Chromatographie II HPLC - uni-regensburg.de
58
1 Chromatographie II WS 2019/20 R. Vasold HPLC Seminar Chromatographie II
Transcript of Chromatographie II HPLC - uni-regensburg.de
1
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
d
HPLC SeminarHPLC Seminar
Chromatographie II
2
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.1 Einleitung (siehe Skript Praktikum)
I.3 Die stationäre PhaseI.4 Die mobile PhaseI.5 Die Pumpe(n)I.6 Die InjektionseinheitI.7 Die DetektoreinheitI.8 Die SoftwareI.9 Die Methode des ISTDI.10 Aufgaben zum theoretischen Teil
I.2 Ziele des Praktikums
Chromatographie II HPLC Praktikum
3
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
d
Über den Aufbau einer HPLC-Anlage, sowie über stationäre und mobile Phase Bescheid wissen.
Wichtige chromatographische Kenngrößen(z.B. tm, tR(X), Vm, VR(X), um, u(X), k etc.)bestimmen können.
Nach diesem Praktikum soll man u.a.:
Eine quantitative Bestimmung mit der Methode des Internen Standards durchführen können.
I.2 Ziele des Praktikums
Ziel 1
Ziel 2
Ziel 3
Ziel 4
Über die Einzelbestandteile (wie z.B. Pumpen, Injektoreinheit und Detektoren) Bescheidwissen.
Chromatographie II
4
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
d
Kapitel I Theoretischer TeilKapitel I Theoretischer Teil
5
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.2.1 Komponenten der HPLC AnlageI Theoretischer Teil
1
2
3
45
6
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.2.1 Komponenten der HPLC AnlageI Theoretischer Teil
Abb. I.2.1: Komponenten eines HPLC-Systems
2
3
45
1
7
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.3 Die Stationäre PhaseI Theoretischer Teil
Normal-Phase-Chomatographie: NP
Stationäre Phase polar
Mobile Phase unpolar
Reversed-Phase-Chomatographie: RP
Stationäre Phase unpolar
Mobile Phase polar
Adsorptions-Chromatographie teilt sich auf in:
8
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.3 Die Stationäre PhaseI Theoretischer Teil
Abb. I.3.1: Komponenten eines HPLC-Systems (Säule)
9
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.3 Die Stationäre Phase
Abb. I.3.2: Darstellung einer HPLC-Säule
Stationäre Phase
End-Kartusche
I Theoretischer Teil
10
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
d
Abb. I.3.3: Darstellung der Einzelpartikel
Partikel (z.B.sphärisch)
3µm -10µm
I.3 Die Stationäre PhaseI Theoretischer Teil
11
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.3.1 Beispiele stationärer Phasen
Abb. I.3.1.a: Material mit polaren Silanol- (SiOH)- Endguppen
I Theoretischer Teil
Nor
mal
-Pha
se
12
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
d
Abb. I.3.1.b: Material mit unpolaren CH3-Endgruppen
RP-
Phas
e
I Theoretischer TeilI.3.1 Beispiele stationärer Phasen
13
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
d
Abb. I.3.1c: Material mit unpolaren C4-Endgruppen
RP-
Phas
e
I Theoretischer TeilI.3.1 Beispiele stationärer Phasen
14
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
d
Abb. I.3.1.d: Material mit unpolaren C8-Endgruppen
RP-
Phas
e
I Theoretischer TeilI.3.1 Beispiele stationärer Phasen
15
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
d
Abb. I.3.1e: Material mit C18-Endgruppen
RP-
Phas
e
I Theoretischer TeilI.3.1 Beispiele stationärer Phasen
16
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
