Deckblatt Untersuchungen zu Struktur und Funktion eines...

Deckblatt Untersuchungen zu Struktur und Funktion

eines Porenproteins der äußeren Chloroplastenmembran

von Diplom-Biochemiker

Dirk Linke

aus Leonberg

von der Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften

der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften

-Dr. rer.nat.-

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuß:

Vorsitzender: Prof. Dr. R. Schomäcker, TU Berlin

Berichter: Priv. Doz. Dr. Petra Fromme, TU Berlin

Berichter: Prof. Dr. G. H. Findenegg, TU Berlin

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 10. Juli 2002

Berlin 2002 D 83

1

INHALT

DECKBLATT.............................................................................................................. 0

INHALT....................................................................................................................... 1

ZUSAMMENFASSUNG.............................................................................................. 4

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .................................................................................. 5

EINLEITUNG .............................................................................................................. 6

Die Erbse (Pisum Sativum)......................................................................................................6

Die Pflanzenzelle .......................................................................................................................7

Der Chloroplast.........................................................................................................................8 Aufbau.....................................................................................................................................8 Funktion des Chloroplasten in der pflanzlichen Zelle ............................................................9 Endosymbiontentheorie...........................................................................................................9

Die äußere Chloroplastenmembran......................................................................................10 Lipide der äußeren Chloroplastenmembran ..........................................................................10 Proteine der äußeren Chloroplastenmembran und ihre Funktion..........................................12 Proteinimport über die äußere und innere Chloroplastenmembran ......................................13 Proteinimport in die äußere Chloroplastenmembran ............................................................14

OEP16 ......................................................................................................................................14 Sequenzen..............................................................................................................................15 Aufbau...................................................................................................................................16 Funktion und Regulation.......................................................................................................16

Faltung von Membranproteinen ...........................................................................................19 Allgemeine strukturelle Eigenschaften von Membranproteinen...........................................19 Mechanismen der Insertion in die Membran in vivo .............................................................19 Thermodynamische Stabilität von Membranproteinen .........................................................20 Der Faltungsprozeß ...............................................................................................................21

Zielsetzung...............................................................................................................................23

MATERIAL UND METHODEN ................................................................................. 25

Überexpression von OEP16 in E.coli ....................................................................................25

Reinigung von OEP16 ............................................................................................................25

SDS-Gelelektrophorese ..........................................................................................................26

2

Faltung von OEP16 ................................................................................................................27 Liposomen.............................................................................................................................27 Detergenz-basierte Methoden für die Rekonstitution ...........................................................28

Spektroskopische Methoden..................................................................................................29 Proteinbestimmung nach Bradford........................................................................................29 Fluoreszenz-Spektroskopie ...................................................................................................30 CD-Spektroskopie .................................................................................................................30 IR-Spektroskopie...................................................................................................................31 Zeitaufgelöste Spektroskopie ................................................................................................31

Physikalisch-chemische Methoden........................................................................................32 DSC .......................................................................................................................................32

Elektronenmikroskopie..........................................................................................................33

Kristallisation..........................................................................................................................33 Probenvorbereitung ...............................................................................................................33 Kristallisationsansätze...........................................................................................................34

Messung der Röntgenbeugung ..............................................................................................35

Theoretische Strukturvorhersage .........................................................................................35 "Multiple Sequence Alignment" ...........................................................................................35 Vorhersage transmembraner Bereiche ..................................................................................36 Hydrophobe Cluster-Analyse................................................................................................37

ERGEBNISSE .......................................................................................................... 38

Von der Proteinreinigung zum gefalteten Protein (eine Einleitung) .................................38

Proteinreinigung .....................................................................................................................40

Faltungsmethoden ..................................................................................................................42 Dialyse...................................................................................................................................42 Gelfiltration ...........................................................................................................................44 Verdünnung...........................................................................................................................44 Fluoreszenzspektroskopie .....................................................................................................45 CD-Spektroskopie .................................................................................................................55 IR-Spektroskopie...................................................................................................................59

Biophysikalische Daten des gefalteten Proteins...................................................................62 DSC .......................................................................................................................................62 Zeitaufgelöste Spektroskopie ................................................................................................65 Zeitaufgelöste Fluoreszenzspektroskopie .............................................................................65 Zeitaufgelöste CD-Spektroskopie .........................................................................................67 Zeitkonstanten und Aktivierungsenergien ............................................................................68

Das Protein wird sichtbar ......................................................................................................73 Elektronenmikroskopie .........................................................................................................73 Kristallisation ........................................................................................................................75

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Theoretische Ansätze zur Strukturaufklärung....................................................................81 Multiple Sequence Alignment...............................................................................................82 Hydropathie und Vorhersage transmembraner Segmente.....................................................83 Hydrophobe Cluster-Analyse................................................................................................85 Topologie ..............................................................................................................................87

ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE........................................................... 90

LITERATUR ............................................................................................................. 92

DANKSAGUNG...................................................................................................... 100

4

Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurde die biophysikalischen Eigenschaften eines kleinen Kanalproteins aus

der äußeren Chloroplastenmembran der Erbse, genannt OEP16 („outer envelope Protein 16 kDa“),

untersucht und ein neues Strukturmodell entwickelt, auf dessen Basis die Funktion des Proteins mit

molekularbiologischen Methoden nun genauer erforscht werden kann.

OEP16 ist ein Membranprotein mit ungewöhnlichen Eigenschaften. Als Protein der äußeren

Chloroplastenmembran insertiert es selbständig in geeignete Lipiddoppellschichten und in

Detergenzmizellen. Bei vielen eukaryontischen Membranproteinen kommt eine bakterielle

Überexpression zur Gewinnung großer Proteinmengen nicht in Frage, da zumeist ein korrekter Einbau

in eine Membran mangels der komplexen eukaryontischen Faltungsmaschinerie in diesen Systemen

nicht gegeben ist. OEP16 hingegen erlaubt es, aufgrund seiner selbsttätigen Renaturierung das Protein

ohne Rücksicht auf die native Struktur in E.coli überzuexprimieren und erst anschließend

rückzufalten.

Es konnte gezeigt werden, daß man große Mengen korrekt gefalteten Proteins erhalten kann, indem

man in chaotropen Puffersystemen aufgereinigtes Protein durch einen Verdünnungsschritt in einen

detergenzhaltigen Puffer überführt. Der Nachweis, daß sich OEP16 in Detergenzmizellen in eine

native Form faltet, ist schwierig, da die Funktion des Proteins, seine Kanalaktivität, nur in einem

Membransystem meßbar ist. Durch den Vergleich von Fluoreszenz- und CD-Spektren von

detergenzhaltigen Proteinlösungen und dem in Liposomen eingebautem Protein (mit nachgewiesener

Funktionalität) konnte gezeigt werden, daß die Struktur von OEP16 in den auf unterschiedliche Weise

rekonstituierten Proben übereinstimmte. Zeitaufgelöste Messungen mit denselben spektroskopischen

Methoden lieferten Daten über den Verlauf und die Geschwindigkeit der Proteinfaltung bei dieser

Renaturierungsmethode, einschließlich der Aktivierungsenergien für den Prozeß. Kalorimetrische

Messungen (DSC) erlaubten eine Abschätzung der Faltungsenthalpie. Durch hochauflösende CD-

Messungen und Infrarotspektroskopie wurde schließlich am in vitro gefalteten Protein gezeigt, daß es

sich bei OPE16 entgegen bisheriger Voraussagen um ein rein α-helikales Membranprotein handelt.

Dieser Befund konnte durch theoretische Methoden der Strukturbestimmung bestätigt werden. Ein

neues Strukturmodell wurde erstellt. Erste vielversprechende Ansätze der Proteinkristallisation und

der Elektronenmikroskopie zeigen, daß eine detaillierte Struktur von OEP16 in absehbarer Zeit

erhältlich sein könnte. Dies wäre weltweit die erste hochaufgelöste Struktur eines im Reagenzglas

gefalteten Membranproteins. In einer Zeit, in der Proteomics, also das Überexprimieren und

Analysieren von Proteinen, die Arbeit der größtenteils abgeschlossenen Sequenzierungprojekte

fortführen sollen, konnte mit OEP16 ein Modellsystem für die detaillierte Struktur- und

Funktionsanalyse von Membranproteinen etabliert werden.

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Abkürzungsverzeichnis

ATP Adenosintriphosphat C8E4 Tetraethylenglykol-Monooctylether C10E6 Hexaethylenglykol-Monodecylether C12E6 Hexaethylenglykol-Monododecylether C12E8 Octaethylenglykol-Monododecylether Capso 3-Cyclohexylamino-2-hydroxy-1-propansulfonsäure CD Zirkulardichroismus (Circular Dichroism) CMC Kritische Mizellare Konzentration (critical micellaer concentration) DGDG Digalaktosyldiacylglycerin β-DM β-D-Dodecylmaltosid DNA Desoxyribonukleinsäure DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraessigsäure E.coli Escherichia coli ER Endoplasmatisches Retikulum FTIR Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie HCA Hydrophobe Cluster-Analyse Hepes N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-Ethansulfonsäure in vitro „im Reagenzglas“ in vivo „im lebenden Organismus“ IPTG Isopropyl–β–D–thiogalactopyranoside kDa Kilodalton MDGD Monogalaktosyldiacylglyzerin MPD 2-Methyl-2,4-Pentandiol mRNA Boten-Ribonukleinsäure (m für engl. „messenger“) NMR Kernspinresonanz (nuclear magnetic resonance) OEP „Outer Envelope Protein“ β-OG β-D-Octylglukosid PC Phosphatidylcholin PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction) PE Phosphatidylethanolamin PEG Polyethylenglykol PG Phosphatidylserin PI Phospahtidyinositol PS Phosphatidylserin R Reynolds-Konstante, R = 8,314 J/mol*K RNA Ribonukleinsäure SB12 n-Dodecyl-N,N-Dimethyl-3-ammoniopropansulfonat SDS Natriumdodecylsulfat SQDG Sulfoquinovosyldiacylglyzerin

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Einleitung

Die Erbse (Pisum Sativum)

Die Erbse ist schon seit den berühmten Experimenten zur Vererbungslehre von Mendel ein

wichtiger Modellorganismus der biologischen Forschung. Für die Untersuchung von

Chloroplasten ist die Erbse besonders geeignet, weil sich diese Plastiden aus den schnell

wachsenden Erbsenkeimlingen vergleichsweise einfach und vor allem intakt isolieren lassen.

Es ist daher nur konsequent, für Experimente zum Stofftransport über die

Chloroplastenmembranen, aber auch für weiterführende molekularbiologische und

biochemische Forschung gerade die Erbsenpflanze als Modell zu wählen.

Abbildung 1:

Foto eines Erbsenkeimlings, wenige Tage alt.

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Die Pflanzenzelle

Abbildung 2:

Schematische Darstellung einer Pflanzenzelle.

Eukaryontische Zellen unterscheiden sich von den einfacher aufgebauten bakteriellen Zellen

durch die Existenz eines Zellkerns, der das Erbgut vom Cytosol der Zelle abtrennt. Die

Pflanzenzelle stellt eine besondere Form der eukaryontischen Zelle dar. Zusätzlich zur

Zellmembran, einem Zellkern, den Mitochondrien und Lysosomen, dem endoplasmatischen

Reitculum (ER) und dem Golgiapparat, die praktisch allen eukaryontischen Zellen gemeinsam

sind, besitzt eine pflanzliche Zelle eine Zellwand, Plastiden und eine oder mehrere Vakuolen.

Die Zellmembran umhüllt die gesamte Zelle und grenzt sie gegenüber der Außenwelt ab.

Stofftransport durch diese Membran ist nur durch Transportproteine möglich. Die Zellwand

der Pflanzen ist eine harte, poröse Struktur aus komplexen Kohlenhydraten, die die Zelle

mechanisch schützt. Die Flüssigkeit innerhalb der Zelle wird als Cytosol bezeichnet. Es

umgibt alle Organellen der Zelle und ist Ort der Biosynthese vieler für die Zelle

lebensnotwendiger Substanzen. Im Cytosol befindet sich auch der Apparat zur Zellteilung.

Der Zellkern enthält die Chromosomen der Pflanzenzelle. Er ist von einer Doppelmembran,

der Kernmembran, umgeben, die Verbindung zum endoplasmatischen Retikulum hat. Am

rauhen ER bzw. den daran angelagerten Ribosomen findet die Proteinbiosynthese statt. Die

Proteine werden dann durch ein Erkennungs- und Transportsystem, den Golgi-Apparat, mit

letzten Modifikationen versehen und mit Hilfe von Vesikeln an ihren Bestimmungsort

geschleust. Am glatten ER werden hauptsächlich chemische Signale von der Zellmembran

verarbeitet und weitergegeben (z.B. in den Zellkern zur Veränderung der Genexpression). In

den Lysosomen werden überflüssige Zellbestandteile zerlegt und giftige Substanzen abgebaut.

Die Vakuole dient als Speicher für Wasser und Nährstoffe und kann Giftstoffe wie z.B.

Schwermetalle einlagern und sie so für die Zelle unschädlich machen. Die Mitochondrien sind

die Kraftwerke der Zelle. Hier wird der Großteil der Energie gewonnen, der zum

Aufrechterhalten der Zellfunktionen notwendig ist. Bei der „Atmung“ werden Kohlenhydrate

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zu Wasser und CO2 oxidiert und die frei werdende Energie in Form von ATP und anderen

biochemischen Energieträgern gespeichert. Die Mitochondrien verfügen über ein

Doppelmembransystem und ein eigenes Genom, das für einen kleinen Teil der in der

Organelle vorhandenen Proteine codiert. Auch die Plastiden, deren prominenteste Vertreter

die Chloroplasten sind, verfügen über eigenes Erbgut. Ihr Aufbau und ihre Funktion werden

im folgenden detaillierter erläutert.

Der Chloroplast

Plastiden sind die Zellorganellen, durch die sich Pflanzenzellen von den Zellen aller anderen

Eukaryonten unterscheiden. Die grünen Chloroplasten sind die wichtigsten und bekanntesten

Plastiden. Erwähnenswert sind aber auch die Chromoplasten, die Pflanzenblüten und Früchten

vor allem durch ihren hohen Carotinoid-Gehalt ihre Farbe verleihen und die Amyloplasten,

die den Stärkespeicher in Pflanzensamen, Wurzeln und Knollen bilden. Auch andere

Plastidentypen in hoch spezialisierten Pflanzengeweben sind bekannt, so sind zum Beispiel

die Plastiden in Wurzeln hauptsächlich mit der Assimilierung von anorganischem Stickstoff

befaßt (Joyard, 1998) (Lam, 1996).

Aufbau

Chloroplasten bestehen aus mehreren Membranschichten von sehr unterschiedlichem Aufbau

und Funktion. Vom Cytosol ist der Chloroplast durch die äußere (1) und die innere

Chloroplastenmembran (2) getrennt. Der Kern eines Chloroplasten wird von gestapelten

Ausstülpungen der Thylakoidmembran, den Grana (3,4) gebildet. Diese Membran umschließt

das Lumen und trennt es vom Stroma (5), dem Raum zwischen den Thylakoiden und der

inneren Chloroplastenmembran, ab. Das Lumen ist ein durchgehender Raum, die Grana sind

durch Membrankanäle, die sogenannten Stromathylakoide, verbunden. Der Chloroplast

besitzt ein eigenes, im Stroma lokalisiertes Genom, das jedoch nur für einen Teil der

Chloroplastenproteine codiert, ebenso eigene Ribosomen für die Translation von RNA in

Proteine. Chloroplasten sind in der Lage, sich unabhängig von der Pflanzenzelle zu teilen und

besitzen den gesamten hierfür notwendigen biochemischen Apparat (Pyke, 1999).

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Abbildung 3:

Schematischer Aufbau eines Chloroplasten.

1: Äußere Chloroplastenmembran

2: Innere Chloroplastenmembran

3: Thylakoide (Querschnitt, darin das Lumen)

4: Thylakoide (Außenansicht)

5: Stroma

Funktion des Chloroplasten in der pflanzlichen Zelle

Die Hauptaufgabe der Chloroplasten ist die Erzeugung von chemischer Energie aus Licht,

Kohlendioxid und Wasser, die Photosynthese. Dieser Prozeß läuft an den

Thylakoidmembranen („Lichtreaktion“, das Aufbauen eines elektrochemischen Gradienten)

und im Stroma („Dunkelreaktion“, die CO2-Fixierung) ab. Als Produkte entstehen

Kohlenhydrate, die die Grundlage des Stoffwechsels einer Pflanzenzelle darstellen.

Gewissermaßen als Nebenprodukt entsteht Sauerstoff, der in die Atmosphäre abgegeben wird.

Darüber hinaus enthalten Chloroplasten Enzyme für eine ganze Reihe grundlegender

Stoffwechselwege, insbesondere für die Lipidbiosynthese und den Aminosäuremetabolismus

(Lam, 1996). Auch eine Reihe von Pflanzenhormonen wird in den Chloroplasten aus

Lipidvorstufen synthetisiert (Joyard, 1998). Ein Austausch von Stoffwechselprodukten und

deren Vorstufen, aber auch anorganischen Ionen über die innere und äußere

Chloroplastenmembran wird durch eine Vielzahl hoch spezialisierter Transportsysteme

ermöglicht (Flügge, 1998).

Endosymbiontentheorie

Chloroplasten sind nicht in der Lage, außerhalb der pflanzlichen Zelle zu leben. Dennoch geht

man davon aus, daß Chloroplasten von Vorläufern der Cyanobakterien abstammen, die eine

symbiotische Verbindung mit frühen eukaryontischen Zellen eingegangen sind (Cavalier-

Smith, 2000; Margulis, 1996). Dafür spricht zum Beispiel, daß diese Organellen ihr eigenes

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Genom besitzen, das allerdings im Lauf der Evolution stark reduziert wurde und inzwischen

von Genen ergänzt wird, die im Zellkern der Pflanze liegen (Leon, 1998). Die Ribosomen im

Stroma der Chloroplasten unterscheiden sich signifikant von den Ribosomen im Cytosol der

Zelle. Sie sind bakteriellen, nicht eukaryontischen Typs(Harris, 1994). Die Untereinheiten des

Proteinimportkomplexes, der im Cytosol translatierte Proteine ins Innere der Chloroplasten

transportiert, haben große Sequenzähnlichkeiten zu cyanobakteriellen Membranproteinen

(McFadden, 1999; Reumann, 1999). Auch die große Ähnlichkeit des in den Thylakoiden

lokalisierten Photosyntheseapparates zu dem der Cyanobakterien zeigt das enge

verwandtschaftliche Verhältnis der Plastiden zu ihren Vorfahren(Blankenship, 1998). Die

Lipidzusammensetzung der Chloroplastenmembranen ist sehr ähnlich zu der

photosynthetischer Bakterien und unterscheidet sich grundlegend von allen anderen

Membranen der pflanzlichen Zelle. So kommt das anionische Lipid

Sulfoquinovosyldoacylglcerin fast ausschließlich in photosynthetischen Bakterien und

Chloroplasten vor(Benning, 1998).

Die äußere Chloroplastenmembran

Gemeinsam bilden die innere und äußere Chloroplastenmembran 5-10% der gesamten

Membranfläche der Chloroplasten. Dennoch enthalten sie nur 1-2% des Gesamtproteins der

Organelle. Die äußere Membran besteht aus 2,5 bis 3 mg Lipid pro mg Protein, dem höchsten

Lipidanteil aller pflanzlichen Membransysteme, und hat damit auch eine sehr geringe Dichte

von 1,08 g/cm3. Dies kann man sich für die Abtrennung von der inneren Plastidenmembran zu

Nutze machen(Joyard, 1991). Wegen ihrer scheinbaren Durchlässigkeit für Substanzen mit

einem Molekulargewicht von unter 10000 g/mol wurde bisher angenommen, daß die äußere

Chloroplastenmembran wie die entsprechende mitochondriale Membran in vivo keinerlei

Membranpotential besitzt. Sollte der Transport durch dieses Membransystem jedoch einer

Regulation unterliegen, wofür es Hinweise gibt(Flügge, 2000; Soll, 2000), ist unter

bestimmten physiologischen Bedingungen ein durch unterschiedliche

Metabolitenkonzentrationen dies- und jenseits der Membran gebildetes Potential

vorstellbar(Lemeshko, 2000).

Lipide der äußeren Chloroplastenmembran

Biologische Membranen bestehen aus einer Lipid-Doppelschicht. Ihre Hauptbestandteile bei

Pflanzen sind anionische Phospholipide (hauptsächlich Phosphatidylcholin (PC),

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Phosphatidylethanolamin (PE) und Phosphatidylglycerin(PG)) und nichtionische Glykolipide

(Mono- und Digalaktosyldiacylglycerin(MGDG und DGDG)) sowie das anionische

Glykolipid Sulfoquinovosyldiacylglycerin (SQDG).

Abbildung 4:

Strukturen der häufigsten pflanzlichen Membranlipide. Alle Fettsäuren sind als Palmitinsäure

dargestellt.

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In kleineren Mengen kommen auch pflanzliche Sterole und Phosphatidylinositol (PI),

Phosphatidyserin (PS) und Cardiolipin (Diphosphatidydiacylglycerin) vor. Interessant ist, daß

sich diese Lipide sehr ungleichmäßig auf die verschiedenen pflanzlichen Membransysteme

verteilen. Insbesondere die Chloroplastenmembranen weichen deutlich von der

Zusammensetzung anderer eukaryontischer Membranen ab. So kommen die beiden

Galaktolipide und das Sulfolipid ausschließlich in Chloroplasten vor. Im Gegensatz dazu

findet man in den Chloroplastenmembranen kein Phosphatidylethanolamin(Block, 1983).

Auch unter den verschiedenen Membranen innerhalb der Plastiden gibt es gravierende

Unterschiede. Phosphatidylcholin findet sich zum Beispiel kaum in den Thylakoiden, in

großen Mengen jedoch in den beiden umhüllenden Membranen der Organelle. Die äußere

Chloroplastenmembran besteht bei den gut untersuchten Spinatchloroplasten aus etwa 20%

MGDG, 30% DGDG, 5% SQDG, 30% PC, 10% PG und 5% PI (Block, 1983). Auch kleine

Mengen Sterole wurden gefunden(Poincelot, 1973).

Proteine der äußeren Chloroplastenmembran und ihre Funktion

In vielen Textbüchern zur Physiologie und Biochemie der Pflanzen werden die äußere

Chloroplastenmembran und ihre Bestandteile nur am Rande erwähnt. Dies liegt hauptsächlich

daran, daß bis vor wenigen Jahren nur eine Handvoll Proteinkomponenten dieser Membran

identifiziert worden waren. Bekannt war der Proteinimportapparat der Chloroplasten, der sich

über die äußere und innere Membran der Organelle erstreckt, und bekannt war auch, daß es

Porenproteine geben mußte, die dafür sorgten, daß Stoffwechselprodukte die

Lipiddoppelschicht passieren können. Man ging davon aus, daß es sich hierbei um Proteine

des Porin-Typs handeln mußte, und tatsächlich konnten in Wurzelplastiden der Erbse solche

Porine identifiziert werden. Allerdings wurden diese den mitochondrialen Porinen ähnlichen

Proteine in vitro nur in nicht-grüne Plastiden importiert. In grünen Chloroplasten scheinen sie

nicht vorzukommen (Fischer, 1994; Popp, 1997). Hinweise auf unterschiedliche spezifische

Kanalpoteine lieferten elektrophysiologische Messungen an intakten äußeren

Chloroplastenmembranen(Heiber, 1995). Später wurden die entsprechenden Gene mit

molekularbiologischen Methoden identifiziert(Bölter, 1999; Pohlmeyer, 1997a; Pohlmeyer,

1998) und die Proteine genauer charakterisiert(Linke, 2000; Röhl, 1999; Steinkamp, 2000).

