Charakterisierung von Pannexin1 in einem experimentellen Modell der Ischämie

Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie und Biotechnologie an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften

der Ruhr Universität Bochum

angefertigt in der Abteilung für Neuroanatomie und Molekulare Hirnforschung

vorgelegt von Meike S. Roux

aus Münster (Westf.)

Bochum Februar 2012

Characterization of Panx1 in an experimental model of ischemia

Dissertation to obtain the degree Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.)

at the Faculty of Biology and Biotechnology International Graduate School of Biosciences

Ruhr-University Bochum

Department of Neuroanatomy and Molecular Brain Research

submitted by Meike S. Roux

from Münster (Westf.), Germany

Bochum February 2012

Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis ............................................................................................ VI  

Tabellenverzeichnis .............................................................................................. VIII  

Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................ IX  

1 Einleitung ...................................................................... 1  

1.1   Die Pannexin Proteinfamilie ........................................................................... 1  

1.1.1   Die Geschichte der Pannexin Proteinfamilie .............................................. 1  

1.1.2   Struktur der Gap Junction Proteine .......................................................... 3  

1.1.3   Expression der Pannexine .......................................................................... 5  

1.2   Eigenschaften und Funktionen von Panx1 ...................................................... 6  

1.2.1   Regulation des Kanals ................................................................................ 6  

1.2.2   Panx1 bei der Weiterleitung von Ca2+-Wellen und ATP-Ausschüttung .... 9  

1.2.3   Panx1 und pathologische Prozesse ........................................................... 11  

1.3   Panx1 und Ischämie ...................................................................................... 14  

1.3.1   Modell Hippocampus ................................................................................ 14  

1.3.2   Hemikanäle des Hippocampus .................................................................. 16  

1.3.3   Zelluläre und molekulare Reaktionen auf Ischämie .................................. 18  

1.3.4   Panx1 und Cx43 im ischämischen Hippocampus ..................................... 22  

2 Zielsetzung ................................................................ 27  

2.1   Klonierung und Expression zweier neuer Panx1-Spleißvarianten ................ 27  

2.2   Etablierung des experimentellen Ischämiemodells ...................................... 27  

2.3   Charakterisierung des neuen Panx1-KO-Mausmodells ................................ 28  

2.4   Charakterisierung neuronaler Kulturen bei Ischämie .................................. 28  

2.5   Bestimmung elektrophysiologischer Aktivität bei Ischämie ........................ 28  

2.6   Expressionsanalyse von Genen der synaptischen Plastizität ....................... 29  

3 Material und Methoden .............................................. 30  

II

3.1   Geräte ........................................................................................................... 30  

3.2   Verbrauchsmaterialien ................................................................................... 31  

3.3   Chemikalien, Enzyme und Antikörper .......................................................... 32  

3.3.1   Chemikalien ............................................................................................. 32  

3.3.2   Kits .......................................................................................................... 34  

3.3.3   Enzyme .................................................................................................... 35  

3.3.4   Antikörper ................................................................................................ 35  

3.4   Oligonukleotide und Plasmide ....................................................................... 36  

3.4.1   Oligonukleotide ........................................................................................ 36  

3.4.2   Plasmide ................................................................................................... 40  

3.5   Versuchsorganismen ...................................................................................... 40  

3.5.1   Bakterien .................................................................................................. 41  

3.5.2   Eukaryotische Zelllinien ........................................................................... 41  

3.5.3   Tiere ......................................................................................................... 41  

3.6   Medien und Lösungen ................................................................................... 42  

3.6.1   Bakterienmedien ...................................................................................... 42  

3.6.2   Zellkulturmedien und Lösungen ............................................................... 43  

3.6.3   Lösungen für die Molekularbiologie .......................................................... 43  

3.6.4   Lösungen für die Proteinbiochemie .......................................................... 44  

3.6.5   Lösungen für die Immuncyto- und Immunhistochemie ............................ 44  

3.6.6   Physiologische Lösungen .......................................................................... 45  

3.6.7   Lösungen zur metabolischen Inhibition (MI) ........................................... 45  

3.7   Molekularbiologie .......................................................................................... 46  

3.7.1   Methoden für die Präparation und Analyse von DNA ............................. 46  

3.7.2   Methoden für die Präparation und Analyse von RNA ............................. 49  

3.7.3   Genotypisierung transgener Mäuse .......................................................... 50  

3.7.4   Expressionsanalyse durch qRT-PCR ........................................................ 50  

3.7.5   Bioinformatik ........................................................................................... 51  

III

3.8   Protein-biochemische Methoden .................................................................... 52  

3.8.1   SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ............................... 52  

3.8.2   Western Blot ............................................................................................ 52  

3.9   Zellkultur ....................................................................................................... 53  

3.9.1   Kultivierung von N2a-Zellen .................................................................... 53  

3.9.2   Präparation und Kultivierung von Neuronenkulturen ............................. 53  

3.9.3   Transiente Transfektion ........................................................................... 54  

3.9.4   Fixierung und Kernfärbung von Zellkulturen .......................................... 54  

3.10   In vitro-Testverfahren .................................................................................. 55  

3.10.1   Zellaktivitätstest .................................................................................... 56  

3.10.2   Zytotoxizitätstest durch Messung der LDH-Ausschüttung .................... 56  

3.11   Immunhistochemie und Morphologie ............................................................ 57  

3.11.1   Gewebevorbehandlung ............................................................................ 57  

3.11.2   Fluoreszenz-Immunhistochemie .............................................................. 58  

3.11.3   Peroxidase-Immunhistochemie ............................................................... 59  

3.11.4   Herstellung von Semidünnschnitten ....................................................... 60  

3.11.5   Immuncytochemie .................................................................................. 61  

3.12   Mikroskopische Methoden ............................................................................ 61  

3.12.1   Konfokale Laser Scanning-Mikroskopie .................................................. 61  

3.12.2   Lichtmikroskopische Dokumentation ..................................................... 62  

3.12.3   Farbstoffefflux Messungen ...................................................................... 62  

3.13   Extrazelluläre Feldpotenzialmessungen ........................................................ 62  

3.13.1   Präparation hippocampaler Horizontalschnitte ...................................... 62  

3.13.2   Elektrophysiologie .................................................................................. 63  

3.14   Datenanalyse ................................................................................................ 65  

4 Ergebnisse ................................................................. 66  

4.1   mPanx1 hat zwei alternative Spleißvarianten ............................................... 66  

IV

4.1.1   Beschreibung der zwei neuen Spleißvarianten .......................................... 67  

4.1.2   Genomische Analyse von mPanx1ext ....................................................... 69  

4.1.3   RT-PCR Analyse ..................................................................................... 70  

4.1.4   Klonierung und Überexpression in N2a-Zellen ......................................... 71  

4.1.5   Charakterisierung der Spleißvarianten im Western Blot .......................... 75  

4.2   Etablierung eines Modells der in vitro-Ischämie ........................................... 78  

4.2.1   Antikörperfärbungen ................................................................................ 78  

4.2.2   Efflux Experimente mit Fluoreszenzfarbstoff ........................................... 79  

4.2.3   Messung der LDH-Ausschüttung aus Rattenneuronen bei MI ................. 82  

4.2.4   Messung metabolischer Aktivität von Rattenneuronen bei MI ................ 83  

4.3   Charakterisierung der Panx1-KO-Maus ........................................................ 86  

4.3.1   Genotypisierung der Panx1-KO-Maus ..................................................... 86  

4.3.2   Morphologische Analyse der Panx1-KO-Maus ......................................... 87  

4.4   Analyse der Panx1-Funktion bei in vitro Ischämie durch

Verwendung des Panx1-KO-Mausmodells ..................................................... 96

4.4.1   Messung der LDH-Ausschüttung aus Mausneuronen bei MI ................... 97  

4.4.2   Panx1-KO-Neurone sind bei MI besser vor Aktivitätsverlust geschützt .. 99  

4.4.3   Morphologische Veränderungen hippocampaler Schnitte bei MI ........... 101  

4.4.4   Messung von Feldpotenzialen hippocampaler Schnitte bei MI ............... 103  

4.4.5   Untersuchung zur differenziellen Genexpression

von Regulatoren der synaptischen Plastizität bei MI ........................... 117  

5 Diskussion ............................................................... 121  

5.1   Zusammenfassung ....................................................................................... 121  

5.2   Panx1-KO-Neurone sind besser vor MI geschützt ....................................... 124  

5.3   Panx1 spielt eine Rolle für die Funktion des hippocampalen

Netzwerks bei Ischämie ............................................................................... 130  

5.4   Transkriptionelle Veränderungen im Panx1-KO bei MI ............................. 138  

V

5.5   Schlussfolgerung zur Rolle von Panx1 bei Ischämie .................................... 142  

5.6   Ausschluss alternativer Panx1-Spleißvarianten auf Protein-Ebene ............. 144  

6 Ausblick ................................................................. 146  

7 Zusammenfassung .................................................... 149  

8 Literaturverzeichnis ................................................. 153  

Anhang .......................................................................... i  

A1   Plasmide ............................................................................................................ i  

A1.1   pCR3.1 mPanx1wt ...................................................................................... i  

A1.2   pCR3.1 mPanx1ext .................................................................................... ii  

A1.3   pCR3.1 mPanx1tru ................................................................................... iii  

A1.4   pRK5 mPanx1wt ....................................................................................... iv  

A1.5   pRK5 mPanx1ext ....................................................................................... v  

A1.6   pRK5 mPanx1tru ...................................................................................... vi  

A1.7   pEGFP-N3 mPanx1ext ............................................................................ vii  

A2   Western Blot Analyse des Panx1-KO ............................................................ viii  

Lebenslauf ................................................................... ix  

Danksagung ................................................................. xi  

Erklärung .................................................................. xiii  

VI

Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Strukturelle Organisation von Gap Junction-Kanälen und Plaque. ................ 2  

Abb. 2: Struktureller Vergleich von Connexinen, Innexinen und Pannexinen. ............ 4  

Abb. 3: Mögliche Anordnung von Connexonen zur Bildung von GJ Kanälen. ............ 5  

Abb. 4: Mögliche Rolle von Panx1 in Ca2+-Wellen. ................................................... 10  

Abb. 5: Modell von Panx1-vermittelter Transmission in einer Synapse. .................... 12  

Abb. 6: Modell eines Maushippocampus .................................................................... 16  

Abb. 7: Darstellung der Lokalisation von Hemikanälen im Hippocampus. ................ 19  

Abb. 8: Schema der Knock-out Strategie des konditionalen Panx1-KO ..................... 42  

Abb. 9: Überblick über die Präparation von 250 µm hippocampale Schnitte ............ 63  

Abb. 10: Synchroslice-Komplettsystem ...................................................................... 64  

Abb. 11: Elektrodenplatzierung in Hippocampusschnitten ......................................... 65  

Abb. 12: Genomisches Modell von mPanx1-Spleißvarianten. ..................................... 67  

Abb. 13: Ergebnisse dreier Proteinvorhersageprogramme für mPanx1-Varianten. .... 69  

Abb. 14: Expressionsanalyse der mPanx1-Varianten in verschiedenen Geweben. ...... 72  

Abb. 15: Zeitverlauf überexprimierter mPanx1-Varianten in N2a-Zellen. .................. 74  

Abb. 16: Vergleich unterschiedlich getaggter mPanx1-Varianten in N2a-Zellen. ....... 76  

Abb. 17: Western Blot Analyse von Lysaten der mPanx1-Varianten. ....................... 77  

Abb. 18: Antikörperfärbung hippocampaler Primärkulturen. .................................... 80  

Abb. 19: Zeitverlauf einer Farbstoffefflux Messung. ................................................... 82  

Abb. 20: Messung der LDH-Ausschüttung aus Ratten Neuronen bei MI. .................. 84  

Abb. 21: Messung der metabolischen Aktivität von Ratten Neuronen bei MI. .......... 85  

Abb. 22: Untersuchung des Panx1-KO durch analytische PCRs. .............................. 86  

Abb. 23: Makroskopische Darstellung von Panx1-KO- und WT-Gehirn. .................. 88  

Abb. 24: Immunfärbung hippocampaler Strukturen von Panx1-KO und WT ........... 90  

Abb. 25: Feinstruktur des Hippocampus bei Panx1-KO und WT ............................. 93  

Abb. 26: Cb- und Parv-Peroxidase-Immunhistochemie im Hippocampus .................. 95  

VII

Abb. 27: Messung der LDH-Ausschüttung aus isolierten Mausneuronen bei MI. ...... 98  

Abb. 28: Messung der metabolischen Aktivität an Mausneuronen bei MI. .............. 100  

Abb. 29: Morphologische Veränderungen hippocampaler Schnitte bei MI. .............. 103  

Abb. 30: Exemplarische Kurvenverläufe elektrophys. Feldpotenzialmessungen. ...... 106

Abb. 31: Feldpotenzialmessungen an hippocampalen Schnitten .............................. 110  

Abb. 32: Verhältnis der verschiedenen Kurvenverläufe nach Kondition. ................. 112  

Abb. 33: Feldpotenzialmessungen an hippocampalen Schnitten mit BIC. ............... 114  

Abb. 34: Verhältnis der verschiedenen Kurvenverläufe mit BIC. ............................ 116  

VIII

Tabellenverzeichnis Tab. 1: Expression der Pannexine im Organismus. ...................................................... 7  

Tab. 2: Liste primärer Antikörper, die in dieser Arbeit verwendet wurden. .............. 35  

Tab. 3: Liste sekundärer Antikörper, die in dieser Arbeit verwendet wurden. ........... 36  

Tab. 4: Oligonukleotide für Klonierungen und Sequenzierungen ............................... 36  

Tab. 5: Liste der durch in vitro Rekombination generierter Plasmide. ...................... 40  

Tab. 6: Schema zum Ansatz einer Standard PCR Reaktion. ..................................... 46  

Tab. 7: Schema zum Ansatz einer PCR Reaktion für die Genotypisierung. .............. 50  

Tab. 8: Genexpressionsanalyse hippocampaler Schnitte bei MI. .............................. 120  

IX

Abkürzungsverzeichnis aa Aminosäuren

A. dest. Aqua dest

ACSF artifizelles cerebrales spinal Fluid

AK Antikörper

A Ampère

AMPA α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4 isoxazolepropionic acid

Amp Ampicillin

ANOVA Varianzanalyse (engl. „analysis of variance“)

APS Ammoniumpersulfat

ARC engl. „activity-regulated cytoskeleton-associated protein“

ATP Adenosintriphosphat

β-ME β- Mercaptoethanol

BIC Bicucullin

bp Basenpaar(e)

BSA Albumin (engl. „bovine serum albumine“)

cAMP cyclisches Adenosinemonophosphat

CA Cornu ammonis

CB Calbindin

CBX Carbenoxolone

cDNA komplementäre DNS (engl. „complementary DNA")

CIAP engl. „Calf-Intestine-Alkalische Phosphatase“

CR Calretinin

CSD kortikale Streudepolarisation

(engl. „cortical spreading depression“)

CT Carboxy-Terminus

Cx Connexin

X

Da Dalton

DAB 3,3’-Diaminobenzidin

DIV Tage in vitro (engl. „days in vitro“)

dSG dorsales Stratum granulare

DMSO Dimethylsulfoxid

D-MEM engl. „Dulbecco´s Modified Eagle Medium“

DNA/DNS Desoxyribonukleinsäure

DNAse I Desoxyribonuklease I

dNTPs Desoxyribose Nukleosidtriphosphate

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EGFP (engl. „enhanced“ - verstärktes) grün fluoreszierendes Protein

EGTA Ethylendioxy-bis-(ethylennitrilo)-tetraessigsäure

elektrophysiol. elektrophysiologisch

ER endoplasmatisches Retikulum

EtBr Ethidiumbromid

EtOH Ethanol

ext engl. „extended“ - verlängert

FCS fetales Kälberserum

fEPSP exzitatorische postsynaptische Feldpotenziale (engl. „field excita-

tory postsynaptic potential“)

FFA Flufenaminsäure

GABA γ-Aminobuttersäure

GABRA GABAA-Rezeptor

GD Gyrus dentatus

GFAP gliales fibrilläres azidisches Protein (engl. „glial acidic protein“)

GFP grün fluoreszierendes Protein

GJ Gap Junction

XI

Glu Glutamat/Glutaminsäure

GLUT Glucosetransporter

GRM metabotroper Glutamatrezeptor

GUSB Glucuronidase-β

H Hilus

HBSS Hank´s balancierte Salzlösung

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-Piperazinyl)-Ethansulfonsäure

HIF engl. „hypoxia inducible factor“

hipp. hippocampal

HSP90 engl. „heat shock protein 90“

ICC Immuncytochemie

IHC Immunhistochemie

IL-1β Interleukin-1β

INL innere Körnerschicht

Inx Innexin

IP3 Inositoltrisphosphat

IV elektrischer Strom/Spannung

KCN Kaliumzyanid

Kana Kanamycin

KO Knock-out

LB LB Medium (engl. „lysogeny broth“)

LDH Lactatdehydrogenase

m Maus

MCS Polylinker (engl. „multiple cloning site“)

MeOH Methanol

MFQ Mefloquine

MI metabolische Inhibition

min Minute

XII

mRNA/mRNA Boten-RNS (engl. „messenger“)

N2a Neuroblastoma 2a oder Neuro 2a

NCBI National Center for Biotechnology Information

NEA nicht-essentielle Aminosäuren

NGS normales Ziegen Serum (engl. „normal goat serum“)

NMDA N-Methyl-D-Aspartat

NO Stickstoffmonoxid

NT Amino-Terminus

OGD Sauerstoff/Glucose Entzug (engl. „oxygen/glucose deprivation“)

ONL äußere Körnerschicht

ORF offener Leserahmen (engl. „open reading frame“)

PS Polymorph Schicht

P/S Penicillin/Streptomycin

P2XR P2X-Rezeptor

P2YR P2Y-Rezeptor

Panx Pannexin

PBS phosphatgepufferte Salzlösung

PBS-T phosphatgepufferte Salzlösung mit 0,1% Tween20

PCMV IE Cytomegalovirus Immediate-Early Promotor

PCR Polymerase-Kettenreaktion (engl. „polymerase chain reaction“)

PEG Polyethylenglycol

PFA Paraformaldehyd

PKC Proteinkinase C

PLL poly-L-Lysin

PNS peripheres Nervensystem

PS Polymorph Schicht

pS pico Siemens

PSD postsynaptische Dichte

XIII

PV Parvalbumin

qRT-PCR quantitative Realtime-PCR

RNA/RNS Ribonukleinsäure

RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse Transkriptase-PCR

s Sekunde

SD Standartabweichung (engl. „standard deviation“)

SDS Natriumdodecylsulfat

SDS-PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese (engl. „sodium dodecylsulfate

polyacrylamide gel electrophoresis“)

SEM Standardfehler (engl. „standard error of the mean“)

SG Stratum granulare

SO Stratum oriens

SM Stratum moleculare

SP Stratum pyramidale

SPES Standard physiologische extrazelluläre Lösung (engl. „standard

physiological extracellular solution“)

SR Stratum radiatum

Std. Stunde

TAE Tris-Acetat-EDTA

TCEP Tris(2-chlorethyl)phosphat

TEMED Tetramethylethylendiamin

TM Transmembran

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

tru engl. „truncated“ - verkürzt

U Unit

UpM Umdrehungen pro Minute

UTP Uridintriphosphat

XIV

UTR untranslatierter Bereich (engl. „untranslated region“)

ü.N. über Nacht

V Volt

vSG ventrales Stratum granulare

WB Western Blot

WT Wildtyp

ZNS zentrales Nervensystem

1 Einleitung

1.1 Die Pannexin Proteinfamil ie

1.1.1 Die Geschichte der Pannexin Proteinfamil ie

Die Familie der Pannexine (Panx) wurde im Jahr 2000 in Vertebraten als sequenz-

homolog zur Familie der Innexine gefunden (Panchin et al. 2000). Bis zu diesem

Zeitpunkt wurde angenommen, dass es sowohl für Invertebraten als auch für Ver-

tebraten nur jeweils eine Proteinfamilie gibt, die Gap Junction-Kanäle formen kann:

Innexine (Inx) für die Invertebraten (Phelan & Starich 2001) und Connexine (Cx),

mit mindestens 21 Vertretern im Menschen (Sohl & Willecke 2003), für die Chorda-

ten. Mit den Pannexinen (von „pan“, griech. für „überall“) wurde nun eine Gruppe

von Proteinen gefunden, die sowohl in Invertebraten als auch in Vertebraten vor-

kommt (Panchin et al. 2000). Die drei Mitglieder der neuen Proteinfamilie, Panx1,

Panx2 und Panx3, weisen neben der Sequenzhomologie zu der Familie der Innexine

eine zusätzliche Strukturhomologie zu den Connexinen auf.

Gap Junctions sind Proteinkomplexe, die Poren zwischen benachbarten Zellen bilden

und deren intrazelluläre Kompartimente miteinander verbinden (Abb. 1). Diese Art

der Zell-Zell Kommunikation ist in fast allen Geweben nachweisbar und in multizellu-

lären Organismen essentiell, was durch die evolutiv unabhängige Entstehung zweier

Proteinfamilien verdeutlicht wird (Panchin 2005). Der Lebenszyklus der Connexine

und Innexine beginnt, wenn sie sich im ER/Golgi als hexamere Halbkanäle (auch

Hemikanäle, s. Abb. 1) formieren. Sie werden nachfolgend in die Zellmembran inse-

riert und bilden mit Hemikanälen benachbarter Zellen die Gap Junction-Kanäle. Die

Zusammenlagerung von mehreren hundert Kanälen wird als Gap Junction-Plaque

bezeichnet (Saez et al. 2003). Diese Kanalkomplexe dienen dem interzellulären mole-

kularen Austausch und im Nervensystem als elektrische Synapsen. Neben der zellver-

bindenden Funktion von Gap Junctions kann sich eine Zelle auch durch Hemikanäle

dem Extrazellularraum öffnen (Goodenough & Paul 2003). Für Pannexine wurde auf

1 Einleitung

2

Grund der Struktur- und Sequenzhomologie ebenfalls die Fähigkeit zur Bildung von

Gap Junction-Kanälen postuliert. Bisher konnte eine physiologische Funktion von

Pannexinen als Gap Junction-Kanäle jedoch nicht nachgewiesen werden. Dies könnte

auf strukturelle Besonderheiten der Pannexine zurückzuführen sein, die in Abschnitt

1.1.2 noch genauer erläutert werden. Hingegen gibt es viele Studien, in denen eine

Funktion der Pannexine als Hemikanäle angenommen wird (zusammengefasst in

(Dahl & Locovei 2006). Daher verständigten sich führende Wissenschaftler dieses

Forschungsfeldes kürzlich darauf, im Zusammenhang mit Pannexinen nur noch von

Pannexin-Kanälen zu sprechen und nicht, wie in der Vergangenheit üblich, von He-

mikanälen (Sosinsky et al. 2011). Diese Terminologie wird auch in dieser Arbeit ver-

wendet.

Abb. 1: Strukturelle Organisation von Gap Junction-Kanälen und Plaque. Typische Anordnung von Gap Junction-Kanälen in einem Gap Junction Plaque, in den Membranen zweier benachbarter Zellen. Connexone werden durch Vesikelfusion in die Membran inseriert. Während der lateralen Diffusion kommt es zur Fusion gegenüberliegender Hemikanäle benachbarter Zellen und zur Ausbildung von interzellulären Gap Junction-Kanälen. Für einige Connexine und Pannexine sind funktionale ungekoppelte Kanäle beschrieben worden. (Illustration von Helga Schulze, verändert)

1 Einleitung

3

1.1.2 Struktur der Gap Junction Proteine

Strukturell bilden alle drei Proteinfamilien Moleküle mit charakteristischem Muster

aus. Sie bestehen aus vier Transmembrandomänen, die durch zwei extrazelluläre und

eine intrazelluläre Schleife getrennt sind und werden von einem intrazellulären N-

und C-Terminus flankiert (Abb. 2; (Panchin 2005). Diese Struktur erlaubt die hexa-

mere Anordnung der Moleküle in der Membran zur Formierung eines „Poren-

Komplexes“ (Unger et al. 1997, Unger et al. 1999). Für Panx1 und Panx3 wird diese

Sekundärstruktur ebenfalls vorhergesagt, während Panx2 ein Octamer bildet

(Ambrosi et al. 2010).

Nur wenige Studien beschäftigen sich mit dem Oligomerisierungsprozess der

Cx/Panx-Monomere. Die vorliegende Literatur besagt, dass eine Oligomerisierung im

endoplasmatischen Retikulum (ER) oder einer post-ER Struktur stattfindet (Boassa

et al. 2008, Goodenough & Paul 2003, Laird 2006, Martin et al. 2001, Musil &

Goodenough 1991). Für Panx1 konnte kürzlich gezeigt werden, dass seine C-terminale

Region für den Oligomerisierungsprozess und den Transport des Proteins zuständig

ist (Gehi et al. 2011). Von Cx Hemikanälen ist bekannt, dass sie durch einen Mikro-

tubuli basierten Signalweg in die Plasmamembran inseriert werden, sobald die Hemi-

kanäle gebildet wurden (Martin et al. 2001). Pannexine zeigen, wie die Innexine, ver-

längerte extrazelluläre Schleifen, die nur zwei Cystein-Reste (C) besitzen. Im Gegen-

satz dazu weisen Connexine drei konservierte Cystein-Reste auf. Die Verknüpfung der

extrazellulären Cysteine durch intermolekulare Disulfidbrücken generiert eine rever-

sible Interaktion zwischen den beteiligten Proteinen. Zum Abbau von Gap Junction-

Kanälen ist die Internalisierung beider gekoppelter Hemikanäle notwendig (Saez et al.

2003). Eine Besonderheit der Pannexine ist die Glykosylierung an einem Asparagin-

Rest (N). Im Panx1 der Maus befindet sich die Glykosylierungsstelle an Position

N254 der zweiten extrazellulären Schleife (Boassa et al. 2007, Boassa et al. 2008),

wohingegen sie bei Panx3 bei der Position N71 der ersten extrazellulären Schleife auf-

1 Einleitung

4

tritt (Penuela et al. 2007). Die Glykosylierung im rauen ER (rER) beeinflusst den

Transport des Proteins zur Plasmamembran. Sie stellt aber auch eine strukturelle

Behinderung bei der Formierung von Gap Junction-Kanälen dar. Dies ist der postu-

lierte Grund, weswegen Pannexine vermutlich physiologisch keine Gap Junction-

Kanäle ausbilden (Boassa et al. 2008).

Abb. 2: Struktureller Vergleich von Connexinen, Innexinen und Pannexinen. Obwohl die Proteinfamilien eine geringe Sequenzhomologie aufweisen, zeigen sie dieselbe Topologie mit vier Transmembrandomänen (M1-M4), intrazelluläre N- und C-Termini, zwei extrazelluläre und eine zytoplasmatische Schleife. Während Connexine drei konservierte Cysteine (C) in den extrazellulären Schleifen aufweisen, haben Innexine und Pannexine nur zwei. Des Weiteren haben Pannexine einen Asparagin-Rest (N) der als Glykosylierungsstelle dient. Dieser Rest kann in den anderen beiden Pro-teinfamilien nicht gefunden werden und befindet sich bei Panx1 in der zweiten extrazellulären Schleife (rot) und bei Panx3 in der ersten extrazellulären Schleife (blau). (Illustration von Helga Schulze, ver-ändert) Die Zusammensetzung der Connexine und Innexine, die Gap Junction-Kanäle bilden,

variiert je nach Entwicklung und Ort der Expression. Generell bilden sechs monomere

Proteine einen Hemikanal. Dabei können homomere (ein Typ Cx/Inx, Abb. 3A/B)

oder heteromere (mehr als ein Typ Cx/Inx, Abb. 3C) Kanäle gebildet werden. Ein

homo- oder heteromerer Hemikanal bildet mit dem Hemikanal der benachbarten Zelle

einen homotypischen Kanal, wenn er aus demselben Hemikanal-Oligomer besteht

(Abb. 3D/F). Er bildet aber einen heterotypischen Kanal, wenn er aus einem anders

zusammengesetzten Hemikanal besteht (Abb. 3E; (Goodenough & Paul 2009). Die

1 Einleitung

5

Zusammensetzung der jeweiligen Kanäle definiert ihre Eigenschaften. So können die

Größe der gebildeten Pore, deren Öffnungskinetik, Leitfähigkeiten und Richtung des

Informationsflusses variieren. Erste Studien zur Untersuchung von Panx1 an gepaar-

ten Oozyten können aus heutiger Sicht nur als artifiziell bezeichnet werden, da die

Glykosylierung des Panx1-Proteins eine Kopplung an andere (Hemi-)Kanäle verhin-

dert (Bruzzone et al. 2003). Ein einzelner Panx1-Kanal zeigt eine sehr große Leitfä-

higkeit von ~550pS (Bao et al. 2004a, Locovei et al. 2006a). Damit ist die Leitfähig-

keit des Panx1-Kanals mindestens 200 pS größer als es für Cx Hemikanäle beschrie-

ben ist (Thompson & Macvicar 2008).

Abb. 3: Mögliche Anordnung von Connexonen zur Bildung von GJ Kanälen. Sechs Connexin Monomere formen entweder homomere (A/B) oder heteromere (C) Connexone. Zwei gegenüberliegende Connexone benachbarter Zellen formen entweder homotypische (D/F) oder hetero-typische (E) Gap Junction-Kanäle. (Illustration von Helga Schulze, verändert)

1.1.3 Expression der Pannexine

Das Panx1 kodierende Gen findet sich auf dem humanen Chromosom 11q14.3 und

hat mindestens zwei alternativ gespleißte mRNAs. In der Maus konnte die gleiche

1 Einleitung

6

Organisation des Panx1 Gens gefunden werden, allerdings auf Chromosom 9

(Baranova et al. 2004, Bruzzone et al. 2003, Panchin et al. 2000). In der Ratte befin-

det sich Panx1 auf Chromosom 8q11 (Lai et al. 2007). Erst kürzlich konnten für

Panx1 zwei neue Spleißvarianten in der Hypophyse der Ratte beschrieben werden (Li

et al. 2011b). Lokalisationsstudien, sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene, zei-

gen für Panx1 und Panx2 ein weites Verbreitungsmuster. Die Expression der Proteine

wird im Laufe der Entwicklung zeit- und ortsspezifisch reguliert. Panx3 tritt nur in

vereinzelten Gewebetypen wie z.B. der Haut auf (zusammengefasst in (Goodenough

& Paul 2009) und Tab.1).

Da sich die vorliegende Arbeit mit der Funktion von Panx1 in einem neuronalen Mo-

dell der Ischämie beschäftigt, soll im Weiteren nur noch auf Panx1 und seine fast

ubiquitäre Verbreitung in verschiedenen Organen hingewiesen werden, insbesondere

dem Nervensystem, den Sinnesorganen aber auch in verschiedenen Zelltypen, wie z.B.

Erythrozyten (Locovei et al. 2006a), und Zelllinien, wie NRK-Zellen (Litvin 2006).

Innerhalb des ZNS findet sich Panx1 im Cerebellum, Hippocampus, Hypothalamus,

der inferioren Olive, dem olfaktorischen Bulbus, Neocortex, Rückenmark, Striatum,

Thalamus, verschiedenen Nuclei des Mesencephalon und des Stammhirns und in der

Retina (Locovei et al. 2006a, Penuela et al. 2007). Insbesondere die Lokalisation von

Panx1 im Hippocampus und dort an der postsynaptischen Dichte wird in Abschnitt

1.2.2 weitergehend diskutiert (Zoidl et al. 2007).

1.2 Eigenschaften und Funktionen von Panx1

1.2.1 Regulation des Kanals

Die Aktivierung von Panx1-Kanälen wird durch verschiedene Stimuli vermittelt. So

öffnen sich Panx1-Kanäle bei Depolarisationen von ≥ -20 mV (Bruzzone et al. 2003)

oder als Antwort auf einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration (Kienitz et

al. 2011, Locovei et al. 2006b). Panx1 weist unterschiedliche Leitfähigkeiten bzw.

1 Einleitung

7

Öffnungsstadien auf (engl. „sub conductance states“) (Bao et al. 2004a, Locovei et al.

2006a). Im Vergleich zu den Connexinen zeigt Panx1 eine geringe Spannungsabhän-

gigkeit.

Tab. 1: Expression der Pannexine im Organismus. Aufgeschlüsselt nach Panx1-3 und nach der Expression im ZNS und anderen Geweben. Studien zur Expression wurden in Maus und Ratte durchgeführt (Baranova et al. 2004, Boassa et al. 2007, Bruzzone et al. 2003, Celetti et al. 2010, Dvoriantchikova et al. 2006, Huang et al. 2007a, Huang et al. 2007b, Lai et al. 2007, Litvin 2006, Pelegrin & Surprenant 2006b, Penuela et al. 2007, Ray et al. 2006, Ray et al. 2005, Schenk et al. 2008, Sridharan et al. 2010, Vogt et al. 2005, Wang et al. 2007, Weickert et al. 2005, Woehrle et al. 2010a, Woehrle et al. 2010b, Zappalà et al. 2006, Zoidl et al. 2007). Das Strom-Spannungsverhältnis (I-V) verläuft je nach Zelltyp über den Bereich von

± 80 mV linear. In Kombination mit ATP-bindenden purinergen P2X7-Rezeptoren

(P2X7R) ist es rektifizierend (Thompson & Macvicar 2008). Auch mechanischer

Stress (Bao et al. 2004a) und die Erhöhung extrazellulärer ATP-Konzentrationen -

durch die Aktivierung purinerger Rezeptoren (Locovei et al. 2006a) - sowie gestiegene

extrazelluläre Konzentrationen von Kaliumionen (Silverman et al. 2009) aktivieren

Panx1-Kanäle. Des Weiteren reagiert Panx1 sensitiv auf Reduktionsmittel wie Tris(2-

1 Einleitung

8

carboxyethyl) Phosphine (TCEP). Die Interaktion mit der modulatorischen Kalium-

Kanal-Untereinheit Kvβ3 reguliert die Sensitivität von Panx1 in Bezug auf das Re-

doxpotential (Bunse et al. 2009). Kürzlich wurde festgestellt, dass Panx1 als Ca2+-

freisetzender Kanal im ER vorkommt (Vanden Abeele 2006). Dort könnte er eine

wichtige Rolle als Regulator intrazellulärer Ca2+-Konzentrationen haben. Im ER

kommt es zur Faltung vieler Proteine. Außerdem beeinflusst es die intrazelluläre

Ca2+-Homöostase. Die Regulation von intrazellulären Ca2+-Konzentrationen und die

Faltung von Proteinen sind zwei Faktoren, die sich bei pathologischen Veränderun-

gen in der Zelle verändern. Eine Beeinträchtigung der Panx1-Funktion könnte unter

pathophysiologischen Bedingungen einen Einfluss auf das ER haben. Das würde be-

deuten, dass sie Einfluss auf die Vitalität von Zellen hat (D'Hondt et al. 2011). Eine

andere Studie beschrieb kürzlich die Regulation des Panx1-Kanals in isolierten Hypo-

physenzellen (Li et al. 2011b). Hier wurde erstmals beschrieben, dass alternative

Spleißvarianten von Panx1, die eine intrazelluläre Lokalisation aufweisen, einen

regulativen Effekt auf dessen Funktion haben. Sie wirken durch die Bildung

heteromerer Kanäle möglicherweise als dominant negative Modulatoren auf Panx1.

Panx1-vermittelte Ströme können durch verschiedene Pharmaka inhibiert werden. Zu

diesen Inhibitoren zählen das Carbenoxolone (CBX) (Pelegrin & Surprenant 2006b),

mimetische Peptide (Pelegrin & Surprenant 2006b, Thompson et al. 2008), das

Gicht-Medikament Probenecid (Silverman et al. 2008), Polyethylenglykol (PEG) mit

einer molekularen Masse bis 1500 kDa (Wang et al. 2007) und dem gegen Malaria

wirkenden Quinine-Derivat Mefloquine (MFQ) (Iglesias et al. 2009b). Nur Probenecid

und Mefloquine (in sehr geringen Konzentrationen von 10-100 nM) wurden als Panx1

spezifisch beschrieben, da alle anderen genannten Blocker mit Connexinen kreuzrea-

gieren. Gleiches gilt für Panx1-mimetische Peptide (Wang et al. 2007).

1 Einleitung

9

1.2.2 Panx1 bei der Weiterleitung von Ca2+-Wellen und

ATP-Ausschüttung

Die Erhöhung intrazellulärer Ca2+-Konzentrationen löst in vielen Zelltypen die Akti-

vierung verschiedener zellulärer Signalwege aus. Dabei konnte früh eine wellenförmige

Weiterleitung von lokalen Ca2+-Fluktuationen in gekoppelten, zellulären Netzwerken

beschrieben werden (Sanderson et al. 1990). Panx1 ist an der intrazellulären Aus-

schüttung von Ca2+ aus dem Lumen des ER beteiligt (Vanden Abeele 2006), initiiert

Ca2+-Wellen und leitet sie an andere Zellen weiter (Locovei et al. 2006a). Dabei kön-

nen zwei Mechanismen ablaufen: sobald eine Ca2+-Welle initiiert wird, werden Ca2+

freisetzende sekundäre Botenstoffe durch Gap Junctions interzellulär weitergeleitet

(Scemes et al. 2007). Zusätzlich kann ein extrazellulärer Signalweg Ca2+-Wellen durch

auf der Zelloberfläche exprimierte Proteine weiterleiten, die ihrerseits durch Boten-

stoffe aktiviert werden. Nach einem initialen Reiz öffnen sich Panx1-Kanäle und ATP

wird in den Extrazellularraum ausgeschüttet (Abb. 4). Dort bindet es entweder auf

auto- oder parakrinem Weg an purinerge Rezeptoren (Enkvist & McCarthy 1992,

Hassinger et al. 1996).

Dies ist eins von mehreren Beispielen dafür, dass Panx1 unter physiologischen Bedin-

gungen ATP ausschütten kann (Dahl & Locovei 2006, Huang et al. 2007b, Scemes et

al. 2009, Scemes et al. 2007). Dieser Mechanismus konnte sowohl im heterologen Ex-

pressionsmodell der Xenopus Oozyten, sowie an endogen exprimiertem Panx1 in Neu-

ronen (Huang et al. 2007a), Astrozyten (Locovei et al. 2007), isolierten Geschmacks-

knospenzellen (Huang et al. 2007b) und Erythrozyten (Locovei et al. 2006a,

Sridharan et al. 2010) nachgewiesen werden. Verschiedene Studien deuten auf eine

spezifische Interaktion zwischen Panx1 und dem purinergen P2X7-Rezeptor (P2X7R)

hin (Iacobas et al. 2007, Mayo et al. 2008, Pelegrin et al. 2008, Pelegrin &

Surprenant 2009, Reyes et al. 2009, Scemes et al. 2009, Suadicani 2006). Panx1 bildet

1 Einleitung

10

mit dem P2X7R einen Signalkomplex. Durch diesen kommt es zur verlängerten Akti-

vierung der Panx1-Kanäle und das wiederum führt zum Zelltod (Locovei et al. 2007).

Abb. 4: Mögliche Rolle von Panx1 in Ca2+-Wellen. Durch verschiedene Stimuli, z.B. mechanischen Stress, schüttet die Zelle ATP durch Panx1-Kanäle aus (1), das an purinerge Rezeptoren bindet (2). Eine Signalkaskade führt zu IP3 Synthese (3), die zu Ca2+-Ausschüttung aus intrazellulären Kompartimenten führt (4). Ca2+ oder IP3 öffnen Panx1, es kommt zur ATP-Ausschüttung und Weiterleitung der Ca2+-Welle. Verschiedene Blocker u.a. Carben-oxolone (CBX) und Mefloquine (MFQ) inhibieren den Panx1-Kanal. (Illustration aus Barbe et al. 2006, verändert) Eine weitere nennenswerte Funktion wurde von Qiu und Dahl beschrieben. Sie fan-

den einen ATP-induzierten, negativen Rückkopplungsmechanismus auf die Panx1-

Kanalfunktion. So inhibieren ATP-Konzentrationen den Panx1-Kanal, auch wenn sie

nur leicht über der benötigten Konzentration für die Aktivierung von P2X7 und

P2Y2 liegen (Qiu & Dahl 2009). Verschiedene pathologische Bedingungen sind denk-

bar, die den negativen Rückkopplungsmechanismus der ATP-Ausschüttung starten,

um den großen Panx1-Kanal zum Zellschutz zu schließen. Eine Reaktion des Kanals

auf Stimuli wie metabolische Inhibition (MI) oder mechanischen Stress kann somit

effizient auf einem lokal begrenzten Raum stattfinden (Dubyak 2009). Neben diesen

Mechanismen lässt die postsynaptische Lokalisation von Panx1 (Zoidl et al. 2007)

1 Einleitung

11

auch einen positiven oder negativen Rückkopplungsmechanismus an Synapsen zu. In

Abbildung 5 wird das Modell eines solchen Mechanismus an einer Synapse dargestellt.

Durch ein Aktionspotential kommt es an der Präsynapse zum Einstrom von Ca2+.

Dadurch verschmelzen mit Glutamat gefüllte Vesikel mit der Plasmamembran und

Glutamat wird ausgeschüttet. Das Glutamat im synaptischen Spalt bindet an postsy-

naptische glutamaterge Rezeptoren (AMPA/NMDA) und führt so zur Öffnung dieser

Kanäle. Es kommt zur Erhöhung intrazellulärer Ca2+-Konzentrationen und zur Öffnung von

Panx1-Kanälen. ATP wird durch diese Kanäle aus der postsynaptischen Zelle ausge-

schüttet und wirkt auf umliegende purinerge Rezeptoren. Es kann sowohl auf Rezep-

toren der Prä- oder Postsynapse wirken, als auch auf nahegelegenen Astrozyten und

beeinflusst damit die Neuron-Neuron oder Neuron-Glia Interaktion. So kommt es

durch die parakrine Wirkung (Abb. 5 rote Pfeile) z.B. in Astrozyten zur Weiterlei-

tung von Ca2+-Wellen. Die autokrine Wirkung würde Panx1-Kanäle durch hohe

ATP-Konzentrationen blockieren oder P2X-Rezeptoren im synaptischen Spalt akti-

vieren (Abb. 5 grüne Pfeile). Für derartige autokrine und/oder parakrine Regulati-

onskreise liegen bereits indirekte Hinweise vor.

