Chromatogramme richtig integrieren und bewerten...Chromatogramme richtig integrieren und bewerten...

15
Chromatogramme richtig integrieren und bewerten Ein Praxishandbuch für die HPLC und GC Herausgegeben von Stavros Kromidas und Hans-Joachim Kuss

Transcript of Chromatogramme richtig integrieren und bewerten...Chromatogramme richtig integrieren und bewerten...

  • Chromatogramme richtig integrieren und bewerten

    Ein Praxishandbuch für die HPLC und GC

    Herausgegeben von Stavros Kromidas und Hans-Joachim Kuss

    1364vch00.indd III1364vch00.indd III 01.04.2008 10:31:0901.04.2008 10:31:09

    InnodataFile Attachment9783527622238.jpg

  • 1364vch00.indd XIV1364vch00.indd XIV 31.03.2008 21:15:0831.03.2008 21:15:08

  • Chromatogramme richtig integrieren und bewerten

    Herausgegeben von Stavros Kromidas und Hans-Joachim Kuss

    1364vch00.indd I1364vch00.indd I 01.04.2008 10:31:0901.04.2008 10:31:09

  • Beachten Sie bitte auch weitere interessante Titel zu diesem Thema

    W. Gottwald

    Statistik im LaborAnwendungen in der analytischen Chemie2., vollständig überarbeitete Aufl age

    2007

    ISBN 978-3-527-32011-0

    S. Kromidas (Hrsg.)

    HPLC richtig optimiertEin Handbuch für Praktiker

    2006

    ISBN 978-3-527-31470-6

    V. R. Meyer

    Fallstricke und Fehlerquellen der HPLC in Bildern

    2006

    ISBN 978-3-527-31268-9

    V. R. Meyer

    Praxis der Hochleistungs-Flüssigchromatographie

    2004

    ISBN 978-3-527-30726-5

    1364vch00.indd II1364vch00.indd II 01.04.2008 10:31:0901.04.2008 10:31:09

  • Chromatogramme richtig integrieren und bewerten

    Ein Praxishandbuch für die HPLC und GC

    Herausgegeben von Stavros Kromidas und Hans-Joachim Kuss

    1364vch00.indd III1364vch00.indd III 01.04.2008 10:31:0901.04.2008 10:31:09

  • Alle Bücher von Wiley-VCH werden sorgfältig erarbeitet. Dennoch übernehmen Autoren, Herausgeber und Verlag in keinem Fall, einschließlich des vorliegenden Werkes, für die Richtigkeit von Angaben, Hinweisen und Ratschlägen sowie für eventuelle Druckfehler irgendeine Haftung.

    Bibliografi sche Information der Deutschen NationalbibliothekDie Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografi e; detaillierte bibliografi sche Daten sind im Internet über abrufbar.

    2008 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

    Alle Rechte, insbesondere die der Übersetzung in andere Sprachen, vorbehalten. Kein Teil dieses Buches darf ohne schriftliche Genehmigung des Verlages in irgendeiner Form – durch Photokopie, Mikroverfi lmung oder irgendein anderes Verfah-ren – reproduziert oder in eine von Maschinen, insbesondere von Datenverarbeitungsmaschinen, verwendbare Sprache übertragen oder übersetzt werden. Die Wiedergabe von Warenbezeich-nungen, Handelsnamen oder sonstigen Kenn-zeichen in diesem Buch berechtigt nicht zu der Annahme, dass diese von jedermann frei benutzt werden dürfen. Vielmehr kann es sich auch dann um eingetragene Warenzeichen oder sonstige gesetzlich geschützte Kennzeichen handeln, wenn sie nicht eigens als solche markiert sind.

