Deletions- und Bruchpunktanalyse mittels Southern-Blot ...

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Aus dem Zentrum für Kinderheilkunde und Jugendmedizin der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Deletions- und Bruchpunktanalyse mittels Southern-Blot- Verfahren bei Familien mit Nephronophthise Typ 1 (NPH1) INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt 2003 von Thalia Vetsi geboren in Esslingen a.N.

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Aus dem Zentrum für Kinderheilkunde und Jugendmedizin

der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.

Deletions- und Bruchpunktanalyse mittels Southern-Blot-Verfahren bei Familien mit Nephronophthise Typ 1 (NPH1)

INAUGURAL-DISSERTATION

zur

Erlangung des Medizinischen Doktorgrades

der Medizinischen Fakultät

der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg im Breisgau

Vorgelegt 2003

von Thalia Vetsi

geboren in Esslingen a.N.

Dekan: Prof. Dr. rer. nat. M. Schumacher

1. Gutachter: Prof. Dr. F. Hildebrandt

2. Gutachter : PD Dr. W. Offensperger

Jahr der Promotion: 2003

Abkürzungen(Begriffe aus dem Englischen sowie Gennamen sind kursiv gedruckt)

ADPKD adult dominant polycystic kidney disease

ARPKD adult recessive polycystic kidney disease

bp Basenpaare

DNA desoxyribo nucleic acid

cDNA copy DNA

cM Centimorgan

cpm counts per minute

EST expressed sequence tag

FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

JN/MCD juvenile nephronophthisis/medullary cystic disease

kb Kilobase(n)

kD Kilodalton

LINE long interspersed nuclear element

MAL maturation associated protein of lymphocytes

MALL MAL-like

Mb Megabase(n)

MCD medullary cystic disease

mRNA messenger ribonucleic acid

NPHP1 Gen für nephronophthise Typ 1

NPH1(2) alte Bezeichnung für das Gen für

Nephronopthise Typ1(2)

NPH Nephronophthise

ORF open reading frame

PAC P1-related artificial chromosome

PCR polymerase chain reaction

PFGE Pulsfeld-Gelelektrophorese

RACE rapid amplification of cDNA ends

RNA ribonucleic acid

SINE small interspersed nuclear element

SSCP single stranded conformation polymorphism

STS sequence- tagged site

TBM Tubuläre Basalmembran

Tris Trihydroxymethylaminomethan

Upm Umdrehungen pro Minute

YAC yeast artficial chromosome

I

1.EINLEITUNG ............................................................................................................... 1

1.1 Die familiäre juvenile Nephronophthise................................................................ 11.1.1 Klassifikation ...................................................................................................... 11.1.2 Epidemiologie..................................................................................................... 21.1.3 Klinik................................................................................................................... 21.1.4 Pathologie und renale Histologie........................................................................ 31.1.5 Ätiologie und Pathogenese ................................................................................ 41.1.6 Diagnostik .......................................................................................................... 51.1.7 Therapie ............................................................................................................. 6

1.2 Genetik..................................................................................................................... 71.2.1 Allgemeine Aspekte............................................................................................ 71.2.2 Tiermodelle ........................................................................................................ 71.2.3 Molekulare Genetik ............................................................................................ 8

2. ZIELSETZUNG......................................................................................................... 19

3. MATERIAL UND METHODEN ................................................................................. 20

3.1 Patienten................................................................................................................ 20

3.2 Genomische DNA.................................................................................................. 203.2.1 EBV-Transformation von Lymphozyten............................................................ 203.2.2 DNA-Extraktion mittels Ionenaustauschersäulen ............................................. 21

3.3 Plasmidpräparation .............................................................................................. 233.3.1 Plasmidpräparation nach Chowdhury............................................................... 233.3.2 Plasmidpräparation nach Birnboim und Doly.................................................... 24

3.4 Präzipitation von DNA .......................................................................................... 263.4.1 Ethanolfällung................................................................................................... 263.4.2 Isopropanolfällung ............................................................................................ 26

3.5 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen.............................................. 263.5.1 Verdau von PAC-Klonen .................................................................................. 263.5.2 Verdau von genomischer DNA......................................................................... 27

3.6 Agarose-DNA-Gelelektrophorese........................................................................ 28

3.7 Southern Blot ........................................................................................................ 293.7.1 Aufbau des Kapillarblots................................................................................... 303.7.2 Blotten der DNA ............................................................................................... 303.7.3 Polymerasekettenreaktion (PCR) ..................................................................... 323.7.4 Gewinnung der Sonde...................................................................................... 333.7.5 Radioaktive Markierung der Sonden ................................................................ 343.7.6 Prähybridisieren und Hybridisieren des Southern Blots ................................... 343.7.7 Waschen der Blots ........................................................................................... 353.7.8 Auswertung der Blots ....................................................................................... 353.7.9 Wiederverwendung der Blots durch “membrane stripping” .............................. 35

3.8 Nährmedien ........................................................................................................... 36

II

3.9 Andere Lösungen und Chemikalien.................................................................... 36

3.10 Restriktionsnzyme .............................................................................................. 39

3.11 Primer und Sonden............................................................................................. 40

3.12 Materialien ........................................................................................................... 40

4.ERGEBNISSE ........................................................................................................... 43

4.1 Allgemein............................................................................................................... 43

4.2 Deletionsanalyse im Bereich der distalen Bruchpunktregion .......................... 444.2.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markierten Sonde (Sonde A) im 3‘-Bereich des NPHP1-Gens........................................... 444.2.2 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit dem EST yb08f05 (Sonde B) 46

4.3 Deletionsanalyse am proximalen Bruchpunkt bei Familie 12........................... 484.3.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markierten Sonde (Sonde C) im Bereich des vermuteten proximalen Bruchpunkts........... 484.3.2 Wiederholung des Experiments aus 4.3.1........................................................ 524.3.3 Erstellung einer partiellen Restriktionskarte für den proximalen Bruchpunkt bei Familie 12 nach Hybridisierung genomischer Southern Blots mit der radioaktiv markierten Sonde C ........................................................................................ 53

4.4 Deletionsanalysen stromabwärts des vermuteten proximalen Bruchpunkts beiweiteren NPH-Familien ............................................................................................... 55

4.4.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markierten Sonde im Sp6-Bereich des PACs 62p20 (Sonde D) ........................................ 55

5. DISKUSSION ........................................................................................................... 57

5.1 Allgemein............................................................................................................... 57

5.2 Bisherige Charakterisierung der Deletionsbruchpunkte für NPHP1 ................ 58

5.3. Die Southern Blot Technik ................................................................................. 585.3.1 Die Southern Blot Technik im Vergleich zu anderen molekularbiologischen Techniken......................................................................................................... 58

5.4 Deletionsanalyse am distalen Deletionsbruchpunkt ......................................... 605.4.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markierten Sonde im 3‘-Bereich des NPHP1 –Gens (Probe A).......................................... 605.4.2 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit dem EST yb08f05 (Probe B). 61

5.5 Deletionsanalyse am proximalen Bruchpunkt bei Familie 12........................... 625.5.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markierten Sonde im Bereich des vermuteten proximalen Bruchpunkts (Probe C)............ 625.5.2 Erstellung einer partiellen Restriktionskarte für den proximalen Bruchpunkt bei Familie 12......................................................................................................... 64

5.6 Deletionsanalysen stromabwärts des vermuteten proximalen Bruchpunkts beiweiteren NPH-Familien............................................................................................... 64

III

5.6.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markierten Sonde im Sp6-Bereich des PACs 62p20 ( Probe D) ........................................ 64

5.7 Mögliche Pathomechanismen für die Entstehung der NPHP1-Deletion .......... 65

5.8 Ausblick................................................................................................................. 66

6. ZUSAMMENFASSUNG............................................................................................ 68

7. LITERATURLISTE ................................................................................................... 69

8. ANHANG

8.1 Sequenzierter Bereich Exon 1 und Exon 2

8.2 Danksagung

8.3 Abstracts und Veröffentlichungen

8.4. Lebenslauf

1

1.EINLEITUNG

1.1 Die familiäre juvenile Nephronophthise

1.1.1 Klassifikation

Unter familiärer juveniler Nephronophthise (NPH) versteht man eine autosomal rezessiv

vererbte zystische Nierenerkrankung (Fanconi et al., 1951), welche im Alter von

durchschnittlich 13 Jahren zum terminalen Nierenversagen führt (Waldherr et al., 1982).

Die NPH stellt die häufigste genetische Ursache für terminales Nierenversagen im

Kindesalter dar (Hildebrandt, 1995).

1945 wurde das Krankheitsbild der NPH zum ersten Mal beschrieben (Smith und

Graham, 1945), 1951 erfolgte die heute gültige Namensgebung (Fanconi et al., 1951).

1997 erfolgte die Identifizierung des Gens für Nephronophthise durch Hildebrandt

(Hildebrandt et al., 1997) und Saunier (Saunier et al., 1997). 1998 gelang die

Entdeckung eines zweiten Genlocus für Nephronophthise (Nephronophthise Typ 2)

durch Haider (Haider et al., 1998).

Die NPH kann auch in Kombination mit Erkrankungen anderer Organe auftreten,

sogenannten extrarenalen Manifestationen. Hierzu zählen die Retinitis Pigmentosa

(Senior et al., 1961; L∅ ken et al., 1961), Leberfibrose (Boichis et al., 1973),

Knochenanomalien (Mainzer et al., 1970), zerebelläre Ataxie (Fontaine et al., 1970),

mentale Retardierung (Proesmans et al., 1975; Donaldson et al., 1985) und

Kleinhirnwurmaplasie (Dekaban et al., 1969).

Neben der autosomal rezessiv vererbten NPH wurde auch eine autosomal dominant

vererbte Form der Erkrankung beschrieben, wobei sich diese beiden Formen

histologisch nicht voneinander unterscheiden (Gardner et al., 1976). Das späte

Auftreten der Krankheitssymptomatik (terminales Nierenversagen) im dritten

Lebensjahrzehnt sowie das Fehlen extrarenaler Manifestationen stellen

charakteristische Merkmale der autosomal dominanten Form der Erkrankung dar. Diese

2

Erkrankungsform bezeichnet man heute als medullary cystic disease (MCD),

Markzystenkrankheit. Die Juvenile Nephronophtise und die Markzystenkrankheit

werden unter dem Begriff des “NPH-Komplexes” zusammengefaßt.

1.1.2 Epidemiologie

Die NPH ist bei weiblichen und männlichen Individuen mit der gleichen Häufigkeit

vorzufinden. Die Angaben über die Inzidenz der NPH unterliegen großen

Schwankungen, was zum einen auf die Seltenheit der Erkrankung, zum anderen auf die

schwer zu stellende Diagnose zurückzuführen ist. So gibt es Schätzungen von 9

Erkrankten pro 8,3 Millionen Lebendgeburten in den USA (Potter et al., 1980). In

Kanada liegen die Schätzungen bei 1 auf 50000 Lebendgeburten (Waldherr et al.,

1983).

In der Bundesrepublik Deutschland beträgt bei pädiatrischen Patienten mit chronischer

Niereninsuffizienz der Anteil der NPH 12% (Pistor et al., 1985).

Unter den Patienten, die vom NPH-Komplex betroffen sind, nimmt die isolierte NPH

einen Anteil von 56 % ein, NPH assoziiert mit Retinitis Pigmentosa (SLS:

Senior-L∅ ken-Syndrom) tritt bei 12% der Patienten auf, NPH in Kombination mit

Erkrankungen der Leber, des Skeletts oder des Zerebellums bei 2-5% der Patienten,

die MCD bei 30% (Gardner und Evan, 1979).

1.1.3 Klinik

Die ersten Symptome der NPH sind Polyurie, Polydipsie, verminderte

Harnkonzentrationsfähigkeit und sekundäre Enuresis. Sie treten bereits im Alter von

ungefähr 4 Jahren auf. Durch die progrediente Einschränkung der Nierenfunktion treten

eine schwere Anämie, renale Osteodystrophie sowie Wachstumsretardierung hinzu.

Das chronische Nierenversagen wird durchschnittlich im Alter von 13 Jahren erreicht.

Ein weiteres charakteristisches Merkmal bei Patienten mit NPH ist eine verminderte

Urinkonzentrationsfähigkeit unter 800 mosm/l nach einem 12-14 h langen Durstversuch

(Waldherr et al., 1984).

Im Vergleich zu anderen degenerativen Nierenerkrankungen ist für die NPH das Fehlen

von Ödemen, Hämaturie und Harnwegsinfektionen typisch. Trotz der Schwere der

Niereninsuffizienz ist das Auftreten von Hypertonie selten, da der

3

Salzverlust durch die Nieren stark ist.

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß aufgrund der unspezifischen

Anfangssymptome sowie des Fehlens von Ödemen und Bluthochdruck, die Diagnose

einer NPH oft erst dann gestellt wird, wenn die Kinder bereits ein chronisches

Nierenversagen aufweisen. Somit besteht für die erkrankten Kinder das Risiko, ohne

richtige frühzeitige Diagnose aufgrund von Störungen des Wasser- und

Elektrolythaushaltes zu versterben (Hildebrandt et al., 1992).

1.1.4 Pathologie und renale Histologie

Im Rahmen der NPH kommt es zu makro-und mikropathologischen Veränderungen

beider Nieren. Zu Erkrankungsbeginn weisen die Nieren eine normale Größe auf. Im

Endstadium der Erkrankung finden sich geschrumpfte Nieren mit dünnen und

atrophischen Rinden. Daher stammt die Wahl des Begriffs der “Nephronophthise”, des

“Nierenschwundes” (Bernstein und Gardner, 1979).

Renale histologische Veränderungen treten bereits im Frühstadium der Erkrankung auf.

Sie imponieren lichtmikroskopisch als tubulointerstitielle lymphohistiozytäre

Infiltrationen. Im weiteren Verlauf der Erkrankung kommt es zur Ausbildung

atrophischer und gewundener Tubuli im Bereich des kortiko-medullären Übergangs.

Elektronenmikroskopisch sind charakteristische Veränderungen der tubulären

Basalmembran (TBM) nachzuweisen. Zu diesen Veränderungen der TBM zählen deren

extreme Verdickung, Aufsplitterung in mehrere Lagen mit dazwischenliegenden

Fibroblasten sowie eine unregelmäßige Faltung.

Im Bereich der Glomeruli findet sich eine periglomeruläre Sklerose und eine

Verbreiterung der Bowmanschen Kapsel.

Im weiteren Verlauf der Erkrankung kommt es zur Ausbildung einer diffus

sklerosierenden tubulo-interstitiellen Nephropathie.

Bei ungefähr 70% der Patienten lassen sich multiple Zysten beobachten, welche von

den Sammelrohren ausgehen und einen Durchmesser von 1-15 mm zeigen. Diese

Zysten sind an der kortikomedullären Grenze gelegen und mit einer bernsteinfarbenen

Flüssigkeit gefüllt (Gardner et al., 1979). Andere Organe sind nicht von zystischen

Veränderungen betroffen (Gardner et al., 1979; Waldherr et al., 1982).

4

1.1.5 Ätiologie und Pathogenese

Die Ursache für NPH ist das Fehlen beider NPHP1 Gene auf Chromosom 2. Unklar

bleibt jedoch die Pathogenese der NPH. Die Fragen, warum die Nierenveränderungen

erst postpartal auftreten, warum sie bevorzugt an der kortikomedullären Grenze

lokalisiert sind, welches die Rolle interstitieller Infiltrationen und Sklerosen sind, bleiben

offen.

Als pathogenetischer Erklärungsversuch für das Auftreten der Nierenveränderungen im

Rahmen einer NPH galt die Annahme eines metabolisch-toxischen Defekts (Giselson et

al., 1970; Van Collenburg et al., 1978). Als Gegenargument hierfür ist jedoch die

Tatsache anzusehen, daß nierentransplantierte NPH-Patienten kein NPH-Rezidiv

entwickelten (Steele et al., 1980).

Da sich viele funktionelle sowie histologische Veränderungen im Bereich der Tubuli

abspielen, gehen viele pathogenetische Erklärungsversuche von dem Vorliegen einer

defekten tubulären Funktion aus. Für einen solchen Defekt sprechen die mangelnde

Harnkonzentrationsfähigkeit und die renalen Salzverluste, das frühe Auftreten einer

tubulärer Azidose in einigen Fällen, das seltene Auftreten einer Proteinurie, welche-

wenn vorhanden- vom tubulären Typ ist (Giselson et al., 1970) und der gestörte

Paraaminohippursäure-Transport (Weber et al., 1982).

Es bleibt weiterhin ungeklärt, ob die Veränderungen an der TBM als primär oder

sekundär anzusehen sind. Die Vermutung, daß es sich hierbei um einen primären

Defekt der TBM handelt, wird durch einen schwächer ausfallenden indirekten

Immunfluoreszenznachweis der TBM-Matrixkomponten bei Patienten mit NPH

unterstützt (Cohen und Hoyer, 1986). Dieser Mangel an Antigenstrukturen der TBM

könnte zu einer verminderten mechanischen Compliance der TBM führen. Die

verminderte mechanische Compliance wiederum kann als potentielle Ursache für die

Entstehung von Zysten angesehen werden. Denn im Tierversuch konnte nachgewiesen

werden, daß durch mutagene Schädigung der tubulären Basalmembranzellen eine

verminderte mechanischen Compliance induziert werden kann und es im weiteren

Verlauf auch zur Zystenbildung kommt (Carone et al., 1989).

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Theorien bezüglich der Zystenbildung beinhalten verschiedene Mechanismen. Zu

diesen zählen die verminderte Compliance der TBM (s. vorangegangener Abschnitt),

durch Epithelhyperplasie verursachte tubuläre Obstruktionen mit nachfolgender

Ausbildung von Tubulusdivertikeln (Waldherr et al., 1983) und der Nachweis von

Zytokinen (Gardner et al., 1991).

In einigen anderen Studien ließ sich ein direkter Zusammenhang zwischen einer

Senkung der intra- bzw. extrazellulären Kaliumkonzentration und vermehrter

Zellproliferation nachweisen (Saeki et al., 1986; Walsh-Reitz et al., 1983; Novak-Hofer

et al., 1988).

Des weiteren wurde ein Zusammenhang zwischen einer erhöhten tubulären Natrium-

Konzentration und einer Zystenausbildung gezeigt (Avner et al., 1985).

1.1.6 Diagnostik

Die Diagnosestellung einer NPH beruht auf der Anamnese, bildgebenden Verfahren

sowie der renalen Biopsie. Bei Vorliegen der typisch klinischen Symptome und bei einer

ev. vorhandenen positiven Familienanamnese sollte eine eindeutige Abgrenzung zu

anderen Nierenerkrankungen erfolgen. Nierenuntersuchungen durch Ultraschall und

Biopsie nehmen hierbei eine wichtige Rolle ein. Als histologisches Charakteristikum für

das Vorliegen einer NPH kann das Vorliegen einer sklerosierenden tubulointerstitiellen

Nephropathie gelten.

Es ist sinnvoll, Eltern und Geschwistern der betroffenen Individuen ebenfalls einer

Untersuchung hinsichtlich des Vorliegens einer NPH zu unterziehen. Dabei ist es

wichtig, außer Ultraschalldiagnostik und Biopsie eine Bestimmung der

Harnkonzentrationsfähigkeit durchzuführen. In einigen Studien wurde nachgewiesen,

daß bei Eltern betroffener Kinder verminderte Harnkonzentrationsfähigkeiten vorlagen

(Brouhard et al., 1977; Herdman et al., 1967; Mangos et al., 1964). Desweiteren sind

bei betroffenen Familien Stammbaumanalysen von Nutzen.

Da bei einem Teil der Erkrankten eine homozygote Deletion auf Chromosom 2q12

nachgewiesen werden konnte (s. Kap. 1.2), kann die Diagnosestellung einer NPH Typ 1

6

auch mittels einer Deletionsanalyse auf PCR-Basis erfolgen. Heterezygote

Deletionsträger sind mit dieser Analyse jedoch nicht detektierbar und diagnostizierbar.

Es gibt andere interstitielle Nephropathien, die von der NPH abzugrenzen sind. Zu

diesen zählen die chronische Pyelonephritis, die Gichtnephropathie (Burke et al., 1982),

die autosomal dominant vererbte (ADPKD) und die autosomal rezessiv vererbte

(ARPKD) polyzystische Nierenerkrankung, die Markschwammniere (Cacchi und Ricci,

1948) und die Nierenhypoplasie mit Oligonephronie (Lennert et al., 1975).