1.2.3 Panx1 und pathologische Prozesse

1.2.3.1 Die Rolle von Pannexinen bei der Tumorsuppression

Panx1 wurde als Tumor-suppressiv beschrieben. So konnte eine verringerte Ex-

pression von Panx1 in der Gliom Zelllinie C6 im Vergleich zu nicht pathologisch ver-

änderten Astrozyten festgestellt werden (Lai et al. 2007). Panx1-Überexpression re-

duzierte in C6 Gliom-Zellen deren Proliferationsfähigkeit und veränderte ihre Mor-

phologie und Motilität. Eine weitere Studie derselben Arbeitsgruppe zeigte, dass auch

Panx2 bei der Gliom-Genese einen Einfluss als negativer Wachstumsregulator hat

(Lai et al. 2009).

1 Einleitung

12

Abb. 5: Modell von Panx1-vermittelter Transmission in einer Synapse. Dieses Modell soll den aktuellen Stand der Wissenschaft zur Rolle von Panx1 in der Postsynapse glu-tamaterger Neurone zusammenfassen. Wenn ein Aktionspotential die Präsynapse erreicht, kommt es zur Öffnung spannungsabhängiger Ca2+-Kanäle, was einen schnellen Ca2+ Einstrom verursacht und zur Ausschüttung vesikulären Glutamats führt. Glutamat bindet an postsynaptische AMPA und NMDA-Rezeptoren und induziert Ca2+-Einstrom in die Postsynapse, was zur Öffnung von Panx1-Kanälen führt. Das durch Panx1 ausgeschüttete ATP agiert im synaptischen Spalt auf autokrine oder parakrine Weise. Bei autokriner Signalübertragung kommt es zur Aktivierung der ionotropen P2X-Rezeptoren, die zu einem vermehrten Ca2+-Einstrom in die Postsynapse führen. Bei parakriner Signalübertragung kommt es durch das ausgeschüttete ATP zur Aktivierung von metabotropen P2Y-Rezeptoren auf der Präsynapse oder umliegenden Gliazellen. Die Aktivierung von P2Y-Rezeptoren führt zu IP3-Produktion, die zum Ca2+-Ausstrom aus dem ER führt – in der Präsynapse kommt es zu einem positi-ven Rückkopplungsmechanismus und vermehrten Ausschüttung von Neurotransmittern oder in Glia-zellen zur Initiierung von Ca2+-Wellen. Die Erhöhung intrazellulären Ca2+ führt in Gliazellen auch zur Öffnung von Panx1-Kanälen und ATP-Ausschüttung in den Extrazellulärraum, wo es zur Weiterlei-tung von Ca2+-Wellen in umliegende Gliazellen kommt. Es kommt zu einem zusätzlichen Rückkopp-lungsmechanismus: wenn zu viel ATP im synaptischen Spalt akkumuliert, kommt es zur autokrinen Hemmung von Panx1-Kanälen. (Illustration von Helga Schulze, verändert)

1 Einleitung

13

1.2.3.2 Immunsystem und Apoptose

Panx1-Kanälen werden verschiedene Rollen bei der Regulation des Immunsystems

zugeschrieben. Diese Funktionen werden im Folgenden zusammengefasst. Erstens

konnte gezeigt werden, dass Panx1 Leukozyten aktiviert. Je nach Art des aktivierten

Leukozyten-Typs ruft dies verschiedene Reaktionen hervor: z.B. Verteidigung des

Wirts gegen Infektionen, allergische Reaktionen durch Ausschüttung von Histamin,

Lymphozyten-Aktivierung, Monozyten-Migration oder Phagozytose.

Außerdem führt die Ausschüttung von ATP durch Leukozyten zu einer autokrinen

Regulation der P2X7-Signalkaskade und zu einer parakrinen Aktivierung anderer

immunologisch aktiver Zellen (Bianco et al. 2005). Zweitens führt die Interaktion von

Panx1 mit P2X7R zur Ausschüttung von Interleukin-1β (IL-1β) aus immunologisch

aktiven Zellen wie Makrophagen und T-Lymphozyten (Locovei et al. 2007, Pelegrin

& Surprenant 2006b, Pelegrin & Surprenant 2009, Schenk et al. 2008). IL-1β gilt als

Initiator akuter inflammatorischer Antworten (Dinarello 2005). Hohe ATP-

Konzentrationen in entzündetem Gewebe führen nicht nur zur Aktivierung von

P2X7R und zur Öffnung des ionotropen P2X7-Kanals, sondern auch zu einer graduel-

len Aktivierung von Panx1-Kanälen (Iglesias et al. 2008), die innerhalb von Sekunden

bis Minuten abläuft. Im Inflammasom-aktivierenden Signalweg fungiert Panx1 als ein

initiierendes („upstream“) liegendes Protein (Martinon & Tschopp 2004, Pelegrin

2008). Außerdem wirkt Panx1 als Regulator der IL-1β-Ausschüttung von Makropha-

gen nach ATP-induzierter P2X7R-Aktivierung (Pelegrin et al. 2008). Weiterhin wird

ein Farbstoffefflux durch den Panx1-P2X7-Komplex, aus neuronalen und astrozytalen

Kokulturen beschrieben. Der Efflux wurde durch Reduzierung der extrazellulären

Ca2+-Konzentration ausgelöst, wie sie unter vielen pathophysiologischen Bedingungen

vorkommen kann (Poornima et al. 2011). Eine weitere Studie beschreibt, dass auch

FGF-1 eine Wirkung auf den Panx1-P2X7-Komplex hat. Es wird beispielsweise als

Folge von Rückenmarksverletzungen ausgeschüttet und macht Zellen, die FGF-1 aus-

gesetzt sind, permeabel (Garre et al. 2010). Eine andere Studie besagt zudem, dass

1 Einleitung

14

unter inflammatorischem Einfluss ATP und Glutamat aus Astrozyten ausgeschüttet

wird. Diese aktivieren durch NMDA- und P2X-Rezeptoren die Panx1-Kanäle, welche

neurotoxisch wirken. Die große Anzahl an Studien zu dem Thema Panx1- und P2X-

Rezeptoren im inflammatorischem Kontext bestätigt die Bedeutung dieses Zusam-

menhangs (Orellana et al. 2011a).

Kürzlich konnte für Panx1 eine wichtige Rolle bei der Apoptose nachgewiesen werden.

Apoptose ist eine Form des programmierten Zelltods, bei der sogenannte Effektor-

Caspasen eine kritische Rolle spielen. Während apoptotischer Prozesse schütten Zel-

len die Nucleotide ATP und UTP durch einen Kanal in der Plasmamembran aus

(Elliott et al. 2009). Dieselbe Arbeitsgruppe fand heraus, dass es sich bei diesem Ka-

nal um Panx1 handelt, und dass Panx1 eine konservierte Caspase 3- und 7-

Schnittstelle besitzt. Durch die Spaltung des Proteins an der Caspase-Schnittstelle

kommt es zu einem konstitutiv offenen Panx1-Kanal, der ATP und UTP ausschüttet.

Diese sogenannten „Finde mich“-Signale initiieren die Rekrutierung von Phagozyten,

die letztlich zur Degradierung der apoptotischen Zelle führt (Chekeni et al. 2010).

1.3 Panx1 und Ischämie

1.3.1 Modell Hippocampus

Der Hippocampus ist Teil des limbischen Systems und eine stammesgeschichtlich alte,

gut untersuchte Region im Temporallappen des Gehirns. Er ist die zentrale Schaltsta-

tion des limbischen Systems und spielt eine herausragende Rolle bei der Bildung des

Kurzzeitgedächtnisses, der räumlichen Orientierung sowie der Überführung von In-

formationen in das Langzeitgedächtnis. Evidenzen für eine funktionelle Beteiligung an

der Bildung von Emotionen liegen vor. Er besteht aus zwei Hauptstrukturen, dem

Gyrus dentatus (GD) und dem Cornu ammonis (CA) mit seinen Unterregionen CA1-

CA3. Deren zelluläre Struktur und das neuronale Verschaltungsmuster sind gut be-

kannt (Abb. 6). Der GD besteht aus drei Schichten, der relativ zellfreien Molekular-

1 Einleitung

15

schicht (Stratum moleculare) und dem Körnerzellband (Stratum granulare), in dem

viele glutamaterge Körnerzellen sowie einige GABAerge Interneurone liegen, die ihre

Dendriten in die Molekularschicht entsenden. Die dritte Schicht, der Hilus (Lamina

multiformis), bildet Interneurone aus und enthält ebenfalls Axone der Körnerzellen,

sogenannte Moosfasern. Das Cornu ammonis kann in zwei Hauptregionen unterteilt

werden, die sich in eine distale, zellarme Region (CA1) und eine proximale, zell-

reichere Region (CA2 und CA3) einteilen lassen. Wie im GD findet sich eine Schicht,

in der die Nervenzellkörper akkumulieren, der Pyramidenzellschicht (Stratum pyra-

midale). Darüber hinaus werden noch weitere morphologische Unterteilungen in die

Schichten Stratum radiatum, Stratum laconosum-moleculare und Stratum oriens vor-

genommen. Pyramidenzellen sind glutamaterge Neurone, deren Dendriten sich radial

ausdehnen. Neben diesen finden sich in den CA-Regionen auch noch hemmende Inter-

neurone und Korbzellen. Der primäre gliale Zelltyp im Hippocampus sind Astrozyten.

Der Hauptverschaltungsweg beginnt mit Eingängen aus dem entorhinalen Cortex, der

den GD innerviert. Dessen Neurone projizieren über die Moosfasern zur CA3-Region.

Von der CA3-Region werden die Signale über die sogenannten Schaffer-Kollaterale an

die CA1-Region weiterleitet. Von CA1 führen Projektionen in den Fornix und ins

Subiculum (Amaral & Witter 1995).

Nachdem nun der Aufbau des Hippocampus besprochen wurde, sollen im Folgenden

einige wichtige physiologische und pathologische Erkenntnisse hervorgehoben werden.

Im Hippocampus konnte der Effekt der synaptischen Plastizität untersucht werden.

Dieser Mechanismus ermöglicht chemischen Synapsen ihre Effektivität zu steigern

oder zu senken. Dabei wurden besonders die Prozesse der Langzeit-Potenzierung

(LTP) und Langzeit-Depression (LTD) erforscht (Bliss & Collingridge 1993, Massey

& Bashir 2007). Beeinträchtigungen des Hippocampus werden mit verschiedenen pa-

thologischen Störungen in Verbindung gesetzt. So spielt er eine Rolle bei der Epilep-

sie (Kuruba et al. 2009, Sloviter 2005), Schizophrenie (Boyer et al. 2007, Harrison

2004), transienter globaler Amnesie (Chung et al. 2006, Lewis 1998), Problemen des

1 Einleitung

16

Alterns (Burke & Barnes 2006) und hormonbedingten Stressreaktionen (Campbell &

Macqueen 2004, Joels 2008, Woon et al. 2010).

Abb. 6: Modell eines Maushippocampus Die drei Hauptregionen des Hippocampus, der Gyrus Dentatus (GD) und das Cornu Ammonis (CA) mit den zwei Unterteilungen CA1 und CA3 und den entsprechenden verbindenden Fasern (Moosfa-sern, Schaffer-Kollaterale). (Illustration von Helga Schulze, verändert)

1.3.2 Hemikanäle des Hippocampus

Eine Reihe von Studien postuliert die elektrische Kopplung der hippocampalen Inter-

neurone durch Cx36 Gap Junctions. Auch Astrozyten sind durch Cx43 Gap Junc-

1 Einleitung

17

tions miteinander verbunden. Es konnte hingegen lange keine Kopplung von Pyrami-

denzellen des Hippocampus nachgewiesen werden.

Dies gelang erstmals 2006 Mercer et al. Da bisher keine Connexine in Pyramidenzel-

len nachgewiesen werden konnten, wird in der Studie angenommen, dass Panx1-

Kanäle sie elektrisch koppeln (Bennett & Pereda 2006, Mercer et al. 2006). Dabei

handelt es sich allerdings um eine einzelne Studie, die der bisher angenommenen Un-

fähigkeit von Panx1 zur Bildung funktionaler Gap Junctions widerspricht.

Nach der kurzen Übersicht über die elektrische Kopplung hippocampaler Zelltypen

durch Gap Junctions soll im Folgenden nun auf deren Hemikanalfunktion eingegan-

gen werden. Es werden Hemikanäle der Connexin-Familie (Cx30, 36, 43, 45) oder der

Panx1-Kanal diskutiert, da diese Proteine in verschiedenen Zelltypen des Hippocam-

pus exprimiert werden. Im Vordergrund stehen dabei ihre morphologische Expression

und deren mögliche Funktionen (Abb. 7 aus (Thompson & Macvicar 2008).

Cx36 ist das wichtigste Gap Junction Protein der GABAergen Interneurone. Es ver-

mittelt koordinierte Aktivität des Interneuronen Netzwerks und synchronisiert so Ak-

tionspotenziale und elektrisches Koppeln der Neurone (Belluardo et al. 1999, Deans et

al. 2001, Ma et al. 2011). Es ist bekannt, dass Cx36 physiologisch primär als Gap

Junction Kanal agiert. Unter extremen pathophysiologischen Bedingungen, wie z.B.

Ischämie, kann jedoch auch eine Hemikanal-Funktion nachgewiesen werden (Schock

et al. 2008). Allerdings weisen solche Hemikanäle nur die geringe Leitfähigkeit von

20-30pS auf (Connors & Long 2004).

Für Cx45 ist hauptsächlich die Bildung axo-axonaler Verknüpfungen in Korbzellen

beschrieben (Maxeiner et al. 2003, Schmitz et al. 2001, Söhl et al. 2005, Traub et al.

2004). Mögliche Hemikanäle dagegen können sich unter Bedingungen, wie extremer

Depolarisierung oder niedrigen extrazellulären Ca2+-Konzentrationen, öffnen und ha-

ben eine Leitfähigkeit von 57pS (Valiunas 2002).

Cx43 ist das wichtigste Gap Junction Protein der Astrozyten, das für zahlreiche

Funktionen, sowohl als Gap Junction Kanal als auch als Hemikanal in verschiedenen

1 Einleitung

18

Kontexten beschrieben wird. Eine Zusammenfassung der umfangreichen Studien zu

Cx43 wurde bereits an anderer Stelle geleistet (Dere & Zlomuzica 2012). Hier soll nur

kurz auf die Rolle von Cx43 als Hemikanal in Astrozyten eingegangen werden. Der

Cx43-Hemikanal öffnet durch Depolarisationen von ≥ 60 mV (Dermietzel et al. 1989,

Giaume & McCarthy 1996), aber auch durch niedrige extrazelluläre Ca2+-

Konzentrationen (Contreras et al. 2003). Außerdem spielt er, ähnlich wie Panx1, zu-

sammen mit P2Y-Rezeptoren eine Rolle bei der Weiterleitung von Ca2+-Wellen (Bao

et al. 2004b, Li et al. 1996). Das Ausschütten von Gliotransmittern wie Glutamat

und ATP wurde lange Cx43-Hemikanälen zugeschrieben Experimente mit Cx43-/--

Mäusen deuten aber darauf hin, dass dieser Effekt eher von P2X7-Kanälen vermittelt

wird (Suadicani 2006).

Cx30 wird in Astrozyten exprimiert; für seine normale Form konnten keine Hemi-

kanal-Funktionen nachgewiesen werden (Kreuzberg et al. 2008, Nagy et al. 1999). Im

Gegensatz dazu konnte Cx30 nach zwei spezifischen Punktmutationen (G11R und

A88V) funktionale Hemikanäle bilden (Essenfelder et al. 2004).

Panx1 lässt durch seine postsynaptische Lokalisation an hippocampalen Pyramiden-

zellen eine Beteiligung an multiplen Prozessen erahnen. So könnten Panx1-Kanäle

unter physiologischen Bedingungen als direkte ATP-Ausschüttungskanäle dienen. Die

Frage, ob Panx1-Kanäle auch in Astrozyten exprimiert sind, ist nach aktuellem

Stand der Wissenschaft noch nicht eindeutig geklärt. Sollten sie in diesem Zelltyp

vorhanden sein, würden sie auch hier als ATP-Ausschüttungskanäle wirken. Ab-

schließend ist noch hinzuzufügen, dass Panx1 auch in den Zusammenhang mit Ischä-

mie und einem NMDA-Rezeptor-vermittelten Strom gestellt werden konnte

(MacVicar & Thompson 2010).

1.3.3 Zelluläre und molekulare Reaktionen auf Ischämie

Das Auftreten eines Herzinfarktes oder Schlaganfalls kann durch Beeinträchtigung

der Blutversorgung des Gehirns zu cerebraler Ischämie führen. Dies kann schwere

1 Einleitung

19

neuronale Defekte und Gewebeverlust zur Folge haben, die hauptsächlich durch einen

als Exzitotoxizität bezeichneten Effekt verursacht werden (Review (Bargiotas et al.

2009). Dabei kommt es zur vermehrten Ausschüttung von Glutamat (Glu), dem

Hauptvermittler erregender synaptischer Transmission. Das hat die Überaktivierung

von N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren (NMDAR) und α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-

4-isoxazol Propionsäure-Rezeptoren (AMPAR) zur Folge. Die Überaktivierung der

Rezeptoren wiederum führt zu einem massiven Na+- und Ca2+-Einstrom und verur-

sacht Membrandepolarisationen der Zellen in dem von der Ischämie betroffenen Be-

reich.

Abb. 7: Darstellung der Lokalisation von Hemikanälen im Hippocampus. Connexine und Panx1 sind an den für sie beschriebenen Zelltypen und mit ihren jeweiligen Funktionen dargestellt. (Illustration aus Thompson & MacVicar 2008, verändert)

1 Einleitung

20

Durch die intrazellulär erhöhten Ca2+-Konzentrationen (Kristian & Siesjo 1998)

kommt es zur Aktivierung von Phospholipase A2 (PLA2) und Phospholipase C

(PLC) (Fahlman et al. 2002, Lazarewicz et al. 1990, Rao et al. 2000). Sie vermitteln

die Ausschüttung von Arachidonsäure (Woo et al. 2000). Arachidonsäure löst die

Prostaglandin-Synthese aus, die wiederum die Produktion zytotoxischer, reaktiver

Sauerstoff-Spezies (ROS) zur Folge hat. Eine weitere Folge erhöhter Ca2+-

Konzentrationen ist die Generierung großer Mengen Stickstoffmonoxid (NO), die mit

H2O2 reagieren. Das so gebildete Peroxinitrit ist ein sehr reaktives freies Radikal

(Beckman et al. 1990, Martin-Romero et al. 2004). Schlussendlich kommt es zu einem

Zusammenbruch des Ionenhaushaltes der Zellen, der im Zelltod enden kann.

Die oben beschriebenen Effekte treten nicht überall gleichzeitig im ischämisch ge-

schädigten Gewebe auf. Im Zentrum, dem ischämischen Kern, wo der Blutfluss un-

terbrochen ist, kommt es zur permanenten anoxischen Depolarisationen der Zellen,

wodurch diese Zellen sehr schnell sterben. Zwischen der Kernzone und dem unbe-

schädigten Gewebe, gibt es einen Bereich mit reduzierter Energieversorgung, der

Penumbra (lat. „Halbschatten“). Dieser Bereich kann von Exzitotoxizität oder schäd-

lichen sekundär Effekten, wie Depolarisierungen, postischämischer Inflammation oder

Apoptose betroffen sein (Contreras et al. 2004).

Bei cerebraler Ischämie tritt darüber hinaus ein Phänomen auf, das zytotoxische

Ödem. Astrozyten nehmen dabei die extrazellulären, im Überfluss vorhandenen Ionen

K+ und Na+ auf, was zu einem übermäßigen Einstrom von Wasser in die Zellen führt

(Kimelberg 2004). Außerdem kann die Blut-Hirn-Schranke durch Ischämie beein-

trächtigt werden, was neuroinflammatorische Prozesse in Gang setzt, bei denen wie-

derum IL-1β eine Hauptrolle spielt. Die Ausschüttung von IL-1β wird, wie im Ab-

schnitt 1.2.4.2 beschrieben, durch ATP und P2X7R vermittelt (Allan et al. 2005).

Durch die massive Ausschüttung von K+ in den Extrazellularraum kommt es zu einer

Welle von Depolarisationen (sogenannte Streudepolarisierung), die von Repolarisatio-

nen der Zellen wieder ausgeglichen wird. Dieser Prozess ist sehr energieaufwendig und

1 Einleitung

21

beeinträchtigt das betroffene Gewebe zusätzlich. So führen Energieverlust, oxidativer

Stress und inflammatorische Reaktionen zu nekrotischem und apoptotischem Zelltod

(Bargiotas et al. 2009).

Neben den verschiedenen Neuronentypen des Hippocampus, die extrem sensitiv für

oxidativen Stress sind spielen besonders die Astrozyten eine übergeordnete Rolle bei

der Homöostase des neuronalen Netzwerks. Die relative Unempfindlichkeit von Astro-

zyten gegenüber oxidativem Stress, wird ihrem Potential zugeschrieben, vom aeroben

zum anaeroben Energiestoffwechsel übergehen zu können (Peuchen et al. 1996). Nach

verlängerten Insulten kann es jedoch auch hier zum astroglialen Zelltod kommen

(Sugawara et al. 2002).

Astrozyten organisieren die strukturelle Architektur des Gewebes und organisieren

Kommunikationswege (Enkvist & McCarthy 1994, Nedergaard et al. 2003). Sie kon-

trollieren durch Aufnahme von Neurotransmittern und Abgabe sogenannter „Glio-

transmitter“ (z.B. Glutamat, GABA, ATP, Taurin, Adenosin, D-Serin und Eikosano-

ide) die extrazellulären Konzentrationen von Glutamat, K+ und H+ (Fields &

Stevens-Graham 2002, Orellana et al. 2009). Außerdem konnte gezeigt werden, dass

Astrozyten zum Erhalt des Redoxpotentials beisteuern indem sie das Antioxidans

Glutathion produzieren und freisetzen (Drukarch et al. 1997, Vargas et al. 2006).

Astrozyten sind durch Cx43 Gap Junctions stark gekoppelt. Das so gebildete astro-

zytale Synzytium kann neurotoxischer Substrate durch räumliche Trennung puffern.

Unter pathologischen Bedingungen kommt es zur Aktivierung eines zweiten wichtigen

glialen Zelltyps, die Mikroglia. Diese schütten pro-inflammatorische Cytokine wie IL-

1β aus. Deren Aktivierung führt zu einer Schwächung der Kopplung durch astro-

zytale Gap Junctions und damit zu einer Schwächung der astroglialen Pufferwirkung

(Orellana et al. 2009, Yenari et al. 2010). Wird das astrogliale Netzwerk also durch

pathologische Bedingungen destabilisiert, werden Neuronen nicht mehr durch das

protektive Verhalten des Netzwerks geschützt, wodurch ihre Viabilität weiter redu-

ziert wird.

1 Einleitung

22

1.3.4 Panx1 und Cx43 im ischämischen Hippocampus

Wie im vorausgegangenen Abschnitt beschrieben wurde, ist das Zusammenspiel der

verschiedenen Zelltypen im Hippocampus essentiell für den Erhalt physiologischer

Funktionen. Kommt es zum ischämischen Insult verändern sich verschiedene moleku-

lare und zelluläre Komponenten und sowohl Neurone als auch Astrozyten werden

beeinträchtigt (Hagberg & Mallard 2005, Parpura et al. 1994). Nachfolgend sollen

insbesondere die Funktionen von Cx43 als wichtigstem Astrozyten-Gap Junction-

Kanal und Panx1 als Kanal in hippocampalen Pyramidenzellen hervorgehoben wer-

den. Panx1 konnte zwar ebenfalls in kultivierten astrozytalen Astrozyten gefunden

werden, hingegen ist der Nachweis des Proteins in vivo aber nach wie vor umstritten

(Huang et al. 2007b, Iglesias et al. 2009b).

1.3.4.1 Cx43

Hossain et al. beschrieb zum ersten Mal 1994 eine morphologische Verlagerung und

Zunahme von Cx43 Reaktivität im Zusammenhang mit Ischämie im Hippocampus.

Seitdem befassen sich mehrere Gruppen mit den zellulären, funktionalen und moleku-

laren Zusammenhängen dieses Phänomens (Hossain et al. 1994). Die erste in vivo-

Evidenz für den Einfluss von Connexinen auf Ischämie-Folgen wurde durch eine re-

duzierte Infarktgröße bei der Gabe von Gap Junction-Blockern erbracht (Rawanduzy

et al. 1997). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass das Vorhandensein von Cx43-

Kanälen und damit auch des astrozytalen Synzytiums protektiv auf die Verbreitung

ischämischer Insulte wirkt. Ein Cx43-Knock-out (KO) hingegen vergrößert die In-

farktregion (Siushansian et al. 2001). Mit MI oder Cytokin IL-1β-behandelte Astrozy-

ten-Kulturen steigern die Cx43-Hemikanalaktivität. Die durch Gap Junction-

vermittelte interzelluläre Kopplung wird reduziert. Dies konnte durch Farbstoff-

Aufnahme aus dem Medium gezeigt werden (Contreras et al. 2002, Retamal et al.

2007). Dieser Effekt konnte durch erhöhte Glucose-Konzentrationen noch potenziert

und durch selektive Cx43-Blocker inhibiert werden, hingegen nicht durch Panx1-

1 Einleitung

23

Blocker (Orellana et al. 2010). Die bevorzugte Öffnung der Cx43-Hemikanäle könnte

darauf zurückzuführen sein, dass es unter ischämischen Bedingungen zu einer ca. 10-

fachen Reduktion extrazellulärer Ca2+- und Mg2+-Konzentrationen kommt. Das hat

Einfluss auf das Öffnungsverhalten des Hemikanals (Kristian & Siesjo 1998, Quist et

al. 2000). Außerdem kommt es durch den hypoxischen Stress zu einem vermehrten

Auftreten der dephosphorylierten Form von Cx43, die in Zellen unter physiologischen

Bedingungen nicht gefunden werden kann (Li & Nagy 2000). Bei Ischämie vorkom-

mende höhere NO-Konzentrationen führen zur Bindung von NO an Cysteine des C-

Terminus von Cx43. Durch die sogenannte S-Nitrosylierung der Cx43-Kanäle und die

dadurch erhöhte Hemikanal-Aktivität kann es zur vermehrten Aufnahme von Stoffen

aus dem Extrazellulärraum kommen. Die Zellen werden durchlässiger und das wirkt

nach längerem Insult zytotoxisch (Retamal et al. 2006).

Für eine extrem komplexe Steuerung des gesamten Netzwerks spricht, dass ähnliche

Reize unterschiedliche Reaktionen hervorrufen. So entwickeln Astrozyten nach photo-

thrombotischen ischämischen Läsionen einen Prozess, der reaktive Astrogliose ge-

nannt wird. Dabei kommt es, entgegen des oben beschriebenen Prozesses, zu einer

verstärkten Kopplung der Astrozyten und erhöhten Zell-Proliferation (Haupt et al.

2007, Pekny & Nilsson 2005).

Cx43 spielt auch bei einem weiteren protektiven Mechanismus eine Rolle - der

Präkonditionierung. Dabei werden Zellen durch nicht-letale ischämische Insulte und

die angestoßenen zellulären „Rettungs-Programme“ vor einem stärkeren Schaden ge-

schützt. Als Erklärung des Mechanismus wird das vermehrte Auftreten von Cx43-

Hemikanälen angenommen. Es fördert die Ausschüttung von ATP und führt extrazel-

lulär zu seinem neuroprotektiv wirkenden Abbauprodukt Adenosin (Lin et al. 2008).

1.3.4.2 Panx1

Der erste indirekte Nachweis für Panx1 als ein Kanal, der in hippocampalen Pyrami-

denzellen exprimiert ist und sich unter ischämischen Bedingungen öffnet, wurde 2006

1 Einleitung

24

von Thompson et al. veröffentlicht (Thompson et al. 2006). Es wurden akut isolierte

hippocampale Pyramidenzellen elektrophysiologisch gemessen, und unter Sauerstoff-

und Glucose-Entzug (engl. „oxygen and glucose deprivation“ - OGD) wurde erstmals

die Öffnung eines großen Kanals mit einer Leitfähigkeit von 530 pS beobachtet. Die

durch diesen Kanal vermittelten Ströme konnten durch Panx1-Blocker inhibiert wer-

den. Auch Farbstoffefflux konnte sowohl aus isolierten Neuronen als auch aus Pyra-

midenzellen hippocampaler Slices durch Panx1-Blocker inhibiert werden. Eine erste

Arbeit zur Aufklärung dieses Öffnungs-Mechanismus postuliert die Generierung gro-

ßer Mengen NOs in ischämischem Gewebe durch OGD und chemische Ischämie (MI

durch Blockade der mitochondrialen Atmungskette und der Glykolyse). Das erhöhte

NO Aufkommen führte zum Farbstoffefflux aus hippocampalen Neuronen, der durch

NO-Synthase-Inhibitoren und den unspezifischen Panx1-Blocker CBX gemildert wur-

de (Zhang et al. 2008). Die Zugabe von CBX auf organotypische Slice-Kulturen bei

hypoxischem Stress führt zu signifikanter Neuroprotektion (de Pina-Benabou et al.

2005, Frantseva et al. 2002b).

Es sollte an dieser Stelle auf die Unterschiede der Öffnungs-Steuerung (engl. „gating“)

von Panx1 im Vergleich zu Connexinen hingewiesen werden, die auf unterschiedliche

Rollen der Proteine unter physiologischen und pathologischen Bedingungen hindeuten.

Cx-Hemikanäle sind bei hohen extrazellulären Ca2+-Konzentrationen geschlossen und

reagieren sensitiv auf Veränderungen dieser, wohingegen Panx1 selbst bei starken

Veränderungen der extrazellulären Ca2+-Konzentrationen nicht beeinflusst wird. Un-

ter ischämischen Bedingungen kommt es zur Reduktion der extrazellulären und zum

Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentrationen (Lipton 1999). Im Gegensatz zu Cx

reagiert Panx1 sensitiv auf Änderungen intrazellulärer Ca2+-Konzentrationen. Es ist

also wahrscheinlich, dass Panx1-Kanäle sich unter ischämischen Bedingungen öffnen

(Bargiotas et al. 2009). Eine kürzlich veröffentlichte Studie konnte zeigen, das Kokul-

turen von Neuronen und Astrozyten durch Reduktion des extrazellulären Ca2+ für

1 Einleitung

25

Farbstoff permeabel werden. Diese Durchlässigkeit wird durch den Panx1-P2X7R-

Komplex vermittelt (Poornima et al. 2011).

Eine neuere Studie befasste sich mit der Frage, ob die bei Ischämie auftretenden

anoxischen Depolarisationen des Gewebes auch durch NMDAR vermittelt werden

könnte. Diese Rezeptoren öffnen sich ebenfalls durch exzessives Glutamat-

Aufkommen. In dieser Arbeit wurden Pyramidenzellen aus der CA1-Region hippo-

campaler Schnitte gemessen. Dabei wurde der durch anoxische Depolarisation verur-

sachte Na+- und Ca2+-Einstrom untersucht. Es wurde anhand der Applikation ver-

schiedener Blocker die Rolle von Panx1 bei der Generierung dieses Einstroms in Fra-

ge gestellt. Stattdessen wurden Glutamat-Rezeptoren für die anoxische Depolarisation

verantwortlich gemacht. Da in dieser Studie nicht mit Panx1-KO-Tieren, sondern

ausschließlich mit Panx1-Blockern gearbeitet wurde, kann bisher keine eindeutige

Zuweisung des Effekts der anoxischen Depolarisation getroffen werden (Madry et al.

2010).

Zwei weitere Studien beschäftigen sich mit der Rolle von Panx1 im Zusammenhang

mit glutamatergen Rezeptoren. Die eine Studie macht Panx1 für einen großen sekun-

där-Strom verantwortlich. Dieser entsteht, wenn isolierte Pyramidenzellen mit

NMDA aktiviert werden (Thompson et al. 2008). Die zweite Studie zeigte, dass aus

Astrozyten ausgeschüttetes Glutamat und ATP toxisch auf Neurone wirkt und diese

für Farbstoff permeabel macht. Dieser Effekt ist Panx1-vermittelt, wird aber durch

die Aktivierung von NMDA und P2X-Rezeptoren angestoßen (Orellana et al. 2011b).

Diese Beobachtungen weisen darauf hin, wie komplex das hippocampale System ist.

Es zeigt sich, dass viele Komponenten an den Mechanismen beteiligt sind, welche

durch pathologische Bedingungen ausgelöst werden.

In den oben beschriebenen Untersuchungen wurden Blocker verwendet, um die Rolle

von Panx1 bei der Ischämie aufzuklären. Wie in Abschnitt 1.2.1 beschrieben wurde,

gibt es keinen verlässlichen spezifischen Panx1-Blocker, sondern ausschließlich die

bekannten Blocker, die Kreuzreaktionen mit anderen Membran-Kanälen (z.B. Con-

1 Einleitung

26

nexinen wie Cx43) aufweisen. Daher ist eine abschließende Bewertung der Panx1-

Funktion unter ischämischen Bedingungen nur eingeschränkt möglich. Eine vor zwei

Monaten (Dezember 2011) veröffentlichte Studie untersuchte erstmals die durch Is-

chämie induzierte Neurodegeneration mithilfe eines Panx1-KO-Mausmodells, wie es

auch in der vorliegenden Arbeit der Fall war (Bargiotas et al. 2011). In dieser Studie

konnten verschiedene Fragestellungen adressiert und beantwortet werden, auf die

näher in der Diskussion dieser Arbeit (s. Abschnitt 5.1) eingegangen wird.

Die durch Ischämie verursachten extrem vielfältigen molekularen und zellulären Me-

chanismen legen nahe, dass Panx1, als eine der vielen Komponenten, eine essentielle

Rolle bei diesem Prozess spielt. So wird angenommen, dass Panx1 die synaptische

Physiologie durch ATP-Ausschüttung beeinflusst. Dabei könnte es in einem patholo-

gischen Modell, postsynaptisch lokalisiert, auf die präsynaptischen Adenosin1-

Rezeptoren (A1R) wirken. Diese A1R inhibieren die Glutamat-Ausschüttung und

könnten somit einen neuroprotektiven Mechanismus darstellen (North & Verkhratsky

2006). Studien an Panx1-KO-Tieren, die eine mögliche funktionelle Bedeutung von

Panx1 im Zusammenhang mit Folgen von Ischämie aufklären können, standen zu

Beginn dieser Arbeit aus und sind daher inhaltlich aufgegriffen worden.

2 Zielsetzung

27

2 Zielsetzung Das Ziel dieser Arbeit ist die Aufklärung eines direkten Zusammenhangs zwischen der

Funktion des Panx1-Kanals und den komplexen pathophysiologischen Prozessen bei

Ischämie. Für die Bearbeitung dieser Fragestellung wurde ein Panx1-KO-Mausmodell

verwendet. In einem experimentellen Modell der Ischämie im Hippocampus, welches

in dieser Promotion etabliert worden ist, sollte anhand von zellbiologischen, elektro-

physiologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht werden ob ein direk-

ter Zusammenhang von Panx1-Aktivität bzw. der Verlust von Panx1 in dem KO-

Modell mit Ischämie nachweisbar ist.

2.1 Klonierung und Expression zweier neuer Panx1-

Spleißvarianten

In einem zweiten Projekt sollten zwei bisher nicht-charakterisierte Panx1-

Spleißvarianten der Maus untersucht werden. Diese Fragestellung ist relevant, da

verlängerte (mPanx1ext) und verkürzte Formen (mPanx1tru) potentiell von Panx1

unabhängige Funktionen im Organismus übernehmen können und mit der geneti-

schen Ausschaltung des Panx1 interferieren. Die Spleißvarianten mPanx1ext und

mPanx1tru sollten kloniert, in N2a- Zellkulturen überexprimiert und anschließend

durch Lokalisationsstudien und Western Blot Analysen hinsichtlich der Expression in

vitro charakterisiert werden.

2.2 Etablierung des experimentel len Ischämiemodells

Zu Beginn dieser Arbeit wurde in zwei Studien nachgewiesen, dass der Panx1-Kanal

möglicherweise einen Einfluss auf neuronales Verhalten bei Ischämie hat (Thompson

et al. 2006, Zhang et al. 2008). Um Fragestellungen in diesem Kontext adressieren zu

können, war das zweite Ziel dieser Arbeit die Etablierung eines experimentellen Mo-

dells der Ischämie in unserem Labor. Dazu sollten sowohl die Methode der Farbstoff-

2 Zielsetzung

28

efflux Studien verwendet werden als auch ein neues Modell zur Charakterisierung von

zellulärer Aktivität und Zytotoxizität (Meloni et al. 2011).

2.3 Charakterisierung des neuen Panx1-KO-Mausmodells

Die Lokalisierung von Panx1 in der Hippocampus wurde bereits detailliert beschrie-

ben (Zoidl et al. 2007). Das dritte Ziel dieser Arbeit war eine vergleichende morpho-

logische Analyse von Hippocampi aus Panx1-KO- und WT Kontroll-Mäusen. Dazu

sollten sowohl Fluoreszenz- als auch Peroxidase Immunhistologische Methoden, sowie

Immuncytochemie anhand von Semidünnschnitten (0,8 µm) durchgeführt werden.

2.4 Charakterisierung neuronaler Kulturen bei Ischämie

Nachdem die grundlegende morphologische Charakterisierung des neuen Panx1-KO-

Mausmodells erfolgt war, sollte eine Charakterisierung von Panx1-KO- und WT-

Neuronen unter ischämischen Bedingungen stattfinden. Die Messung der metaboli-

schen Aktivität der Neuronen sowie deren Zytotoxizität bei Ischämie sollten vergli-

chen werden, um die Frage zu beantworten, ob Panx1 die Vulnerabilität der Neurone

erhöht.

2.5 Bestimmung elektrophysiologischer Aktivität bei Ischämie

Elektrophysiologische Messungen stellen eine Möglichkeit dar das physiologische Zu-

sammenspiel verschiedener Kanäle in komplexen Zellsystemen funktional zu untersu-

chen. Das Ziel war, anhand von elektrophysiologischen Messungen potentielle Unter-

schiede von Panx1-KO- zu WT-Tieren in der Reaktion auf Ischämie zu identifizieren.

Dazu sollten extrazelluläre Feldpotenziale an hippocampalen Schnitten bestimmt

werden.

2 Zielsetzung

29

2.6 Expressionsanalyse von Genen der synaptischen Plastizität

Es wurde vermutet, dass unter pathologischen Bedingungen, wie in dem hier unter-

suchten experimentellen Modell der Ischämie, Änderungen im Transkriptom entste-

hen. Voruntersuchungen hatten diskrete Veränderungen in Transkripten von Genen,

welche im Zusammenhang mit synaptischer Plastizität stehen, gezeigt. Das letzte Ziel

dieser Arbeit war es daher, eine Expressionsanalyse ausgewählter Gene in diesem ex-

perimentellen Modell der Ischämie durchzuführen. Dabei sollten WT- und Panx1-KO-

Schnitte unter Kontroll- und ischämischen Bedingungen verglichen werden.

