Chancen und Möglichkeiten -

Real-time PCR

Life Science Konferenz 05. Mai 2010 in Jena

Die 3 Phasen der PCR

1. Denaturierung

DNA-Doppelstrang wird in Einzelstränge aufgeschmolzen

Für 30 sec auf 95°C erhitzen

Genomische oder komplexe DNA wird vorab für 5-10 min denaturiert

Denaturierung

Die 3 Phasen der PCR

2. Annealing

Anlagerung der Primer an die Template DNA

für 15-30 sec auf 50-60°C abkühlen

Annealing Temperatur (TA) kann anhand der Primer-Schmelztemperatur (TM) abgeschätzt werden

Annealing

Die 3 Phasen der PCR

3. Extension

Polymerase-vermittelte DNA-Synthese ausgehend vom Primer 3‘-Ende (5‘→3‘-Synthese)

Extension

Zyklus 1 Zyklus 2 Zyklus 3 Zyklus 4

Denaturierung Annealing Extension

N = N0 * 2n

N = Zahl der amplifizierten Moleküle

N0 = Zahl der Startmoleküle

n = Zahl der Zyklen

PCR-Reaktion

⇒ Die Menge an Produkt verdoppelt sich mit jedem Zyklus

Zyklus n

2 Kopien 4 Kopien 8 Kopien 16 Kopien 2n Kopien

Kinetik der PCR-Reaktion

Idealfall

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

1 5 9 13 17 21 25 29 33 37

Zyklus

Log

Kop

ienz

ahl

Sättigung

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

1 5 9 13 17 21 25 29 33 37

Zyklus

Log

Kop

ienz

ahl

Gründe für den Sättigungseffekt: Produkte reannealen (Kompetition mit Primern) Anhäufung von inhibierenden Nebenprodukten Polymerase, Primer und dNTPs werden limitierend

Idealer Verlauf Verlauf mit Sättigung

⇒ PCR Reaktionen verlaufen nie optimal, es kommt zu Sättigungseffekten

Zyklus

Log

(Kop

ienz

ahl)

Frühe Phase

Plateau Phase

Log Phase

Kinetik der PCR-Reaktion

Realer Verlauf einer Produktassimilationskurve einer PCR-Reaktion

Frühe Phase- Signal unterhalb des Detektionslimits- Keine optimale Amplifikation, Reaktion muss sich erst „einschwingen“

Log Phase- Amplifikation läuft optimal (exponentielle Vervielfältigung)

Plateau Phase- Amplifikation läuft suboptimal wegen limitierender Reagenzien und

inhibierender Reaktionsprodukte

Das Problem der Quantifizierung

Endpunktanalyse im Agarosegel Schwierig, da nur in einem engen Zyklusfenster möglich nicht quantitativ⇒ Quantifizierung nur über real-time PCR möglich

Zyklus

Log

(Kop

ienz

ahl)

a b c1 2 3

a

b

c

d

d

Auftrennung im Agarosegel

Quantitative Real-Time PCR

Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren (Prinzip der PCR)

Zusätzlich Möglichkeit der Quantifizierung über Fluoreszenz

Erzeugung fluoreszierender PCR-Produkte

Zunehmende Menge an PCR-Produkten →steigende Fluoreszenz

Möglichkeiten:

Interkalierende Farbstoffe

Sequenzspezifische Sonden

Die Zunahme der Fluoreszenzemission wird während der Reaktion überwacht undals Indikator für Produktakkumulation verwendet. In jedem PCR-Zyklus (inEchtzeit).

SYBR Green

Fluoreszenz nach Einlagern in doppelsträngige DNA:

Zunahme Target-DNA korreliert mit Zunahme der Fluoreszenz

Keine Sequenzspezifität

Zwischen verschieden PCR Produkten kann nicht unterschieden werden

Keine Multiplex-Messungen möglich

Schmelzkurvenanalyse nötig

Interkalierende Farbstoffe

Schmelzkurvenanalyse

Fragmentlängen und somit Spezifität bestimmbar

Temperatur langsam kontinuierlich erhöht: Aufschmelzen der DNA

Bei fragment-spezifischer Schmelztemperatur denaturiert Doppelstrang in Einzelstrang

SYBR Green wird freigesetzt →Fluoreszenzabnahme

Unterscheidung da PCR-Produkt DNA hat höheren Schmelzpunkt als unspezifisch entstehende Primerdimer

Sonde: (z.B. Taqman)

Sequenzspezifisch

Fluoreszenz-Farbstoff (Reporter):

FAM, VIC, ROX usw.