1.1.7 Therapie

Die Therapie der NPH ist rein symptomatisch. Ein möglichst früher Therapiebeginn

sollte angestrebt werden. Dies wird jedoch durch die späte Diagnosestellung der NPH

erschwert. Im Durchschnitt beträgt der Zeitraum zwischen Diagnosestellung und

terminalem Nierenversagen 3 Jahre (Pistor et al., 1985).

Das therapeutische Vorgehen beruht auf folgenden Prinzipien:

Einstellung der renalen Hypertonie

Regulation des Säure-Basenhaushaltes

Korrektur des Wasser-und Elektrolythaushaltes

Korrektur der Anämie z.B. durch Erythropoetingabe

Gabe von Vitamin D und Wachstumshormon

Bei Erreichen des terminalen Nierenversagens sind folgende Schritte indiziert:

Peritoneal- oder Hämodialyse

Nierentransplantation

7

1.2 Genetik

1.2.1 Allgemeine Aspekte

Die NPH stellt eine autosomal rezessive Erkrankung dar. Die Untersuchungen, die seit

der ersten Beschreibung des Krankheitsbildes erfolgten, wiesen bereits früh auf den

genetischen Hintergrund der Erkrankung hin. So wurde festgestellt, daß die Eltern

betroffener Kinder auffallend oft Konsanguinität demonstrierten (Balen und Van

Collenburg). Zudem wurde gezeigt, daß Mädchen und Jungen mit der gleichen

Häufigkeit an NPH erkranken (Waldherr et al., 1982). Ein weiterer Hinweis auf ein

erbliches Geschehen ist die Tatsache, daß bei 29 NPH-Patienten die Verschlechterung

der Nierenfunktion homogen verlief (Gretz et al., 1989). Außerdem wurde beschrieben,

daß sich Nierenversagen bei eineiigen Zwillingen übereinstimmend entwickelte

(Mongeau et al., 1967).

1.2.2 Tiermodelle

1971 wurde zum ersten Mal eine Mauslinie mit dem Namen kd (kidney disease) mouse

als Tiermodell für Nephronophthise beschrieben (Lyon and Hulse, 1971). Dieses Modell

weist ein der NPH sehr ähnliches klinisches und pathohistologisches Erscheinungsbild

auf. Neben den Frühsymptomen wie etwa Polyurie, Polydipsie und verminderte

Harnkonzentrationsfähigkeit, zeigen die kd-Mäuse Zystenausbildung sowie eine

mononukleäre Infiltration (Neilson et al., 1983). Studien, in denen ein T-Zell-Transfer

von kd-Mäusen auf HLA-kompatible Kontrollmäuse ohne Nierenerkrankung stattfand,

führten zu der Vermutung, daß die Inaktivierung der T-Suppressorzellen auslösender

Faktor der Erkrankung ist. Die Inaktivierung der T-Suppressorzellen führt zu einem

Toleranzverlust gegen ein 56 kD großes tubuläres Antigen und sukzessiv zur

Schädigung der tubulären Basalmembran in Form einer Autoimmunnephritis (Kelly und

Neilson, 1987). Die Tatsache, daß der Genlocus der Maus für kd auf Chromosom 10

(vergleichbar mit Chromosom 6 beim Menschen) liegt, der NPH1-Genlocus jedoch auf

Chromosom 2 liegt (s. Kap. 1.2.3), spricht gegen ein homologes Gen als Ursache der

Erkrankung.

8

Ein der Nephronophthise ähnliches Krankheitsbild konnte bei Mäusen festgestellt

werden, bei denen die Expression des Gens für Tensin, einem Signalprotein im

Zytoskelettaufbau, unterdrückt worden war. Diese Tensin-knock-out-Mäuse

entwickelten eine progrediente Nierendegeneration mit Zystenbildung (Lo et al., 1997).

1.2.3 Molekulare Genetik

1.2.3.1 Positionsklonierung des Gens für Nephronophtise

Die genetische Kartierung des Genlocus für NPH erfolgte mit Hilfe von

Kopplungsanalysen. Der Genort für NPH konnte hierbei auf Chromosom 2 lokalisiert

werden (Antignac et al., 1993).

Im weiteren Verlauf wurde durch Haplotypenanalyse einer großen NPH-Familie der

Genort für die Erkrankung auf ein Intervall von 15 cM eingegrenzt. Dieser Abschnitt

wird von den Markern D2S135 und D2S110 flankiert. Die zytogenetischen

Untersuchungen ergaben eine Lokalisation auf Chromosom 2p12-2q13 (Hildebrandt et

al., 1993).

Durch weitere Haplotypenanalysen gelang es, den Genlocus für NPH auf ein Intervall

von 5-7 cM einzugrenzen. Dieses Intervall wird durch die Marker D2S293/D2S340 und

D2S121 in der Region 2q13 begrenzt. Außerdem wiesen 4 von 23 untersuchten

Familien keine Kopplung mit Markern des Chromosom 2 auf. Somit wurde gezeigt, daß

bei NPH Genlocusheterogenie besteht. Aufgrunddessen wurde der Begriff

“Nephronophtise Typ 1” für den gefundenen Genort auf Chromosom 2q13 eingeführt

(Medhioub et al., 1994).

1995 wurden an 12 kleineren NPH1-Familien Haplotypenanalysen durchgeführt. Dabei

wurde ein 8 cM großes Intervall für die NPH1-Region bestimmt. Dieses Intervall wird

von den Markern D2S923 und D2S363 begrenzt. Bei der Untersuchung einer großen

Familie ließ sich der Genlocus zytogenetisch auf die Region zwischen 2q11.1 und

2q12.1 kartieren.

9

Da die begrenzenden DNA-Marker der NPH1-Region gefunden waren, bestand der

nächste Schritt aus dem Aufbau einer physikalischen Karte. Hierzu erfolgte ein

Screening von YACs aus der Mega-YAC-Genbank (Albertsen et al., 1990) mit vier in

der NPH1-Region liegenden Mikrosatellitenmarkern. Mit den so gefundenen

YAC-Klonen ließ sich ein partielles Contig zwischen den Markern D2S160 und IL1A

sowie D2S121 und D2S308 erstellen (Hildebrandt et al., 1995).

Durch die Verwendung neuer Mikrosatellitenmarker an 10 NPH1-Familien konnte die

genetische Karte verfeinert werden: die NPH1-Region konnte bei diesen Familien

zwischen dem proximalen Marker D2S1890 und den distalen Marker D2S1888 auf ein

2 cM großes Intervall eingegrenzt werden. Dieses Intervall mit einer maximalen Größe

von 3,5 Mb wurde durch ein YAC-Contig komplett abgedeckt (Konrad et al., 1995).

Parallel dazu wurde ein vollständiges, 7 Mb umfassendes YAC-Contig erstellt. Dieses

Contig erstreckt sich über die von Medhioub et al., 1994 beschriebenen Markergrenzen

für den NPH1-Genort.

Bei fast 80% der Patienten mit NPH ohne extrarenalen Organmanifestationen wurden

1996 große homozygote Deletionen von etwa 250 kb gefunden. Die Deletion liegt

zwischen zwei duplizierten und gleichzeitig invertierten Regionen. Dabei liegt das

telomerische Ende der Deletion innerhalb der distalen Duplikation (Konrad et al., 1996).

1.2.3.2 Identifikation des Gens für Nephronophtise Typ 1 (NPHP1) durch dieForschungsgruppe Hildebrandt et al., 1997

In der NPHP1-Region wurde zwischen den Markern D2S1893 und D2S1888 ein 30

PAC-Klone umfassendes PAC-Contig erstellt. Hierzu wurden am YAC-Klon 804H10

inter-Alu-PCRs durchgeführt. Mit den so amplifizierten Produkten wurde ein ”Screening”

einer ”PAC-library” vollzogen. Die PAC-Enden wurden ansequenziert und entsprechend

kartiert. Insgesamt wurden 36 neue STS-Marker (sequence-tagged-site markers)

generiert. Dies ließ das Erstellen einer hochauflösenden physikalischen Karte zu. Die

Deletionsregion konnte durch 8 aufeinanderfolgende Marker abgedeckt und von den

PAC-Klonen 107o20, 62p20 und 146c2 überspannt werden. Zusätzlich konnten 7 EST

(expressed sequence tag)-Klone in die NPHP1-Region kartiert werden. Zwei dieser

10

sieben EST-Klone (zc07a11 und yy63e10) lagen in der Deletionsregion und stellten

daher sehr gute Kandidaten für das Nephronophthise-Gen dar (Nothwang et al., 1998).

11

Abb

.1.1

ba c d e

12

Die Abbildung 1.1 zeigt das YAC/PAC-Contig und die transkriptionelle Karte der

kritischen NPHP1-Region auf Chromosom 2q12-q13 (Abb. entnommen aus Nothwang

et al., 1998).

A: hier wird die Anordnung aller STS-Marker gezeigt. Die Marker D2S1893 und

D2S1888, welche die NPHP1-Region flankieren, sind eingerahmt. Zwischen den

flankierenden Markern befinden sich zwei weitere Kästchen. Die darin angeführten

Marker befinden sich in der proximalen bzw. distalen Duplikation.

B: das minimale YAC-Contig, welches die kritische NPHP1-Region überspannt

C: die neuen STS-Marker zu sehen, die von PAC-Endsequenzen abgeleitet sind

(ausgefüllte Kreise: von T7-Primern abgeleitet, leere Kreise: von SP6-Primern

abgeleitet)

D: Das PAC-Contig: die horizontalen Linien sind PACs, die vertikal gestrichelten Linien

zeigen STS-Marker, welche mit den jeweiligen PAC-Klonen ein positives

Hybridisierungssignal ergaben

E: Partielle transkriptionelle Karte: Gene oder ESTs sind durch ausgefüllte Dreiecke

gekennzeichnet. Konnte die Transkriptionsrichtung festgestellt werden, so zeigen die

Dreiecke in die jeweilige Richtung. Die minimale homozygote Deletionsregion wird

durch einen Kasten gekennzeichnet.

Isolierung von NPHP1 cDNAsDurch Vergleich von PAC-Endsequenzen wurden zwei EST-Klone identifiziert, yy63e10

und zc07a11. Diese ESTs waren bei NPH-Patienten deletiert. Daraufhin wurde mit einer

aus zc07a11 generierten Sonde eine cDNA-Bank des menschlichen fetalen Gehirns

untersucht. Der Klon EO1 mit einer Länge von 3961 bp wurde isoliert und sequenziert.

Die Exon-Intron-Strukur wurde aufgeklärt. Es konnten 20 Exone gefunden werden, von

denen 18 eine durchschnittliche Größe von 95 bp hatten. Bei Exon 8 entdeckte man,

daß der offene Leserahmen an einem Stop-Codon endete. Dies führte zu dem

Verdacht, daß das Exon 8 bei der Transkription des Gens fakultativ herausgespleißt

werden konnte. Um den längsten offenen Leserahmen des Gens darstellen zu können,

wurde in einer Skelettmuskel-mRNA Genbank eine PCR zwischen den Exonen 7 und 9

durchgeführt. Dabei fand man einen Klon (EO3), bei dem die Sequenz, welche das

Stop-Codon enthielt, herausgespleißt war und der offene Leserahmen erhalten blieb.

13

Expression von NPHP1Eine Northern-Blot Analyse des cDNA-Klons ergab ein 4,5 kb langes mRNA Signal, das

vor allem im Skelettmuskel, aber auch schwach in Herz-, Nieren und Pankreasgewebe

nachweisbar war.

Sequenzhomologien zu SH3 DomänenMittels des BLAST-Programmes (National Center of Biological Information-NCBI)

wurden Datenbankvergleiche erstellt. Es konnten Sequenzhomologien der Exone 5 und

6 mit der src homologen Domäne 3 (SH3) aufgezeigt werden. SH3-Domänen sind

hochkonservierte Regionen. Sie kommen beispielsweise in GRB2-Proteinen bei

Mäusen und beim Menschen sowie in Proteinen von Caenorhabditis elegans und

Schizosaccharomyces pombe vor. Weitere Homologien die cDNA-Sequenz und die

davon abgeleitete Aminosäuresequenz betreffend konnten nicht gefunden werden.

Somit stand fest, daß ein neues Gen, NPHP1, gefunden war, das keinerlei

Verwandtschaft zu einer bisher bekannten Genfamilie aufweist.

Exon-Intron-Struktur des GensDie Exon-Intron-Struktur des Gens ist in Abb.1.2 dargestellt.

Charakterisierung der DeletionZur Durchführung der Deletionsanalysen wurde die genomische DNA von 22 multiplex

NPH Familien, die Kopplung mit NPHP1 aufwiesen, mit STS-Markern untersucht. Dabei

stellte sich heraus, daß 15 NPH Familien für die folgenden 8 STS-Marker deletiert

waren: cen-804/6-Zcb90-Zcb241-107o20S-146c2T-62p20T-765F2L-9657T7C-tel. Der

gemeinsame proximale Bruchpunkt der Deletion befand sich somit zwischen den

STS-Markern 9681S und 804/6. Für Familie 12 wurde ein alternativer proximaler

Bruchpunkt zwischen den STS-Markern Zcb90 und Zcb241 gefunden. Dieser

alternative Bruchpunkt befindet sich zwischen Exon 2 und Exon 3.

Der distale Bruchpunkt wurde auf das Intervall zwischen den Primern 57T7C5 und

57T7D eingegrenzt. Die distale Deletionsregion enthält den Großteil der NPHP1 3‘

untranslatierten Region, da der Marker HILZCB (5/2), der direkt nach dem Alu-Repeat

der 3‘ untranslatierten Region kartiert, ebenfalls deletiert ist.

Hiermit konnte gezeigt werden, daß fast das gesamte NPHP1-Gen bei den meisten

NPH Familien homozygot deletiert war.

14

Identifikation von MALLDas Intervall zwischen dem 3‘-Ende des Gens und dem telomerischen Ende der

Deletion hatte eine Länge von 11 kb. Diese 11 kb wurden sequenziert und durch

Datenbankvergleich auf kodierende Sequenzen hin untersucht. Dabei wurde das erste

Exon eines bekannten EST, MALL (”MAL-like”) genannt, gefunden. MALL weist 60%

Sequenzhomologie zum MAL-Gen, welches das T-Lymphozyten Reifungsprotein

kodiert, auf. Es stellte sich heraus, daß MALL sowie das MAL-Gen aus vier Exonen

bestehen.

Mutationsanalysen bei NPHP1-PatientenDa bei 16 von 22 multiplex Familien sowohl NPHP1 als auch MALL deletiert waren,

waren beide Gene Kandidaten für das Nephronophthise Typ-1 Gen. Um zu zeigen, ob

der Funktionsverlust beider Gene oder Mutationen in einem der beiden Gene

ausreichend ist für die Expression des NPH1-Phänotyps, wurden Patienten ohne

homozygote Deletion auf Punktmutationen hin untersucht. Mit der single-strand

conformation polymorphism (SSCP) Analyse wurde bei drei Familien eine heterozygote

paternale Deletion kombiniert mit einer heterozygoten maternalen Punktmutation

gefunden. Diese Punktmutationen im maternalen Allel führten in zwei Fällen zum

Verlust einer Spleißstelle und in einem Fall zu einer Nonsense-Mutation. Es fanden sich

keine Mutationen in den vier Exonen des MALL-Gens. Diese Ergebnisse sprachen stark

dafür, daß rezessive Mutationen im NPHP1-Gen für die Ausprägung des

NPHP1-Phänotyps notwendig sind (Hildebrandt et al., 1997).

15

Abb

. 1.2

Gen

stru

ktur

des

NPH

P1-G

ens

16

Abb.1.2 zeigt die genomische Struktur und die cDNA der Gene NPHP1 und MALL.

Exons sind als Rechtecke, Introns als Circumflexe, Alu-Sequenzen als vertikal

schraffierte Rechtecke dargestellt.(Abbildung entnommen aus Hildebrandt et al., 1997).

a: Position der potentiellen SH3-Domäne

b: Zusammengesetzte NPHP1-cDNA (aus den Sequenzen der cDNA-Klone c-f), die

den längsten offenen Leserahmen enthält. Die Exongröße in bp ist unterhalb der Exone

angegeben. In Exon 20 befindet sich ein TGA-Stop-Codon, an das sich eine 1380 bp

große 3‘-untranslatierte Region (3‘UTR) anschließt, die vier potentielle

Polyadenylierungssignale enthält.

c: der cDNA-Klon EO1 stellt möglicherweise eine unvollständig gespleißte prä-mRNA

dar, da im zweiten Teil des Exons 8 (genannt Exon 8‘) ein Stop-Codon (TAA) und ein

Polyadenylierungssignal (AATAAA) aus dem Transkript nicht herausgespleißt wurden.

Um Exon 9 zu spleißen, wird eine Splice-Donor-Stelle, die sich an ein Alu-repetitives

Element anschließt, genutzt. Vor dem Poly-A-Schwanz befindet sich kein normales

Polyadenylierungssignal, sondern eine A-reiche Region wie sie für Alu-repetitive

Elemente typisch ist.

d: EST yy63e10 stellt ein kurzes alternatives Transkript dar, das mit Exon 7 beginnt und

das Stop-Codon sowie das Polyadenylierungssignal von Exon 8‘ verwendet.

e: EST zc07a11 benutzt das erste Polyadenylierungssignal von Exon 20 und enthält vor

Exon 9 eine chimärische Sequenz. Diese Sequenz ist nicht Bestandteil des

NPHP1-Gens, da sie in keinem PAC-Klon der NPHP1-Region vorhanden ist.

f: Klon EO3 stellt ein RT-PCR-Produkt zwischen den Primern zcb(3)730 (von Exon 7)

und zcb1365 (von Exon 9) dar. Die Sequenzierung dieses Klons zeigte, daß es sich bei

Klon EO1 um ein unvollständig gespleißtes Transkript handelt.

g: Die Probe A wurde für die Northern Blot Analyse und zur Isolierung des Klons EO1

verwendet. Sie repräsentiert ein 1,114 kb großes PCR-Produkt aus der 3‘-kodierenden

Sequenz zwischen den Primern 146c2T-5 und Zco7A11-3.

h: Position der 4 Exone des MALL-Gens

i: Darstellung der PAC-Klone der NPHP1-Region

k: Position der STS-Marker der NPHP1-Region

l: Ausdehnung der gemeinsamen homozygoten Deletion in 15 NPH Typ1-Familien

17

1.2.3.3 Identifikation des Gens für Nephronophtise Typ 1 (NPHP1) durch dieForschungsgruppe Saunier et al., 1997

Noch im selben Jahr definierten Saunier et al. (1997) ein minimales Deletionsintervall,

das durch die drei BAC-Klone 183K24, 187E16 und 96G18 komplett abgedeckt wurde.

Durch Sequenzieren, cDNA-Selektion und computergesteuerte Analyse gelang es, zwei

transkriptionelle Einheiten zu charakterisieren: eine Einheit, genannt BENE (entspricht

“MAL” bei Hildebrandt et al., 1997). Es kodiert für ein MAL-ähnliches Protein

(T-Lymphozytenreifungsprotein). Das andere ist ein Gen, welches für 730 AS großes

Protein, das eine putative SH3-Domäne besitzt, kodiert. Letzteres wurde als NPH1-Gen

identifiziert, da ebenso wie bei Hildebrandt et al., 1997, die Kombination einer großen

Deletion in einem Allel und einer Punktmutation im anderen Allel zur Ausprägung des

NPH-Phänotyps führt.

Im Gegensatz zu Hildebrandt et al. kam bei der Forschungsgruppe Saunier et al., 1997

die Pulsfeldgelelektrophorese-Technik (PFGE) zum Einsatz (s. Kap. 5.3).

Durch den Einsatz von Markern, die aus BAC-Endsequenzen generiert waren, konnten

mittels PFGE bei 24 Patienten mit NPH homozygote Deletionen im NPH1-Bereich

nachgewiesen werden. Dazu wurde die Patienten- DNA mit dem Restriktionsenzym SfiI

verdaut und die Probe 921H4R, die in der Duplikation liegt, verwendet. Hierbei wurde

das normale 95 kb große zentromerische Fragment detektiert, nicht aber das normale

65 kb große telomerische Fragment.

Mit der Probe 183K24B, die in der Duplikation liegt, zeigten alle 24 Patienten das

normale 50 kb große zentromerische Fragment, aber nur 8 von ihnen das normale

75 kb große telomerische Fragment. Somit wurde demonstriert, daß unterschiedlich

große Deletionen vorliegen. Die minimale Deletionsregion für NPH1 ließ sich auf ein

Intervall von 205 kb zwischen zwei SfiI-Restriktionsschittstellen festlegen.

Für den telomerischen Deletionsbruchpunkt wurde postuliert, daß er in der

telomerischen Duplikation im Intervall zwischen den Markern 96G18B und 183K24B

liegt (hierzu s. Abb.1.3, entnommen aus Saunier et al., 1997).