3 Material und Methoden

30

3 Material und Methoden

3.1 Geräte Autoklaven: 3850EL, Tuttnauer Europe B.V., EH Breda, NL Varioklav 75T/135T, Fisher Scientific, Schwerte Blotting-Kammer: Trans-Blot SD semi-dry transfer cell, BioRad, München Brutschränke: Kelvitron t, Heraeus, Hanau HeraCell, Heraeus, Hanau B6060, Kendro Laboratory Products, Heraeus, Hanau Eismaschine: AF100, Scotsman Ice Systems, Vernon Hills, IL, USA Elektrophysiologische Synchroslice Komplettsystem, Lohmann Research, Apparatur: Equipment, Castrop-Rauxel Gefrierschränke -20 °C: Comfort/Premium Superfrost, Liebherr, Biberach an der Riss Gefrierschränke -80 °C: Herafreeze HFU 686 Basic, Thermo Scientific, Fisher Scientific, Schwerte Model 917, Forma Scientific, Thermo Scientific, Fisher Scientific, Schwerte Gelelektrophorese- Mini-PROTEAN II + III Gel System, BioRad, Hercules, Kammern: Richmond, CA, USA Kühl-Gefrier- Comfort/Premium Superfrost, Liebherr, Biberach an der Kombinationen: Riss Magnetrührer: IKAMAG RH, Janke&Kunkel, IKA Labortechnik, Staufen Mikroliterpipetten: Eppendorf Research, Eppendorf, Hamburg BioHit m300 Mikroskope: LSM510-Meta, Zeiss, Göttingen Olympus BH-2, Olympus, Center Valley, PA, USA TCS SP5 MP, Leica, Wetzlar Mikrotome: CM 3050, Leica, Wetzlar Ultracut UCT, Leica, Wetzlar Mikrowellenofen: M 9234, Samsung Primo pH-Meter: Hydrus 300, Fisherbrand Fisher Scientific, Schwerte Photometer: Ultrospec 3000, Pharmacia Biotech, Amersham, Little Chalfont, UK Microplate reader Model 500, Biorad, München Rechner: MacBook 5.1, Apple Reinstwasseranlage: Milli-Q50, Ultrapure water system, Millipore, Schwalbach Schüttler: Ika Vibrax VXR, Ika, Staufen Minitron, Infors HT, Einsbach Sequenzieranlage: Genetic Analyzer 3130xl, Applied Biosystems,

3 Material und Methoden

31

Foster City, CA, USA Software: Adobe Photoshop 12.0.4 Analysis System, Soft Imaging System GmbH, Münster,

LSM 510 software © Zeiss LSM 510 META Microsoft Excel 2011 Microsoft Word 2011 Olympus BH-2 cellA software © Olympus Prism4 (GraphPad) Synchroslice Software Package, Lohmann Research Vector NTI 9.1.0 4Peaks Version 1.7.2 © Mek & Tosj

Sterilbänke: LaminAir 1.2, Heto-Holten, Allerød, DK Heraguard HPH15, Heraeus, Hanau Thermocycler: PTC-200, MJ Research, Waltham, MA, USA

DNA Engine Opticon®2 Continuous Fluorescence Detection System, Bio-Rad, Hercules, USA

Trockenschränk: T6760, Heraeus, Hanau UV-Geldokumentation: Image Master VDS, Amersham pharmacia biotech, GE Healthcare, Freiburg Vibratom: Vibratome Series 1000, Lancer Technical Products Interanational, St. Louis, MO, USA 500MZ, Campden Instruments, Lougborough, GB Vortex-Mischer: VM-300, Vortex Mixer, neolab, Heidelberg Waagen: A 210P Sartorius, Göttingen Portable Advanced, OHAUS, USA Wasserbäder: WB 22, Mammert Technolab, Herne P 14, Thermo Haake, Sigma, Steinheim Western Blot Scanner: Odyssey Infrared Imaging System, Licor Biosciences Zentrifugen: Eppendorf Centrifuge 5415C, Eppendorf, Hamburg

Sorvall Super T21 centrifuge, Sorvall DuPont, Thermo Fisher Scientific, Schwerte Model 75005286, Biofuge Stratos, Thermo Electron Coper-ation, Heraeus, Hanau

Model 75005521, Biofuge Fresco, Heraeus, Hanau Model 3K15 Sigma Laborzentrifugen, Osterode

3.2 Verbrauchsmaterial ien Blotting Membran: Hybond-ECL nitrocellulose membrane, Amersham

Biosciences, GE Healthcare, Little Chalfont, UK

3 Material und Methoden

32

Deckgläschen: Menzel, Braunschweig

Filterspitzen: Starlab GmbH, Ahrensburg

Filterpipetten (5/10/25 ml): Corning, Becton Dickinson Falcon, Franklin Lakes,

NJ, USA

Kunststoffpetrischalen Becton Dickinson Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA

(3,5/6/10 cm): Sarstedt, Nümbrecht

Mikrotiterplatten: Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

Pipettenspitzen: Starlab GmbH, Ahrensburg

Objektträger: SuperFrost Plus, Menzel, Braunschweig

Reaktionsgefäße: Sarstedt, Nümbrecht

1,5 mL-Reaktionsgefäße: Starlab GmbH, Ahrensburg

0,2 mL-Reaktionsgefäße, steril: Starlab GmbH, Ahrensburg

15 mL-Polypropylenröhrchen: Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

50 mL-Polypropylenröhrchen: Sarstedt, Nümbrecht

Spritzenfilter (0,22 µm): Omnilab, Bremen

3.3 Chemikalien, Enzyme und Antikörper

3.3.1 Chemikalien

Acrylamid-Lösung AppliChem, Darmstadt Agarose Biomol, Hamburg Araldit Serva, Heidelberg Ampicillin AppliChem, Darmstadt Ammoniumchlorid Merck, Darmstadt Blockpuffer Odyssey Licor Biosciences, Lincoln, NE, USA Bromphenolblau Riedel-de Haën, Buchs, CH BSA Merck, Darmstadt Calciumchlorid J.T. Baker, Deventer, NL Carbenoxolone (CBX) Sigma, Darmstadt Chloroform J.T. Baker, Deventer, NL Diaminobenzidin Sigma, Steinheim Entellan Merck, Darmstadt

3 Material und Methoden

33

Ethanol J.T. Baker, Deventer, NL Ethidiumbromid Sigma, Steinheim Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)

Merck, Darmstadt

Ethylendioxy-bis-(ethylennitrilo)-tetraessigsäure (EGTA)

Sigma, Steinheim

Fetales Kälberserum (FCS) BiochromKG, Berlin Fluo-4 Invitrogen, Darmstadt FMC BioProducts PAA, Pasching, A Gewebe Gefriermedium Leica Microsystems, Wetzlar Glucose J.T. Baker, Deventer, NL Glycerin J.T. Baker, Deventer, NL Glycin AppliChem, Darmstadt H2O Gibco, Invitrogen, Darmstadt H2O2 Sigma, Steinheim Hoechst 33342 Invitrogen, Darmstadt Kanamycin AppliChem, Darmstadt Kaliumacetat J.T. Baker, Deventer, NL Kaliumchlorid Merck, Darmstadt Kaliumcyanid Sigma, Steinheim Kaliumdihydrogenphosphat J.T. Baker, Deventer, NL LB-Medium und LB-Agar AppliChem, Darmstadt L-Glutamin PAA, Pasching, A Mefloquine (MFQ) zur Verfügung gestellt von David Spray, New York,

USA Methanol J.T. Baker, Deventer, NL Natriumacetat Riedel-de Haën, Buchs, CH Natriumchlorid J.T. Baker, Deventer, NL Natriumdihydrogenphosphat J.T. Baker, Deventer, NL Natrium-Iodessigsäure Sigma, Steinheim Natriumpyruvat PAA, Pasching, A Nicht essentielle Aminosäuren PAA, Pasching, A Normales Ziegen Serum PAN Biotech, Aidenbach Paraformaldehyd Sigma, Steinheim Penicillin PAA, Pasching, A Phenol AppliChem, Darmstadt Polyethylenglykol Fluka, Buchs, CH ProLong Gold Antifade Reagenz

Molecular Probes, Invitrogen, Darmstadt

3 Material und Methoden

34

Propan, flüssig RUB Fakultät für Chemie Protease Inhibitor Sigma, Steinheim Stickstoff, flüssig RUB Fakultät für Chemie Streptomycin PAA, Pasching, A TEMED AppliChem, Darmstadt Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

AppliChem, Darmstadt

Triton X-100 AppliChem, Darmstadt Trizol Invitrogen, Darmstadt Trypsin-EDTA PAA, Pasching, A Tween 20 AppliChem, Darmstadt Xylol RUB Fakultät für Chemie

3.3.2 Kits

blackPREP Rodent Tail DNA Kit

Analytik Jena, Jena

CellTiter 96® AQueous One So-lution Cell Proliferation Assay

Promega, Mannheim

CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay

Promega, Mannheim

DNAse I Amplification Grade Invitrogen, Carlsbad, CA, USA Effectene Transfection Kit Qiagen, Hilden GeneRuler 1kb & 100bp Plus DNA Ladder

Fermentas, St. Leon-Rot

EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden GeneJET Plasmid Miniprep Kit

Fermentas, St. Leon-Rot

GeneJET Plasmid Miniprep Kit

Fermentas, St. Leon-Rot

Nucleobond Xtra Midi Clontech, Saint-Germain-en-Laye, F Nucleobond Xtra Maxi EF Macherey & Nagel, Düren PageRuler Plus Prestained Protein Ladder

Fermentas, St. Leon-Rot

PrimeScriptTM Reverse Transcriptase

TAKARA, Clontech, Saint-Germain-en-Laye, F

QIAamp DNA Blood Mini Qiagen, Hilden QIAquick PCR Purification Kit

Qiagen, Hilden

3 Material und Methoden

35

QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden SuperScript II Reverse Transcriptase

Invitrogen, Carlsbad, CA, USA

SYBR Adavantage qPCR Premix

Clontech, Saint-Germain-en-Laye, F

3.3.3 Enzyme

Advantage Taq (Clontech), calf intestine alkaline phosphatase (CIAP; Fermentas),

T4 DNA-ligase (Fermentas), Pfu DNA Polymerase (Promega), Platinum Pfx DNA

polymerase (Invitrogen), restriction endonucleases (Fermentas), FastDigest restriction

endonucleases (Fermentas), RNaseA (Sigma), Taq DNA polymerase (Fermentas),

HotStar DNA Polymerase (Qiagen), SybrGreen (Eurogentec).

3.3.4 Antikörper

3.3.4.1 Primärantikörper

Tab. 2: Liste primärer Antikörper, die in dieser Arbeit verwendet wurden.

Name Spezies Herkunft Spezifität β-Actin Maus Sigma, Darmstadt β-Actin Calbindin Kaninchen Swant, Bellinzona, CH Calbindin Calretinin Kaninchen Swant, Bellinzona, CH Calretinin c-myc Maus Sigma, Darmstadt c-myc-Tag Living Colors Maus Clontech, Saint-

Germain-en-Laye, F EGFP, EYFP, ECFP

Panx1 4515 Huhn Aves Labs, Tigard, OR, USA; zur Verfügung gestellt von Gerhard Dahl

Maus-Panx1

Panx1-CT Kaninchen Eigenproduktion Georg Zoidl

Maus-Panx1

Parvalbumin Maus Swant, Bellinzona, CH Parvalbumin

3 Material und Methoden

36

3.3.4.2 Sekundärantikörper

Tab. 3: Liste sekundärer Antikörper, die in dieser Arbeit verwendet wurden.

Name Spezies Herkunft Spezifität Alexa Fluor 488 Ziege Molecular Probes, Invi-

trogen, Carlsbad, CA, USA

Maus/Kaninchen/Huhn

Alexa Fluor 568 Ziege Molecular Probes, Invi-trogen, Carlsbad, CA, USA

Maus/Kaninchen/Huhn

B-ZAK Ziege Axxora, Lörrach Kaninchen IgG B-HAM Pferd Axxora, Lörrach Maus IgG Biotinylated anti rabbit

Ziege Vector Laboratories Kaninchen

Cy5.5 Ziege Abcam, Cambridge, MA, USA

Huhn

IRDye680 Ziege Licor Biosciences, Lin-coln, NE, USA

Maus/Kaninchen

IRDye800 Ziege Licor Biosciences, Lin-coln, NE, USA

Maus/Kaninchen

3.4 Oligonukleotide und Plasmide

3.4.1 Oligonukleotide

Alle verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma biomers.net (Ulm) oder

Sigma-Aldrich (Steinheim) bezogen.

Tab. 4: Oligonukleotide für Klonierungen und Sequenzierungen

Name Primer sense (5’ 3’)

Primer antisense (5’ 3’)

Verwendung

pCR3.1-Seq1/2

GGTGGG-GAGGTCTATA-TAAGCAGAGC

GAAGGCACAGTCGAGGCTGAT-CAGCG

Sequenzierungsprimer

pRK5 Seq1/2 GAATAACATCCACTTTGCC

GAAATTTGT-GATGCTATTGC

Sequenzierungsprimer

3 Material und Methoden

37

pEGFP-N3- mPanx1-s/as

GAGAATT-CCCACCAT-GGCCATCGCCCACTTGGCCA

GAG-GATCCGCAG-GACGGATTCA-GAAGCCTCTGGCG

Klonierung von mPanx1 in pEGFP-N3

EGFP-mPanx1iso-1as

s.o. GCG-GATCCCAAAACATAAAGACAA-TATGAGG

Klonierung von mPanx1ext in pEGFP-N3

mPx1-UNI-C-Myc-1s

GCTCTAGAAT-GGCCATCGCCCACTTGGC

mPx1wt-C-Myc-2as

s.o. CGTCTAG-AGCAGGACG-GATTCAGAA

Klonierung von mPanx1wt in Vektor mit C-terminalen Myc-Tag - pRK5-rPx1-myc

mPx1iso-C-Myc-2as

s.o. CGTCTAG-ACAAAACATAAAGACAAT

Klonierung von mPanx1ext in Vektor mit C-terminalen Myc-Tag - pRK5-rPx1-myc

mPx1tru-C-Myc-2as

s.o. CGTCTAGAGA-TATCTCCCACAGACT

Klonierung von mPanx1tru in Vektor mit C-terminalen Myc-Tag - pRK5-rPx1-myc

mPx1wttr-N-myc-1s

CGCCGCG-GAAAT-GGCCATCGCCCACTTGGCCAC

mPx1wt-N-myc-1as

s.o. GCGGGCCCT-TAGCAGGACG-GATTCAGAA

Klonierung von mPanx1wt in Vektor mit N-terminalen Myc-Tag - pCR3.1-Uni-myc-Kvß3 (Ste-fanie Bunse)

3 Material und Methoden

38

mPx1tru-N-myc-1as

s.o. GCGGGCCCT-CAGATA-TCTCCCACAGACT

Klonierung von mPanx1tru in Vektor mit N-terminalen Myc-Tag - pCR3.1-Uni-myc-Kvß3 (Ste-fanie Bunse)

mPx1ext-N-myc-1s CGCCGCGGAATGAAT-GGCCATCGCCCACTT-GGCCACGGA

GCGGGCCCT-CACAAAACATAAAGACAAT

Klonierung von mPanx1ext in Vektor mit N-terminalen Myc-Tag - pCR3.1-Uni-myc-Kvß3 (Ste-fanie Bunse)

Beta actin-mm-1s/1as

GACGACATG GAGAAGATC TGGCACC

GTCACGCAC GATTTCCCT CTCAGC

Überprüfung anno-tierter Gensequenzen (Mus musculus)

GAPDH-mm-1s/1as

GCTGAACGG GAAGCTCAC TGGC

CTCCTTG-GAGGCCATG-TAGG

s.o.

Px1-hs-1s/1as GCTACTCCT GACAAACCT TGGCATG

GCACAGAAG TTATTCTTC TTTGG

Überprüfung anno-tierter Gensequenzen (Homo sapiens)

Beta actin-hs-1s/1as

CAGCCATGT ACGTTGCTA TCCAGG

CCTTAATGT CACGCACGA TTTCC

s.o.

Px1-rn-1s/1as CTGACAAAC CTAGGCATG ATTAAGATGG

CAGAGAAGG ACAAAGAGA CGAGACATA CAG

Überprüfung anno-tierter Gensequenzen (Rattus norvegicus)

Beta actin-rn-1s/1as

GCTGTGTTG TCCCTGTAT GCCTCTGGT CG

CCTCTCA-GCTGTGGTGGTGAAGCTGTAGC

s.o.

mPx1truncRTPCR-1s/1as

CTTTGTG-GATTCATA-TA-CTGCTGGGCTGC

TCAGATA-TCTCCCACAGACTTGTGCAGC

Panx1tru Primer für quantitative Realtime PCR (qRT-PCR)

mPx1wtRTPCR-1s/1as

GCTGCCAAGAGTGCTCGA-GATTTG

CCACGATT-GGGTACTT-GAAGTGGC

mPanx1wt Primer für qRT-PCR

3 Material und Methoden

39

mPx1IsoRTPCR-1s/1as

CCCTAC-CCTGCCTGT-CACTTGAACC

ACAGGGAGAG-GACAGCAGAGCCATC

mPanx1wt Primer für qRT-PCR

mHIF1aRTPCR-1s/1as

GCGAGAACGAGAAGAAAAA-GATGAGTTCTG

TGGCAACTGAT-GAT-GAGCAAGCT-CATAAA

HIF1a Primer für qRT-PCR

mGLUT1RTPCR-1s/1as

AGCAAGAAGGTGACGGGCCG

TGGGGGGCGTTGATGACACC

GLUT1 Primer für qRT-PCR

qGREM2_1/2 CGCCTCTACAAGGACTT-CGTGCTCAATG

CGCA-GATAGGTGAA-GATGTTG-TAGCGGC

GRM2 Primer für qRT-PCR

qGREM5_1/2 GTGCAGT-GAACCGTGT-GAGAAAG-GACAG

TGGCACGCCTTGCAGGTG-TACTCATC

GRM5 Primer für qRT-PCR

qARC_1/2 GCCTACAGAGCCAGGAGAAT-GACACCAG

ACCCATG-TAGGCAGCTT-CAGGAGAAGAG

ARC Primer für qRT-PCR

qGABRA5_1/2 CATTG-GAAAGTCCT-CAAGCTGCATTGG

GGCAAGAAGTCCATT-GCACACAACATG

GABRA5 Primer für qRT-PCR

qHSP90_1/2 TTTT-CCTCCGCGAGTTGATCTCTAATGC

GAGGGTTGGG-GATGATGTCA-ATTTTCAG

HSP90 Primer für qRT-PCR

qGUSB_1/2 TTTGACTT-CTTCAACTAT-GCGGGACTGC

TCA-CTGCCCTGCACAGAAATCCAG-TAG

GUSB Primer für qRT-PCR

q18s_1/2 TGACTCTTT-CGAGGCCCTG-TAATTG

TGGAATTAC-CGCGGCTGCTG

18S Primer für qRT-PCR

3 Material und Methoden

40

3.4.2 Plasmide

Tab. 5: Liste der durch in vitro Rekombination generierter Plasmide.

Vektor Insert Verwendung

pCR3.1uni Myc-mPanx1wt Eukaryotischer Expressi-onsvektor für ein Fusions-protein von mPanx1-Varianten mit N-terminalen Myc-Tag

Myc-mPanx1ext

Myc-mPanx1tru

pRK5 mPanx1wt-Myc Eukaryotischer Expressi-onsvektor für ein Fusions-protein von mPanx1-Varianten mit C-terminalen Myc-Tag

mPanx1ext-Myc

mPanx1tru-Myc

pEGFP-N3

mPanx1ext

Eukaryotischer Expressi-onsvektor für ein Fusions-protein von mPanx1ext mit C-terminalen EGFP-Tag

Die Plasmid-Karten befinden sich im Anhang A1.

3.5 Versuchsorganismen Die Behandlung, Manipulation und Aufbewahrung aller bakterieller oder eukaryoti-

scher Zelllinien wurde in lizensierten S1 Laboren der Abteilung Neuroanatomie und

Molekulare Hirnforschung der Ruhr-Universität Bochum (RUB) durchgeführt.

Die Unterbringung und Zucht von Mäusen und Ratten erfolgte im Tierhaus der RUB

bei einer konstant kontrollierten Temperatur von 23 °C und nach Auflagen des deut-

schen Tierschutzgesetzes. Der Tag-Nacht-Zyklus betrug 12 Std.. Die Tiere bekamen

Wasser und Futter ad libitum. Alle Experimente inklusive der Gewebeentnahme wur-

den nach erfolgter Autorisierung durchgeführt.

3 Material und Methoden

41

3.5.1 Bakterien

Escherichia coli (E. coli) K-12: DH5α-T1 (Invitrogen)

Genotyp: F- 80lacZM15 (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk

+ ) phoA

supE44 thi-1 gyrA96 relA1 tonA

3.5.2 Eukaryotische Zell l inien

Für die heterologe Expression von cDNA alternativer Panx1-Spleißvarianten in Säu-

gerzellen wurden Neuro 2a (N2a)-Zellen verwendet. N2a-Zellen stammen von einem

Maus-Neuroblastom ab (Mus musculus) und wurden freundlicherweise von Dr. David

Spray (Albert Einstein College, NY, USA) zur Verfügung gestellt (Olmsted et al.

1970).

3.5.3 Tiere

Es wurde mit Gewebe des Laborstamms (Wildtyp, WT) C57Bl/6 Mausstamm (Mus

musculus) und Wistar-Ratten (Rattus norvegicus) gearbeitet, die von Charles River

(Sulzfeld, Deutschland) bezogen wurden.

Des Weiteren wurde mit einem konditionalen Panx1-Knock-out-Mausmodell (Panx1-

KO) gearbeitet, das unter Verwendung des Cre/loxP-Systems hergestellt wurde. Der

Panx1-KO wurde von Dr. Valery Shestopalov (University of Miami, FL, USA) herge-

stellt und freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Die hier verwendeten Mäuse

stammen aus der Verpaarung von Mäusen, welche die Cre-Rekombinase unter Kon-

trolle des CMV-Promoters exprimieren und solchen, in denen die kodierenden Exone

3 und 4 des Panx1-Gens von loxP Erkennungssequenzen flankiert sind. Nachkommen

dieser Verpaarung haben einen globalen und durch die Keimbahn weitergegebenen

Verlust des funktionalen Panx1-Proteins. Der Funktionsverlust resultiert aus einer

Deletion genomischer Fragmente aus Exon 3 und 4 des Panx1-Gens zwischen den

3 Material und Methoden

42

flankierenden loxP-Erkennungssequenzen. Das führt zu einer Verschiebung des Le-

serahmes, der auf Gen- und Proteinebene bestätigt wurde.

Zusammenfassend kommt es durch die Verwendung des CMV-Promotors, der die

Cre-Rekombinase global exprimiert, zur Expression des funktionsunfähigen Panx1

(Panx1 loxP/CMV cre) in den Panx1-KO-Tieren. Als Kontrolle dienen die Panx1-

loxP-Tiere, deren Panx1 nicht durch die Expression der Cre-Rekombinase geschnitten

werden und somit weiterhin ein funktionales Panx1 herstellen können (Abb. 8). Die

Panx1-KO-Tiere weisen keine phänotypischen Abnormitäten auf und ihre ZNS Mor-

phologie war nicht von WT-Tieren zu unterscheiden. Alle Tiere wurden in der zentra-

len Tierhaltung der RUB gehalten.

Abb. 8: Schema der Knock-out Strategie des konditionalen Panx1-KO (Illustration von Dr. Valery Shestopalov, verändert)

3.6 Medien und Lösungen

3.6.1 Bakterienmedien

LB Medium 1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl LB Agar Platten LB Medium mit 1% Agar SOC Medium 2% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 10 mM NaCl,

2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM Glucose

Finale Konzentration von zugegebenen Antibiotika:

Ampicillin 100µg/ml, Kanamycin 100µg/ml, Streptomycin 12,5 µg/ml.

3 Material und Methoden

43

3.6.2 Zellkulturmedien und Lösungen

Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS)

138 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4

Trypsin-EDTA 0,05% Trypsin, 0,02% EDTA HBSS+/+ 1,3 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2*6H2O,

0,4 mM MgSO4*7H2O, 5,3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 4,2 mM NaHCO3, 137,9 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 5,6 mM D-Glucose

N2a- Medium D-MEM (+4,5 g/l D-Glucose, +L-Glutamin, Pyruvat; Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 5% FCS, 1% L-Glutamin, 1% nicht essentielle Aminosäuren (NEA), 1% Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml / 10 mg/ml),

Neuronen Medium Neurobasalmedium (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1% L-Glutamin, 1% N2 Supplement, 2% B27 Supplement

3.6.3 Lösungen für die Molekularbiologie

DNA Lade-Puffer 0,5 M EDTA, 66% Glycerin, 0,025% Xylol Cyanol, 0,025% Bromphenolblau

Genotypisierung blackPREP Rodent Tail DNA Kit (Analytik Jena, Jena, Germany) enthaltene Lösungen: Lysis-Lösung, Bindungs-Lösung, Proteinase K, Wasch-Lösung, Elutions-Puffer

RNA Lade-Puffer 95% Formamid, 0,025% Xylol Cyanol, 0,025% Bromphenolblau, 18 mM EDTA, 0,025% SDS

TAE 1 mM EDTA, 40 mM Tris-Acetat TE 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0

3 Material und Methoden

44

3.6.4 Lösungen für die Proteinbiochemie

Blockpuffer für Immuncyto-chemie/ Immunhistochemie

3% normales Ziegen Serum (NGS), 1% Albumin (BSA) in PBST (0.1% Tween 20)

Blockpuffer für Western Blot Odyssey Blocking Buffer (LI-COR) Laemmli Laufpuffer 192 mM Glycin, 0,1% SDS, 25 mM Tris-HCl,

pH 8,3 Laemmli Probenpuffer 2% SDS, 10% Glycerin, 10% β -Mercaptoethanol,

50 mM Tris-HCl, pH 6,8 PBS s. 3.6.2 PBS-T 1x PBS + 0,1% Tween 20 Transfer-Puffer 20% Methanol, 48 mM Tris, 39 mM Glycin, 0,037%

SDS Tris-Puffer 0,5 M Tris/HCl; pH 6,8 Tris-Puffer 1,5 M Tris/HCl; pH 8,8 10% SDS 10%(w/v) SDS Gewebe-Lysispuffer 0,5 M Tris/HCl pH 6,8, 2% (w/v) SDS, 1 mM

EGTA, 10% (v/v) Glycerol, 2% (v/v) Protease-Inhibitor-Cocktail

3.6.5 Lösungen für die Immuncyto- und Immunhistochemie

PBS s. 3.6.2 PBS-T s. 3.6.4 PBS-A 1x PBS, 2 mg/ml BSA Vorspülungslösung Gewebe-präparation

48,76 mM NaAc, 154 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,36 mM CaCl, 0,25 mM MgCl, 40 g/L Dextran GDRI, 10 mM Nitroprussid-Na; pH 7,4

4%/0,5% Paraformaldehyd (PFA)

83,8 mM Na2HPO4 + 2H2O, 16,17 mM KH2PO4, 4%/0,5% (w/v) PFA

Agaroselösung 1x PBS, 2% (w/v) Agarose Sucroselösung 1x PBS, 30% (w/v) Saccharose Reduktionslösung 1x PBS, 1% (w/v) NaBH4

10% NGS 1x PBS, 10% (v/v) NGS 10% HS 1x PBS, 10% (v/v) HS 10% NGS/HS-PhT 10% NGS/HS, 0,3%(v/v) Triton X-100, 0,05%

(v/v) Phenylhydrazin Primärantikörperlösung 10% NGS/HS, 0,3% (v/v) Triton X-100, 0,1%

NaAzid + 1. AK (Verdünnung je nach AK)

3 Material und Methoden

45

Sekundärantikörperlösung PBS-A + 2. AK 1:1000 Avidin-Biotin-Komplex (ABC-Lösung)

PBS-A, Elite-A 1:1000, Elite-B 1:1000

Imidazol 1 M Imidazol; pH 7,6 Vorinkubationslösung 0,1 mM Imidazol, 5 mM Tris/HCl pH 7,6, 1,38 mM

DAB Inkubationslösung 0,1 mM Imidazol, 5 mM Tris/HCl pH 7,6, 1,38 mM

DAB, 0,015% (v/v) H2O2

Toluidinblaufärbung 1% Toluidinblau, 1% Borax in 30% Saccarose, pH 9,6

Bleizitrat 1,33 g Bleinitrat, 1,76 g Natriumcitrat in 30 ml A.dest.

3.6.6 Physiologische Lösungen

ACSF (artifizielle Cerebrospi-nal-Flüssigkeit) für die Elektrophysiologie an akuten Hirnschnitten

124 mM NaCl, 2,69 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2mM MgSO4, 10 mM Glucose, 2 mM CaCl2*2H2O, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM MgSO4*7H2O, 26 mM NaHCO3

SPES (Standard physiologische extrazelluläre Lösung) für Messungen mit Zell-basierten Testverfahren

147 mM NaCl, 10mM HEPES, 13 mM Glucose, 2 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7,4

3.6.7 Lösungen zur metabolischen Inhibition (MI)

Für Messungen an Zellkulturen in SPES

0,3 mM Natrium-Iodessigsäure; 1 mM Kaliumzya-nid (KCN)

Für elektrophysiologische Messungen in ACSF

0,15 mM Natrium-Iodessigsäure; 0,5 mM Kalium-zyanid (KCN)

3 Material und Methoden

46

3.7 Molekularbiologie

3.7.1 Methoden für die Präparation und Analyse von DNA

3.7.1.1 Amplifizierung von DNA-Fragmenten durch PCR

Zur Amplifizierung spezifischer DNA-Fragmente wurde die Polymeraseketten-

reaktion (PCR) verwendet. Für die Klonierung verwendete PCR-Fragmente wurden

durch Polymerasen mit intrinsischer Korrekturlesefunktion amplifiziert, z.B. der Ad-

vantage Taq oder Pfu. PCR-Reaktionen wurden nach dem folgenden Schema ange-

setzt:

Tab. 6: Schema zum Ansatz einer Standard PCR Reaktion.

PCR Mix µl PCR Programm Primer (s/as)(20 mM) 1 Initiale Denaturierung 1. 94 °C 3 min dNTPs (10 mM) 1 Denaturierung 2. 94 °C 30 s 10x Puffer 5 Hybridisierung 3. 60 °C 30 s DNA-Polymerase 0,5 Elongation 4. 72 °C 1 min Template DNA (1 ng/µl) PCR H2O

1 ad 50

5. 21 Wiederho-lungen von Schritt 2-4

Finale Elongation 6. 72 °C 10 min 7. 4 °C ∞

3.7.1.2 Agarose-Gelelektrophorese von DNA

Zur Aufreinigung der DNA-Fragmente nach ihrer Größe wurde eine horizontale Gel-

elektrophorese durchgeführt. Je nach Größe der erwarteten DNA-Fragmente wurden

0,7-2% Agarose in 1x TAE Puffer und 0,4 µg/ml Ethidiumbromid verwendet. Nach

Zugabe von 1/10 Vol. Ladepuffer wurden die Proben in die Taschen des Gels geladen

und bei einer konstanten Spannung von 6 V/cm Elektrodenabstand für ca. 1 Stunde

separiert. Die Bewertung der DNA-Fragmente wurde anhand des DNA- Standards

3 Material und Methoden

47

GeneRuler 1 kb Ladder und 100 bp LadderPlus (Fermentas) durchgeführt. Der

ImageMaster wurde zur Dokumentation der Resultate verwendet.

3.7.1.3 Isolation und Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen

Unter UV-Licht (λ= 366 nm) wurden die Gel-Fragmente mit einem scharfen Skalpell

ausgeschnitten, welche DNA-Fragmente von Interesse enthielten. Die Aufreinigung

und Elution der Fragmente erfolgte mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)

nach Herstellerangaben.

3.7.1.4 Ligation von DNA-Fragmenten

Die Ligation von DNA-Fragmenten wurde mit einer rekombinanten T4 DANN-Ligase

(Fermentas) nach Herstellerangaben durchgeführt. Dabei wurde ein molares Verhält-

nis von 1:1 bis 5:1 von DNA-Insert zu Vektor-DNA gewählt, um die Ligationseffizienz

zu erhöhen wurde 5% (w/v) PEG 4000 zugegeben. Der Ligationsansatz wurde über

Nacht (ü.N.) bei 10 °C oder für 1 Std. bei RT inkubiert.

3.7.1.5 Transformation kompetenter Bakterien

Für die präparative Produktion von in vitro rekombinierter Plasmid-DNA wurde der

Escherichia coli Stamm DH5α verwendet, der im Vorfeld durch CaCl2-Behandlung

kompetent gemacht wurde (Mandel & Higa 1970, Pope & Kent 1996). Chemische

Transformation wurde durch einen Hitzeschock von 42 °C für 30 s erreicht. In 1 ml

SOC Medium konnte sich eine Antibiotika-Resistenz entwickeln. Positiv transfor-

mierte Bakterien konnten durch eingeführte Resistenz-Gene mit entsprechendem An-

tibiotikum anschließend im LB-Medium selektiert werden. Je nach Vektor wurden

entweder 100 µg/ml Ampicillin oder 50 µg/ml Kanamycin verwendet. Um Einzel-

klone zu erhalten, wurden LB-Agarplatten über Nacht bei 37 °C inkubiert. Zur Prä-

paration von rekombinanter Plasmid-DNA wurden einzelne Kolonien in 5 ml LB-

Flüssigmedium überführt und im Bakterienschüttler bei 37 °C und 225 UpM (Um-

drehungen pro Minute) ü.N. inkubiert.

3 Material und Methoden

48

3.7.1.6 Präparation von Plasmid-DNA

Für analytische und präparative Zwecke wurde Plasmid-DNA aus E. coli Zellen unter

Verwendung verschiedener Isolations-Kits gereinigt. Die Wahl des Kits wurde je nach

zu präparierender DNA-Menge getroffen. Es wurden Kits von Fermentas, Clontech

oder Macherey & Nagel für Mini-, Midi- oder Maxipräparation verwendet. Dabei

wurde nach Herstellerangaben vorgegangen und es konnten bis zu 20 µg, 100 µg oder

500 µg Nucleinsäure isoliert werden. Für größere Mengen Endotoxin-freier Plasmid-

DNA für Transfektionen in eukaryotische Zellkulturen wurde das EndoFree Plasmid

Maxi Kit (Qiagen) verwendet. Es konnten damit bis zu 500 µg DNA routinemäßig

aus Einzelpräparationen erhalten werden.

3.7.1.7 Restriktion von DNA

Für die Linearisierung von Plasmiden oder das Ausschneiden definierter Fragmente

wurden Typ II Restriktionsendonukleasen benutzt. Die analytische Restriktion wurde

zur Analyse rekombinanter Plasmide verwendet, während die präparative Restriktion

zur Produktion rekombinanter DNA genutzt wurde. In den Reaktionsansätzen wurde

jeweils 1 U Endonuklease pro 1 µg DNA eingesetzt und im geeigneten Puffer bei

37 °C für 5-30 min nach Herstellerangaben inkubiert.

3.7.1.8 Feststellung der Konzentration von Nucleinsäuren

Um die Konzentration von DNA oder RNA festzustellen, wurde die Absorption bei

260 nm (A260nm) gemessen. Die Konzentration wurde mit folgender Formel berech-

net:

c (Nucleinsäure) = Absorptionskoeffizient x A260nm x Verdünnung x µg/ml

Der Absorptionskoeffizient von DNA beträgt 50, der von RNA 40. Proteinkontamina-

tionen wurden durch Bestimmung des A260nm/A280nm Quotienten bestimmt. Lö-

sungen mit einem Quotient > 1,8 wurden als nicht kontaminiert erachtet.

3 Material und Methoden

49

3.7.1.9 Sequenzierung von Plasmid-DNA

Die Sequenzierung rekombinierter Plasmid-DNA wurde vom Sequenzierservice der

RUB an der Fakultät für Chemie und Biochemie durchgeführt. Dort wurde der Ge-

netic Analyzer 3130xl mit BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kits und geeig-

neter Analysesoftware (Sequencing Analyzer; 4peaks & Vector NTI) verwendet.

3.7.2 Methoden für die Präparation und Analyse von RNA

3.7.2.1 Isolierung von RNA aus Mausgewebe

Gesamt-RNA wurde durch die Trizol-Methode, basierend auf der Phenol-Chloroform-

Extraktion (Chomczynski & Sacchi 1987), isoliert und gereinigt. Dabei wurden 100

mg Gewebe in 1 ml Trizol homogenisiert. Im Anschluss wurde 1/5 Vol. Chloroform

zugeführt. Durch Zentrifugation werden die RNA-enthaltende Phase und die Protein-

enthaltende Phase voneinander getrennt. Anschließend wurde die RNA durch Isopro-

panol Zugabe und erneute Zentrifugation gefällt, mit 70% Ethanol gewaschen und in

RNase-freiem Wasser resuspendiert.

3.7.2.2 Synthese von cDNA durch reverse Transkription

Die Synthese von DNA komplementär zu mRNA wurde mit dem Kit PrimeScript von

TAKARA nach Herstellerangaben durchgeführt. Vorher wurde 1 µg der für die Tran-

skription eingesetzten RNA für 15 min bei RT mit 1 µg DNAse I-behandelt. Die

DNAse I wurde durch Zugabe von EDTA und 10 min Inkubation bei 65 °C inakti-

viert.

3.7.2.3 Agarose- Gelelektrophorese von RNA

Die Analyse von RNA wurde in 1-2% Agarose Gelen mit 0,4 µg/ml Ethidiumbromid

durchgeführt. Die Proben wurden mit RNA Lade-Puffer vermischt (1 µl Probe + 6 µl

Puffer), 2 min auf 95 °C erhitzt und bei konstanter Spannung von 6 V/cm Elektro-

3 Material und Methoden

50

denabstand für ca. 1 Stunde separiert. Der ImageMaster wurde zur Dokumentation

der Resultate verwendet.

3.7.3 Genotypisierung transgener Mäuse

DNA wurde aus Schwanzspitzen transgener Mäuse isoliert, um deren Genotyp zu

bestimmen. Dazu wurde das blackPREP Rodent Tail DNA Kit (Analytik Jena) nach

Herstellerangaben verwendet. Mit der erhaltenen genomischen DNA wurde eine PCR

Reaktion mit folgendem PCR Programm durchgeführt.

Tab. 7: Schema zum Ansatz einer PCR Reaktion für die Genotypisierung.

PCR Mix µl PCR Programm Primer (s/as)(20 mM) 1 Initiale Denaturierung 1. 95 °C 15 min dNTPs (10 mM) 1 Denaturierung 2. 94 °C 45 s 10x Puffer 2 Hybridisierung 3. 58 °C 45 s HotStar Polymerase (Qiagen)

0,5 Elongation 4. 72 °C 2 min

Template DNA (1 ng/µl) PCR H2O

1 ad 20

5. 42 Wiederho-lungen von Schritt 2-4

Finale Elongation 6. 72 °C 10 min 7. 4 °C ∞

Im Anschluss wurde eine analytische Gelelektrophorese durchgeführt. Die erwartete

Bandengröße von Panx1-KO-Tieren (loxP/CMV cre) lag bei 900 bp und von WT-

Tieren (loxP) bei 1989 bp (s. Abb. 8).

3.7.4 Expressionsanalyse durch qRT-PCR

Zur Messung quantitativer Genexpressionen wurde das SybrGreen System (Eurogen-

tec) nach Herstellerangaben verwendet. SybrGreen ist ein fluoreszierender Farbstoff,

der spezifisch an die kleine Furche der doppelsträngigen-DNA bindet. Die Fluores-

3 Material und Methoden

51

zenzintensität ist proportional zur DNA-Menge, die während des Amplifikationspro-

zesses entsteht.

cDNA wurde im Vorfeld wie oben beschrieben aus vorher extrahierter totaler RNA

synthetisiert. 1 µl cDNA wurde in einer 20 µl Reaktion mit 10 µl SybrGreen, 10 µl

PCR H2O und 0,12 M jedes Primers jeweils in Tripletts angesetzt (für Primer Se-

quenzen s. Tabelle 4).

Zur Quantifizierung wurde das DNA Engine Opticon® 2 Continous Fluorescence De-

tection System (Bio-Rad) verwendet. Ct-Werte wurden zu einem Zeitpunkt bestimmt,

wenn die Fluoreszenzsignale während der exponentiellen Phase der Reaktion, einen

bestimmten Schwellenwert über Hintergrundniveau erreicht hatten. Die Effizienz (E)

der Primer wurde durch Standardkurven mit der folgenden Formel ermittelt E = 10(-

1/Steigung). Die Daten wurden mit dem Programm REST (Relative Expression Software

Tool) analysiert. Diese Software verwendet einen Algorithmus zum Vergleich der Ge-

nexpression, die von Pfaffl et al. entwickelt wurde (Pfaffl et al. 2002).

3.7.5 Bioinformatik

DNA-Sequenzen wurden durch die Nucleotid Such Funktion des National Center for

Biotechnology Information (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/) und

durch die Ensembl Datenbank (http://www.ensembl.org/) identifiziert. Alle durch

Sequenzierung erhaltenen Sequenzen wurden mit dem ClustalW2 multiple sequence

alignment tool für DNA und Proteine vom European Bioinformatics Instiute (EBI;

http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) analysiert. Vorhersagen von Trans-

membrandomänen und der Topologie von Proteinen wurden mit dem TMHMM

(http:/ /www.cbs.dtu. dk/services/ TMHMM- 2.0/), dem TMpred

(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html) oder dem Simple Modu-

lar Architecture Research Tool des EMBL (SMART; http://smart.embl-

heidelberg.de/) getroffen. Das Molekulargewicht von Proteinen wurde durch das Pro-

3 Material und Methoden

52

gramm Compute pI/MW vom ExPASy Server (http://expasy.org/compute_pi/)

kalkuliert.

3.8 Protein-biochemische Methoden

3.8.1 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Elektrophoretische Auftrennungen von Proteinextrakten wurden mit dem Gelsyste-

men Mini-Protean II und III durchgeführt (Laemmli 1970). Denaturierende Poly-

acrylamidgele wurden mit folgenden Zusammensetzungen angesetzt: Sammel-Gel (5%

Acrylamid, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% SDS, 0,08% TEMED, 0,15% APS) und

Trenn-Gel (10-15% Acrylamid, 380 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% SDS, 0,8% TEMED,

0,08% APS). Als elektrophoretischer Marker wurde die PageRuler Prestained Protein

Ladder (Fermentas) verwendet. Proteinproben wurden in Laemmli-Probenpuffer auf-

genommen und 5 min bei 95 °C denaturiert. 5-10 µg Protein wurde pro Spur aufge-

tragen und bei einer konstanten Spannung von 80-100 V aufgetrennt.

3.8.2 Western Blot

Proben für Western Blot (WB) wurden hergestellt, indem transfizierte N2a-Zellen

mit 4 °C kaltem PBS gewaschen wurden und im Anschluss in Laemmli-Probenpuffer

direkt in der Kulturschale lysiert wurden. Die Lysate wurden durch die SDS-PAGE

aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembranen (GE Healthcare) transferiert. Nach

Inkubation mit WB Blockpuffer (LI-COR) wurden die Membranen mit den jeweiligen

Primärantikörpern (s. Tabelle 2) ü.N. bei 4 °C inkubiert. Nach mehreren aufeinander-

folgenden Waschschritten in PBS wurden die Membranen mit sekundären Meer-

rettichperoxidase gekoppelten Antiköpern (s. Tabelle 3) für 90-120 min bei RT inku-

biert. Nach erneuten Waschschritten mit PBS erfolgte die WB Detektion mit einem

dualen Infrarot-Fluoreszenz Laser des Odyssey Systems (LI-COR).

3 Material und Methoden

53

3.9 Zellkultur

3.9.1 Kultivierung von N2a-Zellen

Alle Zelllinien wurden in 10 ml geeigneten Medium bei 5% CO2 –Atmosphäre, 90%

relativer Feuchtigkeit und 37 °C inkubiert. Nach mikroskopischer Abschätzung der

Zelldichte wurden die Zellen alle 48 bis 72 Std. in einer 1:5 bis 1:10 Verdünnung ge-

splittet. Für das Splitten wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und durch

Zugabe von Trypsin/EDTA abgelöst. Danach wurden routinemäßig jeweils 0,5 ml der

Zellsuspension (ca. 1,5x106 Zellen) zu 10 ml frischem Medium gegeben und in einer ø

10 cm Schale kultiviert.

