Coxsackievirus B3-induzierte Veränderungen des Proteoms ... · In einem „uncoating“ ge-...

FRIEDRICH-SCHILLLER-UNIVERSITÄT JENA

BIOLOGISCH-PHARMAZEUTISCHE FAKULTÄT

DIPLOMARBEIT

zur Erlangung des akademischen Grades

Diplom-Biologe

Coxsackievirus B3-induzierte Veränderungen des Proteoms

der Wirtszelle: Untersuchungen am Zellkulturmodell mit

Hilfe der Zweidimensionalen Gelelektrophorese

vorgelegt von

Marc Carlsohn

geboren am 15. Dezember 1975 in Jena

Jena, April 2004

Selbständigkeitserklärung

Hiermit erkläre ich, die eingereichte Diplomarbeit selbständig verfaßt und keine ande-

ren Hilfsmittel und Quellen als die angegebenen benutzt zu haben.

Alle Zitate sind gekennzeichnet, und alle Abbildungen enthalten nur die originalen

Daten und sind in keinem Fall inhaltsverändernder Bildbearbeitung unterzogen wor-

den.

Alle existierenden Exemplare der vorliegenden Diplomarbeit sind in Wort und Bild

übereinstimmend.

Jena, den 23.04.2004

Marc Carlsohn

Betreuer der Arbeit und als Gutachter eingesetzt:

PD Dr. Thomas Munder

Als Zweitgutachter bestimmt:

Prof. Dr. Susanne Grabley

I

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis.........................................................................V

1 Einleitung.........................................................................................1

1.1 Das humanpathogene Coxsackievirus B3 ................................................... 1

1.2 Das Proteom .............................................................................................. 5

1.3 Die Zweidimensionale Gelelektrophorese .................................................. 7

1.4 Zielstellung der Arbeit ............................................................................. 12

2 Material und Methoden ................................................................13

2.1 Material ................................................................................................... 13

2.1.1 Zellkulturen...................................................................................... 13

2.1.2 Verwendeter Virusstamm................................................................. 13

2.1.3 Medien............................................................................................. 13

2.1.4 Puffer und Lösungen ........................................................................ 13

2.1.4.1 Puffer und Lösungen für die Zellkultur......................................... 13

2.1.4.2 Lösungen für die TCA/Aceton-Fällung......................................... 14

2.1.4.3 Lösungen für die Bradford-Proteinbestimmung ............................ 14

2.1.4.4 Äquilibrierlösungen...................................................................... 14

2.1.4.5 Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE (als zweite

Dimension der 2D-Gelelektrophorese).......................................... 14

2.1.4.6 Lösungen zum Anfärben der Proteine im PAA-Gel ...................... 15

2.1.4.7 Puffer und Lösungen für den tryptischen In-Gel-Verdau

von Proteinen ............................................................................... 15

2.1.4.8 Puffer und Lösungen für RT-PCR ................................................ 16

2.1.4.9 Lösungen für Western Blot........................................................... 16

2.1.5 Synthetische Oligonukleotide für die PCR........................................ 16

2.1.6 Kits, Enzyme und Marker................................................................. 16

2.1.7 Chemikalien ..................................................................................... 17

2.1.8 Materialien....................................................................................... 18

2.1.9 Geräte .............................................................................................. 18

2.2 Methoden................................................................................................. 19

2.2.1 Kultivierung der Zellen .................................................................... 19

2.2.1.1 Kulturbedingungen....................................................................... 19

II

2.2.1.2 Passagieren der Zellen .................................................................. 19

2.2.1.3 Infektion der Zellen mit CVB3H3 ................................................ 20

2.2.1.4 Elektronische Zellzählung und Vitalitätsbestimmung ................... 20

2.2.1.5 Ernte der Zellen............................................................................ 20

2.2.2 Aufarbeitung des Zellysats ............................................................... 20

2.2.2.1 Ultraschallbehandlung .................................................................. 20

2.2.2.2 Ultrafiltration ............................................................................... 21

2.2.2.3 Aceton/TCA-Fällung, verändert nach Görg et al. .......................... 21

2.2.3 Bradford-Proteingehaltsbestimmung ................................................ 21

2.2.4 Rehydratisierung und Beladung der IPG-Streifen ............................. 22

2.2.5 Isoelektrische Fokussierung.............................................................. 22

2.2.6 Äquilibrierung der IPG-Streifen ....................................................... 23

2.2.7 SDS-PAGE (als zweite Dimension der 2D-Gelelektrophorese)......... 24

2.2.7.1 Herstellung der Gele..................................................................... 24

2.2.7.2 Aufsetzen der IPG-Streifen auf die SDS-Polyacrylamidgele ......... 24

2.2.7.3 Laufbedingungen der SDS-PAGE ................................................ 24

2.2.8 Färben der Polyacrylamidgele .......................................................... 25

2.2.8.1 Coomassie-Blue-Färbung ............................................................. 25

2.2.8.2 Kolloidale Coomassie-Blue-Färbung ............................................ 25

2.2.8.3 Reversible Silberfärbung nach Mann ............................................ 25

2.2.9 Auswertung der Gele und Identifizierung einzelner Proteine ............ 26

2.2.9.1 Bildverarbeitung mit der Proteinanalyse-Software

Proteomweaver............................................................................. 26

2.2.9.2 Trypsin-Verdau ausgeschnittener Proteinspots.............................. 27

2.2.9.3 Peptidmassenanalyse mittels SELDI-Technologie ........................ 28

2.2.9.4 Identifizierung der Proteine mit der Online-Anwendung

ProFound...................................................................................... 29

2.2.10 Reverse Transkription der Gesamt-mRNA (RT-PCR) ...................... 29

2.2.11 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ................................................. 30

2.2.12 DNA-Agarosegel-Elektrophorese ..................................................... 31

2.2.13 Western Blot im Semi dry-Verfahren ............................................... 31

3 Ergebnisse......................................................................................33

3.1 Etablierung der Zweidimensionalen Gelelektrophorese ............................ 33

III

3.1.1 Optimierung einzelner Arbeitsschritte .............................................. 33

3.1.1.1 Vermeidung nachträglicher Proteindegradation ............................ 33

3.1.1.2 Reinigung der Proben ................................................................... 34

3.1.1.3 Vergleich von TCA/Aceton-Fällung und Ultrafiltration ................ 34

3.1.1.4 Proteingehaltsbestimmung............................................................ 35

3.1.1.5 Rehydratisierung der IPG-Streifen................................................ 35

3.1.1.6 Bedingungen der isoelektrischen Fokussierung............................. 36

3.1.1.7 SDS-PAGE-Bedingungen............................................................. 36

3.1.1.8 Vergleich verschiedener Färbemethoden ...................................... 37

3.1.2 Vorgeschlagenes Protokoll für Proteomuntersuchungen des Ge-

samtzellysats von HepG2-Zellen mittels 2D-Gelelektrophorese........ 38

3.1.3 Systembedingte Variabilität des Spotmusters einer Probe................. 39

3.2 Nachweis Coxsackievirus B3-induzierter Änderungen des Protein-

musters von HepG2-Zellen ...................................................................... 40

3.2.1 Veränderungen im Proteom von HepG2-Zellen 12 Stunden

nach Infektion mit CVB3H3............................................................. 42

3.2.1.1 Abschätzung des experimentellen Fehlers..................................... 44

3.2.1.2 Analyse des Proteinmusters CVB3H3-infizierter HepG2-Zellen

und Vergleich mit dem Proteom nichtinfizierter Zellen................. 46

3.2.2 Analyse des ersten Experiments ....................................................... 48

3.2.2.1 Peptidmassenfingerprinting .......................................................... 48

3.2.2.2 Nachweis der infektionsabhängigen posttranslationalen

Modifikation eines Proteins .......................................................... 50

3.2.2.3 Bestätigung der infektionsabhängigen Regulation der

Mitogen-aktivierten Proteinkinase p38 durch RT-PCR............... 51

3.2.3 Analyse des zweiten Experiments..................................................... 52

3.2.3.1 Peptidmassenfingerprinting .......................................................... 52

3.2.4 Übereinstimmend regulierte Proteine................................................ 54

4 Diskussion ......................................................................................55

4.1 Etablierung der Zweidimensionalen Gelelektrophorese ............................ 55

4.1.1 Reproduzierbarkeit der 2D-Gelelektrophorese .................................. 55

4.1.2 Verbesserung des Auflösungsvermögens der Zwei-

dimensionalen Gelelektrophorese ..................................................... 57

IV

4.1.2.1 Solubilisierung der Proteine.......................................................... 57

4.1.2.2 Ultrafiltration oder TCA/Aceton-Fällung? .................................... 58

4.1.2.3 Bedingungen der Isoelektrischen Fokussierung ............................ 59

4.2 Coxsackievirus B3-induzierte Änderungen der Proteinausstattung

von HepG2-Zellen ....................................................................................... 60

4.2.1 Die Zellkultur als Modell ................................................................. 61

4.2.2 Durch 2D-Elektrophorese detektierte Unterschiede .......................... 61

4.2.2.1 Fehlerraten beider Experimente .................................................... 62

4.2.2.2 Die Mitogen-aktivierte Proteinkinase p38 (MAPK p38 ) .......... 63

4.2.3 Ausblick........................................................................................... 65

5 Zusammenfassung.........................................................................67

6 Literatur ........................................................................................69

V

Abkürzungsverzeichnis

2D-PAGE zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Abb. Abbildung

A. bidest. bidestilliertes Wasser

ACN Acetonitril

A. dest. destilliertes Wasser

AP Alkalische Phosphatase

APS Ammoniumpersulfat

AS Aminosäure(n)

BCIP 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat-4-toluidin

bp basepair(s) (Basenpaare)

BSA bovine serum albumin (Rinderserumalbumin)

CAR Coxsackie- und Adenovirus Rezeptor

cDNA complementary DNA (komplementäre DNA)

CHAPS 3-(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio-1-propansulfat

CVB3 Coxsackievirus B3

d day(s) (Tage)

DCM dilatative Kardiomyopathie

DEPC Diethylpyrocarbonat

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

dNTP Desoxynucleosid-5’-triphosphat

dpi dots per inch (Bildpunkte pro Zoll)

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethyldiamintetraessigsäure

Ethidiumbromid 3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylphenanthridiumbromid

IEF isoelectric focussing (Isoelektrische Fokussierung)

IPG immobilized pH-gradient (immobilisierter pH-Gradient)

kb Kilobasen

kDa Kilo-Dalton

LCM Laser Capture Microdissection (Mikrodissektion mit opti-

scher Pinzette)

VI

M Molar

MALDI-TOF MS matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight

mass spectrometry (matrixgestützte Laser-Desorption/Ioni-

sations-Massenspektrometrie mit Flugzeitanalysator))

MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase

MDa Mega-Dalton

min Minute(n)

mind. mindestens

MKK MAPK Kinase

MKKK MKK Kinase

MKS Maul- und Klauenseuche

mRNA messengerRNA (Boten-RNA)

N Normal

NL nichtlinearer pH-Gradient (bei Herstellung der IPG-Streifen

wurden bestimmte Bereiche des Gradienten aufgeweitet)

OD optische Dichte

PAA Polyacrylamid

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PBS mit Phosphat gepufferte NaCl-Lösung

PCR Polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)

pfu plaque forming units (plaquebildende Einheiten pro Flächen-

einheit)

pH pH-Wert

p.i. post infection (nach Infektion)

pI isoelektrischer Punkt

RNA Ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)

rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)

RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse transcriptase-PCR (PCR mit reverser Transkriptase)

SDS sodium dodecyl sulfate (Natriumdodecylsulfat)

SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

sec Sekunde(n)

VII

SELDI Surface enhanced laser desorption ionisation (Oberflächen-

begünstigte Laser-Desorption/Ionisation)

Tab. Tabelle

TAE Tris-Acetat-EDTA

TBS mit Tris gepufferte NaCl-Lösung

TCA Trichloressigsäure

TEMED Tetramethylendiamin

TNFR Tumor necrosis factor receptor (Tumornekrosefaktorrezep-

tor)

TOF time of flight (Flugzeitanalysator)

Tris 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol

U unit (Einheit)

v/v volume/volume (Volumen/Volumen)

w/v weight/volume (Gewicht/Volumen)

Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Das humanpathogene Coxsackievirus B3

Viren sind einfach gebaute Lebensformen mit in der Regel symmetrischer Struktur

(helikal oder ikosaedrisch), die ohne ihre Wirtszellen nicht vermehrungsfähig sind.

Sie verfügen über zwei Grundbestandteile: ein Nukleinsäuremolekül, die Erbinforma-

tion enthaltend, und eine die Nukleinsäure schützende Proteinhülle (Capsid). Das

Capsid besteht aus einer definierten Zahl gleichartiger Capsidbausteine, den Capso-

meren. Einige komplexere Viren sind zusätzlich von einer äußeren Lipidhülle (enve-

lope) umgeben.

Coxsackieviren gehören zur Familie der Picornaviridae, die derzeit ca. 9 Gattungen

mit etwa 230 Serotypen umfaßt (Nestler, 2002). Zu den prominenten Vertretern der

Picornaviren zählen neben den Coxsackieviren beispielsweise die Maul- und Klauen-

seuche hervorrufenden MKS-Viren, Rhinoviren, das Hepatitis A-Virus und Poliovi-

ren. „Picorna“ setzt sich aus dem griechischen Wort für klein („pikos“) und „RNA“

zusammen. Wie der Name schon sagt, besitzen die Picornaviren ein infektiöses RNA-

Genom in Plus-Orientierung, was bedeutet, daß die Virusproteine ohne Zwischen-

schritt von der RNA translatiert werden.

In der Vergangenheit wurden Coxsackieviren anhand der unterschiedlichen bei einer

Infektion hervorgerufenen Krankheitssymptome in die Subklasssen A mit 23 Seroty-

pen und B mit 6 Serotypen unterschieden (Gauntt et al., 1979). Vor drei Jahren er-

folgte eine Neuklassifizierung der Picornaviren auf der Grundlage molekularbiologi-

scher Daten. Nach dieser Systematik werden Coxsackie A-Viren den Spezies Humane

Enteroviren Typ A und C zugeordnet, die Coxsackie B-Viren gehören zu den Huma-

nen Enteroviren vom Typ B (King et al., 2000). Das Virusgenom der Coxsackieviren

kodiert für ein einzelnes Polyprotein von etwa 2100-2400 Aminosäuren Länge. Darin

sind alle Proteine und Informationen enthalten, die das Virus zu seiner Vermehrung

benötigt, unter anderem die vier Capsidproteine VP1 bis VP4 sowie einige Nicht-

strukturproteine, wie zum Beispiel die RNA-abhängige Polymerase und die Proteasen

2A und 3C. Das Polyprotein wird noch während der Translation proteolytisch in seine

einzelnen Komponenten gespalten.

Einleitung

2

Zum Replikationszyklus ist folgendes

bekannt: Nach der Bindung an einen

Zelloberflächenrezeptor („Coxsackie

und Adenovirus Rezeptor“, CAR)

– ein Protein von 46kDa (Lonberg-

Holm et al., 1976) – werden die Vi-

ruspartikel durch Endozytose in das

Innere der Zellen aufgenommen.

Vermutlich der Verstärkung der Ad-

sorption der Viruspartikel an die Ziel-

zellen (Selinka et al., 2002) dient die

Bindung eines weiteren Oberflächen-

proteins, des als Korezeptor funktio-

nierenden Decay Acceleration Faktors (DAF oder CD55). In einem „uncoating“ ge-

nannten Prozeß wird die Virus-RNA von ihrer Capsid-Proteinhülle befreit und gelangt

anschließend durch Poren in der Vesikel-Membran in das Zytoplasma. Aufgrund der

Plusstrangorientierung der RNA wird diese dort durch zelleigene Enzyme direkt

translatiert. Es entsteht zunächst ein großes Vorläuferprotein, bestehend aus über 1200

AS-Resten, von welchem durch die viruseigene Protease 2A zunächst die vier Struk-

turproteine als Einheit abgespalten werden. Eine weitere Protease (Protease 2C) zer-

legt diese Einheit dann in ihre Bestandteile, die Capsidproteine VP0, VP1 und VP3,

wobei sich VP0 anschließend autokatalytisch zu VP2 und VP4 spaltet. Die Protea-

se 2C ist auch für alle weiteren proteolytischen Spaltvorgänge am Polyprotein ver-

antwortlich.

Die RNA-abhängige Polymerase, ebenso ein wichtiger Bestandteil des Picornavirus-

Polyproteins, katalysiert die Synthese des Minus-Stranges der Virus-RNA, welcher

wiederum als Matrize zur Replikation des Virusgenoms dient (Lindberg et al., 1987).

Sind in einer infizierten Zelle genügend Bausteine für neue Viren vorhanden, werden

diese durch „Self-assembly“ zu infektiösen Viruspartikeln zusammengebaut und diese

nach außen abgegeben.

Coxsackieviren sind säurestabil bis zu pH-Werten unter 3. Dies ermöglicht eine fäkal-

orale Übertragung, z.B. infolge mangelhafter Hygiene oder verunreinigten Trinkwas-

sers, weil sie die Passage des Verdauungstraktes schadlos überstehen. Nach einer

Abbildung 1-1 Röntgenstrukturanalyse der

Virushülle. In den Furchen (cañons) wer-

den die CAR/DAF-Rezeptorbindestellen

vermutet.

Einleitung

3

primären Vermehrung in den Dünndarmtonsillen gelangen die Viren in das Blut und

von dort über infizierte Lymphozyten zu ihren Zielorganen.

Coxsackieviren der Gruppe B verursachen neben leichten Erkrankungen des Respira-

tionstraktes mit fiebrigen, grippeähnlichen Symptomen auch schwerwiegende akute

und teilweise chronische Krankheitsbilder, die letalen Ausgang haben können. So sind

Coxsackieviren der Gruppe B eine der Hauptursachen aseptischer Meningitis und

wichtige Auslöser akuter und chronischer Myokarditis sowie akuter Pankreatitis, die

zur vollkommenen Insuffizienz führen kann (Ramsingh, 1997). Serologische Untersu-

chungen zeigen, daß ca. 50% aller Myokarditis-Patienten eine Enterovirus-Infektion

hatten bzw. haben (Martino et al., 1994).

Die akute Phase einer Myokarditis ist gekennzeichnet durch diffus im Herzmuskel

verteilte herdförmige Läsionen mit inflammatorischen Zellinfiltraten. Im Anfangssta-

dium der Myokarditis werden im Rahmen der unspezifischen Immunantwort Ma-

krophagen und natürliche Killerzellen aktiviert. Später wandern T-Helferzellen und

zytotoxische T-Lymphozyten ein (Abb. 1-2) und bilden die spezifische Immunantwort

(Maisch et al., 2000). Die akute Erkrankung kann folgenlos ausheilen. Gelingt es al-

lerdings dem Immunsystem nicht, das Virus vollständig zu eliminieren, kann das Vi-

rus bei verringerter Virulenz persistieren (Hufnagel et al., 1998). Durch immunologi-

sche Kreuzreaktionen sowohl mit viralen als auch mit myokardialen Antigenen kann

es zur Chronifizierung der Erkrankung kommen (Schultheiss et al., 1998). In diesem

Zusammenhang gibt es Hinweise auf Apoptoseprozesse: Durch Induktion des geord-

neten zellulären Selbstmordprogrammes wäre das Virus in der Lage, sich, geschützt

vor dem Zugriff des Immunsystems, in den apoptoseinduzierten Zellfragmenten – den

sogenannten „membrane bound bodies“ – weiterzuverbreiten. So konnte beispielswei-

se unter in-vitro-Bedingungen die Aktivierung des apoptotischen Proteins Caspase 3

als Folge der Infektion mit CVB3 nachgewiesen werden (Carthy et al., 1998). Zudem

wurde in einem Hefe-Zweihybrid-Screening von CVB3-Proteinen mit einer

cDNA-Bank aus HeLa-Zellen eine Interaktion zwischen dem Capsidprotein VP2 und

dem humanen proapoptotischen Protein Siva nachgewiesen (Henke et al., 2000).

An der Ausprägung der viralen Myokarditis – ursprünglich verstanden als überwie-

gend Immunsystem-vermittelt (Mason et al., 1995) – ist das Virus direkt wohl stärker

beteiligt als angenommen. In infizierten Zellkulturen sind starke zytopathische Ef-

fekte nachweisbar (Carthy et al., 1998). Der Herzmuskel immunsupprimierter Mäuse

Einleitung

4

zeigt ausgedehnte nekrotische Bereiche infolge der Infektion mit CVB3 (Chow et al.,

1992).

Als wichtige Langzeit-Folge-Erkrankung der akuten/chronischen Myokarditis wird

das Krankheitsbild der Dilatativen Kardiomyopathie (DCM) angesehen. Infolge der

durch die Infektion verursachten Schäden am Myokard treten fortschreitende Fibro-

sierungsprozesse auf (Abb. 1-2). Fibroblasten wandern in die nekrotischen Läsionen

ein und bilden funktionsunfähige Narben. Die fibrotischen Ventrikelwände unterlie-

gen einer zunehmenden Dilatation, und die Kontraktilität und die Pumpleistung des

Herzens verringern sich deutlich.

a) gesund b) akut infiziert (7d p.i.)

c) gesund d) chronischer Verlauf

Abbildung 1-2 Histologischer Befund einer CVB3-Infektion am Herzmuskel der

Maus. Obere Reihe: Hämatoxylin-Eosin-Färbung. Gewebezerstörung und Infil-

tration inflammatorischer Zellen (dunkel angefärbt) in die Gewebsläsionen kenn-

zeichnen die akute Phase. Untere Reihe: Chronifizierung der Erkrankung, fort-

schreitende Fibrosierung des geschädigten Gewebes (rot angefärbt). Bilder:

A. Henke, FSU Jena

Die Dilatative Kardiomyopathie ist durch eine hohe Letalität gekennzeichnet. Die

Schäden sind oft so gravierend, daß sie zum plötzlichen Herztod des Patienten führen

bzw. eine Herztransplantation notwendig machen. Auf die Ausprägung und den

Schweregrad der Erkrankung hat neben Alter, Geschlecht und Immunstatus des Wirts

auch die Virusvariante im Zusammenspiel mit dem jeweiligen Wirt einen erheblichen

Einleitung

5

Einfluß (Leipner et al., 2000). Allein in den USA werden jährlich etwa 100.000 neue

DCM-Fälle diagnostiziert (Figulla et al., 1995), in Deutschland sind es etwa 20.000.

