Christine Rodhe: Phagen - Viren gegen Bakterien

Leibniz-Institut • DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

Phagen – Viren gegen Bakterien

BAKT Interdisziplinäres Symposium Antibiotikaresistenz

Erlangen, 19.09.2016

Christine Rohde, Leibniz-Institut DSMZ


Die DSMZ – Auftrag und Schwerpunkte

Sektion Lebenswissenschaften: 24 unabhängige Institute

Schlüsselprofil: Gesundheit & Biodiversität

Auftrag: Gesellschaftliche Relevanz

Maximum-likelihood phylogenetic tree of thebacterial domain. D.Y. Wu et al.: NATURE 462 (2009)

Die DSMZ als forschendes Bioressourcenzentrum • Über 40.000 versch. Bioressourcen in 5 Abteilungen • Sammlung, Service, Forschung • Ökologie, Evolution, Wirkstoffforschung • Medizinisch relevanter Schwerpunkt in Sammlung &

Forschung


Alle Stämme – auch Phagen – werden für die Langzeit in LN aufbewahrt

Alle Stämme Phagen für die Langzeit in LN aufbewahrt

Mikroorganismensammlung der DSMZ Bioressourcen für Forschung, Industrie, Lehre

Phagensammlung expandiert mit

anwendungsbezogenen Vorhaben, Sammlung & Forschung gehen Hand in Hand, DZIF*-

Ressourcen werden genutzt

*DZIF Deutsches Zentrum für Infektionsforschung

Mehr als 350.000 Ampullen gefriergetrockneter Mikroorganismen

Phage T4


Was sind Bakteriophagen (Phagen)?

Phage CBA 120 (E. Kutter)

In den globalen biogeochemischen Zyklen dominieren Prokaryonten die Eukaryonten.

Phagen als auf ein Minimum reduzierte Lebensform sind im prosperierenden

Mikrobenmix seit Urzeiten die stärksten evolutiven Kräfte in Co-Evolution mit ihren

Wirtsbakterien. Zum Verstehen ihrer Rolle ist es nötig, die

Prinzipien der Phage-Bakterium-Beziehung zu kennen.

A. Buckling & P.B. Rainey (2002); M. Clokie et al.,

Phages in nature (2011); C. Rohde & J. Sikorski, Nat. Rundschau 64 (2011)

Viren, die nur Bakterien artspezifisch

befallen und lysieren

Video auf DSMZ-Homepage: https://www.dsmz.de/catalogues/

phages.org

bbc.com


1031 Phagen in der Biosphäre Phagen sind die häufigsten lebenden Einheiten und ein Kennzeichen prokaryotischer Existenz. Die häufigsten Viren sind Phagen. Phagen kommen in allen Habitaten vor, inkl. des menschlichen und tierischen Mikrobioms

Mtkvari (Kura) Tbilisi, Georgien, Quelle vieler Phagen des bekannten ELIAVA Instituts Oker

Braunschweig, Quelle vieler neuer Phagen für Forschung und Anwendung


Wir leben in einem Ozean von Viren! (J.S. Weitz & S.W. Wilhelm, The Scientist, 2013)

K. Schneider, The Scientist

Einige Phagen-Morphotypen Lake Elmenteita, Kenia (J. Khayeli, Diss., DSMZ 2014)


Typisches Myovirus

Phage T4 lysiert mit eskalierender Zahl eine E. coli Zelle. Interner Druck von 3-5 atm (V. Fischetti) führt zum Platzen.

Wirkung lytischer Phagen: die lysierte Bakterienzelle

wird zur Phagenfabrik - Beispiele

SEM: Phage Sb-1 auf MRSA-Zelle nach 5 Min. Inkubation (Sb-1, ELIAVA Inst.)

Der lytische Zyklus


Ultradünnschnitt, TEM: Achromobacter xylosoxidans 90 Min. nach Infektion mit Phage JWAlpha


Phagen: 1031 global players - Phagenwelt in Zahlen

• Die Mehrheit aller viralen aktiven Einheiten befallen Bakterien • 1 mL Ozeanwasser enthält bis 108 Viren, meist Phagen • Phagen lysieren laufend 20-40% der Bakterien in diversen Habitaten • Die globale Rate viralen Genaustausches wird auf auf 20 x 1015/Sekunde

geschätzt (S.C. Jiang & J.H. Paul, 1998) Das humane Mikrobiom ein komplexes Habitat. Sein Phageom reguliert die mikrobielle Balance. Der Mensch hat ständigen Kontakt zu Phagen (Wasser, Nahrung, Umwelt). Phagen gestalten unser individuelles Mikrobiom. Wir tragen ca. 100 x mehr Phagen mit uns als eigene Körperzellen. K. Califf et al.: The Human Microbiome: Getting Personal, Microbe 9, 2014