3.9.2 Präparation und Kultivierung von Neuronenkulturen

Primäre hippocampale Neuronenkulturen wurden von neugeborenen (P0-2) Wistar-

Ratten oder Mäusen verschiedener Stämme (s. Abschnitt 3.5.3) gewonnen. Die Tier-

Handhabung wurde in Übereinstimmung mit dem deutschen Tierschutzgesetz und

unter Aufsicht örtlicher Behörden durchgeführt. Die Anzahl der verwendeten Tiere

wurde auf das für die Evaluierung der experimentellen Daten notwendige Minimum

beschränkt. In Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz wurden alle Vorschriften

eingehalten um tierisches Leid zu minimieren. Für die Präparation neuronaler Kultu-

ren wurden Ratten bzw. Mäuse dekapitiert und die freigelegten Kortizes in eiskaltes

PBS überführt. Nach Entfernung der Hirnhaut wurden die Hippocampi freigelegt und

in PBS mit 0,1% Trypsin resuspendiert. Die Lösung wurde ca. 10 min im Wasserbad

bei 37 °C inkubiert. Im Anschluss setzten sich die Zellen 15 min auf Eis ab. Der

Überstand wurde in ein Röhrchen mit 5 ml eiskaltem DMEM überführt und wieder

auf Eis gestellt. Die Zellen wurden für 10 min bei 300 x g bei 4 °C zentrifugiert. Der

Überstand wurde in eine ø 10 cm Schale dekantiert, das Pellet mit 2 ml DMEM re-

suspendiert und in einer ø 6 cm Schale ohne Beschichtung ausgesät und für 2 Std. im

Wärmeschrank vorkultiviert. Dabei setzten sich selektiv nicht-neuronale Zellen ab,

3 Material und Methoden

54

während Neurone im Überstand verblieben. Nach der Vorplattierung wurde die ange-

reicherte Neuronensuspension der Schalen gesammelt, 6 min bei 300 x g zentrifugiert

und das Pellet in vorgewärmtem DMEM resuspendiert. Die angereicherten dissoziier-

ten hippocampalen Neurone wurden entweder auf mit Poly-L-Lysin (PLL) frisch be-

schichtete 24-Well-Platten mit eingelegten Deckgläschen oder 96-Well-Platten ausge-

sät. Zur Hemmung der Proliferation verbliebener Astrozyten wurde Serum-freies, syn-

thetisches Medium zur Kultivierung der Neurone verwendet. Die Zellen wurden nach

10-12 Tagen in vitro (DIV; engl. „days in vitro“) für Experimente verwendet.

3.9.3 Transiente Transfektion

Transiente Transfektionen von N2a-Zellen wurden mit dem Effectene Transfection

Reagent Kit von Qiagen nach Herstellerangaben durchgeführt. Für immunzytologi-

sche Färbungen wurden 30.000 bis 50.000 N2a-Zellen auf PLL beschichtete Deckgläs-

chen ausgesät und in den 24-Well-Platten mit 400 ng Plasmid-DNA aus EndoFree

Präparationen (s. Abschnitt 3.7.1.6) transfiziert. Das Medium wurde nach 24 Std.

gewechselt, um die Transfektionseffizienz zu steigern.

3.9.4 Fixierung und Kernfärbung von Zellkulturen

N2a-Zellen wurden 48 Std. nach der Transfektion in 500 µl PBS mit 4% Paraformal-

dehyd (PFA) für 20 min bei RT fixiert. Nach zweifachem Waschen in 500 µl PBS

wurden die Zellen durch Zugabe von 500 µl PBS mit 0,2% Triton X-100 für 10 min

permeabilisiert. Es erfolgte erneut ein zweifaches Waschen in 500 µl PBS. Freie Bin-

dungsstellen wurden in PBS mit 1% BSA / 3% NGS für 1 Std. bei RT blockiert. Der

primäre Antikörper (α-c-myc 1:100) wurde in Blockpuffer verdünnt und für 90-120

min bei RT oder 4 °C ü.N. inkubiert. Nach mehrmaligien Waschschritten wurde der

sekundäre Antikörper (Alexa Fluor 488/568 1:1000) in PBS für 60-90 min bei RT

inkubiert. Zellkerne wurden durch Inkubation mit Hoechst 33342 (1:10.000) in PBS-T

3 Material und Methoden

55

für 10 min gefärbt. Nach weiteren Waschschritten in PBS, wurden die Deckgläschen

in ProLong Gold Antifade Reagenz (Molecular Probes) platziert und im Anschluss

bei 4 °C im Dunklen bis zur Analyse durch konfokale Mikroskopie aufbewahrt.

3.10 In vitro-Testverfahren

Zwei Verfahren wurden eingesetzt, um das Modell der metabolischen Inhibition (MI)

an Neuronenkulturen zu etablieren (Meloni et al. 2011). Beide Testverfahren basieren

auf dem Redoxverhalten der verwendeten Tetrazoliumsalze. Diese liegen im oxidier-

ten Zustand farblos vor und konvertieren unter reduzierenden Bedingungen zu einem

gefärbten Formazanprodukt. Diese Konversion kann leicht und schnell mit einem

Microplate Reader (Biorad) spektrophotometrisch bei 490 nm gemessen werden.

Während aller Verfahren wurden isolierte hippocampale Neurone auf 96-Well-Platten

ausgesät und in diesen gemessen (s. Abschnitt 3.9.2). Dadurch konnte eine große An-

zahl von Einzelwerten generiert werden.

Die Neuronenkulturen wurden nach 10-12 Tagen in Kultur (DIV) verwendet. Deren

Reaktion auf die MI wurde im Zeitverlauf analysiert. Vor dem Experiment überprüfte

man die Zellen mikroskopisch quantitativ auf gleiche Dichte und qualitativ auf ihre

Morphologie. Anschließend wurden sie einmal mit vorgewärmter physiologischer ext-

razellulärer Lösung (SPES) gewaschen. Im Anschluss wurden die Zellen im Wärme-

schrank 1 Std. entweder mit SPES als Negativkontrolle oder mit Lösung zur metabo-

lischen Inhibition der Zellen (MI-Lösung; 1 mM KCN, 0,3 mM Natrium-Iodessigsäure

in SPES) inkubiert. Danach wurden die Zellen dreimal mit SPES gewaschen und in

Medium inkubiert. Nach 2, 4 und 24 Std. wurden die Experimente nach Herstelleran-

gaben durchgeführt.

3 Material und Methoden

56

3.10.1 Zellaktivitätstest

Das erste zellbasierte Testverfahren bestimmt die Anzahl von lebendigen Zellen in

einem Zytotoxizitäts-Experiment. Dabei wurde mit dem CellTiter 96® AQueous Assay

(Promega) gearbeitet. Die Konversion des 3-(4,5 Dimethyliazol-2-yl)-5-(3-

Carboxymethoxyphenyl)-2-(4-Sulphenyl)-2H-Tetrazoliumsalz (MTS) kann so quanti-

tativ gemessen werden (Berridge & Tan 1993). Das heißt, dass der MTS-Test die mi-

tochondrialen Konversion des Tetrazoliumsalzes zu einem wasserlöslichen braunen

Formazansalz misst. Die MTS-Absorptions-Daten wurden verwendet, um das Ver-

hältnis von unbehandelten Kontrollen zu behandelten Kulturen darzustellen. Kontrol-

len wurden als 100% aktiv eingestuft und als Mittelwerte ± SEM präsentiert. Die

Überlebensfähigkeit wurde statistisch mit einer Varianzanalyse (engl. „analysis of va-

riance“ – ANOVA) mit Bonferroni´s Post-Test untersucht. Alle Messungen wurden

mit einem Minimum von vier unabhängigen Experimenten durchgeführt.

3.10.2 Zytotoxizitätstest durch Messung der LDH-

Ausschüttung

Eine weitere Methode, um neuronale Zytotoxizität zu überprüfen, ist die Messung der

Lactatdehydrogenase (LDH), die aus lysierten Zellen austritt. Bei dem verwendeten

Test CytoTox 96® (Promega) kommt es wiederum zur Konversion eines Tetrazoli-

umsalzes, das proportional zur Anzahl absterbender Zellen in der Kultur gebildet

wird (Nachlas et al. 1960). Das Experiment wurde nach Herstellerangaben durchge-

führt. Dabei wurde das zelluläre Überleben jeweils prozentual auf eine „100%-Zelltod-

Kontrolle“ normiert, die für jedes Experiment individuell ermittelt wurde. Dazu wur-

den mehrere Wells der jeweiligen Neuronenkulturen mit einem mitgelieferten Ly-

sispuffer permeabilisiert. So konnten die im eigentlichen Experiment erhaltenen LDH-

Absorptions-Daten konvertiert werden und der beobachtete Zelltod proportional zur

„100%-Zelltod-Kontrolle“ dargestellt werden. Die Zytotoxizität wurde statistisch mit

3 Material und Methoden

57

einer ANOVA mit Bonferroni´s Post-Test untersucht. Alle Messungen wurden mit

einem Minimum von vier unabhängigen Experimenten durchgeführt.

3.11 Immunhistochemie und Morphologie

3.11.1 Gewebevorbehandlung

Für die immunhistochemischen und morphologischen Versuche wurden die unter 3.5

genannten Panx1-KO- und altersentsprechende WT-Mäuse wegen der besseren Struk-

turerhaltung perfusionsfixiert. Dazu wurden sie mit Pentobarbital (Narcoren®, ca. 40

mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal anästhesiert. Das narkotisierte Tier wurde ge-

wogen und auf dem Operationstisch fixiert. Nach Öffnung des Thorax und Perikards

wurde 0,5 ml Heparin-Natrium 25000 (Braun Melsungen AG) zur Hemmung der

Blutgerinnung in den linken Ventrikel injiziert, der linke Ventrikel dann mit einer

Federschere eingeschnitten, eine Kanüle eingeführt und die Gefäße mit einer Vorspü-

lung für 15 s durchspült. Anschließend wurde mit einer 4% PFA- (für Immunhisto-

chemie) oder einer 2,5% Glutaraldehyd-Lösung (für Aralditeinbettung) 20 min per-

fundiert. Die Perfusion erfolgte in den ersten drei Minuten bei einem (für Mäuse)

physiologischen Blutdruckwert um 200 mmHg, dann wurde der Druck auf 30 mmHg

reduziert. Im Anschluss wurde das Tier dekapitiert, das Gehirn in toto präpariert und

ü.N. in das jeweilige Fixans eingelegt. Am folgenden Tag wurden die Gehirne mit der

Olympus SZX-12 Kamera (Olympus) fotografiert (Abb. 23), in einem Plexiglasrah-

men mit Nadeln justiert (Paxinos & Watson 2008, Petrasch-Parwez et al. 2007) und

in 2%iger flüssiger Agarose in PBS bei 59 °C ausgegossen. Nach Aushärtung wurden

die Justiernadeln entfernt, die Blöcke in eine Schneidevorrichtung gebracht und mit

einer vibrierenden Klinge in 2 oder 1 mm dicke Frontalhirnblöcke für die Immunhis-

tochemie und 1 mm für die Aralditeinbettung geschnitten. Anschließend wurde die

Agarose entfernt, die Hirnscheiben von beiden Seiten mit der Olympus SZX-12 Ka-

3 Material und Methoden

58

mera zur späteren Orientierung fotografiert und in 0,5%ige PFA-Lösung überführt, in

der sie bis zur Verwendung bei 4 °C aufbewahrt wurden.

3.11.2 Fluoreszenz-Immunhistochemie

Die Fluoreszenz-Immunhistochemie wurde an 4% PFA-fixiertem Gewebe durchge-

führt. Dazu wurden die unter 3.11.1. hergestellten Gewebeblöcke zunächst 3 Std. in

PBS auf dem Schüttler bei mehrfachem Wechsel gewaschen und über Nacht in 30%

Saccharose (Biomol) in PBS eingelegt. Dann wurden die Blöcke auf Korkplatten posi-

tioniert, mit Gewebe Gefriermedium (Leica Microsystems) überdeckt, in 8% Methyl-

cyclohexan in 2-Methylmbutan (v/v; -60 °C) schockgefroren und bei -80 °C aufbe-

wahrt.

Vom Hippocampusblock wurden 12 µm dicke Gefrierschnitte mit einem Kryostaten

(Leica) angefertigt, auf SuperFrost Plus Objektträgern (Menzel) aufgezogen und 2

Std. auf der Wärmeplatte bei 40 °C getrocknet. Anschließend wurden die Schnitte

mit PBS bedeckt. Unspezifische Bindungsstellen wurden bei Verwendung polyklonaler

Antikörper durch Vorinkubation mit 10% normalem Ziegenserum (engl. „normal goat

serum“; NGS) mit 0,3% Triton X-100 in PBS für 1 Std. bei RT blockiert. Die Inkuba-

tion mit dem in der gleichen Lösung angesetzten Primärantikörper (Panx1 1:100,

Spezifität s. (Zoidl et al. 2007) wurde bei 4 °C ü.N. im Dunkeln durchgeführt. Am

folgenden Tag wurden die Schnitte mit PBS mehrfach gewaschen, für 30 min in 0,2%

Rinderserumalbumin (engl. „bovine serum albumin“, BSA) vorinkubiert und dann in

dem in derselben Lösung angesetzten Alexa Fluor 488 Ziege anti-Kaninchen Sekun-

därantikörper bei RT für 1 Std. inkubiert. Nach mehreren Waschschritten mit PBS

wurden die Schnitte abschließend mit ProLong ®Gold Antifade Reagenz mit DAPI

(Molecular Probes) eingedeckelt. Um die Spezifität des Zweitantikörpers zu testen,

wurde jeweils ein Objektträger mitgeführt, bei dem der Primärantikörper weggelassen

wurde.

3 Material und Methoden

59

Zur morphologischen Referenz wurden Nachbarschnitte nach der Nissl-Methode ge-

färbt. Dazu wurden die aufgezogenen Schnitte nach dem Trocknen ü.N. in 70% Etha-

nol gestellt, am nächsten Tag in Aqua bidest überführt und dann in 0,3%iger wässri-

ger Kresylviolettlösung (pH 4,3) für 15 min gefärbt, kurz in Aqua bidest gespült und

dann in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert. Im 96%igen Ethanol wurden die

Schnitte unter mikroskopischer Kontrolle differenziert bis sich die Zellen intensiv vom

farblosen Hintergrund abhoben und dann in 100% Ethanol transferiert. Nach zwei

abschließenden Xylol-Bädern wurden die Schnitte mit Entellan eingedeckelt.

3.11.3 Peroxidase-Immunhistochemie

Für die Peroxidase-Immunhistochemie wurden von einem Hippocampusblock mithilfe

eines Vibratoms (Lancer) 50 µm dicke Serienschnitte angefertigt. Jeder 5. Schnitt

wurde entweder mit Parvalbumin, Calbindin (beide Antikörper 1:50 eingesetzt) im-

munmarkiert oder mit Kresylviolett gefärbt. Die Schnitte wurden zunächst in PBS

gespült und dann in 1% Natriumborhydrid in PBS für 30 min reduziert. Endogene

Peroxidasen wurden durch Inkubation mit 0,05% Phenylhydrazin in 10% NGS für 30

min blockiert. Im Anschluss wurden die Schnitte mit 10% NGS und 0,3% Triton X-

100 in PBS vorinkubiert. Dann wurde der primäre Antikörper (s. Abschnitt 3.3.4.1)

in der vorangegangen Lösung verdünnt und die Schnitte wurden 72 Std. bei 4 °C da-

rin inkubiert. Nach mehreren Waschschritten mit PBS und der Präinkubation mit

0,1% BSA in PBS für 1 Std. erfolgte die Inkubation mit dem biotinylierten sekundär

Antikörper (s. Abschnitt 3.3.4.2) in BSA für 24 Std. bei 4 °C. Die Schnitte wurden

erneut gewaschen und dann für 4 Std. mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase Komplex

inkubiert (ABC). Die Peroxidase-Aktivität wurde mit 3,3’-Diaminobenzidin (DAB)

visualisiert. Die Stärke der braunen DAB-Reaktion wurde unter mikroskopischer

Kontrolle durchgeführt. Schließlich wurden die Schnitte noch mehrfach mit PBS ge-

spült, auf Superfrost Plus Objektträgern für 2 Std. luftgetrocknet, dehydriert und mit

Entellan eingedeckelt.

3 Material und Methoden

60

Als morphologische Referenz für die immunhistochemisch gefärbten Schnitte wurde

jeder 5. Vibratomschnitt mit Kresylviolett gefärbt. Die aufgezogenen Schnitte wurden

ü.N. in 70% Ethanol (EtOH) eingestellt. Im Anschluss wurden sie in Aqua dest (A.

dest.) gespült wie unter 3.11.2 angegeben gefärbt, differenziert, dehydriert und einge-

deckelt.

3.11.4 Herstel lung von Semidünnschnitten

Die Gehirne wurden zuerst wie unter 3.11.1. beschrieben in 1 mm dicke Frontalhirn-

scheiben geschnitten, die nach Fotodokumentation in 0,1 M Phosphatpuffer für 2 Std.

gewaschen und dann in 4% wässrigem Osmiumtetroxid für 3 Std. zur Fixierung der

Lipide nachfixiert wurden. Im Anschluss wurden die Schnitte in 0,1 M Phosphatpuf-

fer erneut gewaschen und in einer aufsteigenden Ethanolreihe dehydriert. Danach

wurde der Ethanol gegen Propylenoxid (Sigma-Aldrich) ausgetauscht und ü.N. auf

dem Schüttler in einer 1:1 Mischung aus Propylenoxid und dem Epoxidharz Araldit

(Serva) mit 3% Beschleuniger (2,4,6-Trisdimethylaminomethylphenol) inkubiert. Im

Anschluss wurden die Präparate in einem Araldit-Gemisch mit 2% Beschleuniger für

5-8 Std. rotiert. Danach wurden sie in hitzefesten durchsichtigen Plastikformen orien-

tiert und für mindestens 12 Std. bei 65 °C zur Polymerisation gebracht.

Nach der Araldit-Einbettung wurden die Scheiben auf 90 °C erwärmt und auf der

Basis der fotodoukumentierten Scheiben mit einer Rasierklinge in Blöcke zerteilt, die

den Hippocampus enthielten. Von den Blöcken wurde mithilfe des Ultracut UCT

(Leica) 0,8 µm dicke Semidünnschnitte hergestellt, die mit 1% Toluidinblaulösung

(pH 9,3) für 5 Min bei 60 °C auf der Wärmeplatte gefärbt wurden. Anschließend

wurden die Schnitte in Aqua bidest gewaschen, auf der Wärmeplatte getrocknet und

mit Entellan (Merck) eingedeckelt.

3 Material und Methoden

61

3.11.5 Immuncytochemie

Immuncytochemie transfizierter N2a-Zellen wurde, falls nicht anders angegeben, zwei

Tage nach Transfektion durchgeführt. Nach Abnahme des Mediums wurden die Zel-

len für 10 min mit 4% PFA bei RT fixiert und im Anschluss mit 1x PBS gewaschen.

Nach einem Permeabilisierungs-Schritt mit 1% Triton X-100 in 1x PBS für 10 min,

wurden unspezifische Bindungsstellen durch Vorinkubation mit 10% normalem Zie-

genserum für 1 Std. bei RT abgesättigt. Die Inkubation mit dem in Blockpuffer ange-

setzten Primärantikörper (Panx1 4515) wurde bei 4 °C ü.N. durchgeführt. Nach drei

aufeinander folgenden Waschschritten mit PBS wurden die Schnitte mit einem in

PBS angesetzten spezifischen Alexa Fluor Sekundärantikörper 488 bei RT für 1-2 Std.

inkubiert. Nach mehreren Waschschritten wurden die Deckgläschen mit ProLong

Gold Antifade Reagenz auf Objektträgern eingebettet. Hoechst 33342 Kernfärbung

wurde zur Sekundärantikörper-Lösung in einer 1:10.000 Verdünnung zugegeben. In

allen Experimenten wurden Färbungen, bei denen entweder der Primär- oder der Se-

kundärantikörper weggelassen wurden, als Negativkontrolle mitgeführt.

3.12 Mikroskopische Methoden

3.12.1 Konfokale Laser Scanning-Mikroskopie

Konfokale-Mikroskopie wurde an einem LSM 510-Meta von Zeiss durchgeführt. Bilder

wurden mit Argon und HeNe Lasern, einer Laser Diode (Emissions-Wellenlänge: 405

nm), 40x und 63 x (NA 1.4) Öl Objektiven aufgenommen. Das verwendete Öl wurde

von Zeiss bezogen. Bildanalyse wurde mit der LSM 510 Meta Software durchgeführt.

Bilder wurden im Einfach- oder Mehrfachspur Modus mit einer Auflösung von

512x512 oder 1024x1024 Pixel aufgenommen, als TIFF Dateien zur Dokumentation

exportiert und in Photoshop CS5 (Adobe) zu Bildplatten verarbeitet.

Für Farbstoffefflux Experimente wurde das Leica TCS SP5 mit dem Leica HCx APO

20x (NA 0,5) Objektiv verwendet.

3 Material und Methoden

62

3.12.2 Lichtmikroskopische Dokumentation

Die Analyse der lichtmikroskopischen Färbungen und Peroxidase-Immunhistochemie

erfolgte mit einem Olympus Mikroskop BH-2, das mit einer Olympus DP71 Kamera

ausgestattet war. Die Präparate wurden mit dem Analysis System (Soft Imaging Sys-

tem GmbH) fotodokumentiert, die Bilder als TIFF Dateien exportiert und in Photos-

hop 12.0.4 (Adobe) bearbeitet.

3.12.3 Farbstoffefflux Messungen

Es wurden hippocampale Neuronenkulturen DIV 10-12 für 20 min mit dem Lebend-

zellfarbstoff Calcein Red Orange AM (Invitrogen) in SPES Puffer beladen. Danach

wurde das Deckgläschen in das TCS SP5 MP (Leica) Mikroskop überführt und dort

in einer Perfusionskammer mit MI-Lösung perfundiert. Dabei wurde der Efflux des

Calcein Red Orange in vivo aufgenommen.

3.13 Extrazelluläre Feldpotenzialmessungen

3.13.1 Präparation hippocampaler Horizontalschnitte

Die Hirnschnitte wurden jeweils am Tag der Experimente frisch präpariert. Da in

verschiedenen Veröffentlichungen eine neurotoxische oder neuroprotektive Einfluss-

nahme von Anästhetika beschrieben wurde, z.B. durch Isofluran (Bickler et al. 2003,

Wei & Xie 2009), wurden die Tiere nicht betäubt sondern durch cervicale Dislokation

getötet. Im Anschluss wurden sie dekapitiert, der Schädel eröffnet, das Gehirn ent-

nommen und in Carbogen-begaste (Carbogen: 95% O2, 5% CO2), eiskalte artifizielle

Cerebrospinal-Flüssigkeit (ACSF) überführt. Mit einem Skalpell wurde der frontale

Cortex, kaudal das Cerebellum und ventral etwas Gewebe abgetrennt, um eine mög-

lichst ebene Auflagefläche zu erhalten (s. Abb. 9). Der so erhaltene Gehirnblock wur-

de mit medizinischem Sekundenkleber auf einem Agarsockel fixiert und im Vibratom

Vibroslice 5000mz (Campden Instruments) horizontal in Schnitte mit 350 µm

3 Material und Methoden

63

Schichtdicke geschnitten. Die erhaltenen Schnitte enthielten die hippocampale For-

mation, den entorhinalen und perirhinalen Cortex sowie temporale Cortex Anteile.

Sie wurden an den Hemisphären getrennt, der Hippocampus freipräpariert und in eine

Kammer überführt, in der sie vor der Messung für mindestens 1 Std. in ACSF bei RT

inkubiert wurden.

Abb. 9: Überblick über die Präparation von 250 µm hippocampale Schnitte Überblick über die Präparation von 250 µm hippocampalen Schnitten. (A) der anteriore Cortex und das Cerebellum wird abgetrennt durch 1.) einen frontalen Schnitt und 2.) einen caudalen Schnitt. Zur Stabilisierung des Gewebes für Vibratom Schnitte wird der ventrale Teil des Gewebeblocks mit einem horizontalen Schnitt 3.) entfernt. (B) Stellt die Fixierung und das Schneiden am Vibratom dar (I.-III.). (Illustration aus (Prochnow 2006), verändert)

3.13.2 Elektrophysiologie

Die Messung der hippocampalen Schnitte erfolgte im Synchroslice-Komplettsystem

(Lohmann Research Equipment), in dem vier Schnitte parallel gemessen werden

konnten (s. Abb. 10). Die Schnitte wurden während des Versuchs in Perfusionskam-

mern überführt und kontinuierlich mit ACSF gespült.

3 Material und Methoden

64

Exzitatorische postsynaptische Feldpotenziale (fEPSPs) wurden aufgenommen, indem

eine Metallableitelektrode (Platin-Iridium, Impedanz 0,5 -0,8 MΩ) im Stratum radia-

tum der hippocampalen CA1-Region platziert wurde. Eine bipolare Reizelektrode

wurde auf den Fasern der Schaffer-Kollaterale platziert, um die hippocampalen CA1-

Pyramidenzellen zu stimulieren (Abb. 11).

Abb. 10: Synchroslice-Komplettsystem Darstellung der Perfusionskammern und Platzierung der Elektroden in hippocampalen Schnitten. (Fo-tos von Lohmann Research Equipment) fEPSP Antworten wurden durch bipolare Stimulation erzeugt, mit Reizamplituden

die jeweils 70% der maximalen Reiz-Antwort generierten (im Bereich 50-600 µA).

Dieser Wert wurde für jeden Hirnschnitt individuell aus einer Input/Output Kurve

errechnet, die vor der eigentlichen Messung ermittelt wurde.

Für die Ableitungen wurde ein Paradigma verwendet, in dem für 20 min eine Basis-

Aktivität der Schnitte in ACSF ermittelt wurde. Dann wurde für 30 min eine Lösung

zur MI der Schnitte (0,5 mM KCN, 0,15 mM Natrium-Iodessigsäure in ACSF) einge-

waschen und im Anschluss daran wieder für 20 min mit ACSF gespült.

3 Material und Methoden

65

Zum Block von Panx1-Kanälen wurde MFQ (zur Verfügung gestellt von David Spray

NY) in einer Konzentration von 50 nM verwendet. MFQ wurde als Stocklösung in

Dimethylsulfoxid (DMSO) gelagert und für Experimente frisch in ACSF angesetzt.

Um die postsynaptische Aktivität GABAerger Interneurone zu blockieren, wurde der

GABAA-Rezeptor Antagonist Bicucullin (BIC) in einer Konzentration von 10 µM

verwendet. BIC wurde als Stocklösung in H2O angesetzt, bei -20 °C gelagert und für

Experimente frisch in ACSF verdünnt.

Abb. 11: Elektrodenplatzierung in Hippocampusschnitten Platzierung der Stimulus- und Ableitelektrode zur Messung von Feldpotenzialen in den Schaffer-Kollateralen (SK) hippocampaler Schnitte. MF – Moosfasern, GD – Gyrus dentatus (Illustration von Nora Prochnow, verändert).

3.14 Datenanalyse Die durch extrazelluläre Feldpotenzialmessungen und Zell-basierten Testverfahren

erhobenen Daten wurden in Microsoft Excel importiert und mit Graph Pad Prism4

Software statistisch analysiert. fEPSP-Daten wurden zur besseren Vergleichbarkeit in

Prozent auf Kontroll-Bedingungen normalisiert.

Die statistische Analyse erfolgte mit dem regulären Two-way ANOVA, bei dem alle

Werte durch Bonferroni´s Post-Tests miteinander verglichen wurden. In allen Fällen

wurde von Gauß´scher Normalverteilung ausgegangen.

4 Ergebnisse

66

4 Ergebnisse

4.1 mPanx1 hat zwei alternative

Spleißvarianten Für Panx1 sind im Menschen zwei (Baranova et al. 2004) und in der Ratte drei al-

ternative Spleißvarianten beschrieben (Li et al. 2011a). In der Maus wurde bisher

keine alternative Spleißvariante von Panx1 charakterisiert. Da deren Kenntnis und

Funktionalität aber für das Design der genetischen Ablation (KO) relevant ist, wer-

den erstmals zwei alternative Spleißvarianten des Panx1 in der Maus (mPanx1) ana-

lysiert. Das murine Panx1 ist auf Chromosom 9 lokalisiert und verfügt über fünf

Exons, die von vier Introns separiert werden (Abb. 12). Das ursprünglich identifizier-

te und bereits beschriebene Genprodukt enthält alle fünf Exone und hat eine Größe

von 1281 bp. Es wird hier als mPanx1-Wildtyp (mPanx1wt) bezeichnet und kodiert

ein Protein mit vier Transmembrandomänen (s. Abschnitt 1.1.2). Vorausgegangene

Untersuchungen in meiner Arbeitsgruppe führten zu der Entdeckung einer alternati-

ven Spleißvariante von mPanx1 mit einem verlängerten C-Terminus. Diese Variante

wird im Folgenden als mPanx1ext (engl. „extended“ - verlängert) bezeichnet (Abb.

12). Durch die bioinformatische Analyse einer Datenbank (www.ncbi.nih.gov) konnte

eine weitere verkürzte Form von mPanx1 gefunden werden, nachfolgend als

mPanx1tru bezeichnet (engl. „truncated“ - verkürzt) (Skoblov & Baranova 2008).

Eine vergleichende Analyse der drei mPanx1-Varianten wurde durchgeführt. Dabei

wurde das Potenzial zur Generierung der beiden Spleißvarianten auf Ebene der ge-

nomischen DNA in verschiedenen Spezies überprüft. Außerdem wurde die mRNA

untersucht und überexprimierte Proteine der beiden neuen Spleißvarianten näher

charakterisiert.

4 Ergebnisse

67

4.1.1 Beschreibung der zwei neuen Spleißvarianten

Die Genome von Eukaryoten enthalten eine große Anzahl von sogenannten "Splicesi-

tes" deren Funktion und Nutzung für die Generierung von Boten-RNS essentiell ist.

Neben konventionellen Splicesites, welche für die Generation von verschiedenen For-

men eines Proteins verwendet werden, existieren auch sogenannte kryptische Splicesi-

tes. Diese kryptischen Splicesites können in allen Abschnitten einer RNS vorkommen.

Über die Regeln, die zur Aktivierung und Nutzung solcher kryptischen Splicesites

führen, ist noch wenig bekannt, ein interessanter und pathologisch relevanter Zu-

sammenhang mit verschiedenen genetischen Erkrankungen wird vermutet (Buratti et

al. 2011, Buratti et al. 2007, Wang & Cooper 2007).

Abb. 12: Genomisches Modell von mPanx1-Spleißvarianten. Abgebildet sind genomische Modelle der verschiedenen Spleißvarianten von mPanx1: mPanx1wt mit fünf Exons (rot), mPanx1ext mit vier Exons (gelb) und mPanx1tru mit drei Exons (blau). Die Se-quenzen, welche die (vorhergesagten) Transmembrandomänen der Proteine codieren, werden grau dargestellt. Meine Untersuchungen lassen vermuten, dass bei der Generierung von mPanx1ext

eine "konventionelle Splicesite“ ignoriert wird. Es kommt dadurch zur weiteren Able-

sung der Sequenz von Exon vier ins nachfolgende Intron, welches die Exons vier und

fünf separiert. Es entsteht dabei eine um 430 bp verlängerte Form von mPanx1, in

der das fünfte Exon fehlt. In dieser Form führt ein Stopp-Codon im Intron nach Exon

4 Ergebnisse

68

vier dazu, dass eine Spleißvariante mit einem offenen Leseraster von 1636 bp entsteht

(Abb. 12).

Ein alternativer Mechanismus kann für die Entstehung des mPanx1tru zugrunde ge-

legt werden. Im mPanx1tru fehlt das dritte Exon und Sequenzanalysen verweisen auf

eine kryptische Splicesite im vierten Exon. Die daraus resultierende alternative

Spleißvariante von Panx1 ist verkürzt und hat eine Länge von insgesamt 336 bp (Abb.

12).

Um Proteineigenschaften vorhersagen zu können, wurden die Aminosäuresequenzen

der drei Panx1-Spleißvarianten in Online-Programmen untersucht. Das Programm

SMART greift auf eine Datenbank mit Informationen über bekannte Proteindomänen

zu und vergleicht die eingegebene Aminosäuresequenz damit. Mögliche Domänen

werden in der Kalkulation und dem ausgegebenen Diagramm dargestellt. Die blauen

Domänen, die SMART für mPanx1wt (426 aa) und mPanx1ext (543 aa) darstellt,

sind Transmembrandomänen (TM) (Abb. 13). Die weiteren angegebenen Striche bei

mPanx1wt stehen für Regionen mit geringer Komplexität. Für mPanx1wt (112 aa)

zeigt SMART somit die bekannten vier TM-Domänen auf. Unerwartet ist jedoch,

dass für mPanx1ext zwei weitere TM-Domänen am C-Terminus des Proteins vorher-

gesagt werden. Die Analyse von mPanx1tru liefert keine Ergebnisse in der Kalkulati-

on des Programms. Da es überraschend war, zwei weitere TM-Domänen in der Se-

quenz von mPanx1ext zu erhalten und im Gegensatz dazu keine einzige in

mPanx1tru, wurden zwei weitere Programme zur Kontrolle verwendet. Die Pro-

gramme TMHMM und TMpred errechnen mittels der Aminosäuresequenz potentielle

TM-Domänen (Stoffel et al. 1993) und zeigen anhand von Hydrophobizität-

berechnungen mögliche TM-Domänen. Beide Programme bestätigen den ersten Be-

fund (SMART) und kalkulieren für mPanx1ext ebenfalls zwei zusätzliche TM-

Domänen am C-Terminus. Im Gegensatz zum SMART Programm sagen beide TM-

Programme eine TM-Domäne für mPanx1tru vorher (Abb. 13).

4 Ergebnisse

69

Abb. 13: Ergebnisse dreier Proteinvorhersageprogramme für mPanx1-Varianten. Abgebildet sind die Proteinvorhersagen der Programme SMART, TMHMM und TMpred, die mit den Aminosäuresequenzen der verschiedenen mPanx1-Spleißvarianten durchgeführt wurden.

4.1.2 Genomische Analyse von mPanx1ext

Der Nachweis gleichartiger alternativer Spleißvarianten in anderen Spezies kann ein

erster Hinweis auf wichtige, konservierte Funktion(en) solcher Varianten sein. Um

diese Frage zu beantworten, wurde eine vergleichende Sequenzanalyse von

mPanx1ext von Maus, Ratte und Mensch durchgeführt. Dabei ergaben sich erhebli-

che Unterschiede zwischen den Spezies. So fand sich das Stopp-Codon bei der Maus

nach 430 bp, im Intron nach Exon vier (Abb. 12). Beim Menschen fand es sich schon

nach 98 bp und bei der Ratte sogar schon nach 71 bp. Um die Sequenzen der Daten-

banken zu überprüfen, wurde genomische DNA aus Maus-, Ratten- und Humanem-

Gewebe isoliert und sequenziert. Die resultierenden Sequenzen waren mit den anno-

4 Ergebnisse

70

tierten Sequenzen der Datenbank identisch. Das heißt, dass die mPanx1ext-

Spleißvariante ausschließlich in der Maus existiert. Das Fehlen konservierter Varian-

ten schließt eine wichtige Rolle von mPanx1ext in der Maus jedoch nicht grundsätz-

lich aus und kann Grundlage einer Spezies-relevanten Variation sein.

4.1.3 RT-PCR Analyse

Aufbauend auf die bereits dargestellten Ergebnisse wurde im Folgenden das Auftreten

der verschiedenen Formen auf mRNA-Ebene untersucht. Dabei wurden spezifische

Primer für die jeweiligen Spleißvarianten designt und qRT-PCR-Experimente an un-

terschiedlichen Maus-Gewebetypen durchgeführt. Die Daten wurden anhand einer

Varianzanalyse analysiert (Two-way ANOVA mit Bonferroni´s Posttests). Diese

Analyse zeigt, dass alle drei mPanx1-Varianten sowohl in nicht-neuronalem als auch

neuronalem Gewebe nachweisbar sind (Abb. 14). In allen Geweben ist der Trend er-

kennbar, dass die verkürzte Panx1-Spleißvariante immer am stärksten und die ver-

längerte Form immer am schwächsten exprimiert ist (mPanx1ext < mPanx1wt <

mPanx1tru). Die höchste Expressionsrate kann in der cDNA des Pankreas gefunden

werden. Hier, sowie im Gewebe der Niere, kann eine signifikant reduzierte Expression

von mPanx1ext im Vergleich zu mPanx1wt gemessen werden (Abb. 14).

Vergleicht man die Expressionsraten der Spleißvarianten in neuronalem Gewebe, so

lässt sich die durchschnittlich höchste Expression in der cDNA des Rückenmarks fest-

stellen. Die niedrigsten Expressionen finden sich im Diencephalon und dem Cerebel-

lum. Expressionsraten der drei Varianten in neuronalem Gewebe unterschieden sich

jedoch nur marginal (Abb. 14).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Expression aller drei mPanx1-

Spleißvarianten in verschiedenen Geweben gefunden werden kann. Die Expression der

verlängerten Form mPanx1ext ist im Gewebe der Niere und des Pankreas signifikant

geringer als die der wildtypischen Form mPanx1wt. Jedoch lässt sich kein klar diffe-

renziertes unterschiedliches Expressionsmuster der drei Varianten erkennen. Das Er-

4 Ergebnisse

71

gebnis dieser Quantifizierung lässt nicht auf eine unterschiedliche Funktion, z.B. auf-

grund nicht-überlappender Expressionsmuster, schließen.

4.1.4 Klonierung und Überexpression in N2a-Zellen

Für weitere Untersuchungen bezüglich Lokalisation und Funktionsweise der alterna-

tiven Spleißvarianten von mPanx1 war die Klonierung in Vektoren mit einem Pro-

tein-Tag (engl. „Markierung“) nötig. Zuerst wurde mPanx1ext in den pEGFP-N3

Vektor kloniert, der ein grün fluoreszierendes Protein im gleichen Leseraster mit der

Kodierungsregion von mPanx1ext fusioniert.

Das mPanx1wt wurde bei der Überexpression in verschiedenen Zellkultur-Systemen

bereits als membranständig beschrieben (Penuela et al. 2007). Hier wurden N2a-

Zellen mit pEGFP-N3 mPanx1wt und mPanx1ext transfiziert und 24, 48 und 96 Std.

nach der Transfektion fixiert. Die Lokalisation der Proteine wurde im Anschluss

durch Aufnahmen der intrazellulären Fluoreszenzverteilung beurteilt (Abb. 15 grün).

Das mPanx1wt zeigt eine starke Expression der Proteine über die ersten 48 Std. nach

Transfektion. Die Lokalisation ist sowohl intrazellulär als auch membranständig.

Nach 96 Std. zeigen sich eher schwächere, aber dafür klar membranständigere Zell-

färbungen. Im Vergleich dazu kommt es bei mPanx1ext insgesamt zu einer sehr viel

schwächeren Expression ohne eindeutige subzelluläre Lokalisation. Über die Zeit ist es

schwieriger überhaupt mPanx1ext-EGFP exprimierende Zellen zu finden. Das könnte

durch eine fehlerhafte Proteinfaltung, veränderte Abbauprozesse oder ein Absterben

der transfizierten Zellen, ähnlich wie sie für spezifische Mutanten des mPanx1 be-

schrieben worden sind (Bunse et al. 2010), verursacht sein. Da der EGFP-Tag mit ca.

31 kDa relativ groß ist und fehlerhafte Proteinfaltungen durch diesen Tag bekannt

sind, wurde die Klonierung in Vektoren mit einem kleinerem Polypeptid-Tag durch-

geführt.

4 Ergebnisse

72

Abb. 14: Expressionsanalyse der mPanx1-Varianten in verschiedenen Geweben. Dargestellt werden die Ergebnisse von qRT-PCR Experimenten, die an cDNAs sieben verschiedener neuronaler Gewebe sowie vier weiteren Organen durchgeführt wurden. Aufgetragen ist der mittlere Ct-Wert. Je näher die Werte der X-Achse kommen, desto höher ist die Genexpression. Es wurden jeweils mindestens zwei unabhängige Experimente in Tripletts durchgeführt und mit einem Two-way ANOVA mit Bonferroni´s Posttest durchgeführt. *P<0,05; angezeigt ist der Mittelwert mit Standardabwei-chung (SD). Es wurde der c-myc-Tag gewählt, der vom c-myc-Gen abstammt, welcher für einen

Transkriptionsfaktor codiert. Mit einer Größe von 1,2 kDa ist der c-myc-Tag sehr

klein und sollte dadurch das Verhalten von mPanx1 nicht beeinflussen. Um einen

Einfluss des Tags auf die Membran-Insertion der Proteine zu vermeiden, wurde c-myc

an beide Termini der mPanx1-Varianten kloniert. Klonierung in den Vektor pCR3.1

resultierte in einem N-terminal fusionierten Tag und in den Vektor pRK5 in einem C-

terminal fusionierten Tag. Die Expressionsvektoren ermöglichten die Detektion der

Proteine durch die Verwendung von α-c-myc Antikörpern. Abbildung 15 (gelb) zeigt

exemplarisch Beispiele, die belegen, dass die Position des Tags keinen Einfluss auf die

Lokalisation hat. Die Transfektion von mPanx1ext oder mPanx1tru Spleißvarianten

führt nicht zur Expression stabiler Proteine mit erkennbarer subzellulärer Lokalisati-

on. Beide Spleißvarianten lassen sich kaum durch eine Antikörperfärbung detektieren,

verbleibende Signale sind diffus und keinem Kompartiment eindeutig zuzuordnen.

4 Ergebnisse

73

Bobachtet wurde, dass das mPanx1ext sowohl mit EGFP-Tag als auch N-terminalen

c-myc-Tag intrazellulär in vesikulären Strukturen schwach exprimiert wird. Wird der

c-myc-Tag am C-Terminus fusioniert, lässt sich das Produkt kaum von der Hinter-

grundfluoreszenz unterscheiden. In beiden c-myc-Konstrukten wird mPanx1tru so

schwach exprimiert, dass es sich nicht von Hintergrund-Fluoreszenz unterscheiden

lässt (Abb. 16). Im Gegensatz dazu zeigt mPanx1wt erwartungsgemäß eine Anfär-

bung von ER/Golgi-Apparat sowie eine membranständige Lokalisation. Die Immun-

fluoreszenz zeigt eine stabile Expression über vier Tage.

Im direkten Vergleich der verschiedenen Konstrukte fällt auch auf, dass die Expressi-

on von mPanx1wt mit C-terminalem EGFP-Tag (pEGFP) und mit N-terminalem c-

myc-Tag (pCR3.1) eher membranständig ist (Abb. 16, Stern). Bei der Expression mit

C-terminalem c-myc-Tag (in pRK5) kommt es zu einer Anreicherung intrazellulärer

Proteinprodukte (Abb. 16, Dreieck). Dieser Befund ist ein eindeutiger Hinweis auf

einen Positionseffekt des Tags (Abb. 16).

