Der Zusammenhang zwischen der Dominanz bestimmter MRSA ... Das Enzym Koagulase wird nur von...

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Transcript of Der Zusammenhang zwischen der Dominanz bestimmter MRSA ... Das Enzym Koagulase wird nur von...

  • Aus der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie

    der Ruhr-Universität Bochum

    Leiter: Prof. Dr. med. S. G. Gatermann

    Der Zusammenhang zwischen der Dominanz bestimmter MRSA-Klone

    und der Variabilität des agr-Genlocus

    Inaugural-Dissertation

    zur

    Erlangung des Doktorgrades der Medizin

    einer

    Hohen Medizinischen Fakultät

    der Ruhr-Universität Bochum

    vorgelegt von

    Sven Hengesbach

    aus Meschede

    2006

  • Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr

    Referent: Prof. Dr. med. S. G. Gatermann

    Koreferent: Prof. Dr. rer. nat. Manfred Köller

    Tag der mündlichen Prüfung: 30.11.2006

  • Abstract

    Hengesbach

    Sven

    Der Zusammenhang zwischen der Dominanz bestimmter MRSA-Klone und der

    Variabilität des agr-Genlocus

    Problem: Weltweit wird das Phänomen beobachtet, dass Epidemien mit Methicillin-

    resistenten Staphylococcus aureus von nur wenigen Stämmen dieser Spezies verursacht

    werden. Die Entdeckung der agrBDC-Interferenzgruppen gab Anlass zu der These, dass

    ein bestimmter agr-Interferenztyp mit der Ausbreitungsfähigkeit von MRSA-

    Epidemiestämmen in Verbindung gebracht werden könnte. Dies sollte in der

    vorliegenden Arbeit genauer untersucht werden.

    Methoden: Anhand der Pulsfeldgelelektrophorese-Muster wurden die Isolate der

    MRSA-Stammsammlung des Instituts für Medizinische Mikrobiologie der Stadt

    Bochum nach epidemiologischen Kriterien klassifiziert und mit anerkannten nationalen

    und internationalen Epidemiestämmen verglichen. Zur Analyse der

    Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen erfolgte zunächst die DNA-Präparation.

    Anschließend wurde eine PCR durchgeführt mit nachfolgender Aufreinigung der PCR-

    Produkte. Zur Restriktionsanalyse wurde das Enzym DraI verwendet.

    Ergebnisse: Es wurden vier epidemische MRSA-Stämme in Bochum identifiziert, die

    51,2% aller Infektionen verursachten. Das PFGE-Muster von zwei Isolaten aus Bochum

    war identisch mit anerkannten Epidemiestämmen aus Kanada, den USA und

    Großbritannien. Auch der Hannoversche-, Süddeutsche- und Berliner Epidemiestamm

    waren in der Stammsammlung enthalten. Im ersten Beobachtungszeitraum (13.02.1998-

    31.12.2000) wiesen 70,9% der epidemischen MRSA-Stämme das agr-Interferenzmuster

    II auf. Bei Betrachtung des gesamten Untersuchungszeitraumes (13.02.1998-

    12.01.2004) nahm sein Anteil auf 53,3% ab, während die Interferenzgruppen I und Ia

    wesentlich häufiger unter den epidemischen Stämmen zu finden waren.

    Diskussion: Da bei den MRSA-Epidemiestämmen mit den meisten Isolaten drei agr-

    Interferenzmuster, I, Ia und II, zu finden waren, scheint es keine Präferenz der

    epidemischen MRSA für ein bestimmtes Interferenzmuster zu geben. Dies gilt auch für

    die Restriktionsmuster der anerkannten deutschen Epidemiestämme.

