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Computergest¨ utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen Fakult¨ aten Der Friedrich-Alexander-Universit¨ at Erlangen-N¨ urnberg zur Erlangung Des Doktorgrades vorgelegt von Heike Meiselbach aus Erfurt

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Computergestutzte Untersuchung der Struktur,Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen

Den Naturwissenschaftlichen Fakultaten

Der Friedrich-Alexander-Universitat Erlangen-Nurnberg

zur

Erlangung Des Doktorgrades

vorgelegt von

Heike Meiselbach

aus Erfurt

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Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakulaten der Friedrich-Alexander-

Universitat Erlangen-Nurnberg

Tag der mundlichen Prufung 19.10.2007

Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. E. Bansch

Erstberichterstatter: Prof. Dr. H. Sticht

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. T. Clark

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Das Schonste, was wir entdecken konnen,

ist das Geheimnisvolle.

Albert Einstein (1879-1955)

Fur Jens und meine Familie

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Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

1.1 Strukturaufklarung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2 Proteindynamik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.2.1 Prinzip der Molekuldynamik-Simulationen . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2.2 Anwendungen der Molekuldynamik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.3 Protein-Tyrosinkinasen der Src-Familien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.3.1 Struktur und Funktion von SH3-Domanen . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.3.2 Tip: Ein herpesviraler SH3-Ligand . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.4 Proteinphosphatase 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.4.1 Katalytische Untereinheit der Proteinphosphatase 1 . . . . . . . . . . 11

1.4.2 Proteininteraktionen vermittelt durch das RVxF-Motiv . . . . . . . . 12

1.5 HIV-1 Protease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.5.1 Struktur der HIV-1 Protease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

1.5.2 Entwicklung von Proteaseinhibitoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

1.5.3 Resistenzentwicklung gegen Proteaseinhibitoren . . . . . . . . . . . . . 14

2 Ziele 17

3 Materialien und Methoden 19

3.1 Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

3.1.1 Rechnersysteme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

3.1.2 Computerprogramme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

3.1.3 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien . . . . . . . . . . . . 20

3.1.4 Verwendete Kits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

3.1.5 Antikorper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

3.1.6 Bakterienstamme und Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

3.1.7 Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

3.1.7.1 Synthetische Peptide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

3.2 Computergestutzte Simulation von Biomolekulen . . . . . . . . . . . . . . . . 21

3.2.1 Kraftfeldparameter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

3.2.1.1 Parametergenerierung fur organische Molekule . . . . . . . . 22

3.2.2 Modellierung von Proteinstrukturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

3.2.2.1 Struktur der PP1γ1 mit dem KSVTW-Peptid . . . . . . . . 22

3.2.2.2 Strukturen der LynSH3-Tip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

i

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ii Inhaltsverzeichnis

3.2.2.3 Strukturen der Hck*-Kinase . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.2.2.4 Strukturen der HIV-1 Protease . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.2.2.5 Einfuhrung von Punktmutationen in die Proteinstruktur . . 23

3.2.3 Systemgenerierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.2.4 Geometrieoptimierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

3.2.5 Aquilibrierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3.2.6 Produktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3.2.7 Analyse der Trajektorien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

3.2.7.1 Berechnung der mittleren quadratischen Standardabweichung 26

3.2.7.2 Berechnung von Bindungsenergien . . . . . . . . . . . . . . . 26

3.2.7.3 Alanin-Scan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3.3 Fluoreszenzspektroskopische Messungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

3.3.1 Bestimmung der Proteinkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

3.3.2 Fluoreszenztitration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

3.3.3 Bestimmung der Dissoziationskonstanten aus den Fluoreszenzdaten . . 29

3.4 Molekularbiologische und proteinbiochemische Methoden . . . . . . . . . . . . 29

3.4.1 GST Pulldown Analysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

3.4.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.4.3 Coomassie-Farbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.4.4 Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

4 Ergebnisse 33

4.1 Einfluss des SH3-SH2 Linkers auf Struktur und Dynamik der Src-Kinasen . . 33

4.1.1 Einfluss der SH3-SH2 Linkersequenz auf die globale Struktur . . . . . 34

4.1.2 Auswirkungen im aktiven Zentrum der inhibitorgebundenen Kinase . 36

4.1.2.1 Untersuchung des Inhibitor-Bindungsmodus . . . . . . . . . 36

4.1.2.2 Untersuchung des DFG-Motivs in der katalytischen Domane 37

4.1.3 Einfluss des Inhibitors auf das aktive Zentrum der Kinase . . . . . . . 38

4.2 SH3-Domane der Tyrosinkinase Lyn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

4.2.1 In silico Alanin-Scan zur Untersuchung des Tip-Bindemotivs . . . . . 41

4.2.2 Bestimmung der Affinitat von Tip-Alaninmutanten zur LynSH3 mittels

Fluoreszenzspektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

4.2.3 Einfluss von L186 und G187 auf die Bindungsaffinitat . . . . . . . . . 45

4.2.4 Untersuchung der Rolle von H41 in LynSH3 . . . . . . . . . . . . . . . 47

4.3 Proteinphosphatase 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

4.3.1 Globale Eigenschaften der PP1γ1-Ligand-Interaktion . . . . . . . . . . 49

4.3.2 Untersuchung der Positionen +1 und +2 des PP1γ1-Bindemotivs . . . 50

4.3.2.1 MD-Simulationen zur detaillierten Analyse der Positionen +1

und +2 aus dem RRVSF- und KSVTW-Bindemotiv . . . . . 50

4.3.2.2 In vitro Analysen zur Identifizierung moglicher Aminosauren 53

4.3.3 Identifizierung tolerierter Aminosauren an der Ligandenposition +3 . 55

4.3.4 Untersuchung der Ligandenposition +4 . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

4.3.5 Untersuchung der Ligandenposition +5 . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

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Inhaltsverzeichnis iii

4.3.6 Aminosaurenpraferenz im PP1γ1-Bindemotiv . . . . . . . . . . . . . . 58

4.3.7 Einsatz des Sequenzmotivs als Pattern fur die Datenbanksuche . . . . 58

4.3.7.1 Erzeugen eines neuen Testdatensatzes . . . . . . . . . . . . . 59

4.3.7.2 Vorhersage neuer Bindungspartner . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.4 HIV-1 Protease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

4.4.1 Untersuchung des Liganden-Bindungsmodus . . . . . . . . . . . . . . . 61

4.4.2 Stabilitat der MD-Simulationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

4.4.3 Untersuchung polarer Wechselwirkungen im Bereich der Mutation . . 63

4.4.4 Strukturelle Auswirkung der Mutation E35D . . . . . . . . . . . . . . 65

4.4.5 Untersuchung der Bindungsaffinitat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

4.4.6 Epitopvorhersage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

5 Diskussion 71

5.1 Einfluss des SH3-SH2 Linkers auf Struktur und Dynamik der Src-Kinasen . . 71

5.1.1 Erhohte Fluktuationen der globalen Struktur durch veranderte Linker-

sequenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

5.1.2 Einfluss der Linkersequenz auf das Aktivierungssegment . . . . . . . . 73

5.2 LynSH3-Tip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

5.2.1 Rolle einzelner Aminosauren im Tip-Bindemotiv . . . . . . . . . . . . 75

5.2.2 Einfluss der C-terminal flankierenden Reste von Tip bei der Bindung

an LynSH3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

5.2.3 Untersuchung der Rolle von Histidin 41 in LynSH3 . . . . . . . . . . . 78

5.3 Proteinphosphatase 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

5.3.1 Eigenschaften des neuen Sequenzmotivs . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

5.3.2 Rolle von Aminosauren außerhalb des Bindemotivs . . . . . . . . . . . 81

5.3.3 Vorhersagegenauigkeit des neuen Patterns . . . . . . . . . . . . . . . . 82

5.3.4 Entwicklung einer Strategie zur Verfeinerung von Bindemotiven . . . . 83

5.4 HIV-1 Protease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

5.4.1 Lokale Auswirkungen der E35D Mutation . . . . . . . . . . . . . . . . 85

5.4.2 Effekte der Mutation E35D auf die Flaps der HIV-1 Protease . . . . . 86

5.4.3 Selektionsmechanismen, welche die Entstehung der Mutation E35D be-

gunstigen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

6 Zusammenfassung 89

7 Summary 93

Literaturverzeichnis 97

A Abkurzungen und Einheiten 115

A.1 Abkurzungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

A.2 Aminosauren: Ein- und Dreibuchstabencode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

A.3 Einheiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

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iv Inhaltsverzeichnis

B Proteinsysteme 117

B.1 Hck-Kinase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

B.1.1 PP1.frcmod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

B.1.2 PP1.prepin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

B.2 LynSH3: In silico Alanin-Scan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

C Protokolle 121

C.1 LEaP: Generierung der Topologie- und Koordinatendateien . . . . . . . . . . 121

C.2 Minimierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

C.3 Aquilibrierung und Produktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123

Danksagung 125

Veroffentlichungen und Tagungsbeitrage 127

Lebenslauf 129

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1 Einleitung

Nach Abschluss der Genomsequenzierungsprojekte [1, 2] verschiedener Organismen rucken

nun insbesondere deren Proteine als wesentliche Effektoren der Zelle in den Mittelpunkt

wissenschaftlicher Untersuchungen.

Proteine sind exakt gebaute Biomolekule, die andere Molekule erkennen, binden, transpor-

tieren und modifizieren konnen. Sie sind imstande, Signale aufzunehmen und weiterzuleiten.

Die meisten Proteine werden erst zu funktionellen Einheiten, wenn sie mit anderen Makro-

molekulen wie Proteinen, Nukleinsauren oder kleinen Molekulen in Wechselwirkung treten.

Solch eine molekulare Wechselwirkung steht am Anfang fast aller biologischen Ereignisse und

bewirkt einen Eingriff in die Abfolge von Stoffwechsel- und Signaltransduktionsprozessen und

lost somit einen physiologischen Effekt aus. Mutationen sind eine der haufigsten Ursachen fur

Storungen dieser exakt geregelten Ablaufe in der Zelle. Bereits geringfugige Fehler konnen

gravierende Auswirkungen haben, wie zum Beispiel die Entstehung von Tumoren.

Die systematische Erforschung von Erkennungsmechanismen auf molekularer Ebene

stellt somit einen wichtigen Beitrag zum strukturellen Verstandnis von Protein-Protein-

Wechselwirkungen als Voraussetzung fur die gezielte Beeinflussung biologischer Funktionen

dar. Da die Funktion von Proteinen in ihrer Struktur begrundet liegt, ist die Aufklarung der

dreidimensionalen Struktur ein wesentlicher Schritt zum Verstandnis biologischer Ablaufe.

1.1 Strukturaufklarung

Die strukturelle Charakterisierung stellt die Voraussetzung fur das Verstandnis biologischer

Prozesse dar. Zur Strukturbestimmung in atomarer Auflosung haben sich zwei Methoden

etabliert, die Rontgenstrukturanalyse und die Kernresonanzspektroskopie (NMR).

Die Rontgenstrukturanalyse ist die altere Methode zur Aufklarung von Protein- und Protein-

komplex-Strukturen. Die Methode erfordert zunachst hohe Konzentrationen von loslichem

Protein, das verschiedenen Kristallisationsbedingungen unterworfen wird [3–5]. Hierbei stoßt

die Rontgenstrukturanalyse teilweise an ihre Grenze, da es nicht immer moglich ist, Protein

bzw. Proteinkomplexe zu kristallisieren. Erhalt man Kristalle, werden diese anschließend in

einem Rontgenstrahl vermessen. Aus dem erhaltenen Beugungsmuster wird im Anschluss die

Kristallstruktur berechnet.

Bei der NMR-Spektroskopie werden die Proteine nativ in ihrer naturlichen Umgebung analy-

siert, wobei ebenfalls eine hohe Proteinkonzentration notwendig ist. Die NMR-Spektroskopie

basiert auf der Tatsache, dass viele Atomkerne einen Eigendrehimpuls, den sogenannten Kern-

spin, besitzen, welcher durch Anlegen eines außeren Magnetfeldes zur Ausrichtung gezwun-

gen wird, und dass nach den Gesetzen der Quantenmechanik in einem außeren Magnetfeld

1

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2 1. Einleitung

nur diskrete Energiezustande existieren [5]. Bei der Einstrahlung eines zusatzlichen elektro-

magnetischen Feldes werden charakteristische Frequenzen absorbiert, die als Resonanzsignale

registriert werden konnen. Durch unterschiedliche chemische Umgebung der Kerne ergeben

sich unterschiedliche Resonanzfrequenzen, die als chemische Verschiebungen wahrgenommen

werden. Aus dem resultierenden Spektrum lassen sich Signale einzelner Atome beobachten

und die Raumstruktur von Molekulen ableiten.

Der Vorteil der Rontgenstrukturanalyse liegt in der Moglichkeit zur Aufklarung großer

Systeme. Seit der ersten Proteinstruktur 1957 konnten bis heute Rontgenstrukturen von zirka

30000 biologischen Makromolekulen aufgeklart werden, unter anderem auch von Membran-

proteinen [6], Protein-Nukleinsaure-Komplexen [7–9] bis hin zu intakten Viren [10–12]. Eine

der gravierendsten Einschrankungen der NMR-Spektroskopie ist im Vergleich zur Rontgen-

strukturanalyse die Große der zu untersuchenden Proteine. Die Grenze, bis zu der Proteine

noch routinemaßig aufgeklart werden konnen, liegt derzeit zwischen 30 kDa bis 40 kDa [13,14].

Insbesondere methodische Weiterentwicklungen haben in den letzten Jahren dazu gefuhrt,

dass die Molekulgroßengrenze zu noch hoheren Molekulargewichten verschoben wurde [15–17].

Neben der Auflosung großerer Proteinstrukturen liefern neuere NMR-Methoden auch bessere

Informationen uber Protein-Proteinkomplexe [18–21].

1.2 Proteindynamik

Neben der strukturellen Aufklarung von Proteinen ist es auch wichtig deren Dynamik zu ana-

lysieren. Wie alle Molekule sind auch die meisten Proteine keine starren Strukturen sondern

innerhalb gewisser Grenzen dynamische Gebilde. Es mussen in der Molekulstruktur Bewe-

gungen existieren, um zum Beispiel andere Proteine spezifisch zu binden oder als Enzym

gewisse Funktionen ubernehmen zu konnen. Daher ist die interne Proteindynamik außerst

fein abgestimmt und kann bereits durch einzelne Mutationen drastisch beeinflusst werden.

Mit Hilfe der NMR-Spektroskopie ist es zwar im Gegensatz zur Rontgenstrukturanalyse

moglich, neben der Strukturbestimmung die Dynamik von Proteinen zu beobachten, aller-

dings nur die langsamen Bewegungen und teilweise nicht mit atomarer Auflosung. Die

oft sehr schnellen Proteinbewegungen sind experimentell außerst schwer zuganglich. Diese

Lucke kann durch Computersimulationen geschlossen werden. Mit Hilfe der klassischen Mo-

lekuldynamik-(MD)-Berechnung ist die Beschreibung atomarer Bewegungen in molekularen

Systemen moglich. Dieses Verfahren findet zunehmend Verbreitung in einer Vielzahl verschie-

dener Anwendungen. Seit der ersten Molekuldynamik-Simulation im Jahre 1957 durch Alder

und Wainright [22] wurden erhebliche rechentechnische Fortschritte erzielt. 1977 wurde von

Karplus die erste Proteindynamiksimulation am Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor (BPTI,

58 AS), allerdings noch ohne Berucksichtigung des Losungsmittels, durchgefuhrt [23,24]. Die

kontinuierliche Weiterentwicklung der Rechnerleistung und die Verfeinerung der Methoden

erlaubt es, sich komplexeren Strukturen und langeren Zeitskalen der Dynamik zuzuwen-

den. Die Simulation uber mehrere Nanosekunden in expliziten Losungsmittelmodellen und

Membranen, welche den physiologischen Bedingungen naher kommen, ist mittlerweile stan-

dardmaßig etabliert [25–27]. So wurden beispielsweise umfangreiche Rechnungen an der F1-

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1.2. Proteindynamik 3

ATPase [28,29], Aquaporin [30–32] und am Ras-Raf-Komplex [33] durchgefuhrt. Der bis da-

hin unbekannte Induktionsmechanismus des Tetrazyklin-Repressors durch Tetrazyklin konnte

mittels MD-Simulationen aufgeklart werden [34,35]. Diese Erkenntnisse stehen stellvertretend

fur die vielen Arbeiten auf diesem Gebiet, welche der Wissenschaft ein tieferes Verstandnis

von Regulationsmechanismen und Krankheitsentstehungen gebracht haben, das auf experi-

mentellen Wegen schwer zuganglich war. Die Simulation von biologischen Systemen soll das

Laborexperiment dennoch nicht ersetzen, sondern vielmehr als Erganzung dienen, um schnel-

ler neue Einblicke zu erlangen.

1.2.1 Prinzip der Molekuldynamik-Simulationen

In einem makromolekularen System existieren Wechselwirkungen unterschiedlichen Typs wie

es in Abbildung 1.1 dargestellt ist. Chemische Bindungskrafte, symbolisiert durch Federn,

definieren den Gleichgewichtsabstand (a) oder Gleichgewichtswinkel (b) zwischen Atomen,

die als Kugeln dargestellt sind. Zur Stabilitat einer Proteinstruktur tragen im wesentlichen

die langreichweitigen elektrostatischen Krafte (c) zwischen den partiell geladenen Atomen

(δ+, δ−) und van der Waals Krafte bei.

a

b d+d

-

d

c

Abb. 1.1: Schematische Darstellung der molekularen Wechselwirkungen innerhalb eines Makro-

molekuls.

Diese Krafte bestimmen die raumliche Proteinstruktur und die Bewegung jedes einzelnen

Atoms und werden daher in der Molekuldynamik-Simulation mit Hilfe eines Kraftfeldes

berucksichtigt [36, 37]. Ein Kraftfeld beschreibt die Summe aller Wechselwirkungen, welche

jeweils durch einen Energieterm (Gleichung 1.1) wiedergegeben werden.

V(rN ) =∑

Bindungen

ki2

(li − li,0)2 +∑

Winkel

ki2

(θi − θi,0)2

+∑

Torsion

Vn2

(1 + cos(nω − γ))

+

N∑

i=1

N∑

j=i+1

(4εij

[(σijrij

)12

−(σijrij

)6]

+qiqj

4πε0rij

)(1.1)

Dabei steht V(rN ) fur die potentielle Energie des Molekuls, als Funktion der r Koordinaten

von N Atomen. Die ersten beiden Terme in Gleichung 1.1 beschreiben die Energie der Bin-

dungen und Winkel als harmonisches Potential mit dem Referenzwerten l0 bzw. θ0 und der

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4 1. Einleitung

Kraftkonstante (ki). Der dritte Term tragt der Bindungsrotation um einen Diederwinkel ω

Rechnung, wahrend der letzte Term die Beitrage der van der Waals- und elektrostatischen

Wechselwirkungen zur Potentialenergiefunktion beschreibt.

Unter dem Einfluss dieser Krafte werden die Atombewegungen in klassischer Naherung durch

numerische Integration der Newtonschen Bewegungsgleichung beschrieben (Gleichung 1.2).

mid2

dt2~ri = ~F (~ri) = −~∇~riV (~ri) (1.2)

Dabei ist mi die Masse von Atom i und ~Fi die auf das Teilchen wirkende Potentialkraft. Die

Kraft wird als negativer Gradient des Potentials V dargestellt.

Da sich die Krafte mit der Atombewegung rasch andern, mussen sie nach kurzen Zeitschrit-

ten von typischerweise 10−15 s erneut berechnet werden. Durch die Wiederholung derartiger

Integrationsschritte werden fur alle Atome des Modellsystems Positionen und Geschwindig-

keiten zu unterschiedlichen Zeiten (in Form einer Trajektorie) ermittelt. Dies ermoglicht die

zeitabhangige Betrachtung dynamischer Prozesse.

Betrachtet man die Bewegungen, die Proteine ausfuhren konnen, so reichen diese von Fluk-

tuationen einzelner Aminosauren im ps-Bereich bis hin zur Faltung von Proteinen im min-

Bereich [38]. Im Folgenden sind einige Proteinbewegungen mit Amplitude und Zeitintervall

aufgelistet:

� Lokale Bewegungen (0.01 bis 5 A, 10−15–10−1 s)

– Atomare Fluktuationen

– Bewegung der Seitenketten

– Bewegung der Loops

� Bewegung einzelner Molekulbereiche (1 bis 10 A, 10−9–1 s)

– Domanenbewegung

– Bewegung von Untereinheiten

– Bewegung von Helices

� Globale Bewegungen (>5 A, 10−7–104 s)

– Helix coil Ubergange

– Dissoziation/Assoziation

– Faltung und Entfaltung

Durch den rasanten Anstieg der verfugbaren Rechnerleistung sind heute MD-Simulationen

von Systemen mit zehn- bis hunderttausend Atomen im ns-Bereich Routine, wodurch fur

viele biologische Fragen relevante Langen- und Zeitskalen erreicht werden [39].

1.2.2 Anwendungen der Molekuldynamik

Neben der atomaren Charakterisierung der Dynamik von biologischen und chemischen

Systemen ist die MD-Simulation ein nutzliches Werkzeug zur Vorhersage von Bindungs-

energien [40, 41], Proteinstabilitat [42] und Proteinfaltung [43, 44].

Mit Hilfe der Freie-Energie-Storungsrechnung (free energy perturbation, FEP) und der ther-

modynamischen Integration (TI) war es erstmals moglich, relative Bindungsenergien von

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1.3. Protein-Tyrosinkinasen der Src-Familien 5

Makromolekulen bei der Komplexbildung zu ermitteln [45]. Durch Aufstellen eines thermo-

dynamischen Zyklus wurde die Bindungsaffinitat bei der Komplexbildung berechenbar. Diese

beiden Methoden sind relativ rechenzeitintensiv, so dass weitere Methoden entwickelt wurden.

Die semiempirische Methode MM/PBSA (Molecular Mechanics Poisson-Boltzmann Surface

Area) zeichnet sich durch einen geringen Rechenzeitbedarf aus und liefert Bindungsenergien,

die in guter Ubereinstimmung mit experimentellen Ergebnissen stehen [46,47]. Diese Methode

wird in Abschnitt 3.2.7.2 naher beschrieben. Eine weitere Anwendung der MM/PBSA-

Methode ist die Analyse von Proteinkontaktflachen mittels eines computerbasierten Alanin-

Scans [48]. Hierbei konnen hot spots-Regionen der Kontaktflache identifiziert werden, die eine

wichtige Rolle fur die Affinitat und Spezifitat der Bindung spielen [49, 50].

Die Untersuchung der Proteinfaltung stellt derzeit noch eine große Herausforderung an bio-

molekulare Simulationen. Simmerling und Kollegen gelang es die Struktur eines kleinen

stabilen Proteins (Trp-Cage, 20 Aminosauren) allein anhand von MD-Simulationen vorher-

zusagen [51]. Die erst spater experimentell mit NMR bestimmte Struktur bestatigte die theo-

retische Vorhersage.

In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe von MD-Simulationen verschie-

dene Fragestellungen erfolgreich bearbeitet werden konnen. Die Proteinsimulation stellt somit

neben den experimentellen Methoden ein nutzliches Werkzeug zur Untersuchung von Protein-

eigenschaften dar. In der vorliegenden Arbeit wurden MD-Simulationen an verschiedenen

biologischen Systemen durchgefuhrt, welche im Anschluss naher vorgestellt werden.

1.3 Protein-Tyrosinkinasen der Src-Familien

In eukaryontischen Zellen werden Signale von einem komplexen Netz aus Kinasen, Phospha-

tasen und weiteren regulatorischen Faktoren vermittelt. Die Protein-Tyrosinkinasen lassen

sich in zwei Gruppen unterteilen:

� Die erste Gruppe stellt die Rezeptortyrosinkinasen dar, welche auf ihrer zytoplasma-

tischen Seite eine katalytische Aktivitat zur Phosphorylierung von Tyrosinresten

besitzen.� Die zweite Gruppe umfasst die zytoplasmatischen Nicht-Rezeptortyrosinkinasen, die

sich ausschließlich im Zytoplasma befinden und dort mit Proteinen, die an der Zell-

membran lokalisiert sind, interagieren.

Letztere Gruppe wird im Folgenden eingehender behandelt. Aufgrund funktioneller und

struktureller Charakteristika lassen sich die zytoplasmatischen Kinasen in acht unterschied-

liche Familien aufteilen. Die Src-Familie, bestehend aus neun Mitgliedern (Src, Yrk, Blk,

Yes, Fgr, Fyn, Hck, Lck und Lyn), stellt eine der bekanntesten Familien der Nicht-

Rezeptortyrosinkinasen dar [52]. Sie sind in Signalwege involviert, die Zellwachstum, Dif-

ferenzierung, Aktivierung und Transformation steuern [53].

Die Familie der Src-Kinasen ist gekennzeichnet durch ihren charakteristischen modularen Auf-

bau (Abb. 1.2). Die N-terminale unique-Domane weist eine Myristylierungsstelle auf, welche

fur die Lokalisation der Src-Kinase an der Zellmembran verantwortlich ist [54,55]. Sie wird von

einem regulatorischen Domanenpaar aus Src-Homologie-3 (SH3) und Src-Homologie-2 (SH2)

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6 1. Einleitung

gefolgt. Dabei bindet die SH3-Domane prolinreiche Sequenzmotive, die ein PxxP-Motiv ent-

halten [56], wahrend die SH2-Domane phosphotyrosinhaltige Proteine erkennt und bindet [57].

Auf die SH2-Domane folgt schließlich die Kinasedomane, welche die hochste Sequenzahnlich-

keit innerhalb der Familie der Src-Kinasen aufweist. Diese Domane besteht aus zwei Sub-

domanen, dem N-Lobe und dem C-Lobe, sowie dem dazwischen liegenden katalytischen Zent-

rum. Abschließend besitzen alle Mitglieder einen regulatorischen COOH-Terminus mit einem

hochkonservierten Tyrosinrest (Y527 in Src). Dieser Rest bindet in phosphorylierter Form an

die SH2-Domane und bewirkt so die Reduktion der Kinaseaktivitat [52].

(A)

Aktivierungs-segment

NH2 Unique SH3 SH2

SH2-KinaseLinker

N-Lobe C-Lobe

Y527

Myristyl-anker

COOH

Kinase

Y416

(B)

N

SH3

SH2

N-Lobe

Kinase

C-Lobe

SH2-Kinase

Linker

SH2-SH3-

Linker

C

SH2-SH3-

Linker

N-Lobe

Kinase

C-Lobe

N

SH2

SH3

P

C

SH2-Kinase

Linker

inaktiv (geschlossen) aktiv (offen)

Y416

Y527P

Y 527

Y416

Abb. 1.2: Schematische Struktur und Regulation der Src-Kinasen. A) Domanenstruktur, die bei allen

Mitgliedern der Src-Familie gleich ist. Auf die N-terminale Myristylierungsstelle folgt die Unique-Domane, die

innerhalb der Src-Familie nicht konserviert ist. Gefolgt wird sie von den beiden regulatorischen Untereinheiten,

SH3 und SH2. Diese werden durch den SH2-Kinase Linker mit der katalytischen Domane verbunden. Die

Kinasedomane setzt sich aus zwei Subdomanen zusammen, dem N-Lobe und dem C-Lobe. Der regulatorische C-

Terminus schließt sich der Kinasedomane an. B) Die Regulation der Kinaseaktivitat findet uber intramolekulare

Bindungsmechanismen statt. In der inaktiven Konformation bindet die SH3-Domane an eine im SH2-Linker

liegende Polyprolin-Helix. Gleichzeitig bindet Y527 (in Src) des regulatorischen C-Terminus phosphoryliert

an die SH2-Domane. Bei der Aktivierung der Kinase kommt es zum Verlust der intramolekularen Kontakte

sowie zur Phosphorylierung von Y416 (in Src) (offene Konformation). Abbildung nach Young et al., 2001 [58],

modifiziert.

Mittels 3D-Strukturen von c-Src [59, 60] und Hck [61] konnten Einblicke in den Regulations-

mechanismus der Kinasen gewonnen werden. Die Kinase ist im inaktiven (geschlossenen)

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1.3. Protein-Tyrosinkinasen der Src-Familien 7

Zustand so gefaltet, dass das Aktivierungssegment mit Y416 und das katalytische Zentrum

unzuganglich ist [62] (Abb. 1.2). Neben dem regulatorischen COOH-Terminus, fungieren

auch die SH2- und SH3-Domanen als Regulatoren. Die SH3-Domane bindet intramoleku-

lar an eine Polyprolin-Helix, die in der Verbindungsregion zwischen der SH2-Domane und

der Kinase liegt [63]. Die aktive (offene) Konformation kann durch Dephosophorylierung des

C-terminalen Tyrosins (Y527) und/oder in Anwesenheit von SH2- bzw. SH3-Liganden, die

mit den intramolekularen Kontaktflachen der Domanen konkurrieren, erreicht werden [64,65]

(Abb. 1.2). Durch Autophosphorylierung des im Aktivierungssegment gelegenen Tyrosinrests

(Y416 in Src) kann eine verstarkte Aktivitat erreicht werden [66].

Trotz der großen Ahnlichkeit der Src-Kinasen untereinander unterscheiden sie sich in der

Regulation ihrer verschiedenen Aktivierungsstufen und ihrer Spezifitat fur bestimmte akti-

vierende Liganden. Die Lck-Kinase scheint hierbei eine Sonderstellung innerhalb der Familie

der Src-Kinasen einzunehmen [67]. Die Bindung von SH3- oder SH2 Liganden an Src-Kinasen

fuhrt zu einer Strukturanderung in der jeweils anderen regulatorischen Domane, die nicht an

der Ligandenbindung beteiligt ist [58]. Dieser sogenannte cross-communication-Effekt wurde

bei Lck nicht beobachtet [68]. Weitere NMR-Untersuchungen zeigten ebenfalls, dass der SH3-

SH2 Linker bei Lck im Vergleich zu anderen Src-Kinasen eine erhohte Flexibilitat aufweist,

was dazu fuhrt, dass im SH3-SH2 Domanenpaar von Lck die relative Domanenorientierung

weniger definiert ist als in anderen Src-Kinasen. Dies wird auf die veranderte Linkersequenz in

Lck zuruckgefuhrt. In der Literatur wird diskutiert, ob diese strukturelle Besonderheit auch

die Dynamik der Lck-Aktivierung beeinflusst [58].

1.3.1 Struktur und Funktion von SH3-Domanen

SH3-Domanen sind kleine, aus zirka 60 Aminosauren bestehende, nichtkatalytische Protein-

module, die Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln. Sie sind eine der am haufigsten

vorkommenden Proteindomanen in eukaryontischen Genomen. In dem menschlichen Genom

wurden bereits mehr als 626 SH3-Domanen identifiziert (Stand 04/2007 in der Pfam-

Datenbank [69, 70]), die in die Regulation verschiedenster zellularer Prozesse involviert sind

[71]. Aus verschiedenen Losungs- und Kristallstrukturen geht hervor, dass alle SH3-Domanen

eine konservierte Faltung aufweisen [72–74].

Die SH3-Domane ist aus funf β-Faltblattstrangen aufgebaut, die zwei antiparallele Faltblatter

bilden, welche nahezu senkrecht aufeinander stehen (Abb. 1.3). Der Faltblattstrang 2 ist dabei

sowohl Teil des ersten als auch des zweiten Faltblattes. Zusammen sind sie so angeordnet,

dass sie eine kompakte Fass-Struktur (β-barrel) bilden, die durch einen stark konservierten

hydrophoben Kern stabilisiert wird. Die β-Strange sind durch verschiedene Schleifenbereiche

verbunden, der RT-Schleife (zwischen β1 und β2), der n-Src-Schleife (zwischen β2 und β3),

der Distalen-Schleife (zwischen β3 und β4) und der 310-Helix (zwischen β4 und β5). Zwischen

der n-Src-Schleife und der RT-Schleife liegt ein relativ flacher und uberwiegend hydrophober

Bereich, der meist aus acht hoch konservierten Aminosauren gebildet wird [71].

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8 1. Einleitung

(A)

RT-Schleife

distale-Schleife

b5

b1

b2

b3

b4

n-Src-Schleife

NH2

COOH

(B)

Src GVTT V L D ESRTET S KKGER Q VNNTEGD L HSLSTGQTG S APSDYes GVTI V L D EARTTE S KKGER Q INNTEGD E RSIATGKNG S APADFgr GVTL I L D EARTED T TKGEK H LNNTEGD E RSLSSGKTG S APVDYrk GVTL I L D EARTED S QKGEK H INNTEGD E RSLSSGATG S APVDFyn GVTL V L D EARTED S HKGEK Q LNSSEGD E RSLTTGETG S APVDBlk DKHF V L D TAMNDR Q LKGEK Q LKGT-GD L RSLVTGREG S ARVELck QDNL I L S EPSHDG G EKGEQ R LEQS-GE K QSLTTGQEG F AKANLyn QGDI V L P DGIHPD S KKGEK K LEEH-GE K KSLLTKKEG S AKLNHck EDII V L D EAIHHE S QKGDQ V LEES-GE K RSLATRKEG S ARVD

.:**: * ** : **::: ::: *:** *:*: : * :* *:** :

F A L F L I W A I VF A L F F I W A I VF A L F F I W A I VF A L F F I W A I VF A L F F I W A I VV A L M L V W A V VV A L F L I W A I VV A L F M V W A I VV A L F M V W A I V

Y Y D W Y P NYY Y D W Y P NYY Y D W C P NYY Y D W Y P NYY Y D W Y P NYY Y D W Y P NFH Y D W F P NFY Y D W F P NYY Y D W Y P NY

10 20 30 40 50 60

RT-Schleife n-Src

Schleife

distale

Schleife

b1 b2 b3 b4 b5

Abb. 1.3: Struktur und Sequenzvergleich von SH3-Domanen. A) Schematische Darstellung der Struk-

turelemente am Beispiel der LynSH3-Domane im Komplex mit dem herpesviralen Liganden Tip (dunkelgrau)

(PDB: 1WA7, [75]). Die Aminosauren der PPII-Helix in Tip sind in gelb hervorgehoben. Die β-Faltblattstrange

der SH3 (grun) sind mit β1-5 bezeichnet und bilden zwei rechtwinklig zueinander stehende Faltblatter. Die an

der Ligandenbindung beteiligten Aminosauren sind als Stabchen (orange) dargestellt. B) Sequenzalignment

von SH3-Domanen aus den Kinasen der Src-Familie. Die Nummerierung wurde entsprechend der LynSH3-

Domane gewahlt. Die an der Ligandenbindung beteiligten Aminosauren sind in orange und Aminosauren, die

den hydrophoben Kern bilden, in blau dargestellt.

Wie in Abbildung 1.4 dargestellt ist, weist die Bindungsregion drei Taschen auf [70,71,76,77].

Die ersten zwei Taschen werden jeweils durch ein Dipeptid der Aminosaurenfolge xP (Position

P−1, P0 sowie P2 und P3) uber hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den konservierten

Aromaten des Proteins und den aliphatischen Seitenketten des Liganden gebunden. Die dritte

Tasche enthalt meist einen negativ geladenen Rest, der eine Salzbrucke mit dem basischen

Aminosauren Arginin oder Lysin des Liganden bilden kann. Bei der Ligandenbindung wer-

den vorwiegend Sequenzabschnitte erkannt, welche die Aminosaure Prolin aufweisen. Unter-

suchungen zeigten, dass ein konserviertes PxxP-Motiv (P: Prolin, x: beliebige Aminosaure)

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1.3. Protein-Tyrosinkinasen der Src-Familien 9

Voraussetzung fur die Bindung an SH3-Domanen ist [78]. Strukturanalysen an Komplexsys-

temen von SH3-Domanen und ihren Liganden zeigten weiter, dass das PxxP-Kernstuck die

Konformation einer Polyprolin-Helix vom Typ II (PPII) aufweist [71, 79]. Hierbei handelt es

sich um eine linksgangige, helikale Struktur mit drei Resten pro Windung, deren Ausbildung

durch die Anwesenheit von Prolin begunstigt wird [80, 81].

Prolinreiche SH3-Liganden lassen sich anhand ihrer Sequenz in zwei Klassen unterteilen (Abb.

1.4) [70, 71, 77, 80, 82, 83]. Liganden der Klasse I besitzen als Motiv +xxPxxP und Klas-

se II Liganden xPxxPx+ und binden jeweils mit gegensatzlicher Orientierung an die SH3-

Domanen. Die Orientierung, in der Liganden an die SH3-Domane binden, wird vom basischen

Rest (+, rote Kugel, Abb. 1.4) des Liganden an Position P−3 beeinflusst. Im Komplex wird

zwischen diesem Rest und einer konservierten negativen Aminosaure, meist Aspartat, eine

Salzbrucke gebildet. Die Aminosauren an Position P−2 und P1 zeigen von der SH3-Domane

weg. Proline an diesen Stellen tragen zur Stabilisierung der PPII-Helix bei. Die beiden kon-

servierten Proline befinden sich bei den Klasse I Liganden an den Positionen P0 und P3 und

bei den Klasse II Liganden an den Positionen P−1 und P2. In beiden Ligandenklassen geht

der basische Rest eine Bindung mit demselben negativen Rest der SH3-Domane ein und ist

an der Position P−3 zu finden [76], wodurch die bereits erwahnte Orientierung der Liganden

beeinflusst wird.