    Printed in the Federal Republic of GermanyGedruckt auf säurefreiem Papier

    Umschlaggestaltung Schulz Grafi k-Design, FußgönheimSatz Manuela Treindl, LaaberDruck betz-druck GmbH, DarmstadtBindung Litges & Dopf GmbH, HeppenheimISBN 978-3-527-31774-5

    Herausgeber

    Dr. Stavros KromidasRosenstraße 1666125 Saarbrücken

    Dr. Hans-Joachim KussPsychatrische Klinik derLudwig-Maximilians-UniversitätNussbaumstraße 780336 München

    1364vch00.indd IV1364vch00.indd IV 01.04.2008 10:31:0901.04.2008 10:31:09

  • V

    Inhaltsverzeichnis

    Vorwort XIII

    Autorenliste XV

    Zum Aufbau des Buches XVII

    Teil I Auswertung in der Chromatographie – die Integration 1

    1 Das Chromatogramm 3Daniel Stauffer

    1.1 Chromatographischer Prozess 31.1.1 Selektivität und Effi zienz – Maß für die unterschiedliche

    Wanderungsgeschwindigkeit 41.2 Chromatographische Kenngrößen 51.2.1 Retentionsgrößen 51.2.1.1 Totzeit (tm; t0) 51.2.1.2 Bruttoretentionszeit (tms; tR) 51.2.1.3 Nettoretentionszeit (ts) 61.2.1.4 Retentionsfaktor oder Kapazitätsfaktor (k; k ) 61.2.2 Peak-Ausdehnung und Peakform 61.2.2.1 Basispeakbreite (wb) 61.2.2.2 Peakbreite in halber Höhe (wh) 71.2.2.3 Peakhöhe (h) 71.2.2.4 Peaksymmetrie, Tailingfaktor (T ) 71.2.3 Aufl ösungsgrößen 91.2.3.1 Die Aufl ösung (R) 91.2.3.2 Quantitative Größe der Selektivität 101.2.3.3 Quantitative Größen für die Effi zienz der Trennsäule 111.2.4 Bestimmung von kleinen Substanzmengen 121.2.4.1 Ermitteln der Nachweis-, Erfassungs-, Entscheidungs- und

    Bestimmungsgrenze 13

    1364vch00.indd V1364vch00.indd V 31.03.2008 21:14:5531.03.2008 21:14:55

  • VI

    1.3 van Deemter- und Golay-Gleichung 151.4 Erzeugen von Chromatogrammen 181.4.1 Datenaufnahme, Erzeugen der Rohdaten 191.4.1.1 Bei der Datenaufnahme verwendete Parameter 221.4.1.2 Beispiele der unterschiedlichen Art der Datenaufnahme 241.4.1.3 Innere/äußere Chromatogramme 281.4.1.4 2-D-/3-D-Chromatogramme 281.4.2 Charakterisierung von Detektoren 301.4.2.1 Zerstörend/nicht zerstörend 311.4.2.2 Selektiv, spezifi sch, universell 311.4.2.3 Konzentrations- und massenstromabhängige Detektoren 311.4.2.4 Detektorempfi ndlichkeit 331.4.2.5 Linearer und dynamischer Bereich 341.4.2.6 Ansprechzeit, Zeitkonstante 351.5 Integration 391.5.1 Integration anschaulich 391.5.1.1 Methoden zur Peakerkennung 411.5.2 Integration und Integrationsparameter, Beispiele 431.5.2.1 Datenaufnahme und -integration mit Empower 2 431.5.2.2 Datenaufnahme und -integration mit Chromeleon 451.5.2.3 Datenaufnahme und -integration mit EZChrom Elite 471.5.2.4 Datenaufnahme und -integration mit ChemStation 471.5.2.5 Vergleich der wichtigsten Integrationsparameter von vier

    unterschiedlichen Integrationsprogrammen 48 Anhang: Experimente zur Optimierung der Zeitkonstante/

    Datensammelrate 50Literatur 53

    2 Integrationsfehler und Auswertung 55Hans-Joachim Kuss

    2.1 Was sagt die Literatur über Integrationsfehler? 552.2 Integration in der täglichen Praxis 582.2.1 Integration – einfach und immer gleich? 582.2.2 Vergleich von Integrationssystemen mit wenigen großen Peaks 612.2.3 Vergleich von Integrationssystemen mit vielen kleinen Peaks 642.3 Chromatogramm-Simulation 662.3.1 Simulation eines digitalen Chromatogramms 682.3.2 Ein Peak 692.3.3 Mehrere Peaks 712.3.4 Rauschen 722.3.5 Drift 722.3.6 Gaschromatogramm 752.3.7 Verschmolzene Peaks 772.3.8 Datenpunktabstand 812.3.9 Tailing 87