18

A: Physikalische Karte der NPH1-Region. STS-Positionen und

SfiI-Restriktionsschnittstellen (F) sind durch vertikale Linien gekennzeichnet. Die

invertierte Duplikation ist durch Pfeile gekennzeichnet.

B: Das BAC-Contig, welches die Deletionsregion und das minimale Deletionsintervall

abdeckt. Die BAC-Klone, die sequenziert wurden, sind unterstrichen. Das minimale

Deletionsintervall von ca. 205 kb ist als weißes Rechteck dargestellt, die telomerische

Bruchpunktregion als liniertes Rechteck und die nicht deletierten Bereiche als

schwarze Rechtecke dargestellt.

C: Transkriptionelle Karte NPH1 Deletionsregion. Die genomischen Strukturen der

NPH1-Kandidatengene, BENE, IMAGE-Klone ID 179152 und ID 70593 und das

Pseudogen α-Centraktin sind eingezeichnet. Die telomerische Kopie der Duplikation ist

als schwarzes Rechteck dargestellt.

Abb.1.3

19

2. ZIELSETZUNG

Nach der Identifikation des Gens für Nephronophthise Typ 1 (s. Kap.1) galt der näheren

Charakterisierung der Deletionsregion und die Eingrenzung der Bruchpunktregion

besonderes Interesse. Daraus ergaben sich für diese Arbeit folgende Zielsetzungen:

1. Mit Hilfe genomischer Southern Blot Analysen sollten – alternativ zur PCR-Technik –

bei Familien mit Nephronophthise Deletionen nachgewiesen werden. Die

Deletionsanalyse mittels Southern Blot ist insofern bedeutend, da sie im Gegensatz zur

PCR-Deletionsanalyse durch Dosiseffekt den Nachweis heterozygoter Deletionen

erlaubt.

2. Durch Einsatz verschiedener Sonden, die in der Nähe des vermuteten Bruchpunktes

lagen, sollten die Deletionsbruchpunkte näher eingegrenzt werden.

3. Bei Familie 12, die eine kürzere Deletion aufweist, sollte der Deletionsbruchpunkt

identifiziert werden. Durch Detektion von junction fragments mit Hilfe des genomischen

Southern Blots sollten Aussagen über unterschiedliche Deletionen und die maximale

Entfernung der verwendeten Marker zum Bruchpunkt gemacht werden.

4. Durch nähere Eingrenzung der Deletionsbruchpunkte sollte nach

Pathomechanismen, die für die Deletion verantwortlich sein könnten, gesucht werden.

20

3. MATERIAL UND METHODEN

3.1 Patienten

Blutproben und Stammbäume aus Familien mit isolierter NPH, d.h. NPH ohne

extrarenale Manifestationen, wurden nach der Einwilligung der jeweiligen Patienten

gewonnen. Die Diagnosestellung einer NPH erfolgte durch einen Nephrologen. Dabei

diente als diagnostisches Kriterium die Entwicklung eines terminalen Nierenversagens

nach einer anfänglichen Symptomatik mit Polyurie, Polydipsie, verminderter

Harnkonzentrationsfähigkeit, Anämie und Wachstumsretardierung. Die Diagnose wurde

in allen Familien durch eine renale Biopsie bestätigt.

3.2 Genomische DNA

Genomische DNA wurde aus Lymphozyten nach Standardmethoden isoliert (Sambrook,

Fritsch, Maniatis, 1987). Die Lymphozyten wurden entweder direkt aus Venenblut oder

aus nach EBV-Transformation der Zellen angelegten Lymphozytenkulturen gewonnen.

3.2.1 EBV-Transformation von Lymphozyten

Um mehrfache Blutentnahmen bei den betroffenen Familien zu vermeiden, wurden die

Lymphozyten mit dem Epstein-Barr-Virus immortalisiert. Die mit EBV transformierten

Zellen können auch nach jahrelanger Aufbewahrung unter Tiefkühlbedingungen zur

DNA-Extraktion angezüchtet werden. Somit ist eine langfristige Verfügbarkeit der DNA

gewährleistet. Für die Transformation der Zellen wurde ein Protokoll angewandt,

welches von Ventura und Mitarbeitern (1988) eingeführt, sowie durch Zimmer (1989)

weiterentwickelt und modifiziert wurde.

Dabei wurden zu 2 ml einer heparinisierten, bei Raumtemperatur belassenen

Venenblutprobe 20 ml RMPI-Medium (RMPI-Medium mit 2 g/l NaHCO3, Fa. Seromed)

hinzugegeben und in einem verschlossenen Zentrifugenröhrchen 10 min lang bei

1400 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer sterilen Pipette abgesaugt und

verworfen. Dann wurde das Pellet in 0,75 ml RMPI und 20 %igem fetalen Kälberserum

21

resuspendiert. Anschließend wurden aus einer im Labor dauerhaft gezüchteten,

EBV-infizierten Affenzellkultur 2 ml zellfreier EBV-haltiger Mediumüberstand

entnommen, steril filtriert und der Probe zugegeben.

Die Anzüchtung der Zellen erfolgte in vier getrennten Ansätzen. In 25cm3-

Triangularflaschen (“Falcon”, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) wurden jeweils 2,5 ml

RMPI, supplementiert mit 20 %igem fetalem Kälberserum, vorgelegt. Danach wurden je

0,3 ml, 0,6 ml und 1,2 ml von der Zell-Virussuspension hinzugefügt. Diese Ansätze

wurden in einer 5 %igen Kohlendioxidatmosphäre bei 37 °C bebrütet. Das Medium

wurde 2 Mal pro Woche gewechselt, so daß nach ca. 2 bis 4 Wochen eine Zelldichte

von 5x105 Zellen/ml erreicht wurde. Der Zellklon konnte dann mit 10 %igem

Dimethylsulfoxid bei -70 °C eingefroren und zur dauerhaften Konservierung in flüssigem

Stickstoff bei -170 °C gelagert werden.

3.2.2 DNA-Extraktion mittels Ionenaustauschersäulen

Für die Extraktion der DNA wurde das Präparationskit der Firma Qiagen GmbH/Hilden

verwendet. Durch diese Methode läßt sich DNA sowohl aus Vollblut als auch aus

isolierten Lymphozyten gewinnen. Dabei ergeben sich Fragmente zwischen ca. 50 und

140 kb. Da die Effizienz der Extraktion großen Schwankungen unterliegt, liegt die DNA-

Ausbeute aus 5 ml Vollblut zwischen 10 und 100 µg.

Lyse

Bei der Lyse der zellulären Bestandteile des Blutes ist eine Stabilisierung der

Kernmembran nötig, um die DNA vor einer chemischen Degradation zu schützen.

Dabei wurden je 5 ml Vollblut mit jeweils 5 ml eiskalter C1-Pufferlösung (1 Teil) sowie

jeweils 15 ml sterilem Aqua bidest. (3 Teile) vermischt. Die Probe wurde in einem

verschlossenen 50 ml-Reagenzröhrchen 10 min lang auf Eis inkubiert. Das lysierte Blut

wurde bei 4° C für 15 min bei 3300 UpM zentrifugiert. Nach Dekantieren des

Überstandes wurde das Pellet mit 1 ml eiskaltem C1-Puffer und mit 3 ml eiskaltem,

sterilem Aqua bidest. (3 Teile) versetzt und anschließend resuspendiert. Unter gleichen

Bedingungen wurde erneut zentrifugiert und der Überstand verworfen. Zum Pellet

wurden 5 ml G2-Extraktionspuffer gegeben. Die Probe wurde mit dem Vortex-Mischer

22

resuspendiert. Nach Zugabe von 100 µl des Enzyms Proteinase K (20 mg/ml,

Fa. Merck, Darmstadt) wurde der Reaktionsansatz über Nacht (ca. 8 h) im 50° C

warmen Wasserbad inkubiert. Dabei dienten die beiden letzten Schritte der Lyse der

Kernmembranen und des Verdaus von Kernproteinen (Histone, kernspezifische

Enzyme).

Extraktion und Aufreinigung

Auf ein steriles 50 ml-Reagenzröhrchen wurde eine Qiagen-Ionenaustauschersäule

gesetzt und mit 4 ml QBT-Puffer äquilibriert. Dabei erfolgte der Durchfluß des Puffers

nur durch Schwerkraft und Kapillarkraft. Die Probe wurde mit dem Vortex-Mischer

gemischt und komplett auf die Säule gegeben. Nachdem die Probe die Säule passiert

hatte, wurde die Säule mit 10 ml QC-Puffer gewaschen. Im Anschluß daran wurde die

Säule auf ein neues, steriles Reagenzröhrchen gesetzt. Die DNA wurde aus dem

Austauscherharz mit 5 ml QF-Elutionspuffer eluiert.

Präzipitation

Zum Eluat wurden 3,5 ml (0,7 Teile) eiskaltes Isopropanol hinzugegeben. Die DNA

wurde durch manuelles Schütteln sichtbar präzipitiert. Dann wurde bei 4° C 15 min mit

5500 UpM zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurde die DNA mit 1 ml

eiskaltem 70 %igem Ethanol gewaschen, in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und ein

letztes Mal bei 14000 UpM pelletiert. Der Überstand wurde abpipettiert und die

erhaltene DNA 5 bis 10 min bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Das nun sichtbare

Pellet wurde in 300 µl TE-Puffer aufgenommen. Der Lösungsprozeß wurde durch die

kontinuierliche Durchmischung auf dem Schüttler beschleunigt.

Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA

Um die Konzentration der erhaltenen DNA zu bestimmen, wurde ein Aliquot (5 oder

10 µl) aus der Präparation entnommen, mit Wasser auf 500 µl (1:50 oder 1:100

Verdünnung) aufgefüllt und daraufhin in eine saubere Glasküvette überführt. Nun wurde

23

die DNA Konzentration der wässrigen Lösung durch Extinktionsmessung bestimmt.

Dabei entspricht eine Extinktion E260 nm von 1,0 einer Konzentration von 50 µg/ml an

doppelsträngiger DNA. Mit der Messung bei E280 nm und dem Bilden des Quotienten aus

E260 nm : E280 nm ließ sich die Verunreinigung der Probe mit Protein beurteilen. Eine

Verunreinigung lag bei Werten unter 1,7 vor.

3.3 Plasmidpräparation

PAC-Klone aus der NPHP1-Region wurden in Glycerin-Stocklösungen (0,85 ml LB-

Medium, 0,15 ml steriles Glycerin) bei -80° C aufbewahrt. Zur DNA-Präparation wurden

kleine Mengen Stocklösung steril entnommen, in das Nährmedium gegeben und

inkubiert. Die amplifizierten Plasmide konnten daraufhin der DNA-Präparation

unterzogen werden.

3.3.1 Plasmidpräparation nach Chowdhury

Die Methode von Chowdhury (1991) dient der Präparation von kleineren Plasmid-

Mengen. Hierzu wurden 0,5 ml Kulturen (LB- oder TB-Nährlösungen versetzt mit dem

entsprechenden Antibiotikum) in sterilen 10 ml Glasröhrchen mit 250 UpM bei 37° C

über Nacht (9-15 h) inkubiert. Jeweils 0,5 ml der gewachsenen Kulturen wurden in

Eppendorf-Röhrchen überführt und mit 0,5 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol

(25:24:1) versetzt. Der Ansatz wurde auf dem Vortexer gemischt und anschließend

5 min bei 15000 UpM zentrifugiert. Nun konnten 0,45 ml des oberen wässrigen

Überstandes vorsichtig abgenommen werden und in einem Eppendorf-Röhrchen mit

0,5 ml Isopropanol gefällt werden (Mischen mit dem Vortexer, 5 min Zentrifugation bei

15000 UpM). Danach wurde der Überstand dekantiert und das Pellet mit 0,5 ml

70 %igem Ethanol gewaschen (Mischen mit dem Vortexer, 5 min Zentrifugation bei

15000 UpM ). Im Anschluß daran wurde das Ethanol abpipettiert und das Pellet im

geöffneten Eppendorf-Röhrchen für ca. 3-5 min luftgetrocknet. Schließlich wurde das

Pellet in 30-50 µl TE-Puffer, bzw. Aqua bidest. gelöst. Es ließen sich hierbei bis zu 3 µg

Plasmid- DNA gewinnen.

24

3.3.2 Plasmidpräparation nach Birnboim und Doly

Die Plasmidpräparation nach Birnboim und Doly (1979) dient der Gewinnung größerer

Mengen hochreiner Plasmid-DNA. Diese Methode basiert auf dem Prinzip der

alkalischen Lyse chromosomaler DNA. Bei einem pH-Wert von 12-12,5 kann

chromosomale DNA denaturiert und ausgefällt werden, während die ringförmige

Plasmid-DNA als Doppelstrang erhalten bleibt. Über eine Ionenaustauschersäule läßt

sich diese DNA extrahieren. Zu diesem Zweck wurde das Midi Plasmid-Extraktionskit

(Fa. Qiagen) verwendet. Die im zugehörigen Qiagen Plasmid Handbuch beschriebene

Vorgehensweise wurde wie folgt modifiziert:

Aus Glycerin-Stockkulturen wurden Bakterien entnommen und in 2 ml LB- bzw TB-

Nährmedium inokuliert. Das Antibiotikum Kanamycin wurde der Lösung in einer

Konzentration von 25 µg/ml Nährmedium beigegeben. Der Ansatz wurde für ungefähr

8 h mit 250 UpM bei 37° C inkubiert. Diese Tageskulturen wurden in ein größeres

Medium-Volumen (60 ml) der gleichen Lösung transferiert und über Nacht unter

gleichen Bedingungen erneut inkubiert (12-16 h). Danach wurden die Ansätze in

Zentrifugenbecher (230 ml) gegeben und bei 3800 UpM und 4° C für 15 min

zentrifugiert (“Sorvall”). Der Überstand wurde dekantiert und das gewonnene Pellet mit

eiskaltem STE-Puffer resuspendiert. Unter Verwendung kleinerer Zentrifugenröhrchen

(35 ml) erfolgte eine weitere Zentrifugation unter gleichen Bedingungen. Nach

Dekantieren des Überstandes wurde dem Pellet 7,5 ml P1-Puffer mit RNAse A

zugegeben. Das Pellet wurde sorgfältig resuspendiert, so daß eine homogene Lösung

ohne Zellklumpen entstand. Durch die Zugabe von P2-Puffer und mehrfachem kräftigen

Schütteln wurden die Bakterien vollständig lysiert und die DNA sowie die Proteine

denaturiert. Um eine irreversible Denaturierung der Plasmide zu vermeiden, mußte

dieser Vorgang innerhalb von 5 min erfolgen. Der nächste Schritt bestand aus der

Addition von eiskaltem Neutralisationspuffer P3. Nach sofortigem Schütteln wurde das

Röhrchen 15 min auf Eis gelagert, wobei zusätzlich gelegentlich geschüttelt wurde.

Danach wurde bei 12000 UpM und 4° C für 30 min zentrifugiert (High-Speed-“Sorvall”).

Der DNA-haltige Überstand wurde vorsichtig in ein neues Zentrifugenröhrchen

transferiert und erneut bei 13000 UpM und 4° C für 30 min zentrifugiert. Der Überstand

wurde erneut überführt und die darin enthaltene Plasmid-DNA mit dem 0,7 fachen

Volumen (15 ml) Isopropanol gefällt. Die gefällte DNA wurde nach kurzem Schütteln für

30 min bei 12000 UpM und 4° C abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 0,5 ml TE-Puffer

25

gelöst, mit 3,5 ml QBT-Puffer versetzt und bei 12000 UpM für 2 min zentrifugiert.

Parallel hierzu erfolgte die Vorbereitung der „Qiagen tip 100 Säulen“ aus dem Qiagen

Kit. Die Säulen wurden mit 4 ml QBT-Puffer äquilibriert. Anschließend wurde das

QBT/DNA-Gemisch auf die Säule gegeben. Der Fluß erfolgte aufgrund der Schwerkraft

sowie der Kapillarkraft. Die an die Säule gebundene DNA wurde durch zweimaliges

Hinzufügen von je 10 ml QC-Puffer gewaschen. Die Säule wurde an ihrem unteren

Ende dicht mit Parafilm verschlossen. Nun wurden 5 ml, auf 37° C vorgewärmter, QF-

Puffer auf die Säule gegeben. Nach 10 min wurde der Parafilm entfernt und das

QF/DNA-Gemisch in ein frisches Zentrifugenröhrchen (35 ml) eluiert. Die Probe wurde

mit 2,5 fachen Volumen an 100 %igem Ethanol gefällt (Schütteln, 30 min bei 4° C,

zentrifugieren in “Sorvall”, 12000 UpM). Das weiße Pellet (wegen des hohen

Salzgehaltes) wurde mit 300 µl 70 %igem Ethanol gewaschen und bei 12000 UpM für

3 min zentrifugiert. Anschließend wurde das oftmals nicht mehr sichtbare Pellet in

0,5 ml TE-Puffer aufgenommen und in ein 1,5 ml-Röhrchen überführt. Es erfolgte eine

weitere Präzipitation mit dem 0,1fachen Volumen an 3 M Natriumacetat und dem

2,5fachen Volumen an 100 %igem Ethanol. Danach wurde mit 70 %igem Ethanol

gewaschen und bei 12000 UpM für 3 min zentrifugiert (“Haereus”). Schließlich konnte

das Pellet in 30-50 µl TE-Puffer aufgenommen werden. Die Proben wurden über Nacht

bei Raumtemperatur auf dem Schüttler durchmischt, so daß sich die Pellets komplett

lösen konnten. Bis zur Weiterverarbeitung wurde die DNA bei 4° C gelagert. Mit dieser

Methode ließen sich 50-100 µg hochreine Plasmid-DNA gewinnen.

Wenn nur kleine Mengen hochreiner DNA benötigt wurden, wurde das „Qiagen Mini Kit“

verwendet. Dabei wurden strikt die Angaben des Herstellers beachtet (Qiagen Plasmid-

Handbuch). Unter Verwendung von 3 ml Kulturen (LB Nährmedium) konnten bis zu

30 µg hochreine DNA extrahiert werden.

Für die photometrische Bestimmung des DNA Gehaltes der erhaltenen Probe wurde ein

Aliquot (5 µl) entnommen, mit sterilem Wasser auf 500 µl (1:100 Verdünnung) aufgefüllt

und die Extinktion im Photometer, wie schon in Kapitel 3.2.2 (s. unter photometrische

Konzentrationsbestimmung von DNA) beschrieben, gemessen.

26

3.4 Präzipitation von DNA

Mit der Fällung der DNA in wässriger Lösung wurde eine Konzentrierung und eine

Reinigung der DNA erzielt. Angewandt wurden sowohl Ethanol, -als auch Isopropanol-

Fällungen.

3.4.1 Ethanolfällung

Die wässrige DNA-Lösung wurde mit 2,5 Volumina eiskaltem 100 %igem Ethanol und

mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,3) bzw. mit ½ Volumen 7,5 M

Ammoniumacetat versetzt. Daraufhin wurde der Ansatz kurz geschüttelt und für 20 min

bei –20° C inkubiert. Anschließend wurde für 15 min bei 15000 UpM mit der Eppendorf-

Zentrifuge (“Haereus”) zentrifugiert, der Überstand vorsichtig abpipettiert, und das

erhaltene Pellet mit 500 µl 70 %igem Ethanol gewaschen. Nach erneuter kurzer

Zentrifugation und Verwerfen des Überstandes wurde das Pellet 5-10 min

luftgetrocknet. Schließlich wurde das Pellet in TE-Puffer gelöst und im Kühlschrank bis

zum Gebrauch gelagert.

3.4.2 Isopropanolfällung

Bei dieser Methode wurde der salzhaltigen DNA-Lösung 0,7 Volumina Isopropanol

hinzugefügt. Nach kurzem Schütteln und mindestens 10 minütiger Inkubation bei

Raumtemperatur wurde in der Eppendorf-Zentrifuge für 15 min bei 15000 UpM

zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 500 µl 70 %igem Ethanol gewaschen. Es wurde

erneut kurz zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Pellet kurz luftgetrocknet und in

TE-Puffer gelöst.

3.5 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen

3.5.1 Verdau von PAC-Klonen

PAC-Klone , P1-related artificial chromosomes, sind DNA-Klonierungssysteme in der

Zelle. Durch Verwendung von Teilen des Bakteriophagen P1 sowie des F (Fertiltäts)-

27

Plasmids wird die DNA durch extrakorporation in die Zellen eingeschleust (Strachan

und Read, Molekulare Himangenetik, 1996).

