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Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik

Prof. Antje von Schaewen (Vertretung für Prof. Iris Finkemeier)

Schwerpunkte:

1. Einführung & Enzyme der Gentechnik

2. Methoden der Gentechnik

3. Vektoren & Klonierung

4. Reportergene

5. Transgene Organismen

6. Proteintechniken

Einführung - Proteine

Grundstruktur einer Aminosäure

Alle Proteine sind aus Aminosäuren aufgebaut

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Die 20 proteinogenen L-Aminosäuren

(Abkürzung als 3 und 1 Buchstaben-Code)

A R(+) N D(-)

C E(-) Q G

H(+) I L K(+)

M F P S

T W Y V

Eigenschaften von Aminosäuren

Hydrophobe Wechselwirkungen (van der Waals-Kräfte),Wasserstoff-BrückenSalzbrücken (Ladung),Fluoreszenz (aromatische Reste)Disulfidbrücken(Cysteine)

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Peptidbindung zwischen zwei Aminosäuren

Carboxyl-Gruppe + Amino-Gruppe Carbonsäureamid-Bindung + Wasser(= Peptidbindung)

Biosynthese an Ribosomen

mRNA

U A CA U G - - -Start(ATG)

AAAAA

Translation und genetischer Code

Degeneriertheit des genetischen Codes: Es existieren mehrere Kombinationen für die gleiche Aminosäure (verschiedene tRNAs!)

Polyribosmen synthetisieren Polypeptidketten (durch Translation von mRNA)

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Struktur von Proteinen

Primärstruktur (linear): Aminosäureabfolge (Polypeptidsequenz)

Sekundärstruktur (2D):z.B. alpha-Helix, beta-Faltblattstruktur

Tertiärstruktur (3D): räumliche Anordnung der Sekundär-strukturen (meist Chaperon-vermittelt)

Quartärstruktur (Multimere):Zusammenlagerung von 2 und mehr gefalteten Proteinketten (Chaperone!)

AB

Mehrere Untereinheiten (engl. subunits)

Anwendung rekombinanter Proteine

1. Industrielle Nutzung (Waschmittel- und Lebensmittelindustrie)

z.B. -Amylase (zum Abbau von Stärke)

2. Diagnostik

z.B. durch Antikörper (Tumordiagnostik)

3. Therapeutische Nutzung

z.B. humanes Insulin, EPO (Erythropoetin)

4. Wissenschaftliche Forschung

z.B. für Strukturanalysen, Studien der Enzymaktivität

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Gliederung (Anwendung rekombinanter Proteine)

1. Vorstellung grundlegender Techniken

2. Nachweis von Proteinen

3. Immuno-Screens

4. Expression von Proteinen

5. Reinigung von Proteinen

6. Herstellung von Antikörpern

7. Proteomics: Massenspektrometrie

(Annotierung von Proteinfragmenten zu Datenbanken)

Herstellung von Protein-Extrakten

Zell-Aufschluss: Material in flüssigem Stickstoff einfrieren und pulverisieren (Mörser, Mühle, etc.)

1. in Pufferlösung* homogenisieren (inkubieren)

2. „Bruchstücke“ abzentrifugieren

3. Überstand abnehmen, Messen oder Lagern (-20°bzw. -80°C)

*Puffer: z.B. Phosphat-, Tris-, HEPES-, MES- oder andere Puffer (garantieren Konstanz von pH-Wert bzw. Ionenstärke)

Zusätze: Protein-stabilisierende Salze (z.B. KCl, NaCl) oder Polymere (z.B. Ficoll, PEG), EDTA (hemmt Metall-abhängige Proteasen) und andere Protease-Hemmer, „Frostschutz“ (beim Einfrieren) wie Glycerin, DMSO oder DMF, Oxdationsschutz (-Mercapto-EtOH, DTT oder DTE), Detergenzien (erhöhen Löslichkeit von Membranproteinen, z.B. SDS, Triton X-100, Brij, CHAPS, etc.)