Auch viele für den Stoffwechsel der Pflanze wichtige Enzyme sind an oder in der äußeren

Membran der Plastiden lokalisiert. Dies konnte unter anderem für das Enzym DGDG-

Synthase gezeigt werden, welches das Membranlipid Monogalaktosyldiacylglycerin in

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Digalaktosyldiacylglycerin umwandelt(Froehlich, 2001) und für die Acyl-Coenzym-A-

Synthase, ein zentrales Enzym des Fettsäurestoffwechsels(Block, 1983). Auch die pflanzliche

Hexokinase, die Glucose und auch Fructose unter ATP-Verbrauch in energiereiche

Zuckerphosphate umwandelt, ist in der Hüllmembran verankert und verhindert dort durch die

Umsetzung möglicherweise einen Rücktransport von Glucose ins Innere der Organelle durch

spezifische Glucose-Translokatoren in der inneren Chloroplastenmembran(Wiese, 1999).

Proteinimport über die äußere und innere Chloroplastenmembran

Ein großer Teil der Proteine in den Chloroplasten wird von Genen im Zellkern codiert. Diese

Proteine, die von den Ribosomen im Cytosol der Pflanzenzelle synthetisiert werden, müssen

mittels spezifischer Transportprozesse in die Chloroplasten gelangen. Dazu ist nicht nur ein

Importsignal innerhalb der Aminosäuresequenz des Proteins nötig, sondern auch ein spezieller

Import-Apparat, der das Peptid über die äußere und innere Chloroplastenmembran

transportiert.

Im allgemeinen enthalten für den Chloroplasten bestimmte Proteine ein sogenanntes

Signalpeptid an ihrem N-Terminus, das während des Importvorgangs in die Organelle

abgespalten wird. Signalpeptide für den Transport ins Stroma und in die innere Membran der

Chloroplasten enthalten oft viele basische und hydroxylierte Aminosäuren und werden von

einer cytosolischen Proteinkinase an einem Serin- oder Threoninrest phosphoryliert. Die

Dephosphorylierung erfolgt vor dem eigentlichen Importprozess vermutlich an der äußeren

Chloroplastenmembran(Heins, 1998). Das Signalpeptid wird dann von einer im Stroma

befindlichen spezifischen Protease beim Durchtritt durch den Importapparat entfernt(Bruce,

2000). Im Gegensatz zu mitochondrialen Signalsequenzen bilden die Signalpeptide der

Chloroplasten selbst keinerlei Sekundärstruktur aus(von Heijne, 1991). Eine solche Struktur

entsteht erst durch Wechselwirkungen mit den Lipiden der äußeren Chloroplastenmembran

und ermöglicht damit den Import des Proteins(Pinnaduwage, 1996; Van't Hof, 1993). Dieser

Vorgang ist vermutlich deshalb selektiv für die äußere Chloroplastenmembran, weil sie als

einzige zum Cytosol exponierte Membran die Glykolipide Mono- und

Digalaktosyldiacylglycerin enthält und die Signalpeptide nachweislich mit diesen Lipiden

wechselwirken können(Pinnaduwage, 1996). Auch hat dieses Membransystem ein hohes

Lipid/Protein-Verhältnis von 3.0(Keegstra, 1989), was eine starke Exponierung von Lipid-

Kopfgruppen zum Cytosol zur Folge hat. Veränderungen in der Lipidzusammensetzung dieser

Membran haben eine Veränderung des Import-Verhaltens zur Folge(Kerber, 1992).

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Die Signalsequenzen für die innere Chloroplastenmembran unterscheiden sich nicht von den

für das Stroma codierenden Signalen. Es wird vermutet, daß die Information für das

Inserieren in die Membran während des Importvorganges in hydrophoben Bereichen des

Proteins außerhalb der abspaltbaren Signalsequenz liegt(Heins, 1998). Für den Import in das

Lumen der Thylakoide oder in die Thylakoidmembran muß das Signalpeptid hingegen aus

zwei Teilen bestehen, einem abspaltbaren Peptid für den Transport ins Stroma und einer

weiteren Sequenz, die nach dem Durchtritt durch die Thylakoidmembran von einer im Lumen

befindlichen spezifischen Protease abgeschnitten wird(Keegstra, 1999). Die

Importmechanismen in die Thylakoide haben Ähnlichkeit mit Transportvorgängen in

Bakterien und im endoplasmatischen Reticulum der Eukaryonten(Cline, 1996; Settles, 1998).

Proteinimport in die äußere Chloroplastenmembran

Der Importweg von Proteinen der äußeren Chloroplastenmembran ist nur in Einzelfällen

komplett aufgeklärt.

OEP75 („outer envelope protein 75 kDa“), selbst Bestandteil der Proteinimport-Maschinerie

der äußeren Chloroplastenmembran, enthält ein Signalpeptid für den Transport ins Stroma.

Eine weitere, ebenfalls abspaltbare Signalsequenz sorgt jedoch dafür, daß OEP75 nicht

komplett ins Stroma überführt wird, sondern im Importkanal stecken bleibt und in der äußeren

Membran verbleibt(Tranel, 1996). Andere, kleinere Proteine wie OEP34 werden jedoch direkt

und ohne Signalpeptid in die äußere Chloroplastenmembran insertiert(Keegstra, 1999).

Hierbei spielt besonders eine hydrophobe Sequenz am C-Terminus des Proteins eine

entscheidende Rolle(Li, 1991). Für OEP14 konnte eine nicht abspaltbare Signalsequenz im N-

Terminus des Proteins identifiziert werden, die für den spezifischen Import verantwortlich

ist(Li, 1996). Die kleinen Kanalproteine der Hüllmembran der Chloroplasten integrieren

spontan durch hydrophobe Wechselwirkungen in die Lipid-Doppelschicht(Cline, 1996; Heins,

1998). Man kann davon ausgehen, daß die besondere Lipidzusammensetzung auch hier eine

entscheidende Rolle für die Selektivität des Imports in die Chloroplastenmembran

spielt(Joyard, 1991; Keegstra, 1989).

OEP16

OEP16 („Outer Envelope Protein 16 kDa“) ist ein in der äußeren Chloroplastenmembran

lokalisiertes Kanalprotein. Entdeckt wurde es, als man versuchte, durch systematische

Analyse von Proteinbestandteilen der äußeren Chloroplastenmembran neue Untereinheiten

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des Proteinimportkomplexes der Chloroplasten und andere Transportproteine zu finden. Das

Protein wurde ansequenziert und seine Gensequenz mittels PCR mit degenerierten Primern

aus einer Genbank ermittelt(Pohlmeyer, 1997a). Schnell stellte sich heraus, daß es sich um

einen eigenständigen Kanal handelte, ohne direkten Bezug zur Import-Maschinerie. Neben

OEP16 wurden weitere Kanalproteine in der äußeren Chloroplastenmembran entdeckt,

namentlich OEP21(Bölter, 1999) und OEP24(Pohlmeyer, 1998). OEP16 konnte in

Chloroplasten aus Blättern und Stengeln, aber auch in dunkel adaptierten Chloroplasten und

in Wurzelplastiden nachgewiesen werden(Pohlmeyer, 1997a). OEP16 inseriert ebenso wie

OEP24 in die äußere Chloroplastenmembran, ohne daß ein Signalpeptid abgespalten wird.

Der Import ist unabhängig vom Proteinimportkomplex der Chloroplasten und von ATP, und

auch Deletionsmutanten, denen der N-Terminus (20 Aminosäuren) oder der C-Terminus (53

Aminosäuren) fehlt, werden korrekt in die äußere Membran integriert(Pohlmeyer, 1997b).

Sequenzen

1 MPRSSFSGSL SSPKLDVVID MGNPFLNLTV DGFLKIGAVA ATRSVAEDTF HIIRKGSISS

61 NDFEKSLKKM CKEGAYWGAI AGVYVGMEYG VERIRGTRDW KNAMFGGAVT GALVSAASNN

121 KKDKIAVDAI TGAAIATAAE FINYLT Abbildung 5: Aminosäuresequenz von OEP16 aus Erbse (Pisum sativum)

Inzwischen kennt man die Gensequenz von OEP16 nicht nur aus der Erbse(Pohlmeyer,

1997a), sondern auch aus Gerste (Baldi, 1999) und der Ackerschmalwand (Arabidopsis

thaliana), deren komplettes Genom inzwischen sequenziert wurde(Arabidopsis Genome

Initiative, 2000; Lin, 1999; Mayer, 1999; Salanoubat, 2000; Tabata, 2000; Theologis, 2000).

OEP16 aus Erbse wurde auch auf Ähnlichkeiten zu anderen, bekannten Proteinen untersucht.

Das Kanalprotein hat in Teilbereichen starke Homologien zu Tim17, Tim22 und Tim23,

Untereinheiten verschiedener Präproteinimportkanäle in der inneren Mitochondrienmembran,

und zu LivH, einem Aminosäuretransporter aus E.coli(Rassow, 1999). Ein auffälliger

Sequenzbereich (Aminosäuren 72-92) mit fünf Glycylresten in einem Abstand von je drei

Aminosäuren hat erstaunlich hohe Homologie zu einem Abschnitt aus den Sequenzen von

Na+-Glucose-Kotransportern aus Mensch, Huhn, Schaf und Ratte. Dasselbe gilt für Teile

eines Na+-Nukleosid-Kotransporters aus Kaninchen, für Permeasen für verzweigte

Aminosäuren aus Salmonella und Pseudomonas, und für einen Na+-Kotransporter für neutrale

Aminosäuren aus dem Schwein(Pohlmeyer, 1997b).

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Aufbau

Der N-Terminus von OEP16 kann in Chloroplasten und Vesikeln der äußeren

Chloroplastenmembran, die mit der Außenseite außen ("right side out") präpariert

wurden(Waegemann, 1992), von der Protease Thermolysin abgespalten werden und ist somit

in vivo zu Cytosol hin exponiert(Pohlmeyer, 1997b). Der Sequenzbereich, der für die Bildung

der eigentlichen Pore zuständig ist, konnte auf die Aminosäuren 21-93 eingeengt

werden(Steinkamp, 2000).

Erste Untersuchungen an nativen Membranen ergaben, daß OEP16 ein Homodimer sein

könnte. Dafür sprechen Crosslink-Experimente(Pohlmeyer, 1997a) und die Tatsache, daß sich

OEP16 durch Zugabe von Kupfer(II)-Chlorid oxidativ dimerisieren läßt(Seedorf, 1995), und

zwar über das in der Sequenz nur ein einziges Mal vorkommende Cystein in Position

Cys71(Pohlmeyer, 1997a). Dieser Vorgang ist reversibel.

Funktion und Regulation

Elektrophysiologische Eigenschaften

Die Existenz von OEP16 als Kanalprotein konnte indirekt durch Messung seiner

elektrophysiologischen Eigenschaften in nativen äußeren Chloroplastenmembranen

nachgewiesen werden(Heiber, 1995), zusammen mit anderen spezifischen Kanalproteinen

dieses Membransystems. Genaue Kenntnis über Leitfähigkeit und Permeabilität für

verschiedene Substrate brachten jedoch Untersuchungen an rekombinantem Protein, das in

Liposomen rekonstituiert und zur Messung in planare Lipid-Doppelschichten eingebaut

wurde(Pohlmeyer, 1997a). Die Lipiddoppelschicht überspannt hierbei ein Loch in einer

Teflon-Membran, welche zwei Elektrodenkammern voneinander trennt. Durch Zugabe

verschiedener Puffer oder Substrate in die beiden Kammern können damit die spezifischen

physiologischen Eigenschaften von OEP16 bestimmt werden. Gemessen in 250 mM KCl auf

beiden Seiten der Membran hat OEP16 die höchste Offen-Wahrscheinlichkeit (etwa 80%

offene Kanäle) bei einer äußeren Spannung von 0 mV. Dies dürfte dem physiologischen

Zustand in vivo nahekommen, auch wenn geringe Membranpotentiale für ähnliche

Membransysteme postuliert wurden(Lemeshko, 2000). Bei einer angelegten Spannung von ±

150 mV waren praktisch alle Kanäle geschlossen.

17

Substrate

Es zeigte sich, daß der Kanal über eine gewisse Selektivität für Kationen verfügt, auch wenn

kleine Anionen wie Cl- praktisch ungehindert passieren können. Etwas größere, organische

Moleküle können aber nur noch dann durch die Pore diffundieren, wenn sie Aminogruppen

und/oder positive Ladungen tragen.

Selektivität des rekonstituierten OEP16-Kanals

Substrat Permeabilität Glycin Ja*

Valin Ja

Arginin Ja*

Lysin Ja

Glutamat Ja

Glutamin Ja*

Kadaverin Ja

Sucrose Nein*

Glucose Nein

Fructose Nein*

1-Phosphoglycerat Nein*

Dihydroxyaceton Nein*

Tetraethylamin Nein*

Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Ja*

Sorbitol Nein

Mannitol Nein

Abbildung 6:

Die in der Tabelle gezeigten Substrate wurden mittels Leitfähigkeitsmessungen auf ihre

Fähigkeit, durch die OEP16-Pore zu diffundieren, getestet. Mit * markierte Ergebnisse

wurden durch osmotisch induzierte Fusion von OEP16-Liposomen mit planaren

Lipiddoppelschichten bestätigt. (Pohlmeyer, 1997a)

Eine ganze Reihe Stoffwechselprodukte müssen die äußere Chloroplastenmembran passieren,

um die Funktion der Pflanzenzelle aufrecht erhalten zu können. OEP16 ist jedoch lediglich

für einen kleinen Ausschnitt dieser organischen Moleküle selektiv. OEP16 ist für alle

Aminosäuren durchlässig, ebenso wie für biologisch relevante Amine wie Cadaverin. Auch

das unphysiologische Tris-Kation konnte die Pore passieren. Praktisch undurchlässig ist

18

OEP16 hingegen für Kohlenhydratprodukte der Glycolyse und Zuckerphosphate, tertiäre

Amine und von Kohlenhydraten abgeleitete Substanzen wie Sorbitol und

Mannitol(Pohlmeyer, 1997a).

Oxidative Zerstörung der Kanalfunktion

Kupfer(II)-Chlorid ist ein effektiver Katalysator zur Bildung von Disulfidbrücken(Seedorf,

1995). Diese kovalente Verknüpfung zweier benachbarter Cysteinreste kann auch zwischen

Cysteinen verschiedener Peptidketten entstehen und spielt in vielen Proteinen und

Proteinkomplexen eine wichtige strukturelle Rolle. OEP16 wird durch Zugabe von CuCl2

dimerisiert(Pohlmeyer, 1997a). Dabei geht die Kanalleitfähigkeit durch die Membran

verloren, der Vorgang ist jedoch umkehrbar. Ob dieser Vorgang auch in vivo reversibel ist,

durch welche biologisch relevanten Oxidationsmittel er ausgelöst werden kann und ob er der

Regulation der Kanalaktivität dient, ist bisher ungeklärt.

Phosphorylierung

Natives OEP16 in der äußeren Chloroplastenmembran ist vermutlich phosphoryliert. Bei in

vitro Phosphorylierungsexperimenten wurde OEP16 durch eine in der äußeren

Chloroplastenmembran befindliche Kinase mit radioaktivem Phosphat verestert. An

Deletionsmutanten konnte gezeigt werden, daß die Phosphorylierungsstelle im Bereich des N-

Terminus, genauer innerhalb der ersten 20 Aminosäuren in der Sequenz, liegen

muß(Pohlmeyer, 1997b). In diesem Bereich befinden sich sechs Serinreste, die als

Phosphatakzeptoren in Frage kommen.

Genexpression

In Gerste ist bekannt, daß die Expression von OEP16 bei Kälte stark zunimmt(Baldi, 1999).

Dies konnte sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene gezeigt werden. Welche Funktion

OEP16 bei der Kälteregulation zukommt, ist bisher ungeklärt. In Spinat macht OEP16 einen

beträchtlichen Teil der Gesamtproteinmenge in der äußeren Chloroplastenmembran

aus(Koike, 1998).

19

Faltung von Membranproteinen

Allgemeine strukturelle Eigenschaften von Membranproteinen

Anders als lösliche, globuläre Proteine müssen Membranproteine bestimmten strukturellen

Vorgaben gehorchen, die aus dem Kontakt mit dem hydrophoben Inneren der biologischen

Membranen resultieren. Entsprechend zeigen die bekannten Strukturen von

Membranproteinen weit weniger verschiedene Strukturmotive, als ihre vielfältigen

Funktionen vermuten lassen(Cowan, 1994). Typische Strukturelemente von

Membranproteinen sind amphiphile Helices, die parallel zur Lipiddoppelschicht angeordnet

sind und mit ihrem hydrophoben Teil in sie hineinragen, und membranspannende Strukturen,

die entweder aus sogenannten „β-Barrels“, antiparallelen β-Faltblattstrukturen, oder Bündeln

von α-Helices bestehen(White, 1999). Große Domänen von Membranproteinen, die nicht in

direktem Kontakt mit den Lipiden stehen, verhalten sich hingegen wie lösliche Proteine(von

Heijne, 1996). Während die genannten amphiphilen Helices häufig bei Proteinen vorkommen,

die lediglich teilweise in die Membran hineinragen, bilden transmembrane Proteine entweder

eine β-Barrel-Struktur oder Helixbündel aus. Gemischte Strukturen sind nicht bekannt.

Typische Vertreter der β-Barrel-Struktur sind die bakteriellen Porine, Diffusionskanäle mit

einem großen Innendurchmesser(Buchanan, 1999; Hirsch, 1997; Klebba, 1998; Kreusch,

1994). Die am besten untersuchten Vertreter der Helixbündel-Proteine sind die bakteriellen

Reaktionszentren(Allen, 1987; Deisenhofer, 1985) und das Bakteriorhodopsin(Griegorieff,

1996). Auch bakterielle(McDermott, 1995) und eukaryontische(Kühlbrandt, 1994)

Lichtsammelkomplexe, die Photosysteme I und II(Jordan, 2001; Zouni, 2001), die ATP-

Synthase(Stock, 1999), die Calcium-ATPase(Toyoshima, 2000) und die Cytochrom C

Oxidase(Iwata, 1995; Tsuhikara, 1996) bestehen in ihrem transmembranen Bereich

ausschließlich aus Helixstrukturen.

Mechanismen der Insertion in die Membran in vivo

In eukaryontischen Zellen werden die meisten Membranproteine direkt bei der Translation

durch Ribosomen in die Membran eingebaut. Die Ribosomen können mRNA-Moleküle, die

für Membranproteine codieren, von denen für lösliche Proteine unterscheiden. Sie haften sich

dann an das sogenannte Translocon, einen großen Proteinkomplex in der Membran des

endoplasmatischen Reticulums an. Das entstehende Polypeptid wird vom Translocon in die

20

Membran eingefädelt. Hier geschehen auch die ersten posttranslationalen Modifikationen.

Später werden die neuen Membranproteine je nach ihren Signalsequenzen über

endoplasmatisches Reticulum und Golgi-Apparat an ihren Bestimmungsort in der Zelle

transportiert. Eine ganze Reihe von Membranproteinen können aber auch spontan in

Membranen eingebaut werden, ohne Mithilfe von anderen Proteinen. Die bestuntersuchten

Vertreter dieser Proteine sind bakterielle Toxine, zum Beispiel das Diphterie-Toxin(White,

1999). Generell werden ungefaltete Proteine in Zellen meist von Chaperonen in Lösung

gehalten. Diese Faltungshelfer verhindern die Aggregation von Peptiden und helfen ihnen,

ihren Bestimmungsort zu erreichen. Auch in Organellen wie den Mitochondrien und Plastiden

gibt es eigene Chaperone(Miernyk, 1999).

Für lösliche Proteine ist aufgrund einer Vielzahl von thermodynamischen, strukturellen und

funktionellen Daten bekannt, daß sich ihre Strukturen unter normalen physiologischen

Bedingungen in einem lokalen Minimum der freien Enthalpie der Proteinfaltung befinden. Es

gibt viele Belege dafür, daß dies auch für Membranproteine gilt(White, 1999). So konnte

gezeigt werden, daß sich auch in Stücke geschnittene Membranproteine in der

Lipiddoppelschicht zu funktionellen Komplexen zusammenlagern können. Dies gilt sowohl

für α-helikale Proteine(Ridge, 1995) als auch für β-Barrel-Proteine(Koebnick, 1996). Auch

Proteine, die wie das Diphterie-Toxin eine stabile lösliche Struktur haben, können in der

Lipidumgebung thermodynamisch stabile Strukturen annehmen(Zhan, 1995).

Thermodynamische Stabilität von Membranproteinen

Drei unterschiedliche Typen von Wechselwirkungen bestimmen Struktur und Stabilität von

Membranproteinen: die Wechselwirkungen von Proteinketten untereinander, die

Wechselwirkungen mit dem wäßrigen Medium und mit der Lipidmembran. Meßbar werden

diese Kräfte durch Untersuchungen des Faltungsprozesses oder des umgekehrten Vorganges,

der Denaturierung, mittels Temperaturänderungen oder durch Zugabe chaotroper Reagenzien,

welche die Proteinstruktur destabilisieren(White, 1999). Das Hauptproblem hierbei ist, daß

Membranproteine häufig nicht komplett denaturieren, weil die in die Lipidumgebung

eingebetteten Bereiche besonders stabil sind. Erfaßt werden dann nur die Dissoziation von

Untereinheiten und die Entfaltung von Domänen außerhalb der Membran. Zudem sind diese

Prozesse oft irreversibel(Haltia, 1995).

21

Die freie Enthalpie ∆G für das Eindringen von hydrophoben Peptiden in eine

Lipiddoppelschicht läßt sich in zwei Faktoren unterteilen. Hydrophobe Aminosäure-

Seitenketten partitionieren freiwillig in die Lipid-Doppelschicht. Die Peptidbindungen des

Protein-Rückrads hingegen können aufgrund ihrer polaren Struktur in der Wasserphase

energetisch günstigere Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden. Nur bei der Ausbildung von

Sekundärstrukturelementen, in denen sämtliche beteiligten Peptidbindungen untereinander H-

Brücken bilden, also bei α-Helices und β-Faltblattstrukturen, ist ein Verbleiben in der

Membran bei direktem Kontakt mit den Lipiden energetisch möglich. In diesem Fall

kompensieren die neu gebildeten hydrophoben Wechselwirkungen der Seitenketten mit der

Membran den Verlust an freier Enthalpie, der durch den Übergang des hydrophilen

Peptidrückrads in das lipophile Medium entsteht(White, 1999). Alternativ dazu können

hydrophile Bereiche in der Membran durch benachbarte Proteinstrukturen bedeckt werden, so

daß sie praktisch nicht mit den Lipiden in Berührung kommen.

Der Faltungsprozeß

Es gibt eine Reihe von Hypothesen und Modellrechnungen über den genauen Ablauf des

Faltungsprozesses, deren komplette Darstellung den Rahmen dieser Arbeit sprengen würde.

Im Folgenden wird die gängigste Hypothese zur Membranproteinfaltung kurz erläutert.

Danach läßt sich der Prozeß der Membranproteinfaltung in vier separate Teilschritte zerlegen.

Zunächst partitioniert ein hydrophobes Peptid aus der Wasserphase in die Grenzfläche

zwischen Wasserphase und Lipidmembran. Im nächsten Schritt bilden sich dort

Sekundärstrukturelemente aus, die das Passieren der Grenzfläche erlauben, im allgemeinen

sind das α-Helices(White, 1999). Diese Sekundärstrukturelemente dringen im dritten Schritt

in die Membran ein und lagern sich zuletzt zu einem funktionell intakten Membranprotein

zusammen(Bechinger, 2000).

Die Anlagerung an die Grenzfläche der Membran ist in erster Linie auf den hydrophoben

Effekt zurückführbar, der lipophile Aminosäureseitenketten aus der Wasserphase verdrängt.

Bei der Assoziation von Membranproteinen mit der Lipiddoppelschicht spielen aber auch

elektrostatische Wechselwirkungen positiv geladener Seitenketten mit den anionischen

Phospholipiden eine entscheidende Rolle. In nativen Membranproteinen liegt oft ein Großteil

der positiv geladenen Seitenketten in dem wäßrigen Medium zugänglichen Bereichen auf

22

einer Seite der Membran. Vermutlich spielen sie eine entscheidende Rolle bei der Frage, in

welcher Orientierung ein Membranprotein in die Membran eingebaut wird.