Der für den Southern Blot bestimmte Restriktionsverdau wurde mit 0,1-0,25 µg PAC-

DNA (pro Gelspur) durchgeführt. Um einen kompletten Verdau zu erzielen, wurden pro

µg DNA 3 Einheiten (Units “U”) des jeweiligen Restriktionsenzyms eingesetzt. Waren

die zu pipettierenden Volumina der Restriktionsenzyme zu klein ( z.B. bei einem Enzym

mit 25 U/µl), wurden 0,1 µl des jeweiligen Enzyms eingesetzt. Der Reaktionsansatz sah

folgendermaßen aus:

PAC-DNA X µl (100 ng)

Restriktionsenzym X µl (0,3 U)

Restriktionsenzympuffer (10x) 4 µl

Aqua dest. ad 40 µl

Der Reaktionsansatz wurde vorsichtig gemischt und für mindestens 2 h in ein

Schüttelwasserbad gestellt. Somit konnte der Verdau bei der für das Enzym optimalen

Temperatur erfolgen. Anschließend wurden die Reaktionsansätze mit Ladepuffer

gemischt und auf ein Agarosegel aufgetragen .

3.5.2 Verdau von genomischer DNA

Beim Verdau von genomischer DNA wurden 20 µg DNA pro Reaktionsansatz

verwendet. Es wurden pro µg DNA 3 U des entsprechenden Enzyms dazugegeben. Der

Reaktionsansatz sah folgendermaßen aus:

DNA X µl (20 µg)

Restriktionsenzym 2 x 30 U

Restriktionsenzympuffer (10x) 40 µl

Aqua dest. ad 400 µl

Zur Vermeidung eines inkompletten Verdaus wurde dem Reaktionsansatz (DNA, Aqua

dest., Restriktionsenzympuffer) unter vorsichtigem Umrühren zuerst die Hälfte der

benötigten Menge an Enzym beigemischt. Dieser Reaktionsansatz wurde für eine

28

Stunde bei der für das Enzym optimalen Temperatur im Schüttelwasserbad inkubiert.

Anschließend wurde die zweite Hälfte der benötigten Menge desselben Enzyms

hinzugefügt. Dieser Ansatz wurde über Nacht im Schüttelbad belassen (14-18 h). Dem

Verdau folgte das Auftragen der Proben auf ein Agarosegel. Da die Taschen des Gels

nur ein Volumen von maximal 50 µl faßten, das Volumen des Reaktionsansatzes

jedoch 400 µl betrug, war eine Konzentrierung des Ansatzes durch Präzipitation

erforderlich. Die Präzipitation erfolgte mit 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat und

2,5 Volumen 100 %igem Ethanol. Der Ansatz wurde 20 min bei -20° C inkubiert und

anschließend in der Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert (“Haereus”, 20 min bei

15000 UpM). Nach vorsichtigem Abpipettieren des Überstandes wurde das Pellet kurz

luftgetrocknet und in 40 µl TE-Puffer aufgenommen. Anschließend wurde die Probe bei

geöffnetem Deckel für 10 min in ein 70° C warmes Schüttelwasserbad gestellt. Dadurch

konnte die Probe von den verbliebenen Ethanolrückständen befreit werden. Danach

konnten die Proben mit Ladepuffer gemischt und zur elektrophoretischen Auftrennug

auf ein Agarosegel aufgetragen werden.

3.6 Agarose-DNA-Gelelektrophorese

Mittels DNA-Gel-Elektrophorese wurden sowohl präparierte als auch amplifizierte DNA

oder durch Restriktionsverdau entstandene DNA-Fragmente untersucht. Dabei ließen

sich die Größe der DNA-Fragmente ermitteln sowie DNA-Mengen und DNA-Reinheit

abschätzen.

Dafür wurden in Abhängigkeit von der zu erwartenden Fragmentgröße Gele mit

0,7-1,5 % Agarose gegossen. Dabei wurden 50 ml bzw. 200 ml des

1xTBE-Elektrophoresepuffers mit der entsprechenden Menge an Agarose unter

regelmäßigem Schütteln erhitzt. Nachdem die Agarose vollständig in Lösung gegangen

war, folgte das Abkühlen des Gels auf 50° C. Anschließend wurden der Lösung 1%iges

Ethidiumbromid (0,05 µl/ml Gel) zugegeben. Nun konnte die Agarose auf einen

Gelschlitten der Größe 10 cm x 7 cm bzw. 20 cm x 20 cm gegossen werden. Nach

einiger Zeit polymerisierte die Agarose vollständig. Das feste Gel konnte dann auf dem

Schlitten in die Horizontal-Elektrophorese-Anlage gelegt werden. Der darin befindliche

1xTBE-Elektrophorese-Puffer mußte das Gel dabei vollständig bedecken. Daraufhin

wurden die Proben mit 1/5 Volumen Ladepuffer (6x) gemischt und bei 70 bzw.120 Volt

aufgetrennt. Die Laufzeit betrug in Abhängigkeit der Fragmentlänge der DNA 0,5-3 h.

29

Die elektrophoretische Auftrennung der für den Southern Blot bestimmten humanen,

genomischen DNA erfolgte unter abgeänderten Bedingungen. Hierbei wurden 0,7 %ige

Agarosegele mit 0,5xTBE-Laufpuffer gegossen. Die Proben wurden mit 6x Ladepuffer

(0,25 % (w/v) Bromphenolblau, 0,25 % (w/v) Xylen-Zyanol) bei einer Spannung von

30-35 Volt aufgetrennt. Eine ausreichende Auftrennung der DNA Fragmente erfolgte in

einem Zeitraum von 18-24 h.

Das elektrophoretische Auftrennen bei präparativen Gelelektrophoresen wurde

ebenfalls unter abgeänderten Bedingungen durchgeführt. Hierbei wurde “low melting

temperature” Agarose kombiniert mit 1xTAE-Elektrophoresepuffer eingesetzt. Die

angelegte Spannung mußte wegen der “low melting temperature” Agarose

entsprechend auf 50 Volt reduziert werden. Nach der Auftrennung konnten die DNA-

Fragmente durch UV-Licht sichtbar gemacht, ausgeschnitten und beispielsweise als

Sonde eingesetzt werden.

Als Längenmarker wurden je 0,5-1 µg der 100 base-pair-ladder (Life technologies) und

des λ-Hind-DNA-digest (Life technologies) eingesetzt.

Nach der elektrophoretischen Auftrennung wurden die Gele auf den UV-Schirm gelegt

und fotografiert.

3.7 Southern Blot

Mit dieser von Southern (1975) beschriebenen Methode lassen sich DNA-Sequenzen

nachweisen. Die DNA wird durch Restriktionsenzyme verdaut (s. Kap. 3.5) und die

resultierenden Fragmente werden dann ihrer Länge nach mittels Agarose-

Gelelektrophorese (s. Kap. 3.6) aufgetrennt. Die DNA wird anschließend in situ

denaturiert und auf eine solide Membran transferiert (geblottet), meist ein

Nitrozellulosefilter oder eine Nylonmembran. Der Transfer kann durch drei Verfahren

erfolgen: dem Kapillarblot, welcher in dieser Arbeit angewandt wurde, dem

elektrophoretischen Blot oder dem Vakuum-Transfer. Die relative Position der DNA-

Fragmente bleibt während des Transfers erhalten. Die auf der Membran fixierte DNA

wird mit einer radioaktiv markierten DNA-Sonde hybridisiert. Anschließend erfolgt eine

Autoradiographie. Dadurch lassen sich spezifische DNA-Banden (Sequenzen)

detektieren, welche komplementär zur Sonde sind.

30

3.7.1 Aufbau des Kapillarblots

500 g Gewicht

Glasscheibe

Zellstoff

Gel Whatman Papier

Nylon Membran

Sockel

Whatman Papier

20xSSC Puffer

Abb. 3.1Schematische Darstellung des Aufbaus eines Kapllarblots (s. auch Kap. 3.8.2 unter

Aufbau des Kapillarblots)

3.7.2 Blotten der DNA

Nach Abschluß der Gelelektrophorese wurde das zu blottende Gel auf dem UV-Schirm

mit Lineal fotografiert. Das Lineal sollte später als Längenmaß dienen, um die Größe

der mittels Hybridisierung erhaltenen DNA-Fragmente zu bestimmen. Das Gel wurde

danach wieder auf den Gelschlitten geschoben. Anschließend wurde nach Angaben

des Hestellers der “HybondTM-N+Membran- (Fa. Amersham) verfahren (S.5-7 des

„blotting-protocol“).

Depurinieren der DNANach Fotografieren des Gels wurde es in eine Wanne, welche 1000 ml 0,25 M HCl

enthielt, gelegt. Die Salzsäurelösung bewirkte ein Depurinieren der DNA. Dadurch sollte

ein effizienterer Transfer der DNA-Fragmente, welche größer als 10 kb waren, erreicht

werden. Die Wanne wurde auf dem Schüttler plaziert. Das Gel wurde auf niedrigster

Stufe geschüttelt, um ein Einreißen zu vermeiden. Nachdem das Blau des im Gel

sichtbaren Ladepuffers auf Grün umschlug (nach ca. 20 min), wurde das Gel nur noch

weitere 10 min in der Salzsäurelösung belassen.

31

Denaturieren der DNANun wurde die Salzsäurelösung verworfen, das Gel mit Aqua dest. vorsichtig gespült

und 1 l Denaturierungslösung (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH) in die Wanne gegeben. Das

Gel wurde unter kontinuierlichem Schütteln für 30 min in der Denaturierungslösung

belassen. Die Farbe des Ladepuffers schlug in dieser Zeit wieder auf Blau um.

Neutralisieren der DNADie Denaturierungslösung wurde verworfen, das Gel vorsichtig mit Aqua dest. gespült

und 500 ml Neutralisierungslösung (1,5 M NaCl; 0,5 M Tris-HCl pH 7,2; 0,001 M EDTA)

in die Wanne gegeben. Das Gel wurde für 15 min unter kontinuierlichem Schütteln in

der Neutralisierungslösung belassen. Anschließend wurde die Neutralisierungslösung

verworfen, das Gel mit Aqua dest. gespült und mit weiteren 500 ml frischer

Neutralisierungslösung 15 min lang neutralisiert.

Aufbau des KapillarblotsDer Aufbau des Kapillarblots erfolgte gemäß Abbildung 3.1. Eine Wanne wurde mit

20xSSC-Puffer gefüllt und ein Sockel (umgedrehter 20x20 cm-Elektrophorese-Schlitten)

darin plaziert. Danach konnte ein an den seitlichen Enden überhängendes Stück

Whatman-Papier auf den Sockel gelegt werden. Als das Papier vollgesogen war, wurde

das Gel auf das Whatman-Papier gesetzt. Eventuell vorhandene Luftblasen zwischen

Papier und Gel wurden durch Rollen mit einer Glaspipette beseitigt. Die auf 20x20 cm

zurechtgeschnittene Nylonmembran wurde für 2 min in 6xSSC-Puffer getaucht und

anschließend auf das Gel gelegt. Eventuell vorhandene Luftblasen wurden entfernt.

Danach wurden vier auf Gelgröße zurechtgeschnittene Stück Whatman-Papiere auf die

Nylonmembran gelegt, wobei die unteren zwei zuvor mit 20xSSC-Puffer befeuchtet

worden waren und die oberen zwei in trockenem Zustand waren. Schließlich wurden

auf dem Aufbau mehrere Lagen Zellstoff, eine Glasscheibe und ein Gewicht von

ungefähr 500 g plaziert. Der kapilläre Sog war nun gesichert. Um einen möglichst

vollständigen Transfer zu gewährleisten, wurde der Aufbau zwei Tage so belassen.

Nach Beendigung des Transfers wurden die Taschen des Gels mit schwarzem

Kugelschreiber auf der Membran nachgezeichnet. Somit ließen sich die fotografierten

DNA-Banden auf dem Gel mit späteren Hybridisierungssignalen auf der Membran direkt

vergleichen. Danach wurde die Membran 30 min lang luftgetrocknet. Währenddessen

wurde das Gel erneut mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Licht auf nicht

transferierte DNA hin untersucht. Anschließend wurde die Membran einer

32

zweiminütigen UV-Bestrahlung unterzogen, um so die transferierten Fragmente an die

Nylonmembran zu binden (UV-Crosslinking). Bevor der Blot zum ersten Mal hybridisiert

wurde, wurde er 5 min lang in 6xSSC-Puffer befeuchtet.

3.7.3 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) stellt eines der schnellsten und einfachsten

Verfahren dar, um DNA zu amplifizieren. Dabei lassen sich spezifische DNA-

Sequenzen aus geringen Mengen an DNA-Proben herstellen. Die DNA-Synthese wird

durch Zugabe von gegenläufigen Oligonucleotiden (+ Primer, - Primer)

Desoxynucleosid-Triphosphaten (dNTPs) als DNA-Bausteinen und einer

hitzebeständigen DNA-Polymerase des Bakteriums Thermophilus aquaticus

(Taq-Polymerase) ermöglicht.

Als DNA-Matritze (template) kam die DNA der präparierten PAC-Klone (s. Kapitel 3.3)

zum Einsatz. Dabei stellten die jeweiligen Oligonucleotidprimer die Anfangs-

und Endpunkte der zu amplifizierenden DNA dar.

Der Reaktionsansatz für die PCR sah folgendermaßen aus:

10x Puffer 2,5 µl

template (30 ng) X µl

+ Primer (18 µMol/µl) 1 µl

- Primer (18 µMol/µl) 1 µl

dNTP-Mix für Agarose 1 µl

Taq-Polymerase(5U/µl) 0,1 µl

Steriles Wasser ad 25 µl

Für die PCR wurden Mikrotiterplatten verwendet. In einem Eppendorf-Röhrchen wurden

der 10xPCR-Puffer, der dNTP-Mix, die Primer und das Wasser vermischt und so der

“Mastermix” hergestellt. Die template wurden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte

vorgelegt. Zu jedem Reaktionsansatz wurde 0,1 µl Taq-Polymerase hinzugegeben.

Abschließend wurde jeder Ansatz mit einem Tropfen Mineralöl versehen, um so ein

Austrocknen der Ansätze zu verhindern.

33

Die PCR wurde dann unter den nachfolgenden Bedingungen durchgeführt, wobei einige

Parameter variierten. So richtete sich die “Annealing” Temperatur nach den

Bindungseenergien der Primer, die Zeit für die “Extension” nach der Länge des zu

vervielfältigenden DNA-Abschnitts.

Temperatur Zeit

Initial Denaturation 94° C 4 min 1 Zyklus

Denaturation 94° C 30sec

Annealing z.B. 53° C 30 sec 30 Zyklen

Extension 72° C 30-90 sec

Final Extension 72° C 10 min 1 Zyklus

Die Reaktionsprodukte wurden nach Beendigung des Programms mit 6x Ladepuffer

vermischt und auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt (s. Kapitel 3.7).

3.7.4 Gewinnung der Sonde

DNA-Sonden wurden mittels PCR unter Verwendung entsprechender PAC-DNA als

template hergestellt. Die erhaltenen Produkte wurden mit Ladepuffer vermischt und

elektrophoretisch aufgetrennt. Hierzu wurde ein 1 %iges Agarosegel bestehend aus

“Low melting Agarose” eingesetzt. Nach Beendigung der Auftrennung wurde das Gel

unter dem UV-Schirm fotografiert. Dabei ließen sich Länge sowie DNA-Menge der

Sonde durch den Vergleich mit den zusätzlich aufgetragenen Längenmarkern

(100 base pair ladder, λ-Hind DNA III digest) ermitteln. Anschließend wurden die

Sonden unter UV-Licht mit einem jeweils frischen Skalpell aus dem Gel geschnitten.

Der nächste Schritt bestand in der Ermittlung des Gewichts der Gelbanden. Dazu wurde

eine Feinwaage benutzt. Nach dem Wiegen wurden die Gelbanden in ein kleines

Eppendorf-Röhrchen überführt. Pro Gramm Gelbande wurden 3 ml steriles Wasser

hinzugegeben. Nach kurzem Erwärmen des Eppendorf-Röhrchens konnte des

Endvolumen des Gel-Wasser-Gemisches abgelesen werden. Nun konnte die

Konzentration der DNA errechnet werden (abgeschätzte DNA-Menge

in µg/Endvolumen in ml).

34

3.7.5 Radioaktive Markierung der Sonden

Bei der radioaktiven Markierung der Sonde wurde nach dem RediprimeTM-Protokoll (Fa.

Amersham) verfahren. Die hier aufgeführten Mengen gelten für die Hybridisierung eines

Blots. Bei Verwendung mehrerer Membranen erfolgte eine entsprechende Modifikation.

Das dem Gel-Wasser-Gemisch, in welchem die Sonde enthalten war (s. Kapitel 2.9 ),

wurde 5-10 min auf 95° C erhitzt, um das Gel zu schmelzen und die DNA zu

denaturieren. Dann wurden 2,5-25 ng DNA entnommen und mit sterilem Wasser auf ein

Volumen von 45 µl aufgefüllt. Die Lösung wurde vorsichtig zum “Rediprime Labelling

Mix” gegeben, vermischt und kurz anzentrifugiert. Der Lösung wurden 5 µl 32P-

markiertes α-dCTP (etwa 10 mCi/ml) zugegeben. Der Reaktionsansatz wurde

wiederum kurz anzentrifugiert und im Anschluß daran bei 37° C für 30 min inkubiert.

Danach wurde ein Aliquot entnommen und in 3 ml Szintillationsflüssigkeit gegeben. Im

Szintillationsmeßgerät wurde die Radioaktivität des Aliquots bestimmt. Der

Reaktionsansatz wurde mit 0,5 Volumen 7,5 M Ammoniumacetat und 2,5 Volumina

100 %igem Ethanol gefällt, um nicht eingebaute Nukleotide zu entfernen (s. Kap. 3.4.1).

Anschließend wurde das Pellet in 200 µl TE-Puffer aufgenommen. Die inkorporierte

Radioaktivität wurde durch die Entnahme eines weiteren Aliquots bestimmt.

3.7.6 Prähybridisieren und Hybridisieren des Southern Blots

Für das Prähybridisieren und das Hybridisieren wurde das ExpressHybTM-Protokoll (Fa.

Clontech) der zugehörigen Hybridisierungslösung verwendet.

PrähybridisierenDie 20 cm x 20 cm großen Southern Blots wurden in Glasröhren gelegt und mit

10 ml ExpressHybTM-Hybridisierungslösung für 30 min bei 60° C im Hybridisierungsofen

prähybridisiert.

HybridisierenDie hergestellte Sonde (s. Kap. 3.7.5) wurde für 3min auf 95° C denaturiert und sofort

zu 10 ml frischer Hybridisierungslösung (60°C) gegeben. Nun enthielt jeder

ml Hybridisierungslösung ungefähr 1-2 Mio cpm Radioaktivität. Danach wurde der Blot

mit der Hybridisierungslösung für mindestens 5 h bei 60° C im Hybridisierungsofen

inkubiert.

35

3.7.7 Waschen der Blots

Nach Beendigung der Hybridisierung und Entsorgen der radioaktiven

Hybridisierungslösung wurde der erste Waschschritt mit Lösung 1 (2xSSC,

0,05 % SDS) durchgeführt. Die Blots wurden bei Raumtemperatur 20 min lang

gewaschen, wobei die Lösung mehrfach gewechselt wurde. Der zweite Waschschritt

wurde mit Lösung 2 (0,1xSSC, 0,1 % SDS) durchgeführt, wobei die Lösung drei Mal

jeweils nach 30 min gewechselt wurde. Nach Beendigung der Waschschritte wurden die

Blots in Plastikfolie eingeschlagen. Anschließend wurden die Blots in Kassetten mit

Verstärkerfolien gelegt. Auf einem Kodak-XRA-Film wurden die Blots bei –80° C für

24 h exponiert. Mit einer automatischen Entwicklermaschine wurden die Filme

entwickelt. Nach einer Exposition über Nacht wurde aufgrund der

Hintergrundschwärzung über eine längere Expositionszeit der Blots entschieden (ggf.

7 Tage).

3.7.8 Auswertung der Blots

Nach ausreichend langer Exposition wurden die Ränder des Blots und die

Markierungen der Geltaschen auf den Film übertragen. Die Längenmarker wurden auf

den Röntgenfilm übertragen (Foto mit Lineal neben Agarosegel). Dazu wurden die

einzelnen Banden des elektrophoretisch aufgetrennten Längenmarkers entsprechend

ihrer Größe und ihrer Entfernung von den Geltaschen auf halblogarithmisches Papier

übertragen. Dabei wurde auf der Abszisse die Entfernung der aufgetrennten

DNA-Banden von den Geltaschen in mm eingetragen. Auf der Ordinate erfolgte die

Größenangabe der DNA in kb. Die einzelnen Punkte wurden miteinander verbunden,

so daß annäherungsweise eine Gerade entstand. Anhand dieser Geraden ließ sich die

Länge jeder auf dem Film sichtbaren Bande ermitteln.