Phagenanwendung in der Humanmedizin Der Beginn

1915: Frederick W. Twort, Arzt, London (sgm.ac.uk), erkannte ein übertragbares Prinzip: „The bacteria appeared to be afflicted with some disease“ (LANCET 11, 1915)

Staphylococcus-Phage „TWORT“, 1948 > Inst. Pasteur, Paris > Félix d‘Hérelle Collection, Univ. Laval, Quebec > DSMZ

1917: Felix d‘Hérelle , Mikrobiologe, Frankreich/Kanada: erste Phagenanwendungen gegen Cholera und Pest in Indien ab 1917. Namensgeber der „Phagen“ (The bacteriophage inquiry of 1927-1936; J. of the History of Medicine & Allied Sciences, 1993)


ELIAVA-Institut IBMV, gestern & heute

George Eliava & Felix d‘Hérelle: gründeten 1923 das ELIAVA Institut (später IBMV), Tbilisi, Georgien, wo seither lytische Phagen routinemäßig als Monopräparate & Cocktails für Therapiezwecke hergestellt werden.

Phagenpräparat „Staphage“ (Apotheke, Tbilisi) mit Phagen des Typ Sb-1 (weites Wirtsspektrum) gegen S. aureus, hochgereinigt; TEM-Foto; 4 Phagen im Wirtsspektrum-Test gegen klinische S. aureus (u.a. Isolate der MHH, durchgeführt in DSMZ)

• http://www.phagetherapycenter.com: Scientific literature: Human trials (chronolog. Überblick) • A Literature Review of the Practical Application of Bacteriophage Research (IBMV, 2009) • Kontakt: [email protected]

http://www.phagetherapycenter.com/


Originalampullen (1930er), Phagenpräparationen gegen C. perfringens, C. histolyticum und Bacté-Coli-Phage, Bacté-Pyo-Phage

- Der DSMZ freundlich überlassen vom ELIAVA Institut -


Frankreich‘s Phagenhistorie und Félix d‘Hérelle Daten: S.T. Abedon et al. (2011), Bacteriophage 1 1919: d’Hérelle begann, Dysenterie-erkrankte Kinder im Krankenhaus zu behandeln (Paris) Wenige Jahre später: Phagenpräparate produziert von Laboratoire du Bactériophage, Paris: Bacté-coli-phage, Bacté-intesti-phage, Bacté-pyo-phage, Bacté-rhino-phage, Bacté-staphy-phage 1939: Monographie von La Médicine berichtete von erfolgreichen Behandlungen von Dysenterie, Typhus, akuter Kolitis, Peritonitis, Prostata und UTI Infektionen, Furunkulose, Sepsis, Ohr- und Halsinfektionen. 1961 / 1976: Reviews von J. F. Vieu (Pasteur bacteriophage service) über Phagentherapie in Frankreich, bes. gegen Staphylococcus, Pseudomonas, Proteus und Coliforme. 1976: Inst. Pasteur, Lyon, produzierte > 60 Therapie-Phagenpräparate


Phagentherapie PERSPECTIVES, a century of the phage: past, present & future

G. Salmond & P. Fineran: Nature Reviews (2015)

- 100 jährige Zeitgeschichte -

Phagenvielfalt, Phagengenomik und Phagenfähigkeiten sind so enorm, dass von einem unvorhersehbar spannenden 2. Jahrhundert der Phagenforschung gesprochen wird

femsre.oxfordjournals.org

S. auch S. Abedon et al. (2011): Phage treatment of human infections. Bacteriophage: Großer Überblick inkl. Monographien; frühe französische Phase, damals die meisten Phagentherapien gegen S. aureus (noch in 1976)


Was macht Phagen so interessant?