Das Ausbilden von Sekundärstrukturelementen ist notwendig, um Peptiden das Eindringen in

die Membran zu ermöglichen. Sind alle Peptidbindungen zum Beispiel zu einer α-Helices

verbrückt, können diese im dritten Schritt der Faltung als helikale Haarnadelstrukturen in die

Membran eindringen. Für den letzten Schritt, die Anordnung der Sekundärstrukturelemente

zum aktiven Membranprotein, ist eine Vielzahl unterschiedlicher Faktoren verantwortlich.

Transmembrane Strukturelemente werden oft durch aromatische Aminosäurereste in der

Grenzfläche der Membran verankert. Untereinander können sie durch

Wasserstoffbrückenbindungen, Disulfidbrücken, hydrophobe Wechselwirkungen und ionische

Wechselwirkungen zusammengelagert sein. Auch die Bindung von Kofaktoren und das

Zusammenwirken von Domänen außerhalb der Membran kann für die korrekte Anlagerung

von transmembranen Elementen aneinander eine Rolle spielen(Booth, 1999).

23

Zielsetzung

Proteine sind wichtigster Bestandteil aller Lebensvorgänge. Neben vielfältigen strukturellen

Aufgaben in der Zelle katalysieren sie vor allem die Stoffwechselreaktionen und sorgen für

den gezielten Transport lebenswichtiger Substanzen an ihren Bestimmungsort. Die

funktionelle Vielseitigkeit der Proteine liegt in der Vielzahl der möglichen Sequenzen

begründet, die aus den 20 Grundbausteinen, den Aminosäuren, gebildet werden können, und

in den komplexen Strukturen, zu denen sich solch ein Proteinstrang zusammenlagern kann.

Um detaillierte Informationen über Struktur und Funktion eines Proteins zu gewinnen, bedarf

es großer Mengen des hochreinen Proteins. In vielen Fällen kann dieser Bedarf nicht durch

Aufreinigung des Zielproteins aus dem ursprünglichen Organismus gedeckt werden. Dies gilt

besonders für Membranproteine, die schwierig zu isolieren sind und oft nur in geringsten

Mengen in der Zelle vorkommen. So gibt es zum Beispiel Rezeptoren in medizinisch

relevanten Signaltransduktionsprozessen, die nur in wenigen oder gar einer Kopie pro Zelle

vorliegen. Diese geringe Verfügbarkeit ist zusammen mit den Schwierigkeiten bei der

Kristallisation der Grund dafür, daß bisher weniger als 30 verschiedene

Membranproteinstrukturen aufgeklärt wurden, gegenüber mehr als 5000 Strukturen löslicher

Proteine.

Die Überexpression – das Produzieren eines Proteins in einem Wirtsorganismus mit

gentechnischen Methoden – ist ein häufig genutztes Mittel zur Herstellung großer

Proteinmengen. Als Wirtsorganismen eignen sich besonders Bakterien, nicht nur weil sie

einfach und kostengünstig zu handhaben sind, sondern auch weil die Proteinausbeuten weit

über denen eukaryontischer Expressionssysteme liegen. Bei der Überexpression von

eukaryontischen Proteinen in Bakterien (meist E.coli) können jedoch verschiedene Probleme

auftreten. Insbesondere Membranproteine werden von Bakterien zumeist nicht in ihrer

korrekten Konformation hergestellt. Dies trifft auch auf das in dieser Arbeit untersuchte

Protein OEP16 zu.

OEP16 ist ein Protein aus der Erbse, das den spezifischen Transport von Aminosäuren und

Aminen durch die äußere Chloroplastenmembran ermöglicht. Es wird von E.coli in Form von

„Inclusion bodies“, großen Proteinaggregaten, produziert. Da OEP16 in der Erbsenpflanze nur

in relativ kleinen Mengen vorkommt und bisher keine Reinigungsprozedur für das native

Protein besteht, sollten in der vorliegenden Arbeit Wege gefunden werden, das fehlgefaltete

24

Protein aus E.coli für strukturelle und funktionelle Untersuchungen zugänglich zu machen. Im

Erfolgsfall würde dies OEP16 darüber hinaus zu einem Modell für die Strukturbildung von

Membranproteinen in vitro machen – ein Vorgang, über dessen Mechanismen bisher nur sehr

wenig bekannt ist. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich daher mit der Faltung des

Membranproteins in vitro.

Bisher existierende Strukturmodelle von OEP16, die sich hauptsächlich auf Crosslink-

Experimente, CD-Spektren und Primärsequenzanalysen stützten, sprachen für ein Homodimer

mit einer gemischten Struktur aus transmembranen α-Helices und transmembranen β-

Faltblattstrukturen. Bisher kennt man Membranproteine dieser Größe nur als rein α-helikal

(z.B. Bakteriorhodopsin) oder als reine β-Faltblattstrukturen (z.B. Porine). Bekannte

Transportproteine der äußeren Membranen von Chloroplasten, Mitochondrien und auch gram-

negativen Bakterien sind ausschließlich aus β-Faltblättern aufgebaut. OEP16 ist nach den

bisherigen Untersuchungen demnach ein Vertreter einer neuen Familie von

Membranproteinen. Dies macht weitergehende Untersuchungen zur Struktur des Proteins

besonders interessant.

Im zweiten Teil der Arbeit sollten physikochemische und spektroskopische Daten erfaßt

werden, die Schlüsse auf die Struktur von OEP16 zulassen. Die gewonnenen Daten und

theoretischen Betrachtungen zur Aminosäuresequenz von OEP16 sollten genutzt werden, um

ein neues, detailliertes Modell für die Struktur dieses ungewöhnlichen Transportproteins zu

erstellen. Darüber hinaus sollten mit Methoden der Proteinkristallographie und

Elektronenmikroskopie Vorarbeiten geleistet werden, auf denen aufbauend in Zukunft ein

Strukturmodell mit nahezu atomarer Auflösung geschaffen werden kann.

25

Material und Methoden

Überexpression von OEP16 in E.coli

Die Überexpression von OEP16 erfolgte in der Arbeitsgruppe von Prof. Soll im Botanischen

Institut der Universität Kiel. Verwendet wurde ein pET-Vektor der Firma Novagen. Der

E.coli-Expressionsstamm BL21(DE3) wuchs in 2YT-Medium (1,6% Caseinhydrolysat, 1%

Hefeextrakt und 0,5% NaCl) mit dem Selektionsantibiotikum Ampicillin (135 mg/l) in 500

ml-Schüttelkulturen. OEP16 lag nach Induktion der Überexpression mit IPTG aggregiert in

Form von so genannten Inclusionbodies vor. Diese Proteinpartikel wurden nach Lyse der

E.coli-Zellen bei 1200 psi in einer „French Press“ in einem Lysepuffer (20 mM Tris/HCl pH

8, 1 mM EDTA, 25% Saccharose) und anschließender Ultraschallbehandlung zur Zerstörung

von DNA mehrfach durch Zentrifugieren (10 min bei 10000 g in einer Sorvall Zentrifuge mit

GSA-Rotor) und Resuspendieren in detergenzhaltigem Puffer gewaschen. Der erste

Waschschritt erfolgte in einem Detergenzpuffer (20 mM Tris/HCl pH 7,5, 200 mM NaCl, 1%

Desoxycholat, 1% Nonidet P40, 1 mM EDTA, 10 mM β-Mercaptoethanol). Anschließend

wurde zweimal mit einem ähnlichen Puffer (mit 0,5% MEGA9 als Detergenz und ohne

Kochsalz) resuspendiert und erneut abzentrifugiert

und anschließend in Puffer (Tris/HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 10 mM DTT) bei –80°C gelagert

bzw. auf Trockeneis versandt.

Reinigung von OEP16

Die OEP16-Inclusionbodies (bis zu 500 µl Pelletvolumen) wurden in 10 ml harnstoffhaltigem

Solubilisierungspuffer (Puffer C) gelöst. Dies geschah entweder durch Schütteln im Kühlraum

über Nacht oder durch Beschallen mit der Mikrospitze eines Branson Sonifiers (30% Puls,

maximale Energie) für etwa 5 Minuten auf Eis. Die Lösung wurde anschließend 10 min bei

5000 g zentrifugiert und anschließend durch einen 0,2 µm Spritzenfilter filtriert.

Abzentrifugieren und Filtrieren der Probe wurde notwendig, um feine Verunreinigungen zu

entfernen, die regelmäßig die Pumpenköpfe der verwendeten Chromatographieanlage

verstopften.

Die chromatographische Reinigung erfolgte bei Raumtemperatur in einem Abzug. Verwendet

wurde eine Knauer-HPLC-Anlage mit zwei Pumpen und einer Programm-Einheit, die das

Mischen des Salzgradienten und die Flußraten steuert. Die Detektion des Proteins erfolgte mit

26

einem Filter-UV-Detektor bei 280 nm Wellenlänge. Chromatogramme (UV-Signal) und

Gradient (Leitfähigkeit) wurden mit einem Zweikanalschreiber aufgezeichnet. Die

Präpaprationspuffer (Puffer A und B) für die Säulenchromatographie entsprechen dem Puffer

zum Lösen der Inclusionbodies, enthielten aber eine geringere Harnstoffkonzentration (6M).

Der Hochsalzpuffer B enthielt zusätzlich 1 M NaCl. Der erste Schritt zur

chromatographischen Reinigung des Proteins erfolgte mit einer Source30Q

Anionenaustauschsäule (Pharmacia) mit einem Säulenvolumen von 30 ml und einem

Querschnitt von 25 mm. Die Flußrate betrug 3 ml/min. Das Protein befindet sich aufgrund

seines hohen isoelektrischen Punktes von 9 im Druchbruch der Säule, während ein Großteil

der Verunreinigungen, vor allem Proteine mit negativer Nettoladung und Nukleinsäuren,

zurückgehalten werden. Details zum Gradienten und das Elutionsprofil werden im

Ergebnisteil dieser Arbeit gezeigt und diskutiert. Der aufgefangene Druchbruch hat ein

Volumen von 15-25 ml und eine geringe Ionenstärke (50-70 µS).

In einem zweiten Schritt wird das so vorgereinigte OEP16 direkt auf eine MonoS

Kationenaustauschsäule mit 1 ml Säulenvolumen (Pharmacia) aufgetragen. Bei einer

Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min bindet das Protein an die Kationenaustauschmatrix und

eluiert nach starten des Salzgradienten bei einer Salzkonzentration von 120 mM NaCl.

Typischerweise erhält man so aus 300 µl Inclusionbodies 3-4 ml einer OEP16-Lösung mit

einer Konzentration von 1 mg/ml.

Die für die Präparation verwendeten Puffer sind:

Puffer A (Präpapration) Puffer B (Präparation) Puffer C (Solubilisierung)

6 M Harnstoff 6 M Harnstoff 8 M Harnstoff

20 mM Hepes/KOH pH 7,5 20 mM Hepes/KOH pH 7,5 20 mM Hepes/KOH pH 7,5

10 mM ß-Mercaptoethanol 10 mM ß-Mercaptoethanol 10 mM ß-Mercaptoethanol

1 mM EDTA 1 mM EDTA 1 mM EDTA

1 M NaCl

SDS-Gelelektrophorese

10 µl des gereinigten Proteins in Harnstoff wurden unverdünnt mit 10 µl Probenpuffer (20

mM Tris/HCl pH 7,5, 2 mM EDTA, 0,2% SDS und 0,2% DTT) versetzt und 5 min auf 95°C

27

erhitzt, um Cysteinreste zu reduzieren und das Protein vollständig zu denaturieren. jeweis 1 µl

der entstandenen Proteinlösung wurden dann mit einem Probenkamm (Pharmacia) auf ein

SDS-HD-Gel (ebenfalls Pharmacia) aufgetragen. Die elektrophoretische Trennung erfolgte

mit einem PhastSystem (Pharmacia) mit einem Standardprogramm (500 V, 10 mA, 158 Vh

bei 15°C). Die Gele wurden einer Silberfärbung nach Vorschrift des Herstellers unterzogen.

Faltung von OEP16

Liposomen

In vivo insertiert OEP16 vermutlich spontan in die äußere Chloroplastenmembran(Cline,

1996; Heins, 1998). Dieser Vorgang läßt sich durch Rekonstitution in Liposomen imitieren.

Für elektrophysiologische Messungen an OEP16 werden Liposomen aus Phosphatidylcholin

verwendet (siehe unten), die mit dem Detergenz MEGA-9 aufgelöst und mit OEP16 in

Harnstoff versetzt wurden. Nach anschließender Dialyse zur Entfernung von Harnstoff und

Detergenz erhält man Liposomen mit eingebautem OEP16, das dieselbe Kanalleitfähigkeit

wie das native Protein zeigt(Pohlmeyer, 1997a). Diese Liposomen lassen sich auch für

spektroskopische Untersuchungen von OEP16 in seiner Lipidumgebung verwenden.

Als Lipid wurde entweder eine Mischung aus hochreinem Phosphatidylcholin mit

Phosphatidsäure (Firma Lipoid) im Verhältnis 20:1 verwendet, oder selbst nachgereinigtes

Phosphatidylcholin (Typ S-IV, Sigma). Zum Reinigen des S-IV-Lipids wurde die

Lipidsuspension (100 mg/ml in 10 mM Tricin/KOH pH 8,2) mit sechs Volumenteilen

Methanol/Chloroform versetzt (Methanol/Chloroform 2:1) und nach Zusatz von zwei

Volumenteilen 1M KCl, 0.2M H3PO4 im Scheidetrichter ausgeschüttelt. Danach wird die

Lösung stehengelassen und gewartet, bis sich die Phasen getrennt haben. Die (untere)

Lipidphase wird abgelassen und der pH der Wasserphase mit KOH auf ca. 8 eingestellt. Dann

wird die Wasserphase erneut mit Lösungsmittel ausgeschüttelt. Anschließend werden die

organischen Phasen vereinigt und das Lipid im Rotationsverdampfer getrocknet. Dieses Lipid

enthält neben Phosphatidylcholin Spuren vieler anderer pflanzlicher Membranlipide.

28

Die Liposomen werden wie folgt hergestellt:

500 µl OEP16-Lösung (1 mg/ml) im Präparationspuffer (Puffer A mit ca. 150 mM NaCl)

werden mit 500 µl einer Lipidlösung (50 mg/ml gelöst in Puffer D mit 160 mM MEGA-9)

versetzt und durch Schütteln und Beschallen im Ultraschallbad bei Raumtemperatur gemischt,

bis das Lipid vollständig gelöst ist. Die klare Lösung wird in einen Dialyseschlauch mit 3500

Da maximaler Porengröße (Spectrum) gefüllt. Die Dialyse zur Bildung der Liposomen erfolgt

gegen 5 l Puffer D zunächst bei Raumtemperatur, da das Detergenz MEGA-9 bei diesen

hohen Konzentrationen in der Kälte ausfällt. Nach etwa zwei Stunden wird die Dialyse über

Nacht im Kühlraum fortgesetzt.

Detergenz-basierte Methoden für die Rekonstitution

Detergenzien können Proteine aus Lipidmembranen herauslösen, indem sie die Bestandteile

dieser Membranen imitieren und ersetzen. Ähnlich wie Membranlipide besitzen Detergenzien

langkettige, hydrophobe Bereiche, die an einem hydrophilen Kopf sitzen. Sie bilden in

wäßrigen Medien Mizellen mit einem hydrophoben Kernbereich. Da OEP16 spontan in

Lipidmembranen eingebaut und korrekt gefaltet werden kann, sollte dieser Vorgang auch in

Detergenzmizellen zu imitieren sein, wenn man das geeignete Detergenz wählt.

Gelfiltration

Getestet wurden verschiedene Sephadex-Materialien (G10, G25 und G50) sowie analytische

Gelfiltrationssäulen mit Superdex-Matrix (Superdex75 und Superdex200).

Sephadex-Säulen mit einem Durchmesser von 0,9 cm und einer Bettlänge von 8 cm wurden

selbst nach Vorschriften des Herstellers (Pharmacia) gegossen. Als Laufpuffer diente der für

die Dialysemethode verwendete Puffer (siehe dort) unter Zusatz einer Detergenzkonzentration

von 0,03% C12E8. Es wurde dieselbe Knauer HPLC-Anlage wie für die Proteinreinigung

verwendet. Die Flußraten lagen bei 0,5 ml/min für selbst gegossene Säulen und bei 1 ml/min

für die fertigen Superdex-Säulen.

Von der Matrix gebundenes Protein wurde mit 0,5 M NaOH eluiert und die Säule

anschließend mit 30% Isopropanol gewaschen. Wiederfindungsraten wurden aus dem UV-

Signal des HPLC-Detektors abgeschätzt.

29

Dialyse

Zur Rekonstitution des Proteins mittels Dialyse wurden der Proteinlösung in Harnstoffpuffer

die notwendige Menge hochkonzentrierter Detergenz-Stammlösung zugesetzt, um die für

weitergehende Untersuchungen notwendige Endkonzentration an Detergenz zu erhalten ohne

das Protein dabei unnötig zu verdünnen. Die Lösung wurde anschließend in Dialyseschläuche

oder in Dialysebuttons (Hampton Research) gefüllt und diese in ein großes Reservoir

Dialysepuffer versenkt. Das Endvolumen der Dialyseansätze betrug (je nach Bedarf des

anschließenden Experiments) 0,2 bi 2 ml. Die Dialyse erfolgte im allgemeinen über Nacht.

Verwendet wurden ausschließlich Dialysemembranen der Forma Spectrum mit einer

Porenweite von 2500 Da. Der Dialysepuffer enthielt 20 mM Hepes/KOH pH 7,5 und

1 mM EDTA.

Verdünnung

OEP16-Proben, die im weiteren Verlauf dieses Kapitels erwähnt werden, wurden (wenn nicht

anders angegeben) durch Verdünnen hergestellt. Hierzu werden 100 µl der aus der

chromatographischen Reinigung erhaltenen OEP16-Lösung in Puffer A ohne weitere

Behandlung mit 900 µl detergenzhaltigem Puffer in einem Reaktionsgefäß (1,5 ml,

Plastibrand) durch vortexen gemischt. Der Verdünnungspuffer enthielt neben der

gewünschten Detergenzkonzentration 20 mM Hepes/KOH (pH 7,6) und 1 mM EDTA. Die

Arbeitskonzentrationen der Detergenzien lagen üblicherweise oberhalb ihrer CMC, im

Bereich 1 x CMC bis 10 x CMC. Die Faltungsreaktion erfolgt bei Raumtemperatur.

Spektroskopische Methoden

Proteinbestimmung nach Bradford

Da die meisten Proteinbestimmungmethoden auf das Reduktionsmittel β-Mecaptoethanol

emfindlich reagieren, das in allen OEP16-Proben enthalten ist, konnte die Konzentration des

Proteins nur mittels der Bradford-Methode bestimmt werden. Da diese Methode durch die

Gegenwart von Detergenzien erheblich gestört wird, beziehen sich alle

Proteinkonzentrationen auf die Messung der Ausgangskonzentration von OEP16 in der

30

Harnstofflösung (Präparationspuffer A mit 150 mM NaCl). Ist von Endkonzentrationen die

Rede, sind diese durch Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors aus der

Ausgangskonzentration berechnet.

Fluoreszenz-Spektroskopie

Die in dieser Arbeit gezeigten Spektren wurden mit einem FluoroMax-2 Spektrometer der

Firma ISA in 1 ml Halbmikro-Quartzküvetten mit einer Schichtdicke von 0,5 cm in der

Anregungsrichtung und 1 cm in der Meßrichtung aufgenommen. Die Bandbreiten für die

Anregungs- und Meßwellenlängen betrugen üblicherweise 1 bis 2 nm. Zur Aufnahme der

Spektren wurden in den meisten Fällen 100 µl einer OEP16-Lösung in Puffer A mit 900 µl

einer geeigneten Detergenzlösung (Detergenzkonzentration wie beim jeweiligen Experiment

angegeben, in 20 mM Hepes/KOH pH 7,6, 1 mM EDTA) in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß

gemischt und anschließend in die Küvette gefüllt. Das Mischen in der Küvette ist aufgrund

der unterschiedlichen Viskositäten ond Dichten der Lösungen schwierig. Die

Endkonzentration von OEP16 in diesen Ansätzen betrug je nach Experiment 0,03 bis 0,1

mg/ml. Die Messungen erfolgten bei Raumtemperatur.

Zum Messen von Differenzspektren (OEP16-Liposomen/leere Liposomen) wurden die wie im

Abschnitt „Liposomen“ beschrieben hergestellten Liposomen mit den oben genannten

Parametern ohne weitere Verdünnung gemessen. Die Spektren wurden ohne weitere

Bearbeitung voneinander abgezogen, um das störende Fluoreszenzsignal der

Liposomenlösung zu eliminieren.

CD-Spektroskopie

Alle CD-Spektren wurden mit einem Jasco J500 CD-Spektropolarimeter bei Raumtemperatur

aufgenommen. Die verwendeten Küvetten hatten eine Schichtdicke von 0,2 mm, die

Probenkammer wurde ständig mit Stickstoff gespült, um Absorptionseffekte durch Sauerstoff

sowie oxidative Beschädigung der empfindlichen Spiegelsysteme des Geräts zu vermeiden.

Die Spektren wurden mit einer Auflösung von 0,1 nm und einer Aufnahmezeit von 10s/nm

aufgenommen. Es wurden jeweils fünf Spektren gemittelt. Die Proteinkonzentrationen lagen

je nach Messung zwischen 0,1 und 0,5 mg/ml. Die Proben wurden wie im Abschnitt

„Detergenz-basierte Methoden für die Rekonstitution“ erläutert hergestellt.

31

Für hochauflösende Spektren im gesamten Wellenlängenbereich wurden Proben mit 0,5

mg/ml OEP16, dialysiert gegen 10 mM Natrimcacodylatpuffer (pH 7,0, mit 50 mM

Natriumsulfat), in Tonnenküvetten mit einer Schichtdicke von 0,05 mm gemessen. Es wurden

wiederum fünf Spektren gemittelt. Alle CD-Messungen erfolgten bei Raumtemperatur.

IR-Spektroskopie

FT-IR-Spektren (Fuorier-Transform-Infrarotspektren) wurden mit einem IFS28/B

Spektrometer der Firma Bruker Optik GmbH, Ettlingen aufgenommen. Die Probenkammer

wurde mit getrockneter Luft gespült. Die Signale wurden mit einem DTGS-Detektor erfaßt

und mittels Fourier-Transformation („Happ-Genzel apodization“) in Infrarotspektren

umgewandelt. Die Geräteauflösung betrug 4 Wellenzahlen. Es wurden jeweils 32 Messungen

gemittelt, um das Rauschen zu reduzieren. Die Spektren sind in ihrer zweiten Ableitung

dargestellt.

Da Protein-FTIR-Spektren wegen der störenden anregbaren Schwingungen des Wassers

(insbesondere der symmetrischen Deformationsschwingung δ bei 1595 cm-1) im

interessierenden Wellenlängenbereich (Wellenzahlen zwischen 2000 und 1400 cm-1) nur in

D2O meßbar sind, mußten die Proben vorher in D2O überführt werden.

Den Liposomen wurden hierzu über nacht in einer Gefriertrocknungsanlage das Wasser

entzogen; sie wurden erst kurz vor der Messung in reinem D2O wieder aufgenommen.

Gleichzeitig mit dem Wechsel des Lösungsmittels kann so auch eine höhere

Probenkonzentration erreicht werden. Liposomensuspensionen mit einem ursprünglichen

Volumen von 1 ml wurden in 100 µl aufgenommen. Die OEP16-Endkonzentration in diesen

Proben betrug für die Messung etwa 5 mg/ml. Die Suspension wird in eine IR-Küvette mit

CaCl2-Fenstern gefüllt, die mit Dichtungsringen zu einer Schichtdicke von 50 µm

zusammengepreßt werden. Gemessen wurde bei Raumtemperatur; Die Probenkammer wurde

vor der Messung ausreichend (mindestens 20 Minuten) mit getrockneter Luft gespült, um den

störenden Einfluß von Wasserdampf auf die Spektren zu minimieren.