(A)

Spezifitätstasche

P-1

P-2

P0

P1

P3

SH3-Domäne

N

C N

C

Klasse I LigandKlasse II Ligand

xP-Bindungstasche

P2

P-3

(B)

Klasse I Ligand:Klasse II Ligand:

NC

++

x

x

x

P x

P

P1

x

P

P-3 P-2 P0P-1xx

P2x

P

P3

CN

Abb. 1.4: Wechselwirkung von SH3-Domanen mit ihren Liganden. A) Schematische Darstellung

der PPII-Helix-Bindung an die SH3-Domane. Die Pfeile stellen die Orientierung der SH3-Liganden in Bezug

auf ihrer Klassenzuordnung dar. Liganden der Klasse I binden mit dem Aminoterminus und Liganden der

Klasse II mit dem Carboxyterminus an die Spezifitatstasche. Die konservierten Proline (blau) in Klasse I an

den Positionen P0 und P3 und in Klasse II an den Positionen P−1 und P2. Die Position P−3 wird sowohl bei

Klasse I als auch bei Klasse II Liganden von basischen Resten (rot) besetzt. Die Aminosauren an der Position

P−2 und P1 (gelb) zeigen von der SH3-Domane weg und bilden keine direkten Kontakte aus. B) Sequenz der

Klasse I und II-Liganden in Bezug auf die Aminosaure-Position nach Lim et al. [83]. Die eingerahmten Reste

kennzeichnen die xP-Dipeptide, die mit der zweiten und dritten Bindungstasche wechselwirken. Farbcode wie

zuvor beschrieben.

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10 1. Einleitung

Das zentrale Bindungsmotiv der SH3-Liganden besteht wie in Abbildung 1.4 aus sieben Ami-

nosauren, wobei funf von ihnen direkt mit der SH3-Domane interagieren. Unter diesen funf

Aminosauren sind zwei invariante Proline und eine konservierte basische Aminosaure [71].

Diese Anordnung mindert die Moglichkeit zur Spezifitatsdeterminierung, trotz allem weisen

die meisten Liganden eine unterschiedliche Spezifitat fur verschiedene SH3-Domanen auf. Die

Spezifitat und Affinitat lassen sich haufig auf zusatzliche Reste zuruckfuhren, die sich N- und

C-terminal vom PxxP-Motiv befinden und weitere Wechselwirkungen mit der SH3-Domane

ausbilden [71, 75, 76, 84, 85].

1.3.2 Tip: Ein herpesviraler SH3-Ligand

Das Herpesvirus saimiri (HVS), ein Rhadinovirus, persistiert apathogen in seinem naturlichen

Wirt, dem Totenkopfaffchen (Saimiri sciureus), wohingegen eine Infektion in anderen Neu-

weltaffen, wie zum Beispiel Weißbuschelaffen (Callithrix jacchus) und Klammeraffen (Ateles

geoffroyii), zu akuten T-Zell-Lymphomen und lymphatischen Leukamien fuhrt [86, 87]. HVS

wird in drei Subgruppen, A, B und C, unterteilt. Viren der Subgruppe C sind in der Lage

humane T-Zellen zu transformieren [88], wobei die Onkogene StpC (Saimiri Transformations-

assoziiertes Protein der Gruppe C) und Tip (Tyrosinkinase interagierendes Protein) essentiell

sind [89–91]. Es konnte gezeigt werden, dass StpC in transgenen Mausen epitheliale Tumore

induziert, ohne die T-Lymphozyten dieser Tiere zu beeinflussen. Somit wird Tip als verant-

wortlich fur die T-Zell-Spezifitat der Transformation angesehen [87, 92].

Die Tyrosinkinase Lck wurde als ein zellularer Bindungspartner von Tip identifiziert [91].

Tip besitzt einen Sequenzbereich aus 38 Aminosauren, der fur die Bindung an Lck notwen-

dig und hinreichend ist [93]. Diese Bindesequenz enthalt zwei Motive, das CSKH-Motiv und

einen prolinreichen SH3-Bindungsabschnitt [91, 93, 94]. Wahrend der prolinreiche Abschnitt

eine Polyprolin-Helix vom Typ II ausbildet und an die SH3-Domane bindet, interagiert das

CSKH-Motiv mit einem noch nicht naher charakterisierten Bereich der Kinasedomane.

Fluoreszenzspektroskopische Analysen zeigten, dass bereits ein kurzes Tip-Fragment (Reste

173-185), das den prolinreichen Abschnitt enthalt, eine hohe Affinitat zu den Src-Kinasen

Hck, Lck und Lyn aufweist [74]. Hierbei wurde Tip von Lyn am starksten gebunden. Insbe-

sondere fuhrten bei Lyn C-terminal flankierende Reste (186-187) zu einer Affinitatssteigerung,

wohingegen bei den anderen Src-Kinasen kein Effekt gemessen wurde [75].

1.4 Proteinphosphatase 1

Proteinphosphatasen (PP) und ihre Antagonisten, die Proteinkinasen, sind in nahezu jeden

Aspekt der Signaltransduktion involviert. Die Proteinphosphatasen dephosphorylieren phos-

phorylierte Proteine und heben somit die Wirkung von Proteinkinasen auf. In Abhangigkeit

der Aminosauren, die dephosphoryliert werden, unterscheidet man zwischen Tyrosin- und

Serin/Threonin-Phosphatasen. Die koordinierte Wechselwirkung zwischen Kinasen und Phos-

phatasen stellt einen fundamentalen Mechanismus zahlreicher biologischer Prozesse dar.

Das menschliche Genom codiert fur mehr als 500 Proteinkinasen, wobei zirka zwei Drittel

Serin/Threonin-Kinasen sind. Dagegen existieren nur zirka 20 Serin/Threonin-Phosphatasen

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1.4. Proteinphosphatase 1 11

[95, 96]. Dieses bestehende Ungleichgewicht zwischen den Kinasen und Phosphatasen wird

durch die große Anzahl der Wechselwirkungspartner der einzelnen Phosphatasen ausge-

glichen [97].

Strukturell lassen sich die Serin/Threonin-Phosphatasen in drei verschiedene Familien (PPM,

FCP und PPP) einteilen [95]. Die PPM-Familie besteht aus Mg2+ abhangigen Enzymen, wie

z. B. die Proteinphosphatase 2C. Die FCP-Familie ist ebenfalls Mg2+ abhangig. Alle ande-

ren Serin/Threonin-Phosphatasen gehoren zur PPP-Familie, die sich aus vier Unterfamilien

(PP1, PP2A, PP2B und PP5) zusammensetzt [97, 98].

1.4.1 Katalytische Untereinheit der Proteinphosphatase 1

Die Proteinphosphatase 1 stellt eine der bedeutendsten Serin/Threonin-Phosphatasen in eu-

karyontischen Zellen dar. Sie reguliert unterschiedliche zellulare Prozesse, wie den Verlauf des

Zellzyklus, die Proteinsynthese, den Kohlenhydratmetabolismus, die Muskelkontraktion, die

Transkription und die neuronale Signaltransduktion [95, 99].

In Saugetierzellen wurden vier Isoformen der Proteinphosphatase 1 identifiziert, die als PP1α,

PP1β/δ, PP1γ1 und PP1γ2 bezeichnet werden. Sie werden von drei Genen codiert, wobei die

letzten beiden Spleiß-Varianten eines Gens sind [100, 101].

Die Kristallstruktur der Proteinphosphatase zeigt ein globular gefaltetes Protein, dessen

Oberflache von drei Furchen, einer hydrophoben, einer sauren und einer C-terminalen, durch-

zogen wird (Abb. 1.5A) [95]. Das aktive Zentrum liegt in der sogenannten Y-Verzweigung der

drei Furchen [95, 102].

(A)

HydrophobeFurche

SaureFurche

C-terminaleFurche C

Aktives Zentrum

N

(B)

C

N

RVxF-Bindungskanal

D166

E287

L289

F293

M283

D240E167

L241

L243I169

D242

F257

Abb. 1.5: Kristallstruktur der PP1γ1 im Komplex mit dem RRVSF-Peptid. A) Frontale Sicht auf

PP1γ1. Das aktive Zentrum befindet sich im Mittelpunkt der Phosphatase, von dem die drei Taschen ausgehen.

Der abseits vom aktiven Zentrum gebundene Ligand ist in blau dargestellt. B) Elektrostatisches Potential der

PP1γ1 Enzymoberflache mit dem RRVSF-Peptid. Der Ligand erstreckt sich entlang dem RVxF-Bindungskanal.

Regionen mit positiver Ladung sind in blau und Regionen mit negativer Ladung in rot eingefarbt.

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12 1. Einleitung

1.4.2 Proteininteraktionen vermittelt durch das RVxF-Motiv

Die Regulation der verschiedenen zellularen Prozesse durch ein einzelnes Enzym gelingt auf-

grund der Wechselwirkung der katalytischen Proteinphosphatase 1 Untereinheit mit mehr als

50 verschiedenen regulatorischen Polypeptiden [95, 97]. Die Bindung der Wechselwirkungs-

partner an die katalytische Phosphataseuntereinheit wird primar durch ein kurzes Sequenz-

motiv, das nach seinen bevorzugten Aminosauren als RVxF-Motiv bezeichnet wird, vermit-

telt [97]. In weiteren Studien konnte dieses Motiv exakter definiert werden, so dass ein wei-

teres Pattern ([RK]X0−1[V]{P}[FW]) aufgestellt wurde. Dieses Bindemotiv interagiert mit

einer konservierten Furche an der Oberflache der katalytischen Untereinheit, die sich abseits

des aktiven Zentrums befindet (Abb. 1.5) [102–104]. Dadurch wird gleichzeitiges Binden von

mehreren Regulatoren ausgeschlossen. Das Bindemotiv konnte die Funktion eines Ankers

fur die initiale Bindung von Wechelwirkungspartnern an die katalytische Untereinheit der

Proteinphosphatase einnehmen und so die Bindung an zusatzliche sekundaren Interaktions-

flachen ermoglichen, welche eine niedrigere Affinitat aufweisen. Somit kann die enzymatische

Aktivitat und Substratspezifitat der Phosphatase beeinflusst werden [105].

Die ligandenbindende Oberflache von PP1γ1 zeigt einen hohen Uberschuss an negativer

Ladung (Abb. 1.5B) und beinhaltet zwei hydrophobe Taschen, welche hauptsachlich durch

die Seitenketten der Aminosauren I169, L243, F257, M283, L289 und F293 gebildet werden.

Durch diese verschiedenen Eigenschaften, der Enzymoberflache, werden die Aminosauren be-

stimmt, die an den verschiedenen Ligandenpositionen zulassig sind [106].

Im intrazellularen C-Terminus von metabotropen Glutamatrezeptoren (mGluR1a, mGluR5a,

mGluR5b und mGluR7b) konnte ein konserviertes Motiv aus funf Aminosauren (KSV[ST]W)

identifiziert werden, welches ebenfalls an PP1γ1 bindet [106–109]. Dieses Bindemotiv ahnelt

zwar dem zuvor beschriebenen Sequenzmotiv ([RK]X0−1[V]{P}[FW]), aber es wurden den-

noch wichtige Unterschiede deutlich. So verhindert die Deletion der Aminosaure Serin an der

Position +2, sowie das Mutieren der Aminosauren Serin bzw. Threonin zu Alanin an Position

+4 die Wechselwirkung mit der Proteinphosphatase [106]. Aus diesen Befunden geht hervor,

dass die Sequenzmerkmale, die fur eine affine Bindung wichtig sind, in dem bisherigen Pattern

erst unzureichend erfasst sind.

1.5 HIV-1 Protease

Zu Beginn der achtziger Jahre wurden in den USA von einer auffalligen Haufung opportu-

nistischer Krankheitsbilder und Krebserkrankungen bei homosexuellen Mannern berichtet, die

bis dahin auf keine der bekannten Immundefekte zuruckzufuhren waren [110]. Das humane

Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) wurde als Erreger dieser neuen Immunschwacheerkran-

kung AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome) identifiziert [111, 112] und charakteri-

siert. Aufgrund morphologischer und molekularbiologischer Eigenschaften wird das HI-Virus

der Familie der Retroviren zugeordnet.

Bei der Erkrankung handelt es sich um eine globale Epidemie. Derzeit sind mehr als 40 Mil-

lionen Menschen weltweit infiziert [113]. HIV/AIDS stellen somit gesehen seit dem Auftreten

der ersten Krankheitsfalle eines der großten Gesundheitsprobleme auf der Welt dar.

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1.5. HIV-1 Protease 13

Seit der Identifizierung wurden intensive Anstrengungen zur Suche nach moglichen Angriffs-

punkten einer Therapie gegen den HI-Virus unternommen. 1985 wurde erstmals postuliert

und 1988 experimentell bestatigt [47, 114], dass das HI-Virus eine eigene Protease besitzt,

die zur Familie der Aspartylprotease gehort. Die Protease zerschneidet die fur die Virus-

replikation essentiellen Polypeptidketten in funktionelle Einheiten, die dann zu infektiosen

Virionen zusammengebaut werden [115]. Somit wurde die Protease als ein außerst wichtiges

Zielmolekul fur die Entwicklung von Wirkstoffen gegen die Immunschwachekrankheit AIDS

erkannt [116].

1.5.1 Struktur der HIV-1 Protease

Mittels Rontgenstrukturanalyse konnte 1989 die 3D-Struktur der HIV-1 Protease bestimmt

werden [117,118]. Die Protease ist ein homodimeres Protein, das aus zwei identischen Unter-

einheiten besteht (Abb.1.6).

Aktives Zentrum

Flap-Region

D25 D25’

*

APV

Abb. 1.6: Kristallstruktur der HIV-1 Protease (PDB: 1HPV) im Komplex mit dem Inhibitor

Amprenavir (APV). Die Proteinketten sind als Bander entsprechend der Untereinheiten in Hell- bzw.

Dunkelgrau eingefarbt. Die Abbildung zeigt die katalytischen Aspartate (D25/D25’) des aktiven Zentrums und

ein strukturgebundenes Wasser (flap water) in der Ligandenbindungstasche, welches mit * gekennzeichnet ist.

In Abbildung 1.6 wird deutlich, dass die beiden Proteinketten C2-symmetrisch zueinander

angeordnet sind. Die beiden Untereinheiten bestehen aus jeweils 99 Aminosauren [119]. Sta-

bilisiert wird das Dimer vorwiegend durch ein vierstrangiges, antiparalleles β-Faltblatt. Das

aktive Zentrum befindet sich an der Kontaktflache der Untereinheiten, die je einen kataly-

tisch aktiven Aspartatrest (in Abb. 1.6 D25 und D25’) tragen. Jede Untereinheit besitzt eine

bewegliche Schleifenregion (Flap), die von einem antiparallelen β-Faltblatt und einem dazwi-

schenliegenden β-turn gebildet wird. Die Flaps legen sich uber die substratbindende Tasche

und kontrollieren somit den Zugang zum aktiven Zentrum.

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14 1. Einleitung

1.5.2 Entwicklung von Proteaseinhibitoren

Unmittelbar nach Veroffentlichung der Kristallstruktur wurden Wirkstoffe gegen die HIV-1

Protease entwickelt, welche die Proteasefunktion storen und somit nichtinfektiose Viruspar-

tikel entstehen lassen. Die Substanzen wurden so entworfen, dass sie genau in das aktive

Zentrum der Protease passen [120]. Zur Zeit existieren zehn von der US Food and Drug

Administation (FDA) als Wirkstoff zugelassene Inhibitoren und mehrere befinden sich noch

in klinischen Testphasen. Die medikamentose Verabreichung dieser Inhibitoren wird heute

innerhalb der sogenannten HAART Therapie (Highly Active Anti-Retroviral Therapy) durch-

gefuhrt. Eine Kombinationstherapie, bestehend aus einem Proteaseinhibitor (PI) und zwei

Inhibitoren der reversen Transkriptase, fuhrte erstmals zu einer langanhaltenen Suppres-

sion der Virusreplikation und einer daraus resultierenden verbesserten Lebensqualitat und

erhohten Lebenserwartung der Erkrankten [121].

1.5.3 Resistenzentwicklung gegen Proteaseinhibitoren

Durch die hochwirksame antiretrovirale Therapie wurde der naturliche Verlauf der HIV-

Erkrankung beeinflusst. Das Virus versucht dem Druck auszuweichen und entwickelt so Re-

sistenzen gegen die Wirkstoffe. Bisher wurden an mehr als 20 Positionen der Protease Mu-

tationen identifiziert, die in Verbindung mit einer Resistenz auftreten [122]. Die Mutationen

werden nach ihrer Lage als active site oder non-active site unterschieden. Bei den Muta-

tionen im aktiven Zentrum, wird die Resistenz meist direkt durch strukturelle Anderungen

der substratbindenden Region bewirkt, woraus eine niedrigere Affinitat zu den Wirkstoffen

resultiert [123, 124].

E35

N88

D30

L90L24

V82

V84

Abb. 1.7: Uberblick der resistenzassoziierten Mutationen der HIV-1 Protease. Mutationen im

aktiven Zentrum sind in gelb und Mutationen außerhalb des aktiven Zentrums in blau dargestellt. Im Text

diskutierte Aminosauren sind entsprechend ihrer Position gekennzeichnet.

Non-active site Mutationen liegen außerhalb des aktiven Zentrums. Der Mechanismus, durch

den diese Mutationen die Bindungsaffinitat verringern, ist noch weitgehend unverstanden. In

der Kristallstruktur lassen die Mutanten im Vergleich zum Wildtyp zumindest keine Unter-

Page 25: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

1.5. HIV-1 Protease 15

schiede in den Protein-Ligand-Wechselwirkungen erkennen, so dass die Effekte der Mutatio-

nen außerhalb des aktiven Zentrums auf Basis der statischen Struktur nicht erklart werden

konnen. Moglicherweise bewirken sie Veranderungen der Enzymkatalyse, Dimerstabilisierung,

Anderung in der Bindungskinetik des Inhibitors oder der Dynamik der Protease [125–128].

Simulationen der Molekuldynamik konnten in den vergangenen Jahren erste Einblicke in die

molekularen Mechanismen der Resistenzentstehung geben. Hierbei wurden Effekte beobach-

tet, die nicht einheitlich sind. So bewirkt die Mutation V82F/I84V ein verstarktes Offnen der

Flaps [129], wohingegen die Mutante N88S neue Wasserstoffbrucken zum Rest D30 im aktiven

Zentrum ausbildet [130]. Im Gegensatz dazu haben die Mutationen L24I und L90M einen

globalen Effekt auf die Dynamik der HIV-1 Protease, wobei die verringerte Plastizitat der

Struktur die wahrscheinliche Ursache der Resistenzentstehung ist [131]. Nachdem die struk-

turellen Effekte haufig auf einer Nanosekunden-Zeitskala beobachtet werden, ist erst durch

die gestiegene Rechnerleistung in den letzten Jahren deren Untersuchung moglich geworden.

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16 1. Einleitung

Page 27: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

2 Ziele

Mit Hilfe von Computermethoden ist es moglich die Struktur und Dynamik von Proteinen

auf atomarer Ebene zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit sollten bioinformatische

Methoden wie Molekulmodellierung und Molekuldynamik-(MD)-Simulation eingesetzt

werden, um Proteininteraktionen an verschiedenen biologischen Systemen zu analysieren.

Die Tyrosinkinasen der Src-Familie zeigen große Ahnlichkeiten in ihrem modularen Aufbau.

In vorangegangen Untersuchungen wurde gezeigt, dass die Sequenz des SH3-SH2 Linkers

maßgeblich die relative SH3-SH2 Orientierung des isolierten Domanenpaars beeinflusst und

somit eventuell auch einen Einfluss auf die Aktivierung der gesamten Kinase besitzt. Im

Rahmen dieser Arbeit sollte mit Hilfe von MD-Simulationen untersucht werden, inwieweit

der SH3-SH2 Linker einen Einfluss auf die Gesamtstruktur und Dynamik von Src-Kinasen

hat. Hierzu sollte die starre SH3-SH2 Linkersequenz in der inaktiven Hck-Kinase durch die

flexiblere Linkersequenz aus Lck ersetzt werden. Durch ein Vergleich mit der Dynamik der

Wildtyp Hck-Kinase sollte untersucht werden, ob ein Effekt auf die globale Struktur bzw. auf

die Struktur des aktiven Zentrums existiert.

Im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit sollte mit Hilfe von MD-Simulationen und

darauf aufbauenden energetischen Analysen die Wechselwirkung zwischen dem herpes-

viralen Protein Tip und der SH3-Domane der Tyrosinkinase Lyn charakterisiert werden.

Es ist bekannt, dass Tip mit einer deutlich hoheren Affinitat an LynSH3, als an andere

homologe SH3-Domanen bindet. Zu Beginn sollte die Rolle der einzelnen Aminosauren im

Tip-Bindemotiv fur die Bindung an die SH3-Domane mit Hilfe eines in silico Alanin-Scans

untersucht werden. Mittels fluoreszenzspektroskopischer Messungen sollten die erhaltenen

Ergebnisse verifiziert und geklart werden, inwieweit bioinformatische Methoden in der Lage

sind quantitative Aussagen uber Bindungsstarken zu liefern. Im zweiten Teil dieser Analysen

sollte mittels der MM/PBSA-Analyse der Einfluss der sich C-terminal an die PPII-Helix

anschließenden Reste bei der LynSH3-Bindung noch detaillierter charakterisiert werden.

Hierbei sollte die Frage beantwortet werden, warum Tip affiner von LynSH3 gebunden wird,

als von anderen homologen SH3-Domanen.

Das Zusammenspiel zwischen Kinasen und Phosphatasen ist einer der wichtigsten regu-

latorischen Mechanismen in biologischen Systemen. Wahrend die Kinasen in einer großen

Vielzahl in der Zelle vorhanden sind, erreichen die Phosphatasen ihre Mannigfaltigkeit

durch die Interaktion mit verschiedenen Bindungspartnern. Bekannt ist, dass die Bindung

an die katalytische Untereinheit der Proteinphosphatase 1 (PP1γ1) uber eine relativ kurze

17

Page 28: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

18 2. Ziele

Erkennungssequenz vermittelt wird. In dieser Arbeit sollte das PP1γ1-Bindemotiv genau

charakterisiert werden, um anschließend ein Pattern zu generieren, mit dem die Spezi-

fitat einer genomweiten Datenbanksuche nach PP1γ1-Interaktionspartnern erhoht werden

kann. Hierzu sollten mittels Computermethoden, wie MD-Simulationen und Molecular

Modelling, moglichst alle Aminosauren identifiziert werden, die im Bindemotiv toleriert wer-

den. Die Vorhersagen sollten anschließend mittels GST-Pulldown-Analysen verifiziert werden.

Eines der Hauptprobleme in der antiretroviralen HIV-Therapie ist die Entstehung von

Resistenzen gegen eingesetzte Wirkstoffe, die haufig auf Mutationen der HIV-1 Protease

zuruckzufuhren sind. Zur Entwicklung neuer Wirkstoffe ist es wichtig den Resistenz-

mechanismus zu verstehen. In der vorliegenden Arbeit sollte die Mutation E35D, welche

sich außerhalb des aktiven Zentrums befindet, untersucht werden. Um Einblicke in den

molekularen Mechanismus der Resistenzentstehung zu erlangen sollte die Mutation in

die Struktur der HIV-1 Protease modelliert werden. Die strukturellen Eigenschaften und

funktionellen Auswirkungen der Mutation sollten mittels MD-Simulationen identifiziert

werden. Des Weiteren sollte die Starke der Ligandenbindung uber die Berechnung der freien

Energien mittels der MM/PBSA-Analyse bestimmt werden.

Page 29: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

3 Materialien und Methoden

3.1 Materialien

3.1.1 Rechnersysteme

Die in der Arbeit beschriebenen Molekuldynamik-(MD)-Simulationen und deren Auswer-

tungen wurden auf den in Tabelle 3.1 aufgefuhrten Rechnersystemen durchgefuhrt.

Tab. 3.1: Verwendete Rechnerarchitekturen.

Rechnersystem Prozessoren Arbeits- Standort

speicher

PC Linux 2 x Intel PIII (773 MHz) 776 MB BI

PC Linux Server 2 x Opteron (1,8 GHz) 2 GB BI

PC Linux Pentium IV (2,8 GHz) 1 GB BI

Silicon Graphics fuel (SGI) 1 x IP35 (700 MHz) 1 GB BI

Cluster CIP-Pool Pentium IV (3,2 GHz) 1 GB CIP

PC Linux 4x Opteron (2,2 GHz) 8 GB RRZE

EM64T-Cluster (64 Knoten) 2 x Xeon (3,2 GHz) 2 GB RRZE

AMD64-Cluster (25 Knoten) 2 x Dual Core Opteron (2 GHz) 4 GB RRZE

3.1.2 Computerprogramme

Die computergestutzten Berechnungen und Analysen sowie die graphische Darstellung wurden

mit Hilfe von folgenden Programmen durchgefuhrt:

Molekuldynamik; Analyse der Trajektorien und AMBER 7/8 [132–134]

RESP-Ladungsberechnung

Analyse von Geometrie und Interaktionsenergien XPLOR [135]

unter Verwendung des AMBER-Kraftfeldes (ff99)

Strukturanalyse PROCHECK [136]

Analyse von Wechselwirkungen LIGPLOT [137]

Elektrostatische Oberflachenberechnung GRASP [138]; DELPHI 4 [139]

Epitopvorhersage SYFPEITHI [140]

Datenanalyse und Graphikprasentation SIGMA PLOT 9 [141];

XMGRACE [142]

Analysetools und Visualisierungsprogramme INSIGHT II [143];

19

Page 30: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

20 3. Materialien und Methoden

VMD 1.8.x [144];

SYBYL [145]; MOLMOL [146]

DS VIEWER PRO 6.0 [147];

SwissPDB-VIEWER [148]

3.1.3 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien

Alle gangigen hier nicht aufgefuhrten Chemikalien und Losungen wurden von den Firmen

Roche Molecular Biochemicals (Mannheim), Carl Roth (Karlsruhe) und Sigma (Deisenhofen)

bezogen.

Ampicillin Sigma

Acrylamid Roth, Karlsruhe

Ammoniumpersulfat Sigma

β-Mercaptoethanol Sigma

Coomassie Brilliant Blue R-250 Serva

Dithiothreitol (DTT) Sigma

Ethidiumbromid Sigma

Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) Sigma

Proteaseinhibitoren Roche

TEMED Gibco BRL

Triton x-100 Sigma

Lysozym Sigma

Benzonase Novagen

Whatman-Papier Biometra

Nitrocellulose Membran Biometra

Filme Amersham Bioscience

3.1.4 Verwendete Kits

BugBuster GST-Bind-Purification Kit Novagen

ECLTM Western Blotting Detection Reagents Amersham Bioscience

3.1.5 Antikorper

Primarantikorper: Maus anti T7 Novagen

Sekundarantikorper: Ziege anti Maus-HRP Novagen

3.1.6 Bakterienstamme und Plasmide

E. coli BL21(DE3)pLysS Novagen

pET21, enthalt einen N-terminalen T7-Tag Novagen

pET41, enthalt einen N-terminalen GST-Tag Novagen

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3.2. Computergestutzte Simulation von Biomolekulen 21

3.1.7 Medium

Bakteriennahrmedien wurden mit VE-Wasser (voll entsalzt; Hausanlage) angesetzt und an-

schließend autoklaviert.

LB-Medium: Trypton 1 % (w/v)

Hefeextrakt 0,5 % (w/v)

NaCl 0,5 % (w/v)

3.1.7.1 Synthetische Peptide

Alle in dieser Arbeit verwendeten synthetisch hergestellten Peptide wurden von der Firma

Coring System Diagonstix (Gernsheim) in einem Reinheitsgrad >95 % bezogen. Die Se-

quenzen sind in Tabelle 3.2 aufgefuhrt. Diese Sequenzen beinhalten alle die Aminosauren

168-187 des herpesviralen Tip Proteins. Innerhalb des Tip-Bindemotivs (AS 174-187) wur-

den Punktmutationen zu Alanin eingefuhrt, welche in fett hervorgehoben sind. Die terminalen

Reste der Peptide wurden jeweils acetyliert (AcNH) beziehungsweise amidiert (CONH2). Um

eine eindeutige Interpretierbarkeit der Fluoreszenzanderung der SH3-Domanen bei Peptidzu-

gabe zu gewahrleisten, wurde W170 von Tip durch Leucin ersetzt, wobei in fruheren Arbeiten

gezeigt wurde, dass der Austausch keinen Einfluss auf die Affinitat hat [74, 75].

Tab. 3.2: Aminosauresequenzen der verwendeten Peptide.

Name Aminosauresequenz Lange

Tip(WT) AcNH-ATLDPGMPTPPLPPRPANLG-CONH2 20mer

Tip(T176A) AcNH-ATLDPGMPAPPLPPRPANLG-CONH2 20mer

Tip(L179A) AcNH-ATLDPGMPTPPAPPRPANLG-CONH2 20mer

Tip(R182A) AcNH-ATLDPGMPTPPLPPAPANLG-CONH2 20mer

Tip(N185A) AcNH-ATLDPGMPTPPLPPRPAALG-CONH2 20mer

Tip(L186A) AcNH-ATLDPGMPTPPLPPRPANAG-CONH2 20mer

Tip(G187A) AcNH-ATLDPGMPTPPLPPRPANLA-CONH2 20mer

3.2 Computergestutzte Simulation von Biomolekulen

Fast alle in dieser Arbeit beschriebenen Molekuldynamik-Simulationen wurden mit dem

Programmpaket AMBER7 [132] und dem Modul sander durchgefuhrt. Mit Hilfe des

PMEMD -Programms, einem Modul im Programmpaket AMBER8 [133], wurden die Simula-

tionen zur Hck-Kinase durchgefuhrt.

Alle MD-Simulationen wurden mit periodischen Randbedingungen unter Verwendung

einer Particle-Mesh-Ewald -Summation [149] fur die langreichweitigen elektrostatischen

Wechselwirkungen durchgefuhrt. Mit Hilfe des SHAKE-Algorithmus [150] wurden Streck-

schwingungen fur alle Bindungen unterdruckt, an denen Wasserstoffatome beteiligt waren.

Die Simulationen wurden sowohl auf Hochleistungsrechnern des Regionalen Rechenzentrums

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22 3. Materialien und Methoden

als auch auf gewohnlichen Arbeitsplatz-PCs im CIP-Pool des Instituts fur Biochemie durch-

gefuhrt.

3.2.1 Kraftfeldparameter

Zur Durchfuhrung von MD-Simulationen ist es notwendig, dass fur das zu bearbeitende

System ein vollstandiger Satz an Parametern fur alle betrachteten Atome und deren mogli-

chen Wechselwirkungen vorliegt.

Alle Simulationen wurden mit den im AMBER7/8-Paket enthaltenen Kraftfeldern ff99 [134]

und gaff durchgefuhrt, wobei das gaff -Kraftfeld nur fur organische Molekule eingesetzt wurde.

3.2.1.1 Parametergenerierung fur organische Molekule

Die Struktur des organischen Liganden PP1 wurde mit dem Programm Gaussian03 quanten-

mechanisch in zwei aufeinanderfolgenden Schritten, HF/MIDI! und HF/6-31G(d), energiemi-

nimiert. Ausgehend von der geometrieoptimierten Struktur wurde im Anschluss eine Ladungs-

berechnung durchgefuhrt. Das elektrostatische Potential (ESP) wurde mit dem Programm

Gaussian03 unter Verwendung des Basissatzes HF/6-31G(d) und mit den von AMBER emp-

fohlenen Einstellungen berechnet. Die anschließende Berechnung der Atomladungen erfolgte

mit dem ANTECHAMBER-Programm, einem Modul im Programmpaket AMBER, basierend

auf der Gaussian03 Ergebnisdatei. Hierbei wurde die ubliche Zweischritt RESP-Fit Prozedur

nach Bayly et al. [151] angewandt.

Simulationsparameter fur Amprenavir (APV), einem Inhibitor der HIV-1 Protease, wurden

aus der Diplomarbeit von Florian Wartha entnommen [152].

3.2.2 Modellierung von Proteinstrukturen

3.2.2.1 Struktur der PP1γ1 mit dem KSVTW-Peptid

Die Kristallstruktur der PP1γ1 im Komplex mit dem Liganden RRVSF [102] wurde als Vor-

lage der Modellierung der PP1γ1-KSVTW Komplexstruktur genutzt. Hierbei wurden die

Seitenketten des RRVSF-Peptids mit SYBYL 6.9 [145] zu KSVTW ausgetauscht. Im An-

schluss daran wurde die Komplexstruktur mit Hilfe des in SYBYL 6.9 vorhandenen Powell-

Algorithmus mit 200 conjugate gradient Schritten energieminimiert. Die resultierende Struk-

tur wurde mit PROCHECK [136] kontrolliert.

3.2.2.2 Strukturen der LynSH3-Tip

Zur Untersuchung der Bindung von Tip an die SH3-Domane der Tyrosinkinase Lyn diente die

NMR-Struktur mit dem PDB-Eintrag 1WA7 [75]. Fur die Simulationen wurden vier reprasen-

tative Strukturen aus dem NMR-Strukturenensemble ausgewahlt, um Abhangigkeiten von

einer einzelnen Startstruktur zu vermeiden [153]. Die drei in der Tip-Sequenz aminoterminal

gelegenen Reste sowie vier Reste des C-Terminus wurden in der Simulation nicht beruck-

sichtigt, da diese Reste nicht zum Bindemotiv (Reste M174-G187) gehoren, und wurden

Page 33: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

3.2. Computergestutzte Simulation von Biomolekulen 23

somit aus der Struktur entfernt. Zusatzlich wurde die Tip-Sequenz mit N- und C-terminalen

Schutzgruppen versehen.

3.2.2.3 Strukturen der Hck*-Kinase

Um den Einfluss der SH3-SH2 Linkersequenz auf die Struktur und Dynamik von Tyrosin-

kinasen zu untersuchen, wurde eine Kinase Hck* modelliert. Hierbei diente als Vorlage die

inaktive Hck-Kinase (PDB-Eintrag 1QCF, [65]), in der die SH3-SH2 Linkersequenz (140V-D-

S-L-E-T-E-E147) durch die Sequenz (A-N-S-L-E-P-E-P) aus Lck ersetzt wurde. Der Aus-

tausch dieses Sequenzbereiches wurde mit Hilfe des Programms SYBYL 6.9 [145] durch-

gefuhrt. Anschließend wurde die Qualitat der generierten Struktur mit Hilfe des Programms

PROCHECK [136] kontrolliert.

3.2.2.4 Strukturen der HIV-1 Protease

Als Basis der MD-Simulationen von HIV-1 Protease dienten die Rontgenstrukturen mit dem

PDB-Eintrag 1HPV fur die Amprenavir komplexierte [154] und 4HVP fur die substratgebun-

dene Protease [155]. Die dreidimensionale Struktur 4HVP enthalt im Komplex ein Substrat-

analogon (MVT-101) mit der Sequenz Acetyl-T-I-Nle-ψ[CH2 -NH]-Nle-Q-R. Die Amidgruppe

zwischen den beiden Norleucinen wurde durch eine Methylengruppe ersetzt. Diese wurde fur

die MD-Simulationen wieder in eine Peptidbindung konvertiert und die beiden Norleucine

durch Methioninseitenketten ersetzt.

Fur die freie Protease existiert keine hochaufgeloste Rontgenstruktur, somit wurden die Si-

mulationen auf Basis der 1HPV-Struktur mit deletiertem Inhibitor durchgefuhrt.

3.2.2.5 Einfuhrung von Punktmutationen in die Proteinstruktur

Punktmutationen in den Wildtyp-Strukturen wurden mit Hilfe des Programms SwissPDB-

VIEWER [148] unter Verwendung der internen Rotamerdatenbank generiert. Hierbei wurde

die Aminosaure gewahlt, die das energetisch gunstigste Rotamer und keine Behinderungen

zu anderen Aminosauren aufwies.

3.2.3 Systemgenerierung

Mit Hilfe der Programme tLEaP und xLEaP (Module im AMBER7/8-Paket, [156]) wurden

die Parameter- und Topologiedateien fur die einzelnen Systeme erstellt.

Hierbei wurde die jeweilige Ausgangs-PDB-Struktur eingeladen. Die bei Kristallstrukturen

nicht vorhandenen Wasserstoffatome wurden automatisch erganzt. Anschließend wurde das

System durch Hinzufugen von Gegenionen neutralisiert. Um eine moglichst physiologische

Umgebung zu erreichen, wurde das Proteinsystem zum Abschluss unter Verwendung des

TIP3P-Wassermodells [157] solvatisiert. Das Protein wurde in einer Wasserbox so platziert,

dass zwischen ihm und der Boxgrenze ein Abstand von mindestens 10 A entstand. Die biolo-

gischen Systeme, die in dieser Arbeit untersucht wurden, sind in Tabelle 3.3 zusammengefasst.