Obwohl Struktur und Genomorganisation der Coxsackieviren und auch eine Reihe

Wirtszellproteine als Interaktionspartner im Verlauf der Infektion gut bekannt sind,

sind doch die Pathogeneseprozesse wenig verstanden. Der virale Einfluß auf ver-

schiedene Signalmoleküle wurde in mehreren Fällen schlaglichtartig beleuchtet

(Carthy et al., 2003; Henke et al., 2000; Huber et al., 1999). Es ist jedoch wenig be-

kannt darüber, wie die einzelnen Moleküle im Zusammenspiel am komplexen Krank-

heitsgeschehen beteiligt sind. Für ein besseres Verständnis des viralen Replikations-

verlaufs und des pathologischen Potentials der Coxsackieviren wird intensiv nach

weiteren, bisher unbekannten Wirtszellproteinen gefahndet, die als Bindeglieder zwi-

schen einzelnen Signalwegen fungieren. Die Kenntnis solcher Signalmoleküle ist

auch von großem therapeutischem Interesse, weil sie in der Wirkstoffentwicklung

potentielle Zielobjekte für neuartige Medikamente darstellen.

Einen in diesem Zusammenhang vielversprechenden Ansatz beider Suche solcher

Bindeglieder stellt die in der Molekularbiologie immer stärker in den Blickpunkt rük-

kende Proteomforschung dar, deren zentrales Werkzeug die Zweidimensionale Gel-

elektrophorese ist.

1.2 Das Proteom

Der noch relativ junge Begriff proteome (dt. Proteom) wurde auf einer 2D-

Elektrophorese-Tagung 1994 in Siena von dem Australier Marc Wilkins geprägt und

ist ein Kunstwort, welches für „PROTEins expressed by the genOME“ steht (Wilkins

et al., 1997). Damit gemeint ist die Gesamt-Proteinausstattung einer Zelle, eines Ge-

webes oder eines Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt. Die Analogie zu den

Begriffen Genom und Transkriptom soll dies verdeutlichen. Anders als das Genom

einer Zelle ist deren Proteom aber keine feststehende und unveränderliche Größe,

sondern von Zelltyp zu Zelltyp verschieden. Zudem wird es von der Zelle in Reaktion

auf Signale von außen, wie z.B. sich ändernde Mileubedingungen, ständig angepaßt,

indem entbehrliche Proteine abgebaut und benötigte Proteine durch diverse Modifi-

kationen aktiviert oder neu synthetisiert werden.

Einleitung

6

Dabei gibt es eine ganze Reihe von Proteinen, kodiert von den sogenannten Haus-

haltsgenen, die ständig in der Zelle vorliegen. Andere sind (im Falle vielzelliger Or-

ganismen) auf bestimmte Gewebe- oder Zelltypen beschränkt, werden als Antwort

und Anpassung an äußere Umstände de novo gebildet oder liegen als inaktive Vorstu-

fen in der Zelle vor und werden aktiviert. Wenn man das Proteom einer Zelle letztlich

als Momentaufnahme begreift, existieren in der Konsequenz endlos viele Proteome:

nämlich für jeden zellulären Zustand genau eines.

Bis zum Abschluß des humanen Genomprojektes wurden beim Menschen etwa

100.000-120.000 Gene vermutet. Diese Zahl mußte deutlich nach unten revidiert wer-

den. Tatsächlich umfaßt das menschliche Genom nur ca. 30.000-35.000 Gene. In der

Zahl der Gene unterscheiden wir uns damit nur unwesentlich von der Maus, deren

Genom auf ebenfalls etwa 35.000 Gene geschätzt wird. Auch die in den Genen von

Mensch und Maus verschlüsselte Information ist in erstaunlich hohem Maße überein-

stimmend. So wurde von 731 vorhergesagten Genen des Maus-Chromosoms 16 nur

für 14 Gene kein Homolog im humanen Genom gefunden, was einer Übereinstim-

mung von über 98 % auf der Ebene der Gene im untersuchten Umfang gleichkommt

(Mural et al., 2002). Inwieweit sich die offensichtlichen phänotypischen Unterschiede

zwischen beiden Säuger-Arten aus diesen Zahlen erklären lassen, ist umstritten.

Zunehmend rückt deshalb die Ebene der Proteine in den Fokus der Aufmerksamkeit.

Denn aus einem Gen können durch alternatives Spleißen und verschiedene post-

translationale Modifikationen (wie z.B. Glycosylierung, Acetylierung, Phosphorylie-

rung) zahlreiche Proteinspezies entstehen. Die Gesamtheit der Proteinspezies des

Menschen, sein „theoretisches Proteom“, wird auf etwa 300.000-1.000.000 geschätzt

und ist damit weitaus höher als die Zahl der menschlichen Gene (Lottspeich and Zor-

bas, 1998). Diese Zahl, sowie die raumzeitlichen Expressions-, Modifikations- und

Interaktionsmuster der Proteinspezies eines Organismus stellen, so wird vermutet, ei-

ne eigene Komplexitätsstufe oberhalb des Genoms dar (Lottspeich and Zorbas, 1998).

Der Ansatz der globalen Erforschung des Proteoms in seiner Komplexität und Dyna-

mik, d.h. die Charakterisierung möglichst vieler Proteine, die unter bestimmten Be-

dingungen in der Zelle vorliegen, hat sich sehr schnell zu einer eigenen Fachrichtung,

der Proteomforschung bzw. Proteomik, entwickelt. Das raumzeitliche Expressions-

muster aller Proteine einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus zu untersu-

chen und deren Erscheinen oder Verschwinden bestimmten Ereignissen, Zuständen

oder Einflüssen zuzuordnen, ist also das Ziel der Proteomforschung.

Einleitung

7

1.3 Die Zweidimensionale Gelelektrophorese

Um das komplexe Proteinmuster einer Zelle oder eines Organismus befriedigend dar-

zustellen und reproduzierbar auszuwerten, ist eine sensitive und verläßliche Methodik

unumgänglich. Zentraler Bestandteil des Methodenarsenals der Proteomik ist die

zweidimensionale Gelelektrophorese. Sie ist derzeit die empfindlichste Methode zur

Auftrennung komplexer Proteingemische (Görg et al., 2000).

Das erste Mal wurden Proteine in zwei Dimensionen 1956 von Smithies und Poulik

getrennt (Smithies and Poulik, 1956). Sie separierten Serum-Proteine mittels einer

Kombination aus Papier- und Stärkegel-Elektrophorese. Das der modernen Form der

2D-Elekrophorese zugrundeliegende Prinzip wurde bereits 1975 durch Farrell, Klose

und Scheele eingeführt (Klose, 1975; O´Farell, 1975; Scheele, 1975). Es besteht aus

der Trennung eines Proteingemisches in zwei voneinander unabhängigen Schritten.

Zunächst erfolgt eine Isoelektrische Fokussierung (IEF), bei der die Proteine in einem

pH-Gradienten entsprechend ihrer isoelektrischen Punkte separiert werden. Als Isoe-

lektrischer Punkt (pI) ist derjenige pH-Wert definiert, an dem alle positiven und ne-

gativen Teilladungen eines Proteins sich aufheben, d.h. seine Nettoladung gleich Null

ist. In einem zweiten Schritt erfolgt die Trennung der derart separierten Proteine nach

Molekulargewicht durch eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE).

Dies geschieht senkrecht zur IEF (Abb. 1-3). Das entstehende, durch geeignete De-

tektionsmethoden (z.B. durch Anfärben der Proteine im Polyacrylamidgel) sichtbar zu

machende, zweidimensionale Proteinmuster kann mehrere Tausend Proteine pro Gel

umfassen. O´Farell separierte bereits über 1.000 Escherichia coli-Proteine und disku-

tierte die Nutzung der 2D-Gelelektrophorese zur Darstellung posttranslationaler Mo-

difikationen (O´Farell, 1975).

Ein optimales hochauflösendes und reproduzierbares Ergebnis hängt allerdings von

sehr vielen Parametern ab, und über die Jahre sind zahlreiche Publikationen erschie-

nen, die sich mit methodischen und gerätetechnischen Verbesserungen zur Erhöhung

der Auflösung und der Reproduzierbarkeit beschäftigten. Erst in den letzten Jahren,

vor allem bewirkt durch die Verwendung sogenannter Immobiline für die IEF, hat die

2D-Gelelektrophorese stark an Bedeutung gewonnen und ihre derzeitige überragende

Stellung in der Proteomforschung eingenommen. Einige wichtige Innovationen auf

diesem Wege sollen im Folgenden kurz dargestellt werden.

Einleitung

8

Abbildung 1-3 Schematische Darstellung der 2D-Gelelektrophorese. Die Trennung eines

Proteingemisches erfolgt zuerst entsprechend der individuellen isoelektrischen Punkte in

einem pH-Gradient (erste Dimension – Fokussierung). Die fokussierten Proteine werden

anschließend mit SDS beladen, auf ein SDS-Gel übertragen und senkrecht zur Fokussie-

rung nach Molekülmasse getrennt (zweite Dimension).

1970 kombinierten Kenrick und Margolis eine native Isoelektrische Fokussierung mit

einer Gradienten-SDS-PAGE, um Serum-Proteine zu separieren (Kenrick and Mar-

golis, 1970). Fünf Jahre später erschienen die schon erwähnten Arbeiten von Klose,

O´Farell und Scheele, in denen die 2D-Gelelektrophorese zu ihrer prinzipiell noch

heute gültigen Form weiterentwickelt wurde, bei der die IEF unter denaturierenden

Bedingungen, d.h. einer Harnstoff-IEF, erfolgt. Zur Erzeugung des für die IEF not-

wendigen pH-Gradienten wurden Trägerampholyte benutzt. Hierbei erfolgt zunächst

die Synthese eines heterogenen Gemisches von Isomeren aliphatischer Oligoamino-

Oligocarbonsäuren. Diese Puffer sind ein Spektrum kleinmolekularer Ampholyte mit

eng benachbarten isoelektrischen Punkten. Natürlich vorkommende Ampholyte, wie

Aminosäuren und Peptide, eignen sich aufgrund ihrer geringen Pufferkapazität an ih-

rem pI nicht (Westermeier, 1990). Den pH-Gradienten erzeugt man im elektrischen

Feld: Die negativ geladenen Trägerampholyte wandern zur Anode, die positiv gelade-

Einleitung

9

nen zur Kathode, wobei die Wanderungsgeschwindigkeit von der Höhe der jeweiligen

Nettoladung abhängt. Sie arrangieren sich in der Reihenfolge ihrer isoelektrischen

Punkte und geben den entsprechende pH-Wert an ihre Umgebung ab. Auf diese Wei-

se erhält man einen stabilen, monoton steigenden pH-Gradienten. Dieser ist jedoch

nicht vollkommen statisch. Vor allem verursacht durch längere Fokussierzeiten, wie

sie bei engen Gradienten und in Anwesenheit hochviskoser Additiva wie Harnstoff

oder nichtionischer Detergenzien notwendig sind, beginnt der Gradient in beide

Richtungen, vor allem in die kathodische („Kathodendrift“), zu driften. In der Mitte

entsteht ein Plateau mit Leitfähigkeitslücken. Ein Teil der Proteine, vor allem der ba-

sischen, geht verloren.

Anfänglich wurde die IEF in Rundgelen durchgeführt. Diese wurden bald ersetzt

durch rehydratisierte Flachgele. Hierbei werden zunächst die Gele hergestellt, an-

schließend getrocknet und erst bei Gebrauch rehydratisiert. Mehrere Vorteile sind

damit verbunden: Die leeren Gele können gewaschen werden, APS, TEMED und

verbliebene Acrylamid- und Bis-Monomere, welche die Fokussierung stören, können

auf diese Weise aus dem Gel entfernt werden. Gele können leicht in größeren Mengen

hergestellt und in trockenem Zustand bei -20 °C aufbewahrt werden. In der Rehydra-

tisierungslösung sind dann die zur Erzeugung des pH-Gradienten notwendigen

Ampholyte enthalten. Die Gele werden für 30 min vorfokussiert, um die Ampholyte

zum pH-Gradienten auszurichten. Anschließend wird die Probenlösung mittels kleiner

Silikontrichter („sample cups“) appliziert.

Wie bereits erwähnt, war die Einführung der immobilisierten pH-Gradienten (kurz

IPG) maßgeblich für die heutige gute Reproduzierbarkeit der 2D-Gelelektrophorese.

Bei dieser Technik wird der pH-Gradient aus Acrylamid-Derivaten mit puffernden

Gruppen, den Immobilinen, durch Kopolymerisation mit den Acrylamid-Monomeren

in ein Polyacrylamidgel eingebaut. Ein Immobiline (Abb. 1-4) ist eine schwache Säu-

re oder eine schwache Base. Man braucht mindestens zwei verschiedene Immobiline:

eine Säure und eine Base. Ein pH-Gradient im Gel wird durch kontinuierliches Ver-

ändern des Immobiline-Mischungsverhältnisses erzielt, nach dem Prinzip einer Säure-

Base-Titration (Görg et al., 1987; Westermeier, 1990). In der Praxis werden immobi-

lisierte pH-Gradienten durch lineares Mischen von zwei verschiedenen Polymerisati-

onslösungen mit einem Gradientenmischer hergestellt.

Der pH-Gradient bleibt absolut linear während der IEF und kann nicht durch die Pro-

teine der Probe beeinflußt werden. Die Beladungskapazität der Gele ist dadurch deut-

Einleitung

10

lich erhöht (Bjellqvist et al., 1993). Der Gradient ist vollkommen zeitstabil und kann

nicht driften. Im Gegensatz zu mehreren 100 Trägerampholyt-Homologen wird der

immobilisierte pH-Gradient mit wenigen, chemisch exakt definierten Substanzen er-

zeugt.

H2C = CH–CO–NH–CH2–COOH pK = 3,6

H2C = CH–CO–NH–(CH2)2–N(C2H5)2 pK > 12

Abbildung 1-4 Beispiel für zwei Immobiline. Die Acrylamidgrund-

struktur ist rot dargestellt.

Die Technik der rehydratisierten Flachgele wird auch hier angewendet. Man stellt

zwei Lösungen her: eine saure, durch Glycerin beschwerte, und eine basische, leichte.

Die saure Lösung ist der saure, die basische der basische Endpunkt des pH-

Gradienten. Auf eine Glasplatte der Gießkassette wird eine Trägerfolie aufgewalzt,

beide Lösungen werden in einen Gradientenmischer mit Mischkammer und Reservoir

gegeben, und die Gießkassette wird befüllt. Beim Gießen entsteht der lineare Dichte-

gradient durch kontinuierliche Überschichtung der immer leichter werdenden Gellö-

sung. Nach seiner Polymerisation wird das Gel gewaschen, anschließend getrocknet

und kann nun zu schmalen Gelstreifen zugeschnitten werden. Durch die Trägerfolie

ist die Stabilität der Gelstreifen gewährleistet.

Entscheidend für den Erfolg der 2D-Gelelektrophorese ist die Probenbehandlung. Ne-

ben einem schnellen und gründlichen Zellaufschluß, der z.B. mechanisch durch Mör-

sern, French pressing sowie Ultraschallbehandlung oder chemisch durch verschiedene

Lysispuffer erfolgen kann, ist die Inhibierung zelleigener Proteinasen wichtig, um

nachträgliche Proteindegradation oder -veränderung zu verhindern. Für ein hochauf-

lösendes Ergebnis wie in Abb. 1-5 und die umfassende Darstellung möglichst vieler

Elemente des Proteoms ist es notwendig, Proteine mit stark unterschiedlichen Eigen-

schaften gemeinsam in Lösung zu bringen. Weil schlecht gelöste Proteine die Gelpo-

ren verstopfen und zu horizontalen Streifen im 2D-Gel führen (Görg et al., 2000),

werden nur vollständig gelöste Proteine ordnungsgemäß fokussiert. Dieses Problem

ist Gegenstand vieler Arbeiten (Chevallet et al., 1998; Luche et al., 2003; Rabilloud,

1996; Rabilloud, 1999; Rabilloud et al., 1997; Rabilloud et al., 1990; Santoni et al.,

Einleitung

11

2000; Vuillard et al., 1995). Besonders Proteine mit extremen isoelektrischen Punkten

wie z.B. Histone, bzw. stark hydrophobe (Membran-)Proteine sind schwer löslich.

Abbildung 1-5 Hochauflösende 2D-Gelelektrophorese unter Ver-

wendung von IPG-Gelstreifen (pH-Bereich 4-7).

Generell basieren die meisten Solubilisierungslösungen nach wie vor auf dem von

O´Farell empfohlenen Lysispuffer, der eine hochmolare Harnstofflösung mit einem

Detergenz (Triton X 100) und einem Reduktionsmittel (2-Mercaptoethanol) kombi-

niert. Abwandlungen ergeben sich aus der Einführung neuartiger wirksamerer nicht-

ionischer bzw. zwitterionischer Detergenzien (z.B. aus der Gruppe der Sulfobetaine),

chaotroper Substanzen wie Thioharnstoff und besser geeigneter Reduktionsmittel wie

DTT. Die Aufrechterhaltung eines reduzierten Zustandes der Proteine während der

Fokussierung ist deshalb wichtig, weil die Reoxidation von SH-Gruppen zu SH-

Brückenbildung und begleitend zu Löslichkeitsverlusten führen kann.

Um Proteine, die nur in wenigen Kopien in der Zelle vorliegen, neben stark expri-

mierten Proteinen überhaupt darstellen zu können oder wenn nur ein Teil der Proteine

einer Zelle interessiert (z.B. ribosomale Proteine), ist eventuell eine Vorfraktionierung

der Probe sinnvoll. Eine Vorfraktionierung kann beispielsweise erreicht werden durch

Ultrazentrifugation, präparative Zellelektrophorese oder Affinitätschromatographie.

Einleitung

12

1.4 Zielstellung der Arbeit

Coxsackievirus B3, zur Familie der Picornaviridae gehörig, gilt als einer der häufig-

sten Erreger viraler Herzerkrankungen. Die Pathogenesemechanismen und Virus-

Wirtszell-Interaktionen sind bisher allerdings nur ansatzweise aufgeklärt. Bis heute

konnte noch keine geeignete Therapie oder Prävention bis zur klinischen Anwendung

entwickelt werden.

Im Rahmen dieser Arbeit sollten deshalb mit Hilfe der Zweidimensionalen Gelelek-

trophorese am Zellkulturmodell durch Proteinmustervergleich Wirtszellproteine iden-

tifiziert und nach Möglichkeit durch Peptidmassen-Fingerprinting am Massenspek-

trometer charakterisiert werden, die im Verlauf der Infektion differentiell exprimiert

werden. Proteine, deren Abundanzen während des Infektionsgeschehens reguliert

werden, sind einerseits potentiell (mittelbar bzw. unmittelbar) an Vorgängen bei der

Virusreplikation beteiligt, andererseits können sie diese unter Umständen stören und

werden deshalb inaktiviert. Der Überblick über solche Proteine wird helfen, einzelne

bereits bekannte Details des Infektionsgeschehens in Zusammenhang zu stellen und

bedeutet somit eine gute Ausgangsbasis zur Entflechtung der komplizierten Signal-

folgen während der Virusreplikation.

Für dieses Ziel sollte zunächst die Methode der 2D-Gelelektrophorese etabliert und

für die Arbeit am Zellkulturmodell optimiert werden. Die Zweidimensionale Gelelek-

trophorese, die als die empfindlichste Methode zur Auftrennung komplexer Protein-

gemische gilt, ist in der Lage, die wichtigsten Komponenten eines beliebigen Prote-

oms befriedigend abzubilden.

Aufgrund der Heterogenität, die solch ein Proteom aufweist (verschiedenste Abun-

danzen, Größen, Hydrophobizitäten und isoelektrische Punkte der enthaltenen Protei-

ne), ist es jedoch nahezu unmöglich, diese Proteine alle gleichermaßen gut darzustel-

len. Die verläßliche Reproduzierbarkeit der Methode ist zudem von vielen Parametern

(unter anderem der Probenbehandlung, den IEF- und SDS-PAGE-Bedingungen und

der Färbemethode) abhängig. Für die geplanten Proteomuntersuchungen am Zellkul-

turmodell sollte daher ein Protokoll entwickelt werden, das bei einfacher Handhabung

möglichst hohe Auflösung und gute Reproduzierbarkeit gewährleistet.

