Charakterisierung der Yersinia enterocolitica · Juli 2012, ISBN 978-3-86345-080-9 A. Drees, P....

Tierärztliche Hochschule Hannover

Charakterisierung der Yersinia enterocolitica–

Infektion im Minipigmodell

INAUGURAL- DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

-Doctor medicinae veterinariae-

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Anna Charlotte Drees aus Berlin

Hannover 2013

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Peter Valentin-Weigand

Institut für Mikrobiologie

1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Peter Valentin-Weigand

2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Karl-Heinz Waldmann

Tag der mündlichen Prüfung: 15.10.2013

Diese Forschungsarbeit wurde unterstützt vom Bundesministerium für Bildung

undForschung (BMBF) im Rahmen des Forschungsverbunds Food-Borne Zoonotic

Infections of Humans (FBI-Zoo) und des Deutschen Zentrums für Infektionsforschung

(DZIF).

Gewidmet all meinen Sponsoren an Liebe, Zeit, Geduld und Geld

Folgende Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits publiziert:

A. Drees, P. Grüning, J. Schaake, A. von Altrock, F. Seehusen, P. Dersch, P.

Valentin-Weigand (2011):

Establishment of a Yersinia enterocolitica infection model in minipigs

Poster auf dem National Symposium on Zoonoses Research, 06.10. – 07.10. 2011,

Berlin

In: National Symposium on Zoonoses Research, 6-7 October 2011, Berlin,

Programme und Abstracts

A. Drees, P. Grüning, J. Schaake, P. Dersch, A. von Altrock, F. Seehusen,

P. Valentin-Weigand (2012):

Serotyp-abhängige Kolonisation von Yersinia enterocolitica im Minipig-Modell

Vortrag auf der Tagung der Fachgruppe “Bakteriologie und Mykologie” der

Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft e.V. (DVG), 27.06. – 29.06. 2012,

Leipzig

In: DVG Tagung der Fachgruppe “Bakteriologie und Mykologie”, Leipzig, 27. bis 29.

Juli 2012, ISBN 978-3-86345-080-9

A. Drees, P. Grüning, J. Schaake, P. Dersch, A. von Altrock, P. Valentin-Weigand

(2012):

Serotype dependent Colonization of Yersinia enterocolitica in a Minipig Infection

Model

Vortrag auf dem 3rd National Yersinia 13.07. – 14.07. 2012, Tübingen

In: 3rd National Yersinia Meeting, 13. bis 14. Juli 2012, Tagungsband

Inhalt

A Einleitung ..................................................................................... 11 A.1 Einleitung und Zielsetzung ...................................................................... 11 A.2 Literaturübersicht ..................................................................................... 13

A.2.1 Allgemeine Eigenschaften von Yersinia enterocolitica ........................ 13

A.2.2 Yersinia enterocolitica: Epidemiologie und zoonotische Bedeutung ... 14

A.2.3 Yersiniose bei Menschen und Tieren: Klinische Symptome................ 17

A.2.4 Virulenzfaktoren enteropathogener Yersinien ..................................... 18

A.2.5 Bedeutung des Virulenzfaktors Invasin ............................................... 19

A.2.6 Kultureller Nachweis pathogener Yersinien ........................................ 21

A.2.7 Infektionsversuche im Mausmodell ..................................................... 22

A.2.8 Infektionsversuche im Schwein ........................................................... 23

B Material und Methoden ............................................................... 26 B.1 Bakterienstämme, Kultivierung und Differenzierung ............................ 26

B.1.1 Verwendete Yersinia enterocolitica-Stämme ...................................... 26

B.1.2 Herstellung der Bakteriensuspension für die orale Infektion ............... 27

B.1.3 Quantitative Isolierung der Yersinien und Differenzierung durch

Resistenzen ........................................................................................ 28

B.1.4 Qualitative Isolierung der Yersinien mittels Kälteanreicherung ........... 28

B.1.5 Biochemische Differenzierung der Isolate ........................................... 29

B.2 Versuchstiere, experimentelle Infektionen und Versuchsdesign ........ 30 B.2.1 Herkunft, Unterbringung und Versorgung der Versuchstiere .............. 30

B.2.2 Versuchsaufbau .................................................................................. 31

B.2.3 Orale Infektion der Minipigs ................................................................ 32

B.2.4 Probenentnahme ................................................................................ 32

B.2.5 Pathologisch-anatomische Untersuchung ........................................... 33

B.2.6 Histopathologische Untersuchung ...................................................... 34

B.2.7 Serologische Untersuchung ................................................................ 34

B.3 Statistische Auswertung.......................................................................... 34

C Ergebnisse ................................................................................... 36 C.1 Etablierung eines Infektionsmodells für Yersinia enterocolitica im

Minipig ....................................................................................................... 36

C.1.1 Vergleich verschiedener Infektionsdosen von Y. enterocolitica

Serotyp O:3 ......................................................................................... 36

C.1.2 Zeitverlauf der Infektion mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 .................. 40

C.2 Vergleichende Infektionsstudie der Serotypen O:3 und O:8 ................ 48 C.2.1 Klinische Beurteilung der Tiere ........................................................... 49

C.2.2 Pathologisch-anatomische Beurteilung ............................................... 49

C.2.3 Histopathologische Beurteilung ........................................................... 49

C.2.4 Quantitative Organbelastung .............................................................. 50

C.2.5 Qualitative Organbelastung ................................................................. 52

C.2.6 Bakterielle Ausscheidung .................................................................... 53

C.2.7 Serologie ............................................................................................. 55

C.3 Koinfektionsversuche mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtyp und Mutanten mit invasinassoziierten Gendefekten im Minipig-Modell ........................................................................................................ 57

C.3.1 Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und

einer RovA-Stabilitätsmutante ............................................................. 58

C.3.2 Koinfektionsversuche mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und

einer PinvA∆IS1667- Mutante ............................................................... 67

C.3.3 Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und

einer ∆invA-Mutante ............................................................................ 75

C.4 Vergleichende Betrachtung der Ergebnisse aus Infektionsversuchen im Maus- und Minipig-Modell .............................. 85

C.4.1 Vergleich der Infektionsstudien mit Y. enterocolitica Serotyp O:3

und O:8 Stämmen ............................................................................... 86

C.4.2 Vergleich der Koinfektionsstudien mit Y. enterocolitica Serotyp

O:3 Wildtyp und Mutanten mit invA-assoziierten Gendefekten ........... 87

D Diskussion ................................................................................... 95

E Zusammenfassung .................................................................... 106

F Summary .................................................................................... 108

G Literaturverzeichnis .................................................................. 110

H Anhang ....................................................................................... 121 H.1 Detaillierte klinische Beurteilung der Minipigs .................................... 121

H.2 Detaillierte pathologisch-anatomische Beurteilung ............................ 128 H.3 Detaillierte histopathologische Beurteilung ........................................ 134 H.4 Tabellarische Auflistung der quantitativen Organbelastung .............. 145 H.5 Nährböden, Medien und Antibiotika ..................................................... 150

H.5.1 Nährböden ........................................................................................ 150

H.5.2 (Nähr-) Medien .................................................................................. 151

H.5.3 „Bunte Reihe“ .................................................................................... 151

H.5.4 Zusätze ............................................................................................. 154

H.5.5 Verwendete Antibiotika ..................................................................... 155

H.6 Tabellenverzeichnis ............................................................................... 155

Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung

A. bidest. Aqua bidestilliert

A. dest Aqua destilliert

Ail engl.: attachment and invasion locus

allg. allgemein

API engl.: analytical profile index

ATP Adenosintriphosphat

bspw. beispielsweise

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

CI engl.: competitive index

CIN-Agar Cefsulodin- Irgasan- Novobiocin- Agar

d.p.i. engl.: days post infection

ELISA engl.: enzyme-linked immunosorbent assay

g Gramm

GALT engl.:gut associated lymphoid tissue

ggr. geringgradig

GIT Gastrointestinaltrakt

H2S Schwefelwasserstoff

hgr. hochgradig

H-NS engl.: Histone-like nucleoid-structuring protein

h lat.: hora

i.c. intracardial

i.m. intramuskulär

InvA Invasin (Invasin A)

i.p. intraperitoneal

IS Insertionselement

i.v. intravenös

Yops engl.: Yersinia outer proteins

k.A. keine Angaben

KBE koloniebildende Einheiten

KnR Kanamycinresistent

L. propria Lamina propria

LB Agar Luria Bertani Agar

LB Medium Luria Bertani Medium

Lnn. Lymphonodi

LPS Lipopolysaccharide

lymph. lymphatisch

M Molar

MCH Mittleres korpuskuläres Hämoglobin (engl.: mean

corpuscular hemoglobin)

MCHC Mittlere korpuskuläre Hämoglobin-Konzentration

(engl.: mean corpuscular hemoglobin

concentration)

MCV Mittleres Erythrozyteneinzelvolumen (engl.: mean

corpuscular volume)

mg Milligramm

ml Milliliter

mM Millimolar

μg Microgramm

μl Microliter

min Minute

mgr. mittelgradig

Myf engl.: Mucoid Yersinia factor

neg. negative

OD optische Dichte

ODC Ornithindecarboxylase

O/F Oxidativ/ Fermentativ

PBS engl.: phosphate buffered saline

PCR engl.: polymerase chain reaction

pH pondus hydrogenii

p.i. post infectionem

pos. positiv

PP Peyersche Platten

pYV engl.: Yersinia Virulence plasmid

RovA engl.: regulator of virulence A

rpm engl.: revolutions per minute

RVR engl.: relative virulence ratio

s. siehe

SPF spezifiziert pathogenfrei

ST Serotyp

Std. Stunde

Tab. Tabelle

T3SS Typ 3 Sekretionssystem

u.a. unter anderem

vgl. vergleiche

wt Wildtyp

YadA Yersinia Adhäsin A

Y. enterocolitica Yersinia enterocolitica

YeO:3 Yersinia enterocolitica Serotyp O:3

YeO:8 Yersinia enterocolitica Serotyp O:8

YmoA engl.: Yersinia modulator A

Yops engl.: Yersinia outer proteins

Y. pseudotuberculosis Yersinia pseudotuberculosis

Yst engl.: Yersinia stable toxin

z.B. zum Beispiel

z.T. zum Teil

Einleitung

11

A Einleitung

A.1 Einleitung und Zielsetzung

Yersinien gehören in Europa zu den häufigsten bakteriellen Erregern von

gastrointestinalen Infekten beim Menschen (Epidemiologisches Bulletin des Robert

Koch Instituts (RKI), 2012; ECDC-Annual epidemiological report, 2011; European

Food Safety Authority (EFSA) Journal, 2011). Die in erster Linie durch Yersinia (Y.)

enterocolitica verursachte Yersiniose ist eine durch Lebensmittel übertragene

Zoonose und zeichnet sich klinisch durch Diarrhoe, krampfhafte Bauchschmerzen

(Pseudoappendizitis), Fieber und Erbrechen aus. Besonders häufig betroffen sind

Kleinkinder (Wehebrink et al., 2008; ECDC-Annual epidemiological report, 2011).

Selten kommt es zu einer Sepsis oder zu ernsten Spätfolgen, wie reaktiver Arthritis

oder Erythema nodosum (Bottone, 1997; Bottone, 1999). Das Schwein gilt als

Reservoirwirt und rohes Schweinefleisch als eine der Hauptinfektionsquellen

(Fredriksson-Ahomaa et al., 2006a). Y. enterocolitica konnte in mehreren Studien

aus Proben von klinisch unauffälligen Mastschweinen isoliert werden (von Altrock et

al., 2010; von Altrock et al., 2006; Gürtler et al., 2005). Weitere Untersuchungen

zeigten eine serologische Prävalenz von bis zu 66,8 % in Mastbeständen (von

Altrock et al., 2006). In Infektionsversuchen im Schwein konnte gezeigt werden, dass

der Erreger in der Lage ist, die Tonsillen und den Darmtrakt zu kolonisieren, ohne

eine klinisch apparente Erkrankung auszulösen (Schiemann, 1988; Thibodeau et al.,

1999; Nielsen et al., 1996). Sowohl in Schweinebeständen als auch in humanen

Patienten kommt in Europa und Japan hauptsächlich der Bioserotyp 4/O:3 vor

(Wehebrink et al., 2008; Gürtler et al., 2005; Thibodeau et al., 1999; Fukushima et

al., 1983). Die meisten Studien in den letzten Jahren wurden allerdings mit Stämmen

des Bioserotyps 1B/O:8 (YeO:8) durchgeführt. Dieser zeigt sich in Mäusen sehr viel

virulenter als Serotyp O:3 (YeO:3) (Schiemann, 1988; Robins-Browne und Prpic,

1985) und war bis vor einigen Jahren in Nordamerika endemisch, wird dort aber

zunehmend von YeO:3 verdrängt (Schiemann, 1988; Epidemiologisches Bulletin des

Robert Koch Instituts (RKI), 2012; Bottone, 1999).

Die beiden Serotypen YeO:3 und YeO:8 unterscheiden sich u.a. durch ihre

unterschiedliche Expression des Virulenzfaktors Invasin und dessen Regulation

durch den Transkriptionsfaktor RovA. Invasin, ein Oberflächenprotein, ermöglicht den

Yersinien das Eindringen in die Darmwand durch direkte Bindung an die β1-Integrine

Einleitung

12

antigenpräsentierender M-Zellen (Grützkau et al., 1990; Clark et al., 1998). Die invA-

Expression wird durch RovA temperaturabhängig aktiviert und reguliert (Herbst et al.,

2009; Uliczka et al., 2011). Da Y. enterocolitica auch in der Umwelt vorkommt und

sich als psychrotrophes Bakterium bei Temperaturen zwischen 0°C und 43°C

vermehren kann (Wehebrink et al., 2008), stellt die Temperaturänderung im

Wirtsorganismus auf 37°C wahrscheinlich einen auslösenden Stimulus für die

Aktivierung bestimmter Virulenzgene dar.

Zum Serotyp O:3 gehörende Stämme weisen im RovA-Gen eine Punktmutation auf,

die den Austausch einer Aminosäure im Protein bedingt (Prolin wird durch Serin

ersetzt). Dies führt zu einer größeren Stabilität des RovAO:3 (RovAS98) bei höheren

Temperaturen (37°C). RovAO:3 ist weniger empfänglich für den Abbau durch ATP-

abhängige Proteasen und weist eine verbesserte DNA-Bindung auf als RovAO:8

(RovAP98) (Herbst et al., 2009; Uliczka et al., 2011). Außerdem befindet sich bei

Serotyp O:3 ein Insertionselement in der invA-Promotorregion (PinvAIS1667). Dieses

beinhaltet einen zusätzlichen Promotor und führt somit zu einer erhöhten invA-

Expression. Der Serotyp O:8 verfügt nicht über ein solches Insertionselement.

Beides führt zu einer vermehrten invA-Exprimierung in YeO:3 verglichen mit YeO:8

(Uliczka et al., 2011). Diese Vorteile könnten ursächlich für das häufigere

Vorkommen von Bioserotyp 4/O:3 in Schweinebeständen und auch in humanen

Patienten sein.

Die Mechanismen, die zu einer symptomlosen Kolonisation des Schweins führen,

sind noch unbekannt. Infektionsversuche mit Yersinia enterocolitica in Schweinen

wurden zwar bereits durchgeführt (Fukushima et al., 1984; Robins-Browne et al.,

1985; Schiemann, 1988; Thibodeau et al., 1999; Nielsen et al., 1996), allerdings

stammen Veröffentlichungen hierzu größtenteils aus den 1980er Jahren und sind nur

schwer miteinander vergleichbar. Ein einheitliches Infektionsmodell existiert bisher

nicht. Auch vergleichende Untersuchungen zu den beiden Serotypen O:3 und O:8

wurden im Schwein bislang nicht durchgeführt.

Vor diesem Hintergrund war es das erste Ziel der vorliegenden Arbeit, ein

Infektionsmodell für Y. enterocolitica im Schwein zu etablieren. Minipigs wurden

aufgrund ihrer Vorteile in Bezug auf Unterbringung und Handhabung ausgewählt.

Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurden experimentelle Infektionen mit den Serotypen

O:3 und O:8 durchgeführt. In diesen Studien sollte untersucht werden, inwieweit die

eingesetzten Stämme in der Lage sind, das Schwein als Wirt zu kolonisieren bzw. zu

Einleitung

13

infizieren und ob sich hier Unterschiede in der Virulenz zeigen, wie sie zuvor bereits

im Mausmodell beobachtet wurden.

Anschließend wurden im dritten Abschnitt die Effekte der vermehrten Invasin-

Expression in Serotyp O:3 durch Koinfektionsversuche im Minipig untersucht.

Eingesetzt wurden verschiedene Mutanten des Serotyp O:3 Stamms Y1, die eine

stufenweise verringerte Invasinbildung zeigten. Die Mutagenese „transformiert“ quasi

den Serotyp O:3 bezüglich der Invasin-Expression in den Serotyp O:8. So wurden

eine RovA-Stabilitätsmutante (YeO:3RovAP98), die das weniger stabile RovA des

YeO:8 (RovAP98) aufwies und eine PinvAΔIS1667-Mutante, der das Insertionselement

im Promotorbereich des invA-Gens fehlte, untersucht. Schließlich wurde eine

Invasin-Knockout-Mutante (ΔinvA) eingesetzt, die kein Invasin exprimierte, um zu

untersuchen, wie wichtig dieser Virulenzfaktor für eine Infektion des Schweins durch

Y. enterocolitica ist.

Abschließend wurden die Ergebnisse der Infektionsversuche im Minipigmodell mit

denen des Mausmodells verglichen.

Die Ergebnisse dieser Arbeit sollen dazu beitragen, durch Untersuchungen im

natürlichen Wirtsorganismus Erkenntnisse zu den Anpassungsmechanismen

enteropathogener Yersinien an ihre Wirtshabitate gewinnen zu können.

A.2 Literaturübersicht

A.2.1 Allgemeine Eigenschaften von Yersinia enterocolitica

Yersinia (Y.) enterocolitica ist ein gramnegatives, kokkoides bis pleomorphes

Stäbchenbakterium. Die Gattung Yersinia gehört zur Familie der Enterobacteriaceae.

Bisher wurden 15 Spezies beschrieben, von denen drei als humanpathogene Erreger

von Bedeutung sind: Y. pestis, der Erreger der Pest, und die beiden

enteropathogenen Arten Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis. Yersinien

wachsen fakultativ anaerob und können sich als psychrophile Bakterien bei

Temperaturen von 4– 42°C vermehren. Diese Eigenschaft wird in der

bakteriologischen Diagnostik mit der „Kälteanreicherung“ genutzt. Die optimale

Kultivierungstemperatur liegt bei 30°C. Y. enterocolitica ist Oxidase- und Laktose-

negativ, Katalase-positiv und bildet weder eine Kapsel noch Sporen (Grötzbach,

2007; Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 1994). Bei Temperaturen um

Einleitung

14

25°C ist Y. enterocolitica peritrich begeißelt und beweglich, bei 37°C weist das

Bakterium keine Begeißelung und somit auch keine Beweglichkeit mehr auf (Bottone,

1977). Y. enterocolitica wird in zwei Subspezies, Y. enterocolitica ssp. palearctica

und Y. enterocolitica ssp. enterocolitica, unterteilt (Neubauer et al., 2000). Zudem

lassen sich biochemisch sechs Biotypen (Biotyp 1A, 1B, 2- 5) und serologisch 28

Serotypen (nach Oberflächenantigenen) unterscheiden. Die als hoch virulent

geltende Y. enterocolitica ssp. enterocolitica umfasst den Biotyp 1B, Y. enterocolitica

ssp. palearctica die als weniger virulent angesehenen Biotypen 1A und 2-5 (Batzilla

et al., 2011a; Neubauer et al., 2000). Die Einteilung in Bio- und Serovare ist neben

molekularbiologischen Methoden diagnostisch von großer Bedeutung, um pathogene

Bioserotypen von apathogenen Umweltisolaten zu unterscheiden (Neubauer et al.,

2001).

A.2.2 Yersinia enterocolitica: Epidemiologie und zoonotische Bedeutung

Verbreitung

Y. enterocolitica gilt als ein wichtiger durch Lebenmittel übertragbarer

Krankheitserreger und hauptsächlicher Verursacher der Yersiniose. Durch Y.

pseudotuberculosis verursachte Fälle treten nur selten auf (European Food Safety

Authority (EFSA) Journal, 2011). In Deutschland besteht seit 2001 eine Meldepflicht

für humane Yersiniosefälle. Das Robert-Koch-Institut (RKI) registrierte im Jahr 2011

in Deutschland 3.397 gemeldete Erkrankungen (Epidemiologisches Bulletin des

Robert Koch Instituts (RKI), 2012), in der Europäischen Union wurden im Jahr 2009

laut European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) 7.686 Fälle erfasst

(ECDC-Annual epidemiological report, 2011). Weltweit am häufigsten werden

Erkrankungen beim Menschen durch Bioserotyp 4/O3 verursacht (Wehebrink et al.,

2008; Bottone, 1999; European Food Safety Authority (EFSA) Journal, 2011). In

Deutschland verursacht Serotyp O:3 annähernd 90 % aller gemeldeten humanen

Yersiniosefälle (Rosner et al., 2010), auch in Japan, Australien, Südafrika, Kanada

und den USA kommt Serotyp O:3 vor (Bottone, 1999) und scheint in Nordamerika

den zuvor dort endemischen Serotyp O:8 zu verdrängen (Schiemann, 1988; Lee et

al., 1990; Tauxe, 2002; Bottone, 1999). Seltener kommen Isolate der ebenfalls

humanpathogenen Bioserotypen 1B/O:8, 2/O:5,27, 2/O:9 und 3/O:3 vor (Fredriksson-

Einleitung

15

Ahomaa et al., 2006a). Biotyp 1A gilt als apathogen, wobei eine fakultative

Pathogenität diskutiert wird (Batzilla et al., 2011b; Bottone, 1999).

Das Schwein als Reservoirwirt

Schweine, insbesondere Mastschweine, gelten als Reservoir für humanpathogene

Yersinien (Bottone, 1999; Fredriksson-Ahomaa et al., 2006a). In zahlreichen Studien

konnte Y. enterocolitica aus Proben von klinisch gesunden Schweinen isoliert

werden (Fukushima et al., 1983). Die serologische Prävalenz in Mastschweinen lag

bei bis zu 66,8 % (von Altrock et al., 2006). Kulturell konnten Yersinien mit ähnlich

hoher Prävalenz aus Tonsillen von Schlachtschweinen isoliert werden, aus Faeces

waren die Nachweisraten allerdings geringer (Thibodeau et al., 1999; Fredriksson-

Ahomaa et al., 2001a; Gürtler et al., 2005; von Altrock et al., 2006). Dabei wurden

z.T. große Unterschiede zwischen den Prävalenzen innerhalb der einzelnen Betriebe

festgestellt (Fukushima et al., 1983; Gürtler et al., 2005). In epidemiologischen

Untersuchungen, die mittels PCR durchgeführt wurden, war die Nachweisrate

oftmals höher als in Studien mit rein kulturellen Nachweismethoden (Johannessen et

al., 2000; Fredriksson-Ahomaa und Korkeala, 2003; Bhaduri et al., 2005). Die von

Schweinen gewonnenen Isolate gehörten fast ausschließlich zu Bioserotyp 4/O:3

(Gürtler et al., 2005; Thibodeau et al., 1999; Fukushima et al., 1983; Pilon et al.,

2000; von Altrock et al., 2010), der auch bei humanen Yersiniosepatienten dominiert.

Mit kulturell-biochemischen (Fukushima et al., 1983; Lee et al., 1990) und

molekularbiologischen (Andersen und Saunders, 1990; Fredriksson-Ahomaa et al.,

2001b; Wojciech et al., 2004) Methoden konnte eine große Übereinstimmung

zwischen Y. enterocolitica Stämmen aus Proben humanen und porzinen Ursprungs

festgestellt werden. Auch für pathogene Yersinien typische Virulenzfaktoren konnten

in Isolaten aus Schweinebeständen nachgewiesen werden (Korte et al., 2004;

Gürtler et al., 2005).

Innerhalb der Schweinebestände ist eine fäkal-orale Übertragung und Verbreitung

der Yersinien durch Zukauf von Absetzferkeln von verschiedenen Ferkelerzeugern

oder über Transportfahrzeuge anzunehmen (Fukushima et al., 1983; Skjerve et al.,

1998; Thibodeau et al., 1999). Während von Mastschweinen sehr frequent

Y. enterocolitica -Stämme isoliert werden konnten, gelang der Nachweis in Proben

von neugeborenen Ferkeln und Sauen nur selten oder z.T. überhaupt nicht (Korte et

al., 2004; Gürtler et al., 2005). Korte et al. (2004) diskutieren eine Rolle der Sau als

Einleitung

16

Quelle für Saugferkelinfektionen. Nach experimenteller Infektion von tragenden

Sauen mit Y. enterocolitica konnte der Erreger aus dem Organmaterial totgeborener

Ferkel und der Plazenta isoliert werden (Platt-Samoraj et al., 2009a). Gürtler et al.

(2005) zeigten außerdem eine Persistenz von Y. enterocolitica in den Tonsillen von

Mastschweinen. In Untersuchungen von Umweltproben aus Schweinebeständen

(Futter, Oberflächen, Staub, Fliegen) konnten keine Yersinien nachgewiesen werden

(Gürtler et al., 2005), was für eine direkte Übertragung von Tier zu Tier spricht.

Infektionsquellen für den Menschen

Die psychrophile Eigenschaft von Y. enterocolitica führt zu einer großen Bedeutung

des Erregers in der Lebensmittelsicherheit, da eine Vermehrung auch unter

Kühlbedingungen (ca. 4°C) möglich ist. Für eine wichtige Rolle des Schweins als

Überträger von pathogenen Yersinien auf den Menschen spricht die hohe

Nachweisrate von Y. enterocolitica in rohem Schweinefleisch und

Schweinefleischprodukten (Fredriksson-Ahomaa et al., 2004). Besonders häufig

konnte das Bakterium aus Zunge und Innereien isoliert werden, aber auch aus Hack-

und anderen Fleischproben. Fredriksson-Ahomaa et al. wiesen yadA-positive

Yersinien in Proben von Tonsillen, Leber, Herz und Nieren von Schlachtschweinen

nach (Fredriksson-Ahomaa et al., 2000b; Fredriksson-Ahomaa et al., 2000a). In einer

Fallkontrollstudie konnten ail-positive Stämme in 10 % der untersuchten rohen

Schweinefleischproben (Lende, Filet, Kotelett, Schinken, Hackfleisch) nachgewiesen

werden (Thisted Lambertz S. und Danielsson-Tham, 2005). Fredriksson-Ahomaa et

al. (2001a) konnten zeigen, dass es durch den Umgang mit dem Geschlinge

während des Schlachtprozesses zu einer Kontamination von Zunge, Lunge, Herz,

Leber und ggf. auch Nieren kommt, da Zunge und Tonsillen mit den anderen

Organen zusammen an Haken aufgehängt oder auf Förderbänder gelegt werden.

Tauxe et al. (1987) vermuteten die Ursache für eine z.T. hohe Kontamination von

Hackfleisch mit Y. enterocolitica in einer regional üblichen Verwertung von

Kopffleisch und Tonsillen. In Fallkontrollstudien stellte sich der Verzehr von rohem

Schweinefleisch als größter Risikofaktor für die Erkrankung an Yersiniose heraus

(Tauxe et al., 1987; Ostroff et al., 1994).

Außer rohem Schweinefleisch spielt in einigen Ländern auch unbehandeltes Trink-

oder Oberflächenwasser eine Rolle als mögliche Infektionsquelle (Ostroff et al.,

1994; Sandery et al., 1996; Falcao et al., 2004). Der enge Kontakt zu Haustieren, wie

Einleitung

17

Hunden und Katzen, kommt vor allem für Kleinkinder als eine weitere Infektionquelle

infrage. Fredriksson-Ahomaa et al. (2001c) konnten zeigen, dass sowohl für Hunde

als auch für Katzen eine Infektion über die Fütterung mit rohem Schweinefleisch und

Schlachtnebenprodukten vom Schwein möglich ist und diese Tierarten die Yersinien

über einen längeren Zeitraum mit dem Kot ausscheiden.

A.2.3 Yersiniose bei Menschen und Tieren: Klinische Symptome

Die humane Yersiniose zeigt sich klinisch in einer Gastroenteritis mit Diarrhoe. Sie

tritt besondes häufig bei Kleinkindern auf und kann bei diesen auch zu einer

hämorrhagischen Diarrhoe führen. In älteren Kindern und Jugendlichen tritt oft eine

Ileitis und akute mesenterische Lymphadenitis mit krampfartigen Schmerzen

(Pseudoappendizitis) auf, die nicht selten zu einer ineffektiven Appendektomie führt.

In Verbindung mit prädisponierenden Faktoren, wie Immundefizienz oder

Eisenüberladung, wurden auch Fälle von Sepsis durch Y. enterocolitica beschrieben.

Eine Yersiniose kann außerdem immunogene Spätfolgen, wie reaktive Arthritis,

Erythema nodosum, Myocarditis und Glomerulonephritis, nach sich ziehen (Bottone,

1999). Die Primärerkrankung selbst verläuft allerdings häufig als eine milde,

selbstlimitierende Diarrhoe (Tauxe et al., 1987). Serologische Untersuchungen bei

gesunden Blutspendern in Finnland und Deutschland zeigten eine hohe Prävalenz

von Serotyp O:3 bzw. O:9 spezifischen Antikörpern, was auf ein häufiges

Vorkommen von subklinischen Infektionen hinweist (Mäki-Ikola et al., 1997).

Beim Schwein treten klinisch manifeste Erkrankungen nur bei Jungtieren auf, ältere

Tiere sind symptomlose Träger (Neubauer et al., 2001). In einem Fallbericht wurde

eine durch Y. enterocolitica Serotyp O:3 verursachte, letal verlaufende Infektion in

einem Minipig-Ferkel geschildert, die mit hochgradiger Enteritis und Septikämie

einherging (Brügmann et al., 2001). Dieser Fall scheint allerdings eine seltene

Ausnahme zu bilden. Auch in einigen Infektionsversuchen im Schwein konnte unter

besonderen Bedingungen eine klinisch manifeste Erkrankung der Tiere beobachtet

werden [vgl. 2.8 Infektionsversuche im Schwein].

Experimentelle Infektionen in Mäusen werden unter A.2.7 beschrieben.

Hunde und Katzen gelten wie das Schwein als asymptomatische Träger von

Y. enterocolitica (Fenwick et al., 1994; Fredriksson-Ahomaa et al., 2001c), allerdings

Einleitung

18

gab es bisher nur wenige Studien zum Vorkommen humanpathogener Yersinien in

Haustieren und einer möglichen Übertragung auf den Menschen.

A.2.4 Virulenzfaktoren enteropathogener Yersinien

Y. enterocolitica kolonisiert nach erfolgter oraler Aufnahme den Dünndarm,

überwindet die Darmbarriere über M-Zellen und vermehrt sich anschließend im

darunterliegenden lymphatischen Gewebe, den Peyerschen Platten (Pujol und

Bliska, 2005). Über den Lymphfluss oder Blutgefäße gelangen die Yersinien

anschließend auch in die regionalen Lymphknoten und können so eine akute

Lymphadenitis verursachen (Bottone, 1999).

Alle bisher als pathogen eingestuften Y. enterocolitica Stämme besitzen nur ein

Virulenzplasmid. Dieses 70 kb große Virulenzplasmid (pYV) codiert für ein Typ-III-

Sekretionssystem (T3SS) und verschiedene Effektorproteine, die sogenannten Yops

(engl.: Yersinia outer proteins): YopH, YopM, YopE, YpkA/YopO und YopJ/P. YopT

konnte bisher ausschließlich in Y. enterocolitica nachgewiesen werden. Die

Effektorproteine werden mithilfe des T3SS über eine nadelähnliche Struktur in die

Wirtszelle sezerniert. Sie ermöglichen es dem Bakterium, der angeborenen

Immunantwort des Wirtsorganismus zu entgehen. YopH ist eine Tyrosinphosphatase

mit antiphagozytischer Wirkung (Viboud und Bliska, 2005). YopE, ein GTPase-

aktivierendes Protein, wirkt zytotoxisch (Rosqvist et al., 1994) und konnte im

Mausmodell als wichtiger Virulenzfaktor ermittelt werden (Black und Bliska, 2000).