d
Im Praktikumsversuch wird folgende Säule eingesetzt:
Hersteller: Fa. PhenomenexDimensionen: 150 mm x 4.6 mm (ID)Material: 3 µmstationäre Phase: C18
I Theoretischer TeilI.3.1 Beispiele stationärer Phasen
17
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.4 Die mobile PhaseI Theoretischer Teil
Normal-Phase-Chomatographie: NP
Stationäre Phase polar
Mobile Phase unpolar
Reversed-Phase-Chomatographie: RP
Stationäre Phase unpolar
Mobile Phase polar
Adsorptions-Chromatographie teilt sich auf in:
18
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.4 Die mobile PhaseI Theoretischer Teil
Abb. I.4.1: Komponenten eines HPLC-Systems (Eluenten)
19
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.4.1 Die Eluotrope Reihe= Anordnung der Laufmittel nach steigender Elutionskraft E0
(≙ Polarität) bezogen auf NP-Phase (empirisch bestimmt)
I Theoretischer Teil
<190>1,11Wasser
2050,95Methanol
2100,822-Propanol
1900,65Acetonitril
2750,63Diethylamin
2700,62Dimethylsulfoxid
RP-
Chr
omat
ogra
phie
2600,58Essigsäureethylester
3300,56Aceton
2300,42Dichlormethan
2450,40Chloroform
2850,29Toluol
1900,00n-Hexan
NP-
Chr
omat
ogra
phie
UV-Grenze [nm]
Elutionskraft[E0 (Al2O3)]
Eluentha
upts
ächl
iche
Ve
rwen
dung
in
Abb. I.4.1.a: Die Eluotrope Reihe (Auszug)
20
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.4.1 Die Eluotrope Reihe
Für die Normalphasen-(NP)-Chomatographie gilt:
n-Hexan CHCl3 CH2Cl2 2-Propanol
E0 = 0,00 E0 = 0, 40 E0 = 0,42 E0 =0,82
I Theoretischer Teil
Elutionskraft = Fähigkeit des Fließmittels Substanzen inder Säule weiter zu befördern
21
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.4.1 Die Eluotrope ReiheBeispiel für die Normalphasen-(NP):
I Theoretischer Teil
50% Hexan + 50% 2-Pr
60% Hexan + 40% 2-Pr
70% Hexan + 30% 2-Pr
80% Hexan + 20% 2-Pr
90% Hexan + 10% 2-Pr
Abb. I.4.1.b: Entwicklung einer NP-Trennung (isokratisch)
E0 = 0,00 E0 = 0,82El
utio
nskr
aft s
inkt
Retentionszeiten steigen
22
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
d
Für die Reversed-Phase-(RP)-Chomatographie gilt:
I Theoretischer TeilI.4.1 Die Eluotrope Reihe
THF CH3CN Methanol H2O
E0 = 0,45 E0 = 0, 65 E0 = 0,95 E0 > 1
Elutionskraft = Fähigkeit des Fließmittels Substanzen inder Säule weiter zu befördern
23
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.4.1 Die Eluotrope ReiheBeispiel für die Reversed-Phase-(RP)-Chomatographie:
I Theoretischer Teil
Abb. I.4.1.c: Entwicklung einer RP-Trennung (isokratisch)
70% CH3CN + 30% H2O
60% CH3CN + 40% H2O
40% CH3CN + 60% H2O
50% CH3CN + 50% H2O
Nebenprodukt
E0 = 0,65 E0 > 1El
utio
nskr
aft s
inkt
Retentionszeiten steigen
24
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.4.2 Die isokratische-Elution
Die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sichwährend der chromatographischen Trennung nicht:
Abb. I.4.2.: Eluentenverlauf bei isokratischer Elution
I Theoretischer Teil
25
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.4.3 Die Gradienten-Elution
Die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sichwährend der chromatographischen Trennung:
I Theoretischer Teil
Abb. I.4.3: Eluentenverlauf bei Gradienten Elution
26
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.5 Die Pumpe / Injektor / DetektorI Theoretischer Teil
Abb. I.5.a: Komponenten eines HPLC-Systems (Pumpe,Detektor, Injektionseinheit)
