Der Einfluss von Toso bei der Effektorfunktion von · Die der vorliegenden Arbeit zugrunde...
Transcript of Der Einfluss von Toso bei der Effektorfunktion von · Die der vorliegenden Arbeit zugrunde...
DerEinflussvonTosobeiderEffektorfunktionvon
Granulozyten
Inaugural‐Dissertation
zur
ErlangungdesDoktorgrades
Dr.rer.nat.
derFakultätfürBiologie
ander
UniversitätDuisburg‐Essen
vorgelegtvon
AndreasMerykausLeverkusen
Essen,September2012
DiedervorliegendenArbeitzugrundeliegendenExperimentewurdenamInstitutfürImmunologiederUniversitätDuisburgEssensowieanderKlinikfürGastroenterologie,HepatologieundInfektiologiederUniversitätsklinikDüsseldorfdurchgeführt.
1.Gutachter: Prof.Dr.KarlSebastianLang
2.Gutachter: Prof.Dr.UlfDittmer
VorsitzenderdesPrüfungsausschusses:Prof.Dr.ShirleyKnauer
TagdermündlichenPrüfung:21.11.2012
meiner Familie gewidmet
INHALTSVERZEICHNIS I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS.......................................................................................................................................I
ABBILDUNGSVERZEICHNIS.......................................................................................................................V‐VI
TABELLENVERZEICHNIS...............................................................................................................................VII
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS...................................................................................................................VIII‐X
1. ZUSAMMENFASSUNG...........................................................................................................................1
1. SUMMARY.................................................................................................................................................2
2. EINLEITUNG.............................................................................................................................................3
2.1. Listeriamonocytogenes...................................................................................................................3
2.1.1. Infektionszyklus.......................................................................................................................4
2.1.2. Immunabwehr..........................................................................................................................5
2.2. Granulozyten.......................................................................................................................................6
2.2.1. Granulozytopoese....................................................................................................................6
2.2.2. EliminierungderListeriendurchGranulozyten.........................................................8
2.2.2.1. ErkennungvonPathogenen...........................................................................................8
2.2.2.2. SynthesevonSauerstoffradikalen............................................................................10
2.2.2.3. RegulationderDegranulation....................................................................................11
2.2.2.4. BildungvonNETs............................................................................................................12
2.3. Toso......................................................................................................................................................13
2.3.1. StrukturdesProteins..........................................................................................................13
2.3.2. FunktionvonToso...............................................................................................................14
2.3.3. Expressionsprofil..................................................................................................................15
2.4. Zielsetzung........................................................................................................................................15
3. MATERIALUNDMETHODEN.........................................................................................................17
3.1. Material..............................................................................................................................................17
3.1.1. ChemikalienundMedien...................................................................................................17
3.1.2. Verbrauchsmaterial.............................................................................................................17
INHALTSVERZEICHNIS II
3.1.3. Geräte........................................................................................................................................18
3.1.4. Kits..............................................................................................................................................18
3.1.5. Software....................................................................................................................................19
3.1.6. LösungenundPuffer...........................................................................................................19
3.1.7. Primer........................................................................................................................................20
3.1.8. Antikörper...............................................................................................................................20
3.1.9. Listeriamonocytogenes.......................................................................................................21
3.1.10. Zellen.........................................................................................................................................21
3.1.11. Versuchstiere..........................................................................................................................21
3.1.12. Statistik.....................................................................................................................................22
3.2. Methoden...........................................................................................................................................22
3.2.1. ExperimentelleArbeiteninvivo.....................................................................................22
3.2.1.1. InfektionenmitListeriamonocytogenes...............................................................22
3.2.1.2. DepletionvonGranulozyten.......................................................................................22
3.2.1.3. VoraktivierungderGranulozyteninvivo...............................................................23
3.2.1.4. ApplikationvonBrdU.....................................................................................................23
3.2.1.5. AdoptivtransfervonGranulozyten...........................................................................23
3.2.1.6. Blutentnahme....................................................................................................................23
3.2.1.7. Organentnahme................................................................................................................24
3.2.1.8. Knochenmarkschimären...............................................................................................24
3.2.2. ArbeitenmitListerien.........................................................................................................24
3.2.2.1. KultivierungvonListerien...........................................................................................24
3.2.2.2. CFSE‐Listerien...................................................................................................................25
3.2.2.3. BestimmungbakteriellerTiterindenOrganen..................................................25
3.2.3. ExvivoArbeitenmitGranulozyten................................................................................25
3.2.3.1. GranulozytenPrimingundAktivierung.................................................................25
3.2.3.2. DetektionvonROSinvivo............................................................................................26
3.2.3.3. EinflussvonIgMaufROS..............................................................................................26
INHALTSVERZEICHNIS III
3.2.3.4. PhagozytosevonListerien...........................................................................................27
3.2.3.5. IgMabhängigePhagozytose........................................................................................27
3.2.3.6. OberflächenexpressionvonToso..............................................................................27
3.2.3.7. IntegrinExpressionimnaivenBlut..........................................................................28
3.2.3.8. Hitzeschock........................................................................................................................28
3.2.3.9. ApoptosevonGranulozyten........................................................................................28
3.2.4. ZellkulturprimärerMakrophagen................................................................................29
3.2.5. UntersuchungvonRNA......................................................................................................29
3.2.6. ELISA..........................................................................................................................................30
3.2.7. Durchflusszytometrie.........................................................................................................30
3.2.8. Immunhistochemie..............................................................................................................30
3.2.9. Zellkultur..................................................................................................................................31
3.2.9.1. ErntenvonZellen.............................................................................................................31
3.2.9.2. GenerierungvonGM‐CSFundM‐CSF......................................................................31
3.2.9.3. GenerierungvonMakrophagenausKnochenmark(MΦ)..............................32
3.2.9.4. AufreinigungvonGranulozytenmittelsMACS®Sort.........................................32
4. ERGEBNISSE..........................................................................................................................................33
4.1. CharakterisierungderToso‐/‐Maus........................................................................................34
4.2. ErhöhteSuszeptibilitätbeiDefizienzvonTosowährendderInfektionmit
Listeriamonocytogenes................................................................................................................35
4.3. TosoExpressioninGranulozyten............................................................................................37
4.4. TosounabhängigeRegulationderBlutgranulozytenpopulation...............................38
4.5. BeeinträchtigtePhagozytosederGranulozytenbeiTosoDefizienz.........................40
4.6. HerunterregulierungvonTosodurchPhagozytose........................................................46
4.7. FehlregulierteROS‐SyntheseundDegranulationvonTosodefizienten
Granulozyten...................................................................................................................................48
4.8. TosobeeinflusstdenAktivierungszustandderGranulozyten....................................55
4.9. IntrinsischerDefektTosodefizienterGranulozyten.......................................................60
INHALTSVERZEICHNIS IV
4.10. AdoptivtransfervonC57BL/6GranulozytenverbessertdieListerienkontrolle
währendderInfektion.................................................................................................................61
5. DISKUSSION..........................................................................................................................................65
5.1. FunktionvonTosoaufdieinitialeKontrollederInfektionmit
Listeriamonocytogenes................................................................................................................65
5.2. EinflüssevonTosoaufdieQuantitätderGranulozyten.................................................67
5.3. KomplementundIgMabhängigePhagozytose..................................................................68
5.4. InvolvierungvonTosobeiderROS‐Synthese....................................................................70
5.5. FolgenderfehlgesteuertenROS‐Synthese...........................................................................73
5.6. EinflussdesIntegrinsCD11b....................................................................................................74
5.7. Ausblick..............................................................................................................................................75
6. ANHANG..................................................................................................................................................76
6.1. InvivoDepletionvonMakrophagen.......................................................................................76
6.2. IgMabhängigePhagozytoseimserumfreienMedium....................................................77
6.3. KonzentrationvonC3imSerum..............................................................................................77
6.4. ROS‐SyntheseinEinzelknochenmarkchimären................................................................78
7. LITERATURVERZEICHNIS...............................................................................................................79
8. DANKSAGUNG......................................................................................................................................88
9. LEBENSLAUF........................................................................................................................................89
10. PUBLIKATIONSLISTE........................................................................................................................90
11. ERKLÄRUNGEN....................................................................................................................................91
ABBILDUNGSVERZEICHNIS V
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb.2.1 IntrazellulärerLebenszyklusvonListeriamonocytogenes..........................................4
Abb.2.2 HämatopoeseimKnochenmark.............................................................................................7
Abb.2.3 InduktiondesRespiratoryburstderGranulozyten.....................................................10
Abb.2.4 ModelldesmurinenFaim3/Toso‐Moleküls...................................................................13
Abb.4.1 DeletionsnachweisvonTosoinderToso‐/‐Maus..........................................................34
Abb.4.2 ZusammensetzungdesBlutesvonnaivenToso‐/‐Mäusen.......................................35
Abb.4.3 ÜberlebenskurvederToso‐/‐MäusebeieinersublethalenInfektionmitL.monocytogenes.......................................................................................................................36
Abb.4.4 BakterientiterindenOrganen.............................................................................................36
Abb.4.5 ÜberlebenskurvebeiderDepletionvonGranulozytenwährendderInfektionmitL.monocytogenes...............................................................................................................37
Abb.4.6 OberflächenexpressionvonToso........................................................................................38
Abb.4.7 ApoptoseundNeubildungvonGranulozyten................................................................39
Abb.4.8 PhagozytosepotenzialvonListeriendurchGranulozyten........................................40
Abb.4.9 IgM‐abhängigePhagozytosevonCFSE‐Listerien.........................................................41
Abb.4.10 GranulombildunginderLeberanTagdreinachListerieninfektion....................43
Abb.4.11 KonfokaleAufnahmeListerienphagozytierenderGranulozyten...........................44
Abb.4.12 PhagozytosekapazitätvonMakrophagenwährendinvitroInkubationmitListerien.........................................................................................................................................45
Abb.4.13 PhagozytoseundEliminierungvonListeriendurchMakrophagen.....................46
Abb.4.14 ExpressionvonTosobeiderPhagozytosevonListerien..........................................47
Abb.4.15 IgMabhängigeInternalisierungvonTosobeiderPhagozytosevonListerien47
Abb.4.16 KorrelationzwischenPhagozytoseundROS‐Produktion........................................48
Abb.4.17 ROS‐SynthesewährendderPrimingphase.....................................................................49
Abb.4.18 ROS‐SynthesebeiInkubationmitdemAktivatorfMLP.............................................50
Abb.4.19 InvitroinduzierteROS‐SynthesenachderPriming‐undAktivierungsphase.51
Abb.4.20 TemperatursensitivitätderGranulozyten......................................................................52
Abb.4.21 InvivoROS‐SyntheseundDegranulationwährendeinerListerieninfektion...53
ABBILDUNGSVERZEICHNIS VI
Abb.4.22 ROS‐SyntheseinGranulozytenderMilz..........................................................................54
Abb.4.23 DerEinflussvonIgMaufdieROS‐SynthesederGranuloyzten...............................55
Abb.4.24 ExpressionvonIntegrinenaufnaivenBlutgranulozyten.........................................56
Abb.4.25 ExpressionvonCD11bnachdemPrimingmitGM‐CSFundLPS...........................56
Abb.4.26 EinflussderCD11b‐ExpressionaufdieEffektorfunktionvonGranulozyten...57
Abb.4.27 ÜberlebenskurvebeiDefizienzvonCD11bwährendeinerListerieninfektion58
Abb.4.28 PhagozytosekapazitätvoraktivierterBlutgranulozyten...........................................59
Abb.4.29 ÜberlebenskurveeinerListerieninfektionbeiVoraktivierung..............................60
Abb.4.30 UntersuchungderGranulozyteningemischtenKnochenmarkschimären........61
Abb.4.31 AufreinigungvonGranulozytenausdemKnochenmark..........................................62
Abb.4.32 ListerientiternachadoptivemTransfervonGranulozyten.....................................63
Abb.4.33 ÜberlebenskurvederToso‐/‐MäusenachadoptivenGranulozytentransferwährendderInfektionmitL.monocytogenes................................................................64
Abb.5.1 InsilicoAnalysedesTosoGenlokusaufChromosom1.............................................69
Abb.5.2 Phosphorylierungvonp47phoxüberverschiedeneMAPKinaseWege............71
Abb.6.1 ÜberlebenskurvevonC57BL/6MäuseninAbhängigkeitvongewebeständigenMakrophagenbeieinerInfektionmitL.monocytogenes...........................................76
Abb.6.2 PhagozytosevonCFSEListerieninAbhängigkeitvomkommerziellenIgM.....77
Abb.6.3 KonzentrationvonC3imSerum.........................................................................................77
Abb.6.4 UntersuchungderGranulozyteninEinzelknochenmarkchimären......................78
TABELLENVERZEICHNIS VII
TABELLENVERZEICHNIS
Tab.2.1 ÜbersichtderwichtigstenPRRsundentsprechendenLigandenbeieinerListerieninfektion...........................................................................................................................9
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VIII
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
7AAD 7‐Aminoactinomycin
Abb. Abbildung
AK Antikörper
AS Aminosäure
BMMΦ KnochenmarkgenerierteMakrophagen(bonemarrowmacrophage)
bp Basenpaare
CD clusterofdifferentiation
CFSE Carboxy‐fluorescein‐diacetate‐N‐succinimidyl‐ester
CFU colonyformingunit
CLP commonlymphocytecellprogenitor
CMP commonmyeloidcellprogenitor
DAPI Diamidino‐2‐Phenylindole
DC dendritischeZelle(dendriticcell)
DHE Dihydroethidium
DHR Dihydrorhodamin123
DMEM Dulbecco`smodifiedeaglemedium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
EDTA Ethylen‐Diamin‐Tetra‐Acetylsäure
ELISA enzymelinkedimmunosobentassay
etal. undandere(etalii)
FACS fluorescenceactivatedcellsort
FAIM Fasapoptoticinhibitorymolecule
FcR Fc‐Rezeptoren
FCS fetalesKälberserum(fetalecalfserum)
FITC Fluorescein‐Isothiocyanate
fMLP N‐formyl‐methionine‐leucine‐phenylalanine
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IX
GM‐CSF Granulozyten‐Makrophagen‐koloniestimulierendeFaktor
(granulocytesmacrophagescolonystimulatingfactor)
GMP granulocyte‐macrophageprogenitor
HSC HämatopoetischeStammzelle(hematopoieticstemcell)
i.p. intraperitoneal
i.v. intravenös
Ig Immunoglobin
IgV variableKettederImmunoglobine
IL Interleukin
IMDM IscovesModifiedDulbeccosMedium
kDA Kilo‐Dalton
LCMV lymphozytärenChoriomeningitisVirus
LPS Lipopolysaccharid
MACS magneticactivatedcellsort
M‐CSF MakrophagenkoloniestimulierenderFaktor(macrophagescolonystimulatingfactor)
MEP megakaryocyte‐erythrocyteprogenitor
MFI mittlereFluoreszenzintensität
MPO Myeloperoxidase
NADPH Nicotinamid‐adenin‐dinukleotid‐phosphat
ND nichtdetektierbar
NETs neutrophilextracellulartraps
NOD NucleotideOligomerizationDomain
OD optischeDichte
p Probability(Wahrscheinlichkeit)
p.i. nachInfektion(postinfection)
PAMPs pathogenassociatedmolecularpatterns
PBS Phosphatebufferedsaline
PCR polymerasechainreaction
PE Phycoerythrin
PeCy7 Phycoerythrin‐Cyanin‐7
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS X
PerCP Peridin‐Chlorophyll
pH potentiahydrogenie
PRR patternrecognitionreceptor
PSG Penicilin‐Streptomycin‐LGlutamine
qRT‐PCR quantitativerealtimePCR
RNA Ribonukleinsäure
ROS reactiveoxygenspecies
rpm roundperminute
RT Raumtemperatur
SPF spezifiziertpathogenfrei
Tab Tabelle
TLR TollählicherRezeptor(toll‐likereceptor)
TNFα Tumornekrosefaktoralpha
VSV vesikulärestromatitisVirus
ZUSAMMENFASSUNG 1
1. ZUSAMMENFASSUNG
Die initiale Kontrolle einer bakteriellen Infektion ist von Zellen des angeborenen
Immunsystemsabhängig.OpsoniertdurchdasKomplementsystemundvonAntikörpern
unterschiedlicherIsotypenwerdenPathogenevonGranulozytenphagozytiertunddurch
dieintrazelluläreSynthesevonreactiveoxygenspecies(ROS)eliminiert.Störungenwiedie
chronischen granulomatösen Erkrankungen (CGD), die die Funktion von Granulozyten
beeinträchtigen, sind häufig mit chronischen und rezidivierenden Pilz und Bakterien
Infektionenassoziiert.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung von fas apoptotic inhibitory
molecule 3 (Faim3/Toso) mittels einer Deletionsmutante während einer Infektion mit
dem Bakterium Listeria monocytogenes im Mausmodell betrachtet. Derzeit wird die
funktionelle Wirkungsweise dieses Transmembranproteins als anti‐apoptotisches
Molekülbzw.alsRezeptorfürIgMkontroversdiskutiert.
TosodefizienteMäusewieseninderfrühenInfektionsphaseeinehoheMortalitätauf.Die
spezifischeDepletionderGranulozytenerhöhtedieSuszeptibilitätvonC57BL/6Mäusen
fürL.monocytogenes,wohingegenderadoptiveTransfervonC57BL/6Granulozytendie
ResistenzvonToso‐/‐Mäusenwiederherstellte.ErstmalskonntedieExpressionvonToso
aufGranulozytenundeinedurchPhagozytosebedingteHerunterregulationdesProteins
beschriebenwerden. Der Einfluss von Toso auf den Phagozytoseprozess von Bakterien
unddieSynthesevonROSkonntesowohl invitroalsauch invivonachgewiesenwerden.
Die Deletion von Toso auf Blutgranulozyten verringerte die IgM abhängige
Phagozytoserate von Bakterien. Desweiteren erhöhte Toso den Schwellenwert für die
Induktion der ROS‐Synthese und verhinderte eine frühzeitige Aktivierung und
Degranulation der Granulozyten im Blut. Als Folge dieser Dysregulation wiesen Toso
defizienteMäuseverminderteEffektorfunktionenderGranulozyten imGewebeundeine
erhöhtePathogenlastindenOrganenauf.
ImRahmen dieserDissertationwurde Toso alswichtiger Regulator für die Aktivierung
unddieKoordinationderEffektorfunktionenvonGranulozytenidentifiziert.
SUMMARY 2
1. SUMMARY
The initial control of bacterial infection depends on cells of the innate immune system.
Pathogens which are opsonized by the complement system and antibodies of different
isotypes are phagocytosed by granulocytes and eliminated by intracellular synthesis of
reactiveoxygen species (ROS).Disorders suchas chronic granulomatousdisease (CGD),
whichaffectthefunctionofgranulocytes,areoftenassociatedwithchronicandrecurrent
fungalandbacterialinfections.
Inthepresentwork,theimportanceoffasapoptoticinhibitorymolecule3(Faim3/Toso)
was investigated by a knockout mice during infection with the bacterium Listeria
monocytogenes. Currently, there is a controversial discussion about the functional
mechanism of this transmembrane protein as anti‐apoptoticmolecule or a receptor for
IgM.
Tosodeficientmice succumbed in theearlyphaseof infection.The specificdepletionof
granulocytes increased susceptibility of C57BL/6 mice for L. monocytogenes, while
adoptivetransferofC57BL/6granulocytesrestoredresistanceofToso‐/mice.Forthefirst
timeexpressionofTosoongranulocytesandaphagocytosisdependingdownregulationof
thisproteinweredescribed.AninfluenceofTosoforuptakeofbacteriaandsynthesisof
ROSweredemonstratedinvitroandinvivo.ThedeletionofTosoongranulocytesreduced
the IgM‐dependentphagocytosisofbacteria.Furthermore,Toso increased the threshold
for induction of ROS synthesis and prevented early activation and degranulation of the
granulocytes in the blood. As a consequence of this dysregulation Toso deficient mice
showed reduced effector functions of granulocytes in tissue and increased bacterial
burdenintheorgans.
InthecurrentthesisTosohasbeenidentifiedasanimportantregulatorfortheactivation
andcoordinationoftheeffectorfunctionsingranulocytes.
EINLEITUNG 3
2. EINLEITUNG
Mehrzellige Organismen sind einer Vielzahl von Pathogen ausgesetzt und haben
StrategienentwickeltsichdurchschnelleErkennungundeffizienteAbwehrmechanismen
zu schützen. Im Verlauf der Evolution hat sich zunächst das phylogenetisch ältere
angeboreneImmunsystementwickelt,dasinallenvielzelligenOrganismenvorkommtund
Eindringlinge unmittelbar und pathogenunspezifisch bekämpft. Das adaptive
Immunsystemhatsicherstindenletzten500MillionenJahrenentwickeltundistbeiallen
Wirbeltierenzufinden.EsisterregerspezifischundbenötignachPathogenkontakteinige
Tage bis zur Funktionalität. Zum angeborenen Immunsystem zählen mechanische
Barrieren wie die Haut, humoralen Faktoren wie das Komplementsystem und
PlasmaproteinensowiezelluläreFaktorenwieMakrophagen,Granulozyten,dendritische
Zellen(DC)undnatürlicheKiller(NK)‐Zellen.DasadaptiveImmunsystemsetztsichausB‐
und T‐Zellen zusammen, welche durch klonale Expansion von spezifisch gegen einen
Erreger ausgerichtete Effektorzellen Pathogene bekämpfen, die sich durch
Immunevasionsmechanismendemangeborenen Immunsystemzuentziehendrohen.Die
beidenArmedes Immunsystemssinddabeiengmiteinanderverknüpft.DieAktivierung
des adaptiven Immunsystems setzt zwingenddiePräsentationvonAntigenendurchdie
ZellendesangeborenenImmunsystemsvoraus(MedzhitovandJaneway,2000).
2.1. Listeriamonocytogenes
Die Gattung Listeria besteht aus sieben Arten, von denen nur Listeria monocytogenes
sowohl tier‐ als auch humanpathogen ist (Vazquez‐Boland et al., 2001a). Listeria
monocytogenes ist ein gram‐positives, stäbchenförmiges und fakultativ intrazellulär
replizierendesBakterium,welches eineKrankheit namens Listeriose verursacht (Sixl et
al.,1978).DieseverläuftbeiimmunkompetentenMenschenmeistsymptomlos,kannaber
in seltenen Fällen zu einer Gastroenteritis führen (Cossart, 2007). Bei
immunsupprimiertenundälterenMenschenkanneineakuteInfektionmitListerieneine
Meningoenzephalitis oder Sepsis hervorrufen, wohingegen Schwangere einen Abort
erleiden können (Antal et al., 2005; Gellin and Broome, 1989). Die Listeriose ist für
weniger als 1% der über Lebensmittel erworbenen Erkrankungen verantwortlich und
weisteineMortalitätsratevonüber20%auf(Vazquez‐Bolandetal.,2001b).
EINLEITUNG 4
2.1.1. Infektionszyklus
Der typische Infektionsweg von Listeria monocytogenes ist die orale Aufnahme über
kontaminierteNahrungsmittel.NachderAufnahmederBakterienwirddasEpithelgewebe
des Gastrointestinaltraktes infiziert, welches die Interaktion von Internalin A der
Bakterienzelle mit E‐Cadherin der Enterozyten benötigt (Gaillard et al., 1991). Die
Internalisation der Bakterien in dieWirtszelle erfolgt über einen Clathrin vermittelten
Zipper‐Mechanismus (Hamon et al., 2006). Mäuse sind gegen diese Infektionsroute,
aufgrund einer einzelnen Punktmutation zwischen humanen und murinen E‐Cadherin,
relativ resistent (Lecuit et al., 2001). Diese Problematik wird umgangen, indem im
Mausmodell meist eine intravenöse oder intraperitoneale Infektion durchgeführt wird.