3.7.9 Wiederverwendung der Blots durch “membrane stripping”

Eine weitere Hybridisierung der geblotteten Nylonmebranen mit neuen Proben war

möglich, wenn die alte Probe von der Membran heruntergewaschen wurde.

Grundvoraussetzung hierfür war es, ein Austrocknen der hybridisierten Membran zu

verhindern. Dies wurde durch ein sorgfältiges Einpacken der Membran in Plastikfolie (s.

36

Kap 3.7.7) gewährleistet. Somit konnte das Waschen des Blots jederzeit erfolgen. Dazu

wurde die Nylonmembran bei 45 °C 30 min lang in 0,4 M NaOH inkubiert. Anschließend

wurde weitere 15 min bei ebenfalls 45 °C in 0,1xSSC, 0,1%SDS und 0,2 M Tris-HCl

(pH 7,5) inkubiert. Nach Abschluß des Waschvorgangs wurde für mindestens 24 h

autoradiografiert, um die Vollständigkeit des Waschvorgangs zu dokumentieren.

3.8 Nährmedien

LB (Luria-Bertani)-Medium 10 g Trypton

5 g Hefeextrakt

10 g NaCl

in 1000 ml H2O gelöst und autoklaviert

TB (Terrific Broth)-Medium 12 g Trypton

(nach Tartof und Hobbs 1987) 24 g Hefeextrakt

10 g NaCl

4 ml Glycerin

in 900 ml H2O gelöst und autoklaviert,

anschließend wurden 100 ml steriler

Phosphatpuffer

(0,17 M KH2PO4,0,72 M K2HPO4) hinzugegeben

3.9 Andere Lösungen und Chemikalien

C1-Puffer Fa. Qiagen, Hilden

C2-Puffer Fa. Qiagen, Hilden

dNTPs 10 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dGTP,

10 mM dTTP

(Fa. Invitrogen Corporation, San Diego, CA, USA)

Ethanol Fa. Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen

37

Isopropanol Fa. Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen

Glycerin Stocklösung 0,85 ml LB Nährlösung, 0,15 ml steriles Glycerin

(Fa. Sigma Chemie GmbH Deisenhofen)

Ladepuffer (6x) 0,25 % Bromphenolblau

0,25 % Xylencyanol

30 % (v/v) Glycerin in Wasser

Längenmarker 100 bp ladder

λ-HindIII DNA digest

Mineralöl Fa. Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen

P1-Puffer 50 mM Tris-HCl (pH 8,0)

10 mM EDTA

100 µg/ml RNAse A

(Fa. Qiagen, Hilden)

P2-Puffer 200 mM NaOH

1%SDS

(Fa. Qiagen, Hilden)

P3-Puffer 3 M Kaliumacetat (pH 8,3)

(Fa. Qiagen, Hilden)

PCR-Puffer (10x) 500 mM KCl

100 mM Tris-HCl (pH 8,3; bei 42 °C)

15 mM MgCl2(Fa. Perkin Elmers, Überlingen)

Phenol-Chloroform-

Isoamylalkohol (25:24:1) Roti�-Phenol/Chloroform gesättigt mit TE-Puffer

(10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na)

(Fa. Roth, Karlsruhe)

38

Prähybridisierungs- und

Hybridisierungslösung ExpressHybTM Hybridisation Solution

(Fa. Clontech, Palo Alto, USA)

QBT-Puffer 750 mM NaCl

50 mM MOPS (pH 7,0)

15% Ethanol

0,15% Triton-X24

(Fa. Qiagen, Hilden)

QC-Puffer 1 M NaCl

50 mM MOPS (pH 7,0)

15% Ethanol

(Fa. Qiagen, Hilden)

QF-Puffer 1,25 M NaCl

50 mM Tris-HCl (pH 8,5)

15% Ethanol

(Fa. Qiagen, Hilden)

Radionuklide α32 P-dCTP

(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)

SSC-Puffer (20x) 3 M NaCl

0,3 M Na-Citrat (pH 7,0)

SDS (10%) Natriumlaurylsulfat 10 % (w/v) in Wasser

(Fa. Roth, Karlsruhe)

STE-Puffer 0,1 M NaCl

10 mM Tris-HCl (pH 8,0)

1 mM EDTA (pH 8,0)

Szintillationsflüssigkeit Rotiszint� eco plus

(Fa. Roth, Karlsruhe)

39

TAE-Puffer 0,04 M Tris-Acetat

0,001 M EDTA

TBE-Puffer 0,09 M Tris-Borat

0,02 M EDTA

TE-Puffer (pH 7,4) 10 mM Tris-HCl (pH 7,4)

1 mM EDTA (pH 8,0)

3.10 Restriktionsnzyme

BamHI G↓GATCC

(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)

BglII A↓GATCT

(Fa. MBI)

DraI TTT↓AAA

(Fa. Pharmacia, Freiburg)

EcoRI G↓ AATTC

(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)

EcoRV GAT↓ATC

(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)

HindIII A↓AGCTT

(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)

PstI CTGCA↓G

(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)

PvuI CGAT↓CG

(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)

40

SalI G↓TCGAC

(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)

XbaI T↓CTAGA

(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)

XhoI C↓TCGAG

(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)

3.11 Primer und Sonden

EST yb08f05 Ressourcenzentrum Berlin

62p17A+ TGCTAGGTGCTGATTTCTGG

61p17A- CCAAAATCTTCAGATATCACC

Zcb198-c+ GGACATTAGGAGAAACCAGG

Zcb159+c- ATTCAGCTTGAACTAAATCCC

3.12 Materialien

Agarose Ultra Pure Agarose

(Fa. Life Technologies, Paisley, UK)

Low melting temperature-

Agarose NuSieve�GTG� Agarose

Fa. FMC Bioproducts, Rockland, USA)

DNA-Extraktionskit (Fa, Qiagen, Hilden)

Elektrophoreseeinheit Pharmacia LKB GPS 200/400 und

Gelelektrophoresis Apparatus GNA 200

41

(Fa. Pharmacia, Freiburg)

Feinwaage Sartorius Basic

(Fa. Sartorius, Göttingen)

Filme Kodak-X OMAT, 35x43 cm

(Fa. Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen)

Hybridisierungsofen Hybaid

(Fa. MWG Biotech, Hook& Tucker, UK)

Mikrotiterplatten (Fa. Techne LTD, Duxford, Cambridge, UK)

Nylonmembran HybondTM-N+ Nylonmembran

(Fa. Amersham, Arlington Heights, USA)

PCR-Maschine Thermal-Cycler Cyclogene PHC3

(Fa. Techne LTD, Duxford, Cambridge, UK)

Photometer Pharmacia LKB Ultraspect III

(Fa. Pharmacia, Freiburg)

Plasmidextraktionskit Qiagen�Plasmid Mini bzw. Midi Kit

(Fa. Qiagen, Hilden)

Schüttelinkubator Certomat R und Certomat HK

(Fa. B.Braun, Melsungen)

Schüttelwasserbad Schüttelwasserbad 1083

(Fa. GFL�, Burgwedel)

Szintillationsmeßgrät Tri-Carb 1900 liquid szintillation analyser

(Fa. Packard, Meriden, USA)

Tischschüttler Bender & Hobein

(Fa. IKA, Wilmington, USA)

42

UV-Leuchttisch (Fa. International Biotechnology Inc.,

New Haven, USA)

Vortex Janke & Kunkel

(Fa. Ika�-Labortechnik, Staufen i. Br.)

Whatman-Papier 3 MM

(Fa. Whatman Laboratory Products, Clifton, USA)

Zentrifugen Biofuge 15

(Fa. Heraeus Sepatech GmbH)

Sorvall Superspeed RC 2-B

(Fa. Norwalk, USA)

Eppendorf Centrifuge 5414

(Fa. Eppendorf Gerätebau, Netheler & Hinz GmbH,

Hamburg)

43

4.ERGEBNISSE

4.1 Allgemein

Zur Veranschaulichung der Ergebnisse sollen hier nochmals die Deletionsregionen

sowie die entsprechenden Bruchpunkte bei Familien mit Nephronophthise dargestellt

werden.

Abb. 4.1 zeigt schematisch die Ausdehnung der Deletion im Bereich des NPHP1 Gens.

Der Abbildung können die Positionen der im Rahmen dieser Arbeit verwendeten

Sonden sowie die Lage der als Positivkontrollen verwendeten PAC-Klone entnommen

werden.

A

Sond

e D

Sond

e C

Sond

e A

Sond

e B

107o20

62p20 (95 kb)

146c2 (50 kb)9657(=21h9)

B

C

50 kb

Abb.4.1A: Physikalische Karte der NPHP1- Region mit Darstellung der Deletionen sowie der invertierten Duplikationen (Inv. Dupl.)B: Darstellung der PAC-Klone, die die Deletionsregion überspannen.Die Größen der PACs 107o20 und 9657 konnten noch nicht genau ermittelt werden ( als Punkte dargestellt)C: Schematische Karte der relativen Position der Sonden

cen tel

Klassische Deletion (250 kb)Inv. Dupl.(100 kb)

Inv. Dupl.(100 kb)

Deletion F 12

Deletionsbruchpunkte:

Der “klassische” zentromer gelegene Deletionsbruchpunkt, den ca. 80% der

Nephronophthisepatienten aufweisen, wurde auf das Intervall zwischen den STS-

Markern 9681S und 804/6 festgelegt. Für Familie 12 wurde ein alternativer proximaler

Bruchpunkt zwischen den STS-Markern Zcb90 und Zcb241 gefunden. Dieser

alternative Bruchpunkt befindet sich zwischen Exon 2 und Exon 3 des NPHP1 Gens.

44

Der gemeinsame distale Bruchpunkt wurde auf ein Intervall zwischen den Primern

9657T7C5 und 9657T7D kartiert (Hildebrandt et al., 1997; s. Kap. 1).

Deletionsanalysen:

Die nachfolgend beschriebenen Experimente wurden mit DNA der Familien F9, F12,

F33 sowie F40 durchgeführt.

Familie 9 (F9):

Aus früheren PCR-Deletionsanalysen ist bekannt, daß die Eltern der Familie 9

heterozygote Träger und die beiden Kinder homozygote Träger einer Deletion im

Bereich des NPHP1-Gens sind (Hildebrandt et al., 1997).

Familie 12 (F12):

Frühere PCR-Analysen ergaben, daß bei der Mutter von F12 der zentromer gelegene

Bruchpunkt zwischen Exon 2 und Exon 3 liegt, der Vater dagegen die “klassische”

größere Deletion im NPHP1-Gen aufweist. Die ersten drei Kinder der Familie sind von

beiden Deletionen im NPHP1-Gen betroffen, das vierte Kind hingegen ist gesund

(Hildebrandt et al., 1997).

Familie 33 (F33)/ Familie 40 (F40) :

Mit SSCP-Mutationsanalysen und anschließender Sequenzierung stellte man fest, daß

die Mütter von Familie 33 und Familie 40 Trägerinnen einer Punktmutation im

NPHP1-Gen sind, während die Väter beider Familien Träger einer heterozygoten

Deletion sind (Hildebrandt et al., 1997). Punktmutation sowie heterozygote Deletion

wurden an die Kinder vererbt (s. Diskussion, Kap. 5).

4.2 Deletionsanalyse im Bereich der distalen Bruchpunktregion

4.2.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markiertenSonde (Sonde A) im 3‘-Bereich des NPHP1-Gens

Da der gemeinsame distale Bruchpunkt mittels PCR auf ein Intervall zwischen den

Primern 57T7C5 und 57T7D eingegrenzt wurde (Hildebrandt et al., 1997), sollte die

Deletion mittels Southern Blot- Hybridisierung bestätigt sowie der Bruchpunkt näher

charakterisiert werden. Hierzu wurde eine genomische Hybridisierungssonde (Sonde A)

10 kb stromabwärts des 3‘-Endes des NPHP1-Gens verwendet. Die ca. 500 bp lange

Probe wurde mittels PCR mit den beiden STS-Primern 9657 T(1) sowie 9657 T7F3

45

hergestellt und radioaktiv markiert. Als Restriktionsenzym für den Southern Blot wurde

BamHI verwendet. Die Abb. 4.2 zeigt einen Ausschnitt der Autoradiographie nach

erfolgter Hybridisierung.

Spur: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

1,2 kb

BamHI

F9-1

-1F9

-1-2

F9-2

-1F9

-2-2

F12-

1-1

F12-

1-2

F12-

2-1

F12-

2-2

F12-

2-3

------

-F3

3-1-

1F3

3-1-

2F3

3-2-

1F3

3-2-

2F4

0-1-

1F4

0-1-

2F4

0-2-

1

F40-

2-3

146c

2

F40-

2-2

9657

Abb. 4.2

Ausschnitt aus der Autoradiographie eines Southern Blots mit der BamHI verdauten

DNA der Familien 9, 12, 33, 40 sowie der PACs 146c2 und 9657 nach Hybridisierung

mit der Sonde 9657 T(1)/ 9657 T7F3 (Sonde A). Die PACs (Spur 20-21) lassen ein

starkes Hybridisierungssignal bei 1,2 kb erkennen. Bei den Familien, die nur Deletion

aufweisen (F9 in Spur 1-4, F12 in Spur 5-9), zeigen die betroffenen Kinder (2-1, 2-2, 2-

3) im Vergleich zu ihren Eltern (Väter jeweils 1-1, Mütter jeweils 1-2) keine Bande bei

1,2 kb. Bei den Familien, die eine Punktmutation in Kombination mit einer

heterozygoten Deletion besitzen (F33 in Spur 1-14, F40 in Spur 15-19 ), zeigen die

betroffenen Kinder (2-1, 2-2, bzw. 2-3) dieselbe 1,2 kb große Bande wie ihre Eltern

(Väter jeweils 1-1, Mütter jeweils 1-2).

Die erfolgreiche Hybridisierung demonstriert bei den Vätern und Müttern der Familien 9

und 12 ein 1,2 kb großes Fragment; den homozygot von der Deletion betroffenen

Kindern dagegen fehlt das 1,2 kb große Fragment. Bei den Kindern sind diese im 3‘-

Bereich des NPHP1-Gens verwendeten Marker deletiert. Für die Famlien 33 und 40 gilt,

daß bei allen Individuen ein Fragment von 1,2 kb Länge zu sehen ist. Die betroffenen

46

Kinder zeigen ebenfalls dasselbe Signal, da eine Punktmutation sowie eine

heterozygote Deletion an sie vererbt wurden (s. Diskussion, Kap. 5).

Dieses Experiment zeigt, daß der bisher postulierte distale Bruchpunkt nicht wie

vermutet zwischen den Deletionsmarkern 57T7C5 und 57T7D liegt. Er muß sich distal

der verwendeten Sonde A befinden, da die Kinder der Familien 9 und 12 in diesem

Bereich der Sonde eine Deletion aufweisen (s. Diskussion, Kap. 5).

4.2.2 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit dem EST yb08f05 (Sonde B)

Der EST yb08f05 (Probe B) kartiert distal der Probe 9657 T(1)/9657 T7F3 (s. 4.2.1) und

proximal des telomer gelegenen etwa 100 kb großen inverted repeats (s. Abb. 4.1).

Aufgrund der Ergebnisse aus 4.2.1 sollte untersucht werden, ob der Bruchpunkt noch

vor dem telomer gelegenen inverted repeat liegt oder nicht. An seinem 5‘-Ende war der

EST mit einer EcoRI-Restriktionsschnittstelle, an seinem 3‘-Ende mit einer XhoI-

Restriktionsschnittstelle in den Plasmid-Vektor kloniert worden. Um den EST als Sonde

für die Hybridisierung von Southern Blots einzusetzen, wurde ein Restriktionsverdau mit

den Enzymen EcoRI und XhoI durchgeführt. Nach erfolgter Inkubation wurde der

Ansatz auf ein low-melting Agarosegel geladen und elektrophoretisch aufgetrennt.

Hierbei zeigten sich zwei Fragmente: ein 1,3 kb Fragment sowie ein 0,5 kb Fragment,

die auf eine interne EcoRI-Restriktionsschnittstelle zurückzuführen waren. Als Sonde

wurde das 1,3 kb Fragment verwendet.

47

Die Abb. 4.3 zeigt einen Ausschnitt aus der Autoradiographie des mit dem

Restriktionsenzym PstI hergestellten genomischen Southern Blots nach erfolgter

Hybridisierung.

Spur: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

PstI

F9-1

-1F9

-1-2

F9-2

-1F9

-2-2

F33-

1-2

F33-

2-1

F33-

2-2

------

-96

57

F12-

1-1

F12-

1-2

F12-

2-1

F12-

2-3

F33-

1-1

4 kb

2 kb

Abb. 4.3

Ausschnitt aus der Autoradiographie eines Southern Blots mit der DNA von Familie

9,12, 33 sowie des PACs 9657 nach Hybridisierung mit dem radioaktiv markierten

1,3 kb-Fragment des EST yb08f05. Die Eltern (Väter jeweils 1-1, Mütter jeweils 1-2) von

Familie 9 und 12 zeigen ein Fragment bei 4 kb Länge, die homozygot deletierten Kinder

dagegen nicht (2-1, 2-2, bzw. 2-3). Bei Familie 33 (F33) zeigt der Vater (1-1) ein

Fragment bei 2 kb Länge. Die Mutter (1-2) sowie die betroffenen Kinder (2-1, 2-2)

lassen das 4 kb große Fragment erkennen. Der PAC läßt ein deutliches 4 kb großes

Fragment erkennen.

Bei den gesunden Eltern der Familien 9 und 12 sieht man ein Fragment von 4 kb

Länge. Den erkrankten Kindern dagegen fehlt das 4 kb-Fragment, da sie im Bereich der

Sonde deletiert sind.

Beim Vater sieht man ein Fragment von 2 kb Länge, das als ”aberrantes” Fragment

klassifiziert wurde (s. Diskussion, Kap.5). Die Mutter sowie die Kinder zeigen ein

Fragment von 4 kb Länge. Da die Kinder auf dem mütterlichen Allel eine Punktmutation

und auf dem väterlichen eine große Deletion im Bereich des NPHP1-Gens besitzen,

zeigen sie dasselbe Fragment wie nicht deletierte Individuen.

48

Durch Demonstration von homozygoten Deletionen im Bereich des EST yb08f05 wird

gezeigt, daß der distale Deletionsbruchpunkt stromabwärts, in Richtung telomer

gelegener invertierter Duplikation liegen muß.

4.3 Deletionsanalyse am proximalen Bruchpunkt bei Familie 12

4.3.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markiertenSonde (Sonde C) im Bereich des vermuteten proximalen Bruchpunkts

PCR-Deletionsanalysen ergaben, daß bei Familie 12 die Deletion im NPHP1-Gen

kürzer ist als bei den anderen NPH-Familien. Während der Vater von Familie 12 Träger

der ”großen” Deletion ist, besitzt die Mutter eine kürzere Deletion. Den an

Nephronophthise erkrankten Kindern wurde die größere Deletion des Vaters und die

kürzere Deletion der Mutter vererbt (Hildebrandt et al., 1997).

Zur Charakterisierung des für Familie 12 spezifischen proximalen Bruchpunkts wurde

aus der Sequenz von Intron 2 des NPHP1-Gens mit den beiden STS-Primern

Zcb 198-c+ sowie Zcb159+c- mit Hilfe einer PCR-Reaktion eine Sonde von 1,9 kb

Länge amplifiziert und radioaktiv markiert (Sonde C in Abb. 4.1). Weiterhin wurde ein

Southern Blot hergestellt, indem DNA mit acht verschiedenen Restriktionsenzymen

verdaut wurde. Dieser Southern Blot wurde mit der DNA der Mutter von Familie 12 und

eines erkrankten Kindes sowie DNA des PAC 62p20 hergestellt. Hierzu wurden die

Restriktionsenzyme BglII, DraI, EcoRI, EcoRV, HindIII, PvuII, SalI und XbaI verwendet

und in der Reihenfolge ihrer Aufzählung bei der Herstellung des Blots aufgetragen.

Abbildung 4. 4 und 4.5 zeigen die Autoradiographie der Southern Blots nach erfolgter

Hybridisierung. In Abbildung 4.4 ist die genomische DNA einzelner Individuen aus

Familie 12, in Abbildung 4.5 sind die dazugehörigen Positivkontrollen mit dem PAC

62p20 dargestellt.

Die Ergebnisse beider Experimente sind in Tabelle 4.1 zusammengestellt.