  • Für meine Eltern

  • Inhalt und Verzeichnisse

    Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 1.1 Staphylococcus aureus 1 1.1.1 Kolonisation und Infektion 1 1.1.2 Nosokomiale und ambulante Infektionen mit Staphylococcus aureus 2 1.2 Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) 3 1.2.1 MRSA im ambulanten Bereich, Alten- und Pflegeheimen 5 1.2.2 Resistenzentwicklung 6 1.2.3 Vancomycin-intermediäre Staphylococcus aureus (VISA) und die Entwicklung neuer Antibiotika 8 1.2.4 Epidemiologie von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) 10 1.2.5 Methoden zur Differenzierung von MRSA-Stämmen 13 1.3 Die Virulenzfaktoren von Staphylococcus aureus und ihre stadienbezogene Expression 14 1.4 Der agr-Genlocus 17 1.4.1 Globale Regulatorsysteme virulenzassoziierter Gene 17 1.4.2 Die Koordination bakterieller Genexpression durch Quorum-sensing-Systeme 19 1.4.3 Aufbau und Funktion des agr-Genlocus 22 1.4.4 Interferenz von S.-aureus-Stämmen durch die hypervariable Region des agr-Genlocus 26 1.4.5 Nachweise von agr in anderen Staphylokokken-Spezies 28 1.5 Komplexe Interaktionen der beiden globalen Regulatoren agr und sar 29 1.6 Fragestellung 30 2 Material und Methoden 32 2.1 Material 32 2.1.1 Chemikalien 32 2.1.2 Stämme 32 2.1.3 Kulturmedien und Puffer 36 2.1.4 Enzyme 36 2.1.5 Oligonukleotide 36 2.2 Methoden 37 2.2.1 Einteilung der MRSA-Stämme nach epidemiologischen Kriterien anhand der Pulsfeldgelelektrophorese- (PFGE-) Muster 37 2.2.2 Operationalisierung und Zuordnung der epidemiologischen Eigenschaften

    „epidemisch“, „unklar“ und „sporadisch“ 39 2.2.3 DNA-Präparation 39 2.2.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 40 2.2.5 Agarosegelelektrophorese 41 2.2.6 Aufreinigung der PCR-Produkte 41 2.2.7 Restriktionsanalyse 42

    I

  • Inhalt und Verzeichnisse

    3 Ergebnisse 43 3.1 Epidemiologie von MRSA-Stämmen in Nordrhein-Westfalen mit Konzentration auf Bochum und Städte der näheren Umgebung 44 3.1.1 Klassifizierung der MRSA-Stämme der Sammlung des Instituts für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum nach der Häufigkeit ihres klinischen Auftretens 44 3.1.2 Aktualisierung der Daten bis Januar 2004 47 3.2 PFGE-Muster-Vergleich der Bochumer MRSA-Sammlung mit anerkannten nationalen und internationalen Epidemiestämmen 51 3.3 Krankenhaus-Assoziation der MRSA-Stämme 54 3.4 Zusammenhang zwischen den agr-Interferenzgruppen und der epidemiologischen Zuordnung der MRSA-Stämme 63 3.4.1 Bestimmung der agr- Interferenzgruppen von Bochumer MRSA 64 3.4.2 Die agrBDC-Interferenzgruppen und ihr möglicher Einfluss auf die epidemiologischen Eigenschaften von MRSA-Stämmen 68 4 Diskussion 76 4.1 Epidemiologische Besonderheiten bei MRSA-Infektionen 76 4.1.1 Klassifizierung von MRSA-Stämmen nach epidemiologischen Kriterien 78 4.1.2 Anerkannte Epidemiestämme in Bochum 79 4.1.3 Grenzfälle bei der epidemiologischen Klassifikation 80 4.2 Die bakterielle Kommunikation und der agr-Genlocus 82 4.2.1 Die Bedeutung des agr-Genlocus für die Ausbreitungsfähigkeit von MRSA-Stämmen 83 4.2.2 Die Assoziation bestimmter S.-aureus-Phänotypen mit einem agr-Interferenzmuster 86 4.2.3 Koordination der Virulenzfaktoren in vivo 87 5 Zusammenfassung 90 6 Literaturverzeichnis 93 7 Danksagung 107 8 Lebenslauf 108