½ O2 H2O

H2C-SH

H2C-SH

DTTred

H2C-S

H2C-S

DTTox

Bsp. Oxidationsschutz

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Zellaufschluss (Protein-Extraktion)

French press

Ultraschall-Bad

Mixer

Kugelmühle

„Potter“

Zerstören der Zell-Integrität durch z.B. Quetschen (Pressen), Schneiden, Resonanzschwingungen (hohe Energie), Zerschlagen, oder Scheren

Bestimmung der Proteinkonzentration

Verschiedene Methoden:

Nach Lowry (kompliziert aber genau) oder hier:

Nach M. Bradford (schnell und gut, im Vergleich mit einem Standardprotein, z.B. BSA oder IgG)

• Bradford-Reagenz (Coomassie Brilliant Blue G250, gelöst in Ethanol/Methanol, Phosphorsäure und Wasser) mit Proteinlösung (i.d.R. verdünnt) mischen

• Inkubation für 5 Minuten (bei RT)

• photometrische Messung (Opt. Dichte, O.D. 595 nm, wenn über 1.0 - Probe verdünnen und noch einmal messen) bindet am Besten an basische Reste!

• Konz. anhand einer Protein-Eichgerade bestimmen (wichtig: im linearen Bereich genau, OD595 < 1)

BSA = Bovine (Rinder) Serum Albumin

0 0.1 0.5 1.0 1.5

mg/ml Protein

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Gel-Elektrophorese von Proteinextrakten

Als Trennmatrix für Proteine verwendet man vertikale Gele aus Polyacrylamid (PAA), mit geringerer Porenweite als für DNA! (es sei denn sehr kleine Fragmente)

ORF zu Protein = 18 : 1

Vergleich: 1 bp = ca. 660 Da (3 bp 1 aa)1 aa = ca. 110 Da

-

+

SDS-Protein-Elektrophorese

SDS:Sodium (Natrium)Dodecyl (CH)12

Sulfat

PAGE:Poly-Acrylamid-Gel-Elektrophorese

Sammel- und Trenngel (SDS-Gel nach Laemmli)

-- - - -

- -- -

-- -

- - -

SDS (sodium dodecylsulfate) ist ein ionisches Detergenz, das beim Erhitzen an denaturierte Polypeptidketten bindet (DTTred hier e-Donor!)

Protein-Trennung nach Ladung!

SO3-

Na+

aliphatische C12-Kette (hydrophob)

anionische Kopfgruppe(hydrophil)

pH 6,8

pH 8,8

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Animation 3-32:

SDS-Polyacrylamid Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE)

http://bcs.whfreeman.com/lodish5e

Färben von Protein-Gelen

Coomassie(brilliant blue)-Färbung

Nachweisgrenze: ~ 300 ng/Bande

Silber(Nitrat)-Färbung

Nachweisgrenze: ~ 10 ng/Bande

Fixierung im Gel durch Essigsäure

(denaturierende Fällung).

CBB bindet an positiv geladene (basische) Seiten-ketten

Ag+-Ionen binden an negativ geladene (saure) Seiten-ketten

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Trocknen von Protein-Gelen

Zwischen feuchtem Cellophan(an der Luft!)

2D-Gel-Elektrophorese: Prinzip

2D-electrophoresis - a complex protein mixture is separated by 2 biochemical principles: In the first dimension, the proteins are separated by isoelectric focusing (IEF) according to their isoelectric points (pI), e.g. proteins migrate in an electric field as long as the surrounding pH differs from their own pI. At their pI, net charge reaches zero and proteins stop running in the electric field. In the second dimension, proteins are separated according to their molecular mass by SDS-PAGE.

sauer neutral basischProtein-gemisch IEF

SDS-PAGE

Fokussierstreifen

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2D-Gel-Elektrophorese: Beispiel

Gleiches MW

Gleicher pI(isoelektrischer Punkt)

Einzelne „spots“ werden sichtbar durch (Silber-) Färbung des Gels, oder auch nach Blotten des Gels (u. Entwicklung mit Antikörpern)

RbcL

RbcS

„Western blot“-Transfer

Proteinen-Abklatsch (aus SDS-Gelen) auf einen festen Träger

Nachweis des gleichmäßigen Proteintransfers auf eine Nitrocellulose-Membran (angefärbt mit Ponceau S). VORSICHT: Bei Nylon oder PDF-Membranen geht das nur mit Amidoschwarz!

Aufbau eines „blot sandwich“(hier: semi-dry)

kD 13095

7255

43

34

26

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Prinzip von Immunoblot-Entwicklungen

Banden-Nachweis entweder durch Farb-Präzipitat auf dem Blotoder Licht-Emission (Radioaktivität, Chemilumineszenz, oder Fluoreszenz)

1. Antikörper(gegen das

Protein der Wahl)

2. Antikörper(zum Nachweis,

z.B. Enzym-gekoppelt)

Protein-Nachweis durch Antikörper

Aufbau eines Antikörpers (AK)

Makromoleküle (Antigene) werden von Antikörpern spezifisch gebunden und können so indirekt nachgewiesen werden (z.B. auch Glykane, etc.)