YopM, ein Gerüstprotein, ist im Mausmodell ebenfalls wichtig für die Virulenz des

Erregers (Mulder et al., 1989; Navarro et al., 2005). YopT ist eine Cysteinprotease

mit antizytotoxischer Wirkung (Trosky et al., 2008), YpkA/YopO verhindert als

multifunktionelles Protein u.a. die Phagozytose des Bakteriums und wird ebenfalls für

einen virulenten Phänotyp in der Maus benötigt (Grosdent et al., 2002; Navarro et al.,

2005; Wiley et al., 2006; Trasak et al., 2007). YopJ, eine Serin-

Threoninacetyltransferase, blockiert die Zytokinproduktion durch Hemmung von

Signalwegen in infizierten Zellen und fördert dadurch die Apoptose der Wirtszelle

(Palmer et al., 1998). YopB stellt kein eigentliches Effektorprotein dar, sondern wird

als Bestandteil der Pore für die Translokation der Yops benötigt (Tardy et al., 1999).

Außer den Genen für das T3SS und die Effektorproteine befinden sich auf dem pYV

auch die Gene für yadA (Yersinia Adhäsin A) und virF, einen Transkriptionsfaktor,

Einleitung

19

der das Virulenz-Regulon aktiviert. YadA vermittelt außer seiner adhäsiven Funktion

auch die Fähigkeit der pathogenen (Virulenzplasmid tragenden) Yersinien zur

Autoagglutination (Laird und Cavanaugh, 1980; Roggenkamp et al., 1996) und

besitzt protektive Eigenschaften gegenüber dem Komplementsystem des

Wirtsorganismus (Schindler et al., 2012). Das Virulenzplasmid vermittelt die Fähigkeit

der pathogenen Yersinien, zu denen die Biotypen 1B, 2, 3, 4 und 5 gerechnet

werden, in lymphatischem Gewebe zu überleben und sich zu vermehren (Tennant et

al., 2003). In Studien mit verschiedenen Serotypen konnte gezeigt werden, dass

pathogene Y. enterocolitica Stämme das Virulenzplasmid auch unter

Kultivierungsbedingungen mit sehr hohem Salzgehalt oder niedrigem pH, wie sie zur

Konservierung von Lebensmitteln eingesetzt werden, nicht verlieren (Bhaduri, 2011).

Das Vorhandensein des Virulenzplasmids allein genügt allerdings nicht für die

vollständige Ausprägung eines virulenten Phänotyps (Heesemann et al., 1984).

Chromosomal codierte Virulenzfaktoren sind außerdem Invasin (invA), Ail (engl.:

attachment and invasion locus), Myf (engl.: mucoid yersinia factor) und das

hitzestabile Enterotoxin Yst (engl.: Yersinia stable toxin). Ail ist ein

membranassoziiertes Protein, das unabhängig von Invasin die Aufnahme der

Bakterien in die Wirtszellen vermittelt (Miller und Falkow, 1988). Außerdem

begünstigt Ail ebenso wie YadA eine Serumresistenz der Yersinien. Das Myf-Antigen

ist ein fimbrienähnliches Oberflächenprotein und putatives Adhäsin (Iriarte et al.,

1993). Das hitzestabile Enterotoxin (Yst) der Yersinien weist Ähnlichkeit mit dem bei

enterotoxischen Escherichia coli vorkommenden Enterotoxin auf, weshalb davon

ausgegangen wird, dass es für das Auftreten von Diarrhoe im Rahmen einer

Yersiniose verantwortlich ist (Takao et al., 1985).

Es wurde mehrfach eine Korrelation zwischen den Bioserotypen und dem

Vorkommen der verschiedenen Virulenzfaktoren nachgewiesen (Thoerner et al.,

2003; Falcao et al., 2004; Gürtler et al., 2005).

A.2.5 Bedeutung des Virulenzfaktors Invasin

Für das Anhaften an und die Invasion in Epithelzellen werden die beiden

chromosomal codierten Virulenzgene invasin (invA) und ail (engl.: attachment and

invasion locus) benötigt (Fredriksson-Ahomaa et al., 2006a). Auch yadA vermittelt

Einleitung

20

die Adhäsion an Epithelzellen, allerdings spielt es eine größere Rolle im späteren

Stadium der Infektion, z.B. für die Persistenz in Lymphfollikeln (Pepe et al., 1995).

Invasin wird bislang als wichtigster Faktor für die initiale Invasion der Bakterien in die

Darmepithelzellen und das darunterliegende Gewebe angesehen (Miller und Falkow,

1988). Es ist ein relativ großes Protein (92 kD) auf der Bakterienoberfläche, das

direkt an β1-Integrine der antigenpräsentierenden M-Zellen bindet und so die

Internalisierung der Bakterien in die Zellen vermittelt (Grützkau et al., 1990; Clark et

al., 1998).

Die invasin-Expression wird temperaturabhängig durch den Transkriptionsfaktor

RovA (engl.: regulator of virulence A) reguliert (Ellison et al., 2004; Heroven et al.,

2008; Quade et al., 2012). RovA, ein globaler Regulator, bindet direkt an den

Promotor des invA-Gens und aktiviert dadurch die Bildung von Invasin (Nagel et al.,

2001). RovA zeigt dabei eine antagonistische Wirkung gegenüber H-NS (engl.:

histone-like nucleoid structuring protein) und YmoA (engl.: Yersinia modulator A), die

die invA-Expression inhibieren (Heroven et al., 2004; Ellison und Miller, 2006). Bei

Temperaturen von 37°C ändert sich die Faltung des RovA-Proteins. Seine DNA-

Bindungskapazität verringert sich bei diesen Temperaturen und es wird leichter

angreifbar für die Spaltung durch ATP-abhängige Proteasen. Da die Expression von

rovA positiv autoreguliert ist, vermindert dies die Bildung von RovA in den Bakterien

erheblich (Herbst et al., 2009).

In Y. enterocolitica Serotyp O:3 (YeO:3) führt eine Punktmutation zum Austausch

einer Aminosäure im RovA-Protein (Prolin wird durch Serin ersetzt). Das RovA des

YeO:3 (RovAO:3 bzw. RovAS98) bleibt dadurch bei 37°C in seiner Proteinfaltung stabil,

weist eine verbesserte DNA-Bindung auf und ist weniger empfänglich für den Abbau

durch ATP-abhängige Proteasen als das RovA des Serotyps O:8 (RovAP98) (Herbst

et al., 2009; Uliczka et al., 2011).

Uliczka et al. (2011) konnten zeigen, dass ein weiterer Unterschied zwischen YeO:3

und YeO:8 im Vorhandensein eines Insertionselements im Promotorbereich des

invA-Gens (PinvAIS1667) bei Serotyp O:3 liegt. Dieses Insertionselement beinhaltet

einen zusätzlichen Promotor und erhöht dadurch die Expression des Virulenzgens

invA. Bei Serotyp O:8 fehlt ein solches Insertionselement. Die beiden beschriebenen

Unterschiede führen letztlich zu einer erhöhten Invasinbildung in YeO:3 verglichen

mit YeO:8.

Einleitung

21

A.2.6 Kultureller Nachweis pathogener Yersinien

Eine einheitliche Vorgabe zum kulturellen Nachweis von präsumptiv pathogenen

Y. enterocolitica in Lebens- und Futtermitteln findet sich in der Norm

DIN EN ISO 10273:2003-12.:

„In der Norm ist ein horizontales Verfahren zum Nachweis von präsumtiv pathogenen

Yersinia enterocolitica festgelegt. Der Nachweis wird in drei aufeinander folgenden

Schritten durchgeführt: Der Anreicherung in den selektiven flüssigen Medien PSB-

Bouillon und ITC-Bouillon folgt die Verbringung der gewonnenen Kulturen auf CIN-

Agar und SSDC-Agar zwecks Identifizierung. Nach 24- bzw. bei Bedarf 48-stündiger

Inkubation in Abhängigkeit vom Medium wird die Anwesenheit charakteristischer

Kolonien von Y. enterocolitica geprüft. Es folgen die biochemische Bestätigung sowie

die Prüfungen zur Biotypisierung, die Prüfung zur Feststellung der

Pathogenitätskriterien und falls erforderlich serologische Untersuchungen.“

Eine Evaluierung dieser Methode zeigte allerdings eine sehr geringe Sensitivität der

kulturellen Methode. Mit dieser gelang der Nachweis pathogener Yersinien in

Lebensmitteln erst ab einer Belastung von >104 KBE/g, während der Nachweis

mittels Real-Time PCR zum Nachweis des ail-Gens als geeignete Screening-

Methode beschrieben wurde (Fredriksson-Ahomaa et al., 2008).

Für den kulturellen Nachweis von Y. enterocolitica aus Proben mit geringem

Keimgehalt oder hoher Begleitflora eignet sich die Kälteanreicherung bei 4°C in PBS

für bis zu 21 Tage mit wöchentlichem Ausstrich auf Selektivnährböden. Die Anzucht

auf Nährböden erfolgt bei 28-30°C für bis zu 48 Std. Auf CIN-Agar (Yersinia-Agar

nach Schiemann) bildet Y. enterocolitica charakteristische, feine dunkelviolette

Kolonien, die von einem transparenten Hof umgeben sind (Bisping W. und Amtsberg

G., 1988). Das Vorhandensein des pYV geht mit bestimmten phänotypischen

Merkmalen einher, die in die diagnostische Untersuchung mit einbezogen werden

können. Zu diesen Merkmalen gehören die Autoagglutination (Laird und Cavanaugh,

1980; Aulisio et al., 1983), die Calciumabhängigkeit des Wachstums (Gemski et al.,

1980), die Kristallviolettbinding (Bhaduri et al., 1987) und die Kongorotbindung (Prpic

et al., 1983).

Einleitung

22

A.2.7 Infektionsversuche im Mausmodell

Schiemann et al. (1988) zeigten in experimentellen Infektionen im Mausmodell, dass

YeO:8 virulenter war als YeO:3, letzterer allerdings bis zu fünf Tage p.i. in hohem

Maße mit den Faeces ausgeschieden wird. Auch in anderen Studien wurde YeO:8 in

Mäusen als sehr virulent beschrieben (Robins-Browne und Prpic, 1985).

Y. enterocolitica Serotyp O:8 Stamm 8081v zeigte sich im Mausmodell wesentlich

weniger virulent, wenn das invasin-Gen ausgeschaltet wurde. Die LD50 allerdings

blieb bei der invA-Mutante und dem Wildtyp sowohl bei oraler als auch bei

intraperitonealer Infektion der Mäuse gleich (Pepe und Miller, 1993).

Y. enterocolitica Serotyp O:8-Mutanten, denen das rovA fehlt, zeigten sich im

Mausversuch insofern attenuiert als sie in geringerer Anzahl in Organen nachweisbar

waren und eine mildere Entzündung in den Peyerschen Platten auslösten als der

YeO:8 Wildtyp (Dube et al., 2003). Auch eine 70fach erhöhte LD50 im Vergleich mit

dem Wildtypstamm konnte gezeigt werden (Revell und Miller, 2000). Dube et al.

(2003) fanden allerdings heraus, dass sich diese Attenuierung in erster Linie nach

oraler Infektion der Mäuse zeigte, während die rovA-Mutante nach intraperitonealer

Infektion wesentlich virulenter erschien. Diese Beobachtung werteten sie als Hinweis

darauf, dass RovA eine wesentliche Rolle in den ersten Phasen der Infektion spielt.

Insgesamt zeigte sich die rovA-Mutante um ein vielfaches abgeschwächter, als eine

invA-Mutante, was darauf hindeutet, dass RovA außer invA noch weitere

Virulenzgene reguliert, die ebenfalls notwendig für eine Invasion der Bakterien in die

Peyerschen Platten oder tiefer liegende Gewebe sind (Ellison et al., 2004).

Uliczka et al. (2011) testeten Serotyp O:3-Mutanten im Mausmodell und konnten in

Infektionen mit jeweils einem Stamm pro Tiergruppe keine signifikanten Unterschiede

zwischen Wildtyp und Mutante feststellen. In Koinfektionsversuchen allerdings

konnten sie eine wesentlich größere Organbelastung mit einer RovAP98-Mutante

feststellen, die das weniger stabile RovA des YeO:8 exprimierte, als mit dem YeO:3

Wildtypstamm Y1. Im Kontrast dazu konnten Uliczka et al. (2011) auch zeigen, dass

eine PinvAΔIS1667-Mutante, der das Insertionselement im invA-Promotorbereich

fehlte, im Vergleich zum YeO:3 Wildtyp in wesentlich geringeren Mengen aus den

Peyerschen Platten und den mesenterialen Lymphknoten der infizierten Mäuse

reisoliert werden konnte.

Einleitung

23

A.2.8 Infektionsversuche im Schwein

Fukushima et al. (1984) fanden nach oraler experimenteller Infektion von

Mastschweinen verschiedenen Alters große Unterschiede zwischen den Individuen

bezüglich der Ausscheidung der Yersinien mit den Faeces. Die Ausscheidung nach

einer Infektion mit Bioserotyp 4/O:3 schien dabei unabhängig vom Alter der Tiere, für

eine Infektion mit Bioserotyp 2/O:5,27 erschienen jüngere Tiere anfälliger. Die

Infektionsdosis betrug 2,6x109 KBE und wurde per Katheter direkt in den Magen

appliziert. Nach einer Infektion mit gleichzeitiger Gabe von 100 ml einer 10 %igen

NaHCO3-Lösung konnte nachfolgend eine höhere Ausscheidung beobachtet werden.

In den Faeces konnten 102 bis 106 KBE/g über mehrere Wochen p.i. nachgewiesen

werden. Außerdem wurde eine horizontale Übertragung beobachtet.

Robins-Browne et al. (1985) untersuchten die Pathogenität von Y. enterocolitica

Bioserotyp 4/O:3 sowie verschiedener Mutanten in gnotobiotischen Ferkeln. Sie

beobachteten, dass eine klinische Manifestation in den Tieren mit intestinalen

Läsionen in Abhängigkeit von der Infektionsdosis auftrat: Nach oraler Infektion mit

2x109 KBE pro Tier war der Verlauf subklinisch bis mild, während alle

gnotobiotischen Ferkel, die 4x1010 KBE erhielten, innerhalb von 24 Stunden

verendeten. Pathologisch-anatomisch sowie histologisch konnten in den Organen

der Tiere leicht geschwollene mesenteriale Lymphknoten, Nekrosen in der Lamina

propria (L. propria), bakterielle Mikrokolonien, Entzündungszellen und Ulzera an den

Zottenspitzen sowie Zottenverlust festgestellt werden. Dabei war das Ileum stärker

betroffen als Jejunum und Dickdarm. Elektronenmikroskopisch konnten Bakterien im

Zytoplasma von Phagozyten beobachtet werden. Bioserotyp 1/O:5 hingegen zeigte

keine Invasion in die Darmwand oder extraintestinale Organe. Es konnten keine

Auswirkungen des Enterotoxins und kein entsprechendes Toxin im Darm

nachgewiesen werden. Mutanten, denen das Virulenzplasmid fehlte, lösten keine

klinischen Symptome in den infizierten Tieren aus, waren jedoch aus dem Gewebe

isolierbar.

Schiemann (1988) verglich in per Kaiserschnitt entbundenen Ferkeln ohne

Kolostrumgabe und natürlich geborenen Ferkeln die Infektion mit Y. enterocolitica

Serotyp O:8, O:21, O:3 und O:13, wobei Serotyp O:3 nicht in natürlich geborenen

Ferkeln untersucht wurde. Letztere schieden die Bakterien in geringeren Mengen

aus, auch die Organbelastung war bei diesen Tieren geringer. Er schlussfolgerte,

Einleitung

24

dass sich die Infektion bei Ferkeln normalerweise auf Rachen und Darmtrakt

beschränkte. Eine klinisch manifeste Erkrankung konnte in den natürlich geborenen

Ferkeln mit Zugang zu Kolostrum nicht beobachtet werden, obwohl diese mit einer

sehr hohen Infektionsdosis von 1013 KBE belastet wurden. Per Kaiserschnitt

entbundene Ferkel erhielten 1010 KBE und entwickelten nach erfolgter Infektion mit

den Serotypen O:13 und O:21 schwere Symptome oder verendeten. Auch bei

Serotyp O:8 zeigte sich eine schwerwiegende Erkrankung in einem von zwei per

Sektio entbundenen Ferkeln. In allen infizierten Tieren wurde eine bakterielle

Kolonisation der Tonsillen und Ausscheidung mit den Faeces nachgewiesen. Da sich

die natürlich geborenen Ferkel wesentlich weniger anfällig zeigten und keines von

ihnen trotz der sehr hohen Infektionsdosis verendete oder schwere Symptome

zeigte, zog Schiemann den Schluss, dass Y. enterocolitica nicht sehr virulent für

Ferkel sei.

Thibodeau et al. (1999) infizierten fünf Wochen alte Hybridschweine mit ca. 108 KBE

YeO:3 und fanden anschließend keine klinischen Symptome in den infizierten Tieren

und pathologisch-anatomisch nur ggr. Läsionen im Magendarmtrakt.

Thibodeau et al. (2001) infizierten ebenfalls fünf Wochen alte Hybridschweine mit

einer „relativ geringen Infektionsdosis“ der Serotypen O:3, O:5,27 und O:9 und

konnten nachfolgend keine klinischen Symptome beobachten. Sie reisolierten die

Bakterien aus den Tonsillen und Faeces der Tiere, konnten sie allerdings nicht in den

Lnn. retropharyngei, den mesenterischen Lymphknoten, dem Ösophagus,

Duodenum, Jejunum, Ileum (PPs), Magen, sowie der Leber und Milz nachweisen.

Nielsen et al. (1996) infizierten SPF-Schweine über das Futter mit ca. 108 KBE

Y. enterocolitica Bioserovar 4/O:3. Sie konnten ebenfalls keine klinisch manifeste

Erkrankung der Tiere feststellen, fanden die Bakterien jedoch vom fünften bis zum

21. Tag p.i. in den Faeces.

Platt-Samoraj et al. (2009a) infizierten tragende Sauen auf oralem Weg in

verschiedenen Trächtigkeitsstadien mit ca. 2,7x109 KBE eines Y. enterocolitica

Serotyp O:3 Stamms, der zuvor aus Tonsillen eines abortierten Schweinefetus

isoliert worden war. Auch die Sauen zeigten keine Klinik bis auf die spät infizierten

(Tag 89 dp) Tiere, die eitrigen Vaginalausfluss aufwiesen. Die Sauen zeigten einen

unauffälligen Trächtigkeitsverlauf ohne Aborte, allerdings gelang der Nachweis der

Yersinien in Rektal-, Oral-, Vaginal- und Halstupfern und zudem in Placentaproben

und Organen von totgeborenen Ferkeln. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass

Einleitung

25

nach einer Infektion im letzten Drittel der Trächtigkeit eine intrauterine Übertragung

auf die Ferkel möglich sei.

Experimentelle Infektionen mit Y. enterocolitica in Minipigs wurden bisher nicht

beschrieben. Auch ein orales Infektionsmodell in Hybridschweinen, das für

Folgestudien eingesetzt wurde, ist bislang nicht publiziert worden.

Material und Methoden

26

B Material und Methoden

B.1 Bakterienstämme, Kultivierung und Differenzierung

B.1.1 Verwendete Yersinia enterocolitica-Stämme

Für die experimentellen Infektionen wurden zwei verschiedene Wildtypstämme von

Yersinia (Y.) enterocolitica eingesetzt. Der Stamm Y1 gehört zum Bioserotyp 4/O:3

(YeO:3) und stammt von einem humanen Patienten. Stamm 8081v gehört zum

Bioserotyp 1B/O:8 (YeO:8) und ist ebenfalls ein Patientenisolat aus der

Humanmedizin. In den Koinfektionsversuchen [vgl. C.3.2] wurde zudem der Stamm

YE13 eingesetzt. Dieser verhält sich wie Stamm Y1, besitzt aber eine Kanamycin-

resistenzkassette, die es ermöglicht, ihn von der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 zu

unterscheiden. Die drei in den Koinfektionsversuchen eingesetzten Mutanten

stammen ebenfalls vom YeO:3 Stamm Y1. In der RovA-Stabilitätsmutante YE14 wird

das bei 37°C weniger stabile RovA des YeO:8 exprimiert (RovAP98, RovAYeO:8); bei

diesem ist die Aminosäure Serin des RovA-Proteins an der Position 98 durch Prolin

ersetzt. Bei der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 fehlt das Insertionselement im invA-

Promotorbereich. Das IS1667 ist bei YeO:3 vorhanden und führt zu einer verstärkten

invA-Expression, fehlt aber bei YeO:8. Der ∆invA-Mutante fehlt das invA-Gen,

dadurch wird Invasin A nicht exprimiert. Die Stämme YE13, YE14 und YE21 sind

kanamycinresistent (KnR) aufgrund einer chromosomal verankerten Kanamycin-

resistenzkassette, während die Stämme 8081v, Y1 und YE15 kanamycinsensibel

sind (Tab. 1). Die Stämme YE13, YE14, YE15 und YE21 wurden in der Arbeit von

Frank Uliczka, Ph.D. konstruiert (Uliczka et al., 2011). Der Serotyp O:8 Stamm 8081v

wurde von Pepe und Miller (1993) beschrieben. Alle eingesetzten Bakterienstämme

sind in Tabelle 1 aufgelistet. Die Yersinienstämme wurden freundlicherweise von

Prof. Dr. Petra Dersch (Arbeitsgruppe Molekulare Infektionsbiologie, Helmholtz-

Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig) und Dr. Eckhard Strauch

(Bundesinstitut für Risikobewertung) im Rahmen der Kooperation innerhalb des

BMBF-Forschungsverbunds Foo-Borne Zoonotic Infections of Humans (FBI-Zoo) zur

Verfügung gestellt.


27

Tab. 1: Verwendete Y. enterocolitica Stämme und deren Herkunft.

B.1.2 Herstellung der Bakteriensuspension für die orale Infektion

Die Yersinien wurden zunächst auf Blutagar mit 3 % Schafblut über Nacht

angezüchtet. Dann wurde eine Einzelkolonie in 50 ml LB-Medium in einen 4er-

Schikanekolben überimpft und über Nacht (für 13 bis 15 h) bei 25°C und 150 rpm in

einem Inkubations-Schüttler (CERTOMAT® IS, Sartorius Stedim Biotech, Sartorius)

inkubiert. Bei der Anzucht der Kanamycin-resistenten Stämme (YE13, YE14, YE21)

wurden dem LB-Medium 25 µg Kanamycin pro ml zugesetzt. Von den

Übernachtkulturen (ÜNK) wurden 30 ml Aliquots bei 4000 rpm und 4°C zentrifugiert,

der Überstand wurde verworfen und das Pellet in sterilem PBS aufgenommen. Der

Waschschritt in PBS wurde dreifach durchgeführt. Anschließend wurde die

Infektionssuspension mit sterilem PBS auf eine OD600 = 1,0 eingestellt (Eppendorf

Bio Photometer, Eppendorf AG). Diese Trübung entspricht einer Konzentration von

ca. 109 KBE/ml. Für die orale Infektion wurde die benötigte Menge pro Tier in 1 ml

sterilem PBS aufgenommen und jede Infektionsdosis bis zur Verwendung in einem

1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäß auf Eis gelagert. Die Reinheit der ÜNK und der

Verdünnung in PBS wurde mittels fraktionierten Ausstrichen auf Blut- und

Gassneragar kontrolliert. Die exakte Infektionsdosis wurde durch Verdünnungsreihen

der OD600 = 1,0 Lösung bestimmt. Hierzu wurden vier Verdünnungsstufen (10-4 bis

10-7) im Doppelansatz auf LB-Agar ausgestrichen (je 100µl), über Nacht bei 30°C

inkubiert und die KBE/100 µl gezählt.

Die Zusammensetzung bzw. Herstellung aller Medien, Nährböden und

Antibiotikazusätze ist im Anhang aufgeführt.


28

B.1.3 Quantitative Isolierung der Yersinien und Differenzierung durch Resistenzen

Die bei der Sektion entnommenen Organproben von Tonsillen, Jejunum, Ileum,

Caecum, Colon, Rectum (nur im Tierversuch zum Vergleich verschiedener

Infektionsdosen, vgl. C.1.1), mesenterialen Lymphknoten (Lnn. jejunales), Leber,

Milz und Niere wurden quantitativ auf die Belastung mit Y. enterocolitica untersucht.

Tonsillen und Darmabschnitte wurden zuvor mit sterilem PBS gespült und für 30 Min.

in Gentamicinlösung (50 µg/ml in PBS) inkubiert, um Bakterien auf der (luminalen)

Oberfläche abzutöten. Nach der Inkubation mit Gentamicin wurden die Tonsillen und

Darmabschnitte dreimal mit sterilem PBS gewaschen. Die Organstücke wurden

gewogen und ca. 1 g pro Organ wurde in 5 ml sterilem PBS homogenisiert (30000

rpm, 30 Sek., Polytron PT 2100 Homogenisator, Kinematica AG). Von vier

Verdünnungsstufen (100, 10-1, 10-2, 10-3) dieses Homogenisats wurden je 50 µl im

Doppelansatz auf CIN-Agar mit Carbenicillinzusatz (carb) ausplattiert, bei 30°C für

bis zu 48 Std. inkubiert und die Kolonien ausgezählt. Im Rahmen der

Koinfektionsversuche wurde je ein Doppelansatz jeder Verdünnungsstufe auf CIN-

Agar mit (CIN +carb +Kn) und ohne zusätzlichen Kanamycinzusatz (CIN +carb)

ausplattiert. In der statistischen Auswertung wurden nur Zählwerte ≥ 15 Kolonien pro

Platte berücksichtigt. Von jeder Agarplatte wurde eine typische Kolonie subkultiviert,

um den jeweiligen Y. enterocolitica -Stamm zu überprüfen [vgl. B.1.5].

B.1.4 Qualitative Isolierung der Yersinien mittels Kälteanreicherung

Rektal- und Tonsillentupfer, Kotproben und Organproben aus der Sektion wurden

mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht. Im Fall der Organproben

geschah dieses zusätzlich zur quantitativen Untersuchung, da die Kälteanreicherung

zwar nur eine rein qualitative Aussage zulässt, aber sensitiver ist als die Direktkultur

(Bisping W. und Amtsberg G., 1988). Tupfer, 1 g Kot bzw. 200 µl des Organ-

Homogenisats [s. B.1.3] wurden zu 9 ml sterilem PBS in Reagenzgläser gegeben

und für 21 Tage bei 4°C inkubiert. Jeweils nach sieben, vierzehn und einundzwanzig

Tagen wurden fraktionierte Ausstriche auf CIN-Agar untersucht. In

Koinfektionsversuchen wurden diese auf CIN-Agar mit und ohne Kanamycinzusatz

ausgestrichen. Von typisch aussehenden Kolonien wurden Subkulturen biochemisch

untersucht [s. B.1.5].


29

B.1.5 Biochemische Differenzierung der Isolate

Von den Kolonien, die auf CIN-Agar die für Y. enterocolitica charakteristische

Morphologie zeigten (dunkelviolette, kleine Kolonien mit hellem Randsaum, Ø 1 mm,

Nährboden um die Kolonien rosa verfärbt), wurden Subkulturen auf Blut- und

Gassneragar angelegt. Wenn auch diese morphologisch Y. enterocolitica

entsprachen (auf Blutagar feine, weißlich-undurchsichtige Kolonien, Ø 1 mm,

laktosenegativ auf Gassneragar) und ein Oxidasetest (Bactident® Oxidase, Merck

KGaA) negativ ausfiel, wurde eine weitere biochemische Differenzierung

durchgeführt. Folgende Reaktionen wurden hierbei überprüft: H2S-Bildung (Kligler-

Agar), Harnstoffabbau (Urease), Citratverwertung, Mannitspaltung, Ornithin-

decarboxylase (ODC), oxidativer und fermentativer Kohlenhydratabbau (O/F-Test)

und Indolbildung. Weitere biochemische Reaktionen wurden nach Bedarf

durchgeführt, um die Infektionsstämme von vor der Infektion von den Minipigs

isolierten Stämmen (Y. intermedia, Y. frederiksenii, Y. enterocolitica) zu

unterscheiden. Die ggf. zusätzlich getesteten Reaktionen waren Inositspaltung

(Säurebildung aus Myo-Inosit), Rhamnoseabbau und Äskulinspaltung. Die

biochemischen Reaktionen der eingesetzten Yersinienstämme sind in Tabelle 2

dargestellt. In den wenigen Fällen, in denen Yersinien bei der Einstallung aus

Kottupfern isoliert wurden, war es nie möglich, diese im weiteren Versuchsverlauf

erneut aus Proben der Tiere zu isolieren.

Tab. 2: Biochemische Reaktionen der eingesetzten Y. enterocolitica Stämme.


30

Von den aus Organproben gewonnenen Isolaten wurde zusätzlich pro Tier ein Isolat

mit dem API 20E®-Testsystem (bioMérieux Deutschland GmbH) untersucht.

B.2 Versuchstiere, experimentelle Infektionen und Versuchsdesign

Insgesamt wurden fünf Tierversuche mit 114 Minipigs durchgeführt. Die Ferkel waren

zwischen fünf und sieben Wochen alt (durchschnittliches Alter: 44 Tage). Es wurden

sowohl weibliche als auch kastrierte männliche Tiere für die Versuche eingesetzt

(65 ♂, 49 ♀). Die Aufteilung in Gruppen erfolgte randomisiert nach Geschlecht und

Alter.

Die Tierversuche erfolgten in Kooperation mit Frau Prof. Dr. Petra Dersch und Julia

Schaake, M. Sc. aus der Abteilung Molekulare Infektionsbiologie des Helmholtz-

Zentrums für Infektionsforschung (HZI) in Braunschweig.

B.2.1 Herkunft, Unterbringung und Versorgung der Versuchstiere

Die Mini-Lewe-Ferkel stammten vom Lehr- und Forschungsgut Ruthe der

Tierärztlichen Hochschule Hannover. Absetzferkel und Sauen wurden vor dem

ersten Tierversuch stichprobenartig auf das Vorhandensein von Yersinien

untersucht, alle Stichproben waren in der bakteriologischen Untersuchung negativ.

Die Antikörpertiter der eingestallten Ferkel in der serologischen Untersuchung lagen

unterhalb des „Cut-off“-Wertes und waren somit als negativ einzustufen.

Versuche, in denen ausschließlich Wildtypstämme untersucht wurden, fanden in den

Stallungen des Instituts für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

statt. Koinfektionsstudien mit gentechnisch veränderten Stämmen wurden in der

Isolierstation des Instituts für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

durchgeführt. Die Minipigs wurden in Gruppen von mindestens drei bis maximal zwölf

Ferkeln in Ställen von etwa 8 m2 (Institut für Mikrobiologie) bzw. 11 m2 (Isolierstation

des Instituts für Virologie) eingestallt. In ersterem wurde ein Teil des Stalls mit Stroh

eingestreut, in letzterem wurden im Liegebereich Gummimatten ausgelegt.

Rotlichtlampen ermöglichten es den Tieren, aktiv den für sie angenehmsten

Temperaturbereich zum Ruhen aufzusuchen. Diese wurden entfernt, wenn die Ferkel

nicht mehr darunter lagen. Die Tiere wurden innerhalb der ersten fünf Tage dreimal,

an den folgenden Tagen zweimal täglich gefüttert, sie erhielten je nach Alter und

Körpergewicht 200 bis 250 g/Tag eines kommerziellen Futters. Die Ration stellte sich


31

zu je 50 % aus Ferkelstartern (primo wean, deuka, Deutsche Tiernahrung Cremer

GmbH & Co. KG) und einem Spezialfutter für Minipigs (ssniff®MPigH, ssniff

Spezialdiäten GmbH) zusammen. Zusätzlich wurden zur Beschäftigung Heucobs

(pre alpin, Agrobs GmbH) und mit geringen Mengen pelletierten Futters gefüllte

Spielbälle angeboten.

Zweimal täglich wurden die Stalltemperatur und Luftfeuchte sowie das

Allgemeinbefinden der Tiere (Haltung, Verhalten, Futteraufnahme, Kotabsatz,

Körpertemperatur) kontrolliert und dokumentiert.

Die Haltung, Unterbringung und jede Behandlung der Tiere erfolgte gemäß den

Vorgaben des Tierschutzgesetzes (Genehmigung durch das Niedersächsische

Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Aktenzeichen 33.12-

42502-04-10/0173 und 33.9-42502-04-11/0462) und in Übereinstimmung mit den

Richtlinien des Europäischen Übereinkommens zum Schutz der für Versuche und

andere wissenschaftliche Zwecke verwendeten Wirbeltiere und den Empfehlungen

der GV-SOLAS.