Ihre Spezifität hilft bei medizinisch relevanten Fragen: • Evolution / Populationsgenetik Pathogener besser verstehen • Pathogene typisieren (zB Salmonella typing am RKI) • Coliforme identifizieren (Trinkwasser; zB phiX174) oder • gefährliche Pathogene (zB gamma gegen B. anthracis) • als Modellsysteme in humaner Virologie zu fungieren (zB MS2 / HIV) • M13-Modell zur Erforschung der Pathologie neurodegen. Erkrankungen (Alzheimer, Parkinson)* • in Therapieanwendungen

* Phage M13-Capsidprotein als generelles Amyloid-Interaktions- Motiv (GAIM). R. Krishnan et al. (2014) J. Mol. Biol. 426

Beste Taxonomen der Bakteriologie!

B. anthracis?B. anthracis!

Neuer Phage vB_BanS-longtail gegen B. anthracis


Kooperation ELIAVA-Institut IBMV - DSMZ

• 2008: Memorandum of Understanding • Gemeinsame Studie: Phagen gegen klin. S. aureus: L. Kvachadze et al. Microbial Biotechnol. 4 (2011) • Phagen gegen Achromobacter xylosoxidans der DSMZ1 wurden kürzlich im IBMV für Therapiezwecke adaptiert • 2016: Phagen gegen A. baumannii, präklin. Mausmodell: Charité - DSMZ - IBMV • 2016: Publikation: 60 Teilnehmer, 12 Nationen (Roundtable Tbilisi Okt. 2015): Silk route to the acceptance and re-implementation of bacteriophage therapy. Biotechnol. J. 11

*freundl. Genehmigung Eliava-Inst. & M. Rohde, HZI 1(J. Wittmann et al.: Virol. J. 1(2014); J. Wittmann et al.: PLOSone 9 (2014)

Foto*


Leitmotiv bakterielle Diversität zur Selektion neuer Phagen nutzen zur Selektion neuer Phagen nutzen

Coliphagen sind leicht isoliert

GWK02 (Univ. Saarbrücken)

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

PT-XU-05 U3: wichtiges Werkzeug

Phagenforschung an der DSMZ


DSMZ-Phagenforschung

A. xylosoxidans

bisher kaum im Fokus, kann aber im Einzelfall wichtig werden (chronisch besiedelte Lunge, Biofilme)

• In-house Genomanalyse für Zukunftsanwendungen

• TEM-/SEM-Analyse der Adsorption an bakterielle Wirtszellen u.a.

mikromorphologische Fragestellungen (Kooperation mit HZI, Braunschweig)

• Vernetzung mit internationalen Phagenexperten

• Expansion der Phagensammlung für opportunistisch pathogene Bakterien:

ESKAPE und andere

• Neue Phagen gegen diverse Pathogene für präklinische und klinische Studien


Phagen authentisch für die Zukunft bewahren

• 4°C-Arbeits-Stock • LN-Vorrat • Vakuum-Ampullen

Phage für Stenotrophomonas humi Reinigungsausstrich Einzelplaques

Phage T4 Vakuum-getrocknet & revitalisiert

Phage aus Klärwasser gegen B. anthracis

Phage Ye03-12 gegen Y. enterocolitica

Phage kappa gegen S. marcescens

Langzeit


Service for Science – Science for Service Authentische Bioressourcen für die Wissenschaft

DSMZ: zwei SOP-geführte Langzeit-Konservierungsmethoden auch bei Phagen – Vakuumtrocknung: ein Plus -


Biologische Phagen-Parameter beurteilen

*Plaque-Größe *Trübheit *Halo *Grad bakt. Resistenz *burst size *efficiency of plating *Umweltresistenz

Phagen gegen A. pittii, P. aeruginosa, P. aeruginosa


Stabilität von Phagensuspensionen Üblicherweise sehr gut:

• Monopräparate & Cocktails bei 5°C, 1 Jahr ohne Titerverlust

• Titerbestimmung einfach & präzise: Agar-Overlay

Phage für K. pneumoniae

Unerlässliche QC: TEM


Das Wissen über Phagen

Erst seit wenigen Jahren trägt die (Meta-)Genomik * erheblich * immer schneller * immer präziser * immer kostengünstiger

zum Wissen über Phagen auf dem Planeten, im humanen Mikrobiom und in allen möglichen Habitaten bei.