Aus diesen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass alle durchgeführten Experimente zur

transienten Expression der alternativen Spleißvarianten von mPanx1 im untersuchten

Zeitraum (24-96 Std.) eine substantielle Expression und distinkte Lokalisation nicht

erhärten können. Vorläufige Experimente mit einem anderen Zelltyp (HEK Zellen,

nicht abgebildet) bestärken die Annahme, dass der verwendete Zelltyp nicht ursäch-

lich für die hier beschriebenen Ergebnisse ist.

4 Ergebnisse

74

Abb. 15: Zeitverlauf überexprimierter mPanx1-Varianten in N2a-Zellen. N2a-Zellen wurden mit Konstrukten von mPanx1-Spleißvarianten transient transfiziert und 24, 48 und 96 Std. nach Transfektion fixiert, gefärbt und mikroskopiert. mPanx1wt und mPanx1ext wurden so-wohl in pEGFP-N3 (grün) als auch in pCR3.1 mit N-terminalem c-myc-Tag (gelb) transfiziert. Der Maßstab entspricht 20 µm.

4 Ergebnisse

75

4.1.5 Charakterisierung der Spleißvarianten im Western

Blot

Die Größe und spezifische Expression von Proteinen kann durch Western Blot Analy-

sen detektiert werden. In Abbildung 13 wird eine Western Blot Analyse gezeigt, mit

Lysaten von mPanx1-Spleißvarianten aus N2a-Zellen. mPanx1wt zeigt die typischen

multiplen Banden des glykosylierten Panx1-Proteins (41-48 kDa, Abb. 17 Stern).

mPanx1ext, mit einer errechneten Größe von 60 kDa (Abb. 17, Dreieck), und

mPanx1tru, mit einer kalkulierten Größe von 12 kDa (Abb. 17, Kreis), sind auf dem

Western Blot nicht nachweisbar. Diese Resultate bestätigen die Ergebnisse der Im-

muncytochemie, die nur extrem geringe Expression und keine spezifische Lokalisation

der beiden neuen mPanx1-Spleißvarianten zeigen.

Die vorläufige Interpretation dieses Ergebnisses ist, dass die auf mRNA-Ebene nach-

weisbaren mPanx1-Spleißvarianten auf Proteinebene möglicherweise keine Bedeutung

haben. Es bleiben verschiedene Möglichkeiten, die sie als mRNA bei der Regulation

der Expression von mPanx1wt übernehmen könnten. So könnte es beispielsweise zu

einer Hemmung der Translation von mPanx1wt durch Kompetition der verschiedenen

Formen an den Ribosomen kommen.

Dabei würde insgesamt die Expression der Wildtyp-Variante verringert. Oder, wie

kürzlich für zwei neue Spleißformen von Panx1 in der Ratte berichtet wurde, könnte

es zur Regulation des Kanals durch Bildung nicht funktionaler heteromerer Kanäle

kommen (Li et al. 2011b). Diese Möglichkeit scheint jedoch hier nicht gegeben, da

selbst die intrazelluläre Expression der beiden neuen mPanx1-Spleißvarianten kaum

vorhanden ist. Um eine mögliche Regulation auf Ebene der mRNA zu untersuchen,

wurden Kotransfektionen von mPanx1wt mit ansteigenden Mengen der beiden ande-

ren Spleißvarianten durchgeführt und die Expression des Wildtyp-Proteins charakte-

risiert (nicht abgebildet). Dabei konnte jedoch keine Änderung der oben beschriebe-

nen Ergebnisse festgestellt werden.

4 Ergebnisse

76

Abb. 16: Vergleich unterschiedlich getaggter mPanx1-Varianten in N2a-Zellen. N2a-Zellen wurden mit DNA von mPanx1-Varianten mit entweder GFP oder N-oder C-terminalem c-myc-Tag transient transfiziert und 48 Std. nach Transfektion fixiert, gefärbt und mikroskopiert. Der Maßstab entspricht 20 µm. So lässt sich abschließend sagen, dass durch die beschriebenen Experimente keine

Funktion für die beiden auf mRNA-Ebene nachweisbaren mPanx1-alternativen

Spleißvarianten gefunden werden konnte.

4 Ergebnisse

77

Abb. 17: Western Blot Analyse von Lysaten der mPanx1-Varianten. Die Lysate stammen von N2a-Zellen. Sie überexprimierten transient 48 Std. Konstrukte mit den ver-schiedenen mPanx1-Varianten (wt, ext, tru). Die Detektion der getaggten Proteine erfolgte mit dem α-c-myc-Antikörper (Sigma, 1:500). mPanx1-Plasmide haben einen c-myc-Tag am N-Terminus (pCR3.1) oder am C-Terminus (pRK5). Sternchen zeigen die erwartete Größe von mPanx1wt (~41-48 kDa), Dreiecke von mPanx1ext (~60 kDa) und Kreise von mPanx1tru (~12 kDa). Mit „-“ sind Lysate nicht transfizierter N2a-Zellen gekennzeichnet; „+“ ist eine Positiv-Kontrolle für den c-myc-Antikörper, Ly-sate von transient transfizierten N2a-Zellen mit Kvß3-c-myc (Bunse 2009).

4 Ergebnisse

78

4.2 Etablierung eines Modells der in vitro-

Ischämie

4.2.1 Antikörperfärbungen

Bei der Präparation von hippocampalen primären Neuronenkulturen werden die Zell-

verbände des Gewebes aufgelöst. Eine strukturelle Charakterisierung einzelner Neu-

ronentypen anhand der Morphologie des Gewebes lässt sich so nicht mehr durchfüh-

ren. Daher wurden hippocampale Neuronenkulturen durch bekannte Markerproteine

angefärbt. Diese Proteine markieren distinkte Subkulturen hippocampaler Neurone.

So wurde versucht, die Zusammensetzung der verschiedenen Zelltypen in den Neuro-

nenkulturen zu beschreiben. Um die Komplexität des hippocampalen Systems zu er-

fassen, ist es essentiell notwendig, die einzelnen zellulären Komponenten zu kennen.

Durch die Antikörperfärbungen wird annähernd ersichtlich, welche Neuronentypen in

welcher Dichte in den hippocampalen Neuronenkulturen vorhanden sind.

Die Neuronenkulturen wurden an DIV 10-12 fixiert und mit Panx1-Antikörpern sowie

Antikörpern gegen hippocampale Markerproteine gefärbt (Abb. 18). Parvalbumin ist

ein Ca2+-bindendes Albumin-Protein, das in bestimmten Interneuronen (z.B. Korbzel-

len) im Hippocampus gefunden werden kann (Abb. 18A). Zur Markierung weiterer

hippocampaler Interneurontypen wurden die ebenfalls Ca2+-bindenden Proteine Cal-

retinin (Abb. 18B) und Calbindin (Abb. 18C/D) nachgewiesen. Durch diese Vorge-

hensweise lassen sich verschiedene neuronale Subpopulationen nachweisen. Parval-

bumin- und/oder Calbindin-immunoreaktive Interneurone zeigten typischerweise flä-

chigere Strukturen während Calretinin-positive Neurone eher schmale Ausläufer zei-

gen. Erwartungsgemäß finden sich auch zahlreiche Panx1-positive Neurone in den

hippocampalen Kulturen (Abb. 18E). Die Kulturen enthalten je nach Kultivierungs-

bedingungen aber auch Astrozyten, die mit einem Antikörper gegen das gliale fibrillä-

re azidische-Protein (GFAP) sichtbar gemacht wurden (Abb. 18D/F).

4 Ergebnisse

79

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die verwendeten hippocampalen Neuronen-

kulturen Interneurone und Pyramidenzellen enthalten. Neben diesem Ergebnis konn-

ten auch die zellmorphologischen Strukturen der Neuronenkulturen studiert werden.

In Hinblick auf weiterführende Interpretationen der folgenden Efflux Experimente

waren die Antikörperfärbungen notwendig. Es stellte sich im Folgenden heraus, dass

die zu erwartenden Ergebnisse von den Veröffentlichungen abweichen (Thompson et

al. 2006, Zhang et al. 2008). Auf Grundlage der zellmorphologischen Strukturen

konnten so weiterführende Zelltypisierungen zugewiesen werden

4.2.2 Efflux Experimente mit Fluoreszenzfarbstoff

Eine gängige Methode zur Untersuchung von Panx1-Kanalaktivitäten ist die Farb-

stoffefflux-Messung aus Zellen. Mit der Methode wurde auch der Panx1-Kanal in zwei

Studien in Modellen der Ischämie untersucht (Thompson et al. 2006, Zhang et al.

2008). Da davon auszugehen ist, dass sich unter ischämischen Bedingungen Panx1-

Kanäle öffnen, erscheint diese Methode besonders geeignet um den Verlauf des is-

chämischen Schocks zu beschreiben.

Die Öffnung des Panx1-Kanals in neuronalen Primärkulturen wurde in einem in vit-

ro-Modell der Ischämie untersucht. Dabei wird die metabolische Aktivität von Zellen

gehemmt. Diese metabolische Inhibition (MI) wird zum einen durch Zugabe eines

Blockers der mitochondrialen Atmungskette (KCN) und zum anderen der Glykolyse

(Natrium-Iodessigsäure) erreicht.

Mit dieser MI wurde der Efflux fluoreszierender Farbstoffe aus hippocampalen Neu-

ronenkulturen von Wistar-Ratten an DIV 10-12 an einem TCS SP5 MP Mikroskop

(Leica) mit Perfusionskammer gemessen. Die Zellen wurden zunächst für 30 min mit

1 µM des ca. 790 Da großen Farbstoffs Calcein Red Orange (Invitrogen) in SPES bei

37 °C im Brutschrank beladen, gewaschen und am Mikroskop 5 min für Kontrollauf-

nahmen in SPES gespült. Nach 5 min wurden die Neurone mit MI-Lösung inkubiert

4 Ergebnisse

80

Abb. 18: Antikörperfärbung hippocampaler Primärkulturen. Einzel- oder Doppelfärbungen hippocampaler Neuronenkulturen DIV 10-12, die mit Parvalbumin (A), Calretinin (B), Calbindin (C/D), Panx1 (E/F) oder GFAP (D/F) gefärbt wurden. Skalierung ent-spricht 30 µm.

4 Ergebnisse

81

und die Fluoreszenz über 65 min gemessen. Die Bildrate betrug 1 Bild pro Minute.

Der Farbstoffefflux aus den Zellen zeigt die Öffnung des Panx1-Kanals an, da es nicht

zu einem Efflux aus intakten Zellmembranen kommen kann. Abbildung 19 zeigt den

Zeitverlauf zweier repräsentativer Experimente. Es wurden vier morphologisch unter-

schiedliche Zelltypen der Neuronenkulturen ausgewählt (Abb. 19A), deren Farbstoff-

beladung über die Zeit gemessen wurde. Dabei wurde in den Graphen der Farbstoff

Calcein in rot und der Ca2+-bindende Biomarker Fluo-4 (Invitrogen) in blau darge-

stellt. Die Messungen stellen Neurone dar, die eine frühe (Abb. 19B), mittlere (Abb.

19C), späte (Abb. 19D) oder gar keine Reaktion auf die MI zeigen. Anhand der Mor-

phologie der Zellen ließen sich Gruppen zusammenfassen, deren Verhalten sich ähnel-

te. Die Messungen der Fluo-4 Intensität zeigen in allen vier Beispielen extrem unter-

schiedliche Kurvenverläufe. Diese Beobachtung belegt die Komplexität der unter-

schiedlichen Zelltypen hinsichtlich ihrer (patho)physiologischen Antworten. Hinzu

kommt, dass jede Zelle des Netzwerks mit verschiedenen Zelltypen verknüpft sein

kann. Positionelle Effekte und physiologische Diversitäten müssen berücksichtigt

werden. Somit kann auch die Reaktion auf einen pathologischen Stress wie Ischämie

offensichtlich sehr unterschiedliche Reaktionen auf zellulärer Ebene auslösen.

Messungen, bei denen kontinuierlich die Blocker CBX oder MFQ appliziert wurden,

ergaben keine anderen Ergebnisse als in Abbildung 19 dargestellt und werden daher

nicht gezeigt.

Die hier generierten Ergebnisse unterscheiden sich von denen, die von Thompson et al.

(2006) und Zhang et al. (2008) veröffentlicht wurden. In diesen Studien kam es nach

Beginn der Ischämie innerhalb von 15 – 20 min zu einem Farbstoffefflux aus neurona-

len Kulturen. Da die hier verwendeten Neuronenkulturen offensichtlich resistenter auf

ischämischen Stress reagierten, musste ein alternatives Modell zur Untersuchung des

Panx1-Kanals entwickelt werden. Dazu konnte auf eine neue Studie zu in vitro-

ischämischen Methoden zurückgegriffen werden (Meloni et al. 2011). In dieser neuen

Studie wurde anhand von verschiedenen Methoden neuronaler Zelltod in einem in

4 Ergebnisse

82

vitro-Modell der Ischämie untersucht. Zur Etablierung des experimentellen Modells

der Ischämie in unserem Labor verwendete ich zwei Methoden aus dieser Studie. Im

Anschluss werden die Messungen zum einen zur Zytotoxizität und zum anderen zur

metabolischen Aktivität von ischämisch gestressten Neuronenkulturen vorgestellt.

Abb. 19: Zeitverlauf einer Farbstoffefflux Messung. (A) Eine typische hippocampale Neuronenkultur (DIV 10), die 30 min mit 1 mM Calcein Red Orange (rote Spur) und Fluo-4 (blaue Spur) in SPES beladen wurde. Die Messung bestand aus 5 min Inkuba-tion in SPES. Im Anschluss wurde MI-Lösung appliziert und die Zellen für 65 min darin gespült. Die Pfeile deuten auf ausgewählte Zellen, um das typische Verhalten von Neuronenkulturen unter ischämi-schen Bedingungen darzustellen. Es wird gezeigt, dass Neurone eine frühe (B), mittlere (C), späte (D) oder keine Reaktion auf die MI zeigen. Der Abfall der relativen Fluoreszenz ist ein Indikator für den Verlust der Membranintegrität, der sowohl den Verlust von Farbstoff als auch von intrazellulärem Ca2+ verursacht.

4.2.3 Messung der LDH-Ausschüttung aus Rattenneuronen

bei MI

Zur Messung von Zytotoxizität lässt sich der Lactatdehydrogenase-Gehalt (LDH) im

Medium kultivierter Zellen bestimmen. LDH wird bei der Lyse von Zellen ins Medi-

um ausgeschüttet. Dazu wurden hippocampale Neuronenkulturen für eine Stunde mit

MI-Lösung behandelt und deren Zytotoxizität im Vergleich zu unbehandelten Kon-

troll-Kulturen nach 2, 4 und 24 Std. bestimmt. Die Messung erfolge in 96-Well Plat-

4 Ergebnisse

83

ten, auf denen Neurone kultiviert wurden. Um den Effekt des Panx1-Kanals auf das

Überleben der neuronalen Kulturen zu bestimmen, wurden die Kulturen neben der

MI-Lösung mit dem Panx1-Blocker MFQ (50 nM) behandelt.

Abbildung 20 zeigt die Ergebnisse von mindestens fünf unabhängigen Experimenten.

In diesen Experimenten wurde das Überleben jeweils prozentual auf eine „100%-

Zelltod-Kontrolle“ (s. Abschnitt 3.10) normiert. Zwei Std. nach dem ischämischen

Insult lässt sich keine signifikante Änderung des neuronalen Überlebens in den unter-

schiedlich behandelten Kulturen feststellen. MI-behandelte Zellen zeigen im Vergleich

zur Kontrolle bereits eine um ca. 10% erhöhte LDH-Konzentration. Nach 4 Std. kann

eine signifikant erhöhte LDH-Konzentration in MI-behandelten Neuronen gemessen

werden. 24 Std. nach dem Insult ist der Unterschied in der LDH-Ausschüttung zwi-

schen ischämisch gestressten und unbehandelten Zellen hochsignifikant. Auch die

Neurone, die zusätzlich zur MI mit dem Panx1-Blocker MFQ behandelt wurden, zei-

gen nach 24 Std. hochsignifikant mehr LDH-Ausschüttung als unbehandelte Zellen.

Hier zeigt sich, dass Neuronen die mit MI und MFQ behandelt wurden, weniger

LDH-Ausschüttung zeigen als Neurone, die nur mit MI-behandelt wurden. Nach 2

Std. kommt es zu einer 4% geringeren LDH-Ausschüttung, nach 4 Std. liegt der Un-

terschied bei 6% und nach 24 Std. kommt es zu einem Unterschied von 12%. Zusam-

menfassend lässt sich festhalten, dass die Inhibition des Panx1-Kanals eine geringere

Sterberate der Zellen bei MI nach sich zieht. Eine pharmakologische Blockade des

Panx1-Kanals wirkt leicht neuroprotektiv auf isolierte hippocampale Neurone unter

ischämischen Bedingungen.

4.2.4 Messung metabolischer Aktivität von Rattenneuronen

bei MI

Eine weitere Möglichkeit zur Charakterisierung des MI-Modells bestand in der Mes-

sung der metabolischen Aktivität der primären hippocampalen Neurone. Dabei wurde

4 Ergebnisse

84

die Konversion eines Tetrazoliumsalzes proportional zur metabolischen Aktivität der

Zellen gemessen. Die gemessenen Werte wurden auf die Aktivität unbehandelter Kon-

trollkulturen normiert.

Abb. 20: Messung der LDH-Ausschüttung aus Ratten Neuronen bei MI. Die LDH-Konzentration hippocampaler Primärkulturen aus der Ratte wurden an DIV 10-12 unter verschiedenen Bedingungen mit dem CytoTox 96 Assay (Promega) bestimmt. Dabei wurde der LDH Gehalt 2, 4 und 24 Std. nach einem 1-stündigen Insult mit MI-Lösung gemessen. Dargestellt ist die prozentuale LDH-Ausschüttung der individuell für jedes Experiment normiert wurde. 2 Std. nach dem Insult zeigen unbehandelte Kulturen 19% LDH-Ausschüttung, MI-behandelte Kulturen 27% und mit MI+MFQ (50nM)-behandelte Kulturen 23%. 4 Std. nach dem Insult kommt es zu signifikanten Unter-schieden in der LDH-Ausschüttung von unbehandelten (20%) zu MI-behandelten (36%) Kulturen. MI+MFQ-behandelte Kulturen zeigen 30% LDH-Ausschüttung. Nach 24 Std. unterscheidet sich so-wohl die LDH-Ausschüttung von MI (66%) als auch von MI+MFQ (54%)-behandelten Kulturen signi-fikant von denen unbehandelter Kulturen (23%). n=5; statistische Analyse mit Two-way ANOVA mit Bonferroni´s Posttest; *P<0,05; ***P<0,001; angezeigt werden Mittelwert mit Standardfehler (SEM). Bereits nach 2 Std. sinkt die neuronale Aktivität der MI-behandelten Kulturen signi-

fikant um 38% (Abb. 21). Dieser Trend bleibt auch nach 4 Std. erhalten. 24 Std.

nach dem Insult ist die metabolische Aktivität von MI-behandelten Kulturen 50%

geringer und unterscheidet sich hochsignifikant von den Kontrollneuronen.

Im Gegensatz zu den Ergebnissen der Zytotoxizitätsstudien (s. Abschnitt 4.3.2) zei-

gen sich mit MFQ-behandelte Neurone stärker durch MI betroffen als solche ohne

den Blocker. Zwei Std. nach dem ischämischen Insult ist der Aktivitätsverlust im

Vergleich zu Kontrollkulturen hochsignifikant und um 57% geringer. Dieser Effekt ist

auch zu den anderen beiden Zeitpunkten zu beobachten. Die Ergebnisse zeigen, dass

4 Ergebnisse

85

die Zugabe von MFQ offenbar eine aktivitätsmindernde Wirkung auf die metaboli-

sche Aktivität der Neurone hat. Bei der Messung des LDH-Gehalts konnte hingegen

eine leichte neuroprotektive Wirkung durch MFQ gemessen werden (Abb. 20).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Etablierung des experimentellen Modells

der Ischämie mithilfe der metabolischen Inhibition erfolgreich war. Es konnte de-

monstriert werden, dass zwei von drei getesteten Methoden geeignet sind um den Ef-

fekt von MI zu analysieren. Aufgrund dieser Vorarbeiten konnte nun im Anschluss

untersucht werden, ob hippocampale Neurone aus Panx1-KO-Mäusen im gewählten

Modell der experimentellen Ischämie geschützt sind (s. Abschnitt 4.4.2/4.4.3).

Abb. 21: Messung der metabolischen Aktivität von Ratten Neuronen bei MI. Die metabolische Aktivität hippocampaler Primärkulturen aus der Ratte wurden an DIV 10-12 unter verschiedenen Bedingungen mit dem CellTiter 96 Assay (Promega) bestimmt. Dabei wurden die Mes-sungen 2, 4 und 24 Std. nach einem 1-stündigen Insult mit MI-Lösung gemessen und die Ergebnisse der unbehandelten Kulturen auf 100% normiert. 2 Std. nach Insult haben mit MI-behandelte Kulturen eine metabolische Aktivität von 62% und mit MI+MFQ (50nM)-behandelte Kulturen von 43%. 4 Std. nach dem Insult zeigen mit MI-behandelten Kulturen 65% und mit MI+MFQ-behandelte Kulturen zeigen 56% metabolische Aktivität im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Nach 24 Std. zeigen beide behandelten Kulturen 50% Aktivitätsreduktion im Vergleich zur Kontrolle. n=4; statistische Analyse mit Two-way ANOVA mit Bonferroni´s Posttest; *P<0,05; **P<0,01; angezeigt werden Mit-telwert mit Standardfehler (SEM).

4 Ergebnisse

86

4.3 Charakterisierung der Panx1-KO-Maus

4.3.1 Genotypisierung der Panx1-KO-Maus

Die in Abschnitt 3.5.3 beschriebenen Panx1-KO-Mäuse wurden zur Bestimmung des

Genotyps vor weiterführenden Experimenten durch PCR genotypisiert. Dazu wurde

die genomische-DNA aus Schwanzspitzen isoliert und eine analytische PCR durchge-

führt (s. Abschnitt 3.7.3). Abbildung 22A zeigt das Ergebnis einer repräsentativen

Genotypisierung. Durch den Wegfall von Exon 3-4 kommt es in der PCR-Reaktion

des Panx1-KO zur Generierung eines 900 bp großen Fragments, während in der PCR-

Reaktion eines Panx1-loxP-Tieres ein Fragment von 1989 bp generiert wird. Des

Weiteren wurde eine analytische PCR mit cDNAs aus verschiedenen Geweben durch-

geführt zur Bestätigung des globalen Panx1-KO (Abb. 22B). Ausgewählt wurden

Gewebe mit bekannter Panx1-Expression (Schwanz, Auge, Cortex, Cerebellum, Herz).

Die Abbildung bestätigt, dass sämtliche Gewebe frei von Panx1-Expression sind.

Abb. 22: Untersuchung des Panx1-KO durch analytische PCRs. 1%ige Agarosegele mit DNA aus analytischen PCR Experimenten. (A) Die Genotypisierung von Panx1-KO-Mäusen mit dem blackPREP Rodent Tail DNA Kit (Analytik Jena). Von links sind aufge-tragen DNA-Marker, DNA aus der Schwanzspitze eines Panx1-KO-Tieres, DNA aus der Schwanzspitze eines Panx1-loxP-Tieres und eine PCR H2O Kontrolle. (B) Zur Überprüfung des globalen Panx1-KO wurde die cDNA verschiedener Gewebe auf heterozygote Zellen untersucht. Dabei wurde cDNA aus Schwanz, Auge, Cortex, Cerebellum und Herz getestet. Alle Gewebe sind frei von Panx1-Expression.

4 Ergebnisse

87

4.3.2 Morphologische Analyse der Panx1-KO-Maus

4.3.2.1 Makroskopischer Vergleich der Gehirne

Die Gehirne von Panx1-KO- und altersentsprechenden WT-Mäusen wurden zunächst

makroskopisch untersucht. Hierzu wurden Gehirne präpariert und fixiert. In Abbil-

dung 23 sind Gehirne einer Kontrollmaus (A/C) im Vergleich zu einer Panx1-KO-

Maus (B/D) dargestellt. Morphologisch lassen sich weder von der dorsalen (A/B)

noch der ventralen Ansicht (C/D) Unterschiede an makroskopisch differenzierbaren

Strukturen wie dem Bulbus olfactorius, dem Vorderhirn, Kleinhirn und dem Hirn-

stamm zwischen den beiden Genotypen feststellen. Die Inspektion der Gehirne zeigte,

dass die genetische Ablation von Panx1 keine makroskopisch erkennbaren Unter-

schiede verursacht.

4.3.2.2 Immunhistochemische Charakterisierung der Panx1-KO-Maus

Zur detaillierteren Charakterisierung des Panx1-KO-Phänotyps wurden exemplarisch

die Hippocampi von Panx1-KO- und altersentsprechenden WT-Mäusen untersucht.

Die Lokalisierung von Panx1 in der Hippocampusformation auf licht- und elektro-

nenmikroskopischer Ebene ist von unserer Arbeitsgruppe bereits detailliert beschrie-

ben worden (Zoidl et al. 2007). Somit war bekannt, dass WT-Mäuse Panx1 in Grup-

pen von immunpositiven Pyramidenzellen der Regionen CA1, 2 und 3 des Hippocam-

pus exprimieren.

4 Ergebnisse

88

Abb. 23: Makroskopische Darstellung von Panx1-KO- und WT-Gehirn. Beim Vergleich von Panx1-Knock-out (KO, B/D) und einem alters- und geschlechtsangepassten Wild-typ (WT, A/C) -Gehirn sind makroskopisch, sowohl in der Dorsal- (A/B) als auch in der Ventralan-sicht (B/D), keine auffälligen Unterschiede erkennbar. Beide sechs Monate alten weiblichen Tiere wur-den mit Glutaraldehyd-Lösung perfusionsfixiert. Der gleiche Prozess kann in Körnerzellen im dorsalen und ventralen Stratum granulo-

sum des Gyrus dentatus beschrieben werden. In publizierten Vorarbeiten wurde ge-

zeigt, dass Panx1-positive Interneurone in allen Subregionen verteilt sind. Die Spezifi-

tät der verwendeten Antikörper (Kaninchen α-Panx1-CT und Huhn α-Panx1 4515)

in den Arbeiten von Ray et al. und Zoidl et al., war durch Western-Blot Analysen

bestätigt worden. Damit war die Voraussetzung für eine vergleichende Untersuchung

gegeben (Ray et al. 2005, Zoidl et al. 2007). Da konditionale Panx1-KO-Mäuse zu

dem Zeitpunkt der beiden o.g. Arbeiten noch nicht vorlagen, war nach deren Verfüg-

4 Ergebnisse

89

barkeit ein Vergleich der WT- und Panx1-KO-Mäuse notwendig, um die Ausschal-

tung des Panx1-Proteins auch auf Proteinebene nachzuweisen.

In Immunfluoreszenzdoppelfärbungen ausgewählter Regionen des ZNS mit bekanntem

Panx1-Expressionsmuster konnte die spezifische Lokalisation von Panx1 in der Reti-

na (Dvoriantchikova et al. 2006), dem Hippocampus (Ray et al. 2005, Zoidl et al.

2007) und dem Kleinhirn (Ray et al. 2006) an WT-Gehirnen bestätigt werden (Abb.

24A/C/E). Im Gegensatz dazu zeigten die entsprechenden Regionen bei Panx1-KO

nur schwache Hintergrundsignale (Abb. 24B/D/E)

In der Retina ließen sich im WT (Abb. 24A) eindeutige Färbungen der Ganglienzell-

schicht und der inneren Abschnitte der inneren Körnerschicht erkennen (engl. „inner

nuclear layer“ - INL). Dieser Befund bestätigt eine Expression in retinalen Ganglien-

zellen und verweist auf eine noch nicht bestätigte Expression in Amakrinzellen. Die

Retina der Panx1-KOs (Abb. 24B) zeigt kein spezifisches Signal. Auch die Färbung

des Hippocampus (Abb. 24C/D) zeigt deutliche Panx1-Signale in Pyramidenzellen

der CA1-Region (Abb. 24C) und in Interneuronen, im Hilus des Gyrus dentatus

(nicht gezeigt), die beim Panx1-KO-Tier nicht gefunden werden (Abb. 24D).

4 Ergebnisse

90

Abb. 24: Immunfärbung hippocampaler Strukturen von Panx1-KO und WT Detail-Aufnahmen von Doppel-Fluoreszenz-Immunfärbungen der Retina, des Hippocampus und Klein-hirns von adulten WT- (A/C/E) und Panx1-KO-Mäusen (B/D/F). Panx1-KO-Färbungen zeigen keine spezifische Färbung des Antikörpers. (A/B) Retina mit Ganglienzellschicht; (C/D) CA1-Region und Hilus des Hippocampus; (E/F) Purkinjezellschicht im Kleinhirn. Panx1 – grün, DAPI – in rot darge-stellt; Skalierung 50 µm. ONL – Äußere Körnerschicht, INL – Innere Körnerschicht, IPL – Innere ple-xiforme Schicht, GCL – Ganglienzellschicht, PCL – Purkinjezellschicht, ML - Molekularschicht

4 Ergebnisse

91

Immunmarkierungen des Kleinhirns zeigten im WT ein starkes Panx1-Signal (Abb.

24E) in Purkinjezellen, Sternzellen der Molekularschicht und eine punktierte Reakti-

on in der Körnerzellschicht. Beim Panx1-KO-Tier werden Stern- und Purkinjezell-

schicht nicht gefärbt, die punktierte Reaktion in der Körnerzellschicht ist vorhanden

und kann als unspezifisch betrachtet werden.

Da durch die vorliegenden Analysen die ursprünglich beschriebenen Ergebnisse der

Panx1-Lokalisation in der Retina, im Hippocampus und Kleinhirn reproduziert wer-

den konnten, kann das Fehlen der Panx1-Immunreaktivität in den Panx1-KOs als

Bestätigung der genetischen Ablation von Panx1 interpretiert werden. Western Blot

Untersuchungen, die in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Dr. Valery Shestopalov

(University of Miami) durchgeführt wurden, bestätigten die hier gemachten Beobach-

tungen durch eine unabhängige Methode (s. A2 im Anhang; freundlicherweise von Dr.

Shestopalov zur Verfügung gestellt).

4.3.2.3 Feinstruktur des Hippocampus in der Panx1-KO- und WT-Maus

Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass Panx1 bereits früh in der

Entwicklung im ZNS exprimiert wird (Ray et al. 2005). Da nicht ausgeschlossen wer-

den kann, dass die Expression von Panx1 für die Entwicklung des Gehirns, bzw. das

Fehlen des Proteins Veränderungen in der Entwicklung der Zytoarchitektur des Ge-

hirns auf mikroskopischer Ebene verursachen kann, wurde eine verfeinerte Analyse

durchgeführt. Um morphologische Unterschiede des Hippocampus im Panx1-KO-Tier

im Vergleich zum WT nachzuweisen, wurden 1 mm dicke Hirnscheiben zunächst os-

miert, in der aufsteigenden Alkoholreihe im 80%igen Alkohol fotografiert (Abb.

25A/B) und dann in Araldit für die Herstellung von Semidünnschnitten eingebettet.

Die Semidünnschnitte (Abb. 25C-H) der Hippocampusregion wurden dann feinstruk-

turell analysiert. In der Übersicht wird an den vergleichenden Hirnscheiben in Höhe

4 Ergebnisse

92

des vorderen Hippocampus deutlich, dass hier morphologisch keine Unterschiede im

Hippocampus und den anderen Hirnregionen erkennbar sind (Abb. 25A/B).

In den Semidünnschnitten ist in der CA1-Region, die Pyramidalzell-Schicht (SP) mit

den radial verlaufenden Dendriten (SR) und dem darüber liegende Stratum oriens

(SO) erkennbar (Abb. 25C/D). Werden Panx1-KO und WT miteinander verglichen,

lässt sich kein Unterschied finden. Dieses gilt auch für die CA3-Region, in der eben-

falls die Pyramidalzell-Schicht sowie das Stratum lucidum (SL) erkennbar sind (Abb.

25E/F). Auch im Gyrus dentatus sind bei beiden Genotypen normale Körnerzellen

und Interneurone detektierbar (Abb. 25G/H). Degenerationen wurden in keiner hip-

pocampalen Region gefunden. Aufgrund dieses Befundes lässt sich schlussfolgern, dass

das Fehlen des Panx1-Proteins im Hippocampus keine lichtmikroskopisch erkennba-

ren strukturellen Veränderungen erkennen lässt.

4.3.2.4 Vergleichende Charakterisierung der morphologischen Strukturen

anhand von zwei Ca2+ bindenden hippocampalen Marker-

Proteinen

Da in der feinstrukturellen Analyse keine morphologischen Unterschiede der Panx1-

KO im Vergleich zum WT festgestellt werden konnten, wurde anschließend noch eine

Immunhistochemie mit zwei Ca2+-bindenden Proteinen durchgeführt. Parvalbumin

markiert im Hippocampus eine Population GABA-erger Interneurone und ist ein sen-

sibler interneuronaler Marker für funktionelle Veränderungen im Hippocampus

(Reynolds et al. 2004). Calbindin färbt sowohl Interneurone als auch Pyramidenzellen

und liefert darüber hinaus eine gute Unterscheidung der hippocampalen Subregionen.

4 Ergebnisse

93

Abb. 25: Feinstruktur des Hippocampus bei Panx1-KO und WT Feinstruktur hippocampaler Strukturen wie im Text beschrieben: CA1 (C/D), CA3 (E/F), GD (G/H). Abkürzungen: Cx – Cortex, Th – Thalamus, cp – Hirnschenkel, Amy – Amygdala, Hy – Hypotha-lamus; SO – Stratum oriens; SP – Stratum pyramidale; SR – Stratum radiatum; SL – Stratum luci-dum; SG – Stratum granulare; Skalierung A/ B 1000 µm, C-H 20 µm.

4 Ergebnisse

94

Hintergrund dieser Analyse war, dass in einer parallel zu dieser Promotion durchge-

führten Studie Hinweise auf eine Funktion von Panx1 in inhibitorischen Neuronen

der Retina (Prochnow et al. 2009) und dem Hippocampus (Prochnow et al., Manu-

skript in Vorbereitung) erhoben worden sind. Es stellte sich daher die Frage, ob

Panx1 die Lokalisation und/oder Anzahl der Interneurone verändert.

Diese Annahme konnte aber durch die durchgeführten immunhistochemischen Unter-

suchungen nicht bestätigt werden. Beim Vergleich der Genotypen fällt in der Calbin-

din-Immunhistochemie auf, dass keine gravierenden Unterschiede zwischen WT- (Abb.

26A/B) und Panx1-KO (Abb. 26C/D) erkennbar sind. Bei beiden Genotypen sind

Pyramidalzellen in CA1 und deren Dendriten im Stratum oriens und radiatum, das

Stratum lucidum der CA3-Region und der Gyrus dentatus mit dem Stratum granulo-

sum und Stratum moleculare markiert. In den Parvalbumin-Markierungen finden sich

immunpositive Interneurone in allen Regionen (Abb. 26F/H). Die dendritischen Ver-

zweigungen sind im Stratum radiatum der CA1-Region und Stratum moleculare des

Gyrus dentatus besonders gut zu erkennen. Auch hier sind keine auffälligen Unter-

schiede zwischen den Genotypen zu erkennen. Da im Rahmen dieser Arbeit jeweils

nur zwei Tiere pro Genotyp untersucht wurden, könnte eine weiterreichende morpho-

logische Analyse des Panx1-KO im Vergleich zum WT in der Zukunft ggf. auch mit

anderen hippocampalen interneuronalen Markern angestrebt werden.

Abschließend lässt sich feststellen, dass die bis jetzt durch verschiedene Methoden

erhobenen strukturellen Befunde zum Hippocampus weder makroskopischen noch

mikroskopische Veränderungen in der Architektur adulter Panx1-KOs im Vergleich

zu altersentsprechenden WT-Mäusen zeigen. Aufgrund der strukturellen Vergleich-

barkeit von WT- und Panx1-KO-Tieren konnte nun im nächsten Schritt das Verhal-

ten von WT- und Panx1-KO-Neuronen in einem experimentellen Modell für Ischämie

untersucht werden.

4 Ergebnisse

95

Abb. 26: Cb- und Parv-Peroxidase-Immunhistochemie im Hippocampus Die Hippocampi von WT-Tieren (A/B, E/F) und Panx1-KO-Tieren (C/D, G/H) wurden entweder mit Calbindin (A-D) oder Parvalbumin (E-H) angefärbt und zeigen den Hippocampus als Übersicht (A/C/E/G) und die CA1-Region in Detailaufnahmen (B/D/F/H). Es lassen sich keine feinstrukturel-len Unterschiede der beiden Genotypen feststellen. OR - Stratum oriens; PY – Pyramidalzellschicht; RAD – Stratum radiatum; MOL – Molekularzellschicht; SL – Stratum lucidum; GC – Ganglienzell-schicht; Skalierungen entsprechen 500 µm (in A für A/C,/E/G) und 200 µm (in B für B/D/F/H).

4 Ergebnisse

96

4.4 Analyse der Panx1-Funktion bei in

vitro Ischämie durch Verwendung des

Panx1-KO-Mausmodells Am Anfang dieser Promotion lagen erste Befunde vor, die darauf hinwiesen, dass die

Blockade von Panx1-Kanälen eine neuroprotektive Wirkung hat (Thompson et al.

2006, Zhang et al. 2008). An diese Studien anknüpfend sollte nun erstmals die Wir-

kung des Panx1-Kanals mithilfe eines neuen Panx1-KO-Modells bei in vitro-Ischämie

charakterisiert werden. Als Grundlage für diese Untersuchung war die in vorangegan-

genen Abschnitten beschriebene Methode der metabolischen Inhibition (MI) etabliert

worden (s. Abschnitt 4.2) und eine Charakterisierung des konditionalen Panx1-KO-

Mausmodells im Vergleich zum WT-Tier durchgeführt worden (s. Abschnitt 4.3). In

diesem Abschnitt werden nun verschiedene Ansätze zur Untersuchung der Panx1-

Funktion im Kontext der Ischämie zusammengefasst.

Zuerst wird eine Charakterisierung der hippocampalen Neuronenkulturen des Panx1-

KO in Bezug auf deren Zytotoxizität (s. Abschnitt 4.4.1) und metabolische Aktivität

(s. Abschnitt 4.4.2) im MI-Modell beschrieben. Im Anschluss daran werden morpho-

logische Veränderungen der mit MI-behandelten hippocampalen Schnitte analysiert (s.

Abschnitt 4.4.3). Anschließend werden Experimente beschrieben, in denen die Funk-

tion von Panx1 bei MI in einem elektrophysiologischen Ansatz analysiert worden sind.

Dies erfolgt anhand von Feldpotenzialmessungen hippocampaler Schnitte (s. Ab-

schnitt 4.4.4). Abschließend werden die Veränderungen der Genexpression ausgewähl-

ter Gene mit bekannter Funktion in der synaptischen Plastizität beschrieben (s. Ab-

schnitt 4.4.5).

4 Ergebnisse

97

4.4.1 Messung der LDH-Ausschüttung aus Mausneuronen

bei MI

Zuerst wurde das Überleben von Kontrollen und mit MI-behandelter neuronaler Kul-

turen bestimmt. Dabei dient die Ausschüttung von LDH aus lysierten Zellen als Mar-

ker für Zytotoxizität der neuronalen Kulturen. Im Gegensatz zu der im Abschnitt

4.2.3 an Rattenneuronen etablierten Methode wurden hier Neurone von WT- und

Panx1-KO-Tieren verwendet.

Unbehandelte WT-Neurone wurden mit solchen verglichen, die nur mit MI oder mit

MI und zusätzlich dem Panx1-Blocker MFQ (MI+MFQ) behandelt wurden (Abb.

27A). Parallel wurden Experimente mit Neuronen aus Panx1-KO-Tieren durchge-

führt, die entweder unbehandelt oder mit MI-behandelt wurden (KO MI). Die Werte

von unbehandelten Neuronenkulturen aus Panx1-KO- und WT-Tieren unterschieden

sich nur marginal (Unterschied zwischen den Mittelwerten: 2 Std. 0.2784 ± 5.762; P=

0,9628/ 4 Std. -5.128 ± 4.689; P= 0,3025/ 24 Std. 5.569 ± 5.465; P= 0,3421), daher

wurden aus Gründen der Übersicht in Abbildung 27 nur Werte aus Messungen mit

WT-Neuronen dargestellt.

Zwei und vier Std. nach dem ischämischen Insult schwankt die LDH-Ausschüttung in

allen Kulturen (WT und Panx1-KO, mit und ohne Behandlung) um 22,8% (2 Std.

23,29%; P=0,4566/ 4 Std. 22,38; P=0,1895). Erst nach 24 Std. lassen sich signifikante

Unterschiede zwischen dem LDH-Ausstoß von unbehandelten und dem der behandel-

ten Kulturen messen. So unterscheiden sich unbehandelte Kulturen (22,56%) hoch-

signifikant von MI-behandelten WT-Kulturen (54,64%; Differenz zu Kontrolle

32,08%; P<0,001). Auch bei WT-Neuronen, die mit MI+MFQ-behandelt wurden,

zeigen sich signifikante Unterschiede (51,02%; Differenz zu Kontrolle 28,46%;

P<0,01). Das gleiche gilt für Messungen von Panx1-KO Neuronen, die sich signifi-

kant von der Kontrolle unterschieden (48,97%; Differenz zu Kontrolle 26,41%;

P<0,01).

4 Ergebnisse

98

Die Streuung der Messwerte 24 Std. nach dem Insult sind in Abb. 27B aufgetragen.

Die Mittelwerte der WT-MI+MFQ-Neurone und der Panx1-KO-MI-Neurone sind

etwas kleiner als die von WT-MI-Neuronen (Differenz zu MI: MI+MFQ 3,619%;

Panx1-KO MI 5,669%). Hier lässt sich ein möglicher Trend innerhalb der MI-

behandelten Kulturen erkennen. Sowohl mit MFQ-behandelte WT-Neuronen, als

auch Panx1-KO-Neuronen zeigen im Durchschnitt einen etwas geringeren LDH-

Ausstoß, als die ausschließlich mit MI-behandelten Neurone.