Antikörper binden Antigeneüber komplementäre Ober-flächen.

Große Antigene exponieren mehrere Epitope an ihrer Oberfläche polyklonaleAntiseren (mit Antikörpern aus verschiedenen B-Zellen)

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Immundetektion

1. primärer Antikörper bindet spezifisch an sein Antigen (z.B. Protein)

2. sekundärer Antikörper bindet spezifisch an den 1. Antikörper

Der 2. Antikörper ist markiert, z.B. durch:- Isotope (radioaktives Jod, I125)- Enzyme (AP oder HRP)- Chromo-/Fluorophore Gruppen- Metalle (silver-enhanced gold)

Detektion erfolgt dann mittels:- Röntgenfilm- Farbreaktion- Lichtemission (empf. Digital-Kamera)- Schwärzung

Chemilumineszenz-Detektionssystem ECLTM

Das an den zweiten Antikörper kovalent gebundene Enzym HRP (Horse-Radish Peroxidase = aus Meerrettich) oder AP (Alkalische Phosphatase) setzt in Anwesenheit von Substrat (hier: H2O2 und Luminol) Licht einer best. Wellenlänge frei, welches detektiert wird.

Blot-Membran mit gebundenem

Antigen-Antikörper-

Komplex

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Gewinnung polyklonaler Antikörper

Die Immunisierung geeigneter Wirte (Affe, Esel, Kaninchen, Huhn, Maus, Schaf, etc.) erfolgt durch Injektion mit dem ANTIGEN (Protein nach Emulgation mit einem Adjuvans) und mehrfache Wiederholung dieser Injektion (sogen. „boosts“).

Blut-Entnahme erfolgt nach 12-14 Tagen, Blutkuchen bei RT/4°C absitzen lassen Serum

Test von Antikörpern im Serum (eventuell Reinigung bestimmter Fraktionen)

WICHTIG: polyklonale Antikörper (AK) erkennen i.d.R. mehrere Epitope des Antigens, da sie aus verschiedenen B-Zellen (Lymphozyten) stammen, mono-klonale AK dagegen nur ein einziges!

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Gewinnung monoklonaler Antikörper

Immunisierung geeigneter Wirte(Maus, Kaninchen, Schaf) mit dem gewünschten Proteindurch Injektion (+ Adjuvans)

Entnahme von Milz-Zellen und Gewinnung von Lymphozyten

Fusion verschiedener B-Zellenmit Myeloma-Zellen (Blutkrebs)

Isolierung einzelner Hybridzellen ( spezielles Selektionsmedium) Diese sind prinzipiell unsterblich! (Lagerung in flüssigem Stickstoff, N2-Tanks)

Bei (erneuter) Kultivierung der eingefrorenen Hybridzellen werden die monospezifischen Antikörper in das Medium sekretiert. MERKE: unterschiedliche Klone erkennen nur jeweils eine Antigen-Determinante! (d.h. einzelne Epitope eines Antigens)

Animation 6-38:

Herstellung Monoklonaler Antikörperhttp://bcs.whfreeman.com/lodish5e

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ELISA - Prinzip

ELISA: Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay

Immunologisches Nachweisverfahrenauf Basis einer enzymatischen Reaktion

Antigene werden über Immunglobuline an einen festen Träger gebunden und mittelsEnzym-markierter Antikörper nachgewiesen

Fixierung der Antigene (Mikrotiterplatten „wells“) „antibody-coated plates“ (MERKE: Proteine binden gerne an Plastik, DNA lieber an Glas!)

Per ELISA kann man Proteine, Zucker, Hormone, Viren, Toxine, etc. nachweisen (med. Diagnostik)

ELISA - Methode

ELISA: Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay

96-well microtiter plate

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12ABCDEFGH

z.B. Toxin oder HIV-Test

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Reinigung von Proteinen - Dialyse nach Salzfällung

Reinigung von Proteinen – Fraktionierung durchGrößenausschluss-Chromatographie

Kleine Moleküle verfangen sich in der Matrix (netzartig, z.B. Sepharose) und eluieren daher später

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Expressionssysteme (rekombinante Technik)

in vitro: Rabbit reticulocyte lysateWheat germ extractE. coli extract (S100)

Das zellfreie RTS System (Roche®): bis zu max. 5 mg Protein/24h

Expressionssysteme

in vivo: Eukaryotische Systeme

wie Hefen oder Insektenzellen

Vorteile: - Expression induzierbar, hohe Ausbeuten- einfache Handhabung von Hefen (Transformierbarkeit, Kulturbedingungen)

Nachteile: - Insektenzellen komplexer in der Handhabung (kostenintensiv) - post-translationale Modifikationen in Hefen mur z.T. möglich - Glykosylierungsmuster abweichend von anderen Systemen

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Expressionssysteme

in vivo: prokaryotische Systeme

wie E. coli oder Bacillus spec.