CsCl-Dichtegradient mit ganzen Phagen

PacBio RS II Sequencer der DSMZ

basiert auf single molecule, real-time Technologie (SMRT)

Ein Phagengenom

ca. 100 €


Metagenomik > Mikrobiom > Phageom

www.cell.com

Metagenomik kann die Rolle von Mikrobiom-beteiligten Bakterien aufklären > indigene Mikrobiota

Unser Mikrobiom trägt viele opportunistisch pathogene Bakterien, darunter ESKAPE-Keime und Zoonoseerreger > der Patient bringt sie inkl. multiresistente als stille Gefahr mit ins Krankenhaus


Globale MDR Krise

MRSA: Methicillin resistente S. aureus VRE: Vancomycin resistente Enterokokken ESKAPE: Enterokokken (VRE) S. aureus (MRSA) K. pneumoniae (Carbapenem resistent) A. baumannii (oft intrinsisch resistent) P. aeruginosa Enterobacteriaceae (ESBL) 3MRGN, 4MRGN etc……

400.000 - 600.000 nosokomial erworbene Infektionen/Jahr für Deutschland berichtet und mind. 25.000 Todesfälle in der EU. Die Antibiotika-Pipeline ist leer.

http://www.gesundheitsforschung-bmbf.de/


WHO Global Surveillance Report 2014, und G7

Ziel der DSMZ:

Substanziell große Sammlung von Phagen gegen

1. Priorität: ESKAPE-Keime

2. Priorität: andere Opportunisten

etablieren und für die Zukunft vorhalten http://www.reactgroup.org/

[email protected] (Feb 2015 Report: Uppsala University)

: Global Action Plan on AMR „AMR requires global collective action: access, conservation, innovation“!

Report 2014, und G7

Thema des Weltgesundheitsgipfels Berlin, Okt. 2016!

http://www.reactgroup.org/

http://www.reactgroup.org/

mailto:[email protected]


International Nosocomial Infection Control Consortium (INICC) Report 2014

6 Jahres-Studie 2007 – 2012

In 503 ICUs in Lateinamerika, Asien, Afrika, Europa

Detailierter Überblick über Antibiotikaresistenzlage, Indikationslagen und Häufigkeiten von zB Katheter-

assoziierten UTI, Beatmungs-assoziierten Pneumonien etc.


Warum Phagen als Option in der Humanmedizin?

Internet-Treffer: „Multi-drug resistant (MDR) bacteria“: ca. 3.440.000

http://www.bionity.com/de/news: dpa, 03.06.2015:

„Ohne scharfes Umsteuern beim Einsatz von Antibiotika wird sich die Zahl der Toten durch multiresistente Keime drastisch erhöhen … geht aus einer Studie der Berliner Charité hervor, … warnen die Autoren, dass sich die Zahl der Toten von jetzt weltweit etwa 700.000/Jahr ohne Gegenmaßnahmen bis 2050 auf 10 Mio erhöhen wird. Für Europa … Anstieg von jetzt 23.000 auf 400.000 prognostiziert

… gehört zu den größten Gefahren für die menschliche Gesundheit ….“.

Öffentliches Interesse stark gestiegen

http://www.bionity.com/de/news


EU Research Participants Portal: Personalising health and care, Calls 2020

„Personalised medicine has the potential to respond to, amongst others, the increasing burden of chronic disease and the complexity of co-morbidities and in doing so contribute to the sustainability of health and care systems…. Personalised medicine refers to a medical model using molecular profiling for tailoring the right therapeutic strategy for the right person at the right time, and/or to determine the predisposition to disease and/or to deliver timely and targeted prevention.“


EMA, European Medicines Agency, London Workshop on Therapeutic use of Bacteriophages 08. Juni 2015

Ca. 60 Experten/Interessenvertreter diskutierten praktische und regulatorische Aspekte für die Zulassung von Phagenpräparaten im Vergleich

zu statischen Drogen

* Klare Definitionen zur Präzisierung aller Details, Beteiligte müssen alle Prozesse verstehen > Basis für Entwurf einer neuen Regulative

* Sie muss nötige Infrastruktur vorgeben > Basis für zuverlässige Prozessketten * Mehr klinische Studien mit verschiedenen medizinischen Targets und Forschung nötig zur Absicherung der Datenlage und um Effizienz und

Sicherheit von Phagenpräparaten zu demonstrieren * Erst so kann Phagentherapie standardmäßig eingesetzt werden

* Rolle der EU Kommission zügig verhandeln

Commentary: L. Debarbieux et al. (2016): A bacteriophage journey at the European Medicines Agency


P.H.A.G.E. – Non-profit Organisation

Direktive EC/2001/83 („Human Code for Medicines“) hat Phagen nicht definiert. P.H.A.G.E. arbeitet an einer Regulative zur Wieder-

Einführung der Phagentherapie als Therapiekonzept in Europa.