Bei oraler Inokulation durchbrechen die Bakterien die Epithelschicht des Darmes und
gelangen über den Blutstrom zu den anderen Organen. In der Leber werden die
Hepatozyten durch die Expression eines weiteren Oberflächenproteins, Internalin B,
welcher an denHepatocyte growth factor receptor (HGFR) bindet, befallen (Shen et al.,
2000).NachdemEintrittindieWirtszelleentkommendieListeriendurchdieExpression
desHämolysinsListeriolysinO(LLO)ausdemPhagosominsZytoplasma(Bieleckietal.,
1990).ImWirtszytoplasmaexprimierendieListeriendasactin‐assembly‐inducingprotein
(ActA),welcheszurBildungvonActin‐PolymerenführtunddenBakterienBeweglichkeit
innerhalbdesZytoplasmasundzur InfektionderNachbarzellenverleiht (Domannetal.,
1992;Kocksetal.,1992).DerInfektionszyklusistinAbbildung2.1.dargestellt.
Abbildung2.1.: IntrazellulärerLebenszyklusvonListeriamonocytogenes.(1)EindringenderBakterienin die Wirtszelle über Internalin A oder B (InIA, InIB); (2) Überleben im Phagosom; (3) Lyse desPhagosomdurchLLO; (4)Vermehrung imZytosol; (5)FortbewegungmittelsAssemblierungvonAktindurchactin‐assembly‐inducingprotein(ActA)zueinemAktinschweif;(6)EindringenindieNachbarzelle;(7)ÜberlebenimDoppelmembran‐Phagosom;(8)LysedesPhagosoms;(9)ErneuteVermehrunginderNachbarzelle.
EINLEITUNG 5
2.1.2. Immunabwehr
Listeriamonocytogenesistseitden1960erJahreneinetabliertesSystem,umdiezellulären
Komponenten des angeborenen und adaptiven Immunsystems im Mausmodell zu
untersuchen (Mackaness, 1962). Innerhalb weniger Minuten nach einer intravenösen
Injektion befallen die Bakterien die Milz und die Leber, in welchen sie von
gewebsständigen Makrophagen aufgenommen werden (Conlan, 1996). Durch
proinflammatorische Zytokine angelockt, wandern die neutrophilen Granulozyten
chemotaktisch als erste Leukozytenpopulation zum Infektionsort und verhindern die
weitereReplikationderBakterien(Czuprynskietal.,1994;RogersandUnanue,1993).Die
sezerniertenZytokinederGranulozytenförderndieMigrationvonMakrophagenausdem
Blut zum Infektionsort (Guleria andPollard, 2001;Mandel and Cheers, 1980).Das vom
entzündetenGewebe freigesetzteChemokinCCL2rekrutiertvorallem inflammatorische
Monozyten, die sich am Infektionsort zu TNFα und iNOS produzierenden dendritischen
Zellen (TIP‐DCs) entwickeln (Serbina et al., 2003). Zusammen unterdrücken diese
frühinflammatorischen Zellen die weitere Replikation der Listerien bis die Zellen des
angeborenen Immunsystems entwickelt sind. Das Fehlen von einer dieser
ZellpopulationenführtzustarkgesteigerterSuszeptibilitätundMortalität(Czuprynskiet
al., 1994; Havell, 1987; Samsom et al., 1997; Serbina et al., 2003). Die endgültige
EliminierungderListerien istentscheidendabhängigvoneinerListerienspezifischenT‐
Zell Immunantwort. Die Verknüpfung zum adaptiven Immunsystem wird über die
PräsentationvonAntigenenaufdendritischenZellenundMakrophagengeschaffen.Diese
sind Teil des angeborenen Immunsystems und essentiell für die Generierung einer
potentenT‐Zell‐Immunantwort(Jungetal.,2002).DieEntwicklungbenötigteinegewisse
Zeit, weswegen die ersten Listerien spezifischen T‐Zellen vier bis fünf Tage nach der
InfektionauftretenunddenHöhepunktinderklonalenExpansionzwischendemsiebten
undneuntenTagderInfektionerreichen(Buschetal.,1998).NachderEliminierungdes
Pathogens kontrahieren die Listerien spezifischen T‐Zellen zu der kleineren
Zellpopulation der stabilenMemoryT‐Zellen. Diese sind verglichenmit naiven T‐Zellen
größer in der Anzahl, weisen einen niedrigeren Schwellenwert für die Aktivierungmit
einem spezifischen Antigen auf und erreichen sehr schnell bei einer wiederholten
Infektion ihre Effektorfunktionen. Auf dieseWeise schützenMemory‐T‐Zellen vor einer
Reinfektion mit Listerien (Bancroft et al., 1991; Bhardwaj et al., 1998). Die humorale
Immunantwort über B‐Lymphozyten spielt während einer Infektion mit Listerien eine
untergeordnete Rolle, da sich die meisten Listerien im Zellinneren aufhalten und die
EINLEITUNG 6
Verbreitung intrazellulär über die Nachbarzelle ohne Eintritt ins extrazelluläre Milieu
abläuft(Mackaness,1962).DennochtrageninnaivenTierennatürlichvorkommendeanti‐
ListerienAntikörperzuBeginnderInfektiondazubeidieAusbreitungderListerienindie
Organezureduzieren(Ochsenbeinetal.,1999).
2.2. Granulozyten
Granulozyten(vomlat.granulum„Körnchen")sindpolymorphkernige,zumangeborenen
Immunsystem zählende, Leukozyten und charakterisiert durch die Anwesenheit von
Granula im Zytoplasma. Anhand ihres Färbeverhaltens können sie in drei Gruppen
unterteiltwerden:neutrophile,basophileundeosinophileGranulozyten.Dieneutrophilen
Granulozyten sind für die Abwehr von Bakterien und Pilzen zuständig, während
eosinophileundbasophileGranulozytenvorrangigfürdieBekämpfungvonmehrzelligen
Parasiten (z.B. Würmern) verantwortlich sind. Den größten Anteil mit 50‐60% aller
LeukozytenimBlutstellendieneutrophilenGranulozytenvondenenjedenTag1011neu
gebildeteZellendasKnochenmarkverlassen(FurzeandRankin,2008).DieLebensdauer
eines neutrophilen Granulozyten nach dem Austritt aus dem Knochenmark ins Blut
beträgt bis zu acht Stunden. Werden sie jedoch durch einen Stimulus oder Pathogen
aktiviert,verlängertsichdieLebensdaueraufbiszuzweiTage(Kobayashietal.,2005).In
der folgenden Arbeitwird der Begriff Granulozyten ausschließlich für die neutrophilen
Granulozytenverwendet.
2.2.1. Granulozytopoese
Die Blutbildung (Hämatopoese) geht von pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen
(HSC) im Knochenmark aus, die aus einer Abfolge von hierarchischer Zellteilung alle
reifen Blutzellen hervorbringen (Cantor and Orkin, 2001). Die HSC sind durch die
Expression von CD34+ gekennzeichnet und durch asymmetrische Zellteilung entstehen
aus einer Stammzelle zwei verschiedene Tochterzellen (Giebel et al., 2006). Die eine
Tochterzelle verbleibt in einem pluripotenten, undifferenzierten Zustand, wodurch der
Stammzellpool im Knochenmark aufrecht erhalten bleibt, und die zweite Tochterzelle
differenziertzueinerProgenitorzellemiteingeschränktemDifferenzierungspotenzialaus
dersichentwederdiegemeinsamelymphoideProgenitorzelle(CLP)oderdiegemeinsame
myeloideProgenitorzelle(CMP)entwickelt(Akashietal.,2000a;Akashietal.,2000b).Aus
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EINLEITUNG 8
anschließend zum Myelozyten sind nur durch Proliferation gekennzeichnet. Hierbei
entstehen aus einem Promyelozytenmindestens achtMyelozyten. Aus demMyelozyten
entstehen durch Differenzierung zunächst stabkernige und abschließend die reifen
segmentkernigenGranulozyten(Borregaardetal.,1995).
2.2.2. EliminierungderListeriendurchGranulozyten
2.2.2.1. ErkennungvonPathogenen
Pathogene werden durch den Wirt über nicht im Wirtsorganismus vorkommende
Proteine,DNAoderRNA(Pathogen‐assoziiertemolekulareMuster(PAMPs))identifiziert.
Die PAMPs sind evolutionär hoch konservierte Strukturen, die für das Überleben des
Pathogensessentiellsind(z.B.LPS),weswegendiesekeinenImmunevasionsmechanismus
bilden können (Medzhitov, 2001) Die Erkennung der PAMPs erfolgt über die sehr
heterogene Gruppe der Pattern‐Recognition Receptors (PRRs), die in lösliche,
transmembrane und zytosolische PRRs eingeteilt werden. Die löslichen PRRs sind
vorwiegendCollektin,FicolinundPentraxin,dieandieOberflächevonBakterienbinden
und das Komplementsystems aktivieren (Iwasaki and Medzhitov, 2010). Durch die
Bindung der Komplementfaktoren opsoniert, werden die Pathogene von Granulozyten
über Komplementrezeptoren wie den Komplementrezeptor 3 (CD11b/CD18)
phagozytiert, wodurch zusätzlich deren Expression durch die Mobilisierung von in
Granula gespeicherten Rezeptoren verstärktwird (Berger et al., 1984; Sengelov, 1995).
Die transmembranen PRRs sind Toll‐like Rezeptoren und entweder auf der
Plasmamembran der Zelle oder in endosomalen/lysosomalen Organellen exprimiert
(Takeda and Akira, 2005). TLRs auf der Oberfläche von Granulozyten erkennen
konservierte Zellmembranstrukturenwie Lipopolysaccharide (LPS) von gram‐negativen
Bakterien(TLR4),Lipoteichonsäurevongram‐positivenBakterien(TLR2)oderFlagellin
(TLR5),wohingegenendosomaleTLRshauptsächlichNukleinsäurenerkennen(TLR3,7,
9) (Iwasaki andMedzhitov, 2010). TLRswerden von fast allen Zellen des angeborenen
und erworbenen Immunsystem exprimiert und die Erkennung von PAMPs durch TLRs
führt zur Aktivierung von Signaltransduktionswegen und in Abhängigkeit vom TLR zu
unterschiedlichen Genexpressionsmustern von Zytokinen, Chemokinen und
antimikrobiellen Proteinen (Iwasaki and Medzhitov, 2004; Takeda and Akira, 2005;
Takeuchietal.,1999).BeidenzytosolischenPRRssindfürdieGranulozytendieNOD‐like
EINLEITUNG 9
Rezeptoren(NucleotideOligomerizationDomain)vongroßerBedeutung.Dieseerkennen
2,6 Diaminopimelinsäure (meso‐DAP), ein Peptidoglycan konstitutiv exprimiert von
gram‐negativenBakterien,oderMDP(MuramylDipeptide),einPeptidoglycanvongram‐
positiven und gram‐negativen Bakterien, und führen zur Aktivierung von
inflammatorischenSignalkaskaden(Stroberetal.,2006).
Tabelle2.1.ÜbersichtderwichtigstenPRRsundentsprechendenLigandenbeieinerListerieninfektion.
PRR Ligand VorkommendesPRR
Collektin,Ficolin,Pentraxin
(Komplementsystem)KohlenhydratresteunddiversePAMPs
Löslich
TLR2Peptidoglykane
LipoteichonsäureZelloberfläche
TLR5 Flagellin Zelloberfläche
FPR fMLP Zelloberfläche
TLR9 UnmethylierteCpGDNA Intrazellulär
NOD2 MuramylDipeptide Intrazellulär
Die Granulozyten exprimieren außerdem zur Pathogenerkennung Formyl Peptide
Rezeptoren (fpr) die zu den G‐Protein gekoppelten Rezeptoren zählen (Migeotte et al.,
2006).ImMenschengehörenzuderfprFamilieFPR1,FPRL1undFPRL2,währendinder
Maus FPR1 und FPR2 beschrieben sind (Le et al., 2002;Migeotte et al., 2006). An FPR
bindet N‐formyl‐methionine‐leucine‐phenylalanine (fMLP), welcher ein Bestandteil
bakterieller Zellwände ist. Es wirkt chemotaktisch auf die Granulozyten und löst die
Zytokinproduktion und die Freisetzung von Granula aus (Hartt et al., 1999). Die
Bedeutung dieser Rezeptorenklasse für Granulozyten wurde in der fpr‐/‐ Maus
verdeutlicht, die eine stark erhöhte Suszeptibilität bei einer Infektion mit Listeria
monocytogenes aufweist (Gao et al., 1999). Die wichtigsten PRRs der Granulozyten
einschließlich deren Ligaden sowie deren Expression sind in der Tabelle 2.1.
zusammengefasst.
EINLEITUNG 10
2.2.2.2. SynthesevonSauerstoffradikalen
Nach der Erkennung und der Phagozytose von Pathogenen produzieren Granulozyten
große Mengen an Sauerstoffradikalen (reactive oxygen species ; ROS), ein Vorgang der
auch als Respiratory Burst bezeichnet wird, und für das Eliminieren der Pathogene im
Phagolysosomessentiell ist(Segaletal.,1981).DieRadikalewerdenzunächstdurchdie
NADPH‐Oxidase, welche in der Plasmamembran und im Phagosom lokalisiert und aus
sechs Untereinheiten aufgebaut ist, durch Oxidation von NADPH auf der zytosolischen
Membranseite und Reduktion von O2 auf der Außenseite der Membran gebildet
(Abbildung2.3.).BeidiesemVorgangentstehenzunächstSuperoxide(O2‐),dieaufgrund
ihrerInstabilitätdurchdieSuperoxid‐DismutaseindasstabileWasserstoffperoxid(H2O2)
umgewandelt werden. (Segal, 2005). DasWasserstoffperoxid dient als Substrat für die
Myeloperoxidase (MPO), die die Bildung von hypochloriger Säure (HOCL) unter
Verwendung von Chloridionen katalysiert und etwa 5 % des gesamten
Neutrophilenproteins und etwa 25 % des Granulaproteins ausmacht (Hampton et al.,
1998). Dieses hochreaktive Produkt reagiert mit der DNA, Proteinen und Lipiden der
MikroorganismenundinduziertdasAbsterbenderBakterien.
Abbildung2.3.: InduktiondesRespiratoryburstderGranulozyten.DiezytosolischenKomponentenderNADPHOxidase (p47phox,p67phox,p40phox,p21rac)assemblierennachPhosphorylierung imZytoplasmamitdenmembranständigenKomponenten(gp91,p22)zumvollständigenKomplex.Dieweiterep47phoxPhosphorylierungimKomplexführtzurAktivierungderNADPHOxidase,welcheunterVerwendungvonNADPHdurchReduktionvonO2O20‐katalysiert.
EINLEITUNG 11
Die ROS‐Synthese erfolgt in einem streng regulierten zweistufigen Prozess aus Priming
und Aktivierung der Granulozyten. Im nicht aktivierten Granulozyten sind einige
Untereinheiten der NADPHOxidase im Zytoplasma verteilt undwerden erst durch das
Primingphosphoryliert,wodurchdieseausdemZytoplasmazurMembranwandernund
zumvollständigenKomplexassoziieren(Clarketal.,1990;Dangetal.,1999;DeLeoetal.,
1998;Wientjesetal.,1993)(Abbildung2.3.).DurchdasPrimingwirdindenGranulozyten
kaumROSsynthetisiert,jedochdieSensitivitätaufeinenzweitenStimuluswiebakterielle
N‐formylPeptidepotenziertundanschließendgroßeMengenanROSsynthetisiert(Elbim
etal.,1994;Moreletal.,1991).DieBedeutungderNADPHOxidase fürdieEliminierung
vonMikrobenwurdebeimMenschenbeiderdurchdieDysfunktionderNADPHOxidase
verursachten Krankheitsgruppe chronische granulomatöse Erkrankung (CGD)
beschrieben,beiderdiePatientensuszeptibelgegenBakterienundPilzInfektionensind
(Thrasheretal.,1994;Winkelsteinetal.,2000).
2.2.2.3. RegulationderDegranulation
Die Granulozyten speichern in Granula Proteine mit vorwiegend antimikrobieller
Funktion, die in die Gruppen primäre, sekundäre, tertiäre und sekretorische Granula
unterteiltwerden(BorregaardandCowland,1997;Chertovetal.,2000).IndiesenGranula
sindüber300Proteineenthalten,die indieUmgebungabgegebenwerdenkönnenoder
mitderPlasmamembranverschmelzen(Lominadzeetal.,2005).WährendderMigration
vom Blut zum Infektionsort werden die Granula in einer festgelegten Reihenfolge
ausgeschüttet. Die sekretorischen Granula werden unverzüglich bei Kontakt der
Granulozytenmit dem Endothelium entleert, die tertiären bei derMigration durch das
Endothelium und die sekundären und primären am Infektionsort (Borregaard and
Cowland,1997;FaurschouandBorregaard,2003).DiesekretorischenGranulaenthalten
eine Ansammlung von Membranrezeptoren wie β2‐Integrine, Komplementrezeptoren,
Formyl Peptide Rezeptoren (fpr), CD14 und CD16, welche durch den Einbau in die
Plasmamembran die Morphologie der Granulozyten verändern und die zuvor relativ
inaktiven Granulozyten sensitiv auf inflammatorische Signale machen (Sengelov et al.,
1993a; Sengelov et al., 1993b). Desweiteren enthalten die sekretorischen Granula
UntereinheitenderNADPHOxidase(BorregaardandTauber,1984).DietertiärenGranula
beinhaltenvorallemMatrixdegradierendeProteine,diedieExtravasationundDiapedese
der Granulozyten ermöglichen (Joiner et al., 1989; Mollinedo et al., 1997). In den
sekundären Granula sind antimikrobielle Substanzen und Proteine (z.B. Lactoferrin,
EINLEITUNG 12
NGAL, Lysozyme) enthalten, die ins Phagosom oder nach außen abgegeben werden
(Maallemetal.,1982;Ogawaetal.,1983).DieprimärenGranulasindgefülltmitProteasen
und antimikrobiellen Proteinen wie Myeloperoxidase, Defensine, Cathepsin G und
Elastase(Riceetal.,1987;Salvesenetal.,1987;Sinhaetal.,1987).DasAusschüttender
Granula ist ein streng kontrollierter Vorgang, der als "regulierte Exozytose" bezeichnet
wird. (Nusse and Lindau, 1988; Toonen and Verhage, 2003). Die Exozytose der
Granulasubtypen ist dabei durch ansteigende Schwellenwerte für aktivierende Stimuli
kontrolliert. Die sekretorische Granula weisen einen niedrigeren Schwellenwert als
tertiäreundtertiäreeinenniedrigerenalssekundäreundprimäreGranulaauf(Kjeldsen
et al., 1993; Kjeldsen et al., 1992; Sengelov et al., 1993a) Die Granulasubtypenwerden
währendderverschiedenenDifferenzierungsstadienderGranulozyten imKnochenmark
gebildet undmit denProteinen gefüllt (Borregaard et al., 1995).NachdemAustritt der
Granulozyten ins Blut werden die neusynthetisierten Proteine nicht mehr in Granula
gepackt(Theilgaard‐Monchetal.,2004).
2.2.2.4. BildungvonNETs
Die Bildung von neutrophil extracellular traps (NET) ist ein alternativer Sterbevorgang
(Netose) zwischen Apoptose und Nekrose, wodurch die Granulozyten auch nach dem
SterbennochantimikrobilleFunktionbesitzen.WährendderNetoseschwilltderZellkern
anunddasChromatinwirdaufgelöst,wodurch langeSträngevonunkondensierterDNA
anderProteineausdemZytoplasmaunddenGranulasowieHistoneangeheftetsindaus
derZelleausgestoßenwerden(Brinkmannetal.,2004;BrinkmannandZychlinsky,2007).
DieNET‐ProteinesindwegenderBindungandieDNAhauptsächlichkationischgeladen
und sind überwiegend Defensine, Elastasen, Proteinase 3, Lactoferrin und
Myeloperoxidase(Urbanetal.,2009).DieBildungvonNETsistabhängigvonderSynthese
von Hydrogenperoxid durch die NADPH Oxidase und dessen weitere Metabolisierung
durch die Myeloperoxidase (Bianchi et al., 2009; Papayannopoulos et al., 2010). Die
fibrilläreMatrix derNETs bindet die Bakterien,wodurch deren Verbreitung verhindert
wird.DieNETswerdennacheinigerZeitdurchimBlutvorkommendeDNAsenabgebaut.
Menschen mit einer Störung der DNase‐1 Aktivität weisen ein höheres Risiko für
NierenentzündungenundZellschädenauf(Fuchsetal.,2007;Hakkimetal.,2010).
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EINLEITUNG 14
2.3.2. FunktionvonToso
DieErstpublikationzuTosobeschriebeineinhibitorischeAktivitätgegenFAS,TNFαund
FADD induzierte Apoptose, jedoch nicht gegen Staurosporine und Ceramide induzierte
Apoptose(Hitoshietal.,1998).DiesersignalwegspezifischeEffektlieseineinhibitorische
Wirkung von Toso auf die Caspase 8 vermuten. Die Interaktion der intrazellulären
DomänevonTosomitFADDunddienegativeRegulationderCaspase8konnte in einer
Folgestudienachgewiesenwerden(SongandJacob,2005).Ineinerkürzlicherschienenen
Publikation wurde die intrazelluläreWirkungsweise von Toso aufgeklärt. Den Autoren
zufolge bindet RIP1 konstitutiv an Toso und bildet einen trimolekularen Komplex mit
FADD,derbeiStimulationüberdenFASRezeptorstabilisiertwird(Nguyenetal.,2011).
AlsFolgestehtFADDnichtmehrfüreffizientesApoptosesignalüberdenaktiviertenFAS
RezeptorzurVerfügungundapoptotischeVorgängewerdenverringert.Tosoerhöhtsomit
denSchwellenwert fürdieFASinduzierteApoptose(Nguyenetal.,2011).DiesesModell
derFunktionvonTosokorreliertmitdenBeobachtungendurchRichteretal. beidenen
ein Knockdown von Toso in primären humanen T‐Zell zu einer erhöhten FAS Ligand
induziertenApoptoseführte(Richteretal.,2009).
InderletztenZeitwirddieanti‐apoptotischeWirkungvonTosokontroversdiskutiertund
eineFunktionvonTosoalsRezeptorfürIgMpostuliert,weswegenTosonunauchalsFcµR
bezeichnetwird(Kubagawaetal.,2009;Shimaetal.,2010).DieIgMbindendeEigenschaft
von Toso führte zu Zweifel an der in der Erstpublikation beschriebenen anti‐
apoptotischenWirkung, da dort ein anti‐FAS Antikörper vom IgM Isotypen verwendet
wurde.Kubagawaetal. konnten in ihrenVersuchen zeigen, dassTosoper se keine anti
apototischeWirkungbesitzt,sondernnurbeiLigationdesFASRezeptorsmiteinemanti‐
FASAntikörpersvomIgM,abernichtvomIgGIsotypen(Kubagawaetal.,2009).Innerhalb
weniger Minuten führt die Bindung von IgM an Toso in humanen B‐Zellen zur
InternalisationvonTosoundIgMundnachTransportinsLysosomzurDegradation(Vire
etal.,2011).DieIgMbindendeEigenschaftvonTosokonntejedochnichtvonNguyenetal.
beobachtetwerdenundwirdzurZeitkontroversdiskutiert(Honjoetal.,2012;Nguyenet
al.,2012). Jedochstütztsichdiebeschriebeneanti‐apoptotischeWirkungvonTosonicht
nur auf den FAS‐Ligand, sondern auch auf die mit den Zytokinen TNFα und TRAIL
induzierteApoptose(Nguyenetal.,2011).
EINLEITUNG 15
2.3.3. Expressionsprofil
DasMolekülTosowurdezunächstaufaktiviertenT‐Zellenidentifiziert,wohingegennaive
T‐Zellen kaumToso auf derOberfläche exprimieren (Hitoshi et al., 1998;Nguyen et al.,
2011).DieAnalysederGenexpressionmittelsMicroarrayhingegenzeigte,dassdiemRNA
vonTosoinnaivenundMemoryT‐ZellenstarkexprimiertistundbeiAktivierungderT‐
Zellenherunterreguliertwird(Abbasetal.,2005).DietransienteExpressiondesProteins
auf aktivierten T‐Zellen wird hierbei im Zusammenhang mit der anti‐apoptotischen
Wirkung gebracht (Nguyen et al., 2011). In den folgenden Jahren konnte zusätzlich die
ExpressionvonTosoaufnaivenB‐Zellen,eineHochregulationaufaktiviertenB‐Zellenund
eineExpressionaufNKT‐Zellennachgewiesenwerden(Kubagawaetal.,2009;Nguyenet
al., 2011; Pallasch et al., 2008). Eine Akkumulation von großen Mengen des Proteins
konnte in den Vesikeln des trans Golghi Netzwerkes aufgefunden werden (Vire et al.,
2011). ImMenschen gewann Toso an Bedeutung für die Forschung, nachdem bei CLL‐
Patienten (chronische lymphatische Leukämie), einem B‐Zell‐Non‐Hodgkin‐Lymphom,
eine Überexpression von Toso auf B‐Zellen beobachtet wurde (Pallasch et al., 2008;
PallaschandWendtner,2009).DasLevelderÜberexpressionkorreliertehierbeimitder
Intensität und Aggressivität der Erkrankung. Bei T‐Zellen konnte ebenfalls eine
ÜberexpressionvonTosomitAutoimmunerkrankungeninAssoziationgebrachtwerden.