    II

  • Inhalt und Verzeichnisse

    Verzeichnis der Tabellen Tabelle 1 Die 20 Kliniken, aus denen die MRSA-Isolate (Gesamtzahl: 1161) zugesandt wurden 33 Tabelle 2 mecA-Primer zum Nachweis des mecA-Gens 34 Tabelle 3 In dieser Arbeit verwendete epidemische MRSA aus Mitteleuropa 35 Tabelle 4 Primer zur Amplifikation der hypervariablen Region des agr-Gens 36 Tabelle 5 Kriterien zur epidemiologischen Klassifikation der MRSA-Isolate (Stand: 31.12.2000) 47 Tabelle 6 Aktualisierung der Tabelle 5 auf den Stand Januar 2004 49 Tabelle 7 Die Kliniken der 1161 MRSA-Isolate mit Farbkodierung (Legende zu Abbildung 13) 57 Tabelle 8 Verteilung der 393 Isolate auf die vier Interferenzgruppen 71 Tabelle 9 Dominanz des Interferenztyps II bei den epidemischen Stämmen 72 Tabelle 10 Aktualisierung der Daten bis auf den Stand Januar 2004 74 Verzeichnis der Abbildungen Abbildung 1 Zwei-Komponenten-Systeme globaler Regulatoren 18 Abbildung 2 Schema der molekularen Vorgänge eines Quorum-sensing-Modells 21 Abbildung 3 Transkription des polycistronischen agr-Locus 23 Abbildung 4 Modell des agr-Systems von S. aureus 25 Abbildung 5 Hypervariable Region des agr-Genlocus 27 Abbildung 6 Screenshot, Molecular Analyst Fingerprinting Software 38 Abbildung 7 Optimization 38 Abbildung 8 Identifikation der vier Interferenzgruppen des agr-Genlocus 42 Abbildung 9 Einteilung der Bochumer MRSA-Isolate in Gruppen anhand ihrer PFGE-Muster (Stand der Sammlung: 31.12.2000) 46 Abbildung 10 Aktualisierung der PFGE-Gruppen-Einteilung der Bochumer MRSA-Stammsammlung 48 Abbildung 11 Screenshot, Molecular Analyst Fingerprinting Software,

    Übereinstimmung mit PFGE-Bandenmustern deutscher Epidemiestämme 52

    Abbildung 12 Übereinstimmende PFGE-Bandenmuster von MRSA-Isolaten aus Deutschland, Kanada, den USA und Großbritannien 54 Abbildung 13 Verteilung der Isolate aus den 20 Kliniken auf die PFGE-Gruppen 56 Abbildung 14 Verteilung der 360 Isolate der Klinik A auf die PFGE-Gruppen 60 Abbildung 15 Verteilung der 294 Isolate der Klinik B auf die PFGE-Gruppen 60 Abbildung 16 Verteilung der 110 Isolate der Klinik C auf die PFGE-Gruppen 61 Abbildung 17 Verteilung der 81 Isolate der Klinik D auf die PFGE-Gruppen 61 Abbildung 18 Foto eines Kontroll-Gels nach der PCR 65 Abbildung 19 Bestimmung der Restriktionsfragmente nach Verdau durch DraI 67 Abbildung 20 Die agr-Interferenzmuster der PFGE-Gruppen und der sporadischen Stämme 69 Abbildung 21 Aktualisierung der agr-Interferenzmuster-Verteilung 73

    III

  • Inhalt und Verzeichnisse

    Verzeichnis der Abkürzungen

    ABC ATP binding cassette ADP Adenosindiphosphat agr accessory gene regulator AIP autoinducing peptide ATP Adenosintriphosphat bidest. Bidestilliert bp Basenpaare °C Grad Celsius CDC Centers for Disease Control and Prevention CF Clumping factor cm Zentimeter cMRSA community acquired MRSA CMRSA Canadian methicillin-resistant Staphylococcus aure