und über SDS-

PAGE aufgetrennten Proteine als Autoradiogram wurde nach Trocknung der Gele mit

der Software AIDA, Raytest, Fuji-Film (Straubenhardt, D) durchgeführt. Die Auto-

radiographie erfolgte für mindestens 5 Tage.


96

2.8.42 Präparation FPLC gereinigter gp1/11-Assembly-Komplexe für TEM-Auf-

nahmen

Aus der Elutionsfraktion, über FPLC gereinigter Assembly-Komplexe, wurden 10 µl

entnommen, auf ein Kupfernetzchen (Athene 200) aufgebracht und für 2 Minuten bei

Raumtemperatur adsorbiert. Überschüssige Flüssigkeit wurde mit Hilfe eines Filter-

papiers von der Oberfläche entfernt und danach das Kupfernetzchen 5 Minuten bei

Raumtemperatur getrocknet. Zur Negativkontrastierung der Proben wurden dann 5 µl

einer 5 %igen Phosphorwolfransäure (pH 7) auf die Netzchenoberfläche aufgebracht,

diese nach 30 Sekunden mit Hilfe eines Filterpapiers von der Oberfläche entfernt und

das Kupfernetzchen für 10 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet.

Ergebnisse

97

3 Ergebnisse

Der filamentöse Coliphage M13 ist einer der bestuntersuchten Objekte in der Mikro- und

Molekularbiologie. Jedoch sind trotz aller bisher durchgeführten Untersuchungen noch

einige grundlegende Aspekte der Biogenese des Phagen ungeklärt. Um die Biogenese

und die Phagenassemblierung des filamentösen Coliphagen M13 besser verstehen zu

können, wurden folgende Versuche durchgeführt:

Abschnitt 1:

Quantifizierung der M13-Phagenextrusion aus infizierten Escherichia coli-Zellen: Die

Quantifizierung erfolgte anhand eines detaillierten „one-step growth“ Experiments einer

wildtypisch verlaufenden Infektion (Kap. 3.1.1). Neben der wildtypischen Infektion wurde

ein induzierbares Phagenextrusionssystem für eine weitere Quantifizierung verwendet

(Kap. 3.1.2), bei dem das Haupthüllprotein gp8 durch ein induzierbares Plasmid in trans

bereitgestellt wird (Kuhn und Wickner, 1985). Außerdem wurden Adsorptions-

experimente von M13mp19-Phagen an F-Pili von E. coli K38-Zellen durchgeführt, um

die Bindungseffizienz des Phagen bei verschieden hohen Werten der „Multiplicity of

infection“ (M.O.I.) zu erörtern (Kap. 3.1.3).

Abschnitt 2:

Visualisierung M13-infizierter Escherichia coli-Zellen: Die Visualisierung erfolgte mit

Hilfe des Transmissionselektronenmikroskops (TEM) und des „Atomic Force Micros-

cope“ (AFM) (Kap. 3.2). Hierzu wurden die aus Versuchsabschnitt 1 erhaltenen Infor-

mationen herangezogen, um den Extrusionsverlauf von M13-Phagen direkt auf der

Zelloberfläche von E. coli, in Abhängigkeit von der Zeit nach erfolgter Infektion, mit dem

AFM messen zu können (Kap. 3.2.4).

Abschnitt 3:

Funktionelle Präsentation und Detektion von Fremdpeptiden am „Minor Coat“ Protein

gp9: Ein „Phage-Display“ am N-Terminus des „Minor Coat“ Proteins gp9 wurde dazu

verwendet, um eine Abhängigkeitsuntersuchung der gp9-Translokation von der E. coli

Membraninsertase YidC (Kap. 3.3.1 - 3.3.6) durchführen zu können.

Abschnitt 4:

Überexpression der Phagenproteine gp1/11 in Escherichia coli-Zellen: Die Proteine gp1

und gp11 bilden zusammen durch intermolekulare Wechselwirkungen in der Zyto-

Ergebnisse

98

plasmamembran von E. coli einen Komplex, über den die M13-Phagen in die äußere

Umgebung sekretiert werden. Von gereinigten gp1/11-Assembly-Komplexen wurde die

Masse ermittelt und TEM-Aufnahmen angefertigt (Kap. 3.4).

Abschnitt 1:

3.1 Quantifizierung der M13-Phagenextrusion

Damit neue Daten über den M13-Infektionsverlauf erhalten werden konnten, wurde in

diesem Abschnitt die Infektion des Wirtsbakteriums Escherichia coli K38 mit M13-

Phagen anhand von Adsorptionsexperimenten untersucht und anschließend die

Sekretion neuer M13-Phagen-Nachkommen mit Hilfe von „one-step growth“ Experi-

menten analysiert.

3.1.1 Quantifizierung der wildtypischen M13-Phagenextrusion

Für die Quantifizierung der M13-Phagenextrusion wurde ein „one-step growth“

Experiment mit M13-infizierten E. coli-Zellen durchgeführt (Kap. 2.8.18). Für diesen

Versuch kam der Bakterienstamm E. coli K38 zur Verwendung. In diesem können sich

M13 Wildtyp-Phagen normal vermehren, während er für Phagen mit Ambermutation

einen Suppressor-Stamm darstellt. Hierdurch sollte die Quantifizierung der induzierten

Sekretion anhand von M13mp19am8 in Kapitel 3.1.2 mit der wildtypischen vergleichbar

sein. Um die Phagenextrusion quantifizieren zu können, wurde eine Batch-Kultur

exponentiell wachsender E. coli K38-Zellen bei 37°C bis zu einer Zelldichte von

2 x 108 Bakterien/ml geschüttelt, anschließend in einem Eiswasserbad abgekühlt und

daraufhin mit M13mp19-Phagen mit einer M.O.I. von 100 infiziert. Die Adsorption der

Phagen an die F-Pili der E. coli-Zellen erfolgte für 5 Minuten im Eiswasserbad, wodurch

die Aufnahme der Phagen-DNA in das Wirtsbakterium durch Herabsetzung des

bakteriellen Stoffwechsels verhindert wurde. Ungebundene Phagen konnten durch

behutsames Zentrifugieren bei 7500 g, um das Abscheren der Pili zu verhindern, von

den infizierten Bakterien abgetrennt werden. Der phagenhaltige Überstand wurde

verworfen und das Zellpellet in neuem vorgewärmten LB-Flüssigmedium aufge-

nommen. Anschließend erfolgte eine erneute Inkubation der Zellen bei 37°C, um die

Aufnahme der Phagen-DNA in die E. coli-Zellen zu ermöglichen. Dies stellt den Zeit-

punkt t = 0 min in Abbildung 3-1 dar. Zu definierten Zeitpunkten wurden Proben

entnommen, zentrifugiert und mit Hilfe des phagenhaltigen Kulturüberstands die Verän-

derung des Phagentiters durch „Plaque-Assay“ (Kap. 2.8.22 b)) und die Veränderung

Ergebnisse

99

des Bakterientiters durch Zählung der Zellen aus der Flüssigkultur am Lichtmikroskop

(Kap. 2.8.24) bestimmt. Die Veränderungen von Phagen- und Bakterientiter während

des Infektionsverlaufs sind in Tabelle 3-1 aufgeführt und in Abbildung 3-1 als „one-step

growth“ Kurve grafisch dargestellt.

Aus Tabelle 3-1 und Abbildug 3-1 (-□-) ist zu entnehmen, dass es innerhalb der

5-minütigen Adsorptionsphase (-10 min bis -5 min) zu einer Verringerung des Phagen-

titers kam. Während dieser Zeit nahm der Titer von 1,8 x 1010 pfu/ml auf 1,66 x 1010

pfu/ml ab. Die hieraus resultierende Differenz von 1,4 x 109 pfu/ml hatte im Verlauf

dieser 5-minütigen Infektion an die Bakterien adsorbiert. Mit einem Bakterientiter von

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

1E8

1E9

1E10

1E11

Adsorption bei 4°C

Eklipse

Phagen

Bakterien

Ph

ag

en

tite

r in

p

fu/m

l

Ba

kte

rie

nti

ter

in

B

ak

teri

en

/ml

Zeit in min

Abb. 3-1: „One-step growth“ Kurve der wildtypisch verlaufenden M13-Phageninfektion von M13mp19 in einer E. coli K38 Batch-Kultur und die Veränderung des Bakterientiters während des Experiments. Die exponentiell wachsende E. coli K38 Batch-Kultur wurde bei einer Zelldichte von 2 x 10

8 Bakterien/ml im Eiswasserbad infiziert. Der Phagentiter nahm im Verlauf der 5-minütigen

Adsorption (-10 bis -5 min) von 1,8 x 1010

pfu/ml auf 1,66 x 1010

pfu/ml (-□-) ab, was einer Gesamtadsorption von 1,4 x 10

9 Phagen/ml entsprach. Somit haben im Durchschnitt an jede Zelle dieser

Batch-Kultur 6 - 7 Phagen gebunden. Nach der Adsorptionsphase erfolgte die Zentrifugation der Batch-Kultur, um ungebundene Phagen von den infizierten Zellen abzutrennen, wodurch sich der Phagentiter zwischen t = -5 min bis t = 0 min um zwei Zehnerpotenzen verringerte. Die infizierten Zellen wurden nach der Zentrifugation in neues LB-Medium aufgenommen und sofort bei 37°C inkubiert (t = 0 min). Die Veränderung des Phagentiters während des weiteren Experiments wurde bei 37°C erfasst. Zu definierten Zeitpunkten erfolgte die Entnahme von Kulturproben. Ein Teil der Proben wurde zentrifugiert und mit Hilfe des phagenhaltigen Kulturüberstands wurde die Veränderung des Phagentiters durch „Plaque-Assay“ ermittelt. Mit dem Rest der Probe wurde die Veränderung des Bakterientiters durch Zählung der Zellen am Lichtmikroskop bestimmt. Aus den Veränderungen des Phagentiters ergab sich, dass nach einer 5-minütigen Eklipse die Sekretion neugebildeter Phagen in das Kulturmedium begann, wodurch der Titer nach 10 min auf 4,7 x 10

9 pfu/ml anstieg. Nach 120 min erreichte der Titer einen Wert von 1,85 x 10

11

Phagen/ml, was einer Gesamtsekretion von ~ 925 Phagen pro ursprünglich infizierter Zelle während 2 h entsprach. Während des Experiments wurde parallel die Veränderung des bakteriellen Titers infizierter Zellen (-●-) ermittelt. Die Generationszeit infizierter E. coli-Zellen verlängerte sich hier auf 48 min, dies entspricht einer Verdoppelung des Wertes von normal wachsenden, uninfizierten E. coli-Zellen.

Ergebnisse

100

2 x 108 Zellen/ml ergibt sich eine durchschnittliche Bindung von 7 Phagen pro

Bakterienzelle. Nach der Adsorptionsphase folgte die Zentrifugation der infizierten

Batch-Kultur, um ungebundene Phagen von den infizierten Zellen abzutrennen.

Dadurch nahm der Phagentiter zwischen t = -5 min und 0 min um zwei Zehnerpotenzen

ab. Nach der Aufnahme der infizierten Zellen in neues LB-Medium und der daraufhin

folgenden Inkubation bei 37°C (Abb.3-1, t = 0) folgte eine Eklipse, welche 6 Minuten

anhielt.

Während dieser Zeit wurden keine Phagen-Nachkommen sekretiert. Die Sekretion der

ersten Phagen-Nachkommen in das LB-Medium der Batch-Kultur begann 6 Minuten

nach Inkubation der Zellen bei 37°C. Dies wurde durch den Anstieg des Phagentiters

zwischen der 6. und 10. Minute in Abbildung 3-1 (-□-) dokumentiert. In dieser kurzen

Zeit erhöhte sich der Phagentiter von 2 x 108 pfu/ml auf 4,7 x 109 pfu/ml. Dies stellt eine

Vermehrung der Ausgangsmenge um das circa 30-fache dar, während der Bakterien-

titer in dieser Zeit nahezu konstant blieb. Daraus ergab sich, dass in dieser Zeitspanne

von 4 Minuten jede infizierte Zelle im Mittel 6 neue Phagen pro Minute in das Medium

sekretiert hatte. Erst nach 20 Minuten verlangsamte sich der Anstieg des Phagentiters

auf durchschnittlich 4 Phagen/min für jede infizierte Zelle. Nach insgesamt 120 Minuten

erreichte der Phagentiter, nach Abzug des Phagenhintergrunds zu t = 0 min, einen Wert

von 1,85 x 1011 pfu/ml. Hieraus ergab sich innerhalb dieser 120 Minuten eine durch-

schnittliche Gesamtsekretion von ~ 925 Phagen pro ursprünglich infizierter Zelle. Mit

einem Bakterientiter von 7,9 x 108 Bakterien/ml, welcher im Verlauf dieses zweistün-

digen Experiments erreicht wurde, erhielt man eine gemittelte Sekretion von 300 neuen

Phagen pro Bakterienzelle. Der ursprüngliche Phagentiter zu t = 0 min konnte während

dieser 120 Minuten um das 1200-fache erhöht werden. Das Experiment zeigte auch,

dass sich die Generationszeit für die infizierten E. coli-Zellen veränderte. Analysiert man

Zeit in min

Phagentiter in pfu/ml

Zeit in min

Bakterientiter in Bakterien/ml

-10 1,80 x 1010

-5 2,0 x 108

-5 1,66 x 1010

0 1,8 x 108

0 1,44 x 108 24 2,07 x 10

8

6 2,04 x 108 48 3,64 x 10

8

10 4,70 x 109 72 3,93 x 10

8

20 1,14 x 1010

96 5,61 x 108

30 1,70 x 1010

120 7,92 x 108

60 3,10 x 1010

90 1,04 x 1011

120 1,85 x 1011

Tabelle 3-1: Veränderung des Phagen- und Bakterientiters während des wildtypischen „one-step growth“ Experiments bei einer M.O.I von 100. Die Bestimmung des Phagentiters [pfu/ml] zu den Entnahmezeiten erfolgte durch „Plaque-Assay“; die Anzahl der infizierten Bakterien wurde durch Auszählung am Lichtmikroskop bestimmt. Zur Bestimmung des Bakterientiters wurde nach dem Zeitpunkt t = 0 min ein Probenintervall von 24 Minuten gewählt, welches der Generationszeit von E. coli entspricht.

Ergebnisse

101

den Verlauf des Bakterientiters in Tabelle 3-1, so ergab sich für infizierte E. coli-Zellen

eine Generationszeit von ~ 48 Minuten. Dies stellte eine Verdoppelung der Gene-

rationszeit gegenüber uninfizierten Zellen dar, da diese während der exponentiellen

Wachstumsphase üblicherweise nur 24 Minuten für eine Zellteilung benötigen.

3.1.2 Quantifizierung der M13mp19am8-Phagenextrusion während der Komple-

mentation durch das plasmidkodierte Haupthüllprotein gp8

Bei diesem „one-step growth“ Experiment war die Phagensekretion aus E. coli durch die

Regulation der gp8-Expression induzierbar. Es sollte der Verlauf der Phagensekretion

mit dem der wildtypischen Sekretion verglichen werden. Zunächst wurde ein induzier-

bares Expressionssystem konstruiert (Kap. 2.8.15 a)). Das Gen 8, welches für das

Haupthüllprotein kodiert, wurde in das Plasmid pGZ119HE kloniert. In diesem Plasmid

stand die gp8-Expression unter der Kontrolle des induzierbaren tac Promotors. Das

resultierende Plasmid pGZg8wt wurde in E. coli K38 transformiert. Für die Infektion der

transformierten Zellen kam der Phagenstamm M13mp19am8 zur Verwendung, in dem

die Aminosäure Lysin an Position 3 des Gens 8 in ein Amber-Stoppcodon verändert

war. Für die Quantifizierung wurden zwei Batch-Kulturen exponentiell wachsender

E. coli K38-Zellen mit transformiertem pGZg8wt verwendet, welche zuvor bei 37°C bis

zu einem Titer von 2 x 108 Bakterien/ml kultiviert, dann in einem Eiswasserbad abge-

kühlt und anschließend mit M13mp19am8-Phagen infiziert wurden (Kap 2.8.18).

Während einer 5-minütigen Adsorptionsphase erfolgte die Bindung der Phagen an die

F-Pili der E. coli-Zellen. Durch behutsame Zentrifugation bei 7500 g konnten anschlie-

ßend ungebundene Phagen von den infizierten Bakterien getrennt werden. Die phagen-

haltigen Überstände wurden verworfen und die Zellpellets in neuen vorgewärmten LB-

Flüssigmedien aufgenommen. Hierauf folgte eine erneute Inkubation der Zellsuspen-

sionen bei 37°C, um die Aufnahme der Phagen-DNA in die E. coli-Zellen zu ermög-

lichen. Sodann erfolgte die Induktion einer der Batch-Kulturen durch Zugabe von IPTG

(1mM Endkonzentration) und damit die Bereitstellung des Haupthüllproteins gp8 in

trans für die Phagenassemblierung. Dies stellt den Zeitpunkt t = 0 min in Abbildung 3-2

dar. Die zweite Batch-Kultur blieb als Referenz uninduziert. In Intervallen wurden

Proben zu definierten Zeitpunkten aus beiden Batch-Kulturen entnommen, zentrifugiert

und mit Hilfe der phagenhaltigen Kulturüberstände durch „Plaque-Assay“ (Kap. 2.8.22

b)) der Verlauf der Phagentiter verfolgt. Die Veränderungen der Phagentiter sind in

Ergebnisse

102

Tabelle 3-2 aufgeführt und in Abbildung 3-2 als „one-step growth“ Kurve graphisch

dargestellt.

Aus Tabelle 3-2 und Abbildung 3-2 ist zu entnehmen, dass es innerhalb der 5-minütigen

Adsorptionsphase (-10 min bis -5 min) in beiden Batch-Kulturen zu einer Verringerung

des Phagentiters kam. Während dieser Zeit nahmen die Titer von 2,66 x 109 pfu/ml auf

1,9 x 109 pfu/ml (-○-) bzw. von 1 x 109 pfu/ml auf 6 x 108 pfu/ml (-▲-) ab. Die hieraus

resultierenden Abweichungen von 7,6 x 108 pfu/ml (-○-) bzw. 4 x 108 pfu/ml (-▲-) hatten

im Verlauf dieser 5 Minuten andauernden Infektionen an die Bakterien adsorbiert. Bei

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

1E7

1E8

1E9

1E10

Eklipse

Ph

ag

en

tite

r in

p

fu/m

l

Zeit in min

(+IPTG)

(- IPTG)

Adsorption bei 4°C

Abb. 3-2: „One-step growth“ Kurve der M13-Phageninfektion von M13mp19am8 in E. coli K38 mit Plasmid pGZg8wt nach induzierter Sekretion. Exponentiell wachsende E. coli K38 Batch-Kulturen wurden bei einer Zelldichte von 2 x 10

8 Zellen/ml im Eiswasserbad mit M13mp19am8 infiziert. Der

Phagentiter nahm im Verlauf der 5 minütigen Adsorption (-10 min bis -5 min) von 2,66 x 109 pfu/ml auf

1,9 x 109 pfu/ml (-○-) bzw. von 1 x 10

9 pfu/ml auf 6 x 10

8 pfu/ml (-▲-) ab, was einer Gesamtadsorption

von 7,6 x 108 Phagen/ml bzw. 4 x 10

8 Phagen/ml entsprach. Im Mittel adsorbierten 2 - 4 Phagen an jede

Zelle dieser Batch-Kulturen. Nach der Adsorption wurden die Batch-Kulturen zentrifugiert, um ungebun-dene Phagen von den infizierten Zellen abzutrennen, wodurch der Phagentiter zwischen t = -5 min und t = 0 min eine Abnahme um zwei Zehnerpotenzen erfuhr. Die infizierten Zellen wurden nach der Zentrifu-gation in frischen LB-Flüssigmedien aufgenommen und erneut bei 37°C inkubiert, um die Aufnahme der Phagen-DNA in die E. coli-Zellen zu ermöglichen. Hier erfolgte die Induktion der Expression des plasmid-kodierten Haupthüllproteins gp8 durch Zugabe von IPTG (1mM Endkonzentration) in das Medium einer der Batch-Kulturen (-○-) zum Zeitpunkt t = 0 min, während die Zweite als Referenz uninduziert blieb (-▲-). Die Veränderungen des Phagentiters während des weiteren Experiments wurden bei 37°C ver-folgt. Zu definierten Zeitpunkten erfolgte die Entnahme von Kulturproben. Die Proben wurden zentrifugiert und mit Hilfe des phagenhaltigen Kulturüberstands wurde die Veränderung des Phagentiters durch „Plaque-Assay“ ermittelt. In der induzierten Kultur (-○-) folgte nach einer 12-minütigen Eklipse zwischen t = 0 min und t = 12 min die Sekretion neugebildeter Phagen in das Medium. Dies zeigte sich durch den Anstieg des Phagentiters von 2,1 x 10

7 pfu/ml auf 4,3 x 10

8 pfu/ml zwischen der 12. und 25. Minute. Nach

120 min erreichte der Phagentiter einen Wert von 3,35 x 1010

pfu/ml, was einer Gesamtsekretion von ~ 190 Phagen pro ursprünglich infizierter Zelle während 2 h entsprach. In der nicht induzierten Parallel-kultur (-▲-) blieb dagegen der Phagentiter unverändert bei ~ 1 x 10

7 pfu/ml. Während des zweistündigen

Experiments fand in dieser Kultur keine Phagenvermehrung statt.

Ergebnisse

103

einem Bakterientiter von 2 x 108 Zellen/ml ergab sich hier eine durchschnittliche

Bindung von 2 bis 4 Phagen pro Bakterienzelle.

Nach der Adsorptionsphase folgte die Zentrifugation der infizierten Batch-Kulturen, um

ungebundene Phagen von den infizierten Zellen abzutrennen. Dadurch nahmen die

Phagentiter zwischen t = -5 min und t = 0 min um zwei Zehnerpotenzen ab. Nach Auf-

nahme der infizierten Zellen in frisches LB-Medium und unter Schütteln bei 37°C (Abb.

3-2, t = 0 min) folgte in der induzierten Kultur (-○-) eine Eklipse, welche circa 12 Minuten

anhielt. Während dieser Zeit wurden keine Phagen-Nachkommen sekretiert. Die

Sekretion der ersten Phagen-Nachkommen in das LB-Medium der induzierten Batch-

Kultur erfolgte 12 Minuten nach Inkubation der Zellen. Hierdurch stieg der Phagentiter

bis zur 18. Minute von 2,10 x 107 pfu/ml auf 2,10 x 108 pfu/ml an. In dieser kurzen

Zeitspanne verzehnfachte sich der Phagentiter gegenüber der Ausgangsmenge. Nach

35 Minuten erreichte der Titer einen Wert von 6,7 x 108 pfu/ml, was einer Sekretion von

6,5 x 108 neuer Phagen pro ml entsprach. Somit wurden von jeder infizierten Bakterien-

zelle ~ 3 Phagen sekretiert. Nach 120 Minuten erreichte der Phagentiter einen Endwert

von 3,35 x 1010 pfu/ml, was einer Gesamtsekretion von ~ 190 Phagen pro ursprünglich

infizierter Zelle innerhalb von 2 h entsprach. Während dieser zweistündigen Infektion

Zeit in min

-IPTG Phagentiter in

pfu/ml

+ IPTG Phagentiter in

pfu/ml

-10 1,00 x 109 2,66 x 109 -5 6,00 x 108 1,90 x 109 0 1,40 x 107 1,75 x 107 4 1,00 x 107 1,35 x 107 8 1,40 x 107 2,10 x 107 12 8,00 x 106 2,10 x 107 14 9,00 x 106 3,20 x 107 16 9,00 x 106 6,60 x 107 18 1,00 x 107 2,10 x 108 20 1,00 x 107 2,55 x 108 25 1,35 x107 4,30 x 108 30 1,20 x 107 6,70 x 108 40 1,25 x 107 1,20 x 109 50 1,30 x 107 1,90 x 109 60 1,40 x 107 2,60 x 109 75 1,30 x 107 8,30 x 109

105 1,25 x 107 3,20 x 1010 120 1,70 x 107 3,35 x 1010

Tabelle 3-2: Veränderung des Phagentiters mit und ohne Induktion des plasmidkodierten Haupthüllproteins gp8 in infizierten E. coli K38 Batch-Kulturen. Die Bestimmung der Phagentiter zu den Entnahmezeiten erfolgte durch „Plaque-Assay“. Zum Zeitpunkt t = 0 min wurde die Expression des Haupthüllproteins gp8 durch Zugabe von IPTG zu einer der Batch-Kulturen induziert, während die Zweite als Referenz uninduziert blieb.

Ergebnisse

104

konnte bei der induzierten Kultur die Ausgangsmenge der Phagen zu t = 0 min um das

1900-fache erhöht werden. Der Verlauf des Phagentiters in der nicht induzierten Kultur

(-▲-) hingegen blieb während des gesamten Experiments unverändert bei ~ 1 x 107

pfu/ml. Dies zeigte, dass keine neugebildeten Phagen in das Medium sekretiert wurden.

3.1.3 M13-Adsorption an F-Pili in Abhängigkeit von der M.O.I.

In diesem Adsorptionsexperiment wurde die maximal mögliche Anzahl von Phagen

ermittelt, die während einer 5-minütigen Adsorptionsphase pro E. coli-Zelle an F-Pili

gebunden werden können.

Für dieses Adsorptionsexperiment wurden Batch-Kulturen exponentiell wachsender

E. coli K38-Zellen bei einer Zelldichte von 2 x 108 Zellen/ml mit M13mp19-Phagen infi-

ziert (Kap. 2.8.19). Hier wurden Adsorptionsverläufe für die M.O.I.-Werte von 5, 10, 20,

52 und 90 erstellt. Die Adsorption der Phagen an die F-Pili der E. coli-Zellen erfolgte für

5 Minuten im Eiswasserbad. Die Analyse der Anzahl an gebundenen Phagen pro Zelle

erfolgte anhand der Abnahmen der eingesetzten Phagentiter während der Adsorptions-

phase. Hierfür wurde einmal der Phagentiter direkt zum Zeitpunkt der Phagenzugabe

zur Batch-Kultur (t = 0 min) und nochmals nach einer 5-minütigen Adsorptionsphase

(t = 5 min) mit Hilfe des „Plaque-Assay“ (Kap. 2.8.22 b)) bestimmt. Aus den sich hieraus

ergebenden Abweichungen in den Phagentitern wurden anschließend die Phagenad-

sorptionen pro Minute für die 5 Minuten andauernden Adsorptionsphasen ermittelt.

Parallel dazu wurde der Wert für die unspezifische Bindung der M13mp19-Phagen an

Glasgeräte und unpilierte Bakterien als Kontrolle bestimmt (Kap. 2.8.19). Hier wurden

Batch-Kulturen exponentiell wachsender E. coli MC4100 verwendet, welche keine F-Pili

besitzen. Unter gleichen Bedingungen wie bei E. coli K38 erfolgten Adsorptionsverläufe

für die M.O.I.-Werte 10, 50 und 100. Alle durchgeführten Experimente wurden 2-mal

wiederholt. Dabei konnte eine ~ 8 %ige Standardabweichung zwischen den Mess-

werten der Einzelmessungen ermittelt werden, welche in den Darstellungen der Adsorp-

tionskurven in Abbildung 3-3 in Form von Fehlerbalken berücksichtigt wurde. Die

ermittelten Werte für die unspezifischen Bindungen sind in Tabelle 3-4, die an E. coli

K38 in Tabelle 3-3 wiedergegeben. Die gemittelten Werte wurden zusätzlich graphisch

als Adsorptionskurven in Abbildung 3-3 dargestellt.

Ergebnisse

105

Tabelle 3-3: Abnahme des Phagentiters in E. coli K38 Batch-Kulturen während der Phagen-Adsorptionsphase: Die Abnahme des Phagentiters während der 5-minütigen Adsorptionsphase wurde für verschiedene M.O.I.-Werte durchgeführt. Hierfür erfolgte die Ermittlung der Phagentiter direkt zum Zeitpunkt der Phagenzugabe zur Batch-Kultur und nochmals nach 5-minütiger Adsorptionsphase mit Hilfe des „Plaque-Assay“. Ab M.O.I. 20 kam es bei einem Wert von ~ -2,8 x 10

8 pfu/min zu einer

Sättigung von gebundenen Phagen an E. coli K38.

Tabelle 3-4: Abnahme des Phagentiters in E. coli MC4100 Batch-Kulturen während der Phagen-Adsorptionsphase: Die Abnahme des Phagentiters während der 5-minütigen Adsorptionsphase wurde für verschiedene M.O.I.-Werte durchgeführt. Hier erfolgte die Bestimmung der Phagentiter direkt zum Zeitpunkt der Phagenzugabe zur Batch-Kultur und nochmals nach 5-minütiger Adsorptionsphase mit Hilfe des „Plaque-Assay“. Aus den Versuchen ergab sich ein Wert von -1 x 10

8 pfu/min für die unspezifische

Bindung während der 5-minütigen Adsorptionsphase in Eiswasserbad, unabhängig von der eingesetzten M.O.I.

M.O.I. Abnahme PhagentiterΔt=5min

pfu/min

5 - 8.00 x 107

10 - 1.52 x 108

20 - 2.70 x 108

52 - 2.74 x 108

90 - 2.80 x 108

M.O.I. Abnahme PhagentiterΔt=5min

[pfu/min]

10 - 1 x 108

50 - 1 x 108

100 - 1 x 108

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

0,0

-5,0x107

-1,0x108

-1,5x108

-2,0x108

-2,5x108

-3,0x108

-3,5x108

spezifische Bindung

unspezifische Bindung

Ab

na

hm

e P

ha

ge

nti

ter

in

p

fu/m

in

M.O.I.

Abb. 3-3: Adsorption der M13mp19-Phagen in E. coli Batch-Kulturen in Abhängigkeit der ver-wendeten M.O.I. Batch-Kulturen exponentiell wachsender E. coli K38 (-■-) bzw. E. coli MC4100 (-○-) Zellen wurden bei einer Zelldichte von 2 x 10

8 Zellen/ml mit unterschiedlichen M.O.I.-Werten im

Eiswasserbad infiziert. Die Abnahmen der Phagentiter während der 5-minütigen Adsorptionsphasen wurden durch Probenentnahme zur Infektionszeit t = 0 min und nach t = 5 min durch „Plaque-Assay“ ermittelt. Aus den sich hieraus ergebenden Abweichungen in den Phagentitern wurden anschließend die Phagenadsorptionen pro Minute für die 5-minütige Adsorptionsphase ermittelt. Für die Adsorptionsex-

Ergebnisse

106

Die Abnahmen der Phagentiter in den einzelnen Adsorptionsexperimenten sind

graphisch in Abbildung 3–3 gegen die eingesetzte M.O.I. aufgetragen. Die ermittelten

Adsorptionswerte in den E. coli K38 Batch-Kulturen (-■-) wurden hier mit dem

ermittelten Wert für die unspezifische Adsorption der Phagen (-○-) bereinigt. Die

Adsorptionskurve zeigt eine ansteigende Bindung von Phagen an die Zellen während

der 5-minütigen Adsorptionsphase mit Zunahme der eingesetzten M.O.I. im Bereich

zwischen M.O.I. 5 – 20. Ab M.O.I. 20 erreichte die Phagenbindung eine gemittelte

Sättigung von ~ -3 x 108 Phagen/Minuten, darüber hinaus konnten durch weitere

Erhöhungen der M.O.I. keine weiteren Phagen während der 5-minütigen Adsorptions-

phase an die F-Pili der Zellen gebunden werden. Bezogen auf die Anzahl der maximal

infizierbaren E. coli-Zellen in den Batch-Kulturen während dieser 5 Minuten, ergab sich

somit ein maximales Verhältnis von 1:7, d.h. nach dieser 5-minütigen Adsorptionsphase

konnten durchschnittlich ~ 7 Phagen pro E. coli-Zelle gebunden werden.

Die Adsorptionsexperimente zur Ermittlung der unspezifischen Bindung an E. coli

MC4100 (Abb. 3-3, -○-) sowie an verwendete Glasgeräte (Erlenmeyerkolben, Glas-

pipetten) ergaben einen konstanten Wert von durchschnittlich -1 x 108 pfu/min nach der

5-minütigen Adsorptionsphase, welcher unabhängig von der verwendeten M.O.I. war.

Abschnitt 2:

3.2 Visualisierung M13-infizierter E. coli-Zellen

Zur Visualisierung neu gebildeter Phagenpartikel auf der Bakterienoberfläche wurden in

diesem Abschnitt M13-infizierte Escherichia coli DH5α-Zellen mit Hilfe des Transmissi-

onselektronenmikroskops (TEM) und des Rasterkraftmikroskops (RKM = AFM, „Atomic

Force Microscope“) untersucht.

perimente mit E. coli K38 wurden M.O.I.-Werte von 5, 10, 20, 52 und 90 verwendet und die Anzahl adsorbierter Phagen/min dargestellt (-■-). Alle durchgeführten Experimente wurden 2-mal wiederholt. Die ermittelte Standardabweichung von ~ 8 % zwischen den Messwerten der Einzelmessungen ist jeweils in den Werten der Adsorptionskurven als Fehlerbalken dargestellt. Die maximale Abnahme lag hier bei ~ -2,8 x 10

8 pfu/min. Dabei trat eine Adsorptionssättigung ab einer M.O.I. von 20 auf. Dies

entsprach einer Adsorption von ~ 7 Phagen pro Zelle nach 5 Minuten. Für die unspezifische Bindung von M13-Phagen an Glasgeräte und Bakterien wurden Adsorptionsexperimente mit E. coli MC4100 durchgeführt, welche keine F-Pili besitzen. Hier wurden M.O.I.-Werte von 10, 50 und 100 eingesetzt. Die Anzahl der adsorbierten Phagen pro Minute an die Zellen und Glasgeräte in den 5-minütigen Adsorptionsphasen wurden in Abhängigkeit von der M.O.I. dargestellt (-○-). Der konstante Wert von -1 x 10

8 pfu/min zeigt, dass die unspezifische Bindung nicht von der eingesetzten M.O.I. abhängig ist.