Material und Methoden

13

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Zellkulturen

HepG2:

humane hepatozelluläre Karzinomzellinie, ATCC-Nr. HB-8065, 1975 etabliert (Aden

et al., 1979), epithelartige Zellen, adhärent als Monolayer wachsend, Verdopplungs-

zeit 48-60 h, Ausbeute der konfluenten Kultur ca. 4 x 105 Zellen/cm2 Wachstumsflä-

che

HeLa:

humane Cervix-Karzinom-Zellinie, ATCC-Nr. CCL 2, 1951 etabliert (Gey, 1952),

epithelartige Zellen, adhärent als Monolayer wachsend, Verdopplungszeit 48-60 h,

Ausbeute der konfluenten Kultur ca. 5 x 104 Zellen/cm2 Wachstumsfläche

2.1.2 Verwendeter Virusstamm

CVB3 Stamm „Nancy“, Variante Woodruff (CVB3H3), Titer: 1,6 x 108 pfu/ml

(Knowlton et al., 1996)

2.1.3 Medien

HepG2: 90 % RPMI 1640 + 10 % FCS, 4 mM L-Glutamin

HeLa: 90 % RPMI 1640 + 10 % FCS, 2 mM L-Glutamin

2.1.4 Puffer und Lösungen

2.1.4.1 Puffer und Lösungen für die Zellkultur

10x Trypsin/EDTA-Lösung: 0,5 % (w/v) Trypsin, 0,2 % (w/v) EDTA

PBS-Puffer: 10 mM PBS in Tablettenform, A. bidest.

Lyse- und Solubilisierungs-

puffer:

8 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4 % CHAPS,

40 mM DTT

Rehydratisierungslösung: 8 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4 % CHAPS,

12 l/ml DeStreak™


14

2.1.4.2 Lösungen für die TCA/Aceton-Fällung

TCA-Lösung: 20 % (w/v) TCA in 50 % Aceton lösen, 20 mM DTT

Aceton/DTT: 80 % Aceton, 20 mM DTT

Rehydratisierungslösung: 8 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4 % CHAPS,

12 l/ml DeStreak™

2.1.4.3 Lösungen für die Bradford-Proteinbestimmung

Bradford-Stammlösung: 100 ml Ethanol 96 %, 200 ml Phosphorsäure 88 %,

350 mg Serva Blue G, bei RT abgedunkelt lagern

Bradford-Arbeitslösung: 425 ml A. bidest., 15 ml Ethanol 96 %, 30 ml Phos-

phorsäure 88 %, 30 ml Bradford-Stammlösung; bei RT

und abgedunkelt 6 Wochen haltbar

BSA-Lösung: 1 mg/ml BSA, A. bidest.

2.1.4.4 Äquilibrierlösungen

Stammlösung: 6 M Harnstoff, 4 % SDS, 30 % Glycerin, 3,3 % Trenn-

gelpuffer pH 8,8

Lösung I: Stammlösung mit 1 % DTT versetzen

Lösung II: Stammlösung mit 4 % Jodacetamid und einigen mg

Bromphenolblau versetzen

2.1.4.5 Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE (als zweite Dimension der 2D-

Gelelektrophorese)

10x Elektrodenpuffer 144 g Glycin, 30 g Tris, 10 g SDS ad 1.000 ml

A. bidest.

Trenngelpuffer: 181,66 g TRIS, 4 g SDS in 900 ml A. bidest. lösen, mit

konz. HCl auf pH 8,8 titrieren, ad 1.000 ml mit

A. bidest.

Acrylamidlösung (10 %): 42 % (v/v) Acrylamid-Bis (37,5:1, 30 %), 25 % (v/v)

Trenngelpuffer, 28 % (v/v) A. bidest., 0,56 M Glycerol

0,5 % (w/v) APS, 0,005 % (v/v) TEMED

Glycerol-Lösung zum Un-

terschichten:

50 % (v/v) Glycerol, 25 % (v/v) Trenngelpuffer, 25 %

A. bidest., eine Spatelspitze Bromphenolblau

Agaroselösung 0,5 %: 0,5 g Agarose in 100 ml 1x Elektrodenpuffer lösen


15

2.1.4.6 Lösungen zum Anfärben der Proteine im PAA-Gel

Coomassie-Blue-Färbung

Fixierlösung: 20 % Methanol, 1 % o-Phosphorsäure (85 %) A. bidest.

Färbelösung: 0,1 % Coomassie, 10 % Essigsäure, 40 % Methanol,

A. bidest.

Entfärber: 10 % Essigsäure, A. bidest.

Kolloidale Coomassie-Blue-Färbung

Fixierlösung: 20 % Methanol, 1 % o-Phosphorsäure (85 %) A. bidest.

Färbelösung: 20 % Methanol, 20 % Roti®-Blue (5x-Konz.), gut ge-

schüttelt, A. bidest.

Waschlösung: 20 % Methanol, A bidest.

Lagerungslösung: 20 % Methanol, 5 % Glycerin (99 %), A. bidest.

Silberfärbung nach Mann

Fixierer: 40 % Ethanol, 10 % Essigsäure, A. bidest.

Waschlösung: 30 % Ethanol, A. bidest.

Sensitivierer: 0,02 % Natriumthiosulfatpentahydrat

(NA2S2O3 x 5H2O), A. bidest.

Färbelösung: 0,2 % Silbernitrat (AgNO3), 0,025 % Formaldehyd

(HCHO), A. bidest.

Entwickler: 3 % Natriumcarbonat, 0,05 % Formaldehyd, A. bidest.

Stopplösung: 5 % Essigsäure, A. bidest.

2.1.4.7 Puffer und Lösungen für den tryptischen In-Gel-Verdau von Proteinen

Puffer A: 50 % Methanol, 10 % Essigsäure, A. bidest.

Puffer B: 100 mM Ammoniumbicarbonat, pH 8, A. bidest.

Puffer C: 50 % Acetonitril, 100 mM Ammoniumbicarbonat,

A. bidest.

Puffer D: 100 % Acetonitril

10x Trypsin-Stammlösung: Trypsin in einer Konzentration von 0,1 mg/ml in 1 mM

HCl lösen, Aliquots herstellen, bei -80 °C lagern

Trypsin-Arbeitslösung

(1x–5x):

Stammlösung mit 25 mM Ammoniumbicarbonat-

Puffer, pH 8 (Puffer B 1:4) verdünnen, sofort verbrau-

chen


16

2.1.4.8 Puffer und Lösungen für RT-PCR

DEPC-H2O 0,1 % DEPC, A. bidest., 24 h rühren, 5 x autoklavieren

2.1.4.9 Lösungen für Western Blot

Towbin-Blotpuffer 3 g Tris, 14,4 g Glycin, 0,05 % (w/v) SDS,

ad 1 l A. bidest.

TBS-T 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1 % (v/v)

Tween 20

Blockierlösung TBS-T mit 5 % (w/v) Magermilchpulver

Ponceau-Rot-Färbelösung 0,1 % Ponceau-Rot in 5 % Essigsäure (v/v)

AP-Puffer 100 mM Tris-HCl (pH 9,5), 100 mM NaCl, 5 mM

MgCl2

AP-Färbelösung 66 l NBT-Stocklösung (5 % in DMFA), 33 l BCIP-

Stocklösung (5 % in 70 % DMFA), 9,9 ml AP-Puffer

2.1.5 Synthetische Oligonukleotide für die PCR

Name Sequenz Herkunft

SivaF 5'-ATGCCCAAGCGGAGCTGCCCCTTCG-3' JenaBioscience

SivaR 5'-TCAGGTCTCGAACATGGCACAGCTG-3' JenaBioscience

ProF 5'-ATGGCTGCCAAAGTGTTTGAGTCCA-3' JenaBioscience

ProR 5'-TCACTGGGGCAGCTGGAGGAGCACG-3' JenaBioscience

DynF 5'-ATGCCCAGTGAAACTCTCTGGGAAA-3' JenaBioscience

DynR 5'-AATCCCAAACAGCAACTCACAGGATGATCC-3' JenaBioscience

p38F 5'-ATGTCTCAGGAGAGGCCCACGTTCT-3' JenaBioscience

p38R 5'-TCAGGACTCCATCTCTTCTTGGTCA-3' JenaBioscience

2.1.6 Kits, Enzyme und Marker

RNeasy Micro Kit (Quiagen, Hilden)

Omniscript RT Kit (Quiagen, Hilden)

Taq DNA Polymerase (Quiagen, Hilden)

Protein- und DNA-Marker (Roth, Karlsruhe und Biorad, München)


17

2.1.7 Chemikalien

Acetonitril Merck, Darmstadt

Acrylamid-Bis 37,5:1 Serva, Heidelberg

Agarose Invitrogen, Karlsruhe

Ammoniumpersulfat (APS) Serva, Heidelberg

Bromphenolblau Sigma, Deisenhofen

CHAPS (3-(3-Cholamidopropyl)dimethyl-

ammonio-1-propansulfat) Sigma, Deisenhofen

Coomassie Brilliantblau G250 Sigma, Deisenhofen

Destreak™ Amersham Biotech, Freiburg

Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth, Karlsruhe

dNTP´s Amersham Biotech, Freiburg

DTT Sigma, Deisenhofen

Ethidiumbromid (1%) Merck, Darmstadt

Ethylendiamintetrasessigsäure (EDTA) Roth, Karlsruhe

Fetales Kälber-Serum (FCS) Biochrom AG, Berlin

Formaldehyd Roth, Karlsruhe

Glycerin (plant, 99,5 %) Serva, Heidelberg

Glycin Roth, Karlsruhe

Guanidinhydrochlorid Sigma, Deisenhofen

Harnstoff (EP-MB grade) Roche Diagnostics, Mannheim

Jodacetamid Sigma, Deisenhofen

L-Glutamin Sigma, Deisenhofen

Natriumcarbonat Roth, Karlsruhe

Natriumthiosulfatpentahydrat Merck, Darmstadt

ortho-Phosphorsäure (85%) Merck, Darmstadt

Pharmalyte™ (3-10, 4-6,5) Amersham Biotech, Freiburg

Phosphate buffered saline (PBS; tablets) Sigma, Deisenhofen

Roti®-Blue Roth, Karlsruhe

RPMI 1640, Zellkulturmedium Gibco, USA

SDS Roth, Karlsruhe

Silbernitrat Sigma, Deisenhofen

Silikonöl DC 200 Serva, Heidelberg


18

TAE Buffer (50x) Invitrogen, Karlsruhe

TEMED Merck, Darmstadt

Thioharnstoff Sigma, Deisenhofen

Trichloressigsäure (TCA) Merck, Darmstadt

Triflouressigsäure (TFA) Merck, Darmstadt

Tris Roth, Karlsruhe

Trypsin (sequencing grade) Roche Diagnostics, Mannheim

2.1.8 Materialien

Einmal-Küvetten 1,5ml (Roth, Karlsruhe)

IPG-Streifen 24 cm; pH 4-7, 3-10, 3-10NL (Amersham Biosciences, Schweden)

Kulturflaschen, div. Größen (Iwaki, Japan)

Ultrafiltrationssystem Microcon -YM 10 (Millipore, USA)

SELDI-Proteinchips: H4 und H50, hydrophobe Oberfläche (Ciphergen, USA)

Immobilon™-P Transfer Membran (Millipore, USA)

2.1.9 Geräte

Begasungsbrutschrank BB 6220 (Heraeus Instruments, Hanau)

Concentrator 5301 (Eppendorf, Hamburg)

Densitometer GS 800 (Bio-Rad, München)

Elektrophorese- und Blotapparatur Multiphor™ II (Amersham Biosciences, Schwe-

den)

Geldokumentationsanlage Gene Genius, SynGene; Software: GeneSnap (Merck Eu-

rolab, Darmstadt)

Horizontale Gelelektrophorese-Apparatur Power Pac 200 (Bio-Rad, München)

Laborzentrifuge 4K15C (Sigma, Taufkirchen)

Mastercycler® gradient (Eppendorf, Hamburg)

Mikroskop Axiovert 25 inkl. CCD-Kamera AxioCam HRC (Carl Zeiss GmbH, Jena)

PCR-Gerät GeneAmp PCR-System 9700 (Perkin Elmer, Langen)

pH-Meter CG825 (Schütt Labortechnik, Göttingen)

Powersupply Powerpac 200 (Bio-Rad, München)

Powersupply EPS 3501 XL (Amersham Biosciences, Schweden)


19

Proteinspot-Excisionsgerät GelPal (Genetix, Großbritannien)

Proteinanalysesoftware Proteomweaver (Definiens, München)

Rehydratisierungstray (Amersham Biosciences, Schweden)

Schüttelgerät Promax 1020 (Heidolph Instruments, Schwabach)

SELDI-MS Protein-Chip-System (Ciphergen, USA)

Steril-Sicherheitswerkbank HB 2448 (Holten LaminAir)

Thermomixer comfort (Eppendorf, Hamburg)

Tischzentrifuge 5415R (Eppendorf, Hamburg)

Ultraschall-Gerät sonoplus HD 2070 mit Mikrospitze MS 73 (Bandelin electronic,

Berlin)

Ultrazentrifuge Optima MAX E (Beckman Coulter, USA)

UV/VIS-Spektrometer Spectronic® 20 Genesys™ (Spectronic Instruments, USA)

Vertikal-Gelelektrophoreseapparatur EttanDALTtwelfe™ inkl. Gelgießstand für 12

Gele (Amersham Biosciences, Schweden)

Zellzahl- und Vitalitätsmeßgerät Vicell™ (Beckman Coulter, USA)

2.2 Methoden

2.2.1 Kultivierung der Zellen

2.2.1.1 Kulturbedingungen

Die adhärent wachsenden Kulturen wurden in den entsprechenden Medien bei 37 °C,

5 % CO2 und gesättigt feuchter Atmosphäre im Begasungsbrutschrank kultiviert.

Sämtliche Arbeiten wurden unter sterilen Bedingungen an einer Sterilwerkbank

durchgeführt.

2.2.1.2 Passagieren der Zellen

Subkonfluente Kulturen (ca. 95 % Konfluenz) wurden mit kalter PBS/EDTA-Lösung

gewaschen, um tote Zellen und Reste des Kulturmediums zu entfernen. Anschließend

wurde die Zellschicht mit vorgewärmter Trypsin/EDTA-Lösung benetzt (1 ml für

25 cm2, 3 ml für 75 cm2 und 5 ml für 150 cm2 Wachstumsfläche). Nach 3-minütiger

Inkubation im Brutschrank wurde die Trypsinlösung abgegossen und die Zellen für

maximal 10 weitere Minuten inkubiert. Lösten die Zellen sich vom Flaschenboden,

wurde die Reaktion durch Zugabe von 2/5/8 ml auf 37 °C vorgewärmten Nährmedi-

ums abgestoppt. Durch mehrmaliges Pipettieren wurden die Zellen homogenisiert,


20

vereinzelt, aufgenommen und im Verhältnis 1:4 in neue Flaschen verteilt (gesplittet).

Abschließend wurden die Flaschen mit auf 37 °C vorgewärmtem Nährmedium aufge-

füllt (25 cm2 auf 20 ml, 75 cm2 auf 40 ml und 150 cm2 auf 60 ml) und kultiviert wie

beschrieben.

2.2.1.3 Infektion der Zellen mit CVB3H3

Diese Arbeiten wurden im Institut für Virologie der FSU Jena von Dr. A. Henke und

Mitarbeitern durchgeführt. Von konfluenten Zellkulturen wurde zunächst das Medium

entfernt. Anschließend erfolgte die Infektion mit 1-2 ml Virus-Suspension, die auf

dem Zellrasen verteilt wurden. Um eine Adhäsion der Virionen an die Zellen zu er-

möglichen, erfolgte eine 45-minütige Inkubation bei 37 °C. Regelmäßiges Schwenken

verhinderte, daß der Zellrasen austrocknete. Schließlich wurde frisches Medium zuge-

fügt und bei 37 °C weiterinkubiert.

2.2.1.4 Elektronische Zellzählung und Vitalitätsbestimmung

Für die elektronische Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung wurden die Zellen mit

Trypsin/EDTA-Lösung vom Flaschenboden abgelöst (10 min bei 37 °C), die Zellsus-

pension bei 500 x g und 4°C für 5 min zentrifugiert und das Zellpellet in einem defi-

nierten Volumen PBS-Puffer resuspendiert. Mit Hilfe von Trypanblau wurde die Vi-

talität der Zellen sowie die Zellzahl im ViCell-Zellzähler bestimmt.

2.2.1.5 Ernte der Zellen

Die Kulturflaschen wurden dem Brutschrank entnommen und der Zellrasen sofort

viermal mit 4 °C kaltem PBS-Puffer gewaschen. Reste des Puffers wurden möglichst

vollständig abgesaugt. Um die Zellen vom Flaschenboden zu lösen und zu lysieren,

wurden diese mit 2 ml Solubilisierungslösung (bei 75 bzw. 150 cm2 Wachstumsflä-

che, 1 ml bei 25 cm2) versetzt. Der Puffer wurde zügig auf dem Flaschenboden ver-

teilt, so lange, bis keine Zellen mehr zu erkennen waren. Da beide Puffer stark dena-

turierend wirken, werden in einem hohen Maße in der Probe enthaltene Proteinasen

inhibiert. Dies ist wichtig, weil man nachträgliche Veränderungen am Proteom ver-

meiden möchte.

2.2.2 Aufarbeitung des Zellysats

2.2.2.1 Ultraschallbehandlung

Die im Puffer aufgenommenen Zellen wurden in ein 15 ml Falcon-Reaktionsgefäß

überführt und mit Ultraschall behandelt (10 x 5 sec bei Puls 2 und 50 %). Dies ge-


21

schah vorrangig, um Membranreste und Nukleinsäuren mechanisch zu destruieren

und daran assoziierte Proteine abzulösen.

2.2.2.2 Ultrafiltration

Zunächst wurde das ultraschallbehandelte Lysat für 30 min bei 75.000 x g und 16 °C

ultrazentrifugiert, um unlösliche Zellfragmente zu pelletieren. Der Überstand wurde

abgenommen und jeweils 500 l davon in einen Mikrofilter (regenerierte Zellulose,

MW 10.000) gegeben, durch Zentrifugation (12.000 x g 16 °C) auf die Hälfte einge-

engt und mit Rehydratisierungslösung auf das Ausgangsvolumen aufgefüllt. Dieser

Waschvorgang wurde zweimal wiederholt.

2.2.2.3 Aceton/TCA-Fällung, verändert nach Görg et al. (Görg et al., 1997)

Das ultraschallbehandelte Lysat wurde im Volumenverhältnis 2:1 mit TCA-Lösung

vermischt und anschließend für 30 min bei -20 °C gefällt, gut geschüttelt und bei 4 °C

für weitere 2 h gefällt. Der Überstand wurde anschließend für 30 min bei 16.000 x g

und 4 °C abzentrifugiert, abgenommen und verworfen. Das Sediment wurde zweimal

mit 1 ml -20 °C kaltem 80%igem Aceton/DTT gewaschen, indem das Pellet im Ace-

ton/DTT durch Pipettieren homogenisiert und anschließend für 15 min bei 16.000 x g

und 4 °C abzentrifugiert wurde. Das Aceton/DTT wurde abgenommen, das Pellet im

Vakuum 10 min getrocknet, wieder in Rehydratisierungslösung aufgenommen, eine

Stunde bei 25 °C und 500 rpm auf einem Thermomixer und über Nacht bei 4 °C in-

kubiert, um die Proteine möglichst quantitativ in Lösung zu bekommen. Unlösliche

Bestandteile wurden durch 15-minütige Ultrazentrifugation bei 75.000 x g und 16 °C

entfernt.

2.2.3 Bradford-Proteingehaltsbestimmung (Bradford, 1979)

Für den quantitativen Vergleich des Proteinspotmusters ist die Ermittlung der Prote-

inkonzentration der zu vergleichenden Proben notwendig, um sicherzustellen, daß

gleiche Proteinmengen auf die Gele geladen werden.

Die Ermittlung des Proteingehaltes erfolgte mit dem Bradfordtest (Bradford, 1979).

Aus der BSA-Lösung wurde eine Verdünnungsreihe mit Lösungen der Endkonzen-

trationen 1-6 g BSA/ml hergestellt: dazu wurden je 100 l A. bidest. auf die jeweili-

gen BSA-Mengen eingestellt und 900 l Bradford-Arbeitslösung hinzupipettiert. Die

Bestimmung der Proteinkonzentration einer Probe erfolgte durch Zugabe von 1 l,

2 l und 4 l Probenlösung zu A. bidest., so daß auch hier Lösungen zu je 100 l


22

Volumen vorlagen, die mit 900 l Bradford-Arbeitslösung zu 1 ml aufgefüllt wurden.

Die Inkubationszeit betrug 15 min bei RT, danach wurde die Extinktion bei 595 nm

bestimmt. Aus der Verdünnungsreihe wurde eine Eichkurve erstellt, aus der sich die

Proteinkonzentrationen der vermessenen Proben errechnen bzw. ablesen ließen. Für

jede unabhängige Messung wurde separat eine Eichkurve erstellt.

2.2.4 Rehydratisierung und Beladung der IPG-Streifen

Bei der sogenannten aktiven Rehydratisierung wird die Probe im Zuge der Rehydrati-

sierung auf die Streifen geladen.

Aus den Proteingehalten der Proben ließen sich definierte Proteinmengen berechnen,

mit denen die IPG-Streifen beladen wurden. Zur Rehydratisierung der 24 cm langen

Streifen wurde ein Volumen von 500 l benötigt. Das heißt, die gewünschte Protein-

menge wurde mit Rehydratisierungslösung auf ein Gesamtvolumen von 500 l ver-

dünnt. Die Probenlösungen wurden in ein Rehydratisierungstray pipettiert, die Gele

von der Schutzfolie befreit und, mit der Gelseite nach unten zur Probenlösung zei-

gend, blasenfrei auf diese aufgelegt. Um Verdunstungserscheinungen zu minimieren

wurden die Gele mit Silikonöl überschichtet. Die getrockneten und bei -20 °C gela-

gerten IPG-Streifen wurden mindestens über Nacht, in der Regel aber für 24 h, rehy-

dratisiert.

2.2.5 Isoelektrische Fokussierung

Die isoelektrische Fokussierung der Proteine erfolgte mit dem Multiphor™ II-System.

Dieses besteht aus einer Kühlplatte, einer darauf liegenden Fokussierkammer, welche

die Elektroden trägt und einer darin liegenden Schablone, deren Vertiefungen der kor-

rekten Ausrichtung der IPG-Streifen dienen.