27
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.5 Die Pumpe
Abb. I.5.b: Kolbenpumpe
Einlaßventil
Auslaßventil
Kolben
I Theoretischer Teil
28
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.5 Die Pumpe
Abb. I.5.c: Einkolben-Pumpe
Kolben
Auslaßventil
Einlaßventil
I Theoretischer Teil
Kolbenantrieb
29
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.5 Die Pumpe
Abb. I.5.e: Diaphragma-Pumpe
Hydraulik-Flüssigkeit
MembranKolben
I Theoretischer Teil
30
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.6 Die Injektionseinheit
Probengläschen
Injektionsnadel
Ventil
Abb. I.6.a:Funktionsweise Autosampler
I Theoretischer Teil
Proben-Schleife
Pumpe Säule
31
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.7 Die Detektoreinheit
Abb. I.7: UV/VIS - Detektor (VWD oder MWD) jeweils nur eine Wellenlänge einstellbar
Spalt
Deuteriumlampe
Gitter
Flußzelle
I Theoretischer Teil
I.7.1 Der UV/VIS-Detektor
Photozelle
32
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
d
Abb. I.7.2: Der Photodiodenarray-Detektor
Deuteriumlampe
Gitter
Spalt Photodioden
Flußzelle
I Theoretischer Teil
I.7.2 Der Diodenarray-Detektor (UV/VIS)I.7 Die Detektoreinheit
33
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.7.2.1 Der ISO-Plot (DAD-Detektor)I Theoretischer Teil
Abb. I.7.2.1: Isoplot einer chromatographischen TrennungZeit [min]
Wel
lenl
änge
[nm
]Absorption0 mAU 100 mAU
34
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
d
I Theoretischer Teil
Abb. I.7.2.2: 3-D-Plot einer chromatographischen Trennung
I.7.2.2 Der 3D-Plot (DAD Detektor)
Abs
orpt
ion
[mA
U]
35
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.7.3 Der MS-Detektor
Quadrupol IonenfalleIonenquelle
HPLC
Abb. I.7.3: Vereinfachte Darstellung eines HPLC-MS-Detektors
I Theoretischer Teil
36
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.7.4 HPLC-Detektoren (Auswahl)I Theoretischer Teil
Abb. I.7.4: häufig eingesetzte HPLC-Detektoren
HPLC-Detektoren Anwendung Nachweisgrenze Linearität
UV/VISDAD (Diodenarray-Detektor);
selektiv für UV/VIS-aktiveAnalyte (ca. 190-950 nm)
ca. 0,3 ng/mL 1 x 104
RI (Refractive-Index-Det.) Brechungsindex
Analyte mit unterschiedlichem Brechungsindex zum Eluenten(temperaturabhängig, keine Gradientenelution, wenig empfindlich)
ca. 0,7 g/mL 3 x 103
FLD (Fluorescence-Det.)Fluoreszenz
selektiv nur für fluoreszierende Analyte
0,2 pg/mL (!) 103 - 104
ECD (Elektro-Chemical-Det.) elektrochemisch
selektiv, nur für oxidierbare bzw. reduzierbare Analyte
ca. 1,0 pg/mL (!) -
CD (Conductivity-Det.)Leitfähigkeit
Selektiv für Ionen a) ca. 105
ELSD (Evaporative-Light-Scattering-Det.)Verdampfungslichtstreuung.
Relativ Universell aber wenig empfindlich
modellabhängig -
MSD (Mass-Selective-Det.)Masse
Relativ universell aber Analytemüssen ionisierbar sein.
modellabhängig -
a) kann bis zu ca. 0,2% Unterschied in der Leitfähigkeit nachweisen.
37
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.8. Software
Abb. I.8: Software Open LAB ChemStation C.01.07 SR4
I Theoretischer Teil
38
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.9 Die Methode des Internen StandardsI Theoretischer Teil
Es kann zu „ganz normalen“ Schwankungenzwischen den Läufen kommen, wie:
Geringe Unterschiede im Injektionsvolumen(Luftblasen, manuelle Injektion).