Zeitaufgelöste Spektroskopie

Zeitaufgelöste Intensitätsunterschiede der Tryptophanfluoreszenz von OEP16 während des

Faltungsprozesses wurden im Zeitfenster von 1 bis 100 ms mit einem SX-18MV stopped flow

32

Apparat der Firma Applied Photophysics (Leatherhead, Großbrittanien) gemessen. UV-

Anregung erfolgte durch eine Xenondrucklampe bei einer Wellenlänge von 280 ± 20 nm. Die

Detektion wurde mit einem Interferenzfilter auf 334 ± 5 nm Wellenlänge eingeschränkt. Das

Mischungsverhältnis von Proteinprobe zu Verdünnungspuffer betrug 1:10, was einer

Enkonzentration von 0,07 mg/ml OEP16 in 600 mM Harnstoff, 20 mM Hepes/KOH (pH 7,6),

1 mM EDTA und 1 mM ß-Mercaptoethanol mit unterschiedlicher Detergenzkonzentration (je

nach Experiment) entsprach. Die erhaltenen Signale wurden mittels nichtlinearer Regression

in einem Bereich von 3-100 ms mit der Methode der kleinten Quadrate als doppelt

exponentielle Kurven angenähert. Einzelne Meßkurven wurden mit einem π∗-180 stopped

flow Apparat desselben Herstellers aufgenommen, der ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis

hat, was den relativen Fehler für die mathematische Bestimmung der Zeitkonstanten von

<10% auf <1% reduziert. Bei niedrigen Detergenzkonzentrationen konnten hier 3-fach

exponentielle Kurven angenähert werden. Die Standardmessungen erfolgten bei

Raumteperatur (25°C). Die temperaturabhängigen Messungen wurden im Temperaturbereich

von 10°C bis 35°C durchgeführt.

Messungen mit CD-Detektion erfolgten ebenfalls mit einem π∗-180 stopped flow Apparat

unter denselben Bedingungen (25°C). Die Änderung der Elliptizität wurde bei einer

Wellenlänge von 228 nm im Bereich von 2-200 ms aufgenommen.

Physikalisch-chemische Methoden

DSC

Denaturierungskurven wurden in einem Microcal MC-2 Scanning-Kalorimeter aufgenommen.

Die Proteinkonzentration für die Messungen betrug 0,55 mg/ml in einem Meßvolumen von

1,225 ml. Der Puffer enthielt 20 mM Hepes/KOH (pH 7,6), 1 mM EDTA und variable

Mengen Detergenz. Die Proben wurden wie im Abschnitt „Detergenz-basierte Methoden für

die Rekonstitution“ erläutert hergestellt. Die Referenzprobe bestand aus demselben Puffer

ohne Protein. Die Heizrate betrug 30°C/h, gemessen wurde im Bereich zwischen 20° und

95°C. Meßgröße war die Wärmekapazität als eine Funktion der Temperatur, die unter

Berücksichtigung von Volumen und Konzentration der Probe auf die molare Wärmekapazität

umgerechnet wurde. Denaturierungstemperatur (Kurvenmaximum) und –enthalpie (Fläche

unter der Kurve) wurden aus der gemessenen Kurve nach Abziehen des Untergrundsignals

bestimmt.

33

Elektronenmikroskopie

Für die Transmissions-Elektronenmikroskopie an OEP16 wurden 5 µl der durch Verdünnung

hergestellten Proteinlösung mit einer Endkonzentration von 0,01 mg/ml auf einem

hydrophilisierten kohlenstoffbeschichteten Gitter (hergestellt durch 60 s Plasmabehandlung

bei 8 W Leistung mit einem Baltec MED 020) aufgetragen, überschüssige Flüssigkeit

abgesaugt und die Probe luftgetrocknet. Ein Tropfen Phospho-Wolframsäure (2% w/v, pH

7,0) wurde für 45 s zugegeben und anschließend wieder abgesaugt. Diese Vorgänge erfolgten

bei Raumtemperatur. Die erneut getrocknete Probe wurde dann in einem Philips CM12

Transmissions-Elektronenmikroskop bei einer 58300-fachen primären Vergrößerung

betrachtet. Hierzu wurde ein „Nieder-Dosis-Protokoll“ des Herstellers verwendet, um

unnötige Strahlungsschäden an der Probe zu vermeiden. Die Bildaufzeichnung erfolgte

fotografisch.

Kristallisation

Probenvorbereitung

Erste Kristallisationsexperimente wurden mit OEP16, rekonstituiert in C12E8, durchgeführt.

Die Proben wurden wie im Abschnitt „Detergenz-basierte Methoden für die Rekonstitution“

erläutert hergestellt. Die Detergenzkonzentration betrug 0,03%. Um eine möglichst hohe

Proteinkonzentration zu erreichen, wurde das gefaltete Protein in Puffer mit gesättigter

Ammoniumsulfatlösung im Verhältnis 1:1 versetzt und dabei präzipitiert. Das Protein wurde

in Wasser wiederaufgenommen, so daß das Endvolumen einem zehntel des

Ausgangsvolumens entsprach, was einer Proteinkonzentration von etwa 10 mg/ml entspricht.

Da auch das verwendete Detergenz mit Ammoniumsulfat aus der Lösung ausfällt, erhöht sich

auch die Detergenzkonzentration entsprechend. Die erhaltene Lösung wurde mit maximaler

Geschwindigkeit (13.000 upm in einer Heraeus Mikrizentrifuge) abzentrifugiert, um reichlich

vorhandene Aggregate abzutrennen und mit den Pufferlösungen der Kristallisationsansätze

versetzt.

34

Kristallisationsansätze

Grundsätzlich wurde wegen der einfachen Handhabbarkeit die Methode der hängenden

Tropfen genutzt. Hierbei wird ein kleiner Tropfen der Proteinlösung mit Puffer hängend an

einem Deckglas angebracht, der mittels Dampfdiffusion mit einem Pufferreservoir in Kontakt

steht. Die Salzkonzentration im Reservoir ist höher als im Tropfen, so daß Salz- und

Proteinkonzentration während des Diffusionsprozesses im Tropfen zunehmen. Hierbei wird

idealerweise die Phasengrenze für die Löslichkeit des Proteins überschritten – eine

notwendige Bedingung für die Kristallisation. Das Verhältnis von Proteinlösung zu

Präzipitationslösung betrug 4:1. Auf diese Weise wurde eine weitere Aufkonzentrierung der

Proteinlösung durch den Diffusionsvorgang erreicht. Das Startvolumen der hängenden

Tropfen zu Beginn des Diffusionsvorganges betrug 5 µl, die Tropfen wurden dann auf

unbehandelte Deckgläser aufgebracht. Deckgläser und Pufferreservoire wurden durch

Silikonpaste gasdicht miteinander verbunden und derart abgedichtet, um ein Austrocknen der

Ansätze zu vermeiden.

Die Löslichkeit von OEP16 wurde durch Variation der Parameter Fällungsmittel, pH,

Kristallisationsansätze und Temperatur verringert. Fällungsmittel, pH-Werte und Zusätze

wurden zunächst durch die fertigen Lösungen zur Proteinkristallisation der Firma Hampton

Research bestimmt. Die Zusammensetzung dieser Lösungen beruht auf empirischen

Erfahrungen bei der Kristallisation von Membranproteinen. Die Ansätze wurden bei 18°C in

einem Temperierschrank und bei 4°C im Kühlraum inkubiert und täglich mit einem

Mikroskop überprüft, ob sich Präzipitat oder Kristalle in den Tropfen gebildet hatten. In

einigen Ansätzen trat auch eine Phasentrennung in zwei nicht mischbare, wäßrige Phasen auf.

Die besten Kristalle wurden mit Natriumzitrat als Fällungsmittel erhalten. Die auftretende

Phasentrennung entsteht wohl in erster Linie durch die geringe Löslichkeit von

Polyethylenglykolen (und damit auch von PEG-haltigen Detergenzien) in Zitrat-

Lösungen(Marcos, 1999). Die Proteinkristalle bilden sich in der entstandenen

detergenzreichen Phase erst nach der Phasentrennung aus. Unter dem Mikroskop läßt sich die

Veränderung von runden, öligen Tropfen (detergenzreiche Phase) zu kantigeren,

doppelbrechenden Kristallen im Lauf von 1-3 Tagen gut beobachten.

35

Messung der Röntgenbeugung

Die einzelnen OEP16-Kristalle wurden vorsichtig mit einer kleinen Kunststofföse (0,5 mm

Durchmesser) zusammen mit einem Tropfen Kristallsiationslösung aus den Ansätzen

„gefischt“. Die Öse („Loop“) wurde in eine dünne Quarzkapillare mit 2 mm Durchmesser

gesteckt und mit dieser so mit Wachs verbunden, daß der Kristall die Quarzoberfläche nicht

berühren konnte (bei Berührung lösten sich die Kristalle auf) und das Röhrchen gasdicht

verschlossen war. Die Kapillare wurde dann auf einen Gonometerkopf aufgebracht und in den

Röntgenstrahl gebracht.

Die Röntgenbeugung der OEP16-Kristalle wurde mit einer rotierenden Kupferanode bei einer

Wellenlänge von 15,4 nm gemessen. Der Generator wurde mit 40 kV und 65 mA betrieben,

die Blenden für die Strahlbegranzung waren auf 0,3 mm eingestellt. Reflexe wurden mit einer

Imageplate (MAR Research) mit 18 cm Durchmesser erfaßt. Die Messung und die

anschließende Auswertung der Beugungsbilder mit dem Programm DENSO in Verbindung

mit dem Grafikprgramm XDISPLAYF erfolgte bei der AG Sänger, FU Berlin.

Theoretische Strukturvorhersage

Sämtliche im Folgenden beschriebenen Methoden sind im Internet abrufbar. Besonders

hilfreich für das Finden solcher Analysewerkzeuge sind die Server des Europäischen

Molekularbiologie-Netzwerks (http://www.embnet.org), des Proteinanalyse-Systems Expasy

(http://www.expasy.ch) oder des Institut Pasteur (http://bioweb.pasteur.fr). Im Folgenden

werden die für diese Arbeit verwendeten Methoden kurz beschrieben und genaue

Internetadressen angegeben.

"Multiple Sequence Alignment"

Um Sequenzen eines Proteins aus verschiedenen verwandten Organismen überhaupt

miteinander vergleichen zu können, muß man sie in geeigneter Weise nebeneinander

darstellen. Was sich zunächst wie ein triviales Problem anhört, wird um so schwieriger, je

geringer der Verwandtschaftsgrad der untersuchten Proteine ist. Das so genannte "Multiple

36

Sequence Alignment" berücksichtigt auch Sequenzbereiche, die nicht in allen Proteinen einer

untersuchten Gruppe vorkommen und markiert diese entsprechend.

Hier wurde der Algorithmus Dialign (Version 2.1) verwendet(Morgenstern, 1999), der unter

der Adresse http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/dialign/ genutzt werden kann. Dialign gibt

nicht nur die entsprechend ihrer Homologie angeordneten Sequenzen aus, sondern berechnet

für jede Position in der Sequenz einen Homologie-Index mit einem Wert zwischen 0 und 5,

wobei 0 komplette Abweichung und 5 eine komplette Übereinstimmung im untersuchten

Sequenzbereich bedeutet.

Vorhersage transmembraner Bereiche

Die Vorhersage von transmembranen Bereichen wird im allgemeinen über sogenannte

Hydrophobizitäts-Plots(Kyte, 1982) vorgenommen. Diese Methode errechnet die

durchschnittliche Hydrophobizität eines kurzen Sequenzbereichs. Anhand solcher

Hydrophobizitätswerte aus Proteinen, deren Struktur bekannt ist, kann man einen Grenzwert

der Hydrophobizität bestimmen, über dem ein Sequenzbereich mit hoher Wahrscheinlichkeit

innerhalb einer Membran liegen muß. Leider versagt diese Methode bei transmembranen β-

Faltblattstrukturen ebenso wie bei amphiphilen α-Helices, da diese relativ viele hydrophile

Aminosäuren enthalten können, wenn sie zum Beispiel einen Kanal durch die Membran

bilden.

Hilfreich ist hier die Verwendung von "Multiple Sequence Alignments". Das Programm

„Pepwindowall“ (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/pepwindowall.html) erlaubt das

Erstellen von gemittelten Hydrophobizitätsplots aus mehreren verwandten Sequenzen. Im Fall

von OEP16 treten hierdurch die transmembranen Segmente deutlicher zu Tage.

Auf ganz andere Weise funktioniert derAlgorithmus TMPred zur Vorhersage transmembraner

Helices(Hofmann, 1993), verfügbar unter der Adresse

http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html. Hier werden Sequenzbereiche mit

einer Sequenzdatenbank bekannter transmembraner Helices direkt verglichen und so ein

Topologiemodell erstellt.

37

Hydrophobe Cluster-Analyse

Die hydrophobe Cluster-Analyse HCA(Callebaut, 1997) erlaubt ebenfalls Vorhersagen über

transmembrane Bereiche und erkennt auch amphiphile Bereiche in vielen Fällen. Die

zweidimensionale Darstellung einer Sequenz zeigt jede Aminosäure umgeben von den sechs

Aminosäuren in ihrer näheren Umgebung (Position -3 bis -1 und 1 bis drei in der Sequenz um

die untersuchte Aminosäure). So lassen sich Sequenzbereiche mit hoher Hydrophobizität

einfach bildlich darstellen. Amphiphile Bereiche und transmembrane β-Faltblattstrukturen

ergeben auffällige Muster. HCA-Plots können unter der Adresse

http://smi.snv.jussieu.fr/hca/hca-form.html erstellt werden.

38

Ergebnisse

Von der Proteinreinigung zum gefalteten Protein (eine Einleitung)

OEP16 ist ein kleines Membranprotein aus der äußeren Chloroplastenmembran der Erbse. Bis

heute gibt es kein Reinigungsprotokoll, das die Isolierung großer Mengen des nativen Proteins

aus Erbsenpflanzen erlaubt. Zum einen ist der Anteil von OEP16 am Gesamtprotein einer

Pflanzenzelle sehr gering, zum anderen ist selbst bei einer Isolierung äußerer

Chloroplastenmembranen und der damit verbundenen Anreicherung von OEP16 das

Abtrennen anderer Membrankomponenten, vor allem der anderen OEPs mit vergleichbaren

isoelektrischen Punkten, schwierig.

Bei Überexpression des Gens in E.coli hingegen kann man große Mengen des Proteins

gewinnen. Dieses Protein ist jedoch fehlgefaltet und läßt sich nur in Form sogenannter

„Inclusion bodies“ isolieren, großen stabilen Proteinaggregaten mit eingeschlossenen

Verunreinigungen. Diese bestehen meist aus RNA und anderen, bakteriellen Proteinen(Brill,

2000). Als Voraussetzung für alle Experimente zur Struktur- und Funktionsaufklärung

müssen diese Proteinaggregate gelöst und das darin enthaltene OEP16 gereinigt werden.

Anschließend gilt es, Methoden zu finden, die eine Faltung in die native Struktur in vitro

erlauben. Abbildung 7 zeigt die möglichen Strategien, um zu korrekt gefaltetem, für

Funktionsuntersuchungen und die Kristallisation geeignetem Protein zu gelangen.

39

Abbildung 7:

Strategien zur Kristallisation von Membranproteinen

Abbildung 7 zeigt schematisch die Schritte, die bis zur Proteinkristallisation notwendig sind.

Nach erfolgreicher Überexpression des Proteins muß das Protein zunächst effizient

solubilisiert werden, um es in einem nächsten Schritt von Verunreinigungen befreien zu

können. Die verschiedenen in Abbildung 7 aufgezeigten Wege zur Rekonstitution von OEP16

40

unterscheiden sich in ihrer Handhabbarkeit und ihrer Effizienz. Der Einbau in eine künstliche

Lipid-Doppelschicht ermöglicht es, bei Wahl einer geeigneten Lipidzusammensetzung die

natürliche Membranumgebung des Proteins möglichst genau nachzuahmen. Dies sollte zu

hohen Rekonstitutionsraten führen, hat aber den Nachteil, daß das Protein in einer Membran

für viele biophysikalische Methoden und vor allem für die Proteinkristallisation nicht

verwendbar ist und erst wieder solubilisiert, d.h. mit Detergenzien aus der Membran

herausgelöst werden muß.

Ein System, das es ermöglicht, das Protein direkt in Detergenz-Mizellen einzubringen und

dabei in seine native Form zu falten, könnte ohne Umwege große Mengen Protein liefern.

OEP16 ist aber ein Porenprotein, dessen Aktivität sich nur in Membranen messen läßt. Die

Schwierigkeit eines reinen Detergenzsystems ist weniger seine Handhabung, als die Frage,

wie man die korrekte Strukturbildung eines Kanalproteins in Lösung bzw. in Mizellen zeigen

kann.

Im Folgenden soll gezeigt werden, daß mit spektroskopischen Methoden in Detergenz

solubilisiertes Protein mit in Membranen eingebautem Protein verglichen werden kann. Der

Beweis der Faltung in Detergenzmizellen ist hierbei indirekter Natur. Die Aktivität als

wichtigster Beleg für eine korrekte Struktur kann nur in Liposomen gezeigt werden. Hier läßt

sich ein Membranpotential aufbauen und die Diffusion von Substraten durch den Kanal wird

meßbar. Die in Verlauf dieser Arbeit erläuterten Methoden der Fluoreszenz-, CD- und

Infrarotspektroskopie ermöglichen dann vergleichende Untersuchungen der unterschiedlich

präparierten Proben. Nur wenn alle verwendeten vergleichenden Methoden eine

Übereinstimmung der Proben in Liposomen und Mizellen zeigen, kann man von einer

korrekten Faltung von OEP16 in Detergenzmizellen ausgehen und Strukturdaten gewinnen.

Zunächst wird der erste Arbeitsschritt, die Reinigung des Proteins im ungefalteten Zustand,

genauer betrachtet.

Proteinreinigung

Die im Kapitel „Material und Methoden“ beschriebene Proteinreinigung basiert auf der in der

Literatur(Pohlmeyer, 1997a; Pohlmeyer, 1997b) beschriebenen Reinigungsmethode für

denaturiertes OEP16 und wurde weiter optimiert.

Zur Solubilisierung wurde ein Beschallungsschritt eingeführt, um das langwierige Lösen des

Proteins im Solubilisierungspuffer zu beschleunigen (siehe Material und Methoden). Durch

Abzentrifugieren und Filtrieren der Probe konnten feine Verunreinigungen entfernt werden,

41

die regelmäßig die Pumpenköpfe der verwendeten Chromatographieanlage verstopften.

Flußgeschwindigkeiten und die Gradienten wurden der Chromatographieanlage angepaßt. Die

Reinigung erfolgte bei Raumtemperatur in einem Abzug.

Die OEP16-Lösung wurde mittels einer 30 ml Anionenaustauschsäule (SOURCE Q,

Pharmacia) von anionischen Verunreinigungen befreit (Flußrate 3 ml/min). Schematisch wird

dieser Reinigungsschritt in Abbildung 8 dargestellt.

Abbildung 8:

Schematische Darstellung

der Anionenaustausch-

Chromatographie

Abbildung 8 zeigt den Salzgradienten (schwarz) und das Elutionsprofil der UV-aktiven

Substanzen in der Lösung (grau) bei der Vorreinigung von OEP16 mit einer SourceQ-

Anionenaustauschsäule. Während der Durchbruch der Säule vorwiegend OEP16 enthält,

eluieren bei höheren Salzkonzentrationen zwei sehr markante Peaks, die zu einem großen Teil

aus Nukleinsäuren bestehen(Brill, 2000).

Der abschließende Reinigungsschritt bestand aus einer Kationenaustauschsäule (MONO S,

Pharmacia) mit 1 ml Säulenvolumen (Fließgeschwindigkeit 1 ml/min), schematisch

dargestellt in Abbildung 9.

Abbildung 9:

Schematische Darstellung

der Kationenaustausch-

Chromatographie

42

Abbildung 9 zeigt schematisch den zweiten Reinigungsschritt von OEP16 (schwarz

dargestellt ist der Salzgradient, grau das Elutionsprofil). OEP16 eluiert von der

Kationenaustauschsäule mit 120 mM NaCl. Im Durchbruch der Säule befindet sich eine

Substanz, die zwar UV-Licht absorbiert, jedoch laut SDS-Gelelektrophorese keine

nennenswerten Mengen Nukleinsäuren oder Protein enthält. Möglicherweise handelt es sich

hier um kleine Bruchstücke von Proteinen und RNA/DNA.

Das Eluat enthält gereinigtes OEP16 in einer Konzentration von 0,5-1 mg/ml. Es dient als

Ausgangslösung für die im Folgenden beschriebenen Experimente zur Faltung des Proteins in

seine native Struktur.

Faltungsmethoden

Zunächst soll die Wechselwirkung von OEP16 mit verschiedenen Detergenzien betrachtet

werden. Das Protein wird in präparativem Maßstab in einem Puffersystem mit 6 M Harnstoff

gereinigt. Der Harnstoff, ein sogenanntes chaotropes Reagenz, verhindert die

Sekundärstrukturbildung. Dies geschieht sowohl durch das Aufbrechen von

Wasserstoffbrückenbindungen des Proteinrückrates, die für α-Helix- und β-Faltblatt-

Strukturen hauptsächlich verantwortlich sind, als auch durch das Stören von

Wechselwirkungen zwischen benachbarten Aminosäureseitenketten. Um diese Wirkung

aufzuheben und gleichzeitig einen Einbau des Proteins in Detergenzmizellen zu erreichen,

wurden verschiedene Methoden getestet.

Dialyse

Ähnlich zu den Verfahren zur Liposomenherstellung kann man die Protein-Harnstofflösung

mit Detergenz versetzen und den Harnstoff anschließend durch Dialyse entfernen. Dabei gilt

es zu beachten, daß Detergenzmizellen im Gleichgewicht mit Detergenzmonomeren in der

Lösung stehen. Detergenzien mit kurzem hydrophobem Alkylrest haben im allgemeinen eine

hohe CMC (kritische mizellare Konzentration), solche mit einem langen hydrophoben Rest

eine niedrige. Oberhalb dieser Konzentration bilden sich Mizellen, eine konstante

Konzentration an monomerem Detergenz in der Lösung bleibt aber erhalten. Benutzt man

Dialysemembranen mit einem Ausschlußvolumen kleiner als die Mizellengröße, können nur

43

Detergenzmonomere bei der Dialyse entfernt werden. In der Probe lösen sich Mizellen auf,

um eine konstante Monomerkonzentration entsprechend der CMC aufrechtzuerhalten. Die

Dialysegeschwindigkeit hängt generell vom Konzentrationsgefälle über die Dialysemembran

ab. Im Falle von Detergenzien ist das Gefälle und damit die Geschwindigkeit der

Detergenzentfernung um so höher, je höher die CMC und damit die Konzentration an

monomerem Detergenz in der Probe ist.

Membranproteine können durch Detergenzmizellen solubilisiert und in Lösung gehalten

werden. Eine Membranproteinlösung muß also unbedingt eine Detergenzkonzentration

oberhalb der CMC enthalten. Unterhalb dieser Konzentration neigen die hydrophoben

Proteine dazu, zu denaturieren und zu aggregieren. In der Dialyse muß also dem

Dialysepuffer Detergenz zugesetzt werden, um die Konzentration konstant zu halten.

Da hochreine Detergenzien sehr teuer sind, kann das Zusetzen von Detergenz zum

Dialysepuffer ein Nachteil der Dialysemethode sein, insbesondere bei Detergenzien mit hoher

CMC. Andere Detergenzien (solche mit langem hydrophobem Rest) sind aufgrund der

geringen Monomerkonzentration und der kinetischen Stabilität der Mizellen durch Dialyse

nur sehr langsam entfernbar und somit für diese Methode besser geeignet. Generell ist die

Dialyse ein langsamer Prozeß, bei dem die Harnstoffkonzentration in einem Zeitraum von

Stunden auf ein Minimum herabgesetzt wird.