Relevante Fragen: Industrieller Maßstab oder Klinik-basiert, individualisiert, Patienten-

spezifisch, „Phages On-Demand“?

P.H.A.G.E. und DSMZ unter MoU: Therapiephagenbank an der DSMZ: potentiell geeignete Phagen verfügbar machen für weitere

Aufreinigung: https://www.dsmz.de/catalogues/catalogue-microorganisms/

• J.-P. Pirnay et al., Pharm. Res. (Jan 2015)

• G. Verbeken et al., Arch. Immunol. Ther. Exp. (Feb 2014) • M. Merabishvili et al., PLoS One (Mar 2009)

PHAGES FOR HUMAN APPLICATIONS GROUP EUROPE

http://www.p-h-a-g-e.org

http://www.p-h-a-g-e.org/













Phagentherapie: ein Therapiekonzept

„Regulation needs to be adapted to phage therapy and not vice versa“ (A. Fauconnier)

- Phagen für die Mainstream Medizin: wie geht es weiter in Europa? -

G. Verbeken et al.: Call for a dedicated European legal framework for

bacteriophage therapy (2014) interviewten 35 Experten zu folg. Basisfragen:

*Definition Human Medicinal Product *Therapeutische Aktivität eines Phagen *Verabreichungs-Route *Mögliche Nebenwirkungen *Physiko-chemisch-

biologische Tests *Vergleichbarkeit natürlicher Phagen mit Vakzinen? *Phagen und die Definition eines ATMP (Advanced Therapy Medicinal Product) *Marketing Authorization

*Over-the-Counter Abgabe *Bedarf für neues Regelwerk


Therapeutisches Prinzip lytischer Phagen

•spezifisch: zielgerichtet gegen Stämme einer Bakterienart •Selbstreplizierend & selbstlimitierend > selbstregulierend am Infektionsort,

danach Zerfall und Abbau durch Reticuloendothel

Was macht Phagen spezifisch? Glycolipide, Membranproteine (OmpC, OmpF…), Flagellenproteine usw

Bakterielle Resistenzentwicklung:

- Fakt! Aber ohne nachhaltige Konsequenzen - geringer bei evolvierten/adaptierten Phagen, die öfters über ihren Wirt passagiert wurden (Studien an P. aeruginosa PAO: V.-P. Friman, A. Betts)


Prinzip lytischer Phagen

Beispiel Phage G7 gegen A. baumannii Laufendes präklinisches in vivo Maus-Lungenmodell

Charité Pneumologie, Lunglab 2016, AG M. Witzenrath


Phagen vs. Antibiotika – Vor- und Nachteile beider antimikrobieller Ansätze aus: NOVOMED Integrative Medicine Center of Georgia, http://www.phagetherapycom/

Bacteriophages Antibiotics Comments Very specific (i.e., usually affect only the targeted bacterial species); therefore, dysbiosis and chances of developing secondary infections are avoided.

Antibiotics target both pathogenic microorganisms and normal microflora. This affects the microbial balance in the patient, which may lead to serious secondary infections.

High specificity may be considered to be a disadvantage of phages because the disease-causing bacterium must be identified before phage therapy can be successfully initiated. Antibiotics have a higher probability of being effective than phages when the identity of the etiologic agent has not been determined.

Replicate at the site of infection and are thus available where they are most needed.

They are metabolized and eliminated from the body and do not necessarily concentrate at the site of infection.

The "exponential growth" of phages at the site of infection may require less frequent phage administration in order to achieve the optimal therapeutic effect.

No serious side effects have been described.

Multiple side effects, including intestinal disorders, allergies, and secondary infections (e.g., yeast infections) have been reported.

A few minor side effects reported for therapeutic phages may have been due to the liberation of endotoxins from bacteria lysed in vivo by the phages. Such effects also may be observed when antibiotics are used.

Phage-resistant bacteria remain susceptible to other phages having a similar target range.

Resistance to antibiotics is not limited to targeted bacteria.

Because of their more broad-spectrum activity, antibiotics select for many resistant bacterial species, not just for resistant mutants of the targeted bacteria.

Selecting new phages (e.g., against phage-resistant bacteria) is a relatively rapid process that can frequently be accomplished in days or weeks.

Developing a new antibiotic (e.g., against antibiotic-resistant bacteria) is a time-consuming process and may take several years.