B.2.2 Versuchsaufbau

Am Tag der Einstallung wurden von allen Tieren Tonsillen- und Rektaltupferproben

genommen, und die Tiere wurden in die zuvor festgelegten Gruppen unterteilt. Nach

siebentägiger Eingewöhnungszeit erfolgte die orale Infektion der Minipigs mit 109

KBE Y. enterocolitica pro Schwein. Nur im Tierversuch zum Vergleich verschiedener

Infektionsdosen (vgl. C.1.1) wurden Infektionsdosen von 108, 109 und 1010 KBE/Tier

eingesetzt. Nach der oralen Infektion wurden Rektaltupfer zweimal wöchentlich

bakteriologisch und Blutproben einmal wöchentlich hämatologisch und serologisch

untersucht. Am siebten bzw. 21. Tag p.i. wurden die Schweine euthanasiert, seziert

und sowohl Organ- als auch Kotproben für die bakteriologische Untersuchung

entnommen. Auch die pathologisch-anatomische Untersuchung und die Entnahme

von Organproben für die histopathologische Beurteilung wurden während der Sektion

durchgeführt. Die letzte Blutentnahme fand ebenfalls am Tag der Sektion der Tiere

statt (Abb. 1).


32

Abb. 1: Zeitlicher Ablauf des Versuchs. (Angegeben in Tagen vor (-) und nach der Infektion)

B.2.3 Orale Infektion der Minipigs

Die Infektionsdosen [vgl. B.1.2] wurden in 1 ml sterilem PBS suspendiert und in

Eppendorf-Reaktionsgefäßen auf Eis zu den Stallabteilen transportiert. Im

Stallbereich wurde jede Dosis einzeln resuspendiert, mit einer sterilen 2 ml-

Einmalspritze aufgezogen und den Tieren direkt in die Maulhöhle eingegeben. Eine

Person fixierte dabei das Tier, eine weitere öffnete und fixierte das Maul und eine

dritte Person applizierte die Bakteriensuspension, so dass die Infektion immer von

drei Personen durchgeführt wurde. Die Infektionen erfolgten immer morgens

unmittelbar vor der morgendlichen Fütterung. Die Kontrolltiere erhielten je 1 ml

steriles PBS („Pseudoinfektion“), das ihnen auf die gleiche Art eingegeben wurde.

B.2.4 Probenentnahme

Am Tag der Einstallung wurden von allen Tieren Rektal- und Tonsillentupfer

genommen. Hierzu wurden die Tiere fixiert. Für das Abtupfern der Tonsillen wurde

das Maul mit einem arretierbaren Maulgatter geöffnet und mit einem sterilen Tupfer

(UNI-TER AMIES CH, Meuss S.r.l.) fest über die Tonsillen gestrichen. Für

Rektaltupfer wurde der sterile Tupfer vorsichtig in den Anus eingeführt. Die Tupfer

wurden anschließend im mitgelieferten Amies-Medium mit Kohlezusatz ins Labor

transportiert. Rektaltupfer wurden nach der Infektion zweimal wöchentlich

genommen.

Für hämatologische und serologische Untersuchungen wurden den Minipigs einmal

wöchentlich EDTA- und Serumproben (EDTA-, Serum-Monovetten®, Sarstedt AG &

Co.) unter Verwendung steriler Einmalkanülen (18G 11/2'') entnommen. Dieses


33

geschah durch Punktion der Vena cava cranialis, für die die Tiere in Rückenlage

fixiert wurden. Es wurden maximal 5 ml Blut/kg Körpergewicht pro Woche

entnommen (entsprechend den Vorgaben der Tierärztlichen Vereinigung für

Tierschutz (TVT) e.V.). Die letzte Blutentnahme fand unmittelbar vor der Euthanasie

und Sektion der Tiere statt. Um unnötigen Stress für die Tiere zu vermeiden, wurden

sie bereits vor der Blutentnahme mit Ketamin (80 mg/kg KGW i.m.; Ursotamin®,

Serum-Werke-Bernburg AG) und Azaperon (16 mg/kg KGW i.m.; Stresnil®, Janssen-

Cilag GmbH) narkotisiert. Während des ersten Tierversuchs wurde initial eine Dosis

von 3 mg/kg KGW Azaperon und 25 mg/kg KGW Ketamin verabreicht. Diese führte

jedoch häufig nicht zu einer ausreichenden Narkosetiefe und zur Notwendigkeit von

Nachdosierungen. Aus diesem Grund wurde ab dem zweiten Tierversuch bereits

initial die oben erwähnte, hohe Dosierung mit sehr gutem Erfolg verwendet. Die

Blutentnahme erfolgte unter der Narkose durch eine Herzpunktion mit direkt

anschließender Euthanasie durch die intracardiale Applikation von Pentobarbital (120

mg/kg KGW, Release®, WDT eG).

Nach Eintritt des Todes wurden die Minipigs auf einen Sektionstisch verbracht und

Brust und Bauchhöhle eröffnet. Während der Sektion wurden von jedem Tier mit

sterilem Sektionsbesteck folgende Proben in eben dieser Reihenfolge entnommen:

Leber, Milz, Nieren, mesenteriale Lymphknoten (Lnn. jejunales), Jejunum, Ileum,

Caecum, Colon, Rectum (nur für den Vergleich verschiedener Infektionsdosen von

Y. enterocolitica Serotyp O:3), Kot aus dem Rectum und Tonsillen. Alle Organe

wurden während der Entnahme aus dem Tierkörper makroskopisch untersucht.

Durch die Reihenfolge der Probenentnahme von eher gering hin zu voraussichtlich

stark kontaminierten Organen sollte das Risiko einer Kontamination bei der

Entnahme minimiert werden. Die Proben wurden in fest verschlossenen, sauberen

Plastikgefäßen direkt nach der Entnahme ins Labor transportiert.

B.2.5 Pathologisch-anatomische Untersuchung

Vor der Sektion wurden die Körperoberfläche und die Körperöffnungen begutachtet.

Nach der Eröffnung der Brust- und Bauchhöhle wurden die Pleura, Lungen und Herz

untersucht. Dabei wurde auf Verklebungen insbesondere der Spitzenlappen geachtet

und der Herzbeutel eröffnet. Danach wurden das Peritoneum, Leber, Milz und Nieren

untersucht; die Organe wurden zu diesem Zweck aus der Bauchhöhle entnommen.


34

Es wurde darauf geachtet, ob die Nierenkapsel leicht abziehbar war, um Hinweise

auf entzündliche oder nekrotische Prozesse zu erhalten. Alle Organe wurden

während der Untersuchung angeschnitten, um die Schnittfläche beurteilen zu

können. Die mesenterialen Lymphknoten sowie die einzelnen Darmabschnitte

wurden zur Begutachtung aus der Bauchhöhle heraus gelagert und palpiert, jedoch

nicht zusätzlich zur Entnahme der nötigen Proben longitudinal eröffnet.

B.2.6 Histopathologische Untersuchung

Für die histologische Untersuchung wurden Organproben von Leber, Milz, Ileum und

mesenterialen Lymphknoten sofort nach der Entnahme für mindestens 24 Std. in

10 %igem, nicht-gepuffertem Formalin fixiert und für die histopathologische

Untersuchung in das Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

verbracht. Dort fand die weitere Herstellung der histologischen Schnitte

(Paraffineinbettung, Schnittherstellung mittels Mikrotom, Hämatoxylin-Eosin (HE) -

Färbung) und die Beurteilung dieser in Kooperation mit Dr. Frauke Seehusen statt.

B.2.7 Serologische Untersuchung

Die serologischen Untersuchungen wurden in Kooperation mit Dr. Alexandra von

Altrock in der Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover

mit einem ELISA-Testsystem (PIGTYPE® YOPSCREEN ELISA Testkit, Labor

Diagnostik Leipzig GmbH/ Quiagen Leipzig GmbH) durchgeführt. Dieses basiert auf

rekombinanten Yops (engl.: Yersinia outer proteins) und dient zum Nachweis von

Antikörpern gegen pathogene Yersinien bei Schweinen. Der ELISA wurde

entsprechend den Herstellerangaben durchgeführt und ausgewertet.

B.3 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Programms SAS® (SAS Institute

Inc., Cary) in Kooperation mit Herrn Prof. Dr. Lothar Kreienbrock und Herrn Dr.

Martin Beyerbach aus dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und

Informationsverarbeitung der Tierärztlichen Hochschule Hannover.

Die relative virulence ratio (RVR) und der competitive index (CI) zur Auswertung der

Koinfektionsversuche wurden wie folgt berechnet:


35

RVR: % im Organ

% im Inoculum

CI: RVR Mutante

RVR wt

Die Auswertung der RVR und des CI erfolgte mit GraphPad Prism® in Kooperation

mit Julia Schaake, M.Sc. aus der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Petra Dersch vom

Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in Braunschweig.

Ergebnisse

36

C Ergebnisse

C.1 Etablierung eines Infektionsmodells für Yersinia enterocolitica im Minipig

Yersinia enterocolitica (Y. enterocolitica ) ist ein bedeutender Durchfallerreger beim

Menschen. Schweine gelten als Reservoirwirt, da sie den Erreger mit einer hohen

Prävalenz beherbergen, jedoch keine klinischen Symptome zeigen (Fukushima et al.,

1983; Gürtler et al., 2005). In Europa ist Serotyp O:3 sowohl in humanen Patienten

als auch in Mastschweinebeständen der häufigste Serotyp (Thibodeau et al., 1999;

Bottone, 1999; Rosner et al., 2010). Obwohl schon experimentelle Infektionen beim

Schwein durchgeführt wurden (Fukushima et al., 1984; Robins-Browne et al., 1985;

Schiemann, 1988; Thibodeau et al., 1999), sind die Mechanismen, die zu einer

Kolonisierung des Schweins führen, noch weitgehend unbekannt.

Molekularbiologische Untersuchungen erfolgten in erster Linie mit Serotyp O:8

(YeO:8) und im gut standardisierten Mausmodell. Daher sollte in der vorliegenden

Arbeit für weitergehende Untersuchungen zur Kolonisation bzw. Infektion von

Y. enterocolitica im natürlichen Wirt, dem Schwein, zunächst ein Modell entwickelt

werden, das möglichst nah an der natürlichen epidemiologischen Situation in

Schweinemastbetrieben bleibt. Es wurde der orale Infektionsweg gewählt, da

Y. enterocolitica häufig in Tonsillen von Schlachtschweinen nachgewiesen werden

konnte (Fredriksson-Ahomaa et al., 2001a; Gürtler et al., 2005) und möglicherweise

dort persistiert. Als Versuchstiere wurden aufgrund ihrer Vorteile in Bezug auf

Unterbringung und Handhabung sowie ihrer zunehmenden Verwendung als

Labortiere Minipigs eingesetzt. Für die Etablierung wurde der in Europa am

häufigsten vorkommende Serotyp O:3 (YeO:3) eingesetzt.

C.1.1 Vergleich verschiedener Infektionsdosen von Y. enterocolitica Serotyp O:3

In Anlehnung an bereits publizierte Daten wurden in drei Tiergruppen von jeweils vier

Minipigs Infektionsdosen von 108, 109 und 1010 koloniebildenden Einheiten (KBE) pro

Ferkel getestet [vgl. B.1.2]. In Publikationen zu oralen Infektionsversuchen im

Schwein (Fukushima et al., 1984; Robins-Browne et al., 1985; Schiemann, 1988;

Ergebnisse

37

Thibodeau et al., 1999) führten diese Dosen zu einer subklinischen Infektion, die

auch im Minipigmodell angestrebt wurde.

Die Tiere wurden sieben Tage nach Einstallung oral mit YeO:3 Stamm Y1 infiziert

und danach zweimal täglich im Hinblick auf klinische Symptome untersucht. Zudem

wurden einmal wöchentlich Blutproben hämatologisch [vgl. B.2.2 bis B.2.4] und

zweimal wöchentlich Rektaltupfer bakteriologisch untersucht [vgl. B.1.4 und B.2.4].

Sieben Tage nach der Infektion wurden alle Tiere euthanasiert und nachfolgend

seziert. Bei der Sektion wurde eine makroskopische Untersuchung des Tierkörpers

und der Organe durchgeführt [vgl. B.2.5]. Für eine quantitative und qualitative

bakteriologische Untersuchung auf Yersinien wurden Proben von folgenden Organen

entnommen: Tonsillen, Jejunum, Ileum, Caecum, Colon, Rectum, mesenterialen

Lymphknoten (Lnn. jejunales), Leber, Milz und Niere. Nur qualitativ mittels

Kälteanreicherung untersucht wurden bei der Sektion direkt aus dem Enddarm

entnommene Kotproben [vgl. B.2.4]. Die Daten von drei Tieren wurden von der

Auswertung ausgeschlossen, daher beziehen sich alle folgenden Ergebnisse auf

eine Gruppengröße von je drei Tieren. Die Gründe hierfür werden im folgenden

Abschnitt näher erläutert.

C.1.1.1 Klinische und pathologisch-anatomische Beurteilung der Tiere

Nach der Einstallung mussten zwei Ferkel wegen akuten Kreislaufversagens mit

Dexamethason behandelt werden, eines von ihnen verendete innerhalb von 24

Stunden. Diese Tiere und ein drittes, das vor der Infektion positiv auf Y. enterocolitica

untersucht wurde, wurden von der Auswertung ausgeschlossen. Keines der Minipigs

zeigte nach der Infektion klinische Symptome. Allerdings zeigten einige Ferkel im

Blutbild eine Anämie, Lympho- oder Leukozytopenie und alle Ferkel eine

Hämokonzentration, sowohl vor als auch nach der Infektion.

Pathologisch-anatomisch konnten nur unspezifische Befunde in überwiegend milder

Ausprägung beobachtet werden. Detaillierte Beschreibungen zu klinischen und

pathologisch-anatomischen Befunden befinden sich im Anhang [vgl. H.1 und 2].

Ergebnisse

38

C.1.1.2 Quantitative Organbelastung

Quantitativ konnte Y. enterocolitica in verschiedenen Organen mit bis zu 2,45x106

KBE/g Organ nachgewiesen werden. Besonders stark belastet waren Tonsillen,

Caecum, Colon und z.T. auch Ileum. In Tonsillen, Ileum und Caecum konnten von

allen neun infizierten Minipigs Yersinien quantitativ bestimmt werden. Aus Jejunum,

Colon und Rectum konnten nur in Gruppe B (Infektionsdosis: 109 KBE/ Tier) nicht

aus allen Proben Yersinien in der Direktkultur nachgewiesen werden. Bei Proben von

Jejunum und Rectum blieben in dieser Gruppe zwei, vom Colon eine der drei Proben

negativ. In den mesenterialen Lymphknoten, der Leber und Niere konnten die

Bakterien nur bei einem Tier aus Gruppe C (Infektionsdosis: 1010 KBE/ Tier)

quantitativ nachgewiesen werden (Abb. 2).

Abb. 2: Quantitative Organbelastung in den drei Dosisgruppen. Jeder Punkt repräsentiert den Logarithmus der KBE/g Organ eines Tieres. In jeder Dosisgruppe wurden drei Tiere oral infiziert und am siebten Tag p.i. seziert. Die Infektionsdosen betrugen 108 (Gruppe A), 109 (Gruppe B) bzw. 1010 (Gruppe C) KBE/Tier.

In den Tonsillen stieg die mittlere Organbelastung (Mittelwert der drei untersuchten

Tiere je Gruppe) mit der Infektionsdosis an. Im Ileum, Caecum, Colon und Rectum

war die mittlere Organbelastung in Gruppe A (Infektionsdosis: 108 KBE/ Tier) zwar

geringer als in Gruppe C (Infektionsdosis: 1010 KBE/ Tier), jedoch war diese auch in

Gruppe B (Infektionsdosis: 109 KBE/ Tier) geringer als in Gruppe A. Alle Zahlen sind

im Anhang aufgelistet [vgl. H.4].

Ergebnisse

39

C.1.1.3 Qualitative Organbelastung

Aus Tonsillen, Ileum, Caecum und Colon konnten die Yersinien bei allen infizierten

Tieren aus allen drei Dosisgruppen mittels Kälteanreicherung reisoliert werden. Die

Rectumproben waren ebenfalls bis auf eine Probe positiv. Qualitativ wurden die

Bakterien auch aus dem Jejunum aller Tiere der Gruppen A (niedrigste

Infektionsdosis) und C (höchste Dosis) sowie einem Tier aus Gruppe B (mittlere

Dosis) reisoliert. Aus den mesenterialen Lymphknoten von Tieren der niedrigsten

und höchsten Dosisgruppe, aus der Leber von Tieren der mittleren und höchsten

Dosisgruppe und aus der Milz eines Tieres der höchsten Dosisgruppe konnten die

Bakterien ebenfalls reisoliert werden (Abb. 3).

Abb. 3: Prozentualer Anteil der positiv getesteten Tiere in den drei Dosisgruppen. Y. enterocolitica wurde mittels Kälteanreicherung in den Organproben nachgewiesen. Die Infektionsdosen betrugen 108 (Gruppe A), 109 (Gruppe B) bzw. 1010 (Gruppe C) KBE/Tier. In jeder Gruppe wurden Proben von jeweils drei Tieren am siebten Tag p.i. untersucht.

C.1.1.4 Bakterielle Ausscheidung

Einen Tag nach der oralen Infektion konnten in Gruppe A (108 KBE/Tier) und C (1010

KBE/Tier) von 67 % der Tiere Yersinien in Kottupfern nachgewiesen werden. In

Gruppe B (109 KBE/Tier) war nur eines der drei Tiere positiv. Drei Tage p.i. waren in

67 % der untersuchten Rektaltupfer aus Gruppe A und B sowie in allen Tieren aus

Gruppe A

Gruppe B

Gruppe C

Ergebnisse

40

Gruppe C Yersinien nachweisbar. An Tag sieben p.i. waren alle bei der Sektion

entnommenen Kotproben positiv (Abb. 4).

Abb. 4: Prozentualer Anteil der Tiere in den drei Dosisgruppen, die Y. enterocolitica mit den Faeces ausschieden. Rektaltupfer der Minipigs (drei Tiere pro Gruppe) wurden zu den angegebenen Zeitpunkten nach der oralen Infektion genommen und mittels Kälteanreicherung untersucht.

Die Ausscheidung mit dem Kot begann somit bei 33 bis 67 % der Tiere bereits 24

Stunden nach der Infektion und dauerte bis zum siebten Tag p.i. bei allen Tieren an.

Fazit:

Eine Kolonisation der Tonsillen und der Darmabschnitte sowie eine Ausscheidung

mit den Faeces konnte nach der Infektion mit allen drei untersuchten Infektionsdosen

beobachtet werden. Da in der Gruppe der höchsten Infektionsdosis die Bakterien

auch aus Lymphknoten, Leber und Milz reisoliert werden konnten, wurden alle

weiteren experimentellen Infektionsstudien mit einer oralen Infektionsdosis von 109

KBE durchgeführt. Diese sollte eine Kolonisierung der Tonsillen sowie der

verschiedenen Darmabschnitte und eine Ausscheidung der Yersinien mit dem Kot

gewährleisten, das Risiko einer klinisch manifesten Erkrankung jedoch möglichst

gering halten.

C.1.2 Zeitverlauf der Infektion mit Y. enterocolitica Serotyp O:3

Im zweiten Versuch zur Etablierung wurde der zeitliche Verlauf der Kolonisation,

Infektion und der fäkalen Ausscheidung nach einer oralen Infektion mit

Gruppe A

Gruppe B

Gruppe C

Ergebnisse

41

Y. enterocolitica untersucht. Zwölf Minipig-Ferkel im Alter von fünf bis sieben

Wochen [vgl. B.2.1] wurden mit je 109 KBE YeO:3 Stamm Y1 infiziert [vgl. B.2.3].

Erwartungsgemäß zeigten auch diese Tiere keine klinischen Symptome. Je drei

Tiere wurden am dritten, siebten, vierzehnten und einundzwanzigsten Tag post

infectionem (p.i.) euthanasiert und seziert. Vier zusätzliche Tiere fungierten als

Kontrollgruppe. Diese wurden separat aufgestallt, mit sterilem PBS „pseudoinfiziert“

und am 21. Tag p.i. seziert [vgl. B.2.2]. Mit Ausnahme des Rectums wurden von allen

Tieren die gleichen Organe beprobt wie in der vorangegangenen Studie [vgl. C.1.1].

Alle Organproben wurden sowohl quantitativ als auch qualitativ untersucht, Rektal-,

Tonsillentupfer und Kotproben hingegen nur qualitativ mittels Kälteanreicherung

[vgl. B.1.3 bis B.1.5]. Zusätzlich wurden einmal wöchentlich Serumproben

genommen und mit einem kommerziellen ELISA (PIGTYPE® YOPSCREEN) auf

Antikörper gegen pathogene Yersinien untersucht [vgl. B.2.7].

Das Ileum und die mesenterialen Lymphknoten (Lnn. jejunales) jedes Tieres wurden

pathologisch-histologisch untersucht [vgl. B.2.6].

C.1.2.1 Klinische Beurteilung der Tiere

Auch in dieser Infektionsstudie zeigten weder die infizierten noch die Kontrolltiere

klinische Symptome wie Fieber oder Diarrhoe. Sowohl vor als auch nach der

Infektion konnten allerdings bei allen Tieren abweichende Befunde im Blutbild erfasst

werden, diese wiesen jedoch nicht deutlich auf eine akute bakterielle Infektion hin

[vgl. H.1].

C.1.2.2 Pathologisch-anatomische Beurteilung

In den Sektionen wurden ebenfalls nur unspezifische, größtenteils geringgradige

Befunde erhoben. Vergrößerte Darmlymphknoten und Anzeichen einer GALT-

Hyperplasie konnten sowohl bei den infizierten als auch bei den Kontrolltieren

beobachtet werden [vgl. H.2].

Ergebnisse

42

C.1.2.3 Histopathologische Beurteilung

Die histologische Untersuchung wurde in allen Versuchen in Kooperation mit Dr.

Frauke Seehusen aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule

Hannover durchgeführt. Auch hier zeigten sich fast ausschließlich unspezifische

Veränderungen, die auch in der nicht infizierten Kontrollgruppe auftraten. Im Ileum

traten ggr. Nekrosen, Zottenveränderungen, Verluste von Epithelzellen und eine ggr.

entzündliche Infiltration der Lamina propria etwas häufiger am dritten und siebten

Tag p.i., als am 14. und 21. Tag p.i. auf. Die mesenterialen Lymphknoten waren

histologisch bis auf eine ggr. lymphatische Hyperplasie unauffällig [vgl. H.3].

Detaillierte Beschreibungen zu klinischen, pathologisch-anatomischen und

histopathologischen Befunden befinden sich im Anhang [vgl. H.1, H.2 und H.3].


Am dritten Tag nach der oralen Infektion konnten bei allen drei Tieren Yersinien in

Tonsillen, Jejunum, Ileum und Caecum quantitativ nachgewiesen werden. In den

Tonsillen und den Darmabschnitten, hier insbesondere dem Ileum, war die

Organbelastung mit bis zu 1,35x106 KBE/g am höchsten. Im Colon konnten nur von

zwei Ferkeln Yersinien quantitativ nachgewiesen werden. In Leber, Milz und Niere

waren die Bakterien nur von je einem der drei Minipigs direkt reisolierbar

(102 KBE/g).

An Tag sieben p.i. war im Hinblick auf die befallenen Organe kein detektierbarer

Unterschied zu Tag drei p.i. zu beobachten. Aus Jejunum, Ileum, Caecum und Colon

konnte bei allen Tieren Y. enterocolitica reisoliert und quantifiziert werden. In den

Tonsillen konnten nur bei zwei, in den mesenterialen Lymphknoten sowie in Leber

und Niere bei einem von drei Schweinen quantitativ Yersinien nachgewiesen werden.

Aus der Milz war sieben Tage p.i. kein quantitativer Erregernachweis möglich. Die

Organbelastung unterschied sich kaum von der an Tag drei p.i. ermittelten.

Zwei Wochen nach der Infektion konnte nur noch aus Ileum, Caecum und Colon aller

drei Tiere Y. enterocolitica quantitativ reisoliert werden. Jeweils bei einem der drei

Tiere konnten Yersinien aus dem Jejunum, den mesenterialen Lymphknoten, Nieren

und Tonsillen quantitativ bestimmt werden. Proben von Leber und Milz blieben bei

allen drei Ferkeln negativ. Die Keimbelastung lag allerdings in niedrigeren Bereichen,

Ergebnisse

43

in den Tonsillen beispielsweise bei 9,09x102 KBE/g. Deutliche Unterschiede

bezüglich der Organbelastungen zeigten sich zwischen Tag drei und Tag 14 p.i. in

Jejunum, Ileum, Caecum und Tonsillen. Zwischen Tag sieben und Tag 14 p.i.

konnten große Unterschiede in Jejunum, Caecum und Colon festgestellt werden.

Drei Wochen nach oraler Infektion waren schließlich nur noch in den Caeca aller drei

Schweine Yersinien qualitativ nachweisbar. Sie konnten zudem aus zwei der drei

Colon- und Tonsillenproben und aus einer Ileumprobe direkt reisoliert werden. Auch

hier konnte eine weitere Abnahme der Organbelastung beobachtet werden, die im

Vergleich zum dritten und siebten Tag post infectionem besonders stark hervortrat.

Deutliche Unterschiede zeigten sich zwischen Tag drei und Tag 21 p.i. in Jejunum,

Ileum und Caecum, sowie zwischen Tag sieben und Tag 21 p.i. in Jejunum, Ileum,

Caecum und Colon und auch zwischen Tag 14 und Tag 21 p.i. in der Belastung des

Ileums (Abb. 5 und Abb. 6). Alle Zahlen sind im Anhang aufgelistet [vgl. H.4].

Aus den Organen der vier am 21. Tag p.i. sezierten Kontrolltiere konnten keine

Yersinien isoliert werden.

Abb. 5: Quantitative Organbelastung der Minipigs zu vier Zeitpunkten nach der Infektion. Jeder Punkt repräsentiert den Logarithmus der KBE/g Organ eines Tieres. Zu jedem Zeitpunkt (drei, sieben, 14 und 21 Tage p.i.) wurden drei Tiere seziert.

Tage p.i.

Ergebnisse

44

Abb. 6: Quantitative Belastung der intestinalen Organe (Jejunum, Ileum, Caecum, Colon) im Verlauf der Infektion. Je drei Tiere wurden am dritten, siebten, 14. und 21. Tag p.i. euthanasiert und seziert. Jeder Punkt repräsentiert den Logarithmus des Mittelwerts der drei untersuchten Tiere. Die Balken zeigen die Standardabweichung an.


Qualitativ konnten mittels Kälteanreicherung von Organproben der an Tag drei p.i.

sezierten Schweine Yersinien aus allen Proben von Tonsillen, Jejunum, Ileum,

Caecum und Colon reisoliert werden. Somit waren zu diesem Zeitpunkt alle Proben

von Tonsillen und Darmabschnitten positiv. In zwei von drei der beprobten

mesenterialen Lymphknoten und Nieren, sowie in je einer Probe von Leber und Milz

konnte Y. enterocolitica ebenfalls nachgewiesen werden. Sieben Tage p.i. erwiesen

sich noch immer alle Darmproben und zwei der drei Darmlymphknoten als positiv.

Zudem waren die Yersinien in je einer der Proben von Tonsillen, Leber, Milz und

Niere nachweisbar. Am 14. Tag p.i. fanden sich die Bakterien noch in allen drei

Proben von Ileum, Caecum und Colon, in zwei der Tonsillenproben und in jeweils

einer Probe der mesenterialen Lymphknoten und Nieren. Negativ blieben zu diesem

Zeitpunkt alle Proben von Jejunum, Leber und Milz. Am 21. Tag nach der Infektion

waren noch alle drei Colonproben positiv, zudem je zwei der drei Proben von

Tonsillen und Caecum. In Jejunum, Ileum, mesenterialen Lymphknoten, Leber, Milz

und Nieren aller drei Tiere konnten keine Yersinien nachgewiesen werden (Abb. 7).

In den Organproben der vier Kontrolltiere konnten auch in der Kälteanreicherung

keine Yersinien nachgewiesen werden.

Ergebnisse

45

Abb. 7: Prozentualer Anteil positiv getesteter Organproben im Bezug zum Zeitpunkt nach der Infektion (Tage p.i.). Die Organproben wurden mittels Kälteanreicherung untersucht. Zu jedem der vier angegebenen Zeitpunkte wurden drei Tiere in der Sektion untersucht.


Um die Ausscheidung der Yersinien mit dem Kot zu untersuchen, wurden zweimal

pro Woche Rektaltupfer aller Tiere und bei den Sektionen frisch aus dem Enddarm

entnommener Kot qualitativ auf Y. enterocolitica untersucht. Auch hier kam die

Kälteanreicherung zum Einsatz, aufgrund der extrem hohen Begleitflora in Kotproben

wurde auf eine quantitative Untersuchung verzichtet.

Einen Tag nach der oralen Belastung der Ferkel waren in allen zwölf untersuchten

Rektaltupfern Yersinien nachweisbar. Drei Tage p.i. wurden elf von zwölf Tupfern

positiv getestet, sieben Tage p.i. waren in allen neun untersuchten Tupfern Yersinien

nachweisbar. Zehn und 14 Tage p.i. waren alle Rektaltupfer der sechs Minipigs

positiv. An Tag 17 p.i. konnten keine Yersinien nachgewiesen werden, 21 Tage p.i.

hingegen waren alle drei Proben dieser Tiere wieder positiv (Abb. 8).

Tage p.i.

Ergebnisse

46

Abb. 8: Prozentualer Anteil der infizierten Tiere, die Y. enterocolitica mit den Faeces ausschieden. Die Untersuchung erfolgte mittels Kälteanreicherung von Rektaltupfern. Am ersten und dritten Tag p.i. wurden 12 Tiere untersucht, am siebten Tag neun Tiere, am zehnten und 14. Tag sechs und am 17. und 21. Tag drei Tiere.

Auch aus Rektaltupfern oder Kotproben der vier Kontrolltiere konnten keine Yersinia

spp. isoliert werden. In den, von jedem Tier sieben Tage vor der Infektion

genommenen, Rektal- und Tonsillentupfern waren kulturell ebenfalls keine Yersinien

nachweisbar.

C.1.2.7 Serologie

Serumanalysen wurden in allen Versuchen mittels eines kommerziellen ELISA-

Systems [vgl. B.2.7] in Kooperation mit Dr. Alexandra von Altrock (Klinik für kleine

Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover) durchgeführt. Die serologische

Untersuchung zeigte einen starken Titeranstieg im Serum der infizierten Tiere ab

dem siebten Tag nach der Infektion. Während die vier nicht infizierten Kontrolltiere

negativ (unter dem „Cut-off“ von 20 OD %) blieben, zeigten die infizierten Tiere

Werte von bis zu 85 OD % und einen steten Titeranstieg bis zum 21. Tag p.i. (Abb.

9). Bis zum siebten Tag p.i. unterschieden sich die Titer der Infektions- und der

Kontrollgruppe kaum, ab dem 14. Tag p.i. konnte trotz deutlich ersichtlicher

Unterschiede aufgrund der geringen Tierzahlen keine statistische Signifikanz

nachgewiesen werden.

Abb. 9: Punkt reoptischeersten T14. Tag 21. Tag

Fazit:

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Ergebnisse

48

C.2 Vergleichende Infektionsstudie der Serotypen O:3 und O:8

Yersinia enterocolitica Serotyp O:3 (YeO:3) ist in Europa der häufigste Auslöser

humaner Yersiniosis-Fälle und wurde in mehreren epidemiologischen Studien auch

aus Proben von Mastschweinen isoliert (Fukushima et al., 1983; von Altrock et al.,

2006; Bottone, 1997; Fredriksson-Ahomaa et al., 2001a; Gürtler et al., 2005;

Thibodeau et al., 1999). In experimentellen Infektionen im Mausmodell zeigte er sich

allerdings wenig virulent. Serotyp O:8 (YeO:8) hingegen kommt selten in Europa vor

und konnte selten aus Mastschweinen isoliert werden, zeigte sich im Mausversuch

aber sehr viel virulenter (Schiemann, 1988; Robins-Browne und Prpic, 1985) und war

in den letzten Jahren wesentlich häufiger Gegenstand molekularbiologischer

Forschung als der Serotyp O:3. Auch in vitro-Experimente in der Zellkultur zeigten

Unterschiede zwischen den beiden Serotypen (Uliczka et al., 2011). Vor diesem

Hintergrund war ein zweites Ziel dieser Arbeit, die Serotypen YeO:3 und YeO:8 im

Minipig-Infektionsmodell zu vergleichen.

Die Infektionsversuche wurden in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr.

Petra Dersch am Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (HZI) in Braunschweig

und Julia Schaake, M.Sc., aus der Arbeitsgruppe Molekulare Infektionsbiologie des

HZI durchgeführt.