Alle Experimente zur Rekonstitution durch Dialyse wurden mit Membranen durchgeführt, die

3500 Da Porenweite besitzen. Die enge Porenweite ist notwendig, um sicherzustellen, daß

denaturierte Proteinstränge nicht durch die Membran dringen können. Für das korrekt

gefaltete Protein sollten Membranen mit 10 bis 12 kDa Ausschlußgrenze ausreichend sein.

Der Proteinlösung in Harnstoffpuffer wurde die notwendige Menge hochkonzentrierter

Detergenz-Stammlösung zugesetzt, um die für das Folgeexperiment benötigte

Endkonzentration an Detergenz zu erhalten ohne das Protein unnötig zu verdünnen. Die

Lösung wurde anschließend in Dialyseschläuche oder in Dialysebuttons (Hampton Research)

gefüllt und diese gegen 5 l Dialysepuffer dialysiert.

Die Dialysemethode führte generell zu denselben Ergebnissen wie das Verdünnen des

Proteins (siehe dort). Besonders für die Probenvorbereitung zur CD-Spektroskopie erwies sie

sich als hilfreich, weil störende Pufferkomponenten wie z.B. Harnstoff komplett entfernt

werden können. Wegen des verhältnismäßig hohen Zeitaufwandes wurde jedoch bei einem

Großteil der Experimente die Verdünnungsmethode bevorzugt.

44

Gelfiltration

Gelfiltrationsmaterialien sind grobkörnige Matrizes, die von Poren definierten Durchmessers

durchzogen werden. Partikeln, die in diese Poren eindringen können, steht ein größeres

Aufenthaltsvolumen zur Verfügung, kleine Partikel wandern also langsamer durch eine

Gelfiltrationssäule als große. Um Protein aus einer Harnstofflösung mittels Gelfiltration in

eine Detergenzlösung zu überführen, muß die Säule mit dem detergenzhaltigen Puffer

äquilibriert werden. Das Protein wandert schneller als der Harnstoff durch das Säulenbett und

wird dadurch in das Laufpuffersystem überführt. Ein Nachteil dieser Methode ist, daß die oft

recht hydrophoben Matrizes der Gelfiltrationsmaterialien stark mit Detergenzien

wechselwirken. Detergenz im Laufpuffer bindet an die Säulenmatrix, der eluierende Puffer

hat eine unbekannte Detergenzkonzentration. Auch wechselwirken hydrophobe Proteine

häufig mit dem Gelfiltrationsmaterial.

Die Methode ist schneller als die Dialysemethode, aber in vielen Fällen konnte die Adsorption

von Protein an das Säulenmaterial beobachtet werden, mit Substanzverlusten bis zu 100% je

nach Gelfiltrationsmaterial und verwendetem Detergenz. Für OEP16 konnte kein

Gelfiltrationsmaterial gefunden werden, das akzeptable Wiederfindungsraten des Proteins

erbrachte. Getestet wurden verschiedene Sephadex-Materialien (G10, G25 und G50) sowie

analytische Gelfiltrationssäulen mit Superdex-Matrix (Superdex75 und Superdex200). Von

den Superdexsäulen konnte das Protein erst mit 0,5M NaOH wieder entfernt werden. Bei den

Sephadexmaterialien fand sich nach dem Lauf nur etwa 10-20% des eingesetzten Proteins

wieder, der Rest eluierte erst mit 0,5 M NaOH oder 30% Isopropanol.

Verdünnung

Die einfachste und schnellste Methode zur Verringerung hoher Harnstoffkonzentrationen ist

das Verdünnen mit detergenzhaltigem Puffer. Dem Protein wird schlagartig ein Großteil des

denaturierenden Harnstoffs entzogen (siehe auch Abbildung 11 weiter unten), gleichzeitig

kommt es mit Detergenzmizellen in Kontakt. Nachteil ist, daß auch das Protein entsprechend

verdünnt wird und oft für spektroskopische Messungen anschließend wieder ankonzentriert

werden muß. Große Vorteile bieten die Geschwindigkeit und einfache Handhabbarkeit der

Methode.

45

Während den Versuchen zeigte sich, daß – abgesehen von Substanzverlusten bei der

Gelfiltration – die angesprochenen Methoden alle bei der Wahl eines geeigneten Detergenz zu

erfolgreicher Rekonstitution von OEP16 führen können. Leider ist es nur mittels IR-

Spektroskopie möglich, genaue Aussagen über die Rekonstitutionseffizienz, also das

Verhältnis von ungefaltetem zu gefaltetem Protein in einer Probe zu machen. Da die IR-

Spektroskopie (siehe dort) aber hohe Probenkonzentrationen benötigt, ist eine Festlegung auf

die effizienteste Methode der Rekonstitution nicht möglich. Im Folgenden wurde daher meist

die einfachste und schnellste Methode, die Verdünnung, verwendet, um mittels verschiedener

spektroskopischer Methoden die korrekte Faltung des Membranproteins OEP16

nachzuweisen.

Fluoreszenzspektroskopie

Kann eine Substanz Lichtquanten bestimmter Wellenlänge absorbieren, so ist der

resultierende angeregte Zustand nur von kurzer Lebensdauer. Die Rückführung der

elektronischen Struktur in den energetisch günstigeren Grundzustand kann unter Aussendung

von Licht erfolgen. Der Grundzustand ist im allgemeinen durch ein Elektronenpaar

gekennzeichnet, das nach dem Pauli-Prinzip antiparallele Spins trägt. Kommt es bei der

Anregung durch Lichtabsorption zur Spinumkehr bei einem der Elektronen, bildet sich durch

diesen quantenmechanisch eigentlich verbotenen Übergang ein Triplett-Zustand. Der

Übergang dieses Triplett-Zustandes in den Grundzustand unter Emission von Licht wird als

Phosphoreszenz bezeichnet. Verläuft die Anregung ohne Spinumkehr, entsteht ein Singulett-

Zustand, dessen Rückführung in den Grundzustand Fluoreszenz genannt wird. Wegen der

erforderlichen erneuten, „verbotenen“ Spinumkehr ist die Lebensdauer der Phosphoreszenz

deutlich größer als die der Fluoreszenz.

Fluoreszenz wird zumeist bei aromatischen und heterozyklischen Molekülen mit zwei oder

mehr kondensierten Ringen beobachtet. Da die angeregten Singulett-Zustände solcher

Moleküle eine höhere Polarität als ihr Grundzustand besitzen, zeigen sie eine stärkere Dipol-

Wechselwirkung mit polaren Lösungsmitteln. Die Folge davon ist, daß die Fluoreszenz-

Emission gegenüber dem Absorptionsspektrum des Grundzustandes zu größeren

Wellenlängen verschoben wird als in unpolaren Lösungsmitteln. Die Dipol-

Wechselwirkungen stabilisieren den angeregten Zustand, die Energie des emittierten Lichts ist

46

geringer. Somit kann man aus dem Fluoreszenz-Emissionsspektrum eines Moleküls auf die

Polarität seiner Umgebung schließen.

In Proteinen ist Tryptophan die Aminosäure, die aufgrund hoher Fluoreszenzausbeute, einem

Absorptionsmaximum von 280 nm (ε280 = 5600 cm-1M-1) und ihrer relativen Seltenheit

innerhalb einer Proteinsequenz als intrinsische Fluoreszenzprobe am häufigsten untersucht

wird(Chen, 1998). Potentiell fluoreszieren auch die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin

(ε280 < 100 cm-1M-1) und Tyrosin (ε280 < 1000 cm-1M-1) , wegen ihrer geringeren

Extinktionskoeffizienten im Wellenlängenbereich um 280 nm können sie aber für die im

folgenden gezeigten Fluoreszenzspektren vernachlässigt werden. Da Tryptophan im Protein in

eine lange Kette von Aminosäuren eingebaut ist, bestimmt sich die Hydrophobizität seiner

Umgebung selten durch das Lösungsmittel, sondern im allgemeinen aus der

Aminosäurezusammensetzung seiner Umgebung im gefalteten Protein. Bei

Membranproteinen ist zusätzlich zu beachten, daß Tryptophanreste, die aus der

Proteinstruktur herausragen und so Kontakt mit dem Lösungsmittel haben, potentiell auch im

transmembranen Bereich des Proteins angesiedelt sein können und somit mit der

Lipiddoppelschicht einer Membran oder – nach Solubilisierung – mit der hydrophoben

Detergenzmizelle wechselwirken können. Auch die Fluoreszenzintensität der einzelnen

Tryptophanreste in einem Protein kann sich deutlich unterscheiden. So ist bekannt, daß die

Aminosäuren Lysin und Tyrosin sowie Cystein und, schwächer, Glutamin, Asparagin,

Glutaminsäure, Asparaginsäure und (protoniertes) Histidin die Fluoreszenz von Tryptophan

quenchen können(Chen, 1998). Auch die Halbwertsbreite des Fluoreszenzpeaks von

Tryptophanresten kann Informationen über deren Umgebung liefern. Grundsätzlich ist der

Emissionspeak um so schmaler, je kleiner die Wellenlänge des Emissionsmaximums ist.

Diese Abhängigkeit ist linear und kann genutzt werden, um vergleichsweise breite

Fluoreszenzspektren aus mehreren Tryptophan-Resten eines Proteins in ihre Bestandteile zu

zerlegen und somit auf die Umgebung des einzelnen Tryptophans

zurückzuschließen(Burstein, 1973). Abbildung 10 zeigt diesen Effekt in einem sehr einfachen

Experiment.

47

0 2 4 6 8 10 12326

328

330

332

334

336

338

340

342

344

346W

elle

nlän

ge [n

m]

Kettenlänge des primären Alkohols

Abbildung 10:

Die Abbildung zeigt die Fluoreszenz von reinem L-Tryptophan in verschiedenen primären

Alkoholen. Je hydrophober das Lösungsmittel ist, desto stärker blauverschoben ist die

Fluoreszenz bei konstanter Anregungswellenlänge von 280 nm.

Die Aminosäuresequenz von OEP16 aus Erbse enthält zwei Tryptophanreste(Pohlmeyer,

1997a). Beide liegen laut den verschiedenen Strukturvorhersagen im Bereich transmembraner

Proteinsegmente und sollten bei korrekter Proteinfaltung mit dem hydrophoben Medium

(entweder der Lipiddoppelschicht oder der Detergenzmizelle) in Kontakt treten. Man erwartet

also eine Blauverschiebung der Fluoreszenz gegenüber dem ungefalteten Protein in 6M

Harnstoff. Bekannt ist, daß Harnstoff seine denaturierende Wirkung oft erst bei

Konzentrationen über 1 M entfalten kann. Korrekte Faltung eines tryptophanhaltigen

Membranproteins sollte eine maximale Blauverschiebung der Fluoreszenz als Zeichen

maximaler Exposition der Tryptophanreste zum hydrophoben Medium zur Folge haben.

Abbildung 11 zeigt die Abhängigkeit der Tryptophanfluoreszenz von OEP16 von der

Harnstoffkonzentration (bei konstanter Detergenzkonzentration).

48

0 1 2 3 4 5 6

335

340

345

350

355W

elle

nlän

ge [n

m]

Harnstoffkonzentration [M]

Abbildung 11:

Tryptophanfluoreszenz von OEP16 in Abhängigkeit von der Harstoffkonzentration.

Aufgetragen wurden die Maxima der Flureszenzspektren.

Es zeigt sich hier am Beispiel des Detergenz C12E8, daß die Blauverschiebung von OEP16

bereits bei Harnstoffkonzentrationen unter 2M maximal ist. Eine Verdünnung auf ein zehntel

der Harnstoffkonzentration von 6 M auf 600 mM ist also in jedem Falle ausreichend, um eine

hohe Faltungseffizienz zu erreichen – vorausgesetzt, daß die Blauverschiebung ein geeignetes

Maß für die korrekte Faltung ist. Bevor dies abschließend geklärt wird, sollen zunächst die

Unterschiede zwischen verscheidenen Detergenzien und Detergenzklassen untersucht werden.

49

Abbildung 12:

Fluoreszenzspektren von OEP16 in

Harnstoff (Spektrum A1), in den

Detergenzien β-D-Octylglykosid (1% w/v,

Spektrum A2) und C12E8 (0,03% w/v,

Spektrum A3), und in Liposomen (Spektrum

B4). Bei letztgenanntem Spektrum handelt

es sich um ein Differenzspektrum, gemessen

gegen Liposomen ohne Protein.

Abbildung 12 zeigt die Fluoreszenzspektren von OEP16 in Harnstoff (Spektrum A1), in den

Detergenzien β-D-Octylglykosid (1% w/v, Spektrum A2) und C12E8 (0,03% w/v, Spektrum

A3), und in Liposomen (Spektrum B4). Das Spektrum in Harnstoff zeigt ein

Fluoreszenzmaximum bei 355 nm, die Spektren in Detergenz zeigen ein Maximum bei 335

nm. Bei dem Spektrum in Liposomen handelt es sich um ein Differenzspektrum. Leere

Liposomen, hergestellt aus S-IV-Lipid (siehe Material und Methoden), haben eine

beträchtliche Eigenfluoreszenz. Für die Aufnahme des Differenzspektrums wurde eine gleich

behandelte Probe leerer Liposomen gemessen, und das resultierende Spektrum von einem

OEP16-Spektrum in Liposomen abgezogen. Auch das Differenzspektrum hat ein

Emissionsmaximum bei 335 nm Wellenlänge.

Das Spektrum in β-D-Oktylglycosid zeigt eine deutliche Schulter. Man kann sich vorstellen,

daß diese Schulter durch Überlagerung eines blauverschobenen Spektrums (des gefalteten

Proteins) und eines rotverschobenen Spektrums (des ungefalteten Proteins) entsteht. Daraus

kann geschlossen werden, daß die Probe in 1% Octylglycosid vermutlich noch beträchtliche

Anteile denaturierten Proteins enthält. Das Spektrum in 0,03% C12E8 hingegen entspricht

recht gut dem Spektrum in Liposomen, auch wenn der Fluoreszenzpeak etwas schmaler zu

sein scheint. Möglicherweise enthält auch die Liposomenpräparation noch aggregiertes,

50

denaturiertes Protein. Dies zeigt sich deutlicher in den FTIR-Spektren an vergleichbaren

Proben (siehe dort).

Offensichtlich kann die Fluoreszenz allein nur Hinweise auf geeignete Faltungprotokolle

geben. Zwar kann qualitativ gezeigt werden, ob sich Protein zu seiner nativen Struktur faltet,

ein Maß für die Effizienz der Faltungsmethode oder eine Quantifizierung des Anteils

ungefalteten Proteins ist nicht gegeben. Dennoch ist die Tryptophanfluoreszenz hilfreich, um

schnell viele verschiedene Detergenzien in unterschiedlichen Konzentrationen auf ihre

Eignung, OEP16 in eine native Struktur zu überführen, zu testen.

250 300 350 400 450 500

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

ß-DM C12E8

C12E6

C8E4

ß-OG SB12 C10E6

Harnstoff

Fluo

resz

enz

[a.u

.]

Wellenlänge [nm]

Abbildung 13:

Fluoreszenzspektren von OEP16 in verschiedenen Puffersystemen. Alle

Detergenzkonzentrationen betragen 1% (w/v), Die Proteinkonzentration lag bei 0,05 mg/ml.

In Abbildung 13 sind die Fluoreszenzspektren von OEP16 in verschiedenen Detergenzien

gleicher Konzentration (1% w/v) abgebildet. Deutlich zu sehen ist, daß die Detergenzien

Octylglycosid, SB12 und C12E8 ein Fluoreszenzmaximum von 335 nm erzeugen, dem Wert,

der auch in Liposomen gemessen wurde (siehe auch Abbildung 12). Die Schulter im

Oktylglycosid-Spektrum ist in dieser Darstellung nicht deutlich zu erkennen. Um so stärker

51

kann man einen Doppelpeak im Spektrum mit β-D-Dodecylmaltosid sehen. Offensichtlich

überwiegt hier sogar der Anteil an fehlgefaltetem bzw. ungefaltetem Protein. Die

Detergenzien C8E4 und C10E6 zeigen eine noch ausgeprägtere Blauverschiebung der Spektren.

Eine Verschiebung über den Wert in Liposomen hinaus kann aber nicht wünschenswert sein.

Auch zeigten die Proben in diesen Detergenzien eine schwache Trübung, die auf Aggregation

des Proteins hindeutet.

Es scheint, als hätten Detergenzien mit glycosidischen Kopfgruppen vergleichbare Effekte

(Spektren mit zwei Peaks), während Detergenzien mit Polyetherkopfgruppe alle einen

einzigen, vergleichsweise schmalen Peak mit maximaler Blauverschiebung liefern. Das

zwitterionische Detergenz SB12 scheint denselben Einfluß auf das Fluoreszenzspektrum von

OEP16 zu haben wie C12E8. Dies hat sich besonders für kalorimetrische Messungen als

hilfreich erwiesen (siehe unten).

Im nächsten Schritt soll aufgeziegt werden, welchen Einfluß die Konzentration der

Detergenzien auf die Faltung von OEP16 hat.

250 300 350 400 450 500

0

20

40

60

80

100

120

ß-DM (0,03%) ß-DM (0,3%) ß-DM (1%) ß-OG (0,1%) ß-OG (0,3%) ß-OG (1%) Harnstoff 6M

Fluo

resz

enz

[a.u

.]

Wellenlänge [nm]

Abbildung 14:

Fluoreszenzspektren von OEP16 in verschiedenen glykosidischen Detergenzien. ß-DM: ß-

Dodecylmaltosid, ß-OG: ß-Octylglukosid

52

250 300 350 400 450 500

0

20

40

60 C10E6 (0,3%) C12E8 (0,3%) C12E6 (0,3%) C8E4 (0,3%) Harnstoff 6M

Fluo

resz

enz

[a.u

.]

Wellenlänge [nm]

Abbildung 15:

Fluoreszenzspektren von OEP16 in verschiedenen Detergenzien mit Ether-Kopfgruppen.

Beispielhaft gezeigt sind die Spektren für eine Detergenzkonzentration von 0,3%. Eine

Variation der Detergenzkonzentration veränderte die Spektren nicht.

Die glykosidischen Detergenzien zeigen eine Konzentrationsabhängigkeit der

Fluoreszenzverschiebung. β-OG verschiebt die Fluoreszenz von OEP16 unterhalb seiner

CMC von 0,7% w/v weniger stark als oberhalb seiner CMC (Abbildung 14). In vivo baut sich

ungefaltetes OEP16 selbsttätig in die äußere Chloroplastenmembran ein. Geht man davon aus,

daß Detergenzmizellen die Membranoberfläche und -struktur simulieren können, kann eine

Proteinfaltung nur oberhalb der CMC – also in Anwesenheit von Mizellen – erfolgen.

Unterhalb der CMC läßt sich eine geringe Blauverschiebung der Fluoreszenz durch

Anlagerung von Detergenzmonomeren an die hydrophoben Bereiche des Proteins erklären.

Möglicherweise entstehen dabei bereits Teilstrukturen, die sich aber nicht zur nativen Struktur

zusammenlagern können. Der bereits gezeigte breite Peak oberhalb der CMC von β-OG

deutet an, daß auch hier mehrere Faltungszustände existieren könnten. Offensichtlich ist die

Faltung unvollständig.

53

β-DM hingegen zeigt bei hohen Konzentrationen einen weiteren Effekt. Es scheint, als

könnten auch hohe Detergenzkonzentrationen Fehlfaltung verursachen. Deutlich zu sehen ist

ein Doppelpeak im Spektrum bei einer Detergenzkonzentration von 1%. Offensichtlich liegt

hier zu etwa gleichen Teilen gefaltetes und ungefaltetes Protein vor. Interessant ist auch die

Zunahme der Fluoreszenz bei steigender Detergenzkonzentration. Die Ursache hierfür könnte

eine Abnahme der Proteinaggregation bei steigender Detergenzmenge sein. In diesem Fall

würde die Fluoreszenz weniger gequencht.

Die Detergenzien mit Etherkopfgruppe zeigen ein ganz anderes Bild. Hier sind die

Fluoreszenzintensitäten praktisch unabhängig von der Detergenzkonzentration (Abbildung 15

zeigt deshalb nur je eine beispielhaft ausgewählte Konzentration), und auch die Unterschiede

zwischen den Detergenzien unterschiedlicher Alkylkettenlängen und Kopfgruppengrößen sind

geringer. Die beiden Detergenzien C10E6 und C8E4 zeigen eine noch stärkere

Blauverschiebung als die beiden langkettigen Tenside und auch stärker als die Verschiebung

in Liposomen. Leider trübten diese Lösungen bei jedem Versuch, höhere

Proteinkonzentrationen zu erreichen, stark ein, was eine Eignung zur korrekten Faltung

unwahrscheinlich macht (Aggregatbildung). Die hohe Verschiebung der Fluoreszenz kommt

vermutlich durch Anlagerung der kleinen Detergenzmoleküle im Bereich der Tryptophanreste

zustande.

54

Abbildung 16:

Schematische Darstellung der Faltung von OEP16 mit Nebenreaktionen.

Abbildung 16 zeigt ein einfaches Modell für die Vorgänge beim Falten von OEP16. Aus den

Inclusionbodies, die sehr große Proteinaggregate sind, wird monomeres, entfaltetes Protein

hergestellt. Durch Versetzen mit Detergenz oder Lipid kann dieses Protein in seine native

Struktur überführt werden. Hierbei enstehen unbekannte Mengen an Aggregaten als

unerwünschtes Nebenprodukt. Diese zeigen sich in der Fluoreszenz durch Verbreiterung der

Fluoreszenzpeaks bzw. durch Nebenmaxima. In Liposomen lassen sich die Aggregate druch

IR-Spektroskopie nachweisen (siehe dort). Außer Acht gelassen wird in der Abbildung die

Möglichkeit von Intermediaten, die nur zum Teil die korrekte Struktur annehmen. Es ist

denkbar, daß diese unterhalb der CMC (z.B. bei Octylglucosid) durch Anlagerung monomerer

Detergenzmoleküle entstehen können. Die kurzkettigen Etherdetergenzien C10E6 und C8E4,

55

die die Fluoreszenz trotz offensichtlicher Aggregation des Proteins oberhalb ihrer CMC stark

verschieben, lagern sich möglicherweise als Monomere in die Aggregate ein.

Geht man davon aus, daß für eine vergleichsweise gute Rekonstitutionsrate der

Fluoreszenzpeak von OEP16 in Detergenz möglichst schmal sein soll (also keine

Nebenmaxima haben darf, die auf Fehlfaltung hindeuten), dieselbe Verschiebung wie das

Spektrum in Liposomen haben soll (wo die Proteinaktivität nachgewiesen wurde) und eine

möglichst hohe Intensität haben sollte (weil auch Fluoreszenzquenching auf Aggregation des

Proteins hinweist), scheinen C12E8 und C12E6 besonders geeignet. Dies gilt es nun mittels

anderer Methoden zu überprüfen.

CD-Spektroskopie

Bei der CD-Spektroskopie nutzt man die Tatsache, daß optisch aktive Substanzen nicht nur

mit linear, sondern auch mit zirkular polarisiertem Licht wechselwirken können. Die

Extinktionskoeffizienten εL und εR für links und rechts zirkular polarisiertes Licht

unterscheiden sich, die eigentliche Meßgröße ist die Differenz der Extinktionskoeffizienten,

die positive und negative Werte annehmen kann. Praktisch gibt man die sogenannte

Elliptizität Θλ an, die wie folgt definiert ist:

LR

LR

IIII

+−=Θλtan

Hierbei sind I die Intensitäten des rechts und links zirkular polarisierten Lichts nach der

Absorption durch die Probe. Die Elliptizität ist wellenlängenabhängig (daher der Index λ) und

erlaubt somit das Aufnehmen von Spektren. Unter Berücksichtigung von Schichtdicke und

Probenkonzentration kann man auch eine molare Elliptizität ΘM in Abhängigkeit von der

Wellenlänge angeben.