Quencher: „dämpft“ Reporter-Fluoreszenz

TAMRA, Black-Hole-Quencher (BHQ)

Polymerase:

5‘-3‘-Exonuclease-Aktivität

Abbau Sonde bei Synthese des Stranges vom 5‘-Ende ausgehend

Quencher und Reporter entfernen sich räumlich → Fluoreszenz steigt an

Messung am Ende der Elongation jedes Zyklus

Sequenzspezifische Sonden

SYBR Green

Assays die nicht der Spezifität von Sonden-basierten Assays bedürfen

Singleplex Reaktionen

Generelles Screenen von Transkripten

Wenn das PCR System voll optimiert ist (keine Primer-Dimere, keine unspezifischen Amplicons)

Genspezifische Sonden

Allelische Diskrimierung

Multiplex Reaktionen

Amplifikation gering exprimierter Transkripte

Detektion seltener Pathogene

Methylierungsspezifische PCR

Einsatzgebiete der Detektionsmethoden

qTOWER TOptical

qTOWER und TOptical

Patentiertes Optisches System

PCR Block

Linsenarray

Lichtquelle

Multiplexer

Messkopf

CPM Detektor

8 Optische Fasern

LED blau

LED weiss

LED rot

Motor 2

8 OptischeFasern

8 Kollimatoren

Konkaver Spiegel

Motor 1

Spindel

Farbmodul

Modulträger rotiert: 6 Umdrehungen/sek.

Shuttle mit 8 optischen Fasern liest 96 Wells spaltenweise aus

Dauer des Scanvorgangs ist unabhängig von der Zahl der gemessenen Farben

Patent Nr. DE 2006 036 171 B4

Rotierender Modulträger

Aufbau des Multiplexers

LED Lichtquelle

Photomultiplier

Filterrad

Scanner

Funktionsweise des Multiplexers

Enden der 8 optischen Fasern

LED Fluoreszenzlicht zur Anregung

Farbmodulgrün

Farbmodulgelb

Farbmodulrot

Farbmodulblau

6 Umdrehungen/sek

8 Kollimatoren

Emissionsfilter (Interferenz)Emissionsfilter (Glas)

Anregungsfilter

Kollimatorlinse

Probe

Detektor

Ferrule mit optischer Faser

Linse

Strahlteiler

Lichtquelle

Optischer Weg

Filter

Anregung durch drei langlebige, hoch-intensive LEDs (blau, weiss, rot)

Farbmodule mit Anregungs- und Emissionsfiltern

Aufrüstung mit bis zu 4 (qTOWER) bzw. 6 (TOptical) Farbmodulen nach Wahl

Kein passiver Referenzfarbstoff notwendig

Filter Anregung Emission Bsp. Farbstoffe

TOptical Filter Modul 1 470nm 520nm FAM, SYBR Green, Alexa488

TOptical Filter Modul 2 515nm 545nm JOE, VIC, HEX, Yakima Yellow

TOptical Filter Modul 3 535nm 580nm TAMRA, DFO, Alexa 546, NED

TOptical Filter Modul 4 565nm 605nm ROX, TexasRed, Cy3.5

TOptical Filter Modul 5 630nm 670nm Cy5, Alexa 633, Quasar 670

TOptical Filter Modul 6 660nm 705nm LightCycler Red 705, Alexa 680

TOptical FRET Modul 1 470nm 580nm FAM/TAMRA

TOptical FRET Modul 2 470nm 670nm FAM/Cy5

TOptical FRET Modul 3 470nm 705nm FAM/Cy5.5

TOptical FRET Modul 4 515nm 670nm JOE/Cy5

Fluoreszenzanregung

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

400 450 500 550 600 650 700

nm

FAM JOE/HEX/VIC 6-ROX TET TAMRA Cy5 Cy5.5 LED blau LED weiss LED rot

LED

Em

issi

on/A

bsor

ptio

n

LED Anregung qTOWER / TOptical vs. Absorption Farbstoffe

Drei LEDs zur bestmöglichen Anregung üblich verwendeter Fluoreszenzfarbstoffe

Block

96 well Silberblock

Heizrate 6°C/sek, Kühlrate 4,5°C/sek

Geeignet für Standard PCR Tubes, 8er Streifen, Mikrotiterplatten

Korrosionsschutz durch Gold-Anodisierung

Temperaturgradient (optional)

qTOWER TOptical

96 well low profile rapid (LPR) Silberblock

Heizrate 12°C/sek, Kühlrate 8°C/sek

Geeignet für kleinste Probenvolumina

Korrosionsschutz durch Gold-Anodisierung

Sample Protection System (SPS)