In einer ersten Studie wurden jeweils acht Minipig-Ferkel mit 109 KBE pro Tier YeO:3

Stamm Y1 bzw. YeO:8 Stamm 8081v infiziert [vgl. B.1.1]. Vier Tiere je Gruppe

wurden an Tag sieben und die verbleibenden vier an Tag 21 p.i. euthanasiert und

seziert [vgl. B.2.2]. Die Kontrollgruppe bestand aus drei Ferkeln, welche ebenfalls 21

Tage nach der („Pseudo“-) Infektion [vgl. B.2.3] seziert wurden.

Alle Versuchstiere wurden bei der Einstallung (sieben Tage vor der Infektion) mittels

Rektal- und Tonsillentupfern auf das Vorhandensein von Y. enterocolitica überprüft.

Blutproben (Serum und EDTA-Blut) wurden von allen Minipigs vor und nach der

Infektion einmal wöchentlich auf Antikörper gegen pathogene Yersinien bzw.

Auffälligkeiten im Blutbild untersucht. Rektaltupfer wurden zweimal wöchentlich auf

Y. enterocolitica hin getestet. Bei den Sektionen wurden die gleichen Organe beprobt

wie in der Infektionsverlaufsstudie [vgl. C.1.2]. Auch die pathologisch-anatomischen,

histopathologischen und mikrobiologischen Untersuchungsmethoden sowie die

regelmäßige klinische Kontrolle der Tiere wurden aus dieser Studie beibehalten

[siehe C.1.2].

Ergebnisse

49

In einer zweiten Studie wurden nochmals je sechs Ferkel mit dem YeO:3 Stamm Y1

bzw. dem YeO:8 Stamm 8081v infiziert und sieben Tage p.i. seziert. Die orale

Infektionsdosis betrug 109 KBE pro Tier. Sämtliche Untersuchungsmethoden wurden

beibehalten und die Ergebnisse der beiden nacheinander erfolgten

Infektionsversuche zusammengefasst. Die einzigen Ausnahmen stellen hier die

Serologie und die Sektion eines Teils der Tiergruppen am 21. Tag p.i. dar.

Serologische Untersuchungen wurden nur in der ersten der beiden Studien

durchgeführt und auch die Belastung am 21. Tag p.i. wurde nur in dieser erfasst.

C.2.1 Klinische Beurteilung der Tiere

In den vergleichenden Infektionsstudien mit den Serotypen O:3 und O:8 wiesen alle

Versuchstiere eine Anämie sowie weitere unspezifische Befunde in der

hämotologischen Untersuchung auf. Klinisch fiel ein Ferkel innerhalb der letzten

Tage des Versuchs durch schleimig-blutige, z.T. auch fibrinöse Kotbeimengungen

auf. Fieber konnte nicht festgestellt werden, einige Tiere wiesen sowohl vor als auch

nach der Infektion eine ggr. Diarrhoe auf. In der Kontrollgruppe verendete ein Tier

perakut an einer Blasenruptur [vgl. H.1].

C.2.2 Pathologisch-anatomische Beurteilung

In den Sektionen konnten sowohl am siebten als auch am 21. Tag p.i. nur

unspezifische Befunde erhoben werden, die überwiegend von milder Ausprägung

und sowohl bei den infizierten als auch bei den Kontrolltieren zu beobachten waren

[vgl. H.2].

C.2.3 Histopathologische Beurteilung

In der histopathologischen Beurteilung der Leber, Milz, mesenterialen Lymphknoten

und des Ileums konnten überwiegend geringgradige unspezifische Befunde erhoben

werden. Lediglich in der Leber traten keine Veränderungen bei den Kontrolltieren auf,

allerdings waren auch die in infizierten Tieren beobachteten Veränderungen

unspezifisch und nur minimal bis ggr. ausgeprägt. Hervorzuheben ist allerdings, dass

Ergebnisse

50

bei einem der Tiere aus Gruppe A (infiziert mit YeO:3) am siebten Tag p.i.

Bakterienkolonien in der Wand des Ileums gefunden wurden [vgl. H.3].



C.2.4 Quantitative Organbelastung

Die Organbelastung mit Y. enterocolitica fiel in den beiden Infektionsgruppen sehr

unterschiedlich aus. Während der YeO:3-Wildtypstamm Y1 am siebten Tag p.i.

quantitativ in mehreren intestinalen Proben (Jejunum, Ileum, Caecum, Colon) und in

den Tonsillen nachgewiesen werden konnte, war der YeO:8-Wildtypstamm 8081v in

der Direktkultur nur aus den Tonsillen eines Tieres reisolierbar. In Leber, Milz, Nieren

und mesenterialen Lymphknoten konnten in beiden Gruppen quantitativ keine

Yersinien nachgewiesen werden.

Am siebten Tag p.i. war in der mit YeO:3 infizierten Gruppe die Anzahl der

reisolierten Bakterien pro Gramm Organ aus Proben vom Ileum besonders groß, hier

konnten in sieben der insgesamt zehn Ferkel zwischen 104 und 106 KBE/g gefunden

werden. In dieser Gruppe waren auch bei sechs von zehn Minipigs Yersinien

quantitativ in den Tonsillen nachweisbar, die Zahlen schwankten zwischen 8x102 und

3x105 KBE/g. Aus vier von zehn Jejunumproben (104 bis 106 KBE/g), vier von zehn

Caecumproben (101 bis 106 KBE/g) und drei von zehn Colonproben (105 KBE/g)

konnte der YeO:3 Stamm Y1 ebenfalls reisoliert werden. Im Vergleich dazu fand sich

der Serotyp O:8 Stamm 8081v am siebten Tag p.i. nur in einer von zehn

Tonsillenproben in einer Menge von 1,33x103 KBE/g. In keiner der anderen

Organproben konnte der YeO:8-Stamm quantitativ bestimmt werden. Im Fisher’s

Exact Test unterschied sich die Organbelastung durch die beiden Stämme signifikant

in Tonsillen, Jejunum und Caecum (P<0,05). Im Ileum war der Unterschied noch

deutlicher (P<0,01), während im Colon und in den extraintestinalen Organen kein

signifikanter Unterschied festgestellt werden konnte (Abb. 10 A).

Am 21. Tag p.i. wurden je vier Tiere pro Infektionsgruppe untersucht. In der mit

YeO:3 Stamm Y1 infizierten Gruppe konnten die Yersinien aus zwei der vier

Tonsillenproben (103 und 105 KBE/g) reisoliert werden. Auch in einer Probe vom

Jejunum (102 KBE/g), zwei Proben vom Ileum (103 KBE/g), zwei Proben vom

Caecum (102 KBE/g) und drei Colonproben (102 bis 105 KBE/g) konnte YeO:3 in der

Ergebnisse

51

Direktkultur quantitativ nachgewiesen werden. Auch zu diesem Zeitpunkt zeigte sich

ein deutlicher Unterschied zwischen den beiden Infektionsgruppen. YeO:8 Stamm

8081v konnte auch drei Wochen nach der Infektion nur aus den Tonsillen reisoliert

werden, allerdings von einem größeren Anteil der Tiere. So wiesen von vier Tieren

drei eine Belastung der Tonsillen mit YeO:8 zwischen 103 und 104 KBE/g auf (Abb.

10 B). Alle Zahlen sind im Anhang aufgelistet [vgl. H.4].

Abb. 10: Quantitative Organbelastung der Minipigs am siebten Tag (A) bzw. am 21. Tag (B) p.i.. Jeder Punkt repräsentiert den Logarithmus der KBE/g Organ eines Tieres. In jeder der beiden Infektionsgruppen wurden zehn Tiere (A) bzw. vier Tiere (B) untersucht. Die Ergebnisse wurden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst.

B

A

Ergebnisse

52

C.2.5 Qualitative Organbelastung

Von den zehn Tieren, die mit YeO:3 Stamm Y1 infiziert und an Tag sieben p.i. seziert

wurden, konnten mittels Kälteanreicherung in 90 % der Tonsillen und der Proben von

Jejunum, Caecum und Colon Yersinien nachgewiesen werden. Die Ileumproben

waren zu 100 % positiv. Von den untersuchten extraintestinalen Proben erwiesen

sich 70 % der mesenterialen Lymphknoten, 40 % der Nieren- und 30 % der

Milzproben als positiv.

Im Gegensatz dazu konnten von den zehn Minipigs, die mit YeO:8 Stamm 8081v

infiziert wurden, ausschließlich aus Proben von Tonsillen und Ileum in der

Kälteanreicherung Yersinien reisoliert werden. Die Tonsillen waren zu 70 % und

Ileumproben zu 30 % positiv, alle extraintestinalen Organe waren frei von

Y.enterocolitica Serotyp O:8. Am 21. Tag p.i. konnte Serotyp O:3 aus den Tonsillen,

dem Ileum, Caecum und Colon aus drei von vier Proben mit der Kälteanreicherung

reisoliert werden. Eine von drei Jejunumproben war ebenfalls positiv. Alle

extraintestinalen Proben blieben negativ. Serotyp O:8 konnte am 21. Tag p.i.

qualitativ aus drei der vier Tonsillenproben und aus einer Caecumprobe reisoliert

werden. Proben von Jejunum, Ileum, Colon sowie den extraintestinalen Organen

blieben in der Kälteanreicherung negativ. Die Organe der mit YeO:3 infizierten Tiere

waren insgesamt häufiger und stärker befallen als die der mit YeO:8 infizierten

Ferkel. Im Fisher’s Exact Test unterschied sich die Häufigkeit, in der die beiden

Stämme in den Organen vorkamen, deutlich signifikant im Ileum (P<0.01). In

Jejunum, Caecum und Colon war der Unterschied hoch signifikant (P<0.001),

während in den Tonsillen und in den extraintestinalen Organen kein signifikanter

Unterschied festgestellt werden konnte (Abb. 11).

Alle Organproben von Kontrolltieren waren sowohl in der Direktkultur als auch in der

Kälteanreicherung frei von Y. enterocolitica .

Ergebnisse

53

Abb. 11: Qualitative Organbelastung mit Yersinia enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 (YeO:3) oder Serotyp O:8 Stamm 8081v (YeO:8). Die Organproben wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht, die Isolate wurden biochemisch differenziert. Alle Proben wurden am siebten Tag p.i. gewonnen. In jeder der beiden Infektionsgruppen wurden zehn Tiere untersucht. Die Ergebnisse wurden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst.

C.2.6 Bakterielle Ausscheidung

Bis einschließlich zum siebten Tag p.i. wurden bezüglich der bakteriellen

Ausscheidung zu jedem der beiden Serotypen Daten von 14 Tieren gewonnen. Vom

achten bis zum 21. Tag p.i. wurden nur vier Tiere je Serotyp auf Yersinien in

Rektaltupfern untersucht. Der Anteil der Ausscheider stieg bei Serotyp O:3 Stamm

Y1 bis zum siebten Tag an und blieb bis zum 21. Tag p.i. sehr hoch, während er bei

Serotyp O:8 Stamm 8081v zum siebten Tag hin abnahm. Ab dem zehnten Tag

waren in Rektaltupfern bzw. Kottupfern von Tieren der Gruppe B keine Yersinien

mehr nachweisbar. Einen Tag nach der oralen Infektion schieden 50 % der Ferkel

YeO:3 und 36 % YeO:8 mit dem Kot aus. An Tag drei p.i. waren 93 % der Proben

von Ferkeln aus Gruppe A und 7 % der Rektaltupfer von Tieren der Gruppe B positiv.

Am siebten Tag nach der Infektion wurden alle Tiere in Gruppe A positiv getestet,

während es in Gruppe B nur 7 % waren. Im Fisher’s Exact Test unterschied sich die

Häufigkeit, in der die beiden Stämme in den Kotproben vorkamen, deutlich signifikant

Ergebnisse

54

(P < 0,001) ab dem dritten Tag p.i.. Am ersten Tag p.i. konnte noch kein signifikanter

Unterschied festgestellt werden (Abb. 12).

Abb. 12: Bakterielle Ausscheidung mit den Faeces nach Infektion mit YeO:3 Stamm Y1 oder YeO:8 Stamm 8081v. Rektaltupfer wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht, die Isolate wurden biochemisch differenziert. In jeder der beiden Infektionsgruppen wurden 14 Tiere untersucht. Die Ergebnisse aus zwei unabhängigen Experimenten wurden zusammengefasst.

Von Tag zehn bis Tag 21 p.i. waren alle Proben in Gruppe A positiv, aus den Proben

der Gruppe B konnten hingegen keine Yersinien reisoliert werden (Abb. 13).

Die Kontrolltiere schieden während der gesamten Versuchsdauer keine Yersinien mit

dem Kot aus.

Ergebnisse

55

Abb. 13: Bakterielle Ausscheidung mit den Faeces nach Infektion mit YeO:3 Stamm Y1 oder YeO:8 Stamm 8081v. Rektaltupfer wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht, die Isolate wurden biochemisch differenziert. Die Ergebnisse stammen aus dem ersten Infektionsversuch. (Anzahl der Tiere: Tag 1-7 p.i.: n=8, Tag 8-21 p.i.: n=4)

C.2.7 Serologie

Während des ersten Infektionsversuchs wurden vor und nach der Infektion mit YeO:3

Stamm Y1 bzw. YeO:8 Stamm 8081v einmal wöchentlich Serumproben auf

Antikörper gegen pathogene Yersinien untersucht [vgl. B.2.7]. Die gewonnenen

Daten beziehen sich bis zum siebten Tag p.i. auf acht Tiere und vom achten bis zum

21. Tag p.i. auf vier Tiere je Infektionsgruppe. Die Kontrollgruppe von drei Tieren

wurde bis zum 21. Tag p.i. serologisch untersucht. Die mit YeO:3 infizierten Ferkel

zeigten zwischen Tag sieben und Tag 14 p.i. einen sehr deutlichen Titeranstieg auf

im Mittel bis zu 80 OD %. In Serumproben der mit YeO:8 infizierten Minipigs und der

Kontrolltiere blieben die Titer bis zum 21. Tag p.i. unterhalb des Cut-off Werts von 20

OD %, wobei sie im Verlauf in der Kontrollgruppe sanken, in der YeO:8- Gruppe

ganz leicht anstiegen (Abb. 14). Aufgrund der geringen Tierzahlen ab dem 14. Tag

p.i. konnte keine statistische Signifikanz nachgewiesen werden.

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Ergebnisse

57

C.3 Koinfektionsversuche mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtyp und Mutanten mit invasinassoziierten Gendefekten im Minipig-Modell

In der vergleichenden Infektionsstudie konnten deutliche Unterschiede im Phänotyp

zwischen dem Serotyp O:3 Stamm Y1 und dem Serotyp O:8 Stamm 8081v

beobachtet werden. Auf genetischer Ebene unterscheiden sich Yersinia

enterocolitica Serotyp O:3 (YeO:3) und Serotyp O:8 (YeO:8) u.a. hinsichtlich der

Expression des Virulenzfaktors Invasin.

Der erste Unterschied besteht in einer Punktmutation des globalen Regulators RovA,

der als Transkriptionsfaktor die invA-Expression aktiviert. Durch diese Punktmutation

befindet sich an Position 98 bei YeO:3 die Aminosäure Serin (RovAS98 bzw.

RovAYeO:3), bei YeO:8 hingegen Prolin (RovAP98 bzw. RovAYeO:8). Diese eine

Aminosäure verändert die Faltung des Proteins bei höheren Temperaturen (37°C)

und bewirkt dadurch eine geringere Empfindlichkeit des RovAYeO:3 gegenüber der

Lon-Protease. RovA wird bei 37°C somit nicht von dieser degradiert, und die höhere

RovA-Konzentration führt zu einer verstärkten invA-Expression (Uliczka et al., 2011).

Der zweite Unterschied besteht im Vorhandensein eines Insertionselements in der

invA-Promotorregion (PinvAIS1667) bei Serotyp O:3. Dieses beinhaltet einen

zusätzlichen Promotor, der eine konstitutive invA-Expression bewirkt (Uliczka et al.,

2011).

Um herauszufinden, inwiefern die genannten genetischen Merkmale dafür

verantwortlich sein könnten, dass die beiden Serotypen im Schwein einen so unter-

schiedlichen Phänotyp zeigten [vergleiche C.2.], führten wir Koinfektionsversuche mit

dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 und verschiedenen Mutanten durch. In diesen

Koinfektionen können Wildtyp und Mutante im selben Tier verglichen werden, was

die Auswirkungen individueller Unterschiede zwischen den Wirtstieren relativiert und

somit einen Erkenntnisgewinn unter Verwendung geringerer Versuchstierzahlen

ermöglicht (Monk et al., 2008).

Eingesetzt wurden eine RovA-Stabilitätsmutante, in der das stabilere RovAYeO:3 durch

das weniger stabile RovAYeO:8 ersetzt wurde, und eine PinvA∆IS1667-Mutante, der das

Insertionselement im Promotorbereich des Invasingens fehlt. Beide Mutanten lassen

somit Serotyp O:3 in einem bestimmten Merkmal dem Serotyp O:8 gleichen und

zeichnen sich im Vergleich mit dem YeO:3 Wildtypstamm durch eine verringerte

invA-Expression aus. Abschließend testeten wir auch eine komplette invA-Knockout-

Ergebnisse

58

Mutante, um zu zeigen, welche Rolle Invasin prinzipiell für die Infektion des Wirtes

Schwein spielt.

Die Koinfektionsversuche wurden, ebenso wie die Vergleichsstudien der beiden

Serotypen O:3 und O:8, in Kooperation mit Prof. Dr. Petra Dersch und Julia Schaake,

M.Sc. aus der Arbeitsgruppe Molekulare Infektionsbiologie des Helmholtz Zentrums

für Infektionsforschung (HZI) in Braunschweig durchgeführt.

C.3.1 Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer RovA-Stabilitätsmutante

In einem ersten Koinfektionsversuch wurden acht Mini-Lewe-Ferkel jeweils mit ca.

5x108 KBE YeO:3 Stamm Y1 (wt) und 5x108 KBE der RovA-Stabilitätsmutante YE14

(Y1 RovAP98, KnR) infiziert. YE14 ist mit dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 identisch, bis

auf ein weniger stabiles RovA-Protein, das ihn in diesem einen Punkt dem Serotyp

O:8 Stamm 8081v gleichen lässt. Außerdem besitzt YE14 eine Kanamycin-

Resistenzkassette, die es ermöglicht, ihn kulturell vom Wildtypstamm Y1 zu

unterscheiden.

Jeweils vier Schweine pro Gruppe wurden in einem ersten Koinfektionsversuch am

siebten und am 21. Tag p.i. euthanasiert und seziert. In einem zweiten

Koinfektionsversuch wurden nochmals vier Minipigs mit je 5x108 KBE YeO:3 Stamm

Y1 (wt) und 5x108 KBE der RovA-Stabilitätsmutante YE14 infiziert und nach sieben

Tagen seziert. Die Ergebnisse vom siebten Tag p.i. wurden aus beiden Versuchen

zusammengefasst und umfassen daher die Daten von insgesamt acht Tieren. Vier

Kontrolltiere wurden mit sterilem PBS pseudoinfiziert und am 21. Tag p.i. seziert.

Um das Verhältnis der Organbelastung durch die Mutante zu der Belastung durch

den Wildtyp zu ermitteln, wurden zwei unabhängige Verdünnungsreihen auf CIN-

Agarplatten mit und ohne Kanamycin-Zusatz ausplattiert und ausgezählt. Danach

wurde die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Gramm (KBE/g) Organ aus

dem Verhältnis der auf Agarplatten mit und ohne Kanamycinzusatz gewachsenen

Kolonien errechnet. Für die Berechnung der RVR (engl.: relative virulence ratio)

wurde zudem der Bezug zum exakten Anteil der beiden Stämme am Inokulum

hergestellt. Der CI (engl.: competitive index) zeigt das Verhältnis der RVRs der

beiden Stämme zueinander innerhalb eines Tieres [vgl. B.3].

Ergebnisse

59


Die Versuchstiere wiesen sowohl vor als auch nach der Infektion diverse

unspezifische Befunde in der hämatologischen Untersuchung auf. Klinische

Symptome konnten abgesehen von gelegentlich auftretendem breiigen Kot nicht

beobachtet werden [vgl. H.1].





[vgl. H.2].


In der histopathologischen Beurteilung der mesenterialen Lymphknoten und des

Ileums konnten überwiegend geringgradige unspezifische Befunde erhoben werden,

die sowohl bei den Tieren der Koinfektions- als auch den Ferkeln der

Kontrollgruppen auftraten. Im Ileum eines der koinfizierten Tiere konnten

Bakterienkolonien in der Darmwand beobachtet werden [vgl. H.3].


histopathologischen Befunden befinden sich im Anhang [vgl. H.1, 2 und 3].


Von den insgesamt acht am siebten Tag p.i. sezierten Ferkeln, konnten sowohl der

Wildtypstamm Y1 als auch die RovA-Stabilitätsmutante YE14 in den Tonsillen und

den verschiedenen Darmabschnitten (Jejunum, Ileum, Caecum und Colon) aller

Tiere quantitativ nachgewiesen werden. Hiervon gab es nur drei Ausnahmen, bei

einem Tier kam der Wildtypstamm nicht in den Tonsillen vor, bei einem weiteren Tier

nicht im Caecum und bei einem dritten nicht im Colon. Die Organbelastung mit dem

Wildtypstamm lag in den Tonsillen zwischen 102 und 104 KBE/g, in einer der acht

untersuchten Tonsillen konnte der Wildtypstamm quantitativ nicht nachgewiesen

Ergebnisse

60

werden. Im Jejunum schwankte die Belastung zwischen 102 und 105 KBE/g, das

Ileum war mit 104 bis 106 KBE/g besonders stark belastet und im Caecum konnten

zwischen 103 und 104 KBE/g, mit Ausnahme der einen negativen Probe, gefunden

werden. Auch das Colon war mit bis zu 106 KBE/g Organ sehr hoch belastet, nur in

einer Probe konnte der Wildtypstamm nicht nachgewiesen werden.

Im Gegensatz zum Wildtyp konnte die RovA-Stabilitätsmutante YE14 in allen

intestinalen Organ- und Tonsillenproben quantitativ nachgewiesen werden. Sie

wurde in den Tonsillen mit 102 bis 104 KBE/g Organ gefunden. Die Belastung des

Jejunums schwankte wie auch beim Wildtypstamm sehr stark (zwischen 101 und 105

KBE/g). Ileum (103 bis 106 KBE/g) und Colon (102 und 105 KBE/g) waren auch hier

besonders hoch belastet. Im Caecum fanden sich zwischen 102 und 104 KBE/g der

RovA-Stabilitätsmutante. Alle Zahlen sind im Anhang aufgelistet [vgl. H.4].

In den extraintestinalen Organen, wie den mesenterialen Lymphknoten, Leber, Milz

und Nieren, konnte weder der Wildtypstamm noch die Mutante quantitativ

nachgewiesen werden.

Im Student’s t-Test und Signed Rank Test konnten keine signifikanten Unterschiede

in der quantitativen Organbelastung (KBE/g Organ) durch den Wildtyp und die RovA-

Stabilitätsmutante nachgewiesen werden (Abb. 15).

Abb. 15: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 (YeO:3 wt) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovAP98). (Zeitpunkt der Probenahme am siebten Tag p.i., untersucht wurden insgesamt acht koinfizierte Ferkel, Angaben in log KBE/g Organ)

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Ergebnisse

62

Abb. 17: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel durch die RovA-Stabilitätsmutante YE14 (RovAP98) im Verhältnis zur Belastung durch den Wildtypstamm Y1 innerhalb desselben Tieres. (Zeitpunkt der Probenahme am siebten Tag p.i., untersucht wurden insgesamt acht koinfizierte Ferkel, Angaben als CI (competitive index))

Am 21. Tag nach der Infektion wurden nur im ersten Koinfektionsversuch vier Tiere

untersucht. Zu diesem Zeitpunkt konnte quantitativ nur in den Tonsillen eines Tieres

sowohl der Wildtyp als auch die Mutante nachgewiesen werden. Die Organbelastung

lag bei 3,17x104 KBE/g (Y1) und 1,5x104 KBE/g (YE14). Es konnte somit zwar kein

Unterschied zwischen den beiden Stämmen, jedoch ein starker Rückgang der

Organbelastung durch sowohl den Wildtypstamm als auch die RovA-

Stabilitätsmutante zwischen dem siebten und dem 21. Tag p.i. festgestellt werden.


Mit Hilfe der Kälteanreicherungstechnik konnten am siebten Tag p.i. sowohl der

Wildtypstamm Y1 als auch die RovA-Stabilitätsmutante YE14 aus allen vier Proben

von Tonsillen, Jejunum, Caecum, Colon und Ileum reisoliert werden. Eine Probe von

mesenterialen Lymphknoten konnte positiv auf Wildtyp und Mutante getestet werden,

in einer weiteren war nur die Mutante nachweisbar. Aus den vier Proben von Leber,

Milz und Nieren konnte keiner der beiden Stämme reisoliert werden. Die Daten zur

qualitativen Organbelastung der vier Tiere aus dem ersten Versuch waren nicht

auswertbar, daher beziehen sich diese Ergebnisse nur auf vier Tiere (Abb. 18 A).

Vom 21. Tag p.i. liegen ebenfalls qualitative Daten von jeweils vier Tieren vor. Zu

diesem Zeitpunkt war der Wildtypstamm Y1 in drei, die RovA-Stabilitätsmutante nur

Ergebnisse

63

in einer von vier Tonsillen nachweisbar. In Ileum, Caecum und Colon wurden

allerdings mehr Tiere positiv auf die Mutante getestet, als auf den Wildtyp. So fand

sich der Wildtypstamm Y1 nur in einer Caecum- und zwei Colonproben, die RovA-

Stabilitätsmutante hingegen in einer Ileum-, zwei Caecum- und drei Colonproben.

Das Jejunum und alle extraintestinalen Organe außer den Tonsillen wurden drei

Wochen nach der Infektion mit negativem Ergebnis auf Y. enterocolitica untersucht (Abb. 18 B).

Ergebnisse

64

Abb. 18: Qualitative Organbelastung mit Yersinia enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 (YeO:3) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovAP98) am siebten (A) und am 21. (B) Tag p.i.. Die Organproben wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht, die Isolate wurden biochemisch differenziert. Es wurden zu jedem Zeitpunkt Organproben von je vier Tieren ausgewertet.

A

B

Ergebnisse

65


Bis einschließlich zum siebten Tag p.i. wurden Daten zur bakteriellen Ausscheidung

von insgesamt zwölf Minipigs erhoben, vom zehnten bis zum 21. Tag p.i. beziehen

sich die Werte nur noch auf vier Tiere.

Einen Tag nach der Infektion konnte der Wildtypstamm Y1 in acht und die RovA-

Stabilitätsmutante in zehn von zwölf Rektaltupfern nachgewiesen werden. Am dritten

Tag p.i. wurden alle Proben positiv auf beide Stämme getestet, am siebten ebenfalls

bis auf eine Probe, in der der Wildtypstamm nicht nachweisbar war (Abb. 19). Am

zehnten Tag p.i. konnte die Mutante in allen vier, der Wildtypstamm in drei

Rektaltupfern nachgewiesen werden. Nach 14 Tagen konnten Wildtyp und Mutante

aus je drei Proben reisoliert werden, am 17. Tag p.i. war der Wildtypstamm in allen

vier, die Mutante in drei Proben nachweisbar. Drei Wochen nach der Infektion waren

wieder drei von vier Proben positiv in der Untersuchung auf beide Stämme.

Abb. 19: Bakterielle Ausscheidung mit den Faeces nach Koinfektion mit YeO:3 Stamm Y1 (YeO:3) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovAP98). Rektaltupfer wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht; die Isolate wurden biochemisch differenziert. Es wurden zwölf Tiere untersucht. Die Ergebnisse wurden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst.

Mit Hilfe des McNemar’s Test konnte kein signifikanter Unterschied bezüglich der

Ausscheidung zwischen dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 und der RovA-

Stabilitätsmutante YE14 nachgewiesen werden.

C.3.1.7

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Ergebnisse

66

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Ergebnisse

67

eine Tendenz, nach der die Mutante attenuiert war. Hinsichtlich der bakteriellen

Ausscheidung mit den Faeces konnte kein Unterschied zwischen den beiden

Stämmen beobachtet werden.

C.3.2 Koinfektionsversuche mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer PinvA∆IS1667- Mutante

Ähnlich wie im Koinfektionsversuch mit der RovA-Stabilitätsmutante (RovAP98)

wurden auch in diesem Versuch zuerst acht Mini-Lewe-Ferkel und in einem späteren

Versuch nochmals vier Minipigs mit je ca. 5x108 KBE des Wildtypstamms

(Stamm YE13, Y1 wt, KnR) und 5x108 KBE der Mutante (YE15, Y1 PinvA∆IS1667)

infiziert. Beide Stämme wurden zu einem Inokulum vermischt und oral verabreicht.

YE13 und YE15 sind mit dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 identisch, bis auf eine

Kanamycin-Resistenzkassette des Wildtypstamms YE13 und das fehlende

Insertionselement IS1667 im Invasin-Promotorbereich der Mutante YE15. Das

Insertionselement IS1667 bei Serotyp O:3 beinhaltet einen zusätzlichen Promotor

und führt dadurch zu einer erhöhten invA-Expression. Das Insertionselement IS1667

fehlt bei Serotyp O:8.

Der Versuchsaufbau entsprach bezüglich Tierzahlen, Sektionsterminen und

Untersuchungsmethoden dem vorigen Koinfektionsversuch (vgl. C.3.1). Die

Kontrolltiere waren mit den im Abschnitt C.3.1. beschriebenen identisch. In Tabellen

werden sie dennoch wieder aufgeführt, um den Vergleich mit Tieren der

Koinfektionsgruppe zu erleichtern.


In den Koinfektionsversuchen mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamm YE13 (wt)

und Stamm YE15 (PinvA∆IS1667- Mutante) traten bei der hämatologischen

Untersuchung der Tiere verschiedene unspezifische Veränderungen auf. Einige

Ferkel zeigten am siebten Tag p.i. auch Anzeichen einer akuten Entzündung. Fieber,

Diarrhoe oder andere klinische Symptome konnten jedoch nicht beobachtet werden

[vgl. H.1].

Ergebnisse

68





[vgl. H.2].





Kontrollgruppen auftraten [vgl. H.3].

Detaillierte Beschreibungen zu den klinischen, pathologisch-anatomischen und

histopathologischen Befunden befinden sich im Anhang [vgl. H.1, 2 und 3].


Am siebten Tag p.i. wurden Organproben von insgesamt acht Tieren auf den YeO:3

Wildtypstamm YE13 und die PinvA∆IS1667- Mutante YE15 untersucht. Am siebten

Tag p.i. konnte der Wildtypstamm quantitativ aus allen acht Tonsillenproben, vier

Jejunum-, fünf Ileum-, sieben Caecum-, fünf Colon- und einer Nierenprobe reisoliert

werden. Besonders hoch belastet war hierbei wiederum das Ileum mit bis zu

107 KBE/g, aber auch die anderen intestinalen Proben wiesen z.T. Belastungen von

bis zu 106 (Colon) oder 105 KBE/g (Jejunum, Caecum) auf. In den Tonsillen fanden

sich im Mittel 104 KBE/g des Wildtypstamms YE13.

Die PinvA∆IS1667- Mutante YE15 war am siebten Tag p.i. quantitativ in sechs von

acht Tonsillen-, zwei Jejunum-, vier Ileum-, sieben Caecum-, sechs Colon- und

ebenfalls einer Nierenprobe nachweisbar. Auch für die ∆IS1667-Mutante lag die

Belastung der Tonsillen zwischen 103 und 105 KBE/g, im Mittel bei 104 KBE/g Organ.

Nur im Ileum kam die PinvA∆IS1667-Mutante YE15 mit bis zu 106 KBE/g vor, in

Jejunum, Caecum und Colon konnten maximal 105 KBE/g gefunden werden. Die

Belastung der Niere eines Tieres lag bei 1,5x103 KBE/g des Wildtypstamms YE13

und 6,7x102 KBE der PinvA∆IS1667-Mutante.

Ergebnisse

69

Im Vergleich der direkten Organbelastung (KBE/g) aller Tiere konnten mithilfe des

Student’s t-Test und Signed Rank Test keine signifikanten Unterschiede durch den

Wildtypstamm YE13 und die PinvA∆IS1667- Mutante YE15 nachgewiesen werden

(Abb. 21).