Ergebnisse

107

3.2.1 Immunogold-Markierung von M13-Phagen

Die Markierung der M13-Phagen mit Protein-A konjugiertem Gold wurde als Vorversuch

durchgeführt, um sicherzustellen, dass es sich bei den filamentösen Strukturen, welche

auf den E. coli-Zellen identifiziert werden sollten, um M13-Phagen handelte. Dafür

wurde eine Probe aus einer M13mp19-Phagenstammlösung mit primären Antikörpern

gegen das Haupthüllprotein gp8 inkubiert (Kap 2.8.30). Der Nachweis der primär an die

M13-Phagen gebundenen gp8-Antikörper erfolgte mittels Protein-A konjugiertem Nano-

gold. Zur Überprüfung der unspezifischen Bindung von Protein-A konjugiertem Nano-

gold an M13-Phagen, erfolgte in einer parallel angefertigten Probe die Inkubation aus-

schließlich mit Protein-A konjugiertem Gold. Von diesen Ansätzen wurden dann jeweils

Abb. 3-4: TEM-Aufnahmen von M13mp19- Phagen, kontrastiert mit 5 % Phosphorwolfram-säure (pH 7). (A) M13-Phage, der zuvor mit Anti-körpern gegen das Haupthüllprotein gp8 und an-schließend, zur Detektion gebundener Erstanti-körper, mit Protein-A konjugiertem Nanogold (20 nm Durchmesser) inkubiert wurde. Hier wurden 4 Goldpartikel an den longitudinalen Seiten des M13-Phagen gebunden. Die Länge des Skalie-rungsbalkens beträgt 500 nm. (B) Vergrößerter Ausschnitt eines, an der longitudinalen Seite ge-bundenen, Goldpartikels. Die Länge des Skalie-rungsbalkens beträgt 100 nm. (C) M13-Phagen, die nur mit Protein-A konjugiertem Nanogold inkubiert wurden. An den Phagen wurden keine Protein-A konjugierten Goldpartikel gebunden. Die Länge des Skalierungsbalkens beträgt 200 nm.

Ergebnisse

108

10 µl auf Trägernetzchen aus Kupfer adsorbiert und eine Negativkontrastierung mit

Phosphorwolframsäure (5 %, pH 7) durchgeführt (Kap. 2.8.27). Die kontrastierten

Proben wurden anschließend am Transmissionselektronenmikroskop (TEM) untersucht

(Kap. 2.8.29). Die Ergebnisse der mit Immunogold markierten Phagen sind in Abbildung

3-4 (A – C) zu sehen. Die Abbildung 3-4 (A) zeigt einen M13-Phagen, der zuvor mit

gp8-Antikörpern inkubiert wurde, bevor die Detektion mit Protein-A konjugiertem Nano-

gold erfolgte. Hier ist ein M13-Phage mit einer Länge von ~ 1 µm zu sehen, an dem vier

Goldpartikel gebunden wurden. In Abbildung 3-4 (B) ist ein vergrößerter Ausschnitt

eines, an der longitudinalen Seite des M13-Phagen, gebundenen Goldpartikels mit

20 nm Durchmesser zu sehen. Die Abbildung 3-4 (C) zeigt eine TEM-Aufnahme der

Probe, die nicht mit dem primären Antikörper gegen gp8 sondern nur mit Protein-A kon-

jugiertem Nanogold inkubiert wurde. An diesen M13-Phagen wurden keine Goldpartikel

gebunden.

3.2.2 TEM-Aufnahmen M13-sekretierenderE. coli DH5α-Zellen

Für TEM-Aufnahmen M13-sekretierender E. coli-Zellen wurden unpilierte E. coli DH5α-

Zellen verwendet, da nur so sichergestellt werden konnte, dass es sich bei filamen-

tösen Strukturen auf den Zelloberflächen um M13-Phagen handelte. Dieser Stamm ver-

fügt über keine F-Pili (F-), sodass die Infektion nur über eine Transfektion mit dem RF-

Plasmid von M13 erfolgen konnte (Kap. 2.8.25). Zur Überprüfung der Transfektion von

E. coli DH5α wurde der Phagenstamm M13amp konstruiert (Kap. 2.8.16), der das

β-Lactamase Gen unter der Kontrolle des lac-Promotors in der „Multiple Cloning Site“

von M13mp19 trug. Mit Hilfe des Phagenstamms M13amp konnten, nach Induktion mit

IPTG, transfizierte Zellen auf ampicillinhaltigen LB-Medien selektiert werden. Nach

Transfektion wurden mehrere gewachsene Einzelkolonien von Selektivplatten in

ampicillin- und IPTG-haltiges LB-Flüssigmedium überführt und über Nacht bei 37°C

unter Schütteln kultiviert. Die anschließenden Bestimmungen der Phagentiter in den

Überständen der einzelnen Kulturen erfolgte mit Hilfe des „Plaque-Assay“ (Kap. 2.8.22

b)). Für Aufnahmen von phagensekretierenden Zellen wurde eine infizierte E. coli

DH5α-Flüssigkultur verwendet, in deren Überstand eindeutig M13-Phagen nachge-

wiesen werden konnten. Damit die filamentösen Oberflächenstrukturen auf den Zellen

eindeutig als M13-Phagen zu identifizieren waren, erfolgte bei diesen Zellen die gleiche

Markierungsprozedur wie bei den Immunogold markierten M13-Phagen in Kap. 3.2.1.

Zur Überprüfung der unspezifischen Bindungen von gp8-Antikörpern und Protein-A

Ergebnisse

109

konjugiertem Nanogold an nicht transfizierte E. coli DH5α-Zellen, wurde parallel eine

nicht infizierte Kultur der gleichen Prozedur unterzogen; diese diente als Kontrolle. Von

den Ansätzen wurden, wie in Kapitel 2.8.27 beschrieben, jeweils 10 µl auf Kupfer-

netzchen adsorbiert und daraufhin mit Phosphorwolframsäure (5 %, pH 7) negativ

kontrastiert. Anschließend folgte die Untersuchung der Proben am TEM (Kap. 2.8.29).

Die Aufnahmen der Immunogold markierten E. coli DH5α-Zellen sind in Abbildung 3-5

(A – C) zu sehen.

Die transfizierten E. coli DH5α (F-)-Zellen in Abbildung 3-5 (A) und (B) zeigten

filamentöse Strukturen an deren Polenden, die an den longitudinalen Seiten Protein-A

konjugierte Nanogoldpartikel von 20 nm Durchmesser gebunden hatten. Die filamen-

tösen Strukturen hatten Längen von ~ 1 µm. Die nicht transfizierte Kontrolle in

Abb. 3-5: TEM-Aufnahmen von gebundenem Protein-A konjugiertem Gold an extrudierenden M13-Phagen. M13amp transfizierte E. coli DH5α- Zellen (F

-) wurden zuerst mit Antikörpern gegen das

Haupthüllprotein gp8 und anschließend mit Protein-A konjugiertem Nanogold behandelt. Negativkon-trastierung der Proben erfolgte mit 5 % Phosphor-wolframsäure (pH 7). (A), (B) Bakterienoberflächen transfizierter Zellen mit filamentösen Strukturen an den polaren Enden, die Längen von ~ 1 µm be-saßen. An den longitudinalen Seiten der Filamente waren Protein-A konjugierte Nanogoldpartikel mit 20 nm Durchmesser gebunden. (C) Nicht transfi-zierte Zelle, die mit gp8-Antikörpern und Protein-A konjugiertem Nanogold inkubiert wurde. Die Zelle zeigte weder filamentöse Strukturen noch gebun-dene Goldpartikel auf der Zelloberfläche. Die Län-gen der Skalierungsbalken betragen 500 nm.

Ergebnisse

110

Abbildung 3-5 (C) hingegen, welche ebenfalls mit gp8-Antikörpern und Protein-A

konjugiertem Nanogold inkubiert wurde, zeigte weder filamentöse Strukturen mit asso-

ziiertem Gold noch gebundene Goldpartikel auf der Bakterienoberfläche.

3.2.3 AFM-Aufnahmen M13-sekretierender E. coli DH5α-Zellen

Das „Atomic Force Microscope“ (AFM) stellt ein geeignetes Instrument dar, um bio-

logische Proben zu messen. Mit Hilfe des AFM ist es möglich, Oberflächenstrukturen

biologischer Proben detailgetreu messen und darstellen zu können. Über ein piezo-

elektrisches Verfahren wird eine Messsonde („Cantilever“), welche eine sehr feine

Spitze („Tip“) besitzt, über eine Probenoberfläche gerastert. Während des Rastervor-

gangs werden die Wechselwirkungskräfte („van der Waals Kräfte“) zwischen der Probe

und der Messsonde zur topographischen Darstellung der Probenoberfläche ausgenutzt.

Für die Messungen M13-sekretierender Zellen am AFM kam die transfizierte E. coli

DH5α-Flüssigkultur aus Kapitel 3.2.2 zur Verwendung. Die infizierte Kultur wurde, wie in

Kapitel 2.8.25 beschrieben, bei 37°C geschüttelt und bis zu einer Zelldichte von

2 x 108 Bakterien/ml inkubiert. Anschließend erfolgte die Aufbereitung der Zellen für die

Messung am AFM (Kap. 2.8.26). Eine 10 µl Probe der infizierten Kultur wurde auf eine

Glimmeroberfläche gegeben, damit die Bakterien auf der Oberfläche des Probenträgers

adsorbieren konnten. Parallel wurde eine Probe nicht infizierter E. coli DH5α-Zellen, die

als Kontrolle diente, auf einem AFM-Probenträger präpariert. Anschließend folgten die

Messungen der hergestellten Proben mit dem AFM im Kontakt-Modus (Kap. 2.8.28).

Die Auflagekraft der Messsonde auf der Probenoberfläche war < 1 nN. Die Ergebnisse

der Messungen sind in Abbildung 3-6 (A – C) als AFM „deflection“-Aufnahmen darge-

stellt. Dabei handelt es sich nicht um topographische Bilder, sondern um Bilder, die im

sogenannten „deflection“-Modus aufgenommen wurden und eine Ableitung der topo-

grafischen Bildinformation darstellen. Dadurch können kleinere Strukturen, wie Phagen,

dargestellt und von größeren Strukturen bei großen Höhendifferenzen besser unter-

schieden werden.

Die Abbildung 3-6 zeigt E. coli DH5α-Zellen mit Strukturierungen auf den Zellober-

flächen. Bei diesen Zellstrukturen handelt es sich um Eintrocknungsartefakte, welche

durch die Aufbereitung der Bakterienzellen für die AFM-Messungen entstehen. Die

Messungen der Zelloberflächen transfizierter Zellen in Abbildung 3-6 (A) und (B) zeigten

filamentöse Strukturen, welche seitlich an den Zellen über die gesamte Oberfläche

Ergebnisse

111

verteilt waren. Diese Strukturen haben Längen zwischen 1,3 – 1,4 µm. Die Messung

der nicht transfizierten Kontrolle (C) hingegen zeigte keine filamentösen Strukturen.

3.2.4 Veränderung der bakteriellen Zelloberfläche nach M13-Infektion

Die aus den Kapiteln 3.1.1 und 3.1.3 in Versuchsabschnitt 1 erhaltenen Ergebnisse

wurden hier verwendet, um in diesem 2. Abschnitt den Extrusionsverlauf von M13-

Phagen direkt auf der Zelloberfläche von E. coli-Zellen in Abhängigkeit von der Zeit,

nach erfolgter Infektion, mit dem „Atomic Force Microscope“ (AFM) messen zu können.

3.2.4.1 Extrusionsverlauf der M13-Phagen auf der Zelloberfläche von E. coli

Aus den vorangegangenen Versuchen in Abschnitt 1 ging hervor, dass die Zeitspanne

zwischen Infektion und Sekretion neuer M13-Phagen aus den Wirtszellen sehr kurz

Abb. 3-6: AFM-Messungen von E. coli DH5α-Zellen. (A), (B) E. coli DH5α (F

-) Zellen wurden mit

dem RF-Plasmid des Phagenstamms M13amp transfiziert. Die Zellen zeigten filamentöse Struk-turen mit Längen von 1,3 – 1,4 µm, welche sich über die gesamte Zelloberfläche verteilten. Die Länge des Skalierungsbalkens in (A) beträgt 1 µm, in (B) 2 µm. (C) Nicht transfizierte Zellen zeigen keine filamentösen Strukturen auf der Zellober-fläche. Die Länge des Skalierungsbalkens beträgt 2 µm.

Ergebnisse

112

war. Damit eine zeitliche Abfolge der einzelnen Sekretions- bzw. Extrusionsstadien

nach Infektion mit dem AFM gemessen werden konnte, kamen hier das Antibiotikum

Alamethicin (aus Trichoderma viride), welches durch Oligomerisierung von 4 – 6 Mole-

külen einen Ionenkanal in Zellmembranen ausbildet (Jones et al., 1980, Fox &

Richards, 1982), und das Ionophor Carbonylcyanid-m-Chlorophenylhydrazon (CCCP)

zur Anwendung. Bei diesen Substanzen handelt es sich um Ionophore, die in der

Membran von E. coli oligomerisieren und die protonenmotorische Kraft, über welche die

Zelle Energie für ihre Synthesevorgänge gewinnt, rasch zusammenbrechen lassen

(Cavari et al., 1966, Gášková et al., 1999). Hierdurch war die Möglichkeit gegeben, die

Zellen in dem Stadium zu konservieren, in welchem sie sich zum Zeitpunkt der Proben-

entnahme befanden. Dadurch erhielt man eine Momentaufnahme der zellulär intakten

E. coli-Oberflächen.

Für die AFM-Messungen des Extrusionsverlaufs der M13-Phagen auf der Zellober-

fläche von E. coli wurde eine Batch-Kultur exponentiell wachsender E. coli XL1-blue-

Zellen, wie in Kapitel 2.8.20 beschrieben, bei einer Zelldichte von 2 x 108 Zellen/ml mit

M13mp19-Phagen (M.O.I. 20) infiziert. Die Adsorption der Phagen an die F-Pili der

E. coli-Zellen erfolgte für 5 Minuten im Eiswasserbad. Anschließend wurde die Batch-

Kultur sofort wieder bei 37°C geschüttelt, um die Aufnahme der Phagen-DNA in die

Zellen zu ermöglichen. Für die Messungen der einzelnen Stadien am AFM wurden aus

der Batch-Kultur Proben entnommen und diesen Alamethicin (5 µM Endkonzentration)

sowie CCCP (50 µM Endkonzentration) zugesetzt. Probenentnahmen erfolgten kurz vor

Infektion sowie direkt nach erneutem Schütteln bei 37°C zu den Zeitpunkten t = 0, 2, 4,

5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 und 16 Minuten. Diese Intervallabstände waren das Ergebnis,

welches sich aus dem wildtypisch verlaufenden „one-step growth“ Experiment aus

Kapitel 3.1 ergab. Die einzelnen Proben wurden daraufhin, wie in Kapitel 2.8.26

beschrieben, für die Messungen am AFM vorbereitet. Auf die Glimmeroberfläche des

AFM-Probenträgers wurden 10 µl der aufbereiteten Proben gegeben, damit die

Bakterien an die Oberfläche des Probenträgers adsorbieren konnten. Anschließend

erfolgten die Messungen der Probenoberflächen mit dem AFM im Kontakt-Modus mit

der Trockenzelle (Kap. 2.8.28). Die Auflagekraft der Messsonde auf der Probenober-

fläche war < 1 nN. Die Messergebnisse der Zelloberflächen von infizierten E. coli XL1-

blue-Zellen sind in Abbildung 3-7, Abbildung 3-8 und Abbildung 3-9 als AFM

„deflection“-Aufnahmen dargestellt. Sie dokumentieren die zeitliche Abfolge des Extru-

sionsverlaufs der M13-Phagen auf der Zelloberfläche von E. coli XL1-blue.

Ergebnisse

113

E

B

C D

Abb. 3-7: AFM Bilder von E. coli XL1-blue-Zellen. Eine exponentiell wachsende Batch-Kultur von E. coli XL1-blue-Zellen wurde bei einer Zell-dichte von 2 x 10

8 Zellen/ml mit M13mp19 (M.O.I.

20) infiziert. Nach 5-minütiger Adsorptionsphase wurden die Zellen wieder bei 37°C geschüttelt und Proben entnommen, um den Sekretionssvorgang mit dem AFM messen zu können. Die Konser-vierung der Bakterienstadien erfolgte durch Zugabe von Alamethicin (5 µM Endkonzentration) und CCCP (50 µM Endkonzentration) zu den Proben. Die Längen der Skalierungsbalken betragen 1 µm. (A) Kontrolle: Zellen vor der Infektion zeigten keine filamentösen Strukturen. (B) Zellen nach 5-min-ütiger Adsorptionsphase von M13mp19 und erneuter Inkubation bei 37°C (t = 0 min). (C) T = 2 min und (D) t = 4 min. Zellen zeigten keine filamen-tösen Strukturen auf ihren Oberflächen. (E) Ab t = 5 min waren erste filamentöse Strukturen (siehe Pfei-le) mit ~ 1 µm Länge am Zellpol zu sehen. (E1, E2) Vergrößerte Darstellung der Zellpole aus (E).

A

E1 E2

2 min 4 min

5 min

0 min

Ergebnisse

114

A

G

H I

J

F

Abb. 3-8: AFM Bilder M13-sekretierender E. coli XL1-blue-Zellen. Eine exponentiell wachsende Batch-Kultur von E. coli XL1-blue-Zellen wurde bei einer Zelldichte von 2 x 10

8 Zellen/ml mit M13mp19

(M.O.I. 20) infiziert. Nach 5-minütiger Adsorptions-phase wurden die Zellen wieder bei 37°C ge-schüttelt und Proben entnommen, um den Sekre-tionsvorgang mit dem AFM messen zu können. Die Konservierung der Bakterienstadien erfolgte durch Zugabe von Alamethicin (5 µM Endkonzentration) und CCCP (50 µM Endkonzentration) zu den Proben. Die Längen der Skalierungsbalken betra-gen 1 µm. (F) T = 6 min; vermehrt zeigen sich fila-mentöse Phagenstrukturen von ~ 1 µm Länge am Zellpol. (G) T = 7 min, filamentöse Strukturen auch am Zellpolrand. (H) T = 8 und (I) t = 9 min. Auf-treten filamentöser Strukturen in geringer Anzahl an den longitudinalen Seiten der Zellen. (J) T = 10 min, filamentöse Strukturen in noch zählbarer Anzahl auf der gesamten Zelloberfläche.

8 min

6 min 7 min

9 min

10 min

Ergebnisse

115

Der Nachweis, dass E. coli XL1-blue-Zellen außer F-Pili keinerlei filamentöse Strukturen

auf ihren Zelloberflächen besaßen, erfolgte durch die AFM-Messung der Probe, welche

kurz vor der Infektion der Batch-Kultur entnommen wurde. Die Abbildung 3-7 (A) zeigt

die Messung der Kontrolle. Die Zellen besaßen keine filamentösen Strukturen auf ihren

Zelloberflächen. Die Messungen der Proben t = 0 min bis t = 4 min in Abbildung 3-7 (B)

– (D) ließen weiterhin keine filamentösen Strukturen auf den Bakterienoberflächen

erkennen. Erst die Messung der Probe t = 5 min in Abbildung 3-7 (E) zeigte erstmalig

filamentöse Strukturen mit Längen von ~ 1 µm an den Zellpolen der E. coli-Zellen

(weiße Pfeile). Nach einer weiteren Minute (Abb. 3-7 (F); t = 6 min) war die Anzahl der

Filamente mit ~ 1 µm Länge am Zellpol angestiegen. Ab t = 7 min (Abb. 3-8 (G)) traten

filamentöse Strukturen an beiden Zellpolen auf. Zwischen den Zeitpunkten t = 8 min bis

L

M

K

Abb. 3-9: AFM Bilder M13-sekretierender E. coli XL1-blue-Zellen. Eine exponentiell wachsende Batch-Kultur von E. coli XL1-blueZellen wurde bei einer Zelldichte von 2 x 10

8 Zellen/ml mit M13mp19

(M.O.I. 20) infiziert. Nach 5-minütiger Adsorptions-phase wurden die Zellen wieder bei 37°C ge-schüttelt und Proben entnommen, um den Sekre-tionsvorgang mit dem AFM messen zu können. Die Konservierung der Bakterienstadien erfolgte durch Zugabe von Alamethicin (5 µM Endkonzentration) und CCCP (50 µM Endkonzentration) zu den Proben. Die Länge der Skalierungsbalken beträgt 1 µm. (K) T = 12 min; Anzahl filamentöser Struk-turen über die gesamte Zelloberfläche nimmt zu. (L) T = 14 min und (M) t = 16 min; die Anzahl der Filamente auf den Zelloberflächen ist nicht mehr zählbar.

12 min 14 min

16 min

Ergebnisse

116

t = 10 min (Abb. 3-8 (H), (I) und (J)) traten die Strukturen mit zunehmender Anzahl auch

an den longitudinalen Seiten der Bakterienoberfläche auf. Die Bilder in Abbildung 3-9

(K) – (M) zeigen die Messungen der Zeitpunkte t = 12 min bis t = 16 min. Die Anzahl der

Filamente nahm in dieser Zeitspanne auf den gesamten Zelloberflächen weiterhin zu.

Ab der 14. Minute (Abb. 3-9 (L)) kam es zu einer Sättigung der bakteriellen Oberflächen

mit filamentösen Strukturen. Die Messung der Bakterienoberflächen für t = 16 min in

Abbildung 3-9 (M) wies keine Veränderungen der Oberflächenbelegung mit Filamenten

zur 14. Minute auf; die Mengen waren nicht mehr zählbar.

Abschnitt 3:

In diesem Abschnitt konnte das wirtsspezifische Translokationssystem identifiziert wer-

den, welches das „Minor Coat“ Protein gp9 in die Zytoplasmamembran von E. coli inse-

riert und somit für die Assemblierung neuer Phagen-Nachkommen zur Verfügung steht.

3.3 Funktionelle Präsentation und Detektion von antigenen Epitopen am

N-Terminus des „Minor Coat“ Proteins gp9

In diesem Versuchsabschnitt konnte unter anderem erörtert werden, ob antigene Epi-

tope am N-terminalen Ende des „Minor Coat“ Proteins gp9 funktionell präsentiert

werden können, ohne die wildtypische Sekretion der M13-Phagen zu beeinträchtigen. In

einem weiteren Schritt wurde dann die Abhängigkeit der Translokation des Hüllproteins

gp9 in die Zytoplasmamembran von E. coli durch die Membraninsertase YidC erörtert.

Das „Minor Coat“ Protein gp9 ist ein sehr kleines Protein, das am Phagen mit nur ~ 5

Kopien präsent ist und sich aus 32 Aminosäuren zusammensetzt. Im direkten Vergleich

mit dem Präprotein des Haupthüllproteins gp8 weist es keine abspaltbare Signal-

sequenz („Leadersequenz“) auf. Der sehr kurze N-terminale Bereich des gp9 befindet

sich in der Zytoplasmamembran und ist periplasmatisch orientiert. Um eine ausreichend

lange und abspaltbare Peptidsequenz im N-terminalen Bereich generieren zu können,

wurde ein „Phage-Display“ am „Minor Coat“ Protein gp9 entwickelt. Funktionell präsen-

tierte antigene Epitope können mit Hilfe spezifischer primärer Antikörper detektiert und

daraufhin über eine sekundäre Reaktion, vermittelt durch Protein-A aus Staphylococcus

aureus, über eine Immunpräzipitation isoliert oder mit Protein-A konjugiertem Nanogold

markiert werden. Gleichzeitig wird durch die Insertion antigener Epitope der N-terminale

Bereich des gp9 verlängert, wodurch eine Zugänglichkeit dieser inserierten Epitope für

Peptidasen, wie z. B. Proteinase K, möglich sein sollte.

Ergebnisse

117

N

C

Für das „Phage-Display“ wurden die in Tabelle 3-5 und Abbildung 3-10 aufgeführten

gp9-Konstrukte erzeugt (Kap. 2.8.17). In den folgenden Versuchen werden zur Verein-

fachung ausschließlich die Konstruktnamen verwendet.

Plasmid Konstruktname Beschreibung

pMS119HE

pMSg9/7 Wildtypisches Gen 9.

pMSg9MunI Gen 9 mit MunI-Schnittstelle an AS-Position +3 und +4.

pMSg9T7 Gen 9 mit inseriertem T7-Tag zwischen AS-Position +3 und +4. T7-AS-Sequenz: QLMASMTGGQQMGSGSQ

pMSg9T7rep

Gen 9 mit inseriertem T7-Tag zwischen AS-Position +3 und +4. AS +1 und +2 wurden nochmals an das Ende des T7-Tags eingefügt.

pMSg9HA Gen 9 mit inseriertem HA-Tag zwischen AS-Position +3 und +4. HA-AS-Sequenz: QLASGSYPYDVPDYAQ

pMSg9HArep

Gen 9 mit inseriertem HA-Tag zwischen AS-Position +3 und +4. AS +1 und +2 wurden nochmals an das Ende des HA-Tags eingefügt.

pMSg9T7SD Wie pMSg9T7, jedoch mit Codonfolge AGGAGG als Shine-Dalgarno-Sequenz vor Gen 9.

pMSg9T7repSD Wie pMSg9T7rep, jedoch mit Codonfolge AGGAGG als Shine-Dalgarno-Sequenz vor Gen 9.

pMSg9HASD Wie pMSg9HA, jedoch mit Codonfolge AGGAGG als Shine-Dalgarno Sequenz vor Gen 9.

pMSg9HArepSD Wie pMSg9HArep, jedoch mit Codonfolge AGGAGG als Shine-Dalgarno-Sequenz vor Gen 9.

pMSg9DT7SD pMSg9T7SD mit doppeltem T7-Tag.

pMSg9DT7repSD pMSg9T7repSD mit doppeltem T7-Tag.

pMSg9DHASD pMSg9HASD mit doppeltem HA-Tag.

pMSg9DHArepSD pMSg9HArepSD mit doppeltem HA-Tag.

C

N

N

C

N

C

N

C

C

N

N

C

N

C

C

N

N

C

N

C

N

C

C

N

N

C

Tabelle 3-5: Auflistung der erzeugten Konstrukte für das „Phage-Display“ am „Minor Coat“ Protein gp9. Aufgeführt sind das parentale Plasmid aller Konstrukte, die Konstruktnamen, eine schematische Darstellung der Konstrukte und eine kurze Erläuterung der Konstrukteigenschaften.

Ergebnisse

118

Abb. 3-10: Schematische Darstellung der erzeugten Konstrukte für das „Phage-Display“ am „Minor Coat“ Protein gp9. Ausgehend von der Wildtypsequenz gp9wt wurden die in den Darstellungen der einzelnen Konstrukte aufgezeigten Veränderungen in gp9 eingefügt. In die Wildtypsequenz wurde eine MunI-Schnittstelle inseriert (gp9MunI), welche dazu diente, kurze, für einen T7- oder HA-Tag kodie-rende Sequenzen, einzubringen. Hierdurch entstanden die Konstrukte gp9T7, gp9T7rep, gp9HA und gp9HArep. Anschließend wurde in die MunI-Schnittstelle dieser Konstrukte jeweils eine weitere kodier-ende Sequenz eines T7- bzw. HA-Tags eingebracht. Hierdurch entstanden die Konstrukte gp9DT7, gp9DT7rep, gp9DHA und gp9DHArep. In den rep-Konstrukten wurde nach den eingefügten Tags die gp9-Wildtypsequenz (schwarz hinterlegt) durch Insertion der 1. und 2. AS wiederhergestellt (schwarz unterstrichen). Die Proteine sind im 1-Buchstabencode dargestellt.

Ergebnisse

119

Tabelle 3-6: Komplementationstest der gp9-Konstrukte ohne zusätzlich eingefügte Shine-Dalgarno-Sequenz mit M13am9-M7. In den Komplementationstests wurden je 10 µl der einzelnen Verdünnungsstufen des Phagenstamms M13am9-M7 von 10

6 pfu/ml bis 10

1 pfu/ml auf die, mit IPTG

induzierten, Bakterienrasen verschiedener gp9-Konstrukte aufgetropft (E – H). Die Komplementationen auf den Bakterienrasen von E. coli K37 (A, Suppressor-Stamm) und E. coli K38 mit Plasmid pMSg7/9 (C) dienten als Kontrollen und zeigten die wildtypische Komplementation von M13am9-M7. Der nicht induzierte Bakterienrasen E. coli K38 mit Plasmid pMSg7/9 (D) diente als Kontrolle und Nachweis, dass die Komplementation nur durch das plasmidkodierte Gen 9 zustande kam. Der Bakterienrasen E. coli K38 (B, Nicht-Suppressor Stamm) diente ebenfalls als Kontrolle, da keine Komplementation von M13am9-M7 Phagen möglich sein sollte.

3.3.1 Komplementationstest der gp9 Konstrukte

Anhand von Komplementationstests erfolgte die Überprüfung der Funktionalität der

generierten Konstrukte durch die Substitution einer Ambermutation im wildtypischen

gp9 des Phagenstamms M13am9-M7. Für die Testreihen der einzelnen Konstrukte

wurden folgende E. coli-Stämme verwendet: Als Suppressorstamm E. coli K37, in wel-

chem die Translation durch ein „Amber-Stoppcodon“ nicht terminiert wird; E. coli K38

als Nicht-Suppressorstamm, in welchem die Translation durch ein „Amber-Stoppcodon“

terminiert wird. Zur Überprüfung der einzelnen gp9-Konstrukte wurden E. coli K38

Zellen mit den jeweiligen Plasmid-Konstrukten transformiert und auf ampicillinhaltigen

LB-Platten ausplattiert (Kap.2.8.15 b)). Für jedes Konstrukt diente eine gewachsene

Einzelkolonie als Basis für die Herstellung von 2 ml Flüssigkulturen. Die Flüssig-

kulturen wurden bei 37°C bis zu einer Zelldichte von 4 x 108 Bakterien/ml kultiviert.

Konstrukt Komplementationstest Konstrukt Komplementationstest

(A) E. coli K37

ohne Plasmid (Kontrolle)

[pfu/ml] 106 105 104

103 102 101

(E) E. coli K38 mit

pMSg9T7

[pfu/ml] 106 105 104

103 102 101

(B) E. coli K38

ohne Plasmid (Kontrolle)

[pfu/ml] 106 105 104

103 102 101

(F) E. coli K38 mit pMSg9T7rep

[pfu/ml] 106 105 104

103 102 101

(C) E. coli K38 mit

pMSg7/9 (Kontrolle + IPTG)

[pfu/ml] 106 105 104 103 102 101

(G) E. coli K38 mit

pMSg9HA

[pfu/ml] 106 105 104

103 102 101

(D) E. coli K38 mit

pMSg7/9 (Kontrolle - IPTG)

[pfu/ml] 106 105 104

103 102 101

(H) E. coli K38 mit pMSg9HArep

[pfu/ml] 106 105 104

103 102 101

Ergebnisse

120

Tabelle 3-7: Komplementationstest der gp9-Konstrukte mit zusätzlich eingefügter Shine-Dalgarno-Sequenz und M13am9-M7. In den Komplementationstests wurden je 10 µl der einzelnen Verdünnungs-stufen des Phagenstamms M13am9-M7 von 10

6 pfu/ml bis 10

1 pfu/ml auf die, mit IPTG induzierten, Bak-

terienrasen verschiedener gp9-Konstrukte (I – P) aufgetropft. Bis auf E. coli mit pMSg9HASD (K) und E. coli mit pMSg9HArepSD (L) konnten alle Konstrukte das, durch Ambermutation ausgeschaltete, gp9 des Phagenstamms M13am9-M7 bis zu einer Verdünnungsstufe von 10

1 pfu/ml komplementieren.

Die gewachsenen Kulturen wurden dann zur Generierung von Bakterienrasen für Spot-

Tests verwendet, auf denen Verdünnungsreihen des Phagenstamms M13am9-M7 auf-

getropft wurden (Kap.2.8.22 a)). Die Induktion der gp9-Konstruktexpression in den ver-

wendeten Bakterienrasen erfolgte durch Zugabe von IPTG. Nach Inkubation bei 37°C

über Nacht, folgte die Auswertung der Plaquebildung auf den einzelnen Bakterien-

rasen.

Die Tabelle 3-6 und Tabelle 3-7 zeigen die Ergebnisse, welche in den durchgeführten

Komplementationstests auf den einzelnen Bakterienrasen der jeweiligen Konstrukte

erhalten wurden. Bis auf pMSg9HASD (K), pMSg9HArepSD (L), pMSg9DHASD (O) und

pMSg9DHArepSD (P) (Tabelle 3-7) konnten alle Konstrukte das, durch Ambermutation

ausgeschaltete, gp9 des Phagenstamms M13am9-M7 bis zu einer Verdünnungsstufe

von 101 pfu/ml komplementieren. Dies entsprach der wildtypischen Komplementation

des Amber 9-Phagen auf dem Bakterienrasen des Suppressorstamms E. coli K37 (A) in

Tabelle 3-6. Auf den Bakterienrasen der Konstrukte pMSg9HASD (K), pMSg9HArepSD

(L), pMSg9DHASD (O) und pMSg9DHArepSD (P) gab es nur Komplementationen bis

zu einer Verdünnung von 102 pfu/ml. Verglichen mit dem Komplementationstest auf

dem Bakterienrasen des Nicht-Suppressorstamms E. coli K38 (B), der hier als Kontrolle

Konstrukt Komplementationstest Konstrukt Komplementationstest

(I) E. coli K38 mit

pMSg9T7 SD

[pfu/ml] 106 105 104

103 102 101

(M) E. coli K38 mit

pMSg9DT7 SD

[pfu/ml] 106 105 104

103 102 101

(J) E. coli K38 mit pMSg9T7rep

SD

[pfu/ml] 106 105 104

103 102 101

(N) E. coli K38 mit pMSg9DT7rep

SD

[pfu/ml] 106 105 104

103 102 101

(K) E. coli K38 mit

pMSg9HA SD

[pfu/ml] 106 105 104

103 102 101

(O) E. coli K38 mit pMSg9DHA

SD

[pfu/ml] 106 105 104

103 102 101

(L) E. coli K38 mit pMSg9HArep

SD

[pfu/ml] 106 105 104

103 102 101

(P) E. coli K38 mit pMSg9DHArep

SD

[pfu/ml] 106 105 104

103 102 101

Ergebnisse

121

diente, haben alle hergestellten Konstrukte die Befähigung das fehlende gp9 des

M13am9-M7-Phagen funktionell zu ersetzen. Dass die Komplementationen auf das

plasmidlokalisierte Gen 9 zurückzuführen waren, zeigte der Vergleich der induzierten

(C) und nicht induzierten (D) Plasmid-Kontrolle pMSg7/9 in Tabelle 3-6. Bei der nicht

induzierten Kontrolle (D) kam es bis zur Verdünnungsstufe von 103 pfu/ml zu Plaque-

bildungen, welche durch Revertanten verursacht wurden. Bei der induzierten Kontrolle

(C) hingegen erfolgte die Komplementation bis zur Verdünnungsstufe von 101 pfu/ml.