In voll aktivierten T‐Zellen wird die Toso mRNA nach einiger Zeit herunterreguliert,
wohingegen die Microarray Analyse bei autoreaktiven T‐Zellen von Patienten mit
systemischenLupuserythematodes(SLE)einekonstitutiveTosoExpressionzeigte(Deng
etal.,2006).
2.4. Zielsetzung
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Relevanz von Toso im Mausmodell
während einer Infektion mit dem gram‐positiven Bakterium Listeria monocytogenes
untersucht.GranulozytensinddieerstenZellendesKörpers,diezurEindämmungeiner
bakteriellen Infektion ins entzündete Gewebemigrieren. Die Verbreitung der Bakterien
durchdieGranulozytenwirdimWesentlichendurchPhagozytoseundderanschließenden
Synthese von Sauerstoffradikalen (reactive oxygen species; ROS) verhindert. Wie diese
beidenAbwehrmechanismen synchronisiert sind, istweitestgehendunklar.DasZiel der
EINLEITUNG 16
Dissertation ist die funktionelle Einordnung des Membranproteins Toso auf die
RegulationdieserProzesse.
In Vorarbeiten konnte erstmals gezeigtwerden, dass Toso auf Granulozyten exprimiert
ist.ZurBeantwortungderobigenFragestellungwirdeineTosodefiziente(Toso–/–)Maus
verwendet.DerEinfluss vonToso auf diePhagozytoseunddie Synthese vonROS sollte
hierbei sowohl durch invitro Untersuchungen von naiven Granulozyten als auch durch
AnalysenderGranulozyteninvivowährendderInfektionmitListerienbetrachtetwerden.
Zur abschließendenBeurteilungderBedeutungvonToso sollten adaptiveGranulozyten
Transfersdurchgeführtwerden.
MATERIALUNDMETHODEN 17
3. MATERIALUNDMETHODEN
3.1. Material
3.1.1. ChemikalienundMedien
Die laborüblichen Standardchemikalien wurden von AppliChem (Darmstadt), Merk
(Darmstadt), Roth (Karlsruhe) oder Sigma‐Aldrich (München) bezogen. Medien für die
Zellkultur wurden bei Pan Biotech (Aldenbach), Biochrom (Berlin) oder Invitrogen
(Darmstadt)bestellt.
BrainHeartInfusion BDBioscience,Heidelberg
BrainHeartInfusionAgar Fluka,München
CarboxyfluoresceinSuccinimidylEster(CFSE) Invitrogen,Darmstadt
Cyclophosphamid(CY) Sigma,München
4',6‐diamidino‐2‐phenylindole(DAPI) Invitrogen,Darmstadt
dihydro‐ethidium(DHE) Invitrogen,Darmstadt
dihydro‐rhodamin123(DHR) Alexis,Lörrach
N‐Formylmethionyl‐Lencyl‐Phenylalanin(fMLP) Sigma,München
FACSLysingSolution BDBioscience,Heidelberg
FetalesKälberserum(FCS) BiochromAG,Berlin
Isofluran DeltaSelectGmbH,Pfullingen
LipopolysaccharidesvonEscherichiacoli(LPS) Sigma,München
peqGOLDTriFast™ PEQLABBiotechnologieGmbH,
Erlangen
Temozolomid Sigma,München
TNFα R&DSystems
3.1.2. Verbrauchsmaterial
Für die Zellkultur wurden Verbrauchsmaterialien von TPP (FaustLaborbedarf,
Schaffhausen)sowieCellstar(GreinerBio‐OneGmbH,Frickenhausen)verwendet.Weitere
MATERIALUNDMETHODEN 18
Lieferanten von Verbrauchsmaterial waren BD Bioscience (Heidelberg), VWR
International (Darmstadt), ebioscience (Frankfurt), Qiagen (Hilden) und Eppendorf
(Hamburg).
3.1.3. Geräte
Cell‐Observer Zeiss,Jena
ELISAReader AnthosLabtecInstrumentsGmbH,
Wals‐Siezenheim
FACSCalibur BDBioscience,Heidelberg
FACSCanto™II BDBioscience,Heidelberg
Fluoreszenz‐MikroskopHSBZ‐9000 KeyenceGmbH,Neu‐Isenburg
Gefrierschrank‐80°C ThermoScientific,Schwerte
KryostatCM3050S Leica,Wetzler
NanoDropND‐1000 PeqlabBiotechnologieGmbH,
Erlangen
Neubauer‐Zählkammerimproved KarlHechtGmbH&CoKG,Sondheim
pHMessgerät WTWGmbH,Weilheim
Thermoblock OehmenGmbH,Essen
TissueLyserII QIAGEN,Hilden
Untertisch‐Zentrifuge HeraeusInstrumentsGmbH&Co.KG,
Düsseldorf
Micro220R‐Zentrifuge AndreasHettichGmbH,Tuttlingen
3.1.4. Kits
AnnexinVApoptosisDetectionKitII BDPharmigenTM,Heidelberg
BrdUFlowKit BDPharmigenTM,Heidelberg
(anti)Ly6GMicroBeadKit MiltenyiBioTech,Bergisch‐Gladbach
MouseGM‐CSFELISASetBDOptEIA™ BDBioscience,Heidelberg
MPOELISAKit HycultBiotech,Beutelsbach
QuantikineMouseM‐CSFELISAKit R&DSystems,Inc.,Minneapolis, MN,
USA
QuantiTectReverseTranscriptionKit QIAGENGmbH,Hilden
MATERIALUNDMETHODEN 19
SYBR®Green AppliedBiosystems,Darmstadt
3.1.5. Software
7500Softwarev2.0.1 AppliedBiosystems,Darmstadt
AxioVisionRel.4.7 CarlZeissMicroImagingGmbH,Jena
FacsDivav&6.2.1 BDBioscience
FlowJo7.6.1 TreeStarInc.,Ashland(OR,USA)
GraphPadPrism5 GraphPadSoftware,LaJolla
(CA,USA)
MicrosoftOffice2007 MicrosoftCorporation,Redmont
(WA,USA)
PhotoshopCS3 AdobeSystems,München
3.1.6. LösungenundPuffer
Medien wurde teilweise Antibiotika aus einer Kombinationslösung bestehend aus
Penicillin, Streptomycin und L‐Glutamin (PSG; Sigma‐Aldrich, München) zugesetzt. Das
zum Ansetzen von Lösungen verwendete Wasser wurde doppelt destilliert von der
Universitätsapotheke der HHU bezogen oder über eine Millipore‐Anlage (Millipore,
Darmstadt)eigensdoppeltdestilliertundfolgendalsddH2Obezeichnet.
Zellkulturmedien
BMMΦ VLE‐DMEM 10%(v/v)FCS 50mMβ‐Mercaptoethanol
GM‐CSF VLE‐DMEM 5%(v/v)FCS 50mMβ‐Mercaptoethanol
M‐CSF VLE‐DMEM 10%(v/v)FCS
MATERIALUNDMETHODEN 20
Lösungen
FACS‐Puffer PBS‐ 2%(v/v)FCS 0,1%(v/v)NaN3
2mMEDTA
MACS‐Puffer 0,5%(v/v)FCS 2mMEDTA PBS‐
EDTA‐Lösung 0,5MEDTA pH8,0
Erythrozyten‐Lyse‐Puffer 0,5MNH4Cl2 10mMKHCO3 0,1mMEDTA pH7,42
Einfriermedium 20%(v/v)DMSO 80%(v/v)FCS
Sodiumazid(100x) 10%(v/v)NaN3
3.1.7. Primer
IndieserArbeitwurdenfolgendeQuantiTectPrimerAssay(QIAGEN,Hilden)verwendet.
Mm_Rn18s_2 18SRNA
Mm_Faim3_1 FAIM3/Toso
3.1.8. Antikörper
In dieser Arbeit wurden direkt fluoreszenzgekoppelte Antikörper von BD Pharmigen
(Heidelberg) sowieeBioscience (Frankfurt)bezogenundnachAnleitungdesHerstellers
verwendet. Die Detektion von Toso erfolgte mit Toso‐spezifischen IgG anti‐Maus
Antikörper,welcherimLaborvonFrauKyeong‐HeeLeehergestelltwurde(Nguyenetal.,
2011).DiegenutztenFluorochromewarenFITC,PE,PerCP,APC,undPeCy7.
MATERIALUNDMETHODEN 21
3.1.9. Listeriamonocytogenes
Listeriamonocytogenes (Stamm43251;ATTC,Wesel)BakterienwurdenvonProf.Klaus
Pfeffer (Institut fürMedizinischeMikrobiologie und Krankenhaushygiene der Heinrich‐
Heine‐UniversitätDüsseldorf)zurVerfügunggestelltundwurdenmitbrainheartinfusion
Medium(BHI‐Medium)kultiviert.
3.1.10. Zellen
In der hier vorgestellten Arbeit fanden die murine Fibroblasten‐Zelllinie L‐929 zur
Generierung von M‐CSF und die Myelom‐Zelllinie X63 zur Herstellung von GM‐CSF
Verwendung.
3.1.11. Versuchstiere
Die verwendeten Versuchstiere (Musmusculus) wurden in der zentralen
TierversuchsanlagederHeinrich‐Heine‐UniversitätDüsseldorfundderUniversitätsklinik
Essen gehalten. Die Mäuse wurden in Kunststoffkäfigen entsprechend den deutschen
Gesetzen fürdenTierschutzgehalten.DieVersuchstierewurdenmitStandardfutterund
Wasser adlibitum ernährt und in einem regelmäßigen zwölf Stunden Tag/Nacht‐
Rhythmus gehalten. Die Tierhaltung erfolgte zum Teil unter spezifisch pathogenfreien
Bedingungen (SPF). Alle in dieser Arbeit verwendeten Deletionsmutanten wurden
mindestens für zehn Generationen auf C57BL/6J‐Hintergrund zurückgekreuzt.
Experimentelle Versuche wurden ausschließlich mit Gewicht‐ und Alters‐angepassten
zwischenachtundzwanzigWochenaltenMäusendurchgeführt.
CD11b‐/‐ C57BL/6J.129S4‐Itgamtm1Myd/J
JH‐/‐ C57BL/6J.129Sv‐JHtm
Toso‐/‐ C57BL/6J‐tosotm
Toso‐/‐xCD11b‐/‐ C57BL/6.129S4‐tosotmItgamtm1Myd
sIgM‐/‐ C57BL/6.129Sv‐sIgMtm
MATERIALUNDMETHODEN 22
3.1.12. Statistik
DieDatenwurdenalsMittelwerteunddieStandardabweichungalsSEMangegeben.Zur
statistischenAnalysewurdezumVergleichzweierGruppenderungepaarteStudent´sttest
verwendet. Statistische Signifikanzen der Messergebnisse über mehrere Zeitpunkte
wurden über 2‐Wege ANOVA berechnet. Für die statistische Analyse bei
ÜberlebenszeitexperimentenwurdederMantel‐Cox(Log‐Rank)Testverwendet.
3.2. Methoden
3.2.1. ExperimentelleArbeiteninvivo
3.2.1.1. InfektionenmitListeriamonocytogenes
Die Verabreichung von Listeriamonocytogenes (Listerien) wurde intravenös in die
Schwanzvene der Tiere unter einer Sterilbank durchgeführt. In der Regel wurde eine
sublethale Konzentration von 104CFU Listerien in einer Infektionsröhre mit einer 24G
Edelstahlkanüle (Terumo Neolus®, Neuwied) appliziert. Die Listerien wurden
entsprechendinPBSverdünntundineinemVolumenvon200µlverabreicht.
3.2.1.2. DepletionvonGranulozyten
DieGranulozytenwurdeneinenTagvorderInfektionmitListeriendurchdieintravenöse
Verabreichung von 200µg des anti‐Gr1 Antikörpers NimpR14 (BD Bioscience,
Heidelberg) depletiert. Die chemische Eliminierung der Leukozyten erfolgte
intraperitoneal mit Cyclophosphamid (200mg/kg Körpergewicht) und Temozolomid
(90mg/kgKörpergewicht)dreiTagevorderInfektionmitListerien.
MATERIALUNDMETHODEN 23
3.2.1.3. VoraktivierungderGranulozyteninvivo
C57BL/6 Mäuse wurden mit 104CFU Listerien infiziert. Jeweils eine Gruppe blieb
unbehandeltundbekamPBS.EinerweiterenGruppewurden120ngGM‐CSFbzw.120ng
GM‐CSFund100ngfMLPanTagen1,2und3p.i.verabreicht.
3.2.1.4. ApplikationvonBrdU
BrdU wurde in einer Konzentration von 10mg/ml in PBS angesetzt und über einen
Zeitraum von zwei Tagen alle 12 Stunden jeder Maus intraperitoneal 200µl (2mg)
appliziert.DieDetektionvonBrdU inGranulozytenausdemBluterfolgtenachAngaben
desHerstellers.
3.2.1.5. AdoptivtransfervonGranulozyten
Für den adoptiven Transfer von Granulozyten wurden 8x106 aufgereinigte Zellen
intravenösinPBS‐verabreicht.HierfürwurdedasKnochenmarkausFemurundTibiader
Hinterbeine von C57BL/6 oder Toso‐/‐ Mäusen steril isoliert. Die Granulozytenwurden
anschließend durch dieMagnet assoziierte Aufreinigung (MACS)mit dem Ly6G‐Kit von
MiltenyiBiotecangereichertundnurZellfraktionenmiteinerReinheitvon>95%weiter
verwendet.
3.2.1.6. Blutentnahme
Den Versuchstieren wurde venöses Blut aus dem retrobulbären Venenplexus unter
NarkosemitIsofluran(DeltaSelect,Pfullingen)entnommen.Biszu200µlVollblutwurden
je nach Verwendungszweck in unbeschichte Röhrchen für Serum oder in
heparinbeschichte Röhrchen für Plasma gegeben. Das heparinisierte Blut wurde
vorwiegend direkt für dieDurchflusszytometrie verwendet,währenddas Serum für die
Bestimmung von Antikörpern verwendet wurde. Die Abtrennung des Serums und vom
geronnenenBluterfolgtedurch30minütigeInkubationdesentnommenenBlutesaufEis
MATERIALUNDMETHODEN 24
und anschließender 10minütiger Zentrifugation bei 6000rpm. Das Serum sowie das
PlasmawurdenbiszurweiterenVerwendungbei‐20°Cgelagert.
3.2.1.7. Organentnahme
Die Entnahme von Organen erfolgte nach zervikaler Dislokation der Versuchstiere. Das
FellderTierewurdedesinfiziertunddasPeritoneumgeöffnet.DieOrganewurdenfürdie
TiterbestimmungderListerien, Immunhistologie,Untersuchungvon Immunzellen sowie
fürdieRNA‐Isolationentnommen.ZurBestimmungbakteriellerTiterimGewebewurden
die entnommenen Organe in 2ml Eppendorfgefäßen (Eppendorf GmbH, Hamburg) mit
1ml PBS und einer Metallkugel (QIAGEN, Hilden) überführt und 10min bei 30rps im
TissueLyser (QIAGEN, Hilden) homogenisiert. Für immunhistologische Untersuchungen
wurdenOrganstückenachderEntnahmeinHistoröhrchenmitO.C.T.Kryoeinbettmedium
(TissueTek;Weckert,Kitzingen)überschichtetundimflüssigenStickstoffschockgefroren.
BeiderUntersuchungvonZellenwurdendieOrganeimMediumaufEisbiszumGebrauch
verwahrt.FürdieRNA‐IsolationwurdenkleineOrganstückein1,5mlEppendorfgefäßen
inflüssigemStickstoffschockgefroren.
3.2.1.8. Knochenmarkchimären
C57BL/6 Mäuse wurden mit 1050rad in einer Kobalt‐Anlage in der Radiologie der
Universitätsklinik Düsseldorf bestrahlt. Am Folgetag wurden die Tiere mit einem 1:1
Gemisch (107Zellen) Knochenmarkszellen isoliert aus C57BL/6xCD45.1 sowie
Toso‐/‐xCD45.2 intravenös rekonstituiert. Die Adaptionszeit nach der Rekonstitution
betrugmindestens30Tage.
3.2.2. ArbeitenmitListerien
3.2.2.1. KultivierungvonListerien
Zur Animpfung einer Listerien‐Flüssigkultur wurden 10‐20µl Stockkultur ca. 12h bei
37°Cund200rpmin3mlautoklaviertenBHI‐MediumsimSchüttelinkubatorkultiviert,so
MATERIALUNDMETHODEN 25
dasseineOD600von0,7bis1,3erreichtwurde.EineODvon1,0entspricht109Listerien
proml.
3.2.2.2. CFSE‐Listerien
109CFUListerienwurdenin10mlPBSmit50µMCarboxyfluoresceinsuccinimidylester
(CFSE)10minbei37°C inkubiert.NachzehnminütigerZentrifugationbei4000rpmund
4°C wurden die CFSE‐Listerien zunächst zweimal mit 10%FCS/PBS gewaschen und
anschließendzweimalmitDMEMgewaschen.
3.2.2.3. BestimmungbakteriellerTiterindenOrganen
Die Milz, Leber und in einigen Fällen das Gehirn wurden entnommen und in einem
Eppendorfgefäß mit 1ml PBS und einer Metallkugel (QIAGEN, Hilden) im TissueLyser
(QIAGEN,Hilden)für10minbei30rpshomogenisiert.AnschließendwurdendieOrgane
aufEisverwahrtundamselbenTagdieTiterbestimmungdurchgeführt.Dazuwurdenin
96‐Well Platten 135µl PBS vorgelegt und 65µl des homogenisiertenOrgans horizontal
titriert. Anschließend wurden 25µl aus jedem zweiten Well (jeweils annähernd 1:10
VerdünnungderAnfangskonzentration)aufeine24‐WellPlattemitBHI‐Agarüberführt.
DiePlattewurdeüberNachtbei37°C inkubiertundanschließenddieCFUderListerien
ausgezählt.
3.2.3. ExvivoArbeitenmitGranulozyten
3.2.3.1. GranulozytenPrimingundAktivierung
10µl peripheren Blutes entsprechender Untersuchungstiere wurden mitmTNFα (R&D
Systems, Wiesbaden), LPS (Sigma Aldrich, München) oder GM‐CSF (Kapitel3.2.9.2) für
30min bei 37°C in einem Gesamtansatz von 100µl Antikörperlösung inkubiert.
Anschließend wurden die Granulozyten für 15min mit 2µl fMLP (Sigma Aldrich,
München) aktiviert. Im Gesamtansatz befanden sich die fluoreszenzgekoppelten
Antikörper anti‐Gr1 und anti‐CD11b und zur Detektion von ROS Dihydrorhodamin
MATERIALUNDMETHODEN 26
(50µg/ml;Alexis,Lörrach).AnschließendwurdedasBlutmitFACS‐Lysing‐Solution (BD
Bioscience, Heidelberg) lysiert. Für Primingstudien wurde der Ansatz bereits nach der
Inkubation mit TNFα, LPS oder GM‐CSF lysiert. Für die Detektion von ROS nach der
AktivierungmitfMLPwurdedasBlutdirektfür30minmitverschiedenenKonzentration
des Reagenz bei 37°C inkubiert. Bei der Detektion von ROS in Verbindung mit CFSE
gelabelten Listerien wurde ersatzweise Dihydroethidium (DHE; Invitrogen, Darmstadt)
anstattDihydrorhodamin(DHR)verwendet.
3.2.3.2. DetektionvonROSinvivo
C57BL/6 und Toso‐/‐Mäuse wurden mit 104CFU Listerien infiziert und an den
angegebenen Tagen Blut oder die Organe entnommen. Die ROS‐Synthesewurde in der
DurchflusszytometrieunterderVerwendungvonDihydrorhodamin(DHR)detektiertund
entwederderprozentualeAnteilderROSproduzierendenGranulozytenbezogenaufdie
Gesamtpopulation der Granulozyten oder die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von
DHRangegeben.BeiderDetektionvonROSimBlutwurdevorderDurchflusszytometrie
eineErythrozyten‐LysemitderFACS‐LysingSolutiondurchgeführt.
3.2.3.3. EinflussvonIgMaufROS
Peripheres Blut wurde zur Entfernung von löslichem IgM über eine fünfminütige
Zentrifugation bei 300g und 4°C dreimalmitMedium gewaschen. Anschließendwurde
das gewaschene Blut in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an aufgereinigtem
murinenIgMκ(BDBioscience,Heidelberg)und160ng/mlGM‐CSFfüreinehalbeStunde
undfürweitere15minmit2µMfMLPbei37°Cinkubiert.DerVersuchsansatzbestehend
ausDMEM‐Mediumversetztmitanti‐Gr1,anti‐CD11bundDHR,demBlutsowiedemfMLP
umfassteeinGesamtvolumenvon100µl.ImAnschlussandieInkubationwurdedasBlut
mitFACS‐LysingSolution(BDBioscience,Heidelberg)lysiertunddieROSproduzierenden
GranulozyteninderDurchflusszytometriedetektiert.
MATERIALUNDMETHODEN 27
3.2.3.4. PhagozytosevonListerien
DasperiphereBlut(10µl)wurdefüreineStundemit106CFUCSFE‐Listerienbei37°Cin
einem Gesamtansatz von 100µl DMEM‐Medium versetzt und mit Fluoreszenz
gekoppeltem anti‐Gr1 Antikörper inkubiert. Anschließendwurde der Ansatzmit FACS‐
Lysing Solution (BD Bioscience, Heidelberg) lysiert und die CFSE‐Listerien positiven
GranulozyteninderDurchflusszytometriequantifiziert.FürdiehistologischeBetrachtung
der Phagozytose wurden 106CFU CFSE‐Listerien mit 30µl Blut für zwei Stunden in
Gegenwart von Penicilin und Streptamycin bei 37°C inkubiert. Im Inkubationsansatz
befanden sich dieAntikörper anti‐Gr1 und anti‐CD11b.Nach der Inkubationwurde das
Blutfixiert,aufObjektträgerzentrifugiertundanschließendkonfokalmikroskopiert.
3.2.3.5. IgMabhängigePhagozytose
C57BL/6undsIgM‐/‐Mäusewurdenmit104CFUListerien infiziertunddreiTagespäter
dasBlutzurGewinnungvonSerumentnommen.106CFUCFSE‐Listerienwurdenfüreine
Stundemit10µlSerumproAnsatzübereinenZeitraumvon60minbei4°Cvorinkubiert.
AnschließendwurdendieBakterienfüreineStundemitgewaschenemBlutvonC57BL/6
undToso‐/‐Mäusenbei 37°C inkubiert.DerAnsatzwurdemitFACS‐LysingSolution (BD
Bioscience, Heidelberg) lysiert und die CFSE‐Listerien positiven Granulozyten in der
Durchflusszytometriequantifiziert
3.2.3.6. OberflächenexpressionvonToso
Das Knochenmark entsprechender Versuchstiere wurde isoliert und
106Knochenmarkszellenbei37°C füreinehalbeStundemit108CFUListerien inkubiert.
AnschließendwurdendieZellenzweimal10minbei1200gund4°CmitDMEM‐Medium
gewaschen und für weitere 30min einem FC‐Block mit murinem anti‐CD16/CD32 (BD
Bioscience, Heidelberg) unterzogen. Nach erneutem Waschschritt wurden die Zellen
30minmiteinemToso‐spezifischenIgGanti‐MausAntikörper,welcherimLaborvonFrau
Kyeong‐HeeLeehergestelltwurde,undmitanti‐Gr1oderanti‐CD19Antikörperngefärbt.