CD-aktive Substanzen zeichnen sich durch große, übergeordnete Strukturen aus. Insbesondere

bei Proteinen kann die CD-Spektroskopie wertvolle Informationen über den

Sekundärstrukturgehalt liefern. Während ein denaturiertes, ungeordnetes Protein nur wenig

Auslenkung des CD-Signals zeigt, haben α-Helices und β-Faltblätter deutlich voneinander

unterscheidbare Maxima und Minima im CD-Spektrum. Der Meßbereich liegt hierbei etwa

zwischen 250 und 180 nm. Die Untergrenze des Meßbereichs wird hierbei durch

Geräteparameter festgelegt. Wird die UV-Absorption der Probe zu hoch, verschlechtert sich

56

das Signal-Rausch-Verhältnis. Proben, die unter 200 nm gemessen werden sollen, dürfen

keine im UV absorbierenden Substanzen (außer dem Protein) enthalten und sollten möglichst

verdünnt und in geringen Schichtdicken verwendet werden. Problematisch ist ebenfalls die

UV-Absorption durch Luftsauerstoff in diesem Wellenlängenbereich, weshalb die Apparatur

ständig mit Stickstoff gespült wird.

Die Proben für die Fluoreszenzspektroskopie enthalten viele störende Substanzen, z.B. NaCl

und Reste von Harnstoff. CD-Spektren dieser Proben sind deshalb bei niedrigen

Meßwellenlängen verrauscht, in 6M Harnstoff läßt sich ein CD-Spekrum z.B. nur bis zu einer

Wellenlänge von etwa 220 nm aufnehmen. Enthält ein Protein α-Helices, was für OEP16

postuliert wurde, zeigen diese jedoch bereits in einem Wellenlängenbereich zwischen 230 bin

220 nm ein deutliches CD-Signal. Für eine erste Einschätzung der Sekundärstrukturbildung

mit Hilfe von Detergenzien kann es also genügen, Spektren in diesem Wellenlängenbereich

aufzuzeichnen, um schnell und einfach viele Proben miteinander vergleichen zu können.

Abbildung 17:

CD-Spektren von

OEP16. A: in 6M

Harnstoff;

B: in 1% ß-OG;

C: in 0,5% ß-DM;

D: in 1% SB12;

E: in 0,3% C12E8.

Abbildung 17 zeigt CD-Spektren von OEP16 in verschiedenen Detergenzien. Selbst in 6M

Harnstoff ist im untersuchten Wellenlängenbereich ein schwaches CD-Signal zu sehen.

Offensichtlich sind selbst in 6 M Harnstoff Teilstrukturen ausgebildet, oder es liegen zum Teil

Aggregate vor, die (wie im Kapitel IR-Spektroskopie deutlich wird) geordnete Strukturen

ausbilden können.

Die unterschiedlichen Detergenzien ergeben bei gleicher Proteinkonzentration sehr

unterschiedliche CD-Signale. Offensichtlich ist die Sekundärstrukturbildung für das Tensid

C12E8 besonders ausgeprägt, dicht gefolgt von SB12. Die beiden glykosidischen Detergenzien

β-OG und β-DM zeigen nur wenig Änderung gegenüber dem Spektrum in Harnstoff.

Verschiedene Aspekte sind jedoch zu beachten:

57

Die Proben wurden zwar gleich behandelt, wurden aber nach der Rekonstitution mit

Konzentratoren, also Ultra-Filtrationseinheiten, ankonzentriert. Substanzverluste an den

Filtern oder den Kunststoffgehäusen der Zentrifugationseinheiten könnten also zumindest

teilweise mitverantwortlich sein für die unterschiedlichen Auslenkungen der CD-Spektren. Da

eine Proteinbestimmung in dem verwendeten Puffersystem praktisch nicht durchführbar ist

(Detergenzien, Harnstoff und Reduktionsmittel wie β-Mercaproethanol stören praktisch alle

Methoden der kolorimetrischen Proteinbestimmung), kann dies jedoch nicht quantitativ

nachvollzogen werden.

Die Proben könnten Aggregate enthalten, die keine korrekte Struktur ausgebildet haben, aber

dennoch einen Beitrag zum CD-Spektrum liefern. Tatsächlich war in vielen der Proben eine

schwach Trübung erkennbar, die auf Aggregation hinweist.

Um ein CD-Spektrum zu erhalten, das auf den Sekundärstrukturgehalt von OEP16

quantitative Schlüsse zuläßt, musste die Probe anders vorbereitet werden. Es galt, sämtliche

UV-aktiven Substanzen zu entfernen. Dies geschah mit Hilfe von Dialysezellen und einer

Dialysemembran von 3.500 kDa Porengröße, die weder für OEP16 noch für Mizellen des

Detergenz (hier C12E8) durchlässig ist. Harnstoff, Reduktionsmittel, Salze und

Puffersubstanzen werden durch einen Puffer aus 10 mM Natrium-Cacodylat und 50 mM

NaSO4 ersetzt. Die Probe wird zur Entfernung potentiell noch enthaltener Aggregate

zusätzlich filtriert. Das resultierende CD-Spektrum, aufgenommen in einer Tonnenküvette mit

0,1 mm Schichtdicke, ist in Abbildung 18 gezeigt.

58

180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-4

-2

0

2

4

6El

liptiz

ität [

mde

g]

Wellenlänge [nm]

Abbildung 18:

CD-Spektrum von 0,5 mg/ml OEP16 in 0,3% C12E8. Als Puffersystem wurde 50 mM

Natriumcacodylat, pH 7,0 mit 50 mM Natriumsulfat verwendet.

Man sieht in dem Spektrum, aufgenommen in 0,3% C12E8, deutlich, daß sich immer noch eine

hohe UV-Absorption oder Lichtstreuung, vermutlich ausgelöst durch das Detergenz, im

Bereich unterhalb von 200 nm Wellenlänge störend auswirkt. Dennoch läßt sich mit Hilfe der

Auswertsoftware des CD-Spektrometers oder anderen im Internet zur Verfügung stehenden

Programmen der Anteil der verschiedenen Sekundärstrukturelemente berechnen. Je nach

verwendeter Software liegt der α-Helixgehalt von OEP16 demnach bei 35-50%, bei

variablem Gehalt an Loops und Turns. Anteile von β-Faltblattstrukturen sagte keines der

verwendeten Programme voraus.

Wegen der Ungenauigkeit der Methode nicht nur wegen des verrauschten Spektrums, sondern

auch wegen der Tatsache, daß sämtliche CD-Rechenalgorithmen auf Vergleichsdaten

löslicher Proteine basieren, sind diese Ergebnisse für das Membranpotein OEP16 mit Vorsicht

zu betrachten. Der Befund, daß OEP16 keine β-Faltblattanteile besitzt, widerspricht den

existenten Strukturmodellen. Daher wurde zur Verifizierung eine weitere Methode, die

Auskunft über den Sekundärstrukturgehalt eines Proteins geben kann, angewendet.

59

IR-Spektroskopie

Bei der Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) wird anders als in gewöhnlichen IR-

Spektrometern nicht der Wellenlängenbereich abgetastet, sondern simultan ein großer

Wellenlängenbereich bestrahlt. Mit einem Interferometer werden die Änderungen von

Interferenzen erfaßt, die durch Absorption einzelner IR-Banden entstehen. Dieses

Interferogramm kann mittels Fouriertransformation in ein komplettes IR-Spektrum

umgerechnet werden. Hauptvorteil dieser Methode ist die Geschwindigkeit, mit der ein

Spektrum aufgezeichnet werden kann, sowie die hohe Strahlintensität und damit ein

geringeres Rauschen.

Proteine haben charakteristische IR-Absorptionsbanden. Insbesondere die Amid-I-Bande

(gemessen in D2O im Wellenzahlenbereich von 1600-1700 cm-1), die hauptsächlich von den

C=O-Streckschwingungen der Carbonylgruppe im Polypeptidrückrad herrührt, wird

maßgeblich von der Sekundärstruktur des Proteins beeinflußt. Dies rührt daher, daß die

Carbonylgruppe je nach Sekundärstruktur unterschiedliche Wasserstoffbrückenbindungen

eingehen kann. α-Helices zeigen charakteristische Amid-I-Banden im Bereich von 1650-1658

cm-1, während typische β-Faltblattstrukturen im Bereich um 1620-1640 cm-1 absorbieren.

Loopstrukturen (1670-1680 cm-1) und ungeordnete Bereiche (1640-1650 cm-1) haben

ebenfalls charakteristische Absorptionsbanden.

60

Abbildung 19:

Zweite Ableitung des Infrarotspektrums von OEP16 in Phosphatidylcholinvesikeln. Die

Proteinkonzentration betrug nach Lyophillisieren und Wiederaufnehmen in D2O mindestens

10 mg/ml

Gezeigt ist ein typisches FTIR-Spektrum von OEP16 in seiner zweiten Ableitung. Das in

Liposomen rekonstituierte und in D2O überführte Protein zeigt vier markante Banden bei

1658, 1648, 1622 und 1512 cm-1. Eine weitere Bande (bei 1587 cm-1) ist möglicherweise auf

die Lipidkopfgruppen in den Liposomen zurückzuführen. Für Proteine ist eine Absorption in

diesem Wellenzahlenbereich nicht bekannt(Winter, 1998).

Die Bande bei 1512 cm-1 entspricht der Schwingung der Hydroxylgruppe der Tyrosine in

OEP16. Diese Bande wird durch unterschiedliche Sekundärstrukturen nicht beeinflußt und

gibt Auskunft über die Proteinmenge. Die im Folgenden diskutierten Banden entsprechen alle

der Carbonyl-Streckschwingung der Amidbindung im Proteinrückgrat, die sich nur durch ihre

unterschiedliche chemische Umgebung unterscheiden.

Die Bande bei 1648 cm-1 liegt in einem Bereich, der typisch für Loop-Strukturen ist, wie sie

als Verbindungen zwischen transmembranen Segmenten zu erwarten sind. Bei 1658 cm-1

absorbieren α-Helices. Diese Bande ist sehr markant und entspricht dem Ergebnis aus der

61

CD-Spektroskopie, daß OEP16 praktisch ausschließlich aus helikalen Strukturen besteht. Die

letzte Absorptionsbande bei 1622 cm-1 liegt in einem Wellenzahlenbereich, der üblicherweise

β-Faltblattstrukturen vorbehalten ist. Dieses Ergebnis ist zunächst unerwartet. Betrachtet man

jedoch mehrere Spektren unterschiedlich präparierter Liposomenproben, stellt man fest, daß

das Verhältnis der beiden Banden bei 1648 cm-1 und 1658 cm-1 zu der β-Faltblattbande

(normiert auf die Tyrosinbande) variabel ist. Das bedeutet: der Sekundärstrukturgehalt der

Probe in Liposomen variiert mit der Probenpräparation. FTIR-Messungen in Detergenzlösung

zum direkten Vergleich sind nicht möglich, weil in Detergenz die notwendigen

Probenkonzentrationen nicht erreicht werden können. Mißt man eine OEP16-Probe in

Detergenz, die bis zur Aggregation ankonzentriert wurde (also stark getrübt ist), sieht man

neben der Tyrosinbande praktisch nur die Bande bei 1622 cm-1.

Wie im Kapitel über die Fluoreszenz bereits andiskutiert, enthalten insbesondere die

Liposomen-Proben also größere Mengen aggregiertes und fehlgefaltetes Protein. Vermutlich

sind diese Aggregate nicht in die Lipiddoppelschichten eingebaut, sondern nur lose daran

assoziiert. Diese Aggregation zeigt sich im IR als Bande bei 1622 cm-1, eine Wellenzahl, bei

der typischerweise antiparallele β-Faltblattstrukturen absorbieren, z.B. solche aus

Aggregationsfibrillen. Solche Fibrillen entstehen aus fehlgefalteten Membranproteinen unter

anderem bei Prionenkrankheiten (Scrapie(Callahan, 2001), BSE und die Creutzfeld-Jakub-

Krankheit, aber auch Alzheimer und Parkinson(Conway, 2000)). Transmembrane

Faltblattstrukturen, wie sie hauptsächlich in Porinen vorkommen, absorbieren bei höheren

Wellenzahlen (ab 1630 cm-1)(Abrecht, 2000).

Während für OEP16 in Detergenzlösung mittels CD-Spektroskopie eine rein α-helikale

Struktur nachgewiesen werden konnte, sind in Liposomen-Proben noch beträchtliche Anteile

an ungefaltetem bzw. fehlgefaltetem Protein enthalten. Diese zeigen sich in der

Fluoreszenzspektroskopie als eine Nebenbande bei höherer Wellenlänge, die das

Gesamtspektrum scheinbar verbreitert. In der IR-Spektroskopie sind die Aggregate als

antiparallele β-Faltblattstrukturen mit einem Absorptionsmaximum von 1622 cm-1

nachweisbar. Offensichtlich handelt es sich bei den Aggregaten um Strukturen, wie sie auch

von vielen anderen aggregierten Membranproteinen bekannt sind.

Es wurde gezeigt, daß sich OEP16 in Lösung wie in Liposomen korrekt falten läßt.

Spektroskopische Methoden zeigten auch, daß OEP16 hauptsächlich aus α-Helices besteht. In

62

den folgenden Abschnitten werden physikalisch-chemische Experimente zur Proteinstabilität

und Faltung vorgestellt.

Biophysikalische Daten des gefalteten Proteins

DSC

Die Differenzkalorimetrie beruht auf der Messung der Wärmekapazität einer Probe gegenüber

der bekannten Wärmekapazität einer Referenz. Probe und Referenz werden während der

Messung kontinuierlich aufgeheizt, wobei die Heizquellen so eingestellt sind, daß die

Temperatur in der Probenzelle etwas langsamer ansteigt als in der Referenzzelle. Ein

Thermoelement kontrolliert die resultierende Temperaturdifferenz zwischen den

Meßkammern und regelt eine Hilfs-Heizquelle. Die Heizleistung P (Energie pro Zeit), die

benötigt wird, um die Temperaturdifferenz zwischen Referenz und Probe auszugleichen, wird

genutzt, um die Wärmekapazität bei konstantem Druck cP zu bestimmen. In die Berechnung

geht die Geschwindigkeit der Temperaturerhöhung χ=∆T/t wie folgt ein:

1−= χPcP

Man erhält eine Kurve, die die Änderung der Wärmekapazität cP in Abhängigkeit von der

Temperatur darstellt. Eine solche Änderung erwartet man zum Beispiel bei einem

Phasenübergang. Da cP als partielle Ableitung der Enthalpie ∆H nach der Temperatur bei

konstantem Druck definiert ist, kann man durch Integration der Fläche unter der gemessenen

Kurve die Enthalpie eines Phasenüberganges berechnen.

Spektroskopische Methoden haben gezeigt, daß OEP16 eine dem nativen Zustand

entsprechende Konformation annehmen kann, wenn es in detergenzhaltigen Puffer

eingebracht wird. Da dieser Faltungsprozeß freiwillig abläuft, muß er mit einem Gewinn an

freier Energie verbunden sein. Diese freie Energie setzt sich aus einem Enthalpie- und einem

Entropieanteil zusammen, es gilt:

( ) )()( FaltungFaltungFaltung STHG ∆−∆=∆

63

Die Entropieänderung für den betrachteten Prozeß dürfte in erster Linie aus dem hydrophoben

Effekt entstehen. Das hydrophobe Protein begibt sich in die hydrophobe Umgebung der

Mizelle, während es zuvor dem Wasser eine geordnete Struktur um seine hydrophoben

Bereiche aufgezwungen hat.

Die Enthalpieänderung setzt sich aus verschiedenen Anteilen zusammen.

1. Das Protein faltet sich in seine Sekundärstrukturelemente. Hierbei werden viele

Wasserstoffbrückenbindungen gebildet. Unabhängig davon, ob es sich um α-Helices oder β-

Faltblattstrukturen handelt, dürfte dies den größten Anteil der Enthalpieänderung ausmachen.

2. Das Protein "löst" sich im Detergenz, die neuen Wechselwirkungen mit der

Proteinumgebung werden sich in der Enthalpieänderung niederschlagen.

3. Eventuell lagern sich mehrere Proteineinheiten unter Ausbildung unterschiedlicher

Wechselwirkungen zusammen.

Erhitzt man das gefaltete Protein in Detergenzlösung in einem geeigneten Kalorimeter, kann

man die Denaturierungswärme des Proteins bestimmen. Diese entspricht dem Umkehrprozeß

der genannten Effekte, mit dem Unterschied, daß das hitze-denaturierte Protein

möglicherweise in der Detergenzmizelle verbleibt - oder aggregiert und aus der Lösung

ausfällt.

In einem Diferenziellen "Scanning"-Kalorimeter (DSC) wurden 0,55 mg/ml OEP16 in

verschiedenen Detergenzlösungen graduell bis auf 95°C erwärmt. Gemessen wurde die

Änderung der Wärmekapazität der Lösung gegenüber einer Referenzlösung, die nur die

detergenzhaltige Pufferlösung ohne Protein enthielt. Die Enthalpieänderung entspricht bei

dieser Messung der Fläche unter einem eventuell auftretenden Denaturierungspeak. Vor allem

Proteinkomplexe mit mehreren Untereinheiten können schrittweise danaturieren, haben also

mehrere Denaturierungspeaks.

Das Detergenz C12E8 lieferte ein starkes, aber extrem verrauschtes Denaturierungssignal bei

ca. 85°C. Da das Detergenz in diesem Temperaturbereich bei der gegebenen Konzentration

von 0,3% selbst eine Phasenumwandlung durchmacht(Mitchell, 1983), ist die

Enthalpieänderung in diesem Fall praktisch nicht auswertbar.

64

Das Detergenz SB12 hingegen zeigt keine Phasenumwandlungen im genannten

Temperaturbereich. In SB12 läßt sich die Denaturierungswärme von OEP16 somit

bestimmen.

Abbildung 20:

DSC-Diagramme von 0,3 mg/ml OEP16 in

0,5% SB12. Das obere Bild zeigt die

Denaturierungskurve ohne Zusatz von

Harnstoff. Im unteren Bild verschiebt sich der

Denaturierungspeak durch die Zugabe von 1,5

M Harnstoff zu einer geringeren Temperatur.

Teil A der Abbildung 20 zeigt die Denaturierungskurve von OEP16 in 1% SB12. Die

Denaturierungstemperatur liegt bei 85°C, und entspricht damit der gemessenen

Denaturierungstemperatur für C12E8. Um zu zeigen, daß der auftretende Peak tatsächlich auf

das Protein und dessen Entfaltung zurückzuführen ist, wurde eine vergleichbare Probe in 1%

SB12 mit 1,5 M Harnstoff versetzt (Teil B der Abbildung). Die Denaturierungstemperatur

wird durch den Harnstoff auf 67°C gesenkt, bei praktisch gleicher Denaturierungenthalpie

von 580 kJ/mol. Harnstoff ist als chaotropes Reagenz dafür bekannt, intramolekulare

Wechselwirkungen in Proteinen aufbrechen zu können. Die Konzentration von 1,5 M

Harnstoff reicht dazu bei Raumtemperatur nicht aus (Siehe Kapitel Fluoreszenz). Während

die Energie der Denaturierung gleich bleibt, wird das Protein bereits bei einer geringeren

Wärmezufuhr entfaltet. Der Harnstoffpuffer gemessen gegen Wasser zeigte keinerlei

Änderung der gemessenen Wärmekapazität über den gesamten Temperaturbereich.

65

Die Faltungsenthalpie von OEP16 liegt bei ca. 600 kJ/mol. Die Hitzedenaturierung erfolgt in

einem einzigen Schritt und ist irreversibel, weil das Protein anschließend aggregiert und

ausfällt (zu sehen an der Trübung der Probe). Der umgekehrte Prozeß, die Faltung des

Proteins, läßt sich demnach kalorimetrisch nicht verfolgen. Messen läßt sich allerdings bei

geeignetem Versuchsaufbau die Geschwindigkeit der Proteinfaltung. Dadurch sind

Rückschlüsse auf die Aktivierungsenergie des Faltungsprozesses und auf seine

Reaktionsordnung möglich.

Zeitaufgelöste Spektroskopie

Um Prozesse wie die hier untersuchte Proteinfaltung besser verstehen zu können, ist es

hilfreich, nicht nur statische Spektren des gefalteten und entfalteten Zustandes zu messen,

sondern auch die Veränderung während dem Prozeß zu verfolgen. Im Prinzip sind bei

geeignetem Versuchsaufbau solche zeitaufgelösten Messungen mit jeder spektroskopischen

Methode möglich. Oft macht aber eine zu geringe Empfindlichkeit der notwendigen

Detektoren das Messen schneller Prozesse sehr schwierig.

Im Verlauf dieser Arbeit wurden zeitaufgelöste Messungen mit Fluoreszenz- und CD-

Detektion durchgeführt. Die Meßprinzipien dieser beiden spektroskopischen Methoden

wurden bereits erläutert. Der Versuchsaufbau ist abgesehen vom unterschiedlichen Detektor

für beide Methoden identisch. Zur Vereinfachung der Messung wird nur eine feste

Wellenlänge detektiert, anstatt zu jedem Zeitpunkt ein komplettes Spektrum aufzunehmen.

Sinnvollerweise wählt man diese Wellenlänge in einem spektralen Bereich, in dem die

größten Änderungen zwischen Anfangs- und Endzustand zu erwarten sind. Der Übergang von

einem Zustand zum anderen wird durch schnelles Vermischen zweier Lösungen in einer

druckbetriebenen Mischkammer, einer sogenannten "stopped-flow" Apparatur erreicht. Diese

Mischkammer dient gleichzeitig als Meßküvette, in der nach einer gerätebedingten Totzeit die

Änderung des Meßsignals erfaßt werden kann.

Zeitaufgelöste Fluoreszenzspektroskopie

Es konnte bereits gezeigt werden, daß sich die Fluoreszenz der Tryptophanreste in OEP16

signifikant ändert, wenn sich die native Struktur des Proteins bildet. Der Faltungsprozeß ist

jedoch so schnell, daß sich mit einem herkömmlichen Spektrometer lediglich der Anfangs-

66

und Endzustand der Strukturbildung sichtbar machen läßt. Der zeitliche Verlauf der Faltung

kann aber wertvolle Hinweise auf Übergangszustände liefern. Messungen bei hoher

Zeitauflösung werden durch das Verfolgen der Fluoreszenzänderung von OEP16 bei 334 nm

Wellenlänge in einer „stopped-flow“ Apparatur ermöglicht. Es zeigt sich, daß der

Faltungsprozeß innerhalb von 100 ms vollständig abläuft.

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,56,6

6,8

7,0

7,2

7,4

7,6

k1 = 809 ± 74 s-1

k2 = 127 ± 7 s-1

k3 = 10.3 ± 0.3 s-1

Fluo

resz

enz

[a.u

.]

Zeit [s]

Abbildung 21:

Stopped-flow-Experiment mit Fluoreszenzdetektion. Gezeigt ist ein typisches Signal für die

Mischung einer 0,7 mg/ml OEP16-Lösung in 6 M Harnstoff, 1:10 verdünnt mit 0,01% C12E8

bei Raumtemperatur.

Gezeigt ist hier die Fluoreszenzänderung bei der schnellen Mischung einer OEP16-Lösung

(0,7 mg/ml) in 6 M Harnstoff mit Detergenzpuffer (hier 0,01% C12E8). Mehrere Prozesse

können unterschieden werden. Sie lassen sich durch nichtlineare Regression mathematisch

erfassen. Die besten Anpassungen an die Meßkurve erhält man mit einer Näherungskurve aus

drei exponentiellen Prozessen erster Ordnung. Der schnellste Prozeß hat dann (für 0,01%

C12E8) eine Zeitkonstante von k1 = 809 ± 74 s-1. Dieser Prozeß wird bei steigender

Detergenzkonzentration schneller als die Zeitauflösung des Geräts und kann somit nicht mehr

67

erfaßt werden. Um seinen Einfluß auf die Berechnung der anderen beiden Prozesse zu

minimieren wurden alle Näherungskurven erst ab t = 3 ms angepaßt; zu diesem Zeitpunkt ist

der schnellste Prozeß vollständig abgelaufen. Die beiden weiteren Prozesse haben für die

gezeigte Detergenzkonzentration die Zeitkonstanten k2 = 127 ± 7 s-1 und k3 = 10,3 ± 0,3 s-1.