3.3.2 Expressionsnachweis der gp9 Mono-Tag Konstrukte in E. coli K38

Anhand der durchgeführten Komplementationstests in Kapitel 3.3.1 konnte gezeigt

werden, dass die Konstrukte mit N-terminalem Mono-Tag imstande waren, das fehlende

gp9 in M13am9-M7 funktionell zu substituieren. Mit dem Expressionsnachweis sollte

gezeigt werden, dass eine Translation der gp9-Konstrukte mit Mono-Tag in den Zellen

erfolgt. Bei gp9 handelt es sich, trotz der fusionierten antigenen Epitope, um ein sehr

kleines Protein mit geringer Expressionsrate. Deshalb wurden die Konstruktexpres-

sionen in vivo radioaktiv mit Hilfe von „Pulse“-Experimenten (Kap. 2.8.39) nachge-

wiesen.

Hierfür erfolgte die Kultivierung von E. coli K38-Flüssigkulturen der Komplemen-

tationstests in Tabelle 3-7 in M9-Minimalmedium bis zur frühen logarithmischen Wachs-

tumsphase bei 37°C. Die Expression der gp9-Konstrukte wurde durch Zugabe von

IPTG (1mM Endkonzentration) zum Kulturmedium induziert. Nach 10 Minuten erfolgte

die Markierung der in der Synthese befindlichen Proteine für weitere 10 Minuten durch

Zusatz von 20 µCi [35S]-Methionin („Pulse“). Die „Pulse“-Reaktionen wurden anschlie-

ßend durch Präzipitation der Proben mit TCA gestoppt. Nach TCA-Fällung der radio-

aktiv markierten Proben erfolgten, unter Verwendung von anti-T7- bzw. anti-HA-Serum,

Immunpräzipitationen (Kap. 2.8.39) zum Nachweis exprimierter gp9T7- und gp9HA-

Konstrukte aus den Zelllysaten. Die immunpräzipitierten Proteine wurden mittels SDS-

PAGE (mit Harnstoff) (Kap. 2.8.35) aufgetrennt und die radioaktiv markierten Proteine

anschließend durch Phosphorimaging (Kap. 2.8.41) als Autoradiogramme detektiert. Als

Kontrolle für die T7- als auch für die HA-Konstruktexpression wurde eine mit dem

Ausgangsvektor pMS119EH transformierte Kultur jeweils mit den entsprechend

spezifischen Antiseren nach Induktion immunpräzipitiert und das Bandenmuster auf das

Vorkommen der zusätzlichen Proteinbande der Konstrukte verglichen.

Ergebnisse

122

Die Autoradiogramme in Abbildung 3-11 zeigen die einzelnen „Pulse“-Analysen der

in vivo Konstruktexpressionen. Für die Konstrukte gp9T7SD (A), gp9T7repSD (B),

gp9HASD und gp9HArepSD (C) wurden die Expressionen der Proteine ( ) in E. coli

K38 nachgewiesen. Aus dem Vergleich des Konstrukts gp9T7repSD in (B) mit der

Markerbande (M) ( ), welche das Haupthüllprotein gp8 mit ~ 5,2 kDa darstellt, kann

gefolgert werden, dass die gp9-Konstrukte ein Molekulargewicht von ~ 5,2 kDa –

5,5 kDa besitzen müssen, da diese sich untereinander nur in der Summe von 2 – 4

Aminosäuren unterscheiden. Aus den radioaktiv markierten Kulturen konnten bei der

Immunpräzipitation, mit Hilfe der spezifischen Antiseren gegen das T7- und HA-Epitop,

gp9 Mono-Tag-Konstrukte nachgewiesen werden, wohingegen aus den Kontrollkulturen

(K) mit pMS119EH keine vergleichbaren Proteine präzipitiert wurden.

3.3.3 Expressionsnachweis der gp9 Di-Tag Konstrukte in E. coli K38

Anhand der durchgeführten Komplementationstests in Kapitel 3.3.1 konnte gezeigt

werden, dass die Konstrukte mit N-terminalem Doppel-Tag imstande waren, das ausge-

schaltete gp9 in M13am9-M7 funktionell zu substituieren. Mit dem Expressionsnachweis

konnte gezeigt werden, dass eine Translation der gp9-Konstrukte mit Doppel-Tag in

den Zellen erfolgte. Der Nachweis der Konstruktexpressionen in vivo erfolgte, wie in

Abb. 3-11: „Pulse“-Analysen der gp9 Mono-Tag-Konstruktexpressionen in E. coli K38. Für den Expressionsnachweis der gp9 Mono-Tag-Konstrukte wurden die transformierten E. coli K38-Kulturen der Komplementationstests in M9-Minimalmedium bei 37°C bis zu einem Bakterientiter von 2 x 10

8 Zellen/ml

kultiviert. Die Expressionen der plasmidkodierten Mono-Tag-Konstrukte erfolgten durch Zugabe von IPTG (1 mM Endkonzentration) zu den Kulturmedien. Nach 10-minütiger Induktion wurden die Kulturen mit 20 µCi [

35S]-Methionin für 10 Minuten radioaktiv markiert („Pulse“) und anschließend mit TCA (12 % End-

konzentration) gefällt. Nach den Immunpräzipitationen folgte die Auftrennung der radioaktiv markierten Proben durch eine 22 %ige SDS-Urea-PAGE mit anschließendem Phosphorimaging. Als Kontrolle (K) wurde eine mit dem Ausgangsvektor pMS119EH transformierte Kultur mit anti-T7 bzw. anti-HA Serum immunpräzipitiert. Die Markerbande (M) ( ) in (B) stellt das Haupthüllprotein gp8 mit einem Molekular-gewicht von ~ 5,2 kDa dar. In den Proben gp9T7 (A), gp9T7rep (B), gp9HA und gp9HArep (C) konnten mit Hilfe der Immunpräzipitationen die einzelnen gp9 Mono-Tag-Konstrukte ( ) aus den Zelllysaten nachgewiesen werden. Zur Identifikation der gp9-Konstrukte wurden die Proben mit den Kontrollen (K) verglichen. Aus dem Vergleich mit der Markerbande (M) konnte gefolgert werden, dass die gp9 Mono-Tag-Konstrukte ein Molekulargewicht von ~ 5,2 kDa – 5,5 kDa besitzen.

M

(A) (B) (C)

~ 5,2

kDa

gp9T7 repSD

K gp9HA SD

K gp9HA repSD

gp9T7SD

K

Antikörper: anti-T7: + + - + + - - -

Antikörper: anti-HA: - - - - - + + +

Ergebnisse

123

Kapitel 3.3.2, radioaktiv mit Hilfe von „Pulse“-Experimenten (Kap. 2.8.39). Hierfür

wurden die entsprechenden E. coli K38-Flüssigkulturen der Komplementationstests in

Tabelle 3-7 in M9-Minimalmedium bis zur frühen logarithmischen Wachstumsphase bei

37°C kultiviert. Die Expressionen der gp9-Konstrukte wurden durch Zugabe von IPTG

(1mM Endkonzentratin) zum Kulturmedium induziert. Nach 10 Minuten erfolgte die

Markierung der in der Synthese befindlichen Proteine für weitere 10 Minuten durch

Zusatz von 20 µCi [35S]-Methionin („Pulse“). Die „Pulse“-Reaktionen wurden anschlie-

ßend durch Präzipitation der Proben mit TCA gestoppt. Nach TCA-Fällung der radio-

aktiv markierten Proben erfolgten, unter Verwendung von anti-T7 bzw. anti-HA Serum,

Immunpräzipitationen (Kap. 2.8.39) zur Isolierung exprimierter gp9DT7SD- und

gp9DHASD-Konstrukte aus den Zelllysaten. Die immunpräzipitierten Proteine wurden

mittels SDS-Tricin-PAGE (Kap. 2.8.35) aufgetrennt und die radioaktiv markierten

Proteine anschließend durch Phosphorimaging (Kap. 2.8.41) detektiert.

Abb. 3-12: „Pulse“-Analysen der gp9 Doppel-Tag-Konstruktexpressionen in E. coli K38. Für den Expressionsnachweis der gp9 Doppel-Tag-Konstrukte wurden die transformierten E. coli K38-Kulturen der Komplementationstests in M9-Minimalmedium bei 37°C bis zu einem Bakterientiter von 2 x 10

8

Zellen/ml kultiviert. Die Expressionen der plasmidkodierten Doppel-Tag-Konstrukte erfolgten durch Zugabe von IPTG (1 mM Endkonzentration) zu den Kulturmedien. Nach 10-minütiger Induktion wurden die Kulturen mit 20 µCi [

35S]-Methionin für 10 Minuten radioaktiv markiert („Pulse“) und anschließend mit

TCA (12 % Endkonzentration) gefällt. Nach den Immunpräzipitationen folgte die Auftrennung der radioaktiv markierten Proben durch eine 16,5 %ige SDS-Tricin-PAGE mit anschließendem Phos-phorimaging. Als Kontrolle (K) wurde eine mit dem Ausgangsvektor pMS119EH transformierte E. coli K38-Kultur mit anti-T7 bzw. anti-HA Serum immunpräzipitiert. In den Proben gp9DT7SD, gp9DT7repSD (A), gp9DHASD und gp9DHArepSD (B) konnten mit Hilfe der Immunpräzipitationen die Expressionen der einzelnen gp9 Doppel-Tag-Konstrukte ( ) mit einem Molekulargewicht von ~ 7,2 – 7,5 kDa nachge-wiesen werden. Im Vergleich zu den Mono-Tag-Konstrukten konnte durch die Immunpräzipitation der Doppel-Tag-Konstrukte jeweils eine zweite Bande ( ) mit einem Molekulargewicht von ~ 5,2 – 5,5 kDa identifiziert werden. Die Identifikation der gp9 Doppel-Tag-Konstrukte erfolgte durch Vergleich der Proteinbandenmuster mit denen der Kontrollen (K).

(A)

(B)

Antikörper anti-T7: - + + +

Antikörper anti-HA: - + + +

K gp9D T7SD

gp9D T7repSD

10 kDa

10 kDa

gp9D HASD

K gp9D HArepSD

~ 5,2 – 5,5 kDa

~ 5,2 – 5,5 kDa

~ 7,2 – 7,5 kDa

~ 7,2 – 7,5 kDa

Ergebnisse

124

Als Kontrolle für die DT7SD- als auch für die DHASD-Konstruktexpression wurde eine

mit dem Ausgangsvektor pMS119EH transformierte E. coli K38-Kultur jeweils mit den

entsprechend spezifischen Antiseren nach Induktion immunpräzipitiert und mit den

Proteinbandenmustern der gp9-Konstrukte verglichen.

Die Autoradiogramme in Abbildung 3-12 zeigen die einzelnen „Pulse“-Analysen der in

vivo Konstruktexpressionen. Aus den radioaktiv markierten Kulturen der Konstrukte

gp9DT7SD, gp9DT7repSD (A), gp9DHASD und gp9DHArepSD (B) konnten, während

der Immunpräzipitation mit dem jeweiligen Antiserum gegen das T7- oder HA-Epitop,

Doppel-Tag tragende gp9 Proteine ( ) mit Molekulargewichten zwischen ~ 7,2 – 7,5

kDa in E. coli K38 nachgewiesen werden. In den Kontrollkulturen (K) wurden keine

vergleichbaren Produkte nachgewiesen. Im Vergleich zu den Mono-Tag-Konstrukten in

Abbildung 3-11 konnte durch die Immunpräzipitationen der Doppel-Tag-Konstrukte

jeweils ein weiteres Produkt als zweite Bande ( ) nachgewiesen werden, welches mit

einem Molekulargewicht von ~ 5,2 – 5,5 kDa mit dem der gp9 Mono-Tag-Konstrukte

vergleichbar war.

3.3.4 Membraneinbau der Proteine gp9T7SD und gp9T7repSD in E. coli K38

In den Kapiteln 3.3.2 und 3.3.3 konnten die Expressionen der Mono- und Doppel-Tag-

Konstrukte in vivo nachgewiesen werden. Nachfolgend sollte der Membraneinbau der

Proteine gp9T7SD und gp9T7repSD in die Zytoplasmamembran von E. coli K38

überprüft werden. Die Translokation des T7-Epitops in das Periplasma von E. coli K38

wurde in vivo radioaktiv mit Hilfe von „Pulse“-Experimenten (Kap. 2.8.40) mit anschlie-

ßendem Protease-Mapping überprüft. Der N-Terminus des wildtypischen gp9 ist peri-

plasmatisch orientiert, so dass die fusionierten T7-Epitope für eine proteolytische

Prozessierung durch Proteinase K zugänglich sein sollten. Bei Abspaltungen der anti-

genen Epitope sollten sich die Konstrukte während der Immunpräzipitation nicht mehr

aus den präzipitierten Zelllysaten isolieren lassen.

Für die Translokationsnachweise wurden die mit pMSg9T7SD und pMSg9T7repSD

transformierten E. coli K38-Flüssigkulturen (Tabelle 3-7) bis zur frühen logarithmischen

Wachstumsphase in M9-Minimalmedium bei 37°C kultiviert. Die Expressionen der gp9-

Konstrukte wurden durch Zugabe von IPTG (1mM Endkonzentration) zum Kultur-

medium induziert. Nach 10 Minuten erfolgte die Markierung der in der Synthese befind-

lichen Proteine für weitere 10 Minuten durch Zusatz von 20 µCi [35S]-Methionin

(„Pulse“). Die Proben wurden dann, wie in Kapitel 2.8.39 beschrieben, dem Protease-

Ergebnisse

125

Mapping unterzogen, in welchem die radioaktiv markierten Proteine in den Sphero-

plasten gp9-exprimierender Zellen mit Proteinase K einer Proteolyse unterzogen

wurden. Nach Proteinase K Verdau erfolgte die Präzipitation der Proben mit TCA und

anschließend die Immunpräzipitation (Kap. 2.8.39) unter Verwendung von anti-T7-

Serum, um die g9T7-Proteine in den Zelllysaten nachzuweisen. Die immunpräzipitierten

Proteine wurden mittels SDS-Tricin-PAGE (Kap. 2.8.35) aufgetrennt und die radioaktiv

markierten Proteine anschließend durch Phosphorimaging (Kap. 2.8.41) detektiert. Als

Kontrolle (K) wurden Zellen, die nur den Ausgangsvektor pMS119EH enthielten,

ebenfalls mit anti-T7 Serum immunpräzipitiert und dann das Proteinbandenmuster

verglichen. Das äußere Membranprotein OmpA sowie das zytosolische Chaperon

GroEL der E. coli-Zellen dienten bei dem Protease-Mapping als interne Kontrollen, um

Abb. 3-13: Protease-Mapping der Konstrukte gp9T7SD und gp9T7repSD in E. coli K38. Für den Translokationsnachweis der gp9T7SD- und gp9T7repSD-Konstrukte wurden die transformierten E. coli K38 Kulturen in M9-Minimalmedium bei 37°C bis zu einem Bakterientiter von 2 x 10

8 Zellen/ml kultiviert.

Die Expressionen der plasmidkodierten Konstrukte erfolgten durch Zugabe von IPTG (1 mM Endkonzen-tration) zu den Kulturmedien. Nach 10 min Induktion wurden die Kulturen mit 20 µCi [

35S]-Methionin für

10 min radioaktiv markiert („Pulse“) und anschließend einem Protease-Mapping unterzogen. Nach Proteinase K Verdau und Immunpräzipitation folgte die Auftrennung der radioaktiv markierten Proben über eine 16,5 %ige SDS-Tricin-PAGE mit anschließendem Phosphorimaging. Als Kontrolle (K) wurde eine mit dem Ausgangsvektor pMS119EH transformierte E. coli K38 Kultur mit anti-T7 Serum immun-präzipitiert. In den nicht mit Proteinase K behandelten Proben (Proteinase K -) von gp9T7SD in (A) und gp9T7repSD in (B) konnten mit Hilfe der Immunpräzipitation exprimierte gp9T7-Proteine ( ) aus den Zell-lysaten isoliert werden. Dass es sich jeweils um die gp9-Konstrukte handelte, ergab sich aus dem Ver-gleich mit den Kontrollen (K), welche auf Höhe der gp9-Bande keine Proteinbanden zeigten. Die mit Pro-teinase K behandelten Proben (Proteinase K +) wiesen ebenfalls auf dieser Höhe keine Proteinbanden auf, was auf eine proteolytische Prozessierung der T7-Epitope hinwies. Dass die Integrität der Sphero-plasten gegeben und die Proteinase funktionsfähig war, ergab sich aus der, trotz Proteinase K Verdau, unprozessierten Kontrolle des zytosolischen GroEL und der abgebauten Kontrolle OmpA der äußeren Membran. (C) Schematische Darstellung der T7-Tag-Prozessierung durch Proteinase K während des Protease-Mappings.

K

(C)

(A)

(B)

OmpA GroEL gp9T7 SD

K

Proteinase K: - + - - + - +

Proteinase K: - + - + - +

gp9T7repSD

OmpA GroEL

Ergebnisse

126

die Integrität der hergestellten Spheroplasten bestätigen zu können. Aus den präzipi-

tierten Proben wurden 10 % der Proben jeweils mit anti-OmpA und anti-GroEL Serum

immunpräzipitiert. In Spheroplasten kann das zytosolische GroEL nicht durch Prote-

inase K proteolytisch abgebaut werden, während OmpA in der äußeren Membran durch

die Protease vollkommen abgebaut wird.

Die Autoradiogramme in Abbildung 3-13 zeigen die aufgetrennten, immunpräzipitierten

Proben der radioaktiven Protease-Mappings. Aus den Proben der Konstrukte gp9T7SD

in (A) wie auch gp9T7repSD in (B), die nicht mit Proteinase K (Proteinase K -)

behandelt wurden, konnten gp9 Proteine mit T7-Epitopen ( ) nachgewiesen werden.

Aus den Proben in (A) und (B), welche mit Proteinase K (Proteinase K +) behandelt

wurden, war keine entsprechende Proteinbande detektierbar. Dass es sich jeweils um

die exprimierten gp9T7-Konstrukte handelte, ergab sich aus dem Vergleich mit den anti-

T7 behandelten Kontrollen (K) in Abbildung 3-13 (A, B), welche ebenfalls keine Banden

auf dieser Höhe zeigten. Somit konnte gezeigt werden, dass die gp9T7-Konstrukte in

die Zytoplasmamembran von E. coli K38 transloziert wurden. Dass die Unversehrtheit

der Spheroplasten gegeben sowie die Protease aktiv war, ergab sich aus der, trotz Pro-

teinase K Verdau, ungeschnittenen zytosolischen Kontrolle GroEL und dem Verdau der

Kontrolle OmpA, welche in der äußeren Membran von E. coli lokalisiert ist.

3.3.5 Nachweis der exprimierten gp9 Konstrukte im M13-Phagen

Nachdem in Komplementations- (Kap. 3.3.1), Expressions- (Kap. 3.3.2; 3.3.3) und

Translokationsexperimenten (Kap. 3.3.4) gezeigt werden konnte, dass die gp9-Kon-

strukte in der E. coli-Zelle synthetisiert und für die Assemblierung neuer M13-Phagen-

Nachkommen in der Zytoplasmamembran vorhanden waren, sollte der Einbau der

modifizierten gp9 Proteine über die Detektion der antigenen Epitope am Phagen nach-

gewiesen werden. Der Nachweis erfolgte zuerst durch Immun-Dot-Blot von, auf Nitro-

zellulosemembran, immobilisierten und komplementierten M13am9-M7-Phagen mittels

spezifischer Seren gegen die T7- und HA-Epitope. In einem ergänzenden Experiment

sollten die antigenen Epitope an den M13am9-M7-Phagen mit Hilfe von Protein-A

konjugiertem Gold markiert und anschließend am TEM visualisiert werden.

3.3.5.1 Nachweis der exprimierten gp9-Konstrukte im M13-Phagen mit Hilfe von

Immun-Dot-Blots

Der Nachweis, dass die konstruierten gp9 Proteine in die Hülle der M13-Phagen

eingebaut wurden, sollte durch Detektion der antigenen Epitope in der N-terminalen

Ergebnisse

127

Domäne der gp9-Proteine erfolgen. Um dies zu ermöglichen wurden zuerst, wie in

Kapitel 2.8.38 beschrieben, Komplementationen von M13am9-M7-Phagen durchge-

führt. Die Batch-Kulturen der transformierten E. coli K38-Zellen (Tabelle 3-7) wurden

nach IPTG-Induktion (1mM Endkonzentration) mit M13am9-M7-Phagen infiziert (M.O.I.

5) und über Nacht bei 37°C kultiviert. Die Abtrennung der komplementierten M13-

Phagen von den Bakterien erfolgte durch die Zentrifugation der Batch-Kulturen. Von

den phagenhaltigen Überständen wurden dann, wie in Kapitel 2.8.38 beschrieben,

Verdünnungsreihen so hergestellt, dass in 400 µl Entnahmevolumen eine Anzahl von

108 pfu bis 106 pfu vorhanden waren. Damit ausgeschlossen werden konnte, dass die

exprimierten Proteine in den E. coli-Zellen keine Signalverfälschung während der

Detektion der Epitope an den Phagen verursachten, wurden von den Überständen der

proteinexprimierenden, nicht infizierten Übernachtkulturen, den Phagenstammlösungen

entsprechend, Verdünnungsstufen (10-1 – 10-3) hergestellt. Anschließend wurden je

400 µl der verdünnten Lösungen mit Hilfe einer Dot-Blot Apparatur auf Nitrozellulose-

membranen adsorbiert. Die Membranen wurden anschließend, wie in Kapitel 2.8.38

erläutert, zuerst mit spezifischen primären und dann mit Meerrettichperoxidase gekop-

pelten Sekundärantikörpern zur Detektion der T7- und HA-Epitope inkubiert. Der

Nachweis der Epitope in den Phagen erfolgte anschließend mittels Chemolumineszenz.

In Abbildung 3-14 sind die Ergebnisse der durchgeführten Immun-Dot-Blots zu sehen.

Um ausschließen zu können, dass es sich bei den Detektionen der antigenen Epitope in

den komplementierten M13am9-M7-Phagen um Signale bzw. Signalverfälschungen von

unspezifisch gebundenen Primärantikörpern handelte, erfolgte zuerst die Inkubation des

Phagenstamms M13am9-M7 mit anti-T7 und anti-HA Serum. Die Immun-Dot-Blots der

adsorbierten Verdünnungsreihen von 108 pfu/400 µl bis 106 pfu/400 µl in (A), welche mit

anti-T7 und anti-HA Serum behandelt wurden, zeigten, dass die Inkubation mit diesen

Seren keine unspezifischen Bindungen bewirkte. Dass in den verwendeten Verdünnun-

gen Phagen vorhanden waren, zeigte der Nachweis des Haupthüllproteins gp8. Mit

Hilfe des anti-gp8 Serums konnten hier bis zu einer Verdünnung von 106 pfu/400 µl

M13am9-M7-Phagen detektiert werden.

Dass in den Verdünnungsreihen der darauf folgenden spezifischen Epitopdetektionen

der Phagenkonstrukte Phagen vorhanden waren, zeigte der Immun-Dot-Blot in

Abbildung 3-14 (B1). Hier erfolgte der Nachweis der Phagen ebenfalls durch Detektion

des Haupthüllproteins gp8 in den jeweils verwendeten Verdünnungen mit Hilfe von anti-

gp8 Serum.

Ergebnisse

128

Abb. 3-14: Immun-Dot-Blot der M13am9-gp9-Konstrukte. Um die antigenen Epitope an den N-termi-nalen Domänen der gp9-Konstrukte im M13-Phagen nachweisen zu können, wurden Komplementationen von M13am9-M7 Phagen in E. coli K38 Flüssigkulturen durchgeführt, welche die veränderten Konstrukte exprimierten. Die erhaltenen Phagenstammlösungen wurden so verdünnt, dass 400 µl der Lösungen 10

8

pfu bis 106 pfu enthielten. Je 400 µl der Lösungen wurden mit Hilfe einer Dot-Blot Apparatur auf Nitrozel-

lulosemembranen adsorbiert. Die Membranen wurden mit spezifischen Primär- (anti-gp8, anti-T7 bzw. anti-HA) und Sekundärantikörpern behandelt und die antigenen Epitope mittels Chemolumineszenz nachgewiesen. Als Kontrollen wurden von den Überständen der gp9 exprimierenden, nicht infizierten Übernachtkulturen, den Phagenstammlösungen entsprechend, Verdünnungsstufen (10

-1 – 10

-3) herge-

stellt und davon 400 µl adsorbiert (B2-D2). Hier konnten in keiner der Proben Signale detektiert werden. (A) Zur Überprüfung der unspezifischen Bindungen von anti-T7 und anti-HA Serum an unmodifizierte M13-Phagen wurde M13am9-M7 verwendet. Hier konnten keine Bindungen detektiert werden. Die Prä-senz der Phagen in den verwendeten Phagenlösungen wurde mit Hilfe des primären Antikörpers anti-gp8 überprüft. (B1) Kontroll-Blot gegen das Haupthüllprotein gp8. Hier konnten Phagen in den einzelnen ver-wendeten Konstruktphagenlösungen nachgewiesen werden. Detektion der antigenen Epitope der M13am9-M7-Mono-Tag-Konstrukte (C1) bis 10

8 und der Doppel-Tag-Konstrukte (D1) bis maximal 10

7

Phagen/400 µl.

M13am9

M13am9T7

M13am9T7rep

M13am9DT7

M13am9DT7rep

M13am9HA

M13am9HArep

M13am9DHA

M13am9DHArep

AK: αgp8

AK: αT7

AK: αHA

M13am9T7

M13am9T7rep

M13am9HA

M13am9HArep

(A)

(B1)

(C1)

(D1)

PFU 10-1 10-2 10-3

Kontrolle: Nichtinfizierte Flüssigkulturüberstände

E.c. + pMSg9T7

E.c. + pMSg9T7rep

E.c. + pMSg9DT7

E.c. + pMSg9DT7rep

E.c. + pMSg9HA

E.c. + pMSg9HArep

E.c. + pMSg9DHArep

E.c. + pMSg9DHA

E.c. + pMSg9T7

E.c. + pMSg9T7rep

E.c. + pMSg9HA

E.c. + pMSg9HArep

E.c. + pMSg9DT7

E.c. + pMSg9DT7rep

E.c. + pMSg9DHA

E.c. + pMSg9DHArep

(B2)

(C2)

(D2)

M13am9DT7rep

M13am9DT7

M13am9DHA

M13am9DHArep

AK: αT7

AK: αHA

PFU 108 107 106

AK: αgp8 AK: αT7

PFU 108 107 106

AK: αHA

PFU 108 107 106

PFU 108 107 106

Ergebnisse

129

In den verwendeten Phagenverdünnungen konnten bis zu einer Verdünnung von

106 pfu/400 µl Phagen nachgewiesen werden. Die adsorbierten, den Verdünnungen der

Phagenstammlösungen entsprechenden, Verdünnungsreihen der Überstände induzier-

ter, jedoch nicht infizierter Übernachtkulturen in Abbildung 3-14 (B2), zeigten keine

Signale. Hierdurch konnte ausgeschlossen werden, dass die verwendeten Kulturen mit

wildtypischen M13-Phagen infiziert waren. Bei den adsorbierten M13am9-M7-Phagen

mit Mono-Tag-Konstrukten (C1) konnten T7- und HA-Epitope maximal nur bis zu einer

Anzahl von 108 pfu/400 µl nachgewiesen werden. Im Vergleich hierzu ließen sich, bis

auf das Konstrukt M13am9DT7, in den M13am9-M7-Phagen mit Doppel-Tag-

Konstrukten die Epitope noch schwach bis zu einer Anzahl von 107 pfu/400 µl detek-

tieren. Dass die in Abbildung 3-14 (C1) und (D1) erhaltenen Signale nicht durch die

Präparationsmethodik der jeweiligen gp9-exprimierenden E. coli-Zellen verursacht

wurden, zeigten die adsorbierten Überstände der verwendeten Flüssigkulturen in

Abbildung 3-14 (C2) und (D2), welche keine Signale mit den jeweils verwendeten

primären Antikörpern aufwiesen.

3.3.5.2 Nachweis der exprimierten gp9 Doppel-Tag-Konstrukte im M13-Phagen

durch Markierung mit Protein-A konjugiertem Gold

In Kapitel 3.3.5.1 konnte gezeigt werden, dass alle, über Komplementation herge-

stellten, M13am9T7- und HA-Konstrukte detektierbare Epitope im Phagen besaßen. Mit

Hilfe von Protein-A konjugiertem Gold sollten hier, wie in Kapapitel 3.2.1 für das Haupt-

hüllprotein gp8, die Doppel-T7- und Doppel-HA-Epitope durch Markierung der M13-

Phagen detektiert und am Transmissionselektronenmikroskop (TEM) visualisiert werden

(Kap. 2.8.29). Dafür wurden 100 µl aus den Phagenstammlösungen aus Kapitel 3.3.5.1,

wie in Kapitel 2.8.30 beschrieben, mit 3 µl primären Antikörpern, entweder mit anti-T7

oder anti-HA, für 1 Stunde inkubiert. Der Nachweis der an die M13-Phagen gebun-

denen Primärantikörper erfolgte mittels 1/20 verdünntem Protein-A konjugiertem Nano-

gold (Kap. 2.8.30). Zur Überprüfung der unspezifischen Bindung von Protein-A konju-

giertem Nanogold an M13am9-M7-Phagen erfolgte in einer parallel angefertigten Probe

die Inkubation ausschließlich mit Protein-A konjugiertem Nanogold. Von diesen

Ansätzen wurden dann jeweils 10 µl auf Trägernetzchen aus Kupfer adsorbiert und eine

Negativkontrastierung mit Phosphorwolframsäure (5 %, pH 7) durchgeführt (Kap.

2.8.27). Die kontrastierten Proben wurden anschließend am TEM untersucht. Die

Ergebnisse der Immunogold-Markierungen sind in Abbildung 3-15 zu sehen.

Ergebnisse

130

Abb. 3-15: TEM-Aufnahmen von M13am9 Doppel-Tag-Phagen, kontrastiert mit 5 % Phos-phorwolframsäure (pH 7). Die Phagen wurden mit anti-T7 oder anti-HA Serum und anschließend, zur Detektion gebundener Erstantikörper, mit Protein-A konjugiertem Nanogold (20 nm Durchmesser) in-kubiert. (A) M13am9-Phage mit Doppel-T7-Epitop an gp9. Hier wurde ein Nanogoldpartikel polar am M13-Phagen gebunden. (B) M13am9-Phagen mit Doppel-T7rep-Epitop an gp9. Hier wurden zwei Nanogoldpartikel polar am M13-Phagen gebunden. (C) M13am9-Phagen mit Doppel-HA-Epitop an gp9. Hier wurde ein Goldpartikel polar am M13-Phagen gebunden. (D) M13am9-Phage mit Dop-pel-HArep-Epitop an gp9. Hier wurde ein Nano-goldpartikel polar am M13-Phagen gebunden. (E) M13am9-Phagen, die ausschließlich mit Protein-A konjugiertem Nanogold inkubiert wurden. An den Phagen wurden keine Goldpartikel gebunden. Die Längen der Skalierungsbalken betragen 500 nm.

A B

C D

E

Ergebnisse

131

Die Abbildung 3-15 (A – D) zeigt TEM-Aufnahmen von M13am9-M7-Phagen mit

Doppel-Tag-gp9-Konstrukten. Die Längen der dargestellten Skalierungsbalken in den

hier gezeigten Aufnahmen betragen 500 nm. Phagen mit T7-Tags wurden zuvor mit

anti-T7 und Phagen mit HA-Tags mit anti-HA Serum inkubiert, bevor die Inkubation mit

Protein-A konjugiertem Nanogold erfolgte. In Abbildung 3-15 (A) ist ein ~ 1 µm langer

M13am9-M7-Phage mit Doppel-T7-Epitop zu sehen, an dem polar ein Nanogoldpartikel

mit 20 nm Durchmesser gebunden wurde. In Abbildung 3-15 (B) sind M13am9-M7-

Phagen mit Doppel-T7rep-Epitop zu sehen, hier wurden an einem M13am9-M7-Phagen

zwei Nanogoldpartikel polar gebunden. Abbildung 3-15 (C) zeigt M13am9-M7-Phagen

mit Doppel-HA-Epitop. An einem Phagen wurde polar ein Nanogoldpartikel gebunden.

In Abbildung 3-15 (D) ist ein ~ 1 µm langer M13am9-M7-Phage mit Doppel-HArep-

Epitop zu sehen, an dem ebenfalls polar ein Nanogoldpartikel gebunden werden

konnte. Die TEM-Aufnahme der Probe in Abbildung 3-15 (E) zeigt M13am9-M7-

Phagen, die nicht mit primären Antikörpern sondern nur mit Protein-A konjugiertem

Nanogold inkubiert wurden. An diesen M13-Phagen wurden keine Nanogoldpartikel

unspezifisch gebunden.

3.3.6 Translokation des Konstrukts gp9T7SD in Abhängigkeit von der E. coli

Membraninsertase YidC

Das YidC-Protein von E. coli ist eine, in der Zytoplasmamembran lokalisierte, Membran-

insertase, welche die Translokation essenzieller E. coli eigener Membranproteine

katalysiert. YidC kann eigenständig oder zusammen mit dem SecYEG Translokations-

kanal der Sec-Translokase Proteine in die Zytoplasmamembran inserieren. Für das

M13-Haupthüllprotein gp8 konnte gezeigt werden, dass dessen Insertion in die Zyto-

plasmamembran nicht durch den bakteriellen Sec-Translokaseapparat katalysiert wird

(Kuhn, 1988), sondern vom Membranpotential und YidC abhängig ist. Das „Minor Coat“

Protein gp9 ist mit einer Länge von 32 Aminosäuren das kleinste Protein unter den

M13-Hüllproteinen. Im Vergleich zum Haupthüllprotein gp8 besitzt es keine N-terminal

abspaltbare Signalsequenz („Leadersequenz“).