    Inhaltsverzeichnis

    1364vch00.indd VI1364vch00.indd VI 31.03.2008 21:14:5531.03.2008 21:14:55

  • VIIInhaltsverzeichnis

    2.3.10 Peakfl äche und Peakhöhe 872.3.11 Andere Kenngrößen 882.4 Anwendungen der Simulation 892.4.1 Simulation einer Kalibriergeraden 912.4.2 Zehnfache Simulation an der Bestimmungsgrenze 982.4.3 Simulation eines isokratischen Chromatogramms 1032.4.4 Simulation eines Gradienten-Chromatogramms 1072.4.5 Nebenproduktanalyse 1132.4.6 Eigene Chromatogramme simulieren 1232.4.7 Welche Konsequenz ist daraus zu ziehen? 1272.5 Auswertung 1282.5.1 Auswertemethoden 1292.5.2 Kalibrierung 1312.5.3 Lineare Regression 1312.5.4 Gewichtete lineare Regression 1362.5.5 Nullpunktsgerade 1402.5.6 Chromatogrammserien überprüfen 140

    Literatur 142

    3 Allgemeine Beurteilung analytischer Daten 145Joachim Ermer

    3.1 (Normal-)Verteilung von analytischen Daten 1453.2 Probleme des Schließens 1493.3 Analytische Variabilität 1533.3.1 Variabilitätsbeiträge und Präzisionsebenen 1533.3.2 Systempräzision 1553.3.3 Wiederholpräzision 1573.3.4 Vergleichspräzision 1593.3.4.1 Varianzanalyse 1603.3.4.2 Literaturangaben zur Vergleichspräzision 1623.3.5 Konsequenzen für das Design eines Prüfverfahrens 1633.3.6 Konzentrationsabhängigkeit der Präzision 1653.3.7 Schlussfolgerungen 1683.4 (Be)Merkenswertes 168

    Literatur 169

    4 Metrologische Aspekte der Beurteilung chromatographischer Daten 171Ulrich Panne

    4.1 Einführung 1714.2 Messunsicherheit 1734.3 Rückführbarkeit von analytischen Messungen 186

    Literatur 189

    1364vch00.indd VII1364vch00.indd VII 31.03.2008 21:14:5531.03.2008 21:14:55

  • VIII Inhaltsverzeichnis

    Teil II Die Charakteristika der Auswertung in einzelnen LC-Modi 191

    5 Auswertung von GC-Daten 193Werner Engewald

    5.1 Einführung 1935.2 Worin unterscheidet sich die GC von der HPLC? 1945.2.1 Welche Konsequenzen ergeben sich aus diesen Unterschieden? 1955.2.1.1 Anwendbarkeit der GC 1955.2.1.2 Probeninjektion 1995.2.1.3 Trennsäule 2005.2.1.4 Detektor 2015.2.1.5 Schnelle Gaschromatographie 2035.3 Qualitative Analyse 2045.3.1 Vorbemerkung 2045.3.1.1 Fingerprint-Analyse 2055.3.1.2 Peakreinheit 2055.3.2 Vergleich von Retentionswerten 2065.3.3 Relative Retentionswerte 2065.3.4 Retention Time Locking (RTL) 2075.4 GC/MS-Kopplung 2085.4.1 MS als identifi zierender Detektor (Scan-Modus) 2095.4.2 Nutzung von Spektrenbibliotheken 2105.4.3 Spektren-Deconvolution 2135.4.4 MS als massenselektiver Detektor 2155.4.4.1 Massenfragmentographie (Reconstructed oder Extracted Ion