Software

Einfaches und übersichtliches Erstellen von Experimenten

Inkl. Auswertungsmodulen für:

a) Absolute Quantifizierung

b) Relative Quantifizierung

c) ∆∆Ct-Quantifizierung

d) Allelische Diskrimierung

e) Schmelzkurvenanalytik

MIQE-konforme Probendokumentation

Benutzerverwaltung inkl. Adminstratorfunktion

Zahlreiche Exporttools (Excel, REST, qBASE, Biogazelle)

Zusammenfassung

modulares Blocksystem

Gradientenfunktion (optional)

Multiplexing bis zu 6 Farben

Offene Plattform für Kits und Plastikmaterialien aller Art

rapidPCR - real time

Kleinste Probenvolumina

Multiplexing bis zu 4 Farben

Geringe Leistungsaufnahme

Geringer Platzdebarf

Patentiertes optisches Shuttlesystem mit Hochleistungs-Optikfasern

Optimale Anregung durch 3 verschiedenfarbige, langlebige LEDs

Anregung und Detektion aller gewöhnlich verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe

Einzigartige Flexibität durch kundenspezifische Konfektionierung mit Farbmodulen

Kein passiver Referenzfarbstoff notwendig

qTOWER TOptical

Trends in der real-time PCR

Multiplex real-time PCR

Kleine Reaktionsvolumina

Rapid/Fast real-time PCR

Offene Plattformen für alle Kits und Plastikwaren

Flexibilität in der Konfiguration der Geräte

Barcode-Reading

LIMS-basierte Probendokumentation

MIQE-konforme Erfassung von Versuchsabläufen

Real time PCR

Hauptanwendungsgebiete

Quantifizierung der Genexpression Qualitätskontrolle und Assayvalidierung Detektion und Quantifizierung von Pathogenen Messung von DNA-Schäden (z.B. Microsatelliten-Instabilitität, Strahlenschäden) Bestimmungen mitochondrialer DNA Genotyptisierungen über allelische Diskriminierung Bestimmung von Copy Number Variations (CNV) Pharmakogenetik

Beispiele für neuere Techniken

DNA-Methylierungsstudien

miRNA Messungen

Assymetrische lineare Amplifikation zur Bestimmung von low-level Transkripten (LATE-PCR)

Neue real-time PCR Techniken

DNA-Methylierungsstudien

Eukaryoten: - Regulation der Genexpression

Prokaryoten: - Schutz vor Fremd-DNA

- Fehlerkorrektur bei der DNA-Neusynthese

Methode

Nachweis der Methylierungsstellen nach Bisulfidkonversion der DNA

Verwendung von spezifischen Sonden, die an unkonvertierte oder konvertierte DNA-Abschnitte binden

MSP (methylation-specific real-time PCR)

CGCGTCG ATC CGCGTCG ATC

CH3 CH3 CH3

UGUGTUG ATU CGCGTCG ATU

CH3 CH3 CH3

UGUGTUG ATU CGCGTCG ATU

CH3 CH3 CH3

BisulfidkonvertierungNaHSO3

Sonde 1Sonde 2

ACACAAC

GCGCAGC

Sonde 1

Sonde 2 ACACAAC

GCGCAGCSonde 2

Sonde 1

Nicht-methylierte DNA Methylierte DNA

Nur Sonde 1bindet

Nur Sonde 2bindet

Real-time PCR

Neue real-time PCR Techniken

LATE-PCR

LATE-PCR wurde spezielle für die Amplifikation von low-copy Targets entwickelt (Gewinn von 1-2 Ct-Werten)

Kombination aus exponentieller Amplikation und linearer Amplifikation

Verwendung von zwei Primern, wobei Primer 1 im deutlichen Überschuss zu Primer 2 eingesetzt wird

Während der ersten Zyklen exponentielle Vermehrung des Produkts

Nach Aufbrauchen von Primer 2 nur noch lineare Amplifikation

Originalpublikation: Sanchez et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA, 101(7):1933-1938.