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24 3. Materialien und Methoden

Tab. 3.3: Biologische Systeme.

System PDB AS-Anzahl Gegenionen Referenz

PP1γ1:

RRVSF-PP1γ1 –a 296 7 Na+ [102]

KSVTW-PP1γ1 – 296 8 Na+

HIV-1 Protease:

WT/E35D-Protease frei 1HPV 198 5 Cl− [154]

WT/E35D-Protease SUBb 4HPV 205 5 Cl− [155]

WT/E35D-Protease APVc 1HPV 198 5 Cl−

LynSH3-Tip: [75]

Lyn-Tip(174−187) 1WA7d 76 1 Cl−

Lyn-Tip(174−185) 1WA7d 74 1 Cl−

Lyn-Tip(174−187)(G187A) 1WA7c 76 1 Cl−

Lyn(H41S)-Tip(174−187) 1WA7d 76 1 Cl−

Lyn(H41S)-Tip(174−185) 1WA7d 74 1 Cl−

Hck/Hck*-SH3:

HckSH3, PP1e, Tyr446-P 1QCF 450 6 Na+ [65]

Hck*SH3, PP1, Tyr446-P 1QCF 450 4 Na+

HckSH3, dephosphoryliert 1QCF 450 4 Na+

Hck*SH3, dephosphoryliert 1QCF 450 2 Na+

aDie Struktur wurde von Prof. D. Barford (Univ. Oxford, UK) zur Verfugung gestellt, da diese nicht

in der PDB [158] hinterlegt ist.b SUB: Substrat mit der Sequenz Ace-Thr-Ile-Met-Met-Gln-ArgcAPV: Proteaseinhibitor AmprenavirdAus der NMR-Schar 1WA7, Struktur 5, 10, 15 und 20.ePP1: Tyrosinkinaseinhibitor

3.2.4 Geometrieoptimierung

Bei Molekuldynamik-Simulationen startet man haufig mit Strukturen die mit anderen Kraft-

feldern berechnet wurden und denen somit im AMBER-Kraftfeld ein relativ hoher Energie-

wert zugeordnet wird. Durch Geometrieoptimierung zu Beginn der Simulationen versucht

man, die Startstrukturen zu relaxieren, um Konformationen zu erhalten, die mit den verwen-

deten AMBER Kraftfeldparametern besser im Einklang stehen.

In der vorliegenden Arbeit wurden alle Strukturen in einem Dreischrittverfahren energiemini-

miert. Zuerst erfolgte die Minimierung der Wassermolekule mit 250 Schritten steepest descent,

gefolgt von 250 Schritten conjugate gradient Minimierung. Hierzu wurden alle verbleibenden

Atome mit einer Kraftkonstante von 500 kcal ·mol−1 · A−2 auf ihrer ursprunglichen Position fi-

xiert. Anschließend erfolgt die Relaxierung der Aminosaurenseitenketten (250 Schritte steepest

descent, 250 Schritte conjugate gradient Minimierung), hierbei wurde nur noch das Protein-

ruckgrat fixiert. In der letzten Phase der Geometrieoptimierung wurden alle Fixierungen

Page 35: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

3.2. Computergestutzte Simulation von Biomolekulen 25

gelost, so dass sich sowohl das Protein als auch das Wasser und die Gegenionen frei bewe-

gen konnten. Die Minimierung wurde hierbei mit 250 Schritten steepest descent und 7250

Schritten conjugate gradient durchgefuhrt.

3.2.5 Aquilibrierung

Das durch Geometrieoptimierung relaxierte Proteinsystem wurde in der Aquilibrierungspha-

se auf die jeweiligen Simulationsbedingungen eingestellt. Hierbei wurden die Systeme schritt-

weise von 50 K auf die endgultige Simulationstemperatur von 298 K erwarmt. Wahrend der

Simulation wurde die Temperatur durch die Kopplung an ein Warmebad [159], das die kine-

tische Energie des Systems entsprechend den Vorgaben korrigiert, konstant gehalten.

3.2.6 Produktion

Nach Einstellung eines dynamischen Gleichgewichts wurde mit der Aufzeichnung der Trajek-

torie fur die nachfolgenden Analysen begonnen. Die in der Arbeit angewandten Simulations-

parameter sind in der Tabelle (Tab. 3.4) aufgefuhrt. Zur Verkurzung der Tabelle wurden hier

nur die Hauptsysteme dargestellt. Alle Simulationen der jeweiligen Untersysteme wurden mit

den gleichen Simulationsprotokollen durchgefuhrt.

Tab. 3.4: Simulationsparameter wahrend der Simulationszeit.

System Schrittweite ∆t Cutoff Temperatur Produktionsphase

PP1γ1 2 fs 8,5 A 298 K 1 ns

HIV-1 Protease 1 fs 8,5 A 298 K 10 ns

LynSH3-Tip 1 fs 10 A 298 K 1 ns

Hck/Hck*-Kinase 1 fs 10 A 298 K 10 ns

Als Zusammenfassung zeigt Abbildung 3.1 eine sche-

matische Ubersicht der zuvor durchgefuhrten Schritte,

welche zur Durchfuhrung einer MD-Simulation notwen-

dig sind.

Abb. 3.1: Schematische Darstellung des Standardver-

fahrens zum Ablauf einer MD-Simulation.

Geometrieoptimierung

LEAP

PDB-Struktur

Produktion

- Einlesen der PDB-Struktur- Hinzufügen fehlender Wasserstoffatome- Neutralisation und Solvatation

- Relaxierung des System in 3 Phasen:1. Proteinsystem vollständig fixiert2. Proteinrückgrat fixiert, Seitenketten frei

beweglich3. Alles frei beweglich

Äquilibrierung- Einstellen der Simulationsbedingungen(Druck, Temperatur, Dichte,...)

- Aufzeichnung der Daten (Abspeichern imTrajektorienfile)

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26 3. Materialien und Methoden

3.2.7 Analyse der Trajektorien

Die einzelnen Strukturen einer Trajektorie sind zeitlich gekoppelt. Aus diesem Grund eignen

sie sich fur die Berechnung von Eigenschaften, welche die Dynamik eines Systems wider-

spiegeln. Des Weiteren ist es moglich, Protein-Ligand-Wechselwirkungen zu analysieren.

3.2.7.1 Berechnung der mittleren quadratischen Standardabweichung

Die mittlere quadratische Standardabweichung (RMSD; root-mean-square-deviation) ist ein

Maß fur die Ubereinstimmung bzw. fur die Abweichung der Konformationen beim Vergleich

verschiedener Geometrien. Sie ist definiert als die Wurzel der mittleren quadratischen Abwei-

chung fur aquivalenten Cα-Atome (Gleichung 3.1).

RMSD =

√√√√√N∑i=1d2i

N(3.1)

Dabei ist N die Anzahl der betrachteten Atome und di der Abstand zwischen den Atomen

des i-ten Paares bei optimaler Uberlagerung.

3.2.7.2 Berechnung von Bindungsenergien

Die spezifische Wechselwirkung von Proteinen mit ihren Liganden erfolgt uber die Ausbildung

einer Vielzahl nichtkovalenter Interaktionen. Hierbei spielen die Komplementaritat der Ober-

flachen sowie die elektrostatischen Eigenschaften der Bindungspartner eine wichtige Rolle.

In physiologischer Umgebung sind nichtkovalente Wechselwirkungen prinzipiell reversibel. Es

besteht somit ein Gleichgewicht zwischen dem gebildeten Komplex und den beiden freien

Komponenten (Protein P bzw. Ligand L).

LPKD⇀↽ L+ P

Die Starke einer Wechselwirkung (Bindungsaffinitat) wird durch eine thermodynamische

Gleichgewichtsgroße, die Bindekonstante KD, beschrieben. Mit Hilfe experimenteller Metho-

den lasst sich die Bindung eines Liganden an ein Protein messen. Die freie Energie der Bin-

dung, ∆Gb, lasst sich aus der experimentell ermittelten Bindekonstante bestimmen (Gleichung

3.2).

∆Gb = RT lnKD (3.2)

Je kleiner die Bindekonstante bzw. je negativer ∆G, desto starker bzw. affiner bindet der

Ligand an das Protein.

Die Berechnung der freien Bindungsenergien ∆Gb wurden in der vorliegenden Arbeit mit

dem Molecular Mechanics/Poisson-Boltzmann Surface Area-Ansatz (MM/PBSA) [160, 161]

gemaß Gleichung 3.3 durchgefuhrt.

∆Gb = ∆GMM + ∆Gsol − T∆S (3.3)

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3.2. Computergestutzte Simulation von Biomolekulen 27

Dabei stellt ∆GMM die molekularmechanische (MM) Wechselwirkungsenergie zwischen

Protein und Ligand, ∆Gsol die freie Solvatationsenergie und −T∆S den entropischen Bei-

trag zur Bindung dar, welcher mittels der Normalmodenanalyse in AMBER berechnet wurde.

∆GMM wurde uber die MM-Wechselwirkungsenergien nach der Gleichung 3.4 berechnet,

∆GMM = ∆Geleint + ∆Gvdwint (3.4)

wobei ∆Geleint und ∆Gvdwint fur die elektrostatischen und van der Waals Wechselwirkungsener-

gien zwischen Protein und Ligand stehen. Diese Terme wurden mit dem AMBER-Modul

sander berechnet.

Die Solvatationsenergie ∆Gsol setzt sich aus einem elektrostatischen (∆Gelesol) und den un-

polaren (∆Gnonpolarsol ) Anteilen zusammen (Gleichung 3.5).

∆Gsol = ∆Gelesol + ∆Gnonpolarsol (3.5)

Der elektrostatische Beitrag der Solvatationsenergie wurde mit Hilfe des Programms DelPhi 4

[139] berechnet, welches die Poisson-Boltzmann Gleichung numerisch lost und die elektro-

statische Energie entsprechend des elektrostatischen Potentials kalkuliert.

Der Beitrag unpolarer Wechselwirkungen zur freien Solvatationsenergie wird als lineare Funk-

tion der losungsmittelzuganglichen Oberflache (solvent accessible surface area, SA) [162] be-

trachtet (Gleichung 3.6)

∆Gnonpolarsol = γSA+ b (3.6)

mit γ = 0.00542 kcal ·mol−1 · A−2, und b = 0.92 kcal·mol−1.

Die MM/PBSA-Analyse wurde mit dem im AMBER7-Paket enthaltenen Skript mmpbsa.pl

durchgefuhrt. Ausgangspunkt der MM/PBSA-Analyse waren die in der Produktionsphase

abgespeicherten Strukturen. Fur einen Satz reprasentativer Strukturen innerhalb der Tra-

jektorie werden die einzelnen Beitrage zur freien Bindungsenergie wie oben beschrieben be-

rechnet und gemittelt. Die Mittelwerte werden im Anschluss zur Berechnung der freien Bin-

dungsenergie verwendet. Um genugend relevante Konformationen zu berucksichtigen, sollten

mindestens 100 Strukturen fur die Analyse verwendet werden. Aus den in der Trajektorie

gespeicherten Protein-Ligand-Komplexen wurden die Protein- und Ligandenstrukturen ex-

trahiert. Topologiedateien von Komplex-, Rezeptor- und Ligandstrukturen ohne Wasser und

Gegenionen wurden mit LEaP erstellt.

3.2.7.3 Alanin-Scan

Eine gangige Methode zur Charakterisierung von molekularen Erkennungsmechanismen ist

der Alanin-Scan [163]. Hierbei konnen Aminosauren identifiziert werden, die einen wichtigen

Beitrag zur Bindung liefern. Beim Alanin-Scan wird die zu untersuchende Position des Peptid-

liganden mit Alanin substituiert, was im Grunde dadurch erreicht wird, dass die Seitenkette

der zu untersuchenden Aminosaure zu einer Methylgruppe reduziert wird. Dadurch werden

nichtkovalente Wechselwirkungen verandert, wobei aber die Gesamtstruktur des Peptids er-

halten bleibt.

Page 38: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

28 3. Materialien und Methoden

Mit Hilfe des MM/PBSA-Skripts (mmpbsa.pl), welches in AMBER7 implementiert ist, wur-

de die zu untersuchende Aminosaure vor der Analyse der freien Bindungsenergien zu Alanin

ausgetauscht und die Bindungsenergie, wie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben, be-

rechnet. Hierbei wird die Berechnung der freien Bindungsenergie nach dem Standardprotokoll

von Massova und Kollman [164] durchgefuhrt. Ausgangspunkt fur den Alanin-Scan waren die

Strukturen, die im Laufe der MD-Simulation in einer Trajektorie gespeichert wurden.

CβCγ

Abb. 3.2: Generierung der Alaninstruktur

am Beispiel von Arginin. Die Bindungs-

lange, welche wahrend des Scan verkurzt

wird, ist als Pfeil gekennzeichnet.

Innerhalb des Scans wird Alanin in die Struk-

turen der Trajektorie durch Verkurzen der

Seitenkette bis zum Cβ-Atom der zu mutie-

renden Aminosaure eingefuhrt, wobei Cγ durch

ein Proton ersetzt wird. Des Weiteren wird die

Cβ–Hβ-Bindungslange auf 1,09 A reduziert.

Die Differenz der freien Bindungsenergie zwischen der Wildtypstruktur und der mutierten

Struktur ist wie folgt definiert:

∆∆GBindung = ∆Gb(Wildtyp)−∆Gb(Mutante) (3.7)

3.3 Fluoreszenzspektroskopische Messungen

3.3.1 Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Proteinkonzentration wurde durch Absorptionsmessungen bei 280 nm unter Berucksich-

tigung der Eigenabsorption des entsprechenden Puffers nach dem Lambert-Beerschen Gesetz

A = ε · c · d (3.8)

bestimmt. Dabei ist A die im Photometer gemessene Absorption, c die molare Konzentration

(mol · l−1), d die Schichtdicke (cm) und ε der molare Absorptionskoeffizient (M−1 · cm−1), der

auf der Basis der Aminosauresequenz berechnet wurde [165].

3.3.2 Fluoreszenztitration

Die Liganden-Bindungseigenschaften von Tip-Varianten an die SH3-Domane wurden mittels

der Fluoreszenztitrationsmethode bestimmt. Hierbei wurde die Abnahme der intrinsischen

Tryptophan-Fluoreszenz des Proteins bei Komplexbildung mit dem Liganden (Quenching)

gemessen. Die Messungen erfolgten an einem Perkin-Elmer LS55 Fluoreszenzspektrometer

(Perkin Elmer, Boston, USA) in einer Halbmikro-Ruhrfischkuvette (1,5 ml Fullvolumen) bei

Page 39: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

3.4. Molekularbiologische und proteinbiochemische Methoden 29

21 ◦C mit einer Anregungswellenlange von 290 nm (Spaltbreite 5,5 nm) und einer Emissions-

wellenlange von 345 nm (Spaltbreite 5,5 nm).

Jeweils 1,2 ml einer Proteinlosung (0,5 µM SH3-Domane in PBS-Puffer mit 1 mM DTT) wur-

den bei einer konstanten Temperatur von 21 ◦C vorgelegt. Unter Ruhren wurden die in Wasser

gelosten Peptide in verschiedenen Konzentrationen dazu pipettiert, bis keine Anderung der

Fluoreszenz mehr zu erkennen war. Nach jedem Titrationsschritt wurde die Losung zur Gleich-

gewichtseinstellung 1 min unter Ruhren inkubiert. Das Fluoreszenzsignal wurde anschließend

uber einen Zeitraum von 30 s aufgezeichnet, gemittelt und die Eigenfluoreszenz des Puffers

subtrahiert. Das Fluoreszenzsignal wurde um die Verdunnung der Proteinlosung durch die

Peptidzugabe korrigiert.

Die hierbei verwendete SH3-Domane wurde freundlicherweise von Prof. Dieter Willbold (For-

schungszentrum Julich) zur Verfugung gestellt, in dessen Labor dann auch die entsprechenden

Messungen durchgefuhrt wurden.

3.3.3 Bestimmung der Dissoziationskonstanten aus den Fluoreszenzdaten

Die Affinitat der Bindung zwischen Ligand und Protein lasst sich durch die Dissoziationskon-

stante (KD) beschreiben. Die Dissoziationskonstante beschreibt das Gleichgewicht zwischen

den freien Spezies und dem Komplex.

KD =[P ] · [L]

[PL](3.9)

Dabei steht [P] fur die Konzentration des freien Proteins, [L] fur die freie Ligandkonzentration

und [PL] fur die Konzentration des Komplexes aus beiden Bindungspartnern.

Die Bestimmung der Dissoziationskonstanten aus Fluoreszenzdaten wurde durch nichtlineare

Regressionsrechnung mit dem SigmaPlot-Programm (Version 9.0) nach der Gleichung 3.10

durchgefuhrt [166].

F = Fmin +

([Pges ] + [Lges ] +KD

2−√

([Pges ] + [Lges ] +KD)2

4− [Pges ][Lges ]

)·(Fmax − Fmin )

Pges

(3.10)

F: Fluoreszenz-Intensitat des Proteins bei der entsprechender Ligandenkonzentration

Pges: Konzentration des vorgelegten Proteins

Lges: Konzentration des titrierten Liganden

Fmin: Fluoreszenz-Intensitat des Proteins bei Titrationsstart

Fmax: Fluoreszenz-Intensitat des Proteins bei gesattigter Ligandenkonzentration

3.4 Molekularbiologische und proteinbiochemische Methoden

Mutationen im KSVTW-Bindemotiv der C-terminalen Domane von mGluR7b wurden durch

Standard PCR-Klonierungstechniken von Dr. Ralf Enz eingefuhrt [106, 167]. Alle Kon-

strukte wurden durch Klonierung in den Escherichia coli Expressionsvektor pET41 mit ei-

nem N-terminalen GST-Tag versehen, wohingegen der Bindungspartner PP1γ1 mit einem N-

Page 40: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

30 3. Materialien und Methoden

terminalen T7-Epitop durch Klonierung in den pET21 Vektor versehen wurde. Alle Plasmide

wurden in den E. coli -Stamm BL21(DE)pLysS transformiert. Um PCR-Fehler auszuschließen,

wurden alle Konstrukte sequenziert.

3.4.1 GST Pulldown Analysen

Mit Hilfe der Glutathion S-Transferase (GST) Pulldown Analyse kann eine Bindung zweier

Proteine in vitro nachgewiesen werden. Hierbei wird eines der zu untersuchenden Proteine

als GST-Fusionsprotein exprimiert.

Die Konstrukte pET21 (T7-Tag–PP1γ1) und pET41 (GST-Tag–mGluR7b) wurden in dem

E. coli -Stamm BL21(DE)pLysS exprimiert. Mit Ampicillin versetztes LB-Medium wurde

hierzu angeimpft und bei 37 ◦C fur ca. eine Stunde geschuttelt. Nach Erreichen einer OD600

von etwa 0,6 wurde die Proteinexpression durch Hinzugabe von 1 mM Isopropyl-Thio-β-

D-Galactopyranosid (IPTG) induziert. Nach vier Stunden wurden die Zellen bei 4 ◦C fur

30 min bei 4000 rpm zentrifugiert. Der Uberstand wurde verworfen, das Sediment in 1x PBS

gewaschen und nach Resuspendierung erneut fur 10 min bei 4 ◦C mit 4000 rpm zentrifugiert.

Das erhaltene Pellet wurde bis zur weiteren Verarbeitung bei -20 ◦C eingefroren.

Zellaufschlusse wurden unter nativen Bedingungen durchgefuhrt. Zur Reinigung der pET41

GST-Fusionsproteine aus E. coli wurde der”BugBuster GST-Bind-Purification Kit“ von

Novagen verwendet. PP1γ1 wurde mit Lysispuffer resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert.

Anschließend erfolgten sechs 10 s Ultraschallbehandlungen (300 W), wobei die Probe ebenfalls

auf Eis gehalten wurde. Die losliche Fraktion wurde durch Zentrifugation von Zelltrummern

abgetrennt, auf die mit den GST-Fusionsproteinen beschichteten Sepharose-Beads gegeben

und eine Stunde bei 4 ◦C in einem Uberkopfschuttler inkubiert. Die Beads wurden dreimal

mit GST-Waschpuffer gewaschen. Gebundenes PP1γ1 wurde im Western-Blot durch einen

T7-Tag spezifischen Antikorper detektiert. Beschichtete Beads wurden anschließend durch

eine Coomassie Brilliant Blue Farbung uberpruft.

Lysispuffer 50 mM NaH2PO4

300 mM NaCl, pH 8,0

25 units/ml Benzonase (Novagen)

1 mg/ml Lysozym (Sigma)

Proteaseinhibitoren (Roche)

1µl/ml Triton x-100

GST-Bindepuffer 4,3 mM Na2HPO4

1,47 mM KH2PO4

137 mM NaCl

2,7 mM KCl, pH 7,3

GST-Waschpuffer GST-Bindepuffer + 0,1 % Triton X-100

Page 41: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

3.4. Molekularbiologische und proteinbiochemische Methoden 31

3.4.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) dient der Analyse und Auftrennung

von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht. Verwendet wurde das diskontinuierliche

Gelsystem mit Tris-Glycin-Puffern von Laemmli [168]. Im Probenpuffer enthaltenes SDS

denaturiert die Proteine und erzeugt negative Ladungen an den Polypeptidketten. Zusatzlich

werden durch β-Mercaptoethanol Disulfidbrucken reduziert und somit kovalente Protein-

Protein-Wechselwirkungen verhindert. Die Proteine wandern im elektrischen Feld zur

Anode. Dabei trennt das Molekularsieb der Polyacrylamidmatrix die Proteine nach ihrem

Molekulargewicht auf.

Es werden Acrylamidkonzentration von 4 % fur das Sammelgel und 8-15 % fur das Trenngel

verwendet. Die Proteinproben werden mit Probenpuffer gemischt und fur 5-10 min bei 95 ◦C

erhitzt. Anschließend werden die Proben auf ein SDS-Gel aufgetragen. Die Elektrophorese

wird mit 100 V gestartet. Nachdem die Proteine ins Trenngel gelaufen sind, wird die

Elektrophorese konstant bei 150 V fur 1,5 h durchgefuhrt.

Trenngelpuffer 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8, 0,4 % (w/v) SDS

Sammelgelpuffer 500 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,4 % (w/v) SDS

10x Laufpuffer 250 mM Tris-HCl, pH 8,3

1,92 M Glycin

1 % (w/v) SDS

Probenpuffer 125 mM Tris-HCl, pH 6,8

4 % SDS

20 % Glycerin

10 % β-Mercaptoenthanol

0,01 % Bromphenolblau

Ammoniumpersulfat (APS) 10 % APS

Wasser

30 % Acrylamidlosung 30 % Acrylamid

0,8 % Methylenbisacrylamid

3.4.3 Coomassie-Farbung

Proteine uber 0,5µg konnen in Polyacrylamid (PAA)-Gelen sehr einfach mit dem Farbstoff

Coomassie Brillant Blue R250 angefarbt werden, wobei der Farbstoff mit den Proteinen

unter Komplexbildung reagiert. Nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wird

das Trenngel ca. 2 h bei Raumtemperatur in der Coomassie-Farbelosung geschwenkt. Das

gefarbte Gel wird anschließend zur Entfarbung des Hintergrunds in Entfarbelosung uberfuhrt.

Coomassie-Farbelosung 0,25 % Coomassie Brilliant Blue R250

50 % Methanol

10 % Essigsaure

Entfarbelosung 10 % Methanol

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32 3. Materialien und Methoden

10 % Essigsaure

Wasser

3.4.4 Western Blot

Die in der Gelelektrophorese aufgetrennten Proteine werden nach einer modifizierten

Methode von Towbin [169] auf eine Nitrocellulosemembran ubertragen. Proteine binden

dabei uber hydrophobe Wechselwirkung an die Membran.

Ein Sandwich aus in Blotpuffer getrankten Whatman-Filtern, der befeuchteten Nitrocellulo-

semembran, dem Gel und zwei weiteren feuchten Filterpapieren werden auf der Anodenplatte

luftblasenfrei aufgeschichtet. Der Transfer findet bei 180 mA fur eine Stunde statt.

Alle folgenden Schritte werden auf dem Wippschuttler durchgefuhrt. Freie Bindungsstellen

auf der Nitrocellulosemembran werden durch 30 min Inkubation mit Blockierlosung ab-

gesattigt. Danach wird die Membran fur eine Stunde mit dem spezifischen Primarantikorper

inkubiert. Nachdem die Membran mehrmals mit Waschpuffer gewaschen worden ist, erfolgt

die Inkubation von einer Stunde mit dem Meerrettich-Peroxidase gekoppelten sekundaren

Antikorper. Anschließend wird die Membran funfmal mit Waschpuffer gewaschen und

zweimal mit 1x PBS gespult.

Zur Visualisierung der Banden wurde die Membran 1 min mit ECL-Reagenz behandelt und

danach das Ergebnis durch Auflegen eines Films zu unterschiedlichen Zeitpunkten in der

Dunkelkammer dokumentiert.

Blotpuffer: 192 mM Glycin

50 % Methanol

10 % Essigsaure

Polyvinyl Pyrrolidon: 10 g PVP-10

(PVP) 10 % 100 ml 1x PBS

Waschpuffer: 0,5 % Triton x-100

0,1 % PVP

1x PBS

Blockierlosung: 1 % PVP

1x PBS

PBS 10x 137 mM NaCl

2,7 mM KCl

4,3 mM Na2HPO4 x 7 H2O

1,4 mM KH2PO4

pH4

Page 43: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

4 Ergebnisse

In der vorliegenden Arbeit wurden theoretische sowie experimentelle Untersuchungen an

verschiedenen biologischen Systemen, der Src-Kinase Hck, der SH3-Domane der Tyrosin-

kinase Lyn, der Proteinphosphatase 1 und der HIV-1 Protease durchgefuhrt. Dabei wurden

unter anderem Methoden zur Untersuchung von Affinitat und Spezifitat angewandt, die

Aufschluss uber Proteininteraktionen geben sollten. Weiterhin wurde die Dynamik der

einzelnen Systeme und die daraus resultierenden Wechselwirkungen analysiert.

4.1 Einfluss des SH3-SH2 Linkers auf Struktur und Dynamik

der Src-Kinasen

Fruhere NMR-Untersuchungen haben gezeigt, dass der Linker zwischen dem SH3-SH2

Domanenpaar aus Lck im Vergleich zu anderen Src-Kinasen eine erhohte Flexibilitat aufweist.

Dies wurde auf die veranderte Zusammensetzung des SH3-SH2 Linkers und auf das Fehlen ei-

ner Salzbrucke zuruckgefuhrt [67] und als relevant bezuglich der Aktivierung von Src-Kinasen

diskutiert [58]. Mittels Molekuldynamik-(MD)-Simulation sollte im Rahmen dieser Arbeit der

Einfluss der SH3-SH2 Linkersequenz auf die Struktur und Dynamik von Tyrosinkinasen un-

tersucht werden.

Aufgrund der Tatsache, dass fur die geschlossene, inaktive Lck-Kinase keine dreidimensionale

Struktur existiert, ist ein direkter Vergleich mit anderen Src-Kinasen nicht moglich. Daher

wurde ein Strukturmodell (Hck*) auf Basis der inaktiven Hck-Kinase (PDB: 1QCF, [65])

erstellt, in dem die starre Hck-Linkersequenz (140V-D-S-L-E-T-E-E147) zwischen den regu-

latorischen Domanen SH3 und SH2 durch die flexiblere Linkersequenz (A-N-S-L-E-P-E-P)

aus Lck ersetzt (Abschnitt 3.2.2.3) ist.

Wie in der Abbildung 4.1 zu erkennen unterscheidet sich die Sequenz des SH3-SH2 Linkers

in vier Aminosauren. Die katalytische Domane, bestehend aus zwei Subdomanen (N- und C-

Lobe), umschließt das aktive Zentrum. Die Struktur der Hck-Kinase wurde mit einem nieder-

molekularen Inhibitor (PP1) kristallisiert. Zur Untersuchung der Effekte des Lck-Domanen-

linkers wurden die fehlenden MD-Parameter des Inhibitors wie im Methodenteil (Abschnitt

3.2.1.1) beschrieben generiert. Diese sind im Anhang zusammengefasst (Anhang B.1.1).

33

Page 44: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

34 4. Ergebnisse

(A)

V140

D141 S142

L143

E144

T145

E146

E147

A140

N141 S142

L143

E144

E146

P145

P147

(B)

PP1

N-Lobe

C-Lobe

SH3

SH2

Abb. 4.1: Modell der geschlossenen, inaktiven Hck*-Kinase. A) Linker zwischen dem regulatorischen

Domanenpaar SH3 und SH2 aus der Wildtyp Hck-Kinase (links) und aus der Lck-Kinase (rechts). B) Uber-

lagerung der Wildtyp-Kinase (orange) und mutierten Kinase (grau) im Komplex mit dem Inhibitor PP1.

4.1.1 Einfluss der SH3-SH2 Linkersequenz auf die globale Struktur

Um festzustellen welchen Effekt der SH3-SH2 Linker auf die globale Struktur besitzt, wurden

sowohl in der inhibitorgebundenen, inaktiven Wildtyp-Kinase als auch in der mutierten Hck-

Kinase die Abstande der Massenschwerpunkte der benachbarten Domanen (SH3, SH2, N-

Lobe, C-Lobe) untersucht. Dies ist in Abbildung 4.2 schematisch gezeigt.

N

SH3

SH2

Y527P

N-Lobe

C-Lobe

Y416

C

Abb. 4.2: Schematische Darstellung der inaktiven

Kinase. Die gestrichelten Linien symbolisieren die zu un-

tersuchenden Abstande.

Die Abstande zwischen den Massenschwerpunkten sind in Abbildung 4.3 gegen die Simula-

tionszeit aufgetragen.

Die Einfuhrung des SH3-SH2 Domanenlinkers aus Lck in die Struktur der Hck-Kinase fuhrte

zu einer erhohten Flexibilitat der globalen Struktur (Abb. 4.3). Im Verlauf der Simulation

konnte beobachtet werden, dass sich der Abstand zwischen den Massenschwerpunkten von

N- und C-Lobe vergroßert, was auf eine leichte Offnungsbewegung hindeutet. Weiterhin ist

zu erkennen, dass der Linkeraustausch einen großen Effekt auf den Abstand zwischen der

SH3-Domane und dem N-Lobe ausubt. Zu Beginn wurde ein Abstand von zirka 29 A einge-

nommen, wohingegen am Ende der Simulation ein Abstand von 32 A vorhanden war. Dies

Page 45: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

4.1. Einfluss des SH3-SH2 Linkers auf Struktur und Dynamik der Src-Kinasen 35

lasst vermuten, dass sich die SH3-Domane vom N-Lobe weg bewegt. Vergleicht man dagegen

die Abstande zwischen der SH2-Domane und dem C-Lobe sowie zwischen den regulatorischen

Domanen, so wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen der Wildtyp- und mutierten

Struktur beobachtet.

(A)

26

28

30

32

34

Abst

and [Å

]

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Zeit [ns]

(B)

26

28

30

32

34

Abst

and [Å

]

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Zeit [ns]

(C)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Zeit [ns]

38

40

42

Abst

and [Å

]

(D)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Zeit [ns]

26

28

30

32

34

Abst

and [Å

]

Abb. 4.3: Abstande zwischen den Massenschwerpunkten der inhibierten Kinase. Abstande zwi-

schen A) der SH3-Domane und dem N-Lobe, B) N-Lobe und C-Lobe der katalytischen Domane, C) der SH2-

Domane und dem C-Lobe und D) zwischen den regulatorischen Domanen SH3 und SH2 im Verlauf der Simu-

lation. schwarz: Hck-Kinase, rot: Hck*-Kinase.

Konsistent mit der in Abbildung 4.3A und B beobachteten Offnungsbewegung konnte bei der

mutierten Kinase ein großerer Abstand zwischen dem Rest S142 im SH3-SH2 Linker (Abb.

4.1) und der Aminosaure A403 im aktiven Zentrum festgestellt werden. Dieser betrug wie

bei der Wildtyp-Kinase zu Beginn 34 A, erhohte sich aber bei der Hck*-Kinase wahrend der

MD-Simulation auf 39 A, wohingegen der Abstand in der Wildtyp-Kinase konstant blieb.

Page 46: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

36 4. Ergebnisse

4.1.2 Auswirkungen im aktiven Zentrum der inhibitorgebundenen Kinase

Nachdem die SH3-SH2 Linkersequenz aus Lck einen großen Einfluss auf die globale Struktur

der Hck-Kinase besaß, wurde untersucht, ob die veranderte Linkersequenz auch Auswirkungen

auf das weit entfernt liegende aktive Zentrum hat.

4.1.2.1 Untersuchung des Inhibitor-Bindungsmodus

Die fur die Simulationen verwendete dreidimensionale Struktur der Hck-Kinase wurde mit

einem niedermolekularen Inhibitor (PP1) kristallisiert, der die inaktive, geschlossene Kon-

formation stabilisiert. Zur Untersuchung des Bindungsmodus wurden die energieminimierten

Strukturen mit LIGPLOT analysiert (Abb. 4.4).

3.09

3.033.23

C14

C13

C15

C16

N1

N4

C2

C5

N2

C3

C1

N3

C4

N5

C6

C7C11

C8

C9

C12

C10

N

CA

CB

C

CG2

OG1

O

N

CA

CBC

CG

SD

CE

O

N

CA

CB

C

CG

CDOE1

OE2

O

K295

L393

F340

L273

V281

A293

I336

S345G344

D348

D404

PP1

T338

M341

E339

Abb. 4.4: Schematische Darstellung der Wechselwirkungen in der Ligandenbindungstasche. In

der Abbildung sind die mit LIGPLOT identifizierten Wechselwirkungen zwischen dem Inhibitor PP1 und der

Hck-Kinase dargestellt. Fur Hck* wurden die gleichen Wechselwirkungen identifiziert. Die Wasserstoffbrucken

sind als gestrichelte Linien eingezeichnet. Hydrophobe Wechselwirkungen sind durch rote Speichen um die

beteiligten Atome des Inhibitors gekennzeichnet. Die entsprechenden Bindungspartner der Kinase sind durch

rote Bogen mit Speichen wiedergegeben. Die Abbildung wurde mit dem Programm LIGPLOT [137] erstellt.

Es konnte beobachtet werden, dass der Inhibitor sowohl in der Wildtypstruktur als auch in

der mutierten Hck-Kinase die gleichen Wechselwirkungen aufweist. Die Einfuhrung des SH3-

SH2 Linkers aus Lck in die Hck-Kinase veranderte somit nicht den PP1-Bindungsmodus. Im

Verlauf der Simulation konnte beobachtet werden, dass die identifizierten Wasserstoffbrucken

zwischen PP1 und den Aminosauren T338, E339 und M341 der katalytischen Domane in Hck

und Hck* uber die gesamte Simulationszeit ausgebildet waren.

Page 47: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

4.1. Einfluss des SH3-SH2 Linkers auf Struktur und Dynamik der Src-Kinasen 37

4.1.2.2 Untersuchung des DFG-Motivs in der katalytischen Domane

Das Aktivierungssegment, das in der Kinasedomane zwischen dem N- und C-Lobe lokali-

siert ist, enthalt im N-Terminus ein konserviertes DFG-Motiv, das nach den entsprechenden

Aminosauren bezeichnet wird. Neuere Arbeiten [170, 171] haben gezeigt, dass dieses Motiv

unterschiedliche Konformationen einnehmen kann. Nachdem der Linkeraustausch zu einer

veranderten globalen Struktur fuhrte, die Wechselwirkungen zum Inhibitor aber nicht beein-

flusst wurden, sollte untersucht werden, ob Auswirkungen auf das DFG-Motiv beobachtet wer-

den konnen. Zur Charakterisierung der Konformation des Peptidruckgrats des DFG-Motivs

wurden die beiden Torsionswinkel phi (φ) und psi (ψ) des jeweiligen Aminosaurenrests ana-

lysiert (Abb. 4.5). Der Winkel phi (φ) beschreibt die Rotation entlang der N–Cα Bindung

und wird durch ein System von vier kovalent verknupften Atomen C–N–Cα–C definiert. Ana-

log definiert das System N–Cα–C–N den Winkel psi (ψ), welcher die Rotation um die Cα–C

Bindung beschreibt.

f

yA403

D404

F405

G406

yf f

yy

Abb. 4.5: Schematische Darstellung der Hck-Kinase. Das konservierte DFG-Motiv (fett hervorgehoben)

und die sich N-terminal anschließende Aminosaure aus dem Aktivierungssegment ist vergroßert dargestellt.

Die Torsionswinkel φ und ψ der einzelnen Aminosauren sind mit Pfeilen gekennzeichnet.