Um eine optimale Wärmeableitung zu gewährleisten, wurden zwischen Fokussier-

kammer und Kühlplatte sowie zwischen Schablone und Fokussierkammer eini-

ge ml Silikonöl verteilt und die Fokussierkammer bzw. die Schablone möglichst luft-

blasenfrei aufgelegt. In die Vertiefungen der Schablone wurden die IPG-Streifen mit-

tig, mit dem sauren Ende zur Anode zeigend, angeordnet und gegeneinander ausge-

richtet. Auf die Enden der IPG-Streifen wurden restfeuchte Elektrodenpapierstreifen

quer aufgelegt, so daß sie die äußeren IPG-Streifen ein kurzes Stück überragten. Auf

die Filterpapierstreifen wurden dann die Elektrodenbrücken mittig aufgebracht. Um


23

zu verhindern, daß die Elektroden- und Gelstreifen austrockneten, und um die Streifen

vor CO2-Einflüssen zu schützen, wurde die gesamte Anordnung in der Fokussier-

kammer großzügig mit Silikonöl überschichtet. Die Fokussierung erfolgte bei 20 °C

nach einem mehrstufigen Programm (Tabelle 2-1).

Tabelle 2-1 Parameter für die isoelektrische Fokussierung (1. Dimension):

IPG pH 4-7 IPG pH 3-10 IPG pH 3-10NL

Voltzahl in V Dauer in h Voltzahl in V Dauer in h Voltzahl in V Dauer in h

150300600

1.2002.4003.500

1,51,5

111

19

150300600

1.2002.4003.500

22

1,511

16

150300600

1.2002.4003.500

22

1,511

16Gesamt: 71,9 kVh in 25 h Gesamt: 61,4 kVh in 23,5 h Gesamt: 61,4 kVh in 23,5 h

2.2.6 Äquilibrierung der IPG-Streifen

Um die Proteine erfolgreich aus dem IPG-Gelstreifen in das SDS-Gel der zweiten

Dimension zu transferieren, ist eine Umpufferung, Äquilibrierung genannt, notwen-

dig. Die Proteine müssen mit SDS beladen werden. Die Eigenladungen der Proteine

werden effektiv überdeckt, es entstehen anionische Mizellen mit einer konstanten

Nettoladung pro Masseneinheit. Die gestreckten, mit SDS beladenen Polypeptidketten

bilden Ellipsoide und es ergibt sich eine lineare Beziehung zwischen dem Logarith-

mus der jeweiligen Molekulargewichte und den relativen Wanderungsstrecken dieser

SDS-Polypeptid-Mizellen (Westermeier, 1990).

Die Äquilibrierung verlief in zwei Schritten: im ersten Schritt wurden die Gelstreifen

für 15 min in der Äquilibrierungslösung I inkubiert. Durch die Zugabe von DTT er-

folgt eine nochmalige Reduzierung der Proteine. Im zweiten Schritt wurden die Gel-

streifen für 15 min in der Äquilibrierungslösung II inkubiert. Die SH-Gruppen werden

durch das Iodacetamid alkyliert und damit geschützt. Gleichzeitig wird das DTT, wel-

ches für vertikales „pointstreaking“ im silbergefärbten Gel verantwortlich gemacht

wird (Görg et al., 1987), wieder entfernt.


24

2.2.7 SDS-PAGE (als zweite Dimension der 2D-Gelelektrophorese)

2.2.7.1 Herstellung der Gele

Die für die vertikale SDS-PAGE benötigten Gele wurden unter Benutzung des zum

Ettan DALTtwelfe™ -Systems gehörenden Gelgießstandes im Labor hergestellt. Die

mit Abstandshaltern von 1 mm Stärke und einem Silikonscharnier versehenen Gelkas-

setten aus Glas wurden vor der Benutzung mit 70%igem Ethanol und einem fussel-

freien Tuch poliert und in der benötigten Anzahl in den Gelgießstand eingesetzt, wel-

cher anschließend mit Kunststoff-Attrappen in den Abmessungen der Gelkassetten

aufgefüllt wurde.

Die Acrylamidlösung wurde frisch hergestellt. Vor der Zugabe von TEMED und APS

wurde die Lösung in eine Saugflasche überführt und für ca. 20 min in 3–4 Zyklen

entgast. Nach der Zugabe von TEMED und APS und kurzem vorsichtigem Vermi-

schen wurde die Lösung in den Gelgießstand eingebracht, unterschichtet mit Glyce-

rol-Lösung und überschichtet mit 2 ml wassergesättigtem Butanol je Gelkassette. Die

Polymerisationszeit betrug bei Raumtemperatur mindestens 4 h.

2.2.7.2 Aufsetzen der IPG-Streifen auf die SDS-Polyacrylamidgele

Nach der Polymerisation wurden die Gelkassetten gründlich unter fließendem A. dest.

gewaschen, um das Butanol sowie eventuell verbliebene Acrylamid-Monomere und

TEMED-Reste zu entfernen. Die äquilibrierten IPG-Streifen wurden, mit der Gelseite

zum Betrachter zeigend und mit dem sauren Ende nach links orientiert, vorsichtig

zwischen die Glasplatten der Gelkassetten geschoben und auf die Geloberfläche auf-

gesetzt. Die Lösung eines Protein-Größenstandards wurde auf 4 x 4 mm messende

Filterpapierecken getropft. Sobald die Ecken die Lösung aufgesaugt hatten, wurden

diese neben den sauren Enden der IPG-Streifen plaziert. Die IPG-Streifen und Filter-

papiere wurden blasenfrei mit 0,5%iger Agarose überschichtet und die Gelkassetten

dabei randvoll befüllt.

2.2.7.3 Laufbedingungen der SDS-PAGE

Nach dem Gelieren der Agarose wurden die Gelkassetten in die Elektrophoresekam-

mer, deren untere Kammer bereits mit 1 x Laufpuffer befüllt war, eingesetzt, die ge-

gen die untere Kammer abgedichtete obere Kammer mit 2 x Laufpuffer befüllt und

der Trennvorgang durch Anlegen einer Spannung gestartet. Die Trennung der Protei-

ne erfolgte bei 20 °C zu den in Tab. 2-2 angegebenen Bedingungen.


25

Tabelle 2-2 Laufbedingungen 2. Dimension (SDS-PAGE, 20 °C):

Zeit [h] Spannung [V]

Einlaufen 4 30

Trennung 16 90

2.2.8 Färben der Polyacrylamidgele

Die Gele wurden aus den Gelkassetten entnommen und wie unten beschrieben wei-

terbehandelt. Um Kontaminationen zu vermeiden, wurden die Gele nur mit Hand-

schuhen berührt.

2.2.8.1 Coomassie-Blue-Färbung

Die Gele wurden zunächst 60 min bei RT in der Fixierlösung und anschließend für

60 min in der Färbelösung geschwenkt. Nach dem Färbevorgang wurde wieder ent-

färbt, bis die Proteinspots sichtbar waren. Der Entfärber wurde dabei unter Umstän-

den mehrfach gewechselt.

2.2.8.2 Kolloidale Coomassie-Blue-Färbung

Zunächst wurden die Gele für 60 min bei RT in Fixierlösung geschwenkt, anschlie-

ßend in frisch angesetzte Färbelösung überführt und darin über Nacht bei RT ge-

schwenkt. Um Farbstoffreste zu entfernen, wurden die Gele am nächsten Morgen in

die Waschlösung überführt und darin bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.

2.2.8.3 Reversible Silberfärbung nach Mann (Shevchenko et al., 1996)

Die Silberfärbung für Proteine in Polyacrylamidgelen nach Mann ist eine sensitive

und reversible Färbemethode. Die Proteine können mit Natriumthiosulfat wieder ent-

färbt werden.

Nach Abdunklung des Labors und der Färbeschalen wurden die Gele für 60 min in

den Fixierer gegeben und bei RT geschwenkt. Die Lösung wurde abgesaugt und die

Gele anschießend für 2 x 20 min mit der Waschlösung und nochmals für 20 min mit

A. dest. gewaschen, wobei die Lösungen durch Absaugen gewechselt wurden. Nun

wurden die Gele für genau 1 min in der Natriumthiosulfat-Lösung inkubiert und dar-

aufhin 2 x 20 sec mit A. dest. gewaschen. Nachfolgend wurde 4 °C kalte Färbelösung

zugegeben und die Gele für 20 min in der Dunkelheit gefärbt, anschließend genau

20 sec mit A. dest. gewaschen und danach im Dunkeln mit Entwicklerlösung benetzt.

Bei Schlierenbildung wurde die Lösung sofort entfernt und neu zugegeben. Die Gele


26

wurden 1-5 min entwickelt (nach visuellem Eindruck), kurz in A. dest. gewaschen,

15 min in der Stopplösung inkubiert und abschließend 2 x 10 min mit A. dest. gewa-

schen.

2.2.9 Auswertung der Gele und Identifizierung einzelner Proteine

2.2.9.1 Bildverarbeitung mit der Proteinanalyse-Software Proteomweaver

Um die Proteinspot-Muster verschiedener Proben vergleichen zu können, wurden von

den fertig entwickelten 2D-Gelen digitale Bilder erzeugt. Dies geschah durch Scannen

der Gele mit einem Densitometer im Transmissionsmodus bei einer Auflösung von

63,5 m (entsprechend 400 dpi). Die erzeugten Bilder wurden mit Proteomwea-

ver 2.1, einer Proteinanalyse-Software, ausgewertet.

Nach einer initialen Spoterkennung, deren Parameter einstellbar sind, und einem Mat-

ching genanntem Vorgang, bei dem die in den zu vergleichenden Bildern detektierten

Spotmuster aufeinander abgestimmt werden, erfolgt der eigentliche Mustervergleich.

Im Prinzip wird dabei das Proteinspot-Muster der Probe I, bestehend aus

x angefärbten Proteinspots, mit dem Proteinspot-Muster der Probe II, bestehend aus

y angefärbten Proteinspots, verglichen. Dabei werden Spots mit unterschiedlichen

Intensitäten und Spots, die in einem der zu vergleichenden Muster fehlen, herausge-

filtert.

Das Programm rechnet dazu die Bilddaten in ein dreidimensionales Gebilde um: Die

Proteinspots bilden, entsprechend ihrer Größe und Farbsättigung im 2D-Bild, die Ber-

ge in einer Ebene aus Hintergrundfärbung (siehe Abbildung 2-1). Diese „Land-

schaftsarchitektur“ liefert dem Programm die Eckdaten, die es braucht, um die zu ver-

gleichenden Gelbilder zu „matchen“, d.h. virtuell übereinanderzulegen. Das Pro-

gramm ist in der Lage, Positionsunterschiede einzelner Spots innerhalb einstellbarer

Grenzen zu erkennen. Durch die Berechnung von Vektoren werden die zu verglei-

chenden 2D-Muster dann aufeinander abgestimmt.

Erst im nächsten Schritt werden Proteinsspots untereinander in ihrer Intensität vergli-

chen.


27

Abbildung 2-1 Ausschnitt eines 2D-Gelbildes in der 3D-Ansicht. Die Berge im Bild stellen

einzelne Proteinspots dar, wobei Höhe und Umfang der Berge mit Farbdichte und Größe

der Spots korrespondieren.

Die Empfindlichkeit dieses Detektionsschrittes war durch drei Parameter beeinfluß-

bar: den Mindestdurchmesser, den ein Spot aufweisen muß, um erfaßt zu werden, sei-

ne aufsummierte Mindestintensität gegenüber dem Hintergrund und seinen Mindest-

kontrast gegen den Hintergrund. Um alle erkennbaren Spots zu erfassen, gleichzeitig

nach Möglichkeit kleine Farbpartikel sowie Hintergrundrauschen von der Detektion

auszuschließen, wurden für die vorliegenden Untersuchungen folgende Einstellungen

zur Spotdetektion gewählt: als Mindest-Ø = 8 (2...10), als Mindestintensität = 5.000

(0...5.000) und als Mindestkontrast = 20 (2...50).

Anschließend wurden die Spotmuster paarweise gematcht, in Experimenten mit mehr

als zwei Gruppen zudem jedes Spotmuster mit jedem. Sowohl Proteinspots, die in ei-

nem der zu vergleichenden Gelbilder fehlten, als auch Proteinspots mit signifikanter

(mehr als dreifacher) Abweichung in der Intensität wurden von der Analyse-Software

herausgefiltert und in ein Analyse-Set überführt. Dieses wurde am Bildschirm manu-

ell editiert. Spots, die nach dieser Sichtprüfung noch interessant erschienen, wurden

aus dem entsprechenden Gel ausgeschnitten, entweder manuell mit dem Skalpell oder

mit dem GelPal-Proteinspotexcisionsgerät.

2.2.9.2 Trypsin-Verdau ausgeschnittener Proteinspots

Trypsin, als Trypsinogen im Pankreas gebildet und aktiv im Dünndarm, ist eine Serin-

Protease, die Proteine schneidet, indem sie Peptidbindungen C-terminal nach Lysin


28

und Arginin hydrolytisch spaltet. Ein Protein wird also in eine charakteristische Zahl

Peptide mit unterschiedlichen Massen geschnitten. Soweit dessen Sequenz vorher

schon bekannt und in einer Proteindatenbank erfaßt war, läßt sich ein Protein durch

das sich ergebende Peptidmassenmuster anschließend mit relativer Genauigkeit iden-

tifizieren.

Die ausgeschnittenen Spots wurden in 0,5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt

und auf dem Thermomixer 1 h mit 400 l Puffer A bei RT und 750 rpm entfärbt. Die

Lösung wurde entfernt, durch frischen Puffer A ersetzt, und die Gelstückchen wurden

bei gleichen Bedingungen für weitere 30 min inkubiert, wobei die Entfärbung mög-

lichst vollständig erfolgen sollte. Der Puffer wurde entfernt, durch 400 l Puffer B

ersetzt und die Spots wurden für zweimal 10 min auf dem Thermomixer bei RT und

750 rpm inkubiert. Puffer B wurde ersetzt durch 400 l Puffer C und in diesem wur-

den die Gelstückchen 1 h auf dem Thermomixer bei RT und 750 rpm inkubiert. Die

Lösung wurde vollständig abgenommen und durch 50 l Puffer D ersetzt (Inkubati-

onsdauer 15 min, auf dem Thermomixer bei RT und 750 rpm). Die Lösung wurde ent-

fernt, die Gelstückchen sollten dehydratisiert weiß erscheinen. Die Gelstückchen

wurden bis zur völligen Trocknung (ca. 10 min) im Vakuum abrotiert. Aus der

10x Trypsinlösung wurde die Arbeitslösung frisch hergestellt und von dieser 10 l

pro Gelstück zugegeben. Die Inkubation erfolgte für 16 h bei 37 °C.

2.2.9.3 Peptidmassenanalyse mittels SELDI-Technologie

SELDI (surface enhanced laser desorption ionisation) ist eine MALDI-TOF-basierte

Proteinchip-Array-Technolgie. Proteinchips mit verschiedenen chromatographischen

Oberflächen (Anionen-, Kationenaustauscher, hydrophobe Oberflächen, usw.) stehen

zur Auswahl und können z.B. mit Zellysaten, Proben von Körperflüssigkeiten u.a.

beladen werden. Durch nachfolgendes Waschen bleiben nur Proteine gebunden, die in

hohem Maße mit der Chipoberfläche wechselwirken. Diese werden dann im Mas-

senspektrometer analysiert. Typischerweise handelt es sich dabei um ein MALDI-MS

(matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry) mit angegliedertem

Flugzeitanalysator (TOF – time of flight). Die Massenspektren verschiedener Proben

(z.B. krank vs. gesund) werden anschließend verglichen. Unterschiede markieren

krankheitsspezifische Proteine. Mit der Kenntnis solcher Marker läßt sich die SELDI-

Technologie beispielsweise zur klinischen Diagnose von Patientenproben einsetzen

(protein profiling).


29

Für die vorliegende Arbeit wurde SELDI zur Peptidmassenanalyse ausgewählter

Proteine benutzt. Dies geschah in Kooperation mit Dr. Ch. Melle von der Core Unit

Chip Applications, einer AG des Instituts für Humangenetik der Friedrich-Schiller-

Universität Jena. Es kamen H4- und H50-Chips mit hydrophober Oberfläche zum

Einsatz. Die H50-Chips wurden direkt vor Gebrauch durch 2 x 5-minütige Inkubation

mit 5 l 50%igem ACN/Spot aktiviert. Anschließend wurde zweimal 1 l Peptidlö-

sung/Spot aufgetragen und diese nach Eintrocknung mit zweimal 0,5 l 20%iger

CHCA-Matrix überdeckt.

In jedem Experiment wurde eine Leerprobe, d.h. ein gleichbehandeltes proteinfreies

Gelstückchen mitgeführt, um Hintergrund- und Trypsin-Autolysis-Signale identifizie-

ren zu können.

Zur internen Kalibrierung jedes einzelnen Chips war das Mitführen eines Massen-

standards, bestehend aus 6 Peptiden, notwendig. Die Kalibrierung erfolgte durch Ab-

gleich der gemessenen Werte mit den exakt bekannten Massezahlen der Peptide des

Standards. Die errechneten Massendifferenzen wurden auf alle mit dem Chip aufge-

nommenen Massenspektren übertragen und die Spektren entsprechend angepaßt.

2.2.9.4 Identifizierung der Proteine mit der Online-Anwendung ProFound

Mit ProFound (http://129.85.19.192/profound_bin/WebProfound.exe) können ver-

schiedene Proteindatenbanken (SwissProt, NCBI) durchsucht und die dort gelisteten

Sequenzen „virtuell verdaut“ werden. In die Suchmaske eingegebene Peptidmassen

werden mit den virtuell erzeugten Fragmentmustern verglichen. Die Proteine mit der

höchsten Übereinstimmung zum eingegebenen Massenspektrum werden anschließend

angezeigt.

Die massenspektrometrisch ermittelten Peptidmassen wurden in die Suchmaske ein-

gegeben. Um die Suche einzuengen, wurden zusätzliche, aus dem 2D-Muster ablesba-

re Daten wie ungefährer pI, ungefähres Molekulargewicht und Modifikationsstatus

des zugehörigen Proteins, hinzugefügt und die Suche gestartet.

2.2.10 Reverse Transkription der Gesamt-mRNA (RT-PCR)

Die Gewinnung der Gesamt-RNA aus dichtgewachsenem infiziertem bzw. nichtinfi-

ziertem Zellrasen erfolgte mittels des kommerziell erhältlichen RNeasy-Mini-Kits von

QIAGEN nach Angaben des Herstellers.


30

Die Generierung von cDNA aus RNA erfolgte unter Verwendung der reversen

Transkriptase des Molony Murine Leukemia Virus (M-MLV). Da nur die Umschrei-

bung aller mRNA-Moleküle gewünscht war, wurde unter Ausnutzung der 3’-termi-

nalen Poly-A-Sequenz, die alle zellulären mRNA-Spezies und auch das Coxsackievi-

rus-RNA-Molekül besitzen, ein unspezifischer Oligo-d(T)-Primer verwendet. Es wur-

den 5 g RNA – das Volumen ergab sich aus photometrischer RNA-Konzentrations-

messung bei 260 nm – auf 10 l mit DEPC-H2O aufgefüllt und 1 l oligo-d(T)-Primer

(0,5 g/ l) zugegeben. Zur Denaturierung wurde zunächst 10 min bei 70 °C inkubiert.

Nach 3 min auf Eis wurden folgende Lösungen hinzugegeben:

4 l 5x RT-Puffer

2 l dNTPs (10 mM)

2 l DTT (1 M)

1 l SUPERSCRIPT™ II-RT/M-MLV RT

Die anschließende reverse Transkription erfolgte im Thermocycler mit folgenden Ein-

stellungen:

Primerannealing 10 min 25 °C 1 Zyklus

Polymerisation 50 min 42 °C

Denaturierung 5 min 90 °C

Kühlung 4 °C

Diese Arbeiten wurden bei Dr. A. Henke im Institut für Virologie der Friedrich-

Schiller-Universität durchgeführt.

2.2.11 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Zur Amplifikation der gewünschten cDNA-Moleküle (RT-Produkte) wurde die Poly-

merase-Ketten-Reaktion (PCR) benutzt. Die Arbeiten wurden im 50 l-Maßstab

durchgeführt.


31

Folgender Ansatz wurde pipettiert:

2 l RT-Produkt (cDNA-Mischung, ca. 0,5 g)

5 l PCR 10x-Puffer (inkl. 15 mM MgCl2)

5 l dNTP´s (0,2mM)

1,25 l 3'-Primer (2,5 M)

1,25 l 5'-Primer (2,5 M)

10 l Q-Solution

25 l A. bidest.

2,5 U Taq-Polymerase

Als universales Programm wurde verwendet:

Erst-Denaturierung 95 °C 3 min 1 Zyklus

Denaturierung

Primer-Anlagerung

Verlängerung

95 °C

55 °C

72 °C

1 min

1 min

1 min

30 Zyklen

Komplettierung

Kühlung

72 °C

4 °C

10 min

2.2.12 DNA-Agarosegel-Elektrophorese

Die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte in 1%igen Agarose-

gelen mit 1x TAE-Elektrophoresepuffer bei 50–110 V. Den Agarosegelen wurde

Ethidiumbromid (SL 10 mg/ml) in einer Endkonzentration von 0,3 g/ml zugegeben.

Es wurden 5–10 l Probe pro Geltasche eingesetzt. Vor dem Auftragen auf das Aga-

rosegel wurde die Probe im Verhältnis 1:5 mit Gelladepuffer gemischt.