AnschließendwurdederAnsatzzweifachwieobenbeschriebengewaschen,dieZellenfür
zehn Minuten mit 2µl 7AAD je Ansatz inkubiert und die Analyse in der
MATERIALUNDMETHODEN 28
Durchflusszytometrie durchgeführt. Unter Ausschluss toter Zellen (7AAD+) wurde die
ExpressionvonTosoalsmittlereFluoreszenzintensitätquantifiziert.
3.2.3.7. IntegrinExpressionimnaivenBlut
FürdieDetektionderExpressionvonCD11a,CD11bundCD18aufGranulozytenwurden
10µlfrischentnommenenBlutesdirektmit2%Formalin/PBS10minfixiert.Diefixierten
Zellen wurden 30min mit anti‐Gr1 und anti‐Cd11a (BD Biosciences, Heidelberg), anti‐
CD11b, oder anti‐CD18 (eBiosciences, Heidelberg) Antikörpern bei 4°C inkubiert und
anschließend das Blut lysiert. Die Expression der Oberflächenantigene wurde in der
DurchflusszytometrieanalysiertundalsmittlereFluoreszenzintensitätquantifiziert.
3.2.3.8. Hitzeschock
10µl des peripheren Blutes von C57BL/6 undToso‐/‐ Mäusenwurden in 100µl DMEM
versetztmit2%FCSsowieanti‐Gr1undanti‐CD11b30minbei4°C,15°C,24°C,37°Cund
42°C inkubiert. Das Blut wurde anschließend mit der FACS‐Lysing Solution (BD
Bioscience, Heidelberg) lysiert und die Degranulation der Granulozyten in der
DurchflusszytometrieüberdieVerringerungderGranularitätimSeitwärtsstreulicht(SSC)
bestimmt.
3.2.3.9. ApoptosevonGranulozyten
20µlHeparinbehandeltenVollbluteswurdenmit40ng/mlGM‐CSFübereinenZeitraum
von sieben Stunden bei 37°C inkubiert oder blieben unbehandelt. Die Detektion
apoptotischerVorgängewurdeunterderVerwendungvonAnnexinVApoptosisDetection
Kit II (BD Pharmingen, Heidelberg) nach Anleitung des Herstellers durchgeführt.
Apoptotische Zellen wurden in der Durchflusszytometrie als 7AAD+/‐ und AnnexinV+
definiert.
MATERIALUNDMETHODEN 29
3.2.4. ZellkulturprimärerMakrophagen
C57BL/6sowieToso‐/‐MakrophagenwurdenausdemKnochenmarkderTiereunterder
Verwendung von M‐CSF generiert und am zehnten Tag nach Differenzierungsbeginn
verwendet.FürimmunhistologischeUntersuchungenwurden105lebenderMakrophagen
(Trypanblau) zwölf Stunden vor dem Beginn des Experiments auf Cover‐Slips ausgesät
undbei37°Cadhärierenlassen.AnschließendwurdedasKulturmediumgewechseltund
dieMakrophagenfürzweiStundenmitCFSEgelabeltenListerieninkubiert.ImAnschluss
wurden die Zellenmit 2% Formalin/PBS fixiert und für die konfokaleMikroskopiemit
anti‐F4/80fluoreszenzgekoppeltenAntikörpergefärbt.
Zur Ermittlung der Pathogen‐Eliminierungskapazität von Makrophagen wurden 105
lebenderZellenfürzwölfStundenunterZusatzvon10ng/mlTNFαsowie200UnitsIFNγ
in einer 24‐Well Platte ausgesät. Anschließendwurden dieMakrophagen zwei Stunden
mit 105 CFU Listerien (MOI1,0) bei 37°C inkubiert und im Anschluss die Wells zur
EntfernungverbliebenernichtphagozytierterBakterienviermalmitMediumgewaschen.
Zur Bestimmung der noch infektiösen, nicht eliminierten Bakterientiter wurden die
Makrophagen zwei Minuten mit einer 50% Saponin/PBS‐Lösung inkubiert, was eine
Permeabilisierung der Makrophagenzellmembran zufolge hatte. Anschließend konnten
diebakteriellenTiterbestimmtwerden.
3.2.5. UntersuchungvonRNA
DieRNAausGewebenwurdemitTriFast®Trizol (PeqLab,Erlangen)nachAngabendes
Herstellersisoliert.FürdieIsolationwurdeninderRegelOrganstückemiteinemGewicht
von 50‐100mg verwendet, welche mit einer Metallkugel (QIAGEN, Hilden) 5min bei
30rps im Trizol mittels TissueLyser (QIAGEN, Hilden) homogenisiert wurden. Zur
Qualitätskontrolle der isolierten RNA wurden 500ng Gesamt‐RNA elektrophoretisch
aufgetrennt. Anschließend wurde 1µg Gesamt‐RNA unter der Verwendung des
QuantiTectReverseTranscriptionKits(QIAGEN,Hilden)nachHerstellerangabenincDNA
umgeschrieben. Die relative Genexpression wurde in der quantitativen realtimePCR
unterderVerwendungvonSYBR®Green (AppliedBiosystems,Darmstadt)nachAngaben
desHerstellers quantifiziert. Hierfürwurden jeMessansatz 50ng cDNA verwendet. Die
relative Transkriptmengewurde nach 40Zyklen auf die 18S rRNA abgeglichen und als
MATERIALUNDMETHODEN 30
2‐ΔCtangegeben.EinTranskript,welchesnach40Zyklennichtamplifizierbarwar,galtals
nichtdetektierbar(ND).
3.2.6. ELISA
ZytokinkonzentrationenvonGM‐CSFundM‐CSFausdenZellüberständen(KAP)wurden
mittels ELISA nach Angaben der entsprechenden Hersteller bestimmt. MPO wurde im
PlasmanachAngabendesHerstellersquantifiziert.
3.2.7. Durchflusszytometrie
Die durchflusszytometrische Untersuchung von Leukozyten heparinisierten Vollblutes
sowie Zellen isoliert aus Organen erfolgte am FACSCanto IITM oder FACSCalibur (BD
Biociences, Heidelberg). Es wurdenmaximal 2x106Zellen einer Einzelzellsuspension in
einem FACS‐Röhrchen (BD Biosciences, Heidelberg) mit 50µl Antikörperlösung,
bestehendausFACS‐PufferoderMediumundfluoreszenzgekoppeltenAntikörpern30min
bei 4°C oder 37°C im Dunkeln inkubiert. Zur Bestimmung von absoluten Zellzahlen
wurden der Antikörperlösung bei Bedarf Kallibrierungsbeads (BC CalibriteTMBeads; BD
Bioscience, Heidelberg) zugesetzt. Die Antikörper wurden nach Herstellerangaben
verwendet.AnschließendandieInkubationwurdedasBlutmitFACS‐Lysing‐Solution(BD
Bioscience) nachHerstellerangaben lysiert, durch fünfminütige Zentrifuagtionbei 300g
und4°CgewaschenundanschließendinderDurchflusszytometrieanalysiert.ToteZellen
wurdenmitDAPIgefärbt(Invitrogen,Darmstadt).
3.2.8. Immunhistochemie
Am Kryostat wurden aus den entsprechend vorbereiteten Organen (KAP) 8mm dicke
OrganschnitteaufObjektträgernangefertigt.NacheinereinstündigenTrocknungszeitbei
RTwurden die Schnitte für 10min in Aceton fixiert und nach kurzer Abdampfungszeit
unspezifische Bindungsstellen durch zehnminütige Inkubation in einer Blocklösung
(10%FCS/PBS) abgesättigt. In einer Färbekammer wurden die Kryoschnitte mit
fluoreszenzgekoppelten Antikörpern gelöst und im Gesamtvolumen von 100µl
Blocklösung 30min im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger mit
MATERIALUNDMETHODEN 31
BlocklösunggewaschenundmitEindeckmedium(FluorescenceMountingMedium;Dako,
Hamburg)luftblassenfreieingedeckelt.
3.2.9. Zellkultur
3.2.9.1. ErntenvonZellen
ZumAberntenadhärenterZellenwurdedasKulturmediumverworfenundderZellrasen
zweifach mit PBS gewaschen. Anschließend wurden 0,1V des Kultivierungsmediums
Trypsin/EDTA‐Lösung (Biochrom, Berlin) in die Flasche gegeben und nach einer
Inkubationszeit von 3 bis 5min bei 37°C die Zellen mit entsprechendem FCS haltigem
Medium abgestoppt. Das Abklopfen der Kulturflasche löste die Zellen ab, die dann bei
300g und 4°C 10min zentrifugiert und im frischen Medium resuspendiert werden
konnten.
3.2.9.2. GenerierungvonGM‐CSFundM‐CSF
Zur Herstellung von GM‐CSF wurde eine transgene Zelllinie (X63‐GMCSF,
Dr.Karasuyama, 1988; Basel) nach beschriebenen Protokollen verwendet (Karasuyama
andMelchers, 1988; Stockinger andHausmann, 1994; Stockinger et al., 1996; Zal et al.,
1994). Die Kultivierung erfolgte im VLE‐DMEM mit 50µM ß‐Mercaptoethanol und
5%FCS. Nach einer zweitägigen Expansion der frisch aufgetauten Zellen wurden diese
geerntet und 8x105 Zellen pro 175cm2 Zellkulturflasche in 40ml Medium über einen
Zeitraum von sieben Tagen inkubiert. Anschließend erfolgte die
KonzentrationsbestimmungüberELISA(Kapitel3.2.6).
M‐CSFwurdeausdemÜberstandvonL929Zellen,welcheinVLE‐DMEMversetztmit5%
FCSund50µMß‐Mercaptoethanol ineiner175cm2Zellkulturflaschekultiviertwurden,
gewonnen.Hierfürwurden8x105Zellenauf175cm2Zellkulturflascheverteiltundbiszur
Konfluenzinkubiert.Nachweiteren24bis48StundenwurdederÜberstandabgenommen
unddieZytokinkonzentrationübereinenELISAbestimmt(Kapitel3.2.6).
DerÜberstandbeiderZelllinienwurdenachderAbnahme20minbei4000rpmund4°C
zentrifugiertundanschließendmiteinem0,45µmFilter(VWR,Darmstadt)sterilfiltriert.
MATERIALUNDMETHODEN 32
3.2.9.3. GenerierungvonMakrophagenausKnochenmark(MΦ)
Die Generierung von Makrophagen erfolgte unter dem Einfluss des Wachstumsfaktors
M‐CSF bei dem sich aus myeloiden Stammzellen im Knochenmark Makrophagen
entwickeln (Weischenfeldt and Porse, 2008). Das Differenzierungsmedium wurde mit
0,4ng/ml M‐CSF versetzt. Die Isolation und Kultivierung wurde nach bereits
beschriebenen Protokollen durchgeführt (Ehlting et al., 2011;Weischenfeldt and Porse,
2008). An Tag acht bis zehn nach Differenzierungsbeginn konnten die generierten
Makrophagenexperimentellverwendetwerden.
3.2.9.4. AufreinigungvonGranulozytenmittelsMACS®Sort
DieAufreinigungvonGranulozytenerfolgtealspositiveSelektion(MACS®CellSeparation
anti‐Ly6GMicroBeadsKit;Miltenyi,Bergisch‐Gladbach)unterderNutzungdermagnetic
assossiated cell sort (MACS®) Methode. Das Knochenmark aus Femur und Tibia wurde
isoliert und durch ein 70µm Zellsieb vereinzelt. Die Einzelzellsuspension wurde nach
Angaben des Herstellers mit den Antikörpern inkubiert. Die Trennung erfolgte mittels
LS‐Magnetsäulen (Miltenyi, Bergisch‐Gladbach) und die Reinheit wurde in der
Durchflusszytometrie überprüft. Nur Zellfraktionen mit einer Reinheit von >95%
Granulozytenwurdenweiterverwendet.
ERGEBNISSE 33
4. ERGEBNISSE
Granulozyten sind die Hauptzellpopulation des peripheren Leukozytenpools und als
Bestandteildesangeborenen ImmunsystemsfürdieBekämpfungbakteriellerPathogene
essentiell(Metcalf,1991;SennandJungi,1975).InnerhalbvonwenigenStundenwerden
diese durch frühinflammatorische Zytokine chemotaktisch an den Ort der Infektion
gelockt (Sabroe et al., 2005a; Sabroe et al., 2005b). Opsoniert durch das
KomplementsystemundAntikörperwerdendieBakterienvonGranulozytenüberpattern‐
recognition receptors (PRRs) erkannt und phagozytiert (Medzhitov, 2001). Die
aufgenommenen Bakterien werden im Phagosom eingeschlossen und zur endgültigen
Inaktivierung in einem Vorgang der als respiratory burst bezeichnet wird, eliminiert.
DieserVorgangsetztdieintrazelluläreSynthesevonreaktivenSauerstoffspezies(reactive
oxygenspecies;ROS)undhypochlorigerSäure(HOCL)voraus.
In der vorliegenden Arbeit wurde unter Verwendung von Listeriamonocytogenes der
Einfluss von fas apoptotic inhibitory molecule 3 (Faim3/Toso) auf die Granulozyten
untersucht.DiesesTransmembranproteinwurdealsanti‐apoptotischwirkendesMolekül
auf aktivierten T‐Zellen entdeckt (Hitoshi et al., 1998) und reduziert zusätzlich den
Schwellenwert für die TNFα induzierte Apoptose (Nguyen et al., 2012; Nguyen et al.,
2011). Kürzlich veröffentlichte Arbeiten beschreiben Toso als einen Rezeptor für IgM
(Kubagawa et al., 2009; Shima et al., 2010) sowie die Internalisierung der Toso/IgM
Komplexe(Vireetal.,2011).ImFokusderBetrachtungstandendiePhagozytoseunddie
InduktionvonROSinGranulozyten.
ERGEBNISSE 34
4.1. CharakterisierungderToso‐/‐Maus
Die Toso‐/‐ Maus wurde im Labor von Prof. TakMak (Toronto, Kanada) generiert und
mehralsneunGenerationenaufC57BL/6Hintergrundzurückgekreuzt.DieDeletionvon
TosowurdesowohlaufDNAalsauchaufRNAEbeneverifiziert(Abbildung4.1.).
Milz0
0.0005
0.0010
NDFAIM3/TosomRNAExpression
C
Leber0
5.010 ‐ 0 8
1.010 ‐ 0 7
1.510 ‐ 0 7
2.010 ‐ 0 7C57BL/6
Toso‐/‐
ND
D
FAIM3/TosomRNAExpression
Abbildung4.1. Deletionsnachweis vonToso inderToso‐/‐Maus A) Genomische DNAwurde aus demGewebe der Toso‐/‐ (‐/‐), Heterozygoten (+/‐) sowie Kontroll C57BL/6 (+/+) Mäusen isoliert und dieDeletionvonTosodurchPCRbestätigt.DieGrößedesPCR‐ProduktsderToso‐/‐beträgt400bpundderC57BL/6Kontrolle450bp.ZurKontrollederPCRwurdeH2Oeingesetzt.B‐D)AusderMilzundderLebervon C57BL/6 und Toso‐/‐ Mäusen wurde die Gesamt‐RNA isoliert. B) Das quantitative real time PCR(qRT‐PCR)ProduktvonTosound18SwurdeaufeinAgarosegelaufgetragen.IndenerstenbeidenSpurenistdasqRT‐PCRProduktvonTosound18SderMilzundinSpurdreiundvierderLeberdargestellt.C+D)DieGenexpressionvonTosowurdeinderqRT‐PCRgemessenundalsrelativeExpression(2‐dCt)normiertauf18SRNAalsReferenzgenangegeben(n=4).
InderDurchflusszytometriewurdedasperiphereBlutvonToso‐/‐ MäusenmitdemBlut
der C57BL/6 Mäuse hinsichtlich der Immunzellen verglichen. Während die Anzahl der
GranulozytenkeinesignifikantenUnterschiedezeigte,konnte inTosodefizientenTieren
eine starke Reduktion an Lymphozyten detektiert werden (Abbildung 4.2.A). Die
VerringerungderLymphozytenberuhteimWesentlichenaufeinerüber50%niedrigeren
FrequenzanB‐Zellen,wohingegendieT‐Zellennichtbetroffenwaren(Abbildung4.2.B).
ERGEBNISSE 35
0
2000
4000
6000C57BL/6
Toso‐/‐
LymphozytenGranulozyten
A
AnzahlderZellenim
Blut(proµl) p=0,0001
B‐Zellen CD4+ CD8+0
1000
2000
3000
4000
5000 C57BL/6
Toso‐/‐
B
AnzahlderZellenim
Blut(proµl) p=0,0001
Abbildung4.2. ZusammensetzungdesBlutesvonnaivenToso‐/‐Mäusen.DieLeukozytenvonC57BL/6(schwarze Balken) sowie Toso-/- -Mäusen (weiße Balken) wurden in der Durchflusszytometriequantifiziert. A) Lymphozyten wurden als Gesamtzahl von CD3+ und CD19+ Zellen errechnet.Granulozyten sind als Gr1hi CD11bhi definiert (n=6). B) Die Zusammensetzung der Anzahl derLymphozyten in B‐Zellen (CD19) sowie in T‐Lymphozyten, welche aus T‐Helferzellen (CD4+) und T‐Killerzellen(CD8+)bestehen(n=6)wurdequantifiziert.
4.2. ErhöhteSuszeptibilitätbeiDefizienzvonTosowährendder
InfektionmitListeriamonocytogenes
Innerhalb der ersten Tagen einer systemischen Infektion mit dem gram‐positiven
Bakterium Listeria monocytogenes (Listerien) spielt vor allem das angeborene
Immunsystem einewichtige Rolle bei der Eindämmung des Bakteriumwachstums. Dem
adaptiven Immunsystem kommt erst im späteren Verlauf der Infektion bei der
endgültigenEliminationderBakterieneineBedeutungzu(Navarinietal.,2006;Unanue,
1997).Der Einfluss vonToso für das Immunsystemwurde durch intravenöse Infektion
mit einer sublethalen Dosis von 104CFU Listerien in Toso‐/‐ und C57BL/6 Mäusen
überprüft und das Überleben der Tiere betrachtet. Während die Kontrolltiere die
Infektionzu80%überlebten,starbendiemeistenToso‐/‐ MäuseindenerstenTagender
Infektion(Abbildung4.3.).
ERGEBNISSE 36
0 5 10 150
20
40
60
80
100C57BL/6
Toso‐/‐
p<0,0001
Zeit p.i.(Tage)
Überleben(%)
Abbildung4.3. Überlebenskurve der Toso‐/‐ Mäuse bei einer sublethalen Infektion mit L.monocytogenes. C57BL/6 (n=15 schwarz ⧯) undToso‐/‐ (n=8weiß ⧮) Mäusewurdenmit 104 CFU L.monocytogenesintravenösinfiziertunddasÜberlebenunterderBerücksichtigungvonAbbruchkriterien(wieBelastungundGewichtsverlustderTiere)beobachtet.DieInfektionderVersuchstierewurdeindreiunabhänigenVersuchsansätzendurchgeführt.
DesweiterenkonnteninderMilz,LeberundimGehirnbiszu100fachhöherebakterielle
Titer an Tag drei nach Infektion mit 104 CFU Listerien in Toso defizienten Mäusen
verglichenmitdenC57BL/6Mäusendetektiertwerden(Abbildung4.4.).
Milz
5
7
9
11
<3
p=0,004
3
A
Listerien‐Titer
(log 10CFU/Organ)
Leber
3
5
7
9
11
<3
p=0,004
B Gehirn
3
5
7
9
11
<3
C57BL/6Toso‐/‐
p=0,006
C
Abbildung4.4. BakterientiterindenOrganen.C57BL/6(schwarz⧯)undToso‐/‐(weiß⧮)Mäusewurdenmit104CFUL.monocytogenesintravenösinfiziertundanTagdreigetötet.DieMilz,LeberunddasGehirnwurden entnommen und die Titer im Gewebe bestimmt. Jeder Datenpunkt gibt den Titer für eineindividuelleMauswieder.DiedurchgezogeneLiniezeigtdenMittelwertderGruppeunddiegestrichelteLiniedasDetektionslimit.IndreiunabhängigenAnsätzenwurdenjeweilsdreiMäuseproGruppeinfiziert(n=9).
Eine wichtige zelluläre Komponente zu Beginn der Infektion mit Bakterien sind
Granulozyten, die durch Phagozytose und anschließender Eliminierung der Bakterien
wesentlichdazubeitragendieAusbreitungdieserzuverlangsamen(RogersandUnanue,
ERGEBNISSE 37
1993). Die Bedeutung der Granulozyten als antibakterielle Barriere wird durch die
BehandlungmiteinemspezifischenDepletionsantikörper(antiGr‐1)deutlich(Czuprynski
et al., 1994). Die Depletion der Granulozyten verursachte in C57BL/6 Mäusen eine
vergleichbareSuszeptibilitätgegendie InfektionmitListerienwiebeiToso‐/‐Mäusen,so
dassbeideVersuchsgruppenwenigeTagenachderInfektionverstarben(Abbildung4.5.).
0 1 2 3 40
20
40
60
80
100C57BL/6+anti‐Gr1Toso‐/‐ +anti‐Gr1
Zeit p.i.(Tage)
Überleben(%)
Abbildung4.5. ÜberlebenskurvebeiderDepletionvonGranulozytenwährendder InfektionmitL.monocytogenes. C57BL/6 (n=3, schwarz ⧯) und Toso‐/‐ (n=3, weiß ⧮) Mäuse wurden zurGranulozytendepletionmit200µganti‐Gr1 (NimpR14)behandelt,umdieGranulozytenzudepletieren.AmFolgetagwurdendieTieremit104CFUL.monocytogenes intravenösinfiziert.DasÜberlebenwurdeunter der Berücksichtigung von Abbruchkriterien (wie Belastung und Gewichtsverlust der Tiere)beobachtet.
4.3. TosoExpressioninGranulozyten
IndenvergangenenJahrenkonntedieExpressionvonTosoaufaktiviertenT‐Zellensowie
eineubiquitäreExpressiondesProteinsaufB‐Zellennachgewiesenwerden(Nguyenetal.,
2011). Die Expressionsanalyse von Toso auf Granulozyten wurde in der
DurchflusszytometriemiteinemToso‐spezifischenIgGanti‐MausAntikörper,welcherim
Labor von Frau Kyeong‐Hee Lee hergestellt wurde, durchgeführt (Nguyen et al., 2011;
Vire et al., 2011). Toso defiziente Granulozyten fungierten hierbei als Negativkontrolle.
DieausdemKnochenmarkisoliertenGranulozytendesC57BL/6Ursprungsexprimierten
Toso(Abbildung4.6.A).DieB‐ZellenderMilzvonToso‐/‐undC57BL/6Mäusenwurdenzur
Verifizierung der Expressionsanalysen verwendet und wiesen erwartungsgemäß eine
ExpressionvonToso indenKontrolltierenauf,wohingegenaufTosodefizienteB‐Zellen
keineExpressiondetektiertwurde(Abbildung4.6.B).
ERGEBNISSE 38
Abbildung4.6. OberflächenexpressionvonToso. A) 106Knochenmarkszellen vonC57BL/6 (blau) undToso‐/‐ Mäusen (rot) wurden mit anti‐Gr1 (Granulozyten) zusammen mit anti‐Maus Toso Antikörperfluoreszenzgefärbt und in die Expression von Toso in der Durchflusszytometrie quantifiziert. B) 106SplenozytenvonC57BL/6(blau)sowieToso‐/‐Mäusen(rot)wurdenmitanti‐CD19(B‐Zellen)zusammenmit anti‐Maus‐Toso Antikörper fluoreszenzgefärbt und in die Expression von Toso in derDurchflusszytometriequantifiziert.ToteZellenwurdendurchVerwendungvon7AADausgeschlossen.
4.4. Toso unabhängige Regulation der Blutgranulozyten‐
population
Die Granulozyten im peripheren Blut besitzen eine Lebenszeitspanne von wenigen
Stunden ehe diese einem Vorgang unterliegen, der als spontane Apoptose bezeichnet
wird. Bei Kontakt mit Pathogenen sowie durch Wachstumsfaktoren wie GM‐CSF
verlängertsichdieLebenszeitaufbiszuzweiTage(Brachetal.,1992;Colottaetal.,1992).