Abb. 21: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit YeO:3 Stamm YE13 (YeO:3wt) und der PinvAIS1667-Mutante YE15 (YeO:3ΔIS1667). (Zeitpunkt der Probenahme am siebten Tag p.i., untersucht wurden insgesamt acht koinfizierte Ferkel, Angaben in log KBE/g Organ)

Am 21. Tag p.i. konnten sowohl der Wildtypstamm YE13 als auch die PinvA∆IS1667-

Mutante YE15 aus einer der drei Tonsillenproben, zwei Caecum- und einer

Colonprobe reisoliert und quantitativ bestimmt werden. Im Ileum wurde nur der

Wildtypstamm in einem der drei Minipigs quantitativ nachgewiesen. Weder der

Wildtypstamm noch die Mutante konnten zu diesem Zeitpunkt quantitativ in

Jejunumproben bestimmt werden. Die Belastung der Tonsillen, des Ileums und des

Colons lag um 103 KBE/g Organ durch beide Stämme, die des Caecums durch den

Wildtypstamm YE13 bei 4,5x101 und 2x103 KBE/g und durch die PinvA∆IS1667-

Mutante bei 1,8x103 und 3x102 KBE/g Organ. Alle Zahlen sind im Anhang aufgelistet

[vgl. H.4].

Hinsichtlich der RVR (engl.: relative virulence ratio) konnte im Ileum und Caecum

eine Attenuierung der PinvA∆IS1667-Mutante gegenüber dem Wildtypstamm YE 13

beobachtet werden, diese zeigte sich durch einen signifikanten Unterschied im

Student’s t-Test (**:P<0,01; ***:P<0,001) (Abb. 22).

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Ergebnisse

70

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Ergebnisse

71


In der Kälteanreicherung konnten vom siebten Tag p.i. nur die Daten von vier Tieren

ausgewertet werden. In allen Tonsillenproben konnte sowohl der wt-Stamm YE13 als

auch die PinvA∆IS1667-Mutante YE15 nachgewiesen werden. Im Jejunum war aus

einer Probe die Mutante, jedoch aus keiner der vier Proben der Wildtyp reisolierbar.

In den restlichen Darmabschnitten (Ileum, Caecum und Colon) konnte der Wildtyp

allerdings in einer größeren Anzahl von Proben gefunden werden als die Mutante. So

wurde der Wildtypstamm YE13 in diesen drei Darmabschnitten jeweils aus drei von

vier Proben reisoliert, die Mutante hingegen nur aus je einer Ileum- und

Caecumprobe sowie aus zwei Colonproben. In den extraintestinalen Organproben

(mesenteriale Lymphknoten, Leber, Milz, Nieren) konnten in der Kälteanreicherung

keine Yersinien nachgewiesen werden. Lediglich aus einem der vier mesenterialen

Lymphknoten konnte die PinvA∆IS1667-Mutante YE15 reisoliert werden. In einer

Nierenprobe konnte der Wildtypstamm YE13 gefunden werden (Abb. 24 A).

Am 21. Tag p.i. wurden nur drei der vier infizierten Ferkel seziert, da ein Tier vorzeitig

nach einer Blutentnahme verstorben war. Zu diesem Zeitpunkt konnte der

Wildtypstamm YE13 nur noch aus einer der drei Tonsillenproben reisoliert werden,

die PinvA∆IS1667-Mutante YE 15 wurde in keiner Tonsillenprobe nachgewiesen. Auch

aus dem Ileum konnte der Wildtypstamm YE13 aus zwei, die PinvA∆IS1667-Mutante

YE15 nur aus einer von drei Proben reisoliert werden. Im Dickdarm war das

Verhältnis zwischen Wildtyp und Mutante umgekehrt, hier fand sich der

Wildtypstamm YE13 in zwei Caecum- und einer Colonprobe, die PinvA∆IS1667-

Mutante YE15 hingegen in allen drei Caecum- und in zwei Colonproben. Im Jejunum

und den extraintestinalen Organen konnten weder der Wildtyp noch die Mutante

nachgewiesen werden (Abb. 24 B).

Ergebnisse

72

Abb. 24: Qualitative Organbelastung mit Yersinia enterocolitica Serotyp O:3 Stamm YE13 (YeO:3 wt) und der PinvAIS1667-Mutante YE15 (YeO:3ΔIS1667) am siebten (A) und am 21. (B) Tag p.i.. Die Organproben wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht, die Isolate wurden biochemisch differenziert. Es wurden am 7. Tag p.i. Organproben von vier und am 21. Tag p.i. von drei Tieren ausgewertet.

A

B

Ergebnisse

73


Am ersten Tag nach der oralen Infektion wurden Rektaltupfer von zwölf Tieren

untersucht. Bis einschließlich zum siebten Tag p.i. konnten Daten zur bakteriellen

Ausscheidung von insgesamt elf Minipigs erhoben werden. Vom zehnten bis zum 21.

Tag p.i. beziehen sich die Werte nur noch auf vier Tiere. Das Fehlen eines Tieres ist

durch den subakuten Tod eines Ferkels nach der Blutentnahme am ersten Tag p.i.

begründet. Die Rektaltupfer und Kotproben wurden mittels Kälteanreicherung

untersucht.

Einen Tag nach der Infektion konnte der Wildtypstamm YE13 in neun und die

PinvA∆IS1667-Mutante YE15 in zehn von zwölf Tupferproben nachgewiesen werden.

Am dritten Tag p.i. fand sich der Wildtypstamm in sieben, die Mutante in sechs der

elf Proben. Am siebten Tag p.i. konnte der Wildtypstamm aus zehn und die Mutante

aus neun von elf Rektaltupfern reisoliert werden (Abb. 25).

Abb. 25: Bakterielle Ausscheidung mit den Faeces nach Koinfektion mit YeO:3 Stamm YE13 (YeO:3 wt) und der PinvAΔIS1667-Mutante YE15 (YeO:3 ΔIS1667). Rektaltupfer wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht, die Isolate wurden biochemisch differenziert. Am ersten Tag p.i. wurden zwölf Tiere untersucht, ab dem dritten Tag p.i. elf Tiere. Die Ergebnisse wurden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst.

Mit Hilfe des McNemar’s Test konnte kein signifikanter Unterschied bezüglich der

Ausscheidung zwischen dem Wildtypstamm YE13 und der PinvA∆IS1667-Mutante

YE15 nachgewiesen werden.

Am zehnten Tag p.i. konnte der Wildtypstamm YE13 in allen drei, die Mutante nur in

zwei der Proben nachgewiesen werden. Nach zwei Wochen war in drei von drei

Proben der Wildtypstamm und in zwei von drei Proben die PinvA∆IS1667-Mutante

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Ergebnisse

74

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Ergebnisse

75

Fazit:

Hinsichtlich der qualitativen Organbelastung und der bakteriellen Ausscheidung mit

den Faeces war keine Attenuierung der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 zu erkennen.

Auch im direkten Vergleich der Organbelastung aller Tiere in absoluten Zahlen

konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Jedoch zeigte sich eine

Attenuierung der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 in den relativen Werten (unter

Berücksichtigung des Anteils der Mutante am Inokulum (RVR)). Die Attenuierung der

PinvA∆IS1667-Mutante konnte noch deutlicher im direkten Vergleich mit dem

Wildtypstamm YE13 innerhalb eines Tieres beobachtet werden (CI).

C.3.3 Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer ∆invA-Mutante

Um herauszufinden, welche Auswirkungen der Virulenzfaktor Invasin auf die

Kolonisation bzw. Infektion hat, wurden Koinfektionsversuche mit dem Serotyp O:3

Wildtypstamm Y1 und einer invA-Knockout-Mutante (ΔinvA YE21) durchgeführt.

Alle Minipigs wurden oral mit je 5x108 KBE des YeO:3 Wildtypstamms Y1 und der

ΔinvA-Mutante YE21 infiziert. Beide Stämme wurden zu einem Inokulum vermischt.

In einem ersten Koinfektionsversuch wurden acht Minipigs oral infiziert und am

siebten Tag p.i. euthanasiert und seziert. Von diesen wurde ein Tier von der

Auswertung ausgeschlossen, da Y. enterocolitica aus einem Rektaltupfer vom Tag

der Einstallung nachgewiesen wurde. Zudem wurden aus diesem Versuch zu den

vorherigen Ergebnissen widersprüchliche Daten bezüglich der quantitativen

Organbelastung erhalten. Daher wurde der Koinfektionsversuch mit zehn Minipig-

Ferkeln wiederholt, von denen eines am Tag nach der Einstallung nach erfolgter

Blutentnahme perakut verstarb. Somit verblieben neun Tiere für die quantitative

Auswertung der Organbelastung. Alle Tiere wurden am siebten Tag p.i. seziert, eine

Untersuchung einer Teilmenge der Tiere am 21. Tag p.i. wurde nicht vorgenommen.

Die klinischen, pathologisch-anatomischen und histopathologischen Befunde der

Kontrolltiere entsprechen den im Abschnitt C.3.1. und C.3.2. beschriebenen und

werden daher nachfolgend nicht im Text erwähnt. Die Proben von Ileum und

mesenterialen Lymphknoten wurden nur während des ersten Koinfektionsversuchs

histopathologisch untersucht. Eine hämatologische und serologische Untersuchung

Ergebnisse

76

der Tiere fand aufgrund der Annahme einer erhöhten Stressempfindlichkeit bei

Blutentnahmen nicht mehr statt.


Die Versuchstiere zeigten nur vereinzelt minimale bis leichte Anzeichen einer

Diarrhoe. Ein Tier fiel zweimalig mit leichtem Husten auf. Bei keinem der Ferkel

konnte Fieber festgestellt werden [vgl. H.1].


In der Sektion am siebten Tag p.i. zeigten sich die Versuchstiere eher unauffällig.

Nur wenige unspezifische Befunde konnten erhoben werden [vgl. H.2].





Kontrollgruppen auftraten. Insbesondere die mesenterialen Lymphknoten waren

histologisch bis auf eine leichte lymphatische Hyperplasie unauffällig [vgl. H.3].

Detaillierte Beschreibungen zu den klinischen, pathologisch-anatomischen und



Am siebten Tag p.i. wurden Organe von insgesamt 16 Tieren auf den Wildtypstamm

Y1 und die ΔinvA-Mutante YE21 untersucht. Die quantitativen Ergebnisse des ersten

Koinfektionsversuchs wichen hinsichtlich der Belastung mit dem Wildtypstamm Y1

sehr stark von allen bisherigen Ergebnissen ab. Daher wurden sie in der statistischen

Auswertung nicht erfasst und der Versuch wiederholt. Im ersten Versuch konnte die

ΔinvA-Mutante YE21 ausschließlich aus den Tonsillen reisoliert werden. Abgesehen

von dem Ileum und Caecum je eines von sieben Tieren konnte jedoch auch der

Wildtypstamm Y1 nur in den Tonsillen quantitativ nachgewiesen werden. Eine

Ergebnisse

77

Erklärung für diese Abweichung von den vorherigen Beobachtungen konnte nicht

gefunden werden. Im zweiten Koinfektionsversuch war Wildtypstamm Y1 in allen

neun Proben von Tonsillen, Ileum und Colon quantitativ nachweisbar. Ebenso in fünf

der neun Jejunum-, acht Caecum-, einer Darmlymphknoten- und einer Milzprobe. Die

ΔinvA-Mutante YE21 hingegen konnte insgesamt aus weniger Proben und in

geringeren Zahlen reisoliert werden. So fand sie sich in acht Tonsillen-, einer

Jejunum-, fünf Ileum- und je sieben Caecum- und Colonproben. In den

extraintestinalen Organen konnte die ΔinvA-Mutante YE21 quantitativ nicht

nachgewiesen werden. Die Belastung durch den Wildtypstamm Y1 schwankte in den

Tonsillen zwischen 102 und 105 KBE/g Organ, die durch die ΔinvA-Mutante YE21

sogar zwischen 101 und 105 KBE/g. Das Jejunum war im Mittel mit 104 KBE/g des

YeO:3 Wildtyps und nur in einer Probe sehr gering (38,5 KBE/g) mit der Mutante

belastet. Das Ileum war auch in diesem Infektionsversuch wieder besonders hoch

belastet mit bis zu 106 KBE/g des Wildtypstamms Y1 und 105 KBE/g der ΔinvA-

Mutante YE21. Im Caecum lag die Belastung durch den Wildtypstamm Y1 um 104

KBE/g und durch die ΔinvA-Mutante YE21 um 103 KBE/g. Das Colon war durch den

Wildtypstamm Y1 in etwa ebenso hoch belastet wie das Ileum (bis zu 106 KBE/g), die

Belastung durch die ΔinvA-Mutante YE21 fiel wesentlich geringer aus (bis zu 103

KBE/g). In einer Probe der Lnn. jejunales konnte der Wildtypstamm Y1 mit 3,27x103

und in einer Milzprobe mit 1,59x105 KBE/g Organ nachgewiesen werden. Abgesehen

von den Tonsillen lag die Belastung durch die ΔinvA-Mutante YE21 in allen Proben

unterhalb der durch den Wildtypstamm Y1. Alle Zahlen sind im Anhang aufgelistet

[vgl. H.4].

Dennoch konnte bezüglich der KBE/g Organ im student’s t-Test kein signifikanter

Unterschied zwischen der Belastung durch den Wildtypstamm Y1 und der durch die

ΔinvA-Mutante YE21 festgestellt werden (Abb. 27).

Abb. 27Minipig-Untersucp.i., Ang

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Ergebnisse

78

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Ergebnisse

79

Der Unterschied zeigte sich auch im „competitive index“ (CI), in dem die Belastung

durch die ΔinvA-Mutante YE21 zu der durch den Wildtypstamm Y1 innerhalb

desselben Tieres ins Verhältnis gesetzt wird (one sample t-Test, P<0.001) (Abb. 29).

Abb. 29: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel durch die ΔinvA-Mutante YE21 (YeO:3 ΔinvA) im Verhältnis zur Belastung durch den Wildtypstamm Y1 innerhalb desselben Tieres. Untersucht wurden insgesamt neun koinfizierte Ferkel. (Zeitpunkt der Probenahme am siebten Tag p.i., Angaben als CI (competitive index))


Die qualitative Untersuchung der Organproben vom siebten Tag p.i. mittels

Kälteanreicherung ergab im ersten Koinfektionsversuch einen deutlichen Unterschied

zwischen dem Wildtypstamm Y1 und der ΔinvA-Mutante YE21. Der Wildtypstamm

Y1 konnte in diesem Versuch aus fünf von sieben Tonsillen- und je vier Jejunum-,

Ileum-, Caecum- und Colonproben reisoliert werden. Die ΔinvA-Mutante YE21

hingegen konnte zwar ebenfalls in fünf Tonsillenproben, jedoch nur in jeweils einer

Ileum- und Caecumprobe und nicht in Proben von Jejunum und Colon nachgewiesen

werden (Abb. 30 A).

Im zweiten Koinfektionsversuch wurden alle neun Tonsillenproben mit positivem

Ergebnis sowohl auf den Wildtypstamm Y1 als auch auf die ΔinvA-Mutante YE21

untersucht. Der Wildtypstamm Y1 konnte zudem aus sechs Jejunum-, allen neun

Ileum-, je acht Caecum- und Colon-, drei Darmlymphknoten- und einer Milzprobe

reisoliert werden. Die ΔinvA-Mutante YE21 war hingegen nur in einer der neun

Jejunumproben nachweisbar. Sie konnte in sechs Ileum-, sieben Caecum- und, wie

der Wildtypstamm Y1, in acht Colonproben nachgewiesen werden und wurde zudem

Ergebnisse

80

auch in einer Probe der mesenterialen Lymphknoten gefunden (Abb. 30 B).

Insgesamt stellte sich der Unterschied zwischen den beiden eingesetzten Stämmen

in der qualitativen Organbelastung im zweiten Koinfektionsversuch weniger deutlich

dar als im ersten Versuch.

Fasst man die Ergebnisse der beiden Versuche zusammen, zeigt sich allerdings

noch immer eine deutliche Attenuierung der ΔinvA-Mutante YE21 gegenüber dem

Wildtypstamm Y1 hinsichtlich der Besiedlung der verschiedenen intestinalen und

extraintestinalen Organe. Im McNemar’s Test konnte ein signifikanter Unterschied in

der Häufigkeit der Organbesiedlung zwischen der invA-Mutante und dem Wildtyp

festgestellt werden. Signifikante Unterschiede fanden sich in der qualitativen

Belastung des Jejunums (P< 0,01), des Ileums (P< 0,05), des Caecums (P< 0,05)

und des Colons (P<0,05) (Abb. 30 C).

Ergebnisse

81

A

B

Ergebnisse

82

Abb. 30: Qualitative Organbelastung mit Yersinia enterocolitica Serotyp O:3 Wildtypstamm Y1 (YeO:3 wt) und der ΔinvA-Mutante YE21 (YeO:3 ΔinvA) am siebten Tag p.i.. Die Organproben wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht, die Isolate wurden biochemisch differenziert. Es wurden in einem ersten Koinfektionsversuch (A) Organproben von sieben und in einem zweiten Versuch (B) von neun Tieren ausgewertet. In Teil C wurden die Ergebnisse aus beiden Versuchen zusammengefasst.


Vom ersten bis zum siebten Tag p.i. wurden Rektaltupfer von insgesamt 16 Tieren untersucht, auch hier werden allerdings zunächst die Ergebnisse der beiden Koinfektionsversuche getrennt betrachtet. Die bakterielle Ausscheidung der beiden Bakterienstämme zeigte, wie auch bei der qualitativen Organbelastung, im ersten Infektionsversuch größere Unterschiede als im zweiten. In ersterem konnte der Wildtypstamm Y1 mittels Kälteanreicherung am ersten Tag p.i. aus drei, am dritten Tag p.i. aus vier und am siebten Tag p.i. aus fünf von sieben Rektaltupfern reisoliert werden, die ΔinvA-Mutante YE21 hingegen nur am ersten Tag aus zwei, am dritten Tag aus einem und am siebten Tag p.i. aus keinem der sieben Rektaltupfer ( Abb. 31 A). Im zweiten Koinfektionsversuch konnten von den neun am ersten Tag p.i. genommenen Rektaltupfern sowohl der Wildtypstamm Y1, als auch die ΔinvA-Mutante YE21 aus je sieben Proben reisoliert werden. Am dritten Tag p.i. fand sich der Wildtypstamm Y1 erneut in sieben von neun Tupferproben. Die ΔinvA-Mutante YE21 konnte nur in vier Proben nachgewiesen werden. Am siebten Tag p.i. konnte der Wildtypstamm Y1 aus allen, die ΔinvA-Mutante YE21 aus acht der neun Rektaltupfer reisoliert werden ( Abb. 31 B). Auch diese Ergebnisse wurden zusätzlich aus beiden Versuchen zusammengefasst (

C

Ergebnisse

83

Abb. 31 C). Ein Nachteil der ΔinvA-Mutante YE21 gegenüber dem Wildtypstamm Y1

zeigte sich hinsichtlich der bakteriellen Ausscheidung in unterschiedlich starker

Ausprägung in beiden Versuchen.

Mit Hilfe des McNemar’s Test konnte ein signifikanter Unterschied bezüglich der

Ausscheidung zwischen dem Wildtypstamm Y1 und der ∆invA-Mutante YE21 am

dritten und am siebten Tag p.i. nachgewiesen werden (P<0,05).

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Ergebnisse

84

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Ergebnisse

85

Fazit:

Die Ergebnisse der Koinfektionsversuche mit dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 und der

ΔinvA-Mutante YE21 zeigen eine deutlich geringere Kolonisation der Organe durch

die ΔinvA-Mutante YE21 im Vergleicht mit dem Wildtypstamm Y1 und geben dadurch

einen Hinweis darauf, dass der Virulenzfaktor Invasin bei der Kolonisation und

Infektion von Schweinen durch Yersinia enterocolitica eine wichtige Rolle spielt.

C.4 Vergleichende Betrachtung der Ergebnisse aus Infektionsversuchen im Maus- und Minipig-Modell

Abschließend wurde die Kolonisation und Infektion mit Y. enterocolitica in den beiden

Wirtsspezies Schwein und Maus vergleichend betrachtet. Hierzu wurden die zuvor

aus dem Minipigmodell gewonnenen Ergebnisse mit Daten aus Infektionsversuchen

im Mausmodell verglichen. Im Rahmen der Kooperation mit Prof. Dr. Petra Dersch

aus der Arbeitsgruppe Molekulare Infektionsbiologie am Helmholtz Zentrum für

Infektionsforschung (HZI) wurden parallel zu den Infektionsversuchen im

Minipigmodell am HZI in Braunschweig vergleichbare Versuche im Mausmodell

durchgeführt. Diese fanden im Rahmen des PhD-Projekts von Julia Schaake, M.Sc.

statt.

Die folgende Betrachtung beschränkt sich auf die quantitative Organbelastung.Eine

qualitative Untersuchung mittels Kälteanreicherung wurde im Mausmodell nicht

durchgeführt. Auch klinische, pathologische und serologische sowie Untersuchun-

gen der bakteriellen Ausscheidung fanden im Mausmodell nicht statt.

Da Mäuse natürlicherweise keine Tonsillen haben, konnten diese im Mausmodell

nicht untersucht werden. Ein weiterer anatomischer Unterschied besteht zwischen

Mäusen und Schweinen in der Morphologie des lymphatischen Gewebes im Ileum.

Während die Peyerschen Platten bei der Maus etwa stecknadelkopfgroß und leicht

herauszupräparieren sind, erstreckt sich das lymphatische Gewebe beim Schwein

über die gesamte Länge des Ileums. Die Peyerschen Platten wurden daher im

Mausmodell isoliert untersucht und fielen im Minipigmodell mit in die Untersuchung

der Ileumproben.

Ein weiterer Unterschied zwischen den beiden Tiermodellen bestand hinsichtlich der

Art der Applikation der Bakteriensuspension. Während den Minipigs das Inokulum

mithilfe einer Spritze direkt in die Maulhöhle appliziert wurde, bekamen die Mäuse

Ergebnisse

86

ihre Infektionsdosis über eine Knopfkanüle in den Magen eingegeben. Außerdem

bestanden die Minipig-Tiergruppen aus kastrierten männlichen und weiblichen

Tieren, die Mausgruppen hingegen nur aus weiblichen Tieren. Die Sektion der

Schweine fand am siebten Tag p.i. statt. Die Mäuse mussten aus Tierschutzgründen

schon am dritten Tag p.i. euthanasiert und seziert werden, da sie – im Gegensatz zu

den Ferkeln - nach einer Infektion mit YeO:8 Stamm 8081v sehr ausgeprägte

klinische Symptome zeigten.

C.4.1 Vergleich der Infektionsstudien mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 und O:8 Stämmen

Die experimentellen Infektionen wurden mit YeO:3 Stamm Y1 und YeO:8 Stamm

8081v durchgeführt. Im Minipigmodell wurden in jeder Gruppe zehn Mini-Lewe-

Ferkel mit 109 KBE/Tier infiziert und am siebten Tag p.i. seziert [vgl. C.2]. Im

Mausmodell wurden pro Gruppe zehn weibliche BALB/c-Mäuse mit je 5x108 KBE

infiziert und am dritten Tag p.i. seziert.

In der quantitativen Organbelastung wiesen die Ergebnisse aus den beiden Modellen

große Unterschiede auf. Während der YeO:8 Stamm 8081v im Minipigmodell

ausschließlich in den Tonsillen nachgewiesen werden konnte und unfähig schien,

den Darmtrakt der Ferkel zu kolonisieren, war die Belastung aller untersuchten

Darmabschnitte und der Peyerschen Platten im Mausmodell durch beide Serotypen

in etwa gleich hoch (Abb. 32).

Ergebnisse

87

Abb. 32: Quantitative Organbelastung mit YeO:3 Stamm Y1 oder YeO:8 Stamm 8081v nach oraler Infektion im Minipig- (A) und Mausmodell (B). Die Probenahme am fand am dritten (B, Maus) bzw. siebten (A, Schwein) Tag p.i. statt. Jeder Punkt repräsentiert den Logarithmus der KBE/g Organ eines Tieres. In jeder Infektionsgruppe wurden zehn Tiere untersucht. Die Ergebnisse wurden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. Alle Versuche im Mausmodell wurden durchgeführt von Julia Schaake, M.Sc.. (Infektionsdosis: 109 KBE/Tier (A, Schwein) bzw. 5x108 KBE/Tier (B, Maus))

C.4.2 Vergleich der Koinfektionsstudien mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtyp und Mutanten mit invA-assoziierten Gendefekten

Auch die Koinfektionsstudien wurden sowohl im Minipig- als auch im Mausmodell

durchgeführt. Hierbei sollten wirtsspezifische Unterschiede hinsichtlich der

Auswirkungen der invA-Expression auf die Fähigkeit zur Kolonisation und Infektion

durch Y. enterocolitica untersucht werden.

Die Ergebnisse aus dem Minipigmodell stammen aus der vorliegenden Arbeit, die

Resultate aus Studien im Mausmodell hingegen aus dem Ph.D.-Projekt von Julia

Schaake, M.Sc.. Die eingesetzten Bakterienstämme wurden im Abschnitt C.3.

beschrieben. In jeder Koinfektionsstudie wurden acht Minipigs [vgl. C.3] bzw. zehn

BALB/c-Mäuse infiziert. Die Infektionsdosis betrug bei den Schweinen insgesamt 109

KBE/Tier (je 5x108 KBE YeO:3 Wildtyp + Mutante) und bei den Mäusen 5x108 KBE

(je 2,5x108 KBE YeO:3 Wildtyp + Mutante).

Ergebnisse

88

C.4.2.1 Vergleich der Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer RovA-Stabilitätsmutante

In den Koinfektionsversuchen, in denen der YeO:3 Wildtypstamm Y1 mit der RovA-

Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovAP98) verglichen wurde, konnte sowohl im

Minipig- als auch im Mausmodell ein signifikanter Unterschied in der Organbelastung

nur im Ileum beobachtet werden. Dieser war nicht in Bezug auf die KBE/g Organ

feststellbar, hinsichtlich der RVR (relative virulence ratio) im Schwein ausgeprägter

als in der Maus, und im CI (competitive index) war nur im Minipigmodell ein

signifikanter Unterschied zwischen dem Wildtypstamm Y1 und der RovA-

Stabilitätsmutante YE14 feststellbar (Abb. 33). Der signifikante Unterschied zwischen

der RovA-Stabilitätsmutante und dem Wildtypstamm in der RVR war zudem

gegensätzlich in den beiden Tiermodellen. Während die RovA-Mutante im Schwein

einen Nachteil in der Besiedlung des Ileums zeigte [vgl. C.3.1], konnte im

Mausmodell ein Vorteil der Mutante festgestellt werden.

Abbildu

ung 33: Fortssetzung undd Beschriftu

Ergebnisse

89

ung auf der ffolgenden SSeite

Ergebnisse

90

Fortsetzung Abbildung 33:

Abb. 33: Vergleich der Organbelastungen im Minipig- (A, C, E) und Mausmodell (B, D, F). Es wurden insgesamt acht (Schwein) bzw. zehn Tiere (Maus) untersucht. Die Ergebnisse wurden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. Alle Versuche im Mausmodell wurden durchgeführt von Julia Schaake, M.Sc.. (Darstellung der quantitativen Organbelastung mit dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 (YeO:3 wt) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovAP98) als log KBE/g (A, B), log relative virulence ratio (C, D) und competitive index (E, F))

C.4.2.2 Vergleich der Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer PinvAΔIS1667-Mutante

In Koinfektionsstudien mit dem YeO:3 Wildtypstamm YE13 und der PinvAΔIS1667-

Mutante YE15 konnte, wie auch in den zuvor beschriebenen Versuchen mit der

RovA-Stabilitätsmutante YE14 , in Bezug auf die KBE/g Organ im student’s t-Test

kein signifikanter Unterschied zwischen dem Wildtypstamm YE13 und der

PinvAΔIS1667-Mutante YE15 nachgewiesen werden. In der RVR konnte ein Nachteil

der RovA-Stabilitätsmutante YE14 gegenüber dem Wildtystamm YE13 im

Minipigmodell im Ileum (P<0.01) und im Caecum (P<0.001), im Mausmodell nur im

Caecum (P<0.05) gezeigt werden. Mithilfe des CI wurde im one sample t-Test im

Schwein ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Stämmen im Jejunum,

Ileum, Colon (P<0.05) und Caecum (P<0,001) nachgewiesen [vgl. C.3.2], während

ein solcher in der Maus nicht zu beobachten war (Abb. 34).

Abbildu


Ergebnisse

91


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Ergebnisse

93


Ergebnisse

94

Fortsetzung Abbildung 35:

Abb. 35: Vergleich der Organbelastungen im Minipig- (A, C, E) und Mausmodell (B, D, F). Es wurden insgesamt acht (Schwein) bzw. zehn Tiere (Maus) untersucht. Die Ergebnisse wurden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. Alle Versuche im Mausmodell wurden durchgeführt von Julia Schaake, M.Sc.. (Darstellung der quantitativen Organbelastung mit dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 (YeO:3 wt) und der ΔinvA-Mutante YE15 (YeO:3 ΔinvA) als log KBE/g (A, B), relative virulence ratio (C, D) und competitive index (E, F))

Fazit:

Es waren deutliche Unterschiede zwischen Ergebnissen aus dem Minipig- und dem

Mausmodell zu beobachten.

Die Serotypen O:3 und O:8 verhalten sich gegensätzlich in den beiden Wirtsspezies.

Während YeO:8 in der Maus hoch virulent ist, verursachen beide Serotypen im

Schwein keine klinisch manifeste Erkrankung. Allerdings findet durch YeO:3 eine

Infektion, durch YeO:8 nur eine Kolonisation der Minipigs statt. Im Mausmodell

konnten im Gegensatz zum Schwein keine Unterschiede in der Organbelastung

durch die beiden Serotypen beobachtet werden.

Es konnte gezeigt werden, dass der Virulenzfaktor Invasin für die Infektion mit

Y. enterocolitica Serotyp O:3 sowohl in der Maus als auch im Schwein eine wichtige

Rolle spielt. Allerdings ergaben die Koinfektionsversuche auch Hinweise darauf, dass

das stabilere RovA und das Insertionselement IS1667 des Serotyps O:3 im Schwein

von größerer Bedeutung sind als in der Maus.

Diskussion

95

D Diskussion

Yersinia (Y.) enterocolitica spielt als ein durch Nahrungsmittel übertragbarer

Zoonoseerreger eine nicht zu unterschätzende Rolle im Verbraucherschutz und in

der Lebensmittelhygiene sowohl in Deutschland als auch in Europa, den USA,

Kanada und Japan (Tauxe et al., 1987; Fredriksson-Ahomaa et al., 2001a;

Fredriksson-Ahomaa et al., 2001b; Fukushima et al., 1983; Gürtler et al., 2005;

Thibodeau et al., 1999; Bhaduri et al., 2005). Die größte Bedeutung als

Krankheitserreger hat der Bioserotyp 4/O:3 (Rosner et al., 2010; Batzilla et al.,

2011a). Dieser ist nicht nur in humanen Patienten, sondern auch in

Schweinebeständen der am häufigsten vorkommende Serotyp (Fukushima et al.,

1983; Bottone, 1999; von Altrock et al., 2006). Das Schwein gilt als Reservoirwirt und

rohes Schweinefleisch als Hauptinfektionsquelle für den Menschen (Fredriksson-

Ahomaa et al., 2006b). Während die Yersinien Schweine symptomlos kolonisieren,

kommt es im Gegensatz dazu beim Menschen zu einer klinisch manifesten Infektion.

Die molekularen Grundlagen für das unterschiedliche Verhalten von Y. enterocolitica

im Schwein und im Menschen sind weitgehend unbekannt. Für wissenschaftliche

Untersuchungen dieser Mechanismen sind weitergehende Studien im natürlichen

Wirtsorganismus erforderlich.

Etablierung des Infektionsmodells Obwohl Schweine anatomisch dem Menschen in vielerlei Hinsicht ähneln, bestehen

im Gastrointestinaltrakt auch Unterschiede, wie z.B. in der Ausprägung der

Peyerschen Platten, die beim Schwein über die gesamte Länge des Ileums

verlaufen, bei Menschen hingegen als einzeln umschriebene Ansammlungen von

Lymphfollikeln vorkommen. Allerdings besitzen Schweine, wie auch Menschen,

Tonsillen, die in der Maus natürlicherweise fehlen (Meurens et al., 2012). Inwiefern

diese anatomischen Unterschiede sich auf die Kolonisation und Infektion durch

Y. enterocolitica auswirken, ist noch nicht erforscht.

Bisher im Schwein durchgeführte experimentelle Infektionen (Fukushima et al., 1984;

Robins-Browne et al., 1985; Schiemann, 1988; Thibodeau et al., 1999; Thibodeau et

al., 2001; Nielsen et al., 1996; Platt-Samoraj et al., 2009a) variieren methodisch stark

bezüglich des Alters und Immunstatus der Versuchstiere, der Infektionsdosen, der

Diskussion

96

eingesetzten Bakterienstämme sowie der kulturellen und molekularbiologischen

Nachweismethoden.