2.2.13 Western Blot im Semi dry-Verfahren

Für den spezifischen Nachweis eines Proteins wurden die Proteine aus dem PAA-Gel

auf eine PVDF-Membran transferiert. Die Membran, das PAA-Gel und die Filterpa-

piere wurden in Towbin-Blotpuffer (Towbin et al., 1979) eingeweicht und dann in der

Blot-Apparatur zu einem Sandwich geschichtet, so daß das Proteingel zur Anode und

die Nitrocellulose zur Kathode zeigte. Durch Anlegen eines Stromes von 1 mA


32

je cm2 Gelfläche wurden die Proteine für eine Stunde auf die Membran transferiert.

Um die Proteine direkt nach dem Transfer auf der Membran sichtbar zu machen, wur-

de die Membran für 5 min mit Ponceau S-Lösung inkubiert und anschließend mit

A. bidest. der überschüssige Farbstoff abgewaschen. Durch Zugabe der Blockierlö-

sung und Inkubation für eine Stunde auf dem Kipptisch wurde die unspezifische Pro-

teinbindung auf der Membran blockiert und die Ponceau S-Färbung wieder entfernt.

Nach zweimaligem Waschen der Membran mit TBS-T wurde der primäre Antikörper,

mit dem ein betreffendes Protein nachgewiesen werden sollte, 1:1.000 in Blockierlö-

sung verdünnt und für eine Stunde auf die Membran gegeben. Anschließend wurde

die Membran fünfmal für je 5min mit TBS-T gewaschen und danach der mit Alkali-

scher Phosphatase gekoppelte Spezies-spezifische Zweitantikörper zugefügt. Nach

einer erneuten Inkubation für eine Stunde auf dem Kipptisch wurde wieder fünfmal

mit TBS-T gewaschen. Zur Detektion der Proteine wurde die Membran in AP-Färbe-

lösung inkubiert, bis Banden sichtbar wurden und die Färbelösung dann mit A. bidest.

abgespült.

Ergebnisse

33

3 Ergebnisse

3.1 Etablierung der Zweidimensionalen Gelelektrophorese

Die Ergebnisse und die Reproduzierbarkeit der 2D-Elelektrophorese sind stark von

den Bedingungen, unter denen diese durchgeführt wird, abhängig. Dies bedeutet, daß

eine Anpassung der Methode an den jeweiligen Einsatzzweck unumgänglich ist.

Zunächst waren die notwendigen Einzelschritte nach den Hinweisen der Hersteller

ausgeführt bzw. aus der vorhandenen Literatur übernommen worden. Zur Reinigung

der Proben wurden zwei geeignete Methoden getestet und die Ergebnisse miteinander

verglichen.

Eigene Erfahrungen führten zur Anpassung der Methodik an die Untersuchungsob-

jekte: die humanen Zellinien HepG2 und HeLa. Die Ergebnisse dieses Optimierungs-

prozesses sowie die daraus erarbeitete „Anleitung für Proteomuntersuchungen an

HepG2-Zellen“ werden nachfolgend präsentiert.

3.1.1 Optimierung einzelner Arbeitsschritte

3.1.1.1 Vermeidung nachträglicher Proteindegradation

Um den nachträglichen Abbau von Proteinen zu verhindern, sollte die Ernte der Zel-

len möglichst schnell erfolgen.

Der PBS-Puffer, mit dem Medium- und Serumreste vom Zellrasen gewaschen wer-

den, sollte 4 °C kalt sein.

Da die zellwandlosen Zellen mit Rehydratisierpuffer lysierbar sind, sollte dieser auch

hierfür verwendet werden. Mehrere Vorteile sind damit verbunden: Die Probe liegt so

bereits in der Rehydratisierungslösung vor und die Komponenten des Puffers sind mit

der TCA/Aceton-Fällung verträglich. Da der Puffer stark denaturierend wirkt, kann

– soweit die Proben rasch aufgearbeitet werden – auf die Zugabe von Proteinase-

Inhibitoren verzichtet werden.

Nach der TCA/Aceton-Fällung, welche zuverlässig Proteinasen inaktiviert (Görg et

al., 2000), war in den Proben auch nach längerer Lagerung (12 Wochen bei -80 °C)

kaum Abbau von Proteinen feststellbar.

Ergebnisse

34

3.1.1.2 Reinigung der Proben

Eine direkte Verwendung des Lysats für die isoelektrische Fokussierung war nicht

möglich.

DNA, Membranbestandteile und andere im Solubilisierungspuffer schlecht lösliche

Verbindungen verstopfen die Poren der IPG-Streifen. Salze und kleinmolekulare ge-

ladene Verbindungen wie Oligonukleotide stören die Fokussierung durch zu hohe an-

fängliche Feldstärke. Dies hatte ein „Ausbrennen“ der Gele, bevorzugt am kathodi-

schen Ende, bzw. Präzipitatbildung zur Folge.

Es war also ein zusätzlicher Reinigungsschritt erforderlich. Zwei Methoden wurden in

Betracht gezogen und verglichen: die Ultrafiltration der Proben und die TCA/Aceton-

Proteinfällung nach Görg (Görg et al., 1997).

3.1.1.3 Vergleich von TCA/Aceton-Fällung und Ultrafiltration

Die Abb. 3-1 zeigt Coomassie-gefärbte Gele, die mit je 250 l TCA/Aceton-gefälltem

bzw. ultrafiltriertem Gesamtzellysat beladen wurden. Deutlich ist zu erkennen, daß

nach TCA/Aceton-Fällung eine wesentlich höhere quantitative Ausbeute an Protein

als nach Ultrafiltration der Proben erreicht wurde.

pH 4 pH7 pH 4 pH7

Abbildung 3-1 Vergleich des Proteinmusters nach TCA/Aceton-Fällung und Ultrafiltration

der Proben. Links: 250 l Gesamtzellysat HepG2, pH 4-7, TCA/Aceton-Fällung; rechts:

250 l Gesamtzellysat HepG2, pH 4-7, Ultrafiltration.

Zudem war die Auflösung des 2D-Musters, die sich durch die Anzahl darstellbarer

Proteine beschreiben läßt, bei TCA-Fällung um mehr als 25 % höher als bei Ultrafil-

tration des Zellysats (Abb. 3-2). Einzelne Proteinspots, die nach einer TCA-Fällung

deutlich erschienen, waren nach paralleler Ultrafiltration der gleichen Probe kaum zu

sehen oder nicht vorhanden.

Ergebnisse

35

TCA-Fällung

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000S

po

ts/

Ge

l

TCA-Fällung Ultrafiltration

Ultrafiltration

Abbildung 3-2 Links: Vergleich der Anzahl der Spots bei TCA/Aceton-Fällung und Ultrafil-

tration der Proben in 3 Experimenten. Rechts: Auflösung und Abundanzen einzelner Pro-

teine im Gel (je 250 l HepG2-Zellysat, gleiche Probe, paralleler Lauf, Ausschnitt)

Im Vergleich zur TCA-Fällung waren die Proteine der äußeren pI-Bereiche nach Ul-

trafiltration der Proben undeutlich aufgelöst und horizontal streifig. Vor allem am

kathodischen (basischen) Ende wurden über schmale Bereiche des IPG-Streifens die

Proteine überhaupt nicht fokussiert (Abbildung 3-1) und teilweise waren Bereiche leer

(d.h. proteinfrei).

3.1.1.4 Proteingehaltsbestimmung

Die möglichst genaue Proteingehaltsbestimmung war entscheidend für die Vergleich-

barkeit des 2D-Musters verschiedener Proben. Nur bei gleichen aufgetragenen Ge-

samtproteinmengen ließen sich reproduzierbare Aussagen über die Abundanzen ein-

zelner Proteine treffen bzw. wurden 2D-Muster verschiedener Proben überhaupt erst

vergleichbar.

3.1.1.5 Rehydratisierung der IPG-Streifen

Wegen ihrer deutlich einfacheren Handhabbarkeit wurde in den vorliegenden Unter-

suchungen nur die sogenannte aktive Rehydratisierung (in-gel-rehydration; (Rabilloud

et al., 1994) betrachtet. Hierbei wird die Probe bereits mit der Rehydratisierungslö-

sung zu den Streifen gegeben.

Wichtig war die Beachtung der maximalen Quellfähigkeit der IPG-Streifen: Die Auf-

nahmefähigkeit der 24 cm-Streifen liegt bei ca. 500 l Lösung/Streifen. Dieses Volu-

men sollte nicht überschritten werden, da vor allem große Proteine eher in Flüssig-

keitsresten zurückbleiben, als sich in die Gelmatrix zu „zwängen“ (Görg et al., 2000).

Ergebnisse

36

Die aktive Rehydratisierung sollte bei Raumtemperatur und mindestens über Nacht,

besser noch für 24 h, erfolgen. Auch nach mehr als 16 h Inkubationsdauer wurden von

den Streifen noch Flüssigkeitsreste aufgenommen. Aus bereits oben zitiertem Grund

sollte die Rehydratisierung deshalb bis zur vollständigen Aufnahme der Probenflüs-

sigkeit durch die Streifen erfolgen.

3.1.1.6 Bedingungen der isoelektrischen Fokussierung

Je schmaler der pH-Gradient, desto länger die Fokussierdauer. IPG-Gele mit extrem

engem pH-Gradient (sogenannte narrow interval IPGs) wurden nicht getestet. Wie aus

Tab. 2-1 ersichtlich, wichen die optimalen Fokussierzeiten der verwendeten Streifen

jedoch abhängig vom pH-Gradient deutlich voneinander ab. Für die 24 cm-Streifen

mit einem pH-Bereich von 3–10 bzw. der nichtlinearen Variante 3–10NL waren

61 kVh Fokussierzeit ausreichend, die Streifen gleicher Größe mit einem pH-Bereich

von 4–7 benötigten 71 kVh. Die Ursache liegt darin, daß die Proteine im flachen Gra-

dient weite Strecken mit niedriger Eigenladung zurücklegen müssen.

Da sich die Streifen durch die angelegten hohen Spannungen stark erwärmen, ist eine

effektive Wärmeableitung notwendig. Als Kontaktflüssigkeit zwischen Kühlblock

und Trägerfolie der Streifen wurde deshalb Silikonöl eingesetzt. Als Folge lokaler

Überhitzungen durch den schlechten Kontakt zur Kühlplatte wurde über Luftblasen

mehrmals dauerhafte oder vorübergehende Präzipitatbildung beobachtet. Darum soll-

ten die Streifen möglichst luftblasenfrei in das Silikonöl gebettet werden.

3.1.1.7 SDS-PAGE-Bedingungen

Für die gleichbleibende Qualität der Gele sind neben der Güte der für die Polymerisa-

tionslösung verwendeten Chemikalien und deren genauer Einwaage auch die Bedin-

gungen während der Polymerisation entscheidend.

Zu niedrige Temperaturen (z.B. bei Verlagerung des Gelgießstandes in den Kühl-

schrank) und zu kurze Polymerisationszeiten hatten nachteiligen Einfluß auf die Qua-

lität der Gele. In der Gelmatrix findet eine langsame Nachpolymerisation statt

(Westermeier, 1990). Deshalb sollten die SDS-PAA-Gele der zweiten Dimension

immer einen Tag vor Verwendung hergestellt werden und bei Raumtemperatur

auspolymerisieren.

Für die Reproduzierbarkeit sehr wichtig waren die Bedingungen während der Elektro-

phorese. Starke angelegte Spannungen verkürzten zwar die zeitliche Dauer der Elek-

trophorese, bewirkten aber ein in die Länge gezogenes Spotmuster. Die einzelnen

Ergebnisse

37

Punkte waren nicht klar rund, sondern zogen Spuren nach. Die Über-Nacht-

Elektrophorese bei 90 V stellte einen guten Kompromiß dar zwischen Spotqualität

und möglichen Diffusionsverlusten aufgrund der verlängerten Trennungszeit. Außer-

dem hatte dies den Vorteil, daß bei unterschiedlicher Beladung der Laufkammer keine

Anpassung des Programms an die Zahl der Gele notwendig war. Bei der anfänglich

benutzten Laufkammertemperatur von 12 °C waren teilweise laufbedingte Unter-

schiede im 2D-Muster festzustellen. Die Kühlung der Kammer schaffte es nicht, die

Temperatur in allen Punkten der Kammer über die gesamte Laufzeit konstant zu hal-

ten. Deshalb erfolgte die Trennung bei 20 °C, was auch Görg et al. empfehlen (Görg

et al., 2000).

3.1.1.8 Vergleich verschiedener Färbemethoden

In der vorliegenden Arbeit wurden einfache Coomassie-Blue-, kolloidale Coomassie-

Blue- und Silber-Färbung nach Mann (Shevchenko et al., 1996) getestet und die Fär-

beergebnisse verglichen.

Die Färbung mit dem kolloidalen Comassie-Blue erreichte im visuellen Vergleich

parallel gefärbter Gele nicht ganz die Sensitivität der Silbernitrat-Färbung. Allerdings

war bei Färbung mit Silbernitrat eher die Sättigung erreicht. Coomassie wies dagegen

einen weiteren linearen Bereich auf, was für die ausgeführten Proteomuntersuchun-

gen, bei denen die relative Proteinmenge einzelner Spots über die Intensität der Fär-

bung quantifiziert wurde, von Vorteil war. Es zeigte sich, daß die gewählte Färbeme-

thode entscheidenden Einfluß auf die Struktur des 2D-Musters der untersuchten Pro-

ben und damit auf die Reproduzierbarkeit hatte, weil jedes Protein eine spezifische,

von anderen Proteinen unterschiedliche Affinität zum jeweiligen Farbstoff besitzt

(Westermeier, 1990).

Einige Proteine, die nach kolloidaler Coomassie-Färbung deutliche Spots ergaben,

waren im parallel silbergefärbten Gel kaum zu detektieren, wie Abb. 3-3 zeigt. Um-

gekehrt waren einige durch Silbernitrat angefärbte Spots im coomassiegefärbten Gel

nicht aufzufinden. Verantwortlich sind die schon erwähnten unterschiedlichen Affi-

nitäten der einzelnen Proteine zum jeweiligen Farbstoff. Nach unterschiedlichen Me-

thoden gefärbte Gele waren deshalb nicht vergleichbar.

Für die Coomassie-Färbung waren vergleichsweise wenige Arbeitsschritte notwendig.

Die Anwendung war sehr einfach und wenig fehleranfällig. Die gefärbten Gele waren

Ergebnisse

38

praktisch frei von störender Hintergrundfärbung, blieben stabil und längere Zeit lager-

fähig.

HepG2-Gesamtzellysat; 0,5 mg Protein/Gel, Aus-schnitt, kolloidale Coomassie-Färbung

HepG2-Gesamtzellysat; 0,5 mg Protein/Gel, Aus-schnitt, Silberfärbung

Abbildung 3-3 Vergleich von kolloidaler Coomassie- und Silbernitrat-Färbung. Sowohl im

coomassiegefärbten als auch im silbergefärbten Gel sind Spots detektierbar, die im jeweils

anderen fehlen oder deutlich unterschiedlich gefärbt erscheinen.

Silbergefärbte Gele dagegen waren brüchig, was nachfolgende Schritte wie das Scan-

nen stark erschwerte. Hintergrundfärbung war als teilweise deutlich wolkiger Schmier

vorhanden, der die Auswertung behinderte. Unterschiedlich entwickelte Gele wiesen

starke Intensitätsdifferenzen auf. Weil die optimale Entwicklungszeit für einzelne

Gele beträchtlich schwankte, war eine feste Zeitvorgabe jedoch nicht möglich. Ein-

zelne Spots waren in Richtung Kathode langgezogen, ein Phänomen, das mit verblie-

benen DTT-Resten in Zusammenhang stehen könnte.

Wegen der deutlich einfacheren Handhabung bei vergleichbarem Färbeergebnis wur-

de die Kolloidale Coomassie-Färbung in das Protokoll für Proteomuntersuchungen

humaner HepG2-Zellen integriert.

3.1.2 Vorgeschlagenes Protokoll für Proteomuntersuchungen des

Gesamtzellysats von HepG2-Zellen mittels 2D-Gelelektro-

phorese

Nachfolgend wird das Protokoll, wie es in der vorliegenden Arbeit zur Anwendung

kam, stichpunktartig vorgestellt. Die einzelnen Arbeitschritte wurden detailliert schon

im Methodenteil der Arbeit unter 2.2 erläutert.

1. viermaliges Waschen des Zellrasens mit 4 °C kaltem PBS-Puffer

2. Lyse der HepG2-Zellen mit Solubilisierungslösung

Ergebnisse

39

3. Ultraschallbehandlung des Zellysats (Mikrospitze, 10 x 5 sec, Pulse 2, 55 %)

4. TCA/Aceton-Fällung

5. Resuspendierung des Proteinpellets in Rehydratisierungslösung

6. Sedimentation unlöslicher Fragmente durch Ultrazentrifugation der Probe

(15 min, 75.000 g, 16 °C)

7. Bradford-Proteingehaltsbestimmung und Einstellung der Proben auf definier-

ten Proteingehalt von 1 mg/ml mit Rehydratisierungslösung

8. aktive Rehydratisierung der 24 cm IPG-Streifen (500 l Probenvolumen – ent-

sprechend 0,5 mg Protein, 24 h bei RT)

9. Isoelektrische Fokussierung (Multiphor II™-System, Streifen mit Silikonöl

überschichtet, stufenweise Erhöhung der Spannung von 150 V auf 3.500 V,

IPG 3-10, 3-10NL: ca. 72 kVh, IPG 4-7: ca. 61 kVh)

10. anschließend unverzüglich Äquilibrierung der IPG-Streifen zur Reduzie-

rung/Alkylierung der Proteine und Beladung mit SDS (2 x 15 min)

11. anschließend SDS-PAGE als zweite Dimension (EttanDALTtwelfe™ -System,

3 h bei 30 V und ca. 16 h bei 90 V, Gele einen Tag vorher gießen)

12. Färbung der Proteine im Gel (kolloidale Coomassie-Färbung, 1 h fixieren,

Färbung über Nacht, waschen in 20 % Methanol)

Die gleiche Arbeitsanleitung war ohne Einschränkung auch zur Proteomanalyse von

HeLa-Zellen nutzbar. Die Übertragung auch auf andere humane Zellinien ist daher

wahrscheinlich unproblematisch. Die Methode in der vorliegenden Form ist außerdem

auch für Proteomuntersuchungen an HepG2-Zellen im größeren Maßstab, wie z.B.

zur Charakterisierung des Wirkmechanismus neuartiger Naturstoffe, geeignet.

3.1.3 Systembedingte Variabilität des Spotmusters einer Probe

Um Unterschiede im 2D-Muster verschiedener Proben zu bewerten, ist es notwendig,

den Fehler des Experiments zu kennen. Bei der 2D-Elektrophorese äußert sich dieser

Fehler in nichtrealen signifikanten Intensitätsunterschieden einzelner Spots. Diese

Artefakte können auf zwei Ebenen entstehen: bei der Probenaufarbeitung,

-applikation und -trennung und später bei der computergestützten Auswertung der

2D-Muster. Sie sind unvermeidlich und der Grund, warum die Ergebnisse einer

2D-Elektrophorese durch mehrfache Wiederholung abgesichert werden müssen.

Ergebnisse

40

Bei Versuchen zur Ermittlung dieses experimentellen Fehlers wurden identische Pro-

ben in gleicher Menge auf IPG-Streifen geladen, fokussiert und anschließend parallel

im gleichen Lauf nach Molekülmasse getrennt. Die sich ergebenden 2D-Muster wie-

sen Unterschiede auf, die 5 bis 10 % aller detektierten Spots umfaßten. Das bedeutet,

5 bis 10 % aller detektierten Spots wurden im Vergleichsgel entweder nicht gefunden

oder wurden dort mit signifikant unterschiedlicher Intensität erkannt. Die detektierten

Unterschiede betrafen fast ausschließlich Spots nahe der Auflösungsgrenze und waren

häufig die Folge abweichender Proteinmengen zwischen den Vergleichsgelen infolge

Toleranzen bei Beladung der IPG-Streifen und Proteinverlusten während IEF, Äquili-

brierung und SDS-PAGE (Görg et al., 2000). Zum Teil wurden Artefakte erst durch

die Analyse-Software zu solchen gemacht, weil Proteinspots aufgrund von Verzer-

rungen im 2D-Muster falsch zugeordnet wurden, weil Hintergrundfärbung fälschlich

zu einem Spot aufsummiert wurde oder weil ein Spot zwar in allen Vergleichsgelen

vorhanden war, aber einmal nicht detektiert wurde. Beispiele hierfür werden in der

Abb. 3-7 gezeigt.

Da der Fehler bei diesen Versuchen deutlich variabel war, sollte jedes

2D-Elektrophorese-Experiment individuell auf seinen Fehler getestet werden. Dazu

wird der Vergleich der parallelen Gele des Experiments (z.B. der Kontrollgele) emp-

fohlen.

3.2 Nachweis Coxsackievirus B3-induzierter Änderungen

des Proteinmusters von HepG2-Zellen

Mit dem optimierten Protokoll sollten Einflüsse von Coxsackievirus B3 auf das Pro-

teom von HepG2-Zellen untersucht werden. Dazu wurde der dichtgewachsene

HepG2-Zellrasen mit einer CVB3H3-Suspension angeimpft und bis zu gerade sicht-

baren zytopathischen Effekten weiterinkubiert. Nach 12 h Inkubationsdauer waren

diese lichtmikroskopisch an abgerundeten Zellen und zerstörten Arealen eng be-

grenzten Umfanges im Zellrasen erkennbar.

Die Proteine des Zellysats wurden in zwei 24 cm-IPG-Streifen fokussiert und an-

schließend nach Molekulargewicht im SDS-PAA-Gel aufgetrennt. In gleicher Weise

erfolgte die Präparation einer nichtinfizierten Kontrolle. Wie Abb. 3-4 zeigt, unter-

schied sich das Proteom der HepG2-Zellen nach 12 h Infektionsdauer deutlich von

dem der nichtinfizierten Kontrollzellen.