Hier sollte, mit Hilfe des durch Proteinase K abspaltbaren antigenen T7-Epitops, die

Abhängigkeit der gp9 Membraninsertion von der Membraninsertase YidC in vivo radio-

aktiv mit Hilfe von „Pulse“-Experimenten (Kap. 2.8.40) und anschließendem Protease-

Mapping überprüft werden. Wie in Kapitel 3.3.4 gezeigt wurde, lassen sich die inse-

rierten Epitope in den gp9-Konstrukten durch Proteinase K proteolytisch abspalten.

Ergebnisse

132

Durch die Verwendung des Bakterienstamms E. coli JS7131, in dem die genomische

YidC-Expression unter Kontrolle des araBAD Promotors steht, kann die YidC-

Expression in diesen Zellen durch Arabinose (Expression) bzw. Glukose (keine

Expression) reguliert werden. Falls die gp9T7-Insertion eine von YidC abhängige

Translokation aufweist, sollte während des Protease-Mappings, bei Abwesenheit von

YidC, keine Prozessierung des N-terminalen antigenen Epitops erfolgen und dadurch

das Protein sich anhand einer Immunpräzipitation aus den Zelllysaten isolieren und

nachweisen lassen. Für den YidC abhängigen Translokationsnachweis wurden E. coli

JS7131-Zellen mit dem Konstrukt pMSg9T7SD transformiert und eine Einzelkolonie in

M9-Minimalmedium bis zur frühen logarithmischen Wachstumsphase bei 37°C kultiviert.

Die gewachsene E. coli-Kultur wurde dann zur Herstellung zweier Flüssigkulturen

verwendet. Zum Medium der ersten Kultur wurde Arabinose (Ara, 0,2 % Endkon-

zentration) zugesetzt, um YidC wildtypisch in den Zellen zu exprimieren.

Der zweiten Kultur wurde Glukose (Glc, 0,2 % Endkozentration) zum Medium zuge-

setzt, um die YidC-Expression für 120 Minuten zu depletieren. Nach Erreichen des

Bakterientiters von 2 x 108 Bakterien/ml erfolgte, wie in Kapitel 2.8.40 beschrieben, eine

Probenentnahme aus den Kulturen für den Nachweis der YidC-Expression. Die Proben

wurden dann durch TCA-Zugabe präzipitiert. Anschließend erfolgte die Auftrennung der

Proben über eine SDS-PAGE (Kap. 2.8.35). Die YidC-Expression in den Kulturen wurde

mit Hilfe eines Western-Blots (Kap. 2.8.37) nachgewiesen (Abb. 3-16). Als Kontrolle (K)

diente gereinigtes YidC, das den gefällten Proben gegenüber gestellt wurde.

Für den Translokationsnachweis wurden in den restlichen Proben die Expression der

gp9-Konstrukte durch Zugabe von IPTG (1mM Endkonzentration) zum Kulturmedium

induziert. Nach 10 Minuten erfolgte die Markierung der in der Synthese befindlichen

Proteine für weitere 10 Minuten durch Zugabe von 20 µCi [35S]-Methionin („Pulse“).

E. coli JS7131 K

Ara Glc

YidC-10xHis

YidC

Abb. 3-16: Western-Blot Analyse der YidC-Expressionen in E. coli JS7131. Die TCA-präzipitierten Proben wurden durch SDS-PAGE (12 %) aufgetrennt und exprimiertes YidC durch Western-Blot und anti-YidC Serum nachgewiesen. Gereinigtes YidC mit 10x His-Tag diente als Kontrolle (K). In der in 0,2 % Arabinose (Ara) kultivierten Kultur wurde YidC exprimiert; in der in 0,2 % Glukose (Glc) kultivierten Kultur konnte keine YidC-Expression nachgewiesen werden.

Ergebnisse

133

Die Proben wurden dann, wie in Kapitel 2.8.39 beschrieben, einem Protease-Mapping

unterzogen, in welchem die radioaktiv markierten Proteine in den Spheroplasten der

gp9-exprimierenden Zellen, durch Zugabe von Proteinase K, einer proteolytischen

Prozessierung ausgesetzt wurden. Nach der Proteolyse erfolgte die Präzipitation der

Proben mit TCA und darauf folgender Immunpräzipitation (Kap. 2.8.39) unter Verwen-

dung von anti-T7 Serum zur Isolierung der T7-Konstrukte aus den Zelllysaten. Die

immunpräzipitierten Proteine wurden mittels SDS-Tricin-PAGE (Kap. 2.8.35) aufge-

trennt und die radioaktiv markierten Proteine anschließend durch Phosphorimaging

(Kap. 2.8.41) detektiert (Abb. 3-17). Als Kontrolle (K) wurden mit pMS119EH trans-

formierte E. coli JS7131-Zellen ebenfalls radioaktiv markiert und anschließend mit anti-

T7 Serum immunpräzipitiert. Das äußere Membranprotein OmpA sowie das zyto-

solische Chaperon GroEL der E. coli-Zelle dienten bei diesem Translokationsversuch

als interne Kontrolle, um die Funktionalität der hergestellten Spheroplasten und die

Aktivität der Protease überprüfen zu können.

Glc

Ara

Proteinase K: - + - - + - +

Proteinase K: - + - + - +

gp9T7SD K OmpA GroEL

Abb. 3-17: Protease-Mapping des Konstrukts gp9T7SD in E. coli JS7131. Für den Translokations-nachweis des gp9T7SD Konstrukts wurden transformierte E. coli JS7131-Kulturen in M9-Minimalmedium mit 0,2 % Arabinose (Ara) bzw. mit 0,2 % Glukose (Glc; 120 min Depletion) bei 37°C bis zu einem Bakte-rientiter von 2 x 10

8 Zellen/ml kultiviert. Die Expression des plasmidkodierten Konstrukts erfolgte durch

Zugabe von IPTG (1 mM Endkonzentration). Nach 10-minütiger Induktion wurden die Kulturen mit 20 µCi [35

S]-Methionin für 10 Minuten radioaktiv markiert („Pulse“) und anschließend einem Protease-Mapping unterzogen. Nach Proteinase K Verdau und Immunpräzipitation mit anti-T7 Serum folgte die Auftrennung der radioaktiv markierten Proben über eine SDS-Tricin-PAGE (16,5 %) mit anschließendem Phosphor-imaging. Als Kontrolle (K) wurde eine mit pMS119EH transformierte E. coli JS7131-Kultur mit anti-T7 Serum immunpräzipitiert. In den in Glukose kultivierten Zellen (A) konnte gp9T7SD ( ) sowohl in der nicht mit Proteinase K behandelten als auch in der mit Proteinase K behandelten Probe nachgewiesen werden. Im direkten Vergleich konnte in den in Arabinose kultivierten Zellen (B) nur in der nicht mit Proteinase K behandelten Probe exprimiertes gp9T7SD ( ) nachgewiesen werden. Dies zeigte, dass unter wildtypischen Bedingungen (YidC-Expression) das gp9T7SD in die Zytoplasmamembran trans-loziert und hierfür YidC benötigt wird. Dass es sich jeweils um die gp9-Konstrukte handelte, ergab sich aus der Kontrolle (K), welche auf Höhe des gp9 keine Proteinbanden zeigte. Dass die Integrität der Spheroplasten gegeben war ergab sich aus der, trotz Proteinase K Verdau, unprozessierten Kontrolle GroEL. Die Funktionalität der Protease zeigte der Abbau der OmpA-Kontrolle.

(A)

(B)

Ergebnisse

134

Aus den präzipitierten Proben wurden 10 % des Probenvolumens entnommen und mit

anti-OmpA und anti-GroEL Serum koimmunpräzipitiert, um die Integrität der Sphero-

plasten überprüfen zu können. Bei intakten Spheroplasten kann das zytosolische GroEL

nicht durch Proteinase K proteolytisch prozessiert werden, während OmpA in der

äußeren Membran vollständig abgebaut wird.

Die Western-Blot Analyse der YidC-Expressionen in E. coli JS7131 (Abb. 3-16) zeigte,

dass die in 0,2 % Arabinose (Ara) kultivierten Zellen YidC exprimierten (siehe Pfeil),

während die Expression von YidC in den in 0,2 % Glukose (Glc) gewachsenen Zellen

depletiert war und kein YidC detektiert werden konnte. Die Autoradiogramme in

Abbildung 3-17 zeigen die aufgetrennten, immunpräzipitierten Proben der radioaktiven

Protease-Mappings. Aus den in Glukose kultivierten Zellen (Abb. 3-17 (A)) konnte das

Konstrukt gp9T7SD ( ) sowohl in der mit Proteinase K behandelten, als auch in der

unbehandelten Probe mit Hilfe von anti-T7 Serum während der Immunpräzipitation

nachgewiesen werden. Das T7-Epitop wurde in beiden Proben nicht proteolytisch

prozessiert. Im Vergleich hierzu konnte in den in Arabinose kultivierten Zellen (Abb.

3-17 (B)) das gp9T7SD-Konstrukt nur in der nicht mit Proteinase K behandelten Probe

mit anti-T7 Serum nachgewiesen werden ( ). Die Prozessierung des T7-Epitops in

der mit Proteinase K behandelten Probe zeigte, dass gp9T7SD in Anwesenheit von

YidC in die Zytoplasmamembran von E. coli JS7131 eingebaut wurde. Dass es sich

jeweils um die exprimierten gp9T7SD-Proteine handelte, ergab sich aus dem Vergleich

mit der anti-T7 behandelten Kontrolle (K) (Abb. 3-17 (A)), welche ebenfalls keine

Banden auf dieser Höhe zeigte. Dass die Unversehrtheit der Spheroplasten gegeben

sowie die Protease aktiv war, ergab sich aus der, trotz Proteinase K Verdau, unge-

schnittenen zytosolischen Kontrolle GroEL und dem Abbau der OmpA-Kontrolle, welche

in der äußeren Membran von E. coli lokalisiert ist. Das Protease-Mapping in Abbildung

3-17 (B) zeigte zudem wiederholt in Übereinstimmung mit Kapitel 3.3.4, dass auch hier

das gp9 mit inseriertem T7-Epitop in die Zytoplasmamembran von E. coli eingebaut

wurde.

Abschnitt 4:

Das Gen 1 des Phagen M13 kodiert sowohl das integrale Membranprotein gp1 als auch

das integrale Membranprotein gp11. Nach Spekulationen von Russel et al. (2004)

bilden diese Proteine vermutlich in der inneren Wirtsmembran einen multimeren Kom-

plex aus jeweils 5 – 6 der einzelnen Moleküle. Dieser Komplex ist für die Assemblierung

Ergebnisse

135

neuer Phagen-Nachkommen essenziell (Silver & Wickner, 1980, Rapoza & Webster,

1995, Marvin 1998). Da weder das Gewicht noch die Größe dieses Assembly-

Komplexes bekannt sind, sollte in diesem Abschnitt zur Gewinnung neuer Daten, mit

Hilfe einer Überexpression der Phagenproteine gp1/11 in E. coli-Zellen, die Masse des

Komplexes durch eine präparative Gelfiltration bestimmt und die gereinigten Komplexe

durch TEM-Aufnahmen visualisiert und analysiert werden.

3.4 Massenbestimmung des gp1/11-Assembly-Komplexes und TEM-Auf-

nahmen der gereinigten Komplexe

Bei den Proteinen gp1 und gp11 handelt es sich um integrale Membranproteine, die in

der Zytoplasmamembran von E. coli den M13 Assembly-Komplex bilden. Dieser

Komplex bildet zusammen mit dem gp4-Porenkomplex in der äußeren Membran von

E. coli einen gp1/11-gp4-Sekretionskomplex (Rapoza & Webster, 1995, Feng et al.,

1999, Haigh & Webster, 1999), durch welchen die M13-Phagen in die äußere Umge-

bung sekretiert werden. Für die Bestimmung der Masse des gp1/11-Assembly-Kom-

plexes sollten diese Proteine in E. coli C41-Zellen überexprimiert und anschließend aus

den Zelllysaten gereinigt werden. Um ausreichende Mengen an gp1/11-Komplexen zu

erhalten, wurde der Bakterienstamm E. coli C41 in Kombination mit dem Vektor pET-

16b gewählt. Mit diesem Expressionssystem können durch Überexpression größere

Proteinmengen synthetisiert und anschließend gereinigt werden. Vor der „Multiple

Cloning Site“ (MCS) enthält das Plasmid pET-16b einen T7 RNA-Polymerase Promotor

und eine ϕ10 Shine-Dalgarno-Sequenz, so dass in speziellen E. coli-Stämmen wie C41,

welche die T7 RNA-Polymerase exprimieren, gezielt klonierte Gene mit hoher Effizienz

translatiert und so Proteine auf diesem Weg überexprimiert werden können. Zusätzlich

enthält die MCS eine 10x His-Tag Sequenz, welche nach Klonierung N-terminale His-

Tag Fusionsprodukte liefert. Diese Fusionsprodukte können dann anhand immobili-

sierter Metallaffinitätschromatographie (IMAC) aus den Zelllysaten isoliert werden.

3.4.1 Überexpression und Identifikation des M13 gp1/11-Assembly-Komplexes in

E. coli C41

Zur Konstruktion des gp1/11-Expressionssystems wurde das für gp1/11 kodierende

Gen 1 durch PCR aus dem Phagengenom amplifiziert und anschließend in die MCS

von pET-16b kloniert. Aus dieser Klonierung ging das Konstrukt pETgp1/11 hervor

(Kap. 2.8.17). Daraufhin erfolgte die Überprüfung der gp1/11-Expression in den E. coli-

Ergebnisse

136

Zellen sowie die Ermittlung der nach der Induktion optimalen Kultivierungsdauer,

während der die höchste Menge an Proteinen erhalten wurde (Kap. 2.8.32). Hierfür

erfolgte die Transformation des Vektors pETgp1/11 in E. coli C41. Von den auf ampicil-

linhaltigen LB-Agarplatten gewachsenen Transformanten wurde eine Einzelkolonie zur

Beimpfung von 2 ml Flüssigkulturen verwendet. Die Kultivierung der Flüssigkulturen

erfolgte bei 37°C unter Schütteln bis zu einem Bakterientiter von 2 x 108 Bakterien/ml,

woraufhin die Expression der Proteine durch Zugabe von IPTG (1mM Endkonzen-

tration) zu den Flüssigkulturen induziert wurde. Nach weiterer Kultivierung bei 37°C

erfolgten die Präzipitationen der Kulturen durch Zugabe von TCA nach 2 h, 4 h und 5 h.

Anschließend wurden die Proben durch SDS-PAGE (Kap. 2.8.35) aufgetrennt und die

exprimierten gp1- und gp11-Proteine mit Hilfe eines Western-Blots (Kap. 2.8.37), unter

Verwendung von anti-gp1/11 Serum gegen die C-terminale Domäne der Proteine,

identifiziert. Als Kontrollen wurden Kulturen von nicht transformierten E. coli C41-Zellen,

sowie mit pET-16b und pETgp1/11 (nicht induziert) transformierten Zellen ebenfalls mit

TCA präzipitiert.

Mit Hilfe der Western-Blot Analyse in Abbildung 3-18 konnte, unter Verwendung des

anti-gp1/11 Serums, die Expression von gp1 ( ) und gp11 ( ) in E. coli C41 nachge-

wiesen werden. In E. coli C41 (K1), E. coli C41 mit pET-16b Vektor (K2) und E. coli C41

mit pETgp1/11 Vektor, jedoch nicht induziert (K3), wurden keine Expressionen von gp1

und gp11 nachgewiesen. Der Vergleich der nach 2 h, 4 h und 5 h präzipitierten Proben

zeigte, dass die Probe mit 2-stündiger Kultivierung nach erfolgter Induktion bei 37°C die

höchsten Mengen an gp1 und gp11 aufwies. Nach 4 h bzw. 5 h Expression nahmen die

Proteinmengen deutlich ab.

K1 K2 K3 2 h 4 h 5 h Abb. 3-18: Western-Blot Nachweis von exprimiertem gp1 und gp11 in E. coli C41: Mit pETgp1/11 transformierte E. coli C41-Zellen wurden bei 37°C bis zu einem Bakterientiter von 2 x 10

8 Zellen/ml kultiviert. Die Expression von gp1 und gp11

erfolgte durch Zugabe von IPTG (1 mM Endkonzentration) zu den 2 ml Flüssigkulturen. Nach 2 h, 4 h und 5 h Expression wurden die Kulturen durch TCA präzipitiert und anschließend über eine 12 %ige SDS-PAGE aufgetrennt. Der Nachweis von exprimiertem gp1 und gp11 erfolgte mit Hilfe eines Western-Blots unter Ver-wendung von anti-gp1/11 Serum gegen die C-terminale Domäne der Proteine. Als Kontrollen wurden Kulturen von nicht trans-formierten E. coli C41-Zellen (K1), sowie mit pET-16b (K2) und pETgp1/11 (K3; nicht induziert) transformierten Zellen aufge-tragen. In den Proben mit 2 h, 4 h und 5 h Expression konnte sowohl gp1 ( ) als auch gp11 ( ) nachgewiesen werden. Im Vergleich dazu erfolgte in den Kontrollen K1 – K3 keine gp1 und gp11-Expression.

130 100 70 55 40 35

25

15

10

Ergebnisse

137

3.4.2 Reinigung überexprimierter M13 gp1/11-Assembly-Komplexe aus E. coli

C41 mittels Metallaffinitätschromatographie (IMAC)

In Kapitel 3.4.1 wurde gezeigt, dass in E. coli C41-Zellen, welche zuvor mit dem Kon-

strukt pETg1/11 transformiert wurden, die Expression von gp1 und gp11 durch IPTG

induzierbar war und nach 2-stündiger Kultivierung die höchsten Proteinmengen erhalten

wurden. Nach erfolgreicher Expression folgte nun die Reinigung der gp1/11-Assembly-

Komplexe aus E. coli C41. Durch die Klonierung des Gens 1 in die „Multiple cloning

site“ (MCS) von pET-16b entstehen bei der Expression von gp1-Fusionsproteine mit

N-terminalem 10x His-Tag. Gp11 ist das Produkt einer internen Initiierung innerhalb des

Gens 1 und bildet dadurch keine Fusionsproteine mit N-terminalem His-Tag. Während

der Reinigung der exprimierten Komplexe aus der Zytoplasmamembran, mittels immo-

bilisierter Metallaffinitätschromatographie (IMAC), können die Komplexe anhand des

N-terminalen His-Tags der gp1-Fusionsproteine isoliert werden.

Für die Überexpression (Kap. 2.8.32) und anschließende Reinigung der Komplexe

(Kap. 2.8.33) wurde das Konstrukt pETg1/11 in E. coli C41 transformiert. Die Reinigung

erfolgte zuerst aus einer 2 L und anschließend nochmals aus einer 4 L LB-Batch-Kultur,

um die Menge an exprimierten gp1/11-Assembly-Komplexen zu erhöhen. Bei allen

durchgeführten Expressionen wurden die Zellen bei 37°C bis zu einer Zelldichte von

2 x 108 Bakterien/ml kultiviert. Die Expression des plasmidkodierten gp1 und gp11

erfolgte durch Zugabe von IPTG (1mM Endkonzentration) zum Kulturmedium. Die

Zellen wurden nach Induktion für weitere 2 h bei 37°C kultiviert und nach anschlie-

ßender Zentrifugation in Tris-Sucrose Lösung (25% Sucrose in 20 mM Tris pH 7,5)

aufgenommen.

Um die in der Zytoplasmamembran lokalisierten gp1/11-Assembly-Komplexe reinigen

zu können, wurden die Zellen im „French Press“-Verfahren aufgeschlossen und die

Zellmembranen unter Verwendung von 3,5 % des zwitterionischen Detergenzes Fos-

cholin 12 (n-Dodecylphosphocholin) solubilisiert. Die Reinigung des gp1/11-Assembly-

Komplexes erfolgte anschließend über den N-terminal fusionierten His-Tag der gp1-

Fusionsproteine mit Hilfe einer Ni-NTA-Säule. Die solubilisierte Proteinfraktion wurde

nach Zugabe von Ni-NTA-Agarose für 2 h unter Rotation bei 7°C inkubiert, damit die

Interaktion zwischen den His-Tags und der Ni-NTA-Matrix erfolgen konnte. Nach Inku-

bation wurde die Ni-NTA-Agarose als Säulenmaterial in eine Spritzenhülse gegeben

und eine Ni-NTA-Säule hergestellt. Im „Gravity flow“-Verfahren wurde anschließend das

Säulenmaterial mit Hilfe ansteigender Imidazolkonzentrationen in den Waschpuffern

Ergebnisse

138

von unspezifisch gebundenen Proteinen gereinigt. Danach folgte die Elution gebun-

dener Proteine von der Ni-NTA-Matrix mit einer Imidazolkonzentration von 300 mM. Im

Verlauf der Reinigungen wurden Proben (à 50 µl) entnommen, um den Verbleib der

gp1- und gp11-Proteine während der einzelnen Reinigungsphasen überprüfen zu

können. Die Proben wurden durch Zugabe von TCA präzipitiert und anschließend durch

SDS-PAGE aufgetrennt (Kap. 2.8.35). Die Identifikation der gp1- und gp11-Proteine

erfolgte über eine Western-Blot Analyse (Kap. 2.8.37) unter Verwendung von anti-

gp1/11 Serum. Um den einzelnen Proteinbanden ein Molekulargewicht zuordnen zu

können, wurde ein Proteinstandard aufgetragen.

Das Coomassie gefärbte SDS-Gel in Abbildung 3-19 (A) zeigte, dass in der Elutions-

fraktion (E) während der Metallaffinitätschromatographie drei Proteine aus der solubili-

sierten Proteinfraktion gereinigt werden konnten. Mit Hilfe des Proteinstandards (M)

konnten für die eluierten Proteine näherungsweise die Molekulargewichte ermittelt

werden. Das Molekulargewicht der oberen Bande ( ) betrug ~ 39 kDa, das der mittleren

( ) ~ 37 kDa und das der unteren ( ) ~ 31 kDa. Auffällig war, dass die Intensität

der ~ 39 kDa Bande ( ) mit der ~ 31 kDa Bande ( ) vergleichbar war.

Abb. 3-19: SDS-PAGE und Western-Blot Analyse der gp1/11-Assembly-Komplex Reinigung aus E. coli C41 (2 L Flüssigkultur). Gp1/11-exprimierende E. coli C41-Zellen wurden mittels „French Press“-Verfahren aufgeschlossen und die Membranen unter Verwendung von 3,5 % des zwitterionischen Detergenzes Fos-cholin 12 (n-Dodecyl-phosphocholin) solubilisiert. Die Reinigung des gp1/11-Assembly-Komplexes erfolgte anschließend über den N-terminalen His-Tag der gp1-Fusionsproteine mit Hilfe einer Ni-NTA-Säule. Im Verlauf der Reinigung wurden 50 µl Proben entnommen, um den Verbleib der gp1- und gp11-Proteine während der einzelnen Reinigungsschritte überprüfen zu können. Die Proben wurden dann nach TCA-Fällung über eine 12 %ige SDS-PAGE aufgetrennt. M = Proteinstandard (Marker), SP = solubilisiertes Pellet, ÜUZ = Überstand Ultrazentrifugation, DS = Durchlauf Ni-NTA-Säule, W1 und W2 = Waschschritt, E = Elution der gebundenen Proteine. (A) Coomassie gefärbtes, 12 %iges SDS-Gel der aufgetrennten Proben. In der Elution waren Banden dreier Proteine zu sehen. Eine Bande bei ~ 39 kDa ( ), eine zweite bei ~ 37 kDa ( ) und eine dritte bei ~ 31 kDa ( ). (B) Western-Blot der Proben aus den Reinigungsschritten. Die Identifikation von exprimierten gp1 und gp11 erfolgte mit anti-gp1/11 Serum. In den Proben des solubilisierten Pellets, des Überstandes nach Ultrazentrifugation und auch im Durchlauf der Säule konnte gp1 ( ) bei ~ 39 kDa und gp11 ( ) bei ~ 12 kDa identifiziert werden. In der Elution wurde ausschließlich gp1 nachgewiesen.

130 100 70

55 40

35

25

15

10

kDa SP ÜUZ Ds W1 W2 E

130 100 70

55 40

35

25

15

10

kDa M SP Üuz Ds W1 W2 E

(A) (B)

Ergebnisse

139

In den Western-Blot Analysen (Abb. 3-18 und Abb. 3-19 (B)) konnte die ~ 39 kDa

Bande ( ) als gp1 identifiziert werden. In den Proben des solubilisierten Pellets (SP,

Abb. 3-19 (B)), des Überstandes nach Ultrazentrifugation (ÜUZ) und auch im Durchlauf

der Säule (DS) konnte bei ~ 12 kDa ( ) gp11 identifiziert werden. In der Elution

hingegen konnte ausschließlich nur gp1 nachgewiesen werden. Das starke gp1-Signal

in der Probe (ÜUZ) des Immun-Blots zeigte außerdem, dass die Membranen mit Fos-

cholin 12 ausreichend solubilisierbar waren. Das gp1-Signal im Durchlauf der Ni-NTA-

Säule (DS) hingegen wies darauf hin, dass ein Teil des gp1 und gp11 während der

2-stündigen Inkubation nicht an die Ni-NTA-Matrix gebunden werden konnte.

Das Coomassie gefärbte Gel in Abbildung 3-20 zeigt die aufgetrennte Probe der

Elutionsfraktion (E) sowie die Waschschritte (W1) und (W2), welche aus der Metall-

affinitätschromatographie von 4 L gp1/11-exprimierenden E. coli C41-Zellen erhalten

wurden. Im Vergleich zur Elutionsfraktion (E) in Abbildung 3-19 (A) konnte in dieser

Elutionsfraktion mit Hilfe der Coomassiefärbung eine vierte Bande bei ~ 20 kDa ( )

und eine fünfte bei ~ 12 kDa ( ) identifiziert werden. Die 12 kDa Bande ent-

sprach, dem Molekulargewicht nach, der des gp11 ( ) im Western-Blot in Abbildung

3-19 (B). Das Bandenmuster des Waschschrittes (W2) hingegen zeigte, dass ab einer

Imidazolkonzentration von 75 mM geringe Mengen gp1 und gp11 von der Säulenmatrix

eluiert wurden, da diese Proteinbanden ebenfalls in der Elutionsfraktion vorhanden

waren. Diese waren jedoch nicht im Waschschritt (W1) zu sehen, welcher mit einer

Imidazolkonzentration von 40 mM durchgeführt wurde.

3.4.3 Massenbestimmung des gereinigten M13 gp1/11-Assembly-Komplexes aus

E. coli C41 durch präparative Gelfiltration

Mit Hilfe präparativer Gelfiltration können Proteine aufgrund ihrer hydrodynamischen

Eigenschaften über eine Säulenmatrix getrennt werden. Je kleiner das hydrody-

Abb. 3-20: SDS-PAGE der gp1/11-Komplexreinigung aus E. coli C41 (4 L Flüssigkultur). Der Reinigungsablauf entsprach dem der 2 L Flüssigkultur. Eine Probe aus der Elutionsfraktion wurde nach TCA-Fällung über eine 12 %ige SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend mit Coomassie gefärbt. In der Elution konnten mit Hilfe der Comassiefärbung fünf Proteinbanden sichtbar gemacht werden: Eine Bande bei ~ 39 kDa ( ), eine zweite bei ~ 37 kDa ( ), eine dritte bei ~ 31 kDa ( ) eine vierte bei ~ 20 kDa ( ) und eine fünfte bei ~ 12 kDa ( ). Das Banden-muster des Waschschrittes W2 zeigte, dass ab einer Konzentration von 75 mM Imidazol im Waschpuffer geringe Mengen der Proteine, welche in der Elutionsfraktion vorhanden waren, eluiert wurden. Diese waren jedoch nicht im Waschschritt W1 zu sehen.

kDa E W1 W2

130 100 70

55 40 35

25

15

10

Ergebnisse

140

namische Volumen eines Proteins ist, desto langsamer passiert es die Matrix, große

Proteine bzw. Proteinkomplexe hingegen passieren aufgrund des größeren hydrody-

namischen Volumens die Matrix schneller. Für eine Bestimmung der Masse, des in

E. coli C41 überexprimierten gp1/11-Assembly-Komplexes, sollte das aus der IMAC-

Reinigung erhaltene Proteingemisch der Elutionsfraktion durch FPLC („fast protein

liquid chromatography“) aufgetrennt werden (Kap. 2.8.34). Damit eine möglichst genaue

Auftrennung des Proteingemisches erfolgen konnte, wurde für die FPLC als Säulen-

matrix SuperdexTM 200 verwendet, da diese einen Trennbereich von 10 – 600 kDa

besitzt. Um in den gesammelten Fraktionen der FPLC die entsprechenden Molekular-

gewichte zuordnen zu können, wurde, wie in Kapitel 2.8.34 beschrieben, zuvor eine

Kalibrierung der Säule durchgeführt. Hierfür erfolgte die Auftrennung eines Gemisches

aus Proteinen (Apoferritin, β-Amylase, BSA, Carboanhydrase) mit bekannten Mole-

kulargewichten zwischen 30 kDa – 440 kDa über die SuperdexTM 200 Matrix. Aus den

Verhältnissen von Elutionsvolumina zu eluierten Molekulargewichten wurde eine Eich-

gerade erstellt. Mit Hilfe dieser Eichgeraden sollten anschließend die Bestimmungen

der Massen in den Elutionsfraktionen der FPLC erfolgen.

Für die Bestimmung der Masse des gp1/11-Assembly-Komplexes wurde das 2 ml

Elutionskonzentrat aus der IMAC in Abbildung 3-20 über die zuvor geeichte XK 16/40

Säule mit SuperdexTM 200 Matrix aufgetrennt. Um die Massen eindeutig zuordnen zu

können, erfolgte, wie bei der Eichung, die Auftrennung des Proteingemisches in deter-

genzhaltigem Laufpuffer (20 mM Tris/HCl pH 7, 50 mM NaCl, 0,8 % Fos-cholin 12) bei

einer Flussrate von 0,35 ml/min. Während der FPLC wurden Elutionsfraktionen von 2 ml

Probenvolumen gesammelt. Die Detektion der eluierten Proteine während der FPLC

erfolgte bei 280 nm. Um die Proteine in den gesammelten Fraktionen identifizieren zu

können, wurden aus diesen jeweils 100 µl entnommen, mit TCA präzipitiert und

anschließend über eine 12 %ige SDS-PAGE aufgetrennt (Kap. 2.8.35) und Coomassie

gefärbt (Kap. 2.8.36). Aufgrund der Säulenkalibrierung und der daraus resultierenden

Eichgeraden (Kap. 2.8.34) konnten den über SDS-PAGE aufgetrennten Einzelfrak-

tionen entsprechende Massen zugeordnet werden.

Das Chromatogramm in Abbildung 3-21 (A) zeigt den Proteindetektionsverlauf sowie

die Anzahl der gesammelten 2 ml Fraktionen während der Gelfiltration. Nach 20 ml

Elutionsvolumen wurde, durch den Anstieg der Absorption auf 10 mAU, die Elution der

ersten Proteine nachgewiesen. Anhand der Kalibrierung der Säule konnten den hier

eluierten Proteinen Molekulargewichte zwischen ~ 350 kDa – 290 kDa zugeordnet

Ergebnisse

141

werden. Hier gilt es jedoch zu beachten, dass die in Fos-cholin 12 solubilisierten

Proteine in Detergenzmizellen mit einem Molekulargewicht von ~ 21 kDa gelöst vor-

liegen. Das SDS-Gel der präzipitierten Fraktionen in Abbildung 3-21 (B) zeigt, dass sich

die entsprechenden Fraktionen F10 und F11 dieser frühen Detektion aus Proteinen mit

~ 39 kDa ( ), ~ 37 kDa ( ), ~ 31 kDa ( ) und ~ 12 kDa ( ) des IMAC-Elutions-

konzentrats zusammensetzten. Da es sich hier um Proteine mit Molekulargewichten

unter 400 kDa handelte, sollten in diesen Fraktionen die in Detergenzmizellen gelösten

gp1/11-Assembly-Komplexe vorliegen.

Nach 26 ml Elutionsvolumen stieg die Adsorption in Abbildung 3-21 (A) um das 5-fache

der zuvor detektierten Menge auf 50 mAU an. In den Fraktionen F13 – F15 wurden somit

die höchsten Mengen an Proteinen während der Gelfiltration eluiert. Diesen Fraktionen

konnten Molekulargewichte von ~ 145 kDa – 62 kDa zugeordnet werden, was der Hälfte

des Molekulargewichts der Fraktionen F10 und F11 entsprach.

100

70 55 40

35

25

15

10

kDa F10 F11 F12 F13 F14 F15 F16 F17 F18 F19

350 290 205 145 74 62 50 37 30 22 Molekulargewicht in kDa:

(B)

Abb. 3-21: Präparative Gelfiltration der gp1/11-IMAC-Elution gereinigt aus E. coli C41. Für die Bestimmung des Molekulargewichts des gp1/11-Assembly-Komplexes aus E. coli C41 wurde das 2 ml Elutionskonzentrat aus der IMAC in detergenzhaltigem Laufpuffer (20 mM Tris/HCl pH 7, 50 mM NaCl, 0,8 % Fos-cholin 12) mit einer Flussrate von 0,35 ml/min über FPLC aufgetrennt. Als Säulenmatrix wurde Superdex

TM 200 verwendet. Die Elutionen wurden in je 2 ml Fraktionen gesammelt. 100 µl Fraktions-

proben wurden durch TCA präzipitiert und über eine 12 %ige SDS-PAGE aufgetrennt. (A) Chro-matogramm der Superdex

TM 200-Auftrennung des gp1/11-Elutionskonzentrats. Ab 20 ml Elutions-

volumen wurden die ersten Proteine ( ; Fraktionen 10 – 11) detektiert. Nach 26 ml Elutionsvolumen ( ; Fraktionen 13 – 15) erfolgte die Elution der höchsten Menge an Proteinen, die sich nach 32 ml um das 5-fache verringerte ( , Fraktion 18). (B) Coomassie gefärbtes SDS-Gel der präzipitierten Fraktionen 10 – 19 (F10 – F19). Durch die Kalibrierung der Säule konnten den einzelnen Fraktionen Molekulargewichte zugeordnet werden. In F10 befanden sich die ersten, im Chromatogramm (A) detek-tierten, Proteine mit Molekulargewichten zwischen 350 – 290 kDa. Diese bestanden aus Proteinen mit den Massen ~ 39 kDa ( ), ~ 37 kDa ( ), ~ 31 kDa ( ) und ~ 12 kDa ( ). In den Fraktionen mit den höchsten Proteinmengen (F13 – F15) wurden ~ 39 kDa, ~ 31 kDa und ~ 12 kDa schweren Proteine eluiert. In den Fraktionen F17 – F19 erfolgte nur noch die Elution des ~ 12 kDa schweren Proteins.