Dieser Vorgang wurde in vitro durch die Verwendung von GM‐CSF imitiert. Nach
siebenstündigerInkubationohneStimulationstarbenüber50%derGranulozytensowohl
ausdenC57BL/6alsauchausdenToso‐/‐Mäusen,währenddieStimulationmitGM‐CSF
dieApoptoserateinbeidenMausstämmenimgleichenMaßreduzierte(Abbildung4.7.A).
ERGEBNISSE 39
1h 7h 7hGM‐CSF0
10
20
30
40
50
60
70C57BL/6
Toso ‐/‐
A
ApoptotischeZellen
(in%vonallenGranulozyten)
0
10
20
30 C57BL/6
Toso‐/‐
XX
BrdU+ Granulozyten
(%vonallenGranulozyten)
B
Abbildung4.7. Apoptose und Neubildung von Granulozyten. A) Das Blut von C57BL/6 (schwarzerBalken) und Toso (weißer Balken) Mäusen wurde bei 37°C inkubiert. Die Inkubation wurde für eineStunde(spontaneApoptose)sowiefürsiebenStundenmitoderohneGM‐CSF(40ng/ml)durchgeführt.Anschließend wurde die Apoptose mittels AnnexinV / 7AAD Färbung in der Durchflusszytometrieanalysiert (n=4).B)C57BL/6(schwarzerBalken)undToso(weißerBalken)MäusenwurdeübereinenZeitraum von zwei Tagen alle 12 Stunden 2 mg BrdU gelöst in PBS intraperitoneal appliziert. DieFrequenz der BrdU+ Granulozyten wurde am dritten Tag nach der Behandlung im Blut in derDurchflusszytometrie quantifiziert. Eswurden je Genotyp insgesamt fünfMäuse in zwei unabhängigenVersuchsansätzenverwendet(n=10).
Die Granulozytenmenge wird durch Neubildung sowie der Migration der Granulozyten
aus dem Knochenmark ins Blut erhalten und wurde in der Durchflusszytometrie
untersucht. Hierzu wurde ein BrdU‐Assay verwendet, welcher über den Einbau der
Substanz in neusynthetisierte DNA die Zellteilung visualisiert. BrdU wurde über einen
zweitätigen Zeitraum alle 12 Stunden intraperitoneal appliziert und die Frequenz der
neugebildetenundinsBlutemigriertenGranulozyteninC57BL/6undToso‐/‐Mäusenam
drittenTagmiteinander verglichen. AmEnde derBehandlung konnten annähernd 20%
neugebildete Granulozyten in beiden Versuchsgruppen detektiert werden (Abbildung
4.7.B).
Die Regulation der Granulozytenmenge durch Apoptose und Neubildung zeigte keine
UnterschiedeindenbeidenGenotypen,weswegenimFolgendendieHauptmechanismen
der antibakteriellen Funktion der Granulozyten untersucht wurden. Nach der
Phagozytose von Pathogenen werden diese durch die Bildung von ROS innerhalb der
Granulozyten eliminiert. Im folgendenKapitelwurde zunächstdiePhagozytose genauer
untersucht.
ERGEBNISSE 40
4.5. Beeinträchtigte Phagozytose der Granulozyten bei Toso
Defizienz
Nach Pathogenkontakt haben die Granulozyten die Aufgabe diese wirkungsvoll und
schnell zu eliminieren. Über spezifische Rezeptoren wie Toll like Rezeptoren (TLR)
werdendiePathogeneerkanntundanschließendphagozytiert(Medzhitov,2001).Neben
demKomplementsystemspielenauchnatürlichvorkommendeanti‐Listerien‐Antikörper
derIgM‐KlasseeineRollebeiderPathogenaufnahme(Ochsenbeinetal.,1999;Schwartzet
al., 2012). Zur Ermittlung des Phagozytosepotentials sowie zur Untersuchung des
Einflusses von IgM auf den Phagozytoseprozess wurden in einem in vitro Assay
GranulozytenausdemperipherenBlutvonToso‐/‐MäusenmitdenBlutgranulozytenvon
Tieren ohne lösliches IgM (sIgM‐/‐) sowie mit C57BL/6‐Granulozyten verglichen. Nach
einer einstündigen Inkubation mit 106CFU Listerien, die mit CFSE angefärbt wurden
(CFSE‐Listerien), hatten knapp 60% der C57BL/6 Granulozyten Listerien phagozytiert
undwareninderDurchflusszytometriepositivfürCFSE‐Listerien(Abbildung4.8.).Toso
defizienteGranulozytenhattenzu40%CFSE‐Listerienaufgenommenundzeigteneinemit
denGranulozytenaussIgM‐/‐MäusenvergleichbarePhagozytose(Abbildung4.8.).
0
20
40
60
80
100
p=0,001
p=0,0007
N.S.
C57BL/6Toso‐/‐
sIgM‐/‐
A
CFSE‐Listerien
+Granulozyten
(in%vonallenGranulozyten)
Abbildung4.8. Phagozytosepotenzial von Listerien durch Granulozyten. A) Peripheres Blut vonC57BL/6(schwarz⧯ ),Toso‐/‐ (weiß⧮)sowiesIgM‐/‐(weiß⧲ ;kein lösliches IgM)Mäusenwurdeübereinen Zeitraum von 60min mit 106CFU CFSE‐Listerien inkubiert und anschließend die Frequenz derCFSE‐Listerien+GranulozytenbezogenaufalleGranulozyteninderDurchflusszytometriebestimmt.JederDatenpunktgibtdenWerteiner individuellenMauswieder (n=3‐6).DiedurchgezogeneLiniezeigtdenMittelwertderGruppe.
DieAbbildung4.8zeigteinevermindertePhagozytosevonGranulozytenausTosound
sIgMdefizientenMäusen,weswegenIgMELISAmitdemSerumvonC57BL/6sowieToso‐/‐
ERGEBNISSE 41
Mäusendurchgeführtwurde.DieKonzentrationenanIgM‐AntikörpernimSerumwaren
indenbeidenVersuchsgruppenvergleichbar(Abbildung4.9.A).
0
1
2
3
4
5
6C57BL/6Toso‐/‐
TotalIgM
(µg/ml)
A
XX
0
20
40
60
XXCFSE‐Listerien
+Granulozyten
(in%vonallenGranulozyten)
B
C57BL/6
Toso‐/‐
0
10
20
30
40
50
60
70C57BL/6
Toso‐/‐
p=0,03
p=0,03
C57BL/6 sIgM‐/‐
SerumSerum
CFSE‐Listerien
+Granulozyten
(in%vonallenGranulozyten)
C
0
20
40
60
80C57BL/6
Toso‐/‐
CFSE‐Listerien
+Granulozyten
(in%vonallenGranulozyten)
C57BL/6C57BL/6SerumSerum(56°C)
D
p=0,04
Abbildung4.9. IgM‐abhängigePhagozytosevonCFSE‐Listerien..A)LöslichesIgMwurdeimSerumvonC57BL/6(schwarz⧯)undToso‐/‐ (weiß⧮)MäusenmittelsELISAquantifiziert.DiedurchgezogeneLiniegibt den Mittelwert der Gruppe wieder. Jeder Datenpunkt ist ein Wert einer individuellen Maus(n=6/Gruppe).B‐D)DasBlutvonC57BL/6(schwarzeBalken)undToso‐/‐(weißeBalken)Mäusenwurdedreimalmit serumfreienMedium zur Entfernung der humoralenKomponenten des Blutes gewaschen.B)106 CFU CFSE‐Listerienwurden im gewaschenenBlut für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die CFSE‐Listerien+GranulozyteninProzentvonallenGranulozytenwurdeninderDurchflusszytometriebestimmt(n=10/Gruppe). C) 106 CFU CFSE‐Listerien wurden für eine Stunde mit dem Serum (von Tag 3 nachListerieninfektion)vonC57BL/6oderToso‐/‐Mäusenvorinkubiert.DiesewurdenanschließendfüreineStundemitdemgewaschenenBlutvonC57BL/6undToso‐/‐Mäusenbei37°Cinkubiert.DieAnalysederCFSE‐Listerien+GranulozyteninProzentvonallenGranulozytenerfolgteinderDurchflusszytometrie.Diehorizontale Linie zeigt die IgM unabhängige Phagozytose. Das Experiment wurde mit 2 Mäusen proGruppeinfünfunabhängigenAnsätzendurchgeführt(n=10).D)106CFUCFSE‐ListerienwurdenfüreineStundemithitzeinaktiviertem(56°C)SerumvonC57BL/6oderSerumvonC57BL/6,jeweilsanTagdreinachListerieninfektionentnommen,vorinkubiert..DiesewurdenanschließendfüreineStundemitdemgewaschenenBlutvonC57BL/6undToso‐/‐Mäusenbei37°Cinkubiert.DieAnalysederCFSE‐Listerien+GranulozyteninProzentvonallenGranulozytenerfolgteinderDurchflusszytometrie(n=4/Gruppe).
ERGEBNISSE 42
Die Differenz in der Phagozytosekapazität zwischenToso‐/‐ und C57BL/6Mäuse könnte
jedochdurchweiterehumoraleKomponentendesBlutesverursacht seinundwurde im
Einzelnenbetrachtet.DiehumoralenKomponentenwieAntikörperunddieBestandteile
des Komplementsystems wurden durch dreimaliges Waschen des Blutes von C57BL/6
undToso‐/‐ Mäusen entfernt. Die Granulozyten im gewaschenen Blut von C57BL/6 und
Toso‐/‐ MäusenwiesendaraufhineinestarkverringertePhagozytoseverglichenmitdem
Granulozyten aus dem ungewaschenen Blut auf (Abbildung 4.8), jedoch war die
PhagozytoserateinbeidenGenotypenaufvergleichbaremNiveau(Abbildung4.9.B).
DerEinflussvonTosoimZusammenhangmitIgMwurdemitdenGranulozytenausdem
gewaschenen Blut näher untersucht. Die CFSE‐Listerien wurden eine Stunde mit dem
Serum von C57BL/6 oder sIgM‐/‐ vorinkubiert bevor dieses Gemisch mit dem
gewaschenen Blut von Toso‐/‐ und C57BL/6 bei 37°C inkubiert wurde. Diese
Vorbehandlung gewährleistete eine Opsonierung der Bakterien mit den humoralen
FaktorendesBluteseinschließlichanti‐IgM‐ListerienAntikörpern(C57BL/6Serum)oder
ohneanti‐IgM‐ListerienAntikörpern(sIgM‐/‐Serum).DieAnwesenheitdeslöslichenIgMs
im C57BL/6 Serum steigerte die Phagozytoserate der C57BL/6 Granulozyten um über
10% gegenüber den Toso‐/‐ Granulozyten, während die Abwesenheit von IgM (sIgM‐/‐
Serum) bei Toso‐/‐ und C57BL/6 Granulozyten in einer vergleichbaren Phagozytose
resultierte (Abbildung 4.9.C). Die Aufnahmekapazität der Granulozyten für Pathogene
konnte jedoch maßgeblich unabhängig vom IgM detektiert werden (gestrichelte Linie;
Abbildung4.9.C).NebendenImmunoglubinenübtdasKomplementsystemeinenEinfluss
auf die Phagozytose aus. Das Komplementsystem wurde durch eine halbstündige
Inkubation bei 56°C inaktiviert. Das hitzeinaktivierte C57BL/6 Serum wurde für eine
StundemitCFSE‐ListerienvorinkubiertundanschließendmitdemgewaschenenBlutvon
Toso‐/‐ und C57BL/6 Granulozyten inkubiert. Die Depletion des Komplementsystems
verringerte diePhagozytose vonBakterien inGranulozytenbeiderGenotypen aufunter
10%(Abbildung4.9.D).
ERGEBNISSE 43
Abbildung4.10. Granulombildung inderLeberanTagdreinachListerieninfektion. C57BL/6 (obereZeile)undToso‐/‐(untereZeile)Mäusewurdenmit104CFULmonocytogenesinfiziertundamdrittenTagderInfektiondieLeberentnommen.DieLeberschnittewurdenzurDetektionderGranulozytenmitanti‐Gr1 (grün) unddie Listerienmit anti‐ListerienAntikörpern (rot) fluoreszenzgefärbt. Gezeigt sind zweirepräsentativeAusschnittevonjezweiMäusenproGenotypausn=3jeGruppe.
Bei einer systemischen bakteriellen Infektion bilden die ins Gewebe einwandernden
Granulozyten Zellhaufen aus hunderten Granulozyten, die als Granulome bezeichnet
werden.InvivomigriertendieGranulozyteninC57BL/6undToso‐/‐ MäusenanTagdrei
nachInfektionmit104CFUListerien indieLeberundformiertensichzuvergleichbaren
Granulomen (Abbildung 4.10.). In den Lebern der C57BL/6 Mäuse wurden in der
ImmunfluoreszenzfärbungverglichenmitdenLebernausToso‐/‐Mäusendeutlichweniger
Listerien detektiert (Abbildung 4.10). Die Verteilung der Listerien wies in beiden
GenotypeneinendeutlichenUnterschiedauf.BeidenKontrolltierenwarendieListerien
vorwiegend um die Granulome konzentriert, wohingegen bei den Toso defizienten
Mäusen die Listerien überwiegend innerhalb der Granulome konzentriert waren
(Abbildung4.10).
ERGEBNISSE 44
Abbildung4.11. KonfokaleAufnahme listerienphagozytierenderGranulozyten.DasBlut vonC57BL/6und Toso‐/‐ Mäusen wurde in vitro mit 106CFU CFSE‐Listerien zwei Stunden in Gegenwartbakteriostatischer Antibiotika bei 37°C inkubiert. Anschließend an die Fixierung wurde das Blut aufObjektträger zentrifugiert undkonfokalmikroskopiert. In blau sinddieGranulozyten (anti‐Gr1), in rotCD11b(anti‐CD11b)undingründieCFSE‐Listerienfluoreszenzgefärbt(n=3)
DieMakrophagenübenalsphagozytierendeZellpopulationeinenerheblichenEinflussauf
den Verlauf einer viralen und bakteriellen Infektion aus (Conlan, 1996). Die
Listerienphagozytose der Granulozytenwurde zudemmit der vonMakrophagen in der
konfokalen Mikroskopie verglichen. Aus dem Knochenmark von C57BL/6 und Toso‐/
Mäusen wurden unter dem Einfluss von M‐CSF als Differenzierungsstimulus
Makrophagen in vitro generiert. Die Makrophagen sowie die Blutgranulozyten beider
Genotypen wurden in vitro mit 106 CFSE‐Listerien zwei Stunden inkubiert, die Zellen
anschließendfixiertundaufObjektträgerzentrifugiert.VerglichenmitC57BL/6konntein
Toso defizienten Granulozyten kaum aufgenommene Listerien detektiert werden
(Abbildung 4.11.). Die Phagozytoserate derMakrophagen zeigte keinenUnterschiede in
AbwesenheitvonToso(Abbildung4.12.).
ERGEBNISSE 45
Abbildung4.12. PhagozytosekapazitätvonMakrophagenwährend invitro InkubationmitListerien.Das Knochenmark von C57BL/6 (obere Zeile) undToso‐/‐ (untere Zeile)Mäusenwurde isoliert und invitro unter Verwendung von M‐CSF primäre Makrophagen generiert. Diese wurden an Tag 10 nachDifferenzierungsbeginnfür12StundenaufCover‐Slipsausgesät.AnschließendwurdedasKulturmediumgewechseltunddieMakrophagenzweiStunden inAnwesenheit vonbakteriostatischenAntibiotikamit106 CFU CFSE‐Listerien inkubiert und eine Fluoreszenzfärbung durchgeführt. Die Makrophagen sind(rot),derZellkern(DAPI,blau)unddieCFSE‐Listerien(grün)dargestellt.
DiesesErgebnis fürdieMakrophagenwurdezusätzlichdurcheinweiteresPhagozytose‐
und Eliminierungsexperiment bestätigt. Die aus dem Knochenmark von C57BL/6 und
Toso‐/‐ Mäusen generierten Makrophagen wurden entweder 12 Stunden mit TNFα und
IFNγ voraktiviert, um die Effektormechanismen für die intrinsische Eliminierung der
ListerienindenMakrophagenzuverstärken,oderbliebenunbehandelt.DieMakrophagen
wurden anschließend zwei Stunden mit 105CFU Listerien inkubiert und die
intrazellulären Listerientiter bestimmt. Die nicht aktivierten Makrophagen beider
Genotypen phagozytierten vergleichbare Mengen an Listerien (Abbildung 4.13.). Die
Voraktivierung mit frühinflammatorischen Zytokinen konnte die Effektorfunktion der
Makrophagensteigern,sodassdieKonzentrationanreplikationsfähigenListerieninden
MakrophagenumFaktor10sowohlinC57BL/6alsauchinToso‐/‐Makrophagenreduziert
wurde(Abbildung4.13.).
ERGEBNISSE 46
4
5
6C57BL/6
Toso‐/‐
TNF+IFNListerienListerien
p=0,0001
p=0,006
<3
Listerientiterinden
Makrophagen(log 10CFU)
Abbildung4.13. Phagozytose und Eliminierung von Listerien durch Makrophagen. Aus demKnochenmarkvonC57BL/6(schwarzeBalken)undToso‐/‐(weißeBalken)MäusenwurdeninvitrounterVerwendung von M‐CSF Makrophagen generiert und an Tag zehn des Differenzierungsprozessesverwendet.105Makrophagenwurdenfür12StundenohneodermitStimulationdurchTNFαundIFNγineinerPlatteausgesät.AnschließendwurdendieZellenmit105CFUListerienfür zweiStundenbei37°CinkubiertunddieWells zurEntfernungnichtphagozytierterListerienviermalmitMediumgewaschen.Durch zweiminütige Inkubation mit 50% Saponin wurden dann die Listerien aus den MakrophagenherausgelöstunddieTiterbestimmt(n=12).
4.6. HerunterregulierungvonTosodurchPhagozytose
Die Phagozytose von Listerien ist sowohl von der Tosoexpression sowie vom IgM
abhängig.DieExpressionsdynamikvonTosoaufGranulozytenwurdefolgenduntersucht.
Hierzu wurden Knochenmarkszellen von C57BL/6 mit und ohne Zugabe von 108 CFU
Listerien inkubiert und die Expression von Toso auf Granulozyten in der
Durchflusszytometrie quantifiziert. Nach der halbstündigen Inkubation mit Listerien
konnte die Oberflächenexpression des Proteins bei C57BL/6 Granulozyten reduziert
detektiertwerden(Abbildung4.14.).
ERGEBNISSE 47
Listerien0
5
10
15
20 p=0,026
TosoExpression(MFI)
B
Abbildung4.14. ExpressionvonTosobeiderPhagozytosevonListerien.106Knochenmarkzellenisoliert
aus C57BL/6 und Toso‐/‐ wurden 30min mit 108 L. monocytogenes inkubiert (blau) oder bliebenunbehandelt (rot). Anschließend wurde eine Fluoreszenzfärbung mit anti‐Maus Toso Antikörper undanti‐Gr‐1 durchgeführt. Tote Zellen wurden durch Verwendung von 7AAD ausgeschlossen. AlsNegativkontrolle dienten unbehandelte Knochenmarkszellen der Toso‐/‐ Maus (grau schattiert) (n=5).A)RepräsentativeQuantifizierungderOberflächenexpressionvonToso.B)QuantifizierungdermittlerenFluoreszenzintensität(MFI)derExpressionvonTosobeiC57BL/6mitundohneInkubationmitListerien.
Die Phagozytose von Listerien konnte in C57BL/6 Mäusen unter dem förderlichen
Einfluss von IgM detektiert werden, weswegen ein direkter Zusammenhang mit der
OberflächenexpressionvonTosountersuchtwurde.DieKnochenmarkzellenvonC57BL/6
undsIgM‐/‐MäusenwurdennacheinerhalbstündigenInkubationmit108CFUListerienin
der Durchflusszytometrie auf die relative Fluoreszenzintensität von Toso auf
Granulozyten untersucht. Die Expression des Proteins verringerte sich auf C57BL/6
Granulozyten signifikant stärker als bei Verwendung der Granulozyten aus der sIgM‐/‐
Maus(Abbildung4.15.).
Listerien0
20
40
60
80
100C57BL/6sIgM‐/‐
p=0,02
TosoExpression
(in%vonunbehandelterKontrolle)
Abbildung4.15. IgM abhängige Internalisierung von Toso bei der Phagozytose von Listerien. 106
Knochenmarkzellen isoliert aus C57BL/6 (schwarze Balken) und sIgM‐/‐ (weiße Balken) wurden für30min mit 108 L. monocytogenes inkubiert oder blieben unbehandelt. Anschließend wurde eineFluoreszenzfärbungmitanti‐MausTosoAntikörperundanti‐Gr1durchgeführt.ToteZellenwurdenmit7AAD ausgeschlossen. Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der Expression von Toso wurde inProzentangegebenundaufdiekorrespondierendeunbehandelteKontrollebezogen(n=8).
ERGEBNISSE 48
4.7. Fehlregulierte ROS‐Synthese und Degranulation von Toso
defizientenGranulozyten
Die phagozytierten Bakterien werden im Phagolysosom der Granulozyten durch die
Generierung von radikalen Sauerstoffspezies (ROS) eliminiert (Segal et al., 1981). Die
Verknüpfung vonPhagozytose undderBildung vonROSwurde folgenduntersucht.Die
Granulozyten aus dem peripheren Blut von C57BL/6 wurden mit 106 CFSE‐Listerien
inkubiert und die ROS‐Synthese in Granulozyten, die Listerien aufgenommen hatten
(Abbildung4.16.A+B;rot)mitGranulozytenohnePhagozytosevonListerien(Abbildung
4.16.A+B; blau) verglichen. Die Phagozytose der Listerien resultierte in der Produktion
vonROS,wohingegen inGranulozyten,diekeinePathogeneaufgenommenhatten,kaum
ROSdetektiertwerden konnte (Abbildung 4.16.B). Der Zusammenhang beider Prozesse
wird zudem durch Inkubation der Granulozyten mit ansteigenden
Listerienkonzentrationendeutlich.InAbhängigkeitvonderPathogenlastkonntedieROS‐
ProduktionbeiderhöchstenListerienkonzentrationaufnahezu100%gesteigertwerden
(Abbildung4.16.C).
0 105 106 1070
20
40
60
80
100
Listerien(CFU)
ROS+Granulozyten
(in%vonallenGranulozyten)
C
Abbildung4.16. Korrelation zwischen Phagozytose und ROS Produktion. A+B) Peripheres Blut vonC57BL/6wurdemit106CFUCFSE‐ListerieninkubiertunddieROS‐SynthesemitDihydroethidium(DHE)detektiert.Das linkeFenster (A)zeigtdieAuftragungdesGranulozytenmarkers (Gr1)gegendie CFSE‐ListerienimDotPlotdesDurchflusszytometers.BlaugefärbtistdiePopulationderGranulozyten,welchekeine Pathogene aufgenommenen hatten, und in rot die phagozytierende Granulozytenpopulationdargestellt.KorrespondierendzurDarstellungin(A)zeigtdasmittlereHistogramm(B)dieintrazelluläreROS‐Synthese beider Zellpopulation. Ein Plot aus drei repräsentativen Experimenten ist gezeigt. C)PeriphereBlutvonC57BL/6wurdeeineStundemit105,106oder107CFUListerieninkubiert.DieROS‐SynthesederGranulozytenwurdeinderDurchflusszytometriemitDihydrorhodamin(DHR)ermittelt.AlsKontrollebliebeineGruppeunbehandelt(n=4).
ERGEBNISSE 49
DieEffektorfunktionenvonGranulozytensindpathogenunspezifischundbasierenneben
derPhagozytoseundderintrazellulärenSynthesevonROSaufderDegranulierungvonin
Granula gespeicherten antimikrobiellen Proteinen (Borregaard and Cowland, 1997;
Lominadzeetal.,2005).DieROS‐Synthesewird inzweiaufeinanderfolgendenSchritten,
der Priming‐ und Aktivierungsphase streng reguliert, welche der Verhinderung von
Gewebeschädendienen(Clarketal.,1990;Dangetal.,1999).DasEliminierungspotenzial
der Zellen in der so genanntenAktivierungsphase, der eigentlichenROS‐Synthese,wird
durchdievorrangehendePrimingphasepotenziert(Elbimetal.,1994;Moreletal.,1991).
DasPrimingalleinlöstjedochkeineProduktionvonSauerstoffradikalenaus.