    Chromatogramm) 2155.4.4.2 SIM (Single Ion Monitoring) oder MID (Multiple Ion Recording) 2165.4.5 Chemische Ionisation 2175.5 Quantitative Analyse 2185.5.1 Aufstellen einer Analysensequenz 2195.6 Isotopenverdünnungsanalyse (IVA) oder Stabilisotopen-

    verdünnungsanalyse (SIVA) 2195.7 Matrixeffekte bei der Spurenanalytik 2205.8 Headspace-GC 2215.9 Abschätzung von Korrekturfaktoren beim FID 222

    Literatur 224

    6 Bewertung chromatographischer Daten in der Ionenchromatographie (IC) 225Heiko Herrmann und Detlef Jensen

    6.1 Einleitung 2256.2 Eluenten 2266.2.1 Der Wasserdip – Lösemittelpeak der Ionenchromatographie 2276.3 Kontaminationen 2306.4 Kalibrierfunktionen 232

    Literatur 233

    1364vch00.indd VIII1364vch00.indd VIII 31.03.2008 21:14:5531.03.2008 21:14:55

  • IXInhaltsverzeichnis

    7 Qualifi zierung von GPC/GFC/SEC-Daten und -Ergebnissen 235Daniela Held und Peter Kilz

    7.1 Einleitung 2357.2 Grundlagen der GPC-Datenverarbeitung in der Ausschluss-

    chromatographie 2367.2.1 Berechnung der Molekulargewichtsmittelwerte 2387.3 Richtlinien, Normen und Anforderungen an GPC-

    Datenverarbeitungsprozesse 2417.4 Bewertung und Tests der GPC-Datenbearbeitungsprozesse 2437.4.1 Beschreibung eines allgemeinen Verifi kationsverfahrens für

    GPC-Software 2437.4.2 Überprüfung der Richtigkeit der Berechnung der

    Molmassenverteilung 2457.5 Einfl uss von Datenprozessen, Kalibrationsverfahren und

    Signalqualität auf Richtigkeit und Reproduzierbarkeit von GPC-Ergebnissen 248

    7.5.1 Prüfung der GPC-Auswertung mit direkter Kalibration 2487.5.2 Überprüfung der Ergebnisgenauigkeit einer GPC-Viskositäts-

    kopplung 2497.5.3 Einfl uss des Detektor-Rauschens auf die Genauigkeit von GPC-

    Ergebnissen 2507.5.4 Einfl uss der Detektordrift auf die Genauigkeit von GPC-

    Ergebnissen 2527.5.5 Einfl uss der Datendichte auf die Genauigkeit von GPC-

    Ergebnissen 2537.6 Einfl uss von GPC-spezifi schen Größen auf Verlässlichkeit und

    Richtigkeit von GPC-Resultaten 2547.6.1 Einfl ussgrößen für GPC mit direkter Kalibration 2557.6.1.1 Einfl uss der Kalibration 2557.6.1.2 Einfl uss der Geräteeigenschaften (Geräteperformance) 2597.6.1.3 Einfl uss der Auswerteparameter 2607.6.2 Einfl ussgrößen für GPC mit Lichtstreudetektion 2627.6.3 Vergleichspräzision und Wiederholbarkeit von GPC-Analysen 2657.7 Zusammenfassung 265

    Literatur 266

    8 Auswertung in der LC-MS-Kopplung 267Hartmut Kirchherr

    8.1 Einleitung 2678.2 Chromatographie und Matrixeinfl uss 2688.3 Interne Standards 2768.4 Einstellungen Massenspektrometer 2808.5 Auswertesoftware 282

    Literatur 283

    1364vch00.indd IX1364vch00.indd IX 31.03.2008 21:14:5531.03.2008 21:14:55

  • X Inhaltsverzeichnis

    Teil III Anforderungen an und Umgang mit chromatographischen Daten aus Sicht von Organisationen und Behörden 285