Abb. 27: Messung der LDH-Ausschüttung aus isolierten Mausneuronen bei MI. Die LDH-Konzentration hippocampaler Primärkulturen aus Panx1-KO- und WT-Tieren wurde an DIV 10-12 unter verschiedenen Bedingungen mit dem CyTox96 Assay (Promega) bestimmt. Dabei wurde der LDH Gehalt 2, 4 und 24 Std. nach einem 1-stündigen Insult mit MI-Lösung gemessen. (A) 2 Std. nach dem Insult haben unbehandelte Kulturen einen Mittelwert von 18% LDH Gehalt im Medium, MI-behandelte Kulturen von 29%, MI+MFQ (50nM)-behandelte Kulturen von 21% und mit MI-behandelte Neurone aus Panx1-KO-Tieren 25%. 4 Std. nach dem Insult zeigen unbehandelte Kulturen einen LDH Gehalt von 16%, MI-behandelte von 23%, MI+MFQ-behandelte von 22% und MI-behandelte Kulturen aus Panx1-KO-Tieren einen Gehalt von 28%. (A/B) 24 Std. nach dem Insult kommt es zu signifikanten Unterschieden von unbehandelten (23%) zu MI-behandelten (55%) Kultu-ren. Der Unterschied zu MI+MFQ-behandelte Kulturen (51%) und MI-behandelten Kulturen aus Panx1-KO-Tieren (49%) ist sehr signifikant. n=4-6 mit jeweils mindestens insgesamt 36 Einzelwerten; statistische Analyse mit Two-way ANOVA mit Bonferroni´s Posttest; **P<0,01; ***P<0,001; ange-zeigt werden Mittelwert mit Standardfehler (SEM).

4 Ergebnisse

99

Auf Grundlage dieser Daten lässt sich kein neuroprotektiver Effekt des Panx1-

Blockes oder des Panx1-KO nachweisen. Es zeigt sich aber eine mögliche Tendenz,

dass Neuronen von Panx1-KO-Tieren oder mit blockierten Panx1-Kanälen etwas ge-

ringere Zytotoxiziät aufweisen als Neurone, die nur mit MI-behandelt wurden.

4.4.2 Panx1-KO-Neurone sind bei MI besser vor

Aktivitätsverlust geschützt

Zur Messung der metabolischen Aktivität von isolierten Mausneuronen wurde die

unter Abschnitt 4.2.4 an Rattenneuronen etablierte Methode verwendet. Dabei wird

jeweils auf die metabolische Aktivität unbehandelter Neuronenkulturen (sowohl von

WT als auch Panx1-KO) normiert. Neurone aus WT- und aus Panx1-KO-Tieren

wurden mit einem MI-Insult behandelt und deren metabolische Aktivität 2, 4 und 24

Std. nach dem Insult gemessen. Dargestellt ist die prozentuale metabolische Aktivität

der behandelten Neuronen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollneuronen (Abb.

28A).

2 Std. nach Insult haben mit MI-behandelte WT-Kulturen eine metabolische Aktivi-

tät von 54,68% und Panx1-KO-Kulturen von 83,81%. 4 Std. nach Insult zeigten mit

MI-behandelte WT-Kulturen eine metabolische Aktivität von 57,01% und Panx1-KO-

Kulturen von 72,46% im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Nach 24 Std. zeigten

Panx1-KO- und WT-Kulturen 53,01% (WT) bzw. 59,7% (Panx1-KO) Aktivität im

Vergleich zu unbehandelten Kontrollen (100%). Dabei zeigt sich, dass Neurone aus

Panx1-KO-Kulturen zu allen Zeitpunkten einen geringeren Aktivitätsverlust aufwei-

sen als Neurone aus WT-Tieren. MI-behandelte WT-Neurone zeigen zu allen drei

Zeitpunkten einen hochsignifikanten Aktivitätsverlust im Vergleich zur unbehandel-

ten Kontrolle (2 Std. 45,32%; 4 Std. 42,99%; 24 Std. 46,99%; alle P<0,001). Neurone

aus Panx1-KO-Tieren zeigen hingegen nach 2 Std. keine signifikante Aktivitätsreduk-

tion im Vergleich zur Kontrolle (16,19%; P>0,05). Jedoch sowohl nach 4 Std.

4 Ergebnisse

100

(27,54%; P<0,01) als auch nach 24 Std. (40,3%; P<0,001) ist der Aktivitätsverlust

im Vergleich zu Kontrollneuronen hochsignifikant.

Abbildung 28B zeigt die Streuung der Messwerte 2 Std. nach dem ischämischen In-

sult. WT-Neuronenkulturen zeigen bei MI einen hochsignifikant größeren Aktivitäts-

verlust als Panx1-KO-Neuronen (Differenz der Mittelwerte -29.14 ± 14.99; P=

0,0040). Vergleicht man die Messwerte der WT- und Panx1-KO-Neurone über die

Zeit fällt auf, dass WT-Neurone zu allen drei Zeitpunkten einen etwa gleichen Aktivi-

tätsverlust aufweisen (54,9%). Im Gegensatz dazu verliert der Panx1-KO erst über

die Zeit an metabolischer Aktivität (Abb. 28A).

Das Ergebnis demonstriert, dass Panx1-KO-Neurone durch das Fehlen des Panx1-

Kanals in der Anfangsphase der metabolischen Inaktivierung, mindestens aber in den

ersten zwei Std. besser vor dem MI-induzierten Aktivitätsverlust geschützt sind.

Abb. 28: Messung der metabolischen Aktivität an Mausneuronen bei MI. (A) Die metabolische Aktivität hippocampaler Primärkulturen von Panx1-KO- und WT-Tieren wur-den an DIV 10-12 unter verschiedenen Bedingungen mit dem CellTiter 96 Assay (Promega) bestimmt. Dabei wurden die Messungen 2,4 und 24 Std. nach einem 1 stündigen Insult mit MI-Lösung gemessen und die Ergebnisse der unbehandelten Kulturen auf 100% normiert. (B) Streuung der Werte 2 Std. nach ischämischem Insult. WT-Neuronen zeigen signifikant mehr Aktivitätsverlust (45,32%) als Panx1-KO-Neurone (16,19%). Es wurden 5 unabhängige Experimente mit mindestens 139 Einzelwer-ten durchgeführt; statistische Analyse mit Two-way ANOVA mit Bonferroni´s Posttest (A) bzw. t-Test (B) ; ***P<0,01; **P<0,01; angezeigt werden Mittelwert mit Standardfehler (SEM).

4 Ergebnisse

101

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beiden Methoden zur Charakterisierung

des Panx1-Kanals in isolierten Neuronen unterschiedliche Ergebnisse erbrachten. Bei

der Messung der neuronalen Zytotoxizität konnten keine signifikanten Unterschiede

zwischen den verschieden behandelten Kulturen gemessen werden. Weder Panx1-

Verlust noch Blockierung hatten eine signifikant neuroprotektive Wirkung auf die

Mausneuronen. Im Gegensatz dazu zeigten die Messungen der metabolischen Aktivi-

tät von Mausneuronen eine signifikante Reduktion des Aktivitätsverlustes bei Panx1-

KO-Neuronen. So entsteht nach der Ischämie ein Zeitfenster von mindestens zwei

Std., bei dem Panx1 Verlust eine protektive Wirkung auf die metabolische Aktivität

ischämisch gestresster Neuronenkulturen hat. In dieser kritischen Phase scheint eine

Intervention gegen ischämischen Stress möglich. Damit bestätigt sich die von Thomp-

son et al. (2006) formulierte Annahme, dass eine Blockade von Panx1-Kanälen neu-

roprotektiv wirkt.

4.4.3 Morphologische Veränderungen hippocampaler

Schnitte bei MI

Hippocampale Horizontalschnitte sind etablierte Gewebepräparationen für elektro-

physiologische Messungen. In Abschnitt 4.4.4 wird die Charakterisierung des Modells

der in vitro-Ischämie anhand von hippocampalen Feldpotenzialen bestimmt. Zu dieser

funktionellen Untersuchung des Panx1-Kanals sollen zwei weitere Experimente

durchgeführt werden, die sich an die Methode der elektrophysiologischen Messungen

anlehnen (s. Abschnitt 3.13). In beiden Ansätzen wird mit den gleichen hippocampa-

len Horizontalschnitten gearbeitet, wie sie für die Elektrophysiologie verwendet wur-

den. An Stelle der kontinuierlichen Messungen soll jedoch jeweils eine Start- (20 min

in ACSF) und Endpunktanalyse (20 min Inkubation mit MI) des in vitro-

ischämischen Modells durchgeführt werden.

4 Ergebnisse

102

Im Folgenden wird zunächst eine morphologische Charakterisierung behandelter bzw.

unbehandelter Schnitte beschrieben. Dabei sollte geklärt werden, ob die Inkubation

mit MI-Lösung erkennbare morphologische Veränderungen der Zellen im Hippocam-

pus nach sich zieht. Es wurde erwartet, dass es Veränderungen in der Zellschicht der

CA1-Region gibt, die als besonders vulnerabel für hypoxisch/ischämischen Stress gilt

(Yamashima et al. 2007). Zur Anfärbung wurde der Thiazinfarbstoff Toluidinblau

verwendet, der blaue Kernfärbungen erzielt. Bereiche, an denen es zum Zelluntergang

kommt, sollten bei der Färbung heller erscheinen.

Abbildung 29A/B zeigt unbehandelte Schnitte (Startpunkt) aus einem WT-Tier (Abb.

29A) und einem Panx1-KO-Tier (Abb. 29B). Die regelmäßige Toluidinblaufärbung

deutet auf ein intaktes Gewebe hin. Im Bereich des Gyrus dentatus (GD) und der

CA3-Region der Schnitte lassen sich einige Bereiche mit weniger Färbung beobachten.

Im Vergleich dazu lässt sich nach der Inkubation mit MI (Endpunkt) sowohl für

Schnitte von WT- als auch von Panx1-KO-Tieren keine deutliche Reduktion in der

Farbintensität beschreiben (Abb. 29C/D). Eine Analyse der Farbintensität in den

Bereichen CA1, CA3 und GD (exemplarische Kästen in Abb. 29 A-D) ergab keine

signifikanten Unterschiede vor und nach MI (Abb. 29E).

Daraus lässt sich schließen, dass ein MI-induzierter potenzieller Zelluntergang in den

hippocampalen Schnitten anhand dieser Daten nicht messbar ist. Eine größere Anzahl

von Färbungen könnte diesen ersten Befund widerlegen. Eine Abschließende Beurtei-

lung bezüglich der Sensitivität der verschiedenen hippocampalen Sektoren kann somit

noch nicht getroffen werden.

4 Ergebnisse

103

Abb. 29: Morphologische Veränderungen hippocampaler Schnitte bei MI. 1%ig Toluidinblaufärbungen von hippocampalen Horizontalschnitten von WT- (A/C) und Panx1-KO-Tieren (B/C). Die Schnitte wurden entweder für 20 min in ACSF (Startpunkt) inkubiert (A/B) oder für 20 min. in MI-Lösung (Endpunkt) inkubiert. Im Anschluss wurden die Schnitte in Glutaraldehyd fixiert und gefärbt. (E) Kästen in A-D markieren die Bereiche (engl. „regions of interest“ – ROI) in CA1, CA3 und GD, die zur Analyse der Farbintensitäten der Sektoren genutzt wurden. n=3 Bilder pro Bedingung (Kontrolle/MI).

4.4.4 Messung von Feldpotenzialen hippocampaler Schnitte

bei MI

In einem elektrophysiologischen Ansatz sollte nun die Funktionalität des hippocam-

palen Netzwerks in Bezug auf die Rolle von Panx1 unter ischämischen Bedingungen

4 Ergebnisse

104

untersucht werden. Dazu wurden hippocampale Schnitte von WT- und Panx1-KO-

Tieren mit Lösung zur metabolischen Inhibition (MI) inkubiert und Änderungen der

elektrischen Aktivität neuronaler Netzwerke über die Inkubationszeit verfolgt. Hierzu

wurden die exzitatorischen postsynaptischen Feldpotenziale (fEPSPs) an hippocam-

palen Schnitten von Panx1-KO- und WT-Tieren in der Annahme gemessen, dass die

metabolische Inaktivierung charakteristische pathophysiologische Veränderungen er-

zeugen wird. Dazu wurden Feldpotenziale durch Platzierung einer Stimuluselektrode

in den Schaffer-Kollateralen generiert, die exzitatorischen Input zu Neuronen der

CA1-Region liefern. Eine Ableitelektrode wurde in die dendritische Schicht der Panx1

exprimierenden Pyramidenzellen der CA1-Region platziert (s. Abschnitt 3.13). Die

durch Reizelektroden vermittelten elektrischen Stimuli induzierten simultane Erre-

gung vieler Neurone. Diese synaptische Transmission konnte als extrazelluläres Feld-

potenzial mit Amplituden im Bereich von 0,5-3 mV an der Ableitelektrode gemessen

werden.

Durch die Kooperation mit PD Dr. Matthias Schmidt von EcocyteBioscience in Cas-

trop-Rauxel hatte ich die Möglichkeit, das Synchroslice-Komplettsystem (Lohmann

Research Equipment) zu benutzen. Dieser Messstand ermöglichte die parallele Mes-

sung von vier hippocampalen Schnitten und erlaubt so einen großen Durchsatz an

Feldpotenzialmessungen von Panx1-KO- und WT-Schnitten, unter verschiedenen Be-

dingungen. Im ersten Schritt wurden eine Dosis-Wirkungskurve erstellt, um die Kon-

zentrationen der Lösung zu bestimmen, die zur metabolischen Inhibition (MI) der

Schnitte führte (s. Abschnitt 3.6.7). Im zweiten Schritt wurden die Mess-Paradigmen

definiert. Dabei stellte sich heraus, dass nur 50% der Inhibitorkonzentration im Ver-

gleich zu den Zellkulturexperimenten mit isolierten Neuronen notwendig war. Es

wurde ein Mess-Paradigma entwickelt, bei dem zunächst für 20 min die Grundaktivi-

tät in ACSF gemessen wurde. Im Anschluss wurden die Schnitte metabolisch inhi-

4 Ergebnisse

105

biert und durch Perfusion mit MI-Lösung für 30 min inkubiert. Diese wurde nachfol-

gend für 20 min in ACSF ausgewaschen (Abb. 30).

Abbildung 30 stellt exemplarisch die zwei grundsätzlichen Typen von Ergebnissen dar,

die unter diesem Paradigma generiert werden konnten. Die generelle Beobachtung ist,

dass die Amplituden der durch elektrische Stimulation erzeugten Feldpotenziale klei-

ner werden, sobald MI-Lösung eingewaschen wird. Es lassen sich zwei Typen von

Zeitverläufen beschreiben. Eine einfache Amplitudenabnahme über die Zeit (Abb.

30A), sowie ein Verlauf, der neben dem Abfall der Amplitude einen häufig sehr vari-

ablen Peak in der Phase der MI zeigt. Da alle Kurvenverläufe, die in den folgenden

Experimenten generiert wurden, sehr stark voneinander abwichen, konnte keine

quantitative Aussage über Unterschiede der Verläufe getroffen werden. Es wurden

Berechnungen von Two-way ANOVAs über den Zeitverlauf durchgeführt. Dabei

wurden jeweils WT-MI-Kurven mit den verschiedenen anderen Konditionen (WT

MI+BIC/Panx1-KO MI/Panx1-KO MI+BIC) verglichen. Es ergaben sich vereinzelte

Werte, die statistisch signifikant voneinander abwichen (Daten nicht gezeigt). Da

diese Methode jedoch nicht ausreichend war, um Unterschiede im Kurvenverlauf adä-

quat zu beschreiben, wurde bei der statistischen Beratung der RUB (Dr. Nicolai Bis-

santz, Lehrstuhl für Stochastik, Fakultät für Mathematik) Rat gesucht. Das Ge-

spräch ergab, dass eine statistische Analyse der verschiedenen Kurvenverläufe nur

durch die Anpassung eines spezifischen Fits möglich sein würde. Diese Art mathema-

tische Entwicklung konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht durchgeführt werden. Da

sich die Kurvenverläufe jedoch offensichtlich in dem Kriterium „mit Peak“ und „ohne

Peak“ unterschieden, wurden die Messungen nach Kurven mit und ohne Peak sortiert.

Dies wurde als das entscheidende, qualitative Kriterium zur Bewertung der Regenera-

tionsfähigkeit der hippocampalen Schnitte verwendet, da vorläufige Untersuchungen

zu verkürzten MI-Inkubationszeiten darauf hindeuteten, dass sich die Feldpotential-

Amplituden der MI-behandelten Schnitte wieder regenerieren können. Daher könnte

der beobachtete Peak als Phase der Regeneration, oder zumindest einer verzögerten

4 Ergebnisse

106

Störung, neuronaler Transmission gedeutet werden. Letztendlich kann neuronale Ak-

tivität unter fortgesetzter metabolischer Inhibition aber für beide Verlaufstypen nicht

wiedererlangt werden. Im Folgenden wird das Auftreten des Peaks als ein Anzeichen

für eine potenziell bessere Suszeptibilität des Netzwerks erachtet, die einen Schutzme-

chanismus gegen Ischämie darstellt. Vereinfacht gesagt: Schnitte, die mehr Kurven-

verläufe mit Peaks aufweisen, können sich besser an Ischämie adaptieren.

Abb. 30: Exemplarische Kurvenverläufe elektrophysiologischer Feldpotenzialmessungen. Exemplarische Beispiele zwei verschiedener Einzel-Feldpotenzialmessungen mit verschiedenen Kurven-verläufen. Zeitverlauf über 70 min, wobei 20 min Grundaktivität des Schnittes in ACSF, 30 min Ap-plikation der MI-Lösung und 20 min Auswaschung der MI-Lösung mit ACSF. Dargestellt sind LO-WESS Berechnungen (GraphPad Prism) aus Einzelamplituden (schwarze Linie) sowie deren Streuung (graue Quadrate). Dabei wird anhand von Berechnungen dem Trend der Daten gefolgt und eine Kur-venanpassung kalkuliert. (A) Relativ flacher Abfall der Amplituden, (B) Kurve mit Peak. Bevor Auswertungen der Feldpotenzialmessungen vorgestellt werden, soll noch ein

Überblick über die zu erwartenden Reaktionen von Ischämie auf das hippocampale

Netzwerk gegeben werden. Insbesondere soll die mögliche Funktionsweise von Panx1

in diesem Zusammenhang erwähnt werden.

4 Ergebnisse

107

4.4.4.1 Zwei Modelle zum Verhalten von Panx1 bei Ischämie

Basierend auf aktuell verfügbaren Literaturdaten zu Panx1 lassen sich zwei mögliche

Modelle diskutieren, die seine Funktion im Hippocampus unter ischämischen Bedin-

gungen erklären: Panx1 als Kanal, über den selektiv ATP ausgeschüttet wird und

Panx1 als unselektiver, großer Ionenkanal. Die Ischämie sensitive CA1-Region des

Hippocampus ist ein Netzwerk aus hauptsächlich Pyramidenzellen und Interneuronen.

Die Pyramidenzellen empfangen exzitatorischen Eingang aus den CA3 Schaffer-

Kollateralen, außerdem können sie durch GABA-Ausschüttung der Interneurone

hemmende Einflüsse erhalten

4.4.4.1.1 Panx1 wirkt als ATP-Ausschüttungskanal

Unter pathologischen Bedingungen kommt es zur exzessiven Ausschüttung von Glu-

tamat und dadurch zur Depolarisation der Pyramidenzellen und Interneurone des

Netzwerks. Panx1-Kanäle werden durch den intrazellulären Anstieg der Ca2+-

Konzentrationen geöffnet und es kommt zur Ausschüttung von ATP. Eine Folge der

ATP-Freisetzung ist die direkte Bindung an purinerge Rezeptoren auf Interneuronen.

Es kommt zur Depolarisation der Interneurone und zur erhöhten synaptischen Inhibi-

tion der postsynaptischen Ziel-Zellen der Interneurone (Bowser & Khakh 2004). Der

Signalweg führt zu einer Hemmung der exzitatorischen Übertragung des Netzwerks.

Diese Mechanismen sind sehr energieaufwändig, stabilisieren aber die zellulären

Netzwerke kurzfristig.

Kommt es in diesem System zum Fehlen von Panx1, wird die Ausschüttung von

ATP vermindert. Eine geringere ATP-Ausschüttung könnte einen vermindernden

Einfluss auf die neuroprotektive Wirkung aktivierter Interneurone haben. Zur Bestä-

tigung dieses Modells sollten Panx1-KO-Schnitte also schlechter auf Ischämie reagie-

ren als WT-Schnitte.

4 Ergebnisse

108

4.4.4.1.2 Panx1 als wirkt als unselektiver Ionenkanal

Der zweite denkbare Prozess wird angestoßen, falls sich der Panx1-Kanal nach der

Aktivierung nicht mehr schließt. In dem Fall kommt es, wie auch schon von Thomp-

son et al. beschrieben (Thompson et al. 2006), schließlich zu einem Verlust der

Membran-Integrität durch die Öffnung des großen Kanals. Dies hätte zur Folge, dass

sämtliche Panx1 exprimierenden Zellen in der Region elektrisch „kurzgeschlos-

sen“ würden und es weder zur weiteren Erregung noch zur Hemmung des Netzwerks

kommen kann. Auch dieser Mechanismus ist prinzipiell neuroprotektiv. Die Zellen

könnten aber auch durch die Öffnung des Kanals sterben, da entweder der ebenfalls

extrem energieaufwändige Prozess der Zelle, das Ionengleichgewicht wiederzuerlangen,

sie zusammenbrechen lässt, oder da der zelluläre Ionenhaushalt so stark aus dem

Gleichgewicht gebracht wird, dass die Zellen dies nicht mehr kompensieren können.

In Anbetracht dieses Modells sollte es Schnitten aus Panx1-KO-Tieren unter ischämi-

schen Bedingungen besser gehen als WT-Schnitten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei beiden Modellen, welche die Funktion

von Panx1-Kanälen unter ischämischen Bedingungen darstellen, der Wegfall von

Panx1 einen messbaren Effekt haben sollte.

4.4.4.2 Panx1-KO-Schnitte sind resistenter gegen Ischämie

Die Messungen der Feldpotenziale hippocampaler Schnitte unter metabolischer Inhi-

bition wurden wie unter 4.4.4.1 beschrieben durchgeführt. Dabei wurden drei ver-

schiedene Ansätze verwendet: WT-Schnitte (Abb. 31A; WT n=19), WT-Schnitte, die

zusätzlich kontinuierlich mit dem Panx1-Blocker MFQ (50 nM) inkubiert wurden

(Abb. 31B; WT MI+MFQ n=14) und Panx1-KO-Schnitte (Abb. 31C; Panx1-KO

n=15). Die Gesamtheit der Kurvenverläufe wurden nach deren Verlauf in eine Grup-

pe „mit Peak“ (rot) und eine Gruppe „ohne Peak“ (blau) unterteilt (Abb. 31, graue

Schattierung). Sämtliche Amplituden wurden auf die Aktivität der jeweiligen Schnit-

4 Ergebnisse

109

te in den ersten 20 min ACSF Messung normiert. Die Restaktivität bezeichnet die

Amplituden, die nach dem Auswaschen der MI-Lösung in den Schnitten messbar sind.

Bei den Messungen an wildtypischen hippocampalen Schnitten (Abb. 31A) fällt auf,

dass es kurz nach der Applikation der MI-Lösung (t= 12,5 min ± 2,5 min) zu einem

erwarteten starken Abfall der Amplituden kommt. Nach 9,5 min ± 2,75 min endet

die Phase des Peaks. Bei der Auswaschung der MI-Lösung kommt es nicht zu einem

Wiedererlangen der elektrischen Aktivität der Schnitte. Die verbleibende Aktivität

streut um ca. 10% der ursprünglichen Amplitude (Abb. 31D). WT-hippocampale

Schnitte, die zusätzlich mit dem Panx1-Blocker MFQ behandelt wurden, zeigen etwas

variablere Kurvenverläufe (Abb. 31B). Dabei beginnt die Peakphase bei 11 min ± 4

min und hat eine Dauer von 11 min ± 5 min. Die Restaktivität nach Applikation der

MI-Lösung beläuft sich unter diesen Bedingungen auf ca. 32,5% der Ausgangsaktivi-

tät. Im Gegensatz zu den beiden anderen zeigen die Messungen an Panx1-KO-

hippocampalen Schnitten die größte Variabilität der Kurvenverläufe, was sich an der

größeren Streuung der Messwerte erkennen lässt (Abb. 31C). Die Peakphase beginnt

hier nach 14 min ± 7 und hat eine Dauer von 9 min ± 7,25 (Abb. 31D). Die

Amplituden, die nach der Applikation der MI gemessen werden können, schwanken

um ca. 25% der Ausgangsaktivität.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass alle Kurven einen der beiden vorgestellten

Verläufe zeigen (vergl. Abb. 30). Das zeitliche Auftreten und die Dauer des Peaks

variiert stark je nach Bedingung. Es ist auffällig, dass die Restaktivität der Schnitte

bei Block der Panx1-Kanäle (32,5%) oder Panx1-KO (25%) im Vergleich zu denen,

die nur mit MI-behandelt wurden, (10%) erhöht ist.

4 Ergebnisse

110

Abb. 31: Feldpotenzialmessungen an WT-/Panx1-KO-/MFQ-hippocampalen Schnitten Messungen von Feldpotenzialen an hippocampalen Schnitten von WT- (A/B) oder Panx1-KO-Tieren (C). Die Schnitte wurden mit dem oben beschriebenen Paradigma über 70 min gemessen. Hier wurde die Gesamtheit der Messungen der jeweiligen Bedingungen aufgetragen und als LOWESS (schwarze Linie - dabei wird anhand von Berechnungen dem Trend der Daten gefolgt und eine Kurvenanpassung kalkuliert) mit SEM (graue Balken) dargestellt. Grau unterlegt sind die nach Kurvenverlauf klassifi-zierten Kurven, dabei sind die Kurvenverläufe mit Peak in rot und diejenigen ohne Peak blau darge-stellt. Da der Panx1-KO nur zwei Kurvenverläufe ohne Peak mit extrem unterschiedlichen Verläufen aufweist, wurden hier beide Kurven dargestellt (C, blau). n ist die Anzahl der gemessenen hippocam-palen Schnitte, alle Experimente wurden an mindestens 5 verschiedenen Tieren durchgeführt. (D) Ta-belle zur Beschreibung der Peakphase der verschiedenen Konditionen.

4 Ergebnisse

111

Dies deutet darauf hin, dass die Blockade von Panx1-Kanälen bzw. deren Verlust

einen aktivitätssteigernden Effekt zeigt. Dieses Ergebnis spiegelt die Ergebnisse der

Zell-Aktivitäts-Studien (s. Abschnitt 4.4.2) wieder. Vergleicht man die verschiedenen

Kurvenverläufe miteinander, fällt auf, dass bei allen drei Bedingungen mehr Kurven

„mit Peak“ generiert werden (Abb. 32). Bei WT-Messungen trat in 63% der Fälle

(n=12/19) ein Peak auf, wohingegen nur bei 37% (n=7/19) der Messungen die Feld-

potenzial-Amplituden einen einfachen Abfall aufweisen. Wird zusätzlich MFQ einge-

waschen, zeigen 57% (n=8/14) der Kurvenverläufe einen Peak, wohingegen 43%

(n=6/14) der Kurven ohne Peak verlaufen. Beim Panx1-KO können die größten Un-

terschiede gefunden werden; hier zeigen 87% (n=13/15) der Messungen einen Kur-

venverlauf mit Peak, während nur zwei Messungen (13%) einen einfachen Abfall auf-

weisen.

Die Tatsache, dass unter allen Konditionen (WT MI/WT MI+MFQ/Panx1-KO MI)

sowohl Schnitte auftauchen, die den Peak aufweisen als auch solche, die keinen Peak

zeigen, deutet darauf hin, dass es zwei Populationen an Schnitten gibt. Eine Popula-

tion reagiert sensitiv auf die ischämischen Bedingungen und zeigt einen schnellen

Verlust der postsynaptischen Aktivität (Kurven ohne Peak). Dabei zeigen nur 13%

der Panx1-KO-Schnitte diesen Verlauf.

Bei der zweiten Population scheint es sich um eine Gruppe zu handeln, deren Verhal-

ten bei MI Panx1-KO abhängig verändert wird. In dieser Population scheint es ein

Zeitfenster zu geben, in dem ein protektiver Effekt greift. Die Art des Effekts lässt

sich anhand der Daten nicht ermitteln. Zur Bestimmung des Zeitfensters bei dem die

Blockade von Panx1 protektiv wirkt, soll in Zukunft mit unterschiedlichen Applikati-

onsdauern der MI-Lösung gearbeitet werden. Aus der Sicht einer möglichen zukünfti-

gen Therapieentwicklung, könnte sich so ein therapeutisches Fenster, identifizieren

lassen, in dem ein Engreifen Sinn machen könnte.

Wird das Auftreten eines Peaks als Phase der Regeneration der Schnitte gedeutet,

kann anhand der Ergebnisse postuliert werden, dass hippocampale Schnitte des

4 Ergebnisse

112

Panx1-KO-Tieres besser auf die ischämischen Bedingungen reagieren als Schnitte aus

wildtypischen Tieren. Diese Ergebnisse bestätigen das unter Abschnitt 4.4.4.1.2 vor-

gestellte Modell, dass Panx1 als unselektiver Ionenkanal wirkt. Wäre der Mechanis-

mus ausschließlich ATP basiert (Abschnitt 4.4.4.1.1) hätten die Panx1-KO-Schnitte

schlechter auf die MI-Bedingungen reagieren müssen als WT-Schnitte. Da dies nicht

der Fall war, besteht nach wie vor die Möglichkeit, dass Panx1 an beiden Mechanis-

men beteiligt ist.

Abb. 32: Verhältnis der verschiedenen Kurvenverläufe nach Kondition. (A) Klassifizierung in Kurvenverläufe „mit Peak“ und „ohne Peak“ verschiedener Messungen (WT, WT MI+MFQ, Panx1-KO) unter ischämischen Bedingungen. Messungen an WT-hippocampalen Schnitten resultierten in 63% Kurven mit und 37% Kurven ohne Peak. Wurden die Schnitte zusätzlich mit MFQ inkubiert, konnten 57% Kurven mit und 43% Kurven ohne Peak gefunden werden. Im Panx1-KO zeig-ten sich die größten Unterschiede im Verhältnis, es wurden 87% Kurven mit und 13% Kurven ohne Peak gefunden. (B) Auftragung der Restaktivität nach Applikation der MI-Lösung. Bei Messungen des WT wird nur ca. 10%, bei WT MI+MFQ 30% und beim Panx1-KO 25% der ursprünglichen Aktivität nach dem Auswaschen der MI-Lösung erreicht. Abschließend lässt sich sagen, das die Ergebnisse der elektrophysiologischen Messun-

gen zwar das zweite Modell der Panx1-Funktion bestätigen, sich jedoch auf Grundla-

ge der Daten nicht ausschließen lässt, dass auch die Funktion von Panx1 als ATP-

Ausschüttungskanal eine Rolle spielt. Zur näheren Untersuchung dieses ersten Mo-

dells wurde ein zweites Experiment konzipiert.

4 Ergebnisse

113

4.4.4.3 Panx1 ist an der MI-induzierten Aktivierung von Interneuronen

beteiligt

Durch die Ausschüttung von ATP kommt es zur Aktivierung eines, in 4.4.4.1.1 vor-

gestellten, durch purinerge Rezeptoren induzierten Signalwegs. Dadurch werden In-

terneurone depolarisiert, und sie übertragen GABA auf Pyramidenzellen. Dieser Pro-

zess wirkt hemmend auf das pathologisch übererregte Netzwerk.

Zur Untersuchung der Beteiligung von Panx1 an diesem Signalweg wurde nun die

durch GABA vermittelte hemmende Wirkung auf Pyramidenzellen durch den GA-

BAA-Rezeptor Antagonist Bicucullin (BIC) unterdrückt. Es kann also durch die Aus-

schüttung von GABA aus den Interneuronen keine Hemmung übertragen werden.

Sollte nun die Öffnung von Panx1-Kanälen diesen protektiven Effekt befördern,

müsste dieser durch die Zugabe von BIC aufgehoben werden.

Das bedeutet, dass WT-Schnitte auf Applikation von MI mit zusätzlichem BIC

schlechter reagieren müssten als auf die alleinige Zugabe der MI-Lösung. Es wird da-

von ausgegangen, dass das Auftreten der Peakphase eine Regenerationsphase der

Schnitte darstellt, die besser auf ischämische Bedingungen reagieren. Demnach sollten

WT-Schnitte in diesem Experiment (im Vergleich zum letzten Experiment) weniger

Messungen aufweisen, die eine Peakphase enthalten.

Im Gegensatz dazu sollten Schnitte des Panx1-KO unverändert bleiben, da auch im

ersten Experiment keine stabilisierende Wirkung durch Panx1-vermittelte ATP-

Ausschüttung vorhanden war. Einen Unterschied im elektrophysiologischen Verhalten

dieser Schnitte auf die Zugabe von BIC sollte nur dann messbar sein, wenn der akti-

vierende Effekt auf die Interneurone Panx1 unabhängig ist.

Es zeigt sich, dass die Zugabe von BIC zusätzlich zur MI-Lösung grundsätzlich nichts

an dem Erscheinungsbild der Kurvenverläufe ändert (Abb. 33). Analysiert man die

Peakphase der WT-Schnitte (Abb. 33A; MI+BIC; n=8) zeigt sich, dass der Peak

nach 10 min ± 1 min beginnt und eine Dauer von 11 min ± 3 aufweist.

4 Ergebnisse

114

Abb. 33: Feldpotenzialmessungen an WT-/Panx1-KO-/MFQ-hippocampalen Schnitten mit BIC. Messungen von Feldpotenzialen an hippocampalen Schnitten von WT- (A/B) oder Panx1-KO-Tieren (C). Die Schnitte wurden mit dem oben beschriebenen Paradigma 70 min gemessen. Dabei wurden durchgehend 10µM Bicucullin (BIC) in ACSF und MI-Lösung appliziert. Hier wurde die Gesamtheit der Messungen der jeweiligen Bedingungen aufgetragen und als LOWESS (schwarze Linie- dabei wird anhand von Berechnungen dem Trend der Daten gefolgt und eine Kurvenanpassung kalkuliert) mit SEM (graue Balken) dargestellt. Grau unterlegt sind die nach Kurvenverlauf klassifizierten Kurven, dabei sind die Kurvenverläufe mit Peak in rot und diejenigen ohne Peak blau dargestellt. n ist die Anzahl der gemessenen hippocampalen Schnitte, alle Experimente wurden an Schnitten aus mindes-tens 3 verschiedenen Tieren durchgeführt. (D) Tabelle zur Beschreibung der Peakphase der verschie-denen Konditionen.

4 Ergebnisse

115

Die Schnitte zeigen nach der Applikation der MI-Lösung eine Restaktivität von 25%

(Abb. 33D). WT-Schnitte, die mit MI+MFQ+BIC-behandelt (Abb. 33 B; n=10)

wurden, zeigen einen Peak nach 14 min ± 6 min mit einer Dauer von 13 min ± 8,5

min. Beim Auswaschen der MI-Lösung zeigen die Schnitte eine Restaktivität von

32,5%. Bei Panx1-KO-Schnitten (Abb. 33C; n=11) kommt es nach 12 min ± 2 min

zum Auftreten des Peaks, der 8 min ± 2 min andauert. Auch hier zeigt sich nach

Applikation der MI eine Restaktivität von 32,5% (Abb. 33D). Wird die Häufigkeit

der Kurvenverläufe „mit Peak“ untersucht, bestätigt sich die Annahme, dass WT-

Schnitte erheblich sensitiver auf die Zugabe von MI mit zusätzlichem BIC reagieren

(Abb. 34A). Es können bei Messungen in denen GABAA-Rezeptoren durch BIC blo-

ckiert werden 38% weniger Kurvenverläufe „mit Peak“ gefunden werden. Es scheint

also einen neuroprotektiven Effekt zu geben, der durch die Aktivierung von Interneu-

ronen vermittelt wird.

Die Kurvenverläufe hippocampaler Schnitte von Panx1-KO-Tieren zeigten 23% weni-

ger Kurvenverläufe „mit Peak“ als beim ersten Experiment. Dieses Ergebnis deutet

darauf hin, dass nicht nur Panx1-Kanäle an der Aktivierung der Interneurone betei-

ligt sind.

Im Vergleich zum ersten Experiment zeigen WT-Schnitte 38%, Panx1-KO-Schnitte

23% weniger Kurven „mit Peak“. Das heißt, dass der neuroprotektive Effekt, der

durch die Aktivierung von Interneuronen besteht, zu 15% Panx1-vermittelt ist.

Normiert man den Gesamteffekt (38%) auf 100%, lässt sich aussagen, dass der

Panx1-vermittelte Effekt an der Neuroprotektion durch Interneurone 39,5% beträgt.

Die verbleibenden 60,5% werden durch andere Mechanismen vermittelt (Abb. 34B).

Der Panx1-bedingte Effekt lässt sich wahrscheinlich auf die Ausschüttung von ATP

und seine Aktivierung von purinergen Rezeptoren auf Interneuronen zurückführen.

Welche die Panx1-unabhängigen neuroprotektiven Mechanismen sind, konnte aus den

hier generierten Daten nicht ermittelt werden. Dazu müssten weitere Experimente

entwickelt werden, die diese Frage beantworten können.

4 Ergebnisse

116

Messungen an WT-Schnitten, bei denen neben MI-Lösung und BIC zusätzlich MFQ

verwendet wurde, unterscheiden sich kaum von den vorangegangenen Messungen oh-

ne zusätzliche Zugabe von BIC. Wie im vorangegangenen Experiment spiegeln die

Messungen, bei denen MFQ als Panx1-Blocker zugegeben wurde, nicht die Ergebnisse

des Panx1-KO wieder.

Abb. 34: Verhältnis der verschiedenen Kurvenverläufe mit BIC. (A) Klassifizierung in Kurvenverläufe „mit Peak“ und „ohne Peak“ verschiedener Messungen (WT, WT MI+MFQ, Panx1-KO) unter ischämischen Bedingungen. Messungen an WT-hippocampalen Schnitten resultierten in 25% Kurven mit und 75% Kurven ohne Peak. Wurden die Schnitte zusätzlich mit MFQ inkubiert konnten 60% Kurven mit und 40% Kurven ohne Peak gefunden werden. Im Panx1-KO zeig-ten sich die größten Unterschiede im Verhältnis, es wurden 64% Kurven mit und 36% Kurven ohne Peak gefunden. (B) Durch GABAerge-Transmission vermittelte Neuroprotektion. 39,5% des Effekts sind Panx1-bedingt, 60,5% des Effekts sind durch andere Mechanismen vermittelt.

Abschließend betrachtet, scheinen beide untersuchten Modelle zur Panx1-Funktion

im Hippocampus bei MI eine Rolle zu spielen. Es liegt nahe zu mutmaßen, dass eine

erste Reaktion auf das pathologische Ereignis der MI eine Ausschüttung von ATP ist.

Die dadurch vermittelte Neuroprotektion könnte über einen purinergen Übertra-

gungsweg vermittelt sein. Kommt es allerdings zu einem dauerhaften Insult und

4 Ergebnisse

117

bleibt der Panx1-Kanal geöffnet, kann die Zelle ihre Funktionen nicht erhalten und

kollabiert.

Weiterführende Aussagen bezüglich dieses Prozesses können nicht anhand der erho-

benen Daten getroffen werden, da die Methode der Feldpotenzialmessungen sie nicht

zulässt. Um die Ionenströme auf zellulärer Ebene eindeutig zu identifizieren, wären

Einzelzellableitungen nötig, die im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt

werden konnten.

4.4.5 Untersuchung zur differenziel len Genexpression von

Regulatoren der synaptischen Plastizität bei MI

In Untersuchungen meiner Arbeitsgruppe zur Charakterisierung des Panx1-KO-

Phänotyps sind diskrete Veränderungen des Transkriptoms hinsichtlich der Expressi-

on von Genen mit funktioneller Bedeutung in der synaptischen Plastizität nachgewie-

sen worden. Es stellte sich daher die Frage, ob ähnliche Veränderungen unter der

Bedingung der MI nachweisbar sind und ob sich aus den potentiellen Veränderungen

Schlussfolgerungen für das beobachtete elektrophysiologische Verhalten ableiten las-

sen. Daher wurde die differenzielle Expression einer Gruppe ausgewählter Kandi-

datengene in Slices von WT- und Panx1-KO-Tieren untersucht. Diese wurden exakt

wie für die elektrophysiologischen Messungen behandelt (20 min in ACSF - Start-

punkt, 20 min in MI-Lösung - Endpunkt), bevor RNA und cDNA präpariert und zum

Messen von Expressionsänderungen durch qRT-PCR eingesetzt wurde.

Es wurden die folgenden sechs Gene untersucht:

HIF1α (hypoxia inducible factor 1α) codiert die Untereinheit eines Transkriptionsfak-

tors, der aus zwei Untereinheiten besteht. Er ist ubiquitär exprimiert und an der zel-

lulären Reaktion auf hypoxisch/ischämischen Stress beteiligt (Sharp & Bernaudin

2004).

4 Ergebnisse

118

GLUT1 (Glucosetransporter 1) ist das Gen, des zuerst entdeckten Glucosetranspor-

ters (Mueckler et al. 1985). Er sorgt durch die basale Glucoseaufnahme für den zellu-

lären Metabolismus. Unter ischämischen Bedingungen kommt es zu reduzierten Glu-

cose-Konzentrationen. GLUT1 Expressionsraten werden unter diesen Bedingungen

erhöht (Yu et al. 2008).

GRM2 und GRM5 codieren die metabotropen Glutamatrezeptoren mGluR2 und

mGluR5. Beide Rezeptoren gehören zur Gruppe der G-Protein-gekoppelten-

Rezeptoren (GPCR) und werden durch einen indirekten metabolischen Prozess akti-

viert. Sie spielen beide essentielle Rollen bei der exzitatorischen synaptischen Trans-

mission im Hippocampus (Anwyl 1999). Es sind verschiedenste Prozesse mit ihrer

Beteiligung beschrieben worden, wie beispielsweise bei dem Effekt der Langzeit-

Potenzierung (LTP), worauf hier aber nicht weitergehend eingegangen werden soll.