49

Spur: 1 2 3 4 5 6 7 8

DraI

EcoR

I

Hind

IIII

PvuI

ISa

lI

EcoR

V

XbaI

BglII

F12-1-2 F12-2-3

23 kb

9 kb

6 kb

4 kb

Abb. 4.4

Autoradiographie eines Southern Blots mit der DNA von Individuen aus Familie 12 nach

Hybridisierung mit der radioaktiv markierten Sonde Zcb 198-c+/ Zcb 159+c- (Sonde C in

Abb.4.1).

Die Mutter von Familie 12 (1-2) zeigt mit dem Restriktionsenzym BglII ein Fragment von

12,2 kb Länge (Spur 1), mit DraI zwei von 1,1 kb und 0,75 kb Länge (Spur 2) , mit

EcoRI zwei von >33 kb und 16 kb Länge (Spur 3) und mit EcoRV ein Fragment von 15

kb Länge (Spur 4). Beim erkrankten Kind von Familie 12 (2-3) sind nach Verdau mit

dem Restriktionsenzym HindIII zwei Fragmente von 9 kb und 3,1 kb Länge zu

identifizieren (Spur 5), mit PvuI eines von 14 kb Länge (Spur 6), mit SalI eines von >23

kb Länge (Spur 7) und mit XbaI zwei von 10 kb und 4,9 kb Länge (Spur 8).

50

BglII

62p20

Spur: 1 2 3 4 5 6 7 8

DraI EcoRI

EcoRV

HindIII

SalIPvuI

XbaI

23 kb

9kb

6 kb

4 kb

Abb. 4.5

Autoradiographie eines Southern Blots mit der DNA des PAC 62p20 nach

Hybridisierung mit der radioaktiv markierten Sonde Zcb 198-c+/ Zcb 159+c- (Sonde C in

Abb. 4.1). Deutlich Signale sind zu erkennen für BglII bei 12,2 kb (Spur 1), für DraI bei

1,1 kb sowie 0,5 kb und 0,3 kb (Spur 2), mit EcoRI bei 16 kb (Spur 3), mit EcoRV bei 15

kb (Spur 4), mit HindIII bei 9 kb und 3,1 kb (Spur 5), mit PvuII bei 14 kb (Spur 6), mit

SalI bei >23kb (Spur 7), mit XbaI bei 10 kb und 4,9 kb (Spur 8) (s. auch Tab. 4.1).

Mit diesem Experiment sollte der proximale Bruchpunkt bei Familie 12 näher

charakterisiert werden, z.B. durch Erstellen einer partiellen Restriktionskarte in diesem

Bereich. Außerdem war von besonderem Interesse, ein Fusionsfragment (junction

51

fragment) zu detektieren. Daher wurden die Banden, die bei Familie 12 zu sehen waren

(Abb.4.4) mit denen der Positivkontrollen (Abb.4.5) in Tabelle 4.1 verglichen.

BglII DraI EcoRI EcoRV HindIII PvuII SalI XbaI

Genom

DNA

12,2 kb 1,1 kb/

0,75 kb

>33 kb/

16 kb

15 kb 9 kb/

3,1 kb

14 kb >23 kb 10 kb/

4,9 kb

62p20 12,2 kb 1,1 kb/

0,5 kb/

0,3 kb

16 kb 15 kb 9 kb/

3,1 kb

14 kb >23 kb 10 kb/

4,9 kb

Tab. 4.1

Tabellarische Zusammenfassung der genomischen Fragmente sowie der Fragmente

des PAC 62p20 nach Hybridisierung mit der Sonde Zcb 198-c+/ Zcb 159+c- (Sonde C

in Abb. 4.1).

Die Fragmentlängen, die dieses Experiment mit den Restriktionsenzymen BglII, EcoRV,

PvuII und SalI lieferte, waren bei den Individuen der Familie 12 mit denen der den

Positivkontrollen identisch. Für die nähere Charakterisierung des Bruchpunktes waren

diese Ergebnisse daher unbedeutend.

Beim Restriktionsverdau mit DraI (Spur 2 in Abb. 4.4) zeigt die Mutter von F12 zwei

genomische Fragmente von 1,1 und 0,75 kb Länge. Dies führt zu der Annahme, daß die

Sequenz der 1,9 kb-Sonde eine bzw. mehrere DraI-Restriktionsschnittstellen besitzt (s.

Anhang: Sequenzierter Bereich Exon 1 und 2; s. Diskussion Kap. 5). Vergleicht man die

Fragmente mit denen der Positivkontrolle (s. Abb. 4.5), so stellt man fest, daß bei der

PAC-Kontrolle ein zusätzliches kleines Fragment zu sehen ist. Dieses (genomische

DNA) ist beim elektrophoretischen Auftrennen wahrscheinlich aus dem Gel gelaufen.

Darauf soll in der Diskussion näher eingegangen werden (s. Kap. 5).

Der Restriktionsverdau mit EcoRI (Spur 3 in Abb. 4.4) liefert bei der Mutter von F12

zwei Fragmente: ein Fragment mit einer Länge >33 kb, sowie ein 16 kb-Fragment.

Vergleicht man dieses Ergebnis mit dem aus der Positivkontrolle (s.Abb.4.5), so stellt

man fest, daß die PAC-DNA lediglich ein Signal bei 16 kb aufweist. Dies führt zur

Annahme, daß es sich bei dem >33 kb-Fragment der Mutter um ein sog. junction

52

fragment handelt, das nach der Deletion aus Fusion der Chromatidenteile entstanden

ist. Darauf soll in der Diskussion (s. Kap. 5) näher eingegangen werden.

Beim Restriktionsenzym HindIII (Spur 5 in Abb. 4.5) sieht man beim dritten erkrankten

Kind von F12 zwei Fragmente von 9 sowie 3,1 kb Länge. Für die Positivkontrolle (s.

Abb. 4.5) liegt dasselbe Ergebnis vor. Dieses doppelte Signal weist darauf hin, daß in

der Sequenz der 1,9 kb-Sonde eine HindIII-Restriktionsschnittstelle enthalten ist (s.

Anhang: Sequenzierter Bereich Exon 1 und 2).

Mit dem Restriktionsenzym XbaI (Spur 8 in Abb. 4.4) zeigt das dritte erkrankte Kind von

Familie 12 zwei Signale: bei 10 kb sowie bei 4,9 kb Länge. In der Positivkontrolle ist

dasselbe zu sehen (s. Abb. 4.5). Diese beiden Signale weisen auf eine interne

XbaI-Restriktionsschnittstelle hin (s. Anhang: Sequenzierter Bereich Exon 1 und 2).

4.3.2 Wiederholung des Experiments aus 4.3.1

Durch die Wiederholung des Experiments aus 4.3.1 sollte zum einen seine

Reproduzierbarkeit gezeigt werden, zum anderen eine bessere Auftrennung des >33 kb

großen junction fragments erzielt werden. Hierzu wurde ein neuer Southern Blot mit

dem Restriktionsenzym EcoRI und der DNA der Mutter sowie des ersten erkrankten

Kindes von Familie 12 durchgeführt. Dieser wurde erneut mit Sonde C hybridisiert. Das

Ergebnis ist in Abb. 4.6 zu sehen.

EcoRI

F12-

1-2

F12-

2-1

>33kb

16 kb

Abb. 4.6Autoradiographie eines Southern Blots mit der DNA der Mutter von F12 und des ersten

erkrankten Kindes von F12 nach Hybridisierung mit der radioaktiv markierten Sonde

Zcb 198-c+/ Zcb 159+c- (Sonde C in Abb. 4.1). Man erkennt bei der Mutter zwei

53

Banden: eine bei 16 kb und eine weitere bei >33 kb (junction fragment). Das erkrankte

Kind zeigt lediglich die >33 kb Bande (junction fragment).

Dieses Experiment zeigt folgende Ergebnisse: bei der Mutter sind zwei Fragmente zu

sehen, das Wildtyp-Fragment von 16 kb Länge sowie das junction fragment von >33 kb

Länge. Das zweite erkrankte Kind zeigt lediglich das junction fragment. Es ist eine

deutlichere Auftrennung der beiden erwarteten Fragmente gelungen.

4.3.3 Erstellung einer partiellen Restriktionskarte für den proximalen Bruchpunktbei Familie 12 nach Hybridisierung genomischer Southern Blots mit derradioaktiv markierten Sonde C

Mit Hilfe der in 4.3.1 erhaltenen Daten (s. Tab. 4.1) ließ sich eine partielle

Restriktionskarte für den proximalen Bruchpunkt bei Familie 12 erstellen (Abb.4.7).

Dazu wurden zum einen die Fragmentlängen derjenigen Positivkontrollen, die im

Bereich der Probe interne Restriktionsschnittsstellen aufwiesen zum anderen das

junction fragment verwendet. Desweiteren wurde die mittels Sequenzierung im

Forschungslabor gewonnene Sequenz im Bereich der Exone eins bis zwei

hinzugezogen. Dadurch sollten die Restriktionsschnittstellen überprüft und die

jeweiligen Fragmentgrößen genau ermittelt werden. Die Sequenz vor und nach Exon 1

ist im Anhang beigefügt.

Aufgrund folgender Fragmentgrößen und Restriktionsschnittstellen wurde eine

postulierte Restriktionskarte erstellt. Als Nullpunkt wurde der Beginn des Exon 1

festgelegt.

-0,505 bis ca.16 kb: 16kb großes EcoRI-Fragment

2,316 bis 4,259 kb: Sonde C (1,923 kb)

3,524 kb: XbaI-Restriktionsschnittstelle

3,581 kb: HindIII-Restriktionsschnittstelle

XbaI–Fragmente: 10 kb und 4,9 kb wegen interner Restriktionsschnittstelle im

Bereich der Probe

HindIII–Fragmente: 9 kb und 3,1 kb wegen interner Restriktionsschnittstelle im

Bereich der Probe

EcoRI-Fragmente: 16 kb Wildtyp Fragment und >33kb junction fragment

54

Die Restriktionsenzyme XbaI und HindIII lieferten wegen Restriktionsschnittstellen im

Bereich der Sonde C jeweils zwei Fragmente. Dabei stellte sich die Frage, welches der

beiden Fragmente zentromer bzw. telomer der Schnittstelle lag. Die HindIII

Restriktionsschnittstelle lag bei 3,513 kb. Wäre das 3,1 kb Fragment zentromer der

Schnittstelle, so hätte sich eine weitere HindIII Restriktionsschnittstelle bei 3,524-

3,1 kb= 424 kb befinden müssen. Da dies nicht der Fall war, ging man davon aus, daß

das 9 kb Fragment zentromer der Restriktionsschnittstelle lag, das 3,1 kb Fragment

telomer davon. Dieselben Überlegungen wurden für die XbaI Fragmente angestellt.

Dort fand sich ebenfalls keine entsprechende Restriktionsschnittstelle ca. 1,5 kb vor

Exon 1. Daher postulierte man, daß das 10 kb Fragment zentromer und das 4,9 kb

Fragment telomer der XbaI Restriktionsschnittstelle (3,513 kb) lagen. Für die Enden

der telomer gelegenen Fragmente ergaben sich folgende postulierte Positionen:

XbaI -Fragmentende telomer: ca.8,4 kb (da keine Sequenz vorhanden)

HindIII –Fragmentende telomer: ca.6,7 kb (da keine Sequenz vorhanden)

Diese beiden Fragmentenden stellten die letzten postulierten Restriktionsschnittstellen

vor dem proximalen Bruchpunkt der Familie 12 dar. Die nächste telomer gelegene

EcoRI Restriktionsschnittstelle war bei den erkrankten Individuen der Familie 12

deletiert (S.4.3.2). Beide Fragmentlängen (HindIII- Fragment, XbaI- Fragment) wurden

jeweils vom 16 kb großen EcoRI Wildtyp-Fragment subtrahiert. Daraus resultierten

folgende Fragmente (in Abb.4.7 ist nur das EcoRI/ XbaI- Fragment als liniertes

Rechteck dargestellt):

EcoRI/ HindIII- Fragment: ca.9 kb

EcoRI/ XbaI- Fragment: ca.7 kb

Daraus läßt sich folgern, daß der proximale Bruchpunkt von Familie 12 auf einen

Bereich von maximal 7 kb eingegrenzt werden kann. Dieses Ergebnis ist in Abb. 4.7

graphisch dargestellt.

Das junction fragment besitzt einen Anteil, der aus dem Bereich des distalen

Bruchpunktes stammt. Das linierte Rechteck ist durch Subtraktion (s. Berechnung im

Absatz zuvor) entstanden. Es steht für ein postuliertes Fragment und stellt gleichzeitig

den Fusionsbereich des junction fragments dar. Durch das EcoRI/ XbaI- Fragment

wird der Bereich des proximalen Deletionsbruchpunktes bei Familie 12 auf eine Länge

von ca. 7 kb eingegrenzt.

55

Abb.4.7 Partielle Restriktionskarte im Bereich des proximalen Deletionsbruchpunkts von Familie 12 mit Darstellung einesjunction fragments.Die einzelnen Restriktionsfragmente mit ihren Längen sind als Rechtecke dargestellt. Anfang und Ende der Rechtecke bzw.die Trenn-linien dazwischen stehen für Restriktionsschnittstellen. Dabei wurden die Restriktionsschnittstellen aus dem nicht sequenzierten Bereichpostuliert. Das durch Subtraktion des 4.9 kb XbaI-Fragments vom EcoRI Wildtyp Fragment entstandene Fragment wurde postuliert (liniert). Es erlaubt die Eingrenzung des proximalen Deletionsbruchpunktes bei F12 auf maximal 7 kb (8,5 kb- 15,5 kb). (Abkürzungen: Prb.C= Probe C; Seq. 1= Sequenzierter Bereich vor Exon 1; Seq. Bereich Ex.1/ 2= sequenzierter Bereich Exon 1/ 2)

0 kb 5 kb 10 kb 15 kb 20 kb

Xba I 10 kb 4,9 kb

SondeC

Hind III 9 kb 3,1 kb

EcoRI Wildtyp Fragment 16 kb

telcen

EcoRI junction fragment >33 kb

Xba I / EcoRI Fragment 7 kb

Fusionsbereich

25 kb 30 kb

Exon 1 Exon 3Exon 2

Seq.1 Seq.Bereich Ex1/2Fusionsbereich

4.4 Deletionsanalysen stromabwärts des vermuteten proximalen Bruchpunkts beiweiteren NPH-Familien

4.4.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markiertenSonde im Sp6-Bereich des PACs 62p20 (Sonde D)

In einer PCR wurde mit den STS-Primern 62p17A+ sowie 62p19A- eine ca. 1 kb große

Probe hergestellt (Sonde D, Abb.4.1). Die Probe kartiert am proximalen Ende des PAC

62p20 (Sp6-Ende). Nach Herstellung eines Southern Blots mit der DNA einzelner

Mitglieder der NPH-Familien 9, 12, 33 und 40 sowie der DNA der PACs 107o20 und

62p20 mit dem Restriktionsenzym PstI, efolgte die Hybridisierung mit Probe D.

Abbildung 4.8 zeigt die Autoradiographie dieses PstI-Blots.

56

PstI

5 kb

F9-1-1

F9-1-2

F9-2-1

F12-1-

1

F9-2-2

F12-1-

2

F12-2-

1

F12-2-

3

F33-1-

2

F33-1-

1

F33-2-

1

F40-1-

1

F33-2-

2

F40-1-

2

F40-2-

1

F40-2-

262

p20

107o

20

Spur: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Abb. 4.8Ausschnitt aus der Autoradiographie des Pst I- Southern Blots nach Hybridisierung mit

der radioaktiv markierten Sonde 62p17A+/62p17A- (Sonde D).

Alle Individuen der Familien 9 (Spur 1-4), 12 (Spur 5-8) und 40 (Spur 13-16) zeigen ein

5 kb langes Fragment. Bei Familie 33 weisen die Mutter sowie die beiden an NPH

erkrankten Kinder ein Fragment gleicher Länge auf, der Vater (Spur 9) dagegen nicht.

Die Positivkontrollen mit den PACs 107o20 sowie 62p20 lassen ein starkes Signal bei

5 kb erkennen.

Mit diesem Experiment wird demonstriert, daß alle Individuen der Familien 9, 12, 33 und

40 -mit Ausnahme des Vaters von Familie 33- ein Fragment von 5 kb Länge aufweisen.

Dies führt zum Schluß, daß sie für den Bereich dieses Markers nicht deletiert sind. Das

Fehlen des Hybridisierungssignals beim Vater von Familie 33, läßt auf eine homozygote

Deletion in diesem Bereich schließen. Da er phänotypisch gesund ist, ergeben sich

mehrere Fragen. In der Diskussion (Kap. 5) wird auf diese Problematik näher

eingegangen.

Die Positivkontrollen mit den PACs 62p20 und 107o20 zeigen ebenfalls ein Signal bei

5 kb.

57

5. DISKUSSION

5.1 Allgemein

Den Hintergrund für diese Arbeit lieferte die Identifikation des Gens für

Nephronophthise Typ 1. Nachdem der Genlocus für NPH anhand von

Kopplungsanalysen und FISH auf die zytogenetische Bande 2q13 festgelegt wurde,

wurden YAC- und PAC-Contigs für diese Region erstellt. Ungefähr 80 % der

NPH-Patienten zeigen in der Region 2q13 homozygote Deletionen. Durch weitere

Forschungsarbeit konnten innerhalb der Deletionsregion zwei Gene, NPHP1 und MALL,

identifiziert werden. Mutationsanalysen führten zum Schluß, daß rezessive Mutationen

im NPHP1-Gen für die Ausprägung des NPH-Phänotyps notwendig sind.

Diese Arbeit beschreibt den Nachweis von Deletionen bei Nephronophthise-Familien

mittels Southern-Blot Technik. Der Southern Bot stellt eine Alternative zur PCR dar, da

er durch Dosiseffekt auch den Nachweis heterozygoter Deletionen erlaubt. Außerdem

sollten durch dieses Verfahren die Deletionsbruchpunkte näher eingegrenzt werden.

Dabei waren bruchpunktnahe, nicht deletierte Marker besonders interessant, weil siebei Deletionsträgern fusionierte Fragmente, junction fragments, ergeben können.

Junction fragments entstehen, wenn ein bruchpunktnaher Marker ein Fragment

detektiert, dessen eine Restriktionschnittstelle ursprünglich in der Deletionsregion lag

und verlorenging. Somit kommt ein neues Fragment zustande, das durch die nächste

Restriktionsschnittstelle außerhalb der Deletionsregion definiert wird.

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, durch neu gewonnene Erkenntnisse bezüglich

der Bruchpunkte nach Pathomechanismen, die für die Deletion verantwortlich sein

könnten, zu suchen. Da das Genom des Menschen keine statische Einheit ist, treten

immer wieder verschiedene vererbbare Mutationen auf. Chromosomen können

verlorengehen oder hinzukommen, es kann zu Brüchen oder Verschmelzungen von

Chromatiden kommen. Zudem enthält das menschliche Genom einen hohen Anteil an

repetitiven DNA-Sequenzen. Auf die Wiederholungssequenzen wirken verschiedene

genetische Mechanismen ein, die zu Austauschvorgängen, Deletionen, Insertionen,

Duplikationen usw. führen können (Strachan, 1996; S.285; S.313).

58

5.2 Bisherige Charakterisierung der Deletionsbruchpunkte für NPHP1

Die bisherige Eingrenzung der Deletionsbruchpunkte durch Hildebrandt et al., 1997, sah

folgendermaßen aus:

Der gemeinsame proximale Bruchpunkt bei Familien mit Nephronophthise wurde auf

das Intervall zwischen den STS- Markern 9681S und 804/6 festgelegt. Bei Familie 12

dagegen- die eine alternative, kürzere Deletion aufweist- lag der proximale Bruchpunkt

zwischen den STS-Markern Zcb90- und Zcb241 somit zwischen Exon 2 und Exon 3des NPHP1-Gens.

Für den gemeinsamen distalen Bruchpunkt wurde postuliert, daß er zwischen den

Markern 57T7C5 und 57T7D liegt.

Die Forschungsgruppe Saunier et al., 1997, postulierte für den telomerischen

Deletionsbruchpunkt, daß er in der telomerischen Duplikation im Intervall zwischen den

Markern 96G18B und 183K24B liegt (hierzu s. Abb. 1.3).

5.3. Die Southern Blot Technik

5.3.1 Die Southern Blot Technik im Vergleich zu anderen molekularbiologischenTechniken

Die Southern Bot Technik stellt ein zur PCR-Technik alternatives Verfahren dar, da sie

im Gegensatz zur PCR-Technik aufgrund eines Dosiseffektes den Nachweis

heterozygoter Deletionen erlaubt.

