Chaperone mechanism of the small heat shock protein Hsp26 2.1 Protein folding and molecular...

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  • TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN

    Lehrstuhl für Biotechnologie

    Chaperone mechanism of the small heat shock protein Hsp26

    Titus Marcellus Franzmann

    Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Chemie der Technischen Universität München

    zur Erlangung des akademischen Grades eines

    Doktors der Naturwissenschaften

    genehmigten Dissertation.

    Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. Horst Kessler

    Prüfer der Dissertation:

    1. Univ.-Prof. Dr. Johannes Buchner

    2. Univ.-Prof. Dr. Thomas Kiefhaber

    3. Univ.-Prof. Dr. Matthias Rief

    Die Dissertation wurde am 20.05.2008 bei der Technischen Universität München eingereicht

    und durch die Fakultät für Chemie am 18.08.2008 angenommen.

  •  

  • To those who I love

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  •  

    1 Summary / Zusammenfassung  

    Die  biologisch  aktive dreidimensionale  Struktur  von Proteinen  ist  sensibel  auf 

    Änderungen  der  Umgebungstemperatur.  Unter  Hitzeschock  können  viele 

    Proteine  ihre  natürliche  Struktur  verlieren  und  werden  in  eine  für 

    Proteinaggregation  anfällige  Konformation  überführt.  Eine  Erhöhung  der 

    Außentemperatur  stellt demnach  eine Bedrohung  für  alle Lebewesen dar. Um 

    der  Proteinaggregation  in  der  Zelle  entgegenzuwirken,  nehmen  Zellen 

    Temperaturunterschiede autonom wahr und antworten auf Hitzestress mit der 

    Expression von Hitzeschockgenen. Die Produkte dieser Hitzeschockanwort sind 

    die  Hitzeschockproteine  (Hsps),  von  denen  viele  als  molekulare  Chaperone 

    identifiziert  wurden.  Molekulare  Chaperone  erkennen  nicht‐native 

    Proteinstrukturen,  binden  diese  spezifisch  und  verhindern  durch  Ausbildung 

    eines  Chaperon‐Substrate‐Komplexes  Proteinaggregation.  Viele  Chaperone 

    binden  und  hydrolysieren  ATP.  Die  freiwerdende  Energie  wird  oft  dazu 

    verwendet, das Chaperon von einem hochaffinen in einen niederaffinen Zustand 

    für  das  Substrate  zu  überführen  und  somit  die  Substratefreisetzung  zu 

    ermöglichen. 

    Kleine  Hitzeschockproteine  (engl.  small  heat  shock  proteins,  sHsps)  sind 

    molekular Chaperone. sHsps binden entfaltete Proteine, bilden mit diesen stabile 

    Substratkomplexe und verhindern so deren Aggregation.  Im Gegensatz zu den 

    ATP‐abhängigen Chaperonklassen  binden und  hydrolysieren  sHsps  kein ATP. 

    Ihre  Aktivität  wird  durch  andere  Strategien,  wie  z.B.  durch  Hitze,  oder 

  • Veränderungen  des  zellulären  Redoxpotentials  reguliert.  Ein  Vertreter  der 

    temperaturkontrollierten sHsps ist Hsp26 aus der Bäckerhefe. 

    Hsp26  ist  das  generelle  kleine  Hitzeschockprotein  in  der  Bäckerhefe, 

    Saccharomyces  cerevisiae.  Strukturuntersuchungen  haben  gezeigt,  dass  Hsp26 

    Homooligomere  aus  24  Untereinheiten  bildet,  die  sich  zu  einer  ca.  600 kDa 

    Hohlkugel zusammenlagern. Sequenzvergleiche zwischen sHsps haben gezeigt, 

    dass  sich  die Hsp26 Domänenstruktur  aus  einer N‐terminalen Domäne,  einer 

    einzigartigen  Mitteldomäne,  der  strukturell  konservierten  α‐Kristallindomäne 

    und einer C‐terminalen Extinsion zusammensetzt. Biochemische Analysen haben 

    gezeigt, dass die N‐terminale Region von sHsps generell eine wichtige Funktion 

    für  die  Substraterkennung  darstellt.  Dies  konnte  ebenfalls  für  Hsp26  gezeigt 

    werden.  Eine  Hsp26  Variante,  der  die  ersten  30  Aminosäuren  fehlen,  wies 

    reduzierte  Chaperonaktivität  auf  und  eine  Variante,  der  die  ersten  95  Reste 

    fehlten  war  chaperoninaktiv.  Während  die  α‐Kristallindomäne  sowie  die  C‐

    terminale  Extension  verantwortlich  für  die Oligomerisierung  von Hsp26  sind, 

    war die Funktion der Mitteldomäne bislang unbekannt. 