Elutionsvolumen in ml

Ab

so

rptio

n in

mA

U

(A)

F10/11

F13 - 15

F16 - 19

Ergebnisse

142

Auf dem SDS-Gel in Abbildung 3-21 (B) zeigte sich, dass in diesen Fraktionen Proteine

mit den Massen von ~ 39 kDa ( ), ~ 37 kDa ( ), ~ 31 kDa ( ) und ~ 12 kDa

( ) der IMAC-Elution vorkamen.

In Abbildung 3-21 (A) erfolgte zwischen den Elutionsvolumina 36 ml – 38 ml ( ) die

Elution der niedermolekularen Proteine. Den Fraktionen F16 – F19 wurden Massen

zwischen ~ 50 kDa und 22 kDa zugeordnet. Das SDS-Gel in Abbildung 3-21 (B) zeigte,

dass in diesen Fraktionen hauptsächlich die Elution des ~ 12 kDa schweren Proteins

( ) erfolgte.

3.4.4 Massenbestimmung des gereinigten M13 gp1/11-Assembly-Komplexes aus

infizierten E. coli K37 durch präparative Gelfiltration

Das Chromatogramm der FPLC-Auftrennung des gp1/11-Elutionkonzentrats aus Kapitel

3.4.3 zeigte, dass die gp1/11-Assembly-Komplexe nach 20 ml Säulenvolumen, das

einem Molekulargewicht von ~ 350 kDa – 290 kDa entspricht, eluiert wurden. Jedoch

war die Proteinmenge an eluierten Komplexen zu gering. Um eine mögliche Beteiligung

weiterer Phagenproteine identifizieren zu können, wurde eine weitere Reinigung des

gp1/11-Assembly-Komplexes aus infizierten E. coli K37-Zellen durchgeführt. Dieser

Bakterienstamm besitzt F-Pili und ist ein natürlicher Wirt des M13-Phagen. Hier sollten

die gp1/11-exprimierenden Zellen zum Zeitpunkt der induzierten Proteinexpression mit

M13mp19-Phagen zusätzlich infiziert werden. Durch die Infektion sollte eine Degra-

dierung des Komplexes in der Zytoplasmamembran aufgrund seiner aktiven Verwen-

dung während der Phagensekretion verringert werden. Durch die zusätzliche Infektion

der Zellen entstehen erwartungsgemäß heterologe Komplexe, die sich wohl aus wild-

typischen und His-Tag fusionierten gp1 zusammensetzen. Über den His-Tag sollten

sich daher auch diese Komplexe mit Hilfe der IMAC reinigen und anschließend über

FPLC auftrennen lassen. Damit eine Reinigung mit anschließender Massenbestimmung

erfolgen konnte, wurde das gp1/11-Fragment, wie in Kapitel 2.8.17 beschrieben, mit

N-terminalem His-Tag aus dem Vektor pETg1/11 in den Vektor pMS119EH kloniert, aus

dem das Konstrukt pMSg1/11 hervorging. Hier stand die Expression der gp1- und gp11-

Proteine unter der Kontrolle des induzierbaren tac Promotors. Diese Umklonierung

wurde durchgeführt, da der Bakterienstamm E. coli K37 keine T7 RNA-Polymerase

exprimiert, die für die Proteinexpression in pET-klonierter Gene benötigt wird.

Für die Reinigung des Komplexes wurden E. coli K37-Zellen mit dem Vektor pMSg1/11

transformiert. Von auf ampicillinhaltigen LB-Agarplatten gewachsenen Transformanten

Ergebnisse

143

wurde eine Einzelkolonie zur Herstellung einer 4 L LB-Batchkultur verwendet. Die

Flüssigkultur wurde bei 37°C bis zu einer Zelldichte von 2 x 108 Bakterien/ml kultiviert,

woraufhin die Expression des plasmidkodierten gp1 und gp11 durch Zugabe von IPTG

(1mM Endkonzentration) zu den Flüssigkulturen und die Infektion der Zellen mit M13-

Phagen (M.O.I. 5) erfolgte (Kap. 2.8.32). Die Zellen wurden nach Induktion für weitere

2 Stunden bei 37°C kultiviert und daraufhin nach anschließender Zentrifugation in Tris-

Sucrose Lösung (25% Sucrose in 20 mM Tris/HCl pH 7,5) aufgenommen. Die Reini-

gung der gp1/11-Assembly-Komplexe aus dem Zelllysat mit Hilfe der IMAC (Kap.

2.8.33) sowie die darauf folgende Auftrennung des Eluats durch präparative Gelfiltration

(Kap. 2.8.34) erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie in Kapitel 3.4.2 in deter-

genzhaltigem Laufpuffer (20 mM Tris/HCl pH 7, 50 mM NaCl, 0,8 % Fos-cholin 12) bei

einer Flussrate von 0,35 ml/min.

Um die Proteine in den gesammelten Fraktionen der FPLC identifizieren zu können,

wurden aus diesen 100 µl entnommen, mit TCA präzipitiert und anschließend durch

Abb. 3-22: Präparative Gelfiltration des gp1/11-IMAC-Elutionskonzentrats gereinigt aus infizierten E. coli K37-Zellen. Für die Bestimmung des Molekulargewichts des gp1/11-Assembly-Komplexes aus infizierten E. coli K37-Zellen wurde das 2 ml Elutionskonzentrat aus der IMAC-Reinigung mit detergenz-haltigem Laufpuffer (20 mM Tris/HCl pH 7, 50 mM NaCl, 0,8 % Fos-cholin 12) und einer Flussrate von 0,35 ml/min über FPLC aufgetrennt. Die Elutionen wurden in je 2 ml Fraktionen gesammelt. (A) Coomassie gefärbtes SDS-Gel des Elutionskonzentrats (E) aus der IMAC-Reinigung gp1/11-expri-mierender sowie infizierter E. coli K37-Zellen. 100 µl der Elutionsfraktion wurde nach TCA-Fällung über eine 12 %ige SDS-PAGE aufgetrennt. In der Elution konnten mit Hilfe der Coomassie-Färbung fünf Proteinbanden sichtbar gemacht werden: Eine Bande bei ~ 62 kDa (Δ), eine zweite bei ~ 39 kDa ( ), eine dritte bei ~ 37 kDa ( ), eine vierte bei ~ 31 kDa ( ), eine fünfte bei ~ 20 kDa ( ) und eine sechste bei ~ 12 kDa ( ). (B) Chromatogramm der FPLC-Auftrennung des gp1/11-Elutionskon-zentrats aus (A). Ab 20 ml Elutionsvolumen (Proteine mit Molekulargewichten zwischen 400 – 290 kDa) wurden die ersten Proteine ( ) in Fraktion 9 mit hoher Konzentration (40 mAU) detektiert. Nach 26 ml Elutionsvolumen ( ; Fraktionen 11 – 20, Proteine mit Molekulargewichten von 205 – 22 kDa) nahmen die Mengen an eluierten Proteinen kontinuierlich ab.

(A)

100 70

55

40

35

25

15

10

kDa E

(B)

F9

F11 - 20

Absorp

tion

in

mA

U

Elutionsvolumen in ml

Ergebnisse

144

eine 12 %ige SDS-PAGE aufgetrennt (Kap. 2.8.35) und Coomassie gefärbt (Kap.

2.8.36). Aufgrund der Säulenkalibrierung und der daraus resultierenden Eichgeraden

(Kap. 2.8.34) konnten den aufgetragenen Fraktionen entsprechende Massen zuge-

ordnet werden.

Das Chromatogramm in Abbildung 3-22 (B) zeigt sowohl den Proteindetektionsverlauf

als auch die Anzahl der gesammelten 2 ml Fraktionen während der präparativen Gel-

filtration. Nach 20 ml Elutionsvolumen wurde, durch den Anstieg der Absorption auf

40 mAU, die Elution der ersten Proteine in Fraktion 9 angezeigt. Anhand der Kali-

brierung der Säule konnten den hier eluierten Proteinen Molekulargewichte zwischen

~ 350 – 290 kDa zugeordnet werden. Hier gilt es jedoch zu beachten, dass die in Fos-

cholin 12 solubilisierten Proteine in Detergenzmizellen mit einem Molekulargewicht von

~ 21 kDa gelöst vorliegen. Das SDS-Gel der präzipitierten Fraktionen in Abbildung 3-23

zeigte, dass sich die Fraktion F9 hauptsächlich aus Proteinen mit der Masse von ~ 37

kDa ( ; gp1 wt) sowie aus Proteinen mit den Massen von ~ 62 kDa (Δ; unbek.), ~ 39

kDa ( ; gp1-His), ~ 31 kDa ( ; gp1p) und ~ 20 kDa ( ; gp1 Dimer?) des IMAC-

Elutionskonzentrats zusammensetzten.

Abb. 3-23: SDS-PAGE der aufgetrennten Fraktionen aus der präparativen Gelfiltration des gp1/11-IMAC-Elutionskonzentrats gereinigt aus infizierten E. coli K37-Zellen. Die Gelfiltration der gp1/11-Assembly-Komplexe erfolgte in detergenzhaltigem Laufpuffer (20 mM Tris/HCl pH 7, 50 mM NaCl, 0,8 % Fos-cholin 12) bei einer Flussrate von 0,35 ml/min. Während der FPLC wurden die Elutionen in je 2 ml Fraktionen gesammelt. Aus den Fraktionen wurden 100 µl mit TCA präzipitiert und über eine 12 %ige SDS-PAGE aufgetrennt. F9 – F18 = Elutionsfraktionen. Ab 20 ml Elutionsvolumen wurden die ersten Proteine in Fraktion 9 mit hoher Konzentration (40 mAU) detektiert. Die Auftrennung der Probe auf dem SDS-Gel zeigte, dass sich diese Fraktion mit Massen zwischen ~ 350 kDa bis 290 kDa hauptsächlich aus dem ~ 37 kDa ( ; gp1 wt) schweren Protein des Elutionskonzentrats der IMAC sowie einem ~ 62 kDa (Δ; unbekannt), dem ~ 39 kDa ( ; gp1-His), dem ~ 31 kDa ( ; gp1 p) und dem ~ 20 kDa ( ; gp11 Dimer?) schweren Protein zusammensetzte. Erst nach 31 ml Elutionsvolumen (Fraktionen 14 – 18) erfolgte die Elution des 12 kDa ( ; gp11 wt) schweren Proteins. Durch Kalibrierung der Säule konnten den einzelnen Fraktionen die entsprechenden Molekulargewichte zugeordnet werden.

350 290 205 145 74 62 50 37 30 22 Molekulargewicht in kDa:

F9 F10 F11 F12 F13 F14 F15 F16 F17 F18 kDa

Unbek.

gp1-His

gp1p

gp11 (Dimer?)

gp11 wt

35

70

55

40

15

10

100

25

gp1 wt

Ergebnisse

145

Da es sich hier um Proteine mit Molekulargewichten unter 400 kDa handelte, sollten,

wie in Abbildung 3-21 (B), in dieser Fraktion in Detergenzmizellen gelöste gp1/11-

Assembly-Komplexe vorhanden sein. Im Verlauf der aufgetragenen Elutionen nahm

zwischen F10 und F12 die Menge eines eluierten Proteins mit ~ 62 kDa (Δ) auffällig zu,

welches ebenfalls in der Elutionsfraktion in Abbildung 3-22 (A) und sehr schwach in den

Western-Blot Analysen in Abbildung 3-18 und Abbildung 3-19 (B) zu sehen war. Im

Vergleich zur Fraktion F9 in Abbildung 3-21 (A) hatte die Fraktion F9 in Abbildung 3-23

mit einer Absorption von 40 mAU eine 40-mal höhere Proteinkonzentration. Somit

konnte durch die Infektion der E. coli K37 Batch-Kultur die Menge an gp1/11-Assembly-

Komplexen zugunsten der Komplexe hin verschoben werden. Jedoch war hier im

Vergleich zu Abbildung 3-21 (B), in der Fraktion F9 kein Protein mit der Masse von ~ 12

kDa zu erkennen. In den Fraktionen F10 – F14 (Massen mit 290 kDa - 62 kDa) nehmen

die Mengen der ~ 39 kDa ( ), ~ 37 kDa ( ), ~ 31 kDa ( ) und ~ 20 kDa ( )

schweren Proteine kontinuierlich ab. Nach 31 ml Elutionsvolumen (F14 – F18; ~ 62 kDa -

22 kDa) erfolgte die Elution eines ~ 12 kDa schweren Proteins.

3.4.5 Identifikation von Proteinbanden im IMAC-Eluat durch MALDI-TOF/MS

In Kapitel 3.4.1und 3.4.2 konnte mit Hilfe des anti-gp1/11 Serums die Proteinbande mit

einem Molekulargewicht von ~ 39 kDa als gp1 und die Proteinbande mit ~ 12 kDa als

gp11 identifiziert werden. Sowohl in den IMAC-Eluaten in Abbildung 3-20 bzw.

Abbildung 3-22, als auch in den FPLC-Elutionsfraktionen in Abbildung 3-23 konnten

weitere Proteine koeluiert werden. Hierbei galt das Interesse vor allem der ~ 37 kDa,

der ~ 31 kDa und der ~ 20 kDa schweren Proteinbanden, da diese kontinuierlich in den

IMAC-Elutionen präsent waren. Zur Identifizierung wurden diese Banden aus den

Coomassie gefärbten SDS-Gelen isoliert und mittels MALDI-TOF/MS („Matrix Assisted

Laser Desorption/Ionization – Time Of Flight / Mass-Spectrometry“) analysiert. Bei

dieser Methode werden zuerst Proteine mittels Trypsinverdau in Peptidfragmente abge-

baut, deren Einzelmassen für jedes Protein einzigartig sind und durch MALDI-TOF/MS-

Analyse bestimmt werden können. Mit Hilfe eines anschließenden Vergleichs des

hieraus entstandenen Peptid-Massen-Fingerprints (PMF), mit den in Datenbanken

hinterlegten PMFs (Mascot, http://www.matrixscience.com), können dann die jeweiligen

Proteine identifiziert werden.

Die MALDI-TOF/MS-Analysen in Abbildung 3-24 (B-D) identifizierten die aus dem SDS-

Gel isolierten Banden als gp1-Proteinfragmente des filamentösen Phagen M13 (s. An-

http://www.matrixscience.com/

Ergebnisse

146

hang). Der Vergleich der mit schwarz hinterlegten, über MALDI-TOF/MS identifizierten,

Aminosäuresequenzen in Abbildung 3-24 (B-D) mit der wildtypischen gp1-Aminosäure-

sequenz in Abbildung 3-24 (A) zeigte, dass es sich wohl bei den Proteinen um

C-terminal proteolytisch prozessierte gp1-Proteine handelte. Vergleicht man die Amino-

säuresequenz des 37 kDa schweren gp1-Fragments (Abb. 3-24 (B)) mit der Amino-

säuresequenz des Wildtyps (Abb. 3-24 (A)), so fällt auf, dass die C-terminalen 47

Aminosäuren des wildtypischen gp1 fehlen. Diese fehlenden Aminosäuren entsprechen

ungefähr der Massendifferenz zum wildtypischen gp1-Protein.

1 MAVYFVTGKL GSGKTLVSVG KIQDKIVAGC KIATNLDLRL QNLPQVGRFA 51 KTPRVLRIPD KPSISDLLAI GRGNDSYDEN KNGLLVLDEC GTWFNTRSWN 101 DKERQPIIDW FLHARKLGWD IIFLVQDLSI VDKQARSALA EHVVYCRRLD 151 RITLPFVGTL YSLITGSKMP LPKLHVGVVK YGDSQLSPTV ERWLYTGKNL 201 YNAYDTKQAF SSNYDSGVYS YLTPYLSHGR YFKPLNLGQK MKLTKIYLKK 251 FSRVLCLAIG FASAFTYSYI TQPKPEVKKV VSQTYDFDKF TIDSSQRLNL 301 SYRYVFKDSK GKLINSDDLQ KQGYSLTYID LCTVSIKKGN SNEIVKCN




(A) AS-Sequenz wt gp1/11

(B) Bande 37 kDa

(C) Bande 31 kDa

(D) Bande 20 kDa

Abb. 3-24: MALDI-TOF/MS-Analysen der Proteinbanden aus der IMAC-Reinigung der gp1/11- Assembly-Komplexe. Eine 100 µl Probe des Eluats aus einer gp1/11 IMAC-Reinigung wurde mit TCA (12 % Endkonzentration) präzipitiert und über eine 12 %ige SDS-PAGE aufgetrennt. Die anschließende Färbung des Gels erfolgte mit Coomassie. Die Banden mit ~ 37 kDa, ~ 31 kDa und ~ 20 kDa wurden aus dem Gel isoliert und die jeweiligen Proteinbanden mit Hilfe des MALDI-TOF/MS analysiert. Die Amino-säuresequenzen, welche identifiziert wurden und mit der Sequenz des wildtypischen gp1 überein-stimmen, wurden schwarz hinterlegt. Die wildtypische Aminosäuresequenz des gp11 ist grau hinterlegt. (A) Aminosäuresequenz des wildypischen gp1/11. (B) Identifizierte Aminosäuresequenz des ~ 37 kDa schweren gp1-Fragments. (C) Identifizierte Aminosäuresequenz des ~ 31 kDa schweren gp1-Fragments. (D) Identifizierte Aminosäuresequenz des ~ 20 kDa schweren gp1-Fragments.

Ergebnisse

147

Dies gilt ebenfalls für das isolierte ~ 31 kDa schwere gp1-Fragment (Abb. 3-24 (C)). Die

Differenz der fehlenden C-terminalen Aminosäuren zum wildtypischen gp1 entspricht

auch hier ungefähr der Massendifferenz. Eine Ausnahme stellt jedoch das isolierte

~ 20 kDa schwere gp1-Fragment dar (Abb. 3-24 (D)), da hier die nachgewiesenen

Peptidfragmente nur einem ~ 10 kDa schweren entsprechen. Zusätzlich fällt auf, dass

hier ein 8 Aminosäuren langes Fragment nachgewiesen wurde, welches dem Bereich

der Aminosäuren 290 - 297 des wildtypischen gp1 (Abb. 3-24 (A)) entspricht und

ansonsten nur noch in der analysierten 37 kDa schweren Bande, nicht aber in der

analysierten 31 kDa schweren Bande, vorkommt. Hier könnte es sich wahrscheinlich

um 2 Fragmente des gp1 handeln, welche einmal die N- und einmal die C-terminal

prozessierten Form darstellen.

3.4.6 TEM-Aufnahmen FPLC gereinigter gp1/11-Assembly-Komplexe

Für die Visualisierung der gp1/11-Assembly-Komplexe wurden 10 µl Proben aus der

Elutionsfraktion F9 in Abbildung 3-23 auf Trägernetzchen aus Kupfer adsorbiert und

eine Negativkontrastierung mit Phosphorwolframsäure (5 %, pH 7) durchgeführt (Kap.

2.8.42). Die kontrastierten Proben wurden anschließend am Transmissionselektronen-

mikroskop (TEM) untersucht (Kap. 2.8.29).

Die TEM-Aufnahmen in Abbildung 3-25 (A) und (B) zeigen, dass in den adsorbierten

Proben aus Fraktion F9, in die während der FPLC-Auftrennung Komplexe mit Moleku-

largewichten zwischen ~ 400 kDa und 290 kDa eluiert wurden, eine große Anzahl

gleichförmiger und gleichgroßer Ringstrukturen vorhanden waren. In der Abbildung 3-25

(C1) und (D1) sind einzelne Komplexstrukturen zu erkennen, die einen Innendurch-

messer von ~ 7 – 8 nm und einen Außendurchmesser von ~ 11 – 12 nm aufweisen. Mit

Hilfe mathematischer Bildprozessierung konnten in den Abbildungen 3-25 (C2) und (D2)

die ringförmigen Strukturen aus (C1) und (D1) verbessert dargestellt werden.

Ergebnisse

148

Abb. 3-25: TEM-Aufnahmen FPLC gereinigter gp1/11-Assembly-Komplexe. Der gp1/11-Assembly-Komplex wurde in E. coli K37-Zellen mit Hilfe des Vektors pMSg1/11 überexprimiert. Durch eine parallel verlaufende Infektion der Zellen mit M13mp19-Phagen wurde die Degradierung des Assembly-Komplexes durch zelluläre Proteasen verringert. Aus den Zelllysaten wurden anschließend über eine IMAC-Reinigung die Komplexe durch einen N-terminal fusionierten His-Tag isoliert und über FPLC gereinigt. Die TEM- Aufnahmen zeigen Proben aus Fraktion F9, welche zuvor mit 5 % Phosphorwolframsäure (pH 7) negativ kontrastiert wurden und Komplexe mit Molekulargewichten von ~ 400 kDa bis 290 kDa besaßen. (A, B) Aufnahmen, welche ringartige Strukturen zeigen, die einen Innendurchmesser von ~ 7 – 8 nm und einen Außendurchmesser von ~ 11 – 12 nm aufweisen. (C1, D1) Einzeldarstellungen der Ringstrukturen aus (A). (C2, D2) Durch Software verbesserte Darstellungen der Einzelpartikel aus C1 und D1. Die Einzelpartikel zeigen deutlich ringförmige Strukturen. Die Längen der Skalierungsbalken betragen 10 nm.

A B C1

D1

C2

D2

Diskussion

149

4 Diskussion

4.1 Phagenextrusion aus infizierten E. coli-Zellen

Charakteristisch für die filamentösen Phagen M13, fd und f1 sind ihre nicht-lytischen

Infektionsverläufe in den Wirtsorganismen. Jedoch ist der zeitliche Ablauf der Wirts-

infektion und die Synthese neuer Phagen-Nachkommen zwischen den Stämmen

filamentöser Phagen variabel und abhängig von den verwendeten Wirtsorganismen

und den äußeren Bedingungen (Panter & Symons, 1966, Minashima et al., 1968).

Vereinfacht kann ein Infektionsverlauf in einer E. coli-Wirtszelle mit den oben

genannten filamentösen Phagen durch die Phasen Adsorption, Infektion, Eklipse und

die Freisetzung neuer Phagen-Nachkommen durch die Wirtszelle beschrieben

werden. Dabei stellt die Eklipse das Stadium zwischen der Aufnahme der Phagen-

DNA in die Wirtszelle und der Freisetzung neuer Phagen-Nachkommen dar

(Delbrück, 1940).

Damit der zeitliche Verlauf einer M13-Phageninfektion speziell für das Wirts-

bakterium E. coli K38 ermittelt werden konnte, wurde eine Quantifizierung der M13-

Phagenextrusion aus infizierten E. coli K38-Kulturen anhand zweier „one-step

growth“ Modellversuche durchgeführt. Diese Modelle sollten anschließend als Basis

dienen, um den Extrusionsverlauf von M13-Phagen auf der Zelloberfläche, in Abhän-

gigkeit von der Zeit nach Infektion, mit dem AFM messen zu können. Im ersten

Modellversuch erfolgte die Quantifizierung anhand der wildtypisch verlaufenden M13-

Infektion in E. coli K38 durch eine Infektion mit M13mp19. Für den zweiten Modell-

versuch wurde ein induzierbares Phagenextrusionssystem hergestellt, in welchem

die Sekretion neugebildeter M13am8 Phagen über das, in trans bereitgestellte,

Haupthüllprotein gp8 kontrolliert werden kann (Kuhn & Wickner, 1985). Mit beiden

Systemen wurden „one-step growth“ Experimente mit infizierten E. coli K38 Batch-

Kulturen durchgeführt.

Bei einer M.O.I. von 20 können während einer 5-minütigen Adsorptionsphase

~ 7 Phagen pro Bakterienzelle binden

Um vergleichbare Infektionsverläufe aus den Experimenten zu erhalten, erfolgten die

Adsorptionen der Phagen an die E. coli-Zellen bei 4°C. Hierdurch wurde die Auf-

nahme der Phagen DNA in die Zellen unterdrückt (Tzagoloff & Pratt, 1964) und

sichergestellt, dass die Aufnahme der Phagen-DNA in beiden Experimenten unter

Diskussion

150

gleichen Bedingungen erfolgen konnte. Aus den erhaltenen „one-step growth“

Kurven beider Experimente ging hervor, dass sich während der 5-minütigen

Adsorption der Phagen an E. coli K38 die Phagentiter verringerten. Dies konnte

ebenfalls von Tzagoloff und Pratt für die Adsorption von M13-Phagen an E. coli 112-

12 sowie von O’ Callaghan (O´ Callaghan et al., 1973) an E. coli K-12 gezeigt

werden. Die Phagen, die sich aus den jeweiligen Differenzen der Phagentiter

ergaben, hatten während dieser 5 Minuten an die F-Pili der Zellen gebunden. Aus

den M13-Adsorptionsversuchen in Kapitel 3.1.3, in welchem die Bindung der Phagen

an die F-Pili in Abhängigkeit der eingesetzten M.O.I. untersucht wurde, ergab sich

eine Adsorptionskonstante von 3 x 108 pfu/min. In diesem ermittelten Wert ist die

Phagenmenge von 1 x 108 pfu/min berücksichtigt, welche unspezifisch an Bakterien

und Glaswaren bindet (Kap. 3.1.3). Tzagoloff und Pratt berechneten für die

Adsorption von M13-Phagen an E. coli 112-12 eine Adsorptionskonstante von

3 x 10-11 pfu/min. Hier muss jedoch beachtet werden, dass die von Tzagoloff und

Pratt angewendeten Methoden, die zu diesem Adsorptionswert führten, weder eine

unspezifische Adsorption der M13-Phagen noch das Abscheren der F-Pili berück-

sichtigten, das während der Zentrifugation und der anschließenden Wiederaufnahme

der Bakterienkultur in frisches Kulturmedium vor der unmittelbaren Adsorptions-

messung der M13-Phagen auftreten kann. Für die wildtypische „one-step growth“

Kurve ergab sich in dem hier durchgeführten Versuch eine durchschnittliche

Adsorption von 6 – 7 Phagen pro Zelle im Verlauf der 5-minütigen Adsorptionsphase

bei einer M.O.I. von 100. Das induzierte „one-step growth“ Experiment ergab eine

durchschnittliche Adsorption von 2 – 4 Phagen pro Zelle bei einer M.O.I. von 10.

Dass diese in den „one-step growth“ Kurven erhaltenen Adsorptionswerte realisierbar

sind, wurde von Ann Jacobson (Jacobson, 1972) bei ihren Adsorptionsmessungen

des Bakteriophagen f1 an E. coli K-12 gezeigt. Sie konnte in ihren Untersuchungen

feststellen, dass die Anzahl der F-Pili pro E. coli-Zelle limitiert ist und diese bis zu 12

F-Pili ausbilden. Die Adsorptionsexperimente in Kap. 3.1.3 zeigten außerdem, dass

ab einer M.O.I. von 20 ein Adsorptionsmaximum von ~ 7 Phagen pro Bakterienzelle

erreicht wurde. Trotz Erhöhung der M.O.I. konnte während dieser 5-minütigen

Adsorptionsphasen keine Steigerung an gebundenen Phagen erreicht werden.

Hierdurch lassen sich auch die unterschiedlichen Adsorptionswerte in den „one-step

growth“ Experimenten dieser Arbeit erklären. Während bei einer M.O.I. von 10

durchschnittlich nur 50 % der F-Pili mit Phagen besetzt waren, wurde bei einer M.O.I.

Diskussion

151

von 100 nahezu eine Bindungssättigung an den F-Pili erreicht. Zudem zeigt die

Kurve des Adsorptionsexperiments in Kap. 3.1.3, dass erst ab einer M.O.I. größer als

5 aussagekräftige Werte für die Adsorption erhalten wurden. Bei M.O.I.-Werten

kleiner als 5 kommt es, aufgrund der Höhe der unspezifischen Bindung, zu unge-

nauen Werten, die keine Berechnung der Adsorption mehr zulässt.

Die Eklipse der wildtypischen Infektion beträgt 5 Minuten, die der induzierten

Sekretion 12 Minuten

Für die Evaluierung des zeitlichen Verlaufs einer wildtypischen Infektion sowie die

einer induzierten Sekretion der Phagen aus E. coli K38, wurden die Kulturen zuvor

mit M13-Phagen infiziert. Im Fall des wildtypischen Verlaufs erfolgte die Infektion der

Bakterienkultur mit einer M.O.I. von 100, im Fall der induzierten Sekretion wurden die

Zellen nur mit einer M.O.I. von 10 für 5 Minuten infiziert, wobei aber trotzdem davon

ausgegangen werden konnte, dass mindestens ein Phage pro Bakterienzelle

gebunden und diese somit auch infiziert wird. Nach der Infektion wurden die

ungebundenen Phagen durch Zentrifugation der Zellkulturen entfernt und die

infizierten E. coli K38-Zellen in neues LB-Medium aufgenommen und bei 37°C

rekultiviert, wodurch sich die 100-fache Abnahme des Phagentiters der „one-step

growth“ Kurve der wildtypisch verlaufenden Infektion und der induzierten Sekretion in

Abbildung 4-1 zwischen t = -5 und t = 0 erklärt. Im Vergleich zur wildtypischen „one-

step growth“ Kurve sind die Phagentiter der induzierten „one-step growth“ Kurve

10-mal geringer, was wohl in diesem Fall auf den 10-mal geringeren M.O.I-Wert der

Infektion dieser Kultur zurückzuführen ist. Trotz des 10-fachen Unterschiedes der

Phagentiter in den erstellten „one-step growth“ Kurven, zeigen diese innerhalb des

120 Minuten andauernden Infektions-Assays einen dennoch vergleichbaren Verlauf.

Diese „one-step growth“ Kurven weisen zudem Übereinstimmungen mit der von

Brown und Dowell (Brown & Dowell, 1968) für die synchronisierte M13-Infektion einer

E. coli S-26 Batch-Kultur erstellte „one-step growth“ Kurve auf. Sowohl in der wild-

typischen, der induzierten als auch in der von Brown und Dowell gezeigten „one-step

growth“ Kurve steigt der Phagentiter nach der M13-Infektion der Bakterienkultur

innerhalb von 20 Minuten um das ~ 100-fache an, woraus gefolgert werden kann,

dass die Sekretion neuer Phagen-Nachkommen durch die infizierten Zellen sehr

schnell erfolgt. Vergleicht man die wildtypische und die induzierte Sekretion (Abb.

4-1), so stellt sich heraus, dass der wildtypische Infektionsverlauf eine Eklipse von

Diskussion

152

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

1E7

1E8

1E9

1E10

1E11

Zugabe von IPTG

Eklipsendauer bei Induktion

Adsorption bei 4°C

Eklipsendauer bei wildtypischer Infektion

Phagensekretion wt nach

Infektion mit M.O.I. 100

Induzierte Phagensekretion

nach Infektion mit M.O.I. 10

Ph

ag

en

tite

r in

p

fu/m

l

Zeit in min

Abb. 4-1: Grafische Gegenüberstellung der wildtypischen und induzierten Phagensekretion aus infizierten E. coli-Zellen. Im Fall der wildtypischen Sekretion wurde die E. coli Flüssigkultur mit einer M.O.I. von 100 mit M13-Phagen infiziert, im Fall der induzierten Sekretion erfolgte die Infektion mit einer M.O.I von 10. Der hellgrau schraffierte Bereich markiert die 5-minütige Eklipse des wild-typischen Infektionsverlauf, der dunkelgrau schraffierte Bereich die 12-minütige Eklipse der indu-zierten Phagensekretion nach Zugabe von IPTG zu t = 0

5 Minuten nach Aufnahme in frisches Kulturmedium (t = 0) und die induzierte

Sekretion eine Eklipse von 12 Minuten nach Zugabe von IPTG zum Kulturmedium

(t = 0) aufweist.

Im Vergleich zu der von Brown und Dowell publizierten „one-step growth“ Kurve,

welche eine 10-minütige Eklipse während des M13-Infektionsverlaufs in E. coli S26

aufwies, zeigt die wildtypische „one-step growth“ Kurve der M13-Phagen in einer

E. coli K38-Kultur eine um 5 Minuten verkürzte Eklipse. Ursache für die unter-

schiedlichen Eklipsenlängen könnte die Abweichung vom verwendeten Bakterien-

stamm sein. Eine schlüssigere Erklärung für die verkürzte Eklipse der wildtypischen

M13-Phagensekretion aus E. coli K38 könnte jedoch die Vortemperierung des Kultur-

mediums sein, wodurch der bakterielle Stoffwechsel und damit die Proteinsynthese

schneller zur ursprünglichen Ausgangsleistung gefunden hat. Möglicherweise ist dies

sogar ein Resultat aus der Kombination von vortemperiertem Kulturmedium und der

Abweichung vom E. coli-Stamm. Da die von Brown und Dowell verwendete E. coli

S26-Kultur nach Zugabe der M13-Phagen bei 0°C erst auf 37°C erwärmt wurde, kam

es wohl hierdurch zu einer Verzögerung der Phagenprotein-Biosynthese, aus der

Diskussion

153

sich eine Verlängerung der Eklipse ergab. Im Vergleich dazu wurde die E. coli K38-

Kultur direkt nach der Adsorptionsphase und Zentrifugation in frisches, bei 37°C vor-

gewärmtes, Kulturmedium überführt, wodurch sich eine Eklipsenlänge von nur

5 Minuten ergab. Während dieser Eklipse erfolgte die Aufnahme der Phagen-DNA

sowie die Synthese der phagenkodierten Proteine durch die Wirtszelle (Jacobson,

1972).