Dem Southern Blot Verfahren liegt die Agarosegelelektrophorese zugrunde. Die

DNA-Fragmente wandern durch die Gelporen wie durch ein Sieb. Kurze Fragmente

wandern schneller als längere Fragmente. Oberhalb einer bestimmten Größe passen

kompakte DNA-Fragmente nicht mehr durch die Poren. Die Moleküle müssen eine

gestreckte Form annehmen, deren vorderes Ende in das Gel eindringt. Eine

Auftrennung nach der Größe ist dabei nur schlecht möglich (Strachan, 1996, S. 338).

Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Agarosegelelektrophoresen für den

Southern Bot zeigten, daß sich DNA-Restriktionfragmente bis zu einer Größe von

maximal 20 kb bzw. 30 kb auftrennen ließen.

59

Die Pulsfeldgelelektrophorese stellt eine modifizierte Form der

Agarosegelelektrophorese dar. Die PFGE dient dazu, sehr große Restriktionsfragmente

aufzutrennen. Man gibt die Agaroseblöcke mit den DNA-Fragmenten in die Taschen

des Agarosegels, und die DNA wandert im elektrischen Feld. Während eines

PFGE-Laufs wird die Orientierung des elektrischen Feldes relativ zum Gel periodisch

verändert, indem im allgemeinen kurze Spannungsimpulse an das Gel angelegt

werden. Diese erzeugen abwechselnd zwei verschieden ausgerichtete elektrische

Felder, so daß ein diskontinuierliches elektrisches Feld entsteht. Dieses

diskontinuierliche elektrische Feld bewirkt eine fortwährende Konformations- und

Richtungsänderung der DNA bei ihrer Bewegung durch das Gel. Die Zeit, die ein

DNA-Molekül für eine Konformations- und Richtungsänderung benötigt, hängt

ausschließlich von der Größe ab. Dadurch lassen sich DNA-Fragmente bis zu einer

Größe von mehreren Megabasen gut auftrennen.

Mit der PFGE ist aufgrund der enormen Fragmentgrößen lediglich eine gröbere

Eingrenzung einer bestimmten Chromosomenregion möglich. Andererseits ist durch die

gute Auftrennung größerer Restriktionsfragmente die Wahrscheinlichkeit höher, ein

junction fragment zu detektieren und somit den Deletionsbruchpunkt zu finden.

Mit der Agarosegelelktrophorese für den Southern Blot ist die Wahrscheinlichkeit, ein

junction fragment mit einer Probe zu detektieren, geringer. Gelingt jedoch die Detektion

eines junction fragments, so erlaubt dies eine feinere Charakterisierung der

entsprechenden Bruchpunktregion auf dem Chromosom. Hierbei kann es jedochproblematisch sein, eine exakte Längenbestimmung eines großen (>20 kb) junction

fragments durchzuführen.

5.3.2 Schwierigkeiten bei der Southen Blot Technik

Die Southern Bot Technik weist eine Reihe von Schwierigkeiten auf, so beispielsweise

in bezug auf DNA und deren elektrophoretische Auftrennung im Gel sowie in bezug auf

die radioaktiv markierte Probe.

DNA:Schwierigkeiten ergeben sich hinsichtlich der DNA-Verfügbarkeit (Patientenblut,

Lymphozytentransformation, DNA-Extraktion; s. Kap.2), da für einen Blot jeweils relativ

große Mengen DNA (mindestens 10 µg) benötigt werden.

60

Eine weitere Schwierigkeitbesteht darin, identische DNA-Mengen aufzutrennen. Vor

dem Auftragen der DNA in die Geltaschen wird die DNA-Konzentration photometrisch

bestimmt (s. Kap.2). Dabei erweist sich die photometrische DNA Messung als nicht

ausreichend sensitiv.

Elektrophoretische Auftrennung der DNA im Gel:Trotz vorheriger Bestimmung der DNA Mengen mit dem Photometer, ergeben sich aus

der nicht ausreichend genauen Messung sowie aus den hohen DNA-Mengen von bis

zu 20 µg unterschiedliche Laufgeschwindigkeiten der im Gel wandernden DNA-

Fragmente. Daraus resultieren kleinere Abweichungen der Fragmentlängen im

Vergleich zu den Positivkontrollen (klonierte PAC-DNA) sowie unterschiedliche

Signalstärken nach Hybridisierung. Zur Optimierung könnte man versuchen, nur 10 bis

15 µg DNA im Gel aufzutragen. Des weiteren ist es sinnvoll, die DNA im Gel bei

geringerer Spannung aufzutrennen.

Auswählen der radioaktiv zu markierenden Probe:Ein weiterer problematischer Punkt ist die Sondenlänge: um eine ausreichende

Signalstärke zu erhalten, sollte die Sonde mindestens 500 bp groß sein.

Trotz der hier aufgeführten Probleme läßt sich sagen, daß die Southern Bot Technik ein

äußerst sensitives Verfahren ist und –wie in 5.3.1 bereits erwähnt- eine brauchbare

Alternative zur PCR darstellt sowie diese ergänzt.

5.4 Deletionsanalyse am distalen Deletionsbruchpunkt

5.4.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markiertenSonde im 3‘-Bereich des NPHP1 –Gens (Probe A)

Allgemein:

Bereits im Vorfeld dieser Arbeit wurden Patienten mit Nephronophthise mit Hilfe der

PCR-Technik auf Deletionen hin untersucht. Der distale Bruchpunkt war nach

Forschungsergebnissen von Hildebrandt et al. (1997) zwischen den Primern 9657T7C5

und 9657T7D im T7-Bereich des PACs 9657 postuliert worden. Aus diesem Grund war

es von besonderem Interesse, in diesem Bereich Deletionsanalysen mit der Southern

Bot Technik durchzuführen, um den Deletionsbruchpunkt näher einzugrenzen.

61

Die Probe A (Kap. 4.1, Abb. 4.1), die aus STS-Primern 9657T(1) und 9657T7F3

generiert wurde, kartiert telomer des Primers 9657D3, der als nicht deletiert galt.

Die Hybridisierung eines genomischen Southern Blots (Restriktionsenzym BamHI)

demonstrierte jedoch Deletion bei den an Nephronophthise erkrankten Individuen. Die

homozygot deletierten Kinder der Familien 9 und 12 zeigten im Gegensatz zu ihrenEltern, die ein gesundes Allel des NPHP1-Gens besitzen, kein entsprechendes Signal.

(Kap. 4.2.1, Abb. 4.2).

Mit diesem Experiment konnte gezeigt werden, daß der distale Deletionsbruchpunkt

weiter telomer liegen muß als aufgrund der PCR-Daten (Hildebrandt et al., 1997)

vermutet wurde. Dies wird in Kapitel 5.4.2 mit einer weiteren Probe bestätigt.

Die Diskrepanz zwischen den PCR-Daten und den in dieser Arbeit mit Hilfe der

Southern Blot Technik erzielten Ergebnisse, lassen sich folgendermaßen begründen:

weitere Sequenzanalysen ergaben, daß die durchgeführten PCR-Untersuchungen

aufgrund von repetitiven Sequenzen in diesem Bereich falsch positive Resultate

lieferten.

5.4.2 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit dem EST yb08f05 (Probe B)

Der EST yb08f05 (entspricht ID 70593 bei Saunier et al., 1997) kartiert weiter telomer

als der in Kap. 4.2.1 verwendeten Marker und proximal des telomer gelegenen 100 kb

großen inverted repeats, der invertierten Duplikation (s. Kap. 4.1, Abb.1).

Mit diesem EST als Sonde sollte untersucht werden, ob der distale Deletionsbruchpunkt

noch vor der telomer gelegenen Duplikation liegt, da sich die Publikationen in diesem

Punkt widersprachen (Hildebrandt et al. 1997, Saunier et al., 1997).

Der Southern Blot mit der PstI-verdauten DNA einzelner Mitglieder der Familien 9, 12,

und 33 zeigte Deletion bei homozygot deletierten Individuen (s. Kap. 4.2.2, Abb. 3).

Bei Familie 33 lagen folgende Ergebnisse vor:

Die Mutter wies die 4 kb Bande auf, da sie ein gesundes Allel und ein Allel mit einer

Punktmutation besitzt. Die Kinder, die ein deletiertes Allel vom Vater sowie ein Allel mit

Punktmutation von der Mutter geerbt haben, zeigten ebenfalls das 4 kb Fragment. Der

Vater hingegen ließ eine aberrante Bande bei 2 kb erkennen. Diese Bande ist auf dem

Röntgenfilm nur sehr schwach zu sehen und ist phototechnisch nicht darstellbar. Eine

mögliche Erklärung für dieses aberrante Fragment ist, daß der Vater von Familie 33

(Daten unveröffentlicht) mit FISH-Untersuchungen (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung)

62

eine Translokation auf Chromosom 6 zeigte. Diese chromosomalen Rearrangements

könnten die Ursache für das Zustandekommen dieses Hybridisierungsergenbisses sein.

Dieses interessante Ergebnis sollte Gegenstand weiterer Forschungsarbeit sein.

Aus diesem Experiment läßt sich schlußfolgern, daß der Deletionsbruchpunkt weiter

stromabwärts, in Richtung telomer gelegene invertierte Duplikation liegt oder, wie

Saunier et al. (1997) postulieren, der telomerische Deletionsbruchpunkt innerhalb der

invertierten Duplikation liegt.

5.5 Deletionsanalyse am proximalen Bruchpunkt bei Familie 12

5.5.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markiertenSonde im Bereich des vermuteten proximalen Bruchpunkts (Probe C)

Mit Hilfe von PCR-Deletionsanalysen wurde festgestellt, daß bei Familie 12 die Deletion

im NPHP1-Gen kürzer ist als bei den anderen NPH-Familien. Der Vater von Familie 12

ist Träger der “großen” “klassischen” Deletion, während die Mutter eine kürzere Deletion

trägt. Den an NPH erkrankten Kindern wurde die große Deletion des Vaters und die

kürzere Deletion der Mutter vererbt (Hildebrandt et al., 1997).

Zur Charakterisierung dieses für Familie 12 spezifischen proximalen Bruchpunkts wurdeaus dem Sequenzbereich nach Exon 2 des NPHP1-Gens die Probe C ( in Abb. 4.1;

Primer: Zcb 198-c+/Zcb159-c-) generiert und als Sonde für einen Southern Blot

eingesetzt.

Abb. 4.4 und 4.5 (s. Kap. 4) zeigen die Ergebnisse der Hybridisierung. Abb. 4.5 ist

wesentlich heller und zeigt schärfere Banden als Abb. 4.4, da die PACs bei der

Hybridisierung stärkere Signale geben als genomische DNA und da der Film

aufgrunddessen nur wenige Stunden exponiert werden mußte. Der Blot mit der

genomischen DNA mußte wegen der schwächeren Hybridisierungssignale mehrere

Tage exponiert werden und zeigt daher auch entsprechend mehr Hintergrundstrahlung.

In Tabelle 4.1 (Kap. 4) sind die Fragmentlängen aus diesem Experiment aufgeführt.

Vergleicht man die Fragmentlängen der PACs mit denen der genomischen DNA, so

erkennt man, daß die Fragmentlängen der Positivkontrollen mit denen der genomischen

63

DNA bis auf zwei Fälle übereinstimmen: bei den Enzymen DraI und EcoRI weichen die

Ergebnisse ab.

Bei dem Enzym DraI zeigte die Mutter von Familie 12 zwei Fragmente: 1,1 kb und 0,7

kb; der Pac 62p20 zeigte 3 Fragmente: 1,1 kb, 0,5 kb und 0,3 kb. Das Auftreten

mehrerer Fragmente beim Verwenden einer Probe ist ein Hinweis auf interne

Restriktionsschnittstellen des jeweiligen Enzyms innerhalb der Sequenz der Probe. Da

die Sequenz von Exon1 und Exon 2, aus der die Probe stammte, bekannt war, wurde

sie herangezogen, um die Fragmentlängen zu überprüfen. Die Sequenz ist im Anhang

beigefügt. Es fanden sich fünf DraI Restriktionsschnittstellen im Bereich der Probe

(2310bp- 4343bp): bei 2305 bp, bei 3370 bp, bei 3389 bp, bei 3471 bp, und bei

4310 bp. Daraus ergaben sich folgende Fragmentlängen: 1055 bp, 19 bp, 82 bp und

839 bp.

Das 1055 bp gr0ße Fragment entspricht dem genomischen und dem PAC Fragment

von 1,1 kb.

Für das 839 bp große Fragment kann folgende Erkärung herangezogen werden: es

entspricht etwa dem genomischen 0,7 kb Fragment und dem 0,5 kb Fragment des

PACs, da die Längenberechnung der Fragmente mit Hilfe eines Längestandards (Kap.

3.7.8) auf halblogarithmischen Papier nicht exakte Werte liefert. Somit können gewisse

Abweichungen und Ungenauigkeiten auftreten.

Im Falle der DNA des PACs, die etwas langsamer gelaufen ist als die genomische

DNA, kann man davon ausgehen, daß das detektierte Fragment von 0,3 kb dem

berechneten ~0,1 kb Fragment entspricht. Denn die halblogarithmische

Fragmentlängenbestimmung ist nicht hundertprozentig und liefert nur Näherungswerte.Der Southern Blot demonstrierte mit dem Restriktionsenzym EcoRI das interessante

Ergebnis eines erstmaligen junction fragments. Während der PAC 62p20 ein Signal bei

16 kb zeigte, sah man bei der EcoRI-verdauten DNA der Mutter von Familie 12 zwei

Banden, eine von 16 kb und eine weitere von >33 kb Länge. Durch Wiederholung

dieses Experiments konnte das Ergebnis bestätigt werden (s. Kap. 4.3.1, Abb. 4.6). Wie

in Kap. 5.1 beschrieben, entsteht ein junction fragment durch Deletion einer

Restriktionschnittstelle und die Verbindung mit einem anderen Fragment nach der

Deletion. Es wird somit von den jeweils ersten Schnittstellen vor und nach der Deletion

begrenzt. Heterozygote Deletionsträger zeigen im Southern Blot ein normales Fragment

sowie ein junction fragment. Homozygot deletierte Individuen besitzen ausschließlich

das junction fragment. So auch in Abb. 4.6.: die Mutter von Familie 12 weist neben dem

64

16 kb Wildtyp-Fragment auch das >33kb junction fragment auf, das erkrankte Kind

dieser Familie jedoch nur das junction fragment.

Die Identifizierung des junction fragments stellt die Grundlage für die weitere

Eingrenzung des proximalen Deletionsbruchpunktes bei Familie 12 dar.

5.5.2 Erstellung einer partiellen Restriktionskarte für den proximalen Bruchpunktbei Familie 12

Die Ergebnisse, die Probe C lieferte, erlaubten die Konstruktion einer partiellen

Restriktionskarte für den proximalen Bruchpunkt bei Familie 12 (s. Abb.4.7, Kap.4.3.3).Die stromabwärts gelegene Restriktionsschnittstelle des EcoRI Wildtyp Fragments (bei

ca. 15,6kb) lag bereits in der Deletionsregion Die letzen beidenRestriktionsschnittstellen vor dem proximalen Bruchpunkt waren bei ca. 7 kb für HindIII

und bei ca. 8,5 kb für XbaI postuliert worden. Der proximale Bruchpunkt bei Familie 12

war auf etwa 7 kb eingegrenzt worden.

Indem man weitere in der Nähe des proximalen Bruchpunktes gelegeneRestriktionsschnittstellen ermitteln würde, würde sich ein kleineres junction fragment

finden. Dadurch würde man die Möglichkeit haben, den zentromerischen und den

telomerischen Bruchpunkt bei Familie 12 zu identifizieren. Mit Hilfe des gemeinsamen

telomerischen Bruchpunktes ließe sich dann auch der „klassische“ proximale

Deletionsbruchpunkt ermitteln.

5.6 Deletionsanalysen stromabwärts des vermuteten proximalen Bruchpunkts beiweiteren NPH-Familien

5.6.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markiertenSonde im Sp6-Bereich des PACs 62p20 ( Probe D)

Mit einer Probe aus dem Sp6 –Bereich des PACs 62p20 (62p17A+/ 62p2019A-; Probe

D, Abb. 4.1)wurden die NPH-Familien 9, 12, 33 und 40 auf Deletion hin untersucht. Es

zeigte sich, wie erwartet, keine Deletion in diesem Bereich. Alle Individuen– mit

Ausnahme des Vaters von Familie 33- lieferten das 5 kb Fragment (Abb. 4.8). Da beim

Vater von Familie 33 keine Bande zu sehen war, sprach dies für homozygot Deletion.

65

Hier lag ein Widerspruch vor, denn er war gesund und zeigte keine Symptome einer

Nephronophthise. Wie in 5.4.2 bereits erwähnt war bei ihm in einer FISH-Untersuchung

eine Translokation auf dem Chromosom 6 gezeigt worden. Ob diese mit dem hier

erwarteten Ergebnis in Verbindung steht, bleibt Gegenstand weiterer Forschungsarbeit.

5.7 Mögliche Pathomechanismen für die Entstehung der NPHP1-Deletion

Neben den einfachen Mutationen gibt es auch Deletionen, die in vielen Organismen

Krankheiten verursachen können. Den häufigsten Mechanismus bei Deletionen von

Genen stellt die homologe Rekombination dar. Dabei unterscheidet man homologe

ungleiche Rekombination zwischen zwei homologen Chromosomen oder

Schwesterchromatiden (Cooper und Schmidtke, 1991) von nicht homologer

Rekombination zwischen zwei kurzen DNA-Sequenzen mit minimaler Homologie

(Krawzak und Cooper, 1991).

Im menschlichen Genom gibt es viele spezifische Sequenzen, die an der Formation von

Deletionen beteiligt sind. Zu diesen zählen die long interspersed nuclear elements

(LINE oder L1), die short interspersed nuclear elements (SINE), wie beispielsweise

Vertreter der Alu-Familie, Transposons (Mariner Elements), Topoisomerase I und II

Sequenzen, direkte und indirekte repetitive Sequenzen sowie verschiedene kleinere

Familien von Transposons.

Die drei häufigsten Arten mobiler Elementen im menschlichen Genom sind

Transposons (Mariner elements), autonome Retrotransposons (IAPs und LINEs) und

nicht autonome Retrotransposons (Alu-Wiederholungsequenzen, prozessierte

Pseudogene). Sie können für krankheitsverursachende Deletionen des menschlichen

Genoms verantwortlich sein (Kazazian, 1998).

Im Bereich des eingegrenzten Deletionsbruchpunktes bei Familie 12 wurde ein LINE-1-Element entdeckt. Es befand sich zwischen Exon 2 und 3 des NPHP1-Gens. Daher soll

die potentielle Rolle dieses Elements bei der Entstehung der Deletion diskutiert werden.

Mehr als 50.000 Wiederholungen der LINE-1-Elemente kommen im menschlichen

Genom vor. Sie machen ungefähr 5% der menschlichen DNA aus. Mindestens ein

Viertel des menschlichen Genoms besteht aus Sequenzen, die direkt mit L1-Elementen

verwandt sind oder durch die Wirkung der von den LINE-1-Elementen kodierten

Reversen Transkriptase entstanden sind (Smit, 1996).

66

Ein vollständiges LINE-1-Element ist ungefähr 6-7 kb groß. Es besitzt zwei offene

Leserahmen (ORF). ORF1 ist ca. 1 kb groß und kodiert für ein unbekanntes Protein,

ORF2 ist 4 kb groß und kodiert für eine Endonuklease sowie für ein Reverse

Transkriptase. Bei mehr als 90% der LINE-1-Elemente handelt es sich jedoch um am

5’-Ende verkürzte Varianten. Die interne Struktur ist bei ungefähr 10% verändert.

LINE-1- Elemente können sich autonom replizieren. Ihr RNA-Transkript kann mit Hilfe

der eigenen Reversen Transkriptase in der Zelle in eine komplementäre DNA

umgeschrieben werden. Der Einbau dieser DNA erfolgt an verschieden Stellen im

Chromosom (Weiner et al., 1986).

Mittlerweile gibt es ca. 10 Berichte in der Literatur über krankheitsverursachende

Deletionen im Bereich von LINE-1- Elementen. Homologe Rekombination zwischen

zwei LINE-1-Elementen fand sich bei einem Fall mit Alport-Syndrom und

Leiomyomatose (Segal et al., 1999) sowie bei einem Patienten mit Hämophilie A (Van

de Water et al., 1998). Meistens jedoch liegen nicht homologe Rekombinationen

zwischen LINE-1-Elementen und nicht repetitiver Sequenz vor.

