Chemisch-Analytische Methodenin der Pflanzenphysiologie

• Qualitative Analytik nennt man Nachweis

• Aufgabe der (Bio)Chemischen Analytik ist die quantitative Bestimmung von Stoffen (Analyten)

• Spurenanalytik (Kleinstmengenanalyse)

• Test (halbquantitative Analyse)

Verfahren, Methode, Prinzip

Proben-nahme

Vor-bereitung Messung Analytische

Information

Aus-wertung

Unter-suchungs-

Objekt

Analyseverfahren

Analysemethode

Prinzip

G ravim etriez .B . W ä g u n g en

Volum etriez .B . T itra tion en

N a ßchem ischeMethoden

Elek troanalytischeMethoden

O ptischeMethoden

z .B . S p ek troskop ie

Trennm ethodenz .B . C h rom atog rap h ie

Instrum entelleMethoden

Chemische Analytik

Kriterien zur Beurteilung einer Methode

• Spezifität (Selektivität)

• Empfindlichkeit (Nachweisgrenzen)

• Genauigkeit & Reproduzierbarkeit (accuracy & precision)

Selektivität

• Selektivität hängt von möglichen Störungen durch andere Probe-Inhaltsstoffe ab.

Abtrennung von störenden Stoffen spezifischere Methoden

• Begriff: Matrix!

EmpfindlichkeitFähigkeit der Methode zwischen kleinen Differenzenin der Konzentration des Analyten zu unterscheiden

abhängig von der Steigung der Kalibrationsgeraden

Nachweisgrenze:

Konzentration des Analyten (c)

Meß

-Sig

nal (

S)

S = m.c + SL

N = SL + 3.StabL

Genauigkeit & Reproduzierbarkeit

• Genauigkeit (accuracy)sagt aus, wie nahe ein Meßwert dem tatsächlichen Wert kommt

• Reproduzierbarkeit (precision)sagt aus wie übereinstimmend wiederholte Messungen sind

Systematischer & Zufälliger Fehler

Genauigkeit

Reproduzier-barkeit

optimal

optimal

ZufälligerFehler

gut

schlecht

SystematischerFehler

gut

schlecht

Die Kalibration

• Leerwerte (blanks)• Standards (externe, interne)• Kalibrationsbereich• Kontrollen

Prozess, mit welchem man die Gerätewerte mit den absoluten Mengen der zu bestimmenden

Substanz in Übereinstimmung bringt.

Leerwerte

• Leerwert ist Matrix ohne Analyt

• Nullpunktbestimmung für jedes analytische Gerät notwendig

• Man unterscheidet:- Reagenzienleerwerte (z.B. Photometrie)- Blindwerte (Grundwert, z.B. Enzymatik)

StandardsProben bekannter Konzentration, die man zur Kalibrierung einer Methode einsetzt, nennt man Standards!

Standards sollten in Matrix hergestellt sein.

• Externe Standards: die zu bestimmende Substanz wird chemisch rein eingesetzt

• Interne Standards: eine ähnliche Substanz, die man zusetzt und die als Bezugsgröße verwendet wird

Kalibrationskurve

Konzentration des Analyten (c)0 4 8 12 16

Inst

rum

ente

n-A

nzei

ge

0

4

8

12

16

Kalibrations-punkte

Arbeitsbereich

Konzentration des Analyten (c)0 4 8 12 16

Inst

rum

ente

n-A

nzei

ge0

4

8

12

16

Nichtlineare Kalibrationskurve

Kalibration1. LeerwertM + R Messung Instrumenten- Auf Null stellen

Anzeige

2. StandardsS1 + M + R Messung Instrumenten- Kalibrations-S2 + M + R Anzeige kurve

3. ProbenP1 + M + R Messung Instrumenten- Werte-P2 + M + R Anzeige berechnung

M, Matrix; R, Reagentien; S1, Standard 1; P1, Probe 1.

Kontrollen• Um eine Methode zu überprüfen sollte

regelmäßig eine Probe bekannter Konzentration gemessen werden.

• Biologische Referenzmaterialien

• Schwierig bei Methoden die keine pool-Größen messen, sondern Prozesse (etwa Enzymaktivitäten)

Berechnungen 1: Konzentrationen

• Masse (kg)c = m / v (Konzentration = Masse / Volumen)

z.B.: mg L-1, µg cm-3, mg mL-1, etc

• Stoffmenge (Mol)

c = n / v (molare Konzentration = Mol / Volumen)

z.B.: mol L-1 (M), mmol L-1 (mM), µmol mL-1 (mM), µmol L-1 (µM)

Berechnungen 2: Verdünnungen

! das Produkt aus Konzentration mal Volumen vor der Verdünnung entspricht dem Produkt nach der Verdünnung!