LATE-PCR(Linear After The Exponential PCR)

Denaturierung

Extension

Annealing

Frühe Phase der Amplifikation

Exponentielle symmetrische Amplifikation

Amplifikation in Sättigung

Sondenbindung bei hohen

Temperaturen

Exponentielle symmetrische Amplifikation

Lineare assymetrische Amplifikation

Lineare assymetrische Amplifikation

Sondenbindung auch bei

niedrigen Temp an Einzelstränge

erleichtert

Exponentielle Amplifikation für ca. 40 Zyklen

Lineare Amplifikation für ca. 50 ZyklenExponentielle

Amplifikation für ca. 20 Zyklen

konventionelle real-time PCR

LATE-PCR

Neue real-time PCR Techniken

miRNA Profiling

miRNAs spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression bei Eukaryoten (Abbau von mRNA - Organogenese, Tumore)

miRNAs sind kleine, non-coding RNAs, die durch die RNA-Polymerase II synthetisiert werden

Sie unterliegen einer Reifung: pri-miRNA -> pre-miRNA -> miRNA

miRNAs haben keinen PolyA-Tail

5‘ 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ 3‘

pri-miRNA pre-miRNA

Drosha

Zellkern

5‘3‘

RISC

Dicer

5‘3‘

RISC

Cytosol

AAAA5‘ 3‘mRNA

Neue real-time PCR Techniken

miRNA Profiling

miRNA spezifischer

Primer

5‘ 3‘miRNA

Polyadenylierung(A)n

cDNA-Erststrangsynthese

Oligo(dT)-Primer mit Tag

(A)n(T)n

Zweitstrangsynthese(T)n

(A)n

(T)n

Amplifikation

Detektion über SYBR Green

5‘3‘

miRNA

Stem-LoopRT-Primer

Bindung eines loop-RT Primers

cDNA Erststrangsynthese

Zweitstrangsynthese

Amplifikation

miRNA spezifischer

Primer

miRNA spezifische

Sonde

Stem-Loop basierte cDNA-Syntheseund sondenbasierter Nachweis

Oligo(dT) basierte cDNA-Syntheseund SYBR Green Nachweis

Neue real-time PCR Techniken

High resolution melting - HRM

Hochauflösende Schmelzkurve mit kleinen Temperaturinkrementen

Verwendung von quantitativ interkalierenden 3rd Generation Farbstoffen wie SYTO9, LCGreen oder Eva Green™

Hohe Temperaturuniformität des Thermocycler-Blocks erforderlich

Detektion von einzelnen Nukleotidaustauschen

Fluo

resz

enz

Temperatur55°C 95°C

agtactggactaggttactcttagccta agtactggactaggctactcttagccta

Normale DNA Mutierte DNA

HRM™ und LCGreen sind Warenzeichen von Idaho Technologies, SYTO®9 Invitrogen Corporation, Eva Green™ Biotium Inc

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !

Wir wünschen Ihnen allen

einen interessanten und

abwechslungsreichen

Tag !

Technische Spezifikationen

TOptical qTOWER

Blockformat 96 well standard, Silber 96 well rapid, Silber

Blockwechsel Ja Nein

Gradient Optional Nein

Max. Heizrate 6,0°C/sek 12,0°C/sek

Max Kühlrate 4,5°C/sek 8,0°C/sek

Blockhomogenität +/- 0,15°C bei 55°C

+/- 0,25°C bei 72°C

+/- 0,50°C bei 95°C

+/- 0,2°C

Kontrollgenauigkeit +/- 0,1°C +/-0,2°C

Probenvolumen 5µl bis 80µl 5µl bis 20µl

LED blau, warmweiss, rot blau, warmweiss, rot

Anregung 8 Hochleistungs-Optikfasern in Shuttle

8 Hochleistungs-Optikfasern in Shuttle

Max. Filteranzahl 6 4

Scandauer 96 well 6 sek 4 sek

Software qPCRSoft qPCRSoft

Algorithmen Absolute Quantifizierung

Relative Quantifizierung

∆∆Ct-Quantifizierung

Allelische Diskrimierung

Schmelzkurvenanalytik

Absolute Quantifizierung

Relative Quantifizierung

∆∆Ct-Quantifizierung

Allelische Diskrimierung

Schmelzkurvenanalytik