ARC (engl. activity-regulated cytoskeleton-associated protein) ist ein Gen, das ein

mit Plastizität assoziiertes Protein codiert. ARC mRNA wird an Synapsen lokal

translatiert und steht im Zusammenhang mit der Endozytose von AMPA-Rezeptoren

(Shepherd et al. 2006)

GABRA5 codiert für den GABAAα5-Rezeptor, der wie alle GABAA-Rezeptoren iono-

trope Cl--Kanäle bildet. Diese vermitteln eine Hyperpolarisation und führen somit

typischerweise zur Hemmung des betroffenen Neurons. Eine erneute Erregung dieses

Neurons durch Depolarisierung wird durch die vorangegangene Hypopolarisierung

erschwert.

Die Versuche wurden so konzipiert, dass in jedem Ansatz drei konstitutiv exprimierte

Gene als Referenzen verwendet wurden. Zum einen wurde das 18S Gen ausgewählt,

welches für den Aufbau von Ribosomen essentiell ist. Außerdem GUSB, das für eine

Hydrolase (β-Glucuronidase) codiert, die sich im Lysosom finden. β- Glucuronide ka-

talysieren komplexe Kohlenstoffe, wie sie an der Zelloberfläche gefunden werden kön-

nen. Sie vermitteln die Modifikation von Proteinen der extrazellulären Matrix. HSP90

(engl. „heat shock protein 90 kDa“) gehört zur Proteinfamilie der konservierten Cha-

4 Ergebnisse

119

perone. Diese sind essentiell zur Faltung der neu translatierten Proteine. HSP90 wird

ubiquitär exprimiert und ist lebensnotwendig für alle Eukaryoten (Wegele et al. 2004).

Die Analyse der durch qRT-PCR generierten Daten erfolgte mithilfe des REST Pro-

gramms (Pfaffl et al. 2002). Dabei wurden Veränderungen der Genexpression zwi-

schen den cDNAs des Start- und Endpunkts analysiert.

Tabelle 8 zeigt die Ergebnisse der REST-Analyse hippocampaler Schnitte sowohl von

WT- als auch Panx1-KO-Tieren. In WT-Schnitten wurde keins der untersuchten Ge-

ne durch MI-Bedingungen signifikant herauf oder herab reguliert. Im Gegensatz dazu

kommt es in Schnitten von Panx1-KO-Tieren zu signifikanten Expressionsunterschie-

den. In diesem Fall werden alle untersuchten Gene bei MI-Bedingungen unterschied-

lich signifikant herunter reguliert. So werden die beiden Gene, die als Indikator für

Ischämie und Hypoxie dienen, HIF1 hochsignifikant (**) und GLUT1 (*) signifikant

herunter reguliert. Die Gene der beiden metabotropen Glutamatrezeptoren GRM2

und GRM5 werden bei in vitro-Ischämie hochsignifikant (***) herunter reguliert.

ARC zeigt eine hochsignifikante (**) und GABRA5 nur eine signifikante Herabregu-

lation.

Bei der Auswertung der qRT-PCR Daten fiel auf, dass die drei Referenzgene in WT-

Schnitten wie erwartet zu allen drei Zeitpunkten konstant exprimiert wurden. Im Ge-

gensatz dazu kam es im Panx1-KO zu einer Regulierung von 18S und GUSB. Ein

Hinweis darauf, dass diese beiden Transkripte durch MI und den Panx1-KO-

Phänotyp beeinflusst werden. Daher konnte nur HSP90 als Referenzgen verwendet

werden.

Die Ergebnisse der Genexpressionsanalyse zeigen ein ungewöhnliches und unerwarte-

tes Zusammenspiel von Panx1-Funktion und Transkriptom auf. Das Ergebnis lässt

vermuten, dass in WT-Tieren die transkriptionelle Kontrolle bei MI entkoppelt ist,

da keines der untersuchten Transkripte reguliert wird. In Panx1-KO-Tieren besteht

aber eine starke Kopplung und bereits nach 20 min kommt es zu einer distinkten Re-

duktion der untersuchten Transkripte. Ob diese Reduktion ursächlich durch reduzier-

4 Ergebnisse

120

te Transkription oder verstärkten Abbau entsteht, kann durch die verwendete Mess-

methode nicht analysiert werden. Es lässt sich aber vermuten, dass bei MI-

Bedingungen der energieaufwendige Prozess der Transkription und Translation ge-

hemmt und so die Expression der Gene reduziert wird.

Tab. 8: Genexpressionsanalyse hippocampaler Schnitte bei MI (WT/Panx1-KO). Nicht verwendete hippocampale Schnitte von Panx1-KO- und WT-Tieren wurden entweder 20 min in ACSF inkubiert (Startpunkt) oder 20 min mit MI-Lösung umspült (Endpunkt). Danach kam es zur Synthese von cDNA und qRT-PCR. Dargestellt ist eine vergleichende Analyse der generierten Daten durch das Analyse Programm REST. Hier werden die Signifikanzen im Vergleich vom Start- zum Endpunkt angegeben. Alle signifikanten Veränderungen waren Herabregulationen in der Genexpressi-on. Für Panx1-KO wurden n=2 Tiere für WT-Messungen n=4 Tiere verwendet. n.s. = nicht signifi-kant; *P<0,05; **P<0,01, ***P<0,001.

5 Diskussion

121

5 Diskussion

5.1 Zusammenfassung In dieser Arbeit wurde die Funktion von Panx1 in einem experimentellen Modell der

Ischämie charakterisiert. Dazu konnte erstmalig mit einem konditionalen Panx1-KO-

Mausmodell gearbeitet werden, was den experimentellen Ansatz zu diesem Zeitpunkt

besonders attraktiv machte.

Panx1 ist in Pyramidenzellen des Hippocampus exprimiert (Bruzzone et al. 2003,

Litvin 2006, Ray et al. 2005, Vogt et al. 2005, Weickert et al. 2005, Zoidl et al. 2007).

Unter Modellbedingungen der Ischämie ändert sich das elektrophysiologische Verhal-

ten dieser Zellen und es treten große Ströme auf, die sich durch CBX blockieren las-

sen (Thompson et al. 2006). Nach diesem ersten Hinweis, dass Panx1 eine funktionel-

le Rolle für neuronale Reaktionen auf ischämische Bedingungen im Hippocampus

spielen könnte, wurde in zwei Folgestudien versucht, den regulatorischen Mechanis-

mus der potenziellen Panx1-Öffnung aufzudecken. Es wurde ein Zusammenhang zu

reaktiven Sauerstoffspezies festgestellt, da Panx1 durch die Entstehung von NO ver-

mehrt geöffnet wird (Zhang et al. 2008). Die zweite Studie beschäftigte sich mit dem

Panx1-P2X7-Komplex und zeigte erhöhte Öffnungswahrscheinlichkeiten durch gerin-

ge extrazelluläre Ca2+-Vorkommen, wie sie bei Ischämie auftreten (Poornima et al.

2011). Drei weitere Studien untersuchten zum einen den molekularen Zusammenhang

von Panx1 und Glutamatrezeptoren (Orellana et al. 2011b, Thompson et al. 2008)

und zum anderen den Einfluss von Panx1 auf das Phänomen der anoxischen Depola-

risierung (Madry et al. 2010). Alle sechs erwähnten Studien zum funktionellen Zu-

sammenhang zwischen Panx1 und neuronaler Ischämie wiesen die Beteiligung von

Panx1 hauptsächlich durch die Verwendung von Blockern nach und konnten somit

nur einen indirekten Nachweis für den Panx1-Kanal erbringen. Die zum Teil wider-

sprüchlichen Ergebnisse lassen sich auf die Verwendung unterschiedlicher Blocker

5 Diskussion

122

zurückführen, von denen alle bis auf MFQ (in geringen Konzentrationen) und Pro-

benecid als Panx1-unspezifisch erachtet werden (s. Abschnitt 1.2.1).

Die essentielle Frage nach der Funktion von Panx1 unter ischämischen Bedingungen

konnte daher nicht eindeutig beantwortet werden, da bis vor kurzem noch keine

Panx1-KO-Tiere zur Verfügung standen.

Die aktuellste Studie zu dem Thema ist zwei Monate alt (Veröffentlichung im De-

zember 2011) und enthält erstmals Daten von Panx1-/--Tieren (Bargiotas et al. 2011).

Die Experimente der vorliegenden Arbeit waren zu dem Zeitpunkt bereits abgeschlos-

sen und wurden mit einem anderen Panx1-KO-Mausmodell generiert. Die Studie von

Bargiotas et al. verwendet meist ein Panx1- und Panx2-Doppelknock-out-Modell. Die

Funktionen des Panx1- (und Panx2-) Kanals konnten damit im Kontext der Ischämie

weiter eingrenzt werden. So zeigten mit metabolischer Inhibition behandelte, kortika-

le Neuronen von Panx1-/-Panx2-/--Mäusen keinen Farbstoffefflux, im Gegensatz zu

entsprechenden Neuronen aus WT-Mäusen. Außerdem war die Infarktgröße bei

Panx1-/-Panx2-/--Tieren in einem in vivo-Modell des Schlaganfalls (Okklusion der

mittleren cerebralen Aterie - MCAO) signifikant reduziert. Diese beiden Ergebnisse

weisen eindeutig eine Beteiligung der Panx1- (und Panx2-) Kanäle im Kontext der

Ischämie nach. Weitere Resultate dieser Studie standen jedoch im Gegensatz zu bis-

her veröffentlichten Ergebnissen. So konnte unter anderem gezeigt werden, dass die

Produktion von IL-1β dort, im Gegensatz zu Studien von Pelegrin et al., Panx1- (und

Panx2-) unabhängig zu sein scheint (Pelegrin et al. 2008, Pelegrin & Surprenant

2006a, Pelegrin & Surprenant 2006b, Pelegrin & Surprenant 2009). Ebenso wird ge-

zeigt, dass ATP nicht Panx1- (und Panx2-) vermittelt aus Astrozyten ausgeschüttet

wird. Auch dies ist widersprüchlich zu vorausgegangenen Arbeiten (Garre et al. 2010,

Iglesias et al. 2009a, MacVicar & Thompson 2010). Beim Phänomen der kortikalen

Streudepolarisierung (engl. „cortical spreading depression“ - CSD) wurde bisher eine

Rolle von Hemikanälen diskutiert (Largo et al. 1997, Margineanu & Klitgaard 2006,

5 Diskussion

123

Nedergaard et al. 1995). Bargiotas et al. konnten nun zeigen, dass dieser Prozess

nicht durch Panx1 und Panx2 beeinflusst wird (Bargiotas et al. 2011).

Die Ergebnisse der vorangegangenen Studien, die sich mit der Rolle von Panx1 bei

Ischämie im Hippocampus befassten, bestätigen die Relevanz der Frage, in welcher

Funktion Panx1 von ischämischen Bedingungen betroffen ist. In der vorliegenden

Arbeit wurden ebenfalls mithilfe eines konditionalen Panx1-KO-Mausmodells drei

verschiedene Fragestellungen im Zusammenhang mit Ischämie geklärt, die in den fol-

genden Abschnitten diskutiert werden. Bevor diese Fragestellungen im Einzelnen be-

arbeitet werden konnten, musste die neue Panx1-KO-Mauslinie zuerst näher charak-

terisiert werden. Dazu wurden für jede verwendete Maus (WT und Panx1-KO) eine

Genotypisierung der DNA und exemplarisch morphologische Analysen des Hippo-

campus durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass WT- und Panx1-KO-

Gehirne sich grob morphologisch nicht unterscheiden. Auch in der Feinstruktur des

Hippocampus konnten keine Unterschiede zwischen WT und Panx1-KO festgestellt

werden (s. Abschnitt 4.3). Da sich WT und Panx1-KO-Tiere auch hinsichtlich ihrer

Vermehrung und Größe nicht unterscheiden, kann zusammenfassend gesagt werden,

dass makroskopisch und mikroskopisch keine Auffälligkeiten zu beobachten sind.

In den folgenden Abschnitten werden die bearbeiteten Fragestellungen im Detail be-

handelt. Zunächst wird die Sensitivität von hippocampalen Neuronenkulturen in Be-

zug auf deren metabolische Aktivität und Zytotoxizität diskutiert. Dazu wurde das

Modell der metabolischen Inhibition an hippocampalen Neuronenkulturen etabliert.

Es konnte geklärt werden, wie sensitiv die Neuronen auf ischämische Bedingungen

reagieren und ob Panx1-Kanäle Einfluss auf die Aktivität und Zytotoxizität der Neu-

ronen haben (s. Abschnitt 5.2).

Die zweite Fragestellung beschäftigte sich mit der grundlegenden elektrophysiologi-

schen Charakterisierung von Feldpotenzialen in hippocampalen Schnitten aus Panx1-

KO- und WT-Mäusen (s. Abschnitt 5.3).

5 Diskussion

124

Bei der dritten Fragestellung handelte es sich um die Expressionsanalyse verschiede-

ner, mit synaptischer Plastizität und Ischämie/Hypoxie assoziierter Gene, die unter

ischämischen Bedingungen reguliert wurden (s. Abschnitt 5.4).

Unabhängig von diesen Fragestellungen bezüglich der Funktion von Panx1 im expe-

rimentellen Modell der Ischämie wurden in einem parallelen Projekt zwei alternative

Spleiß-Varianten von Panx1 charakterisiert. Die beiden Formen wurden kloniert, ihre

mRNA Expression in verschiedenen Geweben analysiert und in Überexpressions-

Experimenten charakterisiert (s. Abschnitt 5.5). Das Ergebnis wird im Kontext der

Generierung der Panx1-KO-Maus diskutiert.

5.2 Panx1-KO-Neurone sind besser vor MI

geschützt Im Folgenden wird die Sensitivität von hippocampalen Neuronenkulturen in Bezug

auf deren metabolische Aktivität und Zytotoxizität diskutiert. In der Vergangenheit

wurden zur Untersuchung des Panx1-Kanals Modulationen des Efflux und der Auf-

nahme von Farbstoffen analysiert. Die Pore des Panx1-Kanals ist so groß, dass Farb-

stoff-Moleküle wie Calcein mit einer Größe von ca. 790 Da bei seiner Öffnung freige-

setzt oder aufgenommen werden können. Drei Studien, die zu Beginn dieser Arbeit

vorlagen, zeigten, dass isolierte hippocampale Neurone unter ischämischem Stress

Calcein-Efflux aufweisen (Thompson et al. 2008, Thompson et al. 2006, Zhang et al.

2008).

In dieser Arbeit wurde zur Etablierung des Ischämie-Modells zuerst eine Charakteri-

sierung der verwendeten hippocampalen Neuronenkulturen anhand von Immunfär-

bungen mit hippocampalen Markerproteinen durchgeführt (s. Abschnitt 4.2.1). Dabei

ließ sich nachweisen, dass die Kulturen sowohl Calbindin-, Calretinin- und Parval-

bumin- als auch GFAP-positive Zellen enthielten. Damit wurde gleichzeitig der

Nachweis erbracht, dass die neuronalen Kulturen Interneurone und Pyramidenzellen

5 Diskussion

125

enthielten, zum Teil aber auch mit Astrozyten durchsetzt waren. Die Morphologie

der jeweiligen Zelltypen konnte auf diese Weise ebenfalls studiert werden. Im An-

schluss daran wurde versucht, die Ergebnisse der Farbstoffefflux Experimente, der

drei oben erwähnten Studien an isolierten Neuronenkulturen zu reproduzieren. Im

Gegensatz zu früheren Berichten waren die hier beschriebenen Neuronenkulturen er-

heblich resistenter gegen den ischämischen Stress und die Ergebnisse variierten daher

stark von publizierten Daten.

Innerhalb der neuronalen Zellpopulationen ließen sich Zellgruppen mit unterschiedli-

cher Morphologie identifizieren, die unterschiedlich stark auf den ischämischen Stress

reagierten (Abb. 19). Da die hier verwendeten hippocampalen Neurone alle Subregio-

nen des Hippocampus repräsentieren, ist dieser Befund erwartungsgemäß. Eine unter-

schiedliche Vulnerabilität ist bekannt. Im Rahmen dieser Studie wurde keine konkre-

te Charakterisierung der Zellen durchgeführt, sondern die Sensitivität der Kulturen

auf CBX (und MFQ) untersucht. Diese war aufgrund der höheren Stabilität der Kul-

turen nicht reproduzierbar (Poornima et al. 2011, Thompson et al. 2006, Zhang et al.

2008).

Eine weitere Studie untersuchte den Effekt von Ischämie auf die Farbstoffaufnahme

in hippocampalen Schnitten. Hier konnte nur bei der Blockierung durch CBX (nicht

durch MFQ) eine leichte Reduktion in der intrazellulären Fluoreszenz, nach verlän-

gerter Dauer des ischämischen Insults (90 min), nachgewiesen werden (Madry et al.

2010). Obwohl diese Studie an hippocampalen Schnitten durchgeführt wurde, sind

ähnliche Effekte wie bei den von mir durchgeführten Farbstoffefflux Studien zu sehen.

Der Effekt der MI führt erst später als von Thompson et al. beschrieben zu einer

Farbstoffaufnahme. Außerdem konnte der Blocker MFQ ebenfalls keinen Effekt auf

die Farbstoffaufnahme generieren.

Eine wahrscheinliche Erklärung für diese unterschiedlichen Ergebnisse liegt in den

verschiedenen Präparationsprotokollen für die Isolation hippocampaler Neurone. Die

hier verwendeten Neurone wurden am postnatalen Tag 1 präpariert, isoliert und vor

5 Diskussion

126

der Verwendung 10-12 Tage in vitro (DIV) in synthetischen Medien ohne Serum und

Zytostatika kultiviert. Diese Isolationsprozedur könnte genau jene Neurone selektie-

ren, welche sich dann auch in den Messungen als besonders stressresistent erweisen.

Im Gegensatz zu dem von mir verwendeten Protokoll arbeiteten Thompson et al. mit

akut isolierten hippocampalen Neuronen von 15-20 Tage alten Wistar-Ratten

(Thompson et al. 2006). Zhang et al. verwendeten hingegen isolierte Neuronen von

E18 Sprague-Dawley-Ratten, die ebenfalls an Tag 10-12 in Kultur verwendet wurden

(Zhang et al. 2008). Trotz der Wahl desselben Untersuchungszeitraums konnten die

Ergebnisse nicht reproduziert werden. Die Präparation der Neurone erfolgte bei

Zhang et al. jedoch auch früher als in dem verwendeten Protokoll dieser Arbeit. Zwei

weitere Studien, auch wie bei Zhang et al. an embryonalen hippocampalen Vorläufer-

zellen, konnten vor kurzem die veröffentlichten Ergebnisse der beiden früheren Farb-

stoffefflux Studien bestätigen. Eine dieser beiden Studien beschäftigt sich mit der

Rolle des Panx1-P2X7R-Komplexes. Dabei wurde durch den Entzug von extrazellulä-

rem Ca2+-Farbstoffefflux aus gemischten Astrozyten- und Neuronenkulturen induziert.

Extrazellulär geringe Ca2+-Konzentrationen treten auch unter ischämischen Bedin-

gungen auf. Es erwies sich, dass sowohl die Blockade von Hemikanälen durch CBX

als auch durch den P2X7R-Antagonisten Brilliant Blue G den Farbstoffefflux blockie-

ren konnte (Poornima et al. 2011). Die andere Studie beschreibt anhand von Farb-

stoff-Aufnahme-Experimenten, dass von Astrozyten ausgeschüttetes Glutamat und

ATP neuronale Panx1-Kanäle aktiviert. Dies kann zum vermehrten Zelltod führen

(Orellana et al. 2011b). Eine weitere Erklärung für die verlangsamte Reaktion der in

der vorliegenden Arbeit verwendeten hippocampalen Neuronenkulturen auf ischämi-

sche Bedingungen könnte in der Wahl des Ischämie-Modells liegen. So konnte ein mit

CBX-blockierbarer Farbstoffefflux sowohl mit einem Modell des Sauerstoff- und Glu-

cose-Entzugs (Thompson et al. 2006), als auch mit einem chemisch induzierten Mo-

dell der metabolischen Inhibition erreicht werden. Bei dieser kommt es zur Blockade

der Atmungskette und Glykolyse der behandelten Zellen (Zhang et al. 2008). In der

5 Diskussion

127

vorliegenden Arbeit wurde ausschließlich mit dem zuletzt erwähnten Modell gearbei-

tet. Die Reaktion der Neurone auf die beiden verschiedenen Formen von ischämi-

schem Stress könnte unterschiedliche zelluläre Mechanismen anstoßen (MacVicar &

Thompson 2010) und Thompson persönliche Kommunikation). Die neuste Studie, die

erstmals die Funktion von Panx1 und Panx2 unter ischämischen Bedingungen mithil-

fe eines Doppel-KO untersuchte, konnte kürzlich erste eindeutige Aussagen treffen

(Bargiotas et al. 2011). So kann die Blockierung mit dem Hemikanal-Blocker CBX,

genauso wie ein vorhandener Panx1- und Panx2-Doppel-KO, die Farbstofffreisetzung

aus kortikalen Neuronen (DIV 10-12) signifikant reduzieren. Sowohl Neurone aus dem

dort verwendeten Panx1-KO als auch aus dem Panx2-KO zeigten nur einen statis-

tisch nicht signifikanten Trend zu reduziertem Farbstoffverlust. Diese Beobachtung

stützt die von Madry et al. und in der vorliegenden Arbeit gefundene Wirkungslosig-

keit von MFQ, welches in sehr geringen Konzentrationen (50 nM) Panx1-selektiv

wirken soll (Iglesias et al. 2009b), im Gegensatz zu dem unspezifischen Hemikanal-

Blocker CBX.

Da sich die hier verwendeten Neurone in ihrer Sensitivität von denen der anderen

Studien unterschieden, wurde statt der Farbstoffefflux-Studien ein anderes Konzept

zur Überprüfung des Ischämie-Modells entwickelt. Eine kürzlich erschienene Studie

verglich mehrere in vitro-Ischämie Methoden anhand von isolierten Neuronenkulturen

(Meloni et al. 2011). Mittels zweier dort verwendeter Testverfahren, einem Zytoto-

xiziätstest und der Bestimmung der metabolischen Aktivität von Neuronenkulturen,

wurde hier das Modell der Ischämie etabliert. Dazu wurden neuronale Kulturen (DIV

10-12) in 96-Well Platten kultiviert und einem einstündigen ischämischen Insult aus-

gesetzt. Nach Regenerationszeiten von 2, 4 und 24 Std. in normalem Medium wurden

zum einen die Zytotoxizität in den neuronalen Kulturen, zum anderen deren metabo-

lische Aktivität bestimmt. Zur erfolgreichen Etablierung des Modells wurde vorerst

mit isolierten hippocampalen Neuronen aus Wistar-Ratten gearbeitet (s. Abschnitt

4.2/3). Anschließend wurden Neurone aus Panx1-KO- und WT-Mäusen verwendet (s.

5 Diskussion

128

Abschnitt 4.4.2/3). Im Folgenden werden nur die Ergebnisse der Messungen an Neu-

ronen aus Panx1-KO- und WT-Mäusen diskutiert.

Es konnte gezeigt werden, dass der ischämische Insult für alle behandelten Kulturen

zu signifikant erhöhter Zytotoxizität im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen führ-

te. Es bestand ein Trend zu reduzierter Zytotoxizität in Panx1-KO-Kulturen oder

solchen, die zusätzlich mit dem Panx1-Blocker MFQ behandelt wurden. Bargiotas et

al. beschreibt, dass der Effekt der Blockade des Farbstoffverlustes durch Ischämie nur

an Neuronen des Panx1- und Panx2-Doppel-KO genauso effektiv ist wie durch CBX

Block (Bargiotas et al. 2011). Sie ziehen die Erklärung heran, dass Panx2 in gewissem

Maße für die Funktion von Panx1 kompensiert und dadurch auch bei Ischämie beein-

flusst wird. Sollte dies der Fall sein, ließe sich der in dem Zytotoxizitäts-Experiment

beobachtete, neuroprotektive Trend des Panx1-Verlustes (Panx1-KO) bzw. Panx1-

Blocks erklären. Demnach sollte unter Verwendung von CBX eine stärkere Neuropro-

tektion zu erreichen sein, was sich in Zukunft leicht überprüfen lässt.

Panx1-KO-Neuronen zeigen signifikant geringere Aktivitätsverluste als WT-Neurone.

Die Untersuchung der metabolischen Aktivität von ischämisch gestressten Neuronen

ergab, dass der Metabolismus von Panx1-KO-Neuronen nicht so stark reduziert ist

wie der von Neuronen, die Panx1 exprimieren. Zwei Std. nach dem ischämischen In-

sult konnten signifikante Unterschiede im MI-induzierten Aktivitätsverlust zwischen

Neuronen aus Panx1-KO- und WT-Tieren gemessen werden. Die beiden späteren

Messpunkte zeigen zwar keine signifikanten Unterschiede zwischen WT- und Panx1-

KO-Neuronen, demonstrieren aber eine schrittweise Minderung der Aktivität der

Neurone ohne Panx1-Kanal. Erst 24 Std. nach dem Insult zeigen Panx1-KO-Neurone

eine ähnlich geringe Aktivität (~60%) wie WT-Neurone sie zu allen drei Messpunkten

zeigen (~55%). Es scheint also eine kritische Phase nach dem ischämischen Insult zu

geben in der die metabolische Aktivität von Neuronen durch einen Block von Panx1-

Kanälen erhalten bleibt. Diese Phase beinhaltet mindestens die ersten beiden Stunden

nach dem ischämischen Insult.

5 Diskussion

129

Bei der Etablierung des Verfahrens zur Messung der metabolischen Aktivität in Rat-

tenneuronen (s. Abschnitt 4.2.4) fiel auf, dass der Blocker MFQ eine starke aktiviäts-

hemmende Wirkung zeigte. Die Literaturrecherche zu dem Thema ergab, dass MFQ

eine inhibitorische Wirkung auf die mitochondriale F0F1-ATP-Synthese hat (Martin-

Galiano et al. 2002, McArdle et al. 2006). Dadurch lässt sich die aktivitätsmindernde

Wirkung von MFQ auf Neuronenkulturen erklären.

Mit der Methode der Messung der metabolischen Aktivität sollen zukünftig weitere

Experimente durchgeführt werden. Zum einen soll die erwähnte kritische Phase zeit-

lich näher eingrenzt werden. Außerdem sollten, neben MFQ, weitere Blocker verwen-

det werden, um die Ergebnisse der Studie von Bargiotas et al. (2011) zu bestätigen.

Damit kann der Effekt eines weiteren, als spezifisch beschriebenen Panx1-Kanal-

Blocker (Probenecid) im Vergleich zu dem allgemeineren Hemikanal-Blocker (CBX)

untersucht werden.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Neurone, deren Panx1-Kanäle durch

MFQ blockiert sind, oder Neurone, die aus Panx1-KO-Tieren stammen, besser vor

ischämischen Stress geschützt sind als WT-Neurone. Sie sind weniger anfällig für zy-

totoxische Prozesse und zeigen einen signifikant geringeren Aktivitätsverlust bei MI.

Diese Ergebnisse bestätigen sowohl die Farbstoffefflux Untersuchungen an Neuronen

der Ratte (Orellana et al. 2011b, Poornima et al. 2011, Thompson et al. 2006, Zhang

et al. 2008), als auch die Ergebnisse der Studie mit dem Panx1- und Panx2- (Dop-

pel)-KO in der Maus (Bargiotas et al. 2011).

5 Diskussion

130

5.3 Panx1 spielt eine Rolle für die Funktion

des hippocampalen Netzwerks bei

Ischämie Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführt Untersuchung zur Veränderung der

Morphologie hippocampaler Schnitte nach Inkubation unter ischämischen Bedingun-

gen wies keine signifikanten Änderungen in der Farbintensität auf. Durch Ischämie

erzeugte Effekte, wie ein Anschwellen der Neurone und deren Aktivitätsverlust und

letztlicher Zelltod, wurden bereits früher beschrieben (Obeidat et al. 2000), konnten

jedoch hier nicht bestätigt werden. In Zukunft sollen weitere Färbungen durchgeführt

und analysiert werden, um die Frage abschließend zu klären.

Der Nachweis der Öffnung von Panx1-Kanälen unter ischämischen Bedingungen

wurde elektrophysiologisch bisher nur indirekt erbracht. Der erste Hinweis war die

Öffnung eines großen Kanals (~530pS) in akut isolierten Pyramidenzellen, in denen

Panx1 exprimiert wird, und der sich durch CBX blocken lässt (Thompson et al.

2006). Eine weitere Studie, die Pyramidenzellen an komplexeren hippocampalen

Schnitten untersuchte, stellte diese Ergebnisse allerdings in Frage. So konnte die

durch Ischämie ausgelöste anoxische Depolarisation der Pyramidenzellen nicht durch

die Applikation der Panx1-Blocker CBX und MFQ inhibiert werden. Im Gegensatz

dazu ließ sie sich durch eine Mischung von Glutamat- und GABAA-Rezeptor-Blockern

(AP5, 7-CK, MK-801, BIC) verhindern (Madry et al. 2010). Dieser Widerspruch lässt

sich auf die Verwendung von nicht Panx1-spezifischen Hemikanal-Blockern zurück-

führen. Um konkrete Aussagen über das Verhalten von Panx1 in Bezug auf Ischämie

machen zu können, ist daher die Analyse von Neuronen aus Panx1-KO-Tieren unver-

zichtbar.

Die vor kurzem veröffentlichte Studie, die mit einem Panx1- (und Panx2-) KO-

Mausmodell arbeitet, führte die Messung von Gleichstrom-Potenzialen (engl. „direct

5 Diskussion

131

current potential“) und Laser Dopplerflusses (engl. „laser doppler flow“ - LDF) an

Mäusen durch, die mit einem in vivo-Modell der Ischämie (MCAO) behandelt wurden.

Diese Messungen konnten in der Vergangenheit die Beteiligung von Cx36 bei der kor-

tikalen Streudepolarisierung nachweisen. Panx1- und Panx2-Kanäle sind aber offen-

bar an diesem Prozess nicht beteiligt (Bargiotas et al. 2011, Margineanu & Klitgaard

2006).

Die Frage nach der Funktion von Panx1 unter ischämischen Bedingungen ist also

noch immer ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde nun mit einem alternativen

Panx1-KO-Mausmodell das elektrophysiologische Verhalten hippocampaler Schnitte

untersucht. Dazu wurden Feldpotenziale unter ischämischen Bedingungen registriert

und die Ergebnisse von hippocampalen Schnitten aus WT- und Panx1-KO-Mäusen

miteinander verglichen. In der Vergangenheit wurden Messungen dieser Art an Neu-

ronen in hippocampalen Schnitten von Ratten durchgeführt und verminderte neuro-

nale Aktivität der CA1-Region beschrieben (Hoffmann et al. 2006). In den hier be-

schriebenen Experimenten wurde mit dieser Methode eine grundlegende elektrophysi-

ologische Charakterisierung des neuen Panx1-KO-Modells im Vergleich zum WT

durchgeführt (s. Abschnitt 4.4.4). Ebenso wurde der Frage nachgegangen, wie Panx1

auf das Netzwerk des Hippocampus unter ischämischen Bedingungen wirken könnte

sowie zwei mögliche Mechanismen vorgestellt. Ein Mechanismus beruht auf einer eher

als indirekt aufzufassenden Rolle von Panx1-Kanälen als unselektive Ionenkanäle mit

hoher Leitfähigkeit. Der andere Mechanismus fasst Panx1-Kanäle als Kanäle auf, die

spezifisch ATP freisetzen. Zudem konnte ein Charakteristikum für ein besseres Adap-

tieren der Schnitte an ischämische Bedingungen beschrieben werden: das Auftreten

einer vorübergehenden Erhöhung (bzw. Erholung) der Feldpotenzialamplitude

(„Peak“) in der Phase der metabolischen Inhibition (MI) (Abb. 30).

Werden Panx1-Kanäle als unselektive Ionenkanäle angesehen, dann müssten sich

Panx1-KO-Schnitte besser an die MI adaptieren können. Die ischämischen Bedingun-

gen könnten zu einer dauerhaften Aktivierung des großen Panx1-Kanals führen. Dies

5 Diskussion

132

hätte kurzfristig zur Folge, dass sämtliche Panx1 exprimierenden Zellen in der Region

elektrisch „kurzgeschlossen“ würden und es weder zur weiteren Erregung noch zur

Hemmung des Netzwerks kommen kann. Auch dieser Mechanismus ist prinzipiell

neuroprotektiv. Langfristig würden die Zellen jedoch durch die andauernde Öffnung

des Kanals sterben. Es käme, wie auch schon von Thompson et al. (2006) beschrieben

wurde, schließlich zu einem Verlust der Membran-Integrität durch die Öffnung des

großen Panx1-Kanals. Dabei könnte der zelluläre Ionenhaushalt so stark aus dem

Gleichgewicht gebracht werden, dass die Zellen dies nicht mehr kompensieren können.

Der extrem energieaufwändige Prozess der Zelle, das Ionengleichgewicht wiederzuer-

langen, würde sie zusammenbrechen lassen. In Anbetracht dieses Modells sollte es

Schnitten aus Panx1-KO-Tieren unter ischämischen Bedingungen besser gehen als

WT-Schnitten.

Die Ergebnisse der durchgeführten Studien bestätigen diese These. Ischämisch inku-

bierte hippocampale Schnitte aus Panx1-KO-Tieren zeigen vermehrt Kurvenverläufe

mit Peak (Abb. 32). Diese Feststellung bestärkt damit die Vorstellung einer eher pas-

siven Beteiligung von Panx1-Kanälen, die aus der ersten Arbeit von Thompson et al.

zu dem Thema resultierte und von verschiedenen Reviews diskutiert wurde

(Bargiotas et al. 2009, MacVicar & Thompson 2010).

Die Ergebnisse der Feldpotenzialmessungen geben jedoch nur Änderungen des Sum-

menpotenzials der CA1-Region der gemessenen hippocampalen Schnitte an. Wie die

einzelnen Zelltypen (hauptsächlich Pyramidenzellen und Interneurone) auf die ischä-

mischen Bedingungen reagieren, kann anhand der Messungen nicht festgestellt wer-

den. In der Literatur finden sich jedoch Hinweise auf das Verhalten der als besonders

Ischämie-sensitiv beschriebenen Pyramidenzellen und den weniger sensitiven Inter-

neuronen (Yamashima et al. 2007). So wurde für intrazellulär gemessene Pyramiden-

zellen eine schnelle Depolarisation unter ischämischen Bedingungen beschrieben

(Tanaka et al. 1997). Eine neuere Studie führte intrazelluläre Messungen an Interneu-

ronen aus der CA1-Region hippocampaler Schnitte durch. Dort zeigte sich, dass die

5 Diskussion

133

Interneuronen zwar normales elektrisches Membranverhalten zeigten, sie jedoch weni-

ger stark erregbar waren als unbehandelte Zellen (Zhan et al. 2007).

Eine weitere Studie beschrieb, dass der Verlust der Erregbarkeit von CA1-Neuronen

zum Teil durch die Blockade des GABAA-Rezeptors kompensiert werden konnte

(Shinno et al. 1997). Dies war der Ansatzpunkt für weiterführende Experimente an

den Schnitten der Panx1-KO-Tiere. Da durch den Befund der ersten Versuchsreihe

nicht ausgeschlossen werden konnte, dass auch die Funktion von Panx1 als ATP frei-

setzender Kanal für das hippocampale Netzwerk unter ischämischen Bedingungen

eine Rolle spielt, wurde ein weiteres Experiment konzipiert, bei dem eine verstärkte

Erregbarkeit des hippocampalen Netzwerks durch die Ausschüttung des hemmenden

Transmitters GABA herbeigeführt wurde (s. Abschnitt 4.4.4.3). So wurde in der Ver-

gangenheit schon mehrfach berichtet, dass Modulationen GABAA-Rezeptor-

vermittelter synaptischer Prozesse neuroprotektive Effekte haben kann. Sowohl eine

Wirkung der Blockade der GABAA-Rezeptoren durch BIC (DeFazio et al. 2009) als

auch der Erhöhung der GABA-Wirkung durch Benzodiazepine (Corbett et al. 2008)

konnte beschrieben werden. Eine Erklärung des neuroprotektiven Effekts von Ben-

zodiazepinen ist, dass durch die Regulation der neuronalen Erregbarkeit die Homöo-

stase der Neurone erhalten bleibt (Galeffi et al. 2004). Genau dieser Effekt würde

ebenfalls erreicht, wenn Panx1 als ATP-durchlässiger Kanal die Ausschüttung von

GABA aus hippocampalen Interneuronen förderte. Dies könnte durch seine Aktivie-

rung unter ischämischen Bedingungen ausgelöst werden. Das Vorhandensein von

Panx1-Kanälen böte in einem solchen Modell (zumindest vorerst) einen Schutz vor

ischämischer Exzitotoxizität.

In den Experimenten dieser Arbeit wurden Schnitte mit BIC, dem spezifischen Blo-

cker der GABAA-Rezeptoren, inkubiert und die Auswirkungen dieser Blockade auf

das Feldpotenzial von Panx1-KO- und WT-Schnitten bei Ischämie-Bedingungen be-

stimmt. Schnitte aus Panx1-KO-Tieren sollten keinen Vorteil gegenüber WT-

Schnitten haben, da der oben für Benzodiazepine beschriebene Mechanismus nicht

5 Diskussion

134

wirken könnte. Im Gegensatz dazu sollten sich aber WT-Schnitte schlechter an is-

chämische Bedingungen anpassen können, da der regulatorische Mechanismus durch

postsynaptische GABAA-Rezeptoren an Pyramidenzellen durch BIC blockiert ist. Wie

postuliert, konnten Schnitte aus WT-Tieren noch schlechter auf die ischämischen Be-

dingungen reagieren als unter Kontroll-Bedingungen ohne BIC. Es war jedoch uner-

wartet, dass sich auch Schnitte von Panx1-KO-Tieren unter Zugabe von BIC schlech-

ter an ischämische Bedingungen anpassen konnten. Dies zeigt zunächst, dass der neu-

roprotektive Effekt durch die Aktivierung von Interneuronen nicht ausschließlich auf

das Vorhandensein von Panx1-Kanälen angewiesen ist. Da jedoch Unterschiede zwi-

schen Panx1-KO- und WT-Schnitten erkennbar sind, lässt sich eine Beteiligung des

Panx1-Kanals an der Funktionalität des hippocampalen Netzwerks nachweisen. So

scheinen die durch BIC blockierten neuroprotektiven Effekte zu 39,5% direkt auf

Panx1 zurückzuführen zu sein (Abb. 34B). Die verbleibenden 60,5% lassen sich auf

andere Faktoren zur Aktivierung von Interneuronen zurückführen. Zum einen könnte

durch die pathologischen Bedingungen ausgeschüttetes Glutamat an Glutamatrezep-

toren auf Interneuronen binden und diese aktivieren (Laezza & Dingledine 2011,

Moga et al. 2002, Schwartz-Bloom & Sah 2001). Eine andere Möglichkeit ist der be-

schriebene, durch ATP-induzierte Weg, nur dass die ATP-Ausschüttung aus anderen

Kanälen erfolgt.

Die Stabilisierung des hippocampalen Netzwerks durch Aktivierung der hemmenden

Interneurone scheint nicht ausschließlich durch ATP-Freisetzung über Panx1-Kanäle

vermittelt zu werden. Wie in der Vergangenheit gezeigt wurde, ist die Ausschüttung

von ATP bei Ischämie auch durch andere Kanäle möglich (Franke et al. 2006,

Orellana et al. 2011a, Orellana et al. 2009). Die Beteiligung insbesondere von Cx43-

Hemikanälen wurde in verschiedenen Studien untersucht (Frantseva et al. 2002a,

Orellana et al. 2010), aber auch Gap Junction-Kommunikation und die Beteiligung

verschiedener Connexine spielen unter ischämischen Bedingungen eine Rolle

(Frantseva et al. 2002b, Oguro et al. 2001). Neben Gap Junction-Kanälen wurden

5 Diskussion

135

aber auch astrozytale Maxi-Anionen-Kanäle beschrieben, über die ATP freigesetzt

werden kann (Liu et al. 2007, Liu et al. 2008). Auch die Inkubation von Astrozyten

mit Glutamat löst ATP-Ausschüttung aus (Queiroz et al. 1997). Die Freisetzung von

Glutamat aktiviert die AMPA- und Kainat-Rezeptoren der umliegenden Astrozyten

und führt somit zur ATP-Freisetzung aus diesen. Dieser Effekt lässt sich durch

DNQX (einem AMPA- und Kainat-Rezeptor Antagonist) oder durch CBX blockieren

(Zhang et al. 2003). Die Beteiligung von Glutamatrezeptoren und oxidativem Stress

an diesem Mechanismus ist lange bekannt und bereits diskutiert worden (Godukhin

et al. 2002, Michaelis 1998, Oguro et al. 1997).

Abschließend ist noch die Rolle von purinergen Rezeptoren im Kontext mit Panx1

und Ischämie zu diskutieren. Purinerge Rezeptoren sind im Zusammenhang mit ver-

schiedenen neuronalen Verletzungen bereits diskutiert worden (Franke et al. 2006).

Unter pathologischen Bedingungen kommt es zur Ausschüttung von ATP. Dies wie-

derum kann zur Induktion von zwei wichtigen Signalwegen führen.

Zum einen kann ATP im Extrazellularraum über Adenosinmonophosphat (AMP) zu

Adenosin abgebaut werden (Ramkumar et al. 2001). Dieses aktiviert in mikromolaren

Mengen die Adenosin1-Rezeptoren (A1R) umliegender Zellen. Dort sind A1R sowohl

an Prä- und Postsynapse als auch an extrasynaptischen Seiten exprimiert. Dadurch

wird auf der präsynaptischen Seite die Fusion synaptischer Vesikel verhindert

(Schwabe et al. 1991) und eine weitere synaptische Glutamat-Ausschüttung kann

verhindert werden (Arrigoni et al. 2005). Dadurch können exzitotoxische Effekte ver-

ringert werden. Somit zeigen Adenosin und A1R eine neuroprotektive Wirkung bei

Exzitotoxizität.

