Chemische Kanzerogenese: Tumorpromotion

Michael Schwarz

Institut für Pharmakologie u. ToxikologieAbteilung für Toxikologie

Eberhardt-Karls-Universität Tübingen

Metabolische Aktivierung von DMBA

CH3

CH3

DMBA

CH3

CH3

DMBA

CH3

CH3

OCYP-450 CH3

CH3

OH

OHEH

Kovalente Binding an DNA

CH3

CH3

OH

OHO

CYP-450

ultimates Kanzerogen

proximales Karzinogen

Kovalente Bindung von DMBA-Metaboliten an DNA

G

C

A

T

Erzeugung von Punktmutationen durch DMBA-induzierte Adenin-Addukte in DNA

---CAA---

---GTT---

---CAA---

---GTT---

---CAA---

---GTT---

?

---CAA---

---GAT---

1. Runde von DNA-Synthese

---CAA---

---GTT---

Repair

Punktmutation

---GAT---

---CTA---

2. Runde von DNA-Synthese

Ha-ras-Mutationen in DMBA-induziertenHauttumoren der Maus

Onkogen Haut Pap./Carc. Inzidenz

Codon Mutation

Ha-ras 45/50 61 A:T->T:A

Quintallina, Balmain et al., 1986

Ras-Gap-Komplex

Scheffzek et al., Science 277, 333 (1997)

The switch function of Ras

Dank an Alfred Wittinghofer

MPI Dortmund

Schalterfunktion von Ras

Operationale Definition von Tumor- Initiatoren und Tumor-Promotoren im Zweistufen-Initiations-

Promotions-Experiment„Hautpinselungsexperimente“ (Mottram, Berenblum, Shubik)

Tumor

kein Tumor

kein Tumor

Tumor

Initiator

Promotor

TPA(irritierend und

tumorpromovierend)

O

O

O

HOH

H

O

O

4

12 13

OHOH

C PA14:4

(’Ti8’)(nur irritierend)

O

O

O

HOH

H

O

O12 13

OHOH

RPA(nur irritierend)

O

O

O

HOH

H

O

O12 13

OHOH

TPAIrritierend und

tumorpromovierend

C14:4PA (“TI8“)nur irritierend

RPAnur irritierend

Agonist

Receptor G-Protein PLC

DAGIP3 PKC

Calcium-Mobilisierung

Protein-Phosphorylierung

Zellproliferation

PIP2

PIP : Phosphatidyl-inositol-bisphosphat2

IP : Inositol-triphosphat

PLC: Phospholipase C

DAG: Diacylglycerol

PKC: Proteinkinase C

TPA: 12-O-Tetradecanoyl-phorbolacetat

3

TPA

Calcium-Mobilisierung

Protein-Phosphorylierung

Zellproliferation

C-Raf

MEK

ERK

EGFRRas

TPA

Tumorpromotion in der Leber

Einige Leber-Tumorpomotoren und ihre Rezeptoren

ChlorinierteBiozide

Dioxine und einige andere PCBs

Peroxisomen-proliferatoren

2,3,7,8-TCDD3,3‘,4,4‘-TCB

ClofibrateWY-14,643DEHP

AhR

PPAR

Arnt

RXR

CYP1A1, 1A2, 1B1 UGT1A1, NQO1

Acyl CoA Oxidase, CYP4A

pS2, VitellogeninSynthetische Hormone

Ethinyl-estradiol

ER ER

Barbiturate

einige PCBs

Gruppe

DDTDieldrin-HCH

CAR? RXR ““

PhenobarbitalCAR

(PXR) RXR CYP2B, 3A, 2C, 2H

2,2‘,4,5‘-TCB CAR RXR ““

Modell-Verbindung

Rezeptor Dimerisierungs-Partner

Einige Target-Gene

Effekt von Leber-Tumorpromotoren in der normalen Leber

Induktion von Hyperplasie und Hypertrophie

Effekt voll reversibel nach Absetzen der Behandlung

Adaptive Antwort; endet wenn neuessteady state erreicht ist

Effekt von Leber- Tumorpromotoren auf Hepatomazellen

Induktion von gesteigerter mitotischerAktivität und erniedrigte Apoptoseraten

Gleichbleibende Antwort bei kontinuierlicher Exposition

Teilweise reversibel nach Absetzen der Behandlung

Tumorpromotion in der Leber:

Beispiel 1:

Phenobarbital

Tumorpromovierende Wirkung von Phenobarbitalin der Rattenleber

PERC

ENTA

GE

OF

RATS

WIT

H TU

MO

RS P

ER G

ROUP

(TUM

OR

SIZE

> 1

0 m

m)

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100 120 140 160 180 200 220 240 260

DAYS

PhenobarbitalAAF Phenobarbital (0.05% im Futter)AAF Kontrollfutter

AAF = 2-Acetylaminofluoren

AAF PHENOBARBITAL

AAF CONTROL

Peraino et al., Cancer Res. 33, 2701-05, 1973.