    9 Beurteilung von analytischen Daten in der Lebensmittelanalytik 287Herbert Otteneder

    9.1 Aufgaben der Behörde 2879.2 Problembereiche 2879.2.1 Pfl anzenschutzmittelrückstände 2899.2.1.1 In-house-Qualitätskontrolle (= IQC: Internal Quality Control) 2929.2.1.2 Laborvergleichsuntersuchung (LVU), Profi ciency Test 2929.2.1.3 Validierungsstudie (Method Performance Study) 2939.2.2 Schadstoffe, Kontaminanten und Mykotoxine 2949.2.3 Pharmakologisch wirksame Stoffe 2959.3 Defi nition und Bestimmung der Messunsicherheit 2979.3.1 Analyse der Einzelkomponenten, „bottom-up“-Prinzip 2979.3.2 Berechnung aus der Vergleichsstandardabweichung,

    „top down“-Prinzip 2989.3.3 Berechnung mit der Horwitz-Gleichung 2989.3.4 Der „Tauglichkeits“-Ansatz 2999.3.5 Ergebnis-Interpretation mit Hilfe der Messunsicherheit 2999.4 Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze 3009.5 Das Problem der Wiederfi ndung 3039.6 Die Probennahme 3069.7 Nationale und internationale Leitlinien und Gremien zur

    Qualitätssicherung in der Analytischen Chemie 309Literatur 312

    10 Beurteilung von analytischen Daten aus Behördensicht – Regelarbeitsweise und AQS für selten angewandte und zeitaufwändige Analysenverfahren 315Günter Papke

    10.1 Einleitung 31510.2 Werkzeuge und Defi nitionen für die AQS 31610.2.1 Kontrollproben 31610.2.2 Kontrollkarten/Zielwertkarten 31610.2.3 Objektbezogene AQS 32010.2.4 Stichproben-AQS 32010.2.5 Stellvertreterproben-AQS 32010.2.6 Validierung von Analysenverfahren 32010.2.7 Messunsicherheit 32310.2.8 Zusammengefasste AQS-Werkzeuge 32410.3 Praxis der AQS 32810.3.1 Hierarchisch aufgebaute AQS 32810.3.2 Praxis bei selten angewandten und zeitaufwändigen

    Analysenverfahren 330

    1364vch00.indd X1364vch00.indd X 31.03.2008 21:14:5531.03.2008 21:14:55

  • XIInhaltsverzeichnis

    10.3.2.1 AQS-Vorgehensweise für selten angewandte Analysenverfahren 33110.3.2.2 AQS-Vorgehensweise für zeitaufwändige Analysenverfahren 33310.4 Beurteilung der Analysenergebnisse 33610.5 Fazit und Ausblick 337

    Literatur 338

    11 Auswertung Chromatographischer Daten nach den Arzneibüchern – Kontrolle von Verunreinigungen 339Ulrich Rose

    11.1 Problemstellung 33911.2 Auswertung qualitativer Daten 34011.2.1 Systemeignungstest 34311.3 Auswertung quantitativer Daten 345

    Literatur 347

    12 Anforderungen an analytische Prüfverfahren im Rahmen der Arzneimittelzulassung 349Susanne Keitel

    12.1 Einführung 34912.2 Beschreibung chromatographischer Prüfverfahren im

    Zulassungsdossier 34912.3 Arzneibuchverfahren 35212.4 Anforderungen an die Validierung und Bewertung durch die

    Zulassungsbehörde 35512.5 Anforderungen der Zulassungsbehörde im Rahmen von Anträgen

    auf Genehmigung klinischer Prüfungen 36012.5.1 Häufi ge Mängel 36112.5.2 Spezielle Mängel 36112.5.3 Fallbeispiele 362

    Literatur 364

    13 Anforderungen an (chromatographische) Daten in der pharmazeutischen Analytik 365Joachim Ermer

    13.1 Systemeignungstests 36513.1.1 Europäisches Arzneibuch (EP) 36713.1.1.1 Chromatographische Parameter 3691.3.1.2 Signal/Rausch-Verhältnis 37013.1.1.3 Systempräzision 37113.1.2 US-Arzneibuch 37313.1.3 FDA Reviewer Guidance 37413.2 Spezifi kationsgrenzen und Präzision 37513.2.1 Gehaltsbestimmungen 37513.2.1.1 Auf Grundlage des Methodenfähigkeitsindex 37513.2.1.2 Auf Grundlage des 95-%-Prognosebereiches (DPhG-Verfahren) 376