Die Ruckgratwinkel des DFG-Motivs und der sich N-terminal anschließenden Aminosaure

A403 sind in Abbildung 4.6 gegen die Simulationszeit aufgetragen.

Wie aus den Abbildungen ersichtlich wird, sind keine signifikanten Unterschiede zwischen

der Wildtypstruktur und der Hck*-Kinase in den beiden Torsionswinkeln φ und ψ des DFG-

Motivs zu erkennen. Der Linkeraustausch scheint somit keinen Einfluss auf das aktive Zentrum

der inhibitorgebundenen Kinase zu haben.

Page 48: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

38 4. Ergebnisse

(A)

0 2 4 6 8 10 12 14

-200

-100

0

100

200

fA403

0 2 4 6 8 10 12 14Zeit [ns]

-200

-100

0

100

200

y

(B)

0 2 4 6 8 10 12 14

-200

-100

0

100

200

D404

0 2 4 6 8 10 12 14Zeit [ns]

-200

-100

0

100

200

fy

(C)

0 2 4 6 8 10 12 14

-200

-100

0

100

200

f

F405

0 2 4 6 8 10 12 14Zeit [ns]

-200

-100

0

100

200

y

(D)

0 2 4 6 8 10 12 14

-200

-100

0

100

200

G406

0 2 4 6 8 10 12 14Zeit [ns]

-200

-100

0

100

200

fy

Abb. 4.6: Torsionswinkel (φ und ψ) des DFG-Motivs und der N-terminal angrenzenden Amino-

saure der inhibitorgebundenen Kinase. Untersuchung der φ/ψ-Winkel der im Aktivierungssegment ge-

legenen Aminosauren A) A403 B) D404 C) F405 und D) G406 im Verlauf der Simulation. schwarz: Hck-Kinase,

rot: Hck*-Kinase.

4.1.3 Einfluss des Inhibitors auf das aktive Zentrum der Kinase

Nachdem in den zuvor durchgefuhrten Simulationen der geschlossenen Hck- und Hck*-Kinase

nur geringe Fluktuationen der φ/ψ-Winkel im Aktivierungssegment beobachtet wurden,

Page 49: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

4.1. Einfluss des SH3-SH2 Linkers auf Struktur und Dynamik der Src-Kinasen 39

stellte sich die Frage, ob der gebundene Inhibitor das aktive Zentrum fixiert. Durch den

Inhibitor konnten mogliche Effekte des unterschiedlichen Linkers eventuell nicht detektierbar

sein. Um den Einfluss des Inhibitors und auch des Linkeraustausches auf die im Abschnitt

4.1.2.2. gemessenen Torsionswinkel zu untersuchen, wurden analoge Simulationen fur Hck

und Hck* mit deletiertem PP1-Inhibitor durchgefuhrt (Abb. 4.7).

(A)

0 2 4 6 8 10 12 14

-200

-100

0

100

200

f

A403

0 2 4 6 8 10 12 14Zeit [ns]

-200

-100

0

100

200

y

(B)

0 2 4 6 8 10 12 14

-200

-100

0

100

200

D404

0 2 4 6 8 10 12 14Zeit [ns]

-200

-100

0

100

200

fy

(C)

0 2 4 6 8 10 12 14

-200

-100

0

100

200

f

F405

0 2 4 6 8 10 12 14Zeit [ns]

-200

-100

0

100

200

y

(D)

0 2 4 6 8 10 12 14

-200

-100

0

100

200

G406

0 2 4 6 8 10 12 14Zeit [ns]

-200

-100

0

100

200

fy

Abb. 4.7: Analyse der Ruckgratwinkel des DFG-Motivs im Verlauf der MD-Simulation der freien

Kinase. A) A403 B) D404 C) F405 und D) G406. schwarz: Hck-Kinase, rot: Hck*-Kinase.

Page 50: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

40 4. Ergebnisse

In Abbildung 4.7 sind die Ruckgratwinkel des DFG-Motivs sowie der N-terminal anschließen-

den Aminosaure A403 gegen die Simulationszeit aufgetragen.

In der Analyse zeigte die Wildtyp-Hck-Kinase generell keine großeren Fluktuationen in den

Torsionswinkeln φ und ψ und es wurden ahnliche Werte wie bei der inhibitorgebundenen

Hck-Kinase gemessen (siehe Abb. 4.6 und 4.7). Im Gegensatz dazu wurden fur die mutierte

Kinase großere Anderungen, insbesondere nach etwa 0,3 ns und 4 ns beobachtet. Außerdem

ist zu erkennen, dass die Winkel der benachbarten Aminosauren A403 (ψ) und D404 (φ) eine

korrelierte Winkelanderung aufweisen. Weitere korrelierte Winkelfluktuationen sind bei den

Aminosauren D404 (ψ), F405(φ, ψ) und G406(φ) zu sehen. Die zu Beginn der Simulationen

gemessenen Winkelanderungen bei A403 und D404 blieben uber den gesamten Simulations-

zeitraum erhalten.

Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die Plastizitat des aktiven Zentrums der Kinase

in den ursprunglichen Simulationen durch die Bindung des Inhibitors eingeschrankt war, und

dass der SH3-SH2 Domanenlinker einen signifikanten Effekt auf die Geometrie des aktiven

Zentrums hat – und somit eventuell auch auf die Aktivierung von Src-Kinasen.

Page 51: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

4.2. SH3-Domane der Tyrosinkinase Lyn 41

4.2 SH3-Domane der Tyrosinkinase Lyn

Aus vorangegangenen Arbeiten ist bekannt, dass Tip an die SH3-Domane der Tyrosinkinase

Lyn (LynSH3) mit einer hoheren Affinitat bindet als an die SH3-Domanen homologer Tyrosin-

kinasen [74, 75]. In dieser Arbeit sollte mit Hilfe von MD-Simulationen und anschließenden

energetischen Betrachtungen die Bindung von Tip an LynSH3 auf molekularer Ebene ein-

gehend charakterisiert werden. Im Mittelpunkt des Interesses stand die Rolle der einzelnen

Aminosauren des Tip-Bindemotivs bei der Interaktion mit der SH3-Domane der Src-Kinase

Lyn.

4.2.1 In silico Alanin-Scan zur Untersuchung des Tip-Bindemotivs

Zur Identifizierung der Aminosauren, welche einen wichtigen Beitrag zur Bindung liefern, wur-

de ein Alanin-Scan durchgefuhrt. Hierbei sollte der Einfluss der variablen, nicht konservierten

Positionen des PxxP-Motivs bei der Bindung an die LynSH3 untersucht werden. Aufbauend

auf den wahrend der MD-Simulation gespeicherten Strukturen des Wildtypkomplexes wurde

vor der energetischen Analyse die Seitenkette der zu untersuchenden Aminosaure auf eine

Methylgruppe verkurzt und anschließend die Bindungsenergie mit dem Standardprotokoll

von Massova und Kollman [164] (Abschnitt 3.2.7.3) bestimmt. Zu einer besseren statistischen

Abschatzung der Ergebnisse wurden unabhangige Simulationen ausgehend von verschiedenen

Startstrukturen aus dem NMR-Ensemble (PDB: 1WA7, Abschnitt 3.2.2.2) durchgefuhrt.

Die berechneten freien Bindungsenergien und ihre Einzelbeitrage sind fur das Wildtypsystem

(LynSH3-Tip) und exemplarisch fur die Tip-Mutante L179A im Komplex mit LynSH3 in

Tabelle 4.1 dargestellt. Die Berechnung der Bindungsenergie der anderen mutierten Reste

wurde analog durchgefuhrt und ist im Anhang zusammengefasst (Anhang B.2).

Tab. 4.1: Freie Bindungsenergie (in kcal ·mol−1) fur die LynSH3-Tip und LynSH3-Tip(L179A)

Interaktion. Die Bindungsenergie wurde mittels der MM/PBSA-Methode berechnet. ∆Gb = ∆Gvdwint +

∆Geleint+∆Gnonpolarsol +∆Gelesol. Nummer der jeweiligen Startstruktur gemaß der Benennung im NMR-Ensemble.

LynSH3-Tip ∆Gvdwint ∆Geleint ∆Gnonpolarsol ∆Gelesol ∆Gb

Struktur 5 -55,32 -152,18 -4,35 179,63 -32,22

Struktur 10 -64,81 -142,37 -4,86 176,68 -35,36

Struktur 15 -51,28 -122,11 -4,04 148,26 -29,17

Struktur 20 -60,06 -149,95 -4,78 180,62 -34,17

LynSH3-Tip(L179A) ∆Gvdwint ∆Geleint ∆Gnonpolarsol ∆Gelesol ∆Gb

Struktur 5 -50,31 -151,97 -3,98 177,88 -28,38

Struktur 10 -60,52 -142,00 -4,53 174,63 -32,42

Struktur 15 -47,68 -122,08 -3,73 147,00 -26,49

Struktur 20 -55,12 -149,71 -4,39 178,88 -30,34

Page 52: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

42 4. Ergebnisse

Tabelle 4.2 zeigt die relativen freien Bindungsenergien (∆∆Gb). Der ∆∆Gb-Wert wird hierbei

aus der Differenz der freien Bindungsenergien von LynSH3 im Komplex mit dem Wildtyp-

Liganden und dem mutierten Liganden (Anhang B.2) berechnet. Je negativer die relative

Bindungsenergie ist, desto wichtiger sind die Originalreste fur die Bindung, so dass ein Aus-

tausch zu Alanin die Affinitat verringern wurde.

Tab. 4.2: Effekt der Substitution einzelner Aminosauren in Tip durch Alanin auf die Bindungsaf-

finitat zur LynSH3 Domane. Die relative Bindungsenergie (in kcal ·mol−1) wurde mittels der MM/PBSA-

Methode berechnet, wobei gilt: ∆∆Gb = ∆GWT - ∆GMut. Nummer der jeweiligen Startstruktur gemaß der

Benennung im NMR-Ensemble.

T176A L179A R182A N185A L186A

System ∆∆Gb ∆∆Gb ∆∆Gb ∆∆Gb ∆∆Gb

Struktur 5 -0,50 -3,84 -9,95 -0,10 -1,35

Struktur 10 -1,08 -2,94 -6,86 -0,13 -4,03

Struktur 15 -0,81 -2,68 -6,38 -0,13 -1,60

Struktur 20 -0,87 -3,83 -9,63 0,05 -2,13

Ø -0,82 -3,32 -8,21 -0,08 -2,28

Wie aus der Tabelle ersichtlich wird, fuhren die verschiedenen Startstrukturen zu leicht

unterschiedlichen Ergebnissen, wobei aber alle Strukturen den gleichen Trend in den berech-

neten relativen Bindungsenergien (∆∆Gb) zeigen. Es konnte weiter beobachtet werden, dass

fur eine Mutation zu Alanin insbesondere im Fall von L179, R182 und L186 eine deutlich

schwachere Bindung erwartet wird.

Es ist bekannt, dass Glycin 187 ebenfalls zur Bindung an die LynSH3 beitragt. Aufgrund

der Tatsache, dass Glycin im Vergleich zu Alanin eine kurzere Seitenkette besitzt, kann die

zuvor beschriebene Strategie fur den Alanin-Scan an dieser Stelle nicht verwendet werden.

Zur Untersuchung, wie wichtig Glycin 187 fur die Bindung ist, wurde eine unabhangige MD-

Simulation der LynSH3-Tip(G187A) Komplexstruktur durchgefuhrt und anschließend mit-

tels der MM/PBSA-Methode (Abschnitt 3.2.7.2) die Bindungsenergie (∆Gb) bestimmt. Der

∆∆Gb-Wert wurde wie zuvor beschrieben aus der Differenz der freien Bindungsenergien der

Wildtypstruktur LynSH3-Tip und der mutierten LynSH3-Tip(G187A) Struktur berechnet.

Hierbei ergab sich ein ∆∆Gb-Wert von -1,32 kcal ·mol−1.

4.2.2 Bestimmung der Affinitat von Tip-Alaninmutanten zur LynSH3 mit-

tels Fluoreszenzspektroskopie

Nachdem mittels in silico Methoden der Einfluss einzelner Aminosauren im Bindemotiv

von Tip charakterisiert wurde, sollten diese Untersuchungen mittels Fluoreszenzspektrosko-

pie verifiziert werden. Fur die Bestimmung der Bindungsaffinitat der SH3-Domane Lyn zu

den mutierten Tip(168-187)-Peptiden wurde die Anderung der intrinsischen Tryptophan-

Fluoreszenz in LynSH3 bei Peptidzugabe ermittelt (Abschnitt 3.3).

Page 53: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

4.2. SH3-Domane der Tyrosinkinase Lyn 43

0 50 100 150 200 250 300

0

10

20

30

40

Tip(T176A)

0 50 100 150 200 250

0

10

20

30

40

Tip(WT)

0 100 200 300 400 500 600

0

10

20

30

40

Tip(L179A)

0 100 200 300 400 500

0

10

20

30

40

Tip(R182A)

0 50 100 150 200 250 300

0

10

20

30

40

Tip(L186A)

0 50 100 150 200 250

0

10

20

30

40

Tip(G187A)

Tip-Konzentration(µM) Tip-Konzentration(µM)

rel. F

luore

szenzin

tenzität

Abb. 4.8: Fluoreszenztitration von Tip-Peptiden zur LynSH3. 0,5 µM LynSH3 wurde in einem

Volumen von 1,2 ml vorgelegt und Tip-Peptid aus wassriger Stammlosung in steigenden Konzentrationen

dazu titriert. Aufgetragen ist die relative Anderung der Fluoreszenz der Tryptophane der LynSH3-Domane

bei 354 nm gegen die Konzentration von Tip-Peptid.

In Abbildung 4.8 ist die Anderung des Fluoreszenzsignals in Abhangigkeit der Peptid-

konzentration dargestellt und die nichtlineare Regressionsrechnung wurde anhand der

Gleichung 3.10 (Abschnitt 3.3.3) durchgefuhrt. Die so erhaltenen Bindekonstanten sind in

Tabelle 4.3 zusammengefasst.

Page 54: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

44 4. Ergebnisse

Tip-Peptid KD [µM]

WT 2,41

T176A 1,35

L179A 32,66

R182A 87,35

N185A n.t.

L186A 4,91

G187A 2,55

Tab. 4.3: KD-Werte der Tip-Peptide zur LynSH3. Die nicht-

lineare Regressionsrechnung erfolgte anhand der Gleichung 3.10

(Abschnitt 3.3.3). n.t. = nicht getestet

Beim Austausch von Arginin 182 bzw. Leucin 179 zu Alanin ließ sich ein signifikanter

Affinitatsverlust beobachten, wohingegen der Austausch von L186 bzw. G187 zu Alanin noch

eine relativ gute LynSH3-Bindung zeigte.

Die Bindekonstanten lassen sich wie im Methodenteil (Abschnitt 3.2.7.2) beschrieben

in ∆G-Werte umrechnen. Der Unterschied der freien Bindungsenergie im Vergleich zum

theoretisch bestimmten ∆∆G-Wert ist in Tabelle 4.4 zusammengefasst.

Tip-Peptid ∆∆G(exp) ∆∆G(theor.)

[kcal ·mol−1] [kcal ·mol−1]

T176A 0,34 -0,82

L179A -1,54 -3,32

R182A -2,13 -8,21

N185A n.t. -0,08

L186A -0,42 -2,28

G187A -0,03 -1,32

Tab. 4.4: Vergleich der experimentell und

theoretisch bestimmten ∆∆Gb-Werte. Der

experimentelle Wert, wurde mittels der Gleichung

∆∆G = RT − lnK(WT )

K(Mut)berechnet. n.t. = nicht

getestet

Die in Tabelle 4.4 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die theoretisch ermittelten ∆∆Gb-

Werte im Vergleich zum Experiment, besonders bei R182A und L186A, abweichen. Dies deutet

darauf hin, dass bei R182A der Beitrag elektrostatischer Wechselwirkungen uberschatzt wird,

wohingegen bei der C-terminal gelegenen Aminosaure L186A offenbar Effekte des induced fits

nicht adaquat berucksichtigt werden. Dennoch kann beobachtet werden, dass trotz der quanti-

tativen Abweichungen eine gute qualitative Korrelation zwischen Vorhersage und Experiment

besteht, wobei folgende Reihenfolge der Wichtigkeit fur die Bindung beobachtet wurde:

MM/PBSA R182>L179>L186>G187>T176>N185

Fluoreszenzspektroskopie R182>L179>L186>G187>T176

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4.2. SH3-Domane der Tyrosinkinase Lyn 45

4.2.3 Einfluss von L186 und G187 auf die Bindungsaffinitat

Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Bindungsaffinitaten fur einen in silico Alanin-Scan

mit computergestutzten Methoden qualitativ gut wiedergegeben werden konnen, sollte nun

der Einfluss der C-terminalen Reste noch detaillierter untersucht werden. Es ist bekannt,

dass die sich C-terminal an die PPII-Helix anschließenden Reste die Bindungsaffinitat zu

SH3-Domanen erhohen [74,75]. In den zuvor beschriebenen Analysen wurde beobachtet, dass

der Austausch von den C-terminal gelegenen Resten L186 bzw. G187 zu Alanin die Bindungs-

affinitat nicht signifikant verschlechtert. Dies lasst vermuten, dass die Kontakte von L186 und

G187 bei der Bindung teilweise durch Alanin ersetzt werden konnen. Aus diesem Grund sollte

der Effekt der Deletion von L186/G187 mit dem Effekt der Substitution dieser Reste durch

Alanin verglichen werden. Zu diesem Zweck wurde mit Hilfe der MM/PBSA-Methode un-

tersucht, wie sich eine Verkurzung der Tip-Sequenz um die Reste L186 und G187 auf die

Bindungsaffinitat zwischen Tip und der LynSH3 auswirkt.

Nachdem die im Abschnitt 4.2.1 beschriebene Strategie hier nicht angewandt werden kann,

da der Ligand verkurzt wurde und nicht einfach ein Austausch zu Alanin stattfand, war es

notwendig, zwei getrennte Simulationen durchzufuhren. Aus diesem Grund wurden zusatzlich

zur MD-Simulation von LynSH3-Tip(174-187) (Abschnitt 4.2.1) auch Simulationen mit der

C-terminal verkurzten Tip-Sequenz (Tip∆C) im Komplex mit LynSH3 durchgefuhrt, wobei

die Simulationen zur besseren statistischen Abschatzung der Ergebnisse ebenfalls auf mehre-

ren Startstrukturen durchgefuhrt wurden. Die Strukturen aus den MD-Simulationen wurden

anschließend nach der MM/PBSA-Methode (Abschnitt 3.2.7.2) ausgewertet. Die berechneten

freien Bindungsenergien und ihre Einzelbeitrage fur LynSH3-Tip∆C sind in Tabelle 4.5 zu-

sammengefasst.

Tab. 4.5: Freie Bindungsenergie (in kcal ·mol−1) von LynSH3-Tip∆C. Die Bindungsenergie wurde

mittels der MM/PBSA-Methode berechnet. ∆Gb = ∆Gvdwint + ∆Geleint + ∆Gnonpolarsol + ∆Gelesol. Nummer der

jeweiligen Startstruktur gemaß der Benennung im NMR-Ensemble.

LynSH3-Tip∆C ∆Gvdwint ∆Geleint ∆Gnonpolarsol ∆Gelesol ∆Gb

Struktur 5 -48,92 -142,83 -3,96 167,50 -28,21

Struktur 10 -51,57 -145,00 -4,21 170,56 -30,22

Struktur 15 -49,95 -131,76 -3,95 159,99 -25,67

Struktur 20 -56,28 -143,38 -4,39 173,30 -30,75

Tabelle 4.6 zeigt die Differenz der freien Bindungsenergie zwischen LynSH3-Tip(174-187)

(Tab. 4.1) und LynSH3-Tip∆C (Tab. 4.5). Aufgrund der Tatsache, dass die Liganden eine

unterschiedliche Lange aufweisen und somit zu erwarten ist, dass die Entropieanderung bei

der Bindung sich fur kurzes und langes Peptid unterscheidet, wurde der entsprechende Un-

terschied mittels Normalmodenanalyse bestimmt. Dabei ergab sich:

∆∆S = ∆Slang - ∆Skurz = 3,18 kcal ·mol−1.

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46 4. Ergebnisse

Tab. 4.6: Effekt der Verkurzung um L186/G187 auf die Affinitat der Bindung. Differenz der freien

Bindungsenergie (in kcal ·mol−1) zwischen der LynSH3 im Komplex mit Tip(174-187) und Tip(174-185).

Nummer der jeweiligen Startstruktur gemaß der Benennung im NMR-Ensemble.

System ∆∆Gb ∆∆Gb

(ohne Entropie) (mit Entropie)

Struktur 5 -4,01 -0,83

Struktur 10 -5,14 -1,96

Struktur 15 -3,50 -0,32

Struktur 20 -3,42 -0,24

Ø -4,02 -0,84

Wie aus der Tabelle zu erkennen ist, bewirkte die Verkurzung der Tip-Sequenz eine Ver-

schlechterung in der Bindungsaffinitat verglichen mit der Wildtypstruktur. Dieses Ergebnis

ist konsistent mit den experimentell durchgefuhrten Untersuchungen zur Bindungsaffinitat

von Tip und Tip∆C im Komplex mit LynSH3 mittels der Fluoreszenzspektroskopie [75]. Die

experimentell ermittelten Daten ergeben ein ∆∆Gb von ca. -1,77 kcal ·mol−1. Wie aus Tabelle

4.6 und Abbildung 4.9 ersichtlich schwanken die Vorhersagen der einzelnen Simulationen sehr

stark, so dass die Vorhersage aus einer einzelnen Simulation kaum aussagekraftig ist. Daher

wurde der Mittelwert uber die Simulationen gebildet.

-5,5

-5,0

-4,5

-4,0

-3,5

-3,0

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

Struktur 5 Struktur 10 Struktur 15 Struktur 20

ΔΔ

G(k

ca

lm

ol-1)

-5,5

-5,0

-4,5

-4,0

-3,5

-3,0

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

Struktur 5 Struktur 10 Struktur 15 Struktur 20

ΔΔ

G(k

ca

lm

ol-1)

Abb. 4.9: Einfluss der Deletion von L186 und G187 auf die Bindungsaffinitat und Abhangigkeit

von der Startstruktur. Die durchgezogene Linie reprasentiert hierbei den experimentell bestimmten Effekt,

wohingegen die gestrichelte (ohne Entropiebeitrage) und gepunktete (mit Entropiebeitragen) Linie den Mit-

telwert der berechneten relativen Bindungsenergien (∆∆Gb) darstellt. Die ∆∆G-Werte zwischen LynSH3-Tip

und LynSH3-Tip∆C sind einzeln fur die vier verschiedenen Startstrukturen dargestellt (◦: ohne Entropie, •:mit Entropie).

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4.2. SH3-Domane der Tyrosinkinase Lyn 47

Wie aus der Abbildung ersichtlich wird, kann das Problem der Ungenauigkeit durch verschie-

dene Startstrukturen in einer Simulation durch Mittelung uber verschiedene Simulationen

deutlich reduziert werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass nach Berucksichtigung des

entropischen Beitrags der gemittelte ∆∆Gb-Wert besser zum Experiment passt (Abb. 4.9,

gepunktete und durchgezogene Linie).

4.2.4 Untersuchung der Rolle von H41 in LynSH3

Wie aus vorangegangenen Arbeiten bekannt ist, wird Tip mit einer hoheren Affinitat von

der LynSH3 gebunden als von anderen Src-Kinasen [74, 75]. Ein Sequenzvergleich zeigte den

auffalligsten Unterschied an Position 41. LynSH3 besitzt an dieser Position ein Histidin, wo-

hingegen die anderen Src-Kinasen ein Serin oder Threonin aufweisen (Abb. 1.3B). Ziel war

es mit Hilfe der MM/PBSA-Analyse die Rolle der Aminosaure Histidin 41 bei der Bindung

von Tip an die SH3-Domane Lyn zu untersuchen.

Hierzu wurde Histidin 41 in allen Startstrukturen der LynSH3 zu Serin mutiert. Des Weiteren

wurden Startstrukturen generiert, welche die verkurzte Tip-Sequenz enthielten. Die Simula-

tionen wurden analog zu den zuvor beschriebenen Systemen durchgefuhrt und mittels der

MM/PBSA-Methode ausgewertet.

Die Tabelle 4.7 zeigt alle Energiebeitrage und die daraus resultierende Bindungsenergien

(∆Gb) fur alle durchgefuhrten Simulationen.

Tab. 4.7: Freie Bindungsenergie (in kcal ·mol−1) fur LynSH3(H41S)-Tip und LynSH3(H41S)-

Tip∆C. Die Bindungsenergie wurde mittels der MM/PBSA-Methode berechnet. ∆Gb = ∆Gvdwint + ∆Geleint +

∆Gnonpolarsol + ∆Gelesol. Nummer der jeweiligen Startstruktur gemaß der Benennung im NMR-Ensemble.

LynSH3(H41S)-Tip ∆Gvdwint ∆Geleint ∆Gnonpolarsol ∆Gelesol ∆Gb

Struktur 5 -62,52 -126,44 -4,75 155,83 -36,98

Struktur 10 -55,58 -149,34 -4,46 177,37 -28,43

Struktur 15 -51,37 -139,97 -4,17 161,89 -29,97

Struktur 20 -63,33 -164,65 -4,93 201,29 -31,63

LynSH3(H41S)-Tip∆C ∆Gvdwint ∆Geleint ∆Gnonpolarsol ∆Gelesol ∆Gb

Struktur 5 -55,30 -145,77 -4,30 172,39 -29,85

Struktur 10 -42,83 -142,44 -3,49 153,87 -26,60

Struktur 15 -47,54 -140,71 -3,86 160,62 -31,57

Struktur 20 -46,20 -144,19 -3,69 157,88 -27,35

Die Berechnung der relativen Bindungsenergie (∆∆Gb) wurde analog zu Abschnitt 4.2.3

durchgefuhrt. Die Bindung von Tip∆C an LynSH3(H41S) ist 0,27 kcal ·mol−1 schwacher als

die Bindung von Tip.

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48 4. Ergebnisse

Die nachstehende Abbildung 4.10 stellt einen schematischen Uberblick der MM/PBSA-

Ergebnisse dar. Die angegebenen Energien wurden aus den Mittelwerten der ∆G-Werte in

Tab. 4.1, 4.5 und 4.7 berechnet.

ΔΔG=-0.84

ΔΔG=0.27

ΔΔG= -0.98 ΔΔG= 0.13

LynH41

Tip(174-187)

LynH41

Tip(174-185)

Lyn*H41S

Tip(174-187)

Lyn*H41S

Tip(174-185)

Abb. 4.10: Schematischer Uberblick der Ergebnisse der Analyse. Die ∆∆G-Werte sind in kcal ·mol−1

angegeben.

Im Mittelpunkt des Interesse stand die Frage, ob Histidin 41 in LynSH3 einen Einfluss auf

die starkere Bindungsaffinitat von Tip hat. Wie in der Abbildung zu erkennen ist, fuhrte

der Austausch von Histidin 41 gegen Serin zu einem Affinitatsverlust. Der hierbei berech-

nete Unterschied in der freien Bindungsenergie zwischen LynSH3-Tip und LynSH3(H41S)-Tip

betragt -0,98 kcal ·mol−1. Der Effekt der H41S Mutation ist ahnlich groß wie der Effekt der

Verkurzung des Tip-Liganden um zwei Aminosauren (∆∆G = -0,84 kcal ·mol−1). Es scheint,

dass die Interaktion zwischen H41 und L186/G187 die Schlusselwechselwirkung der affineren

LynSH3-Tip Bindung ist. Wenn statt H41 ein Serin vorhanden ist, hat die Verkurzung von

Tip praktisch keinen Einfluss auf die Bindungsaffinitat (∆∆G = 0,13 kcal ·mol−1). Dies unter-

streicht ebenfalls die Rolle von H41 fur die affine Bindung.

Page 59: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

4.3. Proteinphosphatase 1 49

4.3 Proteinphosphatase 1

Ausgangspunkt fur diesen Teil der Arbeit waren die von Enz und Kollegen gewonnenen Er-

gebnisse zu den metabotropen Glutamatrezeptoren (mGluR) und deren Bindung uber das

KSV[ST]W-Motiv an die Proteinphosphatase 1γ1 (PP1γ1).

Im Rahmen dieser Arbeit sollten die einzelnen Positionen des Bindemotivs genauer charakte-

risiert werden, um alle Aminosauren zu identifizieren, die eine affine Bindung zur Proteinphos-

phatase ermoglichen. Hierbei wurde ein kombinierter Ansatz aus Modelling, Molekuldynamik-

Simulation und Experiment gewahlt. Die aus in silico Analysen identifizierten Aminosauren

wurden im Anschluss experimentell durch Mutationsstudien getestet. Die daraus gewonnenen

Daten sollten anschließend zu einem neuen Pattern zusammengefasst werden, mit dem die

Spezifitat einer Datenbanksuche erhoht werden kann. Die experimentellen Untersuchungen

wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Ralf Enz durchgefuhrt.

4.3.1 Globale Eigenschaften der PP1γ1-Ligand-Interaktion

Der Bindungskanal der PP1γ1-Oberflache zeigt uberwiegend negativ geladene Aminosauren

(D166, E167, D242, E287) und beinhaltet zwei hydrophobe Taschen, die hauptsachlich durch

die Seitenketten der Aminosauren I169, L243, F257, M283, L289 und F293 (Abb. 4.11) ge-

bildet werden.

E167

D240

L241

D242

C291

L289

T288

E287D166

F293

M283

L243

F257

I169

1

2

3

4

5

E167

D240

L241

D242

C291

L289

T288

E287D166

F293

M283

L243

F257

I169

E167

D240

L241

D242

C291

L289

T288

E287D166

F293

M283

L243

F257

I169

+1

+2

+3

+4

+5

Abb. 4.11: Elektrostatisches Potential der PP1γ1-Oberflache. Die Berechnung der elektrostatischen

Oberflache wurde mit dem Programm GRASP durchgefuhrt [138]. Die blauen und roten Bereiche reprasentie-

ren die positiven und negativen Ladungen der Enzymoberflache. Die Bindungsbereiche fur die Reste +1 bis

+5 des Interaktionsmotivs sind durch Kreise dargestellt und entsprechend nummeriert.

Die Bindesequenz KSVTW aus dem metabotropen Glutamatrezeptor mGluR7b wurde auf

Basis der bekannten Kristallstruktur der PP1γ1 mit der Bindesequenz RRVSF modelliert

(Abschnitt 3.2.2.1).

Das RRVSF-Motiv bindet in einer gestreckten Ruckgratkonformation an die Oberflache der

PP1γ1. Mittels Modelling konnte gezeigt werden, dass die gestreckte Geometrie der Kristall-

Page 60: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

50 4. Ergebnisse

struktur auch vom KSVTW-Motiv eingenommen werden kann, da sie energetisch gunstig ist

und keine sterischen Behinderungen verursacht (Abb. 4.12).

Die Aminosauren an den Positionen +1 und +2 interagieren mit den negativ geladenen Ami-

nosauren auf der PP1γ1 Enzymoberflache (Abb. 4.11), wohingegen die Seitenketten an den

Positionen +3 und +5 zwei hydrophobe Taschen besetzen. Die Aminosaure an der Position

+4 befindet sich relativ weit von der PP1γ1-Oberflache entfernt und hat somit keine direkte

Wechselwirkung mit der Proteinphosphatase.

(A)

R +1R +2

V +3S +4

F +5

K +1

S +2

V +3

T +4

W +5

(B)

Abb. 4.12: Strukturelle Eigenschaften von PP1γ1 und ihren Bindemotiven. A) Struktur der

RRVSF- (links) und KSVTW- (rechts) Liganden in ihrer gebundenen Konformation. Die Aminosauren sind

entsprechend ihrer Position im Liganden von +1 bis +5 nummeriert. B) Strukturuberlagung der model-

lierten KSVTW-Sequenz (blau) aus mGluR7b und des Liganden RRVSF (rot) im Komplex mit der PP1γ1-

Kristallstruktur.

4.3.2 Untersuchung der Positionen +1 und +2 des PP1γ1-Bindemotivs

Die Position +1 zeigte im bisher bekannten Liganden eine deutliche Praferenz fur posi-

tiv geladene Aminosauren, die mit der negativ geladenen Enzymoberflache elektrostatische

Wechselwirkungen eingehen konnen. Fur die Position +2 waren durch Rontgenstruktur-

analysen keine spezifischen Wechselwirkungen erkennbar. Dies deutet darauf hin, dass an

dieser Position deutlich mehr Aminosauren toleriert werden als an Position +1. Mit Hilfe von

MD-Simulationen sollten im Anschluss diese beiden Positionen genauer untersucht werden,

um auch transiente Interaktionen zur Enzymoberflache zu identifizieren.

4.3.2.1 MD-Simulationen zur detaillierten Analyse der Positionen +1 und +2

aus dem RRVSF- und KSVTW-Bindemotiv

Ein wesentlicher Unterschied zwischen den beiden Bindemotiven RRVSF und KSVTW be-

steht in den Aminosauren an den ersten beiden Positionen. Aus diesem Grund wurden mit

Hilfe von MD-Simulationen beide Komplexsysteme in Bezug auf diese beiden Positionen

Page 61: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

4.3. Proteinphosphatase 1 51

untersucht, um detaillierte Einblicke in die Dynamik und die konformationelle Variabilitat

moglicher Interaktionen zu erhalten.

Die Untersuchung des RRVSF-PP1γ1-Komplexes zeigte, dass wahrend der MD-Simulation

eine Vielzahl von polaren Wechselwirkungen (Wasserstoffbrucken, Salzbrucken) mit den ne-

gativ geladenen Aminosauren der Proteinoberflache ausgebildet wurden (Abb. 4.13). Als

Distanzkriterium fur die Ausbildung einer Wasserstoff- bzw. Salzbrucke wurde ein Donor-

Akzeptor-Abstand kleiner 3,5 A gewahlt. Fur die Ausbildung einer Wasserstoffbrucke musste

zusatzlich ein Winkelkriterium von großer 150◦ erfullt sein.

(A)

+2+2

D166

E287D242

E167

R +2

V +3

S +4

F +5

R+1

(B)

Asp166

E287

D242E167

2.81

2.67

2.81

2.88

3.112.89

R +2S +4

V +3

F +5

D240

L241

R +1

(C)

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1Zeit [ns]

0

2

4

6

8

10

12

14

Abst

and [Å

]

R+1(NH1) - D166(OD1)

R+1(NH1) - E287(O)R+1(NH2) - E167(OE2)

R+1(NH2) - D166(OD1)R+1(NH1) - D166(OD2)R+1(NH2) - D166(OD2)R+1(NH2) - E167(OE1)

(D)

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1Zeit [ns]

0

2

4

6

8

10

12

14

Abst

and [Å

]

R+2(NH2) - D242(OD1)R+2(NH2) - D242(OD2)R+2(NE) - D242(OD1)R+2(NE) - D242(OD2)

R+2(NH1) - D240(O)R+2(NH2) - D240(O)R+2(NH1) - L241(O)R+2(NH1) - D242(OD1)

Abb. 4.13: Wechselwirkungen zwischen PP1γ1 und dem RRVSF-Liganden. A) Wasserstoff- und

Salzbrucken (grun gestrichelte Linien) zwischen PP1γ1 und den Ligandenpositionen Arg +1 und Arg +2 nach

einer Simulationszeit von 0,3 ns. Die Aminosauren sind entsprechend ihrer Lage im Bindemotiv nummeriert.

B) Schematisches 2D-Diagramm der Wechselwirkungen zwischen der PP1γ1 und dem Liganden nach einer

Simulationszeit von 0,3 ns. Der Ligand ist als Kugel-Stabchen-Modell dargestellt. Die Aminosauren der PP1γ1

sind grau hinterlegt. Fur jede Wechselwirkung (schwarz gestrichelte Linien) sind die Donor-Akzeptor-Abstande

in A angegeben. Die Darstellung wurde mit dem Programm LIGPLOT erstellt [137]. C) Elektrostatische

Wechselwirkungen der Ligandenposition +1 wahrend der Simulation. 3,5 A wurde als Distanzkriterium fur die

Ausbildung von Wasser- bzw. Salzbrucken gesetzt. D) Elektrostatische Wechselwirkungen der Ligandenposition

+2 wahrend der Simulationszeit. Distanzkriterium wie bei C) beschrieben.

Page 62: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

52 4. Ergebnisse

Die Abbildungen 4.13A und 4.13B zeigen reprasentativ die Struktur aus der MD-Simulation

und ihre ausgebildeten Wechselwirkungen zum Zeitpunkt von 0,3 ns. Die Guanidinogruppe

von Arginin +1 ging polare Interaktionen mit den Seitenketten der Aminosauren D166 und

E167 und der Carbonylgruppe des Proteinruckgrats von E287 auf der Oberflache von PP1γ1

ein. Zusatzlich wurde die Ausbildung einer weiteren Salzbrucke von der Ligandenposition +2

zur Seitenkette der Aminosaure D242 auf der Enzymoberflache beobachtet.