Evolutionary arguments support the idea that active phages can be selected against every antibiotic-resistant or phage-resistant bacterium by the ever-ongoing process of natural selection.

Comparison of the Prophylactic and/or Therapeutic Use of Phages and Antibiotics


Phagen Bakterienwirte neue-Isolierung Forschungs-Stock Forschungs-Zellbank Master-Stock Master-Zellbank Arbeits-Stock Arbeits-Zellbank Produktionsprozess

Generelles Prinzip Produktionsprozess R & D in GMP überführt

(www.phagoburn.eu): erste westliche klin. Phase 1 und 2 randomisierte, kontrollierte Mehrfachstandort-Studie (11 spezialisierte Kliniken für Verbrennungsopfer in Frankreich, Belgien, Schweiz). Start: Juli 2015, 220 Patienten. Phagen-Cocktails gegen E. coli (13) und P. aeruginosa (12), (Pherecydes) C. Sansom: www.thelancet.com/infection 15 (2015)

http://www.phagoburn.eu/

http://www.thelancet.com/infection


Bewährte georgische Phagenpräparate

Bacteriophages for Treatment of Diseases caused by Antibiotic-Resistant Pathogens(ELIAVA Institute IBMV, Mzia Kutateladze, Chief Scientific Council)

http://www.istc.ru/istc/istc.nsf/va_WebResources/Event_Lyon/$File/Kutateladze.pdf

IBMV: neue quasi-GMP Produktion

• Pyo-Phage (5 Komp.: Staphylococcus, E. coli, Streptococcus, Pseudomonas, Proteus) • Intesti-Phage (17 Komp.: Shigella spp., Salmonella spp., Staphylococcus, Proteus

spp., E. coli, div. Serotypen, P. aeruginosa) • Mono-Phagen (Staphylokokken, E. coli, Streptokokken, P. aeruginosa, Proteus)


Phagenpräparat PYOPHAGE

Fotos: freundl. Genehmigung Dr. med. vet. K. Baumgartner, Tiergarten Nürnberg, Sept. 2016

Panzernashorn vor und nach Phagenbehandlung


Phagentherapie in Polen Ludwik Hirszfeld Institute of Immunology & Experimental

Therapy, Wroclaw

• Tausende gut dokumentierte Patientenfälle • 550 Fälle 1981 – 1986: jeder in einem der Overviews

aufgenommen • Heilungsraten um > 80% • Keine auffällige (negative) Immunantwort (Studie 2008 • - 2010 mit 153 Patienten). Folgerung A. Górski betr.

Immunantwort: noch unklar, ob Anti-Phagen- Antikörper bei Therapie helfen oder hinderlich sind. Górski: Phagen wirken trotz der Antikörper! Prof. A. Górski & Dr. B. Weber-Dabrowska [email protected] Die Klinik nimmt antibiotisch austherapierte Patienten und behandelt mit Monophagen.

mailto:[email protected]


QC-Aspekte für nachhaltige Phagenpräparate

•Stabilität (Titer) •Pyrogennachweis

•Sterilität •Zytotoxizität

•Genomsequenzen: Abwesenheit temperenter Phagen und toxincodierender Gene •TEM (Morphologie/Reinheit und Interaktion mit Targetbakterien)

Genomsequenzen: zusätzlicher Vorteil der taxonomischen Einordnung, künftig als

begleitende Forschung essentiell

Wegweisend:

M. Merabishvili et al., PLoS ONE 4 (2009) J.-P. Pirnay et al., Pharm. Res. Jan. 2015


Verunreinigungen von Phagen-Präparaten

Müssen eliminiert werden: •Proteine des bakteriellen Wirts •DNA •Endotoxine •Pyrogene Exotoxine •Hämolysine •Chemische Restbestandteile

ZB: Hyglos-EndoTrap-Säulen, s. rechts

EndoTrap® red EndoTrap® HD

LPS-Bindekapazität: > 2.000.000 EU/ml Gel > 5.000.000 EU/ml Gel

Wiederverwendbarkeit: 3x mehr als 10x

pH Probenpuffer: 6-9 4-10

Geeignete Puffer: Kalziumchelatoren auch für Hochsalzbedingungen (> 150 mM NaCl)

Applikationen: Proteine, Peptide, Antikörper

Proteine, Peptide, Antikörper, DNA/RNA, Antigene, Pflanzenextrakte, automatisierte Systeme, biopharmazeutische Produktionsprozesse