0
5
10
15
20
40 80 1201600
p=0,8
A
GM‐CSF(ng/ml)
ROS+Granulozyten
(in%vonallenGranulozyten)
0
5
10
15
20
0.1 1 10 1000
p=0,9
B
LPS(µg/ml)
0
5
10
15
20
10 100 10000
C57BL/6
Toso‐/‐
p=0,001
C
TNF (ng/ml)
Abbildung4.17. ROS‐SynthesewährendderPrimingphase.DasperiphereBlutvonC57BL/6undToso‐/‐Mäusen wurdemit verschiedenen Konzentrationen an GM‐CSF, LPS oder TNFα eine halbe Stunde bei37°Cinkubiert.AnschließendwurdedieROS‐SynthesederGranulozyteninderDurchflusszytometriemitDihydrorhodamin (DHR) bestimmt und der prozentuelle Anteil der ROS produzierendenGranulozytenbezogenaufdieGesamtheitallerBlutgranulozytenerfasst(n=6).
Die SynthesevonROSkanndurchdieVerwendungvonDihydrorhodamin (DHR) inder
Durchflusszytometriedetektiertwerden.PeripheresBlutvonnaivenC57BL/6sowieToso
defizienten Mäusenmit verschiedenen Konzentrationen einiger Primingsubstanzen wie
GM‐CSF, LPS und TNFα behandelt und die ROS‐Synthese in der Durchflusszytometrie
erfasst. Während die Granulozyten des C57BL/6 Ursprungs auch bei hohen
Konzentrationen der Primingsubstanzen kaum ROS produzierten, induzierte spezifisch
TNFαinToso‐/‐ZelleneinesignifikanteROS‐Synthese(Abbildung4.17.).
ERGEBNISSE 50
0
10
20
30
40
50
0.1 1 10 1000
C57BL/6
Toso‐/‐
p<0,0001
fMLP(µM)
ROS+Granulozyten
(in%vonallenGranulozyten)
B
Abbildung4.18. ROS‐SynthesebeiInkubationmitdemAktivatorfMLP.DasperiphereBlutvonC57BL/6undToso‐/‐Mäusenwurdemit verschiedenenKonzentrationen an fMLP für 30min bei 37°C inkubiert.Anschließend wurde die ROS‐Synthese in der Durchflusszytometrie mit Dihydrorhodamin (DHR)bestimmt. A) Repräsentative DotPlots der durchflusszytometrischen Analyse gegatet auf Granulozyten(Gr1+) von C57BL/6 und Toso‐/‐ Mäusen mit und ohne fMLP‐Stimulation. B) ROS produzierendeGranulozyteninProzentallerGranulozytenbeiansteigendenKonzentrationvonfMLP(n=6).
Die Primingphase ist für die Ausschöpfung der Effektorfunktion der Granulozyten
entscheidend. Naive, nicht geprimte Granulozyten, welche direkt in Kontakt mit einer
Aktivierungssubstanz kommen, produzieren kaum ROS. Der Pathogenkontakt kann in
vitro mit fMLP (N‐Formylmethionyl‐Lencyl‐Phenylalanin) imitiert werden, welches ein
BestandteilebakteriellerZellwändeistundandenfMLPRezeptor(FPR)vonGranulozyten
bindet (Graves et al., 1992; Selvatici et al., 2006). Hohe Konzentrationen der Substanz
konntenohnevorrangegangenerPriminig‐Phasebeica.10%derC57BL/6Granulozyten
ROS‐Produktion induzieren (Abbildung 4.18). Toso defiziente Granulozyten reagierten
signifikantstärkeraufdieAktivierungmitfMLP.BereitsbeieinerKonzentrationvon2µM
fMLP konnte bei der Hälfte aller Granulozyten intrazelluläres ROS detektiert werden
(Abbildung4.18.A‐rechteDotPlots;Abbildung4.18.B.).
ERGEBNISSE 51
0
20
40
60
80
100C57BL/6
Toso‐/‐
p=0,0001
p=0,001
GM‐CSF (ng/ml) 160 0LPS (ng/ml) 0 500fMLP (µM) 2 2
ROS+Granulozyten
(in%vonallenGranulozyten)
Abbildung4.19. In vitro induzierte ROS‐Synthese nach der Priming‐ und Aktivierungsphase.Peripheres Blut von C57BL/6 (schwarze Balken) und Toso‐/‐ (weiße Balken) Mäusen wurde mit160ng/mlGM‐CSFoder500ng/mlLPSeinehalbeStundebei37°C inkubiert.AnschließendwurdederAnsatz 15min mit 2µM fMLP aktiviert. Die ROS‐Synthese wurde in der Durchflusszytometrie mitDihydrorhodamin (DHR) bestimmt und die ROS produzierenden Granulozyten in Prozent allerBlutgranulozytenangegeben(n=6).
DiebishervorgestelltenDatenzeigten,dassdasFehlenvonTosodenSchwellenwert für
die ROS‐Synthese sowohl bei direkter Aktivierungmit fMLP als auch beimPrimingmit
TNFαverringerte,jedochkeinenEinflussbeiGM‐CSFundLPSausübte.DasVerhaltenbei
Priming und anschließender Aktivierung wurde in vitro mit den beiden Priming‐
SubstanzenGM‐CSFundLPSuntersucht.Diesewurdengewählt,dasiebeiTosoDefizenz
währendderPrimingphasekeinenUnterschied inderROS‐Syntheseverglichenmitden
Kontrolltieren aufgewiesen hatten. Über einen Zeitraum von 30min wurde die
GranulozytenimperipherenBlutvonC57BL/6undToso‐/‐MäusenmitGM‐CSFoderLPS
geprimt und anschließend mit 2µM fMLP aktiviert. Die Granulozyten vom C57BL/6
Ursprung produzierten bei der Induktion der ROS‐Synthese mit GM‐CSF und fMLP zu
knapp50%ROS,wohingegenderAnteil anROSproduzierendenGranulozytenbeiToso
Defizienz signifikant größerwar (Abbildung 4.19.). Die selbeBeobachtung konnte beim
PrimingmitLPSundanschließenderAktivierungdurchfMLPgemachtwerden(Abbildung
4.19).
ERGEBNISSE 52
0 7 14 21 28 35 420
10
20
30
40C57BL/6Toso ‐/‐
p=0,005
Temperatur(°C)
DegranulatierteGranulozyten
(in%vonallenGranulozyten)
Abbildung4.20. Temperatursensitivität derGranulozyten. Das Blut von C57BL/6 und Toso‐/‐ Mäusenwurde für 30min bei 4°C, 15°C, 24°C, 37°C und 42°C inkubiert. Die Degranulation der GranulozytenwurdeinderDurchflusszytometriedurcheineVerringerungderGranularitätdesDurchflusszytometers(SSC)bestimmt.DegranulierteGranulozytensindinProzentallerGranulozytenangegeben(n=6).
Zellulärer Stresswie zumBeispielHitzeschockkann zurAktivierungundDegranulation
der Granulozyten führen (Werz et al., 2002). Unter physiologischen Bedingungen trägt
diese Art von Stimulation zu autoinflammatorischen Erkrankungen bei (Nathan, 2006).
Zur Untersuchung der Thermorelevanz der Zellen wurden Granulozyten beider
Genotypen für 30min unterschiedlichen Temperaturen ausgesetzt und die Aktivierung
anhandderDegranulationquantifiziert.GranulozytendesC57BL/6Ursprungstolerierten
die Temperaturschwankungen des gesamten Untersuchungsbereichs von 4°C bis 42°C,
während Toso defiziente Granulozyten bereits bei minimalen Schwankungen
degranulierten. Eine Reduktion der Temperatur von 37°C auf 14°C führte bei Toso
defizientenGranulozytenzueiner30%igenDegranulation,währendZellendesC57BL/6
UrsprungskeineReaktionzeigten(Abbildung4.20.).
ERGEBNISSE 53
0
20
40
60
80
100
p=0,0006
C57BL/6
Toso ‐/‐
naivTag2 p.i.
ROS+Granulozyten
(in%vonallenGranulozyten)
A
0
1000
2000
3000
4000C57BL/6,naiv
C57BL/6,Listerien
Toso‐/‐,Listerien
p=0,002
MPO(ng/ml)
B
XX
Abbildung4.21. Invivo ROS‐Synthese und Degranulation während einer Listerieninfektion. A)C57BL/6 (schwarze Balken) undToso‐/‐ (weiße Balken)Mäusewurdenmit 104 CFUL.monocytogenes(Listerien) infiziert und das Blut an Tag 2 p.i. entnommen. Naives Blut beider Genotypen wurde alsKontrolle verwendet. Die ROS‐Synthese wurde in der Durchflusszytometrie unter Verwendung vonDihydrorhodamin (DHR) gemessen und die ROS produzierenden Granulozyten in Prozent allerGranulozyten angegeben (n=4‐5). B) Die Konzentration vonMPO im Plasmawurdemittels ELISA vonuninfiziertenC57BL/6(schwarz⧳)undvonC57BL/6(schwarz⧯)sowieToso‐/‐(weiß⧮)MäusensechsStunden nach der Infektionmit 106 CFUL.monocytogenes analysiert. JederDatenpunkt gibt denWerteines individuellenTiereswieder(n=4/Gruppe).DiehorizontaleLiniestelltdenMittelwertderGruppedar.
Invitro zeigtenTosodefizienteGranulozytensowohleinenvermindertenSchwellenwert
für die ROS‐Synthese als auch eine verringerte Stresssensitivität. Die Hypersensitivität
TosodefizienterGranulozytenwurdezusätzlichinvivobetrachtet.HierzuwurdenToso‐/‐
undC57BL/6Mäusemit104CFUListerieninfiziertundimBlutdieROS‐Syntheseunddie
DegranulationvonGranulozytenanTagzweinachderInfektionuntersucht.Währendder
prozentuale Anteil der ROS produzierenden Granulozyten bei Toso Defizienz bei über
60%lag,wieseneindeutlichgeringerAnteilderBlutgranulozytenderC57BL/6Mäusen
ROS‐Synthese auf (Abbildung 4.21.A). Die erhöhte ROS‐Synthese im Blut von Toso‐/‐
MäusenkorreliertemiteinersignifikanthöherenFreisetzungderMyeloperoxidase(MPO)
ins Blut, einem Protein welches in Granula der Granulozyten gespeichert ist und als
MarkerfürdieDegranulationherangezogenwerdenkann(Abbildung4.21.B).
ERGEBNISSE 54
0
2000
4000
6000
8000
C57BL/6Toso‐/‐
p=0,0005
ROS‐Synthesevon
Granulozyten(MFI)
Abbildung4.22. ROS‐Synthese in Granulozyten der Milz. C57BL/6 (schwarz ⧯) und Toso‐/‐ (weiß ⧮)
Mäuse wurden mit 104CFU L.monocytogenes intravenös infiziert und die Milzen 24 Stunden späterentnommen. Die ROS‐Synthese der Granulozyten wurde in der Durchflusszytometrie unter derVerwendungvonDihydrorhodamin(DHR)quantifiziertunddiemittlereFluoreszenzintensität(MFI)vonDHRdargestellt(n=5‐6jeGruppe).JederDatenpunktgibtdenWerteinesindividuellenTiereswieder.DiehorizontaleLiniestelltdenMittelwertderGruppedar.
TosodefizienteBlutgranulozytenzeigtenverglichenmitC57BL/6invivoimBluterhöhte
ROS‐SyntheseundverstärkteDegranulation.DieAktivierungderGranulozytenistinden
OrganenfürdasÜberlebenentscheidend.InderMilzwurdedaherdieROSSyntheseder
Granulozyten 24 Stunden nach der Infektion mit Listerien von Toso‐/‐ und C57BL/6
MäuseninderDurchflusszytometrieuntersucht.DieGranulozytendesC57BL/6Ursprung
zeigten verglichen mit Toso defizienten Zellen eine deutlich höhere ROS‐Synthese
(Abbildung4.22.).
Der Phagozytoseprozesse von Listerien ist unter anderem vom löslichen IgM abhängig
(Abbildung4.9).DerZusammenhangvonIgMmitderROS‐SynthesesowiederExpression
von Toso wurde folgend untersucht. Hierzu wurde peripheres Blut von C57BL/6 und
Toso‐/‐ Mäusen zunächst zur Entfernung aller humoralen Faktoren dreimal mit
serumfreien Medium gewaschen. Anschließend wurden die Blutzellen in Gegenwart
unterschiedlicher IgM‐Konzentrationen mit GM‐CSF geprimt und folgend mit fMLP
aktiviert.DieROS‐SynthesederGranulozytenwurdedurchflusszytometrischermittelt.Die
Titrationvon IgMzeigtebeiallenKonzentrationensowohlbeiToso‐/‐ alsauchC57BL/6
Blutgranulozyten einen vergleichbaren Einfluss, wobei die Substitution mit 200µg/ml
IgMdiePhagozytoseratederZellenbeiderGenotypenaufannäherndnullProzentsenkte
(Abbildung4.23.A).DieAbhängigkeitderROS‐SynthesevonlöslichemIgMwurdezudem
mitdemBlutvonTierendefizient für löslichesIgM(sIgM‐/‐)undfürreifeB‐Zellen(JH‐/‐)
analysiert sowie mit den Granulozyten von C57BL/6 und Toso‐/‐ Mäusen verglichen
(Abbildung4.23.B).DieGranulozytenkeinerdergetestetenDeletionsmäusenkonnteeine
mitdenToso‐/‐Granulozytenvergleichbare,erhöhteROS‐Syntheseaufweisen(Abbildung
ERGEBNISSE 55
4.23.B). Toso defiziente Granulozyten zeigten sowohl bei der direkten Aktivierung mit
fMLPalsauchbeiderAktivierunganschließendandasPrimingsignifikanterhöhteROS‐
Produktion.
0 0.8 2.4 7.3 22 66 2000
20
40
60
80
100 C57BL/6
Toso‐/‐
IgM(µg/ml)
ROS+Granulozyten
(in%vonallenGranulozyten)
A
0
20
40
60
80
100 C57BL/6
JH‐/‐
sIgM‐/‐
Toso‐/‐
fMLPGM‐CSF+fMLP
B
ROS+Granulozyten
(in%vonallenGranulozyten) p=0,006
p=0,04
XXX
Abbildung4.23. DerEinflussvon IgMaufdieROS‐SynthesederGranulozyten. A)PeripheresBlut vonC57BL/6(schwarzeBalken)undToso‐/‐ (weißeBalken) MäusenwurdezurEntfernungvonhumoralenKomponentendesBlutes dreimalmit serumfreienMedium gewaschen.Das gewascheneBlutwurde inGegenwart von verschiedenen Konzentrationen an murinem IgM mit 160ng/ml GM‐CSF eine halbeStundebei37°Cinkubiert.ImAnschlussandasPrimingwurdendieGranulozytenmit2µMfMLPweitere15minbei37°Caktiviert.DieROS‐SynthesewurdeinderDurchflusszytometrieunterVerwendungvonDHRquantifiziert und dieROSproduzierendenGranulozyten in Prozent aller Granulozyten angegeben(n=7). B)DasBlut vonC57BL/6 (schwarz),Toso‐/‐(weiß), sIgM‐/‐ (rot) und JH‐/‐ (blau)wurdemit oderohne GM‐CSF (160ng/ml) und mit oder ohne fMLP (2µM) aktiviert. Die ROS produzierendenGranulozyten wurden in der Durchflusszytometrie mittels DHR detektiert und in Prozent allerGranulozytenangegeben(n=4proGruppe).
4.8. TosobeeinflusstdenAktivierungszustandderGranulozyten
Die Ausführung der Effektorfunktionen von Granulozyten ist abhängig von deren
Aktivierung.EinwichtigerMarkerzurErmittlungdesAktivierungszustandesderZellenist
derKomplement3Rezeptor(C3R),welchersichalsHeterodimerausdenUntereinheiten
CD11b und CD18 zusammensetzt (Anderson et al., 2008;Mazzone and Ricevuti, 1995).
Anhand der Oberflächenexpression der Marker auf Granulozyten wurde der
AktivierungszustandimnaivenBlutanalysiert.HierzuwurdedasBlutvonC57BL/6und
Toso‐/‐ Mäusen direkt nach der Entnahmemit Formalin fixiert und die Expression von
CD11a, CD11b und CD18 im Durchflusszytometer quantifiziert. Toso defiziente
GranulozytenzeigtenverglichenmitdenKontroll‐GranulozytenausC57BL/6Mäuseneine
signifikant höhere Expression von CD11b und CD18 (Abbildung 4.24.B‐C), wohingegen
das zur Kontrolle gemessene Integrin CD11a keinen Unterschied aufwies (Abbildung
4.24.A).
ERGEBNISSE 56
0
50
100
150
200
250
300
350 N.S.
A
CD11aExpression(MFI)
0
2000
4000
6000
8000
10000 p=0,008
B
CD11bExpression(MFI)
0
100
200
300
400C57BL/6Toso ‐/‐
p=0,005
C
CD18Expression(MFI)
Abbildung4.24. Expression von Integrinen auf naiven Blutgranulozyten. Das periphere Blut vonC57BL/6 (schwarz ⧯) und Toso‐/‐ (weiß ⧮) Mäusen wurde direkt nach der Entnahme mit 2%Formalin/PBS fixiert. Die Granulozyten wurden mit anti‐CD11a, anti‐CD11b oder anti‐CD18fluoreszenzgefärbtunddiemittlereFluoreszenzintensitätinderDurchflusszytometriequantifiziert.JederDatenpunkt ist der Wert einer individuellen Maus und die horizontale Linie gibt den Mittelwert derGruppean(n=6).
Die Regulation der Oberflächenexpression von CD11b als Aktivierungsmarker von
Granulozytenwurde in Abhängigkeit vom Priming näher untersucht. Hierzuwurde das
periphereBlutTosodefizientersowieC57BL/6TieremitansteigendenKonzentrationen
vonGM‐CSFundLPSinkubiert.DieBlutgranulozytenvonC57BL/6erreichtendurchdas
Priming mit beiden Substanzen ein mit Toso defizienten Granulozyten vergleichbares
relativesExpressionslevelvonCD11b(Abbildung4.25.).
0
2000
4000
6000
8000
10000
+GM‐CSF+LPS[80ng/ml][100µg/ml]
p=0,0426
CD11bExpression
(MFIvonGranulozyten)
C57BL/6
Toso ‐/‐
Abbildung4.25. Expression von CD11bnachdemPrimingmitGM‐CSFund LPS. Peripheres Blut vonC57BL/6(schwarz⧯)undToso‐/‐(weiß⧮)MäusenwurdeeinehalbeStundebei37°CinGegenwartvon80ng/mlGM‐CSFbzw.100µg/mlLPSinkubiert.DiemittlereFluoreszenzintensität(MFI)derExpressionvonCD11baufGranulozytenwurde inderDurchflusszytometriequantifiziert. JederDatenpunkt istderWerteinerindividuellenMausunddiehorizontaleLiniegibtdenMittelwertan(n=5‐6).
ERGEBNISSE 57
Die Oberflächenexpression Toso defizienter Granulozyten zeigte bereits ohne
Voraktivierung erhöhte Level des Aktivierungsmarkers CD11b (Abbildung 4.24.;
Abbildung 4.25). Der Einfluss der Integrinexpression auf die Regulation des
Induktionsschwellenwerts für die Synthese von ROS wurde in der Doppel‐Mutante
(Toso‐/‐xCD11b‐/‐) untersucht. Das periphere Blut von C57BL/6, Toso‐/‐, CD11b‐/‐ sowie
Toso‐/‐xCD11b‐/‐ wurde 30minmit GM‐CSF bei 37°C geprimt und anschließend 15min
mit fMLP aktiviert. Im Anschluss wurde die ROS‐Synthese im Durchflusszytometer
analysiert. Der Anteil der ROS produzierendenGranulozyten beiCD11b‐/‐ Defizienzwar
mitC57BL/6Granulozytenvergleichbar,wohingegendieToso‐/‐ Granulozytenähnlichzu
vorigenExperimentensignifikanthöhereFrequenzenROSproduzierterZellenaufwiesen
(Abbildung 4.26.C). Die ROS‐Generierung der Granulozyten reduzierte sich bei der
Doppel‐Mutante Toso‐/‐xCD11b‐/‐ deutlich gegenüber Toso‐/‐ Granulozyten und war
vergleichbarmitdenGranulozytenvomC57BL/6Ursprung(Abbildung4.26.C).
0
20
40
60
Toso‐/‐
CD11b‐/‐
Toso‐/‐ x CD11b‐/‐
p=0,035 C57BL/6
ROS+Granulozyten
(in%vonallenGranulozyten)
Abbildung4.26. Einfluss der CD11b‐Expression auf die Effektorfunktion von Granulozyten. Dasperiphere Blut von C57BL/6 (schwarze Balken),Toso‐/‐ (weiße Balken),CD11b‐/‐ (blaue Balken) sowieToso‐/‐xCD11b‐/‐ (rote Balken)wurdemit 160ng/ml GM‐CSF eine halbe Stunde bei 37°C geprimt. ZurAktivierungwurdedieInkubationfür15minmit2µMfMLPfortgesetzt.DieROS‐SynthesewurdeinderDurchflusszytometrie unter Verwendung von DHR quantifiziert und die ROS produzierendenGranulozytenalsprozentualerAnteilallerGranulozytenangegeben(n=4).
Die Defizienz des Integrins CD11b verringerte invitro die ROS‐Synthese von Toso‐/‐
GranulozytenaufdasLevelvonC57BL/6Granulozyten.DieAuswirkungderDeletionvon
CD11binvivowurdebeieinerListerieninfektionnäherbetrachtet.HierzuwurdenToso‐/‐
sowie Toso‐/‐xCD11b‐/‐ Mäuse mit 104CFU Listerien infiziert. Die Toso‐/‐xCD11b‐/‐
DoppelmutanteüberlebtedieInfektionzuknapp40%,während90%derTosodefizienten
Mäuseverstarben(Abbildung4.27.).DieCD11b‐/‐MausdientealsKontrolleundverhielt
sichwieC57BL/6inderAbbildung4.3.
ERGEBNISSE 58
0 5 10 15 200
20
40
60
80
100Toso‐/‐
CD11b‐/‐
p=0,038
Zeit p.i.(Tage)
Überleben(%)
Toso‐/‐x CD11b‐/‐
Abbildung4.27. ÜberlebenskurvebeiDefizienzvonCD11bwährendeinerListerieninfektion.Toso‐/‐(weiß),CD11b‐/‐ (blau)Toso‐/‐xCD11b‐/‐(rot)Mäusewurdenmit 104 CFU L.monocytogenes intravenösinfiziert. und das Überleben der Tiere unter Berücksichtigung der Abbruchkriterien (Belastung undGewichtsverlustderTiere)zeitabhängigverfolgt.EswurdenindreiunabhängigenAnsätzenjeweilsdreiTiereproGenotypinfiziert(n=9).
Die Auswirkungen einer Voraktivierung der Granulozyten auf die Phagozytose wurden
invitro in der konfokalen Mikroskopie untersucht. Die Blutgranulozyten von C57BL/6
wurden 20min mit fMLP voraktiviert und die Phagozytose von CFSE‐Listerien mit
Blutgranulozyten naiver nicht geprimter C57BL/6 sowie Toso‐/‐ Tiere verglichen. Die
Inkubationmit CFSE‐Listerienwurde über einen Zeitraum von 2 Stunden durchgeführt
unddiePhagozytosederPathogenenachderFixierungundZentrifugationderZellenauf
Objektträgerkonfokalmikroskopiert.TosodefizienteGranulozytenzeigtenimVergleich
zudenKontrolltiereneine starkverminderteAufnahmevonListerien (Abbildung4.28.)
Die Voraktivierung der C57BL/6 Granulozyten mit fMLP zeigte jedoch einen
reduzierendenEffektaufdiePhagozytosederCFSE‐Listerien(Abbildung4.28)
ERGEBNISSE 59
Abbildung4.28. PhagozytosekapazitätvoraktivierterBlutgranulozyten.106CFUCFSEListerienwurdeninGegenwartvonAntibiotikazweiStundenmitdemBlutnaiver,nichtaktivierterC57BL/6(obereZeile),Toso‐/‐(mittlereZeile)sowiedemBlutvonC57BL/6,welcheszuvor20minmit2µMfMLP(untereZeile)voraktiviert wurde, inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde das Blut umgehend fixiert und aufObjektträger zentrifugiert. Die Granulozyten wurden konfokal mikroskopiert und repräsentativErgebnissevondreiVersuchstierendargestellt.DieListeriensindingrün,dieGranulozyteninblauundCD11binrotfluoreszenzgefärbt.