Vor der Auswertung und Erklärung der einzelnen Prozesse muß nun zuerst einmal verifiziert

werden, daß es sich bei den Fluoreszenzänderungen tatsächlich um strukturbildende

Veränderungen handelt. Hierzu werden die Messungen mit zeitaufgelöster CD-Detektion

wiederholt.

Zeitaufgelöste CD-Spektroskopie

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20

-15

-14

-13

-12

-11

k1 = 1785 ± 450 s-1

k2 = 86 ± 23 s-1

k3 = 14.6 ± 2.5 s-1

Ellip

ticity

[m

deg]

Time [s]

Abbildung 22:

Stopped-flow-Experiment mit CD-Detektion. Gezeigt ist ein typisches Signal für die

Mischung einer 0,7 mg/ml OEP16-Lösung in 6 M Harnstoff, 1:10 verdünnt mit 0,01% C12E8.

Abbildung 22 zeigt eine typische Meßkurve für die Strukturbildung von OEP16, erfaßt mit

einem CD-Detektor. Die mittels nichtlinearer Regression ermittelten Zeitkonstanten

entsprechen den Zeitkonstanten, die mittels Fluoreszentdetektion gewonnen wurden. Damit ist

gezeigt, daß alle als Fluoreszenzänderung erfaßten Prozesse mit einer Strukturbildung

68

einhergehen und nicht etwa allein durch das Mischen mit detergenzhaltigem und damit

hydrophobem Puffer zustandekommen.

Zeitkonstanten und Aktivierungsenergien

Es konnte gezeigt werden, daß sich Faltungs-Teilprozesse einzeln erfassen lassen. Dies

funktioniert gut für das Detergenz C12E8 bis zu Konzentrationen um 0,03% w/v. Bei höheren

Detergenzkonzentrationen werden die Prozesse so schnell, daß eine präzise Berechnung von

Zeitkonstanten nicht mehr möglich ist (jedenfalls nicht mit den gegebenen Meßgeräten).

Ähnliches gilt auch für andere Detergenzien, der Faltungsprozeß läßt sich im Prinzip auch bei

β-Dodecylmaltosid und SB12 verfolgen, ebenfalls nur bei niedrigen Konzentrationen. Da die

Faltungsausbeute bei diesen Detergenzien etwas niedriger ist, sind die Signalintensitäten

entsprechend geringer und die Berechnungen ungenauer. Den schnellsten Prozeß (und

eventuell noch schnellere, gar nicht erfaßte Prozesse) kann man bei diesen Detergenzien wie

auch bei relativ hohen C12E8-Konzentrationen gar nicht beobachten.

Trotz dieser Einschränkungen lassen sich eine Reihe von Ergebnissen aus den zeitaufgelösten

Messungen gewinnen. Diese werden im Folgenden ausschließlich für das Detergenz C12E8

näher ausgeführt, da es sich als das für die Faltung von OEP16 geeignetste Detergenz

erwiesen hat. Zunächst wird die Änderung der Zeitkonstanten mit steigender

Detergenzkonzentration betrachtet:

69

0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,0300

10

20

30

40

50

60

70

CMC

klangsam

1/τ

[s-1]

C12E8 [% w/v]

0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,0300

200

400

600

800

CMC

kschnell

1/τ

[s-1]

C12E8 [% w/v]

Abbildung 23:

Abhängigkeit der errechneten Zeitkonstanten von der Detergenzkonzentration. Der dritte,

schnellste Prozeß ist nur bei einer Detergenzkonzentration um 0,01% sichtbar und ist hier

nicht berücksichtigt.

70

In Abbildung 23 kann man deutlich erkennen, daß die Geschwindigkeitskonstanten der

Prozesse 2 und 3 linear von der Detergenzkonzentration abhängen. Über einen

Konzentrationsbereich von einer Größenordnung (gemessen in einem Konzentrationsbereich

von 0,08 bis 0,8 mg/ml OEP16 Ausgangskonzentration) sind sie jedoch unabhängig von der

Proteinkonzentration. Unterhalb der CMC von C12E8 läßt sich keine Fluoreszenzänderung

messen, was darauf hindeutet, daß das Vorhandensein von Mizellen (und nicht von

Detergenz-Monomeren) entscheidend für eine erfolgreiche Faltung von OEP16 ist.

In Abbildung 24 werden nun die Amplituden der Teilprozesse in Abhängingkeit von der

Detergenzkonzentration betrachtet.

0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,0300

5

10

15

20

25

30

35

40

45

CMC

C12E8 [% w/v]

Ampl

itude

[mV]

Amplitude (schneller Prozeß) Amplitude (langsamer Prozeß)

Abbildung 24:

Amplituden der Faltungsprozesse von OEP16. Der dritte, schnellste Prozeß ist nicht

berücksichtigt.

Während die Zeitkonstanten lediglich Auskunft über die Geschwindigkeit der einzelnen

Prozesse geben, veranschaulichen die Amplituden der Näherungsfunktionen den Anteil der

einzelnen Prozesse am Gesamtsignal.

71

Es wird deutlich, daß Prozeß 2 erst bei höheren Detergenzkonzentrationen dominiert, während

der langsamste Prozeß 3 dort praktisch nicht mehr meßbar ist. Beide Amplitudenänderungen

lassen sich als exponentieller Zusammenhang zwischen Meßgröße und

Detergenzkonzentration darstellen. In beiden Fällen nähern sich die exponentiellen Kurven

nicht der Abszisse, sondern der kritischen mizellaren Konzentration (CMC) asymptotisch an.

Unterhalb dieser Konzentration – also ohne die Gegenwart von Detergenzmizellen – kann der

Faltungsprozeß nicht stattfinden, die Amplituden und die Zeitkonstanten selbst betragen 0.

Oberhalb dieser Konzentration werden die Prozesse um so schneller, je mehr Detergenz im

Puffer zur Verfügung steht. Bei noch höheren Detergenzkonzentrationen stirbt der langsamere

der beiden Prozesse aus. Möglicherweise handelt es sich hierbei um einen Übergangszustand,

der nur unter relativem Detergenz-Mangel bzw. bei einem Mangel an verfügbaren

Detergenzmizellen auftritt.

Zuletzt soll die Temperaturabhängigkeit der Geschwindigkeitskonstanten gezeigt werden. Aus

der Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Temperatur läßt sich die

Aktivierungsenergie eines Prozesses nach Arrhenius berechnen:

21

21

11lnln

TT

kkREeAk ART

EA

−−∗−=⇔∗= −

Hierbei ist EA die Aktivierungsenergie des Teilprozesses, A der sogenannte Stoßfaktor oder

Arrhenius-Faktor, eine Größe aus der statistischen Themodynamik, und R die allgemeine

Gaskonstante. Durch Auftragung der logarithmierten Zeitkonstanten gegen den Kehrwert der

Temperatur läßt sich die Aktivierungsenergie als Steigung der resultierenden Geraden ablesen

(Abbildung 25).

72

0,0032 0,0033 0,0034 0,0035 0,00364,0

4,2

4,4

4,6

4,8

5,0

5,2ln

kla

ngsa

m

1/T [1/K]

0,0032 0,0033 0,0034 0,0035 0,0036

5,8

6,0

6,2

6,4

6,6

6,8

7,0

7,2

ln k

schn

ell

1/T [1/K]

Abbildung 25:

Arrhenius-Darstellungen der Temperaturabhängigkeit der Geschwindigkeitskonstanten.

Gemessen wurde in einem Temperaturbeteich zwischen 10° und 35°C

73

Die Aktivierungsenergien betragen, abgelesen aus Abbildung 25 bzw. gewonnen aus den

Daten der liearen Regression der Datenpunkte, EA = 27 ± 4 kJ mol-1 für den schnelleren

Prozeß und 20 ± 3 kJ mol-1 für den langsameren Prozeß.

Das Protein wird sichtbar

Bisher wurde gezeigt, daß OEP16 in E.coli überexprimiert und in denaturiertem Zustand

gereinigt werden kann, um es anschließend in seine native Form zurückzufalten. Die

zugehörigen strukturbildenden Prozesse konnten detailliert untersucht werden. All dies sind

notwendige Voraussetzungen, um die Struktur des Proteins im Detail aufklären zu können.

Die folgenden Untersuchungen widmen sich direkt der Strukturbestimmung.

Elektronenmikroskopie

Bei der Elektronenmikroskopie macht man sich zu nutze, daß sich Elektronen nach De

Broglie auch wie Wellen verhalten können. Die Wellenlänge eines Elektrons ist umgekehrt

proportional zu seinem Impuls p = mev :

vmhe

=λ

wobei h das Plancksche Wirkungsquantum und me die Masse des Elektrons sind. Die

Geschwindigkeiten der Elektronen bei dieser Methode sind so regelbar, daß man

Wellenlängen um 10-3 nm erreicht. Bei einer Apertur von etwa 10-3 für Elektronenmikroskope

ergibt sich eine um etwa einen Faktor von 1000 bessere Auflösung gegenüber einem

Lichtmikroskop.

Anders als in der Lichtmikroskopie muß der optische Weg des Elektronenmikroskops

evakuiert sein, da Elektronen durch Gase sehr stark gestreut werden. Ansonsten ist der

Aufbau eines Elektronenmikroskops mit dem eines Lichtmikroskops durchaus vergleichbar.

Anstelle einer Lichtquelle wird eine Glühkathode als Elektronenquelle eingesetzt. Kondensor,

Objektiv und Okular werden durch elektromagnetische Linsen ersetzt, und sichtbar gemacht

wird das Abbild der Probe mittels eines durch Elektronen anregbaren Leuchtschirms. Kontrast

entsteht in der Transmissions-Elektronenmikroskopie durch die Streuung und Absorption von

Elektronen an dem Untersuchungsobjekt in Abhängigkeit von dessen Masse und Dicke. Der

74

Kontrast kann durch Zugabe von geeigneten Kontrastmitteln verstärkt werden. Im Falle von

Protein-Proben benutzt man häufig Schwermetalle, die bei der Probenvorbereitung an die

Moleküle binden und sowohl Streuung als auch Absorption den Elektronenstrahls verstärken.

Man spricht in diesem Fall von „negative stain“, da man ein Negativabbild des Proteins

erhält. Transmissions-Elektronenmikroskopie kann, bei geeigneter Wahl eines

Kontrastmittels, einzelne Proteinpartikel sichtbar machen und – wenn auch bei

vergleichsweise niedriger Auflösung – Strukturinformationen liefern. Besonders geeignet ist

diese Methode, wenn es gelingt, aus dem elektronenmikoskopischen Abbild des Proteins auf

dessen Orientierung im Raum zu schließen. In diesem Fall kann man mit Hilfe moderner

Computermethoden hunderte von Aufnahmen mitteln und so ein dreidimensionales Bild des

Proteins generieren.

OEP16, rekonstituiert in C12E8, wurde mit Phospho-Wolframsäure als Kontrastmittel in einem

Kryo-Elektronenmikroskop bei maximaler Vergrößerung (siehe Material und Methoden)

abgebildet. Das Ergebnis ist in Abbildung 26 gezeigt.

Abbildung 26:

Elektronenmikroskopische Aufnahme von

OEP16-Partikeln. Der Balken entspricht 30

nm.

Man sieht deutlich die einzelnen Proteinpartikel, der Maßstab in der unteren rechten Bildecke

entspricht 30 nm. Die Partikel haben also einen Durchmesser von etwa 5 nm. Dieser Wert ist

für ein Protein von 16-48 kDa Größe (je nach dem ob es sich um ein Monomer, Dimer oder

Trimer handelt), sinnvoll. Bemerkenswerterweise taucht derselbe Wert als

röntgenkristallographische Größe im Folgenden nocheinmal auf (siehe Abschnitt

Kristallisation). Bedauerlicherweise sind die Partikel damit zu klein für detailliertere

Strukturaussagen oder 3D-Rekonstitutionsmethoden. Die Methode der 3D-Rekonstitution aus

75

Einzelbildern wird ständig verbessert, höher auflösende Elektronenmikroskope und

automatisierte Bildbearbeitung werden möglicherweise schon in naher Zukunft bessere

Resultate auch mit kleinen Proteinen ermöglichen.

Aus dem Experiment lassen sich aber dennoch Strukturinformationen gewinnen. Man kann

bei einzelnen Partikeln eine Kleeblatt-ähnliche Form, also eine dreizählige Symmetrieachse

ausmachen. Bisherige Strukturmodelle gehen von einem Dimer (mit gemischter α-Helix/β-

Faltblattstruktur(Pohlmeyer, 1997a)) oder von einem Tetramer (reiner β-Faltblattkanal mit

assoziierten Helices(Steinkamp, 2000)) aus. Beides macht eine dreizählige Symmetrieachse

unmöglich. Der Partikeldurchmesser von 5 nm würde zu einem Trimer passen, betrachtet man

das durchschnittliche Volumen von Proteinen entsprechender Größe (etwa 50 kDa).

Die bisher diskutierten spektroskopischen Messungen erlauben keine Aussage über die

Oligomerisierung von OEP16. Es ist denkbar, daß einer der kinetischen Prozesse aus den

zeitaufgelösten Messungen einer Oligomerisierung von OEP16-Monomeren entspricht. Auch

die Kalorimetrie zeigte keinen separaten Monomerisierungs-Prozeß, durch den sich auf die

Enthalpie der Oligomer-Bildung hätte schließen lassen. Möglicherweise geschehen

Denaturierung und Aggregation in der Hitze ohne vorherigen Zerfall in Monomere. Um das

Problem des Oligomerisierungszustandes von OEP16 zu lösen, wurde versucht, das Protein zu

kristallisieren und seine Struktur mittels Röntgenstrukturanalyse zu bestimmen.

Kristallisation

Die Kristallisation und anschließende Röntgenstrukturanalyse ist nach wie vor die effektivste

Methode, um zu hochauflösenden Proteinstrukturen zu gelangen. Inzwischen gibt es

allerdings eine ganze Reihe von Strukturen, die mittels Elektronenmikroskopie und –

kristallographie sowie mit Kernspinresonanzmethoden (NMR) gelöst wurden. Hauptnachteil

der klassischen Kristallisationsmethoden ist der enorme Zeit- und Materialaufwand.

Die Kristallisation von Membranproteinen folgt im Prinzip denselben Regeln wie die löslicher

Proteine. Die Kristallisation erfolgt aus einer übersättigten Lösung, wenn die freie Enthalpie

∆G für diesen Vorgang einen negativen Wert annimmt. Die Übersättigung kann sowohl durch

Erhöhung der Proteinkonzentration als auch durch andere Faktoren, die die Löslichkeit des

Proteins beeinflussen, erreicht werden.

76

Detergenzien

Bei der Kristallisation von Membranproteinen wird deren Löslichkeit natürlich maßgeblich

von den verwendeten Detergenzien beeinflußt. Dies geschieht auch durch Wechselwirkung

des Detergenz mit den verschiedenen Salzen und Kristallisationszusätzen. Oft kristallisieren

Membranproteine dadurch, daß die Löslichkeitsgrenze des Detergenz (und nur indirekt die

des darin gelösten Proteins) unterschritten wird. Auf diesem Prinzip beruht auch die

Kristallisation von OEP16.

Erste Kristallisationsexperimente wurden mit OEP16, rekonstituiert in C12E8, durchgeführt.

Um eine möglichst hohe Proteinkonzentration zu erreichen, wurde das gefaltete Protein in

Puffer mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung im Verhältnis 1:1 versetzt und dabei

präzipitiert. Das Protein wurde in Wasser wiederaufgenommen, so daß das Endvolumen

einem zehntel des Ausgangsvolumens entsprach. Die erhaltene Lösung wurde abzentrifugiert,

um Aggregate abzutrennen und mit den Pufferlösungen der Kristallisationsansätze versetzt.

Es wurde die Methode der hängenden Tropfen genutzt. Hierbei wird ein kleiner Tropfen der

Proteinlösung mit Puffer hängend an einem Deckglas angebracht, der mittels Dampfdiffusion

mit einem Pufferreservoir in Kontakt steht. Die Salzkonzentration im Reservoir ist höher als

im Tropfen, so daß Salz- und Proteinkonzentration während des Diffusionsprozesses im

Tropfen zunehmen. Hierbei wird idealerweise eine Übersättigung der Proteinlösung erreicht

und so die Bildung von Kristallen ermöglicht. Variiert werden die Parameter pH, Salztyp und

Salzkonzentration, die Konzentration von Präzipitationsadditiven wie Polyethylenglykol oder

hydrophoben Alkoholen und – bei Membranproteinen – potentiell auch das Detergenz und

dessen Konzentration.

Für OEP16 in C12E8 zeigten sich folgende Änderungen der Löslichkeit in Abhängigkeit von

physikochemischen Parametern:

pH

Der pH-Wert beeinflußt direkt die Oberflächenladung des Proteins. Saure und basische

Aminosäurereste können protoniert oder deprotoniert werden. Häufig ist die Löslichkeit eines

Proteins am geringsten im pH-Bereich um seinen isoelektrischen Punkt. Hier hat das Protein

77

nach außen keine Nettoladung mehr und wandert entsprechend nicht mehr im elektrischen

Feld.

OEP16 hat einen berechneten isoelektrischen Punkt von 9, seine Löslichkeit sollte mangels

eigener Nettoladung bei einem pH um etwa 9 am geringsten sein. Bei den

Kristallisationsexperimenten konnte Präzipitation und die Bildung von Mikrokristallen bei

allen untersuchten pH-Werten im Bereich von 4,5 bis 9,5 beobachtet werden. Dabei zeigte

sich jedoch wie erwartet, daß die Präzipitation bei höheren pH-Werten bei niedrigeren

Fällungsmittelkonzentrationen erfolgt.

Temperatur

Wie praktisch bei allen Lösungen hängt die maximale Löslichkeit von Proteinen auch von der

Temperatur ab. Es läßt sich nicht sicher vorhersagen, ob ein Protein bei höheren

Temperaturen besser oder schlechter löslich ist als bei niedrigen. Da auch die meisten

Kristallisationszusätze abhängig von der Temperatur das Phasendiagramm des Proteins

unterschiedlich beeinflussen, werden in der Praxis meist Kristallisationsansätze parallel bei

verschiedenen Temperaturen gemacht, um empirische Daten über das Temperaturverhalten zu

bekommen.

OEP16 wurde bei verschiedenen Temperaturen kristallisiert. Zur Verfügung standen ein

Temperierschrank bei 18°C und ein Kühlraum mit 4°C Innentemperatur. Im allgemeinen

waren bei 4°C Phasentrennung und Proteinpräzipitation deutlich ausgeprägter. Die

Zitratansätze (siehe später), die doppelbrechende OEP16-Kristalle lieferten, wurden ebenfalls

bei den verscheidenen Temperaturen angesetzt. Die deutlich besseren Kristalle wurden bei

18°C erhalten. Möglicherweise ging die Phasentrennung bei 4°C so schnell, daß eine

geordnete Kristallisation des Proteins dort verhindert wurde.

Präzipitationszusätze

So genannte Kristallisationszusätze sind zumeist organische Moleküle oder Lösungsmittel,

die Wasser binden oder ordnen (hydrophober Effekt). Dem Protein steht weniger Wasser zur

Verfügung, seine Löslichkeit wird herabgesetzt. Typische Kristallisationszusätze dieser Art

sind mehrwertige Alkohole wie Glyzerin oder MPD (2-Methyl-2,4-Pentandiol) oder

Polyethylenglykole.

78

In Gegenwart von Polyethylenglykolen kurzer Kettenlänge (z.B. PEG 400) bildeten sich in

den OEP16-Ansätzen zwei nicht mischbare flüssige Phasen aus, während Zusatz von sehr

langkettige PEGs (ab etwa PEG 6000) meist zu amorpher Präzipitation des Proteins führten.

PEGs mittlerer Kettenlänge verursachten im allgemeinen Beides, d.h. Phasentrennung bei

gleichzeitigem amorphem Niederschlag. Die Löslichkeit des Proteins nahm mit steigendem

pH auch hier ab. Dennoch konnte in keinem Fall mit PEG Kristallwachstum induziert werden.

Zusatz von Alkoholen wie MPD (2-Methyl-2,4-Paentandiol) verursachten eine Trübung der

Proteinlösung bei 4°C, bei 18°C einen amorphen Niederschlag. Es ist anzunehmen, daß die

Trübung von einer Denaturierung und anschließenden Aggregation der Proteinmoleküle

herrührt.

Ionenstärke

Die Ionenstärke einer Lösung beeinflußt die Löslichkeit von Proteinen maßgeblich. Ionen

wechselwirken mit geladenen und polaren Gruppen auf der Oberfläche des Proteins.

Typischerweise haben Proteine ihre höchste Löslichkeit bei mittleren Ionenstärken. Bei hohen

Ionenstärken konkurrieren die Ionen mit dem Protein um das verfügbare Wasser zur

Hydratation. Hierbei spielt nicht nur die absolute Ionenstärke, sondern auch der Typ des Ions

eine große Rolle, auch weil entstehende Kristallkontakte durch entsprechende Ionen erst

vermittelt werden können. Bei niedrigen Ionenstärken hingegen werden Gegenionen der

geladenen Aminosäurereste im Protein abgelöst, die durch sie vermittelte Abschirmung

entfällt und das Protein kann durch direkte Kontakte aggregieren bzw. kristallisieren.

Komplettes Entfernen aller ionischen Pufferkomponenten durch Dialyse gegen Wasser führte

nicht zu einer ausreichenden Verringerung der Löslichkeit von OEP16, eingesetzt in einer

Konzentration von ca. 1 mg/ml. Als Kristallisiationsmethode kommt diese Methode also nur

bei noch höheren (bei OEP16 z.Z. nicht erreichbaren) Proteinkonzentrationen in Betracht.

Starkes Anheben der Ionenstärke hatte im Gegensatz dazu dramatische Effekte auf die

Löslichkeit von OEP16. Die Löslichkeit ist unter den beobachteten Bedingungen generell bei

4°C niedriger als bei 18°C. Mikrokristalle bildeten sich in Gegenwart verschiedener Salze,

wobei die Art des Salzes ebenso wichtig ist wie seine Konzentration. Es konnte gezeigt

werden, daß der Einfluß verschiedener Anionen auf die Löslichkeit des Proteins deutlich

ausgeprägter als der der verwendeten Kationen ist. Am schwächsten ist der Einfluß von

Chlorid, stärker der von Phosphat und Sulfat-Ionen. Am deutlichsten senkte Citrat die

79

Löslichkeit von OEP16. Kleine Kristalle von OEP16 konnten mit Citrat in einem pH-Bereich

von 6,5 bis 9,5 beobachtet werden, wobei die Größe der Kristalle mit steigendem pH zunahm.

Betrachtete man die Kristallisationsansätze regelmäßig, so konnte man feststellen, daß nach

etwa 48 Stunden eine Phasentrennung eintritt, bei der sich zähe, ölige Tropfen in der

wäßrigen Lösung ausbildeten, die vermutlich in erster Linie aus dem Detergenz C12E8

bestehen. Manche dieser Tropfen wandelten sich dann im Laufe von Tagen langsam in

kantige Kristalle um. Citratkonzentrationen unter 1M führten nicht zu Phasentrennung bei

4°C. Bei 18°C genügte zur Phasentrennung eine Konzentration von 800 mM Citrat.

Die erhaltenen Kristalle wurden fotografiert, zum Teil röntgenkristallographisch untersucht

und mittels SDS-Gelelektrophorese analysiert.

Abbildung 27:

Gelelektrophoretische Analyse der OEP16-Kristalle.

Rechts sind die Banden der Markerproteine angedeutet.

Spur A enthielt den Überstand der Kristallisationsansätze.

Spur B enthält die plättchenförmigen Kristalle,

aufgenommen in SDS-Probenpuffer. Spur C enthält die

Tröpfchen (siehe auch Abbildung 25), soweit sich diese

vom Überstand trennen ließen.