Extrusion neugebildeter Phagen erfolgt 5 Minuten nach Infektion

Während im Verlauf der wildtypischen Infektion nach 5 Minuten neue Phagen-

Nachkommen in das Kulturmedium abgegeben wurden, erfolgte bei der induzierten

Phagenextrusion erst 12 Minuten nach Zugabe von IPTG zum Kulturmedium zu t = 0

die Sekretion neuer Phagen (Abb. 4-1). Ursache für die Differenz von 7 Minuten zum

Wildtyp könnte die Menge des in trans bereitgestellten Haupthüllproteins gp8 sein.

Für die Sekretion werden pro Phage ~ 2800 Moleküle des Haupthüllproteins gp8

benötigt (Stopar et al., 2003). Da es sich bei dem Vektor pGZ119 (Kuhn, 1986, Lessl,

1992) jedoch um ein „medium-copy“ Plasmid handelt, entstand vermutlich durch die

Bereitstellung des plasmidkodierten Haupthüllproteins in trans nach Induktion zu t = 0

über das Konstrukt pGZg8wt eine anfängliche Unterversorgung. Hieraus kann

gefolgert werden, dass erst ~ 7 Minuten nach Induktion ausreichend gp8 in den

Zellen synthetisiert wurde, damit neue Phagen sekretiert werden konnten.

Eine infizierte E. coli-Zelle kann in 115 Minuten bis zu 925 neue Phagen

sekretieren

Nach den Eklipsen folgte, wie auch in dem „one-step growth“ Experiment von Brown

und Dowell für eine M13-infizierte E. coli S26-Kultur (Brown & Dowell, 1968), die

exponentielle Vermehrung der Phagen. In der wildtypisch verlaufenden Infektion

erhöhte sich während dieser Zeitspanne der Phagentiter um das 30-fache aufgrund

einer Sekretion von durchschnittlich 6 neuen Phagen/min pro infizierter Zelle. Bei der

induzierten Sekretion stieg der Phagentiter nur um das 10-fache an, so dass sich

hierfür eine Sekretion von 3 neuen Phagen/min pro infizierter Zelle ergab. Die

Differenz in den Phagensekretionsraten wird wahrscheinlich auch hier durch eine zu

schwache Expression des plasmidkodierten Haupthüllproteins gp8 bei der indu-

zierten Sekretion verursacht. Nach 120 Minuten konnte der Phagentiter in der

Bakterienkultur der wildtypisch verlaufenden Phageninfektion im Vergleich zum

Zeitpunkt t = 0 um das 1200-fache an Phagen erhöht werden. Das bedeutet, dass im

Diskussion

154

Durchschnitt während der 115-minütigen Sekretionssphase jede ursprünglich

infizierte Zelle 925 neue Phagen gebildet hatte. Bezieht man die Sekretionsrate auf

die durchschnittliche Gesamtmenge an Bakterienzellen in dieser Bakterienkultur

während dieses Versuchszeitraums, so ergibt sich eine gemittelte Sekretion von 440

Phagen pro Zelle, was nahezu der Menge entspricht, die Hoffmann-Berling und Mazé

(Hoffmann-Berling & Mazé, 1964) für fd-Phagen-infizierte E. coli K-12-Zellen nachge-

wiesen haben. Ein Grund, weshalb hier keine absoluten Sekretionsraten pro Zelle

über den gesamten Zeitraum angegeben werden können, liegt daran, dass in jeder

E. coli-Kultur die Zellteilungen sowie die Zellstoffwechsel der Bakterien asynchron

verlaufen und dies somit nur eine gemittelte Berechnung der sekretierten Phagen

erlaubt.

Die Menge neugebildeter Phagen wird bei der induzierten Sekretion durch die

in trans bereitgestellten Proteine limitiert

In der Bakterienkultur, in welcher die Sekretion neuer M13-Phagen induziert wurde,

konnte der ursprüngliche Ausgangsphagentiter zu t = 0 nach 120 Minuten um das

1900-fache angereichert werden. Das bedeutet, dass im Durchschnitt durch jede

ursprünglich infizierte sowie induzierte Zelle, während der 115-minütigen Sekretions-

phase, 170 neue Phagen gebildet wurden. Bezieht man die Sekretionsrate auf die

durchschnittliche Gesamtmenge an Bakterienzellen in dieser Bakterienkultur wäh-

rend dieses Versuchszeitraums, so ergibt sich eine gemittelte Sekretion von 80

Phagen pro Zelle. Somit entspricht die Expressionsrate des plasmidkodierten gp8

ungefähr einem Fünftel der Menge, die während der wildtypischen Infektion gebildet

wird. Hier erweist sich ebenfalls das Plasmid pGZg8wt als limitierender Faktor der

Sekretionsrate. Mit Hilfe eines „high-copy“ Plasmids könnte sich eventuell, durch die

Erhöhung der Syntheserate von gp8, diese Limitierung aufheben und eine wild-

typische Sekretion erreichen lassen. Vergleicht man die Steigerungen der Phagen-

titer zwischen der wildtypischen und der induzierten Phagensekretion, so fällt auf,

dass die Steigerungsrate des Ausgangsphagentiters in der induzierten Sekretion um

das 1,5 fache höher ist als in der wildtypischen Sekretion. Da sich aber die Werte

hier auf das Verhältnis von Ausgangsphagentiter zu Endphagentiter beziehen und

die Ausgangsphagentiter davon abhängig sind, wie vollständig die phagenhaltigen

Überstände abgenommen wurden bevor die Aufnahme der infizierten Zellen in neues

Diskussion

155

LB-Medium zu t = 0 erfolgte, sind diese Werte, verglichen mit denen aus der expo-

nentiellen Phagenvermehrungsphase, nur beschränkt aussagekräftig.

M13-Infektionen bewirken eine Veränderung der Generationszeit des Wirtes

Aufgrund der Bestimmungen der Bakterienzellzahlen während des wildtypischen

Infektionsverlaufs in der E. coli K38 Batch-Kultur konnte, wie schon von Hoffmann-

Berling und Mazé (Hoffmann-Berling & Mazé, 1964) für fd-Phagen-infizierte E. coli

K-12 sowie von Brown und Dowell (Brown & Dowell, 1968) für M13-infizierte E. coli

S26 beschrieben, gezeigt werden, dass die Infektion eine deutliche Auswirkung auf

die Generationszeit der E. coli-Zellen hatte. Hier ergab sich für M13-infizierte E. coli

K38-Zellen eine Verdoppelung der Generationszeit von 24 auf 48 Minuten. Da sich

jedoch Phageninfektionen unterschiedlich auf die Generationszeiten verschiedener

Bakterienstämme auswirken können (Panter & Symons, 1966; Minashima et al.,

1968), kann die hier ermittelte Generationszeit von 48 Minuten nur auf M13-infizierte

E. coli K38-Kulturen bezogen werden.

4.2 M13-Sekretion aus infizierten E. coli-Zellen

4.2.1 TEM und AFM-Studien an infizierten E. coli DH5α-Zellen

Infizierte E. coli-Zellen sekretieren M13 über die gesamte Zelloberfläche

Die visuelle Darstellung erfolgte anhand zweier unterschiedlicher Mikroskopie-

verfahren, um jeweils die Vorteile der angewandten Methoden nutzen zu können.

Hierdurch sollten detaillierte und aussagekräftige Ergebnisse von M13-infizierten

E. coli-Zellen erhalten werden. Mit Hilfe des Transmissionselektronenmikroskops

(TEM) und des „Atomic Force Microscope“ (AFM) wurden M13-infizierte E. coli-Zellen

untersucht. Zur eindeutigen Bestimmbarkeit von sekretierten M13-Phagen auf den

Zelloberflächen wurde hier der Bakterienstamm DH5α verwendet. Dieser Bakterien-

stamm besitzt, wie in einer elektronenmikroskopischen Aufnahme einer nicht

infizierten Zelle gezeigt wurde, weder F-Pili noch Fimbrien auf seiner Zelloberfläche.

Dies war ein essenzielles Kriterium, da eine Unterscheidung zwischen diesen

zellulären Oberflächenstrukturen und M13-Phagen aufgrund ihrer ähnlichen Gestalt

und Größe nur schwer durchführbar ist. Zwar bilden Zellen nach einer Infektion durch

M13 keine F-Pili mehr aus (Jacobson, 1972), jedoch gilt dies nicht für Fimbrien,

welche zur Adsorption der E. coli-Zellen an Oberflächen dienen. Des Weiteren

wurden die Zellen mit dem speziell für die Visualisierung infizierter Zellen herge-

Diskussion

156

stellten Phagenstamm M13amp transfiziert. Mit Hilfe dieses Phagenstamms waren

infizierte Zellen resistent gegenüber dem Antibiotikum Ampicillin, wodurch eine

Selektion auf und in selektiven Nährmedien möglich war. Da E. coli DH5α keine F-Pili

besitzt, können diese Zellen ausschließlich über eine Transfektion infiziert werden.

Zur eindeutigen Bestimmbarkeit infizierter Zellen wurden diese auf ampicillinhaltigen

Kulturmedien gehalten. Da mit Hilfe des TEM eine bessere Darstellung unter-

schiedlich dichter Materialien wie z.B. elektronendichtem Nanogoldpartikel und mit

Schwermetallen negativ kontrastierten schwach elektronenstreuenden biologischen

Proben möglich ist, wurde aus einer, in ampicillinhaltigem Medium gewachsenen,

E. coli-Kultur eine Probe infizierter Zellen entnommen und diese für die Unter-

suchung am TEM präpariert. Der eindeutige Nachweis der M13-Phagen an den

E. coli-Zellen sollte hier mit Hilfe eines primären Antikörpers gegen das Haupt-

hüllprotein gp8 mit anschließender Bindung eines Sekundärantikörpers erfolgen,

welcher mit Protein-A konjugiertem Nanogold assoziiert war. Die präparierten Zellen

wurden sodann am TEM untersucht. Durch dieses Verfahren konnten während der

TEM-Untersuchungen an E. coli DH5α-Zellen filamentöse Strukturen mit gebun-

denen Nanogoldpartikeln mit Längen zwischen 1,3 – 1,4 µm dargestellt werden (Abb.

3-5, (A), (B), S. 108). Die visualisierten Strukturen waren zum Teil länger als

wildtypische M13-Phagen, was darauf zurückzuführen ist, dass die hier für die

Infektion verwendeten M13amp-Phagen, aufgrund des im Phagengenom inserierten

β-Lactamase-Gens, ein größeres Genom besitzen als die wildtypischen M13-

Phagen. Da sich die Genomgröße direkt auf die Länge des M13-Phagen auswirkt,

sind M13amp-Phagen um ~ 400 – 500 nm länger als wildtypische M13-Phagen. Die

Spezifität der Detektion des Haupthüllproteins gp8 durch das anti-gp8 Serum sowie

der Sekundärdetektion des primär an die M13-Phagen gebundenen Antikörpers mit

Hilfe von Protein-A konjugiertem Nanogold wurde zuvor experimentell in Kap. 3.2.1

anhand von Phagenstammlösungen überprüft. Hier konnten die longitudinalen Seiten

der M13-Phagen, welche sich aus gp8 Proteinen zusammensetzen, mit Nanogold

markiert werden (Abb. 3-4 (A), (B), S.106). Jedoch waren nicht alle Positionen

entlang der longitudinalen Seiten der Phagen mit den 20 nm großen Nanogold-

partikeln besetzt. Im Vergleich hierzu erreichte Guo et al. (2010) durch die Fusion

eines Goldbindepeptids an die N-terminale Domäne des Haupthüllproteins gp8 eine

nahezu völlige Bedeckung der Phagenoberfläche mit 10 nm großen Nanogold-

partikel. Ursachen für diesen hohen Adsorptionsgrad könnten geringere sterische

Diskussion

157

Beeinträchtigungen durch die 10 nm großen Goldpartikel sowie eine erhöhte Affinität

der Goldbindepeptide für Goldpartikel sein. Weiterhin zeigten die in Kapitel 3.2.1 mit

Immunogold markierten und mit Phosphorwolframsäure negativ kontrastierten

Phagen eine Abweichung des Phagendurchmessers von 7 nm auf 20 nm. Während

der Immunogoldmarkierung der Phagen wurden sie zur Verringerung unspezifischer

Bindungen mit bovinem Serumalbumin (BSA) präinkubiert. Aus der Arbeit von

Rozamond et al. (2006) ist bekannt, dass bei BSA-behandelten und mit Phosphor-

wolframsäure kontrastierten M13-Phagen Abweichungen in deren Durchmessern

beobachtet werden. Sie führten die Ursache dieser Abweichung auf eine, durch die

Verwendung von BSA zur Verringerung unspezifischer Antikörperbindungen,

gebildete Schicht auf der Phagenoberfläche zurück, durch die sich eine Verdickung

der filamentösen Strukturen ergibt.

Das AFM stellt eine weitere Mikroskopietechnik dar, um biologische Proben zu

messen. Mit Hilfe des AFM können Oberflächenstrukturen biologischer Proben ohne

aufwändige Vorbehandlungen mit nahezu atomarer Auflösung detailgetreu ge-

messen und dargestellt werden. Für die AFM-Studien an M13-sekretierenden Zellen

diente eine transfizierte E. coli DH5α-Flüssigkultur, wie sie schon bei den Unter-

suchungen mit dem Transmissionselektronenmikroskop verwendet wurde. Die AFM-

Messungen in Kapitel 3.2.3 zeigten Zelloberflächen mit filamentösen Strukturen

deren Längen 1,3 – 1,4 µm betrugen und somit vergleichbar mit denen aus der TEM-

Studie waren. Im Vergleich zu den TEM Untersuchungen waren hier die sekretierten

M13-Phagen nicht nur auf die Zellpole beschränkt. In der AFM-Studie konnten

infizierte Zellen gemessen werden, welche M13-Phagen über die gesamte Zellober-

fläche sekretierten. Dieser Unterschied zu der TEM-Studie war wahrscheinlich ein

Effekt, der auf die probenschonendere Präparationsmethodik für AFM-Messungen

zurück zu führen ist. Während die Proben für die TEM-Untersuchungen, aufgrund der

Antikörper- und Protein-A Nanogold-Markierungen, mehrmaligen Waschschritten

unterzogen wurden, in denen vermutlich sekretierte Phagen auf den Zelloberflächen

abgeschert wurden, konnten diese während der Probenaufbereitung für die AFM-

Messungen durch die weniger aufwändige Präparationsmethode auf den Zellober-

flächen bewahrt werden. Hier wurden die infizierten Zellen maximal 3-mal mittels

Zentrifugation bei geringen Zentrifugalkräften gewaschen, um Salze und Verunreini-

Diskussion

158

gungen aus den Kulturmedien zu entfernen, die sich sonst störend auf die AFM-

Messungen ausgewirkt hätten.

Durch die AFM-Messung uninfizierter E. coli DH5α-Zellen konnte sichergestellt

werden, dass dieser Stamm keine filamentösen Strukturen auf der Zelloberfläche

besaß.

4.2.2 Extrusionsverlauf der M13-Phagen auf der Zelloberfläche von E. coli

Alamethicin und das Ionophor Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazon (CCCP)

eignen sich zur Konservierung der Stadien infizierter E. coli-Zellen

Mit Hilfe der aus Kap. 3.1 erhaltenen Informationen über den Infektions- bzw. Sekre-

tionsverlauf sollte der Extrusionsverlauf der M13-Phagen direkt auf der Zellober-

fläche von E. coli XL1-blue, in Abhängigkeit von der Zeit nach erfolgter Infektion, mit

dem AFM gemessen und visualisiert werden. Aus den Ergebnissen, welche für den

wildtypischen Sekretionsverlauf in Kapitel 3.1.1 erhalten wurden, ging hervor, dass

die Sekretion erster Phagen-Nachkommen zwischen der 5. und 6. Minute nach

Rekultivierung der infizierten Zellen bei 37°C erfolgte. Zwischen der 8. und 10.

Minute fand die exponentielle Vermehrung der Phagen statt. Dies zeigte, dass die

Sekretion neuer Phagen aus den E. coli-Zellen ein sehr schnell ablaufender Prozess

war. Damit jedoch eine zeitliche Abfolge der einzelnen Extrusionsstadien nach

Infektion mit dem AFM gemessen werden konnte, wurde zu den, nach Infektion und

Rekultivierung, aus der E. coli XL1 Kultur entnommenen Proben Alamethicin und

Carbonylcyanid m-Chlorophenylhydrazon (CCCP) zugegeben. Bei diesen Sub-

stanzen handelt es sich um Ionophore, die in der Zytoplasmamembran von E. coli

Poren bilden (Jones et al., 1980, Fox & Richards, 1982), welche die protonen-

motorische Kraft rasch zusammenbrechen lassen (Cavari et al., 1966, Gášková et

al., 1999). Hierdurch war die Möglichkeit gegeben, eine Konservierung der zellulären

Oberflächen von E. coli-Zellen zum Probenentnahmezeitpunkt zu erhalten, da der

Sekretionsprozess von M13 ATP-abhängig ist (Feng et al., 1997). Für diesen

Versuch wurde der E. coli-Stamm XL1-blue verwendet, da dieser F-Pili besitzt, über

welche die Zellen mit M13 infiziert werden können. Hierdurch konnte der wildtypische

Infektionsverlauf aus Kap. 3.1.1 auf diesen Bakterienstamm übertragen werden. Die

F-Pili der Zellen wirkten sich hier nicht störend auf die AFM-Messungen aus, da

diese nach M13-Infektion nicht mehr ausgebildet werden (O´Callaghan et al., 1973).

Im Vergleich zu E. coli K38 aus Kap. 3.1.1, besitzt E. coli XL1-blue keine, durch ihr

Diskussion

159

Aussehen und Längen störenden, Fimbrien. Wie aus der AFM-Messung uninfizierter

E. coli XL1-blue Zellen in Kapitel 3.2.4.1 hervorging, waren auf den Oberflächen der

Bakterien keinerlei filamentöse Strukturen zu erkennen. Die Abwesenheit der F-Pili

könnte hier eine Folge der Probenpräparation sein. Während der Präparation

könnten durch die einzelnen Waschschritte Abscherungen der labilen F-Pili verur-

sacht worden sein.

Phagensekretion beginnt nach 5 Minuten an den Zellpolen von E. coli

Aus den AFM-Messungen der Proben in Kapitel 3.2.4.1 ging hervor, dass nahezu in

Übereinstimmung mit der „one-step growth“ Kurve aus Kapitel 3.1.1 nach 5 Minuten

erste filamentöse Strukturen an den Zellpolen zu sehen waren. Da diese Strukturen

in Aussehen und Länge (1 – 1,4 µm) den Phagenstrukturen der elektronenmikros-

kopischen Aufnahmen in Kapitel 3.2.2 und der AFM-Messungen M13-infizierter

E. coli DH5α-Zellen in Kapitel 3.2.3 entsprechen, kann davon ausgegangen werden,

dass es sich auch bei den hier am Zellpol visualisierten filamentösen Strukturen um

M13-Phagen handelt. Eine zusätzliche Identifikation der Strukturen über eine

Immunogoldmarkierung, wie es für die TEM-Studien in Kapitel 3.2 angewendet

wurde, wäre hier aufgrund des AFM-Funktionsprinzips sowie dem zu geringen

Größenunterschied zwischen den Nanogoldpartikeln und dem Hintergrund des AFM-

Probenträgers, welcher durch auskristallisierende Salze verursacht wird, nicht

möglich gewesen.

Phagensekretion breitet sich innerhalb von 9 Minuten über die gesamte

Zelloberfläche aus

In der Zeit zwischen der 6. und 7. Minute nahm die Anzahl der Phagen zu den

longitudinalen Seiten der Zelle hin zu. Ab der 8. Minute zeigte die „one-step growth“

Kurve in Kapitel 3.1.1 den Beginn der exponentiellen Phagenvermehrung. Die AFM-

Messungen der entsprechenden Proben ab der 8. Minute zeigten, dass die Sekretion

der Phagen-Nachkommen nun nicht mehr nur auf die Zellpole beschränkt war,

sondern sich jetzt über die gesamte Zelloberfläche erstreckte. Innerhalb der 10. bis

14. Minute steigerte sich exponentiell die Anzahl der sekretierten Phagen, so dass

diese über die gesamten Bakterienoberflächen sekretiert wurden. Nach der 14.

Minute waren die Zelloberflächen soweit mit Phagen belegt, dass sich zu den

Messungen der Bakterien zum Zeitpunkt der 16. Minute keine Veränderungen mehr

ergaben. Wie schon aus der wildtypischen „one-step growth“ Kurve hervorging,

Diskussion

160

erfolgt die Sekretion neuer Phagen durch den infizierten Wirt innerhalb eines kurzen

Zeitraums. Die AFM-Messungen zeigten, dass die Sekretion zunächst an den

Zellpolen beginnt und sich daraufhin sehr schnell und mit zunehmender Anzahl über

die gesamte Zelloberfläche hin ausbreitet. Der Anlass für den Beginn der

Phagensekretion an den Zellpolen ist noch unklar. In der Arbeit von Edgar et al.

(Edgar et al., 2008) konnte mittels Quantum-Dot markierter Phagen gezeigt werden,

dass sowohl nach der Bindung von T4 an die äußeren Membranproteine OmpF und

OmpC (Hashemolhosseini et al., 1994) als auch nach der Bindung des Phagen λ an

den Maltoporinrezeptor LamB (Ryter et al., 1975) die adsorbierten Phagen zu den

Zellpolen transportiert werden und dort die Aufnahme der Phagen-DNA in die Zellen

erfolgt. Außerdem konnten sie durch Fluoreszenzmarkierung des mannosespezi-

fischen Enzyms IIC ManY, welches bei der Aufnahme der λ-Phagen-DNA essenziell

ist (Scandella & Arber, 1974), und der Protease FtsH, welche über den lysogenen

oder lytischen Weg des Phagen λ bestimmt (Herman et al., 1997), zeigen, dass diese

Proteine an den Zellpolen lokalisiert sind. M13 hingegen nutzt für die Infektion von

E. coli-Zellen den F-Pilus (Marvin & Hohn, 1969). Nach Adsorption an den F-Pilus

verkürzt sich dieser (Jacobson, 1972), wodurch der Phage mit dem bakteriellen

TolQRA in der Zytoplasmamembran in Kontakt kommt, welches für die Aufnahme der

Phagen-DNA in die Zelle verantwortlich ist (Click & Webster, 1997, 1998). TolQRA ist

für die Aufnahme des bakteriellen Colicin A in die Zytoplasmamembran verant-

wortlich (Davies & Reeves, 1975a, 1975b), in der es spannungsabhängige Kanäle

bildet (Bourdineaud et al., 1990). Die Aufnahme des Colicin A erfolgt über die

Bindung an BtuB und OmpF (Cavard & Lazdunski, 1981) in der äußeren Membran

von E. coli. Aus den Ergebnissen von Edgar, Cavard und Lazdunski könnte

geschlossen werden, dass das bakterielle TolQRA, welches das OmpF gebundene

Colicin A in die Membran transloziert, sich ebenfalls am Zellpol befindet und daraus

resultierend die Aufnahme der M13-DNA auch dort erfolgt. Von Trenkner et al. und

Smilowitz (Trenkner et al., 1967, Smilowitz, 1974) konnte gezeigt werden, dass bei

einer M13-Infektion die in die Zytoplasmamembran inserierten Hüllproteine wieder in

neugebildete Phagen eingebaut werden. Dies bedeutet, dass durch die in der

Zytoplasmamembran verbleibenden Hüllproteine aus der Infektionsphase eine

anfänglich präferierte Sekretionsstelle an den Zellpolen vorhanden wäre und die

Sekretion hierdurch an den Zellpolen beginnen könnte.

Diskussion

161

4.3 Funktionelle Präsentation antigener Epitope am N-Terminus des „Minor

Coat“ Proteins gp9

Insertion antigener Epitope am N-Terminus von gp9

Das „Minor Coat“ Protein gp9 ist mit 32 Aminosäuren eines der kleinsten von

Ribosomen translatierten Proteine (Russel et al., 2004). Verglichen mit dem „Minor

Coat“ Protein gp3 und dem Haupthüllprotein gp8 wird gp9 ohne N-terminale

Signalsequenz (Kuhn et al., 1986, Peters et al., 1994) synthetisiert. Von Endemann

und Model (Endemann & Model, 1995) konnte gezeigt werden, dass eine an die

N-terminale Domäne inserierte Glutathion-S-Transferase (GST) als antigenes Epitop

verwendet werden kann. Jedoch war das über 35 kDa schwere gp9-GST-Fusions-

protein aufgrund seiner Größe nicht geeignet, einen M13-Phagen mit Ambermutation

in Gen 9 in trans zu komplementieren. Während die Translokation des „Minor Coat“

Proteins gp3 über die Translokase SecYEG (Thie et al., 2008) und die des gp8 über

YidC (Samuelson et al. 2000) erfolgt, ist der Translokationsweg des gp9 in die

Zytoplasmamembran noch nicht eindeutig dargelegt worden. In der Arbeit von

Houbiers (Houbiers et al. 2001), in welcher die Translokation der gp9 Proteine in vitro

in künstlich hergestellte Liposomen aus DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-

cholin) und DOPG (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol) untersucht wurde,

wurde die These aufgestellt, dass dieses Protein aufgrund seiner geringen Größe

spontan in die Membran inseriert. Aus der Arbeit von Endemann und Model

hingegen ging hervor, dass die Fusion eines großen Proteins an die N-terminale

Domäne des gp9 nicht funktional ist. Deshalb sollte ähnlich der Arbeit von Facey und

Kuhn (Facey & Kuhn, 2003), in welcher über N-terminale T7- und HA-Epitope gezeigt

werden konnte, dass das Sensor-Kinaseprotein KdpD unabhängig von den Trans-

lokasen SecYEG und YidC in die Cytoplasmamembran transloziert wird, hier eben-

falls mit Hilfe funktionell präsentierter N-terminaler Epitope am „Minor Coat“ Protein

gp9 die Assemblierung am M13-Phagen verfolgt und die Translokation untersucht

werden. Hierfür wurde das Gen 9 in den Expressionsvektor pMS119EH kloniert und

über die QuikChange® Methode eine MunI-Schnittstelle in die N-terminale Domäne

eingefügt. Über diese Schnittstelle wurden Oligonukleotide inseriert, welche 17, 19,

32, und 36 Aminosäuren lange Peptide kodierten (Abb. 4-2). Auf diese Weise

konnten sowohl T7- als auch HA-Epitope mit unterschiedlichen Längen an die

N-terminale Domäne von gp9 fusioniert werden. Hierdurch sollte der insgesamt

hydrophobe Charakter des N-terminalen Bereichs erhalten bleiben und durch eine

Diskussion

162

Verlängerung der N-terminalen Domäne eine verbesserte Detektion der antigenen

Epitope mit Hilfe spezifischer Antikörper erreicht werden. Des Weiteren erfolgte in

den Konstrukten gp9T7rep, gp9DT7rep, gp9HArep und gp9DHArep die Wiederher-

stellung der wildtypischen Aminosäurenfolge des gp9 (Abb. 4-2) nach den kodier-

enden Sequenzen der inserierten Epitope. Durch die wildtypische Proteinstruktur an

den Enden der Epitope sollte eine eventuelle Interaktion zwischen gp9 und gp7

wiederhergestellt werden. Außerdem wurde vor das Gen 9 der jeweiligen Konstrukte

eine verbesserte „Shine-Dalgarno“-Sequenz (AGGAGG; Shine & Dalgarno 1974)

eingefügt, durch die eine gesteigerte Expression der Fusionsproteine erreicht werden

sollte.

Abb. 4-2: Schematische Darstellung der erzeugten gp9-Konstrukte mit Angabe der zusätzlich inserierten Aminosäuren. Die Anzahl der zusätzlich an die N-terminale Domäne von gp9 inserierten Aminosäuren ist grau hinterlegt. Die dem Wildtyp entsprechende Originalsequenz ist in den rep-Konstrukten schwarz hinterlegt (Ref.: Ploss & Kuhn, 2011)

Diskussion

163

Gp9-Konstrukte mit T7- und HA-Epitopen sind befähigt einen M13-Phagen mit

Ambermutation in Gen 9 in trans zu komplementieren

Die Komplementation stellt eine Methode dar, um die Funktionalität der genetisch

veränderten Proteine während der Phagenreproduktion in vivo zu überprüfen.

Deshalb wurden die hergestellten gp9-Konstrukte in Tabelle 3-5 in Komplemen-

tationsassays dahingehend untersucht, ob die in trans exprimierten Proteine befähigt

waren, an dieser Stelle eine Ambermutation in Gen 9 eines M13-Phagen funktionell

ersetzen zu können.

Im Gegensatz zum Komplementationstest von Endemann und Model (Endemann &

Model, 1995), welcher mit einem gp9-GST-Fusionsprotein durchgeführt wurde, zeigte

sich durch Plaquebildungen in den Komplementationstests in Kapitel 3.3.1, dass

sowohl alle gp9 Mono-Tag- als auch alle gp9 Doppel-Tag-Konstrukte befähigt waren

die Ambermutation des M13am9-Phagen in trans zu ersetzen. Im direkten Vergleich

mit der wildtypischen M13am9-Vermehrung auf dem Suppressorstamm E. coli K37

zeigten die Komplementationen aller untersuchten gp9-Konstrukte eine nahezu

wildtypische Vermehrung. Dass die Komplementationen durch die gp9-Konstrukte

zustande kamen, konnte anhand des Vergleichs zwischen uninduziertem nicht-

Suppressorstamm E. coli K38 mit transformierten pMSg7/9 und dem Komplemen-

tationstest auf E. coli K38 mit induzierten gp9T7- und HA-Konstrukten gezeigt

werden. Die auf dem uninduzierten Bakterienrasen von E. coli K38 + pMSg7/9

gebildeten Plaques, welche bis zu einer Verdünnungsstufe von 103 pfu/ml zu sehen

sind, wurden durch Revertanten und eine geringe Transkriptionsrate des gp9

verursacht und stellen somit den unspezifischen Hintergrund der Komplemen-

tationstests dar. Dass in der Phagenstammlösung von M13am9 Revertanten vor-

handen waren, ging auch aus dem Komplementationstest der M13am9-Phagen auf

dem Bakterienrasen des nicht-Suppressorstamms E. coli K38 hervor, da hier in der

Verdünnungsstufe von 106 pfu/ml eine geringe Plaquebildung zustande kam. Im

Vergleich zu den HA-Tag-Konstrukten konnten nur die T7-Tag-Konstrukte eine

wildtypische Vermehrung bis zur Verdünnungsstufe von 101 pfu/ml erreichen. Die

HA-Tag-Konstrukte zeigten hier eine Vermehrung bis zur Verdünnungsstufe von

102 pfu/ml, was eine Potenz niedriger als bei den T7-Tags ist. Der Grund hierfür ist

unklar, jedoch könnten die negativen Ladungen in den antigenen HA-Epitopen dieser

Konstrukte, welche hier durch vier Aspartate verursacht werden, dafür verantwortlich

sein. Aufgrund dieser Ladungen ist der Translokationsvorgang über die Zytoplasma-

Diskussion

164

membran energieaufwendiger (Facey & Kuhn, 2004). Hierdurch könnte es dazu

kommen, dass mengenmäßig mehr gp9T7-Konstrukte innerhalb einer kurzen Zeit-

spanne in die Membran transloziert werden als gp9HA-Konstrukte, wodurch eine

Limitierung während der Phagensekretion zustande käme und mehr Phagen mit T7-

Konstrukten gebildet werden könnten. Im Gegensatz zu dem von Endemann und

Model (Endemann & Model, 1995) verwendeten antigenen GST-Epitop (Glutathion-

S-Transferase) an der N-terminalen Domäne von gp9 konnten hier, durch die Inser-

tion kürzerer N-terminaler Peptide mit Längen von 17-36 Aminosäuren, nahezu wild-

typische Titer des M13am9-Phagen erhalten werden.

N-terminale T7- und HA-Epitope haben keine negativen Effekte auf die gp9-

Expression

Endemann und Model (Endemann & Model 1995) war es möglich mit Hilfe eines

30 kDa schweren GST-Proteins, welches N-terminal an gp9 fusioniert wurde, mittels

eines spezifischen anti-GST Serums die Expression des plasmidkodierten Fusions-

proteins in E. coli-Zellen durch Western-Blot Analyse nachzuweisen. Vergleichsweise

konnte hier in den Kapiteln 3.3.2 und 3.3.3 ebenfalls die Expression des plasmid-

kodierten gp9 mit Hilfe von N-terminal fusionierten antigenen T7- und HA-Epitopen in

E. coli K38 nachgewiesen werden. Die Autoradiogramme zeigten, dass sich sowohl

die gp9 Mono-Tag-Konstrukte mit zusätzlichen 17 (HA-Tag) bzw. 19 (T7-Tag) Amino-

säuren als auch die gp9 Doppel-Tag-Konstrukte mit zusätzlichen 32 (HA-Tag) bzw.

36 (T7-Tag) Aminosäuren in den E. coli-Zellen in trans exprimieren ließen. Durch den

Vergleich des exprimierten gp9T7repSD-Konstrukts mit dem Haupthüllprotein gp8,

welches ein Molekulargewicht von 5,2 kDa besitzt, konnte dem T7-Fusionsprotein ein

Molekulargewicht von ~ 5,2 kDa bis 5,5 kDa zugeordnet werden. Aufgrund der

Insertion des antigenen, 19 Aminosäuren langen, T7-Epitops war dieses Konstrukt

~ 1,9 kDa schwerer als das wildtypische gp9, welches laut Literatur nur ~ 3,6 kDa

schwer ist (Rasched & Oberer, 1986). Da die weiteren, über Immunpräzipitation

nachgewiesenen, gp9T7-, HA- und HArep-Mono-Tag-Konstrukte in Kapitel 3.3.2 nur

2 – 4 Aminosäuren weniger besitzen als gp9T7repSD, kann davon ausgegangen

werden, dass auch diese Konstrukte ~ 5,2 kDa bis 5,5 kDa schwer sind.