Aus den Abbildungen 4.13A und B wird ersichtlich, dass Arginin an Position +1 deutlich

mehr polare Wechselwirkungen aufweist als Arginin +2. Dies lasst vermuten, dass Arginin

+1 eine dominierende Rolle bei der Ligandenbindung spielt. Aus diesem Grund wurde die

Stabilitat der identifizierten Wechselwirkungen uber die gesamte Simulationszeit untersucht.

Abbildung 4.13C zeigt, dass Arginin an Position +1 uber die gesamte Zeit mindestens

vier stabile polare Wechselwirkungen mit den Aminosauren D166, E167 und E287 von

PP1γ1 aufweist. Das benachbarte Arginin an der Ligandenposition +2 ging wahrend der

Simulationszeit polare Wechselwirkungen mit den Aminosauren D240, L241 und D242 der

PP1γ1-Oberflache ein (Abb. 4.13D). Wahrend die Interaktionen mit den Resten D240 und

L241 uber die Guanidinogruppe von Arginin und die ungeladenen Carbonylsauerstoffe des

PP1γ1-Ruckgrats erfolgte, wurde zu D242 von Arginin +2 eine Salzbrucke ausgebildet. Das

Arginin +2 weist im Gegensatz zur Position +1 großere Fluktuationen in den analysierten

Donor-Akzeptor-Distanzen auf, was sich in dem Simulationsbereich von 0,15 ns–0,30 ns und

0,70 ns–0,75 ns widerspiegelte. Dieser Befund stutzt somit die Annahme, dass Arginin +1

eine dominierende Rolle bei der Ligandenbindung einnimmt.

Die Untersuchung des KSVTW-PP1γ1-Komplexes wurde analog zu dem RRVSF-PP1γ1-

Komplex durchgefuhrt. Wahrend der MD-Simulation bildete Lysin an der Ligandenposition

+1 ahnliche Wechselwirkungen aus, wie sie fur Arginin +1 im RRVSF-Bindemotiv beschrie-

ben wurden. Lysin interagiert hierbei ebenfalls mit den negativ geladenen Aminosauren

D166 und E167 (Abb. 4.14A und B). Weiterhin wurde eine Wasserstoffbrucke zu der

Ruckgratcarbonylgruppe von E287 identifiziert (Abb. 4.14C). Im Vergleich zu Arginin

an der Ligandenposition +1 weist Lysin leicht erhohte Fluktuationen der Wasserstoff-

und Salzbrucken im Bereich zwischen 0,5 ns und 0,6 ns auf (Abb. 4.14C). Serin +2 des

KSVTW-Motivs ging im Vergleich zu Arginin +2 von RRVSF nur wenige Wechselwirkungen

ein (siehe Abb. 4.13D und 4.14D). Serin besitzt eine polare, nicht geladene Seitenkette,

die nicht in der Lage ist eine stabilisierende Salzbrucke zu D242 auszubilden. Stattdessen

wurde eine Wasserstoffbrucke zwischen der Hydroxylgruppe von Serin und der Seitenketten-

carbonylgruppe von D242 ausgebildet, die zu 30 % der Simulationszeit vorhanden war.

Letztendlich konnten durch die MD-Simulationen fur Position +1 deutliche Praferenzen fur

die basischen Aminosauren R, K und eingeschrankt fur H festgestellt werden. An Position +2

zeigten die Seitenketten weniger Wechselwirkungen und konnten teilweise durch andere polare

Seitenketten ersetzt werden. Somit ergaben sich als Vorhersage tolerierter Aminosauren: R,

K, H, (N, Q, S, T, M, C).

Page 63: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

4.3. Proteinphosphatase 1 53

(A)

K +1

S +2

V +3

W +5

T +4

D166

E167

D242

(B)

E167

2.76

E287

D242

D166

2.72

2.85

2.58

T +4

W +5

V +3S +2

K +1

(C)

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1Zeit [ns]

0

2

4

6

8

10

12

14

Abst

and [Å

]

K+1(NZ) - D166(O)K+1(NZ) - D166(OD1)K+1(NZ) - D166(OD2)K+1(NZ) - E167(OE2)K+1(NZ) - E287(O)

(D)

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1Zeit [ns]

0

2

4

6

8

10

12

14

Abst

and [Å

]

S+2(OG) - D242(OD1)S+2(OG) - D242(OD2)

Abb. 4.14: Interaktionen zwischen PP1γ1 und dem KSVTW-Liganden. A) Ausgebildete Wechsel-

wirkungen (gestrichelte Linien) nach einer Simulationszeit von 0,3 ns zwischen der PP1γ1 und den Liganden-

positionen +1 und +2. B) Schematisches 2D-Diagramm der identifizierten Wechselwirkungen nach einer Simu-

lationszeit von 0,3 ns. Hierbei ist der Ligand als Kugel-Stabchen-Modell dargestellt und die Aminosauren der

PP1γ1 sind grau hinterlegt. Die Abstande der Wechselwirkungen sind in A angegeben. Die Abbildung wurde

mit dem Programm LIGPLOT erstellt [137]. Die elektrostatische Wechselwirkungen an Position +1 (C) und

an Position +2 (D) im Verlauf der Simulation.

4.3.2.2 In vitro Analysen zur Identifizierung moglicher Aminosauren

Die aus Modelling und MD-Simulation abgeleiteten Vorhersagen wurden mit Hilfe von Bin-

dungsexperimenten getestet. Daruber hinaus wurden Aminosauren uberpruft, welche im

Modelling keine Hinweise auf eine mogliche Bindung geliefert hatten. Um die Interaktio-

nen zur PP1γ1 in vitro zu bestatigen, wurde ein GST Pulldown Assay (Abschnitt 3.4.1)

durchgefuhrt. Das mutierte mGluR7b wurde als GST-Fusionsprotein exprimiert, uber den

GST-Tag an Glutathion-Sepharose Beads gebunden und anschließend mit PP1γ1, welches

mit T7-Tag versehen ist, inkubiert. Die prazipierten Proteine wurden durch SDS-PAGE auf-

Page 64: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

54 4. Ergebnisse

getrennt (Abschnitt 3.4.2). Gebundene PP1γ1 konnte im Western Blot durch einen T7 spe-

zifischen Antikorper detektiert werden (Abb. 4.15).

WT

K911

A

K911

E

K911

F

K911

H

K911

L

K911

M

K911

P

K911

R

K911

S

K911

T

PP1 1g

Abb. 4.15: Mutationsanalyse an Position +1 im Bindemotiv von PP1γ1. Gebundene PP1γ1 wurde

mit Western Blot Analysen unter Benutzung eines spezifischen T7-Tag Antikorpers (Ziege-anti-Maus-HRP)

detektiert (obere Bildhalfte). Die untere Bildhalfte zeigt die eingesetzte an Sepharose Beads gebundene Pro-

teinkonzentration.

Durch die Analysen an Position +1 konnte gezeigt werden, dass ein Austausch im Binde-

motiv von Lysin zu den basischen Aminosauren Histidin und Arginin noch eine Bindung

zwischen dem Glutamatrezeptor und der Phosphatase erlaubt. Weiterhin ist zu beobachten,

dass der Austausch zu Histidin im Vergleich zu Arginin, ein schwacheres Immunsignal

im Western Blot zeigt. Dies deutet darauf hin, dass HSVTW von PP1γ1 mit einer nied-

rigeren Affinitat gebunden wird als RSVTW. Die Einfuhrung von polaren Aminosauren,

die eine Hydroxylgruppe als Seitenkette tragen (S, T), sowie von sauren Aminosauren (E)

und hydrophoben Aminosauren (A, F, L, M, P) resultierten hingegen im Verlust der Bindung.

Der modellierte Komplex ließ fur Position +2 sowohl in der statischen Struktur als auch

in der MD-Simulation kaum spezifische Wechselwirkungen erkennen. In der MD-Simulation

wurden erhohte Fluktuationen innerhalb der Interaktionspartner registriert (Abb. 4.14), was

eine Ausbildung von stabilen Wechselwirkungen verhindert. Aus diesem Grund wurde Serin

+2 im Bindemotiv durch alle naturlich vorkommenden Aminosauren ersetzt (Abb. 4.16).

WT

S91

2A

S91

2C

S91

2D

S91

2E

S91

2F

S91

2G

S91

2H

S91

2I

S91

2K

S91

2L

S91

2M

S91

2N

S91

2P

S91

2Q

S91

2R

S91

2T

S91

2V

S91

2W

S91

2Y

PP1 1g

Abb. 4.16: Nachweis der Interaktion zwischen PP1γ1 und dem an Position +2 mutierten

KSVTW-Motiv. Das mutierte Bindemotiv wurde als GST-Fusionsprotein mittels Glutathion-Sepharose auf-

gereinigt und mit T7-markierter PP1γ1 inkubiert. Gebundene PP1γ1 wurde im Western Blot nachgewiesen.

Immunfarbung: Anti-T7 Antikorper; Detektion: Ziege-anti-Maus-HRP Antikorper. Die eingesetzte an Beads

gebundene Proteinkonzentration ist in der unteren Bildhalfte dargestellt.

Die Einfuhrung von Aminosauren mit kleinen (G) oder großen hydrophoben (L, I), aroma-

tischen (F, W, Y) wie auch negativ geladenen (D, E) Seitenketten und Prolin ließen keine

Bindung erkennen, wohingegen bei Aminosauren mit hydrophoben Seitenketten mittlerer

Lange (A, M, V) ein schwaches Proteinsignal im Western Blot beobachtet wurde (Abb. 4.16).

Page 65: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

4.3. Proteinphosphatase 1 55

Auffallig im Gelbild war, dass die Einfuhrung von Aminosauren mit polaren und ungeladenen

Seitenketten (C, N, Q, S, T) sowie basische Aminosauren (H, R, L) zu einer starkeren Bindung

fuhrten. Durch die Einfuhrung dieser Aminosauren kann demzufolge die Affinitat zwischen

Glutamatrezeptor und Phosphatase erhoht werden.

4.3.3 Identifizierung tolerierter Aminosauren an der Ligandenposition +3

Das Valin, welches sich in beiden Bindemotiven (RRVSF, KSVTW) an Position +3 befindet

ragt in eine hydrophobe Tasche der Proteinphosphatase hinein (Abb. 4.12) und bringt im Ge-

gensatz zu den Positionen +1 und +2 strikte Voraussetzungen an die Aminosauren mit sich.

Mittels Molecular Modelling wurde Valin gegen Leucin, Isoleucin und Alanin ausgetauscht.

Es konnte gezeigt werden, dass der Austausch zu Leucin bzw. Alanin nicht vorteilhaft fur die

Bindung ist. Die Einfuhrung von Leucin fuhrte zu großen sterischen Behinderungen in der

hydrophoben Tasche, wohingegen Alanin die Tasche aufgrund der Aminosaurengroße schlecht

ausfullt und somit nur kleine Beitrage zur Bindung leistet.

Fur Isoleucin konnte gezeigt werden, dass alle erlaubten Isoleucinrotamere kleinere sterische

Konflikte mit Resten der hydrophoben Tasche aufweisen. Sogar fur das Rotamer mit der

niedrigsten Energie wurden sterische Behinderungen zwischen den Wasserstoffatomen der

Isoleucinseitenkette und der Seitenkette der Aminosauren I169 und L243 beobachtet (Abb.

4.17A und C). Eine sich an die Modellierung anschließende Energieminimierung der Komplex-

struktur fuhrte dazu, dass die sterischen Behinderungen von Isoleucin aufgehoben wurden.

Eine unvorteilhafte Veranderung der Geometrie des Ligandenruckgrats war die Folge.

(A)

+3

(B) (C)

Abb. 4.17: Aminosaurenpraferenz an der Ligandenposition +3 im Bindemotiv der PP1γ1. A)

Detaillierte Ansicht von Isoleucin +3, welche auf die RRVSF-PP1γ1-Komplexstruktur modelliert wurde. Das

Rotamer niedrigster Energie von Isoleucin ist als Stabchen-Modell dargestellt. Mit den Aminosauren I169

und L243 von PP1γ1 kommt es zu sterischen Behinderungen (durch Pfeile gekennzeichnet). B) Raumfullende

Darstellung von Isoleucin +3, welche die sterischen Behinderungen zur Phosphatase deutlicher erkennen lasst.

Zur besseren Ansicht wurde hierbei das Protein 90 ◦ um die vertikale Achse gedreht im Vergleich zu A). C)

Valin +3 in der gleichen Ansicht wie in B); die Pfeile zeigen hier die Stellen, an denen fur Isoleucin sterische

Behinderungen aufgetreten sind. Bei Valin +3 kommt es zu keinen sterischen Behinderungen.

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56 4. Ergebnisse

Analog zu den in Abschnitt 4.3.2.2 beschriebenen Bindungsstudien wurden hier ebenfalls

GST Pulldown Analysen zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktion durchgefuhrt. Im

Western Blot konnte keine Bindung bei dem Austausch von Valin gegen andere hydrophobe

Aminosauren (A, G, L) nachgewiesen werden (Abb. 4.18). Einzig der Austausch von Valin

zu Isoleucin ließ noch ein schwaches Immunsignal erkennen (Abb. 4.18).

V913A

V913G

V913I

V913L

V913T

WT

PP1 1g

Abb. 4.18: Mutationsanalyse an der Position +3 im KSVTW-Bindemotiv. Das mutierte Binde-

motiv wurde als GST-Fusionsprotein exprimiert und anschließend mit T7-markierter PP1γ1 inkubiert. Ge-

bundene PP1γ1 wurde mit Western Blot Analysen unter Benutzung eines spezifischen T7-Tag Antikorpers

(Ziege-anti-Maus-HRP) detektiert (obere Bildhalfte). Die untere Bildhalfte zeigt die im Experiment eingesetzte

Proteinkonzentration.

4.3.4 Untersuchung der Ligandenposition +4

Mit Hilfe von Molecular Modelling Untersuchungen konnten an der Position +4 negativ ge-

ladene Aminosauren (D, E) ausgeschlossen werden, da die PP1γ1-Oberflache negativ geladen

ist (Abb. 4.11). Des Weiteren wurde im Modelling gezeigt, dass die großen Aminosauren

Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan sterisch ungunstige Kontakte mit der Enzymober-

flache eingehen. Aufgrund der negativen Ladung der Enzymoberflache (Abb. 4.11) konnen

an dieser Position positiv geladene Aminosauren (H, R, K) toleriert werden. Weitere Un-

tersuchungen an der statischen Struktur deuteten darauf hin, dass Cystein, Glutamin und

Asparagin ebenfalls an dieser Position toleriert werden sollten.

Im Anschluss an diese Untersuchungen wurden mittels in vitro Mutationsanalysen nachein-

ander Aminosauren mit unterschiedlichen Eigenschaften an Position +4 im KSVTW-Motiv

getestet (Abb 4.19).

T91

4A

T91

4E

T91

4H

T91

4K

T91

4L

T91

4Q

T91

4R

WT

T91

4V

T91

4Y

PP1 1g

Abb. 4.19: Interaktionen der PP1γ1 mit dem an Position +4 mutierten KSVTW-Bindemotiv.

Mittels Western Blot Analysen wurde die Bindung an PP1γ1 nachgewiesen. Immunfarbung: Anti-T7 Anti-

korper; Detektion: Ziege-anti-Maus-HRP Antikorper. Die eingesetzte an Beads gebundene Proteinkonzentra-

tion ist in der unteren Bildhalfte dargestellt.

Der Aminosaurenaustausch von Threonin zu Histidin, Lysin bzw. Arginin fuhrte im Western

Blot im Vergleich zur gebundenen Wildtypsequenz zu einem starkeren Proteinsignal, was auf

Page 67: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

4.3. Proteinphosphatase 1 57

eine starkere Bindung an die Proteinphosphatase hindeutet. Dagegen zeigte sich nach Aus-

tausch zu der sauren Aminosaure Glutamat und zu hydrophoben Aminosauren (A, V, L) keine

Bindung. Dieser Befund untermauert die Ergebnisse der zuvor durchgefuhrten theoretischen

Analysen.

4.3.5 Untersuchung der Ligandenposition +5

Die Aminosauren Tryptophan, Phenylalanin und Tyrosin wurden in der Literatur [105] als

mogliche Aminosauren an der Ligandenposition +5 beschrieben. Aus der Modellierung (Abb.

4.12) wird ersichtlich, dass Tryptophan ohne sterische Behinderungen in die hydrophobe

Tasche auf der Enzymoberflache packt (Abb. 4.12B). Dieser Befund steht im Einklang mit

den experimentellen Arbeiten von Croci et al. [106]. Hierbei konnte nachgewiesen werden,

dass das Bindemotiv aus mGluR7b mit Tryptophan an Position +5 von PP1γ1 gebunden

wird.

Der Aminosaureaustausch gegen Tyrosin zeigte im Modelling, dass die hydrophile Hydroxyl-

gruppe weit in die hydrophobe Tasche hineinragt (Abb. 4.20). Hierbei kommt es zu sterisch

ungunstigen Kontakten zwischen der Hydroxylgruppe und den Seitenketten der Aminosauren

L242 und F257 der PP1γ1, was unvorteilhafte Energien zur Folge hat. Dies lasst vermuten,

dass Tyrosin an dieser Position aufgrund der OH-Gruppe nicht toleriert wird. Der Austausch

zu Alanin fuhrte im Gegensatz dazu, dass die hydrophobe Tasche nicht gut ausgefullt wird.

Dies deutet darauf hin, dass Alanin nicht signifikant zur Bindung beitragen kann.

Diese Vorhersagen wurden im Anschluss mittels den bereits beschriebenen in vitro Mutations-

analysen getestet. Hierbei wurde Tryptophan im KSVTW-Bindemotiv aus mGluR7b durch

die Aminosauren Alanin, Phenylalanin und Tyrosin ersetzt (Abb. 4.20).

(A)

+5

+4

(B)

W915A

W195F

WT

W915Y

PP1 1g

Abb. 4.20: Aminosaurenpraferenz an der Ligandenposition +5 des Bindemotivs der PP1γ1. A)

Detaillierte Ansicht von Tyrosin +5. Die hydrophile Seitenkette steht hierbei ungunstig in die hydrophobe

Tasche hinein (gelber Pfeil). B) Das mutierte Bindemotiv wurde als GST-Fusionsprotein exprimiert und an-

schließend mit PP1γ1 inkubiert. Gebundene PP1γ1 wurde im Western Blot unter Benutzung eines spezifischen

T7-Tag Antikorpers (Ziege-anti-Maus-HRP) detektiert (obere Bildhalfte). Die untere Halfte zeigt die dabei

eingesetzte Proteinmenge.

Wie in der Abbildung zu erkennen ist, zeigte der Austausch von Tryptophan zu der nicht

aromatischen Aminosaure Alanin im Western Blot kein Proteinsignal. Weiterhin konnte be-

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58 4. Ergebnisse

obachtet werden, dass der Austausch zu Tyrosin ebenfalls zum Verlust der Bindung fuhrte.

Dies bestatigt die mit Hilfe des Modelling aufgestellte Vermutung, dass die hydrophile OH-

Gruppe von Tyrosin, welche in die Tasche hineinragt, zum Verlust der Bindung fuhrt. Im

Gegensatz dazu hatte der Austausch zu Phenylalanin keinen Einfluss auf die Bindung. Dies

deutet darauf hin, dass an dieser Position im Liganden die Seitenketten der hydrophoben,

aromatischen Aminosauren notwendig sind, um die Bindung zur Proteinphosphatase zu

ermoglichen.

4.3.6 Aminosaurenpraferenz im PP1γ1-Bindemotiv

Alle in dieser Arbeit gewonnenen Daten zu den einzelnen Ligandenpositionen wurden im

Anschluss zu einem Sequenzmotiv zusammengefasst.

Motiv: [HKR][ACHKMNQRSTV][V][CHKNQRST][FW]

Das PP1γ1-Bindemotiv favorisiert demnach an den Positionen +1 und +2 basische Ami-

nosauren, Valin an der Position +3, an der Position +4 polare ungeladene oder basische

Aminosauren und an der Position +5 hydrophobe aromatische Aminosauren.

Zusatzlich werden an der Position +2 ungeladene Aminosauren toleriert, deren Seitenket-

tenvolumen zwischen der Alanin- und Methioninseitenkette liegt. Prolin wird nicht toleriert,

weil es die gestreckte Ruckgratkonformation des Bindemotivs aufheben wurde. Um Daten-

banken moglichst spezifisch nach PP1γ1-Bindungspartnern durchsuchen zu konnen, wurde

das Pattern restriktiv gestaltet, so dass Isoleucin an der Position +3 nicht in die Sequenz

aufgenommen wurde. Das Bindemotiv mit Isoleucin an Position +3 zeigte nur eine sehr

schwaches Immunsignal im Western Blot (Abb. 4.18) und verursachte im Modelling sterische

Behinderungen in der Komplexstruktur (Abb. 4.17B).

4.3.7 Einsatz des Sequenzmotivs als Pattern fur die Datenbanksuche

Ein Problem der Datenbanksuche auf Grundlage von Pattern ist, dass eine hohe Sensivitat

nicht gleichzeitig mit einer hohen Spezifitat erreicht werden kann. Das bisher in der Literatur

beschriebene Sequenzmotiv [KR][X]0−1[VI]{P}[FW], zielte darauf ab, moglichst sensitiv zu

sein, das heißt alle Interaktionspartner der PP1γ1 zu finden. Aus einem Testsatz von 56

experimentell bestatigten Wechselwirkungspartnern findet das bisherige Pattern 38 Proteine

(86 %). Dies ist recht gut, zeigt aber, dass selbst dieses sehr unscharfe Pattern nicht alle

Wechselwirkungspartner identifizieren kann. Wahrscheinliche Grunde sind nicht-kanonische

oder sekundare Interaktionsmotive, die in der Literatur beschrieben wurden [172, 173]. Ein

großer Nachteil von unscharfen Pattern ist, dass viele falsch-positive Treffer erzielt werden und

es sich somit nicht fur genomweite Datenbanksuchen eignet. Das in dieser Arbeit aufgestellte

Pattern zielte darauf ab, affine Wechselwirkungspartner zu identifizieren, die allein uber das

Pattern an PP1γ1 binden. Dadurch wird die Spezifitat erhoht, was ein Vorteil fur genomweite

Datenbanksuchen darstellt. Dies sollte im Anschluss an einem Testdatensatz verdeutlicht

werden.

Page 69: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

4.3. Proteinphosphatase 1 59

4.3.7.1 Erzeugen eines neuen Testdatensatzes

Mit Hilfe einer UniProt-SwissProt Datenbanksuche wurde ein kleiner Testdatensatz erstellt.

Dieser enthalt Treffer, die nur durch das bisher beschriebene (alte) Pattern identifiziert wer-

den und auch solche, die sowohl durch das alte als auch das neu aufgestellte Pattern gefunden

werden.

Sowohl mit dem neuen als auch mit dem alten Pattern wurde eine auf das Genom der Ratte

beschrankte Datenbanksuche durchgefuhrt. Dabei wurden mit dem alten Pattern 1578 Tref-

fer und mit dem neuen 186 Treffer erzielt. Die gefundenen Kandidaten wurden im Anschluss

verschiedenen Filterprozeduren unterworfen, um trivial falsch-positive Treffer auszuschlie-

ßen. Folgende Filterkriterien wurden angewandt: (a) Kandidaten mussen eine konservierte

PP1γ1-Regulierung aufweisen, (b) das Bindemotiv darf sich nicht in der Transmembran-

region, der extrazellularen Domane oder dem Signalpeptid befinden und (c) bekannte PP1γ1-

Bindungspartner sollen nicht enthalten sein.

Mit Hilfe dieser Filterkriterien wurden ca. 55 % trivial falsch-positive Treffer identifiziert und

verworfen. Aus den restlichen Treffern wurden acht Proteine ausgewahlt, die durch beide

Sequenzmotive abgedeckt wurden, sowie vier Proteine, die nur durch das alte Pattern erfasst

wurden. Diese Proteine wurden im Anschluss experimentell verifiziert.

4.3.7.2 Vorhersage neuer Bindungspartner

Zur Evaluierung der vorhergesagten Proteine als PP1γ1-Bindungspartner wurden Western

Blot Analysen durchgefuhrt. Hierbei sollte mittels der bereits beschriebenen GST Pulldown

Analyse die spezifische Bindung zwischen PP1γ1 und den im Testsatz enthaltenen Proteinen

nachgewiesen werden.

KLV

TF

Inpu

t

GST

KHVSF

KKVSW

KKVTF

KIV

SW

KTV

SF

RRVRF

KPVTF

KYVSF

KNVTF

KAV

SW

KSVSF

PP1 1g

Abb. 4.21: Untersuchung der PP1γ1-Bindung der vorhergesagten Proteine. Die Kandidaten wur-

den als GST-Fusionsproteine exprimiert, uber den GST-Tag an Glutathion-Sepharose Beads gebunden und

anschließend mit T7-markierter PP1γ1 inkubiert. Gebundene PP1γ1 wurden im Western Blot unter Benutzung

eines spezifischen T7-Tag Antikorpers detektiert (obere Halfte). Immunfarbung: Anti-T7 Antikorper, Detek-

tion: Ziege-anti-Maus-HRP Antikorper. Die untere Gel zeigt die dabei eingesetzte Proteinmenge.

Von dem im Testsatz enthaltenen zwolf Kandidaten konnte fur sieben ein Proteinsignal im

Western Blot detektiert werden (Abb. 4.21). Die Datenbanksuche und die darauffolgende

experimentelle Verifizierung sind in Tabelle 4.8 zusammengefasst.

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60 4. Ergebnisse

Tab. 4.8: Spezifitatsuntersuchung der Sequenzmotive. Durch Datenbanksuche identifizierte PP1γ1-

Bindungspartner wurden mit”+“, nicht gefundene Bindungspartner mit

”-“ gekennzeichnet. Hierbei steht

Pattern 1 fur [KR][X]0−1[VI]{P}[FW] und Pattern 2 fur [HKR][ACHKMNQRSTV][V][CHKNQRST][FW].

Motiv Protein Identifikations- Vorhersage der PP1γ1-Bindung

nummer Pattern 1 Pattern 2 Experiment

KHVSF APC NP 036631 + + +

KKVSW CIC7 NP 113756 + + +

KLVTF CRYM NP 446407 + - -

KKVTF Encephalopsin NP 034228 + + +

KIVSW FKBP4 XP 324764 + - -

KTVSF IP3R1 NP 037270 + + +

RRVRF Kv1,6 P17659 + + +

KPVTF Otoferlin XP 343030 + - -

KYVSF P2X7 NP 062129 + - -

KNVTF Properdinahnlich XP 216784 + + -

KAVSW RB1CC1 XP 232667 + + +

KSVSF TRPC5 NP 543174 + + +

Aus der Tabelle geht hervor, dass beide Sequenzmotive (Pattern 1 und 2) die sieben Proteine,

welche tatsachlich von der PP1γ1 gebunden werden, richtig als Bindungspartner identifiziert

haben. Mit dem neuen Pattern wurde nur ein Protein falsch als Wechselwirkungspartner

vorhergesagt (XP 216784). Alle vier zusatzlichen Treffer, die nur durch das alte Pattern ab-

gedeckt wurden, binden in Wirklichkeit nicht an PP1γ1 (Abb. 4.21). Dies zeigt die schlechte

Spezifitat des alten Patterns.

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4.4. HIV-1 Protease 61

4.4 HIV-1 Protease

Es ist bekannt, dass Mutationen der HIV-1 Protease deren Struktur und Dynamik und damit

die Fahigkeit Wirkstoffe mit hoher Affinitat zu binden, beeinflussen [129, 130, 174, 175]. Im

Rahmen dieser Arbeit wurde die außerhalb des aktiven Zentrums lokalisierte Mutation E35D

(Abb. 1.7), welche unter anderem in Verbindung mit dem Inhibitor Amprenavir beschrie-

ben wird, auf atomarer Ebene untersucht, um Einblicke in den molekularen Mechanismus

der Resistenzentstehung zu erlangen. Hierbei wurden MD-Simulationen der freien, inhibitor-

und substratgebundenen Protease sowohl am Wildtyp- als auch am mutierten System durch-

gefuhrt.

4.4.1 Untersuchung des Liganden-Bindungsmodus

Die Rontgenstrukturen 4HVP und 1HPV der HIV-1 Protease, welche die substrat- (SUB)

bzw. inhibitor- (Amprenavir, APV) gebundene Protease reprasentieren, zeigen ein stabili-

sierendes Netzwerk aus Wasserstoffbrucken, welche zwischen Ligand und Enzym ausgebildet

sind. Aus diesem Grund wurde im Anschluss an die Energieminimierung der Ligandenbin-

dungsmodus mit Hilfe des LIGPLOT-Programms analysiert und mit Hilfe des DS-Viewers

graphisch dargestellt.

Es zeigt sich, dass beide Liganden stabilisierende Wechselwirkungen zu beiden Untereinheiten

des Enzyms ausbilden. Die Abbildung 4.22 verdeutlicht den Bindungsmodus der liganden-

gebundenen Wildtyp HIV-1 Protease, welcher sich nicht von dem mutierten System unter-

scheidet.

(A)

D25

D27’D28’

D29

G48 G48’

D25’

(B)

I50

D25 D25’

D28’D30

D29 G27

I50’

Abb. 4.22: Ligandenbindung im aktiven Zentrum der HIV-1 Protease. Dargestellt ist das aktive

Zentrum der Protease komplexiert mit A) Substrat und B) Amprenavir. Die mit LIGPLOT identifizierten

Wasserstoffbrucken sind durch schwarz gestrichelte Linien dargestellt.

Das Substrat wird sowohl von G48/G48’ als auch von den katalytischen Aspartaten

(D25/D25’) uber Wasserstoffbrucken stabilisiert (Abb. 4.22A). Die beiden Aminosauren

(G48/G48’) sind in zwei bewegliche Schleifen integriert, die sich wie ein Deckel uber die

Bindungstasche legen. Diese beweglichen Schleifen werden auch als Flaps bezeichnet. In der

Page 72: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

62 4. Ergebnisse

Abbildung 4.22A ist zu erkennen, dass der Carbonylsauerstoff von Glycin 48 eine Wasser-

stoffbrucke zum Amidproton des Isoleucins an Position zwei des Substrats, ausgebildet hat.

Zusatzlich wurden weitere Wasserstoffbrucken von Resten des aktiven Zentrums zum Sub-

strat ausgebildet, diese wirken ebenso stabilisierend.

Der Inhibitor Amprenavir (Abb. 4.22B) wird ebenfalls uber ein Netzwerk aus Wasserstoff-

brucken im aktiven Zentrum der HIV-1 Protease fixiert und stabilisiert. Die Interaktion zu

den in den Flaps lokalisierten Aminosauren I50 und I50’ wird wie in der Abbildung 4.22B

sichtbar, nicht direkt, sondern uber ein Wassermolekul vermittelt.

Nachdem die Protein-Ligand-Wechselwirkungen im Wildtyp und in der Mutante sowohl in

der statischen Struktur als auch nach der Minimierung gleich geblieben sind, kann die Aus-

wirkung der Mutation ohne MD-Simulationen nicht erklart werden.

4.4.2 Stabilitat der MD-Simulationen

Die MD-Simulation, eine etablierte Methode zur Untersuchung der dynamischen Eigen-

schaften, wurde mit Standardparametern (Abschnitt 3.2.6) durchgefuhrt. Nach Einstellung

des dynamischen Gleichgewichts wurden die Veranderungen der Atomkoordinaten der Ruck-

gratatome anhand der Root-Mean-Square-Deviation (RMSD) charakterisiert.

In Abbildung 4.23 ist die zeitliche Entwicklung der mittleren quadratischen Abweichung

(RMSD) der Systeme im Vergleich zu der jeweiligen Startstruktur der Produktionsphase

aufgetragen.

(A)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Zeit [ns]

0

1

2

3

RM

SD

]

(B)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Zeit [ns]

0

1

2

3

RM

SD

]

(C)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Zeit [ns]

0

1

2

3

RM

SD

]

Abb. 4.23: RMSD im Verlauf der Simulation. Die mittlere quadratische Abweichung der A) freien B)

substratgebundenen und C) inhibitorgebundenen HIV-1 Protease gegen die Simulationszeit, wobei schwarz die

Wildtyp und rot die mutierte Struktur reprasentiert.

Page 73: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

4.4. HIV-1 Protease 63

Es konnte beobachtet werden, dass die einzelnen Simulationen ahnlich große Abweichungen

zur jeweiligen Startstruktur aufweisen, wobei der RMSD der Ruckgratatome nach einer Simu-

lationszeit von 10 ns zwischen 1,0 und 1,9 A liegt. Des Weiteren ist zu erkennen, dass die

Simulationen stabile Trajektorien geliefert haben.

4.4.3 Untersuchung polarer Wechselwirkungen im Bereich der Mutation

Zur Identifizierung der polaren Wechselwirkungen im Mutationsbereich wurden LIGPLOT-

Analysen der Kristallstrukturen durchgefuhrt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass in beiden

Untereinheiten der HIV-1 Protease, Glutamat 35 eine Salzbrucke zu Arginin 57 ausgebildet

hat (Abb. 4.24).

2.89

2.78

N

CA

CB

C

CG

CD

OE1OE2

O

N

CA

CB

C

CG

CDNE

CZ

NH1

NH2

O

E35 R57

Abb. 4.24: LIGPLOT-Analyse zur Identifizierung polarer Wechselwirkungen an Position 35. In

der statischen Struktur, hier die inhibitorgebundene HIV-1 Protease, ist eine Salzbrucke zwischen Glutamat

35 (gelb) und Arginin 57 (grun) ausgebildet. Ein schematisches 2D-Diagramm der Wechselwirkungen zwischen

Glu35 und Arg57 befindet sich in der linken Bildhalfte. Die beiden Reste der HIV-1 Protease sind als Kugel-

Stabchen-Modell dargestellt. Fur jede Wechselwirkung (schwarz gestrichelte Linien) ist der Donor-Akzeptor-

Abstand in A angegeben.

Im Anschluss sollte die Stabilitat der mit LIGPLOT [137] identifizierten Salzbrucke wahrend

der MD-Simulation untersucht werden. Dabei wurden die Abstande uber die gesamte Simu-

lationszeit zwischen den Sauerstoffatomen (Oε1 und Oε2) der Seitenkette an Position 35

(Glutamat) und den Stickstoffatomen (Nη1, Nη2 und Nε) der Seitenkette von Arginin 57

kontrolliert. Des Weiteren sollte die Frage beantwortet werden, ob die Mutation an Position

35 eine Auswirkung auf die Ausbildung der Salzbrucke hat. Hierzu wurden ebenfalls die

Abstande uber den Simulationszeitraum zwischen der mutierten Struktur (Aspartat 35) und

Arginin 57 untersucht. Die Analysen wurden sowohl mit der freien HIV-1 Protease als auch

mit der substrat- und inhibitorgebundenen Protease durchgefuhrt, wobei jeweils beide Unter-

einheiten betrachtet wurden.

Die Abbildung 4.25 zeigt die Existenz von Salzbrucken uber den Simulationszeitraum. Fur

eine stabil ausgebildete Salzbrucke musste ein Distanzkriterium von kleiner 3,2 A zwischen

den geladenen Schweratomen erfullt werden.

Page 74: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

64 4. Ergebnisse

(A)

(B)

(C)

Abb. 4.25: Vergleich der Salzbruckenausbildung der HIV-1 Protease zwischen E/D35 und R57.

HIV-1 Protease: A) freien, B) komplexiert mit dem Substrat (SUB) und C) Amprenavir (APV), wobei schwarz

die Wildtyp- und rot die mutierte Protease reprasentiert. 3,2 A wurde als Distanzkriterium fur eine stabile Salz-

brucken gesetzt. Jeder Punkt zeigt, dass die entsprechende Salzbrucke ausgebildet ist. Die aufgetragenen Plots

wurden entsprechend den Messungen mit 1 bis 12 nummeriert. 1: E35(Oε1)–R57(Nη1); 2: D35(Oδ1)–R57(Nη1);

3: E35(Oε1)–R57(Nη2); 4: D35(Oδ1)–R57(Nη2); 5: E35(Oε1)–R57(Nε); 6: D35(Oδ1)–R57(Nε); 7: E35(Oε2)–

R57(Nη1); 8: D35(Oδ2)–R57(Nη1); 9: E35(Oε2)–R57(Nη1); 10: D35(Oδ2)–R57(Nη2); 11: E35(Oε2)–R57(Nε);

12: D35(Oδ2)–R57(Nε).

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4.4. HIV-1 Protease 65

Aus der Abbildung wird ersichtlich, dass alle untersuchten Wildtypstrukturen der HIV-1

Protease haufiger stabile elektrostatische Wechselwirkungen ausgebildet haben, als es fur die

mutierten Proteinsysteme beobachtet wurde. Dies ist besonders deutlich in der Untereinheit 1

der substratgebundenen Protease zu erkennen (Abb. 4.25B). Wahrend die Struktur des Wild-

typs uber die gesamte Simulationszeit von 10 ns stabile Salzbrucken ausgebildet hat, zeigte

die mutierte Struktur deutliche Fluktuationen in der Salzbruckenausbildung. Es konnte in

der mutierten Struktur eine stabile Salzbrucke nur uber relativ kurze Zeitspannen zwischen

0–1 ns und 8,3–9,3 ns registriert werden.