Vor diesem Hintergrund sollte im ersten Teil der vorliegenden Dissertation ein

Infektionsmodell für Y. enterocolitica in Minipigs etabliert werden. In einem ersten

Vorversuch mit Y. enterocolitica Bioserotyp 4/O:3 wurden verschiedene orale

Infektionsdosen getestet, um eine optimale Infektionsdosis zu ermitteln. Das Ziel war

es, eine symptomlose Kolonisation der Tonsillen und des Darmtrakts zu initiieren,

ohne eine klinisch manifeste Erkrankung auszulösen, da dieses dem natürlichen

Vorgang in Schweinemastbeständen entspricht. Die drei getesteten Dosen von 108,

109 und 1010 KBE pro Tier wurden in Anlehnung an bereits publizierte

Infektionsdosen und mit dem Kot ausgeschiedene Bakterienmengen ausgewählt

(Fukushima et al., 1984; Robins-Browne et al., 1985; Schiemann, 1988; Thibodeau

et al., 1999; Thibodeau et al., 2001; Nielsen et al., 1996; Platt-Samoraj et al., 2009a).

Da ein fäkal-oraler Übertragungsweg und eine Persistenz in den Tonsillen

angenommen werden, wurde der orale Infektionsweg mittels Applikation in die

Maulhöhle gewählt. Um den natürlichen Infektionsvorgang zu simulieren, wurde auf

eine zusätzliche Gabe von Bicarbonat, die nach Fukushima et al. (1984) die

Ausscheidungsmenge mit den Faeces erhöht, verzichtet.

Sowohl nach einer Infektion mit 1010 als auch nach einer solchen mit 109 oder 108

KBE des Y. enterocolitica Serotyp O:3 (YeO:3) Stamms Y1 konnte eine

Kolonisierung der Tonsillen und der verschiedenen Darmabschnitte am siebten Tag

p.i. beobachtet werden. Auch eine Ausscheidung der Bakterien mit den Faeces fand

vom ersten bis zum siebten Tag p.i. statt. In der höchsten Dosisgruppe (1010 KBE)

konnten die Bakterien zusätzlich zu Tonsillen und Darmproben auch aus

Lymphknoten, Leber und Milz reisoliert werden. Daher wurden alle weiteren

experimentellen Infektionsstudien mit einer oralen Infektionsdosis von 109 KBE

durchgeführt, um das Risiko einer klinisch manifesten Erkrankung möglichst gering

zu halten. Obwohl die Tierzahlen des Vorversuchs mit jeweils drei Tieren pro Gruppe

zu gering waren, um eine statistisch absicherbare Aussage treffen zu können, geben

sie zumindest Anhaltspunkte dafür, dass die Ausprägung einer generalisierten

Infektion mit Y. enterocolitica abhängig von der Höhe der Infektionsdosis zu sein

scheint [vgl. C.1.1]. Die rein qualitativ ermittelte Ausscheidung mit den Faeces zeigte

allerdings keine deutlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Dosisgruppen [vgl.

C.1.1.4].

Diskussion

97

Diese Ergebnisse stimmen mit Beobachtungen aus früheren Infektionsversuchen

überein. So konnte eine Kolonisation der Tonsillen und des Darms festgestellt

werden, ohne dass die Tiere klinische Symptome zeigten. Diese Beobachtungen

machten auch Schiemann (1988), Nielsen (1996) und Thibodeau et al. (1999 und

2001). Robins-Browne et al. (1985) fanden pathologisch-anatomische

Veränderungen im Darmtrakt und konnten ernste klinische Symptome bis hin zu

einem letalen Verlauf in Abhängigkeit von der Infektionsdosis in gnotobiotischen

Ferkeln beobachten. Diese Ergebnisse sind allerdings nicht auf Ferkel mit normalem

Immunstatus übertragbar. Auch der von Brügmann et al. (2001) berichtete Fall einer

letalen Septikämie bei einem Minipig-Ferkel ist eher als Einzelfall einzustufen.

In einem weiteren orientierenden Vorversuch wurde der Infektionsverlauf nach einer

oralen Infektion mit 109 KBE des YeO:3 Stamms Y1 über einen Zeitraum von 21

Tagen untersucht. Auch wenn die Tierzahlen (n=3) pro Untersuchungszeitpunkt zu

gering für eine statistische Auswertung waren, so konnte dennoch ein deutlicher

Rückgang der Organbelastung der Schweine mit YeO:3 Stamm Y1 im Verlauf der

Infektion zwischen dem siebten und dem 21. Tag p.i. beobachtet werden. Dieser

Rückgang zeigte sich in den Proben der Darmabschnitte und auch in denen der

extraintestinalen Organe, in denen am 14. und 21. Tag p.i. keine Yersinien

nachgewiesen werden konnten, jedoch nicht in den Tonsillen. Diese Beobachtung

bestätigt die Annahme einer Persistenz der Bakterien in den Tonsillen (Thibodeau et

al., 1999; Gürtler et al., 2005). Zudem wurde der siebte Tag p.i. als ein günstiger

Untersuchungszeitpunkt identifiziert, da im weiteren Verlauf der Infektion die

Organbelastung durch Y. enterocolitica stark nachließ.

Die Ausscheidung mit dem Kot zeigte einen zum letzten Untersuchungszeitpunkt

intermittierenden Verlauf, war aber vom ersten Tag bis zu drei Wochen nach der

oralen Infektion nachweisbar. Ähnliches berichteten auch Fukushima et al. (1984),

Schiemann (1988) und Nielsen (1996). Eine weitere Arbeitsgruppe berichtete sogar

von einer Ausscheidung der Yersinien mit den Faeces bis zum 56. Tag p.i.

(Thibodeau et al., 2001).

Serologische Untersuchungen mit einem auf rekombinanten Yops basierenden

ELISA-Testsystem (PIGTYPE®YOPSCREEN) [vgl. B.2.7] zeigten eine deutliche

Serokonversion der mit YeO:3 Stamm Y1 infizierten Tiere zwischen dem siebten und

dem 14. Tag p.i.. In einer früheren Studie, in der ein auf den Oberflächenantigenen

Diskussion

98

(LPS) der Yersinien (Serovare O:3, O:5,27 und O:9) basierender ELISA eingesetzt

wurde, konnte eine Serokonversion der Schweine erst zwischen dem 21. und 56.

Tag p.i. festgestellt werden (Thibodeau et al., 2001). Die eingesetzten Versuchstiere

waren mit fünf Wochen nicht wesentlich jünger als die Minipigferkel in der

vorliegenden Untersuchung, daher ist eine Erklärung dieses Unterschieds eher im

Hinblick auf die verschiedenen ELISA-Testverfahren zurückzuführen. In

experimentellen Infektionen mit Y. enterocolitica in trächtigen Sauen konnten mit

dem PIGTYPE®YOPSCREEN-ELISA hohe Antikörpertiter bei den Sauen innerhalb

von zwei Wochen nach der Infektion festgestellt werden, die über mehrere Monate

anhielten. Bei neugeborenen Ferkeln konnten nur niedrige Titer gemessen werden,

die ab der sechsten Lebenswoche unter 20 OD % abfielen (Platt-Samoraj et al.,

2009b). Diese Beobachtungen entsprechen den in der vorliegenden Arbeit bei nicht

infizierten Ferkeln der Kontrollgruppe gemachten [vgl. C.1.1.4].

In den durchgeführten Infektionsversuchen zeigte keines der Minipigs ernste

klinische Symptome, wie Diarrhoe, Fieber oder Veränderungen bezüglich Haltung

und Verhaltens. Das Auftreten von leicht breiigem Kot kam selten sowohl vor als

auch nach der Infektion mit Y. enterocolitica und auch bei nicht infizierten

Kontrolltieren vor und scheint in keinem Zusammenhang mit der Infektion zu stehen.

Auffällige hämatologische Befunde im roten und weißen Blutbild konnten regelmäßig

erhoben werden, allerdings traten auch diese schon vor der Belastung der Tiere mit

Y. enterocolitica auf. Da es sich bei den eingesetzten Ferkeln nicht um SPF-Tiere

handelte, kommen vielerlei Ursachen für diese Befunde infrage. Virale Infektionen

können eine Leukozytopenie, eine Neutropenie oder Lymphozytose hervorrufen.

Auch nichtinfektiöse Einflüsse, wie Eisenmangel, zu geringe Flüssigkeitsaufnahme,

erhöhte Umgebungstemperatur und Stress, führen zu Auffälligkeiten im Blutbild. So

vermag Stress beispielsweise eine Leukozytose, Neutrophilie oder Lymphozytopenie

zu verursachen. Erschwerend für die Beurteilung hämatologischer Parameter ist

zudem das Fehlen von aktuellen Referenzwerten für die Rasse Mini-Lewe. Ob die für

Mast- und Zuchtschweine der gängigen Rassen (Deutsche Landrasse, Deutsches

Edelschwein, Pietrain, Hampshire, Duroc) geltenden Referenzwerte übertragbar

sind, ist bislang nicht näher untersucht worden. In den vorliegenden Studien

beziehen sich beschriebene Abweichungen jedoch auf diese „Normalwerte“.

Deutliche Hinweise auf eine akute entzündliche Infektion (Kernlinksverschiebung)

fanden sich in der hämatologischen Untersuchung nicht.

Diskussion

99

Auch die erhobenen pathologisch-anatomischen und histopathologischen Befunde

waren überwiegend von milder Ausprägung und für die Infektion mit Y. enterocolitica

unspezifisch, da sie auch in den Tieren der Kontrollgruppe auftraten. Eine nur milde

Ausprägung histopathologischer Befunde berichteten auch Thibodeau et al. (1999)

nach einer oralen Infektion von Hybridschweinen mit 108 KBE Y. enterocolitica

Serotyp O:3.

Obwohl zwischen Minipigs und den üblicherweise zur Mast genutzten

Hybridschweinen anatomische und physiologische Unterschiede bestehen (Meurens

et al., 2012), lassen die vorliegenden Parallelen zwischen den Ergebnissen aus

Infektionsversuchen in Mastschweinen und Minipigs eine Übertragbarkeit des

Minipigmodells auf kommerzielle Schweinebestände vermuten.

Insgesamt ist es gelungen, ein Infektionsmodell für Y. enterocolitica im Minipig zu

etablieren, das dazu geeignet ist, die Kolonisation und Infektion dieses Erregers im

Schwein als natürlichem Wirtsorganismus weitergehend zu untersuchen.

Vergleichende Untersuchung der Serotypen O:3 und O:8 im Minipigmodell Im zweiten Teil der vorliegenden wissenschaftlichen Arbeit wurde das Minipigmodell

eingesetzt, um den in humanen Patienten und in Schweinebeständen am häufigsten

vorkommenden Bioserotyp 4/O:3 mit dem bisher molekularbiologisch am besten

untersuchten und im Mausmodell hoch virulenten Bioserotyp 2B/O:8 zu vergleichen.

Hierzu wurden jeweils insgesamt zehn Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp

O:3 (YeO:3) Stamm Y1 oder Serotyp O:8 (YeO:8) Stamm 8081v infiziert. Die

Versuche wurden zeitlich versetzt einmal mit vier und einmal mit sechs Tieren

durchgeführt, wobei die Ergebnisse beider Versuche reproduzierbar waren. YeO:3

Stamm Y1 konnte wesentlich häufiger und in größerer Anzahl aus den Organen der

Ferkel reisoliert werden als YeO:8 Stamm 8081v. Eine quantitative Bestimmung des

Keimgehalts war bei YeO:8 Stamm 8081v ausschließlich in den Tonsillen möglich

[vgl. C.2.4]. In der qualitativen Untersuchung mittels Kälteanreicherung konnte der

Serotyp O:8 ebenfalls nur in den Tonsillen und dem Ileum nachgewiesen werden,

während Serotyp O:3 sowohl aus intestinalen als auch aus extraintestinalen Organen

(Lymphknoten, Milz, Niere) reisoliert wurde [vgl. C.2.5]. Auch in Kotproben bzw.

Rektaltupfern konnte YeO:3 ab dem dritten Tag p.i. deutlich häufiger nachgewiesen

werden als YeO:8, was für eine wesentlich längere Ausscheidung mit den Faeces

spricht [vgl. C.2.6]. Letztlich zeigte sich auch hinsichtlich der Immunantwort auf die

Diskussion

100

beiden Serotypen eine sehr unterschiedliche Reaktion der infizierten Tiere. Während

bei Ferkeln, die mit Serotyp O:3 Stamm Y1 infiziert worden waren, eine deutliche

Serokonversion zu beobachten war, trat diese nach Infektion mit Serotyp O:8 Stamm

8081v nicht auf [vgl. C.2.7].

Diese Ergebnisse zeigen, dass sich Serotyp O:3 im Schwein wesentlich invasiver

verhält und im Gegensatz zu Serotyp O:8 eine Infektion verursacht. Serotyp O:8

hingegen scheint ausschließlich die Tonsillen und nur minimal den Darm der Tiere zu

kolonisieren.

Da die eingesetzten Stämme Y1 und 8081v beide das Virulenzplasmid (pYV)

beinhalten, das bei allen Biotypen von Y. enterocolitica bis auf Biotyp 1A vorhanden

ist (Batzilla et al., 2011b), ist es wahrscheinlich, dass beide die gleichen Yops

exprimieren können. Möglich ist allerdings eine unterschiedliche Regulation der

Expression dieser virulenzassoziierten Proteine. Das Fehlen Yop-spezifischer

Antikörper nach erfolgter Infektion mit YeO.8 ist aber eher durch die geringe

Invasivität des Bakteriums begründet.

Zusammenfassend konnte im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit gezeigt

werden, dass Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 im Gegensatz zu Serotyp O:8

Stamm 8081v in der Lage ist, im Schwein eine generalisierte Infektion zu zeigen und

eine Serokonversion zu induzieren. Da die Tiere dennoch keine Klinik zeigten, ist

YeO:3 Stamm Y1 mit großer Wahrscheinlichkeit besser an das Schwein angepasst

als YeO:8 Stamm 8081v. Dieser Umstand könnte auch die weite Verbreitung und

Verdrängung anderer Serotypen durch YeO:3 als Erreger der humanen Yersiniose

begründen. Eine Übertragbarkeit der Ergebnisse auf andere Stämme desselben

Serotyps ist anzunehmen, da insbesondere für Serotyp O:3 eine große Homogenität

beschrieben wurde (Fredriksson-Ahomaa et al., 2006a); sie bedarf aber weiterer

Untersuchungen. Auch andere humanpathogene Serotypen, wie O:9 und O:5,27,

konnten, wenn auch selten, aus Mastschweinen isoliert werden (Thibodeau et al.,

1999; Gürtler et al., 2005). Wie sich diese Serotypen im Schwein verhalten, ist

allerdings bislang nur wenig untersucht worden. Fukushima et al. (1984)

beobachteten in experimentellen Infektionen im Schwein, dass Ferkel anfälliger für

Serotyp O:5,27 waren als adulte Tiere. Bei Serotyp O:3 fanden sie keine

altersabhängigen Unterschiede. Robins-Browne et al. (1985) infizierten

gnotobiotische Ferkel mit den Bioserotypen 4/O:3 und 1/O:5. Sie konnten feststellen,

dass der Bioserotyp 1/O:5 weniger virulent und nicht invasiv war. Auch Schiemann

Diskussion

101

(1988) beobachtete eine geringe Virulenz der Serotypen O:8, O:13 und O:21 in

Ferkeln. Diese Studien unterstützen die Hypothese, dass der Serotyp O:3 an das

Schwein adaptiert ist. Allerdings besteht der Bedarf nach weiteren Untersuchungen

der verschiedenen humanpathogenen Bioserotypen im Schwein.

Bedeutung des Invasins Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die Frage nach den molekularen Grundlagen für

den unterschiedliche Phänotyp der beiden Serotypen behandelt. YeO:3 und YeO:8

unterscheiden sich unter anderem in der Expression des Virulenzfaktors Invasin. In

YeO:3 bewirkt eine Punktmutation im rovA-Gen eine größere Stabilität und

verbesserte DNA-Bindungskapazität des RovA-Proteins. Bei YeO:8 hingegen

verändert sich die Faltung des RovAs bei Temperaturen um 37°C (im

Wirtsorganismus) und es unterliegt vermehrt einer Spaltung durch ATP-abhängige

Proteasen (Uliczka et al., 2011). Da RovA die invA-Expression aktiviert, kommt es

dadurch zu einer verminderten Bildung von Invasin in Serotyp O:8-Stämmen.

Ein weiterer bekannter Unterschied liegt im Vorhandensein eines Insertionselements

(IS1667) im invA-Promotorbereich bei Serotyp O:3, das einen zusätzlichen Promotor

beinhaltet und dadurch ebenfalls zu einer vermehrten invA-Expression in YeO:3

führt. Im YeO:8 fehlt dieses Insertionselement (Uliczka et al., 2011). Um

herauszufinden, inwieweit die genannten Unterschiede zwischen den beiden

Serotypen einen Einfluss auf die Kolonisation und Infektion des Schweins haben,

wurden Koinfektionsversuche mit verschiedenen Mutanten im Minipigmodell

durchgeführt. Es wurden drei verschiedene Mutanten des Serotyp O:3 Stamms Y1

eingesetzt, die eine absteigende Invasinbildung aufwiesen. Die RovA-

Stabilitätsmutante YE14 exprimiert das weniger stabile RovA des YeO:8, der

PinvA∆IS1667-Mutante YE15 fehlt das Insertionselement im invA-Promotorbereich

und der ΔinvA-Mutante YE21 fehlt das gesamte invA (Uliczka et al., 2011).

In den Koinfektionsversuchen wurden die Schweine jeweils mit einer der Mutanten

und dem YeO:3 Wildtypstamm gleichzeitig infiziert. Auf diese Art konnten die beiden

eingesetzten Stämme innerhalb eines Tieres miteinander verglichen und der Einfluss

individueller Unterschiede zwischen den einzelnen Schweinen auf die Ergebnisse

umgangen werden (Monk et al., 2008) [vgl. C.3].

In Koinfektionsversuchen mit der RovA-Stabilitätsmutante YE14 und dem

Wildtypstamm Y1 konnte im Hinblick auf die Organbelastung nur im Ileum ein

Diskussion

102

signifikanter Unterschied zwischen der Mutante und dem Wildtyp nachgewiesen

werden. Allerdings war im competitive index eine leichte Tendenz zu beobachten,

nach der die Mutante auch in anderen Darmabschnitten einen geringen Nachteil

gegenüber dem Wildtyp aufwies. Bezüglich der bakteriellen Ausscheidung mit den

Faeces konnte keine verringerte Ausscheidung der RovA-Stabilitätsmutante

festgestellt werden [vgl. C.3.1].

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Expression eines stabileren RovAs allein nicht zu

der erfolgreicheren Infektion des Schweins durch YeO:3 gegenüber dem YeO:8 führt.

Vielmehr scheint die invA-Expression auch von weiteren Faktoren abhängig zu sein.

Zudem beeinflusst RovA als globaler Regulator nicht nur die Invasinexpression,

sondern aktiviert bzw. hemmt die Transkription von über 60 verschiedenen Genen

(Cathelyn et al., 2007). Dube et al. (2003) konnten zeigen, dass eine YeO:8 rovA-

Mutante in der Maus attenuiert war. Die molekularen Mechanismen, die dieser

Attenuierung zugrunde liegen, sind allerdings noch größtenteils unbekannt.

In der Untersuchung der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 in Koinfektionsversuchen mit

einem YeO:3 Wildtypstamm zeigte sich eine Attenuierung der PinvA∆IS1667-Mutante

YE15 deutlich signifikant unter Berücksichtigung des Anteils dieser am Inokulum

(relative virulence ratio, RVR) und im individuellen Vergleich mit dem Wildtypstamm

YE13 innerhalb desselben Tieres (competitive index, CI) [vgl. C.3.2]. Hinsichtlich der

qualitativen Organbelastung und der bakteriellen Ausscheidung mit den Faeces

konnte jedoch keine Attenuierung der PinvA∆IS1667-Mutante beobachtet werden.

Auch im direkten Vergleich der quantitativen Organbelastung aller Tiere konnte kein

signifikanter Unterschied festgestellt werden.

Diese Resultate bekräftigen wiederum die Hypothese, dass Invasin zwar eine

wichtige Rolle im Infektionsgeschehen spielt (Miller und Falkow, 1988), die invA-

Expression allerdings von weiteren Faktoren zusätzlich zu RovA reguliert wird.

Andererseits ist bekannt, dass Invasin für die Infektion in Mäusen nicht essentiell ist

(Pepe und Miller, 1993) und die Invasion der Yersinien in die Wirtszellen auch durch

andere Virulenzfaktoren vermittelt wird (Fredriksson-Ahomaa et al., 2006a; Pepe et

al., 1995). Außerdem unterstreichen die Ergebnisse die Bedeutung von

Koinfektionsstudien und der Auswertung dieser mittels RVR und CI für die

Erkennung geringer Variationen in der Regulation von Virulenzgenen.

Diskussion

103

Um den Einfluss des Invasins auf die Fähigkeit von Y. enterocolitica das Schwein zu

infizieren besser einschätzen zu können, wurden anschließend Koinfektionsversuche

mit dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 und der ΔinvA-Mutante YE21 durchgeführt. In

diesen zeigte sich eine deutlich geringere Belastung der Organe durch die ΔinvA-

Mutante YE21 im Vergleicht mit dem Wildtypstamm Y1. Dieser Unterschied war

sowohl in der quantitativen als auch in der qualitativen Organbelastung ersichtlich.

Allerdings zeigten sich signifikante Unterschiede wiederum nur in der RVR und dem

CI. Auch hinsichtlich der Ausscheidung der beiden Stämme mit den Faeces konnte

ein signifikanter Nachteil der ΔinvA-Mutante gegenüber dem Wildtypstamm

nachgewiesen werden [vgl. C.3.3].

Die Ergebnisse dieses Koinfektionsversuchs untermauern die Bedeutung des

Virulenzfaktors Invasin. Allerdings scheint die Kolonisation der Tonsillen

invasinunabhängig zu sein. Auch eine Kolonisation des Darms durch die ΔinvA-

Mutante war im Schwein möglich, wenn auch in geringerer Ausprägung.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass keine der eingesetzten Mutanten sich im

Schwein verhielt wie der Serotyp O:8 Stamm 8081v, der fast ausschließlich die

Tonsillen kolonisierte und dessen Ausscheidung mit den Faeces nach dem ersten

Tag p.i. stark abnahm und ab dem 10. Tag p.i. nicht mehr nachweisbar war. Daher

ist davon auszugehen, dass sich die beiden Serotypen YeO:3 und YeO:8 auch in der

Regulation weiterer Virulenzfaktoren unterscheiden.

YadA und Ail sind weitere bekannte Virulenzfaktoren, die mit der Adhäsion an und

der Aufnahme von Y. enterocolitica in die Wirtszellen in Verbindung gebracht werden

(El Tahir und Skurnik, 2001; Heise und Dersch, 2006). Uliczka et al. (2011) zeigten,

dass auch die Koexpression von YadA und eine verminderte Expression des

Oberflächen-Antigens bei 37°C für eine Internalisierung der Yersinien in die

Wirtszellen von Bedeutung sind. Welche Rolle YadA oder die Oberflächenantigene

für die Infektionsmechanismen des YeO:3 im Schwein spielen, ist bisher noch nicht

untersucht worden. Die Beweglichkeit der Yersinien durch Flagellen stellt einen

weiteren wichtigen Faktor für den Kontakt der Yersinien mit Wirtszellen und somit

auch für die Invasion dar (Young et al., 2000). In Hinsicht auf die Beweglichkeit und

die Ausbildung von Flagellen wiesen Uliczka et al. (2011) ebenfalls Unterschiede

zwischen den beiden Serotypen O:3 und O:8 auf.

Diskussion

104

Vergleichende Betrachtung der Infektion im Maus- und Minipigmodell Im letzten Abschnitt dieser Dissertation wurden die Ergebnisse der im Minipigmodell

durchgeführten Infektions- und Koinfektionsversuche mit den Ergebnissen aus

Mausinfektionsversuchen verglichen, die unter vergleichbaren Bedingungen von

Julia Schaake, M.Sc. am HZI in Braunschweig durchgeführt wurden.

Der Vergleich zeigte große Kontraste zwischen den beiden Modellen auf.

Insbesondere der im Schwein so deutliche Unterschied in der Organbelastung durch

YeO:3 und YeO:8 war im Mausmodell nicht feststellbar. In Koinfektionsversuchen mit

der RovA-Stabilitätsmutante YE14 zeigten sich im competitive index unterschiedliche

Tendenzen zwischen Maus- und Minipigmodell. Während die RovA-

Stabilitätsmutante im Schwein eher einen Nachteil gegenüber dem Wildtyp zeigte,

schien sie in der Maus einen geringen Vorteil in der Organbesiedlung aufzuweisen.

Die PinvA∆IS1667-Mutante YE15, die im Schwein einen z.T. deutlichen Nachteil in der

Besiedlung der Darmabschnitte zeigte, wies in der Maus nur einen geringen Nachteil

in der Belastung des Ileums auf. Koinfektionsversuche mit der ΔinvA-Mutante

hingegen ergaben vergleichbare Ergebnisse in beiden Tiermodellen. Nur die

invasinunabhängige Kolonisation der Tonsillen konnte im Mausmodell aufgrund des

Fehlens dieser Organe in Mäusen nicht beobachtet werden. In den Peyerschen

Platten der Maus, wie auch im Ileum des Schweins und allen weiteren untersuchten

Darmabschnitten beider Tierarten zeigte sich die ΔinvA-Mutante gegenüber dem

Wildtypstamm deutlich abgeschwächt. In allen Versuchen fiel die Organbelastung

der Mäuse höher aus als die der Schweine [vgl. C.4].

Der Vergleich zwischen den Ergebnissen aus dem Maus- und dem Minipigmodell

legt die Vermutung nahe, dass Y. enterocolitica Serotyp O:3 möglicherweise besser

an das Schwein als Wirt adaptiert ist. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um

die Mechanismen aufzuklären, die eine unterschiedliche Regulation von

Virulenzfaktoren in verschiedenen Wirtsspezies ermöglichen. Da sich Mäuse und

Schweine in ihrer Körpertemperatur nur wenig unterscheiden (Maus: 36-37°C,

Minipig-Ferkel: 38-40°C), sind vermutlich andere Faktoren als die

Umgebungstemperatur zu berücksichtigen. Einen von vielen Einflussfaktoren könnte

das Immunsystem des Wirts darstellen, ebenso wie die anatomische Verteilung

lymphatischen Gewebes, die Zusammensetzung der Nahrung und

Umgebungsfaktoren im Gastrointestinaltrakt.

Diskussion

105

In der vorliegenden Arbeit wurde erfolgreich ein Infektionsmodell für Y. enterocolitica

im Minipig etabliert. Der Vergleich mit dem Mausmodell zeigt, dass zwischen

verschiedenen Wirtsspezies große Unterschiede bestehen können. Nutztiermodelle

sind daher von großer Bedeutung für die Erforschung von durch Lebensmittel

übertragbaren Zoonosen. Die serotypspezifische Anpassung von Y. enterocolitica an

das Schwein, die in dieser Arbeit beobachtet wurde, stellt einen wichtigen Faktor für

die epidemiologische Beurteilung dieses Erregers dar. Aus diesem Grund sollte sich

die zukünftige Erforschung von Zoonoseerregern nicht auf das Mausmodell

beschränken, sondern auch Untersuchungen in der natürlichen Wirtsspezies mit

einbeziehen.

Die Untersuchungen zur Bedeutung des Invasins für die Kolonisation und Infektion

des Schweins stellen zudem einen wichtigen Beitrag zur Klärung der

Pathomechanismen enteropathogener Yersinien dar.

Bisher ungeklärt und somit potentieller Gegenstand zukünftiger Forschungsprojekte

ist die Frage, durch welche molekularen Grundlagen die Anpassung von

Y. enterocolitica Serotyp O:3 an das Schwein bedingt ist. Die in dieser Arbeit

untersuchten Unterschiede zwischen YeO:3 und YeO:8 (Stabilität des RovAs und

das IS1667 im invA-Promoterbereich) konnten den verschiedenen Phänotyp der

beiden Serotypen nicht ausreichend erklären. Auch die Immunantwort des Schweins

kann von der der Maus oder des Menschen abweichen und so zu einem

verschiedenen Krankheitsbild führen. Die Immunerkennung der Serotypen O:3 und

O:8 zeigte ebenfalls Unterschiede im Schwein, wie genau die Immunantwort im

Reservoirwirt verläuft ist allerdings bislang unbekannt. Auch diese Frage bedarf noch

weiterer Untersuchungen.

Zusammenfassung

106

E Zusammenfassung

Anna Charlotte Drees

Charakterisierung der Yersinia enterocolitica-Infektion im Minipigmodell

In Nordeuropa ist Yersinia (Y.) enterocolitica der dritthäufigste bakterielle Erreger von

Gastroenteritiden beim Menschen. Die Yersiniose kommt dabei gehäuft bei

Kleinkindern vor und kann ernste immunogene Spätfolgen, wie eine reaktive Arthritis

oder das Erythema nodosum, hervorrufen. Im Jahr 2011 wurden in Deutschland

3.397 Erkrankungsfälle gemeldet. Y. enterocolitica ist ein in erster Linie durch

Lebensmittel übertragener Zoonoseerreger. Das Schwein gilt dabei als Reservoirwirt

und rohes Schweinefleisch als Hauptinfektionsquelle für den Menschen. Sowohl in

humanen Patienten als auch in Mastschweinebeständen kommt der Bioserotyp 4/O:3

am häufigsten vor. Dennoch konzentrierten sich bisherige Studien auf den

Bioserotypen 1B/O:8 und experimentelle Infektionen fanden in erster Linie im

Mausmodell statt.

Vor diesem Hintergrund wurde im ersten Teil der vorliegenden Arbeit ein

Infektionsmodell für Y. enterocolitica im Minipig etabliert, das Studien zur

Kolonisation und Infektion von Y. enterocolitica im Schwein ermöglicht. Dieses

Minipigmodell zeichnete sich durch sehr gut reproduzierbare Ergebnisse und die

Vorteile der Minipigs in Bezug auf Unterbringung und Handhabung der Tiere aus.

Das Versuchsdesign und Vergleiche mit früheren Studien in Hybridschweinen lassen

eine Übertragbarkeit auf das Infektionsgeschehen in Mastschweinebeständen als

sehr wahrscheinlich annehmen.

Im zweiten Teil der Arbeit wurden die beiden Serotypen O:3 und O:8 in dem zuvor

etablierten Minipigmodell vergleichend untersucht. Dabei konnten deutliche

Unterschiede bezüglich der quantitativen und qualitativen Organbelastung, der

Ausscheidung mit den Faeces und der Immunantwort festgestellt werden. Während

der Serotyp O:8 (YeO:8) Stamm 8081v nur die Tonsillen und, in minimaler

Ausprägung, den Darmtrakt der Schweine kolonisierte, konnte der Serotyp O:3

(YeO:3) Stamm Y1 aus allen intestinalen und extraintestinalen Organen reisoliert

werden. Zudem wurde YeO:3 von den Tieren länger und häufiger mit dem Kot

ausgeschieden und führte zu einer spezifischen Immunantwort, die in mit YeO:8

infizierten Ferkeln ausblieb.

Zusammenfassung

107

Eine mögliche Erklärung für diesen stark unterschiedlichen Phänotyp im Schwein

stellt die unterschiedliche Expression des Virulenzfaktors Invasin der beiden

Serotypen dar. Die invA-Expression wird durch den Transkriptionsfaktor RovA

aktiviert. Im Gegensatz zu YeO:8 exprimiert YeO:3 ein stabileres RovA und verfügt

zudem über ein Insertionselement (IS1667) im invA-Promotorbereich. Diese beiden

Unterschiede führen zu einer vermehrten Invasinbildung in Y. enterocolitica Serotyp

O:3. In Koinfektionsversuchen mit verschiedenen YeO:3-Deletionsmutanten wurden

daher im dritten Teil der Arbeit die Auswirkungen der Invasinexpression auf die

Infektion des Schweins durch Y. enterocolitica untersucht. Während eine YeO:3

RovA-Stabilitätsmutante, die das weniger stabile RovA des YeO:8 exprimierte, im

Vergleich mit dem Wildtypstamm nur eine verminderte Besiedlung des Ileums

aufwies, konnte bei einer YeO:3 PinvaΔIS1667-Mutante, der das Insertionselement im

invA-Promotorbereich fehlte, eine Attenuierung gegenüber dem Wildtyp in allen

Darmabschnitten gezeigt werden. Der Einsatz einer invasinA-Knockout-Mutante

(ΔinvA) im Minipigmodell wies schließlich eine deutliche Attenuierung der ΔinvA-

Mutante auf. Diese Beobachtungen zeigen, dass Invasin eine wichtige Rolle im

Infektionsgeschehen von Y. enterocolitica spielt. Allerdings erklären sie nur teilweise

die Unterschiede zwischen YeO:3 und YeO:8, weshalb weitere Unterschiede in der

Regulation von Virulenzfaktoren der beiden Serotypen angenommen werden

können.