Produkte und Applikationen:

http://www.hyglos.de/de/produkte-services/produkte/endotoxin-entfernung/endotrapr-red.html



http://www.hyglos.de/de/produkte-services/produkte/endotoxin-entfernung/endotrapr-hd.html

http://www.bioprocessintl.com/journal/2009/July/A-New-Solution-for-Endotoxin-Removal-in-Biomanufacturing-Processes-206585





Phagen-Pharmakokinetik

•Einfluss des Phagen auf den Körper •Einfluss des Körpers auf den Phagen

beinhaltet per def.:

Absorption, Verteilung, Metabolismus, Ausscheidung

„Metabolismus“ bei Phagen: Phageninaktivierung durch ihre Interaktion

mit Immunsystem. Oder: Aktivierung i.S. von in situ Replikation

Ziel immer: völlige bakterielle Beseitigung

J.-P. Pirnay et al., Pharm. Res. Jan. 2015


MRSA – der „populärste“ nosokomiale Problemkeim

Phagenerfolge

Phagen in PhagoBioDermTM entfernen MRSA aus Wunden. Intl. J. Dermatol. 41 (2002)

1921: Der erste Bericht über Phagentherapie am Menschen betraf Staphylokokken-Hautinfektionen bei 6 Patienten (R. Bruynoghe & J. Maisin). Seitdem viele Phagenanwendungen bis zur breiten Anwendung von Antibiotika auch in USA. Produzenten zB: Eli Lilly, Squibb & Sons, Swan-Myers

Intralytix.com


aus: NOVOMED Integrative Medicine Center of Georgia Spezialisierung: chronische Wunden

Chronische Wunden nehmen zu!

USA: 6.5 Mio Patienten: • ältere Gesellschaft • mehr Diabetes

• steigende Gesundheitskosten

- Chronische Wunden seltener bei ansonsten Gesunden - Geschwüre: 20% der Hospitalisierung im Diabeteskontext

- Komplikation: komplex organisierte Multispezies-Biofilme, die Bakterien vor Antibiotika schützen

- Phagen penetrieren tiefer ins lokale Gewebe, AB haben abnehmende Aktivität in tieferen Schichten

- Bei 90.8% (305 Verletzungen) Heilung durch Phagen: S. Slopek et al. (1987) - Bewährter Phagencocktail auf Wunden gesprüht: Pyophage


Einige Projekte zu S. aureus

• Intralytix: z.Zt. Therapieprodukte in versch. Entwicklungsphasen, zB 8-Phagen-Cocktail zur Wundbehandlung/Ulcus cruris: Phase I, Lubbock/Texas S. auch www.clinicaltrials.gov

• Im Deutschen Zentrum für Infektionsforschung (DZIF) arbeiten Forscher der Universitäten Tübingen, München und Münster mit Hyglos GmbH , Bernried, mit BMBF-Unterstützung an der Vorbereitung der klinischen Prüfung eines S. aureus-spezifischen Phagen-Lysins (GMP) zur Sanierung der Nasenflora. Kontakt: A. Peschel, Tübingen

• J.J. Mendes et al., Wound Repair Regen. 21 (2013); Wound Healing Society Topische Phagentherapie bei chron. diabetischen Wunden: Phagencocktail in 2 Nagetiermodellen: Bakterienreduktion, verbesserte Wundheilung mit kleineren Epithelspalten bei S. aureus und P. aeruginosa

idse.net


Sb-1-ähnliche S. aureus- Phagen: eine Phagenfamilie

Sb-1-ähnliche Phagen des ELIAVA-Instituts wurden in der DSMZ auf ihr Wirtsspektrum

gegen MRSA der lfd. Diagnostik getestet (MHH, S. Suerbaum)

Phage 232

„Spot test“ mit 4 von 9 Phagen gegen MRSA

Phage Sb-1: lytisch für ca. 90% aller S. aureus-Stämme

wurde bereits i.v. appliziert:

L. Kvachadze et al., Microb. Biotechnol. 4 (2011) Fotos: M. Rohde


S. aureus / MRSA – DSMZ-Forschung

Jeder neue Phage ist willkommen!