Die Folgen einer vorzeitigen Aktivierung der Granulozyten im Blut der Tiere während
einer Listerieninfektion wurde invivo näher charakterisiert. Hierzu wurden C57BL/6
TieremitdersublethalenDosisvon104CFUListerieninfiziertundmitunterschiedlichen
Kombinationen aus Priming und Aktivierungssubstanzen intravenös behandelt. Die
Überlebenskurve der behandelten Tiere wurde in Bezug zur infizierten
Kontrollbehandlung mit PBS gesetzt. Die Priming‐ und Aktivierungssubstanzen haben
perse ohne Infektion keinen Einfluss auf dasÜberleben der Tiere. Die Behandlung und
somit die Voraktivierung mit GM‐CSF und fMLP führte zu 100%iger Mortalität,
wohingegendieunbehandeltenTierezuknapp80%überlebten(Abbildung4.29.).
ERGEBNISSE 60
0 5 10 150
20
40
60
80
100
Listerien,PBSListerien,GM‐CSFListerien,GM‐CSF,fMLP
,GM‐CSF,fMLPn=4
n=7
n=7p=0,18
n=7p=0,002
Zeit p.i.(Tage)
Überleben(%)
Abbildung4.29. Überlebenskurve einer Listerieninfektion bei Voraktivierung der Granulozyten.C57BL/6Mäusewurdenmit104CFUL.monocytogenes (Listerien) infiziert.EineKontrollgruppewurdemitPBSbehandelt(schwarz⧯),eineweiterewurdeandenTagen1,2und3p.i. intravenösmit jeweils120ng GM‐CSF (grau ⧯) bzw. 120ng GM‐CSF und 100ng fMLP (weiß ⧮) substituiert. DieSubstanzkontrolleerfolgteinderTiergruppeohneInfektion,welchemit120ngGM‐CSFund100ngfMLP(weiß ⧲) behandelt wurde. Das Überleben der Tiere wurde unter der Berücksichtigung vonAbbruchkriterien(BelastungundGewichtsverlustderTiere)verfolgt.DieSignifikanzwurdebezogenaufdiemitListerieninfzierteKontrollgruppe.
4.9. IntrinsischerDefektTosodefizienterGranulozyten
Die Voraktivierung Toso defizienter Granulozyten kann von verschiedenen humoralen
Faktoren wie den proinflammatorischen Zytokinen, den Antikörpern sowie dem
KomplementsystemjedochauchvonanderenZellenwieB‐undT‐Zellen,Endothelzellen
und Thrombozyten beeinflusst werden (Witko‐Sarsat et al., 2000). Die bereits
vorgestelltenDatenkonnten zeigen,dassTosodenSchwellenwert fürdieROSSynthese
beeinflusstundeineVoraktivierungderGranulozytenverhindert.ZurUntersuchungeiner
intrinsischen oder extrinsischen Ursache wurden zunächst Knochenmarkschimären
generiert. C57BL/6 Mäuse wurden mit 1050rad bestrahlt, um das Knochenmark und
somit alle Immunzellen zu zerstören. Anschließend wurden die bestrahlten Mäuse mit
einem 1:1 Knochenmarkgemisch aus C57BL/6 und Toso‐/‐ Mäusen rekonstruiert. Zur
Unterscheidung des Genotyps wurde das CD45 Allelsysthem verwendet. Die
Knochenmarkzellen aus Toso defizienten Tieren wiesen die Allelform CD45.2 auf,
während die wildtypischen Knochenmarkszellen das Allel CD45.1 besaßen (Abbildung
4.30.A).
ERGEBNISSE 61
0
10
20
30
40 C57BL/6Toso‐/‐
p=0,03
B
Granulozyten
(in%ofallenBlutleukozyten)
0
20
40
60
80
100
0.1 1 10 100
C57BL/6
Toso‐/‐
0
p=0,0032
fMLP(µM)
ROS+Granulozyten
(in%vonallenGranulozyten)
C
Abbildung4.30. Untersuchung der Granulozyten in gemischten Knochenmarkchimären. C57BL/6Empfängermäuse wurden mit 1050rad bestrahlt und Folgetag mit einem 1:1 Gemisch aus C57BL/6(CD45.1; blau) und Toso‐/‐ (CD45.2; rot) Knochenmarkzellen rekonstruiert. 30 Tage nach derRekonstruktion wurden die Blutgranulozyten analysiert. A) Repräsentativer DotPlot derdurchflusszytometrischen Analyse der Rekonstruktion vorselektiert auf Granulozyten. In Rot sind dieTosodefizienten,inBlaudiewildtypischenZellendargestelltB)ProzentualerAnteilderBlutgranulozytenallerLeukozyten.DiehorizontaleLiniegibtdenMittelwertderGruppean(n=8).C)DasperiphereBlutwurdemit ansteigenden Konzentrationen an fMLP inkubiert. Die Frequenz der ROS der GranulozytenwurdeinProzentallerGranulozytendesentsprechendenGenotypsangegeben(n=8).
In den gemischten Knochenmarkchimären setzte sich die Granulozytenpopulation aus
einem leicht höheren Anteil von C57BL/6 Zellen zusammen (Abbildung 4.30.B). Die
Induktion der ROS‐Synthese im peripheren Blut wurde anschließend an die
Rekonstitution durchflusszytometrisch analysiert. Hierzu wurde das Blut mit
ansteigendenKonzentrationenvonfMLPinvitroinkubiertundderprozentualeAnteilROS
produzierender Granulozyten des jeweiligen Genotyps erfasst. Der prozentuale Anteil
Toso defizienter Granulozyten, welche ROS produzierten, konnte bei allen getesteten
fMLP Konzentration verglichen mit den C57BL/6 höher detektiert werden (Abbildung
4.30.C).
4.10. Adoptivtransfer von C57BL/6Granulozyten verbessertdie
ListerienkontrollewährendderInfektion
DiePathogenkontrolleunddasÜberlebenderTierebeieinerListerieninfektionhängtvon
der effizienten Effektorfunktion der Granulozyten ab. Zur Ermittlung der Funktionalität
derGranulozytenwurdenadoptiveZelltransferexperimentedurchgeführt.Hierzuwurden
die Granulozyten des Knochenmarks unter der Verwendung von Ly6G positiv mittels
ERGEBNISSE 62
MACS‐Methode aufgereinigt und nur Zellfraktionen mit einer Reinheit von >95%
Granulozyten und einer maximalen Kontamination mit Monozyten von <0,1% weiter
verwendet(Abbildung4.31.).
Abbildung4.31. Aufreinigung von Granulozyten aus dem Knochenmark. Granulozyten aus demKnochenmarkderTierewurdenmittelsLy6GMACS‐Kits(MiltenyiBiotec)nachAnleitungdesHerstellersaufgereinigtunddieFraktionsreinheitinderDurchflusszytometrieanalysiert.DerlinkeDotPlotzeigtdasKnochenmarkvor,derrechtenachderAufreinigung.DieFluoreszenzfärbungbeiderFraktionenerfolgteunterVerwendungderAntikörpernLy6GundCD11bundwarstetsüber95%.InRotsinddieMonozyten(Ly6Gmed.CD11bhi)undinBlaudieGranulozyten(Ly6Ghi,CD11bmed)dargestellt.
Zur Eliminierung der endogenen Granulozyten wurden zunächst C57BL/6 Mäuse mit
Cyclophosphamid und Temozolomid (CY/T) vorbehandelt,wodurch drei Tage nach der
Behandlung nahezu alle Lymphozyten und Granulozyten zerstört wurden (Abbildung
4.32.A). Anschließend wurden die CY/T vorbehandelten C57BL/6 Empfängertiere mit
104CFU Listerien infiziert und an den Tagen null und eins der Infektion aufgereinigte
Granulozyten aus dem Knochenmark von Toso‐/‐ sowie C57BL/6 Mäusen adoptiv
transferiert. Die Listerientiter wurden in der Milz und der Leber am zweiten Tag der
Infektion bestimmt. Zur Kontrolle für den Transfer dienten Listerien infizierte CY/T
vorbehandelte C57BL/6 Mäuse ohne Transfer von Granulozyten sowie eine weitere
Gruppe infizierter C57BL/6Mäuse ohne vorheriger CY/T Behandlung.Während in der
Milz keine Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen detektiert werden konnten,
zeigte der Adoptivtransfer in der Leber deutliche Unterschiede (Abbildung 4.32.B). Der
ListerientiterzwischenunbehandeltenundmitCY/TbehandeltenMäusenwarannähernd
hundertfach höher und konnte durch den Transfer von C57BL/6 Granulozyten auf das
Niveau der unbehandelten Tiere reduziert werden. Der Transfer Toso defizienter
Granulozyten konnte dagegen eine schwächere Pathogenkontrolle erzielen, so dass fast
ERGEBNISSE 63
zehnfach höhere Titer als beim Transfer von C57BL/6 Granulozyten detektiert werden
konnten(Abbildung4.32.B).
0
1000
2000
3000
4000C57BL/6,unbehandeltC57BL/6,CY/T
LymphozytenGranulozyten
A
Leukozytenim
Blut(Zellen/µl)
XX
3
4
5
6
7
8 MilzLeber
<3
B
C57BL/6CY/T,ohnetransfer
CY/T+C57BL/6Granulozyten
CY/T+ Toso‐/‐Granulozyten
p=0,04
Listerien(log 10CFU/Organ)
Abbildung4.32. ListerientiternachadoptivemTransfervonGranulozyten.C57BL/6MäusenwurdezurDepletionvonLeukozytenCyclophosphamid (200mg/kgKörpergewicht)undTemozolomid (90mg/kgKörpergewicht) intraperitoneal appliziert. A) An Tag drei nach CY/T Behandlung (schwarze Balken)wurde den Tieren Blut entnommen und die Anzahl von Lymphozyten und Granulozyten in derDurchflusszytometrie mit unbehandelten C57BL/6 Mäusen (weiße Balken) verglichen (n=4). B) DreiTagenachCY/TBehandlungwurdenalleTieremit104CFUL.monocytogenes infiziert.AndenTagen3und4nachderBehandlungwurdeneinerGruppe jeweils8x106 C57BL/6bzw.eineranderenGruppe8x106Toso‐/‐Granulozytentransferiert.ZurKontrollebliebeineCY/TbehandelteGruppeohneTransferundeineweitereGruppevonC57BL/6wurdenurinfiziertohnemitCY/Tbehandeltwordenzusein.AnTag5wurdendieMilzundLeberderTiereentnommenunddieListerientiterderOrganebestimmt.JederDatenpunkt stellt das Ergebnis eines individuellen Tieres dar und die horizontalen Linien zeigen denMittelwertderGruppe.DasExperimentwurdeindreiunabhängigenAnsätzenmitjeweilsdreiTierenproGruppedurchgeführt(n=9).
DieSchlüsselfunktionderGranulozytenfürdasverminderteÜberlebenderTierebeiToso
DefizienzwährendeinerInfektionmitListerienwurdeebenfallsmittelsAdoptivtransfers
von C57BL/6 Granulozyten untersucht. Hierzu wurden Toso defizienten Tieren an den
Tagen null bis drei nach Infektion mit 3x103CFU Listerien aus dem Knochenmark
aufgereinigte C57BL/6 Granulozyten transferiert und das Überleben der Tiere verfolgt.
Der adoptiveTransfer inToso‐/‐MäuseerhöhtedieÜberlebensrate auf einmitC57BL/6
vergleichbares Niveau, wohingegen nahezu alleToso‐/‐ Mäuse ohne Transfer verstarben
(Abbildung4.33).
ERGEBNISSE 64
0 5 10 150
20
40
60
80
100 C57BL/6Toso‐/‐ +C57BL/6GranulozytenToso‐/‐
p=0,02
Zeit p.i.(Tage)
Überleben(%)
Abbildung4.33. Überlebenskurve der Toso‐/‐Mäuse nach adoptivenGranulozytentransferwährendder Infektion mit L. monocytogenes. C57BL/6 und Toso‐/‐ Mäuse wurden mit 3x103CFU L.monocytogenes intravenös infiziert. Einer Gruppe Toso defizienter Mäuse wurde an Tag 0,1,2,3 p.i.intravenösjeweils8x106C57BL/6Granulozytentransferiert.DieübrigenGruppenbliebenunbehandelt.DasÜberlebenwurdeunterderBerücksichtigungvonAbbruchkriterien(BelastungundGewichtsverlustderTiere)beobachtet(n=7‐14TiereproGruppe).
DISKUSSION 65
5. DISKUSSION
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung von Toso im Mausmodell
während einer Infektion mit Listeriamonocytogenes untersucht. Nach der initialen
Phagozytose der Bakterien durch gewebeständige Makrophagen migrieren die
Granulozyten angelockt durch proinflammatorische Zytokine als erste
Leukozytenpopulation zum Infektionsort. Die Granulozyten phagozytieren die
opsonierten Pathogene und eliminieren diese durch die intrazelluläre Synthese von
reactiveoxygenspecies (ROS).DerEinflussvonTosoaufdieseProzessewurdemiteiner
totalenDeletionsmutanteanalysiert.
DieDeletionvonTosokonnteinderMaussowohlaufDNA‐,RNA‐sowieaufProteinebene
nachgewiesenwerden(Abbildung4.1.undAbbildung4.6.).TosodefizienteMäusewaren
fertilundzeigtennaivkeinegesundheitseinschränkendenphänotypischenAuffälligkeiten.
Die Analyse der Zusammensetzung des Blutes hinsichtlich der Immunzellen zeigte eine
über 50%ige Reduktion an B‐Zellen, was sich jedoch nicht auf die Konzentration an
löslichemIgM imBlutauswirkte (Abbildung4.2.undAbbildung4.9.A).DerEinflussvon
Toso auf das Immunsystem wurde mit dem gram‐positiven Bakterium
Listeriamonocytogenes näher untersucht. In diesem Untersuchungsmodell spielen die
B‐LymphozyteneineuntergeordneteRolle(Mackaness,1962),sodassderenverminderte
FrequenzeninTosodefizientenMäusenkeinenentscheidendenEinflussaufdenAusgang
derInfektionausübensollten.
5.1. Funktion vonToso aufdie initialeKontrolleder Infektion
mitListeriamonocytogenes
Die bakterielle Pathogenkontrolle benötigt ein effizientes Zusammenspiel der
angeborenen und adaptiven Immunantwort. Die ersten Anzeichen der adaptiven
Immunantwort durch klonale Expansion von Listerien spezifischen T‐Zellen lassen sich
frühestens vier Tage nach der Infektion im Blut nachweisen (Busch et al., 1998). Die
Mortalität tritt bei Toso defizienten Mäusen jedoch in den ersten drei Tagen nach der
Infektion ein (Abbildung 4.3.), weswegen eine Dysfunktion des angeborenen
Immunsystemsvorzuliegenscheint.ImZusammenhangmitderhohenMortalitätbeiToso
DISKUSSION 66
Defizienz sind die bakteriellen Titer in der Milz, Leber und im Gehirn stark erhöht
(Abbildung4.4.)unddeutetenaufeinevermindertebakterielleKontrollehin.
DieinitialeEindämmungderAusbreitungvonPathogenenzuBeginneinerInfektionwird
durch gewebeständige Makrophagen in der Milz und der Leber gewährleistet (Conlan,
1996). Diese sind fest mit dem Endothel assoziiert, reichen ins Lumen der Blutgefäße
hineinundsindaufgrundihrerLokalisationprädestiniertfürdieFiltrationdesBlutesvon
Pathogenen (Crispe, 2009; Lang et al., 2010).Durch spezifischeZelldepletion, unterder
Verwendung einer intravenösen Applikation von in Liposomen eingeschlossenem
Clodronat, kann der Einfluss gewebeständiger Makrophagen deutlich gemacht werden
(van Rooijen et al., 1997). Bei einer systemischen Infektion mit dem lymphozytären
Choriomeningitis Virus (LCMV) führte Untersuchungen zufolge die Depletion
gewebeständiger Makrophagen zu einer unkontrollierten viralen Replikation und der
Ausbreitung viraler Partikel in andere Organe. Die Konsequenz war eine verminderte
zytotoxische T‐Zellantwort und die Persistenz des Viruses (Lang et al., 2010). Des
WeiterenkonnteeineessentielleFunktiongewebeständigermetallophilerMakrophagen
der Milz für die Aufnahme von Pathogenen und die Präsentation ihrer Antigene bei
UntersuchungenmitdemvesikulärenstromatitisVirus(VSV)gezeigtwerden.DasFehlen
dieser Zellpopulation führte zu einer ineffektiven Aktivierung des adaptiven
ImmunsystemsundzueinererhöhtenMortalitätderTiere(Honkeetal.,2012).
DieseBeispieleverdeutlicheneinenbedeutendenEinflussgewebeständigerMakrophagen
bei einer viralen Infektion. Der Einfluss dieser Zellpopulation bei einer bakteriellen
Infektion wurde durch die spezifische Depletion mit Clodronat untersucht. Durch das
FehlengewebeständigerMakrophagenerreichtedieMortalitätinC57BL/6Mäusenselbst
beieiner Infektionmiteinernicht letalenDosisvon3x102CFUListerieneineFrequenz
von100% (Anhang6.1.).DieseBedeutungder Zellen für denVerlauf einer bakteriellen
InfektionsetztezunächstdieUntersuchungderFunktionalitätvonMakrophageninToso
defizientenMäusen voraus. Die nähere Charakterisierung dieser Zellpopulation erfolgte
zum Ausschluss exogener Einflüsse ausschließlich invitro. Toso‐/‐ Makrophagen zeigten
bei konfokaler Betrachtung hinsichtlich der Kapazität des Phagozytoseprozesses von
Listerien eine mit wildtypischen Makrophagen vergleichbare Phagozytose (Abbildung
4.12.). Eine vergleichbare Funktionalität von Makrophagen beider Genotypen konnte
zudemmittels eines Listerien‐Eliminierungsassays bestimmt werden (Abbildung 4.13.).
Insgesamt phagozytierten und eliminierten die Makrophagen beider Genotypen die
BakterienineinemvergleichbarenAusmaß.
DISKUSSION 67
Neben gewebeständigen Makrophagen nehmen die neutrophilen Granulozyten einen
gewichtigenEinflussaufdieanfänglicheKontrollederBakterienverbreitung.DieseZellen
migrieren innerhalbweniger Stunden zum Infektionsort und eliminieren die Pathogene
ähnlich zu Makrophagen durch Phagozytose und intrazelluläre Synthese von ROS. Die
Bedeutung bei einer bakteriellen Infektionwurde zahlreich beschrieben (Czuprynski et
al., 1994; Rogers and Unanue, 1993) und konnte durch die spezifische Depletion der
Granulozyten, die die Suszeptibilität in C57BL/6 Mäusen erhöhte, bestätigt werden
(Abbildung 4.5.). Der adaptive Transfer von C57BL/6 Granulozyten in Toso defiziente
Mäuse konnte dagegen die Resistenz für L.monocytogenes wiederherstellen (Abbildung
4.33.) und lässt auf Defizite bei Granulozyten in Abwesenheit von Toso schließen. Die
genauereUntersuchungderGranulozytenwurdefolglichinvivoundinvitrodurchgeführt.
5.2. EinflüssevonTosoaufdieQuantitätderGranulozyten
DieGranulozytenreifenimKnochenmarkaus,emigriereninsBlutundwandernbeieiner
Inflammation zur Bekämpfung der Pathogene am Entzündungsort in das umliegende
Gewebe. ImperipherenBluthabendieGranulozyteneineLebenszeitspannevoneinigen
Stunden bevor sie durch spontane Apoptose sterben. Toso wurde ursprünglich als
anti‐apoptotischwirkendesMolekül auf T‐Zellen beschrieben (Hitoshi et al., 1998). Die
Einflussnahme des Proteins auf die Steuerung der Apoptose und die Neubildung von
GranulozytenwurdeindiesemZusammenhanguntersucht.
Das Überleben der Granulozyten kann durch Pathogenkontakt, bakterielles
Lipopolysaccharid (LPS) sowie proinflammatorische Zytokine, Chemokine und
WachstumsfaktorenwieGM‐CSFumeinigeTageverlängertwerden(Colottaetal.,1992;
Hachiya et al., 1995; Kobayashi et al., 2005; Yamamoto et al., 1993). Zudem weisen
apoptotische Granulozyten eine Herunterregulation von an der Phagozytose beteiligten
Rezeptorenund folglicheineniedrigerePhagozytosekapazitätauf,dieursächlich fürdie
verminderteEffektorfunktionvonTosodefizientenGranulozyten seinkönnte (Whyteet
al., 1993). Eine Störung der spontanen Apoptose sowie der überlebensverlängerende
EinflussvonGM‐CSFwurdeninvitrountersuchtundeineInvolvierungvonTosoaufdiese
Prozesseausgeschlossen(Abbildung4.7.A.).
Störungen, diedieNeubildungderGranulozyten imKnochenmarkbetreffen, sinddurch
eineNeutropeniegekennzeichnetundmit chronischenundrezidivierendenbakteriellen
Erkrankungenverbunden.DieseschwerwiegendenKrankheitensindz.B.mitgenetischen
DISKUSSION 68
MutationenindenGenenELA2(Elastase2),GFI1(growthfactor‐independent1)oderdem
Kostmann‐Syndromassoziert (Ancliff et al.,2001;Kostmann,1956;Personetal.,2003).
Die Neubildung der Granulozyten und derenMigration aus demKnochenmark ins Blut
wurden jedoch nicht durch die Defizienz von Toso beeinflusst (Abbildung 4.7.B).
Korrelierend hierzu war die Populationsgröße reifer Granulozyten im peripheren Blut
naiverToso‐/‐MäusemitdemBlutvonC57BL/6Mäusenvergleichbar(Abbildung4.2.A).
EinefunktionelleRelevanzvonTosoaufdieQuantitätoderNeubildungderZellenkonnte
somit ausgeschlossen werden und nicht als Ursache für die erhöhte Mortalität
herangezogen werden. Neben der Anzahl der Granulozyten ist auch deren funktionelle
Qualität inFormvonPhagozytoseundSynthesevonROSentscheidend fürdenAusgang
einerInfektionmitBakterien.
5.3. Komplement‐undIgM‐abhängigePhagozytose
Die opsonierten Pathogene werden durch Rezeptoren auf der Oberfläche von
Granulozytenerkanntundphagozytiert(Medzhitov,2001;MedzhitovandJaneway,2000).
InzweiunabhängigenStudienmittransfiziertenHeLa‐ZellenkonnteeinedirekteBindung
vonIgManTosonachgewiesenwerden(Shimaetal.,2010;Vireetal.,2011).Dieseführte
innerhalb weniger Minuten zur Internalisierung des Toso/IgM Komplexes sowie zur
lysosomalenDegradierungderProteinkonglomerate (Vire et al., 2011).Dies stellt einen
möglichenMechanismus dar,wodurch an IgM Immunkomplexen gebundene Pathogene
zurEliminierung insZellinnere transportiertwerdenkönntenundanschließendPAMPs
intrazellulär zurVerfügunggestelltwerden.Tosobefindet sich sowohl imMenschenals
auch in der Maus in der unmittelbaren Nachbarschaft zweier bereits beschriebener
Fc‐Rezeptoren pIgR und Fcα/µR für IgM auf dem Chromosom1 (Abbildung 5.1.). Diese
weisen verglichen mit Toso einige konservierte Strukturen in der variablen
Immunoglobindomäne (IgV) auf (Shima et al., 2010), binden jedoch nicht nur IgM,
sondernauchIgAPolymere(Hamburgeretal.,2004).
DISKUSSION 69
Abbildung5.1.: InsilicoAnalysedesTosoGenlokusaufChromosom1.DargestelltisteinAusschnittdesChromosoms1 des Menschen Homosapiens (oben) und der Hausmaus Musmusculus (unten). Quellehttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/DatumderRecherche15.08.2012.