Die elektrostatische Interaktionsenergie (Tab. 4.9) zwischen der Seitenkette von E/D35 in

beiden Untereinheiten der HIV-1 Protease gibt eine Abschatzung fur die Starke der Salz-

brucken. Die fur das mutierte System beobachteten Fluktuationen (Abb. 4.25), spiegeln sich

auch in der Abnahme der elektrostatischen Interaktionsenergie wider.

Tab. 4.9: Berechnung der elektrostatischen Interaktionsenergie zwischen E/D35 und R57 Seiten-

kette in beiden HIV-1 Protease Untereinheiten.

Energie [kcal ·mol−1]

Protease Ligand Untereinheit 1 Untereinheit 2

WT frei -45,45±13,13 -27,44±16,30

E35D frei -39,64±7,28 -8,30±7,59

WT SUB -35,61±8,64 -38,33±16,03

E35D SUB -11,74±12,54 -34,09±7,43

WT APV -40,57±13,86 -48,38±7,10

E35D APV -40,97±7,37 -9,52±8,75

4.4.4 Strukturelle Auswirkung der Mutation E35D

Zur Untersuchung, inwieweit die Mutation E35D eine Auswirkung auf die globale Struktur

der HIV-1 Protease hat, wurde wie in der Literatur beschrieben [129,176] die Geometrie der

Ligandenbindungstasche untersucht. Zu diesem Zweck wurden aus den Strukturen der Tra-

jektorie die Distanzen zwischen dem Cα-Kohlenstoff der Aminosaure Isoleucin 50, welche sich

in der Spitze der Flapregion befindet (Abb. 4.24), und dem Cβ-Kohlenstoff des katalytischen

Aspartats 25 gemessen.

Die Abbildung 4.26 zeigt die Abstande zwischen den Aminosauren D25 und I50 in beiden

Untereinheiten im Verlauf der Simulation fur die freie Form der HIV-1 Protease, wobei der

Wildtyp in schwarz und die mutierte Struktur der Protease in rot dargestellt ist.

Fur das mutierte System konnten im Simulationsverlauf Offnungsbewegungen der Flaps be-

obachtet werden. Zu Beginn der Simulation betrug der D25(Cβ)–I50(Cα)-Abstand sowohl im

Wildtyp- als auch im mutierten System zirka 12 A. Nach einer Simulationszeit von etwa sechs

Nanosekunden wurde eine sprunghafte Flapoffnung in der zweiten Untereinheit der mutierten

Protease sichtbar, wobei Abstande zwischen 18 und 20 A eingenommen wurden. Wie in der

Abbildung ersichtlich, wurden ab diesem Zeitpunkt fur die Untereinheit 1 der Mutante ein

Page 76: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

66 4. Ergebnisse

langsamer Anstieg beobachtet. Im weiteren Simulationsverlauf konnten ebenfalls Offnungs-

bewegungen fur die Untereinheit 1 registriert werden. Zum Ende der Simulation wurden

Distanzen im Bereich von 18 bis zirka 21 A fur das mutierte System gemessen, wohingegen

die Abstande bei der Wildtypstruktur im Bereich zwischen 13 und 14 A lagen.

(A)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9Zeit [ns]

912

15

1821

24

Abst

and [Å

]

Untereinheit 1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9Zeit [ns]

Untereinheit 2

(B)

3 ns 6 ns 8 ns 10 ns

Abb. 4.26: Bewegung der Flaps in der Simulation der freien HIV-1 Protease. A) Offnungsbewegung

im Simulationsverlauf. Die Abstande zwischen dem katalytischen D25(Cβ) und I50(Cα) wurden fur beide

Untereinheiten gemessen. B) Schnappschusse der freien Protease. WT: schwarz, E35D: rot.

Im Anschluss an die Untersuchung der freien HIV-1 Protease wurde die beschriebene Analyse

mit der substrat- und inhibitorgebundenen Protease sowohl fur das Wildtypsystem als auch

fur das mutierte Proteinsystem durchgefuhrt. Hierbei wurden ebenfalls die Abstande der

Aminosauren I50 und D25 in beiden Untereinheiten im Verlauf der Simulation untersucht

und in Abbildung 4.27 dargestellt.

(A)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9Zeit [ns]

912

15

1821

24

Abst

and [Å

]

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9Zeit [ns]

Untereinheit 1 Untereinheit 2

(B)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9Zeit [ns]

912

15

1821

24

Abst

and [Å

]

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9Zeit [ns]

Untereinheit 1 Untereinheit 2

Abb. 4.27: Abstand der Aminosauren I50(Cα)–D25(Cβ) der ligandengebundenen Protease.

Abstande fur die substratgebundene A) und APV-gebundene B) HIV-1 Protease. WT: schwarz, E35D: rot.

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4.4. HIV-1 Protease 67

Wie aus Abbildung ersichtlich wird, konnte fur die ligandengebundene Protease keine

Offnungsbewegung der Flaps wahrend der Simulationszeit von 10 ns beobachtet werden.

Es ist bekannt, dass die Liganden der Protease stabilisierende Wechselwirkungen zu den Flaps

ausbilden (Abb. 4.22). Diese Wechselwirkungen konnten dazu fuhren, dass die Offnungsbe-

wegungen, wie sie bei der freien E35D-Protease gezeigt wurden, bei der gebundenen Form

nicht in diesem Zeitraum beobachtet werden. Aus diesem Grund wurden in den weiteren

Untersuchungen zwei Schlusselinteraktionen zu den Protease-Flaps analysiert, welche fur die

Substrat- bzw. Inhibitorbindung von Bedeutung sind.

Bei der substratgebundenen Protease wurde die Interaktion zwischen dem Carbonylsauerstoff

von Glycin 48 und dem Amidproton von Isoleucin 201, welches an der zweiten Liganden-

position lokalisiert ist, gemessen und in Abbildung 4.28A dargestellt.

(A)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Zeit [ns]

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

Ab

sta

nd

]

(B)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 102

3

4

5

6

7

8

Abst

and [Å

]

I50’ I50

Zeit [ns]

I50’ I50

Abb. 4.28: Abstande im aktiven Zentrum uber die Simulationszeit. A) Abstand von G48(O) zu

I201(HN) des Substrats. B) Abstand zwischen dem Amidproton von I50(HN) und den Sulfonylsauerstoff (O5)

von APV. Zu Beginn der Simulation wird APV sowohl in der WT- als auch in der mutierten Struktur uber das

flap water mit I50 verbruckt, wohingegen die MD-Simulation der E35D-Protease zum Verlust des flap waters

fuhrt. WT: schwarz, E35D: rot.

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68 4. Ergebnisse

Es konnte gezeigt werden, dass die stabilisierenden Wasserstoffbrucken zwischen dem Substrat

und der Wildtypstruktur der HIV-1 Protease wahrend der gesamten MD-Simulation stabil

ausgebildet waren, wohingegen im mutierten System großere Schwankungen beobachtet wur-

den. Dies deutet darauf hin, dass die mutierte Protease das Substrat schwacher bindet.

Die inhibitorgebundene Protease wird wie in Abbildung 4.22 gezeigt uber ein Wassermolekul

mit Isoleucin 50, welches in des Flaps lokalisiert ist, verbruckt. Als Maß fur die strukturelle

Intaktheit der Bindungstasche wurden die Abstande zwischen dem Amidproton von I50 und

dem Sulfonylsauerstoff (O5) von Amprenavir gemessen. Die hierbei registrierten Abstande

(Abb. 4.28B) zeigten fur die inhibitorgebundene Protease in der Wildtypstruktur ahnliche

Abstande, wie sie in der Rontgenstruktur (3,91 A) gemessen wurden. Im Gegensatz dazu

wurden fur das mutierte Proteinsystem großere Abstande beobachtet, die von einer Offnungs-

bewegung herruhren, die zirka nach 6 ns startet.

Zur Identifizierung der Ursachen fur den großeren Abstand wurde die Ruckgratgeometrie der

Flaps analysiert. Dabei konnte beobachtet werden, dass es bei Glycin 49 und bei Isoleucin

50 der inhibitorgebundenen Protease im Simulationsverlauf zu einer lokalen Veranderung des

ψ bzw. des φ-Winkels kommt. Zu Beginn der Simulation wurde fur Glycin 49 ein ψ-Winkel

von -141 ◦ und fur Isoleucin 50 ein φ-Winkel von -73 ◦ gemessen, wohingegen es im Verlauf

der Simulation zu einem Verdrehen kommt, so dass am Ende der Simulation Glycin 50 ein

ψ-Winkel von +160 ◦ und Isoleucin ein φ-Winkel von zirka +60 ◦ eingenommen hat. Hierbei

konnte beobachtet werden, dass die lokalen Anderungen der ψ/φ-Winkels von G49/I50 zum

Verlust des flap waters fuhrten (Abb. 4.28B). Dies lasst vermuten, dass der Inhibitor nicht

mehr so fest gebunden werden kann.

4.4.5 Untersuchung der Bindungsaffinitat

Im Mittelpunkt des Interesses stand die Frage, wie sich der Verlust der zuvor beschriebenen

Wechselwirkungen zwischen der Protease und den gebundenen Liganden auf die Bindungs-

energie von Substrat und Amprenavir auswirkt. Hierzu wurden im Anschluss energetische

Analysen durchgefuhrt. Die Strukturen aus der letzten Nanosekunde der MD-Simulation

wurden dazu nach der MM/PBSA Methode (Abschnitt 3.2.7.2) ausgewertet. Die berech-

neten freien Bindungsenergien und ihre Einzelbeitrage sind in der Tabelle 4.10 sowohl fur die

Substrat- (SUB) als auch fur die Amprenavir- (APV) gebundene HIV-1 Protease zusammen-

gefasst.

Tab. 4.10: Freie Bindungsenergie (in kcal ·mol−1) der ligandengebundenen HIV-1 Protease. Die

Bindungsenergie wurde mit der MM/PBSA-Methode berechnet. ∆Gb = ∆Gvdwint +∆Geleint+∆Gnonpolarsol +∆Gelesol.

System ∆Gvdwint ∆Geleint ∆Gnonpolarsol ∆Gelesol ∆Gb

WT-Protease SUB -78,42 -91,51 -6,25 123,45 -52,73

E35D-Protease SUB -84,12 -73,81 -6,89 127,67 -37,15

WT-Protease APV -58,81 -50,82 -5,00 37,69 -76,94

E35D-Protease APV -56,30 -49,36 -4,89 40,50 -70.05

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4.4. HIV-1 Protease 69

Die schwachere Bindungsenergie (Tab. 4.10) deutet darauf hin, dass die Wechselwirkung der

Protease mit dem Inhibitor Amprenavir durch die Mutation verringert wird. Der Haupt-

beitrag zur schwacheren Interaktionsenergie resultiert aus dem Verlust elektrostatischer

Wechselwirkungen. Diese Beobachtung ist konsistent mit den zuvor beschriebenen Ergebnis-

sen, in denen gezeigt wurde, dass die Bewegung der Flaps zum Verlust von Wasserstoffbrucken

zwischen Ligand und Protease fuhrte.

Wie ebenfalls aus der Tabelle 4.10 ersichtlich wird, zeigt die Mutation E35D auch eine signifi-

kante Auswirkung auf die Bindungsaffinitat zwischen Protease und Substrat. Vergleicht man

die Differenz der freien Bindungsenergie (15,58 kcal ·mol−1 fur SUB und 6,89 kcal ·mol−1 fur

APV), kann man erkennen, dass die Mutation sehr ungunstig fur die enzymatische Aktivitat

der HIV-1 Protease sein sollte. In weiteren Analysen sollte untersucht werden, ob neben dem

Selektionsdruck durch APV weitere Faktoren existieren, die die Entstehung der Mutation

E35D begunstigen.

4.4.6 Epitopvorhersage

In der Literatur wird die Rolle von Fluchtmutationen bei der HIV-Infektion diskutiert, welche

die Effizienz der Immunantwort herabsetzen [177, 178]. Glutamat 35 ist in einem Epitop

(EEMSLPGRW) lokalisiert, welches durch das HLA-B44 Allel erkannt wird. Die Mutation

konnte dazu beitragen, dass das Virus schlechter vom Immunsystem erkannt wird. Zur Bear-

beitung dieser Hypothese wurde untersucht, ob der Austausch von Glutamat 35 zu Aspartat

zu einer Maskierung des Epitops fuhrt und somit als Fluchtmutation dem Immunsystem ent-

kommt.

Das Programm SYFPEITHI [140] wurde zur Vorhersage von T-Zell-Epitopen verwendet, wo-

bei die Genauigkeit der Motivubereinstimmung anhand eines Scores abgelesen werden kann.

Hierzu wurde die Bindungswahrscheinlichkeit sowohl der Wildtypsequenz EEMSLPGRW als

auch der Mutante EDMSLPGRW mit dem MHC-Klasse-1 Molekul (HLA-B*4402) vorher-

gesagt.

Sequenz Score

EEMSLPGRW 24

EDMSLPGRW 14

Tab. 4.11: Epitopvorhersage mittels SYFPEITHI. Die aus-

getauschte Aminosaure ist in fett hervorgehoben.

Der erniedrigte Score (Tab. 4.11), welcher nach dem Austausch von Glutamat zu Aspartat

erhalten wurde, deutet darauf hin, dass das mutierte Epitop von HLA-B44 schlechter er-

kannt wird als das Wildtyp-Epitop, was eine Rolle von E35D als Fluchtmutation nahelegt.

Somit existieren Hinweise auf einen weiteren Mechanismus, der das Auftreten dieser Mutation

begunstigt.

Page 80: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

70 4. Ergebnisse

Page 81: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

5 Diskussion

5.1 Einfluss des SH3-SH2 Linkers auf Struktur und Dynamik

der Src-Kinasen

Trotz der großen Ahnlichkeit der Src-Kinasen untereinander unterscheiden sie sich in der

Regulation ihrer verschiedenen Aktivierungsstufen und ihrer Spezifitat fur bestimmte akti-

vierende Liganden. In fruheren Arbeiten wurde beobachtet, dass die SH3-SH2 Domanenkon-

taktflache in der Lck-Kinase Eigenschaften besitzt, die sich deutlich von den entsprechenden

Kontaktflachen anderer Mitglieder der Src-Familie unterscheiden [67]. Ublicherweise wird

fur die Bindung von SH3- oder SH2-Liganden an Src-Kinasen der Effekt der sogenannten

cross-communication beobachtet [58, 67]. Die Ligandenbindung fuhrt hierbei zu einer Struk-

turanderung in der jeweils anderen regulatorischen Domane. Diese Kopplung wurde in der

Literatur als wichtig fur den Aktivierungsprozess von Src-Kinasen beschrieben [58]. Arbeiten

von Hofmann und Kollegen haben gezeigt, dass der Effekt der cross-communication im iso-

lierten SH3-SH2 Domanenpaar von Lck nicht auftritt [68]. Weitere Untersuchungen ergaben,

dass der SH3-SH2 Domanenlinker der Lck-Kinase im Vergleich zu den anderen Src-Kinasen

ungewohnlich flexibel ist. Diese Besonderheit wurde auf die strukturelle Zusammensetzung

des Linkers zuruckgefuhrt. Außerdem wird diskutiert, ob die veranderte Linkersequenz auch

die Dynamik der Lck-Aktivierung beeinflusst [58, 68].

In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss der SH3-SH2 Linkersequenz auf die Struktur

und Dynamik von Tyrosinkinasen untersucht werden. Hierzu wurde die Linkersequenz zwi-

schen dem regulatorischen Domanenpaar der inaktiven, geschlossenen Hck-Kinase durch die

Linkersequenz aus Lck ersetzt (Abb. 4.1). Zur Untersuchung der strukturellen Besonderheit

der Linkersequenz wurden MD-Simulationen sowohl mit der Wildtyp Hck-Kinase als auch

mit der mutierten Kinase (Hck*) durchgefuhrt. Die Strategie der vergleichenden Simulation

ermoglicht einen direkten Ruckschluss auf den Effekt des SH3-SH2 Linkers, wenn im Verlauf

der Simulation unterschiedliche Effekte beobachtet werden.

5.1.1 Erhohte Fluktuationen der globalen Struktur durch veranderte

Linkersequenz

Die Einfuhrung des SH3-SH2 Linkers aus Lck zwischen die regulatorischen Domanen der

inaktiven Struktur der Hck-Kinase bewirkte im Verlauf der Simulation Anderungen in der

globalen Struktur (Abb. 4.3). Die mutierte Kinase ließ im Vergleich zum Wildtyp eine erhohte

Flexibilitat erkennen, welche sich auf die Domanenorientierung auswirkte. Dabei konnte beob-

achtet werden, dass sich der Abstand zwischen den Massenschwerpunkten der SH3-Domane

und dem N-Lobe der katalytischen Domane vergroßerte (Abb. 4.3A), wohingegen der Ab-

71

Page 82: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

72 5. Diskussion

stand zwischen der SH2-Domane und dem C-Lobe keine Veranderungen zeigte (Abb. 4.3C).

Dies spricht dafur, dass die Position der SH3-Domane in der mutierten Kinase flexibler ist.

Des Weiteren wurden kleinere Offnungsbewegungen zwischen N- und C-Lobe der mutierten

Kinase sichtbar, wahrend in der Wildtyp-Simulation keine Anderungen zu erkennen waren

(Abb. 4.3B). Die im Verlauf der Simulation beobachteten Offnungsbewegungen zwischen der

SH3-Domane und dem N-Lobe sowie zwischen N- und C-Lobe begannen zum gleichen Zeit-

punkt bei zirka 7 ns (siehe Abb. 4.3A und B). Dies deutet darauf hin, dass die Bewegungen

kooperativ sind und wahrscheinlich auf den gleichen strukturellen Ursachen beruhen. Nach-

dem der einzige Unterschied zwischen Hck und Hck* in der Zusammensetzung des Linkers

zwischen den regulatorischen Domanen besteht, liegt es nahe, dass der ausgetauschte SH3-

SH2 Linker fur die hohere Flexibilitat der mutierten Kinase verantwortlich ist.

Die Sequenz des Linkers unterscheidet sich in vier Aminosauren (Abb. 4.1), welche in der Lck-

Sequenz nicht die stabilisierenden Wechselwirkungen ausbilden konnen, die fur andere Src-

Kinasen beschrieben sind [67, 68]. In der Hck-Kinase, wie auch in den anderen Src-Kinasen,

bildet der SH3-SH2 Domanenlinker eine 310-Helix, welche die Orientierung der Domanen zu-

einander stabilisiert und Kontakte zwischen den Domanen ermoglicht. Der SH3-SH2 Linker

aus Lck enthalt im Gegensatz zu den anderen Src-Kinasen zwei Proline, welche die Stabilisie-

rung einer 310-Helix verhindern. Die anderen Src-Kinasen besitzen anstelle eines der Proline

außerdem ein konserviertes Glutamat, das, wie auch in der Simulation fur die Hck-Kinase

beobachtet werden konnte, eine stabilisierende Salzbrucke zu einem Rest der SH3-Domane

bildet. Durch die in der Wildtyp-Kinase ausgebildeten Wechselwirkungen wird die Orientie-

rung der Domanen zueinander stabilisiert (Abb. 4.3).

Die beiden regulatorischen Domanen wirken in der geschlossenen Konformation als eine Art

Klammer, die das aktive Zentrum der katalytischen Domane zusammendruckt und so in der

inaktiven Konformation halt [65]. Young und Kollegen haben in fruheren Arbeiten gezeigt,

dass die Starrheit des SH3-SH2 Domanenlinkers eine wichtige Rolle fur die Repression der

Aktivitat der Kinasedomane spielt [58]. Weiterhin wurde von der Arbeitsgruppe Kuriyan

gezeigt, dass die Substitution des SH3-SH2 Domanenlinkers durch Glycin in c-Src zu einer

konstitutiven Aktivierung fuhrt [58]. Wahrend der hier durchgefuhrten MD-Simulation kon-

nte beobachtet werden, dass der SH3-SH2 Linker der Hck-Kinase im Vergleich zum Linker der

mutierten Kinase relativ starr ist (Abb. 4.3). Dadurch wird wie in der Literatur beschrieben

die Kinase in ihrer inaktiven Konformation fixiert und somit eine Offnungsbewegung im

aktiven Zentrum zwischen N- und C-Lobe verhindert (Abb. 4.3B). In den MD-Simulationen

konnte auch gezeigt werden, dass die Einfuhrung des SH3-SH2 Linkers aus Lck analog zum

kunstlichen Glycin-Linker in c-Src eine erhohte Flexibilitat bewirkt (Abb. 4.3A und B). Eine

Konsequenz dieser besonderen strukturellen Eigenschaft ist eine im Vergleich zu anderen

Src-Kinasen verringerte Fahigkeit des SH3-SH2 Domanenpaars, die Kinasedomane in der in-

aktiven Konformation zu fixieren. Aufgrund dieser und experimenteller Ergebnisse [58] kann

man davon ausgehen, dass die erhohte Flexibilitat der Linkersequenz zu einer veranderten

Dynamik der Aktivierung fuhrt. Die erhohte Flexibilitat und die daraus resultierenden Ande-

rungen der globalen Struktur deuten darauf hin, dass die mutierte Hck-Kinase und somit

auch Lck, leichter als die anderen Src-Kinasen aktiviert werden kann.

Page 83: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

5.1. Einfluss des SH3-SH2 Linkers auf Struktur und Dynamik der Src-Kinasen 73

5.1.2 Einfluss der Linkersequenz auf das Aktivierungssegment

Der Austausch des SH3-SH2 Domanenlinkers von Hck durch den Linker von Lck zeigte

einen großen Effekt auf die globale Struktur. Hierbei kam es unter anderem zu einer

Vergroßerung des Abstandes in der Kinasedomane im Bereich des aktiven Zentrums zwischen

dem N- und C-Lobe (Abb. 4.3B). In weiteren Analysen wurde untersucht, ob diese leichte

Offnungsbewegung weitere Anderungen im aktiven Zentrum bewirkt. Hierbei konnten

allerdings nur geringe Fluktuationen der φ/ψ-Winkel beobachtet werden. Nachdem diese

ersten Simulationen mit gebundenem Inhibitor durchgefuhrt wurden, liegt es nahe, dass

dieser das aktive Zentrum fixiert und somit die Plastizitat des aktiven Zentrums einschrankt.

Somit konnten mogliche Auswirkungen der veranderten Linkersequenz nicht sichtbar werden.

Aus diesem Grund wurden im zweiten Teil der Untersuchungen MD-Simulationen ohne

PP1-Inhibitor durchgefuhrt. Trotz freier Ligandenbindungstasche zeigte die Wildtyp-Kinase

die gleiche Ruckgratgeometrie wie in der Simulation mit Inhibitor (siehe Abb. 4.6 und 4.7).

Im Gegensatz dazu bewirkte die Einfuhrung des regulatorischen Domanenlinkers aus Lck

die Ausbildung alternativer Konformationen des Aktivierungssegments der Kinasedomane

(Abb. 4.7). Wahrend der Simulationen wurden fur die mutierte Kinase großere Fluktua-

tionen der Ruckgratgeometrie des DFG-Motivs im Aktivierungssegment beobachtet (Abb.

4.7). Interessanterweise wurden bei der mutierten Kinase Ruckgratwinkel im DFG-Motiv

eingenommen, wie sie auch bei der inaktiven Abl-Kinase, nach Bindung des Inhibitors

Glivec, beobachtet wurden [171, 179, 180]. Eine typische Anderung, welche in der Literatur

bei Glivec-Bindung beschrieben wird, ist die Anderung des φ-Winkels der Aminosaure D381

(φ von 48 ◦ nach -152 ◦) [171]. Eine ahnliche Anderung konnte in der Simulation von der

Aminosaure D404 in Hck* (entspricht D381 in Abl) beobachtet werden (φ von 50 ◦ nach

-130 ◦, Abb. 4.7B). Fruher ist man davon ausgegangen, dass die Kinasen der Src-Familie

nicht von Glivec inhibiert werden konnen [179–181]. Neue Arbeiten zeigen dagegen eine

Hemmung der T-Zell Aktivierung und Proliferation durch Glivec [182]. Eine im Nature

Biotechnology veroffentlichte Arbeit weist auf die hochaffine Bindung von Glivec an Lck

hin (KD = 62 nM), wohingegen bei den anderen Src-Kinasen keine Inhibition beobachtet

wurde [183]. Wie in der Glivec-gebundenen Kristallstruktur von Abl zu erkennen ist,

bindet der Inhibitor zwischen N- und C-Lobe in das aktive Zentrum der geschlossenen

Kinase [179]. Ein Vergleich der Kristallstrukturen der geschlossenen Kinasen von Hck und

Src [60, 61] mit der Glivec-gebundenen Abl-Kinase ließ Unterschiede in der Geometrie des

Aktivierungssegments im aktiven Zentrum erkennen [184]. Eine analoge Bindung von Glivec

wird folglich in den inaktiven Kinasen von Hck und Src durch die abweichende Geometrie

des Aktivierungssegments verhindert [185]. In der vorliegenden Arbeit fuhrte die Einfuhrung

des Lck-SH3-SH2 Linkers in die Struktur der freien Hck-Kinase zu einer hoheren Plastizitat

des aktiven Zentrums und somit auch zu alternativen Konformationen (Abb. 4.7). Die beson-

deren strukturellen Eigenschaften des SH3-SH2 Domanenlinkers in Lck konnten somit nicht

nur zu einer veranderten Dynamik der Kinaseaktivierung fuhren, sondern auch veranderte

Ligandenbindungseigenschaften der Kinasedomane ermoglichen. Dadurch konnten Inhibi-

toren wie Glivec durch die hohere Plastizitat des aktiven Zentrums leichter gebunden werden.

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74 5. Diskussion

Um den Konformationsraum des aktiven Zentrums noch eingehender zu charakterisie-

ren, ist es notwendig langere Simulationen der Hck*, welche die Lck-Kinase reprasentiert,

durchzufuhren. Darauf aufbauend konnten mittels Molekulmodellierung neue Lck-spezifische

Inhibitoren entworfen werden.

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5.2. LynSH3-Tip 75

5.2 LynSH3-Tip

Die Bindung des herpesviralen Proteins Tip an SH3-Domanen wurde bereits mittels NMR-

und Fluoreszenzspektroskopie biophysikalisch untersucht [74, 75]. Tip bindet mit einer

Polyprolin-Helix vom Typ II an die SH3-Domanen, wobei die PPII-Helix von dem Sequenz-

bereich 176TPPLPPR182 gebildet wird. Es konnte weiter gezeigt werden, dass zusatzlich zur

PPII-Helix C-terminal flankierende Aminosauren an der SH3-Bindung beteiligt sind.

In den letzten Jahren wurden computergestutzte Methoden entwickelt und verfeinert, um

unter anderem Protein-Ligand Bindungseigenschaften genauer zu charakterisieren [45]. Im

Rahmen dieser Arbeit sollte nun untersucht werden, inwieweit sich diese Methoden auch auf

das Komplexsystem LynSH3-Tip anwenden lassen.

An einer Vielzahl von verschiedensten biologischen Systemen konnte gezeigt werden, dass mit

Hilfe von MD-Simulationen ein tiefgehendes Verstandnis von dynamischen und energetischen

Prozessen bei Protein-Ligand-Interaktionen erlangt werden kann. Neben der atomaren Cha-

rakterisierung der Dynamik stellt die MD-Simulation auch eine Methode zur Abschatzung

von relativen Bindungsenergien dar [45]. Eine relativ neue Methode zur Untersuchung von

Bindungsenergien ist die MM/PBSA-Methode, welche sich durch einen geringen Rechen-

zeitbedarf auszeichnet. Nachdem die Methode ursprunglich zur Untersuchung von Enzym-

Inhibitor-Komplexen angewandt [186, 187] worden war, findet sie heute zunehmend auch in

der Untersuchung von Protein-Protein-Komplexen Anwendung [48, 187, 188]. Hierbei konnte

gezeigt werden, dass die MM/PBSA-Methode in der Lage ist, fur viele Systeme, inklusive ei-

niger SH3-Ligand-Komplexe [46,189], Bindungsenergien zu liefern, die in guter Ubereinstim-

mung mit dem Experiment stehen [160]. In dieser Arbeit wurde die Bindung des Tip-Proteins

an die SH3-Domane der Tyrosinkinase Lyn mit Hilfe der MM/PBSA-Methode analysiert, um

die Rolle einzelner Aminosauren abzuschatzen. Des Weiteren wurde versucht, mit Hilfe der

MM/PBSA-Methode eine detaillierte Erklarung zu erlangen, warum Tip affiner von LynSH3

gebunden wird als von anderen Src-Kinasen.

5.2.1 Rolle einzelner Aminosauren im Tip-Bindemotiv

Eine gangige Methode zur Identifizierung von Aminosauren, die einen wichtigen Beitrag zur

Bindung liefern, ist der Alanin-Scan [163]. Hierbei wird die Bedeutung einzelner Seitenket-

ten untersucht, indem die zu untersuchende Aminosaure einzeln gegen Alanin ausgetauscht

und anschließend die Anderung der Bindungsenergie berechnet wird. Eine deutlich verrin-

gerte Affinitat ist ein Anzeichen dafur, dass die entsprechende Seitenkette wichtig ist. In

vielen Systemen konnte bereits mit dieser Methode die Kontaktflachen von Proteinen ge-

nau charakterisiert und die Beitrage einzelner Reste zur Ausbildung von Protein-Protein-

Wechselwirkungen bestimmt werden [48, 50, 190]. Um die Rolle einzelner Aminosauren des

Tip-Bindemotivs zu charakterisieren, wurde zunachst ein Ensemble verschiedener Konfor-

mationen des Tip-LynSH3 Komplexes aus einer Trajektorie der MD-Simulation extrahiert.

Arbeiten von Massova und Kollman haben gezeigt, dass eine Punktmutation zu Alanin keine

signifikanten konformationellen Anderungen in der Komplexstruktur hervorrufen sollte [164],

so dass Alanin direkt vor der energetischen Analyse in die Strukturen eingefuhrt werden kann.

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76 5. Diskussion

Der Vorteil hierbei ist, dass nicht fur jeden einzelnen Austausch eine neue Simulation durch-

gefuhrt werden muss und somit der Rechenzeitaufwand relativ klein gehalten wird. Dennoch

wurden auch hier mehrere Simulationen ausgehend von verschiedenen Startstrukturen zur

besseren statistischen Absicherung der Ergebnisse durchgefuhrt.

Die entsprechenden in silico Vorhersagen wurden anschließend experimentell verifiziert, wobei

sich qualitativ eine gute Korrelation fur die Wichtigkeit der einzelnen Aminosauren aus Tip

fur die Bindung ergab: R182>L179>L186>G187>T176>N185. Der Austausch von R182,

L179 bzw. L186 im Tip-Bindemotiv gegen Alanin zeigte, dass die Verkurzung der Seitenkette

zu einer Verschlechterung der Bindungsaffinitat fuhrt (Tab. 4.2).

R182 zeigte sowohl in der statischen Struktur (Abb. 5.1) als auch wahrend der gesamten MD-

Simulation eine stabil ausgebildete Salzbrucke zu D26 in LynSH3. Durch die Verkurzung der

Seitenkette ging diese starke elektrostatische Wechselwirkung verloren, was sich letztendlich in

der Bindungsenergie widerspiegelte (Tab. 4.4). Die Seitenketten von L186 und L179 besetzen

zwei hydrophobe Taschen (Abb. 5.1). Die Verkurzung der Seitenkette zu einer Methylgruppe

fuhrte wie erwartet zu einer schlechteren Bindungsaffinitat (Tab. 4.4). Die Aminosaure an

Position 185 ließ sowohl in der statischen Struktur (Abb. 5.1) als auch in der MD-Simulation

keine spezifischen Wechselwirkungen zu LynSH3 erkennen. Dies deutet darauf hin, dass dieser

Rest fur die Bindung an die SH3-Domane nicht essentiell ist, was letztendlich auch durch den

in silico Alanin-Scan gezeigt werden konnte (Tab. 4.2).

N185

L186

R182

L179

T176

N

C

Abb. 5.1: Elektrostatisches Oberflachenpotential der LynSH3 im Komplex mit Tip(174-187).

Regionen mit positiver Ladung sind in blau und Regionen mit negativer Ladung in rot eingefarbt. Die nach-

einander zu Alanin ausgetauschten Aminosauren sind farbig hervorgehoben (T176: braun, L179: grun, R182:

blau, N185: orange, L186: gelb). R182 zeigt eine Salzbrucke (grun gestrichelte Linie) zu dem Rest D26 in

LynSH3.

Verglichen mit den experimentellen Befunden (Tab. 4.3) konnte beobachtet werden, dass

der hier durchgefuhrte Alanin-Scan qualitativ den gleichen Trend fur die Bindungsaffinitat

zeigt, wobei die mittels der MM/PBSA-Methode bestimmten ∆∆Gb-Werte generell eher

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5.2. LynSH3-Tip 77

uberschatzt werden. Dies wurde besonders bei dem Austausch von Arginin 182 zu Alanin

deutlich, was auf die Elektrostatik zuruckgefuhrt werden kann. Das Problem, dass vor allem

die Bindungsbeitrage geladener Reste innerhalb der Methode stark uberschatzt werden, ist

bekannt [48,191]. In der Literatur werden derzeit Ansatze diskutiert, wie man die elektrosta-

tischen Wechselwirkungen besser gewichten kann. Moreira und Kollegen fuhrten unterschied-

liche Dielektrizitatskonstanten (ε) fur die Aminosauren ein. Somit bekamen die geladenen

Aminosauren (D, E, K, R und H) ein ε von 4, die polaren Aminosauren (N, Q, C, Y, S und

T) ein ε von 3 und die unpolaren Aminosauren (V, L, I, M und W) ein ε von 2. Dadurch

konnten die berechneten ∆∆Gb-Werte im Vergleich zu den experimentell bestimmten zwar

besser wiedergegeben werden; dennoch zeigte aber weiterhin der Austausch von den geladenen

Resten zu Alanin großere Abweichungen zum experimentell bestimmten ∆∆Gb-Wert [191].

Der Austausch von L186 in Tip gegen Alanin zeigte in der Fluoreszenzspektroskopie kei-

nen großen Effekt auf die Bindungsaffinitat zu der LynSH3 (Abb. 4.8, Tab. 4.3). Alanin,

ebenfalls eine hydrophobe Aminosaure, ist somit in der Lage den Beitrag der Aminosaure

zu kompensieren. Im Gegensatz dazu wurde mittels der MM/PBSA-Methode fur den Aus-

tausch von L186 zu Alanin vorhergesagt, dass die Verkurzung der Seitenkette fur die Bin-

dung nicht vorteilhaft ist (Tab. 4.2). Eine mogliche Erklarung fur die Unterschiede zwischen

computergestutzten und experimentellen Methoden konnte die inadaquate Berucksichtigung

von induced fit Effekten in der MM/PBSA-Methode sein. Alanin wird in der angewandten

Methode direkt vor der Analyse in die Strukturen der MD-Simulation eingefuhrt. Aus diesem

Grund ist es nicht moglich, induced fit Effekte des flexiblen C-Terminus von Tip zu simu-

lieren und somit die Ligandenkonformation nachtraglich zu verandern. L186 bindet in eine

hydrophobe Tasche auf der Oberflache der SH3-Domane (Abb. 5.1). Im Experiment konnen

durch die Effekte des induced fits konformationelle Strukturanderungen von Tip dazu gefuhrt

haben, dass Alanin besser die Tasche ausfullt und somit zu einer hohen Bindungsaffinitat

zwischen Tip und LynSH3 beitragt.

5.2.2 Einfluss der C-terminal flankierenden Reste von Tip bei der Bindung

an LynSH3

Es ist bekannt, dass die Tip-Bindungsaffinitat durch C-terminal flankierende Reste erhoht

wird [74,75]. Hierfur scheinen die Reste L186 und G187 verantwortlich zu sein [74]. Aus diesem

Grund ergab sich die Frage, wie groß die Rolle der beiden Reste bei der Bindung an die SH3-

Domane Lyn ist. Zur Beantwortung dieser Frage wurde mit Hilfe der MM/PBSA-Methode

untersucht, wie stark sich die C-terminale Verkurzung des Tip-Liganden um die Reste L186

und G187 (Tip∆C) auf die Bindung zur SH3-Domane Lyn auswirkt. Hierzu konnte nicht

wie bei dem in silico Alanin-Scan beschrieben auf eine einzige Trajektorie aufgebaut werden.