Promovierender Effekt von Phenobarbitalauf die Tumorbildung in der Rattenleber

Verkürzung der Latenzzeit

Phenobarbital

Enzymveränderte Foci in der Rattenleber(GST-P = Glutathion-S-Transferase P)

GST-P-positive Tumorvorläuferzellein der Rattenleber

GST-P-positiver Focusin der Rattenleber

Phenobarbital promoviert das Wachstum präneoplastischer Foci in der Rattenleber

Goldsworthy, Pitot et al., Carcinogenesis 5, 67 (1984)

DENPhenobarbital

Kontrolldiät

plus PB

minus PB

Tumorpromotion durch PB benötigt CAR

Phenobarbital promoviert die Entstehung von Lebertumoren in der Maus

DEN

Alter: 6 Wochen 42 Wochen

PB im Futter(0.05%)

Kontrolldiät

Analyse von Mutationen

Ha-ras

ß-Catenin (Ctnnb1)

Phenobarbital-vermittelte Änderungen in der PrävalenzHa-ras- and ß-Catenin-mutierter Maus-Lebertumoren

0

10

30

20

40

50Ha-ras

6/20

minusPB

ß-Cat.

0

100

20

40

80

60

Präv

alen

zde

r Mut

atio

nen

(%) Prävalenz

der Mutationen (%

)

Aydinlik et al., Oncogene 20, 7812 (2001)

0/13

minusPB

37/46

plusPB

0/32

plusPB

Phenobarbital-vermittelte Selektion für Ctnnb1- (ß-Cat.) mutierte Maushepatozyten

Ha-ras-mutiert

ß-Cat.-mutiert

minus Phenobarbital plus Phenobarbital

Leber-Tumorpromotion durch PCB-153 (PB-Typ)

Cl

Cl Cl

Cl

ClCl

2,2‘,4,4‘,5,5‘-HexachlorobiphenylPCB-153

Cl

Cl ClCl

Cl

Cl NH

NH

O

O

O

CH3

Phenobarbital

DEN

Alter: 6 Wochen 64 Wochen

20 2-wöchentl. Injektionen

Kornöl

PCB 153

PCB 153 selektioniert für Glutaminsynthetase-positive Hepatome mit aktiviertem ß-Catenin

Genmutation0

.23

0

Vol

umen

ante

il in

d. L

eber

(%)

GS-negative Tumoren

GS-positive Tumore

Ctnnb1 unbekanntB-raf Ha-ras

**

DEN/Kornöl

DEN/PCB 153

100

Verlust der Tumorpromotionswirkung von PB in der Leber von Ctnnb1-knockout-Mäusen

90% der Tumoren von PB-behandelten WT-Mäusensind Ctnnb1-mutiert und GS-positiv

Rignall et al., Carcinogenesis 2010WT WT-PB KO KO-PB

Tum

or m

ultip

lizitä

t

Promotion durch PB benötigtfuntionelles β-Catenin

Der kanonische β-Catenin-Signalweg

See: http://www.wormbook.org

Stahl et al., Hepatology 42, 353 (2005)

low expressionhigh expression

normalliver

β-Cat.-mut.

Ha-ras-mut.

Maus

Mensch

Genexpression in Maustumoren gleicht der von humanen β-Catenin-mutierten HCCs

Ctnnb1-mutierte Tumoren zeigen charakteristische Änderungen in Enzymen des Intermediär-Metabolismus

β-Cat.-mutierte Tumoren: gesteigerte Glutaminsynthese, erniedrigte Aktivität des Harnstoffzyklus

Stahl et al., Hepatology 42, 353 (2005)

A

Glutamin wird u.a. für die Purin-Biosynthesebenötigt

Hohe Gehalte an Glutamin wären für Ctnnb1-mutierte Hepatozyten von Vorteil, aber……

GlutamineGlutamin

Gap junction Kanal

Glutamin akkumuliert in Ctnnb1-mutierten Tumorzellen(Konsequenz: Selektiver Proliferationsvorteil)

Cx32-positiver Tumor(Ha-ras-mutiert)

Cx32-negativer Tumor(Ctnnb1-mutiert)

Connexin32: häufigstes Gap Junction-Protein i.d. Mausleber

In absence of PB, single isolated hepatocytes withactivated -catenin express Cx32 and do not

proliferate

Mouse strain:

Tglox(pA)S33Y-ß-Cat X Alb-Cre

(S. Loeppen)

Tumorpromotoren inhibieren gap junctionalcommunication

Metabolische Kooperation

Zell-Zell Kommunikation

For review see: Yamasaki and Naus, Carcinogenesis 17, 1199 (1996)

Trosko and Ruch, Front. Biosci. 3, 208 (1996)

Verlust der promovierenden Aktivität von PB in Cx32-knockout-Mäusen

Moennikes et al., Cancer Res. 60, 5087 (2000)

0

20

40 Cx32 wt Cx32 null -+ PB* G6Pase-

defiziente Läsionen

Tumor prevalenceTumor multiplicity

wtCx32 Cx32 null

G-6-Pase-defiziente Läsionen Kein Anstieg

Volu

men

frak

tion

in d

er L

eber

(%)

Kein AnstiegKein Anstieg

GS

GJIC

-Catenin

Glutamin

CAR

PB

Aber: Cx32 mRNA unverändertTumoren in Cx32-Null-Mäusen nicht Ctnnb1-mutiert

Proliferation

Tumorpromotion durch PB

CAR

GJIC

Mechanistische Verbindung?