Veränderungen des Säulenmaterials im Laufe des Meßbetriebes.
Veränderungen der Umgebungstemperaturetc.
...warum der Aufwand, wenn man exakt quantifizieren will ?
...warum ist eine externe Kalibrierung oft nicht ausreichend ?
39
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
d
Abb. I.9: Zugabe eines internen Standards (Tracer)
tm
Zeit [s]
tR(X1)
tR(X2)
tS(X1)tS(X2)
t t tR (X) S(X) m
I Theoretischer Teil
Interner Standard
I.9 Die Methode des Internen Standards
40
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.9 Die Methode des Internen Standards
Massenkonzentrationder Komponente iResponsefaktor
der Komponente i
Fläche derKomponente i
I Theoretischer Teil
imf iia = • (1)
Die Fläche eines Peaks ist mit der eingespritzten Stoffmenge bzw. der Massenkonzentration mi des Stoffesproportional:
41
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
d
K = Kalibrierlösung
KK
KK
I.9 Die Methode des Internen StandardsI Theoretischer Teil
fi = i
ima
zu bestimmende Substanz i
(2)
Tracer Substanz
fTr = Tr
Trma
Tr = Tracer
(3)
iKF = i
Tr
ff
=iTr
Tri
amam
Kalibrierfaktor der Komponente i
(4)
42
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.9 Die Methode des Internen Standards
Auflösen nach Massekonzentration der Komponente i
I Theoretischer Teil
x = Probenlösung
i
Tr
ff
= xi
xTr
xTr
xi
amam
(5)
mxi = mTr (6)
i
Tr
ff i
xTra
a xKFi
Aus Kalibriermessung vorher ermittelt
43
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dI.10 Fragen zum Theoretischen Teil (Auswahl)
1.) In welche zwei grundlegenden Typen von Phasensystemen kann die Adsorptionschromatographie unterschieden werden?
2.) Erklären sie den Begriff „endcapping“.3.) Welche Effekte hinsichtlich der Peakform können auftreten, wenn z.B. basische
Substanzen (Amine, Phenole) auf schlecht endgecappten RP-Phasen chromatographiert werden (2 Beispiele)?
4.) Nennen Sie mindestens drei Vorteile, die RP-Phasen im Vergleich zu NP-Phasenaufweisen.
5.) Was versteht man unter der Eluotropen Reihe, wie wurde sie bestimmt, und welchem Ordnungsprinzip folgt sie?
6.) Welcher Zusammenhang besteht zwischen Eo (Al2O3) und Eo (SiO2) ?7.) Zwischen welchen beiden grundlegenden Arbeitsweisen wird beim Einsatz der
mobilen Phase während einer chromatographischen Trennung unterschieden und wie nennt man diese Formen der Elution?
8.) Erläutern sie in diesem Zusammenhang die Begriffe „binärer“, „ternärer“ und „quaternärer“ Gradient.
9.) Nennen sie zwei Gründe, warum Eluenten entgast werden sollten.10.) Nennen sie vier mögliche Verfahren der Eluentenentgasung11.) Wie ist der Kalibrierfaktor KFi einer Komponente i definiert ?12.) Nennen sie mindestens vier Eigenschaften, die ein geeigneter Tracer aufweisen
muß.13.) Nennen sie einen wesentlichen Unterschied zwischen dem Bauprinzip eines
VWD-Detektors und eines DAD-Detektors. 14.) Erläutern sie in diesem Zusammenhang der Ausdruck: „Inverse Optik“.
Nennen sie neben UV/VIS vier weitere Arten von HPLC-Detektoren.