Der zweite durch ATP-Freisetzung initiierte Signalweg betrifft die Bindung von ATP

an purinerge Rezeptoren auf Interneuronen. Dadurch kommt es zur Depolarisation

der Interneurone, und GABA wird aus diesen Ausgeschüttet. GABA-Rezeptoren auf

Pyramidenzellen, den postsynaptischen Ziel-Zellen der Interneurone im Hippocampus,

werden aktiviert. Die Folge ist die synaptischen Hemmung der Pyramidenzellen,

5 Diskussion

136

wodurch die pathologische Übererregung des Netzwerks abnimmt (Bowser & Khakh

2004).

Beide beschriebenen Signalwege werden über purinerge Rezeptoren vermittelt und

führen zu einer Hemmung der exzitatorischen Übertragung des Netzwerks und stabi-

lisieren es. Diese Mechanismen sind zwar sehr energieaufwändig, wirken aber neu-

roprotektiv auf das pathologisch übererregte zelluläre Netzwerk.

Die meisten Studien zu P2-Rezeptoren sprechen ihnen eine neuroprotektive Rolle zu.

Eine Studie zeigte, dass die Hemmung von P2X- und Adenosin-Rezeptoren (A2)

Schutz vor Ischämie induzierter Neurodegeneration bewirken könnte (Sperlagh et al.

2007). Besonders die Rolle der A1-Rezeptoren ist als neuroprotektiv beschrieben

(Coelho et al. 2006, Pearson et al. 2006). Auch für den A3-Rezeptor wurden ähnliche

Effekte beschrieben, die sich jedoch nach längerfristigen ischämischen Insulten von

protektiv zu schädlich verändern können (Pugliese et al. 2007). Die Blockade von

A2A-Rezeptoren zeigte eindeutige neuroprotektive Effekte, wie die Verzögerung der

anoxischen Depolarisation (Pugliese et al. 2009). Sowohl ATP als auch Adenosin

spielen also eine wichtige Rolle bei Ischämie-bedingten Prozessen (Pedata et al. 2007).

Bei der Verwendung des Panx1-Blockers MFQ wurde davon ausgegangen, dass die

Inhibition des Kanals zu ähnlichen Resultaten führt wie Experimente mit Panx1-KO-

Schnitten. Überraschenderweise ließen sich die Ergebnisse nicht eindeutig interpretie-

ren. Dies lässt Rückschlüsse darauf zu, dass der Einsatz dieses Blockers, sogar bei der

geringen Konzentration von 50 nM, Einfluss auf andere Komponenten des Netzwerks

haben kann. Die Eigenschaften von MFQ, die ATPase Aktivität zu inhibieren, wurde

im Abschnitt 5.2 schon diskutiert (Martin-Galiano et al. 2002). Eine weitere Studie

beschrieb den Einfluss von MFQ auf die intrazelluläre Ca2+-Konzentration (McArdle

et al. 2006). Dies sind zwei durch MFQ ausgelöste Mechanismen, die das Verhalten

der hippocampalen Schnitte unter ischämischen Bedingungen beeinflussen könnten.

5 Diskussion

137

Die Tatsache, dass durch den Einsatz von MFQ die Ergebnisse des Panx1-KOs nicht

reproduziert werden konnten, bestärkt die Aussage von Madry et al. (2010) bezüglich

der Verwendung von Panx1-Blockern. Da jedoch keine Experimente mit Glutamat-

Rezeptorblockern durchgeführt wurden, kann seine These, NMDA-Rezeptoren für die

anoxische Depolarisation verantwortlich zu machen, nicht im Kontext neuer Er-

kenntnisse beurteilt werden (Madry et al. 2010).

Abschließend ist zu sagen, dass die in dieser Arbeit durchgeführte Analyse eine erste

funktionelle Charakterisierung des verwendeten Panx1-KO-Mausmodells darstellt.

Panx1-KO- und WT-Schnitte zeigen prinzipiell ähnliche Kurvenverläufe unter ischä-

mischen Bedingungen. Das Charakteristikum des beobachteten Peaks trat im Zeit-

raum von ca. 7 min nach Beginn der MI-Applikation bis zu deren Ende nach 30 min

auf, wobei sich zeigte, dass hippocampale Schnitte des Panx1-KO 24% mehr Kurven

mit diesem Peak aufwiesen als der WT. Vorläufige Untersuchungen zu verkürzten

MI-Applikationszeiten deuten darauf hin, dass das postsynaptische Signal nach kürze-

ren Insulten wieder zurückerlangt werden kann.

Zur genaueren Charakterisierung der molekularen Zusammenhänge sollten in zukünf-

tigen Experimenten verschiedene Blocker verwendet werden, z.B. die Glutamatrezep-

tor-Blocker, die Madry et al. (2010) verwendet haben. Außerdem werden die Experi-

mente zur veränderten Applikationszeiten vervollständigt. Als weiterer Ansatz sollten

Einzelzellmessungen an Pyramidenzellen hippocampaler Schnitte durchgeführt wer-

den. Diese Neurone exprimieren nachgewiesenermaßen Panx1-Kanäle. Demnach soll-

ten sich Neurone aus WT-Tieren unter ischämischen Bedingungen anders verhalten

als solche von Panx1-KO-Tieren. Möglicherweise lassen die Ergebnisse der Einzel-

zellmessungen dann Rückschlüsse auf das Auftreten des beobachteten „Peaks“ zu. So

ließen sich jedenfalls die in diesem Zusammenhang auftretenden Ströme genauer be-

stimmen und beteiligte Kanäle identifizieren

5 Diskussion

138

5.4 Transkriptionelle Veränderungen im

Panx1-KO bei MI Die Untersuchung der Genexpression verschiedener Gene zur synaptischen Plastizität

wurde durchgeführt, um Aussagen über die Funktionsweise des hippocampalen Netz-

werks treffen zu können. Die Ergebnisse zum experimentellen Modell der Ischämie

zeigten zelluläre Reaktionen von Neuronen auf die Ischämie (s. Abschnitt 5.2). Im

Anschluss wurde eine erste funktionelle Charakterisierung des hippocampalen Netz-

werks durchgeführt und die Beteiligung verschiedener Modulatoren bestimmt. Ab-

schließend wird nun, auf Basis des mRNA Levels verschiedener Gene, eine Charakte-

risierung des ischämischen Models diskutiert (s. Abschnitt 4.4.5). Dabei werden zum

einen Ischämie-/Hypoxie-assoziierte Gene diskutiert sowie Gene, die eine Rolle im

Zusammenhang von synaptischer Plastizität spielen. In wildtypischen hippocampalen

Schnitten ließen sich keine Änderungen der Genexpression durch Ischämie im Ver-

gleich zu unbehandelten Schnitten nachweisen. Es folgt die Beschreibung der Ergeb-

nisse der Genexpressionsanalyse von Panx1-KO-Schnitten:

Die Ischämie und Hypoxie assoziierten Gene HIF1α und GLUT1 waren im Panx1-KO

nach ischämischem Stress signifikant herunterreguliert. Dies steht im Gegensatz zu

den bisher veröffentlichten Studien, die zeigen, dass sowohl HIF1α (Chavez et al.

2000, Sharp & Bernaudin 2004, Vazquez-Valls et al. 2011) als auch GLUT1 bei MI

heraufreguliert werden (Chavez et al. 2000, Yu et al. 2008). Die vorliegende Arbeit

verwendet ein anderes Protokoll zur Induktion des hypoxischen Stresses als die früher

veröffentlichten Studien. Es wurden identische Bedingungen wie bei den elektrophysi-

ologischen Messungen angewendet, um zusätzliche Informationen zu den in der Elekt-

rophysiologie gefundenen Ergebnissen zu erhalten. Möglicherweise sind die Unter-

schiede in den experimentellen Ischämie-Protokollen der Grund dafür, dass hier keine

Heraufregulierung der Hypoxiemarker GLUT1 und HIF1α zu verzeichnen ist.

5 Diskussion

139

Ein zweiter Datensatz umfasste Gene der synaptischen Plastizität. Die beiden Gene

der metabotropen Glutamatrezeptoren mGluR2 (GREM2) und mGluR5 (GREM5)

wurden untersucht. In dieser Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass beide Gene,

GREM2 und GREM5, in Panx1-KO-Mäusen, die ischämisch gestresst wurden, hoch-

signifikant herunterreguliert wurden. Das bedeutet, dass die beiden metabotropen

Glutamatrezeptoren mGluR2 und mGluR5 verringert exprimiert werden. Es kommt

also zu einer regulatorischen Anpassung an ischämische Bedingungen auf mRNA

Ebene. Dieser Effekt spiegelt sich funktional ebenfalls in den weiter oben beschriebe-

nen elektrophysiologischen Messungen wider. Dort kommt es durch Ischämie zu ei-

nem Aktivitätsverlust in hippocampalen Schnitten. Beide Ergebnisse lassen sich sehr

gut mit den veröffentlichten Daten zur Funktion von mGluR2 und mGluR5 in Ein-

klang bringen.

Generell ist bekannt, dass sie im Hippocampus exprimiert werden (Hinoi et al. 2001,

Shigemoto et al. 1997). Sie können sowohl prä- als auch postsynaptisch gefunden

werden (Endoh 2004), wobei mGluR2 hauptsächlich präsynaptisch und mGluR5

vermehrt an der Postsynapse lokalisiert sind (Shigemoto et al. 1997). mGluR2 gehört

zur Gruppe II der metabotropen Glutamatrezeptoren, die mit der Inhibition der

cAMP Kaskade verknüpft ist (Bonsi et al. 2005, Chu & Hablitz 2000, Hinoi et al.

2001). mGluR5, der zur Gruppe I der metabotropen Glutamatrezeptoren gehört, ak-

tiviert die Phospholipase C. Dadurch kommt es zum Anstieg des intrazellulären IP3-

Gehaltes, was wiederum einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentrationen zur

Folge hat (Bonsi et al. 2005, Chu & Hablitz 2000, Endoh 2004). Dies sind alles Me-

chanismen, die als Reaktion auf Exzitotoxizität beschrieben sind (Bordi & Ugolini

1999). Es ist bekannt, dass beide Gruppen der metabotropen Glutamatrezeptoren die

Vulnerabilität von Neuronen durch die Regulation von NMDA-Rezeptoren beeinflus-

sen können (Baskys & Blaabjerg 2005). Sie stehen im Zusammenhang sowohl mit

neurotoxischen als auch mit neuroprotektiven Mechanismen (Baskys et al. 2005,

Siliprandi et al. 1992). mGluR2 ist insbesondere in präsynaptische Inhibition invol-

5 Diskussion

140

viert, sodass postsynaptische Potentiale reduziert werden (Chu & Hablitz 2000). Au-

ßerdem reduzieren mGluR2 Agonisten die NMDAR-Aktivierung (Buisson et al. 1996)

und können so Neurone vor Exzitotoxizität schützen (Allen et al. 1999, Ambrosini et

al. 1995, Bruno et al. 1995). mGluR5 assoziiert mit Na+- und K+-Kanälen (Chu &

Hablitz 2000). Sie können durch die Erhöhung der Leitfähigkeit sowohl die Glutamat-

Ausschüttung der präsynaptischen Zelle erhöhen als auch die Ausschüttung inhibie-

ren und spannungsabhängige Ca2+-Kanäle modulieren (Endoh 2004). Sie sind durch

sogenannte PDZ-Proteine in der Nähe von NMDARs verankert (Tu et al. 1999) und

erhöhen somit deren Aktivität (Lea et al. 2002). Die Aktivierung von Rezeptoren der

Gruppe II schützt Neuronenkulturen gegen exzitotoxische Degeneration (Bruno et al.

1995).

Als weiteres Gen, das eine kritische Rolle beim Lernen und bei Gedächtnisprozessen

spielt, wurde ARC (engl. „activity-regulated cytoskeleton-associated protein“) unter-

sucht (McIntyre et al. 2005). In den in dieser Arbeit durchgeführten Genexpressions-

studien konnte eine hoch signifikante Herunterregulation von ARC in ischämisch ge-

stressten Schnitten aus Panx1-KO-Mäusen festgestellt werden. Der soeben dargestell-

te Zusammenhang zu Glutamatrezeptoren (mGluR1/AMPAR) zeigt auch in diesem

Mechanismus eine prinzipielle Anpassung an die Ischämie auf, wie schon bei GREM2

und GREM5. ARC mRNA kann an aktivierten Synapsen gefunden werden, die

NMDAR exprimieren (Gao et al. 2008, Steward et al. 1998, Steward & Worley 2001,

Wallace et al. 1998). Eine 3’ UTR lokalisiert ARC zu neuronalen Dendriten

(Kobayashi et al. 2005, Lyford et al. 1995) oder sogar deren Spines (Yoshimura et al.

2006). Auch eine lokale Transkription von ARC mRNA an Synapsen wurde nachge-

wiesen (Bagni et al. 2000, Yin et al. 2002). Das ARC-Protein hat darüber hinaus

modulatorische Effekte auf den metabotropen Glutamatrezeptor mGluR1 (Plath et al.

2006) und auf AMPA-Rezeptoren (AMPAR) (Shepherd et al. 2006). Es ist an der

Endozytose von AMPAR aus der Plasmamembran beteiligt (Chowdhury et al. 2006).

Dieses wiederum führt konsequenterweise zu reduzierten AMPAR Strömen (Rial

5 Diskussion

141

Verde et al. 2006). Abschließend muss noch erwähnt werden, dass die Aktivierung

von cAMP zu erhöhten ARC-Konzentrationen führt (Bloomer et al. 2008, Waltereit

et al. 2001).

Als letztes Gen wurde die Expression der α5-Untereinheit des GABAA-Rezeptors

GABRA5 untersucht. GABRA5 wurde in Schnitten von Panx1-KO-Tieren, genauso

wie die anderen oben beschriebenen Gene, signifikant herunterreguliert. Es kam je-

doch hier zur schwächsten Modulation. GABAA-Rezeptoren (GABAR) sind die wich-

tigsten Rezeptoren für die Vermittlung postsynaptischer Inhibition im Gehirn. Es

handelt sich um ionotrope Cl--Kanäle, die bei Öffnung in der Regel zu einem Cl--

Ioneneinstrom führen und somit hemmende Einflüsse durch die Generation von

IPSPs vermitteln oder durch einen „Membran-Kurzschluss“ (engl. „shunting inhi-

biton“) die Auslösung von EPSPs verhindern (Campagna-Slater & Weaver 2007,

Costa 1998, Mohler et al. 1990). Die Regulation von GABRA5 bei MI könnte darauf

hindeuten, dass postsynaptische GABAR prinzipiell unter ischämischen Bedingungen

eine wichtigere Funktion übernehmen, als exzitatorische Glutamatrezeptoren. Damit

würde die weniger starke Herabregulation der hemmenden Rezeptoren ebenfalls eine

Anpassung an die Ischämie darstellen.

Als letztes soll hier erwähnt werden, dass die beiden Referenzgene 18S und GUSB

unter ischämischen Bedingungen im Panx1-KO ebenfalls reguliert wurden. Es ist in

der Vergangenheit schon nachgewiesen worden, dass dies für diese beiden Gene unter

ischämischen Bedingungen auftreten kann (Gubern et al. 2009, Nishida et al. 2006),

jedoch bleibt die Frage offen, warum dies nur im Panx1-KO und nicht in wildtypi-

schen Schnitten passiert.

Abschließend lässt sich feststellen, dass die Expressionsanalyse der ischämisch ge-

stressten hippocampalen Schnitte zusätzliche Informationen über das Verhalten der

untersuchten Gene lieferte. Die Ergebnisse der Elektrophysiologie werden um die In-

formationen bereichert, dass wichtige Gene der synaptischen Transmission unter is-

chämischen Bedingungen herunterreguliert werden. Dabei werden Gene, die Auswir-

5 Diskussion

142

kungen auf die glutamaterge Übermittlung haben (GREM2, GREM5, ARC), stärker

herunterreguliert als das Gen, welches die Inhibition des Netzwerks befördert (GAB-

RA5). Es bleibt offen, warum diese Veränderungen nur an Schnitten von Panx1-KO-

Tieren gemessen werden konnten. Dabei kann spekuliert werden, ob das Transkrip-

tom der Panx1-KO-Tiere grundsätzlichen kompensatorischen Veränderungen unter-

liegt oder Panx1 notwendig ist, um auf der Ebene des Transkriptoms stabilisierend zu

wirken. Microarray-Analysen von WT und Panx1-KO werden diese ungeklärte Frage

beantworten können. Außerdem sollte in der Zukunft geklärt werden, warum die mit

Ischämie/Hypoxie assoziierten Gene (HIF1α/GLUT1), anders als in der Literatur

beschrieben, nicht herauf- sondern herabreguliert werden. Möglicherweise ist die Dau-

er des ischämischen Insults so lang, dass bereits zelluläre Mechanismen zur Sicherung

der Energiereserven der Zelle gestartet werden. Die Reduktion der Expression aller

nicht essentiell benötigen Gene wäre hier eine mögliche Erklärung. Eine weitere Er-

klärung basiert auf der Einschränkung der ATP-Freisetzung in Neuronen bei MI im

Panx1-KO. Dadurch könnte die intrazelluläre ATP-Konzentration höher sein als in

WT-Neuronen. Unter dieser Bedingung stünde mehr ATP für intrazelluläre Prozesse

zur Verfügung. Des Weiteren könnten durch die extrazellulär geringeren ATP-

Konzentrationen Signalwege verändert werden. Grundsätzlich ist von einer Störung

komplexer Regelkreisläufe auszugehen, deren Aufklärung im Kontext dieser Disserta-

tion nicht durchgeführt werden konnte.

5.5 Schlussfolgerung zur Rolle von Panx1 bei

Ischämie Wie durch die bisherigen Ergebnisse belegt, spielen Panx1-Kanäle eine Rolle bei der

Ischämie im Hippocampus. Durch die Verwendung eines neuen Panx1-KO-

Mausmodells wurde der direkte Einfluss der Panx1-Kanäle untersucht. Isolierte Neu-

rone von Panx1-KO zeigen hochsignifikant weniger Aktivitätsverlust als wildtypische

5 Diskussion

143

Neurone. Außerdem konnte ein Trend zu weniger Zytotoxizität beobachtet werden.

Beide Ergebnisse bestätigen den beschriebenen, nicht signifikanten neuroprotektiven

Effekt des Panx1-KO in isolierten Neuronen (Bargiotas et al. 2011). In der vorliegen-

den Arbeit wurden elektrophysiologische Messungen an Panx1-KO-hippocampalen

Schnitten durchgeführt. Die beiden Genotypen zeigen deutliche Unterschiede in der

Reaktion auf Ischämie. Zum einen zeigten Schnitte aus Panx1-KO-Tieren vermehrt

Adaptationsmechanismen an Ischämie. Außerdem war ein durch GABAerge-

Transmission vermittelter neuroprotektiver Mechanismus zu ca. 40% durch Panx1

beeinflusst. Diese Ergebnisse bieten Ansätze zur genaueren Untersuchung des Panx1-

vermittelten Rettungseffekts bei Ischämie in der Zukunft.

Panx1 spielt generell und nicht nur im Hippocampus eine wichtige Rolle in ischämi-

schen Zusammenhängen. So konnte 2010 in einer Studie nachgewiesen werden, dass

sich Panx1-Kanäle in Erythrozyten unter Sauerstoffentzug öffnen und ATP freisetzen

(Sridharan et al. 2010). Eine weitere Studie befasste sich mit der Rolle von Gap

Junction und Hemikanälen bei Ischämie im Herz (Johansen et al. 2011). Die Ergeb-

nisse deuten zwar darauf hin, dass Cx43 für den beobachteten protektiven Effekt bei

Ischämie verantwortlich ist, könnten jedoch auch darauf zurückgeführt werden, dass

nur mit dem Panx1-Blocker 10Panx1 gearbeitet wurde und nicht mit einem Panx1-

KO. Man kann darüber spekulieren, dass Panx1 auch hier eine wichtige Rolle spielt,

zumal es in Cardiomyozyten als Kanal wirkt (Kienitz et al. 2011). Ein dritte noch

unveröffentlichte Untersuchung am identischen in dieser Arbeit verwendeten Panx1-

KO-Modell befasst sich mit der Rolle von Panx1 und Ischämie in der Retina (Dvo-

rantchikova et al. PLoS ONE, in revision). Sie konnten die Beteiligung von Panx1 an

zwei Effekten zeigen. Zum einen findet der Farbstoffefflux aus ischämisch gestressten

Panx1-KO-Zellen nicht statt. Der zweite Effekt ist, dass die Inflammasom vermittelte

Aktivierung von Caspase-1 unterdrückt ist. So kommt es nicht zur Produktion von

IL-1β in der Retina. Die Studien in anderen Geweben (Erythrozyten, Herz und Reti-

5 Diskussion

144

na) bestätigen die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Ergebnisse zur Rolle von

Panx1 bei Ischämie.

Zusammenfassend zeigen die hier durchgeführten Untersuchungen und die bereits

veröffentlichten Studien, dass Panx1 eine außerordentlich wichtige Funktion als Ka-

nal unter ischämischen Bedingungen spielt. Sei es seine Funktion als ATP-

Ausschüttungskanal oder die Beteiligung bei der Induktion von inflammatorischen

Prozessen. Damit zeigt sich, dass dieser Kanal als potenzielles Ziel für therapeutische

Ansätze ischämischen Pathologien wie dem Schlaganfall eine Rolle spielen könnte.

5.6 Ausschluss alternativer Panx1-

Spleißvarianten auf Protein-Ebene Chronologisch war es das erste Ziel dieser Arbeit, zusätzliche Panx1-Spleißvarianten

der Maus zu klonieren und näher zu charakterisieren. Aufgrund der Schwerpunkte

dieser Dissertation wird dieser Aspekt aber zum Schluss behandelt. Hintergrund die-

ses Ansatzes war, dass bereits für das humane Panx1 zwei alternative Spleißvarianten

gefunden (Baranova et al. 2004), diese aber nicht näher in ihrer Expression oder

Translation charakterisiert wurden. Die Kenntnis dieser Spleißvarianten hat aber

nicht nur Relevanz hinsichtlich des Funktionsspektrums des Panx1-Genlocus, sondern

ist auch für das Design von KO-Strategien von erheblicher Bedeutung. Hier wurde

eine in der Arbeitsgruppe gefundene, verlängerte Panx1-Variante und eine in der Da-

tenbank erwähnte, verkürzte Panx1-Variante erfolgreich kloniert. Zur expressionellen

Analyse wurden die beiden neuen Varianten mit der bereits bekannten Form vergli-

chen und es konnten gewebespezifische Expressionsunterschiede gefunden werden. Die

Überexpression der Varianten in Zellkulturmodellen und die Charakterisierung mit

immunhistochemischen Methoden führten hingegen nicht zur Detektion einer spezifi-

schen zellulären Lokalisation der beiden neuen Panx1-Varianten. Weiterführende Ex-

pressionsanalysen bestätigten das Fehlen eines überexprimierten Proteins. Diese Er-

5 Diskussion

145

gebnisse legten nahe, dass es sich bei den beiden neuen Panx1-Varianten um aus-

schließlich auf mRNA Ebene vorhandene Formen handelt, die keine Bedeutung als

Protein haben. Eine für andere Gene bekannte transkriptionelle Regulation (Silveyra

et al. 2011) der tatsächlich transkribierten Panx1-Form konnte nicht festgestellt wer-

den. Da beide Spleißvarianten durch die Deletion der Exons 3 und 4 in der konditio-

nalen Panx1-KO-Maus nicht entstehen können, kann ein Einfluss dieser Transkripte

auf den Phänotyp ausgeschlossen werden.

6 Ausblick

146

6 Ausblick In dieser Arbeit konnten auf Grundlage eines neuen konditionalen Panx1-KO-

Mausmodells erste konkrete Aussagen über die Funktion von Panx1 in einem experi-

mentellen Modell der Ischämie getroffen werden. Zusammengefasst unterstützen die

hier vorgelegten Daten eine neuroprotektive Rolle des Panx1-KOs, werfen aber auch

im erheblichen Maße neue Fragen auf.

Die Versuche zur Bestimmung der metabolischen Aktivität von hippocampalen Neu-

ronenkulturen sollen um die Messungen mit den Blockern CBX und Probenecid er-

gänzt werden. Außerdem soll anhand von Messungen weiterer Zeitpunkte die kriti-

sche Phase näher charakterisiert werden in der Panx1-Blockade (oder Ablation) einen

Effekt auf die metabolische Aktivität der Zellen hat.

Zur näheren Bestimmung der Rolle von Panx1 im hippocampalen Netzwerk ließen

sich in Zukunft zwei verschiedene Ansätze wählen. Zum einen die weitere Verwen-

dung des Modells der Feldpotenzialmessungen. Dabei sollten die vorläufigen Experi-

mente zu verkürzten MI-Applikationszeiten vervollständigt werden. Anhand dieser

Ergebnisse lässt sich das kritische Zeitfenster näher charakterisieren, in dem die Inhi-

bition von Panx1-Kanälen einen Einfluss auf die Aktivität der hippocampalen Schnit-

te hat. Außerdem könnten weitere Blocker hippocampaler Rezeptoren verwendet

werden und so exzitatorische von inhibitorischen Komponenten getrennt werden. So

könnte z.B. der Block der glutamatergen Rezeptoren am Panx1-KO andere Ergebnis-

se erzielen als bei der Untersuchung von Madry et al. (2010).

Das Messen von Feldpotenzialen bietet einen guten Überblick über das elektrophysio-

logische Verhalten von Schnitten. Sie lässt jedoch keine konkreten Aussagen in Bezug

auf intrazelluläre Vorgänge zu. So sollte ein zweiter Ansatz darin bestehen, intrazellu-

läre Ableitungen an Pyramidenzellen hippocampaler Schnitte durchzuführen. Unter

Verwendung des Panx1-KO-Mausmodells könnten diese Messungen in dem nun etab-

lierten Modell der Ischämie schnell zu Resultaten führen. Von besonderem Interesse

6 Ausblick

147

ist der in den Experimenten dieser Arbeit entdeckte „Peak“ in den Messungen der

Feldpotenziale. Hier wurde diese Erscheinung als ein mögliches Zeichen der temporä-

ren zellulären Anpassung an die Ischämie gedeutet. Eine weitergehende Charakterisie-

rung lassen die Daten der Feldpotenziale aufgrund ihres Summencharakters nicht zu.

Bei intrazellulären Ableitungen an Pyramidenzellen und/oder Interneuronen ließe sich

der Peak genau charakterisieren.

Des Weiteren lohnt die weitere Investigation der Genexpression anhand des hier etab-

lierten Modells. Die durchgeführten Analysen zeigten bereits signifikante Änderungen

in wichtigen Genen der Plastizität. Diese Gene sollten neben der bereits durchgeführ-

ten Endpunktanalyse zu verschiedenen Zeitpunkten der Ischämie untersucht werden.

Wie gestaltet sich die Expression in der Phase, die in der Elektrophysiologie als

Adaptationsphase an die Ischämie gedeutet wurde? Außerdem könnten weitere Gene,

die im Kontext der Ischämie relevant sind, mit dieser Methode analysiert werden.

Von besonderem Interesse wären Gene, die funktionell sowohl im Zusammenhang mit

Ischämie als auch mit Panx1 stehen. So könnten Gene des IP3-Signalwegs untersucht

werden. Sie sind mit dem Anstieg intrazellulärer Ca2+-Konzentrationen aus dem ER

bei Ischämie assoziiert (Bickler et al. 2009) und haben somit auch einen Einfluss auf

die Öffnung von Panx1. Außerdem könnten auch Gene im Zusammenhang mit dem

zellulären Energiehaushalt, dem Zytoskelett oder reaktiven Sauerstoffspezies unter-

sucht werden. Idealerweise würde man eine Microarray-Studie durchführen, wie be-

reits für das Cx43 und Cx32 erfolgte (Iacobas et al. 2005).

Das Verständnis der zellulären und molekularen Grundlagen von pathologischen Vor-

gängen ist eine Voraussetzung für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze.

Die Untersuchung der Mechanismen des Panx1-Kanals, unter ischämischen Bedin-

gungen, ist in dem Zusammenhang von großer Bedeutung. So bilden sie eine essentiel-

le Basis für die Evaluierung, ob Panx1 ein Kandidat in Hinsicht auf therapeutische

Interventionen bei Ischämie ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten an, dass es nach

einem ischämischen Insult eine kritische Phase gibt, in der die Inhibition von Panx1-

6 Ausblick

148

Kanälen einen protektiven Effekt auf Neurone haben könnte. Aus diesen Ergebnissen

könnten sich therapeutische Ansätze entwickeln lassen, um auf den Prozess der Is-

chämie einzuwirken. Das Verständnis für die Mechanismen weit verbreiteter Patholo-

gien, wie den Schlaganfall, ist essentiell für die Medizin; so kann die Grundlagenfor-

schung einen Beitrag dazu leisten.

7 Zusammenfassung

149

7 Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurde eine Charakterisierung von zwei neuen Panx1-

Spleißvarianten der Maus durchgeführt, und zwar eine verlängerte (mPanx1ext) und

eine verkürzte Form (mPanx1tru). Deren mRNA Level wurde in verschiedenen Ge-

weben mit dem Wildtyp (mPanx1wt) verglichen. Alle drei Formen zeigten je nach

Gewebetyp unterschiedlich hohe Expressionsraten. Eine Überexpressionsanalyse in

N2a-Zellen ergab jedoch, dass die beiden neuen Panx1-Proteine keine distinkte zellu-

läre Expression aufwiesen und vermutlich kurz nach der Expression wieder degradiert

wurden. Dieses Resultat konnte durch eine Western Blot-Analyse bestätigt werden.

Die beiden neuen alternativen Spleißformen von Panx1 erfüllen nach den Erkenntnis-

sen dieser Arbeit keine mit den zur Verfügung stehenden Methoden nachweisbare

Funktion(en) in der Maus.

Der Schwerpunkt dieser Arbeit behandelte die Etablierung eines experimentellen Mo-

dells der Ischämie mithilfe der metabolischen Inhibition und eine anschließende Ana-

lyse der Panx1-Funktion. Dazu wurden isolierte Neuronenkulturen ischämisch ge-

stresst und deren Aktivität und Zytotoxizität bestimmt. Neurone von Panx1-KO-

Tieren und mit MFQ blockierte WT-Neurone waren unter ischämischen Bedingungen

während einer frühen Phase besser geschützt als WT-Neurone.

In einem zweiten Ansatz wurde das elektrophysiologische Verhalten von WT- und

Panx1-KO-hippocampalen Schnitten anhand von Feldpotenzialen unter ischämischen

Bedingungen gemessen. Auch hier bestätigte sich ein protektiver Effekt des Panx1-

KO-Phänotyps, da dieser weniger sensitiv auf die applizierten ischämischen Bedin-

gungen reagierten als WT-Schnitte. Der regulierende Effekt, den Interneurone durch

GABA-Ausschüttung im ischämischen Kontext haben, war zu ca. 40% durch das

Vorhandensein von Panx1-Kanälen vermittelt. Diese beiden Ergebnisse bestätigen,

dass Panx1-KO-Schnitte sich besser an Ischämie anpassen können als solche, die den

Panx1-Kanal exprimieren.

7 Zusammenfassung

150

Zuletzt wurde eine Expressionsanalyse hypoxie- und plastizitätsrelevanter Transkrip-

te an hippocampalen Schnitten mit und ohne MI durchgeführt. Diese Analyse belegt,

dass der Panx1-KO zu einer signifikanten Veränderung des Transkriptoms bei MI

führt.

Abschließend lässt sich nach der Auswertung aller vorgelegten Experimente und der

aktuellsten Literatur sagen, dass von einem regulativen Effekt des Panx1-Proteins auf

das hippocampale Netzwerk bei Ischämie auszugehen ist. Unter Berücksichtigung der

bekannten biophysikalischen Kanaleigenschaften, Expressionsorte und der (pa-

tho)physiologischen Relevanz kann geschlussfolgert werden, das Panx1 ein potentiel-

les Ziel für eine therapeutische Intervention frühzeitig nach einer ischämischen Atta-

cke ist. Die hier vorgelegte Arbeit ist ein Baustein für die weiterführende, biomedizi-

nisch relevante Aufklärung der Funktion(en) von Panx1 im Nervensystem.

7 Zusammenfassung

151

Summary In this paper a characterization of two new splice variants of mouse Panx1 was

conducted, an extended (mPanx1ext) and a truncated form (mPanx1tru). Their

mRNA expression in various tissue was compared to that of wildtype Panx1

(mPanx1wt). All three forms showed different expression levels depending on tissue

type. Over-expression analysis in N2a cells showed that the two new Panx1 proteins

showed no distinct cellular expression. Presumably they were degraded shortly after

the translation. This result was confirmed by Western blot analysis. The two new

alternative splice forms of Panx1 meet no detectable function(s) in the mouse,

according to the knowledge this work.

The focus of this thesis was the establishment of an experimental model of ischemia

using metabolic inhibition and subsequent analysis of Panx1 function. Thus isolated

neuronal cultures were stressed by ischemia and their metabolic activity and cytotox-

icity was determined. Neurons of Panx1-KO animals and WT neurons blocked by

MFQ under ischemic conditions during an early phase were better protected than

WT neurons. In a second approach, the electrophysiological behavior of WT and

Panx1-KO hippocampal slices were measured under ischemic conditions on the basis

of field potentials. This approach confirmed a protective effect of the Panx1-KO

phenotype, since these slices respond less sensitively on the applied ischemic

conditions compared to WT sections. The network regulating effect of GABAA recep-

tors in ischemic conditions was mediated about 40% by the by the presence of Panx1

channels. These two results confirm that Panx1-KO sections can adapt better to

ischemia than those expressing the Panx1 channel.

Finally an expression analysis of hypoxia and plasticity related transcripts was

performed on hippocampal slices incubated with and without MI. This analysis shows

that the Panx1-KO leads to a significant destabilization of the transcriptome under

MI.

7 Zusammenfassung

152

In conclusion after evaluating all submitted experiments and the recent literature, a

regulatory effect of Panx1 protein on the hippocampal network under ischemia can be

described. Taking into account the known channel biophysical properties, expression

pattern and (patho)physiological relevance, it can be concluded that Panx1 a poten-

les target for therapeutic intervention early after an ischemic attack. The work

presented here is a building block for further, more clinically relevant biomedical

understanding the function(s) of Panx1 in the nervous system.

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Anhang

A1 Plasmide

A1.1 pCR3.1 mPanx1wt

Anhang

ii

A1.2 pCR3.1 mPanx1ext

Anhang

iii

A1.3 pCR3.1 mPanx1tru

Anhang

iv

A1.4 pRK5 mPanx1wt

Anhang

v

A1.5 pRK5 mPanx1ext

Anhang

vi

A1.6 pRK5 mPanx1tru

Anhang

vii

A1.7 pEGFP-N3 mPanx1ext

Anhang

viii

A2 Western Blot Analyse des Panx1-KO

Lebenslauf

ix

Lebenslauf

Persönl iche Daten

Name Meike S. Roux

Geburtsdatum 15.08.1983

Geburtsort Münster (Westf.)

Nationalität deutsch, schweizerisch

Studium/Promotion

Ruhr-Univers ität Bochum,

Fakultät für Mediz in

04/2008 – 04/2012

Promotion

Titel der Dissertation „Charakteris ierung von Pannexin1 in

e inem experimentel len Model l der Ischämie“

Abteilung für Neuroanatomie und molekulare Hirnforschung

Westfä l ische Wilhelms

Univers ität Münster, Fa-

kultät für Biologie

10/2006 – 11/2007

Diplom

Abschluss ECTS grade A (ausgezeichnet)

„Analyse des Drosophi la neurexin IV Gens“

Abteilung für Neurobiologie und Verhaltensforschung

Westfä l ische Wilhelms

Univers ität Münster, Fa-

kultät für Biologie

10/2002 – 09/2006

Hochschulstudium

Biologisches Hauptfach Genetik (ECTS grade A, ausgezeichnet),

Biologisches Nebenfach Zellbiologie und Physiologie (ECTS grade

A, ausgezeichnet), Nicht biologisches Nebenfach Biochemie

(ECTS grade B, sehr gut)

St ipendien

Ruhr-Univers ität Bochum,

Research School

07/2008 – 07/2011

„RUB-Grant“ Promotionsstipendium, gefördert im Rahmen der

Exzellenzinitiative des Bundes und der Länder

Berufl iche Erfahrungen

Ruhr-Univers ität Bochum,

Fakultät für Mediz in

04/2008 – 03/2012

Wissenschaft l iche Hi l fskraft/Mitarbeiter in

Abteilung für Neuroanatomie und molekulare Hirnforschung

Lebenslauf

x

Westfä l ische Wilhelms

Univers ität Münster, Fa-

kultät für Biologie

02/2005 – 06/2007

Studentische Hi l fskraft

Abteilung für Neurobiologie und Verhaltensforschung

Zusatzqual i f ikationen

AGCT Bender & Kauch

GbR

Staatlich anerkannte Fortbildungsveranstaltung für den Projektleit-

erschein

Neurowissenschaft l iche

Gesel lschaft e.V.

Methodscourse: „Cerebral Ischemia: In vivo and in vitro mod-

els“ (Prof. Dr. Dirnagl, Carité, Berlin)

Carl Zeiss Micorimaging

GmbH

Zeiss on Your CAMPUS – Introduction into Imaging Systems

Kongresse mit eigener Präsentation

Ruhr-Univers ität Bochum

08/2011

„From Electrical Synapses to the Clinics“

Albert-Ludwigs-

Univers ität Freiburg

12/2009

International Symposium „Structure and Function of Synapses“

Ruhr-Univers ität Bochum

11/2009

„ Section Day Life Sciences 2009 - The Art of Nature“

Nederlands Inst ituut voor

Neurowetenschappen

Amsterdam

11/2008

4th Amsterdam Connexin Meeting

Publ ikationen

Molecular Biology

of the Cel l

first published 08/2011

„A Role for Kinesin Heavy Chain in Controlling Vesicle Transport

into Dendrites in Drosophila“

Schimmelpfeng Henthorn K, Roux M, Herrera C, Goldstein L

Danksagung

xi

Danksagung Ich danke: Prof. Dr. Georg Zoidl für die Möglichkeit an diesem spannenden Thema arbeiten zu können. Ich schätzte seine permanente Bereitschaft mir mit Rat und Tat zur Seite zu stehen aber auch seine Ermutigungen meine eigenen Ideen zu entwickeln und durch-zusetzen. Ich fühlte mich von ihm immer unterstützt und ermutigt. Es hat Spaß ge-macht mit ihm zu arbeiten, zu diskutieren und von ihm betreut zu werden. Prof. Dr. Michael Hollmann für die Zweitbetreuung dieser Arbeit und viele hilfreiche Kommentare bei den Besprechungen während Promotionsverlaufs. Prof. Dr. Rolf Dermietzel für die Möglichkeit meine Studien in seinem Labor durch-führen zu können. Außerdem für viele ergebnisreiche Diskussionen während der Laborseminare. PD Dr. Matthias Schmidt für seine Hilfe und Unterstützung bei der Kollaboration in der Elektrophysiologie und viele spannende Diskussionen darüber und darüber hinaus. Dr. Elisabeth Petrasch-Parwez für ihre Kollaboration und Engagement mir die Morphologie näher zu bringen und mich bei allen Fragen dazu zu unterstützen. Dr. Stefanie Bunse für ihre Betreuung bei meinem ersten Projekt und all ihre Unterstützung, aufbauenden Worte und Hilfe auf dem Weg. Jun.-Prof. Dr. Nora Prochnow für eine Einführung in Feldpotenzialmessungen. Der Research School, insbesondere Frau Dr. Justus, für die Entwicklung vieler weiterer Qualifikationen die über das Fachgebiet hinaus gehen. Außerdem für die Fi-nanzierung und organisatorische Unterstützung. Allen TAs der Abteilung Neuroanatomie für die Möglichkeit in einer gut strukturier-ten und ordentlichen Laboratmosphäre mit viel Kollegialität zu arbeiten.

Danksagung

xii

Insbesondere danke ich Sabine Peukert und Christiane Zoidl für all ihre Hilfe bei technischen Fragen in der Molekularbiologie und die gute Atmosphäre am Nachbar-tisch. Außerdem Sabine Schreiber-Minjoli für ihre Hilfe bei Zellkultur Experimenten. Jeannette für Primärkulturen, Hans Werner und Marlen für Unterstützung bei der Immunhistologie. Ulrike Becker und Monika Birkelbach für all die Verwaltungsarbeit. Dr. Horst Lohmann für die Möglichkeit das Synchroslice System in Castrop-Rauxel bei Lohmann Research zu benutzten. Markus Wüthrich für seine Hilfe die Mac´s am Laufen zu halten. Helga Schulze für wunderschöne Abbildungen. PD Dr. Carsten Theiss Hilfe mit LSM und Dr. Verena Aliane mit dem MPS. Der Vogelsang Stiftung für eine Anfangsfinanzierung. Meinen Mitstreitern um die Doktorwürde Katherin, Sarah und Serra, aber auch Stephan und Arndt. Es war toll mit euch zu arbeiten, ich habe es sehr genossen. Ich danke meiner Familie für die Unterstützung jeglicher Art, die ich seit jeher privilegiert bin zu erhalten. Ihr habt mir immer das Vertrauen vermittelt die Ziele zu erreichen, die ich mir stecke und mich auf dem Weg bestmöglich unterstützt. Danke. Ich danke meinen Freunden für die Bereicherung meines Lebens und den Ausgleich zur Arbeit. Insbesondere Danke ich Krissi für ihre germanistischen Fähigkeiten, die sie in diese Arbeit hat einfließen lassen und Inga, die mir ihren grafischen Blick für diese Arbeit schenkte und InDesign beigebracht hat. Als letztes Danke ich der wichtigsten Person in meinem Leben – Nora. Ohne Worte.

Erklärung

xiii

Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und bei keiner anderen

Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel ver-

wendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um

sechs in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare. Weiterhin erkläre ich,

dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in keinem Fall in-

haltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Bochum, den 01.02.2012

_____________________________________

Meike S. Roux

(Unterschrift)