Zur Untersuchung der Verkurzung wurden parallel zur Simulation der Wildtypstruktur auch

Simulationen mit dem verkurzten Tip-Liganden (LynSH3-Tip∆C) durchgefuhrt. Die Unter-

schiede der Bindungsenergie (∆∆Gb) zwischen LynSH3-Tip und LynSH3-Tip∆C wurden an-

schließend mit der MM/PBSA-Methode berechnet (Tab. 4.6, Abb. 4.10). Die um zwei Reste

verkurzte Tip-Sequenz fuhrte zu einer Verschlechterung der Bindungsaffinitat. Der hierbei be-

rechnete Effekt von -0,8 kcal ·mol−1 liegt in der gleichen Großenordnung wie der experimentell

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78 5. Diskussion

mittels Fluoreszenzspektroskopie bestimmte Wert (∆∆Gb-Wert = -1,77 kcal ·mol−1). Ver-

gleicht man beide Ergebnisse, so ist zu erkennen, dass der mit MM/PBSA bestimmte ∆∆Gb-

Wert die C-terminale Verkurzung ein wenig unterschatzt. Abweichungen um einen Faktor

zwei zwischen experimentellen und computergestutzten Methoden wurden auch in fruheren

Arbeiten beschrieben und liegen somit in dem Bereich der Akkuratheit, die gegenwartig mit

derartigen computergestutzten Vorhersagen fur Systeme erreicht werden kann [187].

Zur Erhohung der Genauigkeit energetischer Berechnungen der Wechselwirkung zwischen

LynSH3 und dem herpesviralen Tip-Protein wurden in dieser Arbeit generell mehrere MD-

Simulationen ausgehend von verschiedenen Startstrukturen durchgefuhrt. Dazu wurden aus

dem in der PDB hinterlegten NMR-Strukturenensemble (PDB: 1WA7, [75]) vier reprasenta-

tive Strukturen ausgewahlt, um Abhangigkeiten von einer einzelnen Startgeometrie zu vermei-

den [153]. Beim Alanin-Scan, bei dem die ∆∆G-Werte fur die Mutation zu Alanin jeweils aus

einer Trajektorie bestimmt wurden, zeigte sich nur ein geringer Einfluss der Startgeometrie auf

die Ergebnisse (Tab. 4.2). Die entsprechende Strategie konnte fur die verkurzten Tip-Peptide

nicht angewandt werden, da aufgrund der großen strukturellen Effekte der Verkurzung und

der expliziten Berechnung von Entropiebeitragen getrennte Simulationen fur LynSH3-Tip und

LynSH3-Tip∆C notwendig waren. Hier zeigte sich eine wesentlich starkere Abhangigkeit der

berechneten ∆∆G-Werte von der Startstruktur (Tab. 4.6). Die Mittelung uber die Werte, die

ausgehend von verschiedenen Startstruktur erhalten wurden, konnten dabei die Genauigkeit

der Vorhersage steigern (Abb. 4.9).

5.2.3 Untersuchung der Rolle von Histidin 41 in LynSH3

Die SH3-Domane der Tyrosinkinase Lyn wird von Tip mit einer deutlich hoheren Affinitat

gebunden, als bei anderen Src-Kinasen beobachtet wurde. Fluoreszenzspektroskopische Un-

tersuchungen haben gezeigt, dass die Verkurzung des Tip-Liganden um die Reste L186 und

G187 die Bindungsaffinitat zu LynSH3 herabsetzt, wohingegen bei LckSH3 keine Anderung

in der Bindungsaffinitat beobachtet wurde [74,75]. Dies zeigt, dass die Reste L186 und G187

mit LynSH3 spezifische Wechselwirkungen ausbilden konnen, die mit anderen SH3-Domanen

nicht moglich sind. Die Seitenkette von L186 ragt in eine hydrophobe Tasche, welche von

den Resten H41, W44 und F57 gebildet wird (Abb. 5.1). Ein Sequenzvergleich mit anderen

SH3-Domanen zeigte, dass die Position 41 in LynSH3 ein Histidin aufweist, wohingegen bei

den anderen Src-Kinasen ein Serin bzw. Threonin vorhanden ist (Abb. 1.3B). Somit scheint

die Position 41 eine besondere Rolle bei der Ligandenbindung einzunehmen. Zur detaillierten

Untersuchung der starkeren Tip-Bindung wurde mit Hilfe der MM/PBSA-Methode die struk-

turelle Besonderheit der Aminosaure an Position 41 in LynSH3 analysiert.

Um zu untersuchen, ob H41 fur die hohere Affinitat bei der Bindung von Tip verant-

wortlich ist, wurden separate Simulationen fur die Mutante Lyn(H41S) im Komplex mit

Tip bzw. den um L186/G187 verkurzten Tip∆C durchgefuhrt. Im Anschluss an die MD-

Simulation wurde die freie Bindungsenergie mit Hilfe der MM/PBSA-Methode bestimmt.

Die hierbei berechneten Unterschiede in der Bindungsenergie zwischen den Komplexsystemen

LynSH3-Tip und Lyn(H41S)-Tip ergaben einen ∆∆Gb-Wert von -1 kcal ·mol−1. Es konnte

beobachtet werden, dass der Effekt des Aminosaurenaustauschs von Histidin zu Serin ahnlich

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5.2. LynSH3-Tip 79

groß ist, wie der Effekt der C-terminalen Verkurzung des Liganden um zwei Aminosauren

(∆∆Gb =-0,84 kcal ·mol−1, Abb. 4.10), wohingegen LynSH3-Tip∆C und Lyn(H41S)-Tip∆C

ungefahr gleich stark binden. Dies unterstreicht die Rolle von H41 fur die hoch affine Bindung

von Tip an die LynSH3.

Dieser Befund, zusammen mit den experimentellen Ergebnissen aus der Fluoreszenzspektro-

skopie, zeigte, dass die Bindungsaffinitat zwischen den Komplexsystemen LynSH3-Tip und

LckSH3-Tip (∆∆Gb = -1,8 kcal) nahezu gleich der Bindungsaffinitat zwischen LynSH3-Tip

und LynSH3-Tip∆C (∆∆Gb = -1,77 kcal) ist [75]. Die hydrophobe Wechselwirkung zwischen

H41 in der LynSH3 und der außerhalb der PPII-Helix gelegenen Aminosaure L186 bietet

somit eine plausible Erklarung fur die starkere Tip-Bindung im Vergleich zu Lck. Die affinere

Bindung von Tip an die SH3-Domane der Tyrosinkinase Lyn kann wichtig werden, wenn Lyn

in der Zelle in einer niedrigen Konzentration vorliegt. Dies ist der Fall bei Herpesvirus saimiri

C488 transformierten T-Zellen, in denen Lck starker als Lyn exprimiert wird [192].

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80 5. Diskussion

5.3 Proteinphosphatase 1

Verschiedenste zellulare Prozesse wie Proteinphosphorylierung, Proteintargeting und Protein-

Protein-Wechselwirkungen werden durch kurze lineare Sequenzmotive vermittelt. Im Rahmen

dieser Arbeit wurden ausgehend von den Motiven KSVTW und RRVSF allgemein die Ami-

nosaurenpraferenzen von PP1γ1-Bindemotiven untersucht. Die an den einzelnen Liganden-

positionen tolerierten Aminosauren wurden zu einem neuen Pattern zusammengefasst.

5.3.1 Eigenschaften des neuen Sequenzmotivs

Die N-terminal im Bindemotiv gelegene Aminosaure an Position +1 reprasentiert einen

Ankerpunkt und bildet eine Vielzahl von Salz- und Wasserstoffbrucken zur Oberflache der

Proteinphosphatase aus. Mittels MD-Simulationen konnte gezeigt werden, dass wahrend der

gesamten Simulationszeit stabile polare Wechselwirkungen ausgebildet waren (Abb. 4.13C,

4.14C). Die dabei dominierende Rolle der Salzbrucken erklart, warum nur positiv geladene

Aminosauren an Position +1 toleriert werden (Abb. 4.15). Im Gegensatz dazu bildet die

Position +2 im RRVSF-Motiv nur wenige stabile Salzbrucken aus (Abb. 4.13D). Dies deu-

tet darauf hin, dass die Interaktionen an dieser Position weniger wichtig sind als die an

der Ligandenposition +1. Ein Anzeichen dafur ist ebenfalls, dass die Wechselwirkungen an

Position +2 teilweise durch das Ausbilden von Wasserstoffbrucken ersetzt werden konnen,

wie es bei der polaren aber ungeladenen Aminosaure Serin in der KSVTW-Sequenz der Fall

ist (Abb. 4.14D).

Die Unterschiede in Bezug auf Stabilitat und Anzahl der polaren Wechselwirkungen, die

wahrend der MD-Simulation ausgebildet wurden, geben eine plausible Erklarung, warum die

Proteinphosphatasebindung mit Arginin +2 dennoch eine hohere Affinitat liefert als fur Serin

+2 (siehe Abb. 4.13D und 4.14D). Serin zeigte wiederum eine hohere Affinitat gegenuber Ami-

nosauren ohne polaren Seitenketten (Abb. 4.16). Es kann davon ausgegangen werden, dass

polare Wechselwirkungen an Position +2 wichtig aber nicht essentiell fur eine PP1γ1-Bindung

sind. Diese Unterschiede in der Praferenz der ersten beiden Aminosauren im Bindemotiv sind

konsistent mit Mutationsstudien [106, 167], welche gezeigt haben, dass eine Serindeletion im

KSVTW-Motiv die Bindung zur Proteinphosphatase aufhebt. Die Deletion von +2 bewirkt

ein Verschieben im Bindemotiv, so dass die Position +1 von einem ungeladenen Glutamin

und die Position +2 von dem positiv geladenen Lysin eingenommen wird. Somit ergab sich

das Motiv QKVTW. Dieses Motiv ist nicht befahigt, an die PP1γ1 zu binden [106]. Die

Deletionsmutante unterstreicht somit die Ungleichwertigkeit von Position +1 und +2. Lysin

an Position +2 ist demnach nicht in der Lage solche stabile Wechselwirkungen auszubil-

den, wie es fur Position +1 in der MD-Simulation gezeigt wurde (siehe Abb. 4.14C). Das

zuvor in der Literatur beschriebene Motiv [KR][X]0−1[VI]{P}[FW] wurde hierbei zu einem

falschen Ergebnis fuhren, da das vier Aminosaurenmotiv KVTW unabhangig von N-terminal

gelegenen Glutamin diesen Konsensus erfullen wurde. Wie aber das Experiment gezeigt hat,

ist QKVTW im Gegensatz zu KSVTW nicht in der Lage an PP1γ1 zu binden [106].

Im Gegensatz zu der Aminosaurenpraferenz fur positiv geladene und polare Aminosauren an

den ersten beiden Motivpositionen, bevorzugt die Position +3 die hydrophobe Aminosaure

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5.3. Proteinphosphatase 1 81

Valin (Abb. 4.17 und 4.18). An Position +4 wird eine hohere Sequenzvariabilitat mit Ten-

denz fur basische und ungeladene aliphatischer Seitenketten beobachtet (Abb. 4.19), wohin-

gegen an Position +5 nur die Seitenketten von aromatischen und unpolaren Aminosauren

Phenylalanin und Tryptophan toleriert werden (Abb. 4.20). Diese Erkenntnisse erlauben die

Definition eines exakteren Bindemotivs fur PP1γ1 regulierte Proteine.

5.3.2 Rolle von Aminosauren außerhalb des Bindemotivs

In einer vor kurzem durchgefuhrten Studie wurde gezeigt, dass der nukleare Proteinphos-

phataseinhibitor NIPP1 an der Position +4 alle Aminosauren mit der Ausnahme von Prolin

toleriert [193]. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu den Befunden dieser und fruherer

Arbeiten, in denen gezeigt wurde, dass Mutationen von Serin oder Threonin an der Position

+4 zu Alanin, Valin oder Glutamat eine PP1γ1-Bindung verhindern (Abb. 4.19) [106, 167].

Die Diskrepanz innerhalb der Motive kann durch die Rolle von Aminosauren außerhalb

des klassischen Bindemotivs erklart werden. In der Literatur wird beschrieben, dass so-

wohl N-terminal flankierende positiv geladene Reste [167, 193, 194] als auch sekundare

Bindungsstellen [172, 173, 193], die in der Sequenz weiter vom Bindemotiv entfernt liegen,

die Bindungsaffinitat erhohen konnen bzw. eine Bindung niederaffiner Partner ermoglichen.

Die zuvor beschriebene Unstimmigkeit in der Aminosaurenpraferenz des NIPP1-Bindemotivs

(RVXF) und der KSVTW-Bindesequenz aus mGluR7b an Position +4 lasst sich durch das

Vorhandensein von drei N-terminal gelegenen Argininen und Lysinen in NIPP1 erklaren.

Tatsachlich konnte gezeigt werden, dass N-terminal vom Interaktionsmotiv gelegene basische

Reste die Affinitat steigern konnen [167]. So ist es naheliegend, dass diese den ungunstigen

Effekt der Aminosaure an Position +4 in NIPP1 kompensieren konnen.

Eine weitere Moglichkeit zur Steigerung der Affinitat der PP1γ1-Bindung ist die Anwesenheit

weiterer Bindungsregionen auf der Proteinoberflache, welche auch die niedrige Affinitat des

primaren Sequenzmotivs zu seiner Bindungsstelle kompensieren konnen.

Ein Beispiel dafur zeigt sich in der Kristallstruktur der PP1δ im Komplex mit MYPT1 [104].

In dem Bindemotiv TKVKF von MYPT1 werden an den ersten beiden Positionen keine

spezifischen Wechselwirkungen ausgebildet. Dies lasst vermuten, dass diese Aminosauren

keine dominante Rolle bei der Bindung zur Phosphatase spielen. Tatsachlich wurde die

TKVKF-Sequenz nicht mit dem neuen Sequenzmotiv gefunden [167], was in Analogie zu dem

untersuchten QKVTW-Motiv der Deletionsmutante des KSVTW-Bindungsmotivs steht. Wie

gezeigt wurde, ist das QKVTW-Motiv nicht zur PP1γ1-Bindung befahigt [106]. Da beide

Motive recht ahnlich sind, aber trotz allem eine Bindung fur TKVKF nachgewiesen wurde,

lasst sich vermuten, dass das Motiv allein nicht fahig ist, einen festen MYPT1-PP1δ-Komplex

zu bilden. Dies ist konsistent mit der Existenz einer zusatzlichen (nicht-kanonischen) Bin-

dungsstelle, die raumlich weit entfernt vom TFVKF-Interaktionsort liegt [104].

Die Existenz von zusatzlichen Bindungsstellen auf der Enzymoberflache konnte somit

erklaren, warum eine Reihe der PP1γ1-Bindungspartner mit dem neuen Pattern nicht

abgedeckt werden. Bei diesen Kandidaten konnten Wechselwirkungen zusatzlich durch

sekundare Motive vermittelt werden.

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82 5. Diskussion

Die Eigenschaften von zusatzlichen Bindungsstellen sind bisher nur mangelhaft charakteri-

siert, so dass fur diese kein zuverlassiges Profil fur die Datenbanksuche erstellt werden kann.

Das neu vorgeschlagene Motiv [HKR][ACHKMNQRSTV][V][CHKNQRST][FW] wurde fur

eine spezifische Datenbanksuche optimiert, welche falsch-positive Treffer ausschließen soll.

Obwohl dieses Pattern nicht alle Bindungspartner der Proteinphosphatase vorhersagt, wer-

den hierbei die Proteine mit hoher Affinitat identifiziert, die allein uber das Bindemotiv

interagieren konnen.

5.3.3 Vorhersagegenauigkeit des neuen Patterns

Die Ergebnisse zur Sensitivitatsuntersuchung (Abschnitt 4.3.7) haben gezeigt, dass das in die-

ser Arbeit aufgestellte Pattern [HKR][ACHKMNQRSTV][V][CHKNQRST][FW] im Vergleich

zu dem in der Literatur beschriebenen Sequenzmotiv [KR][X]0−1[VI]{P}[FW] eine niedrigere

Sensitivitat aufweist. Das neue, restriktiv gestaltete Pattern wurde entwickelt, um eine hohe

Spezifitat zu erreichen. Das weniger restriktive Motiv [KR][X]0−1[VI]{P}[FW] wird bei einer

Datenbanksuche die Mehrheit aller Wechselwirkungspartner von PP1γ1 finden. Dies schließt

aber auch eine Vielzahl von Proteinen mit ein, welche nicht an die Proteinphosphatase bin-

den (falsch-positive) oder sekundare Interaktionsmotive zur Affinitatssteigerung benotigen.

Im Gegensatz dazu wird mit dem neu aufgestellten Pattern eine Untermenge der PP1γ1-

Bindungspartner identifiziert, in welchen das Motiv selbst fur eine affine Bindung ausreicht

(Abb. 4.21 und Tab. 4.8 ).

Die hohere Spezifitat, die durch ein restriktives Pattern erreicht wird, ist vor allem bei einer

genomweiten Datenbanksuche von Vorteil, deren Resultate fur experimentelle Tests genutzt

werden sollen. Eine Datenbanksuche hat gezeigt, dass im Genom der Ratte die neue Se-

quenz [HKR][ACHKMNQRSTV][V][CHKNQRST][FW] zirka 8,5 mal weniger vorkommt als

das bisher in der Literatur beschriebene Sequenzmotiv [KR][X]0−1[VI]{P}[FW]. Wahrend die

Datenbanksuche mit dem neuen Pattern 186 Treffer erzielte, wurden mit dem bisherigen

Motiv 1578 Proteine gefunden. Auch die kleinere Trefferzahl war fur experimentelle Verifi-

zierung und weitere Untersuchung im Rahmen der Arbeit noch zu groß. Aus diesem Grund

wurden Filterroutinen eingefuhrt, welche die moglichen Bindungspartner einschranken und

somit eine experimentell noch testbare Menge liefern. Mit Hilfe der Filterroutinen konnten

so die moglichen Wechselwirkungspartner um mehr als 55 % reduziert werden (Abschnitt

4.3.7.1). Basierend auf den in Tabelle 4.8 zusammengefassten experimentellen Untersuchun-

gen lasst sich abschatzen, dass durch die Spezifitat des neuen Sequenzmotivs ca. 90 % der

vorhergesagten Interaktionspartner tatsachlich auch PP1γ1 binden konnen. Im Gegensatz da-

zu lieferte das zuvor in der Literatur beschriebene Motiv nach Anwendung der Filterprozedur

immer noch mehr als 700 Treffer. Diese Anzahl ist fur weitere experimentelle Untersuchungen

zu groß. Zusatzlich konnte durch die experimentellen Bindungsstudien gezeigt werden, dass

das weniger restriktive Pattern deutlich mehr falsch-positive Treffer liefert als das neue (Tab.

4.8).

Eine Verringerung von falsch-positiven Treffern konnte in Zukunft durch Einfuhrung zusatz-

licher Filterprozeduren erreicht werden, welche unter anderem die zellulare Lokalisation von

Proteinen untersuchen. Hierbei konnten Proteine ausgeschlossen werden, die fur die Protein-

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5.3. Proteinphosphatase 1 83

phosphatase unzuganglich sind, wie Transmembranregionen, globulare Domanen und extra-

zellularen Regionen. Solche Filter existieren bereits in Bioinformatikprogrammen wie dem

Eukaryotic Linear Motif -Server (http://elm.eu.org). Der Vorteil von Suchfiltern wird aus

der im Abschnitt 4.3.7.2 durchgefuhrten Analyse deutlich, welche nach dem Ausfiltern nur

ein Protein als Bindungspartner der PP1γ1 falschlicherweise vorschlug (Tab. 4.8 und Abb.

4.21). Dieses Protein besitzt KNVTF als Sequenzmotiv, welches sich tief verborgen in ei-

ner globularen Domane von Thrombospondin befindet und deshalb nicht fur die PP1γ1-

Wechselwirkung zuganglich ist.

5.3.4 Entwicklung einer Strategie zur Verfeinerung von Bindemotiven

In dieser Arbeit wurde eine neue Strategie entwickelt, um Bindemotive zu verfeinern, welche

eine spezifische Datenbanksuche ermoglichen. Hierbei wurde ein kombinierter Ansatz aus Mo-

lekulmodellierung, MD-Simulation und Experiment angewendet.

Die Positionen im PP1γ1-Bindemotiv wurden nacheinander mit Modelling Methoden bear-

beitet. Hierbei wurden verschiedene Aminosauren eingefuhrt und analysiert, inwiefern sie die

Fahigkeit besitzen, an der jeweiligen Position eine PP1γ1-Bindung zu begunstigen bzw. zu

ermoglichen. Des Weiteren wurden MD-Simulationen durchgefuhrt, um transiente Wechsel-

wirkungen zu identifizieren und somit die Wertigkeit der einzelnen Ligandenpositionen, an

denen elektrostatische Wechselwirkungen eine Rolle spielen, abschatzen zu konnen. Hierbei

konnte beispielsweise gezeigt werden, dass basische Reste an Position +2 im Bindemotiv im

Vergleich zu Position +1 nicht essentiell fur die Bindung sind, da wahrend der MD-Simulation

keine stabilen elektrostatischen Wechselwirkungen gebildet wurden (Abb. 4.13 und 4.14). Die

in silico Befunde wurden anschließend im Laborexperiment verifiziert. Hierbei konnte ge-

zeigt werden, dass die in den Computeranalysen als potentielle Kandidaten identifizierten

Aminosauren richtig vorhergesagt wurden. Zusatzlich konnte ebenfalls nachgewiesen werden,

dass in den computergestutzten Untersuchungen als nicht tolerierbar eingestufte Aminosau-

ren tatsachlich eine Bindung des Liganden verhindern. Durch den kombinierten Ansatz ist

es moglich, den Suchraum der zu untersuchenden Aminosauren einzuschranken, so dass im

Laborexperiment weniger Aminosauren getestet werden mussen.

Eine weitere Moglichkeit, die Wertigkeit der Aminosauren abzuschatzen und somit Aus-

sagen uber die Aminosaurenpraferenzen zu erlangen, bietet die MM/PBSA-Methode, wie sie

zum Teil in anderen Abschnitten dieser Arbeit durchgefuhrt wurde. Das PP1γ1-Bindemotiv

enthalt in der Sequenz polare Reste, was haufig zu Problemen mit dieser Methode fuhren

kann, wie es bei der Analyse der Wechselwirkung von LynSH3-Tip beobachtet wurde (Ab-

schnitt 4.2.1). Daher wurde hier mit in silico Methoden nur eine qualitative Analyse und

keine Quantifizierung der Bindungsstarken durchgefuhrt.

Experimentell lassen sich Bindungsaffinitaten quantitativ mit Hilfe der Fluoreszenzmessung

erhalten. Aufgrund der Tatsache, dass PP1γ1 von seinen Bindungspartnern mit sehr hoher Af-

finitat gebunden wird, ist es nicht moglich, die Bindungsaffinitat mittels Fluoreszenzmessung

zu bestimmen. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit die Affinitat uber das detektierte

Proteinsignal im Western Blot im Vergleich zur eingesetzten Proteinkonzentration bestimmt.

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84 5. Diskussion

Durch die neue Strategie war es moglich ein neues, experimentell getestetes Pattern aufzu-

stellen [167], das sich fur genomweite Datenbanksuchen eignet. Hierbei wurden nur Ami-

nosauren aufgenommen, die eine affine Bindung mit PP1γ1 ermoglichen, was eine deutliche

spezifischere Datenbanksuche erlaubte.

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5.4. HIV-1 Protease 85

5.4 HIV-1 Protease

Durch antiretrovirale Therapie wurde der naturliche Verlauf der HIV-Erkrankung positiv

durch bessere Uberlebenschancen aber auch negativ durch Entstehung von Resistenzen be-

einflusst. Das Virus versucht dem Druck auszuweichen und entwickelt so Resistenzen gegen

die Wirkstoffe. Bei Versagen der antiretroviralen Therapie mit dem Wirkstoff Amprenavir

wurde in einigen Patienten die Mutation E35D nachgewiesen. Diese Mutation befindet sich

außerhalb des aktiven Zentrums und somit ist nicht direkt erklarbar, wie es zur Resistenz-

vermittlung kommt.

In einer vergleichenden Analyse von 73 Rontgenstrukturen, welche unterschiedliche Muta-

tionen aufwiesen, konnten Zoete und Kollegen zeigen, dass Mutationen generell nur einen

geringen Einfluss auf die Struktur der Protease haben [128]. Diese Beobachtungen fuhrten

zu der Hypothese, dass die Mutationen primar die Dynamik der Protease beeinflussen. In

den vergangenen Jahren konnten mit Hilfe von Molekuldynamik-Simulationen bereits in-

teressante Einblicke in den molekularen Mechanismus der Resistenzentwicklung sowohl von

Mutationen innerhalb als auch außerhalb des aktiven Zentrums erlangt werden [129,130,195].

Zur Untersuchung der strukturellen Auswirkungen der Mutation E35D wurden sowohl fur die

Wildtyp- als auch fur die mutierte HIV-1 Protease sechs MD-Simulationen von 10 ns Lange

durchgefuhrt. Die Startstrukturen wurden auf Basis hochaufgeloster Rontgenstrukturen (1,9-

2,3 A) erstellt (Abschnitt 3.2.2.4).

Vergleicht man den RMSD der Systeme, so zeigten alle ahnlich große Abweichungen zur je-

weiligen Startstruktur (Abb. 4.23). Die dabei beobachteten Anderungen der Ruckgratatome,

welche am Ende der MD-Simulation bei ca. 1,0-1,9 A lagen, wurden ebenfalls in vorange-

gangenen Computersimulationen zur HIV-1 Protease beschrieben [129, 130, 196]. Die MD-

Simulationen lieferten somit am Ende der Simulationszeit sechs stabile Trajektorien fur die

weiteren Analysen.

5.4.1 Lokale Auswirkungen der E35D Mutation

Die Aminosaure Glutamat 35 bildete sowohl in der Rontgenstruktur als auch innerhalb der

Simulation eine stabile Salzbrucke zu Arginin 57 aus (Abb.4.24 und 4.25). Biophysikalisch

besitzt Aspartat sehr ahnliche Eigenschaften wie Glutamat. Dies lasst vermuten, dass die

elektrostatische Wechselwirkung bei diesem Austausch erhalten bleibt. Mittels Molecular

Modelling wurde Aspartat an Position 35 eingefugt. Die kurzere Seitenkette von Aspartat

verglichen zum Glutamat fuhrte aber dazu, dass die geladenen Gruppen der beiden Reste

einen großeren Abstand aufwiesen, was einen ersten Hinweis auf schwachere Interaktionen

lieferte. Deshalb wurde die elektrostatische Wechselwirkung zwischen den beiden Resten in

der Simulation untersucht. Wahrend die Wildtypstruktur sowohl in der freien als auch in

der gebundenen Protease eine stabile Salzbrucke aufweist, wurden großere Fluktuationen in-

nerhalb der mutierten Systeme beobachtet (Abb. 4.25). Diese lokale Anderung der Struktur,

welche durch die Mutation hervorgerufen wird, spiegelt sich auch in der Abnahme der Inter-

aktionsenergie wider (Tab. 4.9).

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86 5. Diskussion

5.4.2 Effekte der Mutation E35D auf die Flaps der HIV-1 Protease

Die Mutation E35D fuhrte zu einer lokalen Anderung in der Struktur der HIV-1 Protease, so

dass die im Wildtyp stabil ausgebildete Salzbrucke im mutierten System deutlich schwacher

ausgepragt war. Wie sich diese lokalen Effekte auf die globale Struktur auswirken, wurde

anschließend untersucht. Arginin 57 befindet sich in einem antiparallelen β-Faltblatt, welches

einen Teil der beweglichen Schleifenregionen (Flaps) darstellt (Abb. 1.6). Die Flaps reprasen-

tieren einen funktionell wichtigen Bereich der HIV-1 Protease. Nach der Substratbindung

gehen sie von einer offenen in eine geschlossene Konformation uber, wodurch der Zugang

zum aktiven Zentrum verschlossen wird [197] und somit die Katalyse erfolgen kann. In Ront-

genstrukturen wurde gezeigt, dass die Liganden uber Wasserstoffbrucken mit den Flaps der

Protease verbunden sind [154, 155]. Diese polaren Wechselwirkungen konnten ebenfalls in

dieser Arbeit beobachtet werden (Abb. 4.22). Das hierbei ausgebildete Netzwerk von Was-

serstoffbrucken wirkt stabilisierend auf die Liganden. Die Verbindungen zu den Flaps werden

bei den Inhibitoren der Protease zum Teil uber ein Wassermolekul vermittelt, wie es auch bei

der Protease mit Amprenavir der Fall ist (Abb. 4.22B).

Mit Hilfe von MD-Simulationen zur freien HIV-1 Protease gelang es Hornak und Simmer-

ling im impliziten Losungsmittelmodell Offnungs- und Schließbewegungen der Flaps auf einer

45 ns Zeitskala zu simulieren [198, 199]. Mutationen in der HIV-1 Protease konnen die Be-

weglichkeit der Flaps beeinflussen und ein schnelleres Offnen der Flaps bedingen [129]. In der

Literatur werden derartige Offnungsbewegungen in Zusammenhang mit Wirkstoffresistenz

diskutiert [129, 200].

Perryman und Kollegen beobachteten in einer 22 ns MD-Simulation eine Offnung der Flaps

bei der freien Protease, welche die Mutationen V82F und I84V aufweist [129]. Am Ende

der Simulationen wurden hierbei Abstande zwischen Ile50(Cα) und Asp25(Cβ) fur die mu-

tierte Struktur gemessen, wie sie bei der halboffenen HIV-1 Protease in der Rontgenstruktur

(1HHP, [201]) vorkommen. Diese Effekte konnten in dieser Arbeit nach einer Simulationszeit

von 10 ns ebenfalls fur die freie HIV-1 Protease, welche die E35D-Mutation tragt, beobach-

tet werden (Abb. 4.26). Hierbei wurden Abstande innerhalb der Ligandenbindungstasche

(I50(Cα)-D25(Cβ)) von großer 20 A eingenommen. Vergleicht man diese Abstande mit den

Ergebnissen von Perryman und Kollegen, so liegen diese in gleicher Großenordnung [129]. In

beiden Simulationen wurde hingegen fur die freie Wildtyp-Protease keine Offnungsbewegung

beobachtet. Dies ist ein Anzeichen dafur, dass die E35D-Mutation der HIV-1 Protease einen

Effekt auf das Gleichgewicht zwischen geschlossener und halboffener Konformation ausubt

und somit einen moglichen Mechanismus zur Resistenzentstehung gegen Wirkstoffe darstellt.

Diese Ergebnisse spiegeln die experimentellen Befunde gut wider. Ishima und Kollegen [195]

konnten mit Hilfe von NMR-Experimenten zeigen, dass die Flaps bei der freien Protease

eine deutlich hohere Mobilitat aufweisen, wobei die konformationellen Anderungen im Sub-

Nanosekunden-Bereich erfolgen.

Offnungsbewegungen, wie in der freien Protease beobachtet wurden, konnten fur die liganden-

gebundene Protease auf dieser Zeitskala nicht gezeigt werden (Abb. 4.27). Werden die pola-

ren Wechselwirkungen in Betracht gezogen, welche von den Flaps zum Liganden ausgebildet

wurden (Abb. 4.22), so ist dies nicht verwunderlich. Diese Wechselwirkungen konnen die Be-

Page 97: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

5.4. HIV-1 Protease 87

weglichkeit der Flaps einschranken, so dass in der Simulationszeit von 10 ns keine Offnung

beobachtet werden kann. Um zu prufen, ob die Mutante zumindest zu lokalen Fluktuationen

fuhrt, wurden zwei Schlusselinteraktionen, die von den Flaps zum Liganden ausgebildet wer-

den, naher untersucht. Die substratgebundene Protease zeigte in der Rontgenstruktur eine

Wasserstoffbrucke, welche zwischen den Resten Glycin 48 und der zweiten Aminosaure im

Substrat (hier I201) gebildet wurde. Wahrend die Wildtypstruktur einen stabilen Abstand

zwischen den beiden Resten aufweist, wurden fur die mutierte Struktur großere Fluktuati-

onen beobachtet (Abb. 4.27A). Dies deutet darauf hin, dass das Substrat nicht mehr so fest

gebunden werden kann, wie in der Wildtypstruktur der Fall ist.

Ein ahnliches Verhalten wurde bei der inhibitorgebundenen Protease beobachtet (Abb.

4.27B). In der Kristallstruktur wurde zwischen dem Amidproton von Isoleucin 50 und dem

Sulfonylsauerstoff (O5) von APV ein Abstand von 3,91 A eingenommen, wohingegen die mu-

tierte Struktur der Protease am Ende der Simulation großere Abstande einnahm, welche im

Bereich von 6,5 A lagen. Die E35D-Mutation fuhrte bei der inhibitorgebundenen Protease zu

lokalen Anderungen der φ/ψ-Winkel und somit zum Verlust des flap waters. Nachdem das flap

water besonders wichtig fur die Stabilisierung des Inhibitors in der Bindetasche ist, kommt es

zu einer schwachen Ligandenbindung (Abb. 4.27). Ein ahnlicher Effekt wird als curling in der

Literatur beschrieben [200], wobei Wechselwirkungen zu den Flaps gestort werden, so dass

diese Stabilisierungen verloren gehen. Sind alle Wechselwirkungen zu den Flaps aufgehoben,

so kann es ebenfalls zu Offnungsbewegungen kommen.

Aufbauend auf den MD-Simulationen wurden quantitative energetische Untersuchungen an

der ligandengebundenen HIV-1 Protease mit Hilfe der MM/PBSA-Methode durchgefuhrt.

Diese Methode dient der Berechnung von Bindungsaffinitaten und wurde bereits erfolgreich

zur Untersuchung von anderen Mutationen der HIV-1 Protease eingesetzt. Dabei wurden

Bindungsenergien ermittelt, die gut im Einklang mit den experimentell beobachteten Resis-

tenzen stehen [187, 196, 202, 203].

Wahrend der MD-Simulation sorgte die Mutation E35D dafur, dass wichtige Interaktionen

zwischen Protein und Ligand verloren gingen. Dies spiegelte sich auch in der schlechteren Bin-

dungsenergie wider (Tab. 4.10). Interessanterweise ist die Abnahme der Interaktionsenergie

bei der substratgebundenen Protease großer, als es bei der inhibitorgebundenen Protease be-

obachtet wurde. Das deutete darauf hin, dass diese Mutation eine negative Auswirkung auf

die katalytische Aktivitat der HIV-1 Protease besitzt.

5.4.3 Selektionsmechanismen, welche die Entstehung der Mutation E35D

begunstigen

Die Mutation E35D zeigte einen starken Effekt auf die Substrataffinitat (Tab. 4.10). So stellte

sich die Frage, ob der Selektionsdruck, welcher durch die Wirkstofftherapie mit APV hervorge-

rufen wird, allein ausreicht, um eine E35D-Mutation zu begunstigen. Daher wurde untersucht,

ob noch weitere Mechanismen existieren, um Selektionsdruck auf das Virus auszuuben, und

somit zur Entstehung von Mutationen beitragen konnen.

In fruheren Studien konnte gezeigt werden, dass zusatzlich zu dem durch die antiretrovirale

Therapie hervorgerufenen Selektionsdruck auch ein immunologischer Druck auf das Virus

Page 98: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

88 5. Diskussion

wirkt und somit ebenfalls eine Ursache fur die Entstehung von Mutationen in der HIV-1

Protease darstellt [204–207]. Der immunologische Druck wird durch das Immunsystem aus-

gelost, wobei das Humane Leukozytenantigen (HLA) an ein Peptidepitop bindet, es auf der

Zelloberflache prasentiert und somit zu einer Auslosung der Immunantwort fuhrt. Es ist be-

kannt, dass das HI-Virus in der Lage ist, dem durch das Immunsystem zusatzlich ausgeubten

Selektionsdruck durch Einfuhrung von Mutationen im Epitop zu entkommen [177, 178]. Die-

se sogenannten Fluchtmutationen erschweren den Erkennungsprozess und fuhren so zu einer

Unterdruckung der zellularen Immunantwort.

Die in dieser Arbeit untersuchte Mutation E35D besitzt die Fahigkeit, als Fluchtmutante zu

agieren. Die Aminosaure Glutamat 35 befindet sich in einem Epitop der HIV-1 Protease,

welche die Sequenz EEMSLPGRW aufweist und den Aminosaurenbereich 34-42 umfasst.

Dieses Epitop wird von HLA-B44 erkannt und gebunden [207]. Es wurde untersucht, mit

welcher Wahrscheinlichkeit die E35D von HLA-B44 gebunden wird. Die Epitopvorhersage

mit SYFPEITHI lasst eine schwachere Bindung der Mutante an HLA-B44 erwarten (Tab.

4.11). Dies deutet darauf hin, dass diese Mutation wahrscheinlich dem Virus die”Flucht“

vor dem Immunsystem ermoglicht. Es wird daher erwartet, dass die Mutation gehauft vor-

kommt, wenn sowohl durch die antiretrovirale Therapie hervorgerufene Selektionsdruck als

auch ein immunologischer Druck gemeinsam in einem infizierten Wirt existieren. Die hier

durchgefuhrten Vorhersagen, die eine Rolle von E35D als Fluchtmutation nahelegen, konnten

inzwischen experimentell von Muller und Kollegen bestatigt werden [207].