I Theoretischer Teil
44
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
d
Kapitel II Experimenteller TeilKapitel II Experimenteller Teil
45
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
d
Kapitel II: Experimenteller Teil
II.1 Einleitung (siehe Skript Praktikum)
II.2.1 Vorbereitung der Lösungen (siehe Skript)
II.2.1.1 Vorbereitung der Stammlösungen(siehe Skript Praktikum)
II.2 Versuchsdurchführung
II.2.1.2 Vorbereitung der Eich-(Kalibrierlösung)(siehe Skript Praktikum)
II.2.1.3 Vorbereitung der Probenlösungen(siehe Skript Praktikum)
II.2.2 Durchführung der HPLC-AnalysenII.3 Aufgaben zum experimentellen Teil
46
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
d
Coffein
II Experimenteller Teil
47
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dII.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen
Abb. II.2.2.1: Die Pumpen-Programmierung
II Experimenteller Teil
48
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dII.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen
Abb. II.2.2.2: Die Programmierung des Injektionsvolumens
II Experimenteller Teil
49
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dII.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen
Abb. II.2.2.3: Die Detektorprogrammierung (DAD)
II Experimenteller Teil
50
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dII.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen
Abb. II.2.2.4: Die Programmierung des Säulenthermostaten
II Experimenteller Teil
51
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dII.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen
Abb. II.2.2.5: Die Einstellung der Integrationsparameter
II Experimenteller Teil
52
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dII.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen
Abb. II.2.2.6: Die Programmierung des Autosamplers
II Experimenteller Teil
53
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dII.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen
Abb. II.2.2.7: Das Starten der Probensequence
II Experimenteller Teil
54
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dII.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen
Abb. II.2.2.8: Der Menüpunkt: Data-Analysis
II Experimenteller Teil
55
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dII.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen
Abb. II.2.2.9: Das Erstellen der Kalibriertabelle
II Experimenteller Teil
56
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dII.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen
Abb. II.2.2.10: Das Erstellen des Quantitativen Reports
II Experimenteller Teil
57
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
dII.3 Fragen zum experimentellen Teil (Auswahl)II Experimenteller Teil
1.) Was versteht man unter der chromatographische Durchbruchszeit tm.2.) Welche apparativen Einflüsse können zu einer deutlichen Beeinflussung der
Durchbruchszeit führen (nennen sie 2 Beispiele)?3.) Ermitteln sie aus dem Tracer-Chromatogramm die Retentionszeit tR(X)
von Benzophenon.4.) Berechnen sie die Wanderungsgeschwindigkeit der mobilen
Phase um in [cm/min] bei einer gegebenen Durchbruchszeit von tm = 1,33 min (Länge der Säule = 150 mm).
5.) Berechnen sie das Durchbruchsvolumen Vm der mobilen Phase sowie das Retentionsvolumen VR von Benzophenon.
6.) Berechnen sie den Kapazitätsfaktor k für Benzophenon.7.) Berechnen sie ausgehend von den erhaltenen chromatographischen
Ergebnissen der Kalibriermessung den KF-Wert für Coffein.8.) Berechnen sie mit Hilfe des ermittelten KF-Wertes die Konzentration an
Coffein [mg/ml] in den jeweils untersuchten Originallösungen (Caffee-Lösung / Red Bull / Coca-Cola).
9.) Der „Energy-Drink“ Red-Bull enthält neben Coffein auch die Substanz Taurin. Chemisch gesehen handelt es sich hierbei um 2-Amino-ethan-sulfonsäure.Geben Sie die entsprechende chemische Formel an.
10.) In welchem Teil des Chromatogramms würden sie Taurin relativ zum Coffeinpeak in etwa erwarten (niedrigere oder höhere Retentionszeit). Begründen sie ihre Aussage.
11.) Wie würden sie die Detektionsfähigkeit von Taurin im UV-Detektor einschätzen (Begründung)? Nennen sie eine alternative Detektionsmethode für Taurin.
58
Chr
omat
ogra
phie
II
WS
2019
/20
R. V
asol
d