Ergebnisse

41

Da also der Replikationszyklus der Coxsackieviren bis zur Freisetzung neuer Virus-

partikel in HepG2-Zellen ca. 12 Stunden in Anspruch nahm, war die Frage interes-

sant, ob bereits zu einem früheren Zeitpunkt der Replikation Veränderungen auf Pro-

teomebene detektierbar sein würden. Deshalb wurde das Proteom 6 Stunden nach In-

fektion der HepG2-Zellen mit CVB3H3, vor sichtbaren mikroskopischen Verände-

rungen, analysiert. Bereits zu diesem Zeitpunkt waren Unterschiede in der Proteinaus-

stattung zwischen infizierten und nichtinfizierten Zellen feststellbar (Abb. 3-4). Diese

waren allerdings von deutlich geringerem Umfang als die nach 12 Stunden detektier-

ten Veränderungen.

Abbildung 3-4 Proteinmustervergleich CVB3H3-infizierter HepG2-Zellen. Links: nichtinfi-

zierte Kontrolle, Mitte: 6 h nach Infektion, Rechts: 12 h nach Infektion. Das 2D-Muster

infizierter Zellen (blau) wurde am Computer mit dem Spotmuster nichtinfizierter Kontroll-

zellen (orange) gematcht (in Übereinstimmung gebracht). Nichtregulierte Proteine er-

scheinen als schwarze Punkte, nach Virusinfektion neu bzw. verstärkt exprimierte Proteine

sind blau und infolge der Infektion reprimierte bzw. degradierte Proteine erscheinen

orange. Das blau-orange-Matching zweier Kontrollgele zeigt eine relativ hohe Überein-

stimmung beider Spotmuster. Nach sechs Stunden sind bereits deutliche Einflüsse der Vi-

rusinfektion auf das Proteom der HepG2-Zellen an regulierten – blau bzw. orange ge-

färbten – Spots erkennbar. Zwölf Stunden nach Infektion der Zellen waren noch erheblich

mehr Proteine in ihrer Abundanz verändert.

Nach Auswertung der 2D-Muster konnte die vom Replikationszyklus des Virus ab-

hängige Regulation mehrerer Wirtszellproteine gezeigt werden. Abbildung 3-5 zeigt

die Regulation zweier potentiell zur Familie der Phosphodiesterasen gehörender Pro-

teine. Die räumliche Nähe der beiden Spots zueinander legt nahe, daß es sich um zwei

Isoformen eines Proteins handeln könnte. Für eine sichere diesbezügliche Aussage

waren die SELDI-MS-Daten allerdings zu ungenau.

Ergebnisse

42

Abbildung 3-5 Zeitabhängige Regulation mehrerer Proteine (bzw. verschiedener Isoformen

eines Proteins) mit Homologie zur Familie der Phosphodiesterasen. Gegenüber der Kon-

trolle ist 6 h nach Infektion eine signifikante Zunahme der Intensitäten der beiden Spots

rechts im Bild erkennbar; 12 Stunden nach Infektion sind die Spots fast vollständig ver-

schwunden.

Die in der Wirtszelle auf Proteomebene stattfindenden Veränderungen während der

Infektion und Replikation der Viruspartikel in eine zeitliche Abfolge zu bringen, stellt

also einen interessanten und vielversprechenden Ansatz dar, dessen detaillierte Unter-

suchung die Kenntnisse über den Replikationsvorgang und die beteiligten Kompo-

nenten der Wirtszelle entscheidend erweitern kann.

3.2.1 Veränderungen im Proteom von HepG2-Zellen 12 Stunden

nach Infektion mit CVB3H3

Ausführlich wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit das Stadium 12 Stunden nach

Infektion untersucht. Zur Infektion der HepG2-Zellen wurde Kulturflaschen mit

dichtgewachsenem Zellrasen (> 95 % Konfluenz) das Medium entnommen, die Zellen

mit 1-2 ml (je nach Flaschengröße) CVB3H3-Suspension überschichtet, nach 45-

minütiger Inkubation unter leichtem Schwenken erneut mit Medium versetzt und für

12 Stunden weiterkultiviert. Die Behandlung der Kontrollzellen erfolgte in gleicher

Weise, statt Virus-Suspension erhielten diese ein äquivalentes Volumen virusfreien

PBS-Puffers. Das Experiment wurde zweimal unabhängig ausgeführt. Die Proteine

des jeweils gewonnenen Zellysats wurden in zwei unabhängigen Läufen pro Experi-

ment je zweimal aufgetrennt, so daß sowohl von der nichtinfizierten Kontrolle als

auch von den infizierten Zellen je 8 Gele zur Auswertung zur Verfügung standen.

Nach dem Scannen der Gele wurden die Bilddateien mit der Proteinanalysesoftware

Proteomweaver ausgewertet. Die Abbildung 3-5 zeigt am Computer orange und blau

Ergebnisse

43

getönte und nach dem Matching virtuell übereinandergelegte 2D-Muster eines Kon-

trollgels und eines Gels mit dem Zellysat des 12 Stunden-Infektionsstadiums aus dem

Experiment I. Zur detaillierten Auswertung war diese Darstellungsoption nicht geeig-

net.

Abbildung 3-6 Das Proteom von nichtinfizierten und CVB3H3-infizierten, 12 Stunden postin-

fektional kultivierten HepG2-Zellen im orange-blau-Matching. Die Punkte des Kontroll-

gels wurden orange eingefärbt, die Punkte des Gels mit dem Proteom der infizierten Zel-

len blau. Proteine mit unveränderter Abundanz erscheinen übereinandergelegt schwarz,

Spots mit größerer Intensität im 2D-Muster der Kontrolle erscheinen ± orange und Spots

mit größerer Intensität im 2D-Muster des 12 Stunden-Stadiums ± blau. Ausgewählte Spots

sind vergrößert dargestellt.

Allerdings können auf diese Weise Abweichungen im Spotmuster unmittelbar erfaßt

und anschaulich gemacht werden. In der Intensität gleichbleibende d.h. nichtregulierte

Spots erscheinen schwarz, Spots mit einer Intensitätsabnahme zwischen Kontrolle und

12 Stunden-Stadium (z.B. infolge Degradation) erscheinen ± orange und Spots mit

Ergebnisse

44

einer Intensitätszunahme (z.B. infolge verstärkter Expression) erscheinen ± blau. So-

wohl negativ als auch positiv regulierte Spots sind zu erkennen, potentiell unmittelbar

bzw. mittelbar als Folge der Infektion.

Da jedoch auch durch die Probenaufarbeitung verursachte Intensitätsschwankungen

einzelner Proteine mitunter ein signifikantes Niveau erreichten (siehe folgender Ab-

schnitt), sind wahrscheinlich nicht alle in Abb. 3-6 sichtbaren Unterschiede tatsäch-

lich die Folge der Infektion.

3.2.1.1 Abschätzung des experimentellen Fehlers

Da Intensitätsunterschiede und Differenzen im Spotmuster selbst zwischen Gelen mit

identischer Probe unvermeidlich waren, war es für die Bewertung und Einordnung der

Ergebnisse der Proteinanalyse wichtig, diesen internen Fehler der 2D-Elektrophorese

etwa abschätzen zu können. In beiden Experimenten wurden deshalb die Gele der

nichtinfizierten Kontrollzellen untereinander verglichen. Diese waren mit identischer

Probe gleicher Menge beladen worden, und sollten demzufolge paarweise untereinan-

der identische 2D-Muster aufweisen. Tatsächlich vorhandene Abweichungen sind ar-

tifiziell und lassen erkennen, wie groß der interne Fehler des jeweiligen Experiments

war. Tabelle 3-1 zeigt jeweils vergleichend die Daten des ersten Laufs beider Experi-

mente.

Tabelle 3-1 Festgestellte Abweichungen zwischen Gelen mit nichtinfiziertem Zellysat. Die

Gele waren mit identischer Probe in gleicher Menge beladen worden. Exemplarisch sind

die Ergebnisse des jeweils ersten Laufs beider Experimente dargestellt.

Anzahl

Spots/Gel

Abweichungen zum

Vergleichsgel (in %)

Intensitätsunter-

schiede

im Vergleichsgel

nicht vorhanden

Experiment I:

Kontrollgel 1 1861 237 (12,7 %) 7 230

Kontrollgel 2 1842 278 (15,1 %) 5 273

Experiment II:

Kontrollgel 1 2422 136 (5,6 %) 3 133

Kontrollgel 2 2394 151 (6,3 %) 3 148

Der Fehler des ersten Experiments war mit durchschnittlich 13,9 % tendenziell größer

als der des zweiten Experiments mit durchschnittlich 6,0 %. Das bedeutet, daß bei der

anschließenden Analyse der 2D-Muster CVB3H3-infizierter und nichtinfizierter

Ergebnisse

45

HepG2-Zellen rund 14 bzw. 6 % Abweichung infolge des internen Fehlers der 2D-

Elektrophorese zu erwarten waren.

Als signifikant unterschiedlich in der Intensität wurden 12 Spots im ersten und 6 im

zweiten Experiment erkannt. Damit erreichten artifizielle Intensitätsunterschiede nur

in wenigen Fällen ein signifikantes Niveau (Abb. 3-7d). Zum Teil war dies auf fehler-

haftes Matching, d.h. auf von der Software falsch zugeordnete Spots zurückzuführen

(Abb. 3-7c). Die weitaus meisten Abweichungen ergaben sich daraus, daß Spots nur

in einem der beiden Vergleichsgele detektiert wurden. In einigen Fällen wurde unzu-

lässig Hintergrundrauschen bzw. Proteinschmier zu Spots aufsummiert (Abb 3-7a),

die im Vergleichsgel folgerichtig nicht zu finden waren. Meist handelte es sich jedoch

um Proteine an der Auflösungsgrenze, die zwar als Schatten in beiden Vergleichsge-

len vorhanden waren, aber von der Software nur einmal detektiert wurden (Abb 3-7b).

Abbildung 3-7 Verschiedene Arten des Zustandekommens artifizieller Unterschiede zwischen

2D-Mustern aus einer einzigen Probe. Bei a) und c) handelt es sich nicht um echte Unter-

schiede: beide sind Interpretationsfehler der Analyse-Software. Die Fälle b) und d) sind

zurückzuführen auf artifizielle Abundanzunterschiede, die während der Aufarbeitung ent-

standen sind. a) Intensitätsunterschied infolge aufsummierten Hintergrundes; b) Spot vor-

handen, aber nur einmal detektiert; c) Intensitätsunterschied infolge Falschmatching eines

Spots; d) echter signifikanter Intensitätsunterschied eines Spots.

Ursache für die mangelnde Spoterkennung war, daß die eingestellten Parameter zur

Spoterkennung (Spotdurchmesser, Intensität, Kontrast) einen Schwellenwert defi-

nierten, der im Gel A erreicht, im Gel B jedoch unterschritten wurde. Die Erhöhung

Ergebnisse

46

der Empfindlichkeit minderte zwar dieses Problem, ging aber einher mit vielen aus

bloßem Hintergrundrauschen detektierten Pseudospots.

3.2.1.2 Analyse des Proteinmusters CVB3H3-infizierter HepG2-Zellen und

Vergleich mit dem Proteom nichtinfizierter Zellen

Die aus beiden Experimenten vorhandenen Gele wurden den beiden Gruppen „nicht-

infizierte Kontrolle“ und „CVB3-infiziert“ zugeordnet und die zusammengehörenden

Gele eines Laufs paarweise verglichen. Aus Spots, die nur in einem der beiden Gele

aufzufinden waren, sowie aus Spots mit signifikanter Abweichung in der Intensität

wurde ein Analyse-Set erstellt. Als signifikante Abweichung galt der mindestens drei-

fache Intensitätsunterschied eines Spots. Der paarweise Vergleich der 2D-Muster

CVB3H3-infizierter und nichtinfizierter Zellen erbrachte im ersten Experiment 1367

und in der unabhängigen Wiederholung 691 signifikante Unterschiede (Tab. 3-2).

Dies entsprach einer prozentualen Abweichung von 29 % für das erste und 15 % für

das zweite Experiment. Das Proteom der infizierten Zellen war damit im ersten Expe-

riment deutlich abweichender von der Kontrolle als im zweiten Experiment, was zum

Teil durch den größeren Fehler des ersten Experiments erklärbar ist.

Die Abb. 3-8 zeigt Beispiele der detektierten Unterschiede. Der Grund für die Zu-

nahme bzw. Abnahme der Intensitäten einzelner Spots zwischen Kontrollgel und Gel

der infizierten Zellen ist als unmittelbare bzw. mittelbare Folge der CVB3H3-

Infektion interpretierbar. Eine Zunahme ist erklärbar durch die alleinige Expression

bzw. die verstärkte Expression des entsprechenden Proteins in den infizierten Zellen.

Außerdem bewirken Modifikationen eines Vorläuferproteins, die Veränderungen der

beiden Trennparameter (pI und Molekülmasse) zur Folge haben, daß der entsprechen-

de modifizierte Zustand ausschließlich im Gel der infizierten Zellen detektierbar ist.

Das Vorläuferprotein muß dann allerdings an anderer Stelle im Kontrollgel zu finden

sein und im Gel der infizierten Zellen an Intensität abnehmen, weil es als Folge der

Infektion in seinen modifizierten Zustand überführt wird. Eine Intensitätsabnahme

kann außerdem durch den vollständigen oder teilweisen Abbau des entsprechenden

Proteins hervorgerufen werden.

Wurden Spots nur einmal, d.h. ausschließlich im Gel einer Kontrolle bzw. eines

12 Stunden-Stadiums detektiert (Abb 3-8a und c), bedeutet dies jedoch nicht zwangs-

läufig, daß die entsprechenden Proteine auf einen Zustand beschränkt vorkamen.

Ergebnisse

47

a) nur in infiziert b) nur in Kontrolle

c) signifikant stärker in infiziert d) signifikant stärker in Kontrolle

Abbildung 3-8 Beispiele für die festgestellten Intensitätsunterschiede. Jeweils links im Bild

der Ausschnitt eines Kontrollgels, rechts der gleiche Ausschnitt eines Gels des 12 Stunden-

Stadiums der CVB3H3-Infektion.

Die Abundanz eines entsprechenden Proteins war immerhin soweit verändert, daß es

in einem der Vergleichsgele nicht aufgelöst werden konnte. Allerdings werden die

meisten der in der Zelle vorkommenden Proteine wegen ihres geringen Expressions-

niveaus durch die 2D-Elektrophorese nicht erfaßt.

Die zunächst automatisch generierten Analysedaten (Tab. 3-2) wurden manuell edi-

tiert, weil der begrenzte Durchsatz der SELDI-Technologie nicht die Bearbeitung al-

ler vorhandenen Unterschiede erlaubte.

Tabelle 3-2 Ermittelte Abweichungen im 2D-Muster zwischen Kontrollgelen und Gelen der

infizierten Zellen beider Experimente und Anzahl weiterbearbeiteter Spots.

Unterschiede (Software):

nur in Kontrolle nur in infiziert Kontr. stärker infiziert stärker gesamt [%]

Exp. I 709 549 62 47 1367 29

Exp. II 354 307 14 16 691 15

Subauswahl (weiterbearbeitete Spots):

nur in Kontrolle nur in infiziert Kontr. stärker infiziert stärker gesamt [%]

Exp. I 8 30 5 8 51 1

Exp. II 14 23 2 4 43 1

Ergebnisse

48

Dabei wurden offensichtlich durch die Analysesoftware verursachte artifizielle Unter-

schiede (infolge fehlerhafter Detektion bzw. Falschmatching) aus dem Analyse-Set

entfernt.

Die im Set verbliebenen Proteinspots (Tab. 3-2) wurden aus den Gelen ausgeschnit-

ten, mit Trypsin verdaut und mittels Peptidmassenfingerprinting am SELDI-

Massenspektrometer analysiert.

3.2.2 Analyse des ersten Experiments

3.2.2.1 Peptidmassenfingerprinting

Zieht man die ermittelten 14 % falschunterschiedlichen Spots von den 29 % Gesamt-

unterschied ab, ergeben sich rein rechnerisch 15 % echte Unterschiede. In der Praxis

wurde mit 51 Spots nur gut 1 % zur weiteren Bearbeitung ausgewählt. Die Massen-

spektren der mit Trypsin verdauten Spots wurden bearbeitet, indem Signale, die allen

Spektren gemeinsam waren (wie Matrix- und Trypsin-Autolyse-Peaks), eliminiert

wurden. Die verbliebenen Signale wurden als Peptidmassen interpretiert und ergaben

jeweils charakteristische Fragmentmuster. Mit der Online-Anwendung ProFound

wurden die in den Proteindatenbanken NCBI und SwissProt gelisteten Proteine nach

der Ähnlichkeit ihrer Peptidmuster zu denen der regulierten Proteine durchsucht. Ei-

nem Teil der massenspektrometrisch analysierten Proteinspots konnte auf diese Weise

ein bestimmtes Protein zugeordnet werden (Tab. 3-3). Bei allen identifizierten Protei-

nen handelte es sich um Proteine der Wirtszelle. Die Treffergenauigkeit war für

MAPK p38 , Prohibitin, Dynein light intermediate chain und Tubulin 1-chain be-

sonders hoch. Die CVB3H3-abhängige Regulation dieser vier Proteine wurde deshalb

zusätzlich auf Transkriptionsebene überprüft (Abschnitt 3.2.2.3). Sieben der identifi-

zierten Proteine wurden ausschließlich bzw. mit signifikant höherer Intensität in den

Gelen der infizierten Zellen gefunden. Diese Proteine wurden also vermutlich infekti-

onsabhängig verstärkt exprimiert bzw. entstanden durch posttranslationale Modifika-

tionen aus Vorläufern. Sechs der identifizierten Proteine wurden ausschließlich bzw.

mit signifikant höherer Intensität in den Gelen der nichtinfizierten Kontrollzellen ge-

funden, was die vollständige bzw. teilweise Degradation oder Modifikation dieser

Proteine im Infektionsverlauf wahrscheinlich macht.

Ergebnisse

49

Tabelle 3-3 Im Experiment I regulierte und durch SELDI-Peptidmassenanalyse identifizierte

Proteine. Während in der linken Spalte die Proteine abgebildet sind, die infektionsabhän-

gig entstehen bzw. verstärkt in Erscheinung treten, werden in der rechten Spalte die Pro-

teine aufgelistet, die infektionsabhängig vollständig bzw. teilweise verschwinden. Bei zu-

sammengehörigen Bildpaaren wird jeweils links der Zustand in der nichtinfizierten Kon-

trolle dargestellt.

Experiment I

Intensitätszunahme infolge CVB3H3-

Infektion

Intensitätsabnahme infolge CVB3H3-

Infektion

MAPK p38 (SAPK 2a, MAPK 14) Solute carrier family 39

Hypothetical protein FLJ20651 Apolipoprotein A-IV Precursor

Unnamed protein product BAB14332.1 Dynein light intermediate chain

Ubiquitously-expressed transcript, Iso-

form 2

Sulfated glycoprotein 2

Ergebnisse

50

Tabelle 3-3 Fortsetzung

Prohibitin 3’5’ Cyclic-nucleotide phosphodiesterase

CTP synthetase 2 Hypothetical protein KIAA0546

Tubulin 1-chain

3.2.2.2 Nachweis der infektionsabhängigen posttranslationalen Modifikation

eines Proteins

Es gelang der Nachweis der infektionsabhängigen posttranslationalen Modifikation

eines Proteins. Zwei Proteinspezies mit gleichem Molekulargewicht, die jeweils nur

im Gel der nichtinfizierten Kontrollzellen bzw. im Gel der infizierten Zellen detektiert

wurden, unterschieden sich in ihrem isoelektrischen Punkt um ca. 0,3 pH-Einheiten

(Abb. 3-9). Wie die massenspektrometrische Untersuchung beider Proteinspots ergab,

handelte es sich um ein und dasselbe Protein. Datenbankvergleiche erbrachten jedoch

keine gute Übereinstimmung des Fragmentmusters mit denen bereits bekannter Pro-

teine, so daß die Identifizierung und funktionelle Einordnung dieses Proteins im

Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht möglich war. Eine mögliche Erklärung für den

pI-Shift bietet jedoch die einfache Phosphorylierung des Proteins, die eine Ansäue-

rung um ca. 0,3 pH-Einheiten bewirkt (F. Lottspeich, mündliche Mitteilung).

Ergebnisse

51

pH 4,7 pH 5 pH 4,7 pH 5

a) nichtinfiziert b) 12 h CVB3H3-infiziert

Abbildung 3-9 Nachweis der CVB3H3-abhängigen posttranslationalen Modifikation eines

Wirtszellproteins mit der Technik der 2D-Gelelektrophorese. Bei dem rot umrandeten

Proteinspot handelt es sich in beiden Bildern um das gleiche Protein. Der infektionsab-

hängige pI-Shift könnte die Folge einer Phosphorylierungsreaktion sein.

3.2.2.3 Bestätigung der infektionsabhängigen Regulation der Mitogen-

aktivierten Proteinkinase p38 (MAPK p38 ) durch RT-PCR

Die gefundene infektionsabhängige Regulation von Prohibitin, Dynein light interme-

diate chain, Tubulin 1-chain und MAPK p38 wurde zusätzlich auf Transkriptions-

ebene überprüft.

Dies geschah durch RT-PCR.

Mit dieser Methode sind

quantitative Untersuchungen

des Transkriptoms möglich.