?β-Catenin

Leber-Tumorpromotion:

Beispiel 2:

2,3,7,8-TCDD

TCDD wirkt vermutlich über den AhR

DEN TCDD oder Kornöl

17 31 73 115Behandlung (Tage)

Experimentelles Design

Relativer Volumenanteil (%)

Quantitative Bestimmung der Leberfoci

KontrolleTCDD

0

1

2

3

4

17 31 73 115TCDD-Behandlung (Tage)

Vol

umen

ante

il in

der

Leb

er

(%)

Tumorpromovierende Wirkung von TCDD in der Rattenleber

Effekt von TCDD auf die Zellteilung (BrdU-labeling index)und auf den Apoptoseindex in GST-P-positiven Leberfoci

Apoptosen

H&E/GST-P Eosin-Fluoreszenz

BrdU-Markierung

TCDD-Behandlung (Tage)

Kontrolle

TCDD

0

10

20

30

31 73 115

BrdU

-Mar

kier

ungs

-in

dex

(%)

TCDD-Behandlung (Tage)

Kontrolle

TCDD

0

4

8

12

31 73 115

Apo

ptos

ein

dex

(%)

Viele Leber-Tumorpromotoren inhibieren TGFβ-induzierte Apoptose von FTO2B-Hepatomzellen (Ratte)

% of TGFß control20 µm

Pheno Insulin

Dexa

DieldrinTGFß

+ ++ + + ++ +-- - -

Dexa

0

50

10052

7**

6 *

4**

8**

6**

15**

24** 36**

Phen

o

Insu

lin

Dield

rin

+ TGFß

Dexa

Clofib

rate

DDT

Solv

ents

Inhi

bito

rsHoechst 33258-Färbung

Apoptose-Figuren “DNA-laddering” Caspase-3 Aktivität

% o

f TG

F/s

olve

ntco

ntro

l

TGFß

Buchmann et al., Cell Death Diff 6, 190 (1999)

Leber-Tumorpromotion:

Beispiel 3:

WY-14,643

(Peroxisomenproliferator)

Leber-Tumorpromotion durch den PeroxisomenproliferatorWy-14,643 benötigt PPAR

PPAR (-/-) + Wy-14,643

PPAR (+/+) + Wy-14,643

PPAR-aktivierte Signalkaskade

PPARLigand

Inhibition of let-7c expression

C-MycÜberexpression

Überexpression des

mir-17-92 clusters

RXR

Gesteigerte Zellproliferation

Suppression von Apoptose

Zellproliferation in „humanisierten“ PPAR-Mäusen

Tumorantwort in „humanisierten“ PPAR-Mäusen

mPPAR

mPPAR

hPPAR

hPPAR

Kontrolle

Kontrolle

Wy 14,643

Wy 14,643

0/9 (0%)

5/7 (71%)

0/10 (0%)

1/20 (5%)

Genotyp Tumor-Antwort

Diät

mPPAR

hPPAR

Liver tumor promotion: Beispiel 4

4-Dimethylaminoazobenzol

(„Buttergelb“)

NDEOL0.2

0.4

300

600

4-DAB0.2

0.4

300

600

Behandlung (Wochen)

0 6 8 14 17

relati

ver V

olumen

-

antei

l (%)

Zahl p

ro cc

m

Lebe

rgeweb

e

4-DAB NDEOL0.2

0.4

300

600

4-DAB0.2

0.4

300

600

NDEOL0.2

0.4

300

600

NDEOL 4-DAB0.2

0.4

300

600

Behandlung (Wochen)

0 6 8 14 17Volumen

frakti

on

(%)

Zahl p

ro cm

3

Leberg

eweb

e

Schwarz et al.,Carcinogenesis 5, 725-730, 1984.

Promovierende Aktivität von 4-DAB auf NDEOL-induzierte Leberfoci in der Ratte

Mechanismus?

4-DAB

NDEOL

Expression von fremdstoffmetabolisierendenEnzymen in Ratten-Leberfoci

Hypothese der selektiven Toxinresistenz

Zellteilung

Normale Leberzellen EnzymveränderteTumorvorläuferzellen

Cytochrom P450-System

toxische Metaboliten

Hepatotoxisches Agensz.B. 4-DAB

Zelltod

benigneTumorzelle

initiierte Zelle

normaleSoma-Zellen

Initiation

Promotion

Maligne ProgressionmaligneTumorzelle

Karzinogen

Bindung an DNA

Mutation

Inaktivierung

Reparatur

Immunantwort

Mutation

Mutation

Zelltod

metabolische Aktivierung

Effekt von Tumorpromotoren

Tumor-Promotor

Zelltod

Initiierte

Zelle

Mutation

Direkter Effekt Rezeptorvermittelt

Indirekter Effekt Selektive Toxin-Resistenz

Chronische Irritation

Induktion von regenerativem Wachstum

Zellproliferation