    1364vch00.indd XI1364vch00.indd XI 31.03.2008 21:14:5531.03.2008 21:14:55

  • XII Inhaltsverzeichnis

    13.2.2 Nebenproduktbestimmungen 37713.2.3 (Be)Merkenswertes 37813.3 Interpretation und Behandlung analytischer Daten 37813.3.1 Voraussetzungen 37813.3.2 Messprinzipien und Variabilität 37813.3.3 Ausreißer 37913.3.4 Vergleich von Analysenergebnissen 38013.3.5 Präzision 38013.3.6 Richtigkeit 38213.3.7 (Be)Merkenswertes 383

    Literatur 384

    14 Über Bewertung und Wertung chromatographischer Daten 385Stavros Kromidas

    14.1 Einleitung 38514.2 Die Situation – oder warum ändert sich so wenig? 38514.3 Wie kann sich etwas ändern und wann ist es überhaupt

    notwendig? 38714.4 Wer kann etwas ändern? 390

    Stichwortverzeichnis 393

    1364vch00.indd XII1364vch00.indd XII 31.03.2008 21:14:5531.03.2008 21:14:55

  • XIII

    Vorwort

    In der Chromatographie liegt der Fokus auf der Probenvorbereitung und der Trennung selbst. Das ist auch gut so, denn eine schlechte Trennung ist im Nachhinein nicht „reparierbar“. Wir haben allerdings den Eindruck gewonnen, dass im Alltagsstress der anschließenden Auswertung und auch der Bewertung der Ergebnisse nicht immer mit der gebührenden Vorsicht begegnet wird. Man verlässt sich gerne auf die Auswerteprogramme – schließlich ist ja die Integrati-onssoftware validiert und dies wird per Hersteller-Zertifi kat „belegt“. Dass sich die Integrationsalgorithmen seit 30 Jahren nur unwesentlich geändert haben und dass z. B. die Fläche verschmolzener Peaks stets per Lotfällung bestimmt wird, wird kaum als Problem registriert. Auch reduziert sich die Bewertung der Ergebnisse oft auf die Frage: „Passt der VK und ist mein Wert „in spec“?“. Das mag manchmal ausreichen, manchmal aber auch nicht.

    Wir möchten uns in diesem Buch z.B. mit den folgenden Fragen beschäftigen: „Wie „richtig“ integrieren eigentlich kommerzielle Systeme?“, „Kann man dies überhaupt überprüfen?“, „Wie wichtig sind Einstellparameter, was bewirken sie?“ usw. Wir wollten uns aber auch mit Fragen auseinandersetzen, wie: „Wie kann ich ein Ergebnis wirklich beurteilen?“, „Wie wahrhaftig kann ein Ergebnis sein?“ und schließlich: „Was sagt „die Behörde“ dazu, was muss ich tun, wo bin ich frei?“. Dazu haben wir erfahrene Kollegen eingeladen, die ihr Wissen in diversen Bereichen zur Verfügung gestellt haben. Diesen Kollegen gilt unser herzlicher Dank.

    Das Ziel des Buches ist es, zum einen aufzuzeigen, dass man Auswertesys-temen vielleicht nicht immer blind vertrauen sollte und dass es sich lohnt, ein tieferes Verständnis für das Integrieren zu entwickeln. Zum anderen einen Bei-trag zu leisten, wie chromatographische Ergebnisse kritisch hinterfragt werden können, vor allem wenn es um brisante quantitative Aussagen geht. Wir hoffen, dem Leser möglichst viele Anregungen und Ideen zu geben, die eigene „rich-tige“ Auswerte- und Bewertungspraxis zu fi nden. Dem Verlag WILEY-VCH und insbesondere Frank Weinreich und Steffen Pauly danken wir für die sehr gute Zusammenarbeit.

    Saarbrücken und München Stavros KromidasJanuar 2008 Hans-Joachim Kuss

    1364vch00.indd XIII1364vch00.indd XIII 31.03.2008 21:15:0831.03.2008 21:15:08