Dazu wurde die Gesamt-

RNA von CVB3H3-

infizierten bzw. nichtinfi-

zierten HepG2-Zellen isoliert

und in cDNA umgeschrie-

ben. Die Zahl identischer

mRNA-Transkripte wird bei

diesem einfachen Kopiervor-

gang in die gleiche Zahl

cDNA-Moleküle übersetzt,

so daß die ursprünglichen

mRNA-Abundanzen unver-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M

Abbildung 3-10 Agarosegel der RT-PCR-Produkte von

Prohibitin, Dynein light intermediate chain, Tubu-

lin 1-chain und MAPK p38 . 1;2 = MAPK p38 ,

3-6 = Kontrollen: 3;4 = -Aktin, 4;6 = Kapsidpro-

tein VP1, 7;8 = SIVA, 9;10 = Dynein light interme-

diate chain, 11;12 = Tubulin 1-chain.

Ergebnisse

52

ändert übernommen werden.

Nach einer PCR-Reaktion und der anschließenden Trennung der PCR-Produkte im

DNA-Agarosegel ist an der Bandenstärke das ursprünglich in vivo vorhandene

Transkriptionsniveau der interessierenden Gene anhand der entsprechenden amplifi-

zierten mRNA-Moleküle ablesbar. Für MAPK p38 konnte ein sehr deutlicher An-

stieg des Expressionsniveaus infolge der Infektion mit CVB3H3 auch auf Transkripti-

onsebene gezeigt werden (Abb.3-10), was übereinstimmt mit der Detektion des als

MAPK p38 identifizierten Proteinspots ausschließlich im Gel der infizierten Zel-

len.Für die Proteine Prohibitin, Dynein und Tubulin 1-chain war die im 2D-Gel auf

Proteinebene erkennbare Regulation nicht in gleicher Weise durch RT-PCR auf

mRNA-Ebene nachvollziehbar.

3.2.3 Analyse des zweiten Experiments

3.2.3.1 Peptidmassenfingerprinting

Die ausgewählten und ausgeschnittenen 43 Proteinspots wurden analog zu den Spots

des ersten Experiments mit Trypsin verdaut. Die Massen der resultierenden Peptid-

fragmente wurden per SELDI-MS bestimmt. Wegen eines Defekts am Detektor des

SELDI-Gerätes waren diese Untersuchungen jedoch nicht erfolgreich. Deshalb wur-

den die Spots der entsprechenden Parallelgele ausgeschnitten und der Arbeitsgruppe

Proteinanalytik von Prof. F. Lottspeich, Max-Planck-Institut für Biochemie, Martins-

ried bei München zur Untersuchung am Massenspektrometer (MALDI-TOF-TOF)

zugesandt. Neben einigen Spots, die nicht identifizierbar waren, wurden verschiedene

Isoformen von Aktin und Tubulin detektiert, die infektionsabhängig in höherer Kon-

zentration vorlagen. Erneut wurde beispielsweise eine infektionsabhängige Intensi-

tätssteigerung des Tubulin 1-Spots nachgewiesen. Diese gefundenen Veränderun-

gen besitzen allerdings vermutlich geringe Aussagekraft, denn als Zellstrukturproteine

sind Aktin und Tubulin einem ständigen Auf- und Abbau unterworfen, unabhängig

von einem pathogenen Befall der Zelle.

Der im ersten Experiment als MAPK p38 identifizierte und im zweiten Experiment

in gleicher Weise regulierte Spot konnte im zweiten Experiment wegen unzureichen-

der Signalstärke leider nicht erneut identifiziert werden.

Ergebnisse

53

Tabelle 3-4 Im Experiment II regulierte und durch MALDI-Peptidmassenanalyse identifizierte

Proteine. Während in der linken Spalte die Proteine abgebildet sind, die infektionsabhän-

gig entstehen bzw. verstärkt in Erscheinung treten, werden in der rechten Spalte die Pro-

teine aufgelistet, die infektionsabhängig vollständig bzw. teilweise verschwinden. Bei zu-

sammengehörigen Bildpaaren wird jeweils links der Zustand in der nichtinfizierten Kon-

trolle dargestellt.

Experiment II

Intensitätszunahme infolge CVB3H3-

Infektion

Intensitätsabnahme infolge CVB3H3-

Infektion

nicht zu identifizieren (MAPK p38 ) ATP-dependent RNA helicase DDX19

(DEAD-box protein 19)

Tubulin 1-chain Protein disulfide isomerase, Precursor

(PDI)

ATP-dependent DNA Helicase II, 80 kDa Plasma retinol-binding protein, Precursor

-Aktin, -Aktin Eukaryotischer Translationsinitiations-

faktor 3, Untereinheit 6 (eIF-3 p48)

Ergebnisse

54

Tabelle 3-4 Fortsetzung

UTP-Glucose-1-phosphate uridylyltransfe-

rase 2

3.2.4 Übereinstimmend regulierte Proteine

In Abhängigkeit der Infektion mit CVB3H3 entstandene Intensitätsunterschiede ein-

zelner Proteinspots sollten reproduzierbar in allen Wiederholungen des Experiments

in gleicher Weise wiederkehren. Mit hoher Übereinstimmung wurde die infektionsab-

hängige Intensitätssteigerung des als MAPK p38 identifizierten Spots detektiert.

Insgesamt wurden sieben der 51 ausgewählten Spots des ersten Experiments unter den

43 ausgewählten Spots des zweiten Experiments gleichreguliert an gleicher Stelle im

2D-Muster wiedergefunden. Abgesehen von MAPK p38 konnten diese Proteine bis-

her nicht identifiziert werden, weil keine entsprechenden Fragmentmuster in den Da-

tenbanken gefunden wurden. Es ist also davon auszugehen, daß die gefundenen Pro-

teine bisher unbekannt sind bzw. bisher nicht sequenziert wurden.

Diskussion

55

4 Diskussion

4.1 Etablierung der Zweidimensionalen Gelelektrophorese

Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst die Zweidimensionale Gelelektrophorese

etabliert und für die geplanten Proteomuntersuchungen an humanen Leberkarzinom-

zellen optimiert. Die Aufgabe dabei war, ein Protokoll zu entwickeln, das einfach an-

zuwenden ist und gute Reproduzierbarkeit mit einer möglichst hohen Auflösung

kombiniert.

4.1.1 Reproduzierbarkeit der 2D-Gelelektrophorese

Obwohl bereits nahezu 30 Jahre bekannt, hat die 2D-Gelelektrophorese erst in den

letzten Jahren breite Anwendung erfahren, nicht zuletzt aufgrund zahlreicher Detail-

verbesserungen, welche die Reproduzierbarkeit der Methode deutlich erhöhten.

Trotzdem ist die Handhabung relativ schwierig geblieben. In erster Linie existiert kein

allgemeingültiges Rezept, das die Proteine aus Proben verschiedener Herkunft glei-

chermaßen gut auftrennt. Zudem ist nach wie vor eine gewisse Kunstfertigkeit im

Umgang mit den Gerätschaften erforderlich.

Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse eines Experiments ist an die Vergleichbarkeit

der Spotmuster des Experiments und seiner unabhängigen Wiederholungen gebunden.

Wie die unter 3.1 vorgestellten Ergebnisse deutlich machen, können auch kleine Ab-

weichungen in den Versuchsbedingungen großen Einfluß auf die Qualität des 2D-

Musters haben. Eine gute Reproduzierbarkeit ist deshalb erst mit einem auf die jewei-

lige Fragestellung abgestimmten Protokoll gegeben und hängt in starkem Maße von

der einwandfreien Gleichhaltung der äußeren Bedingungen ab.

Mit dem unter 3.1.2 vorgestellten Protokoll wurde für die anvisierten Untersuchungs-

objekte – humane Zellinien wie HepG2 oder HeLa – bei relativ einfacher Handha-

bung eine zuverlässige Reproduzierbarkeit erreicht. Die Vergleichbarkeit der Spotmu-

ster der bis zu 12 Gele, die mit der vorhandenen Ausrüstung in einem 2D-

Elektrophorese-Lauf möglich sind, war sehr gut. Trotzdem waren Abundanzschwan-

kungen einzelner Proteine bei parallel aufgearbeiteten und vollkommen gleichbehan-

delten Proben nicht zu vermeiden. Die Ursachen sind systembedingt und können sehr

vielgestaltig sein. Zum einen sind der Genauigkeit gerätetechnisch Grenzen gesetzt:

Diskussion

56

Alle verwendeten Geräte einschließlich Densitometer und Analysesoftware arbeiten

mit einem inneren Fehler. Beispielsweise sind in der Vertikalkammer bauartbedingt

kleine Temperaturdifferenzen zwischen verschiedenen Gelen unvermeidlich, was zu

Abweichungen im Spotmuster führen kann. Auch Pipetten arbeiten mit einem inneren

Fehler. Infolge des Pipettenfehlers gering voneinander abweichende Proteinmengen

verschiedener Proben können verursachen, daß ein Protein an der Auflösungsgrenze

im Gel der Probe I gerade noch erkennbar, aber im Gel der Probe II nicht mehr vom

Hintergrund zu unterscheiden ist. Zum anderen ist die manuelle Ausführung der not-

wendigen Arbeitsschritte als Fehlerursache in Betracht zu ziehen. Als besonders feh-

leranfällige Arbeitsschritte stellten sich die Proteingehaltsbestimmung, die isoelektri-

sche Fokussierung und die Übertragung der IPG-Streifen auf die SDS-PAA-Gele der

zweiten Dimension heraus. Die Beachtung der zu den angeführten Punkten im Ergeb-

nisteil unter 3.1.1 erarbeiteten Hinweise und die möglichst vollständige Gleichhaltung

aller beeinflußbaren experimentellen Bedingungen verringerte die Fehlergröße be-

trächtlich.

Bei der vergleichenden Analyse verschiedener Spotmuster im experimentellen Teil

der Arbeit war dieser absolute Fehler zu berücksichtigen. So war die Abgrenzung tat-

sächlicher Abundanzunterschiede von experimentellen Artefakten teilweise schwie-

rig. Durch Wiederholung der Experimente konnten Artefakte allerdings erfaßt und

von tatsächlichen regulierten Proteinen (mit differentem Expressionsniveau) unter-

schieden werden.

Die 2D-Muster der Gele verschiedener Läufe waren direkt nur eingeschränkt ver-

gleichbar, in erster Linie deshalb, weil die Proteinanalysesoftware als Folge von lauf-

bedingten Unterschieden des Spotmusters teilweise Probleme hatte, einzelne Prote-

inspots einander zuzuordnen. Proben, deren 2D-Muster verglichen werden sollten,

wie z.B. CVB3-infizierte und nichtinfizierte Zellen eines Experiments, wurden des-

halb immer parallel behandelt und parallel, d.h. in einem Lauf, in der zweiten Dimen-

sion aufgetrennt. Die Reproduzierung eines Experiments erfolgte mehrmals unabhän-

gig, jeweils mit unabhängiger Auswertung. Die herausgefilterten Unterschiede im

Spotmuster wurden verglichen und annotiert. Erscheint ein Unterschied zuverlässig in

allen Wiederholungen (mind. fünfmalig; F. Lottspeich, mündliche Mitteilung) des

Experiments, gilt dieser als real, d.h. ein experimentelles Artefakt kann ausgeschlos-

sen werden.

Diskussion

57

Es war nicht möglich, die Ergebnisse der in der vorliegenden Arbeit ausgeführten Ex-

perimente auf diese Weise statistisch abzusichern. Einige der unter 3.2 gezeigten Da-

ten tragen deshalb vorläufigen Charakter und bedürfen weiterer Verifizierung.

4.1.2 Verbesserung des Auflösungsvermögens der Zweidimensio-

nalen Gelelektrophorese

4.1.2.1 Solubilisierung der Proteine

Für Proteomuntersuchungen sollte die Solubilisierung der Proteine einer Probe so um-

fassend wie möglich erfolgen, denn nur vollständig gelöste Proteine werden ord-

nungsgemäß fokussiert.

Der Probenpuffer/Solubilisierungspuffer stellt immer einen Kompromiß dar zwischen

der möglichst umfassenden Solubilisierung aller Proteine einer Probe und der Ver-

träglichkeit der verwendeten Chemikalien mit den Gegebenheiten der IEF.

Beispielsweise bleibt die Verwendung des sehr effektiven anionischen Detergenz

SDS für die 2D-Gelelektrophorese die Ausnahme, weil die gebildeten negativ gelade-

nen Protein-SDS-Mizellen die Eigenladungen und damit die isoelektrischen Punkte

der Proteine vollständig überdecken. Die Fokussierung unter Anwesenheit von SDS

kann überhaupt nur bei kathodischem Probenauftrag, wobei die Probe während der

IEF über kleine Trichter (sample cups) appliziert wird, funktionieren. Die negativ ge-

ladenen Protein-SDS-Mizellen müssen dann während des Laufs in Gegenwart von

Harnstoff aufgelöst werden. Allerdings gilt der kathodische Probenauftrag als pro-

blematisch, weil in hohem Maße mit Proteinaggregation an der Auftragsstelle ver-

bunden (Westermeier, 1990). Eine beispielsweise zur Solubilisierung von Membran-

proteinen (Santoni et al., 2000) verwendete Variante besteht aus der initialen Ver-

wendung von SDS im Solubilisierungsgemisch. Vor der Fokussierung wird das SDS

durch Verdünnung der Probe mit einem nicht- bzw. zwitterionische Detergenzien ent-

haltenden Puffer von den Proteinen verdrängt (Harder et al., 1999). Trotzdem kann

SDS auch in geringen Konzentrationen unscharf fokussierte Proteine und damit hori-

zontale Streifen im 2D-Muster verursachen.

Zur Verbesserung der Löslichkeit bei gleichzeitiger Verträglichkeit mit der IEF sind

zahlreiche Arbeiten veröffentlicht worden. Häufig wird die stark chaotrope Substanz

Thioharnstoff als Bestandteil des Solubilisierungspuffers empfohlen (Rabilloud, 1998;

Rabilloud et al., 1997).

Diskussion

58

Als Detergenzien wurden traditionell häufig Triton X-100 und Nonidet P-40 benutzt.

Wegen deren Unverträglichkeit mit der Silberfärbung (starke Hintergrundfärbung)

kommt heute vielfach das zwitterionische Sulfobetain CHAPS zur Anwendung. Aber

auch neuartige zwitterionische Detergenzien, z.B. aus der Gruppe der Amidosulfobe-

taine (Chevallet et al., 1998) wurden getestet.

Als Reduktionsmittel wird häufig DTT eingesetzt. Allerdings liegt es im alkalischen

Milieu geladen vor und wandert deshalb während der Fokussierung Richtung Anode.

Es kommt zur Unterversorgung des basischen Bereichs des Gels mit DTT, was zur

Reoxidation von SH-Gruppen und damit einhergehend zu reduzierter Löslichkeit ver-

schiedener Proteine führen kann (Görg et al., 2000). Vor allem für extrem basische

Gradienten (bis > pH 12) wird deshalb das ungeladene Tributylphosphin (TBP) emp-

fohlen (Santoni et al., 2000).

Für die vorliegende Arbeit wurde als Lyse-, Solubilisierungs- und Rehydratisie-

rungslösung zugleich der Thioharnstoff-Puffer von Rabilloud (Rabilloud, 1998) in

leicht modifizierter Form verwendet. Als chaotrope Substanz enthält dieser Thioharn-

stoff, als Detergenz das zwitterionische CHAPS und als Reduktionsmittel DTT. Die

unzureichende Auflösung des basischen Bereichs bei Verwendung von DTT konnte

bestätigt werden. Statt DTT wurde deshalb das seit kurzer Zeit kommerziell erhältli-

che Reagenz DeStreak (Amersham, Freiburg) nach Herstellerangabe der Rehydrati-

sierungslösung zugesetzt, was eine deutlich verbesserte Auflösung des basischen Be-

reichs zur Folge hatte.

Die Ultraschallbehandlung des Lysats war nützlich, weil Membranen und hochmole-

kulare Nukleinsäuren wirksam zerkleinert wurden und die Probe dadurch weniger

viskos erschien. An Membransystemen oder Nukleinsäuren assoziierte Proteine wer-

den mechanisch abgetrennt und gelangen so besser in Lösung (Görg et al., 2000).

4.1.2.2 Ultrafiltration oder TCA/Aceton-Fällung?

Beide Methoden sind in der Handhabung einfach und sicher. Die TCA/Aceton-

Fällung ist im Vergleich zur Ultrafiltration mit geringerem Material- und Kostenauf-

wand verbunden. Vom Zeitbedarf her ähneln sich beide Methoden: jeweils 4 h sind zu

veranschlagen.

Im folgenden werden die Auswirkungen beider Methoden auf das 2D-Muster des

HepG2-Proteoms diskutiert. Die Abbildung 3-2 macht deutlich, daß die Auflösung

des Spotmusters, die sich durch die Anzahl darstellbarer Proteine beschreiben läßt, bei

Diskussion

59

TCA-Fällung um mehr als 25 % höher ist als bei Ultrafiltration des Zellysats. Einzel-

ne Proteinspots, die nach der TCA-Fällung deutlich erschienen, waren nach paralleler

Ultrafiltration der gleichen Probe kaum zu sehen oder nicht vorhanden (Abb. 3-2).

Möglicherweise verantwortlich dafür ist der vor der Ultrafiltration notwendige Ultra-

zentrifugationsschritt, der unlösliche Bestandteile der Probe abtrennt. Dies sind haupt-

sächlich Teile der Zellmembran bzw. der zellinternen Membransysteme einschließlich

integrierter bzw. assoziierter Proteine. Diese Proteine werden durch die TCA/Aceton-

Fällung potentiell zugänglich für die 2D-Analyse, weil hier in Gegenwart von Aceton

die Lipidschichten von den Membranproteinen entfernt werden (Rabilloud, 1996).

Damit ist die Methode geeignet, Membranproteine anzureichern. Da die Spots jedoch

im einzelnen nicht durch massenspektrometrische Analyse identifiziert wurden, ist

nicht sicher zu entscheiden, ob die nach Ultrafiltration der Probe fehlenden Proteine

als experimentelle Artefakte während der Fällung (z.B. durch pI-Shift infolge Carba-

mylierung oder Degradation) erzeugt wurden. In der Literatur finden sich allerdings

keine Hinweise auf derart destruktive Eigenschaften der TCA/Aceton-Fällung.

Der Grund für die bessere Auflösung der äußeren pH-Bereiche bei der TCA/Aceton-

Fällung liegt in der im Vergleich zur Ultrafiltration besseren Reinigungsleistung be-

gründet. Denn Lipide und Salze behindern die IEF erheblich und werden bei der Fäl-

lung durch Waschen des Proteinpellets mit Aceton effektiv entfernt (Görg et al.,

1997), was durch Ultrafiltration der Proben vermutlich nicht in diesem Maße gegeben

ist.

Bei der TCA-Aceton-Fällung sind allerdings qualitative Proteinverluste durch inkom-

plette Fällung bzw. durch unvollständige Resolubilisierung des getrockneten Pellets

im Anschluß an die Fällung nicht auszuschließen (Görg et al., 1997). Theoretisch

ebenso möglich sind artifizielle Modifikationen einzelner Proteine, woraus sich ein

verändertes Laufverhalten dieser Proteine ergeben kann.

Wegen der insgesamt deutlichen Vorteile gegenüber der Ultrafiltration wurde die

TCA/Aceton-Fällung in das Protokoll für Proteomuntersuchungen an HepG2-Zellen

integriert.

4.1.2.3 Bedingungen der Isoelektrischen Fokussierung

Für ein hochauflösendes Ergebnis der 2D-Gelelektrophorese war vor allem die best-

mögliche Isoelektrische Fokussierung der Proteine entscheidend. Neben den bereits

Diskussion

60

diskutierten Maßnahmen, die letztlich alle der verbesserten Fokussierung dienten, wa-

ren die Bedingungen während der Fokussierung selbst ebenso wichtig.

Fokussierzeiten:

Fokussiert wurde so lange, bis bei maximaler angelegter Spannung kein weiterer

Stromstärkeabfall mehr stattfand, bis also eine Art Fließgleichgewichtszustand (stea-

dy state) erreicht war. Die anfänglich höhere Leitfähigkeit der Streifen wird mit der

Zeit, wenn in der Probe verbliebene Ionen ausgewandert sind und die ersten nieder-

molekularen Proteine ihren pI erreicht haben, immer geringer. Deshalb wurde, um die

Stromstärke über die Dauer der Fokussierung etwa konstant zu halten, die Spannung

stufenweise angehoben (siehe Tabelle 2-1). Zu hohe anfängliche Stromstärken resul-

tieren in Präzipitatbildung und verstärkter Elektroendoosmose, was zu Leitfähig-

keitslücken bzw. zerstörten Gelen führen kann (Westermeier, 1990). Proben mit rela-

tiv hoher verbliebener Salzkonzentration können zunächst eine Stunde bei 50 V „ent-

salzt“ werden (Görg et al., 2000).

Temperatur:

Die pH-Gradienten der IPG-Streifen variieren in Abhängigkeit der Temperatur. Görg

und Mitarbeiter konnten zudem temperaturabhängige ungerichtete Positionsver-

schiebungen einzelner Proteine nachweisen (Görg et al., 1991). Daher ist die Tempe-

raturkontrolle bei der Isoelektrischen Fokussierung für die Reproduzierbarkeit der

2D-Gelelektrophorese wichtig. Erhöhte Temperaturen bei der IEF wirken sich positiv

auf die Auflösung des 2D-Musters aus (Görg et al., 1991). Entgegen der früher emp-

fohlenen 10 °C wird heute meist bei 20 °C fokussiert. Die meisten kommerziell er-

hältlichen Streifen sind dementsprechend für diese Temperatur konfektioniert.