Vorteile: - einfachste Handhabung (Transformierbarkeit, Kulturbedingungen)- schnelles Wachstum, kontrollierbare Produktionsbedingungen- vielfältige Expressionsvektoren (induzierbar je nach Promotor, z.B.

mittels IPTG oder Tetrazyklin)

Nachteil: - fremde Proteine akkumulieren häufig in „Inclusion bodies“- falsche Proteinfaltung (fixiert durch Disulfid-Brücken)- keine post-translationale Modifikationen (wie Glykosylierung etc.)

Expressionsvektoren - Prinzip

Bestehen aus:• Promotor• MCS (bzw. eingebrachtes Gen)• Terminator

• Selektionsmarker• Origin of replication (ori)

Proteintag

Terminator

Promotor

Selektionsmarker

MCS

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Expressionsvektoren (prokaryotisch)

Vektorkarte mit N- und C-terminalen „tags“

Detail der MCS (multiple cloning site)

cDNA Fragment

Affinitätsreinigung (His-tag)

Vorteil: funktioniert auch unter denaturierenden Bedingungen

Nachteil: Der His-tag kann die Konformation beeinflussen und Protein-Aggregation begünstigen (inclusion bodies)

Bindung erfolgt an komplexiertes Nickel (z.B. Ni-NTA-Sepharose, QIAGEN). Nach Waschen, Elution mit His-Analog Imidazol

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Affinitätsreinigung (Strep-tag II)

Proteine mit Strep-tag II binden an Strep-Tactin, ein Avidin-Derivat, das Biotin (Vitamin H) bindet

Waschen mit physiologischem Puffer(eventuell + Detergenz)

Gebundene Proteine werden kompetitiv von der Matrix gelöst (Verdrängung mittels Des-thiobiotin) und eluieren daher relativ rein (der Strep-tag kann auch abgespalten werden)

(z.B. IBA Life Sciences, Göttingen)

Target-Protein

Alternative Systeme zur Affinitätsreinigung

(Maltose- oder Chitin-Bindeproteine bzw. Glutathion-S Transferase)

Vorteil: Der relativ große „tag“ erleichtert korrekte Faltung (wichtig für Kristallisation und nachfolgende Röntgenstrukturanalysen)

Nachteil: funktioniert nur bedingt unter denaturierenden Bedingungen (d.h. nur mit milden Detergenzien, bei denen MBP oder GST noch ihre Struktur behalten)

New England Biolabs (NEB)

ImmobilisiertesGlutathion (GSH)

QIAGEN (Hilden)

Nach dem Waschen (Pufferüberschuss) Target-Protein entweder mit freiem Glutathion (GSH) eluieren oder mit spezifischer Protease abspalten

GSTSpaltstelle

Amylose= Stärke

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Nachträgliche Abspaltung von „tags“

Enterokinase (aus K. lactis):spaltet nach einem Lysin-Rest wenn die spezifische Sequenz 4x Asp-Lys erkannt wird:

Asp-Asp-Asp-Asp-Lys [D-D-D-D-K]

Faktor Xa („10a“, aus B. taurus):spaltet nach einem Arginin-Rest in folgendem Kontext:

Ile-(Asp/Glu)-Gly-Arg [I-(D/E)-G-R]

Analyse von gereinigten Proteinen

Säuger

Wurm

Bakterien

Bioinformatik

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We have the human genome sequence !

Now what? New –functionalgenomics

Proteomics - Warum?ein Genom – aber unterschiedliche Proteome

verschiedene Expresssionsmuster

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2D Gel-Elektrophorese - Prinzip

2D Gel-Elektrophorese - Beispiel

Phosphorylierung der leichten Myosinketten(LC) während der Muskelkontraktion

LC

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Prinzip eines MALDI-TOF-Experiments

MALDI: matrix-assisted LASER desorption / ionisationTOF: time of flight (als Dimension für die Masse!)

MALDI: Laser-induzierte Ionisierung der Probe

zeitaufgelöste Detektion im Massen-Spektrometer (MS)

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time of flight-Analyse

MALDI-TOF-Spektrum

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ENDE