Da in der Nähe des vermuteten proximalen Deletionsbruchpunktes bei Familie 12 ein

LINE-1-Element vorzufinden war, könnte das Entstehen dieser Deletion in direktem

Zusammenhang mit diesem mobilen Element stehen. Das Vorkommen dieses LINE-1-

Elements muß daher als möglicher Pathomechanismus für die Entstehung der Deletion

in Betracht gezogen werden.

5.8 Ausblick

Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Daten stellen die Grundlage für die

Identifizierung der Deletionsbruchpunkte bei Patienten mit Nephronophthise dar. Mit der

erstmaligen Darstellung eines junction fragments bei NPH gelang es, den proximalen

Deletionsbruchpunkt bei Familie 12 auf einen Bereich von 7 kb einzugrenzen. Durch

weiteres Sequenzieren, Verwenden zusätzlicher Restriktionsenzyme und Einsetzen von

Sonden, die sich näher am Bruchpunkt befinden, besteht die Möglichkeit, kürzere

junction fragments zu detektieren. Diese erlauben eine engere Eingrenzung der

Bruchpunktregion. Desweiteren läßt sich mittels einer „across-breakpoint-PCR“ durch

Sequenzieren des amplifizierten Produkts die genaue Identifizierung der

Deletionsbruchpunkte vornehmen. Weiteres Sequenzieren in diesem Bereich kann

Aufschlüsse über Pathomechanismen, die für die Deletion verantwortlich sein können,

67

geben. Dazu müßte man gezielt nach Hinweisen auf Rekombination und nach

spezifischen Sequenzen, beispielsweise LINE-1-Elementen, repetitiven Alu-Elementen,

Topoisomerase I und II Sequenzen sowie anderen repetitiven Elementen suchen.

68

6. ZUSAMMENFASSUNG

Die Juvenile Nephronophthise (NPH) ist eine autosomal-rezessive zystische

Nierenerkrankung, die im Alter von ca. 13 Jahren zu terminalem Nierenversagen führt.Das Gen für Nephronophthise Typ 1 (NPHP1) wurde auf dem Chromosom 2q13

identifiziert. Es besteht aus 20 Exonen. Mehr als 80% der Patienten tragen eine 250 kbgroße homozygote Deletion des NPHP1- Gens, die von beiden Seiten von einer

invertierten Duplikation (100 kb) flankiert wird. Alternativ dazu gibt es bei einer weiteren

NPH-Familie (F12) eine kürzere mütterliche Deletion im proximalen Bereich. Die

Deletionsbruchpunkte waren durch PCR-Analyse postuliert worden. Dabei waren der

klassische proximale sowie der gemeinsame distale Deletionsbruchpunkt auf Intervalle

zwischen STS- Markern festgelegt worden. Der alternative proximale Bruchpunkt vonF12 war zwischen Exon 2 und Exon 3 des NPHP1 Gens eingegrenzt worden.

Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Southern Blot Analysen sollten die PCR-

Daten bestätigen und zur weiteren Charakterisierung der Bruchpunktregion führen.

Mit zwei Experimenten konnte gezeigt werden, daß der gemeinsame distale Bruchpunkt

weiter telomer liegen muß (in Richtung telomer gelegene invertierte Duplikation,

möglicherweise innerhalb dieser) als aufgrund von PCR-Daten bisher vermutet.

Der alternative proximale Deletionsbruchpunkt bei Familie 12 konnte durch die

erstmalige Detektion eines >33 kb junction fragments und durch die Erstellung einer

partiellen Restriktionskarte für diese Region auf einen Bereich von ca. 7 kb eingegrenzt

werden.

In der Nähe des vermuteten proximalen Bruchpunktes bei F12, zwischen Exon 2 und 3,

fand sich ein LINE-1-Element. Dieses autonome Retrotransposon könnte eine

potentielle Rolle bei der Entstehung der Deletion bei F12 spielen.

69

7. LITERATURLISTE

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8. ANHANG8.1 Sequenzierter Bereich Exon 1 und Exon 2

ATAGTACAAAAAAAGGCAACACAAGTTTGTGCTCTTATAAGTTAGGATATTGTTCACCTTTGGT

GTGTGGTAGAGAAGTGAGAGGGTTGAGAGGTTGGGGGTAGGCAAGGACTAGAAAGACAGGAAGA

GTGTGAGTGGGCAGATAATGTTCTGTTTCATAATCTGGGTGCTGTTATGGGGTGGAGGGTTTTC

AGAGCTGCACACAAAGTCTGTAGACTTTTCTCTGTATGTATTATACTTGAAGAAAAAAGTACAT

AAATAATGGTTCATCCTGGCCTGTGGCTGTTCTGAAGAACATTCATTTGTATTAATGGGGTCCA

TCATTTGGAAGGTGAGCCCCAAGCATCATCATTCTTATTCAAGTTCAATTTTGGTGTAGTGGAG

TTTTGGAATTGGATTCATGGGATGCAGTCCCATATGGGGGAAACATGACAACCTTCCTGAGAGT

TGATGTAAACTGGGAATCATAATGAGAACTAATAATTTGCTCATAGATTTGCTGTAGAACAATT

ACCATCCTTACAGAATTCAGAATTGACAACGTGCAATATTAGAATGAAATGAAACTTCAGTAGC

EcoRI

CTAAATGGCAAAGAATTAAAAACTGCCTTTTGAAGTGACAGTATGGAACAGAACCATATATTCC

ATAGGAAAGCTATCCTTGGAGTTAATGAAAGAGTTTAAGATACTAAAATTGTATCTTAACATTA

GCTTACAAAATTGGTATCAGAAAGCAAATGCCATAAAACAGGTATCCCAGCAAGAAGGTGGTGT

TATTATTGATGTATTGTGGGGAATGTAGTTTCAGACGCCGGGGGACGTTCCCCTATCCTTAGGA

ATTGCCGAGGAAAAGTGACTCCCCCGGCTGTGACCTGCCTGGTGGCGTGGGATGACCACCGCAA

GAGAACATTTGACCCTTCCCGGGACCGGCCCGGGCGGGGCGGGGCTGGGAGGCGGGCGCACATC

GATGGCGTCACCTTCTGGCGCCGCCGGTTGGTTTCCCTGGCAACTGGAGCAATCAGAGCACCGC

AGCCAGGGAG

1 ATGCTGGCGA GACGACAGCG AGATCCTCTC CAGGCCCTGC GGCGCCGCAA

exon 1

51 TCAGGAGCTG AAGCAACAGG TATGGTCAGG CTGTGCAGAG GGCCCTGGGG

101 CGGGCGACAG GCGGACGCAG CTGCGCGCAC TGCGCCTTCC CACCGTGACC

151 CCACCTAATC CTGGGAGCTT GCCCCCAACC TACTTACCTT CCCAGGTTGT

201 AACGCCCCCT TACCCCATAA CATTCCAGCA CCCAACCCCG ATTCAAACCC

251 CTCCTGATCC CAACTCAACC CCCAGCCAAA GGCGAAACCT CCCAAAATTC

301 GTGACCATCA ACTAAGCGCC CCCTCCTCCG ACCCTCACTC CCACCTAACG

351 TCTCAACCTC CTACCCTAAC AACTCACTAA CCCACCTTAT CTCCCAATCT

401 AAACTTAGTG GTGTAACCAT TTCCAACCCA ACTCTGAGCC TAGCTCCTCT

451 CCTCCACTTT CCAAGCCCAT TTCCTTTCAG CCTTCCTCAA GTGGAGATTA

501 TTATTGCCTC CGTGAACTCA AGCGAAATAG GTGTCAAGAA ATAGTCTTAA

551 TATGCAAGAA CATTAAGATC TGATAAATGA GCAAAGGAGG TGAACGAGAG

601 AGGAAATACA AGTAACTCAT AAACATACGA GGAATGTTAA CTTCAAAGAT

651 ACTCAAGTAA TTGCAAAGCA CATAAGGTAT CACAAAAATG TTAAAAATCA

701 CAACACTCTG TCTTGAGGAA GGTGTGATGA AGCAGGCACA TTCACTGCTC

751 CCGTGTATAA GGTGCTTGTA CAGCATTTCA GGAAAGCAGC TTGACAAGGT

801 GTAACATATG TGTATGCACC TAGGCTCAAA AATTACATTT CCAGGGATCT

851 GCTATGTGTA ATAATTAGAA AGTAGGACAG AGATTGATGT ATAAAAGTAT

901 TCATCACATT GTTACTTATA TAATATACAC AGAACAGCAT AGAAGGGAAC

951 AGGCTAATAT GGTATTTCTG TGTGACAGGA TGCTGATGAT TATTATGATT

1001 TTCTTTATTC TTTTTCATAT TTATAAAAAT TTTTAGGCCA GGTGTGGTGG

1051 CTCATGCTAG TAGTACCAGC TACTTGGGAG GCTGAGACAG GAGGATCACC

1101 TGAGCCCAGG AGTTCGAGAC TAGCCTGGGC AACATAACAA GACTTGGTCT

1151 CAAAAAAAAA AAAACTTTTT AAAAATACAC TGAGTTCTTA TTAAAAATAA

1201 GAAAAAAGTA AATAGCAACC AGTGGGTTTA TTTTCTGACA TTTTAATTTC

1251 ACTTTAATTT TTTTCATGTG ATCTATTACC AAGTATTTTT CCACTGAGTA

1301 AAATTATTTT ATAATCTGAG GCCGGTAAGA GATTCACTGA TGCTCATATT

1351 TTATCCATTT TTGTTCTCTT GTTTAAAGTA AAAAGGATTT GGAAGGTAAA

1401 TATTTAGGTG ACTGTGTATT GGAATCACAG TGGTGCAACA AAAGCTAAAT

1451 ACTCTTCTGG TAGAAATAAA AAATAAAACT TGATGGGGCA TTGACTTATG

1501 CTGAACTTCG GTGGATCTTA ATATGGTTCT GTGTCTTATT TTAAAATTTC

1551 AACTTTTATT TTAGATTCAG GGGGTACATG TGCAGGTCTG TCACATGGGA

1601 ACACTGTGTT ATGCTGAGGT TTGGGGTACA GATGAGCCTA TCACACAAGC

1651 AGTGAGCACA GTACCCAATA GGCAGTCTTT CAGTCTTCAT TCCTCTTCCC

1701 TCCCCCACCC CACTCCAGCA GTCACCAGTG TCCATTGCTC CCATCTTTAT

1751 GTCCATGTGT ACTCAACGAG TGAGAACATA TGGTATTTGG TTTTCTGTTC

1801 CTATGCTAAT TCACTTAGGA CAATGGCCTC CAGCTCCATC CATGTTGCTG

1851 CAAAGGACAT GATTTCATTC TTTTTTATGG TTGCATATTT TTTCATGGTG

1901 TATATGTACC ACATTTTCTT TATCCAGTCC ACCATTGGTG GGCATCTATG

1951 TTGATTCCAT GTCTTTGCTA TTGTGAATAG TGCTGTAGGG AACATACACA

2001 TGCATGTGAC ATTTTGGTAG AATCATTTCT TTTTTGGGGG TATATACACG

2051 GAAATGGGAT TTCTGGGTCA AATGATAGTT CTGTTTTACG TTGTTTGGGA

2101 AATCTCCAAA CTGCTTTCCA CAGTGGCTGA ACTAATTTTC ATGCCCACCN

2151 AACAGTGTaT ATGTGTACTC TTTTCTTGTC AGCCTCACCA GAATCTGTCA

2201 TTTCTTGATT TTTTAATAAT AGCCATTTTG ACCAGTGTGA GATGGTACCT

2251 CATTGTAGTT TTAATTTGCA TTTCTCTGAT GATTAGTCAT GATGAGTTAA

TTTTAAATTT AGTGGGACAT TAGGAGAACC AGGAAAAGTT TTAGAAGGAA

DraI Zcb198-c+

2351 ACTATAAAAA TGATTNATTA AAACAAACTA TTAGAAAGNT NNTTCTcCCC

2401 TGGNgNAANA taNNNNGCTT NNGGAGCCCT TTNGATACCT TGANAATNNG

2451 GGAAAAGTTT NTTTNGATAG TATTAAGCTA ATTCTTCCCT GTCTTCACAG

2501 AGGACACCTG GAGCTGAATA TGGAACAGAT TTTCTATTCG GTGTCTGTNG

2551 GACAAGTAAT CAACANCCCC TCTGAGTCAG GCCTGTGATG ACTGGCTCTA

2601 TCACTAGGNG NGTGGATTTN GNAAATAACA CTCAGATGGA TGCCAAATTG

2651 CAAGAGTACA GAAGAAACTN ATGGAATTTT CTCTTTTTTC ATCCACTTTA

2701 TCTTCTCTAC GTAATCTATA GAAAACAGAC CAAAGAAGTA TGTGCCTTTT

2751 TGGAGAGTAT ATTGACAAAG TTACATATAG TGTTAGTAAA CAAACTACTA

2801 AGTCAAGAGA AACAAAGTCA TGATACATTC AATACAATGG ATACCACTCA

2851 GTAATGAGAA GGAATGAACT AATGGTACAC ACAACAATAT GGAAGTATCT

2901 CAAAAACATG CTTTGTGGAA AGGTTACACA AGAGTGCTTA CTGTATGAGT

2951 CCATTTATAT AAAATTTCAA GAACAGGCAA AACTAATTTA TGTTGGAAAA

3001 ATATCAAAAC AGGTTTGTCT GTGGAGGAAT AAGGAGGGGA TTTACTGGCA

3051 AGGGCATGAG GGAACTTACT AGGGTGATGG TAGTTTTCTA CATCTTGATA

3101 AGAATTTTGG TTACACAGAT GTATGCATTT GTCGAAACTC AGCAAATGTA

3151 TGCCTCGTAT TTGTGCATTT CACTATATAC ATATTTTACA TCAACTATTG

3201 AACTTTAGTT AGTGACATCC ATAGTCCATT ATTTAGGGAG AAATGTATTG

3251 ATAACTGCAA CTTACTTTGA AAGGCATAAG GTGGGTTGAC GGATAGATCA

3301 AATAAGTATA GTATAATGTT AATGTTTTTT CTAGGTAGCG GGTATATGGG

TTTTCACTGT AAAATTTTTA AAACTTTGTT GTATGTTTAA AAGTGTTCAT

DraI DraI

3401 TATAAAATAT TGGATAAAAA AAGAAGTTTT CTTTCCTAAG GCGATATGGT

ATTTAATAAT GTGATATTTT AAATGGTCTC CATAGGTTGA TAGTTTGCTT

DraI

3501 TCTGAGAGCC AACTGAAAGA AGCTCTAGAA CCCAATAAAA GACAACATAT

exon 2 XbaI exon 2

TTATCAAAGG TAAAGTATGC TAAATTATAT AAGCTTTACA GGAACCGCAC

HindIII

3601 TTACATTTCA ATGCATAGTA TTTAAGGCAT AGAGATTGGT CCTTTGGAAT

3651 CAAATGGAAG AATCACATAG TGTTGTAAGT TGAATGTAGA AGAAACCAAC

3701 CTAAACCTGA TGGTTGCGGA CTTGCTGTTG TGACAGCAAC TATAAAAACT

3751 GCTTAATGTA AACATAGGTG ACATGGGCAG GATTACCCTA AATCCTTAGC

3801 CTATGTAGCC CAGATCCTGT GACCTGGTCA GAAACCTCTG TCTATAAGCA

3851 ATTAGTACTT CATTGGGATG TCAACTTTAA CTCCCATGAG AAGACAACAC

3901 TGTTTTCTAG GTGGGTGTTT TTTGTTTTGT ATTTGTTTTT ACTTAAAAAA

3951 AAATCCTTGG GAGAGTTTAA ATAGACGTGA TGAACTACAT CAAATTTAGA

4001 CTATTAATTC ATAACATTTG TATTAAGTTT AGGACATCAT TAAGATAATC

4051 TTTGTTTTTG AGATATTTAA GGATTTTATT ACATTCCAAA GAACATGAGA

4101 TTCATTCTAT TAATTTAAGT GAATTGTAAT TGTTTGGAGA AGTTTTACTT

4151 AAGTCAGGCA TTCAGAGTGC TTAAAGGCAA AACAAATGAA TTTTGAAATG

TCAAATGAAT TTAATTTATA ATAGTAGGAT TGATTAAGGG ATTTAGTTCA

Zcb 159-c-

AGCTGAATTA ACAGTAATGA AAGAAAAGCA AAGGTTATTG TTCTTGCTTT

ACTAGATTTA AAAACAGAGT AAGATTTATA GACTGAATTT GAAGGCCAAG

DraI

4351 GGAAAACTAC GTTTTTAAAT TTTATGTTAG TAAACTAAAA ATCATAATTA

4401 TTATTATTTT ATTTTTTGAG ACTAAATCTC ACTCTGTCAC CCAGGCTGGA

4451 GTGCAGTGGC GCAATCTCGG CTCATTGCAA CCTGCACCTC CCAGGTTCAA

4501 GCGATTCTTC TGCCTCAGGC TCTTGAGTAG TTGGGATTAC AGTCGTGCCC

4551 CACCACACCT GGCTGGATTT TGTATTTTGA GTAGAGATGG GTTTCATCAC

4601 GTTGGCCAGG CTGGTTTCGA ACTCCTGACC TCAAGGGATC CCCCAGCCTT

4651 GGCCTCCCAA AGTGCTGGGA TTATAGGTGT GAGCCACTGT GCCCAGCCTA

4701 ATAATTGTTA TGTTTTATTT TTTTTGAGAT AGAGTCTCTC TCTGTCGCCC

4751 AGGCTGGAGT GCAGTGGCAT GATCTCGGCT CACTGCAAGC TCCACCTCCC

4801 AGGTTCAAGC GATTCTCCTG CCTCAGCCTC CCGAGTAGCT GGGATTACAG

4851 GTGCCCGCCA CCATGCCTGG CTAATTTTTT GTATTTTTAG TAGAGATGGG

4901 GTTTCACCGT GCTAGCCAGG ATGGTCTCAA TCTCCTGACC TCATGCCCCC

4951 TGCTTTGGCC TCCCAAAGTG CTGGGATTAT AGGCGTGAGC CACCGCGCCC

5001 GGCC

Legende:Exone: doppelt unterstichen

Restriktionsschnittstellen: einfach unterstrichen

Primer: fett unterstrichen

8.2 Danksagung

Mein erster Dank gilt Herrn PD Dr. Friedhelm Hildebrandt für die freundliche

Überlassung des Themas und die vielen konstruktiven Anregungen. Bei meinem

Betreuer Dr. Edgar Otto möchte ich mich für seine Geduld, seine hilfreiche

Unterstützung und seine kompetente Betreuung bedanken.

Recht herzlich danke ich auch Herrn PD Dr. Offensperger für die Übernahme der

Zweitkorrektur.

Anita Imm und den anderen Mitarbeitern im Labor danke ich für ihre gute

Zusammenarbeit und die schöne Zeit.

Bei meinen Freunden und vor allem meiner Familie möchte ich mich für ihre

Unterstützung während der gesamten Zeit bis zum Vollenden dieser Arbeit bedanken.

Thalia Vetsi

8.3 Abstracts und Veröffentlichungen

AbstractsC. Rensing, E. Otto, M. Vollmer, U. Sommer, T. Vetsi, J. Adolphs, H. Omran, M.

Brandis, F. Hildebrandt und Arbeitsgemeinschaft Pädiatrische Nephrologie,

(Universitäts-Kinderklinik Freiburg), Monatszeitschrift Kinderheilkunde Band 146,

Heft 2-1998

C. Rensing, E. Otto, M. Vollmer, U. Sommer, T. Vetsi, A. Imm, M. Brandis, F.

Hildebrandt, (Universitäts-Kinderklinik Freiburg), Mutationsanalyse bei Patienten mit

Nephronophthise Typ 1 und assoziierten Symptomen, Monatszeitschrift

Kinderheilkunde Heft 4-1998

E. Otto, R. Betz, S. Schätzle, T. Kuntzen, T. Vetsi, A. Imm, M. Brandis, F. Hildebrandt

(Universitäts-Kinderklinik Freiburg), Charakterisierung der chromosomalen

Bruchpunktregion bei Patienten mit Nephronophthise Typ 1, Monatszeitschrift

Kinderheilkunde, Heft 2-1999

VeröffentlichungEdgar Otto, Regina Betz, Cornelia Rensing, Silvia Schätzle, Thomas Kuntzen, Thalia

Vetsi, Anita Imm and Friedhelm Hildebrandt (2000) A Deletion Distinct from the

Classical Homologous Recombination of Juvenile Nephronophthisis Type1 (NPH1)

Allows Exact Molecular Definition of Deletion Breakpoints, Human Mutation 16: 211-223