    Eine  Besonderheit  von  Hsp26  ist,  dass  es  autonom  Temperaturänderungen 

    wahrnehmen  kann  und  seine  Chaperonaktivität  temperaturabhängig  ist.  Erst 

    unter Hitzeschockbedingungen, z.B. 45°C, ist Hsp26 in der Lage die Aggregation 

    von  Substraten  zu  verhindern,  während  es  bei  25°C  die  Substrataggregation 

    nicht  unterdrückt.  Mechanistische  Untersuchungen  haben  gezeigt,  dass  die 

    Temperaturaktivierung  der  Hsp26‐Chaperonfunktion  gleichzeitig  die 

    Oligomerstabilität herabsetzt. In analytischen Gelfiltrationsexperimenten konnte 

    gezeigt werden, dass die  temperatur‐induzierte Destabilisierung der Oligomere 

    zur Dissoziation  in Dimere  führt. Gleichzeitig haben elektronenmikroskopische 

    Untersuchungen  gezeigt,  dass  Hsp26‐Substratkomplexe  grundsätzlich  eine 

    andere  Struktur  aufwiesen  als  Hsp26  in  Abwesenheit  von  Substraten.  Diese 

  • Beobachtungen  haben  zu  einem mechanistischen Model  geführt,  in  dem  das 

    Hsp26 Oligomer eine Speichergruppe darstellt, die unter Hitzeschock  in aktive 

    Dimere  dissoziert.  Diese  Dimere  binden  entfaltete  Substrate  Moleküle  und 

    reassozieren zu Hsp26‐Substrate‐Komplexen. Die mechanistischen Details dieses 

    Regulationsprinzips blieben jedoch bislang ungeklärt. 

    Um weitere Details über den Hsp26 Chaperonmechanismus zu erlangen, wurden 

    der  Hsp26  Temperaturaktivierungsmechanismus  und  die  damit  verbundenen 

    temperatur‐induzierten  Strukturänderungen  thermodynamisch  und  kinetisch 

    untersucht. Dazu wurden Hsp26 Varianten hergestellt, die sich spektroskopisch 

    vom  Wildtyp  (wt)  Protein  unterschieden.  Zum  einen  wurden  Hsp26 

    Cysteinvarianten hergestellt,  in denen  jeweils ein Serinrest  in der N‐terminalen 

    Domäne  (Hsp26S4C),  Mitteldomäne  (Hsp26S82C)  sowie  in  der  C‐terminalen 

    Extinsion  (Hsp26S210C)  durch  Cystein  ersetzt  wurde.  Desweiteren  wurden 

    Tryptophanvarianten  hergestellt,  bei  denen  das  Tryptophan  der Mitteldomäne 

    (W72)  und  das  der  C‐terminalen  Extension  (W211)  durch  Tyrosin  ersetzt 

    wurden. 

    Redoxanalysen haben gezeigt, dass Hsp26S4C und Hsp26S210C, jedoch nicht wt 

    Hsp26  und Hsp26S82C,  Disulfidbrücken  bilden  können.  Die  Ausbildung  von 

    Disulfidbrücken zwischen den N‐terminalen Domänen, sowie den C‐terminalen 

    Extensionen  innerhalb eines Oligomers hatte weder Einfluss auf die Sekundär‐ 

    oder Tertiärstruktur noch  auf die  thermodynamische Stabilität.  Jedoch wurden 

    die  Oligomere  durch  die  Ausbildung  von  Disulfidbrücken  zwischen 

    Untereinheiten  innerhalb  eines  Oligomers  signifikant  stabilisiert,  so  dass  eine 

    Dissoziation  in  Dimere  nicht  mehr  beobachtet  wurde.  Untersuchungen  zur 

    Dynamik  der  Oliogmere  zeigten,  dass  wt  Hsp26  in  wässriger  Lösung 

    kontinuierlich  Untergruppen  austauscht,  dieser  Austausch  jedoch  vollständig 

    inhibiert wurde, wenn die Oligomere durch Disulfidbrücken kovalent verknüpft 

  • wurden.  Interessanterweise  war  die  Chaperonaktivität  dieser  kovalent 

    verknüpften Hsp26  Varianten  unbeeinträchtigt. Weder  die  Effizienz  noch  die 

    Temperaturabhängigkeit  der  Chaperonfunktion  waren  verändert.  Diese 

    Experimente  korrigierten  das  bislang  gängige  Arbeitsmodel  und  zeigten 

    eindeutig,  dass  weder  die  Dissoziation  in  Dimere  noch  die  Fähigkeit 

    Untergruppen  austauschen  zu  können  essentielle  Schritte  im  Hsp26 

    Aktivierungmechanismus darstellen. Vielmehr konnte gezeigt werden, dass eine 

    intrinsische  Konformationsänderung  innerhalb  des  Hsp26  Oligomers  zur 

    Aktivierung seiner Chaperonfunktion führt. 

    Um diese Konformationsänderung in einem weiteren mechanistischen Detail zu 

    untersuchen,  wurden  die  Hsp26  Cysteinvarianten  mit  Fluoreszenzfarbstoffen 

    modifiziert  und  mittels  Fluoreszenz‐Resonanz‐Energie‐Transfer  (FRET) 

    untersucht. Bei FRET wird die Energie eines angeregten Donorchromophors auf 

    einen  in  der  Nähe  befindlichen  Akzeptorchromophor  strahlenlos  übertragen. 

    Dieser Prozess  ist Distanzabhängig und ermöglicht so die Entfernungsmessung 

    zwischen zwei Domänen. Die starke Distanzabhängigkeit macht FRET zu einem 

    sensitiven spektroskopischen Werkzeug, das besonders gut geeignet ist, relative 

    Änderungen  zu  beobachten.  So  konnte  unter  Verwendung  der 

    Einzelcysteinvarianten  eine  Serie  von  unterschiedlich  gelabelten  Hsp26 

    Oligomeren  hergestellt  werden  und  ermöglichte  so  eine  ortspezifische