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6 Zusammenfassung

Proteininteraktionen spielen praktisch bei allen biologischen Prozessen eine wesentliche Rolle.

Um die zugrunde liegenden molekularen Vorgange zu verstehen, ist es notwendig die Struk-

tur und Dynamik von Proteinen auf atomarer Ebene zu charakterisieren. In der vorliegenden

Arbeit wurde eine Reihe von Proteininteraktionen eingehend mit verschiedenen in silico und

in vitro Methoden untersucht.

Die Koordination von Ablaufen in biologischen Systemen erfordert das Vorhandensein ver-

schiedener Signalubertragungswege, die untereinander in Wechselwirkung stehen und exakt

reguliert werden mussen. Die Tyrosinkinasen der Src-Familie, die am Anfang vieler Signalwege

stehen unterscheiden sich trotz ihrer großen strukturellen Ahnlichkeit in ihren physiologischen

Funktionen. In fruheren Arbeiten wurde bereits gezeigt, dass die Flexibilitat des SH3-SH2

Domanenlinkers kritisch fur die relative Orientierung von SH3- und SH2-Domane ist. Im

Rahmen dieser Arbeit wurde mit Hilfe von Molekuldynamik-(MD)-Simulationen untersucht,

ob die Flexibilitat des SH3-SH2 Linkers einen globalen Einfluss auf die Struktur und Dynamik

von Src-Kinasen hat. Hierzu wurde die starre SH3-SH2 Linkersequenz aus Hck in der Struktur

der inaktiven Kinase durch die flexiblere Linkersequenz aus Lck ersetzt. Dies fuhrte in MD-

Simulationen zu einer erhohten Flexibilitat im Vergleich zur Wildtyp-Hck und somit zu einer

verringerten Fahigkeit des regulatorischen Domanenpaars die Kinasedomane in der inaktiven

Konformation zu fixieren. Des Weiteren fuhrte der Austausch des SH3-SH2 Domanenlinkers

zu konformationellen Anderungen im Aktivierungssegment der Kinasedomane. Die hierbei

eingenommenen alternativen Konformationen zeigten Ahnlichkeiten zur Konformation der

Tyrosinkinase Abl, die nach Bindung des Inhibitors Glivec eingenommen wird. Die Sequenz

des SH3-SH2 Linkers konnte demzufolge nicht nur die Modulation der Kinaseaktivitat, son-

dern auch die Ligandenbindungseigenschaften im aktiven Zentrum von Src-Kinasen beein-

flussen. Dies konnte erklaren, warum Lck im Gegensatz zu den anderen Src-Kinasen durch

Glivec gehemmt werden kann.

Die Aktivierung der Src-Kinasen kann unter anderem durch die Bindung von Liganden

an die regulatorischen Domanen vermittelt werden. Zur Charakterisierung der Determi-

nanten der Affinitat und Spezifitat der molekularen Erkennung wurden MD-Simulationen

und darauf aufbauende energetische Analysen durchgefuhrt. Als Modellsystem wurde hier

die Wechselwirkung zwischen dem Tip-Protein aus Herpesvirus saimiri und der SH3-

Domane der Tyrosinkinase Lyn (LynSH3) gewahlt. Tip bindet mit dem Sequenzmotiv

(175PTPPLPPRPANLG187), welches eine PPII-Helix beinhaltet, an die SH3-Domane. Mit

Hilfe eines in silico Alanin-Scans wurde die Rolle aller Nicht-Proline bei der LynSH3-

Bindung analysiert. Die dabei erhaltene Reihenfolge der Wichtigkeit fur die Bindung

89

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90 6. Zusammenfassung

(R182>L179>L186>G187) konnte anschließend experimentell mittels fluoreszenzspektro-

skopischer Messungen bestatigt werden. Außerdem konnte ein modifizierter Ansatz entwickelt

werden, der durch die Berucksichtigung entropischer Beitrage auch fur die Deletion von termi-

nalen Aminosauren zuverlassige Aussagen uber Bindungsaffinitaten liefert. Mit dieser Strate-

gie konnte gezeigt werden, dass die Verkurzung des Tip-Peptids um die Reste L186/G187 bei

der LynSH3-Bindung zu einer schlechteren Bindung fuhrt, wohingegen bei homologen SH3-

Domanen kein Effekt beobachtet wurde. Es konnte weiter gezeigt werden, dass die Wechsel-

wirkungen zwischen L186/G187 in Tip und H41 in LynSH3 maßgeblich zu einer Steigerung

der Bindungsaffinitat beitragen.

Das koordinierte Zusammenspiel zwischen Kinasen und Phosphatasen stellt einen wich-

tigen regulatorischen Mechanismus in biologischen Systemen dar. Die Proteinphosphatase 1

(PP1γ1), eine der bedeutendsten Serin-/Threonin-Phosphatasen, erreicht ihre enzymatische

Aktivitat und Substratspezifitat durch die Bindung verschiedener Interaktionspartner. Diese

Interaktion wird primar uber ein funf Aminosauren langes Sequenzmotiv vermittelt, dessen

Eigenschaften bislang nur unzureichend charakterisiert waren, was die Identifizierung neuer

Wechselwirkungspartner erschwerte. In der vorliegenden Arbeit wurde das PP1γ1-Bindemotiv

mit Hilfe von in silico (Modelling und MD-Simulation) und in vitro (GST-Pulldown) Ana-

lysen eingehend charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Aminosaure an Position

+1 einen Ankerpunkt reprasentiert, da sie ein Netzwerk von Salz- und Wasserstoffbrucken

zur PP1γ1 bildet. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Positionen +1 und +2 im

Bindemotiv positiv geladene bzw. polare Aminosauren tolerieren. Im Gegensatz dazu ließ die

Position +3 eine deutliche Praferenz fur Valin erkennen. Die großte Variabilitat innerhalb des

Bindemotivs konnte an der Position +4 beobachtet werden, wohingegen an Position +5 nur

die Seitenketten der unpolaren und aromatischen Aminosauren Phenylalanin und Trypto-

phan toleriert wurden. Durch den kombinierten Ansatz und die systematische Analyse jeder

einzelnen Position des PP1γ1-Bindemotivs war es somit moglich ein spezifisches Interaktions-

motiv [HKR][ACHKMNQRSTV][V][CHKNQRST][FW] aufzustellen. Die Brauchbarkeit die-

ses Motivs fur genomweite Suchen konnte anschließend durch die Identifizierung und experi-

mentelle Verifizierung neuer PP1γ1-Interaktionspartner bestatigt werden.

Die HIV-1 Protease, ein Enzym des HI-Virus, ist essentiell fur die Bildung reifer Viruspar-

tikel. Somit stellt die Protease ein außerst wichtiges Zielmolekul fur die Entwicklung von

Wirkstoffen gegen die Immunschwachekrankheit AIDS dar. Eines der Hauptprobleme der

antiretroviralen Therapie ist die schnelle Entwicklung von Resistenzen gegen die eingesetzten

Wirkstoffe, welche haufig auf Mutationen der HIV-1 Protease zuruckzufuhren sind. Zur Ent-

wicklung effektiver und lang anhaltender Wirkstoffe ist es wichtig die Resistenzmechanismen

zu verstehen. In dieser Arbeit wurde die Mutation E35D, welche unter anderem im Zusam-

menhang mit dem Inhibitor Amprenavir (APV) beschrieben wird, untersucht. Um einen Ein-

blick in den Resistenzmechanismus zu erhalten, wurden sowohl fur den Wildtyp als auch fur

die Mutante MD-Simulationen der freien, inhibitor- und substratgebundenen Protease durch-

gefuhrt. Im Verlauf der Simulationen wurde fur die mutierte HIV-1 Protease eine hohere Fle-

xibilitat von Schleifenbereichen (Flaps) sichtbar, die Teil der Ligandenbindungstasche sind.

Dies wirkte sich bei der freien Protease auf das Gleichgewicht zwischen geschlossener und halb-

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91

offener Konformation aus, wohingegen bei der ligandengebundenen Protease intermolekulare

Wechselwirkungen gestort wurden. Energetische Analysen zeigten, dass die E35D Mutation

zu einer signifikanten Erniedrigung der Bindungsenergien fur Liganden fuhrt und somit die

beobachtete Resistenzentstehung erklaren kann. Weiterfuhrende Analysen zeigten, dass die

Aminosaure E35 auch in einem Epitop liegt, das fur die Erkennung des Virus durch das

Immunsystem wichtig ist. Das Virus kann durch Mutationen im Epitop den Erkennungspro-

zess erschweren und so zu einer Unterdruckung der Immunantwort fuhren. Die Ergebnisse

der Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Mutation E35D sowohl Resistenz gegen

Proteaseinhibitoren vermittelt als auch eine”Flucht“ vor der Erkennung durch das Immun-

system ermoglicht.

Letztendlich konnte im Rahmen dieser Arbeit mittels einer Kombination aus Modelling, MD-

Simulationen und Experiment ein besserer Einblick in Proteininteraktionen bei verschiedenen

biologischen Systemen gewonnen werden.

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92 6. Zusammenfassung

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7 Summary

Protein interactions play an essential function in virtually all biological processes. To under-

stand the underlying molecular principles it is important to characterize the structure and

dynamics of proteins on an atomic level. In this work, different protein interactions were

analyzed with various in silico and in vitro methods.

The coordination of activity in biological systems requires the existence of different signal

transduction pathways that interact with one another and must be precisely regulated. The

Src-family members of tyrosine kinase, which are found at the beginning of a many signal

pathways, differ in their physiological function despite their large structural similarity. In

previous work, it was shown that the flexibility of the SH3-SH2 domain linker is critical for

the relative orientation of the SH3 and SH2 domains. In this thesis, the global effect of the

flexibility of the SH3-SH2 linker on the structure and dynamics of Src kinases was analyzed

using of molecular dynamics (MD) simulations. For this purpose, the rigid SH3-SH2 linker

sequence of inactive Hck kinase structure was replaced with the more flexible linker sequence

from Lck. In the MD simulations, this lead to a higher flexibility in comparison to the wild-

type Hck, which, in turn, reduced the regulatory domain pair’s ability to fixate the kinase

domain in the inactive conformation. Furthermore, the exchange of the SH3-SH2 domain

linker lead to conformational changes in the activation segment of the kinase domain. The

resulting alternative conformation showed similarities to the conformation of the tyrosine ki-

nase Abl when bound to the inhibitor Glivec. Thus, the sequence of the SH3-SH2 linker can

not only modulate the kinase activity, but can also influence the ligand binding properties of

the active site of Src kinases. This could explain why Lck is, in contrast to other Src kinases,

inhibited by Glivec.

One possibility to activate the Src kinases is the binding of ligands to the regulatory do-

mains. To characterize the affinity and specificity determinants of the molecular recognition,

MD simulations and, subsequently, energetic analyses were performed. The interaction be-

tween the Tip protein of Herpesvirus saimiri and the SH3 domain of tyrosine kinase Lyn

was chosen as a model system. Tip binds to the SH3 domain by using the sequence motif

(175PTPPLPPRPANLG187), which contains a PPII-helix. The role of all non-prolines was

analyzed with the help of an in silico alanine scan. The resulting order of importance with

respect to the binding (R182>L179>L186>G187), could be experimentally verified using

fluorescence spectroscopy. In addition, by taking entropic contributions into account, a modi-

fied approach which allows reliable statements about the effect of terminal ligand truncations

was developed. By using this strategy, it was shown that the truncation of the Tip pep-

tide by the L186/G187 residues leads to a lower binding affinity for LynSH3. In contrast,

93

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94 7. Summary

when binding the truncated Tip peptide to homologous SH3 domains, no changes in the

binding affinities were detected. It could furthermore be shown that the interaction between

L186/G187 in Tip and H41 in LynSH3 significantly increases the binding affinity.

The coordinated interplay between kinases and phosphatases represents a fundamental reg-

ulatory mechanism in biological systems. Protein phosphatase 1 (PP1γ1), a major ser-

ine/threonine phosphatase, regulates its enzymatic activity and substrate specificity by ac-

quisition of different binding partners. These interactions are primarily mediated by a five

residue sequence motif, the properties of which are thus far not well characterized. Detailed

knowledge of its sequence properties would greatly facilitate the identification of new inter-

action partners. In this work, the PP1γ1 docking motif was thoroughly characterized with a

combination of in silico (molecular modeling, MD simulations) and in vitro (GST pull-down)

analysis. It was shown that the amino acid at position +1 represents a key anchor point of

the motif, as it forms a network of salt bridges and hydrogen bonds to PP1γ1. In addition, it

could be shown that positions +1 and +2 of the docking motif prefer positively charged and/or

polar residues. In contrast, the position +3 clearly favors the hydrophobic amino acid valine.

The largest sequence variability was observed at position +4, whereas position +5 only toler-

ates the unpolar and aromatic side chains of phenylalanine and tryptophan. By using a com-

bined approach and performing a systematic analysis of each individual position of the PP1γ1

docking motif, the specific interaction motif [HKR][ACHKMNQRSTV][V][CHKNQRST][FW]

could be defined. The usefulness of this motif for genome-wide searches was subsequently

tested by identifying and experimentally verifying previously unknown PP1γ1 interactors.

The HIV-1 protease, an enzyme of the HI virus, is essential for replication and assembly of

the virus. This property makes it an important target for the design of antiviral agents for

AIDS treatment. A major problem of the current HIV therapies is the rapid development of

resistance to antiretroviral drugs by genetic mutation. It is necessary to understand the re-

sistance mechanism in order to develop more effective and longer lasting treatment regimens.

In this thesis, the mutation E35D, which has been described in context with the inhibitor

amprenavir (APV), was analyzed. To gain insight into the resistance mechanism, molecular

dynamics simulations of the wild-type’s as well as the mutant’s free, inhibitor complexed, and

substrate complexed proteases were performed. In the course of the simulations, an increased

flexibility of the mutated HIV protease’s flaps, which are parts of the binding pocket, could

be observed. This affects the conformational equilibrium between the closed and semiopen

conformations of the free protease, whereas in the ligand bound protease some intermolecular

interactions are disrupted. Energetic analysis showed that the E35D mutation also causes

a significant reduction of the calculated ligand binding energies, thus giving a plausible ex-

planation for its ability to develop resistance. Further analysis showed that the amino acid

E35 is also located in an epitope which is important for the recognition of the virus by the

immune system. Mutations in the epitope allow the virus to hamper the recognition process,

thereby suppressing an immune system response. The results of the investigation suggest

that the E35D mutation conveys resistance against protease inhibitors and also allows the

virus to escape immune system recognition.

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95

In conclusion, a combination of modeling, MD simulations, and experiments allowed a more

comprehensive insight in protein interactions of several different biological systems in the

course of this thesis.

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96 7. Summary

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114 Literaturverzeichnis

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A Abkurzungen und Einheiten

A.1 Abkurzungen

Abb. Abbildung

AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome

APV Amprenavir (Proteaseinhibitor VX-478)

AS Aminosaure

BI Abteilung Bioinformatik, Institut fur Biochemie

bzw. beziehungsweise

ca. zirka

CIP CIP-Pool der medizinischen Biochemie

COOH- carboxy-

ε Dielektrizitatskonstante

ff force field

G Gibbs’sche freie Energie

Glivec Handelsname des Tyrosinkinaseinhibitors STI-571 (Imatinib)

4-[(4-Methyl-1-piperazinyl)methyl]-N-[4-methyl-3-[[4-(3-pyridinyl)-

2-pyrimidinyl]amino]-phenyl]benzamid

GST Glutathion-S-Transferase

HAART Highly Active Anti-Retroviral Therapy

HIV Human Immunodeficiency Virus

HLA Humanes Leukozytenantigen

Hck Hamatopoetische Zell-Kinase

Lck Lymphozyten spezifische Tyrosinkinase

Lyn lck/yes-related novel tyrosine kinase

MD Molekuldynamik

Mut Mutante

MM/PBSA Molecular Mechanics Poisson-Boltzmann Surface Area

NMR Nuclear Magnetic Resonance

n.t. nicht getestet

PDB Protein Data Bank

PI Proteaseinhibitor

PP1 Tyrosinkinaseinhibitor

1-ter-butyl-3-p-tolyl-1h-pyrazolo(3,4-d)pyrimidin-4-ylamine

PP1γ1 Proteinphosphatase 1γ1

PPII-Helix Polyprolin-Helix Typ II

115

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116 A. Abkurzungen und Einheiten

PR Protease

RESP Restrained Elektrostatic Potential

RMSD Mittlere quadratische Standardabweichung Root Mean Square Derivation

RRZE Regionales Rechenzentrum Erlangen

RT Raumtemperatur

Tab. Tabelle

Tip Tyrosine kinase interacting protein

SH2 Src-Homologie 2

SH3 Src-Homologie 3

SUB Substrat

WT Wildtyp

z. B. zum Beispiel

A.2 Aminosauren: Ein- und Dreibuchstabencode

Aminosaure Dreibuchstabencode Einbuchstabencode

Alanin Ala A

Cystein Cys C

Asparaginsaure Asp D

Glutaminsaure Glu E

Phenylalanin Phe F

Glycin Gly G

Histidin His H

Isoleucin Ile I

Lysin Lys K

Leucin Leu L

Methionin Met M

Asparagin Asn N

Prolin Pro P

Glutamin Gln Q

Arginin Arg R

Serin Ser S

Threonin Thr T

Valin Val V

Tryptophan Trp W

Tyrosin Tyr Y

A.3 Einheiten

A Angstrom (1 A = 10−10 m) fs Femtosekunde (1 fs = 10−15 s )

nm Nanometer (1nm = 10−9 m) ps Picosekunde (1 ps = 10−12 s)

K Kelvin (0K = −273, 15�

) ns Nanosekunde (1ns = 10−9 s)

kcal Kilokalorie (1 kcal = 4, 186 kJ)

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B Proteinsysteme

B.1 Hck-Kinase

Die Hck-Kinase wurde mit einem niedermolekularen Inhibitor (PP1) kristallisiert. Fur die

molekulardynamischen Untersuchungen wurden die fehlenden Parameter und Ladungen wie

im Methodenteil beschrieben generiert.

B.1.1 PP1.frcmod

MASS

BOND

ANGLE

DIHE

IMPROPER

c3-ca-na-nb 1.1 180.0 2.0 Using default value

ca-na-ca-nb 1.1 180.0 2.0 Using default value

h5-nb-ca-nb 1.1 180.0 2.0 Using default value

ca-nb-ca-nh 1.1 180.0 2.0 Using default value

ca-hn-nh-hn 1.1 180.0 2.0 Using default value

ca-ca-ca-ca 1.1 180.0 2.0 Using default value

ca-ca-ca-nb 1.1 180.0 2.0 Using default value

ca-ca-ca-ha 1.1 180.0 2.0 Using default value

NONBON

B.1.2 PP1.prepin

0 0 2

molecule.res

PP1 XYZ 0

CORRECT OMIT DU BEG

0.0000

1 DUMM DU M 0 -1 -2 0.000 .0 .0 .00000

2 DUMM DU M 1 0 -1 1.449 .0 .0 .00000

3 DUMM DU M 2 1 0 1.522 111.1 .0 .00000

4 C14 c3 M 3 2 1 1.540 111.208 180.000 -0.434

5 H11 hc E 4 3 2 1.085 39.927 -3.540 0.103

6 H12 hc E 4 3 2 1.082 125.463 -79.544 0.103

7 H13 hc E 4 3 2 1.082 122.721 76.147 0.103

117

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118 B. Proteinsysteme

8 C13 c3 M 4 3 2 1.530 68.322 178.629 0.631

9 C15 c3 3 8 4 3 1.534 109.502 -59.252 -0.434

10 H14 hc E 9 8 4 1.085 109.724 59.532 0.103

11 H15 hc E 9 8 4 1.085 110.430 -59.672 0.103

12 H16 hc E 9 8 4 1.081 111.388 179.511 0.103

13 C16 c3 3 8 4 3 1.535 109.568 62.424 -0.434

14 H17 hc E 13 8 4 1.081 111.333 -179.545 0.103

15 H18 hc E 13 8 4 1.085 110.354 59.618 0.103

16 H19 hc E 13 8 4 1.085 109.711 -59.527 0.103

17 N1 na M 8 4 3 1.483 109.053 -178.410 -0.047

18 N4 nb E 17 8 4 1.354 121.077 -1.469 -0.493

19 C2 ca M 17 8 4 1.342 128.597 -179.808 0.710

20 N2 nb M 19 17 8 1.340 127.547 -1.618 -0.828

21 C1 ca M 20 19 17 1.304 112.684 -178.133 0.697

22 H1 h5 E 21 20 19 1.075 116.154 -179.586 0.040

23 N3 nb M 21 20 19 1.330 128.910 1.123 -0.874

24 C4 ca M 23 21 20 1.323 118.181 -1.175 1.045

25 N5 nh B 24 23 21 1.348 117.059 179.730 -1.026

26 H2 hn E 25 24 23 0.994 120.076 -162.982 0.422

27 H3 hn E 25 24 23 0.996 116.155 -11.715 0.422

28 C3 ca M 24 23 21 1.410 119.412 -1.026 -0.750

29 C5 ca M 28 24 23 1.434 140.027 178.250 0.425

30 C6 ca M 29 28 24 1.482 129.959 4.797 -0.007

31 C7 ca M 30 29 28 1.388 121.244 46.646 -0.148

32 H4 ha E 31 30 29 1.076 119.915 0.398 0.156

33 C8 ca M 31 30 29 1.389 120.685 179.135 -0.278

34 H5 ha E 33 31 30 1.076 119.134 -179.518 0.164

35 C9 ca M 33 31 30 1.385 121.067 -0.262 0.278

36 C12 c3 3 35 33 31 1.512 121.508 179.832 -0.387

37 H8 hc E 36 35 33 1.085 111.111 123.567 0.110

38 H9 hc E 36 35 33 1.083 111.301 3.278 0.110

39 H10 hc E 36 35 33 1.086 111.040 -116.868 0.110

40 C10 ca M 35 33 31 1.393 117.998 -0.210 -0.278

41 H6 ha E 40 35 33 1.077 119.493 -179.764 0.164

42 C11 ca M 40 35 33 1.380 121.256 0.324 -0.148

43 H7 ha E 42 40 35 1.073 120.180 -179.896 0.156

LOOP

C5 N4

C3 C2

C11 C6

IMPROPER

C13 C2 N1 N4

C3 N1 C2 N2

H1 N2 C1 N3

C3 N3 C4 N5

C4 H2 N5 H3

C2 C4 C3 C5

C3 C6 C5 N4

C5 C7 C6 C11

Page 129: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

B.1. Hck-Kinase 119

C6 C8 C7 H4

C7 C9 C8 H5

C12 C8 C9 C10

C9 C11 C10 H6

C6 C10 C11 H7

DONE

STOP

Page 130: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

120 B. Proteinsysteme

B.2 LynSH3: In silico Alanin-Scan

In den wahrend der MD-Simulation gespeicherten Strukturen des Wildtypkomplexes LynSH3-

Tip wurde vor der energetischen Analyse die zu untersuchende Aminosaure in Alanin kon-

vertiert und anschließend die Bindungsenergie mittels der MM/PBSA-Methode bestimmt.

Die freie Bindungsenergie und ihre Einzelbeitrage sind fur die Tip-Alaninmutanten im Kom-

plex mit LynSH3 in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst. Nummer der jeweiligen

Startstruktur gemaß der Benennung im NMR-Ensemble.

Tabelle B.1: Freie Bindungsenergie von LynSH3-Tip(Alaninmutanten) (in kcal mol−1) Die Bin-

dungsenergie wurde mittels der MM/PBSA-Methode (Abschnitt 3.2.7.3) berechnet. ∆Gb = ∆Gvdwint +∆Geleint+∆Gnonpolarsol + ∆Gelesol.

(A) T176A

System ∆Gvdwint ∆Geleint ∆Gnonpolarsol ∆Gelesol ∆Gb

Struktur 5 -53,34 -151,02 -4,24 176,88 -31,72Struktur 10 -62,65 -142,52 -4,78 175,67 -34,28Struktur 15 -49,42 -121,20 -3,95 146,21 -28,36Struktur 20 -58,13 -148,51 -4,68 178,02 -33,30

(B) R182A

System ∆Gvdwint ∆Geleint ∆Gnonpolarsol ∆Gelesol ∆Gb

Struktur 5 -48,14 -35,92 -3,65 65,44 -22,27Struktur 10 -59,70 -27,86 -4,17 63,23 -28,50Struktur 15 -44,86 -18,99 -3,45 44,51 -22,79Struktur 20 -51,74 -35,89 -3,92 67,01 -24,54

(C) N185A

System ∆Gvdwint ∆Geleint ∆Gnonpolarsol ∆Gelesol ∆Gb

Struktur 5 -55,27 -152,59 -4,53 180,09 -32,12Struktur 10 -64,64 -143,93 -4,86 178,20 -35,23Struktur 15 -51,22 -122,53 -4,04 148,75 -29,03Struktur 20 -59,39 -150,00 -4,73 179,90 -34,22

(D) L186A

System ∆Gvdwint ∆Geleint ∆Gnonpolarsol ∆Gelesol ∆Gb

Struktur 5 -51,23 -151,88 -4,05 176,29 -30,87Struktur 10 -58,51 -142,27 -4,35 173,80 -31,33Struktur 15 -46,85 -122,14 -3,70 145,12 -27,57Struktur 20 -54,98 -149,34 -4,31 176,59 -32,04

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C Protokolle

C.1 LEaP: Generierung der Topologie- und Koordinaten-dateien

Die notwendigen Topologie- und Koordinatendateien wurden mit LEap erstellt. Alle hier-

zu notwendigen Schritte konnen mit Hilfe einer Eingabedatei automatisiert werden. Hierfur

wurde folgende Datei benutzt, welche jeweils an das entsprechende Proteinsystem angepasst

wurde. Aufruf der Datei ist wie folgt: tleap -f Dateiname.tleap

source leaprc.ff99

source leaprc.gaff

# Einladen zusaetzlicher Parameter

loadoff Y2P_Cmod.lib

loadamberparams frcmod_y2p_Cmod

loadamberprep PP1.prepin

loadamberparams PP1.frcmod

# Einladen der PDB-Struktur

system = loadpdb 1qcf.pdb

alignaxes system

# Neutralisierung

addions2 system Na+ 0

# Hinzufuegen einer TIP3P-Wasserbox

solvatebox system WATBOX216 10

# Speichern der Koordinaten- und Topologiefiles

saveamberparm system Hck.top Hck.crd

quit

Je nach System war es teilweise notwendig zusatzliche Parameter fur Liganden (APV, PP1)

bzw. Phosphoaminosauren, die in Form einer frcmod vorliegen, einzuladen.

HIV-1 Protease im Komplex mit dem Inhibitor APV:

� frcmod: APV.frcmod

� prepin: APV.prepin

Hck-Kinase mit phosphorylierten Tyrosinrest:

� frcmod: frcmod y2p Cmod

� Bibliothek: Y2P Cmod.lib

Hck-Kinase mit Tyrosinkinaseinhibitor PP1:

� frcmod: PP1.frcmod

� prepin: PP1.prepin

121

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122 C. Protokolle

C.2 Minimierung

In der vorliegenden Arbeit erfolgte eine dreiphasige Energieminimierung der Proteinsysteme.

Hierzu dienten folgende Input-Dateien. Abweichungen in einzelnen Parametern sind im Me-

thodenteil beschrieben. Die Minimierung wurde mit dem in AMBER enthaltenen Modul

sander durchgefuhrt.

1. Phase: Protein wurde fixiert

&cntrl

imin = 1, maxcyc = 500, dxm = 0.25,

ncyc = 250, cut = 10, ntr = 1,

&end

keep all atoms frozen

500.0

RES 1 451

END

END

2. Phase: Proteinrueckgrat fixiert

&cntrl

imin = 1, maxcyc = 500, dxm = 0.25,

ncyc = 250, cut = 10, ntr =1,

&end

Restrain the protein backbone atoms

500.0

FIND

* C * *

* CA * *

* N * *

* O * *

SEARCH

RES 1 451

END

END

3. Phase: alle Fixierungen geloest

&cntrl

imin = 1, maxcyc = 500,

ncyc = 250, cut = 10,

cut = 10,

&end

Page 133: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

C.3. Aquilibrierung und Produktion 123

C.3 Aquilibrierung und Produktion

Die Aquilibrierungsphase dient zur Einstellung der Simulationsbedingungen.

&cntrl

imin = 0, nstlim = 10000, nsnb = 15,

ntt = 1, Temp0 = 298, tempi = 50.0,

ntb = 2, ntp = 1, ntp = 1,

taup = 0.01, ntc = 2, ntf = 2,

ntpr = 500, ntwx = 1000, ntwe = 1000,

ntwr = 1000, cut = 10, dt = 0.001,

ntr = 0,

&end

Nach Einstellung eines dynamischen Gleichgewichts erfolgte die Produktionsphase.

&cntrl

irest = 1, nstlim = 1000000, nsnb = 15,

ntt = 1, ntx = 5, Temp0 = 298,

tempi = 298, taup = 1, ntb = 2,

ntp = 1, ntc = 2, ntf = 2,

ntpr = 500, ntwx = 1000, ntwe = 1000,

ntwr = 1000, cut = 10, dt = 0.001,

&end

Page 134: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

124 C. Protokolle

Page 135: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

Danksagung

Zum Gelingen dieser Arbeit haben viele Menschen direkt oder indirekt beigetragen. An dieser

Stelle mochte ich die Gelegenheit nutzen, allen denen zu danken, die mich in den vergangenen

Jahren unterstutzt haben.

Ich mochte mich bei Prof. Dr. Heinrich Sticht fur die Moglichkeit, meine Dissertation

am Institut fur Biochemie der Medizinischen Fakultat anfertigen zu konnen, bedanken. Au-

ßerdem danke ich Ihm fur die interessante Themenstellung, seine Unterstutzung sowie die

hilfreichen Diskussionen die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.

Vielen Dank auch an Prof. Dr. Tim Clark fur die Ubernahme des Zweitgutachtens.

Dr. Ralf Enz mochte ich fur die freundliche Aufnahme im Labor, die Bereitstellung der

Konstrukte sowie fur die sehr gute Kooperation danken.

Ein besonderes Dankeschon geht an meine Gruppenmitglieder Nadine Homeyer, Christian

Weyer, Holger Dinkel, Christoph Jardin und naturlich auch Anselm Horn. Die vielen

Diskussionen, die guten Ratschlage und die wertvollen Anregungen haben einen wesentlichen

Beitrag zu dieser Arbeit geleistet. An dieser Stelle mochte ich mich nochmal besonders bei

Holger bedanken, der mir viele neue Dinge bei der Computeradministation beigebracht hat.

Holger Schmidt, am Forschungszentrum in Julich danke ich fur die Einarbeitung am Fluo-

reszenzspektroskop und die Uberlassung der aufgereinigten SH3-Domane.

Allen Mitarbeitern am Institut fur Biochemie vor allem aber den Leuten vom dritten Stock,

welche uns in ihrem Kaffeezimmer freundlich aufgenommen haben, danke ich fur das gute

Klima, die netten Gesprache und Diskussionen.

Ferner mochte ich aber auch meiner alten Arbeitsgruppe im CCC danken, vor allem Dr.

Harald Lanig, der mir die Welt des Molecular Modelling naher brachte, Dr. Olaf Othersen

und Florian Haberl fur die zahlreichen Diskussionen und Ratschlage. Ein Dankeschon geht

auch an das HPC-Team des RRZEs, fur die Pflege des Rechenclusters.

Weiterhin danke ich der DFG, insbesondere dem SFB466 und SFB473 fur die finanzielle Un-

terstutzung der Promotion.

Ganz herzlich danken mochte ich meinen Freunden fur die netten Ablenkungen nach der

Arbeit und die aufmunternden Worte in schweren Zeiten.

125

Page 136: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

Bisher gibt es nur wenige, die fast jeden Satz meiner Arbeit kennen – Jana Oertel, Nadine

Homeyer und Philipp Janda gehoren dazu. Ich danke Euch ganz herzlich, dass Ihr Eure

Zeit fur das Korrekturlesen geopfert habt.

Ein besonderer Dank gilt meinen Eltern fur die immer wahrende Unterstutzung wahrend

meines gesamten Studiums bis hin zur Promotion.

Nicht zuletzt ein ganz großes Dankeschon an meinen Freund Jens Wilke, fur die große

Unterstutzung und die endlose Geduld, die er wahrend dieser Arbeit aufgebracht hat.

126

Page 137: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

Publikationen und Tagungsbeitrage

Publikationen

F. Wartha, A.H.C. Horn, H. Meiselbach, S. Sticht (2005). Molecular Dynamics si-

mulations of HIV-1 Protease suggest different Mechanisms Contributing to Drug Resistance.

JCTC 1:315-324.

F. Bauer, K. Schweimer, H. Meiselbach, S. Hoffmann, P. Rosch and H. Sticht (2005).

Structural characterization of Lyn-SH3 domain in complex with a herpesviral protein reveals

an extended recognition motif that enhances binding affinity. Protein Science 14:2487-2498.

H. Meiselbach, S. Sticht, R. Enz (2006). Structural Analysis of the Protein Phosphatase 1

Docking Motif: Molecular Description of Binding Specificities Identifies Interacting Proteins.

Chemistry & Biology 13:49-59.

H. Meiselbach, A.H.C. Horn, T. Harrer, H. Sticht (2007). Insights into amprenavir resi-

stance in E35D HIV-1 protease mutation from molecular dynamics and binding free-energy

calculations. J Mol Model 13(2):297-304.

N. Homeyer, T. Essigke, H. Meiselbach, G.M. Ullmann, H. Sticht (2007). Effect of HPr

phosphorylation on structure, dynamics, and interactions in the course of transcriptional

control. J Mol Model 13(3):431-44.

Tagungsbeitrage

Poster

A.H.C. Horn, F. Wartha, H. Meiselbach, H. Sticht. Understanding HIV-1 protease

inhibition resistance: A computational study. 227th ACS National Meeting, 28. March - 1.

April, Anaheim, CA, USA 2004

F. Wartha, A.H.C. Horn, H. Meiselbach, H. Sticht. A computational approach to the elu-

cidation of molecular mechanisms of primary and secondary HIV-1 protease drug resistance

mutations 18. Darmstadter Molecular Modelling Workshop, 18.-19. May, Erlangen, Germany

2004

127

Page 138: Computergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und ... fileComputergest utzte Untersuchung der Struktur, Dynamik und Energetik von Proteininteraktionen Den Naturwissenschaftlichen

H. Meiselbach, F. Bauer, H. Sticht. Towards a Quantitative Prediction of SH3-Ligand

Affinity. ’Computer Simulation and Theory of Macromolecules’, 22.-24. April, Hunfeld,

Germany 2005

H. Meiselbach, F. Bauer, H. Sticht, Computational Approaches to identify the Determi-

nants of SH3-Binding Specificity. 19. Darmstadter Molecular Modelling Workshop, 03.-04.

May, Erlangen, Germany 2005

R. Enz, H. Meiselbach, J.H. Brandstatter, H. Sticht. Mapping and homology-based

molecular modeling of a binding motif for protein phosphatase 1 in metabotropic glutamate

receptors. FENS-Meeting, 08.-12. Juli, Wien, Austria 2006

H. Meiselbach, A.H.C. Horn, H. Sticht, HIV-1 Protease Drug Resistance: Insights into the

Influence of E35D Mutation Modelling Interactions in Biomolecules II, 5.-9. Sep, Prague,

Czech Republik 2005

H. Meiselbach, A.H.C. Horn, H. Sticht, Effect of a Non-active Site Mutation on the

Dynamics and Ligand Binding Properties of HIV-1 Protease ’Computer Simulation and

Theory of Macromolecules’, 19.-20. May, Hunfeld, Germany 2006

H. Meiselbach, A.H.C. Horn, H. Sticht, Molecular Mechanism of Non-Active Site Mutants

in conferring Drug Resistance to HIV-1 Protease. 367th WE-Heraeus-Seminar, Biomolecular

Simulation: From Physical Principles to Biological Function, 22.-24. May, Bad Honnef,

Germany 2006

128

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Lebenslauf

Personliche Daten

Name: Heike Meiselbach

Geburtsdatum: 06.09.1977

Geburtsort: Erfurt

Familienstand: ledig

Schulausbildung

1984 - 1991 POS35 Thomas Muntzer in Erfurt

1991 - 1994 Realschule 2A in Erfurt

Abschluss: Mittlere Reife

1994 - 1997 Integrierte Gesamtschule in Erfurt

Abschluss: Allgemeine Hochschulreife

Hochschulausbildung

1997 - 2003 Studium der Biologie

an der Friedrich-Alexander-Universitat Erlangen-Nurnberg

2002 - 2003 Diplomarbeit im Computer Chemie Centrum in Erlangen

Thema: Energiebetrachtung am Tet Regulationssystem

Abschluss: Diplom Biologin Univ.

2003 - 2007 Dissertation am Institut fur Biochemie, Emil-Fischer Zentrum

der Universitat Erlangen-Nurnberg

129