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  • Charakterisierung von ausgewählten

    Protein-Phosphatasen und MATE-Proteinen aus Arabidopsis thaliana

    Dissertation

    zur Erlangung des akademischen Grades

    "doctor rerum naturalium"

    (Dr. rer. nat.)

    in der Wissenschaftsdisziplin „Molekularbiologie“

    eingereicht an der

    Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

    der Universität Potsdam

    von

    Klaus Pellengahr

    Oktober 2004

    Diese Arbeit wurde am Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie in

    Golm und am Institut für Biochemie und Biologie der Universität Potsdam

    in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Bernd Müller-Röber angefertigt.

  • meiner Mutter gewidmet

  • i

    Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis.......................................................................................... i

    Abkürzungsverzeichnis.................................................................................. v

    Tabellen- und Abbildungsverzeichnis............................................................ vii

    I. Einleitung....................................................................................................... 1

    I.1. Schließzellen dienen als Modellsystem zum Verständnis pflanzlicher Zell-

    funktion..........................................................................................................

    1

    I.1.1. Die Schließzellbewegung wird durch den Membrantransport von Ionen

    gesteuert........................................................................................................

    2

    I.1.2. Wichtige Signalmoleküle innerhalb der Schließzelle..................................... 4

    I.1.2.1. Kalzium fungiert als zentrales Signalmolekül in der Schließzelle.................. 4

    I.1.2.2. ROS und NO……………………………………………………………………… 5

    I.1.2.3. PIP, IP und cADPR………………………………………………………………. 5

    I.1.3. Weitere Proteine mit wichtigen Funktionen in Schließzellen......................... 6

    I.1.4. Beeinflussung der Schließzellfunktion durch posttranslationale Modifika-

    tionen.............................................................................................................

    6

    I.1.4.1. Einfluss von Farnesylierung auf die stomatäre Signaltransduktion............... 6

    I.1.4.2. Einfluss von Protein-Kinasen auf die stomatäre Signaltransduktion............. 7

    I.1.4.3. Einfluss von Protein-Phosphatasen auf die stomatäre Signaltransduktion... 8

    I.1.5. Zielsetzung (PP-Teil)..................................................................................... 10

    I.2. Membranproteine in Arabidopsis thaliana..................................................... 12 I.2.1. Translokatoren und Kanalproteine................................................................. 12

    I.2.2. Membranprotein-Familien aus Arabidopsis thaliana...................................... 13 I.2.3. Die MATE-Familie von Membranproteinen.................................................... 15

    I.2.4. Zielsetzung (MATE-Teil)................................................................................ 16

    II. Material und Methoden.................................................................................. 17

    II.1. Chemikalien................................................................................................... 17

    II.2. Reaktionskits................................................................................................. 17

    II.3. Enzyme.......................................................................................................... 17

    II.4. Pflanzen......................................................................................................... 18

    II.5. Xenopus laevis.............................................................................................. 18 II.6. Bakterien- und Hefestämme.......................................................................... 18

    II.7. Oligonukleotide.............................................................................................. 19

    II.8. Vektoren…………………………………………………………………………… 21

  • ii

    II.9. Puffer, Lösungen und Medien…………………………………………………… 21

    II.10. Programme und Datenbanken zur in silico Analyse...................................... 22 II.11. Auftrennung, Modifikation und Klonierung von DNA .................................... 23

    II.12. Präparation von DNA und RNA aus pflanzlichen Geweben.......................... 23

    II.13. Präparation von Plasmid-DNA aus Escherichia coli und Agrobacterium tumefaciens................................................................................................... 23

    II.14. Präparation von RNA aus Saccharomyces cerevisiae.................................. 24 II.15. PCR............................................................................................................... 24

    II.16. In vitro Transkription...................................................................................... 24 II.17. cDNA-Synthese............................................................................................. 24

    II.18. RNA-Blot Analyse………………………………………………………………… 25

    II.19. Transformation von E. coli, A. tumefaciens und S. cerevisiae……………… 25 II.20. Transformation von Arabidopsis thaliana......………………………………… 25 II.21 Kultivierung von Arabidopsis thaliana............................................................ 25 II.22. GUS-Färbung................................................................................................ 26

    II.23. Präparation von Xenopus laevis Oozyten...................................................... 26 II.24. Injektion von cRNA in Xenopus laevis Oozyten............................................. 26

    III. Ergebnisse..................................................................................................... 27

    III.1. Charakterisierung ausgewählter Protein-Phosphatasen aus A. thaliana....... 27 III.1.1. TOPP2……………………………………………………………………………...

    III.1.1.1. RNA-Blot Analyse der Expression von EST74 und TOPP2.......................... 27 III.1.1.2. Expressionsanalyse von TOPP2 mittels Promotor-GUS Fusionen............... 29 III.1.1.3. Reduktion der TOPP2-Genaktivität in Arabidopsis thaliana.......................... 31 III.1.2.

    Identifikation und Charakterisierung weiterer Protein-Phosphatasen aus

    EF..................................................................................................................

    34

    III.1.2.1. Screeningstrategie......................................................................................... 34

    III.1.2.2. Isolation neuer PP-Transkripte aus EF……………………………………….. 35

    III.1.2.3.

    Untersuchung der zellulären Expression von TOPP1, TOPP5, STH1 und STH2..............................................................................................................

    37

    III.1.2.3.1. Analyse von TOPP1- und TOPP5-Promotor vermittelter gusA-Expression 38 III.1.2.3.2. Analyse von STH1- und STH2-Promotor vermittelter gusA-Expression........ 40 III.1.3. Identifikation und Analyse von STH1-Insertionsmutanten............................. 42 III.2.

    Identifikation und Charakterisierung von Membranproteinen der NIC-

    Familie ..........................................................................................................

    45

    III.2.1. Identifikation von NIC1................................................................................... 45

    III.2.1.1. Klonierung eines EF-spezifischen PCR-Produkts......................................... 45

  • iii

    III.2.1.2. In silico Analyse von Fragment 9-4................................................................ 46 III.2.1.3.

    Homologie von NIC1 zu Proteinen aus A. thaliana und anderen Organis- men................................................................................................................

    47

    III.2.1.4. Klonierung von NIC1...................................................................................... 53 III.2.2. Heterologe Expression von NIC1 in Xenopus laevis Oozyten……………..... 54 III.2.2.1. NIC1 induziert spannungsabhängige Ströme in Xenopus laevis Oozyten.. 54 III.2.2.2. Chlorid-Abhängigkeit der NIC1-induzierten Ström