Cvor x Vvor = Cnach x Vnach

z.B.: Aus einer 1M KCl-Lösung soll 250 mL einer 20mM Lösung hergestellt werden.

1M x X = 0.02M x 250 mLX = (0.02 x 250) / 1 = 5 mL

Lösung: 5 mL einer 1M KCl sind notwendig um 250 mL einer 20 mM Lösung herzustellen

Berechnungen 3: Verdünnungsfaktor

• Z.B.: 10-fache Verdünnung (1 zu 10, 1:10)

1 mL auf 10 mL bedeutet 1 mL + 9 mL oder 1 mL in einem Gesamtvolumen von 10 mL

• Mischt man also gleiche Volumina miteinander hat man eine Verdünnung von 1:2 (nicht 1:1!).

Werteangaben (signifikante Stellen)

Resultat Grenzwert Differenz Max. Fehler*(R) min max (in %)

4 3,5 4,4 0,9 11,254,4 4,35 4,44 0,09 1,02

4,44 4,435 4,444 0,009 0,1014,444 4,4435 4,4444 0,0009 0,010

*) F=0.5(/R)*100

Beispiel:Waage zeigt 0.0256 g an. Die letzte Stelle ist unsicher! Der wahre Wert kann also zwischen 25.55 und 25.64 mg liegen.

Werteangaben 2Beispiel:Meßwerte — 11.44 mg Calcium, 2.11 g Pflanzenmaterial

11.44 2.1111.435 - 11.444 2.105 - 2.114

5.4092

Jeder Wert zwischen 5.409 und 5.437 ist möglich. Der Wert kann also nicht als 5.42 angegeben werden(Grenzwerte 5.415-5.424), sondern nur als 5.4 mg g-1

(Grenzwert 5.35 und 5.44).

5.4366

Praktische Hinweise

• Chemikalien

• Wasserqualitäten

• Wägen

• Zentrifugation

• Volumsmessungen

• Gefahrensymbole

• Qualitätenp.a. (pro analysis), zur Synthese, ACS, OEAB, chemisch rein, Suprapur, Biochimica select

• Beschriftungen von abgefüllten ChemikalienInhalt, Konzentration, Datum, Benutzer

Chemikalien

Giftig Mindergiftig Ätzend Explosions- Brand- Hoch/Leicht Reizend gefährlich fördernd Entzündlich

Chemikalien

Wasserqualitäten• Demineralisiertes Wasser Geschirrspüler

(Reversosmose, Hausleitung)

• Deionisiertes Wasser Abwaschen,(Ionentaustauscherpatrone, allg. Labor) anorg. Analytik

• Destilliertes Wasser Enzymaktivitäten(Quarzdestillationsanlage)

• Milli Q-Wasser Reinstwasser, (Reinstwasser >18.2 MOhm cm-1)Chromatographie

WÄGEN• Wägebereich der Waage beachten!• Störungen: Offene Türen, Heizung, Erschütterungen• Nivellieren (Libelle) und Kalibrieren (Auto)

• Wägegefäß sollte möglich klein sein• Statische Aufladungen vermeiden (kein Kunststoff)• Mitte der Waagschale (Ecklasteffekt) • Waage vorbelasten (Erstwägeeffekt) • Indirekte Handhabung (Zange; T- und RH-Effekte) • Wägegut sollte Umgebungstemperatur haben

Einflüsse beim Wägen

Wägeguterscheint leichter

T+ T-

Wägeguterscheint schwerer

Temperatur Luftfeuchte

Verdunstungerscheint leichter

Wasseraufnahmeerscheint schwerer

Zentrifugation

• Relative Beschleunigung(x g) statt Drehzahl (rpm)

• Max. Drehzahl beachten• Bremsen (je nach An-

wendung) • Austarieren der Gefäße• Beladung:

- 2 x gegenüber (180°)- 3 x im Winkel 120°

Volumsmessung(auf Wägungen zurückführbar)

• Glaspipetten (Ex, 20°, ± 1%)Voll-, Meß-, Präszisionspipetten

• Luftpolsterpipetten• Meßzylinder• Büretten• Dispensoren• Meßkolben (In!)

Enghals, Weithals