Phage „Eberhard“ gegen S. aureus, isoliert aus

Schweinenase

(J. Wittmann & M. Rohde)

MRSA / M. Rohde


Elektronenmikroskopie (TEM & SEM) klärt wichtige Fragen

Phagenpartikel haben oft Kopfgrößen von 30-100 nm, Schwanzlängen variieren je nach taxonomischer Gruppe:

T4, myovirus lambda, siphovirus T7, podovirus

Aus der eigenen Forschung: neue Phagen gegen den opp. pathogenen

A. xylosoxidans

J. Wittmann et al., Virology J. 11 (2014) J. Wittmann et al., PLoS ONE 9 (2014)

T4, myovirus lambda, siphovirus T7, podovirus

SEM of phage JWAlpha adsorbed to Achromobacter DSM 11852 cells (M. Rohde & J. Wittmann).


Eine neue Sammlung für einen opportunistisch pathogenen Erreger

Zahlreiche neue Phagen isoliert von B. Dreiseikelmann, Univ. Bielefeld

Phage Bi2

Serratia marcescens Phagen


Kooperation mit Charité-Universitätsmedizin Berlin Phagen gegen P. aeruginosa & A. baumannii

Voraussetzung: ausreichend Phagen pro Bakterienart

Multi- bzw. panresistente P. aeruginosa-Isolate wurden zum Screenen neuer Phagen genutzt. Die meisten Isolate wurden spontan durch Phagen „abgedeckt“

Phi PaCh5

Präklinische Forschung im Visier

Phi PaCh1 Phi PaCh1

Phi PaCh5


Wanted!: Acinetobacter baumannii Phagen - Präklinisches in vivo Maus-Lungenmodell -

Leibniz Institut DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

8 neue Phagen gegen A. pittii aus Oker-Wasser gefunden, typisch: große Plaques mit Halos – ….. aber A. baumannii-Phagen?

Phage Acibel 004 gegen A. baumannii, freundlich überlassen von M. Merabishvili

QAMH, Brüssel


Acinetobacter baumannii Spezies-ID schwierig!

Helsinki University Hospital: von 55 Acinetobacter-Isolaten 18 A. baumannii, 19 A. pittii (pers. Mitt. M. Skurnik) Empfohlene ID-Methoden: MALDI-TOF: matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry Zu beachten aber die jeweiligen Datenbanken! MLST-PCR-Sequenzierung (bla oxa51, rpoB) Nicht hinreichend zuverlässig: VITEK 2 BIOMÉRIEUX

A. baumannii Stämme: T. Chakraborty, Univ.-Klin. Gießen, TEM: M. Rohde, HZI

Leibniz-Institut • DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Leibniz Institut DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

Warum penetrieren Phagen Biofilme? •Exopolymer-abbauende Enzyme •Studien deuten auf weitere begünstigende Phagen-Eigenschaften: Phagen nutzen Mukosa-Gewebeoberflächen zur Wirkungsverstärkung

Einige Phagen codieren Polysaccharid-Depolymerase. Hier deutliche Höfe um klare Plaques: D. Harper et al.: Bacteriophages and Biofilms. Antibiotics (2014) F. Rossmann et al.: Phage-mediated dispersal of biofilm and distribution of bacterial virulence genes is induced by quorum sensing. PLOS Pathogens (2015)

Phage gegen A. pittii


Vier neue Coliphagen einer großen neuen Phagenserie (H. Lehnherr & M. Rohde)

Cocktail-Anpassung für Stall- und Feldversuche je nach

Zielbakterien-Wirtsbereich

Die „Schnittstelle“… Reduktion von ESBL* E. coli in der Hähnchenmast und der

Antibiotikalast in der Umwelt

Projektbeginn: Jan. 2016, Projektpartner: • PTC, Phage Technology Center GmbH • Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover • Leibniz-Institut DSMZ

*ESBL: extended spectrum ß-lactamase


Reduktion von ESBL E. coli in der Hähnchenmast und der Antibiotikalast in der Umwelt

Phagensuche, Titerquantifizierung, Tagesauswertung (I. Schmidt)


Buchempfehlung zum 100. Geburtstag der

Phagenentdeckung

„Die spezifische Literatur ist sehr viel reicher als gedacht!“

Elizabeth Kutter


Und danke an die DSMZ und ihre Ressourcen

Danke: Johannes Wittmann

Imke Schmidt Bettina Henze Stefanie Letzel Julia Sabirova

Stephanie Peter

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!

Danke: Manfred Rohde, HZI: Alle TEM/SEM-Abb.

Christine Rodhe: Phagen - Viren gegen Bakterien

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