Im letzten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurden die Ergebnisse aus

Infektionsversuchen im Minipig mit aus dem Mausmodell stammenden verglichen.

Hierbei konnten große Unterschiede zwischen den beiden Wirtsspezies festgestellt

werden. Insbesondere YeO:8 zeigte eine sehr unterschiedlich ausgeprägte Virulenz.

Auch das Vorhandensein eines stabileren RovAs und des Insertionselements IS1667

bei YeO:3 scheint in der Maus von geringerer Bedeutung zu sein als im Schwein.

Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Studien darauf hin, dass der

Serotyp O:3 vermutlich besser an das Schwein als Wirtsspezies angepasst ist als

YeO:8. Die Unterschiede zum Mausmodell unterstreichen die Bedeutung

experimenteller Infektionen im natürlichen Wirt für die Zoonoseforschung.

Summary

108

F Summary

Anna Charlotte Drees

Characterization of Yersinia enterocolitica in a Minipig infection model

Yersinia (Y.) enterocolitica is the third most prevalent bacterial cause of human

gastroenteritis in Northern Europe. Yersiniosis mainly appears in infants. It may

cause severe sequelae such as reactive arthritis or erythema nodosum. In 2011 in

Germany 3,397 cases of Yersiniosis have been reported. Y. enterocolitica is an

important food-borne zoonotic pathogen. Swine are considered as a reservoir and

raw pork as the main source of infection in humans. Bioserotype 4/O:3 is the most

prevalent bioserotype in human patients as well as in fattening pigs. However, most

experimental infection studies used bioserotype 1B/O:8 and were carried out in the

mouse model.

Therefore, in the first part of the present study an experimental infection model for

Y. enterocolitica has been established in Minipigs. The established model was

suitable for comparison of colonization and infection of Y. enterocolitica in pigs. It

was characterized by reproducible results and the advantages of minipigs in handling

and housing. The experimental design and comparable studies in cross-breed pigs

suggest that the minipig model reflects natural infections in piggeries.

In the second part of the study serotype O:3 and O:8 strains were investigated

comparatively in the previously established model, revealing substantial differences

concerning the quantitative and qualitative organ burden, fecal shedding and

seroconversion. While serotype O:8 (YeO:8) strain 8081v colonized only the tonsils

and, to a low extent, the gut, serotype O:3 (YeO:3) strain Y1 was reisolated from

intestinal and extraintestinal organs. YeO:3 was shed for a longer time period and, in

contrast to YeO:8, induced an adaptive immune response in the infected piglets.

A possible explanation for the very different phenotypes of both serotypes in the pig

might be a diverse expression of the virulence gene invA. The transcription factor

RovA activates invA expression. YeO:3 expresses a more stable RovA due to one

single point mutation and possesses an insertion sequence element (IS1667) in the

invA promoter region, whereas YeO:8 carries a less stable RovA and lacks the

IS1667. These differences lead to increased amounts of invasin synthesized by

Y. enterocolitica serotype O:3. During the third phase of the study, the impact of

Summary

109

different invA expression on pig infections by Y. enterocolitica was studied by

experimental coinfections using different YeO:3 deletion mutant strains. A RovA

stability mutant, expressing less stable RovA of YeO:8, showed only minor

disadvantages in colonization of the ileum compared to the wildtype strain. In

contrast, YeO:3 PinvaΔIS1667 lacking the IS element showed a reduced colonization

of all gut parts. The invA knockout mutant strain (ΔinvA) showed a significantly

attenuated phenotype in the minipig model, indicating that invasin plays an important

role in the infection process of Y. enterocolitica . However, this only partially explains

the differences observed between YeO:3 and YeO:8 in minipig infection. Therefore,

so far unknown differences in regulation of virulence factors are assumed to

contribute to Y. enterocolitica infections of swine.

Finally, experimental results from the minipig infections were compared with those

from a mouse model, revealing substantial differences between the two host species.

The low organ burden of YeO:8 detected in pigs could not be observed in mice and

expression of a stable RovA and possession of the IS1667 in YeO:3 seems to be of

less importance in mice than in pigs.

In conclusion, the results obtained from this work suggest that serotype O:3 might be

better adapted to pigs than YeO:8. The differences between minipig and mouse

model emphasize the importance of experimental infection studies in the natural host

for zoonoses reseach.

Literaturverzeichnis

110

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Anhang

121

H Anhang

H.1 Detaillierte klinische Beurteilung der Minipigs

Zu C.1.1 Vergleich verschiedener Infektionsdosen von Y. enterocolitica Serotyp O:3

Zwei Wochen vor Einstallung der Minipigs wurde eine Stichprobe von vier

Saugferkeln (ein Ferkel pro Wurf) im Zuchtbetrieb hämatologisch untersucht

[vgl. B.2.1]. Von diesen zeigten zwei Tiere eine deutliche und eines eine

geringgradige (ggr.) Leukopenie. Eines der Ferkel wies auch eine deutliche

Lymphopenie auf. Alle vier Ferkel zeigten eine Hämokonzentration, eines eine ggr.

und eines eine deutliche Erhöhung der segmentkernigen Granulozyten. Am Tag der

Einstallung und am darauffolgenden Tag wurden Blutproben von insgesamt zwölf

Minipigs untersucht. Von diesen zeigten drei eine Leukopenie, acht eine

Lymphopenie und alle zwölf eine Hämokonzentration. Zwei Tiere mussten direkt

nach der Blutentnahme aufgrund von akutem Kreislaufversagen und

Schnappatmung mit je 0,6 ml Dexamethason- Injektionslösung (4 mg

Dexamethason/ml, Vétoquinol) behandelt werden. Eines der beiden Tiere blieb auch

am Tag nach der Blutentnahme zyanotisch und verstarb am folgenden Tag. Eine

diagnostische Sektion ergab eine Blasenruptur als wahrscheinliche Todesursache.

Beide Tiere wurden von der Auswertung des Infektionsversuchs ausgeschlossen,

ebenso ein drittes Tier, bei dem am Tag der Einstallung mittels Kälteanreicherung

Y. enterocolitica aus einem Rektaltupfer isoliert wurde. Dieser Wildstamm ließ sich

biochemisch von dem eingesetzten Infektionsstamm Y1 unterscheiden und wurde

während des Versuchs nicht erneut aus Proben der Minipigs isoliert [vgl. B.1.5].

Somit verblieben neun Tiere, drei in jeder Dosisgruppe. Am Tag der Sektion (Tag 7

p.i.) wiesen sieben von neun Tieren eine hyperchrome Anämie auf. Eines zeigte eine

ggr., eines eine deutliche Lymphopenie, alle neun Ferkel zeigten eine

Hämokonzentration. In Gruppe A (Infektionsdosis: 108 KBE/ Tier) zeigte keines der

drei Ferkel vor und nach der oralen Infektion klinische Symptome, wie Fieber oder

Diarrhoe. Zwei Tiere fielen am Tag der Einstallung und am Tag darauf durch eine

leichte Untertemperatur auf. Auch in Gruppe B (Infektionsdosis: 109 KBE/ Tier)

zeigten zwei der drei Tiere eine ggr. erniedrigte Körpertemperatur am Tag nach der

Einstallung und ein Ferkel eine um ca. 1,5°C erhöhte Körpertemperatur am Abend

des Infektionstags. Auch in dieser Gruppe wurden weder vor noch nach der Infektion

Anzeichen von Diarrhoe bei den Minipigs beobachtet. In Gruppe C (Infektionsdosis:

Anhang

122

1010 KBE/ Tier) zeigten ebenfalls zwei von drei Tieren eine leichte Untertemperatur

am Tag nach der Einstallung. Außerdem wurde breiiger Kot am Tag nach der

Infektion im Stall gefunden und ein Tier wies einen kotverschmierten After auf. In den

folgenden Tagen zeigten aber auch diese Ferkel keine weiteren Anzeichen einer

Diarrhoe.

Zu C.1.2 Zeitverlauf der Infektion mit Y. enterocolitica Serotyp O:3

Bei der Einstallung der zwölf Minipigs sieben Tage vor der oralen Infektion wurden

alle Tiere hämatologisch untersucht, eine Probe war nicht auswertbar. Von den elf

Ferkeln zeigten sieben eine z.T. deutliche Erhöhung der segmentkernigen

Granulozyten und eines eine minimale Lymphopenie. Die Blutwerte der vier

Kontrolltiere zeigten bei einem Tier eine deutliche Leukozytose, bei zwei Tieren eine

ebenfalls deutlich ausgeprägte Lymphopenie und bei drei Tieren eine ggr. bis

deutliche Erhöhung der segmentkernigen Granulozyten. Die drei am dritten Tag p.i.

sezierten Minipigs wiesen in der hämatologischen Untersuchung keine Auffälligkeiten

auf. Am siebten Tag p.i. konnte eine von drei Blutproben nicht untersucht werden, da

sie geronnen war, die anderen beiden Proben waren wieder unauffällig. Auch am 14.

Tag p.i. waren zwei von drei untersuchten Blutproben ohne besonderen Befund, ein

Ferkel zeigte jedoch deutlich erhöhte segmentkernige Granulozyten. Drei Wochen

nach der Infektion war von drei Minipigs eines hämatologisch völlig unauffällig, eines

zeigte eine normo- oder hyperchrome Anämie mit verringertem Hämoglobingehalt,

Hämatokrit und verringerter Erythrozytenzahl bei unverändertem MCHC und das

dritte wies ausschließlich eine verringerte Erythrozytenzahl auf. Am 21. Tag p.i.

waren alle vier untersuchten Ferkel der Kontrollgruppe unauffällig bis auf zwei Tiere

mit minimal verringerten Erythrozyten und ein Ferkel mit einer minimalen

Leukopenie. Klinisch waren alle Tiere vor und nach der Infektion unauffällig, zeigten

kein Fieber oder Diarrhoe. Nur ein Tier wies am Morgen nach der Infektion eine im

Vergleich zum Vortag um 0,5- 1,0°C erhöhte Körpertemperatur von 40,1°C auf. Die

elf weiteren Ferkel lagen zwischen 38,5°C und 39,7°C und wichen damit nicht von

ihren vorherigen Werten ab. Die Kontrolltiere zeigten am 18. Tag p.i. vorübergehend

breiigen Kot, der in den folgenden Tagen nicht wieder auftrat. Fieber konnte bei

keinem Kontrolltier festgestellt werden.

Anhang

123

Zu C.2. Vergleichende Infektionsstudie der Serotypen O:3 und O:8

Hämatologische Untersuchungen während der ersten Infektionsstudie:

In den Die hämatologische Untersuchung aller 20 Tiere am Tag der Einstallung

ergab eine ggr. bis deutlich ausgeprägte Leukozytopenie (Leukopenie) bei 17 Tieren,

eine deutliche Lymphozytopenie (Lymphopenie) bei 18 Tieren und eine normo- bis

hyperchrome Anämie mit verringertem Hämoglobin und Hämatokrit bei

unverändertem MCHC bei allen Ferkeln. In vier Blutproben fanden sich zudem

Howell Jolly Körper, die auf eine verstärkte Blutneubildung hinweisen. Auf Nachfrage

stellte sich heraus, dass im Zuchtbetrieb die sonst übliche zweite

Eisendextraninjektion der Ferkel unterlassen worden sei. Einen Tag nach der oralen

Infektion zeigte sich in keiner der sieben untersuchten Blutproben aus Gruppe A

(Infektion mit YeO:3 Stamm Y1) mehr eine Leukopenie. Vier Tiere wiesen allerdings

noch eine Lymphopenie und alle sieben eine normo- oder hyperchrome Anämie auf,

in zwei Proben wurden Howell Jolly Körper nachgewiesen. In Gruppe B (Infektion mit

YeO:8 Stamm 8081v) zeigte einen Tag p.i. ebenfalls keines der Tiere mehr eine

Leukopenie. Zwei von acht Tieren wiesen eine Lymphopenie und alle acht eine

minimale bis ggr. normo- oder hyperchrome Anämie auf. Von den vier Minipigs der

Kontrollgruppe zeigten zu diesem Zeitpunkt drei Tiere eine Leukopenie, drei eine

normo- oder hyperchrome Anämie und zwei eine Lymphopenie. Am achten Tag p.i.

wurden in den beiden Infektionsgruppen nur noch jeweils vier Tiere hämatologisch

untersucht, da in jeder Gruppe vier Tiere am siebten Tag p.i. seziert wurden. In der

Kontrollgruppe verendete eines der vier Ferkel am siebten Tag p.i. perakut. In der

erfolgten diagnostischen Sektion wurden Anzeichen einer Blasenruptur gefunden

(hgr. Uroperitoneum; hgr. vergrößerte Nieren; Blasenwand sulzig-verdickt, hgr. blutig

infiltriert und mit einer dorsalen Zusammenhangstrennung). Kulturell wurde in der

Blasenwand ein ggr. Keimgehalt an alpha-hämolysierenden Streptokokken, Pantoea

agglomerans und Bacillus spp. nachgewiesen.

Drei der vier Ferkel aus Gruppe A zeigten auch am achten Tag p.i. noch eine ggr.

normo-/ hyperchrome Anämie, je ein Tier eine Leuko- und Lymphopenie und ein Tier

wies ggr. erhöhte segmentkernige Granulozyten auf. In Gruppe B zeigten drei der

vier Tiere ggr. verringerte Erythrozytenzahlen, eines eine ggr. Leukopenie und zwei

eine Lymphopenie. Von den drei Kontrolltieren fielen zwei im Blutbild durch eine

Leukopenie und alle drei durch eine Lymphopenie auf. Alle Kontrolltiere zeigten auch

Anzeichen einer Anämie.

Anhang

124

Am 14. Tag p.i. waren aus Gruppe A nur drei Blutproben auswertbar. Von diesen

zeigten zwei eine ggr. Leukopenie, eine eine verringerte Erythrozytenzahl und eine

eine Lymphopenie. In einer Probe fanden sich außerdem ggr. verringerte

segmentkernige Granulozyten. In Gruppe B wies nur eines der vier Ferkel am 14.

Tag p.i. eine minimale Leukopenie auf. Alle zeigten einen ggr. erhöhten MCHC bei

verringerter Erythrozytenzahl und eines eine Lymphopenie. Die drei Kontrolltiere

zeigten in zwei Blutproben eine Leukopenie, die bei einem Tier deutlich ausgeprägt

war, und eine Lymphopenie. Auch in dieser Gruppe zeigten alle Tiere einen ggr.

erhöhten MCHC bei verringerter Erythrozytenzahl. Am 21. Tag p.i. zeigten in

Gruppe A von vier Tieren eines eine Leukopenie, drei Tiere eine Lymphopenie und

zwei Ferkel Anzeichen einer Anämie. In Gruppe B zeigten drei von vier Ferkeln eine

Leukopenie, Lymphopenie und verringerte Erythrozytenzahlen. Zwei der drei

Minipigs der Kontrollgruppe zeigten am 21. Tag p.i. ebenfalls eine Leukopenie, alle

drei wiesen verringerte Erythrozytenzahlen und eine Lymphopenie auf.

Hämatologische Untersuchungen während der zweiten Infektionsstudie:

Elf Tage vor der geplanten Einstallung wurden zehn Ferkel im Zuchtbetrieb

hämatologisch untersucht. Je drei Tiere wiesen eine ggr. Leukopenie und minimal

verringerte Erythrozytenzahlen auf, eines ggr. verringertes Hämoglobin und drei

einen erhöhten MCV und MCH. Zwei Ferkel zeigten eine ggr. Lymphopenie. Am Tag

der Einstallung zeigte von den 16 Minipigferkeln (je sechs Tiere in den beiden

Infektionsgruppen und vier in der Kontrollgruppe) eines aus Gruppe A eine

ggr. Leukozytose und alle wiesen eine deutliche Lymphopenie auf. Dabei zeigten

allerdings in Gruppe A und B jeweils fünf Tiere eine z.T. deutliche Erhöhung der

segmentkernigen Granulozyten, in der Kontrollgruppe waren diese nur bei einem Tier

minimal erhöht. Die stabkernigen Granulozyten waren in Gruppe A bei fünf und in

Gruppe B bei vier Tieren erhöht, in der Kontrollgruppe blieb dieser Wert unauffällig.

Klinisch fiel in Gruppe A (YeO:3) ein Ferkel ab dem achten Tag p.i. bis zum

Versuchsende mehrfach durch schleimig-blutige, z.T. auch fibrinöse Beimengungen

des Kots auf. In der pathologisch-anatomischen Untersuchung während der Sektion

war dieses Tier (Nr. 16) allerdings nicht speziell auffällig. Ein weiteres Ferkel, das

schon bei der Einstallung einen „Kümmerer“-Habitus aufwies, zeigte nach der

Infektion keine klinischen Symptome. Fieber hatte nach der Infektion keines der

Ferkel. Durchfall zeigten die Tiere nur für wenige Tage vor der oralen Infektion.

Anhang

125

In Gruppe B (YeO:8) schieden mehrere Tiere sowohl vor als auch nach der Infektion

breiigen Kot aus. An einigen Tagen nach der Infektion (Tag 4, 5 u. 10 p.i.) zeigten

wenige Tiere vorübergehend Diarrhoe.

Die Tiere der Kontrollgruppe zeigten im Verlauf des ersten Versuchs bis auf ein

Ferkel, das perakut an einer Blasenruptur verendete, keine klinischen Symptome.

Auch im zweiten Infektionsversuch waren die vier Kontrolltiere während der Studie

klinisch unauffällig.

Zu C.3.1 Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer RovA-

Stabilitätsmutante


Bei der Einstallung sieben Tage vor der Infektion fiel von den insgesamt acht

Minipigferkeln der Koinfektionsgruppe ein Tier durch einen minimal verringerten

Hämatokrit auf. Zwei Ferkel zeigten eine ggr. Leukozytose, zwei weitere eine

minimale bis ggr. Lymphopenie und fünf Tiere eine deutliche Erhöhung der

segmentkernigen Granulozyten. Die Blutwerte der vier Kontrolltiere zeigten bei einem

Tier eine deutliche Leukozytose, bei zwei Tieren eine ebenfalls deutlich ausgeprägte

Lymphopenie und bei drei Tieren eine ggr. bis deutliche Erhöhung der

segmentkernigen Granulozyten. Am siebten und 21. Tag p.i. wiesen die je vier, am

Sektionstag hämatologisch untersuchten, Ferkel der Koinfektionsgruppe keine

Auffälligkeiten im Blutbild auf. Alle vier untersuchten Ferkel der Kontrollgruppe waren

am 21. Tag p.i. unauffällig. Lediglich zwei Tiere zeigten minimal verringerte

Erythrozyten und eines eine minimale Leukopenie.


Elf Tage vor Einstallung wurden im Zuchtbetrieb zehn Ferkel stichprobenartig

hämatologisch untersucht. Von diesen zeigten fünf Tiere Anzeichen einer ggr.

Anämie, drei eine ggr. Leukopenie und zwei eine ggr. Lymphopenie. Am Tag der

Einstallung, sieben Tage vor der Belastung, zeigten zwei der vier Ferkel der

Infektionsgruppe eine ggr. hyperchrome Anämie, eines eine ggr. Thrombozytopenie,

alle vier Ferkel eine deutliche Lymphopenie und eines erhöhte segmentkernige und

stabkernige neutrophile Granulozyten. Von den vier Kontrolltieren zeigten bei der

Einstallung ebenfalls alle Ferkel eine deutliche Lymphopenie, eines von ihnen wies

auch ggr. vermehrt segmentkernige neutrophile Granulozyten auf. Am siebten Tag

p.i. zeigten alle vier Ferkel der Infektionsgruppe eine normo- bis hyperchrome

Anhang

126

Anämie, zwei Tiere eine ggr. Lymphopenie und eines minimal erhöhte

segmentkernige neutrophile Granulozyten. Die vier Kontrolltiere zeigten am siebten

Tag p.i. ebenfalls alle eine ggr. normo- bis hyperchrome Anämie. Drei von ihnen

wiesen auch eine ggr. Leukopenie und eines eine ggr. Lymphopenie auf.

Während beider Infektionsversuche zeigten die Minipigs kaum klinische Symptome.

In dem ersten Koinfektionsversuch zeigte ein Ferkel ab dem 13. Tag p.i. mehrfach

breiigen Kot bis milde Diarrhoe, ab dem 18. Tag p.i. konnte jedoch kein Durchfall

mehr festgestellt werden. Keines der Ferkel zeigte Fieber oder eine um mehr als

0,5°C erhöhte Körpertemperatur nach der Infektion. Auch die Kontrolltiere zeigten am

18. Tag p.i. vorübergehend breiigen Kot, der in den folgenden Tagen nicht wieder

auftrat. Während des zweiten Koinfektionsversuchs zeigten die Ferkel der

Infektionsgruppe überhaupt keine Anzeichen von Diarrhoe oder Fieber. In der

Kontrollgruppe konnte bei einem Tier sowohl vor als auch nach der „Pseudoinfektion“

breiiger Kot beobachtet werden. Dieses Tier wies auch eine, über die ganze

Versuchsdauer wiederholt auftretende, leicht erhöhte Körpertemperatur von 40,0 bis

40,7°C auf, war aber in Bezug auf Futteraufnahme, Verhalten und

Körpergewichtszunahme unauffällig.

Zu C.3.2 Koinfektionsversuche mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer

PinvA∆IS1667- Mutante


Am Tag der Einstallung zeigten von den insgesamt acht Minipig-Ferkeln der

Koinfektionsgruppe zwei Tiere eine deutliche Lymphopenie, fünf Tiere wiesen z.T.

ebenfalls deutlich erhöhte segmentkernige Granulozyten auf und bei zwei Ferkeln

konnten auch erhöhte Werte für stabkernige Granulozyten festgestellt werden. Am

siebten Tag p.i. zeigte von vier infizierten Ferkeln eines einen minimal verringerten

Hämoglobingehalt, eines eine ggr. Lymphopenie und zugleich erhöhte

segmentkernige Granulozyten und ein weiteres Ferkel minimal erhöhte stabkernige

Granulozyten und Monozyten. Am 21. Tag p.i. wies von drei untersuchten Minipigs

nur eines Auffälligkeiten im Rahmen einer minimalen Anämie auf. Das Blutbild zeigte

einen minimal verringerten Hämoglobingehalt und Hämatokrit sowie ggr. verringerte

Erythrozyten.

Anhang

127


Von den elf Tage vor Einstallung im Zuchtbetrieb stichprobenartig hämatologisch

untersuchten zehn Ferkeln zeigten fünf Tiere Anzeichen einer ggr. Anämie, drei eine

ggr. Leukopenie und zwei eine ggr. Lymphopenie. Am Tag der Einstallung wiesen

drei der vier Tiere der Koinfektionsgruppe ggr. verringerte Erythrozyten bei leicht

erhöhtem MCV auf. Ein Ferkel zeigte eine minimale Leukopenie, drei eine deutliche

Lymphopenie und zwei von diesen wiesen auch stark erhöhte segmentkernige

Granulozyten auf. Am siebten Tag p.i. fielen alle vier Minipigs durch eine Anämie

(verringerte Erythrozyten, erniedrigter Hämoglobingehalt und Hämatokrit) auf.

In der Koinfektionsgruppe des ersten Infektionsversuchs fiel bei der Einstallung ein

Ferkel durch eine derbe Umfangsvermehrung im Nabelbereich auf. Im Verlauf des

Versuchs zeigte sich der Nabel gerötet und blutig-krustig verändert. Am siebten Tag

p.i. war er allerdings unauffällig. Vor und nach der oralen Infektion zeigten die acht

Tiere keine klinischen Symptome wie Fieber oder Diarrhoe. Ein Ferkel verstarb

perakut nach der Blutentnahme am ersten Tag p.i.. Auch während des zweiten

Koinfektionsversuchs zeigten die vier infizierten Minipig-Ferkel keine klinischen

Symptome.

Zu C.3.3 Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer ∆invA-

Mutante

Auch in diesen Koinfektionsversuchen mit dem Y. enterocolitica Serotyp O:3

Wildtypstamm Y1 und der ΔinvA-Mutante YE21 zeigten die infizierten Minipig-Ferkel

sowohl vor als auch nach der oralen Infektion wenig klinische Symptome. Während

des ersten Koinfektionsversuchs wiesen drei der acht Ferkel am ersten Tag p.i.

breiigen Kot auf, blieben aber an den folgenden Tagen klinisch unauffällig. Keines

der Tiere zeigte eine erhöhte Körpertemperatur nach der Infektion. Während des

zweiten Koinfektionsversuchs verstarb ein Ferkel am ersten Tag nach der Einstallung

perakut nach erfolgter Blutentnahme. Von den verbliebenen neun Tieren wies eines

noch vor der Infektion einmalig hellen, dünnbreiigen Kot auf. Bei einem weiteren

Ferkel konnte an zwei aufeinanderfolgenden Tagen (dritter und vierter Tag p.i.)

Husten beobachtet werden. Bis auf diese Ausnahmen waren alle Minipigs während

des Versuchs klinisch unauffällig und zeigten keine erhöhte Körpertemperatur nach

der Infektion.

Anhang

128

H.2 Detaillierte pathologisch-anatomische Beurteilung

Zu C.1.1 Vergleich verschiedener Infektionsdosen von Y. enterocolitica Serotyp O:3

In der Sektion konnten bei einem Ferkel aus Gruppe B minimal vergrößerte

Mandibularlymphknoten festgestellt werden. Die Veränderungen der

Darmlymphknoten und des darmassoziierten lymphatischen Gewebes (GALT) sind in

Tabelle 3 dargestellt.

Tab. 3: Makroskopisch-pathologische Befunde der intestinalen Organe und der assoziierten Lymphknoten am siebten Tag p.i.. (Infektionsdosen: Gruppe A: 108 KBE/Tier; Gruppe B: 109 KBE/Tier; Gruppe C: 1010 KBE/Tier, Abkürzungen: derb=derbe Konsistenz, verh.=verhärtet, 0=unauffällig, 1=minimal, 2=mild/leicht, 3=ausgeprägt/deutlich)

Weitere Auffälligkeiten in der Sektion bei der Untersuchung der Nieren ließen den

Verdacht auf geringgradige, multifokale Nekrosen der Nierenrinde mit perifokaler

Fibrose (Verdacht auf älteren Infarkt) bei fünf Tieren zu.


In den Sektionen zeigte am dritten Tag p.i. ein Tier leicht vergrößerte Mandibular-

lymphknoten und ein weiteres Anzeichen einer ggr., multifokalen, subakuten Nekrose

der Nierenrinde mit perifokaler Fibrose (Verdacht auf älteren Infarkt). Am siebten Tag

p.i. zeigten alle drei Tiere auffällige mesenteriale Lymphknoten, die bei einem Tier

zystische Hohlräume aufwiesen. Alle drei Tiere wiesen Anzeichen eines älteren

Niereninfarkts (s. oben) auf. In der Sektion am 14. Tag p.i. zeigten erneut alle drei

Tiere leicht vergrößerte mesenteriale Lymphknoten, die bei einem Ferkel kleine

zystenartige Hohlräume aufwiesen und bei einem weiteren insgesamt blasig-zystisch

verändert waren. Von den drei Ferkeln, die am 21. Tag p.i. seziert wurden, zeigte

Anhang

129

eines eine ausgeprägte fibroblastische Peri- und Epikarditis, die beiden anderen

fielen durch Zysten auf den Ovarien auf. Hinweise auf einen älteren Niereninfarkt (s.

oben) konnten bei einem der Ferkel beobachtet werden. Am 21. Tag p.i. fanden sich

auch bei drei Kontrolltieren Anzeichen älterer Infarkte der Nierenrinde und bei einem

ein Abszess im Bereich des rechten Unterkiefers. Aus dem Abszessinhalt konnten

keine Yersinien isoliert werden.

Die Veränderungen der Darmlymphknoten und des darmassoziierten lymphatischen

Gewebes (GALT) sind in Tabelle 4 dargestellt.

Tab. 4: Makroskopisch-pathologische Befunde der intestinalen Organe und der assoziierten Lymphknoten während der Sektionen zu vier verschiedenen Zeitpunkten p.i.. (Abkürzungen: vergr.=vergrößert, derb=derbe Konsistenz, 0=unauffällig, 1=minimal, 2=mild/leicht, 3=ausgeprägt/deutlich)

Zu C.2 Vergleichende Infektionsstudie der Serotypen O:3 und O:8

Sowohl in Gruppe A (YeO:3) als auch in Gruppe B (YeO:8) und der Kontrollgruppe

zeigten mehrere Tiere veränderte Darmlymphknoten und eine GALT-Hyperplasie.

Eines der Ferkel aus Gruppe A fiel zudem durch leicht vergrößerte Lnn. hepatici und

eines durch eine milde fibroblastische Peri-und Epikarditis auf.



Anhang

130

Tab. 5: Pathologisch-anatomische Befunde der intestinalen Organe und der assoziierten Lymphknoten (Lnn.) am 7. (A) und 21. (B) Tag p.i.. (Abkürzungen: vergr.=vergrößert, derb=derbe Konsistenz, 0=unauffällig, 1=minimal, 2=mild/leicht, 3=ausgeprägt/deutlich, (Z)=zystisch verändert)


Stabilitätsmutante

Von den insgesamt acht am siebten Tag p.i. sezierten Ferkeln der

Koinfektionsgruppen (oral infiziert mit je 5x108 KBE des Wildtypstamms Y1 (YeO:3

wt) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (RovAP98) pro Tier) wiesen in der Sektion

sieben Tiere veränderte mesenteriale Lymphknoten auf. Zwei Tiere zeigten zudem

A

B

Anhang

131

Anzeichen einer ggr., multifokalen, subakuten Nekrose der Nierenrinde mit

perifokaler Fibrose (Verdacht auf älteren Infarkt) und eines wies deutlich vergrößerte

Mandibularlymphknoten auf. Auch in der Kontrollgruppe konnten veränderte

Darmlymphknoten und GALT-Hyperplasie beobachtet werden.

Am 21. Tag p.i. konnte außerdem bei einem Ferkel eine deutlich vergrößerte Milz

und bei zwei Tieren Ovarialzysten festgestellt werden. In der Kontrollgruppe fanden

sich zudem bei drei Ferkeln Anzeichen älterer Infarkte der Nierenrinde und bei einem

ein Abszess im Bereich des rechten Unterkiefers. Aus dem Abszessinhalt konnten

keine Yersinien isoliert werden.



Tab. 6: Pathologisch-anatomische Befunde der intestinalen Organe und der assoziierten Lymphknoten (Lnn.) am siebten bzw. 21. Tag p.i.. (Abkürzungen: vergr.=vergrößert, derb=derbe Konsistenz, 0=unauffällig, 1=minimal, 2=mild/leicht, 3=ausgeprägt/deutlich, (Z)=zystisch verändert)

Anhang

132



Von den insgesamt acht Minipigs, die am siebten Tag nach erfolgter oraler Infektion

mit YeO:3 Wildtypstamm YE13 und der PinvA∆IS1667- Mutante YE15 seziert wurden,

wiesen sechs Tiere veränderte Darmlymphknoten und z.T. eine GALT-Hyperplasie

auf. Zudem zeigte eines der Minipigs Zysten auf den Ovarien und ein weiteres einen

etwa walnussgroßen Abszess im Unterkieferbereich. Aus dem Abszessinhalt

konnten keine Yersinien isoliert werden. Auch am 21. Tag p.i. konnten

Veränderungen der Lnn. jejunales und GALT-Hyperplasien in Tieren der

Koinfektions- und der Kontrollgruppe beobachtet werden. Die Untersuchung der

Nieren ließ bei einem Ferkel der Koinfektionsgruppe den Verdacht auf geringgradige,

multifokale Nekrosen der Nierenrinde mit perifokaler Fibrose (Verdacht auf älteren

Infarkt) zu.