Im Gegensatz zu den gp9 Mono-Tag-Konstrukten konnte bei den Expressionsstudien

der gp9 Doppel-Tag-Konstrukte mit Hilfe der Immunpräzipitationen in den Autoradio-

grammen jeweils ein weiteres, ~ 2 kDa leichteres, Protein in den Proben der

Diskussion

165

Konstrukte nachgewiesen werden. Eine eindeutige Aussage, um welches Protein es

sich jeweils handelt, kann hier nicht gemacht werden. Eine mögliche Erklärung

könnte jedoch sein, dass durch periplasmatische Proteasen an den verlängerten

N-terminalen Domänen der Konstrukte eine proteolytische Abspaltung eines

antigenen Epitops stattgefunden haben könnte und die Doppel-Tag-Konstrukte so zu

Mono-Tag ähnlichen Formen prozessiert wurden (Abb. 4-3). Anhand der verblie-

benen antigenen Epitope könnten durchaus mit Hilfe der Immunpräzipitation Mono-

Tag-Formen nachgewiesen werden. Dies würde bedeuten, dass in den 20 Minuten,

in denen die Expression der Proteine induziert und diese radioaktiv markiert wurden,

ein Abbau der N-terminalen Domäne im Periplasma erfolgte.

N-terminale T7- und HA-Epitope zeigen keine negativen Effekte auf die

Membraninsertion

Die Membraninsertion der gp9-Konstrukte mit N-terminalem T7- bzw. HA-Tag wurde

durch radioaktive Markierungen der in E. coli exprimierten gp9-Konstrukte mit an-

schließenden Protease-Mappings untersucht. Hier konnten in Kapitel 3.3.2 sowohl für

das gp9T7-Mono-Tag- als auch für das gp9HA-Mono-Tag-Konstrukt durch die pro-

teolytische Abspaltung der antigenen Epitope der Einbau der gp9-Konstrukte in die

Zytoplasmamembran nachgewiesen werden. Während aus den Proteinase K behan-

delten Proben keine gp9-Konstrukte durch Immunpräzipitation nachgewiesen werden

konnten, war es möglich gp9-Konstrukte aus den Proteinase K unbehandelten

Abb. 4-3: Schematische Darstellung der proteo-lytischen Prozessierung von gp9 Doppel-Tag- zu gp9 Mono-Tag-Konstrukten durch periplasmatische

Proteasen.

Diskussion

166

Proben mit Hilfe von T7- und HA-Antiseren durch Immunpräzipitation nachzuweisen.

Die Abspaltungen der Epitope zeigten, dass der N-Terminus der gp9-Konstrukte peri-

plasmatisch lokalisiert und für Proteasen zugänglich war. Zudem belegte dies, dass

die Insertion eines antigenen Epitops mit zusätzlichen negativen Ladungen in die

N-terminale Domäne von gp9, wie im Fall des HA-Tags, keine unmittelbaren Auswir-

kungen auf die Membraninsertion hatte und somit für die Assemblierung neuer M13-

Phagen zur Verfügung stehen sollte. Die Unversehrtheit der hergestellten Sphero-

plasten in den durchgeführten Protease-Versuchen ging aus dem proteolytisch

unprozessierten GroEL und die proteolytische Aktivität der Proteinase K aus dem

Abbau des OmpA hervor.

N-terminal inserierte Epitope können mit Hilfe spezifischer Antikörper am M13-

Phagen detektiert werden

In Komplementationstests (Kap. 3.3.1), Expressionsnachweisen (Kap. 3.3.2, 3.3.3)

und Membraninsertionsnachweisen (Kap 3.3.4) konnte gezeigt werden, dass die

hergestellten gp9-Konstrukte funktionsfähig waren und theoretisch für die Phagen-

assemblierung in der Zytoplasmamembran zur Verfügung standen. Durch Infektion

der konstruktexprimierenden E. coli K38-Zellen mit M13am9 wurden, in Folge der

Substitution des wildtypischen gp9 in trans durch T7-, HA-Mono- bzw. T7-, HA-

Doppel-Tag-gp9, Phagen hergestellt, welche theoretisch die gp9-Konstrukte in der

Phagenhülle aufweisen sollten. Nach Titration der Phagenstammlösungen konnte mit

Hilfe von Dot-Blot Analysen, T7 und HA spezifischer Antikörper, der Nachweis der

antigenen Epitope am gp9 in den einzelnen Tag präsentierenden Phagen mittels

Chemolumineszenz nachgewiesen werden. Die ECL-Signale auf den Röntgenfilmen

bestätigten, dass die hier in gp9 inserierten Peptide durch Antikörper detektierbar

waren und die gp9-Konstrukte während der Assemblierung neuer M13-Phagen an

Stelle des wildtypischen gp9 eingebaut wurden. Der Vergleich der Dot-Blot Analysen

von Mono- und Doppel-Tag präsentierenden Phagen in Kapitel 3.3.5.1 zeigte, dass

die Detektion der antigenen Epitope der gp9 Doppel-Tag-Phagen besser war, da

noch bei der geringen Anzahl von 107 Phagen schwache Chemolumineszenz-

Signale nachgewiesen werden konnten. Bei den Mono-Tag-Konstrukten konnten

Chemolumineszenz-Signale nur bis 108 Phagen detektiert werden. Wegen der

Präsenz von zwei antigenen Epitopen besteht wahrscheinlich bei den Doppel-Tag-

Konstrukten die Möglichkeit, eine verbesserte Detektion durch die Bindung der

Diskussion

167

doppelten Anzahl von Antikörpern zu erreichen. Jedoch stellt die Dot-Blot Analyse

nur eine quantitative Methode dar, wodurch es schwierig ist, qualitative Aussagen zu

treffen. Aufgrund statistischer Pipettierfehler in der Größenordnung von ~ 10 % kann

davon ausgegangen werden, dass nicht alle hergestellten Verdünnungsstufen die

gleichen Phagenmengen besaßen. Während bei den T7-Konstrukten mit der

Zunahme der Epitopanzahl die Intensität der Detektionen an den Virionen abnahm,

konnte diese im Fall der HA-Konstrukte gesteigert werden. Da sich in den Expres-

sionsnachweisen der gp9 Doppel-Tag-Konstrukte in Kapitel 3.3.3 durch die Immun-

präzipitationen der Konstrukte ein weiteres, ~ 2 kDa leichteres, Protein identifizieren

ließ, könnte davon ausgegangen werden, dass diese Konstrukte nicht sehr stabil

sind und während der Assemblierung neuer Phagen die gp9 Doppel-Tag-Konstrukte

durch periplasmatische Proteasen zu Mono-Tag ähnlichen Formen prozessiert und in

die Phagenhülle eingebaut werden. Hierdurch würde sich die Anzahl der antigenen

Epitope und in Folge das ECL-Signal bei einer Dot-Blot Analyse verringern.

Zusätzlich müssen hier auch die unterschiedlichen Nachweisqualitäten der hier

verwendeten Erstantikörper berücksichtigt werden, da beide vermutlich nicht

vergleichbar gut an ihre antigenen Epitope binden.

Der ECL-Signalunterschied zwischen gp8 und den gp9-Konstrukten liegt, außer an

den Erstantikörper-Nachweisqualitäten, vermutlich an der Ratio von 135 gp8 zu

1 gp9 im Phagen (Endemann & Model, 1995). Dadurch werden mehr primäre sowie

Peroxidase gekoppelte sekundäre Antikörper an gp8 gebunden und folglich während

der ECL-Reaktion stärkere Signale erhalten.

Antigene Epitope der gp9-Konstrukte sind am Phagen für Antikörper

zugänglich und ermöglichen die Bindung von Goldnanopartikeln

Die Visualisierung phagenpräsentierter gp9-Tag-Konstrukte erfolgte mit Hilfe von

Protein-A konjugiertem Nanogold und anschließender elektronenmikroskopischer

Untersuchungen. Hier wurden die gp9-Konstrukt präsentierenden Phagen zuerst mit

primären Antikörpern gegen das jeweils vorhandene Epitop und anschließend mit

Protein-A konjugiertem Nanogold inkubiert. Diese Methode des Nachweises

inserierter antigener Epitope wurde ebenfalls von Gao et al. (Gao et al., 1999), nach

Insertion der variablen Region der schweren und leichten Kette eines Kokain-

Antikörpers in die M13-Phagenhüllproteine gp7 und gp9, und von Løset et al. (Løset

et al., 2011), nach Insertion eines Fragments des T-Zell Rezeptors (scTCR) in die

Diskussion

168

M13-Phagenhüllproteine gp7 und gp9, angewendet. Für das Display der antigenen

Epitope verwendeten beide Arbeitsgruppen ein Helferphagensystem, durch welches

ein monovalentes „Phage-Display“ zustande kommt, bei dem weniger als 10 % der

veränderten gp9-Konstrukte in die Phagenhülle inseriert werden (Russel et al., 2004).

Trotz der geringen Insertionsrate konnten beide Arbeitsgruppen durch die Bindung

von Protein-A konjugiertem Nanogold an die Phagenspitze die inserierten Epitope in

den Hüllproteinen gp7 und gp9 nachweisen. Im Vergleich hierzu wurden die hier

konstruierten gp9T7- und HA-Konstrukte, nach Infektion der konstruktexprimierenden

E. coli K38-Zellen mit M13am9, in trans für die Assemblierung bereitgestellt und in

Folge der Substitution des wildtypischen gp9 durch die Konstrukte Phagen herge-

stellt, welche theoretisch ausschließlich gp9-Konstrukte in der Phagenhülle auf-

weisen sollten. Durch die elektronenmikroskopischen Untersuchungen und den

Nachweis polar gebundener Nanogoldpartikel an den jeweiligen gp9T7- und HA-

Konstrukt präsentierenden Phagen konnte gezeigt werden, dass die Präsentation

antigener Epitope am „Minor Coat“ Protein gp9 auch unabhängig von einer zusätz-

lichen N-terminalen Leadersequenz und eines Helferphagensystems erfolgen kann.

4.3.1 Die Translokation des Konstrukts gp9T7SD erfolgt durch die Membran-

insertase YidC

Für das Sensor-Kinaseprotein KdpD konnte von Facey und Kuhn (Facey & Kuhn,

2003) mit Hilfe eines N-terminal lokalisierten HA-Epitops nachgewiesen werden, dass

KdpD unabhängig von den Translokasen Sec und YidC in die Zytoplasmamembran

von E. coli transloziert wird. Vergleichbar wie für KdpD, sollte auch hier für das „Minor

Coat“ Protein gp9 die Translokation des Proteins in Abhängigkeit von YidC anhand

eines T7-Epitops in der N-terminalen Domäne untersucht werden. Hierfür erfolgte die

Expression des Konstrukts gp9T7SD in E. coli JS7131 in Abwesenheit von YidC, was

durch eine Western-Blot Analyse bestätigt wurde. Anhand eines „Pulse“-Experiments

und Protease-Mappings konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit von YidC keine

Abspaltung des N-terminalen T7-Epitops durch Proteinase K erfolgte, wodurch sich

gp9T7 durch Immunpräzipitation nachweisen ließ. Im Vergleich hierzu erfolgte in

Anwesenheit von YidC der Abbau des N-terminalen T7-Epitops durch Proteinase K,

wodurch gp9T7 durch Immunpräzipitation nicht mehr nachweisbar war. Dies zeigte,

dass die Translokation von gp9T7SD, ebenso wie die des M13-Haupthüllproteins

gp8 (Samuelson et al., 2001, Stiegler et al., 2011), von YidC abhängig ist. Die

Diskussion

169

Unversehrtheit der im Protease-Mapping hergestellten Spheroplasten ging aus dem

unverdauten GroEL und die proteolytische Aktivität der Proteinase K aus dem

abgebauten OmpA hervor. Von Houbiers et al. (Houbiers et al., 2001) wurden mit

Hilfe überexprimiertem und anschließend gereinigtem gp9 in vitro Insertionsstudien

durchgeführt. Nach einer Reinigung des Proteins aus E. coli erfolgte die Inkubation

von gp9-Molekülen mit künstlich hergestellten Lipid-Monolayern aus DOPC und

DOPG. Die Insertion von gp9 in die Lipidschichten wurde über die Veränderung des

Oberflächendrucks dieser Monolayer verfolgt. Aufgrund der Beobachtung einer

Druckzunahme auf den Oberflächen der Monolayer nach Zugabe von gereinigtem

gp9, postulierte diese Arbeitsgruppe, dass gp9 wegen seiner geringen Größe

spontan in Lipidmembranen inseriert und dies wohl auch in vivo der Fall sein könnte.

4.4 Massenbestimmung des gp1/11-Assembly-Komplexes

Die Phagenassemblierung stellt einen sekretorischen Prozess an der inneren E. coli-

Membran dar. Dabei entsteht der Phagenpartikel direkt durch die Umhüllung der

einzelsträngigen Phagen-DNA mit spezifischen Phagenhüllproteinen, welche nach

ihrer Synthese in die innere Membran transloziert und über den, für die Assem-

blierung essenziellen, gp1/11-Assembly-Komplex herangeführt werden (Silver &

Wickner, 1980, Rapoza & Webster, 1995, Marvin 1998). Das Leseraster des Gens 1

kodiert für zwei Genprodukte, gp1 und gp11 (Russel & Model 1989, Guy-Caffey et

al., 1992, Russel 1993). Die Synthese von gp1 und gp11 erfolgt über eine polycis-

tronische mRNA ohne N-terminale Signalsequenz. Die in der inneren Membran

lokalisierten Genprodukte sind essenziell für die Assemblierung des Phagen. Von

Russel (Russel, 1991) konnte gezeigt werden, dass der zytoplasmatische Bereich

des gp1 ein Nukleotid-Bindemotiv besitzt und von Feng (Feng et al., 1997), dass die

Phagenassemblierung ATP benötigt. Weiter konnte Kazmierczak (Kazmierczak et al.,

1994) nachweisen, dass die periplasmatisch lokalisierten Termini von gp1 und gp4

miteinander interagieren. Über diesen 2-Komponenten-Komplex werden die neu

gebildeten M13-Phagen aus den E. coli-Zellen in die äußere Umgebung sekretiert

(Rapoza & Webster, 1995, Haigh & Webster 1999). Eine weitere und essenzielle

Komponente des gp1/11-Assembly-Komplexes ist das E. coli-Protein Thioredoxin

(Russel & Model, 1985, 1986), dessen Rolle im Assembly-Komplex noch ungeklärt

ist.

Diskussion

170

Gp1 und gp11 liegen im Verhältnis von ~ 1:1,4 in exprimierenden E. coli C41-

Zellen vor

Damit ausreichende Mengen an gp1/11-Assembly-Komplexen für eine Quantifi-

zierung ihrer Masse und ihrer anschließenden Visualisierung mittels TEM erhalten

werden konnten, wurde das Gen I aus dem Genom des M13-Phagen mittels PCR

amplifiziert und in den Vektor pET-16b kloniert. Die Expression erfolgte anschließend

in E. coli C41-Zellen. Mit Hilfe eines, gegen die C-terminale Domäne gerichteten,

Antikörpers ließ sich die Expression von gp1 und gp11 in den Zellen durch eine

Western-Blot Analyse nachweisen. Hier konnte ein Protein mit einer Masse von

~ 39 kDa als gp1 und ein weiteres mit einer Masse von ~ 12 kDa als gp11 identifiziert

werden, die mit den Massen übereinstimmen, die Guy-Caffey für die Genprodukte 1

und 11 des filamentösen Phagen f1 aus infizierten E. coli-Zellen beschrieben hatte

(Guy-Caffey et al., 1992). Ein anschließender Versuch einer Quantifizierung eines

Western-Blots zur Ermittlung des Expressionsverhältnisses von plasmidexprimiertem

gp1 und gp11 in E. coli C41 durch den Vergleich von drei gp1-Banden mit der von

drei gp11-Banden ergab, dass über das pET-Vektor-System ein gemitteltes

Verhältnis von einem gp1 zu ~ 1,5 gp11 (Abb. 4-4) in den Zellen vorlag. Jedoch ist

bei solch einer Quantifizierung zu beachten, dass allgemein die erzeugten Signale in

antikörpervermittelten Proteindetektionen von den Qualitäten und Spezifitäten der

verwendeten Erst- und Zweitantikörper abhängig sind und hierdurch nur beschränkt

aussagekräftige Ergebnisse erhalten werden. Dass es sich in der Western-Blot

Analyse um gp1 und gp11 handelte, ging aus der antikörperspezifischen Detektion

und aus dem direkten Vergleich mit den Negativkontrollen hervor. Guy-Caffey et al.

(1992) konnten für f1-infizierte E. coli-Zellen anhand einer Western-Blot Analyse

zeigen, dass hier die Proteine ein Verhältnis von einem gp1 zu 1 - 2 gp11 in den

Zytoplasmamembranen aufwiesen. Dies zeigt, dass auch in einem E. coli-

Expressionssystem, in welchen gp1/11 über ein pET-Vektor-System unabhängig von

anderen M13-Proteinen exprimiert wird, die Proteine in nahezu wildtypischem

Verhältnis synthetisiert werden können. Bei den durchgeführten gp1/11-Expressions-

experimenten in Kap. 3.5.1 war außerdem aus den Western-Blot Analysen

ersichtlich, dass sich die Mengen von gp1 und gp11 nach zweistündiger Expression

verringerten. Diese Mengenminderung ist wahrscheinlich ein Effekt, der auf eine

Hemmung des Bakterienwachstums durch die verstärkte Expression des gp1/11-

Assembly-Komplexes zurückzuführen ist, wie dies auch schon von Horabin &

Diskussion

171

Webster (1986, 1988) und Guy-Caffey & Webster (1993) bei der Überexpression von

gp1 beobachtet wurde. Sie vermuteten, dass die gp1-Monomere in der Zytoplasma-

membran Poren bilden, welche einen Zusammenbruch des Membranpotentials

verursachen, da während einer ausschließlichen Expression von gp11 das bakterielle

Wachstum unverändert blieb (Rapoza und Webster, 1993). Die Hemmung des Bak-

terienwachstums konnte auch hier während der Expression des gp1/11-Assembly-

Komplexes beobachtet werden, da nach Induktion das Wachstum der E. coli C41-

Zellkultur ungeachtet ihrer logarithmischen Wachstumsphase nur noch stark vermin-

dert erfolgte.

Der gp1/11-Assembly-Komplex lässt sich mit Hilfe der Metallaffinitätschromato-

graphie (IMAC) aus E. coli C41 isolieren

Die Metallaffinitätschromatographie stellt eine Methode dar, durch die große Mengen

heterolog exprimierter Proteine, welche über eine spezifische Domäne oder ein

spezifisches Peptid verfügen, in einem einstufigen Affinitätschromatographieschritt

gereinigt werden können. Hochuli et al. (Hochuli et al., 1987) zeigten, dass mit Hilfe

von matriximmobilisierten Metallionen wie Co2+, Ni2+ Cu2+ und Zn2+ Proteine mit

fusioniertem His-Tag gebunden und hierdurch gereinigt und konzentriert werden

können. Um eine Reinigung der gp1/11-Assembly-Komplexe und eine anschließende

Visualisierung der gereinigten Partikel am TEM durchführen zu können, wurde an

Abb. 4-4: Aus Western-Blot quantitativ bestimmtes Expressionsverhältnis von gp1 zu gp11 in nicht infizierten E. coli-Zellen. Zur Quantifizierung des Verhältnisses von gp1 zu gp11, während der Überexpression in E. coli C41, wurden hier die erhaltenen Signalintensitäten der gp1- und gp11-Banden zur Berechnung der relativen Proteinmengen verwendet und diese aus jeweils drei Ergebnissen gemittelt. Hieraus ergibt sich für uninfizierte Zellen eine Proteinmenge von 135,47 gp1 in relativer Einheit zu 195,47 gp11 in relativer Einheit, was circa 1 gp1 zu 1,5 gp11 entspricht.

Diskussion

172

den N-Terminus von gp1 ein His-Tag aus zehn Histidinen fusioniert. Die Reinigung

der gp1/11-Assembly-Komplexe erfolgte zunächst aus einer 2 L und anschließend

aus einer 4 L E. coli C41 Batch-Kultur. In den durchgeführten Reinigungen wurden

die gp1/11-Assembly-Komplexe mit Hilfe des zwitterionischen Detergenzes Fos-

cholin-12 (n-Dodecylphosphocholin) aus den Membranen solubilisiert.

Im Verlauf der Reinigungen wurden Proben entnommen und anschließend über

SDS-PAGE aufgetrennt, um den Verbleib der gp1/11-Assembly-Komplexe über-

prüfen zu können. Die mit Coomassie gefärbten SDS-Gele in Kapitel 3.4.2 zeigten

durch die Präsenz mehrerer Proteine in den Elutionsfraktionen, dass sowohl aus der

2 L als auch aus der 4 L E. coli C41-Batch-Kultur, nach zweistündiger gp1/11-

Expression, mit Hilfe der Metallaffinitätschromatographie Assembly-Komplexe gerei-

nigt werden konnten. Mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers gegen die C-terminale

Domäne von gp1 konnte durch Western-Blot Analyse sowohl in den solubilisierten,

den ultrazentrifugierten als auch in den Elutionsproben gp1 nachgewiesen werden.

Mit 39 kDa Molekulargewicht war das gp1 um ~ 1 kDa schwerer als das wildtypische

gp1. Diese Abweichung kann vermutlich auf den fusionierten 10 x His-Tag zurück-

geführt werden. Von Feng et al. wurde nach der Fusion eines His-Tags an die

C-terminale Domäne von gp1 eine ähnliche Veränderung des apparenten Molekular-

gewichtes nach erfolgter SDS-PAGE beobachtet (Feng et al., 1999).

In der aus 2 L Bakterienkultur durchgeführten IMAC-Reinigung konnte mit Hilfe einer

Western-Blot Analyse, unter Verwendung des gp1 Antikörpers gegen die C-terminale

Domäne, außerdem in der solubilisierten Probe und der Überstandsprobe nach

Zentrifugation das ~ 12 kDa schwere gp11 nachgewiesen werden. In der Elutions-

fraktion war jedoch kein gp11 detektierbar. Dieser Verlust des gp11 könnte durch

eine Störung der intramolekularen Wechselwirkung zwischen gp1 und gp11, verur-

sacht durch das Detergenz Fos-Cholin-12, oder durch eine mangelhafte Detektion

des gp11 durch den verwendeten Erstantikörper erklärt werden. Zudem zeigte die

Probe des Säulendurchlaufs, dass ein großer Anteil der gp1/11-Assembly-Komplexe

nicht gebunden werden konnte und hierdurch eine ~ 50 %ige Verringerung der

Gesamtproteinmenge zustande kam.

Mit der anschließenden Erhöhung der Bakterienkultur auf 4 L konnte in der darauf-

folgenden IMAC-Reinigung die Menge an gebundenen und eluierten gp1/11-

Assembly-Komplexen gesteigert werden. Während in der Elutionsfraktion der 2 L

Reinigung kein gp11 detektierbar war, konnte in der IMAC-Elutionsfraktion der 4 L

Diskussion

173

Reinigung deutlich ein Protein mit einem Molekulargewicht von ~ 12 kDa identifiziert

werden. Weiterhin konnten in dieser Elutionsfraktion Proteine mit Molekulargewichten

von ~ 39 kDa, ~ 37 kDa, ~ 31 kDa und ~ 20 kDa nachgewiesen werden. Feng et al.

konnten nach IMAC-Reinigungen von plasmidexprimierten gp1 mit C-terminal fusio-

nierten His-Tags gp1-Abbaufragmente mit ~ 30 kDa und ~ 31 kDa (Feng et al.,

1999), unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gegen die N-terminale

Domäne von gp1, durch Western-Blot Analyse nachweisen und mit Hilfe eines

spezifischen Antikörpers gegen die C-terminale Domäne nach weiterer Western-Blot

Analyse diese als proteolytische Abbauprodukte der C-terminalen Domäne identi-

fizieren. Im Weiteren war es ihnen möglich, durch den Vergleich einer wildtypischen

mit einer f1-Phageninfektion, bei der kein funktionsfähiges gp4 über das Phagen-

genom gebildet werden konnte, zu zeigen, dass die gp1-Prozessierung durch gp4

verhindert werden konnte. Außerdem konnten sie durch die Expression von plasmid-

kodierten gp1 in Bakterienstämmen, in denen gezielt Proteasegene deletiert wurden,

ausschließen, dass für die Prozessierungen das periplasmatisch lokalisierte OmpT

und DegP verantwortlich war.

4.4.1 Identifikation der Proteine im IMAC-Eluat

Zur Identifikation der koeluierten Proteinbanden im IMAC-Eluat aus Kapitel 3.4.2

wurden diese mit Hilfe von MALDI-TOF/MS (Matrix Assisted Laser Desorption /

Ionization–Time Of Flight / Mass-Spectrometry) analysiert. Durch diese Methode

können unbekannte Proteine nach Trypsinverdau, aufgrund der resultierenden

Peptidfragmentgrößen, identifiziert werden. Die entstehenden Fragmente sind für

jedes Protein spezifisch und ermöglichen durch den hieraus erzeugten Peptid-

Massen-Fingerprint (PMF) einen Vergleich mit den in Datenbanken hinterlegten

PMFs bekannter Proteine, wodurch diese identifiziert und zugeordnet werden

können.

Anhand der durchgeführten MALDI-TOF/MS Analysen der aus dem SDS-Gel

isolierten ~ 37 kDa, ~ 31 kDa und ~ 20 kDa schweren Proteine wurden diese, wie

auch im Anhang zu entnehmen ist, durch Vergleich mit in der Proteindatenbank

„Mascot“ (http://www.matrixscience.com) hinterlegten PMFs, als gp1-Proteine des

filamentösen Phagen M13 identifiziert. Aus den identifizierten Peptidfragmenten ging

hervor, dass es sich um gp1-Abbauprodukte handelte, welche sich nur in der Länge

ihrer C-terminalen Domänen von dem wildtypischen gp1 mit N-terminal fusioniertem

http://www.matrixscience.com/

Diskussion

174

His-Tag unterschieden (Abb. 4-5) während die N-terminalen Domänen bei allen drei

zu identifizierenden Proteinen unverändert blieben. Wegen des His-Tags besteht

ebenfalls die Möglichkeit, in dem hier verwendeten Expressionssystem, proteolytisch

verkürzte C-terminale gp1-Fragmente durch eine Metallaffinitätschromatographie zu

reinigen. Aufgrund der verkürzten C-terminalen Domäne konnten wahrscheinlich

diese gp1-Abbauprodukte unter Verwendung des C-terminalen Antikörpers nicht in

den Western-Blot Analysen der IMAC-Reinigung in Kapitel 3.4.2 und der Expres-

sionsanalyse in Kapitel 3.4.1 nachgewiesen werden. Durch einen sukzessiven

proteolytischen Abbau der C-terminalen Domäne des gp1 wäre das antigene Epitop,

gegen das der C-terminale Antikörper gerichtet ist, in kürzeren gp1-Fragmenten nicht

mehr vorhanden und so auch nicht mehr detektierbar.

Die MALDI-TOF/MS Analysen zeigten weiterhin, dass im Vergleich zum wildty-

pischen gp1 mit N-terminalem His-Tag, die C-terminale Domäne des ~ 37 kDa

schweren gp1-Fragments um ~ 15 % und die des ~ 31 kDa schweren gp1-Fragments

um ~ 33 % verkürzt war. Da in der MALDI-TOF/MS Analyse des ~ 20 kDa schweren

gp1-Fragments ein 8 Aminosäuren langer Abschnitt (AS 290 – 297) der C-terminalen

Domäne identifiziert wurde, der nur im Fall des um ~ 15 % verkürzten ~ 37 kDa

schweren gp1-Fragments nachweisbar war, kann hier keine endgültige Aussage

Abb. 4-5: Schematische Darstellung der isolierten und durch MALDI-TOF/MS identifizierten gp1-Fragmente im Vergleich zum His-Tag fusionierten gp1 Wildtyp-Protein. Die Verkürzungen der einzelnen C-terminalen Domänen sind prozentual im Vergleich zum His-Tag fusionierten gp1 Wildtyp-Protein (~ 39 kDa, His-Tag grau hinterlegt) dargestellt. Die Bildung der Fragmente ist wahrscheinlich auf eine proteolytische Prozessierung der C-terminalen Domäne durch periplas-matische Proteasen zurückzuführen. Im Fall des ~ 20 kDa schweren Fragments könnte es sich um ein 70 % verkürztes gp1 handeln, denkbar wäre auch eine dimere Form aus prozessiertem gp1 mit ~10 kDa und gp11 mit ~10 kDa.

Diskussion

175

getroffen werden, ob es sich hier wirklich um ein ~ 70 % verkürztes gp1-Fragment

handelt. Eine denkbare Möglichkeit wäre, dass hier eventuell ein Dimer aus

prozessiertem gp1 mit ~ 10 kDa und einem gp 11 mit ebenfalls ~ 10 kDa vorliegt, da

der identifizierte Abschnitt von Aminosäure 290 – 297 sich im Bereich von gp11

befindet (Abb. 4-5).


nicht infizierten E. coli-Zellen durch präparative Gelfiltration

Durch die Größenausschlußchromatographie erfolgt die Auftrennung eines Substrat-

gemisches über eine stationäre Phase aus porösen Polymeren, wie z.B. Sepha-

dexTM, aufgrund des hydrodynamischen Volumens der Moleküle. Hierbei ist die

Effizienz, mit der die einzelnen Moleküle getrennt werden, von den Oberflächen der

eingesetzten porösen Matrizes abhängig. Mixed-Bed-Säulen, in denen Polymere mit

verschiedenen Porengrößen als stationäre Phase eingesetzt werden, trennen über

einen großen Massenbereich linear mit dem hydrodynamischen Volumen. Die hier

zur Massenbestimmung verwendete SuperdexTM 200 Matrix ermöglicht die Auftren-

nung von Stoffgemischen mit Massen von 10 kDa bis 600 kDa. Durch die Verwen-

dung von Proteinstandards mit geringen Molmassenverteilungen kann eine Kali-

brierung solcher Mixed-Bed-Säulen erfolgen. Aus der erhaltenen logarithmischen

Kalibrierungskurve lassen sich die Molmassen berechnen, da das Produkt von

Molmasse und intrinsischer Viskosität proportional zum hydrodynamischen Radius

der Moleküle ist.

Der gp1/11-Assembly-Komplex hat ein gemitteltes Molekulargewicht von circa

300 kDa

Mit Hilfe der Größenausschlußchromatographie konnte in Kapitel 3.4.3 die gp1/11-

Elutionsfraktion aus der Metallaffinitätschromatographie in Fraktionen mit unter-

schiedlichen Massen und Konzentrationen aufgetrennt werden. Durch die vorherige

Kalibrierung der Säule konnten den eluierten, detergenzassoziierten gp1/11-

Assembly-Komplexen entsprechend quantitativ Massen zugewiesen werden. Für das

verwendete Detergenz Fos-cholin 12 wurde für die gebildeten Detergenzmizellen,

unter Einberechnung der substratspezifischen Aggregationszahl, ein Molekular-

gewicht von ~ 21 kDa errechnet. Unter Berücksichtigung der Detergenzmizelle war

es möglich, dem eluierten Molekülkomplex ein gemitteltes reines Gewicht von

~ 300 kDa zuzuordnen.

Diskussion

176

Die Identifikation der Proteinkomponenten in Kapitel 3.4.3 mittels SDS-PAGE ergab,

dass sich die Elutionsfraktion der Größenausschlußchromatographie, welche die

Molekülkomplexe mit Massen von 330 – 270 kDa beinhaltete, überwiegend aus

Proteinen mit den Massen von ~ 39 kDa und ~ 37 kDa und geringfügig aus Proteinen

mit ~ 31 kDa und ~ 12 kDa zusammensetzte. In MALDI-TOF/MS Analysen wurden

die ~ 37 kDa und ~ 31 kDa schweren Proteine als gp1-Fragmente identifiziert,

welche sich vermutlich durch proteolytischen Abbau in der Länge ihrer C-terminalen

Domänen unterscheiden. Aufgrund der geringen Anteile dieser prozessierten gp1-

Fragmente im eluierten Molekülkomplex kann hier wahrscheinlich davon ausge-

gangen werden, dass in dieser durchgeführten Größenausschlußchromatographie,

unter Berücksichtigung der Detergenzmizelle, gp1/11-Assembly-Komplexe mit

Massen zwischen ~ 330 kDa - 270 kDa eluiert wurden. Hieraus lässt sich ein

gemitteltes reines Gewicht von ~ 300 kDa für den gp1/11-Assembly-Komplex

bestimmen.

Feng et al. (1999) konnten mit Hilfe eines Vergleichs von gp1-Proteinen aus einer mit

f1-Phagen-infizierten E. coli-Kultur, bei der kein funktionsfähiges gp4 über das

Phagengenom gebildet werden konnte, mit einer wildtypisch verlaufenden Infektion

in E. coli zeigen, dass eine Prozessierung des gp1 durch gp4 unterbunden werden

konnte. In der hier nach IMAC-Reinigung der überexprimierten gp1/11-Assembly-

Komplexe durchgeführten Größenausschlusschromatographie in Kapitel 3.4.3

konnten in den eluierten Komplexen durch SDS-PAGE gp1-Moleküle mit unter-

schiedlichen Massen identifiziert werden. Hier könnte es sich vermutlich um einen

gp1/11-Assembly-Komplex handeln, in dem, aufgrund des fehlenden gp4 in der

äußeren Membran von E. coli, die gp1-Moleküle nach Translokation in die Zyto-

plasmamembran durch periplasmatische Proteasen C-terminal prozessiert wurden.

Weiterhin war zu beobachten, dass in der Fraktion mit Proteinkomplexen von

145 kDa circa die 4-fache und in der mit 74 kDa circa die 10-fache Menge der zuvor

identifizierten Proteinkomponenten eluiert wurden. Dies könnte ein Hinweis sein,

dass der gp1/11-Assembly-Komplex selbst bei Funktionslosigkeit oder eventuell nach

einem kurzen Intervall einem proteolytischen Abbau unterliegt.