Im Gel sieht man neben den Markerproteinen eine Lösung aus den Kristallen, dem Überstand

des Ansatzes und der kleinen, nicht polarisierenden öligen Tropfen, jeweils vor dem

Auftragen in SDS-Probenpuffer erhitzt. Nur die Kristalle enthalten nennenswerte Mengen an

OEP16. Die öligen Tropfen wurden beim Erhitzen so zäh, daß sie sich kaum auf das Gel

auftragen ließen. Es ist anzunehmen, daß diese Tropfen aus einer detergenzreichen Phase

bestehen. Der Überstand enthält praktisch kein Protein mehr.

80

Abbildung 28:

Kristallisationsansatz von OEP16 in 1 M

Natriumzitrat.

Bild A zeigt den Ansatz in normalem Licht,

Bild B unter polarisiertem Licht.

Abbildung 28 zeigt OEP16-Kristalle. Sie wurden mit 1 M Natriumcitrat und 100 mM

CAPSO-Puffer bei pH 9,5 in C12E8 gezüchtet. Oben wurden die Kristalle unter normalem

Licht fotografiert, unten unter polarisiertem Licht. Deutlich zu sehen ist, daß die kantigen

81

Kristalle die Ebene des polarisierten Lichts drehen können und somit leuchten, während die

kleinen, „öligen“ Tropfen das nicht tun. Die Kristalle sind sehr flach und haben eine

Abmessung von 100-200 µm Länge, 50-100 µm Breite und nur etwa 10 µm Dicke.

Die gezeigten Kristalle ergaben nur ein extrem schwaches Beugungsbild. Röntgendiffraktion

konnte bis zu einer Auflösung von 2 nm beobachtet werden. Schon ein zweites Beugungsbild

nach Drehen des Kristalls um 1° zeigte praktisch keine Diffraktion mehr, der Kristall wurde

im Röntgenstrahl also zerstört. Dennoch läßt sich aus den ersten Beugungsbildern die

Gitterdimension der Elementarzelle in einer der Raumrichtungen auf 5,7 nm abschätzen. Dies

paßt sehr gut zu dem elektronenmikroskopisch gefundenen Partikeldurchmesser. Um bessere

Beugungsbilder zu erhalten müssen Bedingungen gefunden werden, unter denen die Kristalle

größer und vor allem stabiler werden. Auch eine geeignete Kryolösung, in der sich die

Kristalle ohne Eisbildung einfrieren lassen, konnte bisher nicht gefunden werden. Getestet

wurden Lösungen mit 10-30% Glyzerin, 1-2 M Sucrose oder Glukose sowie Trehalose. In

jeder dieser Lösungen waren die Kristalle nicht stabil.

Bei weiterführenden Kristallisationsversuchen sollte der Augenmerk vor allem auf die

Detergenzkonzentration gelegt werden. Die durch das Detergenz mit Citrat verursachte

Phasentrennung ermöglicht zwar erst die Bildung der gezeigten Kristalle. Das in den

Kristallen in großer Menge vorhandene Detergenz und möglicherweise auch das

überschüssige Detergenz in Lösung dürften aber auch verantwortlich für die weiche

Konsistenz und die geringe Stabilität der Kristalle gegen typische Kryoreagenzien sein. Eine

Verringerung der Detergenzkonzentration auf Werte, die eine Kristallisation gerade noch

erlauben, dürfte stabilere und möglicherweise auch größere Kristalle liefern.

Theoretische Ansätze zur Strukturaufklärung

In Verlauf dieser Arbeit konnte mit spektroskopischen Methoden gezeigt werden, daß OEP16

eine rein α-helikale Struktur aufweist. Dies widerspricht allen bisherigen Vorstellungen vom

Aufbau dieses integralen Membranproteins(Pohlmeyer, 1997a; Steinkamp, 2000). Auch wenn

elektronenmikroskopische Untersuchungen und Kristallisationsversuche noch nicht zu einer

Auflösung führen, die eine detaillierte Aussage über die Struktur von OEP16 erlaubt, kann

aufgrund theoretischer Überlegungen ein neues Strukturmodell erstellt werden.

82

Auch wenn die genaue Vorhersage einer Proteinstruktur allein aus der Primärsequenz zum

jetzigen Zeitpunkt unmöglich ist, lassen sich aus den bereits verfügbaren Modellen und

Algorithmen viele nützliche Informationen gewinnen. Hilfreich ist es hierbei, mehrere

Sequenzen eines Proteins aus unterschiedlichen Organismen zur Verfügung zu haben.

Multiple Sequence Alignment

Grundvoraussetzung jeder theoretischen Strukturvorhersage ist eine Aminosäuresequenz.

Diese ist für OEP16 aus den Organismen Erbse, Gerste und der Ackerschmalwand vollständig

bekannt. Da theoretische Ansätze an der Sequenz aus Erbse bisher offensichtlich zu falschen

Annahmen führten, sollen im folgenden die Sequenzen aus allen drei Organismen für die

Erstellung eines neuen Modells herangezogen werden. Grundvoraussetzung hierfür ist das

„Multiple Sequence Alignment“, bei dem die Sequenzen verglichen und homologe

Aminosäuren untereinander gestellt werden.

Erbse 1 MPRSSFSGSL SSPKLDVVID MGNPFLNLTV DGFLKIGAVA ATRSVAEDTFGerste 1 MPTAGLAAG- -SNKVDVAID LGNPLLNRTV DGFLKIGAVG ACRVVAEDAFArabidopsis 1 MPSSTFSGTV STPKLSVAVD MGNPFLNLTV DAFLKIGAVG VTKSLAEDTY

Homologie 2222222222 2334444444 4444444444 4444444443 2333444444

Erbse 51 HIIRKGSISS NDFEKSLKKM CKEGAYWGAI AGVYVGMEYG VERIRGTRDWGerste 49 DCLHRGDISK RQLEETLKKM CKEGAYWGAV AGVYVGMEYG VERVRGDRDWArabidopsis 51 KAIDKGSLSK STLEHALKKL CKEGVYWGAA GGVYIGTEYG IERIRGSRDW

Homologie 3333333333 3333333555 5555555553 3555555555 5555555555

Erbse 101 KNAMFGGAVT GALVSAASNN KKDKIAVDAI TGAAIATAAE FINYLT--Gerste 99 KNALIGGIAT GALVSAASNN KGNKIAQDAI TGGAIATAVE FINYLT--Arabidopsis 101 KNAMLAGAAT GAVLSAVGKK GKDTIVIDAI LGGALATASQ FVNNHYFY

Homologie 5555555335 5555552222 2222222333 3333333333 333222--

Abbildung 29:

Die Abbildung zeigt die Sequenzen von OEP16 der verschiedenen Pflanzen. Die Zeile

„Homologie“ gibt die Übereinstimmung im betreffenden Bereich an. Augenscheinlich ist die

Sequenzhomologie über den gesamten Bereich hoch. Welche Funktion den am besten

konservierten Bereichen zukommt (Homologie-Werte von 4-5) und warum, soll im Folgenden

geklärt werden.

83

Hydropathie und Vorhersage transmembraner Segmente

Hydrophatieplots der OEP16-Sequenz aus Erbse ließen den Schluß zu, daß OEP16 aus drei

transmembranen Helices und zwei β-Faltblattstrukturen besteht. Ermittelt man die mittleren

Hydrophobizitäten der Aminosäuren aus den bekannten Sequenzen, kann man aus den

Mittelwerten einen Hydrophobizitätsplot erstellen, der ein besseres Bild von potentiellen

transmembranen Segmenten liefert. In diesem Plot überschreitet der Sequenzbereich etwa um

die Aminosäuren 25-43 deutlich den gesetzten Schwellenwert für ein transmembranes

Segment, ein Befund, der sich allein aus der Erbsensequenz, aus der die vermeintlichen

Faltblattstrukturen abgeleitet wurden, nicht ergibt(Steinkamp, 2000). Die drei

transmembranen Segmente in den Sequenzbereichen 70-91, 102-118 und 125-144 bestätigen

sich, zusätzlich tritt ein weiterer, hydrophober Bereich am n-Terminus der Sequenz zu Tage.

Abbildung 30:

Gezeigt ist die mittlere Hydropathie der Aminosäurereste des „multiple sequence alignments“

aus Abbildung 29

84

Was bedeutet das für das Strukturmodell? Da transmembrane (hydrophobe) Sequenzbereiche

nach bisherigen Erkenntnissen ausschließlich aus Helices und in Sonderfällen aus antiparallel

angeordneten β-Faltblättern bestehen können, OEP16 aber ausschließlich helikalen Charakter

hat, sollten die transmembranen Segmente jeweils membranspannende Helix-Strukturen

ausbilden. Um dies zu verifizieren, wurde der Algorithmus TMPred angewandt, der erlaubt,

Sequenzen mit einer Datenbank bekannter Helix-Strukturen zu vergleichen. Die Ergebnisse

dieser Datenbankabfrage sind in Abbildung 29 durch Unterstreichung der entsprechenden

Sequenzbereiche dargestellt. Demnach besteht OEP16 aus mindestens vier transmembranen

Helices in den Bereichen 25-43, 70-91, 102-118 und 125-144, von hier an Helix I-IV genannt.

Der hydrophobe Bereich im n-Terminus ergibt nur für die Arabidopsis-Sequenz eine positive

Vorhersage (Aminosäuren 1-19). Vermutlich handelt es sich hier um den Signalbereich, der in

Kontakt mit der äußeren Chloroplastenmembran beim Proteinimport eine Helix ausbildet und

damit das Einfädeln in die Lipiddoppelschicht initiiert(Pinnaduwage, 1996). Gegen ein echtes

transmembranes Segment in diesem Bereich spricht vor allem der experimentelle Befund, daß

sich von OEP16 in nativen Erbsenmembranen durch Proteasebehandlung ein etwa 1 kDa

großes Stück (etwa 10 Aminosäuren) abspalten läßt(Pohlmeyer, 1997b). Dies kann nur am n-

Terminus geschehen, da der c-Terminus nach allen bisherigen Ergebnissen in die Membran

eingebettet sein muß bzw. kaum aus ihr herausragt.

Die bereits postulierten drei transmembranen Helices in den Sequenzbereichen 70-91, 102-

118 und 125-144 bestätigen sich. Helices III und IV können mittels Mutagenese entfernt

werden, ohne die Kanalaktivität zu beeinflussen, ebenso wie der Signalbereich (Reste 1-20).

Helix II hingegen wurde lange als entscheidend für die Kanalaktivität betrachtet. Sie hat

große Ähnlichkeiten mit Helices aus vielen Aminosäuretransportproteinen aus Bakterien und

Säugetieren. Mit diesen gemeinsam hat sie vor allem einen Bereich von fünf jeweils durch

drei Aminosäuren getrennten Gylcinresten(Pohlmeyer, 1997b). Auch enthält sie das einzige

Cystein der Sequenz (Cys71), das unter oxidativen Bedingungen den Kanal zu schließen

vermag – möglicherweise über eine Dimerisierung von OEP16-Untereinheiten. Mutagenese

an hydrophilen Resten dieser Helix änderten jedoch nichts an der Kanalaktivität, lediglich ein

Austausch des Cysteins gegen einen Serinrest verhinderte die oxidative Zerstörung der

Kanalfunktion. Es stellte sich sogar heraus, daß die Helix komplett mittels Mutagenese durch

die ebenfalls sehr lange Helix 4 ersetzt werden kann, ohne die Kanalaktivität zu verändern.

Damit dürfte ihr lediglich eine strukturelle Bedeutung für den Kanal zukommen, die

Selektivität muß von einem anderen Sequenzbereich gesteuert werden.

85

Für den Sequenzbereich 25-43 ist das Ergebnis von TMPred nicht eindeutig. Für die

Gerstesequenz wurde hier kein transmembraner Bereich vorhergesagt. Dies liegt vermutlich

an der Häufung geladener und polarer Aminosäuren in diesem Bereich, der in der

Gerstensequenz noch stärker ausgeprägt ist als in den anderen beiden Sequenzen. Diese

polaren Reste dürften auch für die niedrige Hydropathie der Erbsensequenz verantwortlich

sein, die dort auf transmembrane β-Faltblätter hindeutete. Tatsächlich dürfte es sich um eine

amphiphile Helix handeln, die nur zum Teil in Kontakt mit der hydrophoben Lipidmembran

steht, während die hydrophilen Reste das Innere (oder Teile des Inneren) der Kanalstruktur

bilden, die den Aminosäuretransport von OEP16 ermöglichen. Bei 3,6 Aminosäuren pro

Helixwindung kann auf diese Weise jeder dritte bis vierte Aminosäurerest polar sein – und

damit die Helix den klassischen Analysemethoden entgehen.

Hydrophobe Cluster-Analyse

Die Hydrophobe Cluster-Analyse (HCA) erlaubt, sich ein zweidimensionales Bild der

dreidimensionalen Hydropathie-Verhältnisse in einem Protein zu machen. Eine Aminosäure

in einer Helix, zum Beispiel, ist nicht nur von ihren „Sequenznachbarn“ umgeben, sondern

auch von Aminosäuren, die etwa 3-4 Positionen vor oder hinter ihr in der Sequenz angeordnet

sind. Durch geeignete zweidimensionale Darstellung der Sequenz können solche

Nachbarschaftsverhältnisse aufgezeigt werden. Hydrophobe Bereiche werden markiert.

Ergeben sich großflächige hydrophobe Bereiche, handelt es sich mit hoher

Wahrscheinlichkeit um transmembrane Helices. Auch transmembrane β-Faltblätter können

mit dieser Methode sichtbar gemacht werden. Sie zeichnen sich durch ein Alternieren von

hydrophilen und hydrophoben Aminosäureresten aus und werden durch Zickzack-Linien im

HCA-Plot dargestellt.

86

Abbildung 31:

Hydrophobe Cluster-Analyse von OEP16. In der Gerstesequenz wurden zur besseren

Veranschaulichung bzw. Vergleichbarkeit die beiden Prolin-Reste 10 und 11 eingeführt (Rot

markiert). Die Gerstesequenz ist in diesem Bereich zwei Reste kürzer, siehe auch Abbildung

29).

Gezeigt sind die HCA-Plots für die Sequenzen aus Ackerschmalwand, Gerste und Erbse.

Grau unterlegt wurden die Bereiche, die laut TMPred transmembrane Helices darstellen.

Hydrophobe Bereiche sind umrahmt. Prolinreste sind durch einen Stern, Glycinreste durch

eine Raute und Serin- und Threoninreste durch ein Quadrat (mit bzw. ohne Punkt darin)

gekennzeichnet. Diese besondere Markierung hebt ebenso wie die Hervorhebung der

Cysteinreste die besonderen Struktureigenschaften dieser Aminosäuren hervor. Während

Prolin oft am Beginn oder Ende einer Helix steht, ermöglicht das kleine Glycin Knicke in

Helix- und Faltblattstrukturen. Serin- und Threoninreste können durch

Wasserstoffbrückenbindungen ihrer Hydroxylreste mit dem Proteinrückrat unter Umständen

ihren hydrophilen Charakter innerhalb einer Membran verbergen – wiederum ist ein Knick in

einer α-Helix die Folge.

87

Klar zu sehen ist eine Häufung hydrophober Cluster in den vorhergesagten transmembranen

Segmenten. Putative Faltblattstrukturen sind kurz und nicht in Kernbereichen angeordnet, die

als transmembrane Helix in Frage kommen. Nur ein kurzer Faltblattbereich am Ende von

Helix zwei wird in allen drei Sequenzen sichtbar – in einem Bereich von fünf Aminosäuren,

zu kurz für ein transmembranes Strukturelement. Schön zu sehen in dieser Darstellung ist der

Bereich von fünf nebeneinander liegenden Gylcinresten in Helix II, dem vermutlich eine

wichtige Rolle bei der Kanalbildung zukommt (möglicherweise bei der Oligomerisierung).

Auffällig sind auch die praktisch identischen Hydrophobizitätsmuster in Helix I, was für ihre

besondere Rolle für die Kanalselektivität spricht, und die auffällige Übereinstimmung der

Muster im Loopbereich zwischen den ersten beiden Helices. Für viele Kanal- und

Transportproteine wurde beschrieben, daß Substraterkennung und –selektivität durch Loops

vermittelt wird(Slotboom et al., 2001), die zum Teil in die Membran hineinragen. Es ist

denkbar, daß dies auch bei OEP16 der Fall ist.

Topologie

Zusammengenommen ergeben die genannten theoretischen Untersuchungen folgendes Bild:

88

AN

GG F

M

AT

V

VL A

G

SA

AS

LF

VT L

N

DF

G

GI K

L

AA

VA

DL

V

CM

AG E

K

YG

W

GA I

A

VV

Y

YE M

G

G

AI

IA D

V

TA

G

TA I

A

AE

A

YN I

F

L

G

IT

K

R

DG

I

E

K

D

FE

K

V

R

NK

R

NK

W

I

RT

S

R

ND F

IA

H

S

V L

S

VG I

SS

D

S

P

R

ND

LF GS

K

P

M

E

T

P

S S

S

S

K

KK

II III IVI

C

M

N

T

Abbildung 32:

Topologiemodell von OEP16

Nach Proteolyseexperimenten ist der n-Terminus von OEP16 im Chloroplsten dem Cytosol

zugewandt(Pohlmeyer, 1997b). Das OEP16-Monomer bildet vier transmembrane Helices aus,

wobei Helix I vermutlich die Reste enthält, die die Selektivität des Aminosäurekanals

bestimmen. Die Helix beginnt nach einem Prolinrest. Sie enthält (gezeigt für die Erbsen-

Sequenz) die hydrophilen Aminosäuren Asparagin 28, Aspartat 32 und Lysin 36. Besonders

die beiden geladenen Reste Asp32 und Lys36 dürften für zukünftige Mutageneseexperimente

ein interessantes Ziel darstellen, da sie aus thermodynamischen Gründen unbedingt in das

Innere des Kanals ragen müssen. Helix II scheint ein gemeinsames Strukturmotiv vieler

Aminosäuretransporter darzustellen und hat offensichtlich für den Kanal vor allem eine

strukturgebende Bedeutung. Ob das erwähnte Cystein Cys71 in vivo regulatorisch für die

Kanalaktivität wirkt, bleibt eine interessante Fragestellung für weitere Untersuchungen. Der

„Loop“ zwischen den Helices I und II ist in Gerste möglicherweise durch eine Disulfidbrücke

(Cys40-Cys50) stabilisiert. Helices III und IV haben keine Bedeutung für die Bildung des

Kanals. Möglicherweise sind sie an der Oligomerisierung von OEP16-Monomeren beteiligt.

89

OEP16 muß als intakter Kanal ein Oligomer bilden, da zwei α-Helices für sich genommen

noch keinen Kanal bilden können.

90

Zusammenfassung der Ergebnisse

In der vorliegenden Arbeit wurde die biophysikalischen Eigenschaften eines kleinen

Kanalproteins aus der äußeren Chloroplastenmembran der Erbse, genannt OEP16 („outer

envelope Protein 16 kDa“), untersucht und ein neues Strukturmodell entwickelt, auf dessen

Basis die Funktion des Proteins mit molekularbiologischen Methoden nun genauer erforscht

werden kann.

OEP16 ist ein Membranprotein mit ungewöhnlichen Eigenschaften. Als Protein der äußeren

Chloroplastenmembran insertiert es selbständig in geeignete Lipiddoppellschichten und in

Detergenzmizellen. Bei vielen eukaryontischen Membranproteinen kommt eine bakterielle

Überexpression zur Gewinnung großer Proteinmengen nicht in Frage, da zumeist ein

korrekter Einbau in eine Membran mangels der komplexen eukaryontischen

Faltungsmaschinerie in diesen Systemen nicht gegeben ist. OEP16 hingegen erlaubt es,

aufgrund seiner selbsttätigen Renaturierung das Protein ohne Rücksicht auf die native

Struktur in E.coli überzuexprimieren und erst anschließend rückzufalten.

Es konnte gezeigt werden, daß man große Mengen korrekt gefalteten Proteins erhalten kann,

indem man in chaotropen Puffersystemen aufgereinigtes Protein durch einen

Verdünnungsschritt in einen detergenzhaltigen Puffer überführt. Der Nachweis, daß sich

OEP16 in Detergenzmizellen in eine native Form faltet, ist schwierig, da die Funktion des

Proteins, seine Kanalaktivität, nur in einem Membransystem meßbar ist. Durch den Vergleich

von Fluoreszenz- und CD-Spektren von detergenzhaltigen Proteinlösungen und dem in

Liposomen eingebautem Protein (mit nachgewiesener Funktionalität) konnte gezeigt werden,

daß die Struktur von OEP16 in den auf unterschiedliche Weise rekonstituierten Proben

übereinstimmte. Zeitaufgelöste Messungen mit denselben spektroskopischen Methoden

lieferten Daten über den Verlauf und die Geschwindigkeit der Proteinfaltung bei dieser

Renaturierungsmethode, einschließlich der Aktivierungsenergien für den Prozeß.

Kalorimetrische Messungen (DSC) erlaubten eine Abschätzung der Faltungsenthalpie. Durch

hochauflösende CD-Messungen und Infrarotspektroskopie wurde schließlich am in vitro

gefalteten Protein gezeigt, daß es sich bei OPE16 entgegen bisheriger Voraussagen um ein

rein α-helikales Membranprotein handelt. Dieser Befund konnte durch theoretische Methoden

der Strukturbestimmung bestätigt werden. Ein neues Strukturmodell wurde erstellt. Erste

vielversprechende Ansätze der Proteinkristallisation und der Elektronenmikroskopie zeigen,

daß eine detaillierte Struktur von OEP16 in absehbarer Zeit erhältlich sein könnte. Dies wäre

91

weltweit die erste hochaufgelöste Struktur eines im Reagenzglas gefalteten Membranproteins.

In einer Zeit, in der Proteomics, also das Überexprimieren und Analysieren von Proteinen, die

Arbeit der größtenteils abgeschlossenen Sequenzierungprojekte fortführen sollen, konnte mit

OEP16 ein Modellsystem für die detaillierte Struktur- und Funktionsanalyse von

Membranproteinen etabliert werden.

92

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Nature, 409, 739-743.

100

Danksagung

Ich danke Frau Prof. Dr. Petra Fromme nicht nur für die interessante Aufgabenstellung und

die dafür bereitgestellten finanziellen Mittel aus ihren Projekten, sondern auch insbesondere

für die große Freiheit, die ich beim Berarbeiten des Themas genossen habe. Die Arbeit wurde

hauptsächlich aus Mitteln der DFG (Fördernummer Fr 320/3-1 und 3-2) finanziert.

Herrn Prof. Soll (Kiel, inzwischen München) danke ich für die fruchtbare Zusammenarbeit

bei mehreren Publikationen und ihm und seiner gesamten Arbeitsgruppe für das Produzieren

großer Mengen „inclusion bodies“, ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Herrn

Prof. Wagner (Osnabrück) und seinen Mitarbeitern sind die Leitfähigkeitsmessungen an

OEP16-Liposomen zu verdanken.

Herrn Prof. Findenegg (TU Berlin) danke ich für die Bereitschaft, sehr kurzfristig die

Begutachtung meiner Arbeit zu übernehmen.

Uwe Fink, Dr. Joachim Frank, Jan Kern, Dr. Athina Zouni und Dr. Priv.Doz. Petra Fromme

haben mich ständig durch Fachwissen, neue Ideen und hilfreiche Diskussionen unterstützt.

Ein solch produktives und angenehmes Arbeitsumfeld kann nicht genug gewürdigt werden.

Meinen Eltern, Herrn Timm Krause-Plonka sowie Erwin und Anneliese Schäuble danke ich

für moralische und finanzielle Unterstützung während des gesamten Studiums.

Meiner Frau Daniela gilt besonderer Dank für viel Geduld.

Diese Arbeit ist meinem Sohn Lukas gewidmet, der mit knapp fünf Jahren mehr über

Dinosaurier, Autos und Fische weiß als ich.

Deckblatt Untersuchungen zu Struktur und Funktion eines...

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