Tab. 7: Pathologisch-anatomische Befunde der intestinalen Organe und der assoziierten Lymphknoten (Lnn.) am siebten bzw. 21. Tag p.i.. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Abkürzungen: vergr.=vergrößert, derb=derbe Konsistenz, 0=unauffällig, 1=minimal, 2=mild/leicht, 3=ausgeprägt/deutlich, (Z)=zystisch verändert)

Anhang

133


Mutante

Insgesamt zeigten sich die mit dem Wildtypstamm Y1 und der ΔinvA-Mutante YE21

koinfizierten Minipigs in der Sektion hinsichtlich der pathologisch-anatomischen

Begutachtung sehr unauffällig. Bei der Untersuchung der Nieren fielen bei einem

Ferkel geringgradige, multifokale Nekrosen der Nierenrinde mit perifokaler Fibrose

auf. Dies ließ den Verdacht auf einen älteren Infarkt zu. Zwei Ferkel zeigten leicht

vergrößerte und verhärtete Mandibularlymphknoten. Bei einem Tier waren sie nur

minimal verhärtet und bei einem weiteren zystisch-blasig verändert. Yersinien

konnten jedoch nicht aus diesen Lymphknoten isoliert werden.



Anhang

134

Tab. 8: Pathologisch-anatomische Befunde der intestinalen Organe und der assoziierten Lymphknoten (Lnn.) am siebten Tag p.i.. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Abkürzungen: vergr.=vergrößert, derb=derbe Konsistenz, 0=unauffällig, 1=minimal, 2=mild/leicht, 3=ausgeprägt/deutlich, (Z)=zystisch verändert)

H.3 Detaillierte histopathologische Beurteilung


Der Nachweis von Bakterienkolonien oder Granulationsgewebe im Ileum blieb bei

allen Ferkeln aus, ebenso konnte keine Hyperplasie oder Depletion des

darmassoziierten lymphatischen Gewebes (GALT) beobachtet werden (Tab. 9A). In

den mesenterialen Lymphknoten waren Bakterienkolonien und Entzündungs-

zellinfiltrationen in keiner der Proben zu finden (Tab. 9B).

Anhang

135

Tab. 9: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Ileum (A) und mesenterialen Lymphknoten (B) der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Abkürzungen: (A) Nekr.=Nekrosen; Z.verkürzg.= Zottenverkürzung; Z.fusion= Zottenfusion; Entzdg.allg.=Entzündung allgemeiner Score; Entzdg.LP=Entzündung Lamina propria; Entzdg.PP=Entzündung Peyersche Platten; (B) Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Hypelpl.= lymphatische Hyperplasie; Depl.=lymphatische Depletion; Entzdg.=Entzündung allgemeiner Score; (A und B) NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; Plasmaz.= Plasmazellen; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig)

Zu C.2 Vergleichende Infektionsstudie der Serotypen O:3 und O:8

Eine histologische Untersuchung der Leber und Milz fand bei je vier Tieren pro

Infektionsgruppe (YeO:3 bzw. YeO:8) am siebten und am 21. Tag p.i. statt. Die

Leber- und Milzproben der drei Kontrolltiere wurden am 21. Tag p.i. gewonnen und

ebenfalls histologisch untersucht. Ileum und mesenteriale Lymphknoten (Lnn.

jejunales) wurden am siebten Tag nach der Infektion von insgesamt zehn Tieren pro

Infektionsgruppe und vier Kontrolltieren untersucht. Am 21. Tag p.i. wurden

A

B

Anhang

136

Ileumproben und mesenteriale Lymphknoten von je vier Ferkeln der beiden

Infektionsgruppen und drei Kontrolltieren histologisch untersucht.

Die Befunde der Leberproben sind in Tabelle 10 dargestellt. Die drei an Tag 21. p.i.

sezierten Kontrolltiere wiesen keine Auffälligkeiten des Lebergewebes auf.

Tab. 10: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Leberproben der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Abkürzungen: Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Nekr.=Nekrosen; Entzdg.=Entzündung allgemeiner Score; NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; Plasmaz.=Plasmazellen; Lymph=Lymphozyten; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig)

Anhang

137

In den Milzproben fand sich in der histologischen Untersuchung bei den infizierten

und den Kontrolltieren eine ggr. bis mgr. lymphatische Hyperplasie. Von dieser

abgesehen konnten in den Milzproben keine weiteren Veränderungen gefunden

werden (Tab. 11).

Tab. 11: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Milzproben der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Abkürzungen: Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Hypelpl.=lymphatische Hyperplasie; Depl.=lymphatische Depletion; Entzdg.=Entzündung allgemeiner Score; NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; Plasmaz.=Plasmazellen; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig)

Anhang

138

Die histopathologischen Befunde der Ileumproben sind in Tabelle 12

zusammengefasst. In der Ileumwand eines koinfizierten Tieres konnten

Bakterienkolonien nachgewiesen werden.

Tab. 12: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Ileumproben der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Sektion am siebten (A) bzw. am 21. Tag p.i. (B); Abkürzungen: Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Nekr.=Nekrosen; Z.verkürzg.=Zottenverkürzung; Z.fusion=Zottenfusion; GALT-Hyperpl.=GALT-Hyperplasie; Entzdg.allg.=Entzündung allgemeiner Score; Entzdg.LP=Entzündung Lamina propria; Entzdg.PP=Entzündung Peyersche Platten; NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig)

A

B

Anhang

139

Die Ergebnisse der histologischen Untersuchung der mesenterialen Lymphknoten

sind in Tabelle 13 dargestellt. Am 21. Tag p.i. zeigte ein Tier der Gruppe B (YeO:8)

einen kleinen, fibringefüllten Hohlraum im Lymphknoten.

Tab. 13: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von mesenterialen Lymphknoten der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Sektion am siebten (A) bzw. am 21. Tag p.i. (B); Abkürzungen: Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Hypelpl.=lymphatische Hyperplasie; Depl.=lymphatische Depletion; Entzdg.=Entzündung allgemeiner Score; NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; Plasmaz.=Plasmazellen; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig)

A

B

Anhang

140


Stabilitätsmutante

Ileum und mesenteriale Lymphknoten wurden am siebten Tag nach der Infektion von

insgesamt acht infizierten Ferkeln und vier Kontrolltieren und am 21. Tag p.i. von je

vier Tieren aus der Koinfektions- und Kontrollgruppe histologisch untersucht.

Die histopathologischen Befunde der Ileumproben sind in Tabelle 14

zusammengefasst. Plasmazellen und Granulationsgewebe sowie eine GALT-

Hyperplasie oder –Depletion konnten nicht nachgewiesen werden.

Tab. 14: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Ileumproben der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Sektion am siebten (A) bzw. am 21. Tag p.i. (B); Abkürzungen: Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Nekr.=Nekrosen; Z.verkürzg.=Zottenverkürzung; Z.fusion=Zottenfusion; Entzdg.allg.=Entzündung allgemeiner Score; Entzdg.LP=Entzündung Lamina propria; Entzdg.PP=Entzündung Peyersche Platten; NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig)

A

B

Anhang

141

Die histologische Untersuchung der mesenterialen Lymphknoten ergab sowohl am

siebten als auch am 21. Tag p.i. so gut wie keine Auffälligkeiten. Bakterienkolonien,

eine lymphatische Depletion oder Plasmazellen waren in keiner der Proben

mesenterialer Lymphknoten vermehrt nachweisbar (Tab. 15).




Ileumproben und mesenteriale Lymphknoten wurden vom siebten und 21. Tag nach

der Infektion untersucht. Am siebten Tag p.i. liegen Daten von sieben Ileumproben

vor. Am 21. Tag p.i. fehlte in der Sektion ein Ferkel, das einen Tag p.i. nach der

Blutentnahme verstorben war, somit wurden drei Ileumproben untersucht. Die

mesenterialen Lymphknoten wurden am siebten Tag p.i. von acht und am 21. Tag

p.i. von drei Tieren untersucht. Nachfolgend werden nur die Befunde der infizierten

Ferkel erwähnt, die Kontrolltiere sind identisch mit den im Anhang zu C.3.1

beschriebenen.

Anhang

142

Eine GALT-Hyperplasie oder –Depletion wurde ebenso wie Granulationsgewebe in

keiner der Proben beobachtet. Die Befunde sind in Tabelle 16 aufgeführt. Tab. 16: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Ileumproben der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Sektion am siebten (A) bzw. am 21. Tag p.i. (B); Abkürzungen: Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Nekr.=Nekrosen; Z.verkürzg.=Zottenverkürzung; Z.fusion=Zottenfusion; Entzdg.allg.=Entzündung allgemeiner Score; Entzdg.LP=Entzündung Lamina propria; Entzdg.PP=Entzündung Peyersche Platten; NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; Plasmaz.=Plasmazellen; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig)

Das histologische Bild der mesenterialen Lymphknoten zeigte sich wie auch in den

anderen Versuchen als eher unauffällig. Die Befunde sind in Tabelle 17

zusammengefasst.

A

B

Anhang

143


A

B

Anhang

144


Mutante

Ileumproben und mesenteriale Lymphknoten wurden von insgesamt sieben Tieren

ausschließlich vom siebten Tag nach der Infektion untersucht.

Eine GALT-Hyperplasie konnte nicht beobachtet werden, alle weiteren Befunde sind

in Tabelle 18 dargestellt.

Tab. 18: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Ileumproben der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Sektion am siebten Tag p.i.; Abkürzungen: Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Nekr.=Nekrosen; Z.verkürzg.=Zottenverkürzung; Z.fusion=Zottenfusion; GALT-Depl=GALT-Depletion; Entzdg.allg.=Entzündung allgemeiner Score; Entzdg.LP=Entzündung Lamina propria; Entzdg.PP=Entzündung Peyersche Platten; NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; Plasmaz=Plasmazellen; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig)

Die mesenterialen Lymphknoten (Lnn. jejunales) der Minipigs waren bis auf eine

lymphatische Hyperplasie völlig unauffällig (Tab. 19).

Tab. 19: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von mesenterialen Lymphknoten der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Sektion am siebten Tag p.i.; Abkürzungen: Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Hypelpl.=lymphatische Hyperplasie; Depl.=lymphatische Depletion; Entzdg.=Entzündung allgemeiner Score; NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; Plasmaz.=Plasmazellen; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig)

Anhang

145

H.4 Tabellarische Auflistung der quantitativen Organbelastung

Zu C.1.1.2

Tab. 20: Quantitative Belastung der intestinalen (A) und extraintestinalen (B) Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1. Die Probenahme erfolgte am siebten Tag nach der Infektion mit 108 (Gruppe A), 109 (Gruppe B) bzw. 1010 (Gruppe C) KBE/Tier. (Angaben in KBE/g Organ)

B

A

Anhang

146

Zu C.1.2.4

Tab. 21: Quantitative Belastung der intestinalen (A) und extraintestinalen (B) Organe der einzelnen Minipig-Ferkel. (Probenahme am dritten, siebten, 14. und 21. Tag p.i.; Angaben in KBE/g Organ)

A

B

Anhang

147

Zu C.2.4

Tab. 22: Quantitative Belastung der intestinalen (A) und extraintestinalen (B) Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 oder Serotyp O:8 Stamm 8081v. (Zeitpunkt der Probenahme: sieben oder 21 Tage nach oraler Infektion mit 109 KBE/Tier; Angaben in KBE/g Organ)

Tabelle 22: Fortsetzung und Beschriftung auf der folgenden Seite

A

Anhang

148

Fortsetzung Tab. 22

Zu C.3.1.4

Tab. 23: Quantitative Belastung der Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtypstamm Y1 (wt) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YE14(rovAP98)). (Zeitpunkt der Probenahme: sieben Tage p.i.; Angaben in KBE/g Organ)

B

Anhang

149

Zu C.3.2.4

Tab. 24: Quantitative Belastung der Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtypstamm YE13 (wt) und der PinvAIS1667-Mutante YE15 (YeO:3ΔIS1667). (Probenahme am siebten (A) bzw. 21. Tag p.i.(B), Angaben in KBE/g Organ)

Zu C.3.3.4 Tab. 25: Quantitative Belastung der Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtypstamm Y1 (wt) und der ΔinvA-Mutante YE21 (YeO:3 ΔinvA). Die Tabellen zeigen die Differenz zwischen dem ersten (A) und dem zweiten (B) Koinfektionsversuch. (Probenahme am siebten Tag p.i., Angaben in KBE/g Organ)

A

B

A

B

Anhang

150

H.5 Nährböden, Medien und Antibiotika

H.5.1 Nährböden

1. Blutagar (Fleischextraktpeptonagar mit Zusatz von 3 % defibriniertem Schafblut,

Oxoid Deutschland GmbH)

2. Gassneragar (Wasserblau-Metachromgelb-Laktose-Agar, Oxoid®)

3. CIN-Agar (Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin-/ Yersinia-Agar nach Schiemann)

A. dest: ............................................................................... 1000 ml

Yersinia Selective Agar Base (Oxoid®): ................................... 58 g

- suspendieren, bei 121°C für 15 Min. autoklavieren

- im Wasserbad auf 50-55°C abkühlen lassen

- Yersinia Selective Supplement (Oxoid®) in 4 ml 50 %iger Ethanollösung

zugeben:

(Cefsulodin 15 mg, Irgasan 4 mg; Novobiocin 2,5 mg)

- Carbenicillin Dinatriumsalz (≥ 90 %, Carl Roth GmbH u. Co. KG): 100 mg

ggf.: Kanamycinsulfat (≥750 I.E./mg, Carl Roth®): 50 mg

4. LB-Agar (Luria-Bertani-Agar)

A. dest: ............................................................................... 1000 ml

Bacto-Trypton (Becton-Dickinson GmbH): .............................. 10 g

Hefeextrakt (DifcoTM): ................................................................ 5 g

NaCl (Merck KGaA): ............................................................... 10 g

Agar (Oxoid®): ......................................................................... 15 g


Anhang

151

H.5.2 (Nähr-) Medien:

1. LB-Medium (Luria-Bertani-Medium)

A. dest: ............................................................................... 1000 ml

Bacto-Trypton (Becton-Dickinson®): ........................................ 10 g

Hefeextrakt (Difco®): .................................................................. 5 g

NaCl (Merck®): ........................................................................ 10 g


2. PBS (phosphate buffered saline)

A. dest: ............................................................................... 1000 ml

NaCl (Merck®): ....................................................................... 8,5 g

Na2HPO4 (Merck®): .............................................................. 1,28 g

NaH2PO4 x 2H2O (Merck®): ................................................ 0,156 g

- suspendieren, pH-Wert auf 7,2 einstellen, bei 121°C für 15 Min. autoklavieren

H.5.3 „Bunte Reihe“

1. H2S-Bildung (Kligler)

A. dest: ............................................................................... 1000 ml

Kligler Iron Agar (Becton-Dickinson®): ..................................... 26 g

- erhitzen bei 99,5°C bis Agar flüssig, abfüllen, bei 121°C für 15 Min. autoklavieren

2. Urease (Harnstoff-Dextrose-Agar)

A. dest. ............................................................................... 2000 ml

Casein Pepton (Becton-Dickinson®) ....................................... 18 g

gesättigte Köchsalzlösung ...................................................... 40 ml

K2HPO4 (Merck®) .................................................................... 2 g

Glucose (Merck®) ................................................................... 10 g

Bromthymolblau, alkoholisch (Merck®) .................................. 20 ml

- suspendieren, pH-Wert auf 6,8 einstellen, je 500 ml 6,5 g Agar (Oxoid®)

zugeben bei 121°C für 15 Min.autoklavieren, auf 55°C abkühlen, 5 ml Urease-

Lösung auf 500ml zugeben, steril abfüllen

Anhang

152

3. Citrat-Agar

A.dest (heiß): ...................................................................... 2000 ml

Ammoniumphosphat (NH4H2PO4, Merck®) ............................... 2 g

Dikaliumphosphat (K2HPO4, Merck®): ....................................... 2 g

NaCl (Merck®): ........................................................................ 10 g

Magnesiumsulfat (MgSO4 x 7H2O, Merck®): .......................... 0,4 g

Bromthymolblau, alkoholisch: ................................................. 10 ml

- erhitzen bei 99,5°C bis vollständig gelöst, mit 4 %iger NaOH auf pH 6,6

einstellen, je 500 ml 6,5 g Agar zugeben, bei 121°C für 15 Min. autoklavieren,

auf 55°C abkühlen, 5 ml Natriumcitrat-Lösung auf 500ml zugeben, steril

abfüllen

4. Mannit

Hottinger Bouillon mit 1 % Mannit (Merck®)

- Zucker (Mannit) steril einwiegen, 1 g Zucker auf 100 ml Hottinger Bouillon

5. ODC (Ornithin nach Moeller)

A. dest: ................................................................................. 500 ml

Moeller Decarboxylase (Becton-Dickinson®): ....................... 5,25 g

1 % L-Ornithinmonohydrochlorid (Merck®): ............................... 5 g

- suspendieren, pH-Wert auf 6,0 einstellen, abfüllen, bei 121°C für 15 Min.

autoklavieren

- nach dem Beimpfen mit Paraffin (Merck®) überschichten

6. Indol (Hottinger Bouillon für Indolreaktion)

A. dest: ............................................................................... 1000 ml

NaCl (Merck®): ....................................................................... 2,5 g

K2HPO4 (Merck®): ................................................................ 1,25 g

Casein Pepton (Becton-Dickinson®): ....................................... 10 g

- suspendieren, pH-Wert auf 7,2 – 7,4 einstellen, abfüllen, bei 121°C für 15 Min.

autoklavieren

- zum Ablesen der Reaktion nach der Bebrütung einige Tropfen Kovacz-

Reagenz (KOVACS indole reagent (Merck®) zugeben

Anhang

153

7. O/F-Testbouillon

A. dest: ............................................................................... 1000 ml

OF Testbouillon (Merck®): ....................................................... 11 g

Glucose (Merck®): ................................................................... 10 g

HCl (Merck®): ........................................................................ 0,5 ml

Paraffin (Merck®): ..................................................................... 1 ml

- erhitzen bei 99,5°C bis vollständig gelöst, abfüllen, Hälfte der Röhrchen mit

Paraffin überschichten (erwärmt), bei 121°C für 25 Min. autoklavieren

8. Inosit

Hottinger Bouillon mit 1 % Inosit (Merck®)

- Zucker (Inosit) steril einwiegen, 1 g Zucker auf 100 ml Hottinger Bouillon

9. Rhamnose

Hottinger Bouillon mit 1 % Rhamnose (Merck®)

- Zucker (Rhamnose) steril einwiegen, 1 g Zucker auf 100 ml Hottinger Bouillon

10. Äskulin

A. dest: ................................................................................. 500 ml

NaCl (Merck®): ....................................................................... 2,5 g

Pepton (Oxoid®): ....................................................................... 5 g

Fleischextrakt (Oxoid®): ............................................................. 5 g

NaOH (Merck®): .................................................................. 0,75 ml

- pH-Wert auf 7,2 – 7,4 einstellen

Äskulin (Merck®): .................................................................... 0,5 g

- suspendieren, abfüllen, bei 121°C für 15 Min. autoklavieren

- zum Ablesen der Reaktion nach der Bebrütung einen Tropfen 1 %ige Eisen-

(III)-Chlorid-Lösung (1 g Eisen-III-Citrat (Merck®) in 100 ml A. dest) zugeben

Anhang

154

11. Hottinger Bouillon für die „Bunte Reihe“:

A. dest: .............................................................................. 1000 ml

NaCl (Merck®): ...................................................................... 2,5 g

K2HPO4 (Merck®): ............................................................... 1,25 g

Proteose Peptone No.3 (Becton-Dickinson®): ........................ 10 g

Bromthymolblau wässrig 0,1 %: ............................................ 40 ml

NaOH (Merck®): ...................................................................... 5 ml

- suspendieren, pH-Wert auf 8,4 einstellen, abfüllen, bei 121°C für 15 Min.

autoklavieren

H.5.4 Zusätze

1. Bromthymolblau-Lösung 1,5 %ig, alkoholisch

A. dest (steril): ........................................................................ 24 ml

Alkohol 96 %: ......................................................................... 76 ml

Bromthymolblau (Merck®): ..................................................... 1,5 g

2. Bromthymolblau- Lösung 0,1 %ig, wässrig

Alkohol 96 %: ......................................................................... 10 ml

Bromthymolblau (Merck®): ......................................................... 1g

- über Nacht stehen lassen bis Bromthymolblau ganz gelöst

- A. dest (steril): 990 ml

3. Harnstofflösung

A. dest: ................................................................................... 50 ml

Harnstoff (Merck®): .................................................................. 50 g

4. Na-Citrat-Lösung

A. dest: ................................................................................... 80 ml

Na-Citrat (Merck®): .................................................................. 40 g

- sterilfiltrieren

Anhang

155

H.5.5 Verwendete Antibiotika

1. Gentamicin

- 50 µg/ml in PBS, zur Inkubation der Tonsillen und der Darmproben

2. Carbenicillin

- 100 mg/l im CIN- (Minipigversuche) und LB-Agar (Mausversuche)

3. Kanamycin

- 50 mg/l im CIN- (Minipig) und LB-Agar (Maus) zusätzlich zu Carbenicillin in

der Hälfte der Nährböden zur Unterscheidung der Stämme in Koinfektions-

versuchen

- 25 µg/ml im LB-Medium für die Übernachtkultur kanamycinresistenter Stämme

(Herstellung der Infektionsdosen)

H.6 Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Verwendete Y. enterocolitica Stämme und deren Herkunft. ..........................27

Tab. 2: Biochemische Reaktionen der eingesetzten Y. enterocolitica Stämme. ........29

Tab. 3: Makroskopisch-pathologische Befunde der intestinalen Organe und der

assoziierten Lymphknoten am siebten Tag p.i. .............................................128

Tab. 4: Makroskopisch-pathologische Befunde der intestinalen Organe und der

assoziierten Lymphknoten während der Sektionen zu vier verschiedenen

Zeitpunkten p.i.. ............................................................................................129

Tab. 5: Pathologisch-anatomische Befunde der intestinalen Organe und der

assoziierten Lymphknoten ...........................................................................130


assoziierten Lymphknoten ............................................................................131





Tab. 9: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Ileum (A) und

mesenterialen Lymphknoten (B) der Minipigs. ..............................................135

Anhang

156

Tab. 10: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Leberproben

der Minipigs. ..................................................................................................136

Tab. 11: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Milzproben der

Minipigs. ........................................................................................................137

Tab. 12: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Ileumproben

der Minipigs. ..................................................................................................138

Tab. 13: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von mesenterialen

Lymphknoten der Minipigs. ...........................................................................139


der Minipigs. ..................................................................................................140




der Minipigs. ..................................................................................................142


Lymphknoten der Minipigs. ........................................................................... 143


der Minipigs. ..................................................................................................144



Tab. 20: Quantitative Belastung der intestinalen (A) und extraintestinalen (B)

Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3

Stamm Y1. ....................................................................................................145


Organe der einzelnen Minipig-Ferkel. ...........................................................146


Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3

Stamm Y1 oder Serotyp O:8 Stamm 8081v. .................................................147

Tab. 23: Quantitative Belastung der Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit

Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtypstamm Y1 (wt) und der RovA-

Stabilitätsmutante YE14 (YE14(rovAP98)). .....................................................148


Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtypstamm YE13 (wt) und der

PinvAIS1667-Mutante YE15 (YeO:3ΔIS1667). ...............................................149

Anhang

157


Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtypstamm Y1 (wt) und der ΔinvA-

Mutante YE21 (YeO:3 ΔinvA). ......................................................................149

H.7 Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Zeitlicher Ablauf des Versuchs. ..................................................................... 32

Abb. 2: Quantitative Organbelastung in den drei Dosisgruppen.. .............................. 38

Abb. 3: Prozentualer Anteil der positiv getesteten Tiere in den drei

Dosisgruppen. ................................................................................................. 39

Abb. 4: Prozentualer Anteil der Tiere in den drei Dosisgruppen, die

Y. enterocolitica mit den Faeces ausschieden.. .............................................. 40

Abb. 5: Quantitative Organbelastung der Minipigs zu vier Zeitpunkten nach der

Infektion. ......................................................................................................... 43

Abb. 6: Quantitative Belastung der intestinalen Organe (Jejunum, Ileum,

Caecum, Colon) im Verlauf der Infektion.. ...................................................... 44

Abb. 7: Prozentualer Anteil positiv getesteter Organproben im Bezug zum

Zeitpunkt nach der Infektion. ........................................................................... 45

Abb. 8: Prozentualer Anteil der infizierten Tiere, die Y. enterocolitica mit den

Faeces ausschieden. ...................................................................................... 46

Abb. 9: Bestimmung der Serumantikörper-Titer mittels ELISA im Verlauf der

Infektion.. ........................................................................................................ 47

Abb. 10: Quantitative Organbelastung der Minipigs am siebten Tag (A) bzw. am

21. Tag (B) p.i... .............................................................................................. 51

Abb. 11: Qualitative Organbelastung mit Yersinia enterocolitica Serotyp O:3

Stamm Y1 (YeO:3) oder Serotyp O:8 Stamm 8081v (YeO:8). ........................ 53

Abb. 12: Bakterielle Ausscheidung mit den Faeces nach Infektion mit YeO:3

Stamm Y1 oder YeO:8 Stamm 8081v.. ........................................................... 54

Abb. 13: Bakterielle Ausscheidung mit den Faeces nach Infektion mit YeO:3

Stamm Y1 oder YeO:8 Stamm 8081v. ............................................................ 55

Abb. 14: Bestimmung der Serumantikörper-Titer mittels ELISA im Verlauf der

oralen Infektion mit YeO:3 Stamm Y1 bzw. YeO:8 Stamm 8081v. ................. 56

Anhang

158

Abb. 15: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der

einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1

(YeO:3 wt) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovAP98) ............. 60


einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 (wt)

und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (RovAP98) im Verhältnis zum

Anteil des Inokulums. ...................................................................................... 61


einzelnen Minipig-Ferkel durch die RovA-Stabilitätsmutante YE14

(RovAP98) im Verhältnis zur Belastung durch den Wildtypstamm Y1

innerhalb desselben Tieres. ............................................................................ 62


Stamm Y1 (YeO:3) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3

RovAP98) am siebten (A) und am 21. (B) Tag p.i.. ........................................... 64

Abb. 19: Bakterielle Ausscheidung mit den Faeces nach Koinfektion mit YeO:3

Stamm Y1 (YeO:3) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3

RovAP98). ......................................................................................................... 65

Abb. 20: Bestimmung der Serumantikörper-Titer mittels ELISA vor und nach

oraler Infektion mit YeO:3 Stamm Y1 und der RovA-Stabilitätsmutante

YE14. .............................................................................................................. 66


einzelnen Minipig-Ferkel mit YeO:3 Stamm YE13 (YeO:3wt) und der

PinvAIS1667-Mutante YE15 (YeO:3ΔIS1667). ................................................. 69


einzelnen Minipig-Ferkel mit YeO:3 Stamm YE13 (YeO:3wt) und der

PinvAIS1667-Mutante YE15 (YeO:3ΔIS1667) im Verhältnis zum Anteil des

Inokulums. ....................................................................................................... 70


einzelnen Minipig-Ferkel durch die PinvAIS1667-Mutante YE15

(YeO:3ΔIS1667) im Verhältnis zur Belastung durch den Wildtypstamm

YE13 innerhalb desselben Tieres. .................................................................. 70


Stamm YE13 (YeO:3 wt) und der PinvAIS1667-Mutante YE15

(YeO:3ΔIS1667) am siebten (A) und am 21. (B) Tag p.i.. ............................... 72

Anhang

159


Stamm YE13 (YeO:3 wt) und der PinvAΔIS1667-Mutante YE15 (YeO:3

ΔIS1667). ........................................................................................................ 73

Abb. 26: Bestimmung der Serumantikörper-Titer mittels ELISA vor und nach

oraler Infektion mit YeO:3 Stamm YE13 und der PinvA∆IS1667-Mutante

YE15. .............................................................................................................. 74


einzelnen Minipig-Ferkel mit YeO:3 Stamm Y1 (YeO:3 wt) und der ΔinvA-

Mutante YE21 (YeO:3 ΔinvA). ........................................................................ 78


einzelnen Minipig-Ferkel mit YeO:3 Stamm Y1 (YeO:3 wt) und der ΔinvA-

Mutante YE21 (YeO:3 ΔinvA) im Verhältnis zum Anteil des Inokulums. ......... 78


einzelnen Minipig-Ferkel durch die ΔinvA-Mutante YE21 (YeO:3 ΔinvA)

im Verhältnis zur Belastung durch den Wildtypstamm Y1 innerhalb

desselben Tieres. ............................................................................................ 79


Wildtypstamm Y1 (YeO:3 wt) und der ΔinvA-Mutante YE21 (YeO:3

ΔinvA) am siebten Tag p.i.. ............................................................................. 82


Stamm Y1 (YeO:3 wt) und der ΔinvA-Mutante YE21 (YeO:3 ΔinvA).. ............ 84

Abb. 32: Quantitative Organbelastung mit YeO:3 Stamm Y1 oder YeO:8 Stamm

8081v nach oraler Infektion im Minipig- (A) und Mausmodell (B). ................... 87

Abb. 33: Vergleich der Organbelastungen im Minipig- (A, C, E) und Mausmodell

(B, D, F). ......................................................................................................... 90


(B, D, F). ......................................................................................................... 92


(B, D, F). ......................................................................................................... 94

Danksagung

Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand für die Überlassung des

interessanten Themas, die fachliche Beratung und engagierte Unterstützung

während des Projekts.

Bei Frau Dr. Petra Grüning bedanke ich mich für die gute Betreuung und die vielen

praktischen Tipps im Labor.

Frau Prof. Dr. Petra Dersch, Julia Schaake, M. Sc., Tatjana Stolz und der gesamten

Forschungsgruppe Molekulare Infektionsbiologie vom Helmholtz Zentrum für

Infektionsforschung (HZI) in Braunschweig danke ich ganz besonders für die gute

Zusammenarbeit, die konstruktiven Gespräche und die Unterstützung an Infektions-

und Sektionstagen.

Dr. Alexandra von Altrock, Dr. Doris Höltig, Dunja Herfert, Klaus Schlotter und den

Mitarbeitern des Labors der Klinik für kleine Klauentiere danke ich für die

Durchführung der hämatologischen und serologischen Untersuchungen, die

Archivierung der Proben und ganz besonders für die praktische Unterstützung bei

Blutentnahmen, Sektionen und klinischen Notfällen.

Dr. Frauke Seehusen aus dem Institut für Pathologie gilt mein Dank für die

histopathologische Untersuchung der Organproben, die geduldige Beantwortung

vieler Fragen und ihre Hilfe bei der korrekten Formulierung der Befunde.

Ich danke Herrn Prof. Dr. Lothar Kreienbrock und Herrn Dr. Martin Beyerbach aus

dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung für die

Beratung und Unterstützung bei der statistischen Auswertung und die geduldige

Einarbeitung in das Programm SAS®.

Bei Dr. Stefanie Schmeiser, Günter Thiem und allen anderen Mitarbeitern des

Referenzlabors der Europäischen Kommission für die Klassische Schweinepest

(KSP) des Instituts für Virologie möchte ich mich ganz herzlich für die freundliche

Unterstützung während der in der Isolierstation durchgeführten Tierversuche

bedanken.

Mein Dank gilt ausserdem Werner Scharnhorst, Florian Rögener, Jenny Pawlik,

Dörte Krause, Katrin Hail, Henrike Eulenburg und Marina Behling für die Mitarbeit in

den Tierversuchen und besonders für die zuverlässige und fürsorgliche Betreuung

der Minipigs. Bei Herrn Jens-Oliver Minx vom Lehr- und Forschungsgut Ruthe

bedanke ich mich für die nette und unkomplizierte Zusammenarbeit im Vorfeld der

Tierversuche, die Ermöglichung von Blutentnahmen, Futterumstellungen und die

Übermittlung von Geburtsdaten und Fotos.

Allen Mitarbeitern des Instituts für Mikrobiologie aus den verschiedenen

Arbeitsgruppen und Abteilungen danke ich herzlich für die jederzeit von vielen Seiten

erfahrene Hilfsbereitschaft und für das nette Arbeitsklima, dass mir viel Spaß an

diesem Projekt bescherte.

Den Mitgliedern des Forschungsverbunds FBI-Zoo danke ich für den regen

Gedanken-, Ideen- und Ergebnisaustausch, die gute Kooperation und die ebenso

informativen wie netten Treffen im Rahmen des Projekts.

Mein besonderer Dank gilt Jörch Merkel für seine geduldige Hilfe bei diversen

Computer- und sonstigen Problemen, für Ermunterung und Antrieb, wenn nötig, für

nettes und lustiges Beisammensein und für Schokolade.

Meiner Familie und meinen Freunden danke ich für ihren Rückhalt und ihre

Unterstützung in allen Lebenslagen, für Glück, Freude, Gelassenheit, Trost, Kraft

und einen doppelten Boden.

Charakterisierung der Yersinia enterocolitica · Juli 2012, ISBN 978-3-86345-080-9 A. Drees, P....

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