4.2 Coxsackievirus B3-induzierte Änderungen der Protein-

ausstattung von HepG2-Zellen

Nachdem die 2D-Elektrophorese etabliert und die Parameter soweit optimiert waren,

daß das Proteom von HepG2-Zellen reproduzierbar in hoher Auflösung dargestellt

werden konnte, wurde die 2D-Elektrophorese benutzt, um die Mechanismen der Cox-

sackievirus-Infektion am Zellkulturmodell auf Proteomebene zu studieren. Dabei war

zunächst die Frage interessant, inwieweit die 2D-Elektrophorese in der Lage ist, die

bei einer Infektion auftretenden Änderungen des Proteoms der Wirtszelle zu visuali-

Diskussion

61

sieren. Die Frage, ob potentiell für die Replikation und Pathogenese des Virus wichti-

ge Änderungen lokalisierbar wären, war der nächste Schritt.

4.2.1 Die Zellkultur als Modell

Um den Verlauf der Virusinfektion im Herzmuskel detaillierter untersuchen zu kön-

nen, wird häufig die Maus als Tiermodell genutzt. Zahlreiche Tiere mit unterschiedli-

chem genetischen Hintergrund stehen zur Verfügung und eine Reihe humanpathoge-

ner Virusstämme sind an das murine System adaptiert worden. Das murine Modell

erweist sich aber für Proteomuntersuchungen als nur bedingt geeignet, da externe,

proteomverändernde Einflüsse (z.B. Streß) schwer auszuschließen sind. Weil die be-

fallenen Gewebsareale diffus im Herzmuskel verteilt vorliegen, wären Gewebsproben

befallener Herzen daher inhomogen und würden sich aus infizierten und nichtinfi-

zierten Myozyten, verschiedenen Immunzellen und anderen angrenzenden Zelltypen

zusammensetzen. Moderne Mikromanipulationsmethoden wie die Laser Capture Mi-

crodissection (LCM) liefern zwar weitgehend homogenes Material, die erhaltenen

Mengen wären für eine präparative Analyse größerer 2D-Gele aber vollkommen un-

zureichend.

Die Zellkultur stellt dagegen ein vergleichsweise einfach zu überwachendes Modell-

system dar. Größere Mengen homogenen Materials können problemlos bereitgestellt

werden. Allerdings werden die Verhältnisse im Organismus sehr stark vereinfacht

nachgestellt. Soll aber der Verlauf der CVB3-Infektion per se untersucht werden, ist

diese Vereinfachung zulässig. Die verwendeten HepG2-Zellen entstammen einem he-

patozellulären Karzinom und werden hinsichtlich ihrer erhaltenen physiologischen

Eigenschaften als relativ natürlich angesehen (Aden et al., 1979; Knowles and Aden,

1983; Knowles et al., 1980). Sie sind durch CVB3H3 infizierbar, es kommt zur Virus-

replikation und das Virus verursacht zytopathische Effekte im Zellrasen. Damit sind

HepG2-Zellen als zelluläres Modell zum Studium der CVB3-Infektion geeignet.

4.2.2 Durch 2D-Elektrophorese detektierte Unterschiede

Wie die vorliegenden Proteomuntersuchungen der CVB3H3-infizierter HepG2-Zellen

zeigen, kann die 2D-Elekrophorese einen wichtigen Beitrag zur Aufklärung an Virus-

replikation und -ausbreitung beteiligter Wirtszellproteine leisten.

Diskussion

62

Es konnten deutliche Unterschiede im Proteom nichtinfizierter und CVB3H3-

infizierter HepG2-Zellen nachgewiesen werden. Auch die infektionsabhängige Modi-

fikation eines Wirtszellproteins aus der Familie der Phosphodiesterasen, möglicher-

weise durch Phosphorylierung eines Aminosäurerestes, wurde belegt. Zudem wurde

die infektionsabhängige Induktion der Mitogen-aktivierten Proteinkinase p38

(MAPK p38 ) durch gesteigerte Expression dokumentiert.

4.2.2.1 Fehlerraten beider Experimente

Wie der Vergleich der Kontrollgele ergab, lag der Fehler des ersten Experiments bei

etwa 14 % und der des zweiten Experiments (einer unabhängigen Wiederholung) bei

etwa 6 %. Das heißt, 14 bzw. 6 % aller detektierten Spots wiesen signifikante Inten-

sitätsunterschiede auf, obwohl in den Vergleichsgelen dieselbe Probe in gleicher

Menge und unter identischen Bedingungen aufgetrennt wurde. Für den Vergleich

zwischen Kontrollgel und Gel der infizierten Zellen bedeutete dies, daß etwa 14 %

bzw. 6 % der detektierten Intensitätsunterschiede durch experimentelle Artefakte her-

vorgerufen wurden. Von den sich bei 29 % (Exp. I) bzw. 15 % (Exp. II) Gesamtunter-

schied rechnerisch ergebenden 15 % bzw. 9 % echten Unterschieden wurde jedoch

mit 51 (Exp. I) bzw. 43 Spots (Exp. II) nur ein Bruchteil weiterbearbeitet, weil die

Auswahl durch visuelle Auslese stark eingeschränkt werden mußte. Das bedeutet, ne-

ben offensichtlichen Artefakten wurden wahrscheinlich zahlreiche echte Unterschiede

aussortiert. Die geringe Übereinstimmung beider Experimente hinsichtlich in gleicher

Weise regulierter Spots liegt zumindest teilweise hierin begründet. Denn auf Überein-

stimmung überprüfbar waren nur die endgültigen, manuell editierten Analyse-Sets. Es

besteht die Möglichkeit, daß ausgewählte Spots des ersten Experiments im zweiten

Experiment in gleicher Weise reguliert waren, aber zugunsten anderer aus dem Ana-

lyse-Set aussortiert wurden. Die Bearbeitung deutlich größerer Mengen verbot sich

jedoch aus wirtschaftlichen Gesichtspunkten, denn die SELDI-Technik arbeitet sehr

kostenintensiv und ist für einen vergleichsweise geringen Probendurchsatz konstru-

iert. Moderne MALDI-MS-Geräte bearbeiten Chips im 96 well- Format (oder größer)

mit hoher Geschwindigkeit und Genauigkeit und bieten damit die Möglichkeit, auch

mehrere Hundert Spots eines Gels zu analysieren.

Sofern die experimentellen Möglichkeiten vorhanden sind, sollten deshalb alle Spots

mit detektierten Unterschieden massenspektrometrisch analysiert und tatsächlich re-

Diskussion

63

gulierte Proteine von Artefakten durch mehrfache Wiederholung des Experiments

unterschieden werden.

4.2.2.2 Die Mitogen-aktivierte Proteinkinase p38 (MAPK p38 )

Sowohl im Experiment I als auch in der unabhängigen Wiederholung (Exp. II) wurde

im 2D-Gel CVB3H3-abhängig eine starke Intensitätszunahme des MAPKinase p38 -

Proteinspots detektiert. Zunächst konnte nicht geklärt werden, ob diese Intensitätszu-

nahme auf eine Aktivierung infolge Phosphorylierung oder auf die gesteigerte

Transkription des MAPK p38 -Gens zurückzuführen war. Durch RT-PCR konnte die

infektionsabhängige Induktion der MAPK p38-Gens auf Transkriptionsebene nach-

gewiesen werden, weshalb eine infektionsabhängige Zunahme der Proteinmenge

wahrscheinlich ist.

Mitogen-aktivierte Proteinkinasen sind evolutionär konservierte Enzyme, die Zell-

oberflächenrezeptoren mit regulatorischen Proteinen verbinden. Die p38-Signalwege

werden im allgemeinen durch inflammatorische bzw. streßauslösende Stimuli akti-

viert und sind in diskreten parallelen Signalkaskaden organisiert, in denen eine

MAPK Kinase Kinase (MKKK) eine dualspezifische MAPK Kinase (MKK) durch

Phosphorylierung aktiviert, und diese wiederum aktiviert die MAPK durch doppelte

Phosphorylierung an einem Threonin- und einem Tyrosin-Rest in einem Thr-Gly-Tyr-

Motiv (Clark et al., 2003). Von p38 MAPKinasen weiß man, daß sie vielfältige regu-

latorische nachgeordnete Proteine durch Phosphorylierung aktivieren. Als direkt bzw.

indirekt durch p38 aktivierte Zielobjekte sind verschiedene Transkriptionsfaktoren

(unter anderem MEF 2C/2A, p53, CREB, SRF, STAT1, SAP1), Proteinkinasen (wie

MK2, MK3/3pK, MNK1, MSK1/2) und andere Proteine wie cdc25B, die Hitze-

schockproteine Hsp25/27 und der Translationsinitiationsfaktor eIF-4E bekannt (Shi

and Gaestel, 2002). Das bedeutet, die p38 MAPKinase-Kaskade ist die zentrale

Schaltstelle eines weit verzweigten Signalnetzwerkes.

Die durch MAPK p38 aktivierten Transkriptionsfaktoren MEF 2C und 2A (myo-

cyte enhancer factors) binden die Promotorregionen zahlreicher muskelspezifischer

Proteine. Dem MAPK p38 -Weg wird deshalb eine Rolle bei der Kardiogenese, ein-

schließlich Kardiomyozyten-Differenzierung, -Apoptose und -Hypertrophie zuge-

sprochen (Davidson and Morange, 2000). In Monozyten resultiert die Aktivierung

von MEF 2C in vermehrter Transkription des unmittelbar frühen Gens c-jun (Han et

al., 1997), weshalb vermutet wird, daß MAPK p38 über die Regulation der Produkti-

Diskussion

64

on von c-Jun an Abwehrprozessen und Entzündungsreaktionen beteiligt ist. Die dau-

erhafte Aktivierung von MAPK p38 in transgenen Mäusen mit herzspezifisch kon-

stitutiv aktivierten MAPKinase Kinasen (MKK3 und MKK6) führte zum frühzeitigen

Tod der Tiere. Das pathologische Bild äußerte sich in stark vergrößerten Vorkam-

mern, deutlicher interstitieller Fibrosierung, verminderter Myozytenkontraktilität und

einem für Herzschwäche charakteristischem Expressionsprofil verschiedener fetaler

Gene (Liao et al., 2001). In Primärkulturen von Myozyten neonataler Ratten verur-

sachte die Aktivierung der MAPK p38 durch MKK3 eine Induktion des program-

mierten Zelltodes, während die Aktivierung von p38 der Apoptose-Induktion ant-

agonistisch entgegenwirkte (Ravingerova et al., 2003; Wang et al., 1998).

Eine CVB3-abhängige Aktivierung der MAP Kinase p38 wurde bisher nicht be-

schrieben. Allerdings ist bekannt, daß die Transduktion von Adenovirus-Vektoren in

humane Nierenepithel-Zellen (REC) über die Aktivierung von MAPK p38 zur Ex-

pression des pro-inflammatorischen Chemokins IP 10 (interferon-inducible prote-

in 10) führt. Die Aktivierung der MAPK p38 erfolgt jedoch unabhängig vom CAR

(Coxsackie- und Adenovirus-Rezeptor) (Tibbles et al., 2002). Der Kerntransport der

Adenovirus-RNA über den mikrotubuliabhängigen Dynein/Dynactin-Motorkomplex

scheint ebenfalls durch die p38 MAPK-Kaskade (einschließlich der nachgeordneten

Proteinkinase MK2) vermittelt zu sein (Suomalainen et al., 2001). Die Nutzung des

Dynein/Dynactin-Multiprotein-Motorkomplexes als Transportband Richtung Zellkern

ist in vielen Virusfamilien verbreitet. Von Coxsackieviren ist eine Interaktion zwi-

schen Virushülle und einer 8 kDa-Untereinheit des Komplexes, Dynein light chain 8

(LC8), bekannt (Martinez-Moreno et al., 2003).

Somit könnte die in HepG2-Zellen ermittelte Coxsackievirus-induzierte Aktivierung

von MAPK p38 in Herzmuskelzellen einerseits direkt in das Infektionsgeschehen

involviert sein. Denkbar wäre hier zum Beispiel eine Rolle bei der Vermittlung des

Kerntransports der Viruspartikel bzw. der CVB3-RNA, wie bei Adenoviren nachge-

wiesen. Andererseits ist die Aktivierung im Zuge einer Abwehrreaktion beispielswei-

se unter Vermittlung pro-inflammatorischer Signale denkbar. Bei Chronifizierung der

Erkrankung könnte MAPK p38 am komplexen Geschehen der Ausprägung einer

dilatativen Kardiomyopathie beteiligt sein. Da im Zusammenhang einer CVB3-

Infektion auch über apoptotische Vorgänge berichtet wurde (Carthy et al., 1998; Hen-

Diskussion

65

ke et al., 2000), ist auch in diesem Zusammenhang eine Beteiligung des p38 MAPK-

Signalweges nicht auszuschließen.

Zur genaueren Charakterisierung der Rolle von MAPK p38 bei CVB3-Infektionen

sollte zunächst durch Einsatz eines klassischen MAPK-Inhibitors wie SB203580, ei-

nem Pyridinyl-Imidazol, im Zellkulturmodell überprüft werden, ob bei Inhibierung

von MAPK p38 die Infektionsfähigkeit bzw. die Replikationsrate von CVB3 herab-

gesetzt sind. Sollte dies der Fall sein, wäre eine direkte Beteiligung des

MAPK p38 -Signalweges am Infektionsgeschehen wahrscheinlich. Sollten keine

Einflüsse auf die Vermehrungsrate feststellbar sein, ist es wahrscheinlich, daß

MAPK p38 indirekt durch Streß- bzw. pro-inflammatorische Stimuli aktiviert wird.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Induktion der MAPK p38 infolge gesteigerter

Transkription nachgewiesen. Um die phosphorylierte, physiologisch aktive Form der

MAPK p38 im infizierten Gewebe direkt nachzuweisen, sollte der

MAPK p38 -Phosphorylierungsgrad vor und während der Infektion z. B. über We-

stern Blotting mit gegen PP-MAPK p38 gerichteten Antikörpern untersucht werden.

Von großem Interesse wären auch Kenntnisse über den genauen Aktivierungsmecha-

nismus sowie über stromab aktivierte Effektormoleküle. Sollte sich eine Beteiligung

des MAPK p38 -Weges an der CVB3-induzierten Ausprägung einer chronischen

Myokarditis bzw. Dilatativen Kardiomyopathie bestätigen, wäre dies von großem the-

rapeutischem Interesse, denn es würden sich neue Ziele für eine medikamentöse Be-

handlung der Erkrankung ergeben.

4.2.3 Ausblick

Die vorliegende Arbeit bietet mehrere Ansatzpunkte für weiterführende Untersuchun-

gen. Bereits in der vorangegangenen Diskussion wurden einige ungelöste Fragen auf-

gegriffen. An dieser Stelle sollen diese Fragen und mögliche Strategien zu ihrer Be-

antwortung kurz zusammengefaßt werden.

Zunächst bedürfen die vorliegenden Ergebnisse weiterer Verifizierung. Das beschrie-

bene Experiment der zweidimensionalen elektrophoretischen Untersuchung des Pro-

teoms CVB3H3-infizierter HepG2-Zellen sollte zu diesem Zweck und zum ergänzen-

den Erkenntnisgewinn noch mehrmals wiederholt werden. Zusätzlich sollten diese

Untersuchungen auch auf andere infizierbare humane Zellkulturen ausgeweitet wer-

den. Gleichen sich die Ergebnisse in verschiedenen Zelltypen, wird die Übertragung

Diskussion

66

auf das natürliche System plausibler. Von großem Wert wäre in diesem Zusammen-

hang die Gewinnung einer Myozyten-Primärkultur aus der Maus.

Die MAPK p38 , die, wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden konnte, im

Zellkulturmodell CVB3H3-abhängig induziert wird, könnte eine wichtige Rolle bei

Pathogenese spielen. Wie bereits angedeutet, sollte zunächst geklärt werden, ob die

Inhibierung des Enzyms die Infektionsfähigkeit des Virus herabsetzt. Ebenso eine

Untersuchung des Phosphorylierungsgrad der MAPK p38 vor bzw. nach Infektion

mit CVB3 erfolgen, denn die Aktivierung der Proteinkinase erfolgt durch doppelte

Phosphorylierung. Um zu erfahren, auf welchem Weg die Induktion erfolgt, wäre eine

Analyse des Promotors zu erwägen. Dies könnte Bindestellen für Proteine offenbaren,

deren Beteiligung am Infektionsgeschehen bereits bekannt ist bzw. wichtige Hinweise

über mögliche Aktivatoren liefern.

Zusammenfassung

67

5 Zusammenfassung

Die vorliegende Arbeit beinhaltete zunächst die Etablierung der Zweidimensionalen

Gelelektrophorese und die Anpassung und Optimierung der Parameter an die effi-

ziente, reproduzierbare und hochauflösende Untersuchung des Proteoms von huma-

nen Zellinien, insbesondere der Leberkarzinomzellinie HepG2. Da die Sauberkeit der

Probe für ein hochauflösendes Ergebnis von besonderer Bedeutung ist, wurden zwei

verschiedene Reinigungsmethoden, die Ultrafiltration und die TCA/Aceton-Fällung

nach Görg, verglichen. Zur Anfärbung der Protein im Polyacrylamid-Gel wurden die

kolloidale Coomassie- und die reversible Silberfärbung nach Mann ausführlich gete-

stet. Die Ergebnisse dieses Optimierungsprozesses ermöglichten die Anfertigung ei-

ner Anleitung zur hochauflösenden und reproduzierbaren zweidimensionalen Tren-

nung des Proteoms von HepG2-Zellen. Ausführliche Beachtung fanden die Grenzen

des Systems, die zu einem Systemfehler führen, welcher zwischen 5 % und 10 %

liegt.

Die 2D-Elektrophorese wurde anschließend benutzt, um das Proteom Coxsackievirus

B3H3-infizierter HepG2-Zellen zu untersuchen. Coxsackieviren der B-Gruppe gelten

als die häufigsten Erreger der humanen Myokarditis. Die virusinduzierte Myokarditits

ist charakterisiert durch das Auftreten von Herzmuskelnekrosen und die Infiltration

inflammatorischer Zellen in die nekrotischen Bereiche. Die Chronifizierung der Er-

krankung führt zum kardialen Remodelling und äußert sich im pathologischen Bild

einer Dilatativen Kardiomyopathie mit terminaler Herzinsuffizienz.

Mit Hilfe der 2D-Elektrophorese konnten zahlreiche virusinduzierte Änderungen der

Proteinausstattung der HepG2-Wirtszellen nachgewiesen werden. Eine wichtige Er-

kenntnis stellt die CVB3H3-infektionsabhängige Induktion der Mitogen-aktivierten

Proteinkinase p38 dar. Dieses Signalmolekül ist in wichtige zelluläre Regelprozesse

in einer Vielzahl von Geweben eingebunden. In kardialen Myozyten ist es unter ande-

rem an Differenzierungsprozessen beteiligt, und es spielt auch bei pathologischen

Gewebsveränderungen wie Fibrosierungsprozessen oder Myozyten-Hypertrophien in

Reaktion auf Bluthochdruck eine wesentliche Rolle. Die Vermutung einer Beteiligung

der MAPK p38 am akuten virusinduzierten Entzündungsprozeß bzw. der Konversi-

Zusammenfassung

68

on der Entzündung in das klinische Bild der Dilatativen Kardiomyopathie ist insoweit

begründet.

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Heidelberg.

Danksagung

Diese Arbeit wurde in der Zeit von Mai 2003 bis April 2004 am Hans-Knöll-Institut

für Naturstoff-Forschung e.V. Jena in der Abteilung Molekulare Naturstoff-Forschung

durchgeführt.

Zuallererst möchte ich mich herzlich bei Frau Prof. Dr. Susanne Grabley für die

Möglichkeit, in ihrer Abteilung die vorliegende Diplomarbeit anzufertigen, bedanken.

Zudem wurde durch Frau Prof. Grabley die Aufgabe übernommen, das Zweitgutach-

ten zu dieser Arbeit zu erstellen. Auch dafür danke ich herzlich.

Mein besonderer Dank gilt Herrn PD. Dr. Thomas Munder, der mir stets als kompe-

tenter Betreuer zur Seite stand und in seiner lockeren Art ein optimistisches und er-

gebnisorientiertes Arbeitsklima schuf.

Die Zusammenarbeit mit dem Institut für Virologie der Friedrich-Schiller-Universität

war eine wichtige Grundlage für die Bearbeitung des vorgestellten Themas. Vor allem

danke ich hier Herrn PD. Dr. Andreas Henke für seine Unterstützung bei virologi-

schen Arbeiten.

Ebenso unverzichtbar war die Zusammenarbeit mit der Core Unit Chip Applications

des Instituts für Humangenetik der FSU. Die Benutzung des dortigen SELDI-Gerätes

ermöglichte die massenspektrometrische Vermessung relevanter Proteine, wofür ich

vor allem Herrn Dr. Christian Melle dankbar bin.

Alle Mitarbeiter und Nachwuchswissenschaftler der Abteilung Molekulare Natur-

stoff-Forschung haben mich in allen Phasen der Arbeit unterstützt, besonders durch

die angenehme Arbeitsatmosphäre. Dafür danke ich Alexander Raßmann, Janka

Teutschbein, Frau Dr. Katleen Gura, Katharina Mihatsch, Sebastian Günther, Dörthe

Peter und Andreas Busch. Durch die kritische Revision des Manuskripts trug Janka

Teutschbein in besonderem Maße zum Gelingen dieser Arbeit bei. Hierfür vielen

Dank.

Ganz besonders möchte ich mich bei meiner Familie bedanken, deren finanzielle und

ideelle Unterstützung das Studium und dessen erfolgreichen Abschluß erst ermög-

lichten. Dafür danke ich vor allem meiner Frau Christiane, meinen Eltern sowie mei-

nem Schwager Alexander, der mir am Computer eine große Hilfe war.

Coxsackievirus B3-induzierte Veränderungen des Proteoms ... · In einem „uncoating“ ge-...

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