Diskussion

177


infizierten E. coli-Zellen durch präparative Gelfiltration

Für die Assemblierung und die Sekretion neuer Phagen-Nachkommenschaften

werden drei, durch den Phagen kodierte, Proteine, gp4 (Brissette und Russel, 1990),

gp1 und gp11 (Guy-Caffey et al., 1992, Rapoza & Webster, 1995) sowie das von

E. coli synthetisierte Thioredoxin benötigt (Russel & Model, 1985; 1986). Zur Identi-

fikation neuer Proteinkomponenten am Assembly-Komplex und zur Verringerung des

proteolytischen gp1-Abbaus durch periplasmatische Proteasen (Feng et al., 1999)

wurde eine Reinigung des Assembly-Komplexes aus einer mit M13mp19-infizierten

E. coli K37 Batch-Kultur durchgeführt.

Durch Infektion gp1/11-exprimierender Zellen entstehen gp1/11-Hybrid-

komplexe

Der Vergleich der über SDS-PAGE aufgetrennten Elutionsproben aus nicht infizierten

E. coli-Zellen und infizierten E. coli-Zellen zeigt, dass trotz Infektion weiterhin die

gleichen Abbauprodukte in der Elution der Metallaffinitätschromatographie vorhan-

den waren. Auffällig ist jedoch, dass das IMAC-Elutionskonzentrat aus der gp1/11-

Reinigung der infizierten Kultur nur geringe Mengen an gp1 mit ~ 39 kDa aufweist,

aber dafür große Mengen an gp1 mit ~ 37 kDa. Durch eine zusätzliche Infektion der

gp1-His-Tag exprimierenden E. coli K37-Zellen mit M13-Phagen kommt es zur

Bildung von gp1/11-Hybrid-Assembly-Komplexen, welche sich aus wildtypischen und

His-Tag präsentierenden gp1-Proteinen zusammensetzen. Diese lassen sich an-

schließend ebenso über die Metallaffinitätschromatographie isolieren und reinigen.

Durch die Infektion und die hieraus entstehende additive Expression des gp1

verringert sich jedoch die Anzahl der His-Tag präsentierenden gp1-Moleküle mit

einem Molekulargewicht von ~ 39 kDa. Gleichzeitig kommt es in den Komplexen zu

einer Anreicherung des wildtypischen gp1, welches ein Molekulargewicht von

~ 37 kDa besitzt. Trotz der Infektion werden weiterhin die ~ 31 kDa schweren gp1-

Abbauprodukte gebildet. Eine Ursache hierfür könnte ein stöchiometrisches Un-

gleichgewicht zwischen dem additiv exprimierten gp1 und dem durch Infektion gebil-

deten gp4 sein. Vermutlich ist die bei einer Infektion gebildete Menge an gp4 nicht

ausreichend, damit alle synthetisierten gp1-Moleküle vor einem proteolytischen

Abbau im Periplasma geschützt sind. Dass ein proteolytischer Abbau eines plasmid-

exprimierten gp1 im Periplasma erfolgt, konnte von Feng et al. durch die Identi-

Diskussion

178

fikation eines ~ 31 kDa schweren gp1-Abbauprodukts (Feng et al., 1999) anhand

einer Western-Blot Analyse unter Verwendung spezifischer Antikörper gegen die

N-terminale Domäne von gp1 nachgewiesen werden. Mit Hilfe eines inserierten His-

Tags und einer Ambermutation in der C-terminalen Domäne von gp1 konnten Feng

et al. die proteolytische Spaltung auf den Bereich der Aminosäuren 275 bis 298

einschränken. Da dieser Bereich des gp1 vermutlich durch intermolekulare Wechsel-

wirkungen mit gp4 den gp1/11-gp4-Sekretionskomplex bildet, spekulierten sie, dass

gp1 möglicherweise hierdurch vor dem proteolytischen Abbau im Periplasma ge-

schützt wird.

Eine M13-Infektion gp1/11-exprimierender Zellen erhöht den Schutz des

Assembly-Komplexes vor proteolytischer Prozessierung

Das Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie in Kapitel 3.4.4 zeigte,

dass die Reinigung des Elutionskonzentrats aus der IMAC-Reinigung infizierter

Zellen sich wie das Elutionskonzentrat aus der IMAC-Reinigung uninfizierter Zellen

auftrennen ließ. Auch hier ließen sich die gp1/11-Elutionsfraktionen aus der Metall-

affinitätschromatographie in Fraktionen mit unterschiedlichen Massen und Konzen-

trationen auftrennen. Im Vergleich zur Reinigung der gp1/11-Assembly-Komplexe

aus uninfizierten Zellen erfolgte hier die Elution hoher Molekulargewichte von 350 -

290 kDa in einer früheren Fraktion. Im Unterschied zu den uninfizierten Zellen war es

hier durch die Infektion wahrscheinlich möglich, eine Protektion des gp1/11-

Assembly-Komplexes zu bewirken, da die Menge an unprozessierten gp1/11-

Assembly-Komplexen um das circa 40-fache erhöht werden konnte. Dies deutet

darauf hin, dass mit Hilfe einer M13-Infektion von gp1/11-exprimierenden Zellen die

Reinigung zugunsten intakter Assembly-Komplexe verschoben werden konnte. Die

Identifikation der Proteinkomponenten in dieser frühen Elutionsfraktion mittels SDS-

PAGE ergab, dass sich die eluierten Assembly-Komplexe hauptsächlich aus gp1-

Molekülen mit einer Masse von ~ 37 kDa zusammensetzten, was ungefähr der

Masse des wildtypischen gp1 entspricht. Die geringe Präsenz des ~ 39 kDa

schweren gp1 zeigte, dass die hier eluierten Assembly-Komplexe auch gp1-Moleküle

mit His-Tag enthielten. Über diese konnten wahrscheinlich während der Metallaffini-

tätschromatographie die Bindungen der Komplexe an die Ni-NTA-Matrix erfolgen.

Zudem ist dies ein Hinweis, dass bei der hier angewendeten Reinigungsmethode nur

ein geringer Anteil von His-Tag fusionierten gp1 benötigt wird, um größere Mengen

Diskussion

179

an gp1/11-Assembly-Komplexen isolieren zu können. Die außerdem in dieser

Elutionsfraktion identifizierten ~ 31 kDa und ~ 20 kDa schweren gp1-Abbauprodukte

sind vermutlich eine Folge des stöchiometrischen Ungleichgewichts zwischen gp4,

welches durch die M13-Infektion gebildet wurde, und gp1. Durch dieses Ungleich-

gewicht könnte in den gp1/11-exprimierenden Zellen ein Gemisch aus intakten und

prozessierten Assembly-Komplexen entstehen, welche während der Metallaffinitäts-

chromatographie gereinigt und in der Größenausschlusschromatographie wegen der

zu geringen Massenunterschiede in die gleiche Fraktion eluiert wurden. Da jedoch,

wie aus der SDS-PAGE der Fraktion hervorgeht, die Mengen der gp1-Abbauprodukte

im Vergleich zu den wildtypischen gp1-Proteinen sehr gering waren, kann davon aus-

gegangen werden, dass in dieser frühen Elutionsfraktion 90 % der gereinigten

gp1/11-Assembly-Komplexe in ihrer nativen Form vorlagen. Für eine höhere Aus-

beute an unprozessierten Assembly-Komplexen könnte es essenziell sein, das

stöchiometrische Gleichgewicht zwischen gp1 und gp4 herzustellen. Dies würde

unter anderem dadurch erreicht werden, indem man das gp1/11-Expressionssystem

dahingehend verändert, dass die Expressionsrate von gp1/11 verringert oder die

gp4-Expressionsrate erhöht wird. Im Unterschied zur Größenausschlusschromato-

graphie der IMAC-Reinigung des Elutionskonzentrats aus infizierten Zellen, konnte in

der frühen Fraktion durch SDS-PAGE kein gp11 als Bestandteil des Assembly-

Komplexes identifiziert werden. Eine mögliche Ursache hierfür könnte eine zu

geringe Menge des Proteins sein. Da jedoch in den späteren Fraktionen das ~ 12

kDa schwere gp11 nachgewiesen wurde, kann davon ausgegangen werden, dass

dieses auch im Assembly-Komplex präsent war, jedoch in einer zu geringen

Konzentration.

4.4.4 TEM-Aufnahmen FPLC gereinigter gp1/11-Assembly-Komplexe

Der gp1/11-Assembly-Komplex bildet eine ringförmige Struktur mit einem

Durchmesser von ~ 11 – 12 nm

Die TEM-Aufnahmen der Proben aus der Elutionsfraktion mit Assembly-Komplexen

mit Molekulargewichten von 330 kDa - 270 kDa aus Kapitel 3.4.4, welche über

Größenausschlusschromatographie gereinigte gp1/11-Assembly-Komplexe aus infi-

zierten E. coli K37-Zellen enthielt, zeigten nach Negativkontrastierung mit 5 %iger

Phosphorwolframsäure deutlich ringförmige Strukturen. Mit Hilfe einer software-

gestützten Bildprozessierung konnte die Erkennbarkeit des ringförmigen Charakters

Diskussion

180

dieser Strukturen verbessert werden. Aus diesen Bildern lässt sich für den Außen-

durchmesser des Assembly-Komplexes eine Länge von ~ 11 – 12 nm und für den

Innendurchmesser eine Länge von ~ 7 – 8 nm ermitteln. Vergleicht man die durch

Opalka et al. ermittelten Größen für die homomultimere gp4-Pore in der äußeren

Membran von E. coli, welche mit dem gp1/11-Assembly-Komplex einen Sekretions-

komplex bildet, mit den hier ermittelten Größen des Assembly-Komplexes, so könnte

dieser in das Innere der 13,5 nm großen gp4-Pore (Opalka et al., 2003) hineinragen

(Abb. 4-6).

Durch diese intermolekulare Interaktion könnte die C-terminale Domäne des gp1 im

Bereich der Aminosäuren 275 – 320 (Feng et al., 1999) durch die N-terminale

Domäne der gp4-Pore vor einer proteolytischen Prozessierung geschützt werden.

Dabei interagieren nur die C-terminalen Domänen der gp1-Monomere mit den

N-terminalen Domänen der gp4-Monomere und bilden nach einer Hypothese von

Feng et al. einen gp1/11-gp4-Sekretionskomplex. Der Innendurchmesser des

gp1/11-Assembly-Komplexes wäre hier mit einem Innendurchmesser von 7 – 8 nm

ausreichend dimensioniert für die Sekretion neugebildeter M13-Phagen. Die hier

innere Membran

Periplasma

Murein

äußere Membran

13,5 nm

11 - 12 nm


gp4-Multimer

Abb. 4-6: Schematische Darstellung des gp1/11-gp4-Sekretionskomplexes. Aufgrund des gp1/11-Assembly-Komplex-Außendurchmessers von 11-12 nm besteht die Möglichkeit, dass der C-terminale Bereich des Assembly-Komplexes in den N-terminalen Bereich der 13,5 nm großen gp4-Pore hineinragt und hierdurch das gp1 vor einer proteolytischen Prozessierung geschützt ist (nach Webster, 1996, verändert).

gp11 gp1 gp4

N

N N

C C

C

Zytoplasma

Diskussion

181

verwendeten Proben enthielten, aufgrund der Analyse der Größenausschlusschro-

matographie, ausschließlich Moleküle mit Massen von ~ 330 – 270 kDa. Hier kann

somit davon ausgegangen werden, dass die aufgenommenen ringförmigen Struk-

turen Assembly-Komplexe darstellen, welche sich, wie aus der SDS-PAGE in Kapitel

3.4.4 hervorging, hauptsächlich aus gp1-Molekülen mit ~ 37 kDa und einem sehr

geringen Anteil aus gp11 mit ~ 12 kDa zusammensetzen.

Der gp1/11-Assembly-Komplex könnte ein Decamer oder Dodecamer sein

Auf der Basis des über Größenausschlußchromatographie ermittelten Molekular-

gewichts von gemittelten ~ 300 kDa für den Assembly-Komplex, den anschließend

durch SDS-PAGE identifizierten gp1 Fragmenten und deren ermittelten Einzel-

massen, könnte vermutet werden, dass es sich bei den hier gereinigten Assembly-

Komplexen um Multimere handelt. Aus den identifizierten Einzelmassen der gp1-

Fragmente in diesen Komplexen ergibt sich für diese ein gemitteltes Molekular-

gewicht von ~ 37 kDa. Aus einer angenommenen Ratio von einem gp1 mit ~ 37 kDa

zu einem gp11 mit ~ 12 kDa würde sich für ein theoretisches gp1/11-Dimer eine

Gesamtmasse von ~ 49 kDa errechnen lassen. Da dem hier gereinigten Assembly-

Komplex eine Masse von ~ 300 kDa zugeordnet werden konnte, könnte sich dieser

somit aus 5 - 6 gp1/11-Dimeren zusammensetzen und hieraus ein decamerer bzw.

ein dodecamerer Komplex resultieren. Dies ist jedoch rein hypothetisch, da in den

gereinigten Komplexen kein gp11 nachweisbar war. Dass sich der Assembly-

Komplex eventuell aus jeweils 5 - 6 gp1 Monomeren und 5 - 6 gp11 Monomeren

zusammensetzen könnte, wurde auch schon von Russel et al. spekuliert (Russel et

al., 2004). In Anbetracht der vorgegebenen Symmetrie durch die gp4-Pore, welche

aus ~ 12 – 14 gp4-Monomeren gebildet wird (Opalka et al., 2003), ergäbe sich im

Fall eines dodecameren gp1/11-Assembly-Komplexes bei einer intermolekularen

Interaktion mit der gp4-Sekretionspore eine plausible stöchiometrische Überein-

stimmung.

Wie aus der SDS-PAGE Analyse der Elution größenausschlußchromatographie-

gereinigter Assembly-Komplexe aus infizierten E. coli K37-Zellen in Kapitel 3.4.4

hervorging, entsprechen aufgrund des zu großen Anteils an prozessierten gp1-

Molekülen und der zu geringen Menge von gp11-Molekülen die gereinigten Kom-

plexe nicht zu 100 % der nativen Form.

Diskussion

182

Hypothetisch könnte, mit Hilfe der aus den TEM-Untersuchungen erhaltenen

Informationen, unter Berücksichtigung einer ringförmigen Symmetrie des Assembly-

Komplexes und des Durchmessers des deutlichsten Signals eines Monomers im

Komplex der vergrößerten TEM-Aufnahme in Abbildung 4-7 (A, siehe Pfeil), nach

einer theoretischen Positionierung von gedachten gp1- (rot) und gp11-Monomeren

(gelb) in (B) im Verhältnis 1:1, ein dodecamerer Assembly-Komplex modelliert

werden, dessen innerer Durchmesser ~ 7 – 8 nm und äußerer Durchmesser ~ 11 –

12 nm (C) beträgt.

Abb. 4-7: Schematische Darstellung des gp1/11-Assembly-Komplexes. (A) Vergrößerte Darstellung einer elektronenmikroskopischen Aufnahme eines ringförmigen gp1/11-Assembly-Komplexes. Das deutlichste Signal eines Monomers wird durch einen weißen Pfeil markiert. (B) Nach der theoretischen Positionierung virtueller gp1- (rot) und gp11-Monomere (gelb) im Verhältnis 1:1 ergibt sich ein Dodecamer mit einem Durchmesser von 11 – 12 nm. (C) Schematisches Modell des sich aus (B) ergebenden gp1/11-Assembly-Komplexes. Die Längen der Skalierungsbalken betragen 10 nm.

N

Ø 11 - 12 nm

C


gp11 gp1

(C)

N

C

Zusammenfassung/Summary

183

5 Zusammenfassung

Der Phage M13 ist taxonomisch den Einzelstrang-DNA-Phagen zugeordnet und

gehört zur Familie der Inoviridae. Für die Vermehrung verwendet M13 Gram-nega-

tive Escherichia coli-Zellen, die F-Pili ausbilden, als Wirt. Durch die Vermehrung wird

die Wirtszelle nicht geschädigt. In dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse über die

M13-Biogenese erhalten werden, welche den Bereich Infektionsprozess, die Assem-

blierung und die Phagensekretion betreffen.

Durch Adsorptionsexperimente, in denen das Wirtsbakterium E. coli K38 mit M13-

Phagen infiziert wurde, konnte gezeigt werden, dass innerhalb der ersten 5 Minuten

die Bindung der Phagen an die Zellen stattfindet und hier aufgrund einer Limitierung

der F-Pili pro Zelle maximal 7 Phagen pro E. coli-Zelle binden konnten.

Die Insertion des Phagenhüllproteins gp9 in die Zytoplasmamembran der Wirtszelle

wurde mit Hilfe antigener Epitope in der N-terminalen Domäne nachgewiesen und es

konnte gezeigt werden, dass das YidC-Protein von E. coli dafür benötigt wird.

Zudem wurde gezeigt, dass plasmidkodiertes gp9 mit zusätzlich eingebrachten

antigenen Epitopen in der N-terminalen Domäne keinen negativen Effekt auf die

Assemblierung neuer Phagen-Nachkommen hatte. Daher kann das gp9 durch die

Insertion kurzer Peptidsequenzen (17 – 36 Aminosäuren) für ein „Phage-Display“

verwendet werden.

Hinsichtlich der Phagenassemblierung war es möglich, den membranständigen

gp1/11-Assembly-Komplex, nach Überexpression in E. coli und Größenausschluß-

chromatographie, zu charakterisieren und ihm ein Molekulargewicht von ~ 300 kDa

zuzuordnen. Die transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Untersuchung des

gereinigten gp1/11-Assembly-Komplexes zeigte ringförmige Strukturen mit einem

Innendurchmesser von ~ 7 – 8 nm und einem Außendurchmesser von ~ 11 – 12 nm.

Die Untersuchung der wildtypischen Phagensekretion zeigte, dass nach einer

5-minütigen Latenzphase (Eklipse) die Sekretion neuer Phagen-Nachkommen

erfolgte und eine infizierte E. coli-Zelle in einem Zeitraum von 115 Minuten bis zu 925

neue Phagen sekretieren kann, was einer durchschnittlichen Sekretion von 7 Phagen

pro Minute entspricht. Durch die M13-Infektion verlängerte sich die Generationszeit

der E. coli K38-Zellen von 24 auf 48 Minuten.


184

Die Untersuchung der Phagensekretion und der Phagenreplikation genetisch

veränderter Phagen, deren Synthese des Haupthüllproteins gp8 durch das Wirts-

bakterium mit Hilfe einer Punktmutation im Phagengenom unterbunden wurde,

erfolgte in Wirtszellen mit zusätzlich plasmidkodiertem Gen 8 des Phagen. Es zeigte

sich, dass das plasmidkodierte gp8 limitiert war, was eine Verringerung der Phagen-

sekretion auf ~ 2 Phagen pro Minute verursachte und die Latenzzeit (Eklipse) auf

12 Minuten verzögerte.

Die Sekretion von M13-Phagen aus infizierten E. coli-Zellen konnte mit dem „Atomic

Force Microscope“ (AFM) dargestellt und die Phagen am TEM, nach Markierung mit

Protein-A konjugiertem Gold, nachgewiesen werden. Die Sekretion von M13-

Phagen-Nachkommen begann an den Zellpolen von E. coli und breitete sich im

Verlauf von 4 Minuten von diesen zu den Seiten der Zellen hin aus und erstreckte

sich nach 16 Minuten über die gesamte Zelloberfläche.


185

5 Summary

Taxonomically, the bacteriophage M13 is assigned to the single-stranded DNA

phage and belongs to the family of Inoviridae. For propagation the Gram-negative

bacteria Escherichia coli with F-pili is required. The host cell is not lysed by the

phage. New findings about the M13 phage biogenesis are presented here within four

essential areas of the M13 phage cycle concerning the sections infection, assembly,

and phage secretion.

Phage adsorption experiments in which the host bacterium E. coli K38 was infected

by M13 phage showed that the phage adsorption to the cells takes place within the

first 5 minutes and because of a limitation of F-pili per cell a maximum of 7 phages

per cell were found to be adsorbed.

The insertion of the phage coat protein gp9 into the cytoplasmic membrane of the

host cell was verified by the periplasmic location of antigenic epitopes introduced into

the N-terminal domain of gp9. The membrane insertion of gp9 was found to depend

on the host protein YidC. Plasmid-encoded gp9 exhibiting antigenic epitopes at the

N-terminal domain did not interfere with the assembly of new progeny phage.

Therefore, the development of a phage display system with gp9 by introducing short

peptide sequences (17 – 36 amino acids) is feasible.

After overexpression of gp1/11 assembly complexes in E. coli and size exclusion

chromatography, respectively, the complex was characterized and a molecular

weight of ~ 300 kDa was assigned. Examinations of the purified gp1/11 assembly

complexes by transmission electron microscopy (TEM) revealed ring-like structures

with ~ 7 – 8 nm in inner diameter and ~ 11 – 12 nm in outer diameter.

The investigation of M13 wild-type infection showed that the secretion of new

progeny phage starts after a short lag period (eclipse). An infected E. coli cell

secreted upto 925 progeny in a time period of 115 minutes which corresponds to an

average of 7 secreted phages per minute. The generation time of the infected E. coli

K38 cells rose from 24 minutes to 48 minutes.

Experiments were carried out with genetically manipulated phages which were

hindered to synthesize the major coat protein gp8 in the host cell by a nonsense

mutation in the phage genome. Therefore, phage replication was only observed in


186

host cells bearing plasmid encoding gene 8. Since the quantity of the protein was

limited the lag period (eclipse) was extended to 12 minutes and the efficiency of

phage secretion was decreased to about 2 phages per minute.

The M13 phage secretion from infected E. coli cells was visualized by atomic force

microscopy (AFM). The identity of the phage was verified by labeling with protein-A

conjugated gold and transmission electron microscopy (TEM). The secretion of M13

progeny was first observed at the cell poles of E. coli and then spreaded within

4 minutes along the cell surface. After 16 minutes the secretion was observed over

the entire cell surface.

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Anhang

205

7 Anhang

Abkürzungsverzeichnis

A

A Adenin

Abb. Abbildung

AFM Atomic Force Microscope

Amp Ampicillin

APS Ammoniumpersulfat

Ara Arabinose

AS Aminosäure(n)

ATP Adenosintriphosphat

B

bp Basenpaare

bzw. Beziehungsweise

C

C Cystein

ca. circa

CaCl2 Calciumchlorid

cm Zentimeter

C-Terminus Carboxyl-Terminus

D

D Asparaginsäure

dATP Desoxyadenosintriphosphat

dCTP Desoxycytosintriphosphat

ddNTP Didesoxyribonukleotidtriphosphat, z. B. ddATP

ddH2O zweifach destilliertes Wasser

dGTP Desoxyguanidintriphosphat

dNTP Desoxyribonukleotidphosphat, z. B. dATP

dTTP Desoxythymidinphospha

d.h. das heißt

DNA Desoxyribonucleinsäure

DNase Desoxyribonuclease

ds doppelsträngig

Anhang

206

DMSO Dimethylsulfoxid

DTT Dithiothreitol

E. coli Escherichia coli

E

E Glutaminsäure

E Extinktion

ECL Enhanced chemoluminescence, verstärkte

Chemolumineszenz

EDTA Ethylendiamintetraacetat

et al et aliter; und andere

F

F Phenylalanin

F´ Fertility (Fruchtbarkeit)

G

G Glycin

g Vielfaches der Erdbeschleunigung

g Gramm

Glc Glukose

gp Genprodukt

H

H Histidin

h Stunde(n)

HCl Chlorwasserstoffsäure

His Histidin

Hz Hertz

I

I Isoleucin

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

K

K Lysin

Kap. Kapitel

kb Kilobasen

kDa Kilodalton

KCl Kaliumchlorid

Anhang

207

L

L Leucin

L Liter

LB Luria-Bertani

M

M Methionin

M Mol

mA Milliampére

MCS Multiple Clonig Site, multiple Klonierungsstelle

mg Milligramm

MgCl2 Magnesiumchlorid

MgSO4 Magnesiumsulfat

min Minute

ml Milliliter

MnCl2 Manganchlorid

M.O.I. Multiplicity of infection

MOPS 3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure

N

N Asparagin

NaCl Natriumchlorid

Na2CO3 Natriumcarbonat

µCi Mikro-Curie

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µM Mikromol

µm Mikrometer

NaOH Natriumhydroxid

nN Nanonewton

nm Nanometer

ng Nanogramm

O

OD Optische Dichte

P

P Prolin

Anhang

208

PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

PCR polymerase chain reaction,

Polymerasekettenreaktion

PEG Polyethylenglycol

pfu plaque forming units

pN Pikonewton

Q

Q Glutamin

R

R Arginin

Ref. Referenz

RF Replikative Form

RbCl Rubidiumchlorid

RNA Ribonucleinsäure

RT Raumtemperatur

RKM Rasterkraftmikroskop

RNase Restriktionsendonuclease

rpm rotations per minute

S

S Serin

S Seite

s Sekunde

s. siehe

SDS Sodiumdodecylsulfate

SRP Signal-Erkennungs-Partikel

ss single stranded, Einzelstrang

T

T Threonin

Tab. Tabelle

TBE Tris-Borsäure-EDTA

TBS Tris-buffered saline

TCA Trichloressigsäure

TE Tris-EDTA

TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylendiamin

Anhang

209

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

U

u. a. unter anderem

UV Ultraviolett

V

V Valin

V Volt

v/v Volumen/Volumen

W

W Tryptophan

wt Wildtyp

w/v Gewicht/Voluen

X

X-Gal 5-Bromo 4-Chlor-indoxyl-β-D-galactosid

Y

Y Tyrosin

Z

z. B. zum Beispiel

Diverse Zeichen

Ø Durchmesser

λ Wellenlänge Lambda (nm)

~ circa

Anhang

210

MALDI-TOF/MS Analysedaten

Spektrum 37 kDa gp1-Proteinbande

Mit der gp1 AS-Sequenz übereinstimmende AS sind rot dargestellt:

Anhang

211



m/z 804.2520 1.0 805.0855 1.0 805.2674 1.0 805.7854 1.0 806.2630 1.0 821.2963 1.0 826.2472 1.0 827.3998 1.0 829.4222 1.0 842.2302 1.0 858.1888 1.0 887.6396 1.0 902.3538 1.0 915.5013 1.0 917.2537 1.0 1024.5669 1.0 1118.5679 1.0 1207.6451 1.0 1247.5983 1.0 1262.6629 1.0 1304.6133 1.0 1318.6193 1.0 1351.7017 1.0 1378.6950 1.0 1380.6159 1.0 1381.5103 1.0

m/z 1395.7302 1.0 1409.7034 1.0 1411.7314 1.0 1427.7209 1.0 1594.8936 1.0 1780.8429 1.0 1894.8778 1.0 1908.8965 1.0 2116.0044 1.0 2327.1174 1.0 2568.1682 1.0 2575.2975 1.0 2595.1471 1.0 2597.8727 1.0 2599.1066 1.0 2612.2274 1.0 2628.1731 1.0 2645.2213 1.0 2669.2267 1.0 2901.2248 1.0 2917.2928 1.0 2920.3233 1.0 2931.3118 1.0 2933.3349 1.0

Anhang

212



Anhang

213

Sequenzen

gp1 DNA-Sequenz

1 ATGGCTGTTTATTTTGTAACTGGCAAATTAGGCTCTGGAAAGACGCTCGTTA

53 GCGTTGGTAAGATTCAGGATAAAATTGTAGCTGGGTGCAAAATAGCAACTAA

105 TCTTGATTTAAGGCTTCAAAACCTCCCGCAAGTCGGGAGGTTCGCTAAAAC

156 GCCTCGCGTTCTTAGAATACCGGATAAGCCTTCTATATCTGATTTGCTTGCT

208 ATTGGGCGCGGTAATGATTCCTACGATGAAAATAAAAACGGCTTGCTTGTTC

260 TCGATGAGTGCGGTACTTGGTTTAATACCCGTTCTTGGAATGATAAGGAAAG

312 ACAGCCGATTATTGATTGGTTTCTACATGCTCGTAAATTAGGATGGGATATT

364 ATTTTTCTTGTTCAGGACTTATCTATTGTTGATAAACAGGCGCGTTCTGCATT

417 AGCTGAACATGTTGTTTATTGTCGTCGTCTGGACAGAATTACTTTACCTTTTG

470 TCGGTACTTTATATTCTCTTATTACTGGCTCGAAAATGCCTCTGCCTAAATTA

522 CATGTTGGCGTTGTTAAATATGGCGATTCTCAATTAAGCCCTACTGTTGAGC

575 GTTGGCTTTATACTGGTAAGAATTTGTATAACGCATATGATACTAAACAGGC

627 TTTTTCTAGTAATTATGATTCCGGTGTTTATTCTTATTTAACGCCTTATTTATC

681 ACACGGTCGGTATTTCAAACCATTAAATTTAGGTCAGAAGATGAAATTAACT

733 AAAATATATTTGAAAAAGTTTTCTCGCGTTCTTTGTCTTGCGATTGGATTTGC

786 ATCAGCATTTACATATAGTTATATAACCCAACCTAAGCCGGAGGTTAAAAAG

839 GTAGTCTCTCAGACCTATGATTTTGATAAATTCACTATTGACTCTTCTCAGCG

891 TCTTAATCTAAGCTATCGCTATGTTTTCAAGGATTCTAAGGGAAAATTAATTA

944 ATAGCGACGATTTACAGAAGCAAGGTTATTCACTCACATATATTGATTTATGT

997 ACTGTTTCCATTAAAAAAGGTAATTCAAATGAAATTGTTAAATGTAATTAA

gp1 AS-Sequenz

1 M A V Y F V T G K L G S G K T L V S V G K I Q D K I V A G C K I A T N L D L R

40 L Q N L P Q V G R F A K T P R V L R I P D K P S I S D L L A I G R G N D S Y D

80 E N K N G L L V L D E C G T W F N T R S W N D K E R Q P I I D W F L H A R K

119 L G W D I I F L V Q D L S I V D K Q A R S A L A E H V V Y C R R L D R I T L P

158 F V G T L Y S L I T G S K M P L P K L H V G V V K Y G D S Q L S P T V E R W

196 L Y T G K N L Y N A Y D T K Q A F S S N Y D S G V Y S Y L T P Y L S H G R Y

234 F K P L N L G Q K M K L T K I Y L K K F S R V L C L A I G F A S A F T Y S Y I

273 T Q P K P E V K K V V S Q T Y D F D K F T I D S S Q R L N L S Y R Y V F K D

309 S K G K L I N S D D L Q K Q G Y S L T Y I D L C T V S I K K G N S N E I V K C

348 N

http://web.expasy.org/cgi-bin/translate/dna_sequences?/work/expasy/tmp/http/seqdna.15979,1,1



Anhang

214

gp11 DNA-Sequenz

1 ATGAAATTAACTAAAATATATTTGAAAAAGTTTTCTCGCGTTCTTTGTCTTGC

54 GATTGGATTTGCATCAGCATTTACATATAGTTATATAACCCAACCTAAGCCGG

108 AGGTTAAAAAGGTAGTCTCTCAGACCTATGATTTTGATAAATTCACTATTGAC

161 TCTTCTCAGCGTCTTAATCTAAGCTATCGCTATGTTTTCAAGGATTCTAAGG

213 GAAAATTAATTAATAGCGACGATTTACAGAAGCAAGGTTATTCACTCACATAT

266 ATTGATTTATGTACTGTTTCCATTAAAAAAGGTAATTCAAATGAAATTGTTAA

318 ATGTAATTAA

gp11 AS-Sequenz

1 M K L T K I Y L K K F S R V L C L A I G F A S A F T Y S Y I T Q P K P E V K K V

41 V S Q T Y D F D K F T I D S S Q R L N L S Y R Y V F K D S K G K L I N S D D L

80 Q K Q G Y S L T Y I D L C T V S I K K G N S N E I V K C N


Anhang

215

Publikationen

Ploss, M. & Kuhn, A. (2010). Kinetics of filamentous phage assembly. Phys. Biol.

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Ploss, M. & Kuhn, A. (2011). Membrane insertion and assembly of epitope-tagged

gp9 at the tip of the M13 phage. BMC Microbiol. 11(1), 211-9

Anhang

216

Danksagung

Bedanken möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Andreas Kuhn für die freundliche

Überlassung des interessanten Themas, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und

die Ermöglichung dieser Arbeit. Vielen Dank für das Korrekturlesen des Manuskripts

sowie der hilfreichen Ratschläge.

Herrn Prof. Dr. Artur Pfitzner vom Institut für Genetik, Fg. Allgemeine Virologie,

danke ich für die freundliche Bereitschaft zur Übernahme des Koreferats.

Bedanken möchte ich mich auch bei Frau Dr. Sandra Facey für Ihre Hilfsbereitschaft,

den hilfreichen Diskussionen, konstruktiven Anregungen und der Unterstützung in

allen Lebenslagen sowie dem Lesen des Manuskripts; ich danke Dir!

Danken möchte ich auch allen Mitarbeitern des Instituts für Mikrobiologie für die

Zusammenarbeit und Hilfsbereitschaft.

Des Weiteren möchte ich mich herzlich bei meiner Frau Stefanie für die hilfreichen

und konstruktiven Diskussionen, das Manuskript betreffend, bedanken. Ich danke Dir

für das Korrekturlesen dieser Arbeit, den allerbesten Rückhalt, Deine Geduld und für

Deine Aufmunterungen. Ich bin froh, dass es Dich in meinem Leben gibt!!

Ein weiteres Dankeschön gilt meinem Sohn Florian, der mich während des

Schreibens des Manuskripts stets mit selbst gebrühten Kaffee versorgt hat, für seine

abwechslungsreichen Ablenkungen und die Ausflüge in den Garten, zum Sand-

kasten und auf den Spielplatz, wodurch ich immer wieder neue Kräfte sammeln

konnte. Flo ich bin dankbar, dass Du Teil meines Lebens bist!!

Meiner Schwiegermutter Ingrid möchte ich herzlich für das gute Essen, das

Korrekturlesen des Manuskripts und ihre stets herzliche Hilfe und Unterstützung

danken. Du bist die weltbeste Schwiegermutter die man sich als Schwiegersohn nur

wünschen kann.

Meiner Schwägerin Monika und meinem Schwager Gregor möchte ich für die Hilfe

bei der Klärung grammatikalischer Fragen bedanken. Gregor ich möchte mich bei Dir

recht herzlich für die Zeit, die Du Dir, trotz Deines engen Zeitplans, genommen hast

um meine „Summary“ zu lesen, bedanken.

Biogenese und Virusassembly des filamentösen Coliphagen M13 · Biogenese und Virusassembly des...

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