DieCharakterisierungvonTosoalsRezeptor für IgMmachteeinenähereUntersuchung
des Phagozytoseprozesses notwendig. Toso defiziente Granulozyten zeigten verglichen
mitC57BL/6GranulozyteneinevermindertePhagozytoserate.DieUrsachehierfürwurde
gesondert für das Komplementsystem und anti‐Listerien‐IgM Antikörper untersucht. In
diesemProzesskommtdemKomplementsystemeinegrößereBedeutungzu (Abbildung
4.9.D). Die Hitzeinaktivierung der Komponenten verminderte die Phagozytose auf ein
zwischen Toso‐/‐ und C57BL/6 Granulozyten vergleichbar geringes Niveau (Abbildung
4.9.D).DieVerwendungvomintaktenSerumeinschließlichanti‐Listerien‐IgMAntikörper
resultiertebeiAnwesenheitvonToso inverbesserterPhagozytoseopsonierterListerien
(Abbildung 4.9.C). Eine direkte Bindung der kommerziell erwerblichen murinen anti
ListerienIgM‐PentamereanPathogeneimserumfreienMediumerbrachtejedocheinemit
C57BL/6GranulozytenvergleichbarerePhagozytosevonToso‐/‐Zellen(Anhang6.2).
DiegezeigtenVersuchesuggeriereneineaufdenPhagozytoseprozessförderlicheWirkung
der Interaktion von Tosomit löslichem IgM nur in Anwesenheit von Bestandteilen des
Komplementsystems.DasFehlenvonnureinerdieserdreiKomponentenführtezukeiner
PotenzierungderPhagozytoseratevonPathogenen(Abbildung4.9.undAnhang6.2.).Eine
mögliche Erklärung für den Zusammenhang könnte sein, dass Bestandteile des
Komplementsystems zusammen mit IgM Immunkomplexen förderlich auf die C3
Opsonierung von Bakterien wirken und dessen anschließender Phagozytose über die
Komplementrezeptoren1(C1R)und3(C3R)erlauben(Ogdenetal.,2005;Schwartzetal.,
2012). In einer Studiemit dem gram‐negativen Bakterium Francisellatularensis konnte
gezeigtwerden,dassnatürliches IgMimSerumvonnicht immunenMenschenessentiell
für die Komplement‐abhängige Phagozytose ist. Das natürliche IgM bindet an die
DISKUSSION 70
Oberfläche der Bakterien und aktiviert dadurch über C1q den klassischen Weg des
Komplementsystems. Dies erhöht die C3 Anlagerung auf der Bakterienoberfläche und
führtschließlichzurPhagozytoseüberdenKomplementrezeptor3(Schwartzetal.,2012).
Übertragen auf die Ergebnisse der durchgeführten Opsonierungsexperimente lässt die
StudievonSchwartzetal.(2012)eineInvolvierungvonTosobeidiesemVorgangmöglich
erscheinen. Toso könnte hierbei die Phagozytose opsonierter Pathogene durch direkte
oderindirekteInteraktionmitdenKomplementrezeptorenbeeinflussen.
DieBedeutungvon IgMaufdenPhagozytosevorgangkonntezusätzlichdurchdiesIgM‐/‐
Mausverdeutlichtwerden.DieBlutgranulozytenausdersIgM‐/‐Mauszeigtenähnlichzu
Toso‐/‐ Granulozyten verglichen mit C57BL/6 Zellen eine verminderte Phagozytoserate
(Abbildung 4.8.). Eine exogeneUrsache für dieMinderung derAufnahmekapazität Toso
defizienter Granulozyten durch z.B. geringere Konzentrationen humoraler Faktoren im
SerumderTierekonnteausgeschlossenwerden(Abbildung4.9.AundAbbildung6.3.).Die
HypotheseeinesintrinsischenDefektsderGranulozytenbeiTosoDefizienswurdedurch
adaptivenZelltransferToso‐/‐sowieC57BL/6GranulozyteninCY/TbehandelteC57BL/6
Empfängertiere bekräftigt. In diesem Experiment zeigten die C57BL/6 Granulozyten
verglichen mit Toso‐/‐ Granulozyten invivo eine verbesserte bakterielle Kontrolle
(Abbildung4.32.B).
5.4. InvolvierungvonTosobeiderROS‐Synthese
DiebakteriellePhagozytosedurchGranulozytenruftdieintrazelluläreSynthesevonROS
hervor. Die enge Verknüpfung beider Prozesse zeigte sich durch die Analyse der ROS‐
ProduktionphagozytierenderGranulozytengegenüberGranulozytenohneAufnahmevon
Listerien (Abbildung 4.16.). Sauerstoffradikale konnten nur in Granulozyten detektiert
werden,welcheBakterienaufgenommenhatten(Abbildung4.16.).DerEinflussvonToso
aufdieReduktiondesSauerstoffszuO•wurdeinvitrogenaueruntersucht.DieInduktion
derROS‐SyntheseistinzweiPhasen,diePriming‐unddieAktivierungsphase,gegliedert.
Die Synthese von ROS benötigt zwingend die Assemblierung der Untereinheiten der
NADPH‐Oxidase(Segal,2005).DieNADPH‐Oxidase isteinMultiproteinkomplex,welcher
aus sechs Proteinen besteht von denen zwei das in der Membran eingebaute
Flavocytochrom b558 bilden und die anderen von zytolischen Proteinen gestellt werden
(Babior,1999).DieVerteilungdieserProteinimZytosolnichtaktivierterZellensolleinen
inaktiviertenZustandderNADPH‐Oxidasegewährleisten,welchererstbeiStimulationzur
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DISKUSSION
558 führt
‐Oxidase
omatose
n zählen,
., 2003).
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NFα das
l., 2008)
u einer
nEnzym
anulozytenTNFα dies
eihohen
hrend in
n konnte
menhang
N 71
DISKUSSION 72
mit der Schwellenwertsetzung für die TNFα induzierte Apoptose und konnte mittels
heterologer Expressionsstudien sowie invivo Untersuchungen die anti‐apoptotische
Wirkung vonToso bestätigen (Nguyen et al., 2011).Die vorgestelltenDatenpassen zur
erhöhtenTNFαSensitivitätundverstärktenROS‐SyntheseTosodefizienterGranulozyten.
DieInduktionderROS‐SynthesewarTNFαspezifischundkonntenichtbeiGM‐CSFoder
LPS beobachtet werden, weswegen eine Involvierung von Toso in den p38 Signalweg
möglichzuseinscheint.
In diesem Zusammenhang konnte in einer kürzlich veröffentlichten Arbeit ein auf den
TNFα induziertenPrimingeffekt regulatorischwirkendesProteincharakterisiertwerden
(Boussettaetal.,2010).DasPrimingmitTNFαaktiviertdieIsomerasePin1,welcheandas
phosphorylierteSerinS345vonp47phoxbindetunddieKonformationsänderungsowiedie
PhosphorylierungweitererAminosäurendurchdieProteinkinaseC(PKC)induziert.Dies
ermöglicht schließlich die Bindung von p47phox an die p22phox‐Untereinheit, was zur
Assemblierung des funktionsfähigen NADPH‐Oxidase Komplexes führt. Die Inhibierung
vonPin1konntedenPrimingeffekt vonTNFαaufheben.DieseStudien lassenvermuten,
dass Toso entweder bei der Phosphorylierung von p47phox über Moleküle des p38
SignalwegsinvolviertseinkönnteoderregulatorischaufPin1einwirkenkönnte.
Die gemischten Knochenmarkchimären konnten zudem zeigen, dass eine intrinsische
Dysfunktion der Toso‐/‐ Granulozyten in Bezug auf die Induktion der ROS‐Synthese
vorliegen muss (Abbildung 4.30.). Bei allen getesteten Konzentrationen von fMLP
reagierte in gemischtenChimären einhöhererAnteil anToso‐/‐ Granulozytenverglichen
mit C57BL/6 Granulozyten mit der Synthese von ROS. Dieser Befund konnte mit
Einzelknochenmarkchimären rekonstituiert mit Toso defizientem bzw. C57BL/6
Knochenmarkverifiziertwerden(Anhang6.4.).
InsgesamtführtedieBehandlungderGranulozytenausallenChimärenmitansteigenden
Konzentrationen von fMLP im Vergleich zu Granulozyten aus naiven, unbestrahlten
MäusenzuerhöhterROS‐Synthese(Abbildung4.18.undAbbildung4.30).Untersuchungen
zufolgekonnten imSerumbestrahlterTiereerhöhteKonzentrationenanZytokinen,von
denen einige Primingpotenzial haben, detektiert werden (Cairo et al., 1992; Lee et al.,
2004).
DISKUSSION 73
5.5. FolgenderfehlgesteuertenROS‐Synthese
Die Abwesenheit von Toso in Granulozyten führte beim Priming und anschließender
Aktivierung sowie bei direkter Aktivierungmit fMLP invitro zu erhöhter ROS‐Synthese
(Abbildung4.18.undAbbildung4.19.).Tosokönntesomiteineungeeigneteundvorzeitige
Aktivierung der Granulozyten im Blut verhindern, so dass die ROS‐Synthese erst bei
Pathogenkontakt in Organen erfolgt. Die fehlgeleitete Induktion der Radikal‐Synthese
wirdbeimdirektenVergleichderROSProduktionderGranulozytenimBlutundderMilz
deutlich(Abbildung4.21.AundAbbildung4.22.).InwildtypischenZellenvermindertedie
Expression von Toso die ROS‐Synthese im Blut, verstärkte diese jedoch im Organ. Der
zugrunde liegende funktionelleMechanismusvonTosowirdunterderBerücksichtigung
der Expressionsanalyse deutlich. Die Phagozytose von Listerien verringerte die
Oberflächenexpression von Toso deutlich (Abbildung 4.15. und Abbildung 4.16.). In
diesem Kontext würde die Expression von Toso auf Blutgranulozyten bei Kontakt mit
Primingsubstanzen wie TNFα, welche von Kupfferzellen relativ früh während der
Infektionsezerniertwerden,derVerhinderungderROS‐InduktionimBlutdienen(Havell,
1987). Nach der Migration in die Organe phagozytieren die Granulozyten die Listerien
infolge dessen Toso internalisiert werden würde. Die Herunterregulation des Proteins
würde die Sensitivität auf Primingsubstanzen in Organen verringern und die
ROS‐Syntheseerlauben.
DieKonsequenzeinerunkontrolliertenundineffizientenAktivierungderGranulozytenim
Blut konnte durch die Applikation der Tiere mit Priming‐ und Aktivierungssubstanzen
während der Infektion induziert werden. Die Behandlung der C57BL/6 Tiere, die
unbehandeltdie InfektionmitListerienüberlebten, führtezurSuszeptibilitätderMäuse
für die Pathogene (Abbildung 4.29.). Die Hyperaktivierung der Granulozyten ist zudem
häufigmitAutoimmunerkrankungenwiezumBeispielderVaskulitisassoziiert(Cascaoet
al., 2009; Kain et al., 2010; Nathan, 2006). Studien mit bereits im Blut geprimten
Granulozyten konnten diesen nachteiligen Effekt bestätigen. Eine mehrfache
Kombinationsbehandlung mit LPS und fMLP führte in Kaninchen zur verstärkten
AktivierungvonGranulozytenunddarausresultierendenGewebeschädigungderLungen
(Worthenetal.,1987).DieexvivoStimulationvonGranulozytenausLymphompatienten,
diemitGM‐CSFbehandeltwurden,zeigteeineerhöhteSensitivitätderGranulozytenauf
fMLP (Khwaja et al., 1992).DesWeiteren korreliertedie Intensität derROSProduktion
mitderKonzentrationvonTNFαimBlutvonacuteresperitorydistresssyndrome (ARDS)
PatientenundPathogenesederLungenverletzung(Chollet‐Martinetal.,1992)
DISKUSSION 74
5.6. EinflussdesIntegrinsCD11b
Das Integrin CD11b (Mac1) ist einBestandteil desKomplement 3Rezeptors (C3R) und
wird alsMarker für denAktivierungszustand der Granulozyten genutzt. Die Expression
von CD11bwirdwährend der Primingphase durch die Verschmelzung vonGranulamit
der Plasmamembran heraufreguliert. Toso defizienteGranulozytenwiesen imVergleich
zuC57BL/6GranulozyteneineerhöhtebasaleExpressionderIntegrineCD11bundCD18
auf, weshalb von einer Voraktivierung der Granulozyten im Blut ausgegangen werden
konnte (Abbildung 4.24.). Das Priming mit GM‐CSF oder LPS induzierte eine
HochregulationdesIntegrinsaufC57BL/6Granulozyten,sodassdiegeprimtenC57BL/6
Granulozyten eine mit Toso defizienten Zellen vergleichbare Expression von CD11b
aufwiesen(Abbildung4.25.).InfolgeeinesaktivierendenStimuluskorreliertedasPriming
vonC57BL/6GranulozytendurchGM‐CSFoderLPSmiteinemniedrigerenSchwellenwert
für die Induktion der ROS‐Synthese. Die ungeprimten Granulozyten produzierten beim
Kontakt mit fMLP kaum ROS, wohingegen das Priming zur Synthese von ROS führte
(Abbildung4.18.undAbbildung4.19.).
DieKorrelationdesAktivierungszustands vonGranulozytenmit derROS‐Synthesewird
beim Fehlen von CD11b deutlich. Die Deletion von CD11b in Toso defizienten Tieren
führte invitro zu einer verringerten ROS‐Synthese, die vergleichbar mit der
ROS‐Produktion von C57BL/6 Granulozyten war (Abbildung 4.26.). Der verringerte
AktivierungszustandunddiereduzierteROS‐SyntheseverminderteninvivodieMortalität
von Toso‐/‐xCD11b‐/‐ Mäusen gegenüber Toso‐/‐ Tieren während der Infektion mit
Listerien(Abbildung4.27.).
Der direkte Nachweis einer Interaktion von Toso mit CD11b bzw. ein regulatorischer
ZusammenhangbeiderProteineaufdieAssemblierungderNADPH‐Oxidasekonntejedoch
nicht erbracht werden. Ein Zusammenhang von ROS‐Synthese und der Expression von
CD11bwurdeinMakrophagendurcheineBlockierungvonCD11bmiteinemspezifischen
Antikörper verdeutlicht. Die Behandlung führte invitro zur Störung der Assemblierung
des NADPH‐Oxidase Komplexes und folglich zur kompletten Inhibierung der ROS‐
SyntheseinMakrophagen(Husemannetal.,2001).
DISKUSSION 75
5.7. Ausblick
Zusammenfassend lassen die Untersuchungen vermuten, dass Toso zwei Funktionen
ausübt. Zum einen fungiert Toso als ein exklusiver Fc‐Rezeptor für IgM und ist an der
Phagozytose von IgM opsonierten Pathogenen beteiligt, zum anderen reguliert Toso
Signale, die zum Priming und zur Aktivierung der Granulozyten beitragen. Die duale
Funktion von Toso konnte bereits für andere Rezeptoren wie das Integrin CD11b
nachgewiesenwerden.CD11bbindetverschiedeneLigandenwieICAM‐1, iC3b,Kollagen,
Fibrinogen und ist somit an der Phagozytose von Komplement opsonierten Pathogen
beteiligt (Ross,2002)sowieeinnegativerRegulatorvonTLR‐Signalen(Hanetal.,2010;
MeansandLuster,2010;Mocsaietal.,2006).
DievorliegendeArbeitkonntezeigen,dassTosodenSchwellenwertfürdieInduktionder
ROS‐Synthese sowie die Phagozytose von IgM opsonierten Bakterien beeinflusst. Die
molekularen Grundlagen für diese Funktionen konnten jedoch bisher nicht ermittelt
werden.Es istnochoffen,obTosodirektoder indirektmitanderenRezeptorenwiez.B.
CD11b auf der Oberfläche von Granulozyten sowie anderen Zellen interagiert oder in
intrazelluläreSignalwegewiedenp38MAP‐Kinasewegeingreift.DiegezielteBetrachtung
der Phosphorylierung von hierfür relevanten Proteinen sowie Interaktionsstudien mit
anderenProteinenkönntenindiesemKontexthelfen,dieFunktionvonTosogenauerzu
charakterisieren.
ANHANG 76
6. ANHANG
6.1. InvivoDepletionvonMakrophagen
3x103CFUListerien
0 5 10 150
20
40
60
80
100
Zeit p.i.(Tage)
Überleben(%)
XX
103CFUListerien
0 5 10 150
20
40
60
80
100
Zeit p.i.(Tage)
Überleben(%)
XX
3x102CFUListerien
0 5 10 150
20
40
60
80
100
C57BL/6(PBS)C57BL/6(Clodronat)
Zeit p.i.(Tage)
Überleben(%)
Abbildung6.1.: Überlebenskurve von C57BL/6 Mäusen in Abhängigkeit von gewebeständigenMakrophagenbeieinerInfektionmitL.monocytogenes.C57BL/6Mäusewurdenintravenösmit200µlClodronatbehandelt(n=6grau)oderbliebenunbehandelt(n=6schwarz).AmFolgetagwurdendieMäusemit 3x103 , 103 oder 3x102CFU L.monocytogenes intravenös infiziert und das Überleben unter derBerücksichtigungvonAbbruchkriterien (wieBelastungundGewichtsverlustderTiere)beobachtet.DieInfektionderVersuchstierewurdeinzweiunabhänigenVersuchsansätzendurchgeführt
ANHANG 77
6.2. IgMabhängigePhagozytoseimserumfreienMedium
0 10 100
1000
0
20
40
60
C57BL/6
Toso‐/‐
Mausanti‐IgM‐ListerienAntikörper[ng]
CFSE‐Listerien
+Granulozyten
(in%vonallenGranulozyten)
Abbildung6.2.: PhagozytosevonCFSEListerieninAbhängigkeitvomkommerziellenIgM.DasBlutvonC57BL/6(schwarzeBalken)undToso‐/‐(weißeBalken)MäusenwurdedreimalmitserumfreienMediumzurEntfernungderhumoralenKomponentendesBlutesgewaschen.106CFUCFSE‐Listerienwurdenmitden angegebenen Konzentration von anti‐IgM‐Listerien Antikörpern (Santa Cruz) für eine Stundevorinkubiert.AnschließendwurdediesmitdemgewaschenenBlutfüreineStundebei37°Cinkubiert.DieCFSE‐Listerien+ Granulozyten in Prozent von allen Granulozyten wurden in der Durchflusszytometriebestimmt(n=4/Gruppe)
6.3. KonzentrationvonC3imSerum
0
2
4
6
C57BL/6naivC57BL/6Tag2 p.i.
Toso‐/‐Tag2 p.i.
C3Kom
plementimBlut(log
10ng/ml)
Abbildung6.3.: KonzentrationvonC3imSerum.C57BL/6(grau)undToso‐/‐(weiß)Mäusewurdenmit
104CFUL.monocytogenesinfiziertunddasBlutanTag2p.i.entnommen.ZurKontrollewurdeBlutnaiverC57BL/6Tieren(schwarz)verwendet.VondiesemBlutwurdedieKonzentrationvonC3mittelsELISAquantifiziert.
ANHANG 78
6.4. ROS‐SyntheseinEinzelknochenmarkchimären
0
20
40
60
80
100
0.1 1 10100
C57BL/6
0fMLP(µM)
ROS+Granulozyten
(in%vonallenGranulozyten)
A
0
20
40
60
80
100
0.1 1 101000fMLP(µM)
ROS+Granulozyten
(in%vonallenGranulozyten)
Toso‐/‐
B
0
20
40
60
80
100
0.1 1 10100
C57BL/6
0
Toso‐/‐
fMLP(µM)
ROS+Granulozyten
(in%vonallenGranulozyten)
P=0,009
C
Abbildung6.4.: Untersuchung der Granulozyten in Einzelknochenmarkchimären. C57BL/6
Empfängermäusewurdenmit 1050rad bestrahlt und am folgenden Tagmit einem C57BL/6 (CD45.1;schwarz) oder Toso‐/‐ (CD45.2; weiß) Knochenmarkzellen rekonstruiert. 30 Tage nach derKnochenmarksrekonstruktionwurdendieBlutgranulozytenanalysiert.DasperiphereBlutvonC57BL/6(A) oder Toso‐/‐ (B) wurde mit ansteigenden Konzentrationen von fMLP inkubiert. C) zeigt dieÜberlagerungderErgebnisseausAundB.DieFrequenzderROSderGranulozytenwurdeinProzentallerGranulozytendesentsprechendenGenotypsangegeben(n=8).
LITERATURVERZEICHNIS 79
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DANKSAGUNG 88
8. DANKSAGUNG
Herrn Prof. Dr. Karl Sebastian Lang, danke ich herzlich für die Überlassung des
interessanten Themas, für die gute und intensive Betreuung sowie für die großen
gestalterischenFreiheitenwährenddesgesamtenForschungsprojekts.VielenDankfürdie
andauerndeUnterstützung.
HerrnProf.Dr.UlfDittmerdankeichfürdiefreundlicheÜbernahmedesKorreferats.
Ein besonderer Dank gilt Prof. Dr. Dieter Häussinger für die Möglichkeit in seinen
Laborräumenarbeitenzudürfen.DesweiterenmöchteichmichbeiallenMitarbeiterndes
InstitutsfürGastroenterologie,HepatologieundInfektiologiebedanken.
Weiterhinmöchte ichmich bei allenMitarbeitern derHumboldt Research Group sowie
denDoktorandenundDiplomandenfürdiekollegialeZusammenarbeitbedanken.
MeinDankgiltauchdenMitarbeiternderTVADüsseldorfundEssenfürdiefortwährende
Hilfe. Ein ganz besonderer Dank gilt Konstanze Schättel für die vorbildliche Zucht der
MäusesowiedemständigenEntgegenkommen.
Den Mitarbeitern des Instituts für Zellbiologie sowie den ehemaligen Mitarbeitern der
AbteilungfürMolekulareParasitologieschuldeicheinriesigesDankeschön.Insbesondere
binichPietfürjedenoffenen,wennauchdesÖfterensehreinseitigen,Schlagabtauschund
dieständigeHilfsbereitschaftdankbar.
Den Korrekturlesern, Caro, Denis, Falk und Pauline möchte ich für den Fleiß und die
AusdauerbeimLesendesManuskriptsdanken.
Denis "Devil" Delic möchte ich besonders dafür danken, dass er mir die jugoslawische
(Tablic) Mentalität näher gebracht und mich in den letzten Jahren geformt hat. Vielen
DankfürdielangjährigeUnterstützung.
Ein ganz besonderer Dank gilt Pauline Funkner, die mich über die Jahre unermüdlich
unterstützt und stets aufgemuntert hat. Vielen Dank für den Zusammenhalt, die
HilfsbereitschaftunddieständigeGeduld.DANKE.
MeinenElterndankeichsehrfürihreUnterstützung,ihrVerständnisunddiesteteGeduld.
SiehabenmirerstdasStudiumunddiePromotionermöglicht.Danke.
DesweiterendankeichallenmeinenFreunden.
LEBENSLAUF 89
9. LEBENSLAUF
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ERKLÄRUNGEN 91
11. ERKLÄRUNGEN
Erklärung:
Hiermiterkläre ich,gem.§6Abs.2, fderPromotionsordnungderMath.‐Nat.‐Fakultäten
zurErlangungderDr.rer.nat.,dass ichdasArbeitsgebiet,demdasThema"DerEinfluss
von Toso bei der Effektorfunktion von Granulozyten“ zuzuordnen ist, in Forschung und
LehrevertreteunddenAntragvonAndreasMerykbefürworte.
Essen,den_____________________________________________________Prof.Dr.med.KarlLang
Erklärung:
Hiermit erkläre ich, gem. § 6 Abs. 2, c und e der Promotionsordnung der Math.‐Nat.‐
Fakultäten zur Erlangung des Dr. rer. nat., dass ich die vorliegende Dissertation
selbständig verfasst und mich keiner anderen als der angegebenen Hilfsmittel bedient
habeundallewörtlichoder inhaltlichübernommenenStellenals solchegekennzeichnet
habe.
Essen,den_______________________________________________ AndreasMeryk
Erklärung:
Hiermit erkläre ich, gem. § 6 Abs. 2, d und f der Promotionsordnung der Math.‐Nat.‐
Fakultäten zur Erlangung des Dr. rer. nat., dass ich keine anderen Promotionen bzw.
Promotionsversuche in der Vergangenheit durchgeführt habe, dass diese Arbeit von
keineranderenFakultätabgelehntwordenist,unddassichdieDissertationnurindiesem
Verfahreneinreiche.
Essen,den